JP2007043997A - New kit for amplifying target nucleic acid - Google Patents

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Inventor
Naoto Nakajima
直人 中島
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Tosoh Corp
東ソー株式会社
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Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a kit for amplifying and detecting a target nucleic acid, improved so as to shorten a required time for analyzing the target nucleic acid including a time for preparing reagents. <P>SOLUTION: This kit for amplifying and detecting the target nucleic acid comprises a reagent of a solid state and a reagent of a liquid state, wherein the reagent of the solid state is formed so that a part or all of a reagent component necessary for amplifying the target nucleic acid including an oligonucleotide primer comprising an analytical item-specific component is preliminarily made to be the solid state and the reagent of the liquid state comprises a constituent formed into a reagent constitution by which the amplification of the target nucleic acid is started by dissolving the reagent of the solid state therein. Therefore, the time necessary for preparing the reagents for amplifying the target nucleic acid by an experimenter is shortened and further a required time for obtaining a result of the analysis is shortened. <P>COPYRIGHT: (C)2007,JPO&INPIT

Description

本発明は、分子生物学の分野に属するものであり、特定塩基配列を含む標的核酸の増幅試薬に関するものである。 The present invention belongs to the field of molecular biology, it relates to the amplification reagent of the target nucleic acid containing a specific nucleotide sequence. 本発明は遺伝子診断等の臨床診断分野での利用に有用であり、さらには、食品中、室内、土壌中、河川中、海洋中等の環境中の微生物の定性又は定量を行う際に有用である。 The present invention is useful for use in the clinical diagnostic field of genetic diagnosis and the like, and further, in the food, room, soil, rivers, useful in performing qualitative or quantitative determination of microorganisms in marine secondary environment .

一般的に、感染症の遺伝子診断では、臨床試料中の標的核酸(ウィルスや微生物由来)が極微量なことが多いため、高感度かつ良好な再現性の測定を実現するために、信号強度を向上し高感度化する目的で、標的核酸(DNAまたはRNA)を増幅する方法がとられる。 Generally, the genetic diagnosis of infectious diseases, for the target nucleic acid in clinical samples (from viruses and microorganisms) that is very small amount often, in order to realize highly sensitive measurement and good reproducibility, the signal strength with improved purpose of increasing sensitivity, a method of amplifying a target nucleic acid (DNA or RNA) is taken.

標的DNAを増幅する方法として、ポリメレースチェーンリアクション(PCR)法が知られている。 As a method of amplifying a target DNA, Polymerase chain reaction (PCR) method is known. 標的RNAの増幅法としては、RT−PCR法、NASBA法(特許文献1および2、非特許文献1および2参照)、3SR法(特許文献3、非特許文献3参照)、TRC法(特許文献4、非特許文献4参照)などが知られている。 The amplification methods of the target RNA, RT-PCR method, NASBA method (Patent Documents 1 and 2, see Non-Patent Documents 1 and 2), 3SR method (see Patent Document 3, Non-Patent Document 3), TRC method (Patent Documents 4, such as a non-Patent Document 4) is known. RT−PCRは基本的に逆転写(RT)とPCRの独立した2段階の工程が必要であり、一方、NASBA法や3SR法、およびTRC法では、RNA増幅産物の方向性および増幅機構に若干の違いがあるものの、概ね以下に示した一段階のRNA増幅反応だと言える。 RT-PCR is required essentially reverse transcription (RT) and PCR of independent two steps, whereas, NASBA method and 3SR method, and the TRC method, slightly direction and amplification mechanism of RNA amplification products despite differences of, it says that it is one step of the RNA amplification reaction shown generally below.

一段階のRNA増幅反応は、まず標的RNAを鋳型とし、プロモーター配列を含むプライマー、逆転写酵素、及びリボヌクレエースHにより、プロモーター配列を含む2本鎖DNAが合成され、該2本鎖DNAを鋳型としてRNAポリメレースにより標的RNAの特定塩基配列を含むRNAを合成し、該RNAが引き続きプロモーター配列を含む2本鎖DNA合成の鋳型となる連鎖反応を行うものである。 RNA amplification reaction one step, first the target RNA as a template, a primer containing a promoter sequence, reverse transcriptase, and the ribonuclease H, a double-stranded DNA containing a promoter sequence is synthesized, the double-stranded DNA the RNA polymerase synthesizes an RNA containing a specific base sequence of a target RNA as a template, and performs chain reaction becomes a double-stranded DNA synthesis template containing the RNA continues promoter sequences. このようなRNAの増幅法は、一定温度、一段階での増幅反応であるため、自動化へ適用が容易であり、臨床現場での遺伝子診断法として有用性が非常に高い。 Amplification methods such RNA, since a constant temperature, an amplification reaction in one step, is easily applied to automation, it is very highly useful as a gene diagnostic methods in clinical practice. また、比較的迅速な標的核酸増幅反応であるため、緊急度の高い検査への対応が期待されている。 Further, since a relatively rapid target nucleic acid amplification reaction, the corresponding is expected to urgent inspection.

市販されている、標的核酸の増幅を実施するための検査キットには、標的核酸増幅の原料となるモノヌクレオチド(NTPやdNTP、およびITPなど)やオリゴヌクレオチド(プライマーなど)、標的核酸増幅に必要な無機塩類、および逆転写酵素、DNAポリメレースやRNAポリメレースなどの酵素類、さらに、増幅反応を最適化するために添加される物質(例えばジメチルスルフォキシド(DMSO)、ソルビトールなど)が適当に小分けされた状態で構成されている。 Are commercially available, the test kit for carrying out the amplification of the target nucleic acid, mononucleotide (NTP and dNTPs, and ITP, etc.) as a raw material of a target nucleic acid amplification or oligonucleotide (primer etc.), needed for target nucleic acid amplification enzymes such inorganic salts, and the reverse transcriptase, such as DNA polymerase or RNA polymerase, additionally, substances added to optimize amplification reactions (such as dimethyl sulfoxide (DMSO), sorbitol, etc.) suitably aliquoted and it is configured in a state of being.

たとえば株式会社カイノスから発売されているNASBA Amplificationキットにおいては、測定者が準備する2種類のプライマーをトリス緩衝液とDMSOからなるNASBA溶解液に添加し、固体状態のNASBA試薬(dNTP、NTP)を溶解し、標的RNAの有無を測定する試料数と同数の反応容器へ分注する。 For example, in the NASBA Amplification kit sold by Ltd. Kainos was added 2 kinds of primers measurer prepared NASBA lysis solution consisting of Tris buffer and DMSO, NASBA reagents (dNTPs, NTP) solid state lysed and dispense the sample as many reaction vessels to measure the presence or absence of the target RNA. 次に、各反応容器へサンプルを添加し、所定の温度条件下でインキュベートする。 The samples were then added to each reaction vessel and incubated at a given temperature conditions. その間、固体状態のNASBA酵素試薬をヌクレエースフリー水に溶解し、溶解した酵素溶液を各反応容器へ添加する。 Meanwhile, to dissolve the NASBA enzyme reagent in the solid state to the j Kure Ace-free water, adding the dissolved enzyme solution to each reaction vessel. 以上の操作をもって、RNA増幅が開始される。 Through the above operations, RNA amplification is started.

一方、東ソー株式会社から発売されているTRC遺伝子検査システムの試薬キットは、基質試薬とプライマー試薬を適当量混合し試薬ミックスを調整し、調整した試薬ミックスを標的RNAの有無を測定する試料数と同数の反応容器に分注し、各反応容器へサンプルを添加後、所定温度条件下でインキュベートする。 On the other hand, a reagent kit TRC genetic test systems that are available from Tosoh Corporation, a substrate reagent and the primer reagent to adjust the appropriate amount mixed reagent mix, the number of samples the reagent mix was adjusted to measure the presence or absence of the target RNA dispensed into the same number of reaction vessel, after addition of the sample to each reaction vessel and incubated at a predetermined temperature condition. 最後に、反応容器と共に所定温度条件下でインキュベートした酵素試薬を、該反応容器へ一定量ずつ添加する。 Finally, the incubated enzyme reagent at a predetermined temperature conditions along with the reaction vessel, added by a predetermined amount into the reaction vessel. 以上の操作をもって、RNA増幅が開始される。 Through the above operations, RNA amplification is started.

特許第3241717号 Patent No. 3241717 特許第2650159号 Patent No. 2650159 特許第3152927号 Patent No. 3152927 特開2000−14400号公報 JP 2000-14400 JP

実際に核酸増幅を実施する際には、核酸増幅に至るまでの試薬の調製にある程度の時間を要する。 In carrying out the actual nucleic acid amplification takes some time for the preparation of the reagents up to a nucleic acid amplification. また、精度の高いピペットを用い微量の試薬を正確に測り取ることが必要であり、ある程度の熟練が必要な操作を要求する。 Further, it is necessary to take accurately measure the reagents traces with high accuracy pipette requires a degree of skill is required operations. たとえば上記した市販されている標的核酸の検査キットにおいては、測定する試料数が多くなるほどに、試薬ミックスの分注やサンプルの添加、および酵素試薬の添加の所要時間が増大し、RNA増幅反応の開始に至るまでの所要時間が長くなるという問題がある。 For example, in the test kit of the target nucleic acid on the market described above, the higher the number of samples to be measured is increased, the addition of the dispensing samples and reagents mix, and required time is increased the addition of enzyme reagent, the RNA amplification reaction there is a problem that the time required until the start becomes longer.

実際に10個の試料を測定するためのRNA増幅試薬の調製には、熟練度と準備の差異に依存するものの、概ね20分から30分程度の時間を要する。 In fact the preparation of RNA amplification reagents for measuring the 10 samples, but depends on the difference preparation and skill, generally 20 minutes takes about 30 minutes time. RNA増幅反応自体は比較的迅速な反応であるため、増幅に要する時間は早い場合30分程度であるが、試薬の調製に同等の時間を要するため、全体としての検査所要時間は早くとも1時間程度である。 For RNA amplification reaction itself is a relatively rapid reaction, but the time required for amplification is faster when about 30 minutes, it takes a comparable time in the preparation of the reagent, 1 hour at the earliest the inspection required time as a whole it is the degree.

検査開始から結果の判定までの時間が制約されている場合、特に、手術開始後に患者の検査の必要性が生じた場合には、検査所要時間は短いほど好ましい。 If the time from the test start until the determination result is constrained, particularly, when the needs of the patient examination occurred after starting surgery, the inspection time required shorter preferable. そのため、増幅試薬の調製が従来よりも容易で、かつ迅速な検査が可能となる標的核酸の増幅キットの登場が望まれている。 Therefore, easy preparation of amplification reagents than conventional, and the advent of rapid amplification kit of the target nucleic acid is possible inspection is desired.

また、検査所要時間の短縮を目的に、核酸増幅試薬をあらかじめ用意しておき、検査の必要性が生じた場合に使用することが考えられるが、必要性がなかった場合は高価な試薬類が無駄となり、また、保険の浪費に繋がり好ましくない。 Further, for the purpose of shortening the inspection time required prepares a nucleic acid amplification reagent in advance, it is conceivable to use when the need for testing occurs, if there was no need for expensive reagents wasted, also, undesirable leads to a waste of insurance.

本発明者は上記課題を解決するべく鋭意研究を重ねた結果、試料中の標的核酸と、標的核酸の増幅に必要な試薬成分の一部が1つの容器に固体状態で入っている固体状態の試薬と、標的核酸の増幅に必要な残りの試薬成分が1つの容器に液体状態で入っている液体状態の試薬とを混合することで固体状態の試薬が溶解して標的核酸の増幅反応を実施することで、核酸増幅試薬の調製にかかる時間を大幅に短縮可能であることを見出した。 The present inventors have result of intensive studies to solve the above problem, a target nucleic acid in a sample, a solid state in which a part of the reagent components necessary for amplification of the target nucleic acid is in a solid state into one container implementation and reagents, the amplification reaction of the dissolved reagent in a solid state target nucleic acids by the remaining reagent components necessary for amplification of target nucleic acid is mixed with a reagent of being liquid state enters in the liquid state into one container doing, it was found that the time required for preparation of nucleic acid amplification reagents that are significantly be shortened. これにより、緊急度の高い検査においても迅速に結果の判定が可能となり、臨床現場におけるRNA増幅反応の有用性が向上した。 Thus, also it becomes possible to determine rapidly results in urgent test the usefulness of the RNA amplification reaction in clinical practice has been improved.

以下、本発明を詳細に説明する。 The present invention will be described in detail.

本発明は、さらなる迅速性や簡便性が要求されている核酸検査における、標的核酸の増幅試薬の調製に要する時間を短縮させることが可能な試薬構成である標的核酸の増幅キットに関するものであり、核酸増幅反応の種類に特に限定されない。 The present invention, in the nucleic acid test further rapidity and simplicity is required, relates to amplification kit of the target nucleic acid is possible reagent configuration to reduce the time required for preparation of the amplification reagent of the target nucleic acid, no particular limitation on the type of nucleic acid amplification reactions. たとえばPCR法、RT−PCR法、TRC法、NASBA法、または3SR法などが例示できる。 For example the PCR method, RT-PCR method, TRC method, a NASBA method, or 3SR method can be exemplified. これらの核酸増幅法の中でも、TRC法、NASBA法および3SR法については増幅反応の開始から一定温度であり、増幅反応の初期に高温にする必要がないため、高温で活性が低下するような酵素を後から添加する必要がなく、本発明に適した増幅反応である。 Among these nucleic acid amplification method, TRC method, a constant temperature from the start of the amplification reaction for NASBA method and 3SR method, the beginning of the amplification reaction need not be a high temperature, enzymes such as activity decreases at higher temperatures there is no need to add later, it is an amplification reaction suitable for the present invention.

本発明の試料は特に限定されないが、臨床診断分野における感染症や病態の検査に本発明を使用する場合には、血液、血清、血漿、組織、その他の体液などの検体が例示できる。 While samples of the present invention is not particularly limited, when using the present invention in an infectious challenge and pathology in clinical diagnostic field, blood, serum, plasma, tissue, the specimen such as other body fluids can be exemplified. また、食品中、室内、土壌中、河川中、海洋中などからの抽出物を試料とすることで、環境中のウイルスや微生物の定性又は定量に本発明を使用することも可能である。 Further, in the food, room, soil, rivers, extracts from such in the ocean by a sample, it is also possible to use the invention for the qualitative or quantitative determination of viruses and microorganisms in the environment.

本発明の標的核酸の増幅に必要な試薬成分とは、増幅反応の基質となるモノヌクレオチド(dNTP、NTPおよびITPなど)を含む基質試薬、標的核酸またはその相補鎖の配列に相補的結合が可能な配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーやオリゴヌクレオチドプローブなどを含むプライマー試薬および増幅反応の触媒となる逆転写酵素、DNAポリメレース、RNAポリメレースやその他の酵素(リボヌクレースHなど)を含む酵素試薬からなる。 The reagent components necessary for amplification of target nucleic acids of the present invention, mononucleotide which is a substrate for the amplification reaction substrate reagent containing (dNTPs, such as NTP and ITP), allows complementary binding to the sequence of the target nucleic acid or its complementary strand reverse transcriptase as the catalyst of the primer reagent and amplification reactions, including oligonucleotide primers and oligonucleotide probes containing Do sequence, DNA polymerase, made of enzyme reagent containing RNA polymerase and other enzymes (Ribonukuresu H, etc.). また、基質試薬、プライマー試薬および酵素試薬にはそれぞれ、核酸増幅反応を最適化するためや試薬の安定性を高めるため、増幅産物の検出をするためなどのその他の試薬(各種無機塩類、DMSO、ソルビトール、インヒビター、DTT、検出プローブなど)が含まれていても良い。 Further, substrate reagent, each of the primer reagent and enzyme reagent, to increase the stability of and reagents for optimizing nucleic acid amplification reaction, other reagents (various inorganic salts, such as for the detection of amplification products, DMSO, sorbitol, inhibitors, DTT, etc. detection probes) may be included. この標的核酸の増幅に必要な試薬成分を構成する固体状態の試薬および液体状態の試薬と、試料中の標的核酸を混合することで、増幅反応が開始される。 And the reagent of the reagent and the liquid state of the solid state which constitutes the reagent components necessary for amplification of the target nucleic acid, by mixing the target nucleic acid in a sample, the amplification reaction is initiated.

本発明の固体状態の試薬の成分は、標的核酸の増幅に必要な試薬成分の一部または全部を含んでいても良く、含まれる試薬の種類や数には限定されない。 Components of the reagent in the solid state of the present invention may include some or all of the reagent components necessary for amplification of the target nucleic acid, the type and number of reagents including but not limited. したがってたとえば、基質試薬の一部を固体状態の試薬とし、残りの一部を液体状態の試薬として容器に入れていても良い。 Thus, for example, a portion of the substrate reagent and the reagent in the solid state, may be placed in a container a portion of the remaining as a reagent in the liquid state. また各試薬成分は液体状態の試薬および固体状態の試薬の両方に含まれていても良く、特にその他の試薬のうち、試薬の安定性を向上させるという目的のために添加されているものに関しては、液体状態の試薬および固体状態の試薬の両方に含まれることで効果的となることもある。 And each reagent component may be contained in both the reagent in the reagent and solid in liquid state, in particular of other reagents, with respect to what has been added for the purpose of improving the stability of the reagents to be an effective by being included in both the reagent in the reagent and a solid state in a liquid state. また好ましい態様としては、検査項目に特異的な成分の全部を、固体状態の試薬に含ませておくことにより、試薬の取り違えによる誤診の可能性の低減が期待される。 As a preferred embodiment, all of the specific components to the inspection item, by previously contained in the reagent in the solid state, reducing the possibility of misdiagnosis by misidentification of the reagent is expected. たとえば、検査項目に特異的であるプライマー試薬を、固体状態の試薬に含ませておくことで、測定する試料と固体状態の試薬を正しく組み合わせれば、液体状態の試薬は検査項目に依存せず広く使用できる試薬とすることが可能な場合、試薬の取り違えの可能性が低減することとなる。 For example, the primer reagent is specific to the inspection item, by leaving included in the reagent in the solid state, by combining the reagent sample and a solid state measuring correctly reagent in the liquid state is not dependent on the test item If it is possible to widely use reagents, so that the possibility of mix-up of the reagent is reduced. また、液体状態の試薬についてはその保存性から冷凍保存(−20℃以下)が望ましいが、試薬を固体状態にすることで常温保存が可能となる。 Furthermore, it is frozen from its storage stability for reagents in the liquid state (-20 ° C. or less) it is desirable, it is possible to cold storage by the reagents to the solid state. したがって、凍結融解により安定性が損なわれる試薬成分が含まれる場合は、その試薬成分を固体状態の試薬とすることが好ましい。 Therefore, if it contains reagent components for stability is impaired by the freeze-thaw, it is preferable that the reagent components and the reagent in the solid state.

本発明の固体状態の試薬は常温で固体であり、液体状態の試薬は常温で液体であることを特徴とする。 Reagent solid state of the present invention are solid at room temperature, the reagent in the liquid state is characterized in that it is a liquid at room temperature. また固体状態の試薬における固体化の方法は特に限定されないが、液体状態の試薬と混合されることで迅速に溶解することが好適であるため、試薬成分が風乾、真空乾燥または凍結乾燥したものであることが好ましい。 The method of solidification in the reagent in a solid state is not particularly limited, since it is preferable to rapidly dissolving by being mixed with the reagent in the liquid state, in which the reagent component air-dried, and vacuum dried or freeze-dried there it is preferable. さらに試薬の固体化を反応容器中で行うことで、反応容器に固体状態の試薬が密着し、実験者の操作をより簡便とすることが可能となる。 Furthermore by performing the solidification of the reagents in the reaction vessel, the reagent in the solid state in the reaction vessel is in close contact, it is possible to more simplify the operation of the experimenter. 一方、試薬成分に増粘剤などを添加したり圧縮したりすることで錠剤とすることも例示できる。 On the other hand, it can also be exemplified be tablets or to compress or the like is added thickeners reagent components. なお、固体化により酵素試薬の活性が低下するような場合には、酵素試薬を液体状態の試薬とすることが例示できる。 Incidentally, in the case such that decrease the activity of the enzyme reagent by solidification, can be exemplified by the enzyme reagent and the reagent in the liquid state.

本発明の標的核酸の増幅キットまたは標的核酸の検出キットは、実験者が試薬調製に要する時間を減少させる目的では、必要量の固体状態の試薬があらかじめ反応容器に入った状態のキットであることが好ましく、そのためにキットの製造過程において反応容器に固体状態の試薬の原料を分注後、適当な方法で固体状態とすることとなる。 It kit for detecting amplification kit or target nucleic acid of a target nucleic acid of the present invention, in order to reduce the time experimenter required for reagent preparation, reagent in the solid state required amount is kit state entered on the reaction vessel It is preferred, so that the dispensing after the material of the reagent in the solid state in the reaction vessel in the process of manufacturing the kit for its, a solid state in a suitable manner to. また、固体状態の試薬があらかじめ反応容器に入っていなくても、各反応容器に速やかに入れられるような固体状態、例えば、錠剤のように固体状態の試薬が個別包装された形態で提供することによっても、実験者の試薬調製の所要時間を短縮する効果がある。 Also, the reagents in the solid state is not entered on the reaction vessel, quickly placed is such a solid state to the reaction vessel, for example, be provided with a reagent in the solid state is individually packaged form as tablets as well, the effect of shortening the time required for reagent preparation experimenter.

一方、本発明の液体状態の試薬は、基本的には固体状態の試薬と補完的であり、液体状態の試薬および固体状態の試薬と、試料中の標的核酸が混合されることにより標的核酸増幅が開始されうる成分を含むものである。 On the other hand, the reagent in the liquid state of the present invention is basically complementary with the reagent in the solid state, the target nucleic acid amplification by the reagent of the reagent and a solid state in a liquid state, the target nucleic acid in the sample is mixed There is intended to include components that may be initiated. たとえば、固体状態の試薬に標的核酸の増幅に必要な成分の全部が含まれている場合、液体状態の試薬は必要なく、実験者が標的核酸を含む試料または適宜希釈して調製した試料を固体状態の試薬と混合し、標的核酸の増幅反応を開始することとなる。 For example, if it contains all the components required for amplification of the target nucleic acid to the reagent in the solid state, the reagent in the liquid state is not required, the experimenter was prepared by diluting the sample or appropriately containing the target nucleic acid sample solid mixed with state of the reagent, and thus to initiate the amplification reaction of the target nucleic acid. したがって、固体状態の試薬に標的核酸の増幅に必要な成分の全部が含まれている場合は、固体状態の試薬のみで本発明の増幅キットを構成することもできるし、固体状態の試薬および試料希釈用の希釈液から構成することもできる。 Thus, if the reagent in the solid state contains all the components required for amplification of the target nucleic acid may constitute a amplification kit of the present invention only in the reagent in the solid state, the reagent in the solid state and the sample It may be configured from the diluent for dilution. また、固体状態の試薬がプライマー試薬のみからなる場合、液体状態の試薬の成分は酵素試薬、基質試薬およびその他の試薬から構成され、実験者は試料を液体状態の試薬と混合した後に固体状態の試薬と混合することで固体状態の試薬を溶解させたり、または、試料で固体状態の試薬を溶解後、液体状態の試薬と混合するなどの方法を行うこととなる。 Also, when the reagent in the solid state are composed of only the primer reagents, component enzyme reagent of the reagent in the liquid state, is constituted from a substrate reagent and other reagents, experimenters solid state samples after mixing with reagents in the liquid state or dissolve the reagent in the solid state by mixing with the reagent, or, so that the conducted after dissolving the reagent in solid state at sample, a method such as mixing the reagent in the liquid state.

さらに、本発明は、標的核酸の増幅に伴い蛍光特性が変化するように設計された検出プローブを固体状態の試薬または液体状態の試薬のどちらか一方、または両方にあらかじめ添加しておくことにより、標的核酸増幅のリアルタイムな測定が可能となるため、検査結果を迅速に得る目的としては非常に有効である。 Furthermore, the present invention is, by previously added in advance to either one or both, of the reagent or reagents in the liquid state of the designed detection probes solid state as fluorescence properties due to amplification of the target nucleic acid changes, since it is possible to real-time measurement of target nucleic acid amplification, it is very effective for the purpose of obtaining test results quickly. 使用する検出プローブは特に限定はされないが、標的核酸の増幅産物と相補的2本鎖を形成可能な核酸プローブとインターカレーター性蛍光色素、もしくは、インターカレーター性蛍光色素を標識した核酸プローブで、かつ標的核酸と形成した相補的2本鎖部分に前記インターカレーター性蛍光色素部分がインターカレートすることによって蛍光特性が変化するように設計された核酸プローブを例示することができる。 While detection probes to be used is not particularly limited, the amplification product and can form a complementary double-stranded nucleic acid probe and the intercalating fluorescent dye of the target nucleic acid, or labeled nucleic acid probe intercalating fluorescent dye, and it can be exemplified a nucleic acid probe designed to fluorescence properties change by the intercalating fluorescent dye moiety complementary double-stranded portion formed with the target nucleic acid is intercalated.

本発明により、標的核酸の増幅反応のための試薬の調製方法が簡便化され、試薬調製を含めた分析所要時間を短縮することが可能となった。 The present invention, process for the preparation of reagents for the amplification reaction of the target nucleic acid is simplified, it becomes possible to shorten the time required for analysis, including reagent preparation. それにより、迅速性が要求される場面における標的核酸の増幅反応の有用性が向上した。 Thus, the utility of amplification reactions of target nucleic acid in a scene where rapidity is required is improved. さらに、プライマー試薬のような分析項目特異的な成分を、あらかじめ固体状態で反応容器に入れておくことにより、操作が簡便化され実験者による実験誤差の発生を最小限に抑えることが可能である標的核酸の増幅キットおよび標的核酸の検出キットを提供した。 Furthermore, the analysis items specific components, such as primers reagents, by previously placed in a reaction vessel in advance the solid state, it is possible to minimize operation the generation of experimental error due to simplified by the experimenter It provided the amplification kit and detection kit of the target nucleic acid of a target nucleic acid.

また、本発明では標的核酸の増幅に必要な試薬成分の一方を固体状態にすることで、凍結融解を繰り返すことで不安定となる試薬を安定して保存することが可能となった。 Also, one of the reagent components necessary for amplification of target nucleic acid in the present invention by a solid state, it becomes possible to stably store a reagent unstable by repeating freezing and thawing. また、固体状態の試薬は常温保存が可能となり、輸送や保存の際にも取り扱いが容易となる。 The reagent in the solid state enables stored at room temperature, it becomes easy to handle during shipping and storage. さらに固体状態の試薬は錠剤として使用したり反応容器に密着させて使用したりすることができるため、実験者の操作性をより簡便にし、さらなる分析所要時間の短縮に貢献している。 Reagent addition the solid state it is possible or used in close contact to the reactor or used as a tablet, and more convenient manipulation of the experimenter, contributing to further shorten the time required for analysis.

以下、実施例を用いてさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。 Will be described in more detail with reference to Examples, but the present invention is not limited thereto.

実施例1 固体状態の試薬を用いたTRC反応における検査所要時間の評価 (1)使用した標準RNAは、mecA(メチシリン耐性黄色ブドウ球菌の細胞壁合成酵素PBP2'遺伝子配列(非特許文献5参照)を含む2183塩基のRNA)、およびVT2(大腸菌O−157のベロ毒素2型遺伝子配列(非特許文献6参照)を含む1361塩基のRNA)である。 Standard RNA was evaluated (1) the use of the inspection required time of TRC reaction with a reagent of Example 1 the solid state, mecA (cell wall synthesis of methicillin-resistant Staphylococcus aureus enzyme PBP2 'gene sequence (see Non-Patent Document 5) 2183 nt RNA containing), and VT2 (verotoxin type 2 gene sequence of E. coli O-157 (see non-Patent Document 6) 1361 nt RNA containing). これらの配列の標準RNAをRNA希釈液(10mM Tris−HCl (pH8.0)、0.1mM EDTA、1mM DTT、0.5U/μl RNase Inhibitor)で1000コピー/5μlになるように調製しRNA試料とした。 The standard RNA of these sequences RNA diluent (10mM Tris-HCl (pH8.0), 0.1mM EDTA, 1mM DTT, 0.5U / μl RNase Inhibitor) at 1000 copies / 5 [mu] l to become so prepared RNA samples and the.

(2)本実施例中に記載されているオリゴヌクレオチドの塩基配列は以下の通りである。 (2) the nucleotide sequence of the oligonucleotides described in this example are as follows. 第一のオリゴヌクレオチド(T7RNAポリメレース・プロモーター配列含有センスプライマー) The first oligonucleotide (T7RNA polymerase promoter sequence-containing sense primer)
mecA用:配列表の配列番号1に記載のもの VT2用:配列表の配列番号2に記載のもの第二のオリゴヌクレオチド(アンチセンスプライマー) mecA for: for VT2 as described in SEQ ID NO: 1: as set forth in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing second oligonucleotide (antisense primer)
mecA用:配列表の配列番号3に記載のもの VT2用:配列表の配列番号4に記載のもの第三のオリゴヌクレオチド(3'末端をアミノ基修飾) For mecA: for VT2 as described in SEQ ID NO: 3: the third oligonucleotide (3 'terminal amino group qualify) as set forth in SEQ ID NO: 4 in Sequence Listing
mecA用:配列表の配列番号5に記載のもの VT2用:配列表の配列番号6に記載のもの第四のオリゴヌクレオチド(増幅RNA検出用インターカレーター標識プローブ(プローブの構造は非特許文献7に従った)) For mecA: for VT2 as described in SEQ ID NO: 5: Structure of the fourth oligonucleotide (amplified RNA detection intercalator-labeled probe (probe as set forth in SEQ ID NO: 6 in the Sequence Listing in Non-Patent Document 7 follow the))
mecA用:配列表の配列番号7に記載の配列中の5'末端から6番目の塩基(G)と7番目の塩基(A)の間のリン原子に、インターカレーター性蛍光色素としてオキサゾールイエローを標識したもの VT2用:配列表の配列番号8に記載の配列中の5'末端から12番目の塩基(T)と13番目の塩基(A)の間のリン原子に、インターカレーター性蛍光色素としてオキサゾールイエローを標識したもの (3)以下の組成のmecA、VT2増幅用試薬溶液それぞれ5μlを、0.5ml容PCRチューブ(GeneAmp Thin−Walled Reaction Tubes、パーキンエルマー製)に10本づつ分注し、該PCRチューブごと凍結乾燥して固体状態の試薬を調製した。 For mecA: the phosphorus atom between the sixth base from the 5 'end of the sequence set forth in SEQ ID NO: 7 (G) and 7 th base (A), the oxazole yellow as intercalating fluorescent dye labeled ones for VT2: to the phosphorus atom between the 12th base from the 5 'end of the sequence set forth in SEQ ID NO: 8 of the sequence Listing (T) and 13 th bases (a), as intercalating fluorescent dye those labeled oxazole yellow (3) the following mecA, VT2 amplification reagent solution each 5μl of composition, 0.5 ml volume PCR tube (GeneAmp Thin-Walled Reaction tubes, Perkin Elmer) dispensed ten increments amount to, reagents were prepared in the solid state and lyophilized by the PCR tube.

固体状態試薬の組成(各濃度は最終反応液量30μlにおける濃度) The composition of the solid state reagent (each concentration concentration in the final reaction volume 30 [mu] l)
各0.25mMのdATP、dCTP、dGTP、dTTP each of dATP 0.25mM, dCTP, dGTP, dTTP
3.6mM ITP 3.6mM ITP
各3.0mMのATP、CTP、GTP、UTP Each of ATP 3.0mM, CTP, GTP, UTP
1.0μMの第一のオリゴヌクレオチド1.0μMの第二のオリゴヌクレオチド0.16μMの第三のオリゴヌクレオチド25nMの第四のオリゴヌクレオチド (4)以下の組成のmecA、VT2増幅用試薬溶液それぞれ280μlを、0.5ml容PCRチューブ(GeneAmp Thin−Walled Reaction Tubes、パーキンエルマー製)に1本づつ分注し、液体状態試薬を調製した。 The first oligonucleotide 1.0μM of 1.0μM second oligonucleotide 0.16μM of the third mecA the fourth oligonucleotide (4) the following composition of the oligonucleotides 25 nM, VT2 amplification reagent solutions respectively 280μl the, 0.5 ml volume PCR tube (GeneAmp Thin-Walled Reaction tubes, Perkin Elmer) dispensed one by one minute to to prepare a liquid state reagent.

液体状態試薬の組成(各濃度は最終反応液量30μlにおける濃度) The composition of the liquid state reagent (each concentration concentration in the final reaction volume 30 [mu] l)

3で調製した固体状態の試薬と4で調製した液体状態の試薬で構成した試薬のセットを、本発明における簡易型RNA検査キット(図1)として使用する。 The set of reagents composed of the reagent in the liquid state, prepared by the reagent in the solid state prepared by 3 and 4, used as a simplified RNA test kit (Figure 1) in the present invention.

(5)以下の組成のmecA、VT2増幅用試薬溶液それぞれ110μlを、0.5ml容PCRチューブ(GeneAmp Thin−Walled Reaction Tubes、パーキンエルマー製)に1本づつ分注し、基質試薬を調製した。 (5) the mecA, VT2 amplification reagent solution each 110μl of the following composition, 0.5 ml volume PCR tube (GeneAmp Thin-Walled Reaction Tubes, Perkin Elmer) dispensed one by one minute to to prepare a substrate reagent.

基質試薬の組成(各濃度は最終反応液量30μlにおける濃度) The composition of the substrate reagent (each concentration concentration in the final reaction volume 30 [mu] l)

(6)以下の組成のmecA、VT2増幅用試薬溶液それぞれ110μlを、0.5ml容PCRチューブ(GeneAmp Thin−Walled Reaction Tubes、パーキンエルマー製)に1本づつ分注し、プライマー試薬を調製した。 Of (6) the following composition mecA, VT2 amplification reagent solutions respectively 110 [mu] l, 0.5 ml volume PCR tube (GeneAmp Thin-Walled Reaction Tubes, Perkin Elmer) dispensed one by one minute to to prepare a primer reagent.

プライマー試薬の組成(各濃度は最終反応液量30μlにおける濃度) Composition of the primer reagent (each concentration concentration in the final reaction volume 30 [mu] l)

(7)以下の組成のmecA、VT2増幅用試薬溶液それぞれ60μlを、0.5ml容PCRチューブ(GeneAmp Thin−Walled Reaction Tubes、パーキンエルマー製)に1本づつ分注し、酵素試薬を調製した。 (7) the mecA, VT2 amplification reagent solution each 60μl of the following composition, 0.5 ml volume PCR tube (GeneAmp Thin-Walled Reaction Tubes, Perkin Elmer) dispensed one by one minute to to prepare an enzymatic reagent.

酵素試薬の組成(各濃度は最終反応液量30μlにおける濃度) Composition of Enzyme Reagent (each concentration concentration in the final reaction volume 30 [mu] l)

5、6、7で調製した試薬のセットを、従来型RNA検査キット(図2)として使用する。 The set of reagents prepared in 5,6,7, used as conventional RNA test kit (Figure 2).

(8)簡易型RNA検査キットのmecA増幅用固体状態試薬が入った10本のPCRチューブに、mecA標準RNAをそれぞれ5μlづつ添加し、mecA増幅用液体状態試薬が入ったPCRチューブと共に44℃で5分間保温後、液体状態試薬の25μlを標準RNAが添加された固体状態試薬のPCRチューブにそれぞれ分注した。 (8) to ten PCR tubes containing the mecA amplification solid state reagent simplified RNA test kit, were added, respectively 5μl increments the mecA standard RNA, at 44 ° C. with PCR tube containing mecA amplification liquid state reagent after incubation for 5 minutes, was dispensed each fraction into PCR tubes in the solid state reagents of 25μl of liquid state reagent standard RNA were added. 同様の操作を、VT2においても実施した。 The same operation was also performed at VT2.

(9)引き続きPCRチューブを44℃で保温しながら、蛍光強度の変化をモニターした。 (9) while continuing kept PCR tubes at 44 ° C., and monitoring the change in fluorescence intensity.

(10)従来型RNA検査キットのmecA増幅用の基質試薬とプライマー試薬を、それぞれ105μlづつ量り取り、混合して210μlの試薬ミックスを調製し、0.5ml容PCRチューブの10本に20μlづつ分注した。 (10) the substrate reagent and the primer reagent of mecA for amplification of conventional RNA test kits, respectively 105μl increments weighed and mixed to prepare a reagent mix 210 .mu.l, 20 [mu] l increments amount to ten 0.5ml volume PCR tubes It was dispensed. 該PCRチューブのそれぞれに、mecA標準RNAの5μlを添加した。 Each of the PCR tubes was added 5μl of mecA standard RNA. 同様の操作を、VT2においても実施した。 The same operation was also performed at VT2.

(11)10で調製した25μlの試薬が入ったPCRチューブと、mecA増幅用の酵素試薬55μlを44℃で5分間保温後、酵素試薬の5μlをそれぞれのPCRチューブに分注した。 (11) and PCR tube containing reagent 25μl prepared in 10, after incubation for 5 minutes enzyme reagent 55μl for mecA amplification at 44 ° C., was dispensed 5μl of enzyme reagent to each PCR tube min. 同様の操作を、VT2においても実施した。 The same operation was also performed at VT2.

(12)引き続きPCRチューブを44℃で保温しながら、蛍光強度の変化をモニターした。 (12) while continuing to kept the PCR tubes at 44 ° C., and monitoring the change in fluorescence intensity.

1から7までは、RNA検査キット製造者が行う作業を示し、8以降は現場で実験者が行うRNA検査のモデルである。 Until 1 through 7, shows the work of RNA test kit manufacturer is done, 8 or later is a model of RNA test site in the experimenter perform. 実験者がmecA(図3)、VT2(図4)、それぞれ10本分の試薬を調製するのに要した時間は、簡易型RNA検査キットでは15分程度であるのに対し、従来型RNA検査キットでは30分を要した。 Experimenter mecA (Figure 3), VT2 (Fig. 4), the time required to prepare the reagents of each of 10 duty, in simplified RNA test kit to the range of about 15 minutes, conventional RNA testing in the kit it took the 30 minutes. RNAの増幅効率を反映する蛍光強度の立ち上がり時間を比較した結果、どちらのキットを使用してもほぼ同じ時間(mecA:15分、VT2:30分)であった。 Result of comparing the rise time of the fluorescence intensity reflects the RNA amplification efficiency, using either kit approximately the same time (mecA: 15 minutes, VT2: 30 min) was. 以上のことから、本発明の簡易型RNA検査キットによって、試薬調製を含めたRNA検査の所要時間が最大三分の二に短縮された。 From the above, the simplified RNA test kit of the present invention, the time required for RNA testing, including reagent preparation was reduced to a maximum two-thirds.

本発明における簡易型RNA検査キットの試薬構成と操作手順を示したものである。 It shows the reagent configuration and procedures simplified RNA test kit of the present invention. 従来型RNA検査キット(TRC検査キット)の試薬構成と操作手順を示したものである。 It shows the reagent configuration and procedures conventional RNA test kit (TRC test kit). mecAを標的核酸としたRNA増幅反応の実施における、RNA増幅用試薬の調製開始から結果の判定までの所要時間を示したものである。 In the practice of the RNA amplification reaction that target nucleic acid mecA, it shows the time required for the determination of the results from the preparation initiation of RNA amplification reagents. 本発明におけるRNA検査キットを使用することにより、結果の判定までの所要時間が短縮されたことが示されている。 By using the RNA test kit according to the present invention, of the time taken until the determination results have been shown to have been reduced. VT2を標的核酸としたRNA増幅反応の実施における、RNA増幅用試薬の調製開始から結果の判定までの所要時間を示したものである。 In the practice of the RNA amplification reaction that target nucleic acid VT2, it shows the time required for the determination of the results from the preparation initiation of RNA amplification reagents. 本発明におけるRNA検査キットを使用することにより、結果の判定までの所要時間が短縮されたことが示されている。 By using the RNA test kit according to the present invention, of the time taken until the determination results have been shown to have been reduced.

Claims (8)

  1. 試料中の標的核酸を増幅するキットであって、標的核酸の増幅に必要な試薬成分の一部が1つの容器に固体状態で入っている固体状態の試薬と、標的核酸の増幅に必要な残りの試薬成分が1つの容器に液体状態で入っている液体状態の試薬とからなり、試料中の標的核酸と、固体状態の試薬と、液体状態の試薬とを混合することで固体状態の試薬が溶解して標的核酸の増幅が可能となる、標的核酸の増幅キット。 A kit for amplifying a target nucleic acid in a sample, the remaining required and reagent in the solid state portion of the reagent components necessary for amplification of the target nucleic acid is in a solid state in one vessel, the amplification of the target nucleic acid becomes reagent components is one vessel from the reagent in the liquid state contained in the liquid state, and the target nucleic acid in the sample, and the reagent in the solid state, the reagent of the solid state by mixing the reagents in the liquid state dissolved thereby enabling amplification of the target nucleic acid, amplification kit of the target nucleic acid.
  2. 試料中の標的核酸を増幅するキットであって、標的核酸の増幅に必要な試薬成分の全部が1つの容器に固体状態で入っている固体状態の試薬からなり、試料中の標的核酸と、固体状態の試薬とを混合することで固体状態の試薬が溶解して標的核酸の増幅が可能となる、標的核酸の増幅キット。 A kit for amplifying a target nucleic acid in a sample, made from the reagent in the solid state in which all of the reagent components necessary for amplification of the target nucleic acid is in a solid state into one container, and the target nucleic acid in a sample, the solid it is possible to amplify the target nucleic acid dissolved reagent in the solid state by mixing the state of the reagent, amplification kit of the target nucleic acid.
  3. 固体状態の試薬にプライマー試薬を含むことを特徴とする、請求項1または2の標的核酸の増幅キット。 Characterized in that it comprises a primer reagent in the reagent in the solid state, amplification kit of the target nucleic acid of claim 1 or 2.
  4. 液体状態の試薬に酵素試薬を含むことを特徴とする、請求項1または3の標的核酸の増幅キット。 Characterized in that it comprises an enzymatic reagent to the reagent in the liquid state, amplification kit of the target nucleic acid of claim 1 or 3.
  5. 固体状態の試薬および/または液体状態の試薬に、標的核酸の増幅に伴い蛍光特性が変化するように設計された検出プローブを含むことを特徴とする、請求項1ないし4のいずれかの標的核酸の検出キット。 To the reagents and / or reagent in the liquid state in the solid state, characterized in that it comprises a detection probe that is designed to fluorescence properties due to amplification of the target nucleic acid changes, any target nucleic acid of claims 1 to 4 detection kit.
  6. 試料中の標的核酸の増幅方法であって、試料中の標的核酸と、標的核酸の増幅に必要な試薬成分の一部が1つの容器に固体状態で入っている固体状態の試薬と、標的核酸の増幅に必要な残りの試薬成分が1つの容器に液体状態で入っている液体状態の試薬とを混合することで増幅反応が開始される、標的核酸の増幅方法。 A method for amplifying a target nucleic acid in a sample, the target nucleic acid in a sample, and the reagent in the solid state portion of the reagent components necessary for amplification of the target nucleic acid is in a solid state in one vessel, the target nucleic acid the method of the remaining reagent components amplification reaction is initiated by mixing the reagents in a liquid state containing a liquid state into one container necessary for amplification of target nucleic acid amplification.
  7. 試料中の標的核酸の増幅方法であって、標的核酸と、標的核酸の増幅に必要な試薬成分の全部が1つの容器に固体状態で入っている固体状態の試薬とを混合することで増幅反応が開始される、標的核酸の増幅方法。 A method for amplifying a target nucleic acid in a sample, the amplification reaction by mixing a target nucleic acid, and a reagent in a solid state in which all of the reagent components necessary for amplification of the target nucleic acid is in a solid state into one container There is started, the amplification method of the target nucleic acid.
  8. 増幅反応が一定温度で行われることを特徴とする、請求項6または7の標的核酸の増幅方法。 Wherein the amplification reaction is carried out at a constant temperature, the amplification method of a target nucleic acid of claim 6 or 7.

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