JP2007022969A - コラゲナーゼ阻害剤およびこれを含有する食品 - Google Patents

Abstract

【課題】従来より食品の貯蔵もしくは容器として利用されており、安全性に問題がない木材に由来する成分を有効成分とするコラゲナーゼ阻害剤を開発し、その利用法を確立すること。
【解決手段】木材の抽出物を有効成分として含有してなる、コラゲナーゼ阻害剤、該コラゲナーゼ阻害剤を含有することを特徴とする食品もしくは食品素材、並びに蒸留酒（ブランデー、ウイスキー、焼酎など）、果実酒、ビール、清酒、リキュールを製造するにあたり、小さな樽および樽のチップや木材片を加えて貯蔵することや、アルコール度数をコントロールして貯蔵することや、樽や木材チップに貯蔵した水を割水とすることを特徴とする、コラゲナーゼ阻害活性を有する蒸留酒、果実酒、ビール、清酒、リキュールの製造法を提供する。
【選択図】なし

Description

本発明は、樽や木材に由来する物質を有効成分とするコラゲナーゼ阻害剤、並びにこれを含有する食品もしくは食品素材に関する。

マトリックス繊維を分解するマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）が種々の病原体に関係していることが明らかとなっている。ＭＭＰの中でも、繊維芽細胞等の間葉系細胞や、炎症部位に存在する好酸球等により生産される間質系のコラゲナーゼが、ガン細胞の転移や潰瘍形成、歯周炎やう歯形成等に関与することが報告されている（非特許文献１、特許文献１、特許文献２）。

一方、人の皮膚のシワやタルミの形成過程で起きる皮膚弾性の減少は、真皮線維芽細胞より生産されるコラゲナーゼがコラーゲンの傷害による３次元構造の変性に関わることが明らかとなっている。従って、そのコラゲナーゼの活性を抑制し、皮膚の弾力や張りを維持するコラーゲンの変性を防止することがシワやタルミの形成防止、すなわち、皮膚の老化防止に重要である（特許文献２）。

樽や木材は、アルコール飲料や食品に色付けや風味付けをする。また、チロシナーゼ活性阻害作用（非特許文献２）、アルドース還元酵素阻害作用（非特許文献３）、抗酸化活性（非特許文献４、特許文献３）、抗アレルギー性（特許文献３）、抗菌性（特許文献３）があると報告されている。しかし、上記のコラゲナーゼの阻害作用については未だ報告がない。
河医研研究年報 ３８、１９８８、ｐ２５−３２ 日本薬学会１２４年会 予稿集２ ｐ１５６ 大口ら 日本糖尿病合併症学会 ２００４ 根本ら 日本農芸化学会 ２００５ 講演要旨集 ｐ２７１ 山崎ら 特開２００１−１８１１２９号公報 特開２００５−８５４１号公報 特開２０００−１３６１４５号公報

本発明は、繊維芽細胞等の間葉系細胞や好酸球等により生産される間質系のコラゲナーゼに対して特異的に阻害を示し、炎症や創傷、ガンの転移、潰瘍形成、皮膚の老化等コラゲナーゼの関与する病体を改善し、或いは防止し得ることのできる物質、並びにこれを含有する食品もしくは食品素材を提供することを目的とするものである。

本発明者は上記の目的を達成するため、従来より食品もしくは食品素材として利用されており、人体に対して副作用の心配が殆どない農林水産物の中から当該物質を検索すべく検討を重ねた。その結果、果実酒や蒸留酒を貯蔵する樽やその木材の有機溶媒もしくは水による抽出物に高いコラゲナーゼ阻害活性を有する成分があることを見出し、係る知見に基づいて本発明に到達した。

すなわち、請求項１に記載の本発明は、樽や木材の抽出物を有効成分として含有してなる、コラゲナーゼ阻害剤である。
請求項２に記載の本発明は、請求項１記載のコラゲナーゼ抽出物を有効成分とすることを特徴とする食品もしくは食品素材である。
請求項３に記載の本発明は、請求項１記載のコラゲナーゼ阻害剤を有効成分とするアルコール飲料を含む食品の製造方法である。

本発明は、繊維芽細胞等の間葉系細胞や好酸球等により生産される間質系のコラゲナーゼに対して特異的に阻害を示し、炎症や創傷、ガンの転移、潰瘍形成、皮膚の老化等コラゲナーゼの関与する病体を改善し、或いは防止し得ることのできる物質、並びにこれを含有する食品もしくは食品素材を提供することが可能となる。本発明によれば、従来より貯蔵容器として利用されており、安全上の上で心配のない樽や木材に由来する特定の化合物を有効成分として含有するコラゲナーゼ阻害剤、並びに該阻害剤を含有する食品素材が提供される。さらに、樽貯蔵を行う蒸留酒（ブランデー、ウイスキー、焼酎など）、果実酒、ビール、日本酒、リキュールで、高いコラゲナーゼ阻害活性を有するアルコール飲料の製造法が提供される。

本発明のコラゲナーゼ阻害剤の有効成分は、樽や木材に含まれている。樽には主にオークや杉が使用され、アルコール飲料の貯蔵をはじめ、漬物や味噌などの食品の貯蔵に幅広く使用されている。樽の一部にはさくら、りんご、ブナ、くるみ、ピッコリーなどの木材も使用される。

樽や木材には、タンニンや低分子と高分子のポリフェノール、リグニンが含まれている（今村ら、木材利用の科学 ６章木材加工と抽出成分 ｐ７６〜８８ 共立出版）。タンニン、ポリフェノール、リグニンは蒸留直後の蒸留酒に含まれていないため、貯蔵後の蒸留酒中に存在するタンニン、ポリフェノール、リグニンは樽や木材由来のものであると認められる。
樽や木材由来のタンニン、ポリフェノール、リグニンによるコラゲナーゼの阻害作用については、これまでに報告がない。

樽や木材からタンニン、ポリフェノールを含む成分を抽出する場合には、有機溶媒や水が使用される。はじめに有機溶媒を用いた抽出について説明する。有機溶媒としては、エタノール、メタノール、アセトンが使用でき、特にエタノールが好ましい。抽出法の１例を示すと、樽や木材を１ｍｍ程に粉砕し、粉砕直後の樽や木材の重量に対して１〜１００倍量、好ましくは１０倍量のエタノール等の有機溶媒を加えて室温で０．５〜６０時間、好ましくは２４時間振盪を行って抽出を行い、タンニン、ポリフェノールの抽出液を得る。
抽出液は、そのままでコラゲナーゼ阻害剤として用いられるが、所望により、該抽出液を減圧下、エバポレーターを用いて濃縮乾固して得られたものを阻害作用剤として用いることができる。

一方、水を使用して抽出を行う場合について述べると、前述の如く、樽や木材を１ｍｍ程に粉砕し、粉砕直後の樽や木材の重量に対して水を１〜１００倍量、好ましくは１０倍量の水を加えて室温で０．５〜６０時間、好ましくは２４時間振盪を行って抽出を行い、タンニン、ポリフェノールの抽出液を得る。
この抽出液をコラゲナーゼ阻害剤として用いてもよいが、好ましくは、前述の如く、濃縮、乾固したものを用いる。

次いで、樽や木材からリグニンを含む成分を抽出する場合には、有機溶媒や水が使用される。はじめに有機溶媒を用いた抽出について説明する。有機溶媒としては、メタノール、アセトンが使用でき、特にメタノールが好ましい。抽出法の１例を示すと、樽や木材を１ｍｍ程に粉砕し、粉砕直後の樽や木材の重量に対して１〜１００倍量、好ましくは１０倍量のメタノール等の有機溶媒を加えて室温で０．５〜６０時間、好ましくは２４時間振盪を行って抽出を行い、リグニンの抽出液を得る。
抽出液は、そのままでコラゲナーゼ阻害剤として用いられるが、所望により、該抽出液を減圧下、エバポレーターを用いて濃縮乾固して得られたものを阻害作用剤として用いることができる。

一方、水を使用して抽出を行う場合について述べると、前述の如く、樽や木材を１ｍｍ程に粉砕し、粉砕直後の樽や木材の重量に対して水を１〜１００倍量、好ましくは１０倍量の水を加えて室温で０．５〜６０時間、好ましくは２４時間振盪を行って抽出を行い、リグニンの抽出液を得る。
この抽出液をコラゲナーゼ阻害剤として用いてもよいが、好ましくは、前述の如く、濃縮、乾固したものを用いる。

このようして得られた樽や木材の抽出物は、タンニンやポリフェノール、またはリグニンを含んでおり、これがコラゲナーゼ阻害剤の有効成分である。なお、タンニン、ポリフェノールの抽出物には若干のリグニンが、リグニンの抽出物には若干のタンニン、ポリフェノールが混在するが、精製品を望む場合の他は、これらを除去する必要はない。

これらの抽出物等は、食品や医薬品、化粧品などの形態で提供される。食品もしくは食品素材として用いる場合は、単独で各種食品等に添加する他、必要に応じて安定剤、増量剤、膨張剤などの補助剤と併用して用いることができる。具体的な例としては、アルコール飲料、炭酸飲料、果実飲料、乳酸菌飲料、コーヒー、紅茶、お茶、アイスクリーム、飴、ガム、菓子、パン、麺類等に用いることができる。本発明に係る有効成分の食品等への添加量は、用途などを考慮して適宜決定すればよい。また、一般に市販されているウイスキーやブランデー、樽詰め焼酎、樽詰めホワイトブランデーは本発明で言う樽抽出物に相当する。
次に、医薬品として用いる場合には、散剤、顆粒剤、錠剤、トローチ剤、カプセル剤、液剤、シロップ剤などの経口剤、座剤、軟膏、噴霧剤、注射剤などの非経口剤の剤形を採用することができる。製剤化にあたっては、賦形剤、結合剤などの常用の成分を必要に応じて適宜配合することができる。なお、有効成分の使用量については、用途などを考慮して適宜決定すればよい。
さらに、化粧品として用いる場合には、石鹸、洗顔料、クリーム、乳液、化粧水、パウダー、香水、口紅などの皮膚化粧品や浴用化粧品、さらにシャンプー、リンス等の毛髪用化粧品ならびに歯磨きなどに用いることができる。なお、有効成分の使用量については、用途などを考慮して適宜決定すればよい。

樽や木材に含まれている、タンニン、ポリフェノール、リグニンは水などに容易に溶解する。従って、上記のようにして得られたタンニン、ポリフェノール、リグニンを含む抽出物等は、例えばアルコール飲料、炭酸飲料、果実飲料、乳酸菌飲料、コーヒー、紅茶、お茶などの飲料に加えて利用することができる。この場合の配合量についても、用途などを考慮して適宜決定すればよい。

次に、高いコラゲナーゼ阻害剤を有効成分とするアルコール飲料を含む食品の製造について説明する。はじめにアルコール飲料の製造について説明する。アルコール飲料の製造に用いる原料や製造法などの条件は、基本的に従来法と同じで良く、貯酒のみが通常の製造法と異なる。
すなわち、焦がしていない白い樽もしくはその木材で貯蔵する場合、１％〜９９．５％未満のアルコール濃度、好ましくは６０％で貯蔵する。焦がした樽もしくはその焦がした木材で貯蔵する場合、１％〜９９．５％未満のアルコール濃度、好ましくは４０％や７０％で貯蔵することで、アルコール飲料を得る。
また、樽や木材との接触面積を大きくするため、小さな樽に小分けして貯蔵するか、樽のチップや木材片を加えて貯蔵することで、アルコール飲料を得る。
アルコール度数の高いアルコール飲料の場合、目的のアルコール度数とするために使われる割水をあらかじめ樽や木材に詰め、有効成分が十分に抽出されたものを割水に使用し、アルコール飲料を得る。

一方、食品の製造は、低温抽出の場合、樽や木材を細かくし、１％未満のアルコール水溶液あるいは水で、４℃〜４０℃、好ましくは２５℃、０．５時間〜１ヶ月、好ましくは２４時間で抽出して得る。高温抽出の場合、樽や木材を細かくし、１％未満のアルコール水溶液あるいは水で、４０℃〜１００℃、好ましくは９８℃、０．５分〜２４時間、好ましくは３分で抽出して得る。

果実酒を単式蒸留機で二回蒸留し、これをアルコール４０％に加水し蒸留酒ベースとした（試験区１）。フレンチオークチップのミディアムトースト０．５ｇを１００ｍＬの蒸留酒ベースに加え、１５℃で２週間貯蔵した（２２５Ｌ樽貯蔵に相当、通常のブランデー、ウイスキーと同等）。貯蔵後の上清を蒸留水で１０倍希釈した溶液１００μＬをサンプルとした（試験区２）。フレンチオークチップのトーストなしを使用して得た溶液を１００μＬと、アメリカンオークチップのミディアムトーストを使用して得た１００μＬ、アメリカンオークチップのトーストなしを使用して得た１００μＬを、それぞれ試験区３、試験区４、試験区５とした。

上記の５種類のサンプルについてコラゲナーゼ阻害活性を測定した。Ｉ型コラゲナーゼの活性測定は次の通り行った。すなわち、１．５ｍＬマイクロチューブに蛍光標識Ｉ型コラーゲン（５０μｇ／５０μＬ／ｔｕｂｅ）を入れ、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、アジ化ナトリウムを含む０．１Ｍトリス−塩酸バッファー中和溶液（ｐＨ７．５）５０μＬと試料１００μＬを加え、さらに０．５ｕｎｉｔ／ｍＬコラゲナーゼ（有限会社ライフ研究所）５０μＬ添加した後、３７℃で酵素反応を２時間行った。
反応終了後に、塩化ナトリウム、０−フェナントロリンを含む０．０５Ｍトリス−塩酸バッファー／エタノール溶液酵素反応停止剤（ｐＨ７．５）２００μＬを添加して反応を停止させ、２０００×ｇで１５分間遠心分離して得た上澄液を励起光４９５ｎｍ、蛍光５２０ｎｍで強度を測定した。なお、対照として、試料の代わりに２倍に薄めた中和液を用いた場合についても同様の測定を行い、これをコントロールとした。
反応活性阻害率は下記の（１）式により算出した。

一方、ＩＶ型コラゲナーゼの活性測定は次の通り行った。すなわち、１．５ｍＬマイクロチューブに蛍光標識ＩＶ型コラーゲン（２５μｇ／２５μＬ／ｔｕｂｅ）を入れ、ＩＶ型コラーゲン中和溶液２５μＬと試料５０μＬを加え、さらに０．５ｕｎｉｔ／ｍＬコラゲナーゼ（有限会社ライフ研究所）１０μＬ添加した後、４２℃で酵素反応を２時間行った。
反応終了後に、蛍光測定調整液３００μＬを添加して反応を停止させ、８０００×ｇで１５分間遠心分離して得た上澄液を励起光４９５ｎｍ、蛍光５２０ｎｍで強度を測定した。なお、対照として、試料の代わりに２倍に薄めた中和液を用いた場合についても同様の測定を行い、これをコントロールとした。
反応活性阻害率は上記の（１）式により算出した。
Ｉ型コラゲナーゼの活性測定結果を表１に、ＩＶ型コラゲナーゼの活性測定結果を表２に示す。これらの表から明らかなように、樽や木材の抽出成分がコラゲナーゼ阻害活性を示した。

フレンチオークチップのミディアムトースト２５ｇを粉末にし、これを２５０ｍＬのヘキサンで振盪機を使い、室温で２４時間抽出した。この抽出液を濾過し、フレンチオークチップの粉末を再び、２５０ｍＬのヘキサンで振盪機を使い、室温で２４時間抽出した。抽出液を濾過し、先の抽出溶液と合わせ、エバポレーターを用いて減圧下で個体になるまで濃縮し、抽出成分を得た。さらにこの抽出粉末を同様の操作でエーテルにて抽出を行い、固体の抽出成分を得た。この後も同様に逐次抽出を、酢酸エチル、エタノール、メタノール、水を用いて行い、それぞれの固体の抽出成分を得た。
得られた固体抽出成分１ｍｇを４０％アルコール水溶液１０ｍＬに溶解し、それぞれのアルコール水溶液を得た。フレンチオークチップから抽出された成分について、実施例１と同様にしてコラゲナーゼ阻害活性を測定したところ、木材由来のタンニン、ポリフェノール、リグニン成分が抽出されてくる、エタノール、メタノール、水抽出画分に強い阻害活性が認められた。

果実酒を単式蒸留機で二回蒸留し、これをアルコール４０％に加水し蒸留酒ベースとした。フレンチオークチップのミディアムトースト２０ｇを１００ｍＬの蒸留酒ベースに加え、１５℃で２週間貯蔵した（５Ｌ樽貯蔵に相当）。貯蔵後の上清を蒸留水で４０倍希釈した溶液１００μＬをサンプルとした。これを実施例１と同様にしてコラゲナーゼ阻害活性を測定し、結果を表３、表４に示した。この結果から明らかなように、小さな樽に小分けして貯蔵するか、樽のチップや木材片を加えて貯蔵することで、樽や木材との接触面積を大きくすることが可能となり、高いコラゲナーゼ阻害活性を有するアルコール飲料を得ることができる。

フレンチオークチップのミディアムトーストの粉末１ｇに１００ｍＬの熱湯を加え、３分間抽出した。この抽出液を濾過し、上清を蒸留水で１０倍希釈した溶液１００μＬをサンプルとした（試験区１）。フレンチオークチップのトーストなしを使用して得た溶液を１００μＬと、アメリカンオークチップのミディアムトーストを使用して得た１００μＬ、アメリカンオークチップのトーストなしを使用して得た１００μＬを、それぞれ試験区２、試験区３、試験区４とした。これらを実施例１と同様にしてコラゲナーゼ阻害活性を測定し、結果を表５、表６に示した。この結果から明らかなように、コラゲナーゼ阻害活性を有するお茶などの飲料として利用可能であり、またコラゲナーゼ阻害活性を付与させる蒸留酒などの割水としても利用可能である。

蒸留酒（ブランデー、ウイスキー、焼酎など）の製造に利用可能である。また、果実酒、ビール、清酒、リキュールなどの製造にも利用可能である。水でも有効成分を抽出することが可能であるので、炭酸飲料、果実飲料、乳酸菌飲料、コーヒー、紅茶、お茶などの清涼飲料にも適用できる。樽や木材の抽出物は、食品、医薬品、化粧品などの製品に利用可能である。

Claims (3)

1. 樽や木材の抽出物を有効成分として含有してなる、コラゲナーゼ阻害剤
2. 請求項１記載のコラゲナーゼ抽出物を有効成分とすることを特徴とする食品もしくは食品素材
3. 請求項１記載のコラゲナーゼ阻害剤を有効成分とするアルコール飲料を含む食品の製造方法