JP2007089566A - Microorganism separating device - Google Patents

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Masato Yoshino
口 智 原
野 正 人 吉
永 是 松
口 朋 之 田
森 義 雄 石
山 春 子 竹
田 広 和 豊
子 政 雄 金
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Tokyo Univ Of Agriculture & Technology
Toshiba Corp
国立大学法人東京農工大学
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    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12MAPPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M47/00Means for after-treatment of the produced biomass or of the fermentation or metabolic products, e.g. storage of biomass
    • C12M47/02Separating microorganisms from the culture medium; Concentration of biomass

Abstract

PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a microorganism separating device capable of selectively separating a target microorganism from sample water with good accuracy and recovering the microorganism.
SOLUTION: This microorganism separating device is equipped with a microchip 20 for capturing the target microorganism contained in the sample water, a sample water supply means 19 for supplying the sample water to the microchip 20, and a sample water suction means 21 for sucking the sample water from the microchip 20. The microchip 20 has a flat plate substrate 10 on which a flow channel 11 having a fluid supply port 13, a fluid suction port 15, and a fluid discharge port 14 are formed and a capturing part 12 positioned on the fluid suction port 15 of the flat plate substrate 10. The capturing part 12 of the microchips has a plurality of open holes 12a each having a diameter smaller than a minimum diameter of the target microorganism.
COPYRIGHT: (C)2007,JPO&INPIT

Description

本発明は、上水道原水水質管理、浄水水質管理、その他水処理水質管理、環境水質管理、食品衛生管理、養殖施設管理等において、微生物を含む試料水中から、特定の微生物を選択的に捕捉し、分離・回収するための微生物分離装置に関する。 The present invention, water supply raw water quality management, water purification water quality management, other water treatment water quality management, environmental water quality management, food sanitation management in aquaculture facilities management, etc., from a sample water containing microorganisms, selectively capturing a particular microorganism, It relates to a microorganism separation device for separating and recovering.

上水道の浄水水質の検査、食品検査、食品加工施設の工程管理、養殖漁業施設の水質検査等において、微生物の検出が行われている。 Inspection of water purification water quality of water supply, food inspection, process management of food processing facilities, in water quality inspection of aquaculture facilities, the detection of microorganisms has been carried out. これらの各検査において、特に病原性微生物はその影響力が大きく、病原性微生物は処理水や製品を通じて拡散することにより人に対して健康被害を及ぼす可能性がある。 In each of these tests, especially pathogenic microorganisms increases its influence, pathogenic microorganisms is likely to exert a health hazard to people by diffusing through the treated water and products. そのため、検出対象となる病原性微生物もしくは病原性微生物発生の指標となる微生物の検出が求められている。 Therefore, the detection of microorganisms which becomes pathogenic microorganisms or indicator of pathogenic microorganisms occurs to be detected are required. それに付随して、検出の前段階として、微生物の分離回収プロセスが必要となる。 Concomitantly, as pre-stage of the detection, it is necessary to separate and recover process of the microorganism.

従来の微生物の検出技術は、培養によるコロニー形成を観察する方法が一般的である。 Detection techniques conventional microorganisms, a method of observing colony formation by cultured are common.

この方法は簡便に行えるという利点はあるものの、結果が得られるまでに時間がかかり、また、操作に熟練を要するといった問題点がある。 Although this method is advantageous in that conveniently enables the results takes time to obtain, and there is a problem that requires skill to operate. また、浄水場で問題となっているクリプトスポリジウムやジアルジア等の原虫類は、上記の様な培養による方法では検出が難しい。 In addition, protozoa such as Cryptosporidium and Giardia, which has been a problem of a water treatment plant, is difficult to detect in the process of such a culture of the above.

近年、生物がもつ遺伝子・DNA・抗原などを用いた、分子生物学的な手法による微生物の検知・同定方法が提案されている。 Recently, using a gene-DNA-antigen with organisms, detection and identification method for microorganisms has been proposed, by molecular biology techniques. これら手法は対象生物に固有の塩基配列や抗原を対象としており、対象生物を選択的に識別して特異的に対象生物を検知することが可能である。 These techniques are directed to a specific nucleotide sequence or antigen to the subject organism, it is possible to detect selectively identify and specifically target biological target organism. しかし、これら手法で用いるDNA断片・抗体等は、対象とする微生物以外の微生物や濁質等の夾雑物を非特異的に吸着することがあり、誤認識の原因となる。 However, DNA fragments, antibodies, etc. used in these techniques, may nonspecifically adsorb contaminants microorganisms and suspended substances other than the microorganism of interest, causing misrecognition. 実際には、試料水中に対象微生物が純粋な状態で存在しているわけでは無く、他の多くの微生物および懸濁物質と共存している。 In fact, rather than necessarily subject microorganism sample water is present in pure form, coexisting with many other microorganisms and suspended matter. そのため、誤認識を完全に排除するのは困難である。 Therefore, it is difficult to completely eliminate the erroneous recognition.

前述したように、対象微生物は試料水中に純粋な状態で存在しているわけでは無く、他の多くの微生物および懸濁物質と共存している。 As described above, the target microorganism not mean exist in a pure state in sample water, coexisting with many other microorganisms and suspended matter. そのため、検出精度を向上させるには、試料水中から対象の微生物を選択的に分離・回収することが必要である。 Therefore, in order to improve the detection accuracy, it is necessary to selectively separate and recover the microorganisms of interest from the sample water. また、前記したクリプトスポリジウムやジアルジア等の原虫類は、微生物量が少量であっても大きな人的被害となる可能性がある。 Furthermore, protozoa such as Cryptosporidium and Giardia mentioned above is likely to be a small amount of microbial load becomes large human suffering. そのため、試料水中に存在する、希薄な当該微生物のみを分離・回収することが求められる。 Therefore, present in the sample water, it is required to separate and recover only dilute the microorganism.

また、従来より微生物検出に際し、顕微鏡を用いて観察が行われている。 Further, when conventionally microbial detection, observation using a microscope is performed. 顕微鏡観察をするために、固定化プレートとしては、スライドガラスやメンブレンディスクフィルタなどが用いられており、このため対象となる観察部面積が比較的大きくなることがある(特許文献1および2)。 To microscopy, the immobilized plate, such as a slide glass and a membrane disk filters are used, it may become relatively large observation unit area Therefore of interest (Patent Documents 1 and 2).
特公平5−88417号公報 Kokoku 5-88417 Patent Publication No. 特許第3422402号公報 Patent No. 3422402 Publication

この場合作業の効率化を図るために、観察する際画像処理技術が適用されているが、画像処理技術を適用する上で、顕微鏡視野の移動のためのステージ走査機構、もしくは励起レーザー光の走査機構が必要となる。 For efficient this case work, the image processing technique in observing is applied, in applying the image processing technology, the stage scanning mechanism for moving the microscopic field, or scan of the excitation laser light mechanism is required. そのため、装置の大型化、高コスト化がすすみ、かつ走査に要する時間だけ応答が遅れるといった問題がある。 Therefore, size of the apparatus, high cost is proceeds, and there is a problem response by the time required for scanning is delayed.

本発明はこのような点を考慮してなされたものであり、微細加工技術を応用したマイクロチップを利用することにより、検出対象とする微生物を、微小領域でかつ特定位置に選択的に捕捉し分離することができる微生物分離装置を提供することを目的とする。 The present invention has been made in consideration of such points, microfabrication techniques by utilizing a microchip that applies, the microorganism to be detected, selectively captures the minute area a and the particular position and an object thereof is to provide a microorganism separating apparatus capable of separating.

本発明は、試料水中に含まれる対象微生物を分離して回収する微生物分離装置において、流体供給口および流体吸引口を含むフロー流路が内部に形成された平板基板と、平板基板の流体吸引口に設けられ対象微生物の最小径より小さい径の複数の貫通孔からなる捕捉部とを有するマイクロチップと、マイクロチップの捕捉部に接続され試料水を吸引する試料水吸引手段と、マイクロチップの平板基板の流体供給口に接続され試料水を供給する試料水供給手段と、を備えたことを特徴とする微生物分離装置である。 The present invention, in a microorganism separation device for separating and recovering target microorganisms contained in the sample water, the fluid supply opening and a flat substrate flow passage formed therein comprising a fluid suction port, a fluid suction port of the flat substrate a sample water suction means for sucking the microchip, the sample water is connected to the capture portion of the microchip and a catching portion including a plurality of through-holes of smaller diameter than the minimum diameter of the target microorganism provided, the microchip flat a sample water supply means for supplying a sample solution is connected to the fluid supply port of the substrate, a microorganism separation device characterized by comprising a.

本発明によれば、対象微生物をマイクロチップの捕捉部に効果的に導くことが可能である。 According to the present invention, it is possible to effectively guide the object microorganism trapping section of the microchip. また連続流通する試料水から、短時間で対象微生物を捕捉部により分離・回収することが可能であり、かつ特定位置に対象微生物を保持することが可能となる。 Also from the sample water to continuous flow, it is possible to separate and recover the capturing unit target microorganisms in a short time, and it is possible to hold the object microorganism in a specific position.

本発明は、平板基板の貫通孔内に、対象微生物の抗原を特異的に認識する抗体を設けたことを特徴とする微生物分離装置である。 The present invention, in the through hole of the flat substrate, a microorganism separation apparatus characterized by comprising an antibody that specifically recognizes the antigen of interest microorganisms.

本発明によれば、効果的に捕捉部の貫通孔に対象微生物を分離・回収・保持することができる。 According to the present invention, it can be separated and recovered and holding a target microorganism in the through hole of effectively capturing unit.

本発明は、対象微生物の抗原を特異的に認識するとともに磁性物質で標識した抗体を試料水に供給するための磁性物質標識抗体供給手段と、この磁性物質標識抗体供給手段から供給された磁性物質標識抗体と微生物の抗原との反応を行う反応部とを更に備え、平板基板の貫通孔内に、磁性物質を引力する材料を設けたことを特徴とする微生物分離装置である。 The present invention is a magnetic material which is supplied with antibodies labeled with a magnetic material with specifically recognizes the antigen of interest microorganisms and the magnetic substance-labeled antibody supplying means for supplying the water sample from the magnetic substance-labeled antibodies supply means anda reaction unit to carry out the reaction with the antigen of the labeled antibody and the microorganism, in the through hole of the plate substrate, a microorganism separation device, characterized in that a material for the force of the magnetic material.

本発明は、対象微生物の抗原を特異的に認識するとともに磁性物質で標識した抗体を試料水に供給するための磁性物質標識抗体供給手段と、この磁性物質標識抗体供給手段から供給された磁性物質標識抗体と微生物の抗原との反応を行う反応部とを更に備え、平板基板の貫通孔内に、磁性物質を吸引する磁気を発生させる磁気印加手段を設けたことを特徴とする微生物分離装置である。 The present invention is a magnetic material which is supplied with antibodies labeled with a magnetic material with specifically recognizes the antigen of interest microorganisms and the magnetic substance-labeled antibody supplying means for supplying the water sample from the magnetic substance-labeled antibodies supply means anda reaction unit to carry out the reaction with the antigen of the labeled antibody and the microorganism, in the through hole of the plate substrate, a microorganism separation device, characterized in that a magnetic applying means for generating a magnetic for attracting the magnetic material is there.

本発明は、試料水中に含まれる対象微生物を分離して回収する微生物分離装置において、流体供給口および流体吸引口を含むフロー流路が内部に形成された平板基板と、平板基板の流体吸引口に設けられた複数の貫通孔からなる捕捉部とを有するマイクロチップと、マイクロチップの流体吸引口側の面に設けられたメンブレンフィルタと、メンブレンフィルタのマイクロチップと反対側の面に設けられ、試料水を吸引する試料水吸引手段と、平板基板の流体供給口に接続され試料水を供給する試料水供給手段と、を備えたことを特徴とする微生物分離装置である。 The present invention, in a microorganism separation device for separating and recovering target microorganisms contained in the sample water, the fluid supply opening and a flat substrate flow passage formed therein comprising a fluid suction port, a fluid suction port of the flat substrate a microchip having a catching portion including a plurality of through holes provided in the membrane filter provided on the surface of the fluid suction port side of the microchip, provided the microchip and the opposite surface of the membrane filter, a sample water suction means for sucking the water sample, a microorganism separation apparatus characterized by comprising: a sample water supply means for supplying is connected to the fluid supply port of the flat substrate sample water, the.

本発明によれば、メンブレンフィルタ上の貫通孔に対応する特定位置に対象微生物を固定でき、また、マイクロチップを繰り返し使用することが可能であり、低コスト化が図れる。 According to the present invention, a specific position corresponding to the through holes on the membrane filter can be fixed to the target microorganism, also, it is possible to use repeatedly microchip, cost reduction can be achieved.

本発明は、マイクロチップの平板基板のフロー流路は流体排出口を有し、流体排出口にフロー流路を通過した試料水を回収し、再び試料水供給手段に戻す循環手段を接続したことを特徴とする微生物分離装置である。 The present invention, the flow passage of the flat substrate of the microchip having a fluid outlet, to the sample water which has passed through the flow passage in fluid outlets were collected and connect the circulating means back into the sample water supply means a microorganism separation device according to claim.

本発明によれば、一度マイクロチップを通過した試料水を回収し、再び試料水供給手段に戻すことができ、マイクロチップの捕捉部で捕捉されずに通過した対象微生物を再び捕捉部に供給することが可能となり、回収率の向上を図ることができる。 According to the present invention, once the sample water having passed through the microchip is recovered, it can be again returned to the sample water supply means for supplying again capturing unit target microorganism that has passed without being caught by the catching portion of the microchip it becomes possible, it is possible to improve the recovery rate.

本発明は、マイクロチップにエネルギーを印加する物理的印加手段を更に備えたことを特徴とする微生物分離装置である。 The present invention is a microorganism separation device, characterized in that it further comprises a physical application means for applying energy to the microchip.

本発明によれば、マイクロチップの貫通孔内に残留している対象微生物以外の微生物や粒子状物質を効率的に除去することが可能となり、対象微生物を効果的に分離・回収することができる。 According to the present invention, it is possible to it is possible to remove the microorganisms and particulate matter other than the target microorganisms remaining in the through hole of the microchip efficiently, effectively separating and recovering the target microorganism .

本発明は、マイクロチップのフロー流路に洗浄液を流すための洗浄液供給手段を更に備えたことを特徴とする微生物分離装置である。 The present invention is a microorganism separating apparatus characterized by further comprising a cleaning liquid supply means for supplying a cleaning liquid to flow channel of the microchip.

本発明によれば、貫通孔内に残留している対象微生物以外の微生物や粒子状物質を、洗浄液により効率的に除去することが可能となる。 According to the present invention, the microorganisms and particulate matter other than the target microorganisms remaining in the through hole, it is possible to efficiently remove the cleaning liquid.

本発明は、試料水供給手段の前段に、マイクロチップに供給する試料水中に含まれる対象微生物及びその他の粒子を大きさで分画する分画処理手段を設けたことを特徴とする微生物分離装置である。 The present invention, in front of the sample water supply means, a microorganism separation device, characterized in that a fraction processing means for fractionating the target microorganisms and other particles contained in the sample water supplied to microchip size it is.

本発明によれば、予め試料水中に含まれる対象微生物およびその他の粒子を粒子径により分画処理することにより、マイクロチップに供給する試料水中の対象微生物濃度を高めることができ、また、対象微生物より小さい粒子径を有するものを予め除去することにより、貫通孔の閉塞などを軽減でき、効率よい回収が可能となる。 According to the present invention, by fractionation by particle diameter target microorganisms and other particles contained in the pre-sample water, it is possible to increase the target microorganism concentration in sample water supplied to the microchip, also subject microorganism by previously removed those with smaller particle size, etc. can reduce clogging of the through holes, efficient recovery is possible.

本発明は、サンプル水中の特定の対象微生物を分離・回収する微生物分離装置において、対象微生物より小さな孔径をもつ貫通孔が形成された板状のマイクロチップと、このマイクロチップの上面に配置され第1のフロー流路を有する第1の支持体と、マイクロチップの下面に配置され第2のフロー流路を有する第2の支持体とを備え、第1の支持体の第1のフロー流路と第2の支持体の第2のフロー流路はマイクロチップの貫通孔を介して互いに連通自在となっていることを特徴とする微生物分離装置である。 The present invention, in a microorganism separation device for separating and recovering a specific target microorganisms in the sample water, first arranged a plate-shaped microchip through hole having a smaller pore size than the target microbes are formed on the upper surface of the microchip a first support having a first flow passage, and a second support having a second flow passage disposed on the lower surface of the microchip, the first flow passage of the first support When the second flow passage of the second support is a microorganism separation device, characterized in that it freely communicate with each other through the through-hole of the microchip.

本発明は、第1の支持体の第1のフロー流路は外方へ開口する供給口を有し、第2の支持体の第2のフロー流路は外方へ開口する排出口を有することを特徴とする微生物分離装置である。 The present invention includes a first flow channel of the first support member has a supply opening which opens outwardly, the second flow passage of the second support has an outlet which opens outwardly it is a microorganism separation device according to claim.

本発明は、マイクロチップの貫通孔はレーザー加工により形成されることを特徴とする微生物分離装置である。 The present invention, through-holes of the microchip is a microorganism separation device characterized in that it is formed by laser processing.

本発明は、第1および第2の支持体は、透明体から構成されることを特徴とする微生物分離装置である。 The present invention, first and second supports, a microorganism separation device characterized in that it is made of a transparent material.

本発明は、対象微生物はクリプトスポリジウムであることを特徴とする微生物分離装置である。 The present invention is subject microorganism is a microorganism separation device which is a Cryptosporidium.

本発明は、貫通孔の最狭部の孔径は2〜3μmとなることを特徴とする微生物分離装置である。 The present invention, the pore size of the narrowest portion of the through hole is a microorganism separating apparatus characterized by comprising a 2 to 3 [mu] m.

本発明は、マイクロチップの厚さは5〜50μmとなることを特徴とする微生物分離装置である。 The present invention, the thickness of the microchip is a microorganism separating apparatus characterized by comprising a 5 to 50 [mu] m.

本発明は、マイクロチップに、マイクロチップを洗浄する物理的洗浄手段を設けたことを特徴とする微生物分離装置である。 The present invention relates to a microchip, a microorganism separation device, characterized in that a physical cleaning means for cleaning the microchip.

本発明は、マイクロチップに、マイクロチップに対して洗浄液を流すための洗浄液供給手段を接続したことを特徴とする微生物分離装置である。 The present invention relates to a microchip, a microorganism separation apparatus characterized by connecting the cleaning liquid supply means for supplying a cleaning liquid against the microchip.

本発明は、第1のフロー流路内面に親水化処理を施したことを特徴とする微生物分離装置である。 The present invention is a microorganism separating apparatus characterized by having been subjected to hydrophilic treatment to the first flow passage inner surface.

本発明によれば、試料水に含まれる微生物が第1のフロー流路に付着することを防止することが可能となる。 According to the present invention, it is possible to prevent the microorganisms contained in the sample water is attached to the first flow passage.

本発明は、第1の支持体の第1のフロー流路内面に対する親水化処理は、プラズマ処理を含むことを特徴とする微生物分離装置である。 The present invention, hydrophilic treatment for the first flow passage inner surface of the first support is a microorganism separating apparatus which comprises a plasma treatment.

本発明によれば、プラズマ処理することにより、フロー流路部の表面に親水基が導入され、試料水の流通性が改善されるとともに、微生物の吸着が低減される。 According to the present invention, by plasma treatment, is introduced hydrophilic group on the surface of the flow passage section, with the distribution of the sample water is improved, adsorption of microorganisms is reduced.

本発明は、第1の支持体の第1のフロー流路内面に対する親水化処理は、プラズマ処理と、プラズマ処理を施した後の陰イオン界面活性剤によるコーティング処理とを含むことを特徴とする微生物分離装置である。 The present invention, hydrophilic treatment for the first flow passage inner surface of the first support, characterized in that it comprises a plasma treatment, and a coating treatment with anionic surfactant was subjected to a plasma treatment it is a microorganism separation device.

本発明によれば、プラズマ処理することにより、流路の親水性が向上することによって流通性が改善され、また陰イオン界面活性剤を用いて表面を被覆することにより、表面電位が負に帯電している、クリプトスポリジウム等の微生物の吸着を低減することができる。 According to the present invention, charging by plasma treatment, distribution property is improved by the hydrophilic flow path is improved, also by coating the surface with an anionic surfactant, the surface potential is negative it is, it is possible to reduce the adsorption of microorganisms Cryptosporidium like.

本発明は、第1の支持体および第2の支持体は、ポリジメチルシロキサン(PDMS)からなることを特徴とした微生物分離装置である。 The present invention, first support and the second support is a microorganism separating apparatus characterized by comprising a polydimethylsiloxane (PDMS).

本発明によれば、透明で成形性の良好なポリジメチルシロキサンを用いることにより、複雑な形状の流路を簡易に製作可能であり、プラズマ処理および界面活性剤コーティングにより、微生物の付着防止効果を得ることができる。 According to the present invention, by using a good polydimethylsiloxane transparent moldability, and can be manufactured with a flow path having a complicated shape easily by a plasma treatment and surfactant coating, the adhesion preventing effect of microorganisms it is possible to obtain.

本発明は、藻類を除去する手段を更に備えたことを特徴とする微生物分離装置である。 The present invention is a microorganism separating apparatus characterized by further comprising means for removing algae.

本発明によれば、クリプトスポリジウムと同等の粒子径を持ち、かつ自家蛍光を発することから、クリプトスポリジウムの蛍光観察の妨害となる藻類を除去することにより、観察精度の向上を図ることができる。 According to the present invention have a particle diameter of equal to Cryptosporidium, and since it emits autofluorescence, by removing the algae as a disturbance of Cryptosporidium fluorescence observation, it is possible to improve the observation accuracy.

本発明は、藻類を除去する手段は、酵素による溶解処理手段からなることを特徴とする微生物分離装置である。 The present invention, means for removing the algae is a microorganism separating apparatus characterized by comprising a dissolution treatment enzymatic means.

本発明は、藻類を除去する手段は、酵素としてリゾチームを使用することを特徴とする微生物分離装置である。 The present invention, means for removing the algae is a microorganism separating apparatus characterized by the use of lysozyme as an enzyme.

本発明によれば、溶菌作用のあるリゾチームを使用し、細胞壁を構成している糖鎖を切断することにより、藻類の細胞を破壊することができる。 According to the present invention, by using lysozyme with bacteriolysis, by cutting the sugar chain constituting the cell walls can be disrupted algal cell. この際、リゾチームはクリプトスポリジウムのオーシスト壁を破壊しないことから、クリプトスポリジウムの蛍光観察の妨害にはならない。 In this case, lysozyme because it does not destroy the Cryptosporidium oocysts walls, not to interfere with Cryptosporidium fluorescence observation.

本発明は、藻類を除去する手段は、酵素としてプロテアーゼを使用することを特徴とする微生物分離装置である。 The present invention, means for removing the algae is a microorganism separating apparatus characterized by the use of protease as an enzyme.

本発明によれば、タンパク質分解酵素であるプロテアーゼを使用し、細胞壁を構成しているタンパク質を分解することにより、藻類の細胞を破壊することができる。 According to the present invention, using the protease is a proteolytic enzyme, by degrading the proteins that make up the cell walls can be disrupted algal cell. この際、プロテアーゼはクリプトスポリジウムのオーシスト壁を破壊しないことから、クリプトスポリジウムの蛍光観察の妨害にはならない。 In this case, the protease is because it does not destroy the Cryptosporidium oocysts walls, not to interfere with Cryptosporidium fluorescence observation.

本発明は、藻類を除去する手段の酵素による溶解処理は、リゾチームとプロテアーゼの混合溶液による処理からなることを特徴とする微生物分離装置である。 The present invention, dissolution treatment enzymatic means for removing the algae is a microorganism separation device characterized by comprising the treatment with a mixed solution of lysozyme and protease.

本発明によれば、作用の異なる2種類の酵素を利用することにより、より効果的に藻類の細胞を破壊することができる。 According to the present invention, by utilizing two enzymes having different actions, it can destroy more effectively algae cells.

本発明は、マイクロチップに酵素液を供給するための酵素液供給手段を接続したことを特徴とする微生物分離装置である。 The present invention is a microorganism separating apparatus characterized by connecting the enzyme solution supply means for supplying enzyme solution into the microchip.

本発明によれば、酵素液を自動的にマイクロチップに供給することが可能となり、連続自動装置化を図ることができる。 According to the present invention, it is possible to supply automatically microchip enzyme solution, it is possible to achieve a continuous automated system of.

以上説明したように、本発明による微生物分離装置によれば、試料水から選択的に対象微生物をパターン化された位置に精度良く分離回収できる。 As described above, according to the microorganism separation device according to the present invention, it can be accurately separated and recovered selectively target microbial patterned position from the sample water.

また、本発明によれば、サンプル水中から特定の対象微生物のみを迅速且つ確実に分離して回収することができる。 Further, according to the present invention, only a specific target microorganisms from the sample water can be recovered quickly and reliably separated.

本発明によれば、試料水中の微生物を、フロー流路に付着させること無く、マイクロチップ部に回収することが可能となる。 According to the present invention, the microorganism of the sample water, without adhering to the flow channel, it is possible to recover the microchip part. また、本発明によれば、藻類を除去することにより、蛍光染色したクリプトスポリジウムの観察精度を向上させることが可能となる。 Further, according to the present invention, by removing the algae, it is possible to improve the observation accuracy of the fluorescence stained Cryptosporidium.

第1−1の実施の形態 1-1 embodiment
図1乃至図3により本発明による微生物分離装置の第1−1の実施の形態について説明する。 It described the 1-1 embodiment of the microorganism separation device according to the present invention with reference to FIG. 1 to FIG.

ここで図1(a)はマイクロチップを示す平面図であり、図1(b)は図1(a)のX−X'線断面図であり、図2はマイクロチップの捕捉部を示す斜視図であり、図3は微生物分離装置を示す全体概略図である。 Here, FIG. 1 (a) is a plan view showing a microchip, a line X-X 'sectional view of FIG. 1 (b) FIGS. 1 (a), perspective Fig. 2 showing the capture portion of the microchip a diagram, FIG. 3 is a schematic overall view showing a microorganism separation device.

本発明による微生物分離装置は試料水中に含まれる対象微生物を分離して回収するものである。 Microorganism separation device according to the present invention is to separating and recovering target microorganisms contained in the sample water.

図3に示すように微生物分離装置は、流体供給口13と、流体吸引口15と、流体排出口14とを含むフロー流路11が内部に形成された平板基板10と、平板基板10の流体吸引口15に設けられ対象微生物の最小径より小さい複数の貫通孔12aを有する微生物捕捉部12とを備えている。 Microorganism separating apparatus as shown in Figure 3, the fluid supply port 13, a fluid suction port 15, a flat substrate 10 the flow channel 11 which includes a fluid outlet 14 formed therein, the fluid of the flat substrate 10 provided the suction port 15 and a microbe trapping section 12 having a plurality of through holes 12a smaller than the minimum diameter of the target microorganism.

このうち、平板基板10と微生物捕捉部12とによってマイクロチップ20が構成されている。 Of these, the microchip 20 is constituted by a plate substrate 10 and the microorganism trapping section 12.

また、マイクロチップ20の微生物捕捉部12に、試料水を吸引する流体吸引装置(試料水吸引手段)21が接続され、さらにマイクロチップ20の流体供給口13に試料水をマイクロチップ20側へ供給する試料水供給ポンプ(試料水供給手段)19が試料水供給ライン16を介して接続されている。 Further, the microorganism trapping section 12 of the microchip 20, the fluid suction device (sample water suction means) 21 for sucking the sample water is connected, further supplying a sample solution to the fluid supply port 13 of the microchip 20 to the microchip 20 side sample water supply pump (sample water supply means) 19 for is connected through a sample water supply line 16. さらに試料水供給ライン16のうち試料水供給ポンプ19の前段には、試料水供給バルブ17および試料水リザーバタンク18が上流側から下流側に向って順次接続されている。 More front of sample water supply pump 19 of the sample water supply line 16 are successively connected sample water supply valve 17 and the sample water reservoir tank 18 toward the upstream side to the downstream side.

またマイクロチップ20の流体排出口14には、試料水排出バルブ22が取付けられている。 The fluid outlet 14 of the microchip 20, the sample water discharge valve 22 is attached.

次にマイクロチップ20の構成について、図1および図2により更に詳述する。 Next, configuration of the microchip 20 will be described in more detail by FIGS.

図1および図2に示すように、マイクロチップ20は主に、流体供給口13、流体排出口14、および流体吸引口15を有するフロー流路11が形成された平板基板10と、微生物捕捉部12とを備え、このうち微生物捕捉部12には多数の微生物捕捉孔(貫通孔)12aが形成されている。 As shown in FIGS. 1 and 2, the microchip 20 mainly includes a flat substrate 10 the flow channel 11 is formed with a fluid supply port 13, a fluid outlet 14 and fluid suction port 15, a microorganism trapping section and a 12, of the microorganism trapping section 12 is a large number of microorganisms trapping holes (through holes) 12a are formed.

図1において、対象微生物を含有した試料水は外部の試料水供給ポンプ19により、流体供給口13からフロー流路11に導入される。 In Figure 1, the sample water containing the target microorganisms by an external sample water supply pump 19 is introduced from the fluid supply port 13 to the flow channel 11. このための試料水供給ポンプ19としては、チューブポンプもしくはプランジャポンプ等の微小流量を制御可能なマイクロポンプが適用可能である。 The sample water supply pump 19 for this, controllable micro pump minute flow rate, such as a tube pump or a plunger pump is applicable. 特に、微生物を含む粒子状物質が試料水には含まれることから、濁質を送液するのにも適した上記ポンプを適用することが望ましい。 In particular, since the particulate matter including microorganisms are included in the sample water, it is desirable to apply the pump suitable for feeding a turbid medium.

マイクロチップ20を構成する平板基板10および微生物捕捉部12の材質としては、シリコン、金属、プラスチック、ガラス、セラミック基板等が使用可能である。 The material of the flat substrate 10 and microorganism trapping section 12 constituting the microchip 20, silicon, metal, plastic, glass, ceramic substrate, or the like can be used. 平板基板10のフロー流路11、および微生物捕捉孔12aは、フォトリソグラフィと化学的エッチング処理を組み合わした方法や、レーザー加工、マイクロ機械加工技術等により作製される。 Flow channel 11 of the flat substrate 10 and microorganism capturing hole 12a, it is a method in which Kumiawashi photolithography and chemical etching process, laser processing, is fabricated by micromachining technology.

また、対象微生物を含有した試料水は、フロー流路11を流通し、微生物捕捉部12に導入され、微生物捕捉部12において、流体吸引装置21により吸引される流体吸引口15によって吸引される。 Further, the sample water containing a target microorganism, flows through the flow passage 11, is introduced into a microorganism trapping section 12, in a microorganism trapping section 12 is sucked by the fluid suction port 15 is sucked by the fluid suction apparatus 21. その際、対象微生物は捕捉孔12aに捕捉される。 At that time, the target microorganisms are trapped in trapping holes 12a. なお、微生物捕捉部12以降の流体排出口14側のフロー流路11は塞いでも構わない。 Incidentally, the flow channel 11 of the fluid outlet 14 side after the microorganism trapping section 12 may be closed.

図2においては、クリプトスポリジウムを選択的に捕捉することを目的に作製されたマイクロチップ20の微生物捕捉部12、および微生物捕捉孔12aの形状を一例として示す。 2 shows microorganism trapping section 12 of the microchip 20 made for the purpose of selectively capturing Cryptosporidium, and the shape of the microorganism capturing hole 12a as an example. 微生物捕捉孔12aは微生物捕捉部12のパターン化された位置に加工されている。 Microorganism trapping holes 12a is processed into a patterned position of microorganism trapping section 12.

クリプトスポリジウムは直径約5μmの球形状微生物であり、これを捕捉するために微生物捕捉孔12aの入口開口部の孔径は直径10〜30μmとなっている。 Cryptosporidium is a spherical microorganism with a diameter of about 5 [mu] m, pore size of the inlet opening of the microorganism trapping holes 12a to capture this has a diameter 10 to 30 [mu] m. 微生物捕捉孔12aの孔径は試料水と接する部分の入口開口部から深さ方向に行くに従って小さくなり、最小直径は1μmとなっている。 Diameter of microorganisms trapping holes 12a becomes smaller toward the depth direction from the inlet opening of the portion in contact with the sample water, the smallest diameter has a 1 [mu] m. これ以上の深さ方向においては微生物捕捉孔12aの孔径は1μmとなっており、貫通孔として加工されている。 Diameter of microorganisms trapping holes 12a in more depth direction has a 1 [mu] m, it is processed as a through hole. 微生物捕捉孔12aの深さ方向の長さについて、入口開口部から最小直径の位置まで10μmとなっている。 The length in the depth direction of the microorganisms trapping holes 12a, has a 10μm from the inlet opening to the position of the minimum diameter. クリプトスポリジウムの大きさは直径約5μmであることから、微生物捕捉孔12aの入口開口部から最小径の位置まで深さは5μm以上必要であり、10μm以上が望ましい。 Since the size of Cryptosporidium is about 5 [mu] m in diameter, located to a depth of minimum diameter from the inlet opening of the microorganism trapping holes 12a is required than 5 [mu] m, 10 [mu] m or more. それより深い位置の出口開口部までの深さは10μmとなっているが、特に限定されない。 Although the depth to the outlet opening of deeper than the position has become 10 [mu] m, it is not particularly limited.

微生物捕捉孔12aはそれぞれ30μm間隔で配置され、微生物捕捉部12の材質はSUS基板からなっている。 Microorganism trapping holes 12a are arranged at 30μm intervals each, the material of the microorganism trapping section 12 is made of SUS substrate. また、微生物捕捉孔12aの入口開口部および出口開口部の形状について、図2では円形を設定したが、形状は特に問わず、多角形としてもよい。 Further, the shape of the inlet and outlet openings of the microorganism trapping holes 12a, but with a circle in FIG. 2, the shape is not particularly limited, it may be a polygon. 最小直径の部分の形状も特に問わないが、最小直径は1μmとなるように形成されている。 Shape of the portion of the smallest diameter also not particularly limited, but the smallest diameter is formed to be 1 [mu] m.

また、図2においては、微生物捕捉孔12aのうち最小直径の部分より出口開口部に向う深い位置の貫通孔部において、最小径と同一径で加工しているが、特に限定する必要はなく、例えば、最小直径の部分から出口開口部まで径を広げても構わない。 Further, in FIG. 2, in the through hole of the deeper toward the outlet opening than the portion of the smallest diameter of the microorganism trapping holes 12a, but are processed in the minimum diameter and the same diameter, not critical and for example, it may be spread diameter from the portion of the smallest diameter to the outlet opening.

次にこのような構成からなる本実施の形態の作用について説明する。 Next a description of the operation of the embodiment having such a configuration. 試料水は試料水供給ライン16を通じて、試料水供給バルブ17を介して、試料水リザーバタンク18に導入される。 Water samples through the sample water supply line 16, through the sample water supply valve 17, is introduced into the sample water reservoir tank 18. 所定量の試料水を試料水リザーバタンク18に導入した後、試料水供給バルブ17を閉じ、試料水供給ポンプ19により試料水リザーバタンク18からマイクロチップ20のフロー流路11に試料水を供給する。 After a predetermined amount of sample water is introduced into the sample water reservoir tank 18, to close the sample water supply valve 17 to supply the water sample by sample water supply pump 19 from the sample water reservoir tank 18 to the flow channel 11 of the microchip 20 .

試料水はマイクロチップ20のフロー流路11から微生物捕捉部12に導入され、微生物捕捉部12に導入された試料水は流体吸引装置21により微生物捕捉孔12aを通じて吸引される。 Sample water is introduced into a microorganism trapping section 12 from the flow channel 11 of the microchip 20, the sample water introduced into a microorganism trapping section 12 is aspirated through the microorganism trapping hole 12a by the fluid suction apparatus 21. このとき試料水に含まれていた対象微生物は微生物捕捉孔12aに捕捉され、微生物捕捉孔12aの最小直径部の径より小さい微生物や物質はこの微生物捕捉孔12aを通過して、吸引、排出される。 Target microorganisms at this time was included in the sample water is trapped in the microorganism trapping holes 12a, small microorganisms and substances than the diameter of the smallest diameter portion of the microbial capturing hole 12a passes through the microorganism trapping holes 12a, suction is discharged that. この過程において、対象微生物を含む粒子状物質は微生物捕捉孔に捕捉される。 In this process, particulate matter including the target microorganism is captured microorganisms trapping holes.

この場合、実際に対象微生物が捕捉されているかどうかをマイクロチップ20上で確認することも可能である。 In this case, it is possible to confirm actually whether a subject microorganism is captured on a microchip 20. すなわち対象微生物を含む粒子状物質はマイクロチップ20のパターン化された位置に捕捉されることになり、例えば、マイクロチップ20の平板基板10が透明材質からなる場合、顕微鏡による観察も実施可能であり、特定位置のみの観察が可能となる。 That particulate matter containing target microorganisms would be trapped in the patterned position of the microchip 20, for example, when the flat-plate substrate 10 of the microchip 20 is made of a transparent material, it is also feasible microscopic observation , it is possible to observe a specific position only.

さらに、対象微生物を検出もしくは生物の種類を特定する場合、抗原・抗体の結合反応や、DNAのハイブリダイゼーション反応を利用した生物的な情報に基づく検出法をマイクロチップ20上で実施することも可能である。 Furthermore, when identifying the type of detection or biological target microorganisms, it is also possible to carry out coupling reaction or antigen-antibody, a detection method based on biological information using hybridization reaction DNA on microchips 20 it is. 例えば、対象微生物を抗原として認識する抗体に蛍光もしくは発光色素で標識した標識抗体や、対象生物に含まれるDNAもしくはRNAと特異的に結合するDNAプローブに蛍光もしくは発光色素で標識した標識DNAプローブを供給する手段を設け、この供給手段がマイクロチップ20に標識抗体、標識DNAプローブをマイクロチップ捕捉部に供給してもよい。 For example, labeled antibodies labeled with a fluorescent or luminescent dye antibodies recognizing target microorganisms as an antigen, to DNA or RNA contained in the target organism which specifically binds to the DNA probe with a fluorescent or luminescent dye labeled labeled DNA probe the means for supplying provided, labeled antibody the supply means to the microchip 20 may be supplied with labeled DNA probes microchip capture portion. その結果、対象微生物を選択的に染色でき、それらを蛍光顕微鏡を用いて観察することが可能となる。 As a result, selectively staining target microorganism them it is possible to observe using a fluorescent microscope.

第1−2の実施の形態 1-2 embodiment of the
次に、図4により本発明の第1−2の実施の形態について説明する。 The following describes a 1-2 embodiment of the present invention by FIG. 図4に示す第1−2の実施の形態において、図1乃至図3に示す第1−1の実施の形態と同一部分には同一符号を符して詳細な説明は省略する。 In the 1-2 embodiment of shown in FIG. 4, a detailed description with marks by the same reference numerals in the 1-1 embodiment, the same parts of the embodiment of shown in FIGS. 1 to 3 will be omitted. 図4に、マイクロチップに試料水の循環機構を取り入れる場合の構成例を示す。 4 shows a configuration example of a case incorporating the circulation mechanism of the sample water to the microchip.

図4に示すように、流体排出口14の出口側に試料水循環バルブ23が取付けられた循環ライン23aが接続され、循環ライン23aは試料水リザーバタンク18に連通している。 As shown in FIG. 4, the circulation line 23a of the sample water circulation valve 23 on the outlet side of the fluid outlet 14 is attached is connected, the circulation line 23a is communicated with the sample water reservoir tank 18. なお、これら循環ライン23aと試料水循環バルブ23とによって循環手段が構成されている。 Incidentally, the circulating means is constituted by these circulation line 23a and the sample water circulation valve 23. 試料水は試料水供給ライン16を通じて、試料水供給バルブ17を介して、試料水リザーバタンク18に導入される。 Water samples through the sample water supply line 16, through the sample water supply valve 17, is introduced into the sample water reservoir tank 18.

所定量の試料水を試料水リザーバタンク18に導入した後、試料水供給バルブ17を閉じ、試料水供給ポンプ19により試料水リザーバタンク18からマイクロチップ20に試料水を供給する。 After a predetermined amount of sample water is introduced into the sample water reservoir tank 18, to close the sample water supply valve 17 to supply the water sample to the microchip 20 from the sample water reservoir tank 18 by the sample water supply pump 19. マイクロチップ20の微生物捕捉部12に導入された試料水は、流体吸引装置21により微生物捕捉孔12aを通じて吸引される。 Sample water introduced into a microorganism trapping section 12 of the microchip 20 is sucked through the microorganism trapping hole 12a by the fluid suction apparatus 21. 試料水に含まれていた対象微生物は微生物捕捉孔12aに捕捉される。 Target microorganisms contained in the sample water is captured microorganisms trapping holes 12a. 微生物捕捉孔12aの最小直径部の径より小さい微生物や物質はこの微生物捕捉孔12aを通過して、吸引されて排出される。 Small microorganisms and substances than the diameter of the smallest diameter portion of the microbial capturing hole 12a passes through the microorganism trapping holes 12a, and is discharged is aspirated. 微生物捕捉孔12a側で吸引されずに、微生物捕捉部12を通過した試料水は、流体排水口14より排出される。 Without being sucked by the microorganism trapping holes 12a side, the sample water having passed through the microorganism trapping section 12 is discharged from the fluid discharge port 14.

図4に示すように、この排出液は再度試料水リザーバタンク18に戻され、再びマイクロチップ20へ供給される。 As shown in FIG. 4, the effluent is returned to the water sample reservoir tank 18 again, and again supplied to the microchip 20. この循環工程においては、試料水循環バルブ23を開、試料水排出バルブ22は閉の状態にしておく。 In the circulation step, the sample water circulation valve 23 opened, the sample water discharge valve 22 is kept in the closed state. 所定の時間循環を繰り返した後、試料水循環バルブ23および試料水排出バルブ22を閉じ、試料水全てを吸引装置21により微生物捕捉孔12aを通じて吸引する。 After repeating a predetermined time circulation, close the water sample circulation valve 23 and the sample water discharge valve 22 is aspirated through the microorganism trapping holes 12a all sample water by the suction device 21. または、所定の時間循環を繰り返した後、試料水循環バルブ22を閉じ、試料水排出バルブ22を開き、残液を排出する。 Or, after repeating a predetermined time circulation, close the water sample circulation valve 22, open the sample water discharge valve 22 to discharge the residual liquid. この循環過程において微生物を含む粒子状物質は複数回マイクロチップの微生物捕捉部12を通過することになり、捕捉効率が向上する。 Particulate matter including microorganisms in the circulation process will pass through multiple microchips microorganism trapping section 12 of the capture efficiency is improved.

第1−3の実施の形態 1-3 embodiment of the present invention
次に、図5により本発明の第1−3の実施の形態について説明する。 The following describes a 1-3 embodiment of the present invention by FIG. 図5に示す第1−3の実施の形態は、微生物捕捉部12の構成が異なるのみであり、他は図1乃至図3に示す第1−1の実施の形態と略同一である。 1-3 embodiment shown in FIG. 5, structure of microbial trapping section 12 is only different from the other is substantially the same as the 1-1 embodiment shown in FIGS. 図5に示す第1−3の実施の形態において、図1乃至図3に示す第1−1の実施の形態と同一部分には同一符号を符して詳細な説明は省略する。 In the 1-3 embodiment of shown in FIG. 5, a detailed description with marks by the same reference numerals in the 1-1 embodiment, the same parts of the embodiment of shown in FIGS. 1 to 3 will be omitted.

図5は微生物捕捉孔の概念図を示す。 Figure 5 shows a conceptual diagram of a microorganism trapping holes. マイクロチップ20に設けられた微生物捕捉部12の微生物捕捉孔12aの孔内入口部に対象微生物の抗原を特異的に認識する微生物捕捉用抗体24が固定化されている。 Specifically recognizing microbial capture antibody 24 antigen of interest microorganisms hole inlet portion of the microorganism trapping holes 12a of the microorganism trapping section 12 provided in the microchip 20 is immobilized. マイクロチップ20内では、流体吸引装置21により対象微生物を含有する試料水が微生物捕捉部12の微生物捕捉孔12aを介して吸引される。 Microchip Within 20, the sample water containing the target microorganism by the fluid suction apparatus 21 is sucked through the microorganism trapping holes 12a of the microorganism trapping section 12. その際、対象微生物25は特異的に微生物捕捉孔12aの入口開口部に固定化された微生物捕捉用抗体24に捕捉される。 At that time, the subject microorganism 25 is captured specifically microorganism capture antibody 24 immobilized on the inlet opening of the microorganism trapping holes 12a.

一般に生物に対する選択性を向上させるために抗体を利用することは、最も効果的な手法である。 Generally to utilize antibodies in order to improve the selectivity to the organism is the most effective method. 微生物捕捉孔12aの入口開口部に抗体を固定化しておくことにより、微生物捕捉孔に到達した対象微生物を強固に捕捉・保持することが可能となる。 By fixing the antibody to the inlet opening of the microorganism trapping holes 12a, it is possible to firmly capture and retain the target microorganisms that reaches the microorganism trapping holes. 例えば、対象微生物をクリプトスポリジウムとした場合、シリコン基板上への抗クリプトスポリジウム抗体の固定化については、下記の例に示す手法にて実現可能である。 For example, when the target microorganism and Cryptosporidium, for immobilization of anti-cryptosporidium antibodies on a silicon substrate, can be realized by the method shown in the example below.

まず微生物捕捉孔を作製したシリコン基板の微生物捕捉部に10%KOH−エタノール溶液を滴下し30分間放置・洗浄した後、アルゴンガスで乾燥、2%−MEPTES(3−mercaptopropyl triethoxysilane)トルエン溶液に60分間浸漬する。 First After standing, washed 10% KOH-ethanol solution was added dropwise to 30 minutes microorganism trapping section of a silicon substrate to produce a microorganism trapping holes, dried with argon gas, the 2% -MEPTES (3-mercaptopropyl triethoxysilane) toluene 60 minutes immersion. 洗浄・アルゴンガスで乾燥後、1mM−GMBS(N−(γ−maleimidobutyryloxy)succinimide ester)エタノール溶液に30分間浸漬する。 After drying for cleaning, argon gas, dipped 1mM-GMBS (N- (γ-maleimidobutyryloxy) succinimide ester) ethanol solution for 30 minutes.

洗浄後、0.5mg/ml−Strptavidinを滴下し、一晩インキュベートする。 After washing, it was added dropwise to 0.5mg / ml-Strptavidin, incubated overnight. Blocking buffer(1%−BSA,0.01%−NaN3)に20分間以上浸漬後、Deposition buffer(10mM−PBS+10mM−NaCl+10mM−Sucrose,0.1%BSA)中に混合したBiotin標識抗クリプトスポリジウム抗体を捕捉孔部にスポッティングすることにより、捕捉孔内部に抗クリプトスポリジウム抗体を導入する。 Blocking buffer (1% -BSA, 0.01% -NaN3) After immersion for more than 20 minutes, Deposition buffer (10mM-PBS + 10mM-NaCl + 10mM-Sucrose, 0.1% BSA) and Biotin-labeled anti-Cryptosporidium antibodies mixed into by spotting the capture hole, introducing anti Cryptosporidium antibodies within the capturing hole.

抗体と生物との結合は強固であるため、抗体の固定部位は可能な限り微生物捕捉孔12a内に限定することが望ましい。 Since binding of the antibody to the organism is strong, fixed site of the antibody is preferably limited to microorganisms trapped hole 12a as possible. しかし、微生物捕捉孔12a外部に抗体が固定されている場合でも、微生物捕捉孔12a外部と微生物捕捉孔12a内部とでは脱離に必要とするエネルギーが異なることから、適切な洗浄条件を設定すれば、微生物捕捉孔12a内部に優先的に対象微生物を捕集することが可能となる。 However, even if the antibody to the microorganism trapping holes 12a outside is fixed, the internal microorganism trapping holes 12a outside microorganism capturing hole 12a since the energy required to detachment is different, by setting the appropriate wash conditions , it is possible to collect preferentially target microorganism within the microorganism trapping holes 12a.

第1−4の実施の形態 1-4 embodiment of the present invention
次に、図6および図7により本発明の第1−4の実施の形態について説明する。 The following describes a 1-4 embodiment of the present invention by FIGS. 図6および図7に示す第1−4の実施の形態において、図1乃至図3に示す第1−1の実施の形態と同一部分には同一符号を符して詳細な説明は省略する。 In the 1-4 embodiment of shown in Figures 6 and 7, detailed description and marks the same reference numerals in the 1-1 embodiment, the same parts of the embodiment of shown in FIGS. 1 to 3 will be omitted. 図6は磁性物質標識反応部と、磁気印加手段を備えた微生物分離装置の装置構成例を示し、図7(a)(b)は微生物捕捉孔の概念図を示す。 Figure 6 shows a magnetic substance labeling reaction unit, a device configuration example of a microorganism separating apparatus provided with a magnetic applying means, FIG. 7 (a) (b) is a conceptual diagram of microorganisms trapping holes.

図6および図7に示すように、マイクロチップ20の前段に試料水リザーバタンク兼磁性物質標識反応槽26が設置され、またマイクロチップ20の後段に試料水循環バルブ23を有する循環ライン23aが接続され、この循環ライン23aは試料水リザーバタンク兼磁性物質標識反応槽26に接続されている。 As shown in FIGS. 6 and 7, the water sample reservoir tank and the magnetic substance-labeled reaction vessel 26 is installed in front of the microchip 20 and the circulation line 23a having a sample water circulation valve 23 is connected downstream of the microchip 20 the circulation line 23a is connected to the sample water reservoir tank and the magnetic substance-labeled reaction vessel 26.

図6および図7において、試料水は試料水供給ライン16を通じて、試料水供給バルブ17を介して、試料水リザーバタンク兼磁性物質標識反応槽26に導入される。 6 and 7, the sample water through the sample water supply line 16, through the sample water supply valve 17, is introduced into the sample water reservoir tank and the magnetic substance-labeled reaction vessel 26. 試料水リザーバタンク兼磁性物質標識反応槽26に試料水が所定量導入されると、試料水供給バルブ17が閉じられる。 When the sample water sample water reservoir tank and a magnetic substance labeling reaction tank 26 is introduced a predetermined amount, the sample water supply valve 17 is closed. 他方、対象微生物の抗原と特異的に反応する磁性物質を標識した抗体が、磁性物質標識抗体保存容器27から磁性物質標識抗体供給ライン28および磁性物質標識抗体供給バルブ29を介して、磁性物質標識抗体供給ポンプ30により試料水リザーバタンク兼磁性物質標識反応槽26に一定量導入される。 On the other hand, the antibody labeled magnetic substances to antigen react specifically target microorganisms, via the magnetic substance-labeled antibody feed line 28 and the magnetic substance-labeled antibody supply valve 29 of a magnetic substance-labeled antibody storage container 27, the magnetic substance-labeled introduced a certain amount of sample water reservoir tank and the magnetic substance-labeled reaction vessel 26 by antibodies feed pump 30.

試料水リザーバタンク兼磁性物質標識反応槽26内では、磁性物質標識抗体が所定の条件下で所定の時間インキュベートされて、対象微生物と磁性物質標識抗体とが反応する。 The sample water reservoir tank and a magnetic substance labeling reaction tank 26, the magnetic substance-labeled antibody is incubated predetermined time under a predetermined condition, the target microorganism and the magnetic substance-labeled antibody reacts.

その後、試料水供給ポンプ19によりマイクロチップ20側に磁性物質標識抗体と反応した対象微生物を含有する試料水を供給する。 Thereafter, it supplies the sample water containing target microorganisms which have reacted with the magnetic substance-labeled antibody to the microchip 20 side by the sample water supply pump 19. マイクロチップ20の微生物捕捉部12に導入された試料水は流体吸引装置21により微生物捕捉孔12aを通じて吸引される。 Sample water introduced into a microorganism trapping section 12 of the microchip 20 is sucked through the microorganism trapping hole 12a by the fluid suction apparatus 21.

試料水を吸引する際、磁気印加装置31により微生物捕捉孔12aの内表面に設けられた磁気材料33に対して磁気を印加することで、試料水に含まれている、磁性物質標識抗体32と反応した対象微生物25が微生物捕捉孔12a内に捕捉される(図7(a))。 When sucking the water sample, by applying the magnetic to the magnetic material 33 provided on the inner surface of the microorganism trapping holes 12a by the magnetic applying device 31, are included in the water sample, the magnetic substance-labeled antibody 32 the reaction was subject microorganism 25 is captured in the microorganism trapping holes 12a (FIG. 7 (a)).

微生物捕捉孔12aの最小直径部の径より小さい微生物や物質は、この微生物捕捉孔12aを通過して、吸引、排出される。 Small microorganisms and substances than the diameter of the smallest diameter portion of the microorganism trapping holes 12a passes through the microorganism trapping holes 12a, suction, are discharged.

また、磁気印加装置31により微生物捕捉孔12aの内表面の磁気材料33に磁気を印加するのではなく、予め、標識用磁性物質と引力関係を有する磁性材料34を微生物捕捉孔12aの内側表面に設けておいてもよい(図7(b))。 Also, instead of applying the magnetic to the magnetic material 33 of the inner surface of the microorganism trapping holes 12a by the magnetic applying device 31, in advance, the magnetic material 34 having a label magnetic substance and attraction relationship to the inner surface of the microorganism trapping holes 12a may be previously provided (FIG. 7 (b)). 図7(a)(b)に示すように試料水を吸引する際、特異的に磁気標識された対象微生物は、微生物捕捉孔12aの内側表面に設置した磁気材料33もしくは磁性材料34に吸着され、微生物捕捉孔12aの入口開口部に対象微生物が捕捉・回収される。 When sucking the water sample as shown in FIG. 7 (a) (b), specifically magnetically labeled target microorganism is adsorbed to the magnetic material 33 or the magnetic material 34 was placed on the inner surface of the microorganism trapping holes 12a target microorganisms are trapped and recovered to the inlet opening of the microorganism trapping holes 12a.

第1−5の実施の形態 The 1-5 embodiment of the present invention
次に、図8により本発明の第1−5の実施の形態について説明する。 The following describes a 1-5 embodiment of the present invention by FIG. 図8に示す第1−5の実施の形態において、図1乃至図3に示す第1−1の実施の形態と同一部分には同一符号を符して詳細な説明は省略する。 In the 1-5 embodiment of shown in FIG 8, a detailed description with marks by the same reference numerals in the 1-1 embodiment, the same parts of the embodiment of shown in FIGS. 1 to 3 will be omitted. ここで図8は洗浄機構を備えた場合の微生物分離装置の構成例を示す。 Here, FIG. 8 shows a configuration example of a microorganism separation device when equipped with a cleaning mechanism.

図8において、マイクロチップ20の後段に試料水循環バルブ23を有する循環ライン23aが接続され、この循環ライン23aは試料水リザーバタンク18に接続されている。 8, the circulation line 23a having a sample water circulation valve 23 is connected downstream of the microchip 20, the circulation line 23a is connected to the sample water reservoir tank 18. また試料水供給ポンプ19の前段には、洗浄液供給ラインバルブ36を介して洗浄液保存容器35が接続されている。 Also in the front of the sample water supply pump 19, the washing liquid storage vessel 35 via the cleaning liquid supply line valve 36 is connected. 図8において、マイクロチップ20により対象微生物を分離した後、洗浄液保存容器35より、試料水供給ポンプ19により洗浄液がマイクロチップ20側に供給される。 8, after separation of the target microorganisms by microchip 20, from the washing liquid storage vessel 35, cleaning liquid is supplied to the microchip 20 side by the sample water supply pump 19. 洗浄液は次に微生物捕捉部12に導入され、微生物捕捉孔12aを洗浄し、排出される。 The cleaning liquid is then introduced into a microorganism trapping section 12, washed microbial trapping holes 12a, and is discharged.

洗浄液としては界面活性剤、アルコール、有機溶剤、酸、アルカリ等が使用される。 The washing liquid detergent, alcohols, organic solvents, acids, alkali, or the like. ただし、洗浄液によりマイクロチップ20及び対象微生物がダメージを受けないものを選定することが必要である。 However, it is necessary to select those microchip 20 and the target microorganism is not damaged by the cleaning liquid. 例えば、界面活性剤を洗浄液として適用した場合、界面活性剤の効果としては、マイクロチップ20の表面と粒子との界面に洗浄液が浸透し、マイクロチップ20の表面と粒子との距離を離すことにより、表面から粒子が引き離されるのに必要なポテンシャルエネルギーが低減する。 For example, the case of applying the surfactant as a cleaning liquid, as the effect of the surfactant, the cleaning liquid penetrates into the interface between the surface and the particles of the microchip 20, by increasing the distance between the surface and the particles of the microchip 20 , potential energy required for the particles is pulled away from the surface is reduced. その結果、対象微生物は微生物捕捉孔12aの内面との相互作用が大きいのに対し、それ以外の粒子の相互作用は小さいことから脱離しやすくなり、対象微生物のみが微生物捕捉孔12aに捕捉されることになり、このため微生物の捕捉回収効率が向上する。 As a result, while the target microorganism large interaction with the inner surface of the microorganism trapping holes 12a, interaction of the other particles easily detached from smaller, only the target microbe is captured microorganisms trapping holes 12a It will be, and therefore improves the capture efficiency of recovering microorganisms.

また、このとき、微生物捕捉孔12aからの対象微生物以外の粒子状物質のマイクロチップ20からの脱離を促進するために、マイクロチップ20に物理的印加手段37が設けられている。 At this time, in order to facilitate desorption from the microchip 20 of particulate matter other than the target microorganisms from the microorganism trapping holes 12a, physically applying means 37 is provided in the microchip 20. 例えば、物理的印加手段37は、超音波や機械的振動、電気的振動、熱供給などのエネルギーをマイクロチップ20に対して印加するものである。 For example, the physical application means 37 is used to apply ultrasonic and mechanical vibration, electrical vibration energy such as heat supplied to the microchip 20.

物理的印加手段37をマイクロチップ20に設置し、振動による機械的エネルギーを粒子状物質に与えることにより、マイクロチップ20から脱離に必要なエネルギーを供給することができる。 Physical application means 37 installed in the microchip 20, by applying mechanical energy by vibrating the particulate matter, it is possible to supply the energy required from the microchip 20 to desorption. 同様に、物理的印加手段37から加熱エネルギーをマイクロチップ20に供給することによっても、脱離を促進することが可能となる。 Similarly, by supplying heat energy to the microchip 20 from the physical application means 37, it is possible to promote desorption.

ただし、過剰の振動・過熱によって対象微生物も脱離してしまう可能性もある。 However, there is also a possibility that the target microorganisms eliminated by excess vibration and overheating. これを防止し、かつ他の粒子状物質を効果的に除去するために、最適な洗浄条件を設定する必要がある。 To prevent this, and in order to effectively remove other particulate matter, it is necessary to set the optimum washing conditions. なお、上記の洗浄液による洗浄作用、及び物理的印加手段37によるエネルギーの印加作用はそれぞれ単独で使用しても良いし、組み合わせて使用することも効果的である。 Incidentally, the cleaning operation of the above washing solution, and to respectively apply the action of energy by physically applying means 37 may be used alone, it is also effective to use in combination.

第1−6の実施の形態 The 1-6 embodiment
次に、図9により本発明の第1−6の実施の形態について説明する。 The following describes a 1-6 embodiment of the present invention by FIG. 図9に示す第1−6の実施の形態において、図1乃至図3に示す第1−1の実施の形態と同一部分には同一符号を符して詳細な説明は省略する。 In the 1-6 embodiment of shown in FIG. 9, a detailed description with marks by the same reference numerals in the 1-1 embodiment, the same parts of the embodiment of shown in FIGS. 1 to 3 will be omitted. ここで図9は分画処理機構を備えた微生物分離装置の構成例を示す。 Here, FIG. 9 shows a configuration example of a microorganism separating apparatus having a fractionation treatment mechanism.

図9において、マイクロチップ20の後段に試料水循環ポンプ23を有する循環ライン23aが接続され、この循環ライン23aは試料水リザーバタンク18に接続されている。 9, the circulation line 23a having a sample water circulation pump 23 is connected to the subsequent stage of the microchip 20, the circulation line 23a is connected to the sample water reservoir tank 18. また試料水リザーバタンク18の前段に分画処理手段38が設置されている。 The fractionation unit 38 is installed in front of the sample water reservoir tank 18. マイクロチップ20に導入する試料水に対して、物質の大きさを利用した分画処理がマイクロチップ20に導入される前段階として分画処理手段38により実施される。 The sample water to be introduced into the microchip 20 is carried out by fractionation processing means 38 as a preliminary step fractionation process using the size of the material is introduced into the microchip 20. 例えば、クリプトスポリジウムを対象微生物とする場合、クリプトスポリジウムは直径約5μmであることから、例えば10μm以上の孔径を持つものを除去する分画処理手段38が、試料水リザーバタンク18の前段に設置されている。 For example, when targeting a microorganism Cryptosporidium, Cryptosporidium fractionation unit 38 for removing those with because it is approximately 5μm in diameter, e.g., 10μm or more pore size, is placed in front of the sample water reservoir tank 18 ing.

これにより、対象微生物より大きい10μm以上の径を有する夾雑物等を除去することができ、不純物の割合を低減することが可能となる。 Thus, it is possible to remove contaminants or the like having a size of at least target microorganism greater than 10 [mu] m, it becomes possible to reduce the proportion of impurities. この場合、分画処理手段38の種類としては、中空糸膜フィルタ、メンブレンフィルタ、セラミックフィルタ、プランクトンネットなどが挙げられるが、特にその種類は問わない。 In this case, as the types of fractionation means 38, the hollow fiber membrane filter, membrane filter, a ceramic filter, but plankton net and the like, not limited in particular its kind.

また、例えば、上記とは逆に、直径1μm以下ものを除去する分画処理手段38を、試料水リザーバタンク18の前段に設置してもよい。 Further, for example, contrary to the above, the fractionation process means 38 for removing those less in diameter 1 [mu] m, it may be installed in front of the sample water reservoir tank 18. 微生物捕捉孔12aの最小直径を1μmとした場合、試料水中の1μm以下の粒子は予め除去されているので、微生物捕捉孔12aの閉塞などの問題が軽減される。 If the minimum diameter of the microorganisms trapped holes 12a and 1 [mu] m, since smaller particles 1 [mu] m of sample water is previously removed, problems such as clogging of the microorganism trapping holes 12a is reduced. この場合、分画処理手段38の種類も、特に限定されない。 In this case, the type of fractionation unit 38 is also not particularly limited.

第1−7の実施の形態 1-7 embodiment of the present invention
次に、図10および図11により本発明の第1−7の実施の形態について説明する。 The following describes a 1-7 embodiment of the present invention with reference to FIG. 10 and FIG. 11. 図10および図11に示す第1−7の実施の形態は、マイクロチップ20の下面(流体吸引口側の面)にメンブレンフィルタ39を設けた点が異なるのみであり、他は図1乃至図3に示す第1−1の実施の形態と略同一である。 1-7 embodiment shown in FIGS. 10 and 11 are points where the membrane filter 39 is provided on the lower surface of the microchip 20 (the surface of the fluid suction port side) differ only, others are 1 through FIG. 1-1 embodiment shown in 3 and is substantially the same. 図10および図11において、図1乃至図3に示す第1−1の実施の形態と同一部分には同一符号を符して詳細な説明は省略する。 10 and 11, detailed description and marks the same reference numerals in the 1-1 embodiment, the same parts of the embodiment of shown in FIGS. 1 to 3 will be omitted.

図10にマイクロチップとメンブレンフィルタとを組み合せた構造概念図を、図11にマイクロチップの構造概念図を示す。 The structure schematic diagram combining the microchip and the membrane filter 10 is a schematic diagram of a configuration microchip Figure 11. 微生物捕捉部12と、平板基板10とを有するマイクロチップ20の下面に、メンブレンフィルタ39が設置されている。 Microorganisms acquisition unit 12, the lower surface of the microchip 20 having a flat substrate 10, the membrane filter 39 is provided. マイクロチップ20の微生物捕捉部12に導入された試料水は、微生物捕捉孔12aの内部に入り込み、メンブレンフィルタ39を介してメンブレンフィルタ39のマイクロチップ20と反対側の面に設けられた流体吸引装置21(図3参照)により吸引される。 Microorganism trapping section 12 sample water introduced into the microchip 20, enters the interior of the microorganism trapping holes 12a, the fluid suction device provided on the surface opposite to the microchip 20 of the membrane filter 39 through the membrane filter 39 is sucked by 21 (see FIG. 3). この際、対象微生物はメンブレンフィルタ39上に捕捉・固定される。 In this case, the target microorganisms are trapped and fixed on the membrane filter 39.

メンブレンフィルタ39の孔径については、対象微生物によるが、クリプトスポリジウムを対象微生物とした場合、1μm程度が望ましい。 The pore size of the membrane filter 39, depending on the target microorganism, if you Cryptosporidium target microorganism is preferably about 1 [mu] m. メンブレンフィルタ39の材質に関しては特に限定されないが、マイクロチップ20との密着が良好であることが必要である。 It not specifically defined, the material of the membrane filter 39, but it is necessary that the adhesion of the microchip 20 is good. マイクロチップ20は微生物捕捉孔12aの開口部の形状は特に問わず、円形でも多角形でもよい。 Microchip 20 is the shape of the opening of the microorganism trapping holes 12a is not particularly limited, and may be polygonal in shape. 微生物捕捉孔12aの深さ方向の形状に関しても特に限定されることはなく、例えば円柱状でもよい。 Is not particularly limited with respect to the depth direction of the shape of the microorganism trapping holes 12a, it may be, for example, cylindrical. 微生物捕捉孔12aの開口部の寸法について、最小でも対象微生物の大きさより大きいことが必須であるが、最大値に関しては適度な寸法を設定する。 The size of the opening of the microorganism trapping holes 12a, but the minimum is essential greater than the size of the target microorganisms, the set an appropriate size with respect to the maximum value.

微生物捕捉孔12aの深さ寸法についても特に限定されない。 There is no particular limitation on the depth of the microorganism trapping holes 12a.

図10および図11において、メンブレンフィルタ39は固定プレート媒体として機能し、マイクロチップ20は分画機能、および微生物をメンブレンフィルタ39表面上の一定位置へ捕捉固定する機能をもつ。 10 and 11, the membrane filter 39 functions as a fixed plate medium, microchips 20 Fractionation function, and with the microorganism capture fixed functions into a fixed position on the membrane filter 39 surface. そのため、マイクロチップ20は繰返し使用することが可能である。 Therefore, the microchip 20 can be used repeatedly. また、メンブレンフィルタ39上に、例えば、対象微生物の抗原に特異的に反応する抗体を固定化しておけば、対象微生物を効率よく捕捉可能となる。 Further, on the membrane filter 39, for example, if by antibodies immobilized which specifically reacts with the antigen of interest microorganism, and the target microorganism can be efficiently captured.

第2−1の実施の形態 2-1 embodiment
以下、図面を参照して本発明の第2−1の実施の形態について説明する。 Hereinafter, it will be described with reference to the drawings 2-1 the embodiment of the present invention.

図12乃至図14は本発明による微生物分離装置の第2−1の実施の形態を示す図である。 12 to 14 are views showing the 2-1 embodiment of the microorganism separation device according to the present invention. ここで図12(a)は微生物分離装置の平面図、図12(b)は図12(a)のX−X′線断面図、図13(a)はマイクロチップの斜視図、図13(b)はその拡大図である。 Here, FIG. 12 (a) a plan view of the microorganism separation device, FIG. 12 (b) line X-X 'sectional view of FIG. 12 (a), the 13 (a) shows a perspective view of the microchip, Fig. 13 ( b) is an enlarged view thereof.

図12(a)(b)、図13(a)(b)および図14に示すように、微生物分離装置110は、特定の対象微生物を分離・回収するものであり、対象微生物より小さな孔径をもつ貫通孔111が形成された板状のマイクロチップ(金属板ともいう)101と、このマイクロチップ101の上面に配置された第1の支持体102a、102bと、マイクロチップ101の下面に配置された第2の支持体102cとを備えている。 Figure 12 (a) (b), as shown in FIG. 13 (a) (b) and 14, microorganism separation device 110 is for separating and recovering a specific target microorganism, a smaller pore size than the target microorganism and 101 through hole 111 is formed a plate-like microchip (also referred to as a metal plate) having a first support member 102a which is arranged on the upper surface of the microchip 101, and 102b, are disposed on the lower surface of the microchip 101 and and a second support 102c.

このうち第1の支持体102a、102bは、上部支持体102aと中間支持体102bとからなり、また第2の支持体102cは下部支持体102cからなっており、第1の支持体102a、102bおよび第2の支持体102cにより支持体102が構成される。 Among first support 102a, 102b is composed of a upper support 102a and the intermediate support 102b, and the second support 102c is made of lower support 102c, a first support member 102a, 102b and the support 102 is constituted by the second support member 102c.

このように第1の支持体102a、102bが上部支持体102aと中間支持体102bとからなる2層構造を有しているが、上部支持体102aと中間支持体102bを一体構造に形成してもよい。 Thus the first support member 102a, but 102b has a two-layer structure consisting of an upper support 102a and the intermediate support 102b, the upper support 102a and the intermediate support member 102b integrally formed structure it may be.

なお、マイクロチップ101は、第1の支持体102b(102a)と第2の支持体102c間に配置されているが、単に積層するのみでも、第1の支持体102a(102b)と第2の支持体102cとによりマイクロチップ101を圧着するなど種々の手段が採用できる。 Incidentally, the microchip 101, first support 102b and (102a) second are disposed between the support 102c, simply only laminated, the first support member 102a (102b) and the second various means such as crimping the microchip 101 by the support 102c may be employed.

また上部支持体102aには、その表面に沿って水平方向に延び、かつ上部支持体102aを貫通するフロー流路104aと、フロー流路104aに連通し、かつ外方に開口する供給口103とが形成されている。 Also the upper support 102a, extending horizontally along the surface thereof, and a flow passage 104a penetrating through the upper support 102a, communicates with the flow passage 104a, and a supply port 103 which opens outwardly There has been formed. さらに中間支持体102bには、中間支持体102bを貫通するフロー流路104bが形成されている。 More intermediate support 102b, flow passages 104b penetrating the intermediate support 102b is formed. このうち上部支持体102aのフロー流路104aと中間支持体102bのフロー流路104bとによって第1のフロー流路が構成される。 First flow passage by the flow passage 104b of the flow passage 104a and the intermediate support 102b of these upper support 102a is formed.

また下部支持体102cには、その表面に沿って水平方向に延び、かつ下部支持体102cを貫通するフロー流路104cが形成され、このフロー流路104cには外方へ開口する排出口105が連通している。 Also to the lower support member 102c extends in the horizontal direction along the surface thereof and the flow passage 104c passing through the lower support 102c is formed on the flow passage 104c is the outlet 105 which opens outwardly communicate with each other. このフロー流路104cは第2のフロー流路となる。 The flow passage 104c is the second flow passage.

中間支持体102bのフロー流路104bと、下部支持体102cのフロー流路104cは互いにマイクロチップ101の貫通孔(微生物捕捉孔ともいう)111を介して連通している。 A flow passage 104b of the intermediate support 102b, communicate with each other through the lower support flow passage 104c of 102c is (also referred to as a microorganism trapping holes) through-hole of the microchip 101 with each other 111. なお、図示を省略するが、第2の支持体(下部支持体)102cは、第1の支持体を上部支持体102aと中間支持体102bとからなる2層構造で形成したと同様に、2層構造で形成するようにしてもよい。 Although not shown, the second support member (lower support) 102c, in the same manner as a two-layer structure comprising a first support and an upper support 102a and the intermediate support 102b, 2 it may be formed in the layer structure. また、第2の支持体を2層構造で形成した場合、上層に排出口105を設けてもよい。 Further, when the second support is a two-layer structure may be provided an outlet 105 in the upper layer.

このように構成された本実施の形態において、微生物分離装置110に導入されたサンプル水は供給口103から導入され、フロー流路104a、104bを通り、金属板101に到達する。 In such embodiment, which is configured, the sample water introduced into a microorganism separation device 110 is introduced from the supply port 103, as the flow channel 104a, the 104b, to reach the metal plate 101. このとき、金属板101の貫通孔111の孔径より小さな物質、及び溶解成分はフロー流路104cを通って、排水口105から排出され、孔径より大きな物質が金属板101に捕捉される。 At this time, little material, and dissolved components than the diameter of the through hole 111 of the metal plate 101 through the flow passage 104c, it is discharged from the discharge port 105, greater substance than the hole diameter is trapped to the metal plate 101.

ここで、金属板101は、微生物の寸法より小さい貫通孔111を有している。 Here, the metal plate 101 has a size smaller than the through-hole 111 of the microorganisms. 一般的に細菌類や原虫類の大きさは1〜数μmであり、それ以下の寸法の貫通孔111を形成する。 Generally the size of the bacteria or protozoa is 1 to several [mu] m, to form the through hole 111 of less dimension. しかし、その様な微小孔を加工する場合、レーザー加工にしても、化学的・物理的なエッチング加工にしても、貫通孔111の加工寸法と比較して厚さが厚いと、孔径が大きくなってしまい、加工が不可能であった。 However, when processing such micropores, even if the laser processing, even in the chemical and physical etching, when the thicker compared to the processing size of the through hole 111, the hole diameter is increased and will, processing was impossible. 厚さを薄くすれば加工は可能であるが、プラスチック等では強度が弱くなり、サンプル水の吸引ろ過、及び加圧送液に耐えられない可能性がある。 Machining Thinner thickness is possible, the strength becomes weak in plastic or the like, suction filtration of the water sample, and may not withstand pressure pumping liquid. そこで、比較的薄くても強度が維持できる金属を使用することにより、微小な貫通孔111の実現と、吸引・加圧による実用的な処理速度の実現を両立可能となる。 Therefore, by using a metal that is relatively thin strength even maintenance, and realization of minute through-holes 111, thereby enabling both the realization of practical processing speed by the suction and pressure.

第1および第2の支持体102a、102b、102cは、薄い金属板101を上下からサポートし、吸引・加圧による送液が可能となる様にするためのものである。 First and second supports 102a, 102b, 102c supports a thin metal plate 101 from above and below, is for the as liquid feed by sucking and pressurizing becomes possible. 同時にサンプル水送液のための供給孔103、フロー流路104a、104b、104c、排水口105を設けることにより、金属板101上に微小流路を形成することができる。 At the same time supply hole 103 for sample water feed liquid flow passage 104a, 104b, 104c, by providing a drain outlet 105, it is possible to form a fine channel on the metal plate 101. このような構成とすることにより、一部の配管類が省略可能となり、部品点数の低減につながる。 With such a configuration, a portion of the piping becomes optional, leading to a reduction in the number of component parts. また流路を微小化することにより、対象微生物の流路への堆積の防止という効果も期待できる。 Further, by micronizing the flow path, the effect of preventing the deposition of the flow path of the target microorganism can be expected.

この貫通孔111の加工方法としては、レーザー加工を適用することが有効である。 As a processing method of the through hole 111, it is effective to apply the laser processing. 機械加工や物理的・化学的なエッチング方法では、貫通孔111を形成する場合には、概ね孔径数十μmのオーダーが加工精度の限界である。 The machining or physical and chemical etching methods, in the case of forming the through hole 111 is substantially pore diameter of several tens of μm order is the limit of the processing accuracy. 上述のように細菌、原虫等検査対象となる微生物の寸法はμmオーダーであり、数十μmの貫通孔111では透過してしまい、捕捉することが不可能である。 Bacteria as described above, the dimensions of the microorganism to be parasites such as inspection target is [mu] m order, dozens will be transmitted in the through hole 111 of [mu] m, it is impossible to capture.

レーザー加工においても、加工厚さが厚くなると、孔径が大きくなるという点は同様であるが、加工厚さを低減することにより、かなり小径の微生物捕捉用貫通孔111を作製することができる。 Also in the laser processing, the working thickness becomes thicker, but the point that the hole diameter increases is the same, by reducing the working thickness, can be considerably making small diameter microorganisms captured through hole 111. そこで、薄板の金属板101にレーザー加工を行うことにより、μmオーダーの貫通孔111を形成することが可能となり、細菌・原虫等の微生物を確実に貫通孔111により捕捉することができる。 Therefore, by performing laser processing on a metal plate 101 of the sheet, it is possible to form a through-hole 111 of μm order can be captured by reliably through-hole 111 of microorganisms such as bacteria, protozoa.

金属板101の材質としては、各種の金属が使用可能であるが、河川水等各種イオン成分を含んだ水が流れること、反応液や洗浄液として、酸、アルカリ、有機溶媒等の腐食性液体が流れる事などを考慮すると、ステンレス鋼を使用することが望ましい。 As material of the metal plate 101, various metals can be used, it may flow water containing river water and various ionic components, as a reaction solution or washing solution, acids, alkalis, corrosive liquids such as organic solvents When considering the fact that flow, it is desirable to use stainless steel.

第1および第2の支持体102a、102b、102cの材質としては、プラスチック、ガラス、シリコン、金属、セラミック等が適用可能である。 First and second supports 102a, 102b, as the material of 102c, plastic, glass, silicon, metals, ceramics and the like are applicable. このとき金属板101の貫通孔111に捕捉された対象微生物を検出するため、蛍光発光の観察等の光学的手法が用いられる。 To detect the target microorganisms trapped in the through-hole 111 at this time the metal plate 101, an optical method of observation or the like of the fluorescence emission is used. この場合、第1および第2の支持体102a、102b、102cを光を透過する材質から作製する必要がある。 In this case, it is necessary to produce a material in which the first and second supports 102a, 102b, 102c, transmits light. 特に上部支持体102aを透明体とすることにより、上部から励起光を照射し、貫通孔111に捕捉された対象微生物からの蛍光を検出することが可能となる。 In particular, by the upper support 102a and the transparent body, is irradiated with excitation light from the upper, it is possible to detect the fluorescence from the target microorganisms trapped in the through hole 111. 好適には、第1および第2の支持体102a、102b、102cには安価で透明性が高く、かつ接着も容易なアクリル樹脂から構成することが望ましい。 Preferably, the first and second supports 102a, 102b, inexpensive, highly transparent to 102c, and it is desirable to construct an adhesive easy acrylic resin.

次に金属板101の微生物捕捉用貫通孔111の形状について、図13および図14により詳述する。 Next, the shape of the microorganisms captured through holes 111 of the metal plate 101 will be described in detail by FIGS.

図13は、耐塩素性微生物クリプトスポリジウムを選択的に捕捉することを目的にデザインした金属板101の貫通孔111の形状の一例を示す。 Figure 13 shows an example of a shape of the through hole 111 of the metal plate 101 was designed for the purpose of selectively capturing the chlorine resistance microorganism Cryptosporidium.

貫通孔111は金属板101の、パターン化された位置に加工されている。 Through holes 111 of the metal plate 101, is processed into a patterned location. 貫通孔111を形成するとき、レーザー加工を利用する。 When forming the through holes 111, utilizing laser processing. この場合、加工領域の先端部にレーザーの焦点を絞って加工を施すため、微生物捕捉用貫通孔111の形状はテーパーを有し、レーザー照射面側の上部開口111aの孔径が大きくなる。 In this case, for performing the process by focusing the laser tip processing region, the shape of the microorganisms captured through hole 111 has a tapered, the hole diameter of the upper opening 111a of the laser irradiation surface side is increased. そのため、照射面と反対側の下部開口111bの寸法を、対象微生物の大きさより小さくすることにより微生物の捕捉が可能となる。 Therefore, the dimensions of the opposite side of the lower opening 111b and the irradiation surface, capture of microorganisms becomes possible by smaller than the size of the target microorganism.

クリプトスポリジウムは直径約5μmの球形状微生物であり、これを捕捉するためにサンプル水導入側の微生物捕捉用貫通孔111の上部開口111aの孔径を直径3〜5μmとした。 Cryptosporidium is a spherical microorganism with a diameter of about 5 [mu] m, the pore size of the upper opening 111a of the sample water inlet side of the microorganisms captured through hole 111 has a diameter 3~5μm to capture it. レーザー加工を施した際、この貫通孔111の孔径は試料水と接する部分の上部開口部111aから深さ方向に行くに従って小さくなる。 When subjected to laser processing, the diameter of the through hole 111 becomes smaller toward the depth direction from the upper opening 111a of the portion in contact with the sample water. 金属板101の厚さを5μmとした場合、レーザー照射面の反対側の下部開口111bの孔径は約2〜3μmとなり、クリプトスポリジウムの直径より小さいことから捕捉することが可能となる。 If the 5μm thickness of the metal plate 101, the diameter of the lower opening 111b on the opposite side of the laser irradiation surface is about 2~3μm next, it is possible to capture the smaller than the diameter of Cryptosporidium.

図14(a)(b)は実際に金属板101として、厚さ5μmのSUS304の薄板を用い、この金属板101にレーザー加工を施した場合の微生物捕捉状況を示したものである。 As Figure 14 (a) (b) is actually the metal plate 101, using SUS304 thin plate having a thickness of 5 [mu] m, there is shown a microorganism capturing situation when subjected to laser processing to the metal plate 101.

ここで図14(a)は、金属板101上に設けた微生物捕捉用貫通孔111の配置位置を示し、図14(b)は貫通孔111に捕捉されたクリプトスポリジウム模擬粒子の捕捉状況を示す図である。 Here, FIG. 14 (a), shows the location of the microorganisms captured through hole 111 provided on the metal plate 101, FIG. 14 (b) shows the capture condition of Cryptosporidium simulated particles trapped in the through-hole 111 it is a diagram.

貫通孔111の孔径を実測した結果、上部開口111aが3.1±0.6μm、下部開口111bが2.5±0.6μmであった。 Pore ​​size results of actual measurement of the through-hole 111, the upper opening 111a is 3.1 ± 0.6 .mu.m, the lower opening 111b was 2.5 ± 0.6 .mu.m.

実際にクリプトスポリジウム模擬粒子(クリプトレーサー1号:(財)水適技術研究センター)を使用して捕捉実験を行ったところ、クリプトが微生物捕捉用貫通孔111の部位に捕捉されていることが確認できた。 Indeed Cryptosporidium mimic particles (crypto racer No.1: Institute) Mizuteki Technology Center) was subjected to trapping experiments using, confirm that crypto is captured at the site of microbial capturing through hole 111 did it. また、下部開口111b側を減圧することにより、流速を向上させることが可能となり、圧力差40kPaでは約100μL/min、88kPaでは350μL/minとの実用的なろ過性能が得られた。 Moreover, by reducing the pressure of the lower opening 111b side, it is possible to improve the flow rate of about 100 [mu] L / min at a pressure difference 40 kPa, practical filtration performance of 88kPa at 350 [mu] L / min was obtained.

この場合、レーザー加工の制限から、微生物捕捉用貫通孔111にテーパー角がある程度存在するため、金属板101が厚くなると、上部開口111aの孔径が大きくなり、隣接する貫通孔111との間隔が広くなる。 In this case, the limitation of the laser processing, since the taper angle is present to some extent in the microorganisms captured through hole 111, the metal plate 101 is increased, the pore size of the upper opening 111a becomes larger, wider spacing between adjacent through-holes 111 Become. このため、一定面積内に多数の貫通孔111を配置するのが困難になるという問題点がある。 Therefore, there is a problem that it is difficult to place a large number of through-holes 111 in a certain area. そのため、金属板101の厚さは、できる限り薄いことが望ましい。 Therefore, the thickness of the metal plate 101, are desirably as thin as possible. しかし、ある程度の厚さがないと強度が不足する。 However, insufficient strength and there is no certain thickness.

今回の加工実績から計算すると、隣接する微生物捕捉用貫通孔111の間隔の上限を30μmに設定すると、金属板101の厚さは50μm以下にする必要がある。 When calculated from the current processing performance, by setting the upper limit of the interval between the adjacent microorganisms captured through hole 111 in 30 [mu] m, the thickness of the metal plate 101 should be 50μm or less. 以上のことから、金属板101の膜厚は、5〜50μm以下とすることが望ましい。 From the above, the thickness of the metal plate 101 is preferably set to 5~50μm less.

また、微生物捕捉用貫通孔111の開口部の形状について、図13では円形を設定したが、形状は特に問わず、多角形としてもよい。 Further, the shape of the opening of the microorganisms captured through hole 111, but with a circle in FIG. 13, the shape is not particularly limited, it may be a polygon. 最小直径の部分の形状も特に指定はなく、微生物の寸法より小さいことが重要である。 Shape of the portion of the smallest diameter is also not particularly specified, it is important that less than the size of the microorganisms.

第2−2の実施の形態 2-2 embodiment of the present invention
次に本発明の第2−2の実施の形態について図15により説明する。 Next 2-2 embodiment of the present invention will be described with reference to FIG. 15.

図15は、図12乃至図14に示す第2−2の実施の形態における微生物分離装置を組込んだ微生物分離システムを示す。 Figure 15 illustrates a microorganism separation system incorporating a microorganism separation device in the 2-2 embodiment shown in FIGS. 12 to 14.

図15において、サンプル水は試料水供給バルブ122を介して試料水供給ライン121に流れ、試料水リザーバタンク123に導入される。 15, the sample water flows into the sample water supply line 121 through the sample water supply valve 122, is introduced into the sample water reservoir tank 123. 所定量のサンプル水を導入後、試料水供給バルブ122を閉じ、試料水供給ポンプ124により供給口103から微生物分離装置110へサンプル水が供給され、微生物分離装置110の金属板1101においてサンプル中の特定の対象微生物が捕捉される。 After introducing a predetermined amount of sample water, close the sample water supply valve 122, is supplied sample water from the supply port 103 to the microorganism separation device 110 by the sample water supply pump 124, in the sample in the metal plate 1101 of the microorganism separation device 110 specific target microorganisms are captured. その後、サンプル水は、微生物分離装置110の排出口105から排出されて流体吸引装置126により吸引される。 Then, the sample water is discharged from the outlet 105 of the microbial separator 110 is sucked by the fluid suction device 126.

この間、サンプル中に含まれていた対象微生物は微生物捕捉用貫通孔111に捕捉される。 During this time, the target microorganisms contained in the sample is captured microorganisms captured through hole 111. 微生物捕捉用貫通孔111の最小直径部の径より小さい微生物や物質はこの微生物捕捉用貫通孔111を通過して吸引され、流体吸引装置126側へ排出される。 Small microorganisms and substances than the diameter of the smallest diameter portion of the microorganisms captured through hole 111 is sucked through the microorganism trapping holes 111, and is discharged to a fluid suction device 126 side.

この過程において、対象微生物を含む粒子状物質は微生物捕捉用貫通孔に捕捉される。 In this process, particulate matter including the target microorganism is captured microorganism capturing through hole.

サンプル水は試料水の供給ポンプ124と流体吸引装置126の双方により微生物分離装置110内へ導入されるが、供給ポンプ124と液体吸引装置126のうちいずれか一方のみを設けてもよい。 Although sample water is introduced into a microorganism separation device 110 by both of the feed pump 124 and the fluid suction device 126 of the water sample may be provided only one of the feed pump 124 and the liquid suction device 126.

また、実際に対象微生物が捕捉されているかどうかを金属板101上で確認することも可能である。 It is also possible to confirm actually whether a subject microorganism is captured on the metal plate 101. 対象微生物を検出もしくは生物の種類を特定する場合、抗原・抗体の結合反応や、DNAのハイブリダイゼーション反応を利用した生物的な情報に基づく検出法を金属板101上で実施することが可能である。 , To identify the type of detection or biological target microorganism, it can be implemented binding reaction and the antigen-antibody, a detection method based on biological information using hybridization reaction DNA on the metal plate 101 . 対象微生物を抗原として認識する抗体に蛍光もしくは発光色素で標識した標識抗体や、対象生物に含まれるDNAもしくはRNAと特異的に結合するDNAプローブに蛍光もしくは発光色素で標識した標識DNAプローブを供給する手段を金属板101に設け、標識抗体、標識DNAプローブを金属板101側に供給する。 And labeled antibodies labeled with a fluorescent or luminescent dye antibodies recognizing target microorganisms as an antigen, supplies the labeled labeled DNA probe to DNA or RNA contained in the target organism which specifically binds to the DNA probe with a fluorescent or luminescent dye a means in the metal plate 101, labeled antibody supplies labeled DNA probe to the metal plate 101 side. その結果、対象微生物を選択的に染色でき、それらを蛍光顕微鏡を用いて観察することが可能となる。 As a result, selectively staining target microorganism them it is possible to observe using a fluorescent microscope.

第2−3の実施の形態 2-3 embodiment of the present invention
次に本発明の第2−3の実施の形態について図16により説明する。 Next 2-3 embodiment of the present invention will be described with reference to FIG.

図16は洗浄機構を備えた微生物分離装置の構成例を示す図である。 Figure 16 is a diagram showing a configuration example of a microorganism separating apparatus having a cleaning mechanism.

なお、図16において、図15に示す実施の形態と同一部分には同一符号を付して詳細な説明は省略する。 In FIG. 16, the same reference numerals, and the descriptions in the embodiment the same parts of the embodiment shown in FIG. 15 will be omitted. 図16において、洗浄液保存容器131から洗浄液切換バルブ132を通じ、試料供給ポンプ124により洗浄液が金属板101に供給され、その後金属板101の貫通孔111に導入される。 16, through the cleaning liquid change-over valve 132 from the washing liquid storage vessel 131, the cleaning liquid is supplied to the metal plate 101 by the sample supply pump 124, is then introduced into the through hole 111 of the metal plate 101. 洗浄水は微生物捕捉用貫通孔111を洗浄し、洗浄液排出バルブ133を通じて排出される。 Washing water to wash the microorganisms captured through hole 111, and is discharged through the cleaning liquid discharge valve 133.

洗浄液としては界面活性剤、アルコール、有機溶剤、酸、アルカリ等が使用される。 The washing liquid detergent, alcohols, organic solvents, acids, alkali, or the like. ただし、洗浄液により金属板101及び対象微生物がダメージを受けないものを選定することが必要である。 However, it is necessary to select those metal plate 101 and the target microorganism is not damaged by the cleaning liquid. 例えば、界面活性剤を洗浄液として適用した場合、金属板101表面と粒子との界面に、洗浄液が浸透し、表面と粒子との距離を離すことにより、表面から粒子が引き離されるのに必要なポテンシャルエネルギーを低減させる。 For example, the case of applying the surfactant as a cleaning solution, the interface between the metal plate 101 surface and the particles, the cleaning liquid can penetrate, the potential required by increasing the distance between the surface and the particles, the particles from the surface is pulled away reduce the energy. その結果、対象微生物は孔内面との相互作用が大きいのに対し、それ以外の粒子の相互作用は小さいことから脱離しやすくなり、対象微生物のみが微生物捕捉孔に捕捉されることになる。 As a result, the target microorganism whereas interaction with hole inner surface is large, the interaction of the other particles easily detached from smaller, only the target microbe is captured microorganisms trapping holes. このため、微生物の捕捉回収効率が向上する。 This improves the trapping efficiency of recovering microorganisms.

また、微生物捕捉用貫通孔111からの対象微生物以外の粒子状物質の脱離を促進するために、物理的洗浄手段134を設けてもよい(図16)。 In order to accelerate the elimination of particulate matter other than the target microbe from microorganisms captured through hole 111 may be provided with a physical cleaning means 134 (FIG. 16). 例えば、物理的洗浄手段134としては、超音波や機械的振動、電気的振動、熱供給などを利用する。 For example, the physical cleaning means 134, ultrasonic or mechanical vibration, electrical vibrations, utilizing thermal supply. 物理的洗浄手段134を金属板101に設置し、振動による機械的エネルギーを粒子状物質に与えることにより、脱離に必要なエネルギーを供給する。 The physical cleaning means 134 is placed on the metal plate 101, by applying mechanical energy by vibrating the particulate matter, and supplies the energy required for desorption.

同様に、加熱によりエネルギーを供給することによっても、脱離を促進することが可能となる。 Similarly, by supplying energy by heating, it is possible to promote desorption. ただし、過剰の振動・過熱によって対象微生物も脱離してしまう可能性もある。 However, there is also a possibility that the target microorganisms eliminated by excess vibration and overheating.

これを防止し、かつ他の粒子状物質を効果的に除去するために、最適な洗浄条件を設定する必要がある。 To prevent this, and in order to effectively remove other particulate matter, it is necessary to set the optimum washing conditions. なお、上記の洗浄液による洗浄、及び物理的洗浄手段はそれぞれ単独で使用しても良いし、組み合わせて使用することもできる。 Incidentally, washing with the above washing solution, and to each physical cleaning means may be used alone may also be used in combination.

第3−1の実施の形態 3-1 embodiment
以下、図面を参照して本発明の第3−1の実施の形態について説明する。 Hereinafter, it will be described with reference to the drawings 3-1 the embodiment of the present invention.

図17乃至図18は本発明による微生物分離装置の第3−1の実施の形態を示す図である。 17 to 18 are views showing the 3-1 embodiment of the microorganism separation device according to the present invention. ここで図17(a)は微生物分離装置の平面図、図17(b)は図17(a)のX−X′線断面図、図18(a)はマイクロチップの斜視図、図18(b)はその拡大図である。 Here, FIG. 17 (a) a plan view of the microorganism separation apparatus, X-X 'line cross-sectional view of FIG. 17 (b) FIG. 17 (a), the FIG. 18 (a) a perspective view of the microchip, Fig. 18 ( b) is an enlarged view thereof.

図17(a)(b)、図18(a)(b)に示すように、微生物分離装置110は、特定の対象微生物を分離・回収するものであり、対象微生物より小さな孔径をもつ貫通孔1111が形成された板状のマイクロチップ(金属板ともいう)101と、このマイクロチップ101の上面に配置された第1の支持体102aと、マイクロチップ101の下面に配置された第2の支持体102b,102cとを備えている。 Figure 17 (a) (b), as shown in FIG. 18 (a) (b), the microorganism separation device 110 is for separating and recovering a specific target microorganism, a through hole having a smaller pore size than the target microorganism and 1111 (also referred to as a metal plate) plate-like microchip formed 101, a first support member 102a which is arranged on the upper surface of the microchip 101, a second support disposed on the bottom surface of the microchip 101 It includes a body 102b, and 102c.

このうち第1の支持体102aは上部支持体102aからなり、また第2の支持体102b,102cは中間支持体102bと下部支持体102cからなっている。 Among first support 102a comprises an upper support 102a, and the second support 102b, 102c are made from the intermediate support 102b and the lower support 102c. さらに第1の支持体102a、第2の支持体102b、102cにより支持体102が構成される。 Furthermore, the first support 102a, a second support 102b, the support 102 is configured by 102c.

なお、マイクロチップ101は、第1の支持体102aと第2の支持体102b間に配置されているが、単に積層するのみでも、第1の支持体102aと第2の支持体102bとによりマイクロチップ1を圧着するなど種々の手段が採用できる。 Incidentally, the microchip 101 are disposed between the first support 102a and the second support member 102b, simply only laminated, micro by a first support member 102a and the second support 102b various means such as crimping the chip 1 can be adopted.

このとき支持体102a、102b、102cの材質としては、各種のプラスチック材料、金属材料、ガラス等が使用できるが、ポリジメチルシロキサン(PDMS),PMMA,ガラス等の透明材料を使用することが望ましい。 In this case the support 102a, 102b, as the material of 102c, various plastic materials, metallic materials, glass, etc. can be used, polydimethylsiloxane (PDMS), PMMA, it is preferable to use a transparent material such as glass. 本実施の形態では、支持体102a、102cをPDMSで構成し、支持体102bをスライドガラスで構成している。 In this embodiment, the support 102a, 102c, constituted by PDMS, constitute the support 102b on glass slides.

また上部支持体102aには、その表面に沿って水平方向に延び、かつ上部支持体102aを貫通するフロー流路104aと、微生物を捕捉孔に連なるフロー流路104bと、フロー流路104aに連通し、かつ外方に開口する供給口103とが形成されている。 Also the upper support 102a, communicating with the flow passage 104a which extends horizontally along the surface, and penetrates the upper support 102a, a flow passage 104b for communicating the microorganisms trapping holes, the flow passage 104a and, and a supply port 103 is formed to be opened outwardly. さらに、上部支持体102aに洗浄液や、対象微生物以外の粒子状物質の排出口として作用する、洗浄排水口106が形成されている。 Additionally, or cleaning liquid to the upper support 102a, acts as a discharge port of the particulate matter other than the target microorganisms, detergent drain port 106 is formed. この上部支持体102aのフロー流路104aとフロー流路104bとによって第1のフロー流路が構成される。 First flow passage by the flow passage 104a and the flow passage 104b of the upper support 102a is formed.

中間支持体102bには、中間支持体102bを貫通するフロー流路104cが形成されている。 The intermediate support 102b, the flow passage 104c passing through the intermediate support 102b is formed.

また下部支持体102cには、その表面に沿って水平方向に延び、かつ下部支持体102cを貫通するフロー流路104dが形成され、このフロー流路104dには外方へ開口する排出口105が連通している。 Also to the lower support member 102c extends in the horizontal direction along the surface thereof and the flow passage 104d penetrating the lower support 102c is formed on the flow passage 104d discharge port 105 which opens outwardly communicate with each other. この中間支持体102bのフロー流路104c、および下部支持体102cのフロー流路104cによって第2のフロー流路が形成されている。 The flow passage 104c of the intermediate support 102b, and the second flow passage by the flow passage 104c of the lower support member 102c is formed.

中間支持体102bのフロー流路104bと、下部支持体102cのフロー流路104cは互いにマイクロチップ101の貫通孔(微生物捕捉孔ともいう)111を介して連通している。 A flow passage 104b of the intermediate support 102b, communicate with each other through the lower support flow passage 104c of 102c is (also referred to as a microorganism trapping holes) through-hole of the microchip 101 with each other 111. ここで、フロー流路104a、104bを親水化処理することにより、水との親和性が強くなることから、付着した微生物が流水で容易に剥離するようになる。 Here, the flow channel 104a, by 104b the hydrophilic treatment, since the affinity to water is increased, the deposited microorganisms so easily peeled off with running water. その結果、微生物の流路への付着が抑制される。 As a result, adhesion of the microorganisms of the channel is suppressed.

このように構成された本実施の形態において、微生物分離装置110に導入されたサンプル水は供給口103から導入され、フロー流路104a、104bを通り、金属板101に到達する。 In such embodiment, which is configured, the sample water introduced into a microorganism separation device 110 is introduced from the supply port 103, as the flow channel 104a, the 104b, to reach the metal plate 101. このとき、金属板101の貫通孔111の孔径より小さな物質、及び溶解成分はフロー流路104cを通って、排水口105から排出され、孔径より大きな物質が金属板101に捕捉される。 At this time, little material, and dissolved components than the diameter of the through hole 111 of the metal plate 101 through the flow passage 104c, it is discharged from the discharge port 105, greater substance than the hole diameter is trapped to the metal plate 101. フロー流路104a、104bは前記の通り、親水化処理されているため、微生物の付着が抑制され、試料水中に含まれる微生物は、ほぼ全てが金属板101に到達するようになる。 Since the flow passage 104a, the 104b are processed as hydrophilizing of the adhesion of microorganisms is suppressed, the microorganisms contained in the sample water is as nearly all to reach the metal plate 101.

ここで、金属板101は、微生物の寸法より小さい貫通孔111を有している。 Here, the metal plate 101 has a size smaller than the through-hole 111 of the microorganisms. 一般的に細菌類や原虫類の大きさは1〜数μmであり、それ以下の寸法の貫通孔111を形成する。 Generally the size of the bacteria or protozoa is 1 to several [mu] m, to form the through hole 111 of less dimension. 金属板101に到達した微生物は、貫通孔111に捕捉される。 Microorganisms reach the metal plate 101 is captured in the through hole 111. 本実施の形態によれば、流路への微生物の付着を防止し、精度の向上を図ることができる。 According to this embodiment, to prevent the adhesion of microorganisms to the flow path, it is possible to improve the accuracy.

貫通孔111はレーザー加工や機械加工等の方法により形成されるが、加工方法によっては両面で、貫通孔の孔径が異なる。 Although the through-hole 111 is formed by a method such as laser processing or machining, depending processing method on both sides, the hole diameter of the through hole is different. 図18は金属板101(SUS304製)をレーザー加工によって加工して貫通孔を製作した例を示したものであるが、厚さ5μmの金属板101に孔径2〜3μmの孔を開けた場合、反対側の面の開口部は3〜5μmの孔径となる。 Figure 18 case but illustrates an example of fabricating a processed through hole by laser processing a metal plate 101 (manufactured by SUS304), opening the pores of 2~3μm the metal plate 101 having a thickness of 5 [mu] m, opening opposite to the surface becomes diameter of 3 to 5 [mu] m. この金属板は、どちらを上面にしても微生物分離に適用することは可能である。 The metal plate, it is possible to apply either the even microorganisms separated in the upper surface. 図18では、孔径の小さい面をフロー流路104b側(供給側)とした例を図示している。 In Figure 18, it illustrates an example of a small surface pore diameter flow channel 104b side (supply side). この構成を利用して、微生物模擬粒子を捕捉した例を図19に示す。 Using this configuration, shown in Figure 19 an example of capturing the microorganisms simulated particles. ここではクリプトスポリジウム模擬粒子(クリプトレーサー1号:(財)水適技術研究センター)を使用した。 It was used here Cryptosporidium simulated particles (script racer No. 1 :( goods) Mizuteki Technology Research Center). 1つの輝点が粒子1つに対応しており、ほぼ1つの孔に1つの粒子が捕捉されていることがわかる。 One bright spot corresponds to one particle 1, it can be seen that one particle is trapped in approximately one hole.

実際のサンプル水では、微生物以外の非生物性の粒子も多く含まれている。 The actual sample water contains many abiotic particles other than microorganisms. 分子生物学的手法を用いることにより、対象とする微生物以外は染色されないことから、誤認識の面ではそれほど問題は無いが、貫通孔を閉塞させてしまう恐れがある。 The use of molecular biology techniques, since the other microorganisms of interest are not stained, but serious problem is not in terms of false recognition, there is a possibility that occlude the through hole. これを防止するために、酸・アルカリ等の薬品をマイクロチップ101に供給し、流路や貫通孔に付着した非生物性の粒子を除去することが可能である。 To prevent this, to supply chemicals such as acids and alkalis in the microchip 101, it is possible to remove the abiotic particles adhered to the flow path and the through-hole.

非生物性の粒子としては、カルシウム,鉄,シリカ等の鉱物性の成分が挙げられる。 The abiotic particles, calcium, iron, mineral components such as silica and the like. 表1に、実際に水道水中に含まれていた鉱物系の元素の重量比,原子量比の例を示す。 Table 1 shows actual weight ratio of the element of mineral contained in the tap water, the example of atomic weight ratio.

通常、これら鉱物性の粒子を溶解させるためには、塩酸洗浄が有効である。 Typically, the order to dissolve these mineral particles, hydrochloric acid washing is effective. 例えば、1mol/LのHClを10分間作用させることにより、クリプトスポリジウムを溶解させること無く、酸化鉄(Fe ),炭酸カルシウム(CaCO ),水酸化亜鉛(Zn(OH ))酸化銅(CuO,Cu O)を溶解除去することが可能である。 For example, by the action of HCl 1 mol / L 10 min, without dissolving Cryptosporidium, iron oxide (Fe 2 O 3), calcium carbonate (CaCO 3), zinc hydroxide (Zn (OH 2)) oxide copper (CuO, Cu 2 O) can be dissolved and removed. その他の酸では、硝酸,スルファミン酸,クエン酸等の、スケール洗浄に使用される酸類の適用が可能である。 In other acid, nitric acid, sulfamic acid, and citric acid, can be applied acids that are used to scale cleaning. 塩酸処理だけで十分に粒子を除去できない場合は、シリカ(SiO )が含まれていることが考えられる。 If you can not remove enough particles only treatment with hydrochloric acid, it is considered that silica (SiO 2) is contained. この場合には、助剤として、フッ酸を添加することで、溶解性を向上させることができる。 In this case, as auxiliaries, the addition of hydrofluoric acid, thereby improving the solubility.

図20は支持体102a、102cを構成するPDMS素材に各種処理を施した際の、接触角の変化を示したものである。 Figure 20 is a support 102a, when subjected to various processes in PDMS material constituting the 102c, shows the change in contact angle. 処理前は100°以上の接触角となっているが、プラズマ処理を施したものは、いずれも大きく接触角が低下していることがわかる。 Although pretreatment has a contact angle of more than 100 °, were subjected to plasma treatment, it can be seen that both large contact angle is lowered.

プラズマ処理後に純水(Milli−Q水)で処理を行った場合は、処理直後は接触角が大きく低下するものの、5時間後には再び増加する傾向にある。 When performing the process with pure water (Milli-Q water) after the plasma treatment, immediately after treatment but the contact angle is greatly reduced, it tends to increase again after 5 hours. これは、プラズマ処理によって表面に形成された親水基が徐々に消失することに起因するものと考えられる。 This is considered to be due to the hydrophilic groups formed on the surface by the plasma treatment is gradually lost. プラズマ処理後に界面活性剤(1%SDS(ドデシル硫酸ナトリウム))で処理した場合は、純水で処理したものに比較すると、接触角の増加は抑えられる傾向にあり、より親水化の効果を発揮させることができる。 If after the plasma treatment were treated with a surfactant (1% SDS (sodium dodecyl sulfate)), when compared to those treated with pure water, an increase in the contact angle tends to is suppressed, an effect of more hydrophilic it can be.

また、陰イオン界面活性剤を用いて表面を被覆することにより、表面電位が負に帯電しているクリプトスポリジウムオーシストの吸着を阻害すると考えられる。 Further, by coating the surface with an anionic surfactant, it is thought to inhibit the adsorption of Cryptosporidium oocysts surface potential is negatively charged. 今回の試験では、流路の材質として、PDMSを用いたが、他の材質についても、処理方法を工夫することによって、導入流路におけるクリプトスポリジウムオーシストの吸着は抑制できると考えられる。 In this test, as the material of the flow path, but using PDMS, for other materials, by devising the processing method, the adsorption of Cryptosporidium oocysts in introducing flow channel is considered to be suppressed.

図21は、微小流路内への微生物模擬粒子の付着状況を比較したものである。 Figure 21 is a comparison of the adhesion state of microorganisms simulated particles to fine flow path. PDMSを使用して、幅200μm、深さ200μm、長さ1cmの流路を作製し、シリンジポンプを用いて流速100μL/minでクリプトスポリジウム模擬粒子の懸濁液(100個/10μL)を導入した。 Use PDMS, to prepare a width 200 [mu] m, depth 200 [mu] m, the flow path length 1 cm, was introduced a suspension (100/10 [mu] L) of Cryptosporidium simulated particles using a syringe pump at a flow rate of 100 [mu] L / min . クリプトスポリジウム模擬粒子は、クリプトレーサー1号:(財)水適技術研究センターを使用した。 Cryptosporidium simulated particles, using a crypto racer No. 1 :( goods) Mizuteki Technology Research Center. この模擬粒子は比重、表面電位が実際のクリプトスポリジウムと同様になっており、蛍光色素を予め含んでいる。 The simulated particle specific gravity, has become similar to the surface potential actually Cryptosporidium include a fluorescent dye in advance. 5分間各溶媒で粒子を導入後、流路内の溶液を空気で押し出した後に、U励起下で蛍光顕微鏡観察した。 After introduction of the particles at 5 minutes each solvent, the solution in the channel after extrusion with air, and fluorescence microscopy under U excitation. 無処理の流路Aの場合、非常に多くの粒子が流路内に残存していることが分かる。 If the flow path A of the untreated, it can be seen remaining in very many particles flow path.

それに対し、プラズマ処理および界面活性剤として1%SDS処理を施した流路Bの場合、ほとんど流路内に蛍光発光による輝点は見られず、模擬粒子の吸着は見られない。 In contrast, when the plasma treatment and the flow path was subjected to 1% SDS treatment as the surfactant B, bright spots by fluorescence was not observed in most flow path, the adsorption of the simulated grain is not observed.

図22は各種処理を施した場合の、流路内への微生物模擬粒子の付着数を比較したものである。 Figure 22 shows a comparison of the case of applying various kinds of processing, the number of microbial adherence simulated particles into the flow path. 試験条件は図4の場合と同様である。 Test conditions were the same as in the case of FIG. プラズマ処理を施した流路では、無処理のものに比較して付着粒子数が低減している。 In the flow path subjected to plasma treatment, the number of adhered particles is reduced as compared to that of untreated. 特に、プラズマ処理+SDSの処理を行った流路では顕著に付着粒子が低下している。 In particular, remarkably adhered particles is reduced in the flow path performing the process of plasma treatment + SDS.

この様に、プラズマ処理、さらに陰イオン界面活性剤による表面処理を行うことにより、クリプトスポリジウムの吸着を有効に防止することができる。 Thus, plasma treatment, by further performing surface treatment by anionic surfactants, it is possible to effectively prevent the adsorption of Cryptosporidium.

第3−2の実施の形態 3-2 embodiment of the present invention
次に本発明の第3−2の実施の形態について図23により説明する。 Next 3-2 embodiment of the present invention will be described with reference to FIG. 23.

図23は、図17乃至図20に示す第3−1の実施の形態における微生物分離装置を組込んだ微生物分離システムを示す。 Figure 23 illustrates a microorganism separation system incorporating a microorganism separation device in the 3-1 embodiment shown in FIGS. 17 to 20.

図23において、サンプル水は試料水供給バルブ122を介して試料水供給ライン121に流れ、試料水リザーバタンク123に導入される。 23, the sample water flows into the sample water supply line 121 through the sample water supply valve 122, is introduced into the sample water reservoir tank 123. 所定量のサンプル水を導入後、試料水供給バルブ122を閉じ、試料水供給ポンプ124により供給口103から微生物分離装置110へサンプル水が供給され、微生物分離装置110の金属板101においてサンプル中の特定の対象微生物が捕捉される。 After introducing a predetermined amount of sample water, close the sample water supply valve 122, is supplied sample water from the supply port 103 to the microorganism separation device 110 by the sample water supply pump 124, in the sample in the metal plate 101 of the microorganism separation device 110 specific target microorganisms are captured. その後、サンプル水は、微生物分離装置110の排出口105から排出されて流体吸引装置126により吸引される。 Then, the sample water is discharged from the outlet 105 of the microbial separator 110 is sucked by the fluid suction device 126.

この間、サンプル水中に含まれていた対象微生物は、第1の支持体102aの第1の流路104a、104bを通過して微生物捕捉用貫通孔11に捕捉される。 During this time, the target microorganism contained in the sample water, first flow path 104a of the first support 102a, trapped 104b microorganisms captured through hole 11 through the. ここで、第1の流路104a、104bでの微生物吸着が多いと、金属板101に到達する微生物の割合が低下し、検出率の低下につながる。 Here, the first flow path 104a, the many microorganisms adsorption at 104b, the percentage of microorganisms that reaches the metal plate 101 is lowered, leading to lowering of the detection rate. しかしながら、第3−1の実施の形態に示すように第1の流路104a、104b内面を親水化することにより、より高い確率で微生物が金属板101に到達することになる。 However, the first flow path 104a, as shown in 3-1 embodiment, by hydrophilized 104b inner surface, microorganisms will reach the metal plate 101 at a higher probability. こうして第1の流路104a、104bを通過した、微生物捕捉用貫通孔111の最小直径部の径より小さい微生物や物質はこの微生物捕捉用貫通孔111を通過して吸引され、流体吸引装置126側へ排出される。 Thus the first channel 104a, have passed through the 104b, small microorganisms and substances than the diameter of the smallest diameter portion of the microorganisms captured through hole 111 is sucked through the microorganism trapping holes 111, the fluid suction device 126 side It is discharged to.

この過程において、対象微生物を含む粒子状物質は微生物捕捉用貫通孔111により捕捉される。 In this process, particulate matter including the target microorganism is captured by the microorganisms captured through hole 111.

サンプル水は試料水の供給ポンプ124と流体吸引装置126の双方により微生物分離装置110内へ導入されるが、供給ポンプ124と液体吸引装置126のうちいずれか一方のみを設けてもよい。 Although sample water is introduced into a microorganism separation device 110 by both of the feed pump 124 and the fluid suction device 126 of the water sample may be provided only one of the feed pump 124 and the liquid suction device 126.

また、実際に対象微生物が捕捉されているかどうかを金属板101上で確認することも可能である。 It is also possible to confirm actually whether a subject microorganism is captured on the metal plate 101. 対象微生物を検出もしくは生物の種類を特定する場合、抗原・抗体の結合反応や、DNAのハイブリダイゼーション反応を利用した生物的な情報に基づく検出法を金属板101上で実施することが可能である。 , To identify the type of detection or biological target microorganism, it can be implemented binding reaction and the antigen-antibody, a detection method based on biological information using hybridization reaction DNA on the metal plate 101 . 対象微生物を抗原として認識する抗体に蛍光もしくは発光色素で標識した標識抗体や、対象生物に含まれるDNAもしくはRNAと特異的に結合するDNAプローブに蛍光もしくは発光色素で標識した標識DNAプローブを供給する手段を金属板101に設け、標識抗体、標識DNAプローブを金属板101側に供給する。 And labeled antibodies labeled with a fluorescent or luminescent dye antibodies recognizing target microorganisms as an antigen, supplies the labeled labeled DNA probe to DNA or RNA contained in the target organism which specifically binds to the DNA probe with a fluorescent or luminescent dye a means in the metal plate 101, labeled antibody supplies labeled DNA probe to the metal plate 101 side. その結果、対象微生物を選択的に染色でき、それらを蛍光顕微鏡を用いて観察することが可能となる。 As a result, selectively staining target microorganism them it is possible to observe using a fluorescent microscope.

第3−3の実施の形態 3-3 embodiment of the present invention
次に本発明の第3−3の実施の形態について、図24乃至図26により説明する。 Next 3-3 embodiment of the present invention will be described with reference to FIG 24 to FIG 26.

ここでは、蛍光顕微鏡像による微生物検出の妨害となる、藻類の除去に関する効果について説明する。 Here, the disturbance of the microbial detection by fluorescence microscopic image is described effect on the removal of algae. サンプル中に藻類が含まれる場合、藻類は細胞内にクロロフィル、フィコシアニンといった、蛍光性の物質を含んでおり、自ら蛍光発光する性質がある(以下、自家蛍光とする)。 If the sample contains algae, algae chlorophyll in the cell, such as phycocyanin, contains a fluorescent substance, the property of its own fluorescence (hereinafter referred to as autofluorescence). そのため蛍光染色を利用した検出法を採る場合、誤認識の原因となりうるため、除去することが望ましい。 So if you take the detection method utilizing fluorescent staining, since that could cause a false recognition, it is desirable to remove. 特に耐塩素性の病原性微生物である、クリプトスポリジウムを検出対象とする場合、クリプトスポリジウムの直径が約5μmであることから、藻類と同等の大きさであり、微生物捕捉用貫通孔111の分画精度だけでは、十分に分離することが困難である。 Especially pathogenic microorganisms chlorine resistance, when it is detected Cryptosporidium, since the diameter of Cryptosporidium is about 5 [mu] m, a size equivalent to algae, fractionation of microorganisms captured through hole 111 accuracy alone, it is difficult to sufficiently separate.

図24は藻類除去機能を更に備えた微生物分離システムを示す。 Figure 24 shows a further microorganism separation system with algae removal function. なお、図24において、図23に示す第3−2の実施の形態と同一部分には同一符号を付して詳細な説明は省略する。 Incidentally, in FIG. 24, the same reference numerals, and the descriptions in the first 3-2 embodiment, the same parts of the embodiment of shown in FIG. 23 will be omitted.

まず、上述した第3−2の実施の形態で示したように、サンプル水が金属板101に到達して、サンプル水中の微生物が金属板101の微生物捕捉用貫通孔11により捕捉される。 First, as shown in the first 3-2 embodiment described above, the sample water has reached the metal plate 101, the microorganism of the sample water is captured by the microorganisms captured through holes 11 of the metal plate 101.

次に図24において、藻類溶解酵素液保存容器131から溶解液切換バルブ132を通じ、試料供給ポンプ124により溶解液が金属板101に供給され、その後金属板101の貫通孔111に導入される。 Referring now to FIG. 24, through the solution switching valve 132 from alga dissolving enzyme liquid storage container 131, lysate by the sample supply pump 124 is supplied to the metal plate 101, it is then introduced into the through hole 111 of the metal plate 101. 溶解水は微生物捕捉用貫通孔111を洗浄し、排出バルブ133を通じて排出される。 Dissolved water washing the microorganisms captured through hole 111, and is discharged through the discharge valve 133.

次に、蛍光染色液保存容器134から、蛍光染色液切換バルブ135を通じ、試料供給ポンプ124により、蛍光染色液が金属板101に供給される。 Next, a fluorescent staining liquid storage container 134, through the fluorescent staining solution switching valve 135, the sample supply pump 124, a fluorescent staining liquid is supplied to the metal plate 101. この蛍光染色液は、蛍光標識された、対象微生物を特異的に認識・結合する抗体、DNAプローブからなる。 The fluorescent staining solution was fluorescently labeled antibodies that specifically recognize and bind the target microorganism comprises DNA probe. 金属板101の微生物捕捉用貫通孔111に捕捉された粒子のうち、対象微生物を抗体、DNAプローブが認識、選択的に結合することにより、対象微生物のみが染色される。 Of the particles trapped microorganisms captured through holes 111 of the metal plate 101, an antibody target microorganism, a DNA probe recognition, by selectively coupling, only the target microbes are stained. この構成とすることにより、藻類を除去した後、対象微生物を染色することが可能となる。 With this arrangement, after removal of the algae, it is possible to stain the target microorganism.

本発明では、藻類溶解酵素を使用して藻類を除去する。 In the present invention, to remove the algae using algal lytic enzyme. 図25には、各種の細胞溶解処理方法に対する、藻類の自家蛍光強度特性を示す。 FIG 25, for various cell lysis treatment process, shows the autofluorescence intensity characteristics of algae. 細胞溶解処理方法として、リゾチーム(Lysozyme)や、プロテアーゼの一つであるプロテイナーゼK(Proteinase K)等を用いた酵素処理を検証した。 As a cell lysis treatment method, lysozyme (Lysozyme) and verified the enzymatic treatment with proteinase K (Proteinase K) or the like which is one of the proteases. ここでは試験サンプルの藻類として、BG−11培地で振とう培養し、80μLのTris−HCl buffer(pH8.5)に懸濁したSynechoccoccus sp. As algae test samples here, and cultured with shaking at BG-11 medium, Synechoccoccus sp suspended in 80μL of Tris-HCl buffer (pH8.5). NKBG 042902(6×10 cells/ml)を用いた。 NKBG 042,902 and (6 × 10 7 cells / ml ) was used. この藻類懸濁液中に、50mg/mL−リゾチーム20μLを添加し、室温で20分間インキュベートした。 This algae suspension was added 50 mg / mL-lysozyme 20 [mu] L, and incubated at room temperature for 20 minutes. さらに、1mg/mL−プロテイナーゼKを10μL加え、各条件下でインキュベートした。 Furthermore, the 1 mg / mL-Proteinase K 10 [mu] L was added and incubated under each condition. 遠心回収、洗浄後G励起下で蛍光顕微鏡観察を行い、蛍光強度を測定した。 Centrifugal recovery performs fluorescence microscopy with washing after G under excitation, fluorescence intensity was measured.

その結果、どちらの酵素を使用しても、藻類による自家蛍光の減少が観察されており、藻類除去効果が得られる。 As a result, using either enzymes, reduction of autofluorescence due to algae have been observed, algae removal effect can be obtained. 特に、リゾチーム+プロテイナーゼKの連続処理による溶解が効果的であり、藻類の自家蛍光強度の大きな減少が見られている。 In particular, lysis by continuous processing of lysozyme + proteinase K are effective, large decrease in autofluorescence intensity algae have been observed.

クリプトスポリジウムのオーシストに対して、同様の処理を実施した結果を図26に示す。 Against Cryptosporidium oocysts, the result of the same processing shown in FIG. 26. クリプトスポリジウムに関しては、Tris−HCl緩衝液に比較して、酵素処理を行った場合でも蛍光強度の低下は見られず、クリプトスポリジウムは藻類溶解処理を行っても溶解されずに、免疫染色が可能であることが分かる。 For the Cryptosporidium, compared with Tris-HCl buffer, decrease in fluorescence intensity even when subjected to enzyme treatment was not observed, Cryptosporidium undissolved even if algae dissolution process, can immunostaining it can be seen that is. この結果から、藻類とクリプトスポリジウムの混合物をマイクロチップ上に補足した後、藻類のみを選択的に除去できるといえる。 This result was supplemented with a mixture of algae and Cryptosporidium on a microchip, it can be said that only can be selectively removed algae.

本発明による微生物分離装置の第1−1の実施の形態を示すマイクロチップの構造概念図。 1-1 Structure conceptual diagram of a microchip showing an embodiment of a microorganism separation device according to the present invention. 微生物分離装置のマイクロチップの微生物捕捉部および微生物捕捉孔を示す構造概念図。 Structure conceptual diagram showing a microorganism trapping section and microorganisms trapping holes in the microchip of the microorganism separation device. 本発明による微生物分離装置の第1−1の実施の形態を示す全体概略図。 1-1 schematically whole showing an embodiment of a microorganism separation device according to the present invention. 本発明による微生物分離装置の第1−2の実施の形態を示す全体概略図。 1-2 schematically whole showing an embodiment of a microorganism separation device according to the present invention. 本発明による微生物分離装置の第1−3の実施の形態を示す微生物捕捉孔の概念図。 Conceptual view of microorganisms trapping holes showing the first 1-3 embodiment of the microorganism separation device according to the present invention. 本発明による微生物分離装置の第1−4の実施の形態を示す全体概略図。 1-4 schematically whole showing an embodiment of a microorganism separation device according to the present invention. 本発明による微生物分離装置の第1−4の実施の形態の微生物捕捉孔を示す概念図。 Conceptual view illustrating a microorganism trapping holes of 1-4 embodiment of the microorganism separation device according to the present invention. 本発明による微生物分離装置の第1−5の実施の形態を示す全体概略図。 The 1-5 schematically whole showing an embodiment of a microorganism separation device according to the present invention. 本発明による微生物分離装置の第1−6の実施の形態を示す全体概略図。 The 1-6 schematically whole showing an embodiment of a microorganism separation device according to the present invention. 本発明による微生物分離装置の第1−7の実施の形態を示すマイクロチップとメンブレンフィルタの構造概念図。 1-7 Structure conceptual view of the microchip and membrane filter showing an embodiment of a microorganism separation device according to the present invention. 本発明による微生物分離装置の第1−7の実施の形態を示すマイクロチップの微生物捕捉部および微生物捕捉孔とメンブレンフィルタの構造概念図。 1-7 Structure conceptual diagram of a microorganism trapping section and microorganisms trapping holes and the membrane filter of the microchip showing an embodiment of a microorganism separation device according to the present invention. 本発明による微生物分離装置の第2−1の実施の形態を示す構成図。 Diagram showing the 2-1 embodiment of the microorganism separation device according to the present invention. 金属板の微生物捕捉用貫通孔を示す図。 It shows microorganisms captured through hole of the metal plate. 微生物捕捉用貫通孔の位置とクリプトスポリジウム模擬粒子の捕捉状況を示す図。 It shows the capture status position and Cryptosporidium simulated particles microorganism capturing through hole. 本発明による微生物分離装置の第2−2の実施の形態を示す構成図。 Diagram showing the 2-2 embodiment of the microorganism separation device according to the present invention. 本発明による微生物分離装置の第2−3の実施の形態を示す構成図。 Diagram showing the 2-3 embodiment of the microorganism separation device according to the present invention. 本発明による微生物分離装置の第3−1の実施の形態を示すマイクロチップの構造概念図。 3-1 Structure conceptual diagram of a microchip showing an embodiment of a microorganism separation device according to the present invention. 微生物分離装置のマイクロチップの微生物捕捉部および微生物捕捉孔を示す構造概念図。 Structure conceptual diagram showing a microorganism trapping section and microorganisms trapping holes in the microchip of the microorganism separation device. マイクロチップへの粒子捕捉例を示す図。 It shows the particle capture example to the microchip. PDMSにプラズマ+各種界面活性剤処理を施した際の接触角を示す図。 It shows the contact angle when subjected to plasma + various detergent treatment to PDMS. 微小流路内への微生物模擬粒子の付着状況を示す図。 Shows the adhesion state of microorganisms simulated particles to fine flow path. PDMSにプラズマ+各種界面活性剤処理を施した際の残留粒子数を示す図。 It shows the number of residual particles when subjected to plasma + various detergent treatment to PDMS. 本発明による微生物分離装置の第3−2の実施の形態を示す全体概略図。 3-2 schematically whole showing an embodiment of a microorganism separation device according to the present invention. 本発明による微生物分離装置の第3−3の実施の形態を示す全体概略図。 3-3 schematically whole showing an embodiment of a microorganism separation device according to the present invention. 各種の細胞溶解処理方法に対する、藻類の自家蛍光強度の減少特性を示す図。 It shows for various cell lysis treatment method, the reduction characteristics of the autofluorescence intensity algae. 各種の細胞溶解処理方法に対する、C. For various cell lysis treatment process, C. parvumオーシスト蛍光染色強度測定結果を示す図。 It shows a parvum Oocysts staining intensity measurements.

符号の説明 DESCRIPTION OF SYMBOLS

10 平板基板11 フロー流路12 微生物捕捉部12a 微生物捕捉孔13 流体供給口14 流体排出口15 流体吸引口16 試料水供給ライン17 試料水供給バルブ18 試料水リザーバタンク19 試料水供給ポンプ20 マイクロチップ21 流体吸引装置22 試料水排出バルブ23 試料水循環バルブ24 微生物捕捉用抗体25 対象微生物26 試料水リザーバタンク兼磁性物質標識反応槽27 磁性物質標識抗体保存容器28 磁性物質標識抗体供給ライン29 磁性物質標識抗体供給バルブ30 磁性物質標識抗体供給ポンプ31 磁気印加装置32 磁性材料物質標識抗体33 磁気材料34 磁性材料35 洗浄液保存容器36 洗浄液供給ラインバルブ37 物理的印加手段38 分画処理手段39 メンブレンフィルタ101 金属板102a 上部 10 planar substrate 11 flow channel 12 microorganism trapping section 12a microorganism capturing hole 13 fluid supply port 14 fluid discharge port 15 fluid suction port 16 sample water supply line 17 sample water supply valve 18 sample water reservoir tank 19 sample water supply pump 20 microchip 21 fluid suction apparatus 22 sample water discharge valve 23 sample water circulation valve 24 microorganism capture antibody 25 target microbes 26 sample water reservoir tank and the magnetic substance-labeled reaction vessel 27 magnetic substance-labeled antibody storage container 28 magnetic substance-labeled antibody supply line 29 magnetic substance labeling antibodies supply valve 30 magnetic substance-labeled antibody feed pump 31 magnetic applying device 32 magnetic material substance-labeled antibody 33 magnetic material 34 magnetic material 35 the washing liquid storage vessel 36 cleaning liquid supply line valve 37 physically applying means 38 fractionation unit 39 membrane filter 101 metal plate 102a top 持体102b 中間支持体102c 下部支持体103 供給口104a フロー流路104b フロー流路104c フロー流路105 排水口111 微生物捕捉用貫通孔121 試料水供給ライン122 試料水供給バルブ123 試料水リザーバタンク124 試料水供給ポンプ126 流体吸引装置131 洗浄液保存容器132 洗浄液切換バルブ133 洗浄液排出バルブ134 物理的洗浄手段 Bearing member 102b intermediate support 102c lower support 103 supply port 104a flows passage 104b flows flow path 104c flow channel 105 drain port 111 microorganisms captured through hole 121 sample water supply line 122 sample water supply valve 123 sample water reservoir tank 124 sample water supply pump 126 fluid suction device 131 cleaning liquid storage container 132 cleaning fluid changeover valve 133 cleaning liquid discharge valve 134 physical cleaning means

Claims (28)

  1. 試料水中に含まれる対象微生物を分離して回収する微生物分離装置において、 In a microorganism separation device for separating and recovering target microorganisms contained in the sample water,
    流体供給口および流体吸引口を含むフロー流路が内部に形成された平板基板と、平板基板の流体吸引口に設けられ対象微生物の最小径より小さい径の複数の貫通孔からなる捕捉部とを有するマイクロチップと、 A flat substrate which flow channel formed therein which includes a fluid supply port and a fluid suction port and a capture portion comprising a plurality of through-holes of smaller diameter than the minimum diameter of the target microorganism is provided in the fluid suction port of the flat substrate and a microchip having,
    マイクロチップの捕捉部に接続され試料水を吸引する試料水吸引手段と、 A sample water suction means for sucking the sample water is connected to the capture portion of the microchip,
    マイクロチップの平板基板の流体供給口に接続され試料水を供給する試料水供給手段と、 A sample water supply means for supplying a sample solution is connected to the fluid supply port of the planar substrate of the microchip,
    を備えたことを特徴とする微生物分離装置。 Microorganism separating apparatus characterized by comprising a.
  2. 平板基板の貫通孔内に、対象微生物の抗原を特異的に認識する抗体を設けたことを特徴とする請求項1記載の微生物分離装置。 In the through hole of the plate substrate, microorganism separation device according to claim 1, characterized by providing an antibody that specifically recognizes the antigen of interest microorganisms.
  3. 対象微生物の抗原を特異的に認識するとともに磁性物質で標識した抗体を試料水に供給するための磁性物質標識抗体供給手段と、 The antibody labeled with a magnetic material with specifically recognizes the antigen of interest microorganisms and the magnetic substance-labeled antibody supplying means for supplying the water sample,
    この磁性物質標識抗体供給手段から供給された磁性物質標識抗体と微生物の抗原との反応を行う反応部とを更に備え、 Anda reaction unit to carry out the reaction with the antigen of the supplied magnetic substance-labeled antibody and microorganisms from the magnetic substance-labeled antibodies supply means,
    平板基板の貫通孔内に、磁性物質を引力する材料を設けたことを特徴とする請求項1記載の微生物分離装置。 In the through hole of the plate substrate, microorganism separation device according to claim 1, characterized in that a material for the force of the magnetic material.
  4. 対象微生物の抗原を特異的に認識するとともに磁性物質で標識した抗体を試料水に供給するための磁性物質標識抗体供給手段と、 The antibody labeled with a magnetic material with specifically recognizes the antigen of interest microorganisms and the magnetic substance-labeled antibody supplying means for supplying the water sample,
    この磁性物質標識抗体供給手段から供給された磁性物質標識抗体と微生物の抗原との反応を行う反応部とを更に備え、 Anda reaction unit to carry out the reaction with the antigen of the supplied magnetic substance-labeled antibody and microorganisms from the magnetic substance-labeled antibodies supply means,
    平板基板の貫通孔内に、磁性物質を吸引する磁気を発生させる磁気印加手段を設けたことを特徴とする請求項1記載の微生物分離装置。 In the through hole of the plate substrate, microorganism separation device according to claim 1, characterized in that a magnetic applying means for generating a magnetic for attracting the magnetic material.
  5. 試料水中に含まれる対象微生物を分離して回収する微生物分離装置において、 In a microorganism separation device for separating and recovering target microorganisms contained in the sample water,
    流体供給口および流体吸引口を含むフロー流路が内部に形成された平板基板と、平板基板の流体吸引口に設けられた複数の貫通孔からなる捕捉部とを有するマイクロチップと、 マイクロチップの流体吸引口側の面に設けられたメンブレンフィルタと、 A flat substrate having flow passages formed therein which includes a fluid supply port and a fluid suction port, a microchip having a catching portion including a plurality of through holes provided in the fluid suction port of the planar substrate, the microchip a membrane filter provided on the surface of the fluid suction port side,
    メンブレンフィルタのマイクロチップと反対側の面に設けられ、試料水を吸引する試料水吸引手段と、 Provided on a surface opposite to the microchip of the membrane filter, and the sample water suction means for sucking the water sample,
    平板基板の流体供給口に接続され試料水を供給する試料水供給手段と、 A sample water supply means for supplying a sample solution is connected to the fluid supply port of the planar substrate,
    を備えたことを特徴とする微生物分離装置。 Microorganism separating apparatus characterized by comprising a.
  6. マイクロチップの平板基板のフロー流路は流体排出口を有し、流体排出口にフロー流路を通過した試料水を回収し、再び試料水供給手段に戻す循環手段を接続したことを特徴とする請求項1乃至5のいずれか記載の微生物分離装置。 Flow passage of the flat substrate of the microchip having a fluid outlet, a sample water which has passed through the flow passage in the fluid outlet is recovered, characterized in that connecting the circulation means back into the sample water supply means microorganism separation device according to any one of claims 1 to 5.
  7. マイクロチップにエネルギーを印加する物理的印加手段を更に備えたことを特徴とする請求項1乃至6のいずれか記載の微生物分離装置。 Microorganism separation device according to any one of claims 1 to 6, further comprising a physical application means for applying energy to the microchip.
  8. マイクロチップのフロー流路に洗浄液を流すための洗浄液供給手段を更に備えたことを特徴とする請求項1乃至7のいずれか記載の微生物分離装置。 Microorganism separation device according to any one of claims 1 to 7, further comprising a cleaning liquid supply means for supplying a cleaning liquid to flow channel of the microchip.
  9. 試料水供給手段の前段に、マイクロチップに供給する試料水中に含まれる対象微生物及びその他の粒子を大きさで分画する分画処理手段を設けたことを特徴とする請求項1乃至8のいずれか記載の微生物分離装置。 In front of the sample water supply means, any of claims 1 to 8, characterized in that a fraction processing means for fractionating the target microorganisms and other particles contained in the sample water supplied to microchip size microorganism separation device according to any.
  10. サンプル水中の特定の対象微生物を分離・回収する微生物分離装置において、 In a microorganism separation device for separating and recovering a specific target microorganisms in the sample water,
    対象微生物より小さな孔径をもつ貫通孔が形成された板状のマイクロチップと、 A plate-shaped microchip through hole having a smaller pore size than the target microbes are formed,
    このマイクロチップの上面に配置され第1のフロー流路を有する第1の支持体と、マイクロチップの下面に配置され第2のフロー流路を有する第2の支持体とを備え、第1の支持体の第1のフロー流路と第2の支持体の第2のフロー流路はマイクロチップの貫通孔を介して互いに連通自在となっていることを特徴とする微生物分離装置。 Comprising a first support having a first flow passage is arranged on the upper surface of the microchip, and a second support having a second flow passage disposed on the lower surface of the microchip, the first first flow passage and the second flow passage of the second support microorganism separation device, characterized in that it freely communicate with each other through the through-hole of the microchip of the support.
  11. 第1の支持体の第1のフロー流路は外方へ開口する供給口を有し、第2の支持体の第2のフロー流路は外方へ開口する排出口を有することを特徴とする請求項10記載の微生物分離装置。 First flow passage of the first support member has a supply opening which opens outwardly, the second flow passage of the second support and wherein a discharge opening which opens outwardly microorganism separation device according to claim 10 wherein.
  12. マイクロチップの貫通孔はレーザー加工により形成されることを特徴とする請求項10または11記載の微生物分離装置。 Microchip of the through hole microorganism separation device according to claim 10 or 11, wherein the formed by laser processing.
  13. 第1および第2の支持体は、透明体から構成されることを特徴とする請求項10乃至12のいずれか記載の微生物分離装置。 First and second supports, a microorganism separation device according to any one of claims 10 to 12, characterized in that it is made of a transparent material.
  14. 対象微生物はクリプトスポリジウムであることを特徴とする請求項10乃至13のいずれか記載の微生物分離装置。 Target microorganism microbes separation device according to any one of claims 10 to 13 characterized in that it is a Cryptosporidium.
  15. 貫通孔の最狭部の孔径は2〜3μmとなることを特徴とする請求項10乃至14のいずれか記載の微生物分離装置。 Microorganism separation device according to any one of claims 10 to 14 pore size of the narrowest portion of the through hole is characterized in that a 2 to 3 [mu] m.
  16. マイクロチップの厚さは5〜50μmとなることを特徴とする請求項10乃至15のいずれか記載の微生物分離装置。 Microorganism separation device according to any one of claims 10 to 15 the thickness of the microchip is characterized in that a 5 to 50 [mu] m.
  17. マイクロチップに、マイクロチップを洗浄する物理的洗浄手段を設けたことを特徴とする請求項10乃至16のいずれか記載の微生物分離装置。 The microchip, microorganism separation device according to any one of claims 10 to 16, characterized in that a physical cleaning means for cleaning the microchip.
  18. マイクロチップに、マイクロチップに対して洗浄液を流すための洗浄液供給手段を接続したことを特徴とする請求項10乃至17のいずれか記載の微生物分離装置。 The microchip, microorganism separation device according to any one of claims 10 to 17, characterized in that connecting the washing liquid supply means for supplying a cleaning liquid against the microchip.
  19. 第1のフロー流路内面に親水化処理を施したことを特徴とする請求項10記載の微生物分離装置。 Microorganism separation device according to claim 10, characterized in that is subjected to hydrophilization treatment first flow passage inner surface.
  20. 第1の支持体の第1のフロー流路内面に対する親水化処理は、プラズマ処理を含むことを特徴とする、請求項19記載の微生物分離装置。 Hydrophilic treatment for the first flow passage inner surface of the first support, characterized in that it comprises a plasma treatment, a microorganism separation system according to claim 19, wherein.
  21. 第1の支持体の第1のフロー流路内面に対する親水化処理は、プラズマ処理と、プラズマ処理を施した後の陰イオン界面活性剤によるコーティング処理とを含むことを特徴とする、請求項20記載の微生物分離装置。 Hydrophilic treatment for the first flow passage inner surface of the first support, characterized in that it comprises a plasma treatment, and a coating treatment with anionic surfactant was subjected to a plasma treatment, claim 20 microorganism separation device according.
  22. 第1の支持体および第2の支持体は、ポリジメチルシロキサン(PDMS)からなることを特徴とした、請求項19記載の微生物分離装置。 First support and the second support was characterized by comprising a polydimethylsiloxane (PDMS), microorganism separation device according to claim 19, wherein.
  23. 藻類を除去する手段を更に備えたことを特徴とする請求項10記載の微生物分離装置。 Microorganism separation device according to claim 10, characterized in further comprising a means for removing the algae.
  24. 藻類を除去する手段は、酵素による溶解処理手段からなることを特徴とする、請求項23記載の微生物分離装置。 Means for removing the algae is characterized by comprising a dissolution treatment enzymatic means, microorganism separation device according to claim 23.
  25. 藻類を除去する手段は、酵素としてリゾチームを使用することを特徴とする、請求項24記載の微生物分離装置。 Means for removing the algae is characterized by the use of lysozyme as an enzyme, a microorganism separation system according to claim 24, wherein.
  26. 藻類を除去する手段は、酵素としてプロテアーゼを使用することを特徴とする、請求項24記載の微生物分離装置。 Means for removing the algae is characterized by the use of protease as an enzyme, a microorganism separation system according to claim 24, wherein.
  27. 藻類を除去する手段の酵素による溶解処理は、リゾチームとプロテアーゼの混合溶液による処理からなることを特徴とする、請求項24記載の微生物分離装置。 Dissolution treatment with the enzyme of the means for removing the algae, characterized by comprising the treatment with a mixed solution of lysozyme and protease, microbial separation apparatus of claim 24, wherein.
  28. マイクロチップに酵素液を供給するための酵素液供給手段を接続したことを特徴とする、請求項24記載の微生物分離装置。 Characterized in that connecting the enzyme solution supply means for supplying enzyme solution into the microchip, microorganism separation device according to claim 24, wherein.
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