JP2007097466A - Method for producing n-acetyl-d-glucosamine by enzymatic hydrolysis - Google Patents

Method for producing n-acetyl-d-glucosamine by enzymatic hydrolysis Download PDF

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Ji Tae Jang
Teuk Rae Jung
Hyeon Pil Yang
智泰・張
特來・鄭
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Kitto Life Co Ltd
株式会社キットライフKitto Life Co.,Ltd.
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Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide an environment-friendly production process with simplified steps, for obtaining N-acetyl-D-glucosamine from chitin without requiring an existing acid hydrolysis step. <P>SOLUTION: The method for producing the N-acetyl-D-glucosamine involves a step for swelling the chitin, and a step for obtaining an enzymatically hydrolyzed liquid of the chitin by carrying out an enzymatic reaction by adding an N-acetyl-D-glucosamine-splitting enzyme to the swollen chitin. <P>COPYRIGHT: (C)2007,JPO&INPIT

Description

本発明は、キチンからN−アセチル−D−グルコサミンを製造する方法に係り、より詳細には、従来の酸加水分解工程を経ることなしにも、キチンからN−アセチル−D−グルコサミンを得ることができるため、製造工程の簡略化及び親環境的なN−アセチル−D−グルコサミンの製造方法に関する。 The present invention relates to a process for producing N- acetyl -D- glucosamine from chitin, and more particularly, also without going through the conventional acid hydrolysis step, to obtain N- acetyl -D- glucosamine from chitin since it is a process for the preparation of simplification and environment-friendly N- acetyl -D- glucosamine production process.

N−アセチル−D−グルコサミンは、エビ、カニなどの甲殻類、イカの軟骨、カブトムシなどの昆虫類や真菌類の細胞壁などに含まれている、キチンの構成単位として自然界に広く存在する単糖類の1種である。 Is N- acetyl -D- glucosamine, shrimp, crustaceans such as crabs, squid cartilage, as included in the cell walls of insects and fungi, such as beetles, monosaccharides widely present in nature as a constituent unit of the chitin it is a kind of.
N−アセチル−D−グルコサミンの製造と関連して、特許文献1によると、先ず、キチンを、酸(塩酸、ギ酸、硫酸など)により部分加水分解し、水酸化ナトリウム溶液で中和した後、濾過して残存物を除去し、この溶液をイオン交換膜電気透析法によって脱塩処理して、N−アセチル−D−グルコサミンとN−アセチルキトオリゴ糖を製造する。 In connection with the preparation of N- acetyl -D- glucosamine, according to Patent Document 1, first, chitin, partially hydrolyzed by an acid (hydrochloric acid, formic acid, such as sulfuric acid), after neutralization with sodium hydroxide solution, filtered the residue to remove, the solution was desalted by ion exchange membrane electrodialysis method, producing N- acetyl -D- glucosamine and N- acetyl Quito oligosaccharides. ここに、N−アセチルキトオリゴ糖に対して加水部分解能を有する酵素を作用させてN−アセチル−D−グルコサミンの含量を高めることによって、N−アセチル−D−グルコサミンを製造する方法が開示されている。 Here, by increasing the content of N- acetyl -D- glucosamine by the action of an enzyme having a hydrolytic unit resolution, a method for producing a N- acetyl -D- glucosamine is disclosed to N- acetyl Quito oligosaccharides ing.

しかし、このような製造方法は、N−アセチル−D−グルコサミンを得るために、原料であるキチンを対象として酸加水分解段階及び脱塩処理段階を必要とするので、その工程が煩雑であり、また、発生する廃水処理の問題だけでなく、得られたN−アセチルキトオリゴ糖とN−アセチル−D−グルコサミンの混合物からN−アセチル−D−グルコサミンを選択的に分離するための別途の分離膜技術を必要とするため、経済性が低いという問題がある。 However, such a manufacturing method, N- acetyl -D- glucosamine in order to obtain, since it requires an acid hydrolysis step and desalting step as target chitin as a raw material, the process is complicated, Further, not only the problem of waste water treatment for generating, selecting from the resulting mixture of N- acetyl Quito oligosaccharide and N- acetyl -D- glucosamine N- acetyl -D- glucosamine to additional separation to separate requires a membrane technology, there is a problem of low economic efficiency.
特開2000-281696号公報 JP 2000-281696 JP

本発明は、前記のような従来技術が有する問題を解決するためになされたものであって、本発明の目的は、従来の酸加水分解及び脱塩工程を経ることなしにも、キチンからN−アセチル−D−グルコサミンを得ることができるため、製造工程の簡略化及び親環境的なN−アセチル−D−グルコサミンの製造方法を提供することにある。 The present invention was made to solve the problem of the prior art as described above has an object of the present invention, also without going through the conventional acid hydrolysis and desalting step, N from chitin - it is possible to obtain the acetyl -D- glucosamine is to provide a method of manufacturing simplicity and eco-friendly N- acetyl -D- glucosamine production process.

前記目的を達成するために、本発明はキチンを膨潤させる段階;及び 膨潤したキチンにN−アセチル−D−グルコサミン分解酵素を加えて酵素反応させ、キチンの酵素分解液を得る段階を包含するN-アセチル−D−グルコサミンの製造方法を提供する。 To achieve the above object, the present invention is step swell the chitin; added and swollen chitin N- acetyl -D- glucosamine degrading enzyme is an enzymatic reaction, comprising the step of obtaining the enzyme hydrolyzate was chitin N - to provide a method for producing acetyl -D- glucosamine.

本発明は、好ましくは前記キチンが、αキチン、またはβキチンであるN−アセチル−D−グルコサミンの製造方法を提供する。 The present invention, preferably said chitin is to provide a method for producing α chitin or N- acetyl -D- glucosamine is β chitin.
本発明は、好ましくは前記キチンを膨潤させる段階が、αキチンを燐酸に溶解させる段階と、所定量の水を加えて膨潤させたαキチンを溶剤から分離させる段階を包含する。 The present invention preferably includes a step of separating step of swelling the chitin, the method comprising dissolving the α chitin phosphate, the α chitin swollen by adding a predetermined amount of water from the solvent.
本発明は、好ましくは前記キチンを膨潤させる段階が、βキチンを粉末化させる段階と、前記βキチンの粉末を希酢酸溶液に浸漬させ、所定の時間放置した後、撹拌する段階を包含する。 The present invention preferably includes the step of swelling the chitin, a step of powdering the β chitin, the soaked powder β chitin in a dilute acetic acid solution, was left for a predetermined time, the agitation stages.
本発明は、好ましくは前記分解酵素がトリコデルマ・レセイ(Trichoderma reesei)由来のエキソ型キチナーゼ又は、セルロモナス種(Cellulomonas sp.)由来のエキソ型キチナーゼであることを特徴とする。 The present invention is preferably characterized in that the enzyme is Trichoderma reesei (Trichoderma reesei) exo-type chitinase derived or a Cellulomonas species (Cellulomonas sp.) Derived from exo-type chitinases.
本発明は、好ましくは前記分解酵素が、α膨潤キチン5重量%(水の重量基準)を基準として20〜40unit/gキチン量になるように添加することを特徴とする。 The present invention, preferably said enzyme, characterized in that the addition of α swells chitin 5 weight percent (by weight of water) such that the 20~40unit / g chitin weight basis.
本発明は、好ましくは前記分解酵素が、βキチン2重量%(希酢酸溶液重量基準)を基準として20〜40unit/gキチン量になるように添加することを特徴とする。 The present invention, preferably said enzyme, characterized in that the addition of β chitin 2% by weight (dilute acetic acid solution by weight) so as to 20~40unit / g chitin weight basis.

又、本発明は、好ましくは酵素分解液を2段階にで濾過することにより未反応物質を除去し、さらに分離膜で濾過して酵素を除去する段階と、 Further, the present invention includes the steps of preferably unreacted material was removed by filtering the enzyme hydrolyzate was in the two stages, and further filtered through a separation membrane to remove the enzyme,
前記分離膜を通過した濾過液を減圧濃縮し、N−アセチル−D−グルコサミンを析出する段階と、 A step of said filtrate which has passed through the separation membrane and concentrated under reduced pressure, the precipitated N- acetyl -D- glucosamine,
前記析出されたN−アセチル−D−グルコサミンを洗滌及び濾過した後、乾燥してN−アセチル−D−グルコサミンの粉末を得る段階をさらに包含することを特徴とする。 After washing and filtering the N- acetyl -D- glucosamine is the precipitation, further characterized in that it comprises the step of obtaining a powder of dried N- acetyl -D- glucosamine.

上述のように、本発明によれば、従来の酸加水分解工程を経ることなく、単にキチンを膨潤させて酵素処理することによりN−アセチル−D−グルコサミンを製造するため、工程の単純化及び費用節減の効果が高く、かつ親環境的な製造工程が提供される。 As described above, according to the present invention, without a conventional acid hydrolysis process, simply for the production of N- acetyl -D- glucosamine by enzymatic treatment to swell the chitin, process simplification and highly effective cost savings, and eco-friendly production process is provided.

以下、本発明の内容をより詳細に説明する。 Hereinafter, describing the contents of the present invention in more detail.
本発明に用いられるキチンの原料としては、αキチン又はβキチンが挙げられる。 The raw material of the chitin used in the present invention include α chitin or β chitin. αキチンは、2つの分子間の鎖が逆方向に平行になるように配列されているキチンであり、このようなキチンは、カニ、又はエビなどの甲殻類の殻に含有されている。 α chitin is a chitin chains between the two molecules are arranged in parallel in opposite directions, such chitin is contained in the shells of crustaceans such as crabs or shrimp. βキチンは、分子間の鎖が同一方向に平行に配列されているキチンであり、このようなキチンは、イカなどの軟体動物の軟骨に含有されている。 β chitin is a chitin chains between molecules were aligned in parallel in the same direction, such chitin is contained in cartilage molluscs such as squid.

本発明は、既存の酸加水分解工程を必要としなく、キチンを膨潤処理し、ここにキチン分解酵素を反応させてN−アセチル−D−グルコサミンを製造する簡単な工程を提供する。 The present invention is not require existing acid hydrolysis process, chitin and swelling treatment, provides a simple process for producing by N- acetyl -D- glucosamine herein is reacted with chitinases.
キチンの膨潤処理は、分解酵素の酵素反応を容易にし、キチンの種類によって具体的な処理工程は異なる場合もあるが、後述する2つの方法を例示することができる。 Swelling treatment of chitin, the enzymatic reaction of the enzyme to facilitate, although specific processing steps depending on the type of chitin may be different, it is possible to illustrate two methods described below.

キチンが、αキチンである場合の膨潤処理は以下のとおりである。 Chitin, swelling treatment when it is α chitin is as follows. すなわちキチンと燐酸(H 3 PO 4 )を重量比で1:2〜1:6、好ましくは1:3〜1:5、より好ましくは1:3.5〜1:4.5になるように燐酸にキチンを溶解した後、常温で一定の時間放置する。 That 1 chitin and phosphoric acid (H 3 PO 4) in a weight ratio: 2 to 1: 6, preferably from 1: 3 to 1: 5, more preferably 1: 3.5 to 1: such that 4.5 after dissolving the chitin phosphate and left for a certain time at room temperature. 放置時間は、夏の場合は2〜3時間の短時間で十分であり、冬の場合は24時間程度まで放置することが良い。 Standing time is, in the case of summer is sufficient in a short period of time of 2-3 hours, in the case of winter good to be left up to about 24 hours. 放置した後の前記溶液にキチン量の8〜12倍量の水、好ましくは9〜11倍量の水を前記溶液に撹拌しながら添加する。 8-12 times the amount of water chitin amount to the solution after the standing, preferably added with stirring 9-11 volumes of water to the solution.
一方、キチンが、βキチンである場合には、キチンを60〜80メッシュで粉砕した粉末を希酢酸溶液(0.075%)に重量比で0.1〜10%、好ましくは0.5〜7%、より好ましくは1〜3%になるように浸漬させ、3〜6時間放置した後、ホモジェナイザーで3,000〜5,000rpmに高速撹拌してキチンを膨潤させることができる。 On the other hand, chitin, in the case of β Chitin 0.1 to 10 percent by weight of the powder ground chitin at 60-80 mesh dilute acetic acid solution (0.075%), preferably 0.5 to 7%, and more preferably is immersed to be 1-3% and allowed to stand 3-6 hours to swell the chitin with high speed stirring 3,000~5,000rpm in homogenizer.

これによって、キチンは膨潤され、膨潤されたキチンは溶剤と分離させる。 Thus, chitin is swollen, the swollen chitin is separated from the solvent. 膨潤されたキチンの溶剤との分離過程は遠心分離3,000〜5,000rpmまたはフィルタープレス(filter press)、ドラムフィルターなどを用いることができる。 Process of separation and solvent swollen chitin centrifugation 3,000~5,000rpm or filter press (filter press), may be used such as a drum filter.
膨潤処理されたキチンを溶剤と分離した後、酵素の最適温度であるpH4.0〜6.0、好ましくはpH4.2〜5.5になるまで水による洗滌又は中和を行う。 After the swelling treatment chitin separated from the solvent, the optimum temperature of the enzyme PH4.0~6.0, preferably performs washing or neutralization by water until PH4.2~5.5.
前記酵素反応は、分解酵素を前記膨潤処理されたキチンに添加して行われる。 The enzymatic reaction is performed by adding enzyme to the swelling treatment chitin. 本発明に使用することができる分解酵素としてはトリコデルマ・レセイ由来のエキソ型キチナーゼ、セルロモナス種由来のエキソ型キチナーゼなどがある。 The enzyme that can be used in the present invention exo-type chitinase from Trichoderma reesei, and the like exo-type chitinase from Cellulomonas species.

酵素反応は、使用される具体的な酵素、酵素の力価、基質の種類及び濃度などによって異なることができる。 The enzymatic reaction can be specific enzyme used, the titer of the enzyme, depending on the type and concentration of the substrate varies. 例えば、キチンが、αキチンである場合、水重量の基準で膨潤されたキチン5重量%(膨潤キチンの重量対比10重量%がキチン量)に対して分解酵素20〜40unit/gキチン量、好ましくは25〜35unit/gキチン量を添加して35〜45℃で48〜72時間分解させると十分である。 For example, chitin, alpha case of chitin, enzyme 20~40unit / g chitin amount to the chitin 5 wt% is swollen with water weight basis (weight by weight based on the weight of 10% by weight of the swelling chitin chitin) preferably is sufficient when the decomposed 48-72 hours at 35 to 45 ° C. by adding 25~35unit / g chitin amount. 一方、キチンが、βキチンである場合、希酢酸溶液を基準としてキチン2重量%に対して20〜40unit/gキチン量、好ましくは25〜35unit/gキチン量を添加して35〜45℃で48〜72時間分解させると十分である。 On the other hand, chitin, when a β chitin, 20~40unit / g chitin amount to the chitin 2 wt% dilute acetic acid solution as a reference, preferably 35 to 45 ° C. by adding 25~35unit / g chitin amount When decomposing 48-72 hours is sufficient.
前記過程を経て得られる分解液はその後濾過される。 Decomposing solution obtained by the above process is then filtered. 濾過はフリーフィルター(1μm)−ゼータフィルター(0.7μm)で構成される2段階の濾過過程を経て、未反応物質を除去する工程を包含することが好ましい。 Filtration free filter (1 [mu] m) - via a 2-step filtration process consisting of zeta filter (0.7 [mu] m), it is preferable to include a step of removing the unreacted material. また、酵素と目的物を分離するために分離膜を用いることができる。 Further, it is possible to use a separation membrane to separate the enzyme and the desired product. 分離膜は特に限定されないが、例えば、限外濾過膜(MWCO 10,000)で濾過することによって酵素を除去することができる。 While the separation membrane is not particularly limited, for example, it is possible to remove the enzyme by filtration with an ultrafiltration membrane (MWCO 10,000).

前記過程を経て得られる濾過液は濃縮され、次いで、N−アセチル−D−グルコサミンを析出する工程が行われる。 Filtrate obtained by the above process are concentrated and then the step of precipitating N- acetyl -D- glucosamine is performed. 濾過液の濃縮は、真空減圧濃縮器を用いて1〜2回にわたり約40〜60BX程度に減圧濃縮させ、4℃の低温で12時間ぐらい保管してN−アセチル−D−グルコサミンを析出させるか、濾過液から1ステップで液を完全に蒸発させて、N−アセチル−D−グルコサミンを析出することもできる。 Or concentration of the filtrate, was concentrated under reduced pressure to about 40~60BX over 1-2 times with vacuum vacuum evaporator to precipitate and store about 12 hours at a low temperature of 4 ° C. N-acetyl -D- glucosamine can be liquid evaporated completely in one step from the filtrate, also precipitating N- acetyl -D- glucosamine. この場合、液の蒸発には真空バッチ結晶化装置(Vaccum batch crystallizer,QE−04−026)を用いることができる。 In this case, it is possible to use a vacuum batch crystallizer (Vaccum batch crystallizer, QE-04-026) is the evaporation of the liquid.
析出されたN−アセチル−D−グルコサミンは、洗滌及び濾過する過程を経て濾過液を乾燥すると、N−アセチル−D−グルコサミンの粉末を得ることができる。 Precipitation has been N- acetyl -D- glucosamine and dried the filtrate through a washing and process of filtration, it is possible to obtain a powder of N- acetyl -D- glucosamine. 前記の洗滌過程では通常エタノールが使用され、濾過過程はグラスフィルター(glass filter)によって行われることができる。 Wherein the of the cleaning process usually ethanol is used, the filtration process can be carried out by a glass filter (glass filter). なお、濾過液の乾燥過程は真空乾燥或は、熱風乾燥による。 The drying process of the filtrate vacuum drying or, by hot air drying.

本発明によって、前記全過程を経ることによって純度の高い、αキチンとβキチンの種類に拘わらず、高収率のN−アセチル−D−グルコサミンを得ることができることが確認された。 The present invention, the highly pure by passing through the entire process, regardless of the type of α chitin and β chitin, that it is possible to obtain a N- acetyl -D- glucosamine yield was confirmed.
本発明の前記N−アセチル−D−グルコサミンの製造方法は、酸加水分解工程が全然含まれない。 Method for producing the N- acetyl -D- glucosamine of the present invention, the acid hydrolysis step is not included at all. さらに、N−アセチル−D−グルコサミンを分離するための別途の分離膜技術も要しない。 Furthermore, no need even additional separation membrane technology for separating N- acetyl -D- glucosamine.
従って、本発明による製造方法は、工程の単純化を通じて経済性を提供するとともに酸加水分解工程を要しないので、この工程における廃液処理の問題なども発生することがない。 Therefore, the production method according to the present invention does not require the acid hydrolysis step with providing economy through process simplification and does not also occur, such as problems of waste liquid treatment in this step.

以下、本発明の好ましい実施例及び比較例を通じて本発明をより詳細に説明する。 Hereinafter, the present invention is described through examples illustrate the invention in more detail. なお、以下の実施例は本発明の説明と理解のためであり、本発明の範囲内で多様な変形や変更が行われることができることは、当技術分野で通常の知識を有する者には自明なことといえる。 The following examples are for explanation and understanding of the present invention, it may be various modifications and changes within the scope of the present invention is carried out is obvious to those skilled in the art it can be said that the things.

[実施例1] [Example 1]
カニのキチン(αキチン)を基質として使用した。 Crab chitin (α chitin) was used as the substrate. キチンと燐酸(H 3 PO 4 )を重量比で1:4になるように燐酸にキチンを溶解して常温で12時間放置した後、キチン量の10倍量の水を前記溶液に撹拌しながら添加した。 Chitin and phosphoric acid (H 3 PO 4) in a weight ratio of 1: After standing for 12 hours at room temperature to dissolve the chitin phosphate to be 4, with stirring 10 volumes of water chitin amount to the solution It was added. 膨潤されたキチンは遠心分離(5,000rpm)して溶剤と分離した後、pH4.5になるまで水による洗滌又は中和を行った。 After swollen chitin separated and the solvent was centrifuged (5,000 rpm), it was washed or neutralized with water until pH 4.5.
前記の過程を通じて水重量の基準で膨潤されたキチン5重量%(膨潤キチン重量対比10重量%がキチン量)に対して分解酵素30unit/gキチン量を添加して40℃で72時間分解させた。 Chitin 5% by weight was swollen with reference water weight (swollen chitin by weight based on the weight of 10 wt% chitin amount) was allowed to decompose at 40 ° C. 72 hours added enzyme 30unit / g chitin weight relative through the process .
分解液は、フーリフィルター(1μm)−ゼータフィルター(0.7μm)で構成される2段階の濾過過程を経て未反応物質を除去し、酵素と目的物を分離するために限外濾過膜(MWCO 10,000)で濾過して酵素を除去した。 Decomposition solution, Fourier filter (1 [mu] m) - via a 2-step filtration process consisting of zeta filter (0.7 [mu] m) to remove unreacted substances, ultrafiltration membrane to separate the enzyme and the desired product (MWCO 10,000 and filtered to remove the enzyme in).
濾過液は、真空減圧濃縮器を利用して1〜2回にわたり約50BX程度で減圧濃縮させ、4℃の低温で12時間程度保管することによってN−アセチル−D−グルコサミンを析出させた。 Filtrate is then concentrated under reduced pressure at about 50BX over 1-2 times using vacuum vacuum evaporator to precipitate the N- acetyl -D- glucosamine by storing approximately 12 hours at a low temperature of 4 ° C..
析出されたN−アセチル−D−グルコサミンをエタノールで洗滌してグラスフィルターで濾過した後、真空乾燥してN−アセチル−D−グルコサミンの粉末50%(キチンの重量対比、以下同)を得た。 After filtration with a glass filter and the precipitated been N- acetyl -D- glucosamine and washed with ethanol, 50% powder and vacuum dried N- acetyl -D- glucosamine (by weight based on the weight of the chitin, following the same) to give the .

[実施例2] [Example 2]
カニのキチン(αキチン)を基質として使用した。 Crab chitin (α chitin) was used as the substrate. キチンと燐酸(H 3 PO 4 )を重量比で1:4になるように燐酸にキチンを溶解して常温で12時間放置した後、キチン量の10倍量の水を前記溶液に撹拌しながら添加した。 Chitin and phosphoric acid (H 3 PO 4) in a weight ratio of 1: After standing for 12 hours at room temperature to dissolve the chitin phosphate to be 4, with stirring 10 volumes of water chitin amount to the solution It was added. 膨潤されたキチンは遠心分離(5,000rpm)して溶剤と分離した後、pH4.5になるまで水による洗滌又は中和を行った。 After swollen chitin separated and the solvent was centrifuged (5,000 rpm), it was washed or neutralized with water until pH 4.5.
前記の過程を通じて水重量の基準で膨潤されたキチン5重量%(膨潤キチン重量対比10重量%がキチン量)に対して分解酵素30unit/gキチン量を添加して40℃で72時間分解させた。 Chitin 5% by weight was swollen with reference water weight (swollen chitin by weight based on the weight of 10 wt% chitin amount) was allowed to decompose at 40 ° C. 72 hours added enzyme 30unit / g chitin weight relative through the process .
分解液は、フーリフィルター(1μm)−ゼータフィルター(0.7μm)で構成される2段階の濾過過程を経て未反応物質を除去し、酵素と目的物を分離するために限外濾過膜(MWCO 10,000)で濾過して酵素を除去した。 Decomposition solution, Fourier filter (1 [mu] m) - via a 2-step filtration process consisting of zeta filter (0.7 [mu] m) to remove unreacted substances, ultrafiltration membrane to separate the enzyme and the desired product (MWCO 10,000 and filtered to remove the enzyme in).
濾過液から1ステップで液を完全に蒸発させ、N−アセチル−D−グルコサミンを析出させた。 Liquid completely evaporated in one step from the filtrate to precipitate N- acetyl -D- glucosamine.
析出されたN−アセチル−D−グルコサミンをエタノールで洗滌してグラスフィルターで濾過した後、熱風乾燥してN−アセチル−D−グルコサミンの粉末51%を得た。 After filtration with a glass filter and the precipitated been N- acetyl -D- glucosamine and washed with ethanol to give 51% powder by hot-air drying N- acetyl -D- glucosamine.

[実施例3] [Example 3]
エビのキチン(αキチン)を基質として使用した。 Shrimp chitin (α chitin) was used as the substrate. キチンと燐酸(H 3 PO 4 )を重量比で1:4になるように燐酸にキチンを溶解して常温で12時間放置した後、キチン量の10倍量の水を前記溶液に撹拌しながら添加した。 Chitin and phosphoric acid (H 3 PO 4) in a weight ratio of 1: After standing for 12 hours at room temperature to dissolve the chitin phosphate to be 4, with stirring 10 volumes of water chitin amount to the solution It was added. 膨潤されたキチンは遠心分離(5,000rpm)して溶剤と分離した後、pH4.5になるまで水による洗滌又は中和を行った。 After swollen chitin separated and the solvent was centrifuged (5,000 rpm), it was washed or neutralized with water until pH 4.5.
前記の過程を通じて水重量の基準で膨潤されたキチン5重量%(膨潤キチン重量対比10重量%がキチン量)に対して分解酵素30unit/gキチン量を添加して40℃で72時間分解させた。 Chitin 5% by weight was swollen with reference water weight (swollen chitin by weight based on the weight of 10 wt% chitin amount) was allowed to decompose at 40 ° C. 72 hours added enzyme 30unit / g chitin weight relative through the process .
分解液は、フーリフィルター(1μm)−ゼータフィルター(0.7μm)で構成される2段階の濾過過程を経て未反応物質を除去し、酵素と目的物を分離するために限外濾過膜(MWCO 10,000)で濾過して酵素を除去した。 Decomposition solution, Fourier filter (1 [mu] m) - via a 2-step filtration process consisting of zeta filter (0.7 [mu] m) to remove unreacted substances, ultrafiltration membrane to separate the enzyme and the desired product (MWCO 10,000 and filtered to remove the enzyme in).
濾過液は、真空減圧濃縮器を利用して1〜2回にわたり約50BX程度で減圧濃縮させ、4℃の低温で12時間程度保管することによってN−アセチル−D−グルコサミンを析出させた。 Filtrate is then concentrated under reduced pressure at about 50BX over 1-2 times using vacuum vacuum evaporator to precipitate the N- acetyl -D- glucosamine by storing approximately 12 hours at a low temperature of 4 ° C..
析出されたN−アセチル−D−グルコサミンをエタノールで洗滌してグラスフィルターで濾過した後、真空乾燥してN−アセチル−D−グルコサミンの粉末52%を得た。 After filtration with a glass filter and the precipitated been N- acetyl -D- glucosamine and washed with ethanol to give 52% powder and vacuum dried N- acetyl -D- glucosamine.

[実施例4] [Example 4]
エビのキチン(αキチン)を基質として使用した。 Shrimp chitin (α chitin) was used as the substrate. キチンと燐酸(H 3 PO 4 )を重量比で1:4になるように燐酸にキチンを溶解して常温で12時間放置した後、キチン量の10倍量の水を前記溶液に撹拌しながら添加した。 Chitin and phosphoric acid (H 3 PO 4) in a weight ratio of 1: After standing for 12 hours at room temperature to dissolve the chitin phosphate to be 4, with stirring 10 volumes of water chitin amount to the solution It was added. 膨潤されたキチンは遠心分離(5,000rpm)して溶剤と分離した後、pH4.5になるまで水による洗滌又は中和を行った。 After swollen chitin separated and the solvent was centrifuged (5,000 rpm), it was washed or neutralized with water until pH 4.5.
前記の過程を通じて水重量を基準で膨潤されたキチン5重量%(膨潤キチン重量対比10重量%がキチン量)に対して分解酵素30unit/gキチン量を添加して40℃で72時間分解させた。 Chitin 5% by weight of water was swollen by the reference (swollen chitin by weight based on the weight of 10 wt% chitin amount) was allowed to decompose at 40 ° C. 72 hours added enzyme 30unit / g chitin weight relative through the process .
分解液は、フーリフィルター(1μm)−ゼータフィルター(0.7μm)で構成される2段階の濾過過程を経て未反応物質を除去し、酵素と目的物を分離するために限外濾過膜(MWCO 10,000)で濾過して酵素を除去した。 Decomposition solution, Fourier filter (1 [mu] m) - via a 2-step filtration process consisting of zeta filter (0.7 [mu] m) to remove unreacted substances, ultrafiltration membrane to separate the enzyme and the desired product (MWCO 10,000 and filtered to remove the enzyme in).
濾過液から1ステップで液を完全に蒸発させ、N−アセチル−D−グルコサミンを析出させた。 Liquid completely evaporated in one step from the filtrate to precipitate N- acetyl -D- glucosamine.
析出されたN−アセチル−D−グルコサミンをエタノールで洗滌してグラスフィルターで濾過した後、熱風乾燥してN−アセチル−D−グルコサミンの粉末50%を得た。 After filtration with a glass filter and the precipitated been N- acetyl -D- glucosamine and washed with ethanol to give 50% powder by hot-air drying N- acetyl -D- glucosamine.

[実施例5] [Example 5]
イカ軟骨のキチン(βキチン)を基質として使用した。 Squid cartilage of chitin (β chitin) was used as the substrate. キチンを60メッシュで粉砕した粉末を希酢酸溶液(0.075%)に重量比で2%になるように浸漬させ、12時間放置した後、ホモジェナイザーで5,000rpmに高速撹拌してキチンを膨潤させた。 Chitin 60 mesh ground powder dilute acetic acid solution (0.075%) in immersed at 2 percent by weight, after standing for 12 hours, swelling chitin with high speed stirring to 5,000rpm at homogenizer It was. これに分解酵素30unit/gキチン量を添加して40℃で72時間分解させた。 To this was added enzyme 30unit / g chitin amount was decomposed at 40 ° C. 72 hours.
分解液は、フーリフィルター(1μm)−ゼータフィルター(0.7μm)で構成される2段階の濾過過程を経て未反応物質を除去し、酵素と目的物を分離するために限外濾過膜(MWCO 10,000)で濾過して酵素を除去した。 Decomposition solution, Fourier filter (1 [mu] m) - via a 2-step filtration process consisting of zeta filter (0.7 [mu] m) to remove unreacted substances, ultrafiltration membrane to separate the enzyme and the desired product (MWCO 10,000 and filtered to remove the enzyme in).
濾過液は、真空減圧濃縮器を利用して1〜2回にわたり約50BX程度で減圧濃縮させ、4℃の低温で12時間程度保管することによってN−アセチル−D−グルコサミンを析出させた。 Filtrate is then concentrated under reduced pressure at about 50BX over 1-2 times using vacuum vacuum evaporator to precipitate the N- acetyl -D- glucosamine by storing approximately 12 hours at a low temperature of 4 ° C..
析出されたN−アセチル−D−グルコサミンをエタノールで洗滌してグラスフィルターで濾過した後、真空乾燥してN−アセチル−D−グルコサミンの粉末78%を得た。 After filtration with a glass filter and the precipitated been N- acetyl -D- glucosamine and washed with ethanol to give 78% powder and vacuum dried N- acetyl -D- glucosamine.

[実施例6] [Example 6]
イカ軟骨のキチン(βキチン)を基質として使用した。 Squid cartilage of chitin (β chitin) was used as the substrate. キチンを60メッシュで粉砕した粉末を希酢酸溶液(0.075%)に重量比で2%になるように浸漬させ、12時間放置した後、ホモジェナイザーで5,000rpmに高速撹拌してキチンを膨潤させた。 Chitin 60 mesh ground powder dilute acetic acid solution (0.075%) in immersed at 2 percent by weight, after standing for 12 hours, swelling chitin with high speed stirring to 5,000rpm at homogenizer It was. これに分解酵素30unit/gキチン量を添加して40℃で72時間分解させた。 To this was added enzyme 30unit / g chitin amount was decomposed at 40 ° C. 72 hours.
分解液は、フーリフィルター(1μm)−ゼータフィルター(0.7μm)で構成される2段階の濾過過程を経て未反応物質を除去し、酵素と目的物を分離するために限外濾過膜(MWCO 10,000)で濾過して酵素を除去した。 Decomposition solution, Fourier filter (1 [mu] m) - via a 2-step filtration process consisting of zeta filter (0.7 [mu] m) to remove unreacted substances, ultrafiltration membrane to separate the enzyme and the desired product (MWCO 10,000 and filtered to remove the enzyme in).
濾過液から1ステップで液を完全に蒸発させてN−アセチル−D−グルコサミンを析出させた。 Liquid to precipitate completely evaporated to N- acetyl -D- glucosamine in one step from the filtrate.
析出されたN−アセチル−D−グルコサミンをエタノールで洗滌してグラスフィルターで濾過した後、熱風乾燥してN−アセチル−D−グルコサミンの粉末75%を得た。 After filtration with a glass filter and the precipitated been N- acetyl -D- glucosamine and washed with ethanol to obtain 75% powder by hot-air drying N- acetyl -D- glucosamine.

本発明によれば、N−アセチル−D−グルコサミンの製造を、従来より単純かつ低コストで行うことができるのみならず、環境に対する負荷をより少なく実施することができる。 According to the present invention, N- acetyl -D- production of glucosamine, not only it can be carried out in a simple and lower cost than conventionally, can be performed in less load on the environment. したがって、本発明は、N−アセチル−D−グルコサミンの製造業および関連産業の発展に寄与するところ大である。 Accordingly, the present invention is greater where to contribute to the development of the N- acetyl -D- glucosamine manufacturing and related industries.

Claims (8)

  1. キチンを膨潤させる段階;及び 膨潤した前記キチンにN−アセチル−D−グルコサミン分解酵素を加えて酵素反応させ、キチンの酵素分解液を得る段階を包含するN-アセチル−D−グルコサミンの製造方法。 Step swell the chitin; and swelled by adding N- acetyl -D- glucosamine degradation enzyme in said chitin is enzyme reaction method for producing N- acetyl -D- glucosamine comprises the step of obtaining the enzyme hydrolyzate was chitin.
  2. キチンが、αキチン、又はβキチンであることを特徴とする請求項1に記載の製造方法。 Chitin method according to claim 1, characterized in that the α chitin, or β chitin.
  3. キチンを膨潤させる段階が、αキチンを燐酸に溶解させる段階と、 Step to swell the chitin, the method comprising dissolving the α chitin phosphate,
    所定量の水を添加して膨潤させたαキチンを溶剤から分離させる段階とを包含することを特徴とする請求項2に記載の製造方法。 The method according to claim 2, characterized in that it comprises the step of separating the α chitin swollen by adding a predetermined amount of water from the solvent.
  4. 水の添加を、膨潤したαキチン全体の重量に対して10重量%の量のαキチンに、膨潤したαキチンの量が前記水に対して5重量%となるように行い、N−アセチル−D−グルコサミン分解酵素の添加を、20〜40unit/gキチンの量で行うことを特徴とする請求項3に記載の製造方法。 The addition of water, the α chitin in an amount of 10 wt% by weight of the total α chitin swollen performed so that the amount of the swollen α chitin is 5% by weight relative to the water, N- acetyl - the addition of D- glucosamine decomposition enzymes, the production method according to claim 3, characterized in that an amount of 20~40unit / g chitin.
  5. 前記キチンを膨潤させる段階が、βキチンを粉末化させる段階と、 Step of swelling the chitin, a step of powdering the β chitin,
    前記βキチンの粉末を希酢酸溶液に浸漬させ、所定の時間放置した後、撹拌する段階とを包含することを特徴とする請求項2に記載の製造方法。 Wherein and the powder was immersed in β chitin in a dilute acetic acid solution, was left for a predetermined time, The method according to claim 2, characterized in that it comprises the steps of stirring.
  6. 希酢酸溶液の添加を、膨潤したβキチンの量が前記希酢酸溶液に対して2重量%となるように行い、N−アセチル−D−グルコサミン分解酵素の添加を、20〜40unit/gキチンの量で行うことを特徴とする請求項5に記載の製造方法。 The addition of dilute acetic acid solution, and so that the amount of the swollen β chitin is 2 wt% with respect to the dilute acetic acid solution, the addition of N- acetyl -D- glucosamine decomposition enzymes, the 20~40unit / g chitin the method according to claim 5, characterized in that an amount.
  7. N−アセチル−D−グルコサミン分解酵素が、トリコデルマ・レセイ由来のエキソ型キチナーゼ又はセルロモナス種由来のエキソ型キチナーゼであることを特徴とする請求項1〜6のいずれかに記載の製造方法。 N- acetyl -D- glucosamine decomposition enzymes, the production method according to claim 1, characterized in that the exo-type chitinase from exo-type chitinase or Cellulomonas species derived from Trichoderma reesei.
  8. 酵素分解液を2段階で濾過することにより未反応物質を除去し、さらに分離膜で濾過して酵素を除去する段階と、 The method comprising the enzyme hydrolyzate was unreacted materials were removed by filtration in two steps is further filtered to remove the enzyme in the separation membrane,
    前記分離膜を通過した濾過液を減圧濃縮し、N−アセチル−D−グルコサミンを析出する段階と、 A step of said filtrate which has passed through the separation membrane and concentrated under reduced pressure, the precipitated N- acetyl -D- glucosamine,
    前記析出されたN−アセチル−D−グルコサミンを洗滌及び濾過した後、乾燥してN−アセチル−D−グルコサミンの粉末を得る段階とをさらに包含する請求項1〜7のいずれかに記載の製造方法。 After washing and filtering the N- acetyl -D- glucosamine are the precipitated preparation according to any one of further comprising claims 1 to 7 and a step of obtaining a powder of dried N- acetyl -D- glucosamine Method.
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