JP2007159417A - Protein having salt tolerance-improving activity, dna fragment encoding the protein and method for screening dna fragment having salt tolerance-improving activity - Google Patents

Protein having salt tolerance-improving activity, dna fragment encoding the protein and method for screening dna fragment having salt tolerance-improving activity Download PDF

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晃世 山田
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良宏 小関
Haruko Takeyama
春子 竹山
Tadashi Matsunaga
是 松永
Hiroko Yokouchi
裕子 横内
Junichi Kanetani
潤一 金谷
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Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a protein having salt tolerance-improving activity, a DNA fragment encoding the protein and to provide a method for screening the DNA fragment having salt tolerance-improving activity. <P>SOLUTION: The DNA fragment is derived from a microorganism which coexists with Stylissa massa and encodes the protein having salt tolerance-improving activity. <P>COPYRIGHT: (C)2007,JPO&INPIT

Description

本発明は、海洋メタゲノム由来の耐塩性向上に関与する遺伝子、ならびに該遺伝子の利用に関する。より具体的には、本発明は、耐塩性向上活性を有するタンパク質、該タンパク質をコードするＤＮＡ断片、ならびに耐塩性向上活性を有するＤＮＡ断片のスクリーニング方法に関する。   The present invention relates to a gene involved in the improvement of salt tolerance derived from a marine metagenome, and the use of the gene. More specifically, the present invention relates to a protein having a salt tolerance improving activity, a DNA fragment encoding the protein, and a method for screening a DNA fragment having a salt tolerance improving activity.

自然界に存在する生物は種々の環境耐塩性に曝されている。特に、塩ストレスは、多くの高等植物や微生物の生育を阻害する最も大きな要因の１つである。高等植物や各種微生物の耐塩性活性の強化は、農産物生産および発酵生産の増大につながるため、遺伝子導入によりこれらの生物の耐塩性活性を強化させる試みが、活発に進められている。   Living organisms that exist in nature are exposed to various environmental salt tolerances. In particular, salt stress is one of the biggest factors that inhibit the growth of many higher plants and microorganisms. Since enhancement of the salt tolerance activity of higher plants and various microorganisms leads to an increase in agricultural production and fermentation production, attempts to enhance the salt tolerance activity of these organisms by gene introduction are being actively promoted.

耐塩性活性を強化する機能を有するタンパク質は、適合溶質(グリシンベタイン、マンニトール、トレハロース、プロリン)合成酵素、イオンホメオスタシスに関与する酵素(Ｎａ＋／Ｈ＋アンチポーター)、およびこれらの遺伝子の発現を制御する転写調節因子に大別することができる。これらのタンパク質を発現した形質転換細胞で耐塩性活性の向上が認められた例が近年多数報告されている。 Proteins that have the function of enhancing salt tolerance activity are compatible solutes (glycine betaine, mannitol, trehalose, proline) synthase, enzymes involved in ion homeostasis (Na + / H + antiporter), and expression of these genes It can be roughly divided into transcriptional regulatory factors to be controlled. In recent years, there have been many reports on examples in which improved salt tolerance activity was observed in transformed cells expressing these proteins.

例えば、コリンオキシダーゼをコードする遺伝子が染色体ＤＮＡ中に導入されたユーカリ属の植物体（例えば、特許文献１参照）、耐塩性藍藻（Aphanothec eha1opytica）由来Ｎａ＋／Ｈ＋アンチポーターをコードするＤＮＡ（例えば、特許文献２参照）、植物の細胞内におけるプロリン分解系の酵素をコードする遺伝子の発現を抑制することを特徴とする植物の耐塩性を上昇させる方法（例えば、特許文献３参照）がそれぞれ報告されている。 For example, a plant of the genus Eucalyptus in which a gene encoding choline oxidase is introduced into chromosomal DNA (see, for example, Patent Document 1), a DNA encoding Na + / H + antiporter derived from a salt-tolerant cyanobacterium (Aphanothec eha1opytica) ( For example, see Patent Document 2), and a method for increasing the salt tolerance of plants characterized by suppressing the expression of a gene encoding a proline-degrading enzyme in plant cells (see, for example, Patent Document 3). It has been reported.

しかしながら、上記の耐塩性活性強化因子を発現した生物を、農業や各種微生物産業に応用するためには、上記の適合溶質合成系酵素やアンチポーターだけでは不十分であると思われる。   However, in order to apply organisms expressing the above-mentioned salt tolerance enhancing factor to agriculture and various microbial industries, the above-mentioned compatible solute synthase and antiporter alone are considered insufficient.

近年、本特許出願の発明者が、塩生植物から全く新しいタイプの耐塩性活性強化遺伝子を発見した例を報告しており（例えば、非特許文献１，２および特許文献４参照）、今後も未知の遺伝子資源に注目することで、さらに新しいタイプの耐塩性活性強化遺伝子の発見が期待できる。新しいタイプの耐塩性活性強化遺伝子を発見することができれば、それを単独で用いることによって、あるいは、既知の耐塩性活性強化遺伝子と複合的に組み合わせることによって、従来にない耐塩性植物や微生物を作出できると期待できる。しかしながら、現状はその十分な探索がなされていない。   In recent years, the inventors of the present patent application have reported examples in which a completely new type of salt-tolerant activity-enhanced gene has been discovered from halophytes (see, for example, Non-Patent Documents 1 and 2 and Patent Document 4) and will remain unknown By paying attention to the genetic resources of, we can expect the discovery of a new type of gene with enhanced salt tolerance activity. If a new type of salt-tolerant activity-enhanced gene can be found, it can be used alone or combined with known salt-tolerant activity-enhancing genes to create unprecedented salt-tolerant plants and microorganisms. I can expect it. However, the current search has not been made sufficiently.

環境中の微生物のうち、平板培養法などの既存の方法によって実験室内で培養できるものは、実際に環境中に存在する微生物のわずか１％未満とされている（非特許文献３）。したがって、「培養できない微生物」を遺伝子資源として注目すれば、従来にない新規耐塩性遺伝子の発見が期待できる。
特開２００３−１４３９８８号公報 特開２００３−１８０３７３号公報 特開２００３−１８６８７９号公報 特開２００１−３３３７８４号公報 Yamada A, Sekiguchi M, Mimura T, Ozeki Y. 2002a. The Role of Plant CCTα in Salt- and Osmotic- Stress Tolerance. Plant Cell Physiol. 43:1043-1048， Yamada A, Saitoh T, Mimura T, Ozeki Y. 2002b. Expression of Mangrove Allene Cyclase Enhances Salt Tolerance in Escherichia coli, Yeast, and Tobacco Cells. Plant Cell Physiol. 43: 903-910 Amann RI, Ludwig W, Schleifer KH. 1995. Phylogenetic identification and in situ detection of individual microbial cells without cultivation. Microbiol. Rev. 59:143-69 Among microorganisms in the environment, those that can be cultured in a laboratory by an existing method such as a plate culture method are considered to be less than 1% of microorganisms actually present in the environment (Non-patent Document 3). Therefore, if attention is paid to “microorganisms that cannot be cultivated” as gene resources, discovery of a novel salt-tolerant gene that has not been possible in the past can be expected.
JP 2003-143988 A JP 2003-180373 A JP 2003-186879 A JP 2001-333784 A Yamada A, Sekiguchi M, Mimura T, Ozeki Y. 2002a. The Role of Plant CCTα in Salt- and Osmotic- Stress Tolerance. Plant Cell Physiol. 43: 1043-1048, Yamada A, Saitoh T, Mimura T, Ozeki Y. 2002b.Expression of Mangrove Allene Cyclase Enhances Salt Tolerance in Escherichia coli, Yeast, and Tobacco Cells.Plant Cell Physiol. 43: 903-910 Amann RI, Ludwig W, Schleifer KH. 1995. Phylogenetic identification and in situ detection of individual microbial cells without cultivation. Microbiol. Rev. 59: 143-69

本発明者らは、耐塩性向上遺伝子を探索するための遺伝子資源として、海水中の浮遊微生物を濃縮または共在させるカイメン（stylissa massa）に着目し、カイメン共在微生物より抽出されたＤＮＡ断片から「メタゲノムライブラリ」を構築して、全く新しいタイプの耐塩性遺伝子の同定に成功した。   The present inventors pay attention to a sponge (stylissa massa) that concentrates or coexists floating microorganisms in seawater as a genetic resource for searching for a salt tolerance-enhancing gene, and from a DNA fragment extracted from the sponge coexisting microorganism. A “metagenome library” was constructed and a completely new type of salt tolerance gene was successfully identified.

本発明の目的は、耐塩性向上活性を有するタンパク質、該タンパク質をコードするＤＮＡ断片、および耐塩性向上活性を有するＤＮＡ断片のスクリーニング方法を提供することである。   An object of the present invention is to provide a protein having a salt tolerance improving activity, a DNA fragment encoding the protein, and a method for screening a DNA fragment having a salt tolerance improving activity.

本発明の別の目的は、耐塩性向上活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ断片を含む発現ベクター、ならびに、前記発現ベクターを宿主細胞に導入することにより得られる形質転換体を提供することである。   Another object of the present invention is to provide an expression vector comprising a DNA fragment encoding a protein having a salt tolerance improving activity, and a transformant obtained by introducing the expression vector into a host cell.

本発明の第１の態様のＤＮＡ断片は、
カイメン（stylissa massa）の共在微生物由来であり、かつ、耐塩性向上活性を有するタンパク質をコードすることができる。 The DNA fragment of the first aspect of the present invention is
It is possible to encode a protein derived from a coexisting microorganism of stylissa massa and having a salt tolerance improving activity.

本発明において、「カイメンの共在微生物由来であるＤＮＡ断片」には、（i）カイメンの共在微生物から抽出されたＤＮＡ断片、（ii）カイメンの共在微生物から抽出されたＤＮＡ断片の一部を構成するＤＮＡ断片、ならびに、（iii）（i）または（ii）のＤＮＡ断片の塩基配列に基づいて作製された複製物が含まれるものとする。   In the present invention, “a DNA fragment derived from a sponge commensal microorganism” includes (i) a DNA fragment extracted from a sponge commensal microorganism, and (ii) a DNA fragment extracted from a sponge symbiotic microorganism. And a DNA fragment constituting the part, and a replica produced based on the base sequence of the DNA fragment of (iii) (i) or (ii).

本発明の第２の態様のＤＮＡ断片は、以下の（ａ）〜（ｃ）記載のいずれかのタンパク質をコードすることができる。   The DNA fragment of the second aspect of the present invention can encode any of the following proteins (a) to (c).

（ａ）配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号４に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ耐塩性向上活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質と相同性が７０％以上のアミノ酸配列からなり、かつ耐塩性向上活性を有するタンパク質。 (A) a protein comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 (b) consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4, and salt tolerance (C) A protein comprising an amino acid sequence having a homology of 70% or more with the protein comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 and having a salt tolerance improving activity.

本発明の第３の態様のＤＮＡ断片は、配列番号１、２、および３のいずれかにより表される塩基配列またはその相補的配列を有することができる。   The DNA fragment of the third aspect of the present invention can have the base sequence represented by any of SEQ ID NOs: 1, 2, and 3 or a complementary sequence thereof.

本発明の第４の態様のＤＮＡ断片は、配列番号１、２、および３のいずれかにより表される塩基配列において、１または数個の塩基が置換、欠失、もしくは付加されている塩基配列を有し、かつ耐塩性向上活性を有するタンパク質をコードすることができる。   The DNA fragment according to the fourth aspect of the present invention is a base sequence in which one or several bases are substituted, deleted, or added in the base sequence represented by any of SEQ ID NOs: 1, 2, and 3. And a protein having a salt tolerance improving activity.

本発明の第５の態様のＤＮＡ断片は、配列番号１、２、および３のいずれかにより表される塩基配列と７０％以上の同一性を有する塩基配列を有し、かつ耐塩性向上活性を有するタンパク質をコードすることができる。   The DNA fragment of the fifth aspect of the present invention has a base sequence having 70% or more identity with the base sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 1, 2, and 3, and has a salt tolerance improving activity. Can be encoded.

本発明の第６の態様のＤＮＡ断片は、ＤＮＡ断片とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ耐塩性向上活性を有するタンパク質をコードすることができる。   The DNA fragment of the sixth aspect of the present invention can encode a protein that hybridizes with a DNA fragment under stringent conditions and has a salt tolerance improving activity.

本発明の第７の態様のＤＮＡ断片は、以下の（ａ）〜（ｃ）のうちいずれか１つの塩基配列またはその相補的配列と、以下の（ｄ）〜（ｉ）のうち少なくとも１つの塩基配列またはその相補的配列と、を含むことができる。   The DNA fragment according to the seventh aspect of the present invention includes any one of the following base sequences (a) to (c) or a complementary sequence thereof, and at least one of the following (d) to (i): A nucleotide sequence or a complementary sequence thereof.

（ａ）配列番号１により表される塩基配列
（ｂ）配列番号１により表される塩基配列の一部または全部を含み、かつ耐塩性向上活性を有するタンパク質をコードする塩基配列
（ｃ）配列番号１により表される塩基配列と７０％以上の同一性を有する塩基配列を有し、かつ耐塩性向上活性を有するタンパク質をコードする塩基配列
（ｄ）配列番号２により表される塩基配列
（ｅ）配列番号２により表される塩基配列の一部または全部を含み、かつ耐塩性向上活性を有するタンパク質をコードする塩基配列
（ｆ）配列番号２により表される塩基配列と７０％以上の同一性を有する塩基配列を有し、かつ耐塩性向上活性を有するタンパク質をコードする塩基配列
（ｇ）配列番号３により表される塩基配列
（ｈ）配列番号３により表される塩基配列の一部または全部を含み、かつ耐塩性向上活性を有するタンパク質をコードする塩基配列
（ｉ）配列番号３により表される塩基配列と７０％以上の同一性を有する塩基配列を有し、かつ耐塩性向上活性を有するタンパク質をコードする塩基配列。 (A) a base sequence represented by SEQ ID NO: 1 (b) a base sequence encoding a protein comprising part or all of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 and having a salt tolerance improving activity (c) SEQ ID NO: A base sequence encoding a protein having a base sequence having 70% or more identity with the base sequence represented by 1 and having a salt tolerance improving activity (d) a base sequence represented by SEQ ID NO: 2 (e) (F) a base sequence that encodes a protein having a part or all of the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 and having a salt tolerance improving activity; (f) 70% or more identity with the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 (G) a base sequence represented by SEQ ID NO: 3 (h) a base sequence represented by SEQ ID NO: 3 A base sequence comprising a part or all of the sequence and encoding a protein having a salt tolerance improving activity (i) having a base sequence having 70% or more identity with the base sequence represented by SEQ ID NO: 3, and A base sequence encoding a protein having an activity of improving salt tolerance.

本発明の第８の態様の発現ベクターは、上記本発明の第１〜第７の態様のいずれかに記載のＤＮＡ断片を含むことができる。   The expression vector according to the eighth aspect of the present invention can contain the DNA fragment according to any one of the first to seventh aspects of the present invention.

本発明の第９の態様の形質転換体は、上記本発明の第８の態様の発現ベクターを宿主細胞に導入することにより得ることができる。この場合、前記宿主細胞は微生物細胞であることができる。さらに、この場合、前記形質転換体は耐塩性向上活性を有することができる。   The transformant according to the ninth aspect of the present invention can be obtained by introducing the expression vector according to the eighth aspect of the present invention into a host cell. In this case, the host cell can be a microbial cell. Further, in this case, the transformant can have a salt tolerance improving activity.

本発明の第１０の態様のタンパク質は、カイメン（stylissa massa）の共在微生物由来であり、かつ、耐塩性向上活性を有することができる。 The protein according to the tenth aspect of the present invention is derived from a coexisting microorganism of stylissa massa and can have a salt tolerance improving activity.

本発明において、「カイメンの共在微生物由来であるＤＮＡ断片」には、（i）カイメンの共在微生物から抽出されたタンパク質、ならびに、（ii）カイメンの共在微生物から抽出されたＤＮＡ断片の一部または全部の塩基配列に基づいて作製されたタンパク質が含まれるものとする。   In the present invention, the “DNA fragment derived from the sponge commensal microorganism” includes (i) a protein extracted from the sponge commensal microorganism, and (ii) a DNA fragment extracted from the sponge commensal microorganism. Proteins produced based on part or all of the base sequence are included.

本発明の第１１の態様のタンパク質は、配列番号４、５、および６のいずれかにより表されるアミノ酸配列を有することができる。   The protein of the eleventh aspect of the present invention can have the amino acid sequence represented by any of SEQ ID NOs: 4, 5, and 6.

本発明の第１２の態様のタンパク質は、配列番号４、５、および６のいずれかにより表されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が置換、欠失、もしくは付加されているアミノ酸配列を有し、かつ耐塩性向上活性を有することができる。   The protein of the twelfth aspect of the present invention is an amino acid sequence in which one or several amino acids are substituted, deleted, or added in the amino acid sequence represented by any of SEQ ID NOs: 4, 5, and 6. And having a salt resistance improving activity.

本発明の第１３の態様のタンパク質は、配列番号４、５、および６のいずれかにより表されるアミノ酸配列と７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ耐塩性向上活性を有することができる。   The protein of the thirteenth aspect of the present invention has an amino acid sequence having 70% or more identity with the amino acid sequence represented by any of SEQ ID NOs: 4, 5, and 6, and has a salt tolerance improving activity. be able to.

本発明の第１４の態様の耐塩性向上活性を有するＤＮＡ断片のスクリーニング方法は、
カイメン（stylissa massa）の共在微生物から複数のＤＮＡ断片を抽出すること、
前記複数のＤＮＡ断片がそれぞれ挿入された複数の発現ベクターを作製することにより、ライブラリを構築すること、および
前記複数の発現ベクターを宿主細胞に導入し、該宿主細胞を塩ストレス条件下で培養することにより、耐塩性向上活性を有するクローンを選択すること、
を含むことができる。 The method for screening a DNA fragment having a salt tolerance improving activity according to the fourteenth aspect of the present invention comprises:
Extracting multiple DNA fragments from coexisting microorganisms of sponge ( stylissa massa ),
Constructing a library by preparing a plurality of expression vectors into which the plurality of DNA fragments are respectively inserted, and introducing the plurality of expression vectors into a host cell and culturing the host cell under salt stress conditions Selecting a clone having an activity of improving salt tolerance,
Can be included.

この場合、前記宿主細胞が微生物細胞であることができる。   In this case, the host cell can be a microbial cell.

本発明のＤＮＡ断片によれば、カイメン（stylissa massa）の共在微生物由来であり、かつ耐塩性向上活性を有するタンパク質をコードするため、本発明のＤＮＡ断片を用いることにより、高等植物や微生物などの幅広い生物群の耐塩性活性を向上させることができる。 According to the DNA fragment of the present invention, since it encodes a protein derived from a common microorganism of stylissa massa and having an activity of improving salt tolerance, by using the DNA fragment of the present invention, higher plants, microorganisms, etc. Can improve the salt tolerance activity of a wide range of organisms.

微生物によるアミノ酸などの有用物質の生産を行なう場合、生産物（代謝産物）による塩ストレスが生じ、この塩ストレスが、微生物の有用物質生産能に悪影響をもたらす現象が知られている。この場合、本発明の耐塩性向上活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ断片を微生物に導入することにより、塩ストレスによる悪影響を受けることなく有用物質の生産を行なうことができる。   When a useful substance such as an amino acid is produced by a microorganism, salt stress is caused by a product (metabolite), and a phenomenon in which this salt stress adversely affects the ability of the microorganism to produce a useful substance is known. In this case, a useful substance can be produced without being adversely affected by salt stress by introducing a DNA fragment encoding the protein having the salt tolerance improving activity of the present invention into a microorganism.

また、近年、土壌における塩分の集積により可耕地が激減していることを鑑みれば、本発明の耐塩性向上活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ断片を、農業における生産性向上に利用することができる。   In recent years, in view of the drastic decrease in arable land due to the accumulation of salt in soil, the DNA fragment encoding the protein having the salt-tolerant activity of the present invention can be used for improving productivity in agriculture. .

１．耐塩性向上活性を有するタンパク質、該タンパク質をコードするＤＮＡ断片、発現ベクター、および形質転換体
１．１．ＤＮＡ断片およびタンパク質
本発明のＤＮＡ断片としては、例えば以下の態様（Ａ）〜（Ｆ）が挙げられる。 1. 1. Protein having salt tolerance improving activity, DNA fragment encoding the protein, expression vector, and transformant 1.1. DNA fragment and protein Examples of the DNA fragment of the present invention include the following embodiments (A) to (F).

（Ａ）カイメン（stylissa massa）の共在微生物から抽出され、かつ耐塩性向上活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ断片
（Ｂ）以下の（ａ）〜（ｃ）記載のいずれかのタンパク質をコードするＤＮＡ断片
（ａ）配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号４に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ耐塩性向上活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質と相同性が７０％以上のアミノ酸配列からなり、かつ耐塩性向上活性を有するタンパク質
（Ｃ）配列番号１、２、および３のいずれかにより表される塩基配列またはその相補的配列を有するＤＮＡ断片
（Ｄ）配列番号１、２、および３のいずれかにより表される塩基配列において、１または数個の塩基が置換、欠失、もしくは付加されている塩基配列を有し、かつ耐塩性向上活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ断片
（Ｅ）配列番号１、２、および３のいずれかにより表される塩基配列と７０％以上の同一性を有する塩基配列を有し、かつ耐塩性向上活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ断片
（Ｆ）以下の（ａ）〜（ｃ）のうちいずれか１つの塩基配列またはその相補的配列と、以下の（ｄ）〜（ｉ）のうち少なくとも１つの塩基配列またはその相補的配列と、を含むＤＮＡ断片
（ａ）配列番号１により表される塩基配列
（ｂ）配列番号１により表される塩基配列の一部または全部を含み、かつ耐塩性向上活性を有するタンパク質をコードする塩基配列
（ｃ）配列番号１により表される塩基配列と７０％以上の同一性を有する塩基配列を有し、かつ耐塩性向上活性を有するタンパク質をコードする塩基配列
（ｄ）配列番号２により表される塩基配列
（ｅ）配列番号２により表される塩基配列の一部または全部を含み、かつ耐塩性向上活性を有するタンパク質をコードする塩基配列
（ｆ）配列番号２により表される塩基配列と７０％以上の同一性を有する塩基配列を有し、かつ耐塩性向上活性を有するタンパク質をコードする塩基配列
（ｇ）配列番号３により表される塩基配列
（ｈ）配列番号３により表される塩基配列の一部または全部を含み、かつ耐塩性向上活性を有するタンパク質をコードする塩基配列
（ｉ）配列番号３により表される塩基配列と７０％以上の同一性を有する塩基配列を有し、かつ耐塩性向上活性を有するタンパク質をコードする塩基配列
上記態様（Ｂ）〜（Ｆ）のＤＮＡ断片は、（i）カイメンの共在微生物から抽出されたＤＮＡ断片、（ii）（i）のＤＮＡ断片の一部を構成するＤＮＡ断片、ならびに、（iii）（i）または（ii）のＤＮＡ断片の塩基配列に基づいて作製された複製物であってもよい。 (A) DNA fragment that is extracted from a coexisting microorganism of stylissa massa and encodes a protein having an activity of improving salt tolerance (B) It encodes any one of the following proteins (a) to (c) A DNA fragment (a) a protein comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 (b) consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4, and Protein having salt tolerance improving activity (c) Protein consisting of an amino acid sequence having 70% or more homology with the protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 and having salt tolerance improving activity (C) SEQ ID NO: 1, 2 And a DNA fragment having a base sequence represented by any one of (3) and (3), or a complementary sequence thereof (D) And a DNA fragment encoding a protein having a base sequence in which one or several bases are substituted, deleted, or added in the base sequence represented by any one of 3 and 3, and having a salt tolerance improving activity (3) E) DNA fragment encoding a protein having a base sequence having 70% or more identity with the base sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 1, 2, and 3 and having a salt tolerance improving activity (F) DNA comprising any one of the following base sequences (a) to (c) or a complementary sequence thereof, and at least one of the following base sequences (d) to (i) or a complementary sequence thereof: Fragment (a) Base sequence represented by SEQ ID NO: 1 (b) Base sequence encoding a protein comprising part or all of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 and having a salt tolerance improving activity (C) a base sequence encoding a protein having a base sequence having 70% or more identity with the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 and having a salt tolerance improving activity (d) represented by SEQ ID NO: 2 (E) a base sequence encoding a protein containing part or all of the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 and having a salt tolerance improving activity (f) 70% of the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 (G) a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 3 (h) a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 3 having a nucleotide sequence having the above identity and encoding a protein having a salt tolerance improving activity A base sequence that encodes a protein that includes part or all of the protein and that has a salt tolerance improving activity (i) a base sequence that has 70% or more identity with the base sequence represented by SEQ ID NO: 3 And a base sequence encoding a protein having an activity of improving salt tolerance, the DNA fragments of the above embodiments (B) to (F) are: (i) a DNA fragment extracted from a coexisting microorganism of sponge, (ii) ( It may be a DNA fragment constituting a part of the DNA fragment of i) and a replica produced based on the base sequence of the DNA fragment of (iii) (i) or (ii).

また、本発明のタンパク質としては、例えば以下の態様（Ａ）〜（Ｃ）が挙げられる。   Moreover, as a protein of this invention, the following aspects (A)-(C) are mentioned, for example.

（Ａ）配列番号４、５、および６のいずれかにより表されるアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｂ）配列番号４、５、および６のいずれかにより表されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が置換、欠失、もしくは付加されているアミノ酸配列を有し、かつ耐塩性向上活性を有するタンパク質
（Ｃ）配列番号４、５、および６のいずれかにより表されるアミノ酸配列と７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ耐塩性向上活性を有するタンパク質
上記態様（Ａ）〜（Ｃ）のタンパク質は、（i）カイメンの共在微生物から抽出されたタンパク質、または、（ii）カイメンの共在微生物から抽出されたＤＮＡ断片の一部または全部の塩基配列に基づいて作製されたタンパク質であってもよい。上記（ii）のタンパク質は、公知の方法（例えば、遺伝子組み換え法，化学合成法など）を用いて得ることができる。 (A) A protein having an amino acid sequence represented by any of SEQ ID NOs: 4, 5, and 6 (B) In the amino acid sequence represented by any of SEQ ID NOs: 4, 5, and 6, one or several A protein having an amino acid sequence in which amino acids are substituted, deleted, or added, and having a salt tolerance improving activity (C) 70% or more of an amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 4, 5, and 6 A protein having an amino acid sequence having the same identity and having a salt tolerance-improving activity, the protein of the above aspects (A) to (C) is (i) a protein extracted from a coexisting microorganism of sponge, or (ii) ) It may be a protein produced based on the base sequence of a part or all of a DNA fragment extracted from a sponge coexisting microorganism. The protein of (ii) above can be obtained using a known method (for example, genetic recombination method, chemical synthesis method, etc.).

本発明において、「耐塩性」とは、塩ストレスに対する耐性をいい、「耐塩性」が高い生物ほど、塩濃度が高い条件下で生存することができる。限定されないが、例えば、本発明の耐塩性向上活性を有するＤＮＡ断片が導入された微生物は、本発明の耐塩性向上活性を有するＤＮＡ断片が導入されていない微生物と比較して、所定濃度の塩存在下で統計学上有意に優れた増殖を示すことになる。また、限定されないが、例えば、耐塩性向上活性を有するタンパク質を発現する微生物は、本発明の耐塩性向上活性を有するタンパク質を発現していない微生物と比較して、所定濃度の塩存在下で統計学上有意に優れた増殖を示すことになる。   In the present invention, “salt tolerance” refers to tolerance to salt stress, and organisms with higher “salt tolerance” can survive under conditions of higher salt concentration. Although not limited, for example, a microorganism into which a DNA fragment having the salt tolerance improving activity of the present invention has been introduced has a salt concentration of a predetermined concentration compared to a microorganism into which the DNA fragment having the salt tolerance improving activity of the present invention has not been introduced. It will show statistically significant growth in the presence. Although not limited, for example, a microorganism expressing a protein having a salt tolerance improving activity is statistically measured in the presence of a predetermined concentration of salt as compared to a microorganism not expressing a protein having a salt tolerance improving activity of the present invention. The growth will be significantly superior academically.

また、「塩」とは、陽イオンと陰イオンとが電荷を中和させる形で生じた化合物の総称をいう（岩波理化学辞典第５版、２８０頁、岩波書店（２０００））。本発明において「耐塩性」の対象となる塩の種類は限定されないが、本発明のＤＮＡ断片は特に、一価の陽イオンを含む塩（例えば、ＮａＣｌ，ＬｉＣｌ，ＫＣｌ）に対して高い耐性を有する。   “Salt” is a general term for compounds formed in such a way that a cation and an anion neutralize charges (Iwanami Physics and Chemistry Dictionary 5th edition, 280 pages, Iwanami Shoten (2000)). In the present invention, the type of salt targeted for “salt tolerance” is not limited, but the DNA fragment of the present invention is particularly resistant to salts containing monovalent cations (for example, NaCl, LiCl, KCl). Have.

上記「１または数個の塩基配列が置換、欠失、もしくは付加されている塩基配列」とは、例えば１〜２０個、好ましくは１〜１５個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個の任意の数の塩基配列が置換、欠失、もしくは付加されている塩基配列を意味する。   The “base sequence in which one or several base sequences are substituted, deleted, or added” is, for example, 1 to 20, preferably 1 to 15, more preferably 1 to 10, more preferably It means a base sequence in which 1 to 5 arbitrary numbers of base sequences are substituted, deleted, or added.

また、上記「１または数個のアミノ酸が置換、欠失、もしくは付加されているアミノ酸配列」とは、例えば１〜２０個、好ましくは１〜１５個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個の任意の数のアミノ酸が置換、欠失、もしくは付加されているアミノ酸配列を意味する。   In addition, the above-mentioned “amino acid sequence in which one or several amino acids are substituted, deleted, or added” is, for example, 1 to 20, preferably 1 to 15, more preferably 1 to 10, more preferably. Means an amino acid sequence in which any number of 1 to 5 amino acids are substituted, deleted, or added.

例えば、１もしくは数個の塩基が置換、欠失、もしくは付加されているＤＮＡ（変異ＤＮＡ）は、化学合成法、遺伝子工学的手法、突然変異誘発法などの当業者に既知の任意の方法により作製することができる。具体的には、配列番号１に示される塩基配列を含むＤＮＡ断片に対して、変異原となる薬剤と接触作用させる方法、紫外線を照射させる方法、遺伝子工学的な手法（例えば、部位特異的変異誘発法、制限酵素による切断、エキソヌクレアーゼによる消化）などを用いて、ＤＮＡ断片に変異を導入することにより、変異ＤＮＡを得ることができる。   For example, DNA (mutant DNA) in which one or several bases are substituted, deleted, or added can be obtained by any method known to those skilled in the art such as chemical synthesis, genetic engineering, and mutagenesis. Can be produced. Specifically, a method of contacting a DNA fragment comprising the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 with a mutagen agent, a method of irradiating with ultraviolet rays, a genetic engineering method (for example, site-specific mutation) Mutant DNA can be obtained by introducing a mutation into a DNA fragment using an induction method, restriction enzyme digestion, exonuclease digestion, or the like.

遺伝子工学的手法の一つである部位特異的変異誘発法は、特定の位置に特定の変異を導入できる手法であることから有用であり、Molecular Cloning: A laboratory Mannual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY., 1989.（以下、「モレキュラークローニング第２版」と略す。）、Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1〜38, John Wiley & Sons（1987-1997）などに記載の方法に準じて行なうことができる。この変異ＤＮＡを適切な発現系を用いて発現させることにより、１または数個のアミノ酸が置換、欠失、もしくは付加されているアミノ酸配列を有するタンパク質を得ることができる。 Site-directed mutagenesis method which is one of genetic engineering techniques, is useful as it is a method capable of introducing a specific mutation into a specific position, Molecular Cloning:. A laboratory Mannual , 2 nd Ed, Cold Spring Described in Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY., 1989. (hereinafter abbreviated as "Molecular Cloning 2nd Edition"), Current Protocols in Molecular Biology, Supplements 1-38, John Wiley & Sons (1987-1997), etc. It can be performed according to the method. By expressing this mutant DNA using an appropriate expression system, a protein having an amino acid sequence in which one or several amino acids are substituted, deleted, or added can be obtained.

上記「配列番号１、２、および３のいずれかにより表される塩基配列と７０％以上の同一性を有する塩基配列」とは、配列番号１、２、および３のいずれかにより表される塩基配列との相同性が７０％であれば特に制限されるものではなく、例えば、７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上であることを意味する。   The “base sequence having 70% or more identity with the base sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 1, 2, and 3” is the base represented by any one of SEQ ID NOs: 1, 2, and 3. There is no particular limitation as long as the homology with the sequence is 70%. For example, 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more, still more preferably 95% or more, and particularly preferably 98%. As mentioned above, it means that it is 99% or more most preferably.

本発明において、塩基配列の相同性は、当該技術分野において知られている相同性検索アルゴリズムを利用して決定することができる。このようなアルゴリズムとしては、ＢＬＡＳＴが挙げられ、その使用方法は当業者によく知られている。   In the present invention, the homology of the base sequence can be determined using a homology search algorithm known in the art. An example of such an algorithm is BLAST, and its usage is well known to those skilled in the art.

また、上記「配列番号４、５、および６のいずれかにより表されるアミノ酸配列と７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列」とは、配列番号４、５、および６のいずれかにより表されるアミノ酸配列との相同性が７０％であれば特に制限されるものではなく、例えば、７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上であることを意味する。   In addition, the “amino acid sequence having 70% or more identity with the amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 4, 5, and 6” is represented by any one of SEQ ID NOs: 4, 5, and 6. There is no particular limitation as long as the homology with the amino acid sequence is 70%, for example, 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more, still more preferably 95% or more, particularly preferably. It means 98% or more, most preferably 99% or more.

上記本発明の配列番号１に示される塩基配列またはその相補的配列の一部もしくは全部を含み、かつ、耐塩性向上活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含むＤＮＡ断片としては、例えば、配列番号７で表される塩基配列またはその相補的配列を含むＤＮＡを具体的に例示することができる。   Examples of the DNA fragment containing the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 of the present invention or a part or all of its complementary sequence and containing a base sequence encoding a protein having an activity of improving salt tolerance include, for example, SEQ ID NO: Specific examples of the DNA include the base sequence represented by 7 or a complementary sequence thereof.

上記「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ断片」とは、ＤＮＡまたはＲＮＡなどの核酸をプローブとして使用し、例えば、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法、サザンブロットハイブリダイゼーション法などの公知の方法を用いて得られるＤＮＡ断片をいい、具体的には、コロニーまたはプラーク由来のＤＮＡ断片が固定化されたフィルターを用いて、０．７〜１．０ＭのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行なった後、０．１〜２倍程度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液は、１５０ｍＭ塩化ナトリウムおよび１５ｍＭクエン酸ナトリウムを含む。）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるＤＮＡを挙げることができる。ハイブリダイゼーションは、モレキュラークローニング第２版などに記載されている方法に準じて行なうことができる。   The above-mentioned “DNA fragment that hybridizes under stringent conditions” uses a nucleic acid such as DNA or RNA as a probe, and is known, for example, a colony hybridization method, a plaque hybridization method, a Southern blot hybridization method, etc. Specifically, the DNA fragment obtained by using the above-mentioned method, specifically, using a filter on which a DNA fragment derived from a colony or a plaque was immobilized, in the presence of 0.7 to 1.0 M NaCl at 65 ° C. After hybridization, the filter is washed under conditions of 65 ° C. using an SSC solution of about 0.1 to 2 times (a 1-fold concentration SSC solution contains 150 mM sodium chloride and 15 mM sodium citrate). DNAs that can be identified by: Hybridization can be performed according to the method described in Molecular Cloning 2nd edition.

例えば、ストリンジェントな条件でハイブリダイズすることができるＤＮＡ断片としては、プローブとして使用可能なＤＮＡ断片の塩基配列と一定以上の相同性を有するＤＮＡを挙げることができ、例えば７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の相同性を有するＤＮＡ断片を好適に例示することができる。   For example, the DNA fragment that can hybridize under stringent conditions can include DNA having a certain degree of homology with the base sequence of a DNA fragment that can be used as a probe, for example, 70% or more, preferably A DNA fragment having a homology of 80% or more, more preferably 90% or more, further preferably 95% or more, particularly preferably 98% or more, and most preferably 99% or more can be suitably exemplified.

なお、本発明のＤＮＡ断片は、配列番号１、２、または３に表される塩基配列またはその一部を有するＤＮＡ断片を使用し、他の生物体などにより、該ＤＮＡのホモログを適当な条件下でスクリーニングすることにより単離することができるほか、上述の変異ＤＮＡの作製方法によっても調製することができる。   As the DNA fragment of the present invention, a DNA fragment having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1, 2, or 3 or a part thereof is used, and the homologue of the DNA is subjected to appropriate conditions by other organisms. In addition to being isolated by screening below, it can also be prepared by the above-described method for producing mutant DNA.

上記本発明のＤＮＡ断片およびタンパク質を用いることにより、動物および植物ならびにこれらの組織、器官、細胞、ならびに細菌、酵母、カビなどの微生物の耐塩性を向上させることができる。   By using the above-described DNA fragment and protein of the present invention, the salt tolerance of animals and plants and their tissues, organs, cells, and microorganisms such as bacteria, yeasts and molds can be improved.

１．２．耐塩性向上活性を有するＤＮＡ断片のスクリーニング方法
本発明の耐塩性向上活性を有するＤＮＡ断片のスクリーニング方法は、（i）カイメン（stylissa massa）の共在微生物から複数のＤＮＡ断片を抽出すること、（ii）前記複数のＤＮＡ断片がそれぞれ挿入された複数の発現ベクターを作製することにより、ライブラリを構築すること、および、（iii）前記複数の発現ベクターを宿主細胞に導入し、該宿主細胞を塩ストレス性条件下で培養することにより、耐塩性向上活性を有するクローンを選択すること、を含む。 1.2. Screening Method for DNA Fragment Having Salt Tolerance Improvement Activity The method for screening a DNA fragment having salt tolerance improvement activity according to the present invention comprises: (i) extracting a plurality of DNA fragments from a coexisting microorganism of stylissa massa ; ii) constructing a library by preparing a plurality of expression vectors into which the plurality of DNA fragments are respectively inserted; and (iii) introducing the plurality of expression vectors into a host cell, Selecting a clone having a salt tolerance-enhancing activity by culturing under stress conditions.

カイメンの共在微生物（例えばバクテリア）から抽出されたＤＮＡ断片には、耐塩性向上活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む遺伝子ＤＮＡが含まれている。   A DNA fragment extracted from a sponge coexisting microorganism (for example, a bacterium) contains a gene DNA containing a base sequence encoding a protein having an activity of improving salt tolerance.

（i）カイメンの共在バクテリアから複数のＤＮＡ断片を抽出する方法としては、例えば、カイメンから組織および核を除去することにより、カイメン共在バクテリアを回収した後、該バクテリアを溶解して粗製ＤＮＡを得、この粗製ＤＮＡを公知の方法にて精製することにより、複数のＤＮＡ断片を得る方法が挙げられる。なお、必要に応じて、回収されたＤＮＡを制限酵素または物理的に適当な長さに断片化してもよい。   (I) As a method for extracting a plurality of DNA fragments from a sponge commensal bacterium, for example, by removing tissues and nuclei from the sponge, the sponge symbiotic bacterium is recovered, and then the bacterium is dissolved to obtain a crude DNA. And a method of obtaining a plurality of DNA fragments by purifying the crude DNA by a known method. If necessary, the recovered DNA may be fragmented into restriction enzymes or physically appropriate lengths.

（ii）前記複数のＤＮＡ断片がそれぞれ挿入された複数の発現ベクターを作製することにより、ライブラリを構築する際に用いる発現ベクターとしては、例えば、プラスミド、フォスミド、ファージ（例えばλファージ）、コスミド、ＢＡＣ、ＹＡＣが挙げられる。ここで使用される発現ベクターとしては、具体的には、本発明の発現ベクターとして後述するものを使用することができる。   (Ii) Examples of expression vectors used for constructing a library by preparing a plurality of expression vectors into which the plurality of DNA fragments are inserted include plasmids, fosmids, phages (for example, λ phages), cosmids, BAC, YAC are mentioned. As the expression vector used here, specifically, those described later as the expression vector of the present invention can be used.

フォスミドを用いたライブラリの構築は、例えば、コピー・コントロール・フォスミド・ライブラリ・プロダクション・キット（Copy Control Fosmid Library Prodution Kit（EPICENTRE社））を用いて行なうことができる（EPICENTRE社のカタログNo．CCFOS110参照）。このキットを用いてライブラリを構築する場合、例えば、上述の方法で得られたカイメン共在バクテリアから抽出された精製ＤＮＡに対して平滑末端化処理を行ない、必要に応じて、回収されたＤＮＡをより短い断片に切断した後、パルスフィールド電気泳動により30-50kbpのＤＮＡ断片を回収し、次いで、このＤＮＡ断片を発現ベクター（コピーコントロール（CopyControl）pCC1FOS（商標）フォスミド）に導入して、前記ＤＮＡ断片が導入された発現ベクターを得る。次いで、この発現ベクターを形質転換大腸菌に導入することにより、カイメンに共在するバクテリアのメタゲノムライブラリを構築することができる。発現ベクターを形質転換大腸菌に導入する方法としては、後述する公知の方法を用いることができる。ここで、「メタゲノム」とは、微生物が生育する環境から培養を経ないで回収された微生物のゲノムをいう。   The construction of a library using a fosmid can be performed using, for example, a Copy Control Fosmid Library Production Kit (EPICENTRE) (see catalog No. CCFOS110 of EPICENTRE). ). When constructing a library using this kit, for example, the purified DNA extracted from the sponge coexisting bacteria obtained by the above-mentioned method is subjected to blunt end treatment, and the recovered DNA is recovered as necessary. After cutting into shorter fragments, a 30-50 kbp DNA fragment was recovered by pulse field electrophoresis, and then this DNA fragment was introduced into an expression vector (CopyControl pCC1FOS ™ fosmid) to An expression vector into which the fragment has been introduced is obtained. Subsequently, by introducing this expression vector into transformed Escherichia coli, a bacterial metagenomic library coexisting with sponge can be constructed. As a method for introducing the expression vector into the transformed Escherichia coli, a known method described later can be used. Here, the “metagenome” refers to the genome of a microorganism collected without culturing from the environment where the microorganism grows.

（iii）前記複数の発現ベクターを宿主細胞に導入し、該宿主細胞を塩ストレス性条件下で培養することにより、耐塩性向上活性を有するクローンを選択する方法においては、例えば、発現ベクターとして上述のフォスミドを使用し、かつ、宿主細胞として微生物細胞（例えば大腸菌）を使用することができる。   (Iii) In a method for selecting a clone having salt-tolerant activity by introducing the plurality of expression vectors into a host cell and culturing the host cell under a salt-stressing condition, for example, the expression vector is described above. And microbial cells (for example, E. coli) can be used as host cells.

この場合、前記複数のＤＮＡ断片がそれぞれ挿入された複数のフォスミドを大腸菌に導入し、この大腸菌を塩ストレス性条件下で培養することにより、耐塩性向上活性を有するクローンを選択することができる。ここで、塩ストレス性条件とは、その宿主細胞の通常の成育条件の塩濃度よりも高い塩濃度条件のことをいい、その塩濃度は特に限定されない。より具体的には、大腸菌の生育用培地に所定量の塩を添加することにより、塩ストレス性条件を設定することができる。また、この塩ストレス性条件下で大腸菌を培養することにより、該大腸菌が塩ストレス性向上活性を有するか否かを判断することができる。   In this case, clones having salt-tolerant activity can be selected by introducing a plurality of fosmids into which the plurality of DNA fragments are inserted into E. coli and culturing the E. coli under salt stress conditions. Here, the salt stress property refers to a salt concentration condition higher than the salt concentration of the normal growth condition of the host cell, and the salt concentration is not particularly limited. More specifically, the salt stress condition can be set by adding a predetermined amount of salt to the growth medium for Escherichia coli. In addition, by culturing Escherichia coli under the salt stress condition, it can be determined whether or not the Escherichia coli has a salt stress enhancing activity.

耐塩性向上活性を有するクローンの選択は例えば、目視による方法、細胞内の塩濃度を測定する方法（例えば、McLaggan D, Naprstek J, Buurman ET, Epstein W. 1994. Interdependence of K+ and Glutamate Accumulation during Osmotic Adaptation of Escherichia coli. J. Bacteriol. 269:1911-1917参照）、あるいはこれらの組み合わせにより行なうことができる。   Selection of clones having salt tolerance enhancing activity includes, for example, a visual method, a method of measuring intracellular salt concentration (for example, McLaggan D, Naprstek J, Buurman ET, Epstein W. 1994. Interdependence of K + and Glutamate Accumulation during Osmotic Adaptation of Escherichia coli. J. Bacteriol. 269: 1911-1917), or a combination thereof.

より具体的には、上述の方法で得られた耐塩性向上活性を有するクローンに挿入された配列をシーケンスし、該配列をＰＣＲ、もしくは適当な制限酵素で処理することにより、適当な制限酵素で処理することにより、耐塩性向上活性を有するＤＮＡ断片を得、このＤＮＡ断片を発現ベクターに導入し、該発現ベクターを宿主細胞に導入して得られた形質転換体について、上述の細胞内の塩濃度を測定する方法にて耐塩性を評価することにより、耐塩性向上活性を有するクローンを選択することができる。   More specifically, a sequence inserted into the clone having the salt tolerance improving activity obtained by the above-described method is sequenced, and the sequence is treated with PCR or an appropriate restriction enzyme, whereby an appropriate restriction enzyme is used. By processing, a DNA fragment having a salt tolerance improving activity is obtained, the DNA fragment is introduced into an expression vector, and the transformant obtained by introducing the expression vector into a host cell is subjected to the aforementioned intracellular salt. By evaluating the salt tolerance by a method of measuring the concentration, a clone having a salt tolerance improving activity can be selected.

本発明の耐塩性向上活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ断片は、上述のスクリーニング方法によって得られた耐塩性向上活性を有するクローンを適当な制限酵素で処理することにより得ることができる。   The DNA fragment encoding the protein having the salt tolerance improving activity of the present invention can be obtained by treating the clone having the salt tolerance improving activity obtained by the above screening method with an appropriate restriction enzyme.

１．３．タンパク質の取得および調製方法
本発明のタンパク質はまた、天然由来の単離されたタンパク質、化学合成されたタンパク質、および遺伝子組み換え技術により作製された組み換えタンパク質のいずれでもよい。 1.3. Methods for Obtaining and Preparing Proteins The protein of the present invention may also be any isolated protein derived from nature, chemically synthesized protein, and recombinant protein produced by genetic engineering techniques.

天然由来の単離されたタンパク質を取得する場合、かかるタンパク質を発現している細胞または組織からタンパク質の単離および精製方法を適宜組み合わせることにより、本発明のタンパク質を取得することができる。   When obtaining an isolated protein derived from nature, the protein of the present invention can be obtained by appropriately combining isolation and purification methods of the protein from cells or tissues expressing such protein.

化学合成によりタンパク質を調製する場合、例えば、Fmoc法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、tBoc法（t-ブチルオキシカルボニル法）などの化学合成法にしたがって、本発明のタンパク質を合成することができる。また、各種の市販のペプチド合成機を利用して、本発明のタンパク質を合成することもできる。   When a protein is prepared by chemical synthesis, for example, the protein of the present invention can be synthesized according to a chemical synthesis method such as Fmoc method (fluorenylmethyloxycarbonyl method) or tBoc method (t-butyloxycarbonyl method). it can. In addition, the protein of the present invention can be synthesized using various commercially available peptide synthesizers.

遺伝子組換え技術によりタンパク質を調製する場合、タンパク質をコードする塩基配列を含むＤＮＡ断片を好適な発現系に導入することにより、本発明のタンパク質を調製することができる。   When a protein is prepared by a gene recombination technique, the protein of the present invention can be prepared by introducing a DNA fragment containing a base sequence encoding the protein into a suitable expression system.

これらの中でも、比較的容易な操作でかつ大量に調製することが可能である点で、遺伝子組換え技術による調製が好ましい。   Among these, preparation by a gene recombination technique is preferable in that it can be prepared in a large amount by a relatively easy operation.

本発明のＤＮＡ断片は、組換えタンパク質の調製に利用することができる。組換えタンパク質の調製は、上記本発明のＤＮＡ断片を適当な発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを適当な宿主細胞に導入して形質転換体を作製し、次いで、この形質転換体を培養して、発現したタンパク質を該形質転換体またはその培養上清から回収することにより行なうことができる。   The DNA fragment of the present invention can be used for the preparation of a recombinant protein. The recombinant protein is prepared by inserting the DNA fragment of the present invention into an appropriate expression vector, introducing the expression vector into an appropriate host cell to produce a transformant, and then culturing the transformant. The expressed protein can be recovered from the transformant or its culture supernatant.

遺伝子組み換え技術により本発明のタンパク質を製造する場合、形質転換細菌、形質転換酵母、形質転換植物細胞などの形質転換体を培養し、該形質転換体またはその培養液の上清から回収する方法を用いることができる。   When the protein of the present invention is produced by a genetic recombination technique, a method for culturing a transformant such as a transformed bacterium, transformed yeast, or transformed plant cell and recovering the transformant or the supernatant of the culture solution, Can be used.

また、遺伝子組換え技術によって本発明のタンパク質を調製する場合、かかるタンパク質を細胞培養物から回収し精製するためには、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、酸抽出、アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー、およびレクチンクロマトグラフィーなどの公知の方法（好ましくは高速液体クロマトグラフィー）が用いられる。特に、アフィニティークロマトグラフィーに用いられるカラムとしては、例えば、本発明のタンパク質に対するモノクローナル抗体などの抗体を結合させたカラムや、上記本発明のタンパク質に通常のペプチドタグを付加した場合、このペプチドタグに親和性のある物質を結合させたカラムを用いることにより、これらのタンパク質の精製物を得ることができる。また、本発明のタンパク質が細胞膜に発現している場合、細胞膜分解酵素を作用させた後、上記の精製処理を行なうことにより、精製標品を得ることができる。   In addition, when the protein of the present invention is prepared by gene recombination technology, ammonium sulfate or ethanol precipitation, acid extraction, anion or cation exchange chromatography, phosphocellulose chromatography can be used to recover and purify the protein from the cell culture. , Known methods (preferably high performance liquid chromatography) such as hydrophobic interaction chromatography, affinity chromatography, hydroxyapatite chromatography, and lectin chromatography are used. In particular, as a column used for affinity chromatography, for example, a column in which an antibody such as a monoclonal antibody against the protein of the present invention is bound, or when a normal peptide tag is added to the protein of the present invention, the peptide tag By using a column to which a substance having affinity is bound, purified products of these proteins can be obtained. In addition, when the protein of the present invention is expressed in the cell membrane, a purified preparation can be obtained by carrying out the above purification treatment after allowing the cell membrane degrading enzyme to act.

さらに、配列番号４、５、および６のいずれかにより表されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が置換、欠失、もしくは付加されているアミノ酸配列を有し、かつ耐塩性向上活性を有するタンパク質、あるいは、配列番号４、５、および６のいずれかにより表されるアミノ酸配列と７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ耐塩性向上活性を有するタンパク質は、配列番号１、２、および３のいずれかにより表される塩基配列に基づいて、当業者が適宜調製または取得することができる。   Furthermore, the amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 4, 5, and 6 has an amino acid sequence in which one or several amino acids are substituted, deleted, or added, and has an activity of improving salt tolerance. Or a protein having an amino acid sequence having 70% or more identity with the amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 4, 5, and 6 and having a salt tolerance improving activity is SEQ ID NO: 1. Those skilled in the art can appropriately prepare or obtain the base sequence represented by any one of 2 and 3.

例えば、配列番号１に示される塩基配列またはその一部を有するＤＮＡ断片をプローブとして、カイメン共在微生物以外の生物より、該ＤＮＡ断片のホモログを適当な条件下でスクリーニングすることにより、ホモログＤＮＡを単離することができる。このホモログＤＮＡの全長ＤＮＡをクローニングした後、発現ベクターに組み込み、適当な宿主細胞で発現させることにより、該ホモログＤＮＡによりコードされるタンパク質を製造することができる。   For example, by using a DNA fragment having the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 or a part thereof as a probe and screening a homologue of the DNA fragment from an organism other than the sponge coexisting microorganism under appropriate conditions, It can be isolated. After cloning the full-length DNA of this homolog DNA, the protein encoded by the homolog DNA can be produced by incorporating it into an expression vector and expressing it in an appropriate host cell.

上記本発明のタンパク質とマーカータンパク質および／またはペプチドタグとを結合させることにより、融合タンパク質を作製することもできる。ここで、マーカータンパク質としては、従来知られているマーカータンパク質であれば特に制限されるものではなく、例えば、アルカリフォスファターゼ、ＨＲＰなどの酵素、抗体のＦｃ領域、ＧＦＰなどの蛍光物質などを具体的に挙げることができる。また、ペプチドタグとしては、ＨＡ，ＦＬＡＧ，Ｍｙｃなどのエピトープタグや、ＧＳＴ、マルトース結合タンパク質、ビオチン化ペプチド、オリゴヒスチジンなどの親和性タンパク質などを具体的に挙げることができる。かかる融合タンパク質は、常法により作製することができ、Ｎｉ−ＮＴＡとＨｉｓタグとの親和性を利用したタンパク質精製および検出、ならびに、本発明のタンパク質に対する抗体の定量や、その他当該分野の研究用試薬としても有用である。   A fusion protein can also be prepared by binding the protein of the present invention to a marker protein and / or a peptide tag. Here, the marker protein is not particularly limited as long as it is a conventionally known marker protein. For example, an enzyme such as alkaline phosphatase or HRP, an Fc region of an antibody, a fluorescent substance such as GFP, or the like is specifically used. Can be listed. Specific examples of peptide tags include epitope tags such as HA, FLAG, and Myc, and affinity proteins such as GST, maltose-binding protein, biotinylated peptide, and oligohistidine. Such a fusion protein can be prepared by a conventional method, and is used for protein purification and detection using affinity between Ni-NTA and His tag, quantification of an antibody against the protein of the present invention, and other research in the field. It is also useful as a reagent.

本発明のタンパク質に特異的に結合する抗体を作製することも可能である。かかる抗体としては、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、ヒト化抗体などの免疫特異的な抗体を挙げることができる。この抗体は、配列番号４、５、または６により表されるアミノ酸配列を含むタンパク質、配列番号４、５、または６により表されるアミノ酸配列と相同性が７０％以上のアミノ酸配列からなり、耐塩性向上活性を有するタンパク質、あるいは、配列番号４、５、または６により表されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が置換、欠失、もしくは付加されているアミノ酸配列を有するタンパク質を抗原として用いて作製することができる。これらの抗体は、耐塩性向上活性を有するタンパク質の分子機構を明らかにするうえで有用である。   It is also possible to produce an antibody that specifically binds to the protein of the present invention. Examples of such antibodies include immunospecific antibodies such as monoclonal antibodies, polyclonal antibodies, chimeric antibodies, single chain antibodies, humanized antibodies and the like. This antibody comprises a protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4, 5, or 6, an amino acid sequence having a homology of 70% or more with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4, 5, or 6, A protein having a property-improving activity, or a protein having an amino acid sequence in which one or several amino acids are substituted, deleted, or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4, 5, or 6 as an antigen Can be used. These antibodies are useful for clarifying the molecular mechanism of a protein having a salt tolerance improving activity.

上記耐塩性向上活性を有するタンパク質に対する抗体は、慣用のプロトコルを用いて、動物（好ましくはヒト以外）に耐塩性向上活性を有するタンパク質またはエピトープを含む断片、類似体もしくは細胞を投与することにより産生され、例えば、モノクローナル抗体の調製には、連続細胞系の培養物により産生される抗体をもたらすハイブリドーマ技法（Nature, 256, 494-497, 1975）、トリオーマ技法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技法（Immunology Today, 4, 72, 1983）、およびＥＢＶ−ハイブリドーマ技法（MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, pp.77-96, Alan R.Liss, Inc., 1985）などの任意の技法を用いることができる。   The antibody against the protein having the salt tolerance improving activity is produced by administering a fragment, analog or cell containing the protein or epitope having the salt tolerance improving activity to an animal (preferably, other than human) using a conventional protocol. For example, monoclonal antibodies can be prepared using hybridoma techniques (Nature, 256, 494-497, 1975), trioma techniques, human B cell hybridoma techniques (Immunology Today, 4, 72, 1983) and any technique such as EBV-hybridoma technique (MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, pp. 77-96, Alan R. Liss, Inc., 1985) can be used.

本発明の耐塩性向上活性を有するタンパク質に対する一本鎖抗体を作製するために、一本鎖抗体の調整法（米国特許第4,946,778号）を適用することができる。また、ヒト化抗体を発現させるために、トランスジェニック植物またはトランスジェニック動物などを利用したり、上記抗体を用いて耐塩性向上活性を有するタンパク質を発現するクローンを単離および同定したり、アフィニティークロマトグラフィーでそのポリペプチドを精製することもできる。   In order to produce a single-chain antibody against a protein having the salt tolerance improving activity of the present invention, a method for preparing a single-chain antibody (US Pat. No. 4,946,778) can be applied. In addition, in order to express humanized antibodies, a transgenic plant or a transgenic animal is used, clones that express a protein having a salt tolerance-enhancing activity are isolated and identified using the above antibodies, and affinity chromatography is used. The polypeptide can also be purified graphically.

１．４．発現ベクターおよび形質転換体
本発明の発現ベクターは、上記本発明のＤＮＡ断片を含む。本発明の形質転換体は、上記本発明の発現ベクターを宿主細胞に導入することにより得られる。この場合、前記宿主細胞は微生物細胞（例えば大腸菌）であることができる。また、本発明の形質転換体は、耐塩性向上活性を有する。 1.4. Expression vector and transformant The expression vector of the present invention comprises the above-described DNA fragment of the present invention. The transformant of the present invention can be obtained by introducing the expression vector of the present invention into a host cell. In this case, the host cell can be a microbial cell (eg, E. coli). Moreover, the transformant of the present invention has a salt tolerance improving activity.

宿主細胞への発現ベクターの導入方法としては、当業者に公知の方法（例えば、エレクトロポレーション法、ヒートショック法、マイクロインジェクション、遺伝子銃、例えばλファージなどのバクテリオファージを用いる方法などの公知の方法を用いることができる（遺伝子ライブラリの作製法、羊土社（１９９４）・植物細胞工学入門、学会出版センター（１９９８））。形質転換体を培養して、発現されたタンパク質を回収する方法は、当該技術分野においてよく知られている。また、組換えタンパク質を発現させるための形質転換体の培養は、当業者に一般的に用いられている方法および条件にて行なうことができる。   Methods for introducing an expression vector into a host cell include methods known to those skilled in the art (eg, electroporation, heat shock, microinjection, gene guns, methods using bacteriophages such as λ phage, etc.). (A method for preparing a gene library, Yodosha (1994) / Introduction to Plant Cell Engineering, Academic Publishing Center (1998)) A method for culturing a transformant and recovering an expressed protein is described below. In addition, the transformant for expressing the recombinant protein can be cultured by methods and conditions generally used by those skilled in the art.

本発明の発現ベクターとしては、本発明のＤＮＡ断片を含み、かつ耐塩性向上活性を有するタンパク質を発現することができる発現ベクターであれば特に限定されない。本発明の発現ベクターは、本発明のＤＮＡ断片を適切にインテグレイトすることにより構築することができる。かかる発現ベクターとしては、宿主細胞において自立複製可能であるもの、あるいは、宿主細胞の染色体中に組み込み可能であるものが好ましい。また、本発明のＤＮＡ断片を発現できる位置に、プロモータ、エンハンサー、ターミネータなどの制御配列を含有しているものを好適に使用することができる。   The expression vector of the present invention is not particularly limited as long as it is an expression vector that can express a protein having the DNA fragment of the present invention and having a salt tolerance improving activity. The expression vector of the present invention can be constructed by appropriately integrating the DNA fragment of the present invention. Such an expression vector is preferably one that can replicate autonomously in the host cell or one that can be integrated into the chromosome of the host cell. Moreover, what contains control sequences, such as a promoter, an enhancer, a terminator, in the position which can express the DNA fragment of this invention can be used conveniently.

本発明の発現ベクターとしては、例えば、細菌用発現ベクター、酵母用発現ベクター、植物細胞用発現ベクターが挙げられ、このうち細菌用発現ベクターがより好ましい。   Examples of the expression vector of the present invention include bacterial expression vectors, yeast expression vectors, and plant cell expression vectors. Among these, bacterial expression vectors are more preferred.

細菌用の発現ベクターとしては、例えば、コピーコントロール（CopyControl）pCC1FOS（商標）ベクター、λファージ、Ｍ１３ファージ、λＺＡＰII、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ＰＥＴ、ｐＢＴＴｒＰ２，ｐＢＴａｃ１，ｐＢＴａｃ２（いずれもベーリンガーマンハイム社製）、ｐＫＫ２３３−２（ファルマシア社製）,ｐＳＥ２８０（インビトロジェン社製）,ｐＧＥＭＥＸ−１（プロメガ社製）,ｐＱＥ−８（キアゲン社製）,ｐＱＥ−３０（キアゲン社製）,ｐＫＹＰ１０（特開昭58-110600）,ｐＫＹＰ２００（Agric. Biol. Chem., 48, 669(1994)）,ＰＬＳＡ１（Agric. Biol. Chem., 53, 277(1989)），ｐＧＥＬ１（Prod. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 4306(1985)），ｐＴＰ５，ｐＣ１９４，ｐＵＣ１８（Gene, 33, 103(1985)），ｐＵＣ１９（Gene, 33, 103(1985)），ｐＳＴＶ２８（宝酒造社製），ｐＳＴＶ２９（宝酒造社製）を挙げることができる。細菌用のプロモータとしては、例えば、ｔｒｐプロモータ（Ｐｔｒｐ）、ｌａｃプロモータ（Ｐｌａｃ）、ＰＬプロモータ、ＰＲプロモータ、ＰＳＥプロモータなどの大腸菌やファージなどに由来するプロモータ、ＳＰ０１プロモータ、ＳＰ０２プロモータ、ｐｅｎＰプロモータなどを挙げることができる。   Examples of the expression vector for bacteria include a copy control pCC1FOS ™ vector, λ phage, M13 phage, λZAPII, pBluescript, PET, pBTTrP2, pBTac1, and pBTac2 (both manufactured by Boehringer Mannheim), pKK233-2 (Manufactured by Pharmacia), pSE280 (manufactured by Invitrogen), pGEMEX-1 (manufactured by Promega), pQE-8 (manufactured by Qiagen), pQE-30 (manufactured by Qiagen), pKYP10 (Japanese Patent Laid-Open No. 58-110600), pKYP200 (Agric. Biol. Chem., 48, 669 (1994)), PLSA1 (Agric. Biol. Chem., 53, 277 (1989)), pGEL1 (Prod. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 4306 ( 1985)), pTP5, pC194, pUC18 (Gene, 33, 103 (1985)), pUC19 (Gene, 33, 103 (1985)), pSTV28 (Takara Shuzo), pS V29 can be mentioned (Takara Shuzo Co., Ltd.). Examples of promoters for bacteria include trp promoter (Ptrp), lac promoter (Plac), PL promoter, PR promoter, PSE promoter and other promoters derived from E. coli and phage, SP01 promoter, SP02 promoter, penP promoter and the like. Can be mentioned.

また、これらのプロモータを用いて、本発明のＤＮＡ断片を葉緑体移行シグナルやミトコンドリア移行シグナルとの融合タンパク質として形質転換体内に発現させることも本発明に含まれる。   In addition, expression of the DNA fragment of the present invention as a fusion protein with a chloroplast transfer signal or a mitochondrial transfer signal using these promoters is also included in the present invention.

酵母用の発現ベクターとしては、例えば、ｐＹＥＳ２（インビトロジェン社），ＹＥｐ１３（ＡＴＣＣ３７１１５），ＹＥｐ２４（ＡＴＣＣ３７０５１），Ｙｃｐ５Ｏ（ＡＴＣＣ３７４１９），ｐＨＳ１９，ｐＨＳ１５などを例示することができる。酵母用のプロモータとしては、例えば、ＰＨＯ５プロモータ、ＰＧＫプロモータ、ＧＡＰプロモータ、ＡＤＨプロモータ、ｇａｌ１プロモータ、ｇａｌ１０プロモータ、ヒートショックタンパク質プロモータ、ＭＦα１プロモータ、ＣＵＰ１プロモータなどのプロモータを例示することができる。   Examples of the expression vector for yeast include pYES2 (Invitrogen), YEp13 (ATCC37115), YEp24 (ATCC37051), Ycp5O (ATCC37419), pHS19, pHS15 and the like. Examples of the promoter for yeast include promoters such as PHO5 promoter, PGK promoter, GAP promoter, ADH promoter, gal1 promoter, gal10 promoter, heat shock protein promoter, MFα1 promoter, and CUP1 promoter.

植物細胞用の発現ベクターとしては、Ｔｉプラスミド（Tumor inducing plasmid）、ｐＳＰＯＲＴ１、ｐＴ７Ｂｌｕｅ-Ｔベクター、ｐＩＧ１２１−Ｈｍ（Plant Cell Report, 15, 809-814(1995)）、ｐＢＩ１２１（EMBO J. 6, 3901-3907(1987)）などのプラスミド、あるいは、タバコモザイクウイルス、カリフラワーモザイクウイルス、ジェミニウイルスなどの植物ウイルスベクターなどを例示することができる。植物細胞用のプロモータとしては、例えば、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモータ（Mol. Gen. Genet (1990) 220, 389-392）、ルブロースビスフォスフェートカルボキシラーゼスモールサブユニットプロモータなどを挙げることができ、ターミネータとしては、例えばノパリン合成酵素遺伝子のターミネータを挙げることができる。   As expression vectors for plant cells, Ti plasmid (Tumor inducing plasmid), pSPORT1, pT7Blue-T vector, pIG121-Hm (Plant Cell Report, 15, 809-814 (1995)), pBI121 (EMBO J. 6, 3901). -3907 (1987)) or plant virus vectors such as tobacco mosaic virus, cauliflower mosaic virus, and gemini virus. Examples of promoters for plant cells include cauliflower mosaic virus 35S promoter (Mol. Gen. Genet (1990) 220, 389-392), lubros bisphosphate carboxylase small subunit promoter and the like. Can include, for example, the terminator of the nopaline synthase gene.

また、本発明の形質転換体としては、上記本発明の発現ベクターが導入され、かつ少なくとも耐塩性向上活性を有するタンパク質を発現するものであれば特に制限されない。本発明の形質転換体としては、特に限定されないが、例えば、形質転換細菌、形質転換植物細胞、形質転換動物細胞、形質転換酵母を挙げることができ、このうち、形質転換細胞（例えば大腸菌）、形質転換酵母、形質転換植物細胞を形質転換体として好適に例示することができる。これらの形質転換体は、アミノ酸生産などの各種の微生物産業に好適に応用することができる。   In addition, the transformant of the present invention is not particularly limited as long as the expression vector of the present invention is introduced and at least a protein having an activity of improving salt tolerance is expressed. Although it does not specifically limit as a transformant of this invention, For example, a transformed bacterium, a transformed plant cell, a transformed animal cell, a transformed yeast can be mentioned, Among these, a transformed cell (for example, E. coli), A transformed yeast or a transformed plant cell can be preferably exemplified as a transformant. These transformants can be suitably applied to various microbial industries such as amino acid production.

２．実施例
以下に、実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。 2. EXAMPLES Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to examples, but the present invention is not limited to these examples.

２．１．メタゲノムライブラリの作製
沖縄県石垣島で採取したカイメン（Stylissa massa）を、TENバッファー（3.5％ NaCl，EDTA・2Na（50 mM）， Trisバッファー（10 mM），pH7.5）を加えて破砕し、カイメンの組織および核を除去するために、700Ｇで5分間遠心分離を行ない、上清を回収した。回収した溶液は、さらに7000Ｇで20分間遠心分離を行ない、その沈殿をTENバッファーで３回洗浄して、カイメン共在バクテリアを回収した。 2.1. Preparation of metagenomic library Stylissa massa collected in Ishigaki Island, Okinawa Prefecture, was crushed by adding TEN buffer (3.5% NaCl, EDTA · 2Na (50 mM), Tris buffer (10 mM), pH 7.5), To remove sponge tissues and nuclei, centrifugation was performed at 700 G for 5 minutes, and the supernatant was collected. The collected solution was further centrifuged at 7000 G for 20 minutes, and the precipitate was washed three times with TEN buffer to recover sponge-coexisting bacteria.

次に、カイメン共在バクテリアからのＤＮＡ抽出および精製を以下の方法で行った。回収されたカイメン共在バクテリアは、リゾチーム（100 mg）、プロテイナーゼＫ（20 mg）、Rnase（10 mg）を含むTEバッファー（Trisバッファー（10 mM），E DTA（1 mM），pH7.6）2mLに懸濁し、37℃で30分間インキュベートし、2倍量のGESバッファー（60％ グアニジンチオシアネート，EDTA（10 mM），0.5％サルコシル）を加え、穏やかに攪拌することで細胞を溶解し、氷上に移した。   Next, DNA extraction and purification from the sponge coexisting bacteria were performed by the following method. Collected sponge coexisting bacteria are lysozyme (100 mg), proteinase K (20 mg), TE buffer containing Rnase (10 mg) (Tris buffer (10 mM), EDTA (1 mM), pH 7.6) Suspend in 2 mL, incubate at 37 ° C for 30 min, add 2 volumes of GES buffer (60% guanidine thiocyanate, EDTA (10 mM), 0.5% sarkosyl), lyse cells by gentle agitation, and on ice Moved to.

次に、1/3量の7.5Mの酢酸アンモニウムを加えて穏やかに攪拌した後、1/10量のCTAB（cetyl trimethyl ammonium bromide）を加え、65℃で１時間インキュベートし、ＤＮＡを抽出した。さらにフェノール／クロロホルム抽出法および塩化セシウム密度勾配法による精製をそれぞれ２回行なうことにより、カイメン共在バクテリアから抽出された精製ＤＮＡを得た。   Next, 1/3 amount of 7.5 M ammonium acetate was added and gently stirred, and then 1/10 amount of CTAB (cetyl trimethyl ammonium bromide) was added and incubated at 65 ° C. for 1 hour to extract DNA. Further, the purified DNA extracted from the sponge coexisting bacteria was obtained by performing the purification by the phenol / chloroform extraction method and the cesium chloride density gradient method twice.

次いで、カイメンに共在するバクテリアのメタゲノムライブラリを構築した。メタゲノムライブラリの構築は、コピー・コントロール・フォスミド・ライブラリ・プロダクション・キット（Copy Control Fosmid Library Prodution Kit（EPICENTRE社））を用いて以下の方法で行った（EPICENTRE社のカタログNo．CCFOS110参照）。   Next, a bacterial metagenomic library coexisting with sponge was constructed. The metagenomic library was constructed by the following method using a copy control Fosmid library production kit (EPICENTRE) (see catalog No. CCFOS110 of EPICENTRE).

具体的には、上述の方法で得られたカイメン共在バクテリアから抽出された精製ＤＮＡに対して、前記キットに付属のエンド・リペア・エンザイム・ミックス（End Repair Enzyme Mix）を用いて平滑末端化処理を行なった後、1％ 低融点アガロースゲルを用いたパルスフィールド電気泳動により、35-50kbpのＤＮＡ断片を回収した。次に、前記キットのプロトコルにしたがって、コピーコントロール（CopyControl）pCC1FOS（商標）ベクター（プラスミド）にライゲーションして、フォスミドを得た。次いで、このフォスミドを、前記キットに付属のマックスプラック・ラムダ・パッケージング・エクストラクト（MaxPlax Lambda Packaging Extracts）を用いて形質転換大腸菌（E．coli EPI300）に導入して、カイメンに共在するバクテリアのメタゲノムライブラリを構築した。このライブラリには、約60,000個の独立したクローン（フォスミド）が含まれていた。   Specifically, the purified DNA extracted from the sponge coexisting bacteria obtained by the above method is blunt-ended using the End Repair Enzyme Mix attached to the kit. After the treatment, a 35-50 kbp DNA fragment was recovered by pulse field electrophoresis using a 1% low melting point agarose gel. Next, the fosmid was obtained by ligation to a copy control pCC1FOS ™ vector (plasmid) according to the protocol of the kit. Then, this fosmid is introduced into transformed E. coli (E. coli EPI300) using MaxPlax Lambda Packaging Extracts attached to the kit, and bacteria coexisting with sponges. A metagenomic library was constructed. This library contained approximately 60,000 independent clones (fosmids).

２．２．耐塩性向上活性を有するクローンの選抜
次に、耐塩性向上活性を有するクローンの選抜を以下の方法で行なった。 2.2. Selection of clones having improved salt tolerance activity Next, clones having improved salt tolerance activity were selected by the following method.

塩ストレス条件下（1MのNaClを含む2YT寒天プレート（クロラムフェニコール：12.5μg/ml））に、上述の方法にて各フォスミドが導入された形質転換大腸菌（E．coli EPI300ＴＭ-TiＲ strain）を植菌し、その後の生育を評価した。目視にて、耐塩性が認められた形質転換大腸菌を選別し、選別された形質転換大腸菌からフォスミドを抽出し、これらのフォスミドをそれぞれ大腸菌（E．coli EPI300ＴＭ-TiＲ strain）に再導入した。 Transformed Escherichia coli (E. coli EPI300 ™ -Ti R ) in which each fosmid was introduced by the above-described method under salt stress conditions (2YT agar plate containing 1M NaCl (chloramphenicol: 12.5 μg / ml)) strain) was inoculated and the subsequent growth was evaluated. Visually, it was selected transformed E. coli salt tolerance was observed, and extracted fosmid from sorted transformed E. coli, these fosmid respectively reintroduced into E. coli (E.coli EPI300 TM -Ti R strain) .

再導入により得られた10,000個以上の形質転換大腸菌の耐塩性を検討した結果、わずか１つの形質転換大腸菌（クローンc132B7を含む大腸菌）のみに、顕著な耐塩性が確認された。   As a result of examining the salt tolerance of 10,000 or more transformed Escherichia coli obtained by reintroduction, only one transformed Escherichia coli (E. coli containing clone c132B7) was found to have remarkable salt tolerance.

この形質転換大腸菌（クローンc132B7を含む大腸菌）の全シーケンスを調べた結果、約37KbのＤＮＡ断片がクローニングされていることが確認された。   As a result of examining the entire sequence of this transformed Escherichia coli (E. coli containing clone c132B7), it was confirmed that a DNA fragment of about 37 Kb was cloned.

２．３．クローンc132B7が導入された形質転換大腸菌の耐塩性向上活性の評価
次に、クローンc132B7が導入された形質転換大腸菌がどのような表現型を獲得したかについて、詳細な検討を試みた。 2.3. Evaluation of Salt Tolerance Enhancement Activity of Transformed Escherichia coli Introduced with Clone c132B7 Next, a detailed study was attempted on what phenotype the transformed Escherichia coli introduced with clone c132B7 acquired.

まず、コントロール（empty fosmid vector）と、スクリーニングで得られたフォスミドクローンc132B7とを、それぞれ大腸菌（E．coli EPI300ＴＭ-TiＲ strain）に導入し、得られたコロニーをピックアップして、約５時間前培養し、菌体濃度が2.0-3.0（Ａ６００）になるまで2YT液体培地（クロラムフェニコール：12.5μg/ml、pH 7.6）で前培養した。次に、この培地の初期菌体濃度が0.05（Ａ６００）となるように調整してから、4 mlの前記培地をＬ字管で培養して、生育を評価した。なお、生育の評価には、アドバンテック（Advantec）社のバイオフォトレコーダーを用い、34rpmの振とう速度にて37℃で培養した。その結果を図１（ａ）〜図１（ｇ）に示す。 First, the control (empty fosmid vector) and the fosmid clone c132B7 obtained by screening were introduced into E. coli (E. coli EPI300 ™ -Ti R strain), and the obtained colonies were picked up. The cells were pre-cultured for an hour and pre-cultured in 2YT liquid medium (chloramphenicol: 12.5 μg / ml, pH 7.6) until the bacterial cell concentration reached 2.0-3.0 (A 600 ). Next, after adjusting the initial bacterial cell concentration of this medium to be 0.05 (A 600 ), 4 ml of the medium was cultured in an L-shaped tube to evaluate the growth. For evaluation of growth, a biophoto recorder manufactured by Advantec was used and cultured at 37 ° C. at a shaking speed of 34 rpm. The results are shown in FIGS. 1 (a) to 1 (g).

図１（ａ）〜図１（ｇ）において、横軸は時間（ｈ）を、縦軸は600nmの吸光度（Ａ６００）を示す。600nmの吸光度（Ａ６００）が高いほど、細胞濃度（cell concentration）が高いことを示す。また、図１（ａ）〜図１（ｇ）において、「○」は、フォスミドクローンc132B7が導入された形質転換大腸菌の生育を示し、「●」は、空ベクターが導入された形質転換大腸菌の生育を示す。37℃で通常の2YT培地で生育した形質転換大腸菌は、フォスミドクローンc132B7が導入された形質転換大腸菌および対照の形質転換大腸菌のどちらもほぼ同等な生育を示した（図１（ａ）参照）。 1 (a) to 1 (g), the horizontal axis represents time (h), and the vertical axis represents absorbance at 600 nm (A 600 ). A higher absorbance at 600 nm (A 600 ) indicates a higher cell concentration. In FIGS. 1 (a) to 1 (g), “◯” indicates the growth of transformed E. coli introduced with fosmid clone c132B7, and “●” indicates transformed E. coli introduced with an empty vector. The growth of is shown. The transformed Escherichia coli grown in normal 2YT medium at 37 ° C showed almost the same growth in both the transformed Escherichia coli introduced with fosmid clone c132B7 and the control transformed Escherichia coli (see FIG. 1 (a)). .

また、培地に1.5Mのソルビトールを添加した場合（図１（ｂ）参照）、培地のｐＨを変化させた場合（pH 9の場合，図１（ｃ）参照）、ならびに、培養温度を変化させた場合（培養温度が42℃の場合，図１（ｄ）参照）のいずれにおいても、フォスミドクローンc132B7が導入された形質転換大腸菌の生育および対照の形質転換大腸菌の生育にほとんど差は認められなかった。   In addition, when 1.5M sorbitol was added to the medium (see FIG. 1 (b)), the pH of the medium was changed (in the case of pH 9, see FIG. 1 (c)), and the culture temperature was changed. In both cases (when the culture temperature is 42 ° C., see FIG. 1 (d)), there is almost no difference between the growth of the transformed Escherichia coli introduced with fosmid clone c132B7 and the growth of the control transformed Escherichia coli. There wasn't.

これに対して、培地のNaCl濃度を、通常の2YT培地におけるNaCl濃度（86 mM）から800 mMに変化させた場合（図１（ｅ）参照）、通常の2YT培地にLiClを400mM添加した場合（図１（ｆ）参照）、ならびに、通常の2YT培地にKClを500mM添加した場合（図１（ｇ）参照）、フォスミドクローンc132B7が導入された形質転換大腸菌は、対照の形質転換大腸菌と比較して顕著な生育が認められた。   In contrast, when the NaCl concentration of the medium is changed from the NaCl concentration (86 mM) in the normal 2YT medium to 800 mM (see FIG. 1 (e)), when 400 mM LiCl is added to the normal 2YT medium. (See FIG. 1 (f)), and when 500 mM of KCl is added to a normal 2YT medium (see FIG. 1 (g)), the transformed E. coli introduced with fosmid clone c132B7 is the same as the control transformed E. coli. In comparison, remarkable growth was observed.

以上の結果から、ＤＮＡ断片（132B7）を含むフォスミドクローンc132B7が導入された形質転換大腸菌は、耐塩性（特に１価の塩に対するストレス耐性）の向上活性を有することが確認された。   From the above results, it was confirmed that the transformed Escherichia coli introduced with the fosmid clone c132B7 containing the DNA fragment (132B7) has an activity of improving salt resistance (particularly stress resistance to monovalent salts).

２．４．クローンc132B7が導入された形質転換大腸菌の細胞内ナトリウムイオン含量の評価
次に、フォスミドクローンc132B7が導入された形質転換大腸菌の細胞内ナトリウムイオン含量の評価を行なった。対照として、空ベクターが導入された形質転換体を用いた。培養には、86，400，600，800 mMのNaClを含む2YT液体培地（クロラムフェニコール：12.5μg/ml）を用いた。上述の方法と同様の方法にて、フォスミドクローンc132B7が導入された形質転換大腸菌の培養を行ない、定常期に達した形質転換大腸菌を回収し、上述のMcLagganらの方法にしたがって、細胞内のナトリウムイオン含量（細胞タンパク質当たりのＮａ＋含量）を評価した。すなわち、大腸菌を破砕して、イオンクロマトグラフィーを行なうことにより、細胞タンパク質当たりのＮａ＋含量を求めた。 2.4. Evaluation of intracellular sodium ion content of transformed Escherichia coli introduced with clone c132B7 Next, the intracellular sodium ion content of transformed Escherichia coli introduced with fosmid clone c132B7 was evaluated. As a control, a transformant introduced with an empty vector was used. For the culture, 2YT liquid medium (chloramphenicol: 12.5 μg / ml) containing 86,400,600,800 mM NaCl was used. The transformed E. coli introduced with fosmid clone c132B7 is cultured in the same manner as described above, and the transformed E. coli that has reached the stationary phase is recovered. In accordance with the above-mentioned method of McLaggan et al. Sodium ion content (Na + content per cell protein) was evaluated. That is, Escherichia coli was disrupted and ion chromatography was performed to determine the Na + content per cell protein.

図２において、「○」は、異なるNaCl濃度の培地で培養された、ＤＮＡ断片132B7が導入された形質転換大腸菌の細胞内Ｎａ＋含量を示し、「●」は、対照である空ベクターが導入された形質転換大腸菌の細胞内Ｎａ＋含量を示す。 In FIG. 2, “◯” indicates the intracellular Na + content of the transformed Escherichia coli introduced with the DNA fragment 132B7 cultured in media having different NaCl concentrations, and “●” indicates the introduction of an empty vector as a control. The intracellular Na + content of the transformed E. coli is shown.

図２に示されるように、培地のNaCl濃度が400mMを超える場合（より具体的には、培地のNaCl濃度600mM以上の場合）、対照の形質転換大腸菌の細胞内ナトリウムイオン含量が大幅に増加したのに対して、フォスミドクローンc132B7が導入された形質転換大腸菌の細胞内ナトリウムイオン含量は、培地のNaCl濃度が86, 400 mMのときのナトリウムイオン含量とほとんど変わらなかった。このことから、フォスミドクローンc132B7の導入により大腸菌に生じる耐塩性向上活性は、細胞内ナトリウムイオン濃度の恒常性の安定化が原因であると考えられる（図２参照）。   As shown in FIG. 2, when the NaCl concentration of the medium exceeded 400 mM (more specifically, when the NaCl concentration of the medium was 600 mM or more), the intracellular sodium ion content of the control transformed Escherichia coli was greatly increased. In contrast, the intracellular sodium ion content of the transformed Escherichia coli into which fosmid clone c132B7 was introduced was almost the same as the sodium ion content when the NaCl concentration of the medium was 86,400 mM. From this, it is considered that the salt tolerance improving activity generated in Escherichia coli by introduction of fosmid clone c132B7 is caused by stabilization of homeostasis of intracellular sodium ion concentration (see FIG. 2).

２．５．耐塩性向上活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ断片の同定
次に、フォスミドクローンc132B7のＤＮＡ断片132B7のデリーションクローンシリーズを作成し、全長約37ＫｂのＤＮＡ断片132B7のうち、どの領域が耐塩性向上に機能しているかを検討した。 2.5. Identification of a DNA fragment encoding a protein having an activity of improving salt tolerance Next, a deletion clone series of DNA fragment 132B7 of fosmid clone c132B7 was prepared, and which region of DNA fragment 132B7 of about 37 Kb in total length was improved in salt tolerance We examined whether it was functioning.

予備的な検討として、図３に示される約１０Ｋｂ付近（ORF1近傍）の塩基配列のみが導入された形質転換大腸菌を作成し、上述の方法と同様の方法によって、その耐塩性向上活性を評価したところ、フォスミドクローンc132B7が導入された形質転換大腸菌と同等の耐塩性向上活性が認められた。このため、約１０Ｋｂ付近に存在するORFを含むサブクローン（c132B7J-7，c132B7J-5，図３参照）を作成し、耐塩性の向上活性を評価した。   As a preliminary study, transformed Escherichia coli into which only the base sequence of about 10 Kb (near ORF1) shown in FIG. 3 was introduced was prepared, and its salt tolerance improving activity was evaluated by the same method as described above. However, the salt tolerance improving activity equivalent to that of transformed Escherichia coli introduced with fosmid clone c132B7 was observed. For this reason, subclones containing ORFs present in the vicinity of about 10 Kb (c132B7J-7, c132B7J-5, see FIG. 3) were prepared, and the salt-tolerant activity was evaluated.

図３において、各領域は、ＰＣＲで増幅したものをフォスミドにクローニングすることにより、サブクローンを作製した。このサブクローンは機能領域同定実験に使用された。また、サブクローンにはＰＣＲ変異が入っていないことを確認した。   In FIG. 3, each region was subcloned by cloning a PCR amplified product into fosmid. This subclone was used for functional region identification experiments. In addition, it was confirmed that the subclone did not contain a PCR mutation.

5 ’-GAAATGTTCGGGAGGGTGAATTCGGTGA-3’と、
5 ’-AGTG GCCGGCAAGCTTGTACTCGCAACC-3’との２つのプライマーを用いて、ＤＮＡ断片132B7の全長をテンプレートとしてPCRで増幅した後、EcoRI，HindIIIで制限酵素処理し、フォスミド（EcoRI、HindIIIサイト）にクローニングすることにより、配列番号７で表される塩基配列132B7J-7を有するＤＮＡ断片が導入されたサブクローンc132B7J-7を作製した。 5 '-GAAATGTTCGGGAGGGTGAATTCGGTGA-3'
5 Using two primers '-AGTG GCCGGCAAGCTTGTACTCGCAACC-3', amplify by PCR using the full length of DNA fragment 132B7 as a template, treat with restriction enzyme with EcoRI and HindIII, and clone to fosmid (EcoRI and HindIII sites) Thus, subclone c132B7J-7 into which a DNA fragment having the base sequence 132B7J-7 represented by SEQ ID NO: 7 was introduced was prepared.

塩基配列132B7J-7はまた、図５に示されている。図５においては、開始コドンが一重線のアンダーラインで示され、終止コドンが二重線のアンダーラインで示されている。   The base sequence 132B7J-7 is also shown in FIG. In FIG. 5, the start codon is indicated by a single line underline and the stop codon is indicated by a double line underline.

配列番号７で表される塩基配列132B7J-7は、配列番号１で表される塩基配列132B7J-5（ORF1）、配列番号２で表される塩基配列ORF2、および配列番号３で表される塩基配列ORF3を含む。   The base sequence 132B7J-7 represented by SEQ ID NO: 7 is the base sequence 132B7J-5 (ORF1) represented by SEQ ID NO: 1, the base sequence ORF2 represented by SEQ ID NO: 2, and the base represented by SEQ ID NO: 3. Contains the sequence ORF3.

また、5 ’-GAAATGTTCGGGAGGGTGAATTCGGTGA-3’と、
5 ’-GGATCAAGCTTGCGCCCGCCGTCAAA-3’との２つのプライマーを用いて、サブクローンc132B7J-7を作製する場合と同様の方法にて、フォスミド（EcoRI、HindIIIサイト）にクローニングすることにより、配列番号１で表される塩基配列132B7J-5（ORF1）を有するＤＮＡ断片が導入されたサブクローンc132B7J-5を作製した。 Also, 5 '-GAAATGTTCGGGAGGGTGAATTCGGTGA-3'
5 Using the two primers '-GGATCAAGCTTGCGCCCGCCGTCAAA-3' and cloning into fosmid (EcoRI, HindIII site) in the same manner as when subclone c132B7J-7 is prepared, A subclone c132B7J-5 into which a DNA fragment having the nucleotide sequence 132B7J-5 (ORF1) to be introduced was introduced was prepared.

得られた各デリーションクローン（サブクローンc132B7J-7, c132B7J-5）を大腸菌（E．coli EPI300ＴＭ-TiＲ strain）に導入して、形質転換大腸菌を作製した。そして、上述の方法と同様の方法にて、培地中のNaCl濃度が異なる場合における形質転換大腸菌の耐塩性向上活性を評価した（図４（ａ）〜図４（ｆ）参照）。 Each of the obtained deletion clones (subclones c132B7J-7 and c132B7J-5) was introduced into E. coli (E. coli EPI300 ™ -Ti R strain) to prepare transformed E. coli. And the salt tolerance improvement activity of transformed Escherichia coli in the case where the NaCl concentration in the medium is different was evaluated by the same method as described above (see FIGS. 4 (a) to 4 (f)).

図４（ａ）〜図４（ｆ）は、塩基配列132B7J-7を有するＤＮＡ断片が導入された形質転換大腸菌（○）、ならびに、塩基配列132B7J-5（◇）を有するＤＮＡ断片が導入された形質転換大腸菌の耐塩性向上活性の評価結果を示す。ここで、培地が各NaCl濃度である場合の生育曲線（図４（ａ）〜図４（ｆ）参照）を指標として評価を行なった。また、図４（ａ）〜図４（ｆ）において、「●」は、対照である空ベクターが導入された形質転換大腸菌の耐塩性向上活性の評価結果を示す。   FIG. 4 (a) to FIG. 4 (f) show a transformed Escherichia coli (◯) into which a DNA fragment having the base sequence 132B7J-7 was introduced, and a DNA fragment having the base sequence 132B7J-5 (◇). The evaluation result of the salt tolerance improvement activity of transformed Escherichia coli is shown. Here, the evaluation was performed using as an index a growth curve (see FIGS. 4A to 4F) when the culture medium had each NaCl concentration. Moreover, in FIG. 4 (a)-FIG.4 (f), "(circle)" shows the evaluation result of the salt tolerance improvement activity of the transformed Escherichia coli which introduce | transduced the empty vector which is a control | contrast.

その結果、図４（ａ）〜図４（ｆ）に示されるように、サブクローンc132B7J-5が導入された形質転換大腸菌（◇）およびサブクローンc132B7J-7が導入された形質転換大腸菌（○）の両方において、耐塩性向上活性が確認された。   As a result, as shown in FIG. 4 (a) to FIG. 4 (f), transformed Escherichia coli introduced with the subclone c132B7J-5 (◇) and transformed Escherichia coli introduced with the subclone c132B7J-7 (○ In both cases, the salt-tolerant activity was confirmed.

特に、サブクローンc132B7J-7が導入された形質転換大腸菌（○）、すなわち、塩基配列132B7J-7（塩基配列ORF1の下流に２つの塩基配列ORF（ORF2, ORF3）が存在する塩基配列）を有するＤＮＡ断片が導入された形質転換大腸菌においては、全長約３７ＫｂのＤＮＡ断片（132B7）が導入された形質転換大腸菌（図１参照）と同等の耐塩性性向上活性が認められた。   In particular, transformed Escherichia coli (○) into which subclone c132B7J-7 has been introduced, that is, has base sequence 132B7J-7 (a base sequence in which two base sequences ORF (ORF2, ORF3) exist downstream of base sequence ORF1) In the transformed Escherichia coli into which the DNA fragment was introduced, the same salt tolerance improving activity as that in the transformed Escherichia coli into which the DNA fragment (132B7) having a total length of about 37 Kb was introduced (see FIG. 1) was observed.

以上の結果より、塩基配列ORF１を有するＤＮＡ断片を大腸菌に導入することにより、耐塩性向上活性が認められ、これに加えて、塩基配列ORF１と、塩基配列ORF１の下流に存在する塩基配列ORF2, ORF3とを有するＤＮＡ断片を導入することにより、耐塩性向上活性をより高められることが明らかになった。   From the above results, by introducing a DNA fragment having the base sequence ORF1 into Escherichia coli, a salt tolerance improving activity was observed. In addition, the base sequence ORF1 and the base sequence ORF2, existing downstream of the base sequence ORF1, were observed. It was revealed that the activity of improving salt tolerance can be further enhanced by introducing a DNA fragment having ORF3.

塩基配列ORF1, ORF2, ORF3はそれぞれ、配列番号１，２，３に表される。また、各ＯＲＦのアミノ酸配列を図６に示す。ＢＬＡＳＴ２（http://blast.genome.jp/）を用いて、各塩基配列と最も相同性の高い既知の配列を検索した結果を以下に示す。   The base sequences ORF1, ORF2, and ORF3 are represented by SEQ ID NOs: 1, 2, and 3, respectively. Moreover, the amino acid sequence of each ORF is shown in FIG. The result of searching for a known sequence having the highest homology with each base sequence using BLAST2 (http://blast.genome.jp/) is shown below.

塩基配列ORF1は、Nitrosospira multiformis ATCC 25196由来の ATP-dependent metalloprotease FtsHと７１％の相同性を有し、大腸菌のFtsH遺伝子とも６４％の相同性を有することが明らかになった。 The nucleotide sequence ORF1 was found to have 71% homology with ATP-dependent metalloprotease FtsH derived from Nitrosospira multiformis ATCC 25196 and 64% homology with the E. coli FtsH gene.

また、大腸菌のFtsH遺伝子をクローニングし、耐塩性向上活性を測定した結果、NaClの濃度が800 mMである培地で培養した場合、空ベクターが導入された形質転換大腸菌（対照）では、600nmの吸光度が0.5であったのに対し、大腸菌のFtsH遺伝子が導入された形質転換大腸菌では、600nmの吸光度が1.0-1.5に達し、ごくわずかな耐塩性活性の向上が認められた。しかしながら、塩基配列132B7J-5（=ORF1）を有するＤＮＡ断片が導入された形質転換大腸菌の600nmの吸光度が2.0-2.5であったことから、本実施例で示された塩基配列ORF1の導入による大腸菌の耐塩性の向上は、塩基配列ORF1に特有であると理解できる。   In addition, as a result of cloning the FtsH gene of Escherichia coli and measuring the salt tolerance improving activity, when cultured in a medium with a NaCl concentration of 800 mM, the transformed Escherichia coli introduced with an empty vector (control) has an absorbance of 600 nm. On the other hand, in the transformed Escherichia coli introduced with the FtsH gene of Escherichia coli, the absorbance at 600 nm reached 1.0-1.5, and a slight improvement in salt tolerance activity was observed. However, since the absorbance at 600 nm of the transformed E. coli into which the DNA fragment having the base sequence 132B7J-5 (= ORF1) was introduced was 2.0-2.5, E. coli by introduction of the base sequence ORF1 shown in this Example It can be understood that the improvement of the salt tolerance is peculiar to the base sequence ORF1.

塩基配列ORF2は、Xanthomonas oryzae由来の酵素（dihydropteroate synthase）と５７％の相同性を有するが、この酵素と耐塩性との関連性はこれまでに報告されていない。 The base sequence ORF2 has 57% homology with an enzyme derived from Xanthomonas oryzae (dihydropteroate synthase), but no relationship between this enzyme and salt tolerance has been reported so far.

塩基配列ORF3は、Thiobacillus denitrificans ATCC 25259 の酵素（phosphoglucosamine mutase）と５４％の相同性を有するが、この酵素と耐塩性との関連性はこれまでに報告されていない。 The nucleotide sequence ORF3 has 54% homology with the enzyme (phosphoglucosamine mutase) of Thiobacillus denitrificans ATCC 25259, but no relationship between this enzyme and salt tolerance has been reported so far.

以上の結果により、本発明の新規遺伝子群が導入された形質転換大腸菌には耐塩性向上活性が認められた。これにより、本発明の新規遺伝子群は、様々な微生物（例えばバクテリア）の耐塩性活性の向上に利用できる。また、本実施例に記載されているように、耐塩性向上活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ断片を含む発現ベクターを用いて大腸菌を形質転換する方法は、大腸菌以外の各種微生物にも応用することができるため、該方法の各種の微生物産業への応用が期待できる。   Based on the above results, salt-tolerant activity was observed in the transformed Escherichia coli introduced with the novel gene group of the present invention. Thereby, the novel gene group of this invention can be utilized for the improvement of the salt tolerance activity of various microorganisms (for example, bacteria). In addition, as described in this example, the method of transforming E. coli using an expression vector containing a DNA fragment encoding a protein having a salt tolerance improving activity can be applied to various microorganisms other than E. coli. Therefore, the application of the method to various microbial industries can be expected.

図１（ａ）〜図１（ｇ）は、カイメン（stylissa massa）の共在バクテリア由来のＤＮＡ断片（132B7）が導入された形質転換大腸菌（○）の各種ストレス耐性の評価結果を示す。Figure 1 (a) ~ FIG 1 (g) shows the evaluation results of various stress tolerance sponge (stylissa massa) transformed E. coli coexistence bacteria derived DNA fragment (132B7) has been introduced in (○). 図２は、異なるNaCl濃度の培地で培養したときの、塩基配列132B7を有するＤＮＡ断片が導入された形質転換大腸菌の細胞内Ｎａ＋含量の評価結果を示す。FIG. 2 shows the evaluation results of intracellular Na + content of transformed Escherichia coli into which a DNA fragment having the base sequence 132B7 was introduced when cultured in media having different NaCl concentrations. 図３（ａ）〜図３（ｆ）は、ＤＮＡ断片132B7（全長約37 Kb）の機能領域を同定するためのデリーションクローン作成方法を模式的に示す図である。3 (a) to 3 (f) are diagrams schematically showing a method of creating a deletion clone for identifying the functional region of the DNA fragment 132B7 (total length: about 37 Kb). 図４（ａ）〜図４（ｆ）は、塩基配列132B7J-7を有するＤＮＡ断片が導入された形質転換大腸菌（○）、ならびに、塩基配列132B7J-5を有するＤＮＡ断片（◇）が導入された形質転換大腸菌の耐塩性向上活性の評価結果を示す。FIG. 4 (a) to FIG. 4 (f) show transformed E. coli (◯) into which a DNA fragment having the base sequence 132B7J-7 was introduced, and a DNA fragment (◇) having the base sequence 132B7J-5. The evaluation result of the salt tolerance improvement activity of transformed Escherichia coli is shown. 図５は、塩基配列132B7J-7を示す。FIG. 5 shows the nucleotide sequence 132B7J-7. 図６は、塩基配列ORF1, 2, 3を示す。FIG. 6 shows the base sequences ORF1, 2, and 3.

Claims (17)

カイメン（stylissa massa）の共在微生物由来であり、かつ、耐塩性向上活性を有するタンパク質をコードする、ＤＮＡ断片。 A DNA fragment which is derived from a coexisting microorganism of stylissa massa and encodes a protein having an activity of improving salt tolerance. 以下の（ａ）〜（ｃ）記載のいずれかのタンパク質をコードする、ＤＮＡ断片。
（ａ）配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号４に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ耐塩性向上活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質と相同性が７０％以上のアミノ酸配列からなり、かつ耐塩性向上活性を有するタンパク質 A DNA fragment encoding any one of the following proteins (a) to (c).
(A) a protein comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 (b) consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4, and salt tolerance Protein having improving activity (c) Protein having an amino acid sequence having a homology of 70% or more with the protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 and having a salt tolerance improving activity 配列番号１、２、および３のいずれかにより表される塩基配列またはその相補的配列を有する、ＤＮＡ断片。   A DNA fragment having a base sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 1, 2, and 3 or a complementary sequence thereof. 配列番号１、２、および３のいずれかにより表される塩基配列において、１または数個の塩基が置換、欠失、もしくは付加されている塩基配列を有し、かつ耐塩性向上活性を有するタンパク質をコードする、ＤＮＡ断片。   A protein having a base sequence in which one or several bases are substituted, deleted, or added in the base sequence represented by any of SEQ ID NOs: 1, 2, and 3, and having a salt tolerance improving activity A DNA fragment encoding. 配列番号１、２、および３のいずれかにより表される塩基配列と７０％以上の同一性を有する塩基配列を有し、かつ耐塩性向上活性を有するタンパク質をコードする、ＤＮＡ断片。   A DNA fragment encoding a protein having a base sequence having 70% or more identity with the base sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 1, 2, and 3, and having a salt tolerance improving activity. 請求項３に記載のＤＮＡ断片とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ耐塩性向上活性を有するタンパク質をコードする、ＤＮＡ断片。   A DNA fragment that hybridizes with the DNA fragment according to claim 3 under a stringent condition and encodes a protein having an activity of improving salt tolerance. 以下の（ａ）〜（ｃ）のうちいずれか１つの塩基配列またはその相補的配列と、以下の（ｄ）〜（ｉ）のうち少なくとも１つの塩基配列またはその相補的配列と、を含む、ＤＮＡ断片。
（ａ）配列番号１により表される塩基配列
（ｂ）配列番号１により表される塩基配列の一部または全部を含み、かつ耐塩性向上活性を有するタンパク質をコードする塩基配列
（ｃ）配列番号１により表される塩基配列と７０％以上の同一性を有する塩基配列を有し、かつ耐塩性向上活性を有するタンパク質をコードする塩基配列
（ｄ）配列番号２により表される塩基配列
（ｅ）配列番号２により表される塩基配列の一部または全部を含み、かつ耐塩性向上活性を有するタンパク質をコードする塩基配列
（ｆ）配列番号２により表される塩基配列と７０％以上の同一性を有する塩基配列を有し、かつ耐塩性向上活性を有するタンパク質をコードする塩基配列
（ｇ）配列番号３により表される塩基配列
（ｈ）配列番号３により表される塩基配列の一部または全部を含み、かつ耐塩性向上活性を有するタンパク質をコードする塩基配列
（ｉ）配列番号３により表される塩基配列と７０％以上の同一性を有する塩基配列を有し、かつ耐塩性向上活性を有するタンパク質をコードする塩基配列 Any one of the following base sequences (a) to (c) or a complementary sequence thereof, and at least one of the following base sequences (d) to (i) or a complementary sequence thereof: DNA fragment.
(A) a base sequence represented by SEQ ID NO: 1 (b) a base sequence encoding a protein comprising part or all of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 and having a salt tolerance improving activity (c) SEQ ID NO: A base sequence encoding a protein having a base sequence having 70% or more identity with the base sequence represented by 1 and having a salt tolerance improving activity (d) a base sequence represented by SEQ ID NO: 2 (e) (F) a base sequence that encodes a protein having a part or all of the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 and having a salt tolerance improving activity; (f) 70% or more identity with the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 (G) a base sequence represented by SEQ ID NO: 3 (h) a base sequence represented by SEQ ID NO: 3 A base sequence comprising a part or all of the sequence and encoding a protein having a salt tolerance improving activity (i) having a base sequence having 70% or more identity with the base sequence represented by SEQ ID NO: 3, and Nucleotide sequence encoding a protein having an activity of improving salt tolerance 請求項１ないし７のいずれかに記載のＤＮＡ断片を含む、発現ベクター。   An expression vector comprising the DNA fragment according to any one of claims 1 to 7. 請求項８に記載の発現ベクターを宿主細胞に導入することにより得られる、形質転換体。   A transformant obtained by introducing the expression vector according to claim 8 into a host cell. 請求項９において、
前記宿主細胞は微生物細胞である、形質転換体。 In claim 9,
The transformant, wherein the host cell is a microbial cell. 請求項９または１０において、
耐塩性向上活性を有する、形質転換体。 In claim 9 or 10,
A transformant having an activity of improving salt tolerance. カイメン（stylissa massa）の共在微生物由来であり、かつ、耐塩性向上活性を有するタンパク質。 A protein derived from a coexisting microorganism of stylissa massa and having a salt tolerance improving activity. 配列番号４、５、および６のいずれかにより表されるアミノ酸配列を有する、タンパク質。   A protein having an amino acid sequence represented by any of SEQ ID NOs: 4, 5, and 6. 配列番号４、５、および６のいずれかにより表されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が置換、欠失、もしくは付加されているアミノ酸配列を有し、かつ耐塩性向上活性を有する、タンパク質。   The amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 4, 5, and 6 has an amino acid sequence in which one or several amino acids are substituted, deleted, or added, and has an activity of improving salt tolerance; protein. 配列番号４、５、および６のいずれかにより表されるアミノ酸配列と７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ耐塩性向上活性を有する、タンパク質。   A protein having an amino acid sequence having 70% or more identity with the amino acid sequence represented by any of SEQ ID NOs: 4, 5, and 6, and having a salt tolerance improving activity. カイメン（stylissa massa）の共在微生物から複数のＤＮＡ断片を抽出すること、
前記複数のＤＮＡ断片がそれぞれ挿入された複数の発現ベクターを作製することにより、ライブラリを構築すること、および
前記複数の発現ベクターを宿主細胞に導入し、該宿主細胞を塩ストレス性条件下で培養することにより、耐塩性向上活性を有するクローンを選択すること、
を含む、耐塩性向上活性を有するＤＮＡ断片のスクリーニング方法。 Extracting multiple DNA fragments from coexisting microorganisms of sponge ( stylissa massa ),
Constructing a library by preparing a plurality of expression vectors each having the plurality of DNA fragments inserted therein; and introducing the plurality of expression vectors into a host cell and culturing the host cell under salt stress conditions To select a clone having a salt tolerance improving activity,
A method for screening a DNA fragment having a salt tolerance improving activity, comprising: 請求項１６において、
前記宿主細胞が微生物細胞である、耐塩性向上活性を有するＤＮＡ断片のスクリーニング方法。 In claim 16,
A method for screening a DNA fragment having a salt tolerance improving activity, wherein the host cell is a microbial cell.
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