JP2007125004A - Method for producing polyhydroxyalkanoic acid - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、生分解性及び優れた柔軟性を有するポリヒドロキシアルカン酸の油脂類からの製造方法に関する。 The present invention relates to a method for producing polyhydroxyalkanoic acid from fats and oils having biodegradability and excellent flexibility.
ポリヒドロキシアルカン酸（以下、「PHA」と称する）は微生物が細胞内に蓄積するポリエステルである。近年では、生分解性プラスチック素材としてのみならず、バイオマス由来のプラスチック素材として注目されている。最も一般的なPHAは、(R)-3-ヒドロキシブタン酸(以下、「3HB」と称する）を構成ユニットとするホモポリマー(以下、「P(3HB）」と称する)である。P(3HB)は結晶性が高いため、柔軟性がないのが欠点であった。その後、3HBと(R)-3-ヒドロキシ吉草酸（以下、「3HV」と称する）からなる共重合体(以下、「P(3HB-co-3HV）」と称する）の微生物による製造法が開発されたが、3HBと3HVとが共結晶化するために、柔軟性はほとんど向上しなかった。 Polyhydroxyalkanoic acid (hereinafter referred to as “PHA”) is a polyester in which microorganisms accumulate in cells. In recent years, it has attracted attention not only as a biodegradable plastic material but also as a plastic material derived from biomass. The most common PHA is a homopolymer (hereinafter referred to as “P (3HB)”) having (R) -3-hydroxybutanoic acid (hereinafter referred to as “3HB”) as a constituent unit. Since P (3HB) has high crystallinity, it has a drawback of not being flexible. Later, a method for producing a copolymer of 3HB and (R) -3-hydroxyvaleric acid (hereinafter referred to as “3HV”) (hereinafter referred to as “P (3HB-co-3HV)”) was developed. However, since 3HB and 3HV cocrystallized, the flexibility was hardly improved.
近年、3HBと(R)-3-ヒドロキシヘキサン酸(以下「3HHx」と称する)とからなる共重合体(以下、「P(3HB-co-3HHx)」と称する)の製造法が確立され、高い柔軟性を有するPHAの製造が可能になった(特許文献１参照)。P(3HB-co-3HHx)の製造法は、具体的には、高いPHA蓄積能を示すRalstonia eutropha(ラルストニア・ユートロファ)属由来のPHA合成酵素遺伝子欠損変異株（PHB-4株）に土壌細菌Aeromonas caviae(アエロモナス・キャビエ)属由来のPHA合成酵素（PhaCAc）を組み込んだ組換え株を作製し、植物油を炭素源として微生物合成を行うものである。炭素源として大豆油を使用すると、3HHxを5mol%含む共重合体が得られる。 In recent years, a method for producing a copolymer consisting of 3HB and (R) -3-hydroxyhexanoic acid (hereinafter referred to as `` 3HHx '') (hereinafter referred to as `` P (3HB-co-3HHx) '') has been established, PHA having high flexibility can be produced (see Patent Document 1). Specifically, the production method of P (3HB-co-3HHx) is based on the PHA synthase gene-deficient mutant strain (PHB - 4 strain) derived from the genus Ralstonia eutropha that exhibits high PHA accumulation ability. to prepare Aeromonas caviae (Aeromonas caviae) recombinant strains incorporating from the genus PHA synthase (PhaC Ac), performs a microorganism synthetic vegetable oil as a carbon source. When soybean oil is used as a carbon source, a copolymer containing 5 mol% of 3HHx is obtained.
一方、3HBと3-ヒドロキシアルカン酸(以下、「3HA」と称する)とからなる共重合体(以下、「P(3HB-co-3HA)」と称する)は、P(3HB-co-3HHx)に比べて更に柔軟なポリマーであり、3HAを約6mol%含むP(3HB-co-3HA)は低密度ポリエチレンと同等の破壊のび性を示す。P(3HB-co-3HA)の製造法としては、糖類を炭素源とし、Pseudomonas 61-3株由来の組換え株を用いる方法が知られている（非特許文献１参照）。 On the other hand, a copolymer consisting of 3HB and 3-hydroxyalkanoic acid (hereinafter referred to as “3HA”) (hereinafter referred to as “P (3HB-co-3HA)”) is represented by P (3HB-co-3HHx). P (3HB-co-3HA) containing about 6 mol% of 3HA exhibits a fracture resistance equivalent to that of low density polyethylene. As a method for producing P (3HB-co-3HA), a method using a saccharide as a carbon source and a recombinant strain derived from the Pseudomonas 61-3 strain is known (see Non-Patent Document 1).
更に、糖類を炭素源とし、Pseudomonas 61-3株由来のポリヒドロキシアルカン酸合成酵素の477番のセリンがアルギニンに及び481番のグルタミンがリシン、メチオニン、アルギニン等に置換された変異株、又は325番目のセリンがシスティン又はトレオニンに置換された変異株を大腸菌内で培養すると、P(3HB)の蓄積量が上昇することが報告されている（非特許文献２参照）。 Further, a mutant strain in which saccharides are used as a carbon source and the polyhydroxyalkanoate synthase derived from Pseudomonas 61-3 is substituted with 477 serine for arginine and glutamine for 481 with lysine, methionine, arginine or the like, or 325 It has been reported that the accumulation amount of P (3HB) increases when a mutant strain in which the second serine is substituted with cysteine or threonine is cultured in E. coli (see Non-Patent Document 2).
また、上記酵素の130番目のグルタミン酸がアスパラギン酸に置換された変異株を大腸菌内で培養すると、P(3HB)の蓄積量が著しく上昇することも報告されている（非特許文献３参照）。 It has also been reported that when a mutant strain in which the 130th glutamic acid of the above enzyme is substituted with aspartic acid is cultured in E. coli, the accumulated amount of P (3HB) is significantly increased (see Non-Patent Document 3).
しかしながら、PHA製造の炭素源としては、一般的に、生産性の点から糖類よりも脂質類の方が適しており、P(3HB-co-3HHx)の油脂類からの製造法は特許文献１の方法により確立されているが、P(3HB-co-3HA)の油脂類からの製造法は知られていない。
従って、本発明は、油脂類を炭素源として、柔軟性等の機械的物性に優れたP(3HB-co-3HA)を高い生産性で製造する方法を提供することを目的とする。
However, as a carbon source for PHA production, lipids are generally more suitable than saccharides in terms of productivity, and P (3HB-co-3HHx) is produced from fats and oils by Patent Document 1. However, a method for producing P (3HB-co-3HA) from fats and oils is not known.
Accordingly, an object of the present invention is to provide a method for producing P (3HB-co-3HA) excellent in mechanical properties such as flexibility with high productivity using fats and oils as a carbon source.
本発明者らは、斯かる実状に鑑み、油脂類を炭素源とし、Pseudomonas 61-3株由来ポリヒドロキシアルカン酸合成酵素の477番のセリン、325番目のセリン、130番目のグルタミン酸又は481番のグルタミンがそれぞれ、当該アミノ酸以外のアミノ酸に置換された変異酵素を作製し、P(3HB-co-3HA)蓄積能を検討したところ、特定のアミノ酸に置換された変異酵素を用いることにより、P(3HB-co-3HA)を高い生産性で製造できることを見出した。また、当該共重合体は、(R)-3-ヒドロキシブタン酸(3HB)を約90 mol%と高い割合で含む、柔軟性に優れた共重合体であることを見出し、本発明を完成するに至った。 In view of such a situation, the present inventors use fats and oils as a carbon source, Pseudomonas 61-3 derived polyhydroxyalkanoic acid synthase No. 477 serine, No. 325 serine, No. 130 glutamic acid or No. 481 Glutamine was prepared by substituting an amino acid other than the amino acid, and the P (3HB-co-3HA) accumulation ability was examined. By using a mutant enzyme substituted with a specific amino acid, P ( It was found that 3HB-co-3HA) can be produced with high productivity. In addition, the copolymer is found to be a highly flexible copolymer containing (R) -3-hydroxybutanoic acid (3HB) at a high ratio of about 90 mol%, and the present invention is completed. It came to.
すなわち、（１）本発明は、配列番号１で示されるアミノ酸配列の477番のセリンが、システィン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リシン、ロイシン、トレオニン、バリン、トリプトファン又はチロシンに置換されたアミノ酸配列をコードする、Pseudomonas(シュウドモナス) 61-30株由来ポリヒドロキシアルカン酸合成酵素遺伝子を提供するものである。 That is, (1) the present invention encodes an amino acid sequence in which the 477th serine of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is substituted with cysteine, aspartic acid, glutamic acid, lysine, leucine, threonine, valine, tryptophan or tyrosine The present invention provides a polyhydroxyalkanoate synthase gene derived from Pseudomonas 61-30 strain.
（２）本発明はまた、上記置換されたアミノ酸が、ロイシン、トレオニン又はバリンである、（１）の記載の遺伝子を提供するものである。 (2) The present invention also provides the gene according to (1), wherein the substituted amino acid is leucine, threonine or valine.
（３）本発明はまた、（１）又は（２）の遺伝子から翻訳される、ポリヒドロキシアルカン酸合成酵素を提供するものである。 (3) The present invention also provides a polyhydroxyalkanoic acid synthase that is translated from the gene of (1) or (2).
（４）本発明はまた、（１）又は（２）の遺伝子を含む組換えベクターを提供するものである。 (4) The present invention also provides a recombinant vector containing the gene (1) or (2).
（５）本発明はまた、（４）の組換えベクターがRalstonia eutropha(ラルストニア・ユートロファ) PHB-4株に導入されてなる形質転換体を提供するものである。 (5) The present invention also provides a transformant obtained by introducing the recombinant vector of (4) into Ralstonia eutropha PHB - 4 strain.
（６）本発明はまた、配列番号１で示されるアミノ酸配列の481番のグルタミンが、システィン、グルタミン酸、フェニルアラニン、イソロイシン、リシン、ロイシン、メチオニン、バリン、トリプトファン又はアルギニンに置換されたアミノ酸配列をコードするPseudomonas 61-3株由来ポリヒドロキシアルカン酸合成酵素遺伝子を含む組換えベクターが、Ralstonia eutropha(ラルストニア・ユートロファ) PHB-4株に導入されてなる形質転換体を提供するものである。 (6) The present invention also encodes an amino acid sequence in which the 481st glutamine of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is substituted with cysteine, glutamic acid, phenylalanine, isoleucine, lysine, leucine, methionine, valine, tryptophan or arginine. The present invention provides a transformant in which a recombinant vector containing a polyhydroxyalkanoate synthase gene derived from Pseudomonas 61-3 strain is introduced into Ralstonia eutropha PHB - 4 strain.
（７）本発明はまた、上記置換されたアミノ酸が、イソロイシン、バリン又はトリプトファンである、（６）記載の形質転換体を提供するものである。 (7) The present invention also provides the transformant according to (6), wherein the substituted amino acid is isoleucine, valine or tryptophan.
（８）本発明はまた、配列番号１で示されるアミノ酸配列の130番のグルタミン酸が、フェニルアラニン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、バリン、トリプトファン又はチロシンに置換されたアミノ酸配列をコードするPseudomonas 61-3株由来ポリヒドロキシアルカン酸合成酵素遺伝子を含む組換えベクターが、Ralstonia eutropha PHB-4株に導入されてなる形質転換体を提供するものである。 (8) The present invention also relates to a strain Pseudomonas 61-3 encoding an amino acid sequence in which the glutamic acid at position 130 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is substituted with phenylalanine, histidine, isoleucine, leucine, valine, tryptophan or tyrosine A recombinant vector containing the derived polyhydroxyalkanoate synthase gene is provided as a transformant introduced into Ralstonia eutropha PHB - 4 strain.
（９）本発明はまた、上記置換されたアミノ酸が、フェニルアラニン、イソロイシン、バリン又はチロシンである、（８）記載の形質転換体を提供するものである。 (9) The present invention also provides the transformant according to (8), wherein the substituted amino acid is phenylalanine, isoleucine, valine or tyrosine.
（１０）本発明はまた、配列番号１で示されるアミノ酸配列の325番のセリンが、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、メチオチン、アスパラギン、又はチロシンに置換されたアミノ酸配列をコードするPseudomonas 61-3株由来ポリヒドロキシアルカン酸合成酵素遺伝子を含む組換えベクターが、Ralstonia eutropha PHB-4株に導入されてなる形質転換体を提供するものである。 (10) The present invention also relates to Pseudomonas 61 encoding an amino acid sequence in which the serine at position 325 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is substituted with phenylalanine, glycine, histidine, isoleucine, leucine, methionine, asparagine, or tyrosine. -3 strain-derived polyhydroxyalkanoate synthase gene is provided as a transformant introduced into Ralstonia eutropha PHB - 4 strain.
（１１）本発明はまた、上記置換されたアミノ酸が、ロイシン又はチロシンである、（１０）記載の形質転換体を提供するものである。 (11) The present invention also provides the transformant according to (10), wherein the substituted amino acid is leucine or tyrosine.
（１２）本発明は更に、油脂類の存在下、上記形質転換体を培養し、得られる培養物から(R)-3-ヒドロキシブタン酸と(R)-3-ヒドロキシアルカン酸との共重合体を採取することを特徴とする、ポリヒドロキシアルカン酸共重合体の製造法を提供するものである。 (12) The present invention further comprises culturing the transformant in the presence of fats and oils, and co-reducing (R) -3-hydroxybutanoic acid and (R) -3-hydroxyalkanoic acid from the resulting culture. The present invention provides a method for producing a polyhydroxyalkanoic acid copolymer, which is characterized by collecting a coalescence.
（１３）上記共重合体中の上記(R)-3-ヒドロキシブタン酸の含量が68〜95 mol%である、（１２）記載の製造法を提供するものである。 (13) The production method according to (12), wherein the content of the (R) -3-hydroxybutanoic acid in the copolymer is 68 to 95 mol%.
（１４）本発明はまた、上記(R)-3-ヒドロキシアルカン酸が、(R)-3-ヒドロキシヘキサン酸、(R)-3-ヒドロキシオクタン酸、(R)-3-ヒドロキシデカン酸及び(R)-3-ヒドロキシドデカン酸から選ばれる、（１２）又は（１３）記載の製造法を提供するものである。 (14) The present invention also provides that the (R) -3-hydroxyalkanoic acid is (R) -3-hydroxyhexanoic acid, (R) -3-hydroxyoctanoic acid, (R) -3-hydroxydecanoic acid, and The production method according to (12) or (13), which is selected from (R) -3-hydroxydodecanoic acid.
（１５）本発明は更に、上記油脂類が大豆油である、（１２）〜（１４）のいずれか１つに記載の製造法を提供するものである。 (15) The present invention further provides the production method according to any one of (12) to (14), wherein the oil or fat is soybean oil.
本発明により、生分解性及び高い柔軟性を有する、(R)-3-ヒドロキシブタン酸と(R)-3-ヒドロキシアルカン酸とからなる共重合体P(3HB-co-3HA)を収率良く製造することができる。従って、本発明の製造法は、優れた機械的物性を有する生分解性プラスチック材料の微生物的製造法として工業的に有用である。 According to the present invention, a copolymer P (3HB-co-3HA) comprising (R) -3-hydroxybutanoic acid and (R) -3-hydroxyalkanoic acid having biodegradability and high flexibility is obtained. Can be manufactured well. Therefore, the production method of the present invention is industrially useful as a microbial production method of a biodegradable plastic material having excellent mechanical properties.
Pseudomonas 61-3株由来のポリヒドロキシアルカン酸合成酵素(PhaC1Ps)は、細胞内に共重合体P(3HB-co-3HA)を蓄積する能力を有する。P(3HB-co-3HA)を構成する3-ヒドロキシアルカン酸(3HA)としては、3HAの3位の置換基であるアルキル基が炭素数３〜９であるものが好ましい。このような3HAとしては、例えば3-ヒドロキシへキサン酸、3-ヒドロキシオクタン酸、3-ヒドロキシデカン酸、3-ヒドロキシドデカン酸が挙げられる。 Polyhydroxyalkanoate synthase (PhaC1 Ps ) derived from Pseudomonas 61-3 strain has the ability to accumulate copolymer P (3HB-co-3HA) in cells. As the 3-hydroxyalkanoic acid (3HA) constituting P (3HB-co-3HA), an alkyl group that is a substituent at the 3-position of 3HA has preferably 3 to 9 carbon atoms. Examples of such 3HA include 3-hydroxyhexanoic acid, 3-hydroxyoctanoic acid, 3-hydroxydecanoic acid, and 3-hydroxydodecanoic acid.
本発明の遺伝子は、当該PhaC1Psのアミノ酸配列（配列番号１）の477番のセリン(agt)が、システィン（tgc)、アスパラギン酸(gac)、グルタミン酸(gaa)、リシン(aag)、ロイシン（ctg）、トレオニン(acc)、バリン(gtc)、トリプトファン(tgg)又はチロシン(tac)に置換されたアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する。この中で、共重合体P(3HB-co-3HA)の生産性の高さ及び共重合体中の3HB(3-ヒドロキシブタン酸)の含有率の高さの点から、当該セリンがロイシン、トレオニン又はバリンに置換されたアミノ酸配列をコードする塩基配列が好ましい。
各アミノ酸に対応する遺伝暗号は、当該アミノ酸に対応する他の遺伝暗号に変更してもよいが、導入する遺伝子の翻訳効率の点から、各アミノ酸について、使用頻度の高い上記括弧内の遺伝暗号を使用することが好ましい。
In the gene of the present invention, serine (agt) at position 477 of the amino acid sequence of PhaC1 Ps (SEQ ID NO: 1) is cysteine (tgc), aspartic acid (gac), glutamic acid (gaa), lysine (aag), leucine ( ctg), a base sequence encoding an amino acid sequence substituted with threonine (acc), valine (gtc), tryptophan (tgg) or tyrosine (tac). Among these, in terms of the high productivity of the copolymer P (3HB-co-3HA) and the high content of 3HB (3-hydroxybutanoic acid) in the copolymer, the serine is leucine, A base sequence encoding an amino acid sequence substituted with threonine or valine is preferred.
The genetic code corresponding to each amino acid may be changed to another genetic code corresponding to the amino acid, but from the viewpoint of the translation efficiency of the gene to be introduced, the genetic code in the parentheses frequently used for each amino acid is used. Is preferably used.
尚、Pseudomonas 61-3株由来ポリヒドロキシアルカン酸合成酵素遺伝子のアミノ酸配列（配列番号１）はDDBJ 受託番号 BAA36200.1として、塩基配列（配列番号２）はDDBJ受託番号 AB014758として登録されている。 The amino acid sequence (SEQ ID NO: 1) of the polyhydroxyalkanoate synthase gene derived from the Pseudomonas 61-3 strain is registered as DDBJ accession number BAA36200.1, and the base sequence (SEQ ID NO: 2) is registered as DDBJ accession number AB014758.
ポリヒドロキシアルカン酸合成酵素(PhaC1Ps)への変異の導入は、例えばpGEM-T（プロメガより入手可能）等のベクターに、Pseudomonas 61-3株由来ポリヒドロキシアルカン酸合成酵素遺伝子phaC1Ps（野生型）とR. eutropha属由来のモノマー供給遺伝子phaABReを挿入することによって作製されたプラスミドを鋳型として、PCR反応により行うことができる。すなわち、各アミノ酸について、変異が挿入されたフォワードプライマー及び変異が挿入されていないリバースプライマーを設計し、これらを用いてプラスミドごとに増幅することにより導入できる。
導入する変異は、477番のセリン(agt)に関しては、システィン（tgc)、アスパラギン酸(gac)、グルタミン酸(gaa)、リシン(aag)、ロイシン（ctg）、トレオニン(acc)、バリン(gtc)、トリプトファン(tgg)又はチロシン(tac)である。
The introduction of mutations into polyhydroxyalkanoate synthase (PhaC1 Ps ) can be achieved by, for example, pGEM-T (available from Promega) and other vectors, Pseudomonas 61-3 derived polyhydroxyalkanoate synthase gene phaC1 Ps (wild type) And a plasmid prepared by inserting the monomer supply gene phaAB Re derived from the genus R. eutropha with a template as a template. That is, for each amino acid, it can be introduced by designing a forward primer into which a mutation has been inserted and a reverse primer into which no mutation has been inserted, and amplifying each plasmid using these.
Regarding the 477th serine (agt), cysteine (tgc), aspartic acid (gac), glutamic acid (gaa), lysine (aag), leucine (ctg), threonine (acc), valine (gtc) , Tryptophan (tgg) or tyrosine (tac).
また、本発明では、配列番号１で示されるアミノ酸配列の481番のグルタミン(cag)に関しても変異を導入することができる。具体的には、システィン(tgc)、グルタミン酸(gaa)、フェニルアラニン(ttc)、イソロイシン(atc)、リシン(aag)、ロイシン(ctg)、メチオニン(atg)、バリン(gtc)、トリプトファン(tgg)又はアルギニン(cgc)が挙げられる。この中で、P(3HB-co-3HA)の生産性の高さ及び共重合体中の3HBの含有率の高さの点から、バリン、トリプトファン又はイソロイシンが好ましい。 In the present invention, a mutation can also be introduced into the 481st glutamine (cag) of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1. Specifically, cysteine (tgc), glutamic acid (gaa), phenylalanine (ttc), isoleucine (atc), lysine (aag), leucine (ctg), methionine (atg), valine (gtc), tryptophan (tgg) or Arginine (cgc) is mentioned. Among these, valine, tryptophan, or isoleucine is preferable from the viewpoint of high productivity of P (3HB-co-3HA) and high content of 3HB in the copolymer.
更に、本発明では、配列番号１で示されるアミノ酸配列の130番のグルタミン酸(gaa)に関しても変異を導入することができる。具体的には、フェニルアラニン(ttc)、ヒスチジン(cag)、イソロイシン(atc)、ロイシン(ctg)、バリン(gtc)、トリプトファン(tgg)又はチロシン(tac)が挙げられる。中でも、フェニルアラニン、イソロイシン、バリン又はチロシンが好ましい。 Furthermore, in the present invention, a mutation can also be introduced with respect to the 130th glutamic acid (gaa) of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1. Specific examples include phenylalanine (ttc), histidine (cag), isoleucine (atc), leucine (ctg), valine (gtc), tryptophan (tgg) or tyrosine (tac). Of these, phenylalanine, isoleucine, valine or tyrosine is preferred.
更にまた、本発明では、配列番号１で示されるアミノ酸配列の325番のセリンに関しても変異を導入することができる。具体的には、フェニルアラニン(ttc)、グリシン(ggc)、ヒスチジン(cag)、イソロイシン(atc)、ロイシン(ctg)、メチオニン(atg)、アスパラギン(aac)、又はチロシン(tac)が挙げられる。中でも、ロイシン又はチロシンが好ましい。 Furthermore, in the present invention, a mutation can also be introduced with respect to the 325th serine of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. Specific examples include phenylalanine (ttc), glycine (ggc), histidine (cag), isoleucine (atc), leucine (ctg), methionine (atg), asparagine (aac), or tyrosine (tac). Of these, leucine or tyrosine is preferable.
本発明の形質転換体を導入する宿主細胞としては、油脂類を炭素源として使用した場合の増殖性が良好で、菌株の安全性が高く、菌体と培養液との分離が比較的容易である点から、R. eutropha H16のPHA蓄積能欠損株であるR. eutropha PHB-4株を使用する。現在のところ、遺伝子phaC1PsのR. eutropha PHB-4株への直接的な形質転換法は確立されていないが、接合伝達によって本発明の遺伝子phaC1Psを伝達することができる。尚、接合伝達は、Fプラスミドを有する細胞(F+)から有さない細胞(F-)に遺伝子が自然伝達される現象であり、菌株間で二つの細胞を接触させることにより、DNAの一部が伝達される。具体的には、移動能を有するmob領域を持つベクターpBBR1MCS-2に、本発明の遺伝子phaC1Psを含む上記プラスミドのDNA断片をライゲーションし、ライゲーションによって得られるプラスミドを、DNAの移動に直接関わるtra領域が染色体中に組み込まれているE. coli S17-1株中で形質転換した後、得られたプラスミドをR. eutropha PHB-4株と接触させる。図１に本発明の形質転換体の作製法を示す。 As a host cell into which the transformant of the present invention is introduced, the growth property when oils and fats are used as a carbon source is good, the safety of the strain is high, and the cell body and the culture solution are relatively easy to separate. From a certain point, the R. eutropha PHB - 4 strain, which is a PHA accumulation-deficient strain of R. eutropha H16, is used. At present, a direct transformation method of the gene phaC1 Ps to the R. eutropha PHB - 4 strain has not been established, but the gene phaC1 Ps of the present invention can be transmitted by conjugative transfer. Conjugation transfer is a phenomenon in which a gene is naturally transferred from a cell having F plasmid (F + ) to a cell not having F plasmid (F − ). Part is transmitted. Specifically, the vector pBBR1MCS-2 having a mob region having the ability to migrate is ligated with the DNA fragment of the above plasmid containing the gene phaC1 Ps of the present invention, and the plasmid obtained by the ligation is directly related to the DNA transfer. After transformation in E. coli strain S17-1 in which the region has been integrated into the chromosome, the resulting plasmid is contacted with the R. eutropha PHB - 4 strain. FIG. 1 shows a method for producing the transformant of the present invention.
本発明の形質転換体の宿主細胞への導入は、公知の方法により行うことができる。例えば、カルシウム法（Lederberg. E. M. et al., J. Bacteriol. 119. 1072(1974)）やエレクトロポレーション法（Current Protocols in Molecular Biology, 1 巻, 184頁, 1994年）等を用いることができる。また、Fast Track TM-Yeast Transformation KitSM(Geno Technology)のような市販の形質転換キットを利用することもできる。 Introduction of the transformant of the present invention into a host cell can be performed by a known method. For example, the calcium method (Lederberg. EM et al., J. Bacteriol. 119. 1072 (1974)), the electroporation method (Current Protocols in Molecular Biology, 1, 184, 1994), etc. can be used. . A commercially available transformation kit such as Fast Track ™ -Yeast Transformation KitSM (Geno Technology) can also be used.
本発明の共重合体P(3HB-co-3HA)の製造は、培養培地に本発明の形質転換体を添加して培養した後、得られた当該培養菌体又は培養物からP(3HB-co-3HA)を回収することにより行うことができる。培養温度は、菌の生育可能な温度、好ましくは15〜40℃、特に好ましくは20〜40℃、更に好ましくは28〜34℃である。培養時間は、特に限定されないが、例えばバッチ培養では１〜７日間が好ましく、また連続培養も可能である。培養培地は、本発明の宿主が利用できるものである限り特に限定されない。炭素源に加えて、窒素源、無機塩類、その他の有機栄養源等を含有する培地を使用することができる。 Production of the copolymer P (3HB-co-3HA) of the present invention is carried out by adding the transformant of the present invention to the culture medium and culturing, and then using the obtained cultured cells or culture, P (3HB- co-3HA) can be recovered. The culture temperature is a temperature at which bacteria can grow, preferably 15 to 40 ° C, particularly preferably 20 to 40 ° C, and more preferably 28 to 34 ° C. The culture time is not particularly limited, but for example, 1 to 7 days is preferable in batch culture, and continuous culture is also possible. The culture medium is not particularly limited as long as it can be used by the host of the present invention. In addition to the carbon source, a medium containing a nitrogen source, inorganic salts, other organic nutrient sources, and the like can be used.
本発明の製造法では炭素源として油脂類を用いる。油脂類としては、例えば大豆油、コーン油、綿実油、落花生油、ヤシ油、パーム油、パーム核油、又はこられの分別油、例えばパームWオレイン油（パーム油を2回無溶媒分別した低沸点画分）、パーム核油オレイン（パーム核油を１回無溶媒分別した低沸点画分）、又はこれらの油脂やその画分を化学的もしくは生化学的に処理した合成油、あるいはこれらの混合油が挙げられる。なかでも、コストの点から天然油が好ましく、特に大豆油が好ましい。 In the production method of the present invention, fats and oils are used as a carbon source. Examples of fats and oils include soybean oil, corn oil, cottonseed oil, peanut oil, coconut oil, palm oil, palm kernel oil, or fractionated oils thereof such as palm W olein oil (low-oil fractionated palm oil twice). Boiling fraction), palm kernel oil olein (a low-boiling fraction obtained by fractionating palm kernel oil once), or a synthetic oil obtained by chemically or biochemically treating these oils and fats, or these A mixed oil is mentioned. Of these, natural oil is preferable from the viewpoint of cost, and soybean oil is particularly preferable.
窒素源としては、例えばアンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸水素二アンモニウム等のアンモニウム塩、ペプトン、肉エキス、酵母エキス等が挙げられる。
無機塩類としては、例えばリン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸水素マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム等が挙げられる。
その他の有機栄養源としては、例えばグリシン、アラニン、セリン、トレオニン、プロリン等のアミノ酸類；ビタミン B1、ビタミン B12、ビオチン、ニコチン酸アミド、パントテン酸、ビタミンC等のビタミン類などが挙げられる。
Examples of the nitrogen source include ammonium salts such as ammonia, ammonium chloride, ammonium sulfate, and diammonium hydrogen phosphate, peptone, meat extract, and yeast extract.
Examples of inorganic salts include monopotassium phosphate, dipotassium phosphate, magnesium hydrogen phosphate, magnesium sulfate, and sodium chloride.
Examples of other organic nutrient sources include amino acids such as glycine, alanine, serine, threonine, and proline; vitamins such as vitamin B1, vitamin B12, biotin, nicotinamide, pantothenic acid, and vitamin C.
P(3HB-co-3HA)の菌体からの回収は、例えば、次の方法によって行うことができる。培養終了後、遠心分離器等で培養液から菌体を分離し、その菌体を蒸留水、メタノール等により洗浄した後、乾燥させた後、この乾燥菌体から、クロロホルム等の有機溶媒を用いて共重合体を抽出する。次いで、この共重合体を含む有機溶媒溶液から、濾過等によって菌体成分を除去し、その濾液にメタノールやへキサン等の貧溶媒を加えて共重合体を沈殿させる。沈殿した共重合体から、濾過や遠心分離によって上澄み液を除去し、乾燥させ、共重合体を回収することができる。得られた共重合体の分析は、例えば、ガスクロマトグラフ法や核磁気共鳴法等により行うことができる。 Recovery of P (3HB-co-3HA) from cells can be performed, for example, by the following method. After completion of the culture, the cells are separated from the culture solution using a centrifuge, the cells are washed with distilled water, methanol, etc., and then dried, and then an organic solvent such as chloroform is used from the dried cells. To extract the copolymer. Next, the bacterial cell component is removed from the organic solvent solution containing the copolymer by filtration or the like, and a poor solvent such as methanol or hexane is added to the filtrate to precipitate the copolymer. The supernatant can be removed from the precipitated copolymer by filtration or centrifugation, and dried to recover the copolymer. The obtained copolymer can be analyzed, for example, by gas chromatography, nuclear magnetic resonance, or the like.
本発明の製造法によって得られるP(3HB-co-3HA)における(R)-3-ヒドロキシブタン酸（3HB)の含量は、通常、68〜95 mol%の範囲である。特に477番目のセリンのロイシン、トレオニン又はバリンへの置換体、325番目のセリンのフェニルアラニン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン又はチロシンへの置換体、130番目のグルタミン酸のフェニルアラニン、イソロイシン、バリン、トリプトファン又はチロシン、及び481番目のグルタミンのイソロイシン、バリン又はトリプトファンへの置換体では、約80〜95 mol%と非常に高い。このように、P(3HB-co-3HA)の90 mol%前後が3HBで構成されかつ残りの10 mol%前後が上記の中鎖長モノマーで構成される共重合体は、特に柔軟性に優れるため、工業的に有用な高分子材料である。 The content of (R) -3-hydroxybutanoic acid (3HB) in P (3HB-co-3HA) obtained by the production method of the present invention is usually in the range of 68 to 95 mol%. Especially, 477th serine to leucine, threonine or valine, 325th serine to phenylalanine, histidine, isoleucine, leucine, methionine or tyrosine, 130th glutamic acid phenylalanine, isoleucine, valine, tryptophan or In the substitution of tyrosine and 481st glutamine with isoleucine, valine or tryptophan, it is very high at about 80 to 95 mol%. Thus, a copolymer in which about 90 mol% of P (3HB-co-3HA) is composed of 3HB and the remaining about 10 mol% is composed of the medium chain length monomer is particularly excellent in flexibility. Therefore, it is an industrially useful polymer material.
次に実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に何ら限定されるものではない。 EXAMPLES Next, although an Example is given and this invention is demonstrated in detail, this invention is not limited to these Examples at all.
以下、3-ヒドロキシブタン酸、3-ヒドロキシへキサン酸、3-ヒドロキシオクタン酸、3-ヒドロキシデカン酸、3-ヒドロキシドデカン酸を、それぞれC4モノマー、C6モノマー、C8モノマー、C10モノマー、C12モノマーと称することがある。 Hereinafter, 3-hydroxybutanoic acid, 3-hydroxyhexanoic acid, 3-hydroxyoctanoic acid, 3-hydroxydecanoic acid, and 3-hydroxydodecanoic acid are respectively referred to as C4 monomer, C6 monomer, C8 monomer, C10 monomer, and C12 monomer. Sometimes called.
＜材料及びその調製方法＞
（１）微生物
a) Escherichia coli（エスチェリシア・コリ) DH5α株（カタラバイオより入手）
b) Escherichia coli S17-1株（H. G. Schlegel (Georg-August-Universitat、ドイツより入手）
c) Ralstonia eutropha(ラルストニア・ユートロファ) PHB-4（R. eutropha H16のポリヒドロキシアルカン酸蓄積能欠損株 DSM541、ドイツDSMより入手）
<Material and its preparation method>
(1) Microorganism
a) Escherichia coli DH5α strain (available from Katara Bio)
b) Escherichia coli S17-1 strain (HG Schlegel (Georg-August-Universitat, obtained from Germany))
c) Ralstonia eutropha PHB - 4 ( R. eutropha H16 polyhydroxyalkanoic acid accumulation deficient strain DSM541, obtained from Germany DSM)
（２）培地
a) Luria-Bertani（LB）培地
Bacto trypton 10 g、酵母エキス ５g、NaCl 10 gを脱イオン水１Lに溶かして、110℃で20分間オートクレーブして作製した。また、寒天培地は、上記成分に寒天 1.5〜2 %(vol/vol)となるよう加えオートクレーブして作製した。抗生物質（カナマイシン：終濃度 50μg/mL、アンピシリン：終濃度100μg/mL）は、液体培地、寒天培地ともにオートクレーブ後に添加した。
b) Nutrient-rich（NR）培地
Bacto trypton 10 g、酵母エキス ２g、肉エキス 10 gを脱イオン水１Lに溶かして、110℃で20分間オートクレーブして作製した。抗生物質（カナマイシン：終濃度50μg/mL）はオートクレーブ後の液体培地に添加した。
c) シモンズクエン酸培地
クエン酸ナトリウム ２g、NaCl ５g、NH4H2PO4 １g、K2HPO4 １g、MgSO4 0.2 gを脱イオン水１Lに溶かして、110℃で20分間オートクレーブした後、アガー 15gを加えて作製した。寒天培地は、まず液体培地をpH 6.9に調整し、渇変を防ぐため当該液体培地と寒天成分とを別々に121℃で20分間オートクレーブした後にこれらを混合した。更に、200 g/Lに調整したMgSO4・7H2Oをフィルター滅菌し、培地全量に対し1/1000量及び抗生物質（カナマイシン：終濃度50μg/mL）を加え、滅菌シャーレに分注してプレートを作製した。
d) MS培地
d-1) 微量金属塩培地(0.1N HCl)：CoCl2・6H20 0.218 g、FeCl3 9.7 g、CaCl2 7.8 g、NiCl3・6H2O 0.118 g、CrCl3・6H2O 0.105 g、CuSO4・5H2O 0.156 gを脱イオン水１Lに溶かして、110℃で20分間オートクレーブして作製した。
d-2) ミネラル培地(pH 7)：K2HPO4 1.5 g、Na2HPO4・12H2O 9.0 g、NH4Cl 0.5 g、微量金属塩培地 １mlを脱イオン水１Lに溶かして、110℃で20分間オートクレーブした後、MgSO4・7H2O 0.2 gを加えて作製した。
(2) Medium
a) Luria-Bertani (LB) medium
Bacto trypton 10 g, yeast extract 5 g, and NaCl 10 g were dissolved in 1 L of deionized water and autoclaved at 110 ° C. for 20 minutes. The agar medium was prepared by autoclaving the above components to 1.5 to 2% (vol / vol) of agar. Antibiotics (kanamycin:
b) Nutrient-rich (NR) medium
Bacto trypton 10 g, yeast extract 2 g, and meat extract 10 g were dissolved in 1 L of deionized water and autoclaved at 110 ° C. for 20 minutes. Antibiotics (kanamycin:
c) Simmons citrate medium 2 g of sodium citrate, 5 g of NaCl, 1 g of NH 4 H 2 PO 4, 1 g of K 2 HPO 4 and 0.2 g of MgSO 4 were dissolved in 1 L of deionized water and autoclaved at 110 ° C. for 20 minutes. It was prepared by adding 15 g of agar. For the agar medium, the liquid medium was first adjusted to pH 6.9, and the liquid medium and the agar component were separately autoclaved at 121 ° C. for 20 minutes in order to prevent thirst, and then mixed. Furthermore, filter sterilize MgSO 4 · 7H 2 O adjusted to 200 g / L, add 1/1000 volume and antibiotics (kanamycin:
d) MS medium
d-1) Trace metal salt medium (0.1N HCl): CoCl 2 ·
d-2) Mineral medium (pH 7): K 2 HPO 4 1.5 g, Na 2 HPO 4 · 12H 2 O 9.0 g, NH 4 Cl 0.5 g, trace metal salt medium 1 ml is dissolved in 1 L of deionized water. After autoclaving at 20 ° C. for 20 minutes, 0.2 g of MgSO 4 .7H 2 O was added.
（３）プラスミドの構築
図１にプラスミドの構築法を示す。
a) 野生型pGEM"C1PsABRe
pGEM"C1PsABReは、pGEM-Tベクター(プロメガより入手)に、配列番号２で示されるPseudomonas 61-3株由来のPHA合成酵素遺伝子phaC1Psと、R. eutropha属由来のモノマー供給遺伝子phaABReとを挿入して作製した。
(3) Construction of plasmid FIG. 1 shows a construction method of a plasmid.
a) Wild-type pGEM "C1 Ps AB Re
pGEM "C1 Ps AB Re is added to the pGEM-T vector (obtained from Promega), PHA synthase gene phaC1 Ps derived from Pseudomonas 61-3 strain represented by SEQ ID NO: 2, and monomer supply gene phaAB derived from the genus R. eutropha. Re and inserted.
b) 変異導入pGEM"C1PsABRe
上記野生型のプラスミドpGEM"C1PsABReを鋳型としたPCR法により、PHA合成酵素遺伝子phaC1Psの1429〜1431番のコドンagt（Ser）（配列番号２の塩基配列中の下線部）が、コドンtgc（Cys）、gac（Asp）、gaa（Glu）、aag（Lys）、ctg（Leu）、acc（Thr）、gtc（Val）、tgg（Trp）、tac（Tyr）、gcc（Ala）、ttc（Phe）、ggc（Gly）、cac（His）、atc（Ile）、atg（Met）、aac（Asn）、ccg（Pro）、cag(Gln)又はcgc(Arg)にそれぞれ置換された塩基配列を有するDNA断片を、当該変異が挿入されたフォワードプライマー（配列番号３）及び変異が挿入されていないリバースプライマー（配列番号４）によりプラスミド全体を増幅させ、これを自己ライゲーションすることにより、当該変異を挿入した。配列番号３の「X」は、Ser以外の19種類のアミノ酸残基を示す。PCRの条件は、96℃で１分、58℃で30秒、68℃で8分を１サイクルとして、これを30回繰り返した。
b) Mutated pGEM "C1 Ps AB Re
By the PCR method using the wild-type plasmid pGEM "C1 Ps AB Re as a template, the codon agt (Ser) at positions 1429 to 1431 of the PHA synthase gene phaC1 Ps (underlined in the base sequence of SEQ ID NO: 2) Codons tgc (Cys), gac (Asp), gaa (Glu), aag (Lys), ctg (Leu), acc (Thr), gtc (Val), tgg (Trp), tac (Tyr), gcc (Ala) , Ttc (Phe), ggc (Gly), cac (His), atc (Ile), atg (Met), aac (Asn), ccg (Pro), cag (Gln) or cgc (Arg), respectively By amplifying the whole plasmid with a forward primer (SEQ ID NO: 3) in which the mutation is inserted and a reverse primer (SEQ ID NO: 4) in which the mutation is not inserted, and self-ligating the DNA fragment having the base sequence, The mutation was inserted, and “X” in SEQ ID NO: 3 represents 19 types of amino acid residues other than Ser. The PCR conditions were 96 ° C for 1 minute, 58 ° C for 30 seconds and 68 ° C for 8 minutes, and this was repeated 30 times.
また、PHA合成酵素遺伝子phaC1Psの1441〜1443番のコドンcag（Gln）（配列番号２の塩基配列中の下線部）が、tgc（Cys）、gaa（Glu）、ttc（Phe）、atc（Ile）、aag（Lys）、ctg（Leu）、atg（Met）、gtc（Val）、tgg（Trp）、gcc（Ala）、gac（Asp）、ggc（Gly）、cac（His）、aac（Asn）、ccg（Pro）、agt（Ser）、acc（Thr）、tac（Tyr）又はcgc(Arg)にそれぞれ置換された塩基配列を有するDNA断片を、当該変異が挿入されたフォワードプライマー（配列番号５）及び変異が挿入されていないリバースプライマー（配列番号６）によりプラスミド全体を増幅させ、これを自己ライゲーションすることにより、当該変異を挿入した。配列番号５の「X」は、Gln以外の19種類のアミノ酸残基を示す。 In addition, codons cag (Gln) of 1441 to 1443 of the PHA synthase gene phaC1 Ps (underlined portion in the base sequence of SEQ ID NO: 2) are tgc (Cys), gaa (Glu), ttc (Phe), atc ( Ile), aag (Lys), ctg (Leu), atg (Met), gtc (Val), tgg (Trp), gcc (Ala), gac (Asp), ggc (Gly), cac (His), aac ( Asn), ccg (Pro), agt (Ser), acc (Thr), tac (Tyr) or cgc (Arg), each of the DNA fragments having the nucleotide sequence replaced with the forward primer (sequence) The whole plasmid was amplified by No. 5) and a reverse primer (SEQ ID No. 6) into which no mutation was inserted, and the mutation was inserted by self-ligation. “X” in SEQ ID NO: 5 represents 19 types of amino acid residues other than Gln.
また、PHA合成酵素遺伝子phaC1Psの388〜390番のコドンgaa（Glu）（配列番号２の塩基配列中の下線部）が、tgc（Cys）、cag（Gln）、ttc（Phe）、atc（Ile）、aag（Lys）、ctg（Leu）、atg（Met）、gtc（Val）、tgg（Trp）、gcc（Ala）、gac（Asp）、ggc（Gly）、cac（His）、aac（Asn）、ccg（Pro）、agt（Ser）、acc（Thr）、tac（Tyr）又はcgc(Arg)にそれぞれ置換された塩基配列を有するDNA断片を、当該変異が挿入されたフォワードプライマー（配列番号７）及び変異が挿入されていないリバースプライマー（配列番号８）によりプラスミド全体を増幅させ、これを自己ライゲーションすることにより、当該変異を挿入した。配列番号７の「X」は、Glu以外の19種類のアミノ酸残基を示す。 In addition, codon gaa (Glu) of 388 to 390 of PHA synthase gene phaC1 Ps (underlined part in the base sequence of SEQ ID NO: 2) is tgc (Cys), cag (Gln), ttc (Phe), atc ( Ile), aag (Lys), ctg (Leu), atg (Met), gtc (Val), tgg (Trp), gcc (Ala), gac (Asp), ggc (Gly), cac (His), aac ( Asn), ccg (Pro), agt (Ser), acc (Thr), tac (Tyr) or cgc (Arg), each of the DNA fragments having the nucleotide sequence replaced with the forward primer (sequence) The whole plasmid was amplified by No. 7) and a reverse primer (SEQ ID No. 8) into which no mutation was inserted, and the mutation was inserted by self-ligation. “X” in SEQ ID NO: 7 represents 19 types of amino acid residues other than Glu.
更に、PHA合成酵素遺伝子phaC1Psの973〜975番のコドンagc（Ser）（配列番号２の塩基配列中の下線部）が、tgc（Cys）、gaa（Glu）、cag（Gln）、ttc（Phe）、atc（Ile）、aag（Lys）、ctg（Leu）、atg（Met）、gtc（Val）、gcc（Ala）、gac（Asp）、ggc（Gly）、cac（His）、aac（Asn）、ccg（Pro）、acc（Thr）、tac（Tyr）又はcgc(Arg)にそれぞれ置換された塩基配列を有するDNA断片を、当該変異が挿入されたフォワードプライマー（配列番号９）(下線部分が変異導入部分）及び変異が挿入されていないリバースプライマー（配列番号１０）によりプラスミド全体を増幅させ、これを自己ライゲーションすることにより、当該変異を挿入した。配列番号９の「X」は、Ser以外の19種類のアミノ酸残基を示す。 Furthermore, codons agc (Ser) from 973 to 975 of the PHA synthase gene phaC1 Ps (underlined part in the base sequence of SEQ ID NO: 2) are tgc (Cys), gaa (Glu), cag (Gln), ttc ( Phe), atc (Ile), aag (Lys), ctg (Leu), atg (Met), gtc (Val), gcc (Ala), gac (Asp), ggc (Gly), cac (His), aac ( Asn), ccg (Pro), acc (Thr), tac (Tyr) or a DNA fragment having a base sequence substituted by cgc (Arg), a forward primer (SEQ ID NO: 9) with the mutation inserted (underlined) The mutation was inserted by amplifying the entire plasmid with a reverse primer (SEQ ID NO: 10) into which the mutation was introduced and a reverse primer into which no mutation was inserted, and self-ligating it. “X” in SEQ ID NO: 9 represents 19 types of amino acid residues other than Ser.
c) プラスミドの抽出
野生型pGEM"C1PsABRe及び変異導入pGEM"C1PsABReプラスミドをE. coli DH5α株に形質転換し、抗生物質含有LB寒天培地で37℃、12時間培養した。プレート上に形成された単一コロニーを拾い、抗生物質含有LB培地1.7 mLに植菌し、37℃、160/分で12時間振盪培養した。当該培養液からE. coli DH5α株を回収し、75μLのTE溶液（10 mM Tris-HCl, １mM EDTA, pH 8.0）を用い、Rapid Plasmid Miniprep System（MARLIGEN BIOSCIENCE社製）によりプラスミドを抽出した。
c) Extraction of plasmid Wild-type pGEM "C1 Ps AB Re and mutagenized pGEM" C1 Ps AB Re plasmid were transformed into E. coli DH5α strain and cultured in an antibiotic-containing LB agar medium at 37 ° C for 12 hours. A single colony formed on the plate was picked, inoculated into 1.7 mL of antibiotic-containing LB medium, and cultured with shaking at 37 ° C. and 160 / min for 12 hours. The E. coli DH5α strain was recovered from the culture solution, and a plasmid was extracted with 75 μL of TE solution (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0) using Rapid Plasmid Miniprep System (manufactured by MARLIGEN BIOSCIENCE).
d) pBBR1"C1PsABRe
まず、挿入DNA断片を作製した。上記c)の抽出プラスミドをBamHIによって消化し、0.8 %アガロースゲル（TaKaRa社製）を用いて電気泳動を行った。その後、分離した目的のDNA断片のゲルを切り出し、Rapid Gel Extraction System（MARLIGEN BIOSCIENCE社製）を用いて精製した。その際、50μLのTE溶液を用いて溶出した。更に、このDNA断片をエタノール沈殿によって濃縮し、10μLのTE溶液に溶解した。
このようにして得られた濃縮挿入DNA断片４μLとpBBR1MCS-2ベクター（M. E. K. Kovach, Louisiana State University，米国より入手)１μLとを混合し、DNA Ligation kit ver.2（TaKaRa社製）を５μL加えた後、16℃で約２〜３時間反応させた。次いで、上記c)の方法によって、プラスミド抽出を行い、挿入断片の有無及び挿入方向を確認し、pGEM"C1PsABReのBamHI断片（phaC1PsとphaABReとを含む）を挿入したプラスミドpBBR1"C1PsABReを作製した。
d) pBBR1 "C1 Ps AB Re
First, an inserted DNA fragment was prepared. The extracted plasmid of c) was digested with BamHI and electrophoresed using a 0.8% agarose gel (TaKaRa). Then, the gel of the target DNA fragment which isolate | separated was cut out, and it refine | purified using Rapid Gel Extraction System (made by MARLIGEN BIOSCIENCE). At that time, elution was performed using 50 μL of TE solution. Further, this DNA fragment was concentrated by ethanol precipitation and dissolved in 10 μL of TE solution.
4 μL of the thus obtained concentrated inserted DNA fragment was mixed with 1 μL of pBBR1MCS-2 vector (obtained from MEK Kovach, Louisiana State University, USA), and 5 μL of DNA Ligation kit ver. 2 (TaKaRa) was added. Then, it was made to react at 16 degreeC for about 2-3 hours. Next, plasmid extraction is carried out by the above method c), the presence or absence and direction of insertion of the inserted fragment are confirmed, and the plasmid pBBR1 "into which the BamHI fragment of pGEM" C1 Ps AB Re (including phaC1 Ps and phaAB Re ) has been inserted. C1 Ps AB Re was prepared.
（４）リコンビナントR. eutropha PHB-4株の作製及び培養
a) リコンビナントR. eutropha PHB-4株の作製
R. eutropha PHB-4株への遺伝子伝達を目的として接合伝達を行った。プラスミドpBBR1"C1PsABReをE. coli S17-1株へ形質転換し、抗生物質入りのプレートで37℃、12時間培養を行った。プレート上に形成された単一コロニーを拾い、抗生物質を入れた1.7 mLのLB培地に植菌し37℃、160/分で12時間振盪培養した。培養後、培養液を1.5 mLチューブに移し、12,000 rpm（12,500×g）で１分間遠心した。ここで、抗生物質含有LB培地は上清を完全に取り除き、新たにLB培地を500μL加えて懸濁し、再度12,000 rpmで１分間遠心した。次いで、LB培地の上清を残りが約50μLとなるよう取り除き懸濁させた。
(4) Production and culture of recombinant R. eutropha PHB - 4 strain
a) Preparation of recombinant R. eutropha PHB - 4 strain
Conjugative transfer was performed for the purpose of gene transfer to R. eutropha PHB - 4. Plasmid pBBR1 "C1 Ps AB Re was transformed into E. coli strain S17-1, and cultured on a plate containing antibiotics for 12 hours at 37 ° C. A single colony formed on the plate was picked and antibiotics were collected. Was inoculated into 1.7 mL of LB medium containing sucrose and cultured with shaking at 37 ° C. and 160 / min for 12 hours, after which the culture was transferred to a 1.5 mL tube and centrifuged at 12,000 rpm (12,500 × g) for 1 minute. Here, the supernatant of the antibiotic-containing LB medium was completely removed, 500 μL of LB medium was newly added and suspended, and centrifuged again at 12,000 rpm for 1 minute, and the remaining supernatant of the LB medium was about 50 μL. Removed and suspended.
同時に、宿主となるR. eutropha PHB-4株も1.7 mLのNR培地に植菌し、30℃、12時間培養を行った。LB培地同様、培養液を1.5 mLチューブに移し、12,000 rpm(12,500×g)で１分間遠心を行った。そして、NR培地の上清を残りが約50μLとなるよう取り除き懸濁させた。これらの懸濁液を混合し、抗生物質無添加のLBプレート上に滴下し、乾燥させた後37℃で５時間培養を行った。 At the same time, the host strain R. eutropha PHB - 4 was also inoculated into 1.7 mL of NR medium and cultured at 30 ° C. for 12 hours. Like the LB medium, the culture solution was transferred to a 1.5 mL tube and centrifuged at 12,000 rpm (12,500 × g) for 1 minute. Then, the supernatant of the NR medium was removed and suspended so that the remaining amount was about 50 μL. These suspensions were mixed, dropped onto an LB plate without antibiotics, dried, and then cultured at 37 ° C. for 5 hours.
その後、E. coli S17-1株とR. eutropha PHB-4株との混合菌体を抗生物質入りのシモンズクエン酸培地に白金耳を用いて塗布し、30℃で２〜３日培養した。ここで、単離したコロニーを白金耳で拾い、再び抗生物質入りのシモンズクエン酸培地に塗布し、30℃で２〜３日培養した。これにより単離したコロニー（リコンビナントR. eutropha株）を以降の実験で使用した。 Thereafter, mixed cells of E. coli S17-1 strain and R. eutropha PHB - 4 strain were applied to Simmons citrate medium containing antibiotics using a platinum loop and cultured at 30 ° C. for 2 to 3 days. Here, the isolated colony was picked up with a platinum loop, applied again to Simmons citrate medium containing antibiotics, and cultured at 30 ° C. for 2 to 3 days. Colonies thus isolated (recombinant R. eutropha strain) were used in subsequent experiments.
b) リコンビナントR. eutropha株の培養
リコンビナントR. eutropha株の培養にはMS培地を用いた。シモンズクエン酸培地上で単離した単一コロニーを白金耳を用いて1.7 mLのNR培地に植菌し、30℃で12時間振盪培養した（前培養）。この培養液１mLを、大豆油(5 g/L)及び抗生物質を含む100 mLのMS培地に植菌し、30℃、130/分で72時間振盪培養を行った（本培養）。
以上の方法で培養後、250 mL遠心管に培養液を移し、４℃、6,000 rpm（4,050×g）で10分間遠心し集菌した。ここで、大豆油を除去するために、培養液に20 mLのヘキサンを加え、よく振盪することにより残存していた油脂分を取り除いた。菌を遠心分離後、約20 mLの水に菌体を懸濁させ、再度４℃、6,000 rpmで10分間遠心し集菌し、上清を取り除いた。集菌した菌のペレットを２〜３mLの超純水に懸濁させ、５mLのポリプロピレン容器に移し、風穴を開けたパラフィルムを貼り付け、-80℃で凍結乾燥し、72時間真空乾燥させることにより乾燥菌体を得た。
b) the culture of culture recombinant R. eutropha strains of recombinant R. eutropha strain using the MS medium. A single colony isolated on a Simmons citrate medium was inoculated into 1.7 mL of NR medium using a platinum loop and cultured with shaking at 30 ° C. for 12 hours (preculture). 1 mL of this culture solution was inoculated into 100 mL of MS medium containing soybean oil (5 g / L) and antibiotics, followed by shaking culture at 30 ° C. and 130 / min for 72 hours (main culture).
After culturing by the above method, the culture solution was transferred to a 250 mL centrifuge tube and collected by centrifugation at 4 ° C. and 6,000 rpm (4,050 × g) for 10 minutes. Here, in order to remove soybean oil, 20 mL of hexane was added to the culture solution, and the remaining fat and oil were removed by shaking well. After centrifuging the bacteria, the cells were suspended in about 20 mL of water, collected again by centrifugation at 4 ° C. and 6,000 rpm for 10 minutes, and the supernatant was removed. Suspend the collected bacterial pellets in 2 to 3 mL of ultrapure water, transfer to a 5 mL polypropylene container, attach parafilm with air holes, freeze dry at -80 ° C, and vacuum dry for 72 hours. As a result, dried cells were obtained.
（５）PHAの精製及びPHAの分析
a) PHAの精製
PHAを蓄積させた乾燥菌体を100 mLの蓋付ガラス瓶に移し、100 mLのクロロホルムを加え72時間攪拌した。撹拌後の溶液をNo.1濾紙（アドバンテック社製）でろ過し、ナス型フラスコに移し変えた。その後、ロータリーエバポレーターで完全に濾液を揮発させ、共重合体を析出させた。析出した共重合体を少量のメタノールで洗い取り、約20 mLのクロロホルムに完全に溶解させた後、400 mLのメタノールに少量ずつ滴下しながら撹拌を行い精製した。精製した共重合体をNo.1濾紙で回収し、48時間ドラフト中で乾燥させ、以降の実験に使用した。
(5) PHA purification and PHA analysis
a) Purification of PHA
The dried cells in which PHA was accumulated were transferred to a 100 mL glass bottle with a lid, 100 mL of chloroform was added, and the mixture was stirred for 72 hours. The stirred solution was filtered with No. 1 filter paper (manufactured by Advantech) and transferred to an eggplant type flask. Thereafter, the filtrate was completely volatilized by a rotary evaporator to precipitate a copolymer. The precipitated copolymer was washed with a small amount of methanol, completely dissolved in about 20 mL of chloroform, and then purified by stirring while adding dropwise to 400 mL of methanol little by little. The purified copolymer was recovered with No. 1 filter paper, dried in a draft for 48 hours, and used in the subsequent experiments.
b) PHA分析
菌体内のPHA含有率とその組成は、ガスクロマトグラフ(GC)で決定した(Brauneggら, 1978)。まず、得られた乾燥菌体を耐圧ガラス管に10〜15 mL秤量し、ここに硫酸メタノール溶液（硫酸：メタノール＝15 vol%：85 vol%）２mL及びクロロホルム２mLを加えて密栓し、100℃、140分間ヒートブロックで加熱しメタノール分解した。加熱中は約30分ごとにサンプルを撹拌した。その後、室温まで冷却し、純水１mLを加えて激しく撹拌した。静置後、二層に分離した下層（クロロホルム層）をパスツールピペットで吸引し、0.45μm径のMillex-FH PVDFフィルター（ミリポア社製）でろ過した。ろ過後のクロロホルム層500μLに内部標準物質である0.1vol%カプリル酸メチル500μLを加え混合したものをサンプルとした。GC装置は島津製作所製のガスクロマトグラフGC14Bを用い、カラムにはGLサイエンス社製NEUTRA-BOND-1（内径30 m×0.25 mm、膜厚0.4μm）を用いた。キャリアガスとしてHe及びN2を用い、成分の検出には水素炎イオン化検出器を用いた。
b) PHA analysis The PHA content and its composition in the cells were determined by gas chromatography (GC) (Braunegg et al., 1978). First, weigh 10-15 mL of the obtained dried cells into a pressure-resistant glass tube, add 2 mL of a sulfuric acid methanol solution (sulfuric acid: methanol = 15 vol%: 85 vol%) and 2 mL of chloroform, and seal it at 100 ° C. Then, methanol was decomposed by heating with a heat block for 140 minutes. During heating, the sample was stirred about every 30 minutes. Then, it cooled to room temperature, added 1 mL of pure water, and stirred vigorously. After standing, the lower layer (chloroform layer) separated into two layers was sucked with a Pasteur pipette and filtered with a 0.45 μm diameter Millex-FH PVDF filter (Millipore). A sample was prepared by adding 500 μL of 0.1 vol% methyl caprylate as an internal standard substance to 500 μL of the chloroform layer after filtration. The GC device used was a gas chromatograph GC14B manufactured by Shimadzu Corporation, and the column used was NEUTRA-BOND-1 (inner diameter 30 m × 0.25 mm, film thickness 0.4 μm) manufactured by GL Sciences. He and N 2 were used as carrier gases, and a flame ionization detector was used to detect the components.
c) PHAの物性解析
c-1) GPC(ゲル浸透クロマトグラフ)測定
菌体から精製したPHAの数平均分子量(Mn)及び分子量分布(Mw/Mn)（Mw：重量平均分子量）をGPC測定によって求めた。標準物質としてポリスチレンを使用しているため、本発明で求めた分子量はポリスチレン換算相対分子量である。用いた５種類のポリスチレンの分子量は、3,790、30,300、219,000、756,000及び4,230,000である。GPCサンプルは、精製した重合体を約１mg/mLとなるようにクロロホルムに溶解し、孔径0.45μmのMillex-FH PVDFフィルター（ミリポア社製）を取り付けたシリンジでろ過して作製した。GPC測定には島津製作所社製のLC-VPシリーズ（システムコントローラー：SCL-10AVP、オートインジェクター：SIL-10A VP、送液ユニット：LC-10AD VP、カラムオーブン：CTO-10A、ディテクター：RID-10A）を使用し、カラムにはShodex社製のK-806M及びK-802を用いた。移動層にはクロロホルムを用い、総液流量は0.8 mL/分、カラム温度は40℃に設定し、サンプル注入量は50μLとした。データの解析にはCLASS-VP用GPC（島津製作所社製)を用いた。ポリスチレンスタンダードから検量線を引き、これとサンプルデータとを照合することによりポリスチレン換算分子量及び分子量分布を算出した。
c) Physical property analysis of PHA
c-1) GPC (Gel Permeation Chromatography) Measurement The number average molecular weight ( Mn ) and molecular weight distribution ( Mw / Mn ) ( Mw : weight average molecular weight) of PHA purified from bacterial cells were determined by GPC measurement. . Since polystyrene is used as the standard substance, the molecular weight obtained in the present invention is a relative molecular weight in terms of polystyrene. The molecular weights of the five types of polystyrene used are 3,790, 30,300, 219,000, 756,000 and 4,230,000. The GPC sample was prepared by dissolving the purified polymer in chloroform so as to be about 1 mg / mL, and filtering it with a syringe equipped with a Millex-FH PVDF filter (Millipore) having a pore size of 0.45 μm. For GPC measurement, Shimadzu LC-VP series (System controller: SCL-10AVP, Autoinjector: SIL-10A VP, Liquid feeding unit: LC-10AD VP, Column oven: CTO-10A, Detector: RID-10A The column used K-806M and K-802 made by Shodex. Chloroform was used for the moving bed, the total liquid flow rate was set to 0.8 mL / min, the column temperature was set to 40 ° C., and the sample injection volume was 50 μL. GPC for CLASS-VP (manufactured by Shimadzu Corporation) was used for data analysis. A calibration curve was drawn from the polystyrene standard, and this was compared with sample data to calculate the polystyrene-equivalent molecular weight and molecular weight distribution.
c-2)示差走査熱量(DSC)測定
DSCサンプルは、精製したPHAを約10 mg秤り取り、５mL容のサンプルバイアルに入れ、約１〜２mLのクロロホルムに完全に溶解した。これをドラフト中で48時間乾燥させた後、24時間真空乾燥させることによりキャストフィルムを作製した。このキャストフィルムから約３mgを秤量し、専用アルミニウムパンに入れたものをDSC測定サンプルとした。測定には、パーキンエルマー社製のPyris 1 DSCを使用した。測定は20 mL/分の窒素雰囲気下で行った。対照には試料の入っていないアルミニウムパンを用いた。測定の条件として、初めに25℃〜200℃まで20℃/分の昇温速度で加熱し、200℃で１分間保持した後、-500℃/分で-120℃まで急冷した。次に、-120℃で１分間保持した後、20℃/分の昇温速度で200℃に加熱した。解析には、パーキンエルマー社製の解析ソフトData Analysisを用いた。測定した試料の融点Tm及び融解エンタルピーΔHmの決定は、最初に昇温した時のサーモグラムより、熱容量変化の中点をガラス転移温度Tgとした。
c-2) Differential scanning calorimetry (DSC) measurement
For the DSC sample, about 10 mg of purified PHA was weighed and placed in a 5 mL sample vial and completely dissolved in about 1 to 2 mL of chloroform. This was dried in a draft for 48 hours and then vacuum-dried for 24 hours to prepare a cast film. About 3 mg of this cast film was weighed and put in a dedicated aluminum pan to make a DSC measurement sample. For the measurement, Pyris 1 DSC manufactured by PerkinElmer was used. The measurement was performed in a nitrogen atmosphere at 20 mL / min. An aluminum pan without sample was used as a control. As the measurement conditions, the sample was first heated from 25 ° C. to 200 ° C. at a heating rate of 20 ° C./min, held at 200 ° C. for 1 minute, and then rapidly cooled to −120 ° C. at −500 ° C./min. Next, after maintaining at −120 ° C. for 1 minute, it was heated to 200 ° C. at a rate of temperature increase of 20 ° C./min. For the analysis, analysis software Data Analysis manufactured by PerkinElmer was used. The determination of the melting point T m and melting enthalpy [Delta] H m of the measured sample than the thermogram when heated first, the midpoint of the heat capacity change and the glass transition temperature T g.
＜結果＞
（１）部位481(グルタミン)への飽和変異導入によって蓄積されたPHA
部位481(グルタミン)への飽和変異導入によって蓄積されたPHAの含量及びその組成をGC測定により求めた結果を表１、図２及び３に示す。
表１及び図３中の3HB、3HHx、3HO、3HD、3HDD、C4、C6、C8、C10及びC12は以下のモノマーを示す。3HB及びC4；3-ヒドロキシブタン酸、3HHx及びC6；3-ヒドロキシヘキサン酸、3HO及びC8；3-ヒドロキシオクタン酸、3HD及びC10；3-ヒドロキシデカン酸、3HDD及びC12；3-ヒドロキシドデカン酸。PHA含量は乾燥細胞が100 %ポリマーで形成されていると仮定した場合の含量を示す。
<Result>
(1) PHA accumulated by introducing a saturation mutation into site 481 (glutamine)
Table 1 and FIGS. 2 and 3 show the results obtained by GC measurement of the content and composition of PHA accumulated by introducing a saturation mutation into site 481 (glutamine).
Table 1 and 3HB in FIG. 3, the 3HH x, 3HO, 3HD, 3HDD , C4, C6, C8, C10 and C12 are the following monomers. 3HB and C4; 3-hydroxybutanoic acid, 3HH x and C6; 3-hydroxyhexanoic acid, 3HO and C8; 3-hydroxyoctanoic acid, 3HD and C10; 3-hydroxydecanoic acid, 3HDD and C12; 3-hydroxydodecanoic acid . The PHA content indicates the content when it is assumed that the dry cells are formed of 100% polymer.
表１から明らかなように、グルタミン(Q)がシスティン(C)、グルタミン酸(E)、フェニルアラニン(F)、イソロイシン(I)、リシン(K)、ロイシン(L)、メチオニン(M)、バリン(V)、トリプトファン(W)、アルギニン(R)に置換された変異酵素を使用した場合にはいずれも、PHA含量が野生型と比較して増加した。更に、これらのPHA組成をみると、3-ヒドロキシブタン酸(3HB)が約74〜94 mol%と高含量であることが判った。特に、(V)又は(W)に置換された変異酵素を使用した場合には、PHA含量が野生型と比較して著しく増加した。すなわち、疎水性アミノ酸を使用した場合には、本発明の所望の効果を有するPHAが得られることが示唆された。
一方、グルタミン酸(E)への置換体（参考例）では3-ヒドロキシブタン酸(3HB)の含量が低く、中鎖長モノマー含量が比較的高かった。
尚、アラニン、アスパラギン酸、グリシン、ヒスチジン、アスパラギン、プロリン、セリン、トレオニン又はチロシンへの置換体では、野生型に比較してPHA含量の増加が認められなかった。
As is apparent from Table 1, glutamine (Q) is cysteine (C), glutamic acid (E), phenylalanine (F), isoleucine (I), lysine (K), leucine (L), methionine (M), valine ( In all cases where mutant enzymes substituted with V), tryptophan (W), and arginine (R) were used, the PHA content increased compared to the wild type. Furthermore, when these PHA compositions were examined, it was found that 3-hydroxybutanoic acid (3HB) was a high content of about 74 to 94 mol%. In particular, when a mutant enzyme substituted with (V) or (W) was used, the PHA content was remarkably increased compared to the wild type. That is, it was suggested that when a hydrophobic amino acid is used, PHA having the desired effect of the present invention can be obtained.
On the other hand, the substitution product (reference example) to glutamic acid (E) had a low content of 3-hydroxybutanoic acid (3HB) and a relatively high medium chain length monomer content.
In addition, in the substitution product to alanine, aspartic acid, glycine, histidine, asparagine, proline, serine, threonine or tyrosine, an increase in PHA content was not observed as compared with the wild type.
（２）部位477(セリン)への飽和変異導入によって蓄積されたPHA
部位477(セリン)への飽和変異導入によって蓄積されたPHAの含量及びその組成をGC測定により求めた結果を表２、図４及び５に示す。
表２及び図５中の3HB、3HHx、3HO、3HD、3HDD、C4、C6、C8、C10及びC12は以下のモノマーを示す。3HB及びC4；3-ヒドロキシブタン酸、3HHx及びC6；3-ヒドロキシヘキサン酸、3HO及びC8；3-ヒドロキシオクタン酸、3HD及びC10；3-ヒドロキシデカン酸、3HDD及びC12；3-ヒドロキシドデカン酸。PHA含量は乾燥細胞が100 %ポリマーで形成されていると仮定した場合の含量を示す。
(2) PHA accumulated by saturation mutation introduction at site 477 (serine)
Table 2 and FIGS. 4 and 5 show the results obtained by GC measurement of the content and composition of PHA accumulated by introducing the saturation mutation into site 477 (serine).
Table 2 and 3HB in FIG. 5 shows a 3HH x, 3HO, 3HD, 3HDD , C4, C6, C8, C10 and C12 are the following monomers. 3HB and C4; 3-hydroxybutanoic acid, 3HH x and C6; 3-hydroxyhexanoic acid, 3HO and C8; 3-hydroxyoctanoic acid, 3HD and C10; 3-hydroxydecanoic acid, 3HDD and C12; 3-hydroxydodecanoic acid . The PHA content indicates the content when it is assumed that the dry cells are formed of 100% polymer.
表２から明らかなように、セリン(S)がアスパラギン酸(D)、グルタミン酸(E)、ロイシン(L)、トレオニン(T)、バリン(V)又はトリプトファン(W)に置換された変異酵素を使用した場合にはいずれも、PHA含量が野生型と比較して著しく増加した。
なかでも、(T)又は(V)に置換された変異酵素では、それぞれ野性型の約7.4倍、約8.1倍と大きな増加を示した。従って、これらの変異体と他のモノマー供給酵素遺伝子等とを組み合わせることにより、植物油からの更に効率的にPHAが製造できることが期待できる。
As is clear from Table 2, mutant enzymes in which serine (S) is replaced with aspartic acid (D), glutamic acid (E), leucine (L), threonine (T), valine (V) or tryptophan (W) In all cases, the PHA content was significantly increased compared to the wild type.
Among them, the mutant enzyme substituted with (T) or (V) showed a large increase of about 7.4 times and about 8.1 times that of the wild type, respectively. Therefore, it can be expected that PHA can be more efficiently produced from vegetable oils by combining these mutants with other monomer-feeding enzyme genes and the like.
更に、これらのPHA組成をみると、いずれのPHAも3-ヒドロキシブタン酸(3HB)が約68〜93 mol%と高含量であることが判った。これはPHA合成酵素の基質特異性によるもの考えられる。高いPHA含量を示した(T)又は(V)への置換体では、PHA中の3HBの割合が90 mol%前後であり、これは高分子材料として有用なPHA組成であることが明らかとなった。同様に高いPHA含量を示した(D)、(E)、(L)又は(W)への置換体では3HHX〜3HDDが20 mol%以上を占め、これらの変異酵素によって合成されたPHAはエラストマー的な性質を示すものと考えられる。
尚、アラニン、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、メチオニン、アスパラギン又はグルタミンへの置換体では、野生型に比較してPHA含量の増加が認められなかった。
Furthermore, when these PHA compositions were examined, it was found that all PHA had a high content of 3-hydroxybutanoic acid (3HB) of about 68 to 93 mol%. This may be due to the substrate specificity of PHA synthase. In the substitution to (T) or (V) that showed a high PHA content, the ratio of 3HB in PHA was around 90 mol%, which proved to be a useful PHA composition as a polymer material. It was. Similarly, in substitution to (D), (E), (L) or (W) which showed high PHA content, 3HHX-3HDD accounted for 20 mol% or more, and PHA synthesized by these mutant enzymes is an elastomer. It is thought that it shows a natural property.
In addition, in the substitution product to alanine, phenylalanine, glycine, histidine, isoleucine, methionine, asparagine or glutamine, an increase in PHA content was not observed as compared with the wild type.
（３）PHAの特性解析
上記表１及び２においてPHA含量の高かった５菌体から、PHAの抽出を行い、得られたPHAのGPC測定及びDSC測定を行った。その結果を表３に示す。
(3) Characteristic analysis of PHA PHA was extracted from 5 cells having high PHA content in Tables 1 and 2 above, and GPC measurement and DSC measurement of the obtained PHA were performed. The results are shown in Table 3.
各PHAの分子量測定の結果、セリン(S)のバリン(V)への置換体を用いて得られたPHAが最も高い分子量(Mn=70,000)を示した。 As a result of measuring the molecular weight of each PHA, the PHA obtained using the substitution product of serine (S) to valine (V) showed the highest molecular weight (M n = 70,000).
（４）部位130(グルタミン酸)への飽和変異導入によって蓄積されたPHA
部位130(グルタミン酸)への飽和変異導入によって蓄積されたPHAの含量及びその組成をGC測定により求めた結果を表４に示す。
表４中の3HB、3HHx、3HO、3HD、3HDD、C4、C6、C8、C10及びC12は以下のモノマーを示す。3HB及びC4；3-ヒドロキシブタン酸、3HHx及びC6；3-ヒドロキシヘキサン酸、3HO及びC8；3-ヒドロキシオクタン酸、3HD及びC10；3-ヒドロキシデカン酸、3HDD及びC12；3-ヒドロキシドデカン酸。PHA含量は乾燥細胞が100 %ポリマーで形成されていると仮定した場合の含量を示す。
(4) PHA accumulated by saturation mutation introduction into site 130 (glutamic acid)
Table 4 shows the results obtained by GC measurement of the content and composition of PHA accumulated by introducing the saturation mutation into site 130 (glutamic acid).
Table 4 in 3HB, showing the 3HH x, 3HO, 3HD, 3HDD , C4, C6, C8, C10 and C12 are the following monomers. 3HB and C4; 3-hydroxybutanoic acid, 3HH x and C6; 3-hydroxyhexanoic acid, 3HO and C8; 3-hydroxyoctanoic acid, 3HD and C10; 3-hydroxydecanoic acid, 3HDD and C12; 3-hydroxydodecanoic acid . The PHA content indicates the content when it is assumed that the dry cells are formed of 100% polymer.
表４から明らかなように、フェニルアラニン（F）、ヒスチジン（H）、イソロイシン（I）、ロイシン（L）、バリン（V）、トリプトファン（W）、チロシン（Y）への置換体は全て、野生型と比較して２倍以上のPHA含量を示した。中でも、(I)への置換体を用いた株は、最も高い蓄積量（47 wt%）を示した。蓄積量が30 wt%を超えた株では、3HB組成が約80 mol%、3Hが約20 mol%からなる共重合体を生産した。 As is apparent from Table 4, all substitutions for phenylalanine (F), histidine (H), isoleucine (I), leucine (L), valine (V), tryptophan (W), and tyrosine (Y) are all wild. The PHA content was more than twice that of the mold. Among them, the strain using the substitute for (I) showed the highest accumulation amount (47 wt%). In the strains with accumulated amounts exceeding 30 wt%, a copolymer with 3HB composition of about 80 mol% and 3H of about 20 mol% was produced.
（５）部位325(セリン)への飽和変異導入によって蓄積されたPHA
部位325(セリン)への飽和変異導入によって蓄積されたPHAの含量及びその組成をGC測定により求めた結果を表５に示す。
表５中の3HB、3HHx、3HO、3HD、3HDD、C4、C6、C8、C10及びC12は以下のモノマーを示す。3HB及びC4；3-ヒドロキシブタン酸、3HHx及びC6；3-ヒドロキシヘキサン酸、3HO及びC8；3-ヒドロキシオクタン酸、3HD及びC10；3-ヒドロキシデカン酸、3HDD及びC12；3-ヒドロキシドデカン酸。PHA含量は乾燥細胞が100 %ポリマーで形成されていると仮定した場合の含量を示す。
(5) PHA accumulated by saturation mutation introduction at site 325 (serine)
Table 5 shows the results obtained by GC measurement of the content and composition of PHA accumulated by introducing the saturation mutation into site 325 (serine).
Table 5 in 3HB, showing the 3HH x, 3HO, 3HD, 3HDD , C4, C6, C8, C10 and C12 are the following monomers. 3HB and C4; 3-hydroxybutanoic acid, 3HH x and C6; 3-hydroxyhexanoic acid, 3HO and C8; 3-hydroxyoctanoic acid, 3HD and C10; 3-hydroxydecanoic acid, 3HDD and C12; 3-hydroxydodecanoic acid . The PHA content indicates the content when it is assumed that the dry cells are formed of 100% polymer.
表５から明らかなように、フェニルアラニン（F）、グリシン（G）、ヒスチジン（H）、イソロイシン（I）、ロイシン（L）、メチオニン（M）、アスパラギン（N）、チロシン（Y）への置換体は、野生型と比較して２倍以上のPHA含量を示した。中でも、(L)又は(Y)への置換体を用いた株は、最も高い蓄積量（37 wt%）を示した。蓄積量が30 wt%を超えた株では、3HB組成が約85 mol%、3HAが約15 mol%からなる共重合体を生産した。 As is clear from Table 5, substitution with phenylalanine (F), glycine (G), histidine (H), isoleucine (I), leucine (L), methionine (M), asparagine (N), tyrosine (Y) The body showed more than twice the PHA content compared to the wild type. Among them, the strain using the substitution to (L) or (Y) showed the highest accumulation amount (37 wt%). In the strain with accumulated amount exceeding 30 wt%, a copolymer with 3HB composition of about 85 mol% and 3HA of about 15 mol% was produced.
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