JP2006046977A - CONTINUOUS MEASURING METHOD OF TOLLIKERECEPTORS (TLRs), CD14 MOLECULE AND PRINCIPAL TISSUE AFFINITY MOLECULE COMPOSITE - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、ヒト血漿を用いた細胞培養工学的手法によりフローサイトメトリー分析器で各細胞膜上タンパク分子を測定する医療産業分野の技術に属し、殊にToll like receptors(TLRs)、CD14分子および主要組織適合分子複合体の各測定定量化を連続的に行い得る測定方法に関するものである。 The present invention belongs to a technology in the medical industry field in which protein molecules on each cell membrane are measured with a flow cytometry analyzer by a cell culture engineering technique using human plasma, and in particular, Toll Like Receptors (TLRs), CD14 molecules and major molecules The present invention relates to a measurement method capable of continuously performing each measurement and quantification of a tissue compatible molecular complex.
従来、細胞膜上のToll like receptors(TLRs)を測定する際には、単核球分画(単球、マクロファージ、樹状細胞を含む)を無血清の液体培地であるRPMI Medium1640with25mM HEPES buffer with L−glutamine(Invitrogen Corporation,California)か、他の動物の血清を添加した低血清液体培地、あるいは、リン酸緩衝液(PBS:phosphate buffer saline)にBovine Serum Albumin(BSA)を0.1%の割合で添加した溶液に浮遊させてから、TLRsに対する蛍光標識抗体と反応させ、フローサイトメトリー分析器にて蛍光強度を測定し、細胞膜上の各TLRs量の測定を行っていた(例えば、非特許文献1参照。)。しかしながら、浮遊細胞と蛍光標識抗体の反応が完了するまでに室温で30分〜60分程度の時間が必要であり、さらに、フローサイトメトリーにて測定する間の時間がかかるため、この方法では、ヒト血液から採取した状態をそのまま反映した細胞膜上のTLRs量は計測できない。なぜならば、時間の経過とともに細胞死(アポトーシスが主である)が進行、もしくは、細胞死が起こらなくとも細胞膜上のTLRsをはじめ各種蛋白レセプターに変化が起こってしまうためである。このことを防がなければ、実際にヒトの血管内を流れている状態のCD14陽性細胞(単球、マクロファージ、樹上細胞)膜上の正確なTLRs量とはならず(正確性の問題)、まして、TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR9、CD14、HLA−A,B,C、HLA−DRとフローサイトメトリーでの測定に要する約45分から60分間という時間だけ考えても、このようなレセプター群の連続的かつ正確な解析は不可能であった。
Conventionally, when measuring Toll Like Receptors (TLRs) on a cell membrane, a mononuclear cell fraction (including monocytes, macrophages, and dendritic cells) is RPMI Medium 1640 with 25 mM HEPES buffer with L- 0.1% Bovine Serum Albumin (BSA) in glutamine (Invitrogen Corporation, California), low serum liquid medium supplemented with serum from other animals, or phosphate buffer saline (PBS) After floating in the added solution, it is reacted with a fluorescently labeled antibody against TLRs, the fluorescence intensity is measured with a flow cytometry analyzer, and the amount of each TLRs on the cell membrane is measured. Tsu which was (e.g., see Non-Patent
哺乳動物におけるTLRsは、1997年にJaneway、Medzhitovらによって発見された。その後、単球、マクロファージ、樹状細胞などの自然免疫にとって重要な細胞は、TLR1とTLR2のヘテロダイマーとなったレセプターを介してグラム陽性菌の菌体成分(ペプチドグリカン、リポタイコ酸)を認識し、CD14で捕捉されたリポポレサッカライド(LPS)をTLR4に受け渡すかたちで、CD14とTLR4がグラム陰性菌の認識に関与することが明らかとなった。また、TLR3は、ウイルスの二本鎖RNAを認識し、TLR9は、ウイルスや細菌のDNAの認識にあたることが知られている。TLR5は、サルモネラ菌などの鞭毛を構成するタンパクであるフラジェリンを認識する。TLR7とTLR8は、ウイルスDNAを認識することが報告されている。現在まで、TLRsは、1〜10まで10個知られているが、TLR10に関しては何を認識するレセプターなのか不明である。 TLRs in mammals were discovered in 1997 by Janway, Medzitov et al. Thereafter, cells important for innate immunity such as monocytes, macrophages, dendritic cells, etc. recognize cell components of gram-positive bacteria (peptidoglycan, lipoteichoic acid) via receptors that have become heterodimers of TLR1 and TLR2, It was revealed that CD14 and TLR4 are involved in the recognition of Gram-negative bacteria in the form of passing lipopolysaccharide (LPS) captured by CD14 to TLR4. TLR3 is known to recognize viral double-stranded RNA, and TLR9 is known to recognize viral and bacterial DNA. TLR5 recognizes flagellin, a protein that constitutes flagella such as Salmonella. TLR7 and TLR8 have been reported to recognize viral DNA. To date, 10 TLRs from 1 to 10 are known, but it is unclear what receptors recognize TLR10.
一方、主要適合因子複合体(MHC)は、クラス1とクラス2が存在し、クロスプリゼンテーションが起こり得るものの、おおまかなところ、MHCクラス1は、内因性抗原をCD8陽性リンパ球T細胞へ抗原提示する役割を担い、MHCクラス2は、外因性抗原をCD4陽性リンパ球T細胞へ抗原提示する役割を担う。両者とも獲得免疫に重要な因子となっている。MHCは、ヒトでは、human leukocyte antigen(HLA)と呼ばれ、クラス1は、主にHLA−A,B,Cであり、MHCクラス2は、HLA−DRがその一部を成す。
On the other hand, the major fitness factor complex (MHC) has
ヒトの疾患においてウイルス感染症なのか、細菌感染症なのか、また、感染症ではなく他の疾患なのか鑑別できないことが少なからずある。また、細菌感染症であっても、その細菌を同定できないことも多い。例えば、感染性心内膜炎や敗血症(血液培養やエンドトキシン測定にたよってきたが、抗生剤投与療法中であれば、その細菌同定の可能性は低いし、たとえ抗生剤投与中でなくとも80%程度の同定率とされる。)、あるいは、サンプルが採取できない箇所における感染症では、内科的に細菌同定できる手段が、皆無という場合も存在する。 In many cases, it is not possible to distinguish whether a human disease is a viral infection, a bacterial infection, or another disease rather than an infection. Moreover, even if it is a bacterial infection, the bacteria cannot often be identified. For example, infective endocarditis and sepsis (according to blood culture and endotoxin measurement, if the antibiotic treatment is in progress, the possibility of bacterial identification is low, even if the antibiotic is not administered. %), Or there are cases where there is no means for medically identifying bacteria for infections where samples cannot be collected.
上記のような症例において、TLRs、CD14およびHLAの測定は、細菌感染なのか、ウイルス感染なのか、または、異なる疾患に起因したものなのか、さらには、細菌感染であれば、グラム陽性菌なのか、あるいは、グラム陰性菌なのかを迅速かつ正確に診断する検査方法に成り得る。しかしながら、臨床的実施に対しては、TLRs、CD14およびHLAの量測定において、その確実なる再現性に加え、患者の血管中を流れている血液細胞そのものを反映したかたちでの正確性が当然に要求される。 In cases like the above, whether TLRs, CD14 and HLA are measured by bacterial infection, viral infection, or due to a different disease, and if bacterial infection, Gram-positive bacteria Or a gram-negative bacterium can be quickly and accurately diagnosed. However, for clinical practice, in the measurement of the amount of TLRs, CD14 and HLA, in addition to its reliable reproducibility, the accuracy in the form of reflecting the blood cells themselves flowing in the patient's blood vessels is naturally Required.
本発明は、患者の血液から分離した単核球分画(単球、マクロファージ、樹状細胞を含む)に最適な処理を施すことで、フローサイトメトリー機器を使用し、感染症の有無あるいは疾患鑑別という課題の解決に寄与しようとするものである。本発明者は、上記課題に鑑み鋭意研究の結果、感染症の起炎菌(グラム陽性菌かグラム陰性菌か)あるいは、ウイルス感染に応じて、それらを認識するとされる特定のTLRs、CD14、HLA分子の定量化に成功し、健常者のそれらに比べて増加することを見い出した。これにより、身体における感染箇所の特定はできないまでも、患者が感染症に侵されているかどうかの診断を迅速かつ正確に行うことができ、医療上きわめて有用な検査方法を提供することができる。 The present invention uses a flow cytometry device by applying an optimal treatment to a mononuclear cell fraction (including monocytes, macrophages, and dendritic cells) separated from the blood of a patient, and the presence or absence of an infection or disease It is intended to contribute to the solution of the problem of discrimination. As a result of intensive studies in view of the above problems, the present inventor has identified specific TLRs, CD14, which are considered to recognize infectious disease-causing bacteria (gram-positive bacteria or gram-negative bacteria) or virus infection depending on the infection. We succeeded in quantifying HLA molecules and found that it increased compared to those in healthy subjects. As a result, even if the infection site in the body cannot be identified, it is possible to quickly and accurately diagnose whether or not the patient is affected by an infection, and it is possible to provide a medically extremely useful test method.
患者の状態を正確に反映したCD14陽性細胞(単球、マクロファージ、樹状細胞)を、そのままのかたちでフローサイトメトリーでの測定へともっていけるかどうか、つまり、TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR9、CD14、HLA−A,B,C、HLA−DRと連続的に解析しても最初から最後まで正確な量測定が行えているのかどうかが問題であった(正確性の問題)。従来の方法では、これだけの数の分子を連続的に解析するため、時間がかかりすぎ、細胞にストレスを与え、最悪の場合には、主にアポトーシスを引き起こし、その解析結果は、正確性を欠いたものであった。 Whether CD14-positive cells (monocytes, macrophages, dendritic cells) that accurately reflect the patient's condition can be directly used for measurement by flow cytometry, that is, TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, Even if it was continuously analyzed as TLR9, CD14, HLA-A, B, C, and HLA-DR, it was a problem whether accurate quantity measurement could be performed from the beginning to the end (problem of accuracy). Conventional methods analyze such a large number of molecules continuously, taking too much time, stressing the cells, and in the worst case mainly causing apoptosis, and the results of the analysis lack accuracy. It was what was there.
本発明では、患者の血漿を10%〜20%含む液体培地であるRPMI Medium1640with25mM HEPES buffer with L−glutamine(Invitrogen Corporation,California:以下、RPMI Mediumと略する)に分離した単核球分画を浮遊させた上で、蛍光標識抗体と室温で30〜60分間反応させ、フローサイトメトリーにてTLRs、CD14、HLA分子の量を順次測定すれば、さらに測定に必要な2倍以上の時間をかけても、同一のサンプルは20%誤差範囲でもって測定できることが判明した。したがって、患者血漿を10%〜20%量とした液体培地に添加するというこの条件は、アポトーシスを防ぎ、また細胞へのストレスを最小限に止め、患者本来の細胞に最も近い状態で測定を行っているものとみなせる。 In the present invention, a mononuclear cell fraction separated into RPMI Medium 1640 with 25 mM HEPES buffer with L-glutamine (Invitrogen Corporation, California, hereinafter abbreviated as RPMI Medium), which is a liquid medium containing 10% to 20% of patient's plasma. And then react with the fluorescently labeled antibody at room temperature for 30 to 60 minutes. If the amounts of TLRs, CD14, and HLA molecules are sequentially measured by flow cytometry, more than twice the time required for the measurement is taken. However, it was found that the same sample could be measured with a 20% error range. Therefore, this condition of adding patient plasma to a liquid medium with 10% to 20% volume prevents apoptosis, minimizes stress on cells, and performs measurement in the state closest to the patient's original cells. It can be regarded as.
実際、上記方法手順に従う測定方法により、起炎菌の確定した感染症患者(本測定を行うことに同意を得た)と健康者ボランティア群との比較検討を行うことで起炎菌のグラム陽性、陰性かを迅速かつ高感度に指摘でき、正確な補助的診断を行うことに成功した(有効性)。上述した検討の結果、「患者血漿を10%〜20%含む液体培地(RPMI Medium)に分離した単核球分画を浮遊させた上で、蛍光標識抗体と室温で30〜60分間反応させ、フローサイトメトリーにてTLRs、CD14、HLA分子の量を順次測定する」という条件が、その他血漿添加濃度の条件に比べ最も望ましいと結論された。 In fact, according to the measurement method according to the above procedure, infectious disease patients with confirmed pathogenic bacteria (obtained consent to perform this measurement) and healthy volunteer groups were compared with Gram positive It was possible to point out the negative quickly and with high sensitivity, and succeeded in making an accurate auxiliary diagnosis (effectiveness). As a result of the above-mentioned examination, “the mononuclear cell fraction separated in a liquid medium (RPMI Medium) containing 10% to 20% of patient plasma was suspended, and then reacted with a fluorescent-labeled antibody at room temperature for 30 to 60 minutes. It was concluded that the condition that “the amounts of TLRs, CD14, and HLA molecules are sequentially measured by flow cytometry” is the most desirable as compared to the conditions of other plasma concentrations.
以下、採取した血液より分離した単核球分画を患者血漿含有RPMI Medium(10%〜20%の濃度で)内に浮遊し、蛍光標識抗体と反応させ、フローサイトメトリーにてTLRs、CD14、HLA分子の量を順次測定することの正確性を検討した結果と上記結論に至る経過を記載した。
ヒト正常健康者(本検査測定に参加することに同意を得た血液提供者)よりヘパリンを入れた注射器で血液を30ml採取し、単核球分画(単球、マクロファージ、樹状細胞を含む)を分離し、−80℃で冷凍保存しておいた。その際、得られた血漿も同様に−80℃で冷凍保存しておいた。
Hereinafter, the mononuclear cell fraction separated from the collected blood is suspended in patient plasma-containing RPMI Medium (at a concentration of 10% to 20%), reacted with a fluorescent labeled antibody, and TLRs, CD14, The results of studying the accuracy of sequentially measuring the amount of HLA molecules and the course leading to the above conclusion are described.
30 ml of blood is collected with a syringe containing heparin from a normal human healthy person (a blood donor who has consented to participate in this test), and a mononuclear cell fraction (including monocytes, macrophages and dendritic cells) ) Were separated and stored frozen at -80 ° C. At that time, the obtained plasma was also stored frozen at -80 ° C.
冷凍保存しておいた単核球を37℃で解凍し、遠心操作を行い、上清を除去した。RPMI Mediumにヒト血漿濃度が10%となるように添加し、全部で16mlとした液体内に単核球を浮遊させた。これを16本の1.5ml清潔チューブに1mlずつ分注し、すべてのチューブにFITCで蛍光標識したCD14抗体を入れ、1本目と9本目はCD14抗体のみ、2本目と10本目はPEで蛍光標識したTLR1抗体を、3本目と11本目はPEで蛍光標識したTLR2抗体を、4本目と12本目はPEで蛍光標識したTLR3抗体を、5本目と13本目はPEで蛍光標識したTLR4抗体を、6本目と14本目はPEで蛍光標識したTLR9抗体を、7本目と15本目はPEで蛍光標識したHLA−A,B,C抗体を、8本目と16本目はPEで蛍光標識したHLA−DR抗体をそれぞれに入れ、室温で30分〜45分間反応させ抗原抗体反応を完了させた。 The cryopreserved mononuclear cells were thawed at 37 ° C., centrifuged, and the supernatant was removed. Mononuclear cells were suspended in the liquid which was added to RPMI Medium so that the human plasma concentration was 10% and made a total of 16 ml. Dispense 1 ml each into 16 1.5 ml clean tubes, put CD14 antibody fluorescently labeled with FITC into all tubes, 1st and 9th are CD14 antibody only, 2nd and 10th are fluorescent with PE The 3rd and 11th antibodies are labeled with TLR2 antibody, the 4th and 12th antibodies are labeled with TLR3 antibody, the 5th and 13th antibodies are labeled with PE and the TLR4 antibody is labeled with PE. The 6th and 14th antibodies are TLR9 antibody fluorescently labeled with PE, the 7th and 15th antibodies are HLA-A, B, and C antibodies fluorescently labeled with PE, and the 8th and 16th antibodies are HLA-fluorescently labeled with PE. The DR antibody was put in each, and reacted at room temperature for 30 to 45 minutes to complete the antigen-antibody reaction.
フローサイトメトリーでの分析は、まず、励起させるレーザー光の波長を488nmとし、1本目のFITC蛍光標識したCD14抗体のみを入れたサンプルの解析を行った。コンピューター上で、前方散乱と側方散乱に分けたグラフ画面上で、CD14陽性細胞(単球、マクロファージ、樹状細胞)が多く集まる細胞集団を曲線ゲート(以下、Aゲートと略する)で囲み、さらに、側方散乱を横軸にCD14の陽性度を表わす対数軸を縦軸にとったグラフでFITC蛍光を520nmの側方散乱光で拾い、CD14が陽性となる細胞群を四角ゲート(以下、Bゲートと略する)で囲んで、そのAとBの両ゲート内に入る細胞のみに関して分析を行うよう設定した。そして、CD14陽性細胞(単球、マクロファージ、樹状細胞)が持つ自家蛍光とCD14細胞のCD14平均蛍光強度(MFI:mean fluorescence intensity)をまず測定しておいた。 In the analysis by flow cytometry, first, the wavelength of the laser beam to be excited was set to 488 nm, and a sample containing only the first FITC fluorescently labeled CD14 antibody was analyzed. On a computer, on a graph screen divided into forward scatter and side scatter, a cell population in which many CD14 positive cells (monocytes, macrophages, dendritic cells) gather is surrounded by a curved gate (hereinafter abbreviated as A gate). Further, a graph in which side scatter is plotted on the horizontal axis and the logarithmic axis representing the positive degree of CD14 is plotted on the vertical axis, FITC fluorescence is picked up by side scattered light of 520 nm, and a group of cells positive for CD14 is square gated (hereinafter referred to as a square gate) , Abbreviated as B gate), and the analysis was set only for the cells that entered both the A and B gates. Then, autofluorescence of CD14 positive cells (monocytes, macrophages, dendritic cells) and CD14 average fluorescence intensity (MFI: mean fluorescence intensity) of CD14 cells were first measured.
次に、2本目のサンプル、FITC蛍光標識したCD14抗体とPEで蛍光標識したTLR1抗体の分析を行い、AとBの両ゲートに入る細胞集団の細胞膜上に存在するTLR1量を610nmの蛍光波長を拾い、TLR1のMFIの測定を行った。この値をCD14陽性細胞の自家蛍光MFIで割った値を1細胞あたりの膜表面に発現しているTLR1レセプターの量とし数値化した。同様に、2本目〜8本目のサンプルを分析器にかけ、連続的にTLR2、TLR3、TLR4、TLR9、HLA−A,B,C、HLA−DRの測定数値化を行った。この測定の間に要した時間はおよそ1時間であった。続いて、同じ1本目〜8本目と同じサンプルである9本目〜16本目のサンプルに関して、1時間遅れで上記すべての値に関して測定を行った。 Next, analysis of the second sample, FITC fluorescently labeled CD14 antibody and TLR1 antibody fluorescently labeled with PE, was performed, and the amount of TLR1 present on the cell membrane of the cell population entering both gates A and B was determined to be a fluorescence wavelength of 610 nm. The MFI of TLR1 was measured. The value obtained by dividing this value by the autofluorescence MFI of CD14-positive cells was quantified as the amount of TLR1 receptor expressed on the membrane surface per cell. Similarly, the second to eighth samples were applied to an analyzer, and TLR2, TLR3, TLR4, TLR9, HLA-A, B, C, and HLA-DR were continuously digitized. The time required for this measurement was approximately 1 hour. Subsequently, with respect to the ninth to sixteenth samples, which are the same samples as the first to eighth samples, measurement was performed for all the above values with a delay of one hour.
また、3名の別人の正常健康者より採血し、冷凍保存しておいた単核球を37℃で解凍し、遠心操作を行い、上清を除去した。RPMI Mediumにヒト血漿濃度が、それぞれ20%、25%、5%となるように添加し、すべての血漿濃度の場合に全部で16mlとした液体内に単核球を浮遊させることで、上述の操作を行い、それぞれ1本目〜8本目、さらに同じサンプルである9本目〜16本目の合計16本のサンプルを準備し、フローサイトメトリー解析を行った。20%、25%、5%ヒト血漿入りの各3名の1本目〜8本目のサンプルを連続して計るまで約1時間を要し、すべて一時間遅れで各3名の9本目〜16本目のサンプルに関して、分析を行った。 In addition, blood was collected from three different normal healthy individuals and the cryopreserved mononuclear cells were thawed at 37 ° C., centrifuged, and the supernatant was removed. By adding human plasma concentrations to RPMI Medium to be 20%, 25%, and 5%, respectively, and suspending mononuclear cells in the liquid made up to 16 ml in all plasma concentrations, the above-mentioned The operation was performed to prepare a total of 16 samples, the first sample to the eighth sample and the ninth sample to the 16th sample, respectively, and the flow cytometry analysis was performed. It takes about 1 hour to continuously measure the first to eighth samples of 3 people each containing 20%, 25% and 5% human plasma, and the 9th to 16th samples of each 3 people with a one hour delay. Analysis was performed on the samples.
フローサイトメトリーを用いた測定方法では、細胞と各蛍光標識抗体とを反応させる必要があり、最低でも抗原抗体反応が完了するためには、30分から45分程度の時間経過が必須となる。この経過時間にフローサイトメトリーでの測定に要する時間を加えれば、患者の感染症を反映したそのままの細胞状態で、TLRs、CD14、HLA−A,B,C、HLA−DRを、順次連続的に測定することは、従来方法論に従っては、不可能である。そのため、RPMI Mediumにそのヒト自身の血漿を入れ込むことを発案した。
従来のRPMI Mediumに細胞群を浮遊させフローサイトメトリーで測定する方法では、細胞にストレスを与え、約1時間も経てばアポトーシスが生じてくる。このことは、フローサイトメトリーによる解析コンピューター画面上Aゲートの細胞集団が左下方へ外れていくことで表わされ、5%と25%ヒト血漿でも、抗体と反応させてから約1時間30分も経過すれば、Aゲート内の細胞の数的割合は減り、左下方への細胞集団の移動が観察されることで示された。
ここに、感染症を含むその他疾患(自己免疫疾患)の有無をこれら自然免疫、獲得免疫に関与する細胞膜上分子を利用して明らかとするためには、すべての分子にわたって連続的に測定する必要が生じる。
In the measurement method using flow cytometry, it is necessary to react cells with each fluorescently labeled antibody, and in order to complete the antigen-antibody reaction at least, a time of about 30 minutes to 45 minutes is essential. If the time required for measurement by flow cytometry is added to this elapsed time, TLRs, CD14, HLA-A, B, C, and HLA-DR are sequentially and continuously applied as they are in the cell state reflecting the patient's infection. It is impossible to measure in accordance with conventional methodologies. Therefore, it was proposed to put the human plasma in RPMI Medium.
In a conventional method in which a cell group is suspended in RPMI Medium and measured by flow cytometry, stress is applied to the cells, and apoptosis occurs after about 1 hour. This is represented by the fact that the A-gate cell population moves to the lower left on the computer screen for analysis by flow cytometry. About 1
Here, in order to clarify the presence of other diseases including infectious diseases (autoimmune diseases) using molecules on cell membranes involved in these innate immunity and acquired immunity, it is necessary to measure continuously over all molecules. Occurs.
5%と25%濃度では、1本目〜8本目のサンプルを測定終了した時点(抗体処理から約2時間30分後)では、同一であるはずの9本目〜16本目のサンプルの測定値に最大で±50%の変化が生じた。このことにより、抗体と反応させて後に1本目〜8本目のサンプルを順次測定する間にも、細胞変性が進行しているのは確実であり、測定した値が患者の細胞状態を表わしたものとは考え難いと結論された。さらに、HLA−A,B,Cは、細胞にストレスがかかれば、細胞内変性タンパクが増え、その抗原提示を行うため、細胞膜上の量は増えてくる。5%ヒト血漿濃度では、この現象が起こっており、アポトーシスが生じなくとも、測定するCD14陽性細胞にストレスがかかっていることが観察され、このような細胞膜上各種レセプターの測定量は、正確なものとはいえない。逆に、25%ヒト血漿濃度では、HLA−A,B,C量が減少することが観察された。このことは、ストレス緩和もしくはNK(ナチュラルキラー)細胞に自己細胞であることを認識させる必要性がなくなっているために起こっている現象とみなされ、このように25%高濃度血漿の場合でも、細胞膜上各種レセプターの測定量は、信頼性(正確性)を欠いたものであった。以上より、5%と25%ヒト血漿では、CD14、TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR9、HLA−A,B,C、HLA−DRを順次連続して正確な測定を行うことは、不可能であった。 At the concentration of 5% and 25%, the measurement value of the 9th to 16th samples, which should be the same at the time when the measurement of the 1st to 8th samples was completed (about 2 hours and 30 minutes after the antibody treatment), was the maximum. Changed by ± 50%. In this way, it is certain that cell degeneration has progressed during the subsequent measurement of the first to eighth samples after reacting with the antibody, and the measured value represents the patient's cellular state. It was concluded that it was difficult to think. Furthermore, HLA-A, B, and C increase the amount of intracellular denatured protein and increase the amount on the cell membrane when the cells are stressed, and the antigen is presented. At 5% human plasma concentration, this phenomenon occurs, and even when apoptosis does not occur, it is observed that the CD14-positive cells to be measured are stressed. The measured amounts of various receptors on the cell membrane are accurate. Not a thing. Conversely, at 25% human plasma concentration, it was observed that the amount of HLA-A, B, C decreased. This is considered to be a phenomenon that occurs because there is no need to relieve stress or make NK (natural killer) cells recognize that they are autologous cells. Thus, even in the case of 25% high-concentration plasma, The measured amounts of various receptors on the cell membrane lacked reliability (accuracy). From the above, in 5% and 25% human plasma, CD14, TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR9, HLA-A, B, C, and HLA-DR cannot be measured in succession sequentially. Met.
しかしながら、10%〜20%ヒト血漿濃度では、アポトーシスもほとんど起こることなく(Aゲートから外れる細胞数もほとんどなく)、1本目〜8本目のサンプルの測定値と1時間遅れで測定した9本目〜16本目のサンプルの測定値は、いずれも±20%の変化に留まった。HLA−A,B,C分子の抗体処理を行ってから約3時間以内での時間的変化もほとんど認められなかった。これらの事実より、患者の細胞状態を最も正確に表わす測定には、10%〜20%ヒト血漿含有RPMI Mediumでの細胞抗体処理する方法が適切であり、その後のフローサイトメトリーによる各種細胞膜上タンパク量の測定値は、患者のもった免疫担当細胞群の状態そのものに最も近いものと判断され得る。 However, at the 10% to 20% human plasma concentration, apoptosis hardly occurs (the number of cells that deviate from the A gate is scarce), and the measurement values of the first to eighth samples and the ninth sample measured with a one hour delay The measured values of the 16th sample all changed by ± 20%. Almost no temporal change was observed within about 3 hours after antibody treatment of HLA-A, B, and C molecules. From these facts, the method of treating cell antibodies with RPMI Medium containing 10% to 20% human plasma is appropriate for the most accurate measurement of the patient's cellular state, and various protein on the cell membrane by subsequent flow cytometry. The measured value of the amount can be judged to be the closest to the state of the immunocompetent cell group possessed by the patient.
本発明によれば、患者の静脈血液の採取により、単球、マクロファージ、樹状細胞上のこれら分子群(TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR9、CD14、HLA−A,B,C、HLA−DR)を連続して測定でき、しかも正確な測定値が得られる。これにより、ヒトの疾患においてウイルス感染症なのか、細菌感染症なのか、また、感染症ではなく別の疾患なのか鑑別できるようになる。また、細菌感染症と明らかに判っていても、その細菌を同定できないことも多かった。例えば、抗生剤投与療法中であれば、感染性心内膜炎や敗血症の血液培養による細菌同定率は低いが、たとえ抗生剤投与中であっても、菌体成分に反応する細胞の特性をみる本発明では、細菌のグラム陽性菌かグラム陰性菌かを判断でき、治療にとって非常に有用な情報を与えるものとなる。さらに、サンプルが採取できない箇所における炎症があったとしても、採血という簡易的方法により、感染症の有無について判断できる。
また、本発明は、患者血液から分離した単核球分画(単球、マクロファージ、樹状細胞を含む)に最適な処理を施すことで、フローサイトメトリー機器を使用し、感染症の有無あるいは疾患鑑別という課題の解決に寄与しようとするものであり、患者が感染症に侵されているかどうかの診断が、迅速かつ正確に行え、従来にはなかった医療上有用な補助的検査方法を提供するものとなる。
According to the present invention, by collecting venous blood from a patient, these molecular groups on monocytes, macrophages and dendritic cells (TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR9, CD14, HLA-A, B, C, HLA- DR) can be measured continuously, and an accurate measurement value can be obtained. This makes it possible to distinguish whether a human disease is a viral infection, a bacterial infection, or a different disease rather than an infection. Moreover, even if it was clearly known as a bacterial infection, the bacteria could often not be identified. For example, during antibiotic therapy, the bacterial identification rate of blood cultures of infective endocarditis and septicemia is low, but even during antibiotic therapy, the characteristics of cells that respond to bacterial cell components In the present invention to be seen, it is possible to determine whether a gram-positive bacterium or a gram-negative bacterium, and to provide very useful information for treatment. Furthermore, even if there is inflammation at a location where a sample cannot be collected, the presence or absence of an infectious disease can be determined by a simple method called blood collection.
In addition, the present invention provides a flow cytometry device by applying an optimal treatment to a mononuclear cell fraction (including monocytes, macrophages, dendritic cells) separated from patient blood, It is intended to contribute to the solution of the problem of disease discrimination, and it provides a medically useful auxiliary test method that can quickly and accurately diagnose whether a patient is affected by an infectious disease. To be.
以下、本発明の実施の形態を図面に示す測定結果に基づいて詳細に説明する。
本発明に係るフローサイトメトリーのコンピューターの画面上に設定した各グラフの一覧を列記して示した。図1から図4は、RPMI Mediumに10%ヒト血漿を添加した測定結果を示すグラフである。図5から図8はRPMI Mediumに20%ヒト血漿を添加した測定結果を示すグラフである。図9から図12はRPMI Mediumに5%ヒト血漿を添加した測定結果を示すグラフである。図13から図16はRPMI Mediumに25%ヒト血漿を添加した測定結果を示すグラフである。
Hereinafter, embodiments of the present invention will be described in detail based on measurement results shown in the drawings.
A list of each graph set on the screen of the flow cytometry computer according to the present invention is listed. 1 to 4 are graphs showing measurement results obtained by adding 10% human plasma to RPMI Medium. 5 to 8 are graphs showing measurement results obtained by adding 20% human plasma to RPMI Medium. 9 to 12 are graphs showing measurement results obtained by adding 5% human plasma to RPMI Medium. FIGS. 13 to 16 are graphs showing measurement results obtained by adding 25% human plasma to RPMI Medium.
詳述すると、まず、図1(a)は、前方散乱を縦軸に側方散乱を横軸にとったグラフであり、単核球細胞群のなかでも、その細胞の大きさおよび細胞内小器官密度により、ある程度、各種細胞集団に分けることが可能となる。Aの曲線形態ゲートに囲まれた部分に多くのCD14陽性細胞が存在する。図1(b)は、AゲートにおいてCD14陽性細胞をさらにBゲートに入る細胞集団として分けたもので、以下の解析は、AとBの両ゲートに入ったもののみ、つまり、単球、マクロファージ、樹状細胞について解析するようコンピューター設定を行った結果を示す。図中、右側の図1(c)と図1(d)は、図1(a)と図1(b)を測定した後、故意に一時間程遅らせ測定した同一サンプルのグラフで、比較検討を容易にするために並列して示す。図2(a)と図2(b)は、それぞれ、FITC標識CD14抗体でとらえたCD14の平均蛍光強度(MFI:mean fliuorescence intensity)とA、B両ゲートに入ったCD14陽性細胞の(単球、マクロファージ、樹状細胞)の自家蛍光を表わしたグラフである。図中、右側の図2(c)と図2(d)は、図2(a)と図2(b)を測定した後、故意に一時間程遅らせ測定した同一サンプルのグラフで、比較検討を容易にするために並列して示す。図3(a)〜(e)は、PE標識TLR1,2,3,4,9でとらえた各TLRのフローサイトメトリーでの一次元解析を表わすグラフで、それらのMFI値とそれらの値を自家蛍光MFIで割った値、つまり、各TLRの細胞表面発現量を示すものである。図面右側の図3(f)〜(j)は、図3(a)〜(e)を測定した後、故意に一時間程遅らせ測定した同一サンプルのグラフで、比較検討を容易にするために並列して示す。図4(a)と図4(b)は、PE標識HLA−A,B,C抗体とPE標識HLA−DR抗体でとらえたHLA−A,B,CとHLA−DRのフローサイトメトーでの一次元解析を表わすグラフで、それらのMFI値とそれらの値を自家蛍光MFIで割った値、つまり、各HLAの細胞表面発現量を示す。図中、右側の図4(c)と図4(d)は、図4(a)と図4(b)を測定した後、故意に一時間程遅らせ測定した同一サンプルのグラフで、比較検討を容易にするために並列して示す。図5から図8に示すグラフは、RPMI Mediumに20%ヒト血漿を添加したものであり、その他の条件は、図1から図4に示すグラフとそれぞれ同じものである。図9から図12に示すグラフは、RPMI Mediumに5%ヒト血漿を添加したものであり、その他の条件は、図1から図4に示すグラフとそれぞれ同じものである。図13から図16に示すグラフは、RPMI Mediumに25%ヒト血漿を添加したものであり、その他の条件は、図1から図4に示すグラフとそれぞれ同じものである。
More specifically, FIG. 1 (a) is a graph in which forward scatter is taken on the vertical axis and side scatter is taken on the horizontal axis. Among the mononuclear cell groups, the size of the cells and the intracellular small size are shown. Depending on the organ density, it can be divided into various cell populations to some extent. There are many CD14 positive cells in the area surrounded by the curved gate of A. FIG. 1 (b) shows CD14 positive cells divided into cell populations that enter the B gate in the A gate. The following analysis shows only those that enter both the A and B gates, that is, monocytes, macrophages. The results of computer settings to analyze dendritic cells are shown. In the figure, Fig. 1 (c) and Fig. 1 (d) on the right side are graphs of the same sample measured intentionally delayed for about an hour after measuring Fig. 1 (a) and Fig. 1 (b). Shown in parallel to facilitate. 2 (a) and 2 (b) show the mean fluorescence intensity (MFI) of CD14 captured by FITC-labeled CD14 antibody, and the CD14 positive cells (monocytes) entering both A and B gates, respectively. , Macrophages, dendritic cells). 2 (c) and 2 (d) on the right side of the figure are graphs of the same sample measured intentionally delayed for about one hour after measuring FIG. 2 (a) and FIG. 2 (b). Shown in parallel to facilitate. 3 (a) to 3 (e) are graphs showing a one-dimensional analysis by flow cytometry of each TLR captured by PE-labeled
先ず、本検査の実施にあたり同意を得た正常健康者ボランティア(実施例で行ったのは4名)からノボ・ヘパリン(10000単位/10ml)1ml入り注射器にて30mlの静脈採血を行い、清潔操作にて最終濃度5mMのEDTA入りリン酸緩衝液(以下、PBS/EDTAと略する)を20ml添加し、室温、400gで35分間遠心した後、上部の1.5倍に希釈された血漿と下部の赤血球とに分離し、その中間に存在するバフィーコート層を採取した(慎重に希釈された上部の血漿を別の清潔容器に移し取りながら)。採取した8〜10ml程のバフィーコートをPBS/EDTAで35mlまで希釈し、15mlのLYMPHOPREP(商品名:第一化学薬品株式会製,JAPAN)を入れた新たな50ml容器に35mlの細胞溶液を緩やかに入れ上乗せし2層に分かれるようにする。再び、400gで35分間遠心し、上清を取り除きながら中間層にできた10ml程度の単核球層を分離する。PBS/EDTAで50mlとし、300gで10分間遠心し、沈澱した細胞を吸い取らないよう慎重に上清を除き、混入している血小板を取り除く。次に、再度50mlのPBS/EDTAで撹拌し、細胞を浮遊させ、250gで10分間遠心を2度繰り返し行い、混入している血小板を取り除く操作を行った。最後に、細胞凍結保存液であるセルバンカー2(商品名:#ZCB-201、ダイアトロン,JAPAN)の1.5mlに沈澱した単核球細胞を浮遊させ、−80℃の冷蔵庫に保存した。最初に分離したPBS/EDTAで希釈された血漿も同じく−80℃の冷蔵庫に保存しておいた。 First, a normal healthy volunteer (4 people in the example) who gave consent to conduct this test collected 30 ml of venous blood with a 1 ml syringe containing Novo heparin (10000 units / 10 ml) to clean it. Add 20 ml of EDTA phosphate buffer solution (hereinafter abbreviated as PBS / EDTA) at a final concentration of 5 mM, centrifuge at 400 g for 35 minutes at room temperature, and then dilute the upper 1.5 times plasma and lower The buffy coat layer existing in the middle was collected (while carefully diluted upper plasma was transferred to another clean container). Dilute the collected buffy coat of about 8 to 10 ml to 35 ml with PBS / EDTA, and gently add 35 ml of the cell solution to a new 50 ml container containing 15 ml of LYMPHOPREP (trade name: Daiichi Chemicals Co., Ltd., Japan). It is put on and is divided into two layers. Again, centrifugation is performed at 400 g for 35 minutes, and the mononuclear cell layer of about 10 ml formed in the intermediate layer is separated while removing the supernatant. Make up to 50 ml with PBS / EDTA, and centrifuge at 300 g for 10 minutes. Carefully remove the supernatant so that the precipitated cells are not sucked off, and remove the contaminating platelets. Next, the mixture was again stirred with 50 ml of PBS / EDTA, the cells were suspended, and centrifugation at 250 g for 10 minutes was repeated twice to remove contaminating platelets. Finally, mononuclear cells precipitated in 1.5 ml of Cell Banker 2 (trade name: # ZCB-201, Diatron, JAPAN), which is a cell cryopreservation solution, were suspended and stored in a refrigerator at -80 ° C. The plasma that was first diluted with PBS / EDTA was also stored in a refrigerator at -80 ° C.
フローサイトメトリーでのTLRs、CD14、HLA−A,B,C、HLA−DRの解析時において、−80℃で単核球細胞を保存液に入れ、ストックしておいたチューブを37℃の温浴につけ、約5分間かけて溶解させた。続いて300gの遠心を10分間行い、細胞を沈澱させ、上清を吸い取った。
ヒト血漿各濃度(本実施例で行ったのは、5%、10%、20%、25%の濃度)含有RPMI Medium内に沈澱細胞を浮遊させ、1.5mlチューブを8本準備しておき、均等に8サンプルに分注した(本実施例では、時間差をみるため、2倍の16本に分注した。)。速やかにすべてのサンプルにFITC標識CD14抗体を5μl添加していき、次いで2本目のサンプルには、PE標識TLR1抗体を5μl添加した。3本目のサンプルには、PE標識TLR2抗体を、4本目のサンプルには、PE標識TLR3抗体を、5本目のサンプルには、PE標識TLR4抗体を、6本目のサンプルには、PE標識TLR9抗体を、7本目のサンプルには、PE標識HLA−A,B,C抗体を、8本目のサンプルには、PE標識HLA−DR抗体を、それぞれ5μl添加した。そして、室温で30分〜45分程度時間をおき、抗原抗体反応を進行させた。
At the time of analysis of TLRs, CD14, HLA-A, B, C, and HLA-DR by flow cytometry, mononuclear cells were placed in a stock solution at -80 ° C, and the stocked tube was warmed at 37 ° C. And dissolved for about 5 minutes. Subsequently, centrifugation was performed at 300 g for 10 minutes to precipitate the cells, and the supernatant was sucked off.
Precipitated cells were suspended in RPMI Medium containing each concentration of human plasma (concentrations of 5%, 10%, 20%, and 25% performed in this example), and eight 1.5 ml tubes were prepared. The sample was evenly dispensed into 8 samples (in this example, in order to see the time difference, it was dispensed into 16 doubles). Immediately, 5 μl of FITC-labeled CD14 antibody was added to all samples, and then 5 μl of PE-labeled TLR1 antibody was added to the second sample. PE labeled TLR2 antibody for the third sample, PE labeled TLR3 antibody for the fourth sample, PE labeled TLR4 antibody for the fifth sample, PE labeled TLR9 antibody for the sixth sample 5 μl of PE-labeled HLA-A, B, C antibody was added to the seventh sample, and 5 μl of PE-labeled HLA-DR antibody was added to the eighth sample. Then, the antigen-antibody reaction was allowed to proceed for 30 minutes to 45 minutes at room temperature.
その後、フローサイトメトリー機器での分析を行ったが、その蛍光励起レーザー光の波長は、488nmとした。FITC蛍光は、520nmを中心にして拾い、光電子増倍管での電気信号変換により、蛍光強度を測定した。PE蛍光は、610nmを中心にして拾い、別の光電子増倍管での電気信号変換により、蛍光強度を測定した。
図1(a)は、前方散乱(細胞の大きさを表わす)と側方散乱(細胞内の小器官密度を表わす)から考えて、Aの曲線形態ゲート内に囲まれた細胞集団が、単球、マクロファージ、樹状細胞を多く含む集団であることが予測された。その左下方の数的割合の多い集団は、リンパ球の集団である。図1(b)では、予測通り、Aゲートに囲まれた部分は、約80%の細胞が、CD14陽性細胞でBの四角ゲート内に入ってきた。したがって、A、B両ゲート内に入った細胞群のみの分析は、ほぼ単球、マクロファージ、樹状細胞のみの分析を行ったに等しい(CD14陽性細胞は、単球、マクロファージ、樹状細胞のみであるから)。
Thereafter, analysis was performed with a flow cytometry instrument, and the wavelength of the fluorescence excitation laser light was 488 nm. FITC fluorescence was picked up around 520 nm, and the fluorescence intensity was measured by electric signal conversion in a photomultiplier tube. PE fluorescence was picked up around 610 nm, and fluorescence intensity was measured by electric signal conversion in another photomultiplier tube.
FIG. 1 (a) shows that a cell population surrounded by a curve-shaped gate of A is simply expressed by considering forward scatter (representing cell size) and side scatter (representing intracellular organelle density). It was predicted to be a population rich in spheres, macrophages, and dendritic cells. The high-numbered population at the lower left is a population of lymphocytes. In FIG. 1 (b), as expected, about 80% of the cells surrounded by the A gate entered the B square gate as CD14 positive cells. Therefore, the analysis of only the cell group that entered the gates A and B is almost equivalent to the analysis of only monocytes, macrophages, and dendritic cells (CD14 positive cells are only monocytes, macrophages, dendritic cells). )
図2(a)は、縦軸に細胞数をとり、積分面積値に等しいCD14細胞群の平均蛍光強度(MFI:mean fluorescence intensity)を表わしたグラフであり、その数値は積分面積値に等しい。図2(b)では、PE標識の抗体を入れていない610nm蛍光波長を拾いCD14陽性細胞群が自らもつ自家蛍光のこの波長範囲内での強さを表わした。すべての物質は、原子でできており、当然のことながら自家蛍光をもっている。細胞も例外ではない。 FIG. 2A is a graph showing the mean fluorescence intensity (MFI) of the CD14 cell group having the number of cells on the vertical axis and equal to the integrated area value, and the numerical value is equal to the integrated area value. In FIG. 2 (b), the intensity of the autofluorescence within the wavelength range of the CD14-positive cell group picked up by the 610 nm fluorescence wavelength without the PE-labeled antibody is shown. All substances are made of atoms and naturally have autofluorescence. Cells are no exception.
図3(a)〜(e)は、それぞれ、610nm蛍光波長を拾ってPE標識TLR1、2、3、4、9抗体処理後のMFI値を解析した結果である。ここで得られた各MFI値をCD14陽性細胞のもつ自家蛍光のMFIで割った値をもって、各TLRsの細胞膜上の発現量を数値化できる。 FIGS. 3A to 3E show the results of analyzing MFI values after treatment with PE-labeled TLR1, 2, 3, 4, 9 antibody by picking up the fluorescence wavelength of 610 nm, respectively. The expression level of each TLRs on the cell membrane can be converted into a numerical value by dividing each MFI value obtained here by the autofluorescence MFI of CD14 positive cells.
図4(a)と(b)は、それぞれPE標識HLA−A,B,C抗体とHLA−DR抗体で処理した際の、610nm蛍光波長を拾ったMFI値を表わしたもので、これら数値をCD14陽性細胞のもつ自家蛍光のMFIで割れば、HLA−A,B,C、HLA−DRの量を数値化できる。 4 (a) and 4 (b) show MFI values picked up at 610 nm fluorescence wavelength when treated with PE-labeled HLA-A, B, C antibody and HLA-DR antibody, respectively. By dividing by the autofluorescence MFI of CD14 positive cells, the amounts of HLA-A, B, C and HLA-DR can be quantified.
図1〜図4を通して、右側のグラフはすべて、左側のグラフと抗体処理時間を同じくした完全に同一のサンプルではあるが、フローサイトメトリーでの解析を故意に1時間遅延させてから行ったものである。 1-4, all the graphs on the right side are completely the same sample as the left side graph, but the analysis with flow cytometry was intentionally delayed for 1 hour. It is.
炎症所見のない正常健康者で、本研究への参加に同意した者より、ノボ・ヘパリン(Aventis,USA:10000単位/10ml)1ml入り注射器にて30mlの静脈採血を行った。清潔操作にて最終濃度5mMのEDTA入りリン酸緩衝液(phosphate buffer saline)(以下、PBS/EDTAと略する)の20mlを添加し、スイングローターにセットし、ブレーキなしで20℃、400gで35分間遠心した。バフィーコート層の上部5mlを残し、最上部の1.5倍に希釈された血漿を慎重に別の清潔50ml円錐チューブに移し取りながら、その中間に存在するバフィコート層をさらに別の50ml円錐チューブに採取した(下部層は、赤血球)。採取した8〜10ml程のバフィーコートにPBS/EDTAを加え35mlとし、転倒混和した。新たに50ml円錐チューブに15mlのLYMPHOPREP(商品名:第一化学薬品株式会製,JAPAN)を入れ、35mlに希釈したバフィーコート層を緩やかに入れ重層した。これをスイングローターにセットし、ブレーキなしで20℃、400gで35分間遠心した。上清を取り除きながら中間層にできた10ml程度の単核球層を分離し、清潔な50ml円錐チューブに移した。そして、PBS/EDTAで50mlとし、300gで10分間遠心し、沈澱した細胞を吸い取らないよう慎重に上清を取り除いた。次に、再度50mlのPBS/EDTAで撹拌し、細胞を浮遊させ、250gで10分間遠心を2度繰り返し行い、混入している血小板を取り除く操作を行った。最後に、細胞凍結保存液であるセルバンカー2(#ZCB-201、ダイアトロン,JAPAN)の1.5mlに沈澱した単核球細胞群を浮遊させ、−80℃の冷蔵庫に保存した。最初に分離したPBSで希釈された血漿も同じく−80℃の冷蔵庫に保存しておいた。 A normal healthy person with no inflammatory findings and a person who agreed to participate in this study collected 30 ml of venous blood using a syringe containing 1 ml of Novo heparin (Aventis, USA: 10000 units / 10 ml). In a clean operation, add 20 ml of phosphate buffer solution (hereinafter referred to as PBS / EDTA) containing 5 mM EDTA at a final concentration of 5 mM, set on a swing rotor, 35 at 20 ° C. and 400 g without brake. Centrifuge for minutes. While leaving the top 5 ml of the buffy coat layer and carefully transferring the 1.5-fold diluted plasma at the top to another clean 50 ml conical tube, the buffy coat layer in the middle is further separated into another 50 ml conical tube. (Lower layer is red blood cells). PBS / EDTA was added to about 8-10 ml of the collected buffy coat to make 35 ml, and mixed by inversion. 15 ml of LYMPHOPREP (trade name: manufactured by Daiichi Chemicals Co., Ltd., JAPAN) was newly added to a 50 ml conical tube, and a buffy coat layer diluted to 35 ml was gently put and layered. This was set on a swing rotor and centrifuged at 20 ° C. and 400 g for 35 minutes without a brake. While removing the supernatant, a mononuclear cell layer of about 10 ml formed in the intermediate layer was separated and transferred to a clean 50 ml conical tube. Then, the volume was adjusted to 50 ml with PBS / EDTA, centrifuged at 300 g for 10 minutes, and the supernatant was carefully removed so as not to suck the precipitated cells. Next, the mixture was again stirred with 50 ml of PBS / EDTA, the cells were suspended, and centrifugation at 250 g for 10 minutes was repeated twice to remove contaminating platelets. Finally, the mononuclear cell group precipitated in 1.5 ml of Cell Banker 2 (# ZCB-201, Diatron, JAPAN), which is a cell cryopreservation solution, was suspended and stored in a refrigerator at −80 ° C. The plasma which was diluted with PBS first separated was also stored in a refrigerator at -80 ° C.
−80℃で単核球細胞を保存液に入れ、ストックしておいたチューブとPBS/EDTAで希釈したそのヒトの血漿を37℃の温浴につけ、約5分間かけて溶解させた。続いて細胞の入ったストックチューブを300gの遠心に10分間かけ、細胞を沈澱させ、上清の保存液を吸い取った。
RPMI Medium内のヒト血漿濃度が10%になるように血漿を加え16mlの細胞懸濁液を準備した。そこに沈澱細胞を浮遊させ、1.5mlチューブの16本に等しく分注した。速やかにすべてのサンプルにFITC標識CD14抗体(eblosience,Cat.11−0149.USA)を5μl添加していき、次いで2本目と10本目のサンプルには、PE標識TLR1抗体(eBioscience,Cat.12−9911,USA)を5μl添加した。3本目と11本目のサンプルには、PE標識TLR2抗体(eBioscience,Cat.12-9922,USA)を、4本目と12本目のサンプルには、PE標識TLR3抗体(eBioscience,Cat.12−9039,USA)を、5本目と13本目のサンプルには、PE標識TLR4抗体(eBioscience,Cat.12−9917,USA)を、6本目と14本目のサンプルには、PE標識TLR9抗体(eBioscience,Cat.12−9099,USA)を、7本目と15本目のサンプルには、PE標識HLA−A,B,C抗体(eBioscience,Cat.12−9983 USA)を、8本目と16本目のサンプルには、PE標識HLA−DR抗体(eBioscience,Cat.12−9956,USA)を、それぞれ5μl添加した。そして、室温で30分〜45分程度時間をおき、抗原抗体反応を進行させた。
Mononuclear cells were placed in the stock solution at -80 ° C and the stocked tubes and their human plasma diluted in PBS / EDTA were placed in a 37 ° C warm bath and allowed to lyse for about 5 minutes. Subsequently, the stock tube containing the cells was centrifuged at 300 g for 10 minutes to precipitate the cells, and the stock solution of the supernatant was sucked off.
Plasma was added to prepare a 16 ml cell suspension so that the human plasma concentration in RPMI Medium was 10%. Precipitated cells were suspended there and dispensed equally into 16 1.5 ml tubes. Immediately, 5 μl of FITC-labeled CD14 antibody (ebloscience, Cat.11-0149.USA) was added to all samples, and then PE-labeled TLR1 antibody (eBioscience, Cat.12-) was added to the second and tenth samples. 9911, USA) was added. PE labeled TLR2 antibody (eBioscience, Cat. 12-9922, USA) was used for the third and eleventh samples, and PE labeled TLR3 antibody (eBioscience, Cat. 12-9039, USA) was used for the fourth and twelfth samples. USA) for the 5th and 13th samples, PE labeled TLR4 antibody (eBioscience, Cat. 12-9917, USA), and for the 6th and 14th samples, PE labeled TLR9 antibody (eBioscience, Cat. 12-90999, USA), PE-labeled HLA-A, B, C antibodies (eBioscience, Cat. 12-9983 USA) for the 7th and 15th samples, and 8th and 16th samples, PE-labeled HLA-DR antibody (eBioscience, Cat 12-9956, USA) were respectively 5μl added. Then, the antigen-antibody reaction was allowed to proceed for 30 minutes to 45 minutes at room temperature.
その後、フローサイトメトリー機器(EPICS ELITE,Beckman Coulter,USA)での分析を行ったが、その蛍光励起レーザー光の波長は、488nmとし、FITC蛍光は、520nmを中心にして拾い、光電子増倍管での電気信号変換により、蛍光強度を測定した。PE蛍光は、610nmを中心にして拾い、別の光電子増倍管での電気信号変換により、蛍光強度の測定を行った。
図1(a)は、前方散乱(細胞の大きさを表わす)と側方散乱(細胞内の小器官密度を表わす)から考えて、Aの曲線形態ゲート内に囲まれた細胞集団が、単球、マクロファージ、樹状細胞を多く含んだ集団であることが、それら細胞形態より予測された。その左下方の数的割合の多い集団は、T、Bリンパ球の集団であることも確かめた。図1(b)では、予測通り、Aゲートに囲まれた部分の約80%の細胞が、CD14陽性細胞であり、Bの四角ゲート内に入ってきた。したがって、A、B両ゲート内に入った細胞群のみの分析を行うようコンピューターを設定し、単球、マクロファージ、樹状細胞のみの分析を行った(CD14陽性細胞は、単球、マクロファージ、樹状細胞のみであるから)。
Thereafter, analysis was performed with a flow cytometry apparatus (EPICS ELITE, Beckman Coulter, USA). The wavelength of the fluorescence excitation laser light was 488 nm, the FITC fluorescence was picked up around 520 nm, and a photomultiplier tube. The fluorescence intensity was measured by electrical signal conversion at. PE fluorescence was picked up around 610 nm, and fluorescence intensity was measured by electric signal conversion in another photomultiplier tube.
FIG. 1 (a) shows that a cell population surrounded by a curve-shaped gate of A is simply expressed by considering forward scatter (representing cell size) and side scatter (representing intracellular organelle density). It was predicted from the cell morphology that the population was rich in spheres, macrophages, and dendritic cells. It was also confirmed that the population with a high numerical ratio in the lower left is a population of T and B lymphocytes. In FIG. 1 (b), as expected, about 80% of the cells surrounded by the A gate were CD14 positive cells and entered the B square gate. Therefore, a computer was set up to analyze only the cell groups that entered the gates A and B, and only monocytes, macrophages, and dendritic cells were analyzed (CD14 positive cells were monocytes, macrophages, trees) Because it is only dendritic cells).
図2(a)は、縦軸に細胞数をとり、その積分面積値を表わすCD14細胞群の平均蛍光強度(MFI:mean fluorescence intensity)をコンピューターグラフ上に描かせ数値化した(PE蛍光のみの一次元解析)。図2(b)では、PE標識の抗体を入れていない610nm蛍光波長を拾い、CD14陽性細胞群が自らもつ自家蛍光のこの波長範囲内での強さをコンピューターグラフ上に表わした (すべての物質は、原子でできており、当然のことながら自家蛍光をもっているため、細胞も例外ではない)。 FIG. 2 (a) shows the mean fluorescence intensity (MFI: mean fluorescence intensity) of the CD14 cell group that represents the integrated area value with the number of cells on the vertical axis, and was digitized (PE fluorescence only). One-dimensional analysis). In FIG. 2 (b), the fluorescence wavelength without a PE-labeled antibody was picked up at 610 nm, and the intensity of the autofluorescence of the CD14 positive cell group within this wavelength range was represented on a computer graph (all substances). Is made of atoms and naturally has autofluorescence, so cells are no exception).
図3(a)〜(e)の結果は、PE標識TLR1、2、3、4、9抗体処理後、2本目から6本目のサンプルを連続的に解析していき、610nm蛍光波長を拾ったAとBの両ゲートに入った細胞のみの一次元解析であり、それぞれのMFI値を示した。ここで得られた各MFI値をCD14陽性細胞のもつ自家蛍光のMFIで割った値をもって、各TLRsの細胞膜上の発現量として数値化した。 The results of FIGS. 3A to 3E show that after treatment with the PE-labeled TLR1, 2, 3, 4, 9 antibody, the second to sixth samples were continuously analyzed, and the fluorescence wavelength of 610 nm was picked up. This is a one-dimensional analysis of only the cells that entered both gates A and B, and the respective MFI values were shown. Each MFI value obtained here was divided by the autofluorescence MFI of CD14 positive cells, and the value was expressed as the expression level of each TLRs on the cell membrane.
図4(a)と(b)は、それぞれPE標識HLA−A,B,C抗体とHLA−DR抗体で処理した際の、610nm蛍光波長を拾ったMFI値を表わしたもので、これら数値をCD14陽性細胞のもつ自家蛍光のMFIで割り、HLA−A,B,C、HLA−DRの量として数値化した。 4 (a) and 4 (b) show MFI values picked up at 610 nm fluorescence wavelength when treated with PE-labeled HLA-A, B, C antibody and HLA-DR antibody, respectively. It was divided by the autofluorescence MFI of CD14 positive cells and quantified as the amount of HLA-A, B, C, HLA-DR.
続いて、図1乃至図4を通して、図中、右側のグラフはすべて、左側のグラフと抗体処理時間を同じくした完全に同一のサンプルの測定結果ではあるものの、フローサイトメトリーでの解析を故意に1時間遅らせてから連続的に実施例1と同様にして計測したものである。 Subsequently, through FIGS. 1 to 4, all the graphs on the right side are the measurement results of the same sample with the same antibody treatment time as the left side graph, but the analysis by flow cytometry is intentionally performed. This was measured continuously in the same manner as in Example 1 after being delayed for 1 hour.
別の正常健康者で、この本研究への参加に同意した者より、ノボ・ヘパリン(Aventis,USA:10000単位/10ml)1ml入り注射器にて30mlの静脈採血を行った。以下、上記と同様の操作手順に従って行った。ただし、(0019)においては、単核球分画沈澱細胞を懸濁するRPMI Medium内のヒト血漿濃度に関して、この場合20%になるように血漿を加え、全体を16mlの細胞懸濁液とし、同様に16本のサンプルを準備した。そして、フローサイトメトリーでの1〜8本目の測定値と故意に1時間遅らせてから連続的に解析した同一のサンプル群である9〜16本目の測定値とを比較した。 Another normal healthy person who agreed to participate in this study collected 30 ml of venous blood using a syringe containing 1 ml of Novo heparin (Aventis, USA: 10000 units / 10 ml). Thereafter, the same operation procedure as described above was performed. However, in (0019), with respect to the human plasma concentration in RPMI Medium in which the mononuclear cell fraction-precipitated cells are suspended, plasma is added so as to be 20% in this case, and the whole is made into a 16 ml cell suspension, Similarly, 16 samples were prepared. And the measured value of the 1st-8th in flow cytometry and the measured value of the 9th-16th which is the same sample group analyzed continuously after deliberately delaying for 1 hour were compared.
3人目の正常健康者で、この本研究への参加に同意し、血液を提供して頂ける方より、ノボ・ヘパリン(Aventis,USA:10000単位/10ml)1ml入り注射器にて30mlの静脈採血を行った。以下、上記と同様の操作手順に従って行った。ただし、単核球分画沈澱細胞を懸濁するRPMI Medium内のヒト血漿濃度に関して、この場合5%になるように血漿を加え、全体を16mlの細胞懸濁液とし、同様に16本のサンプルを準備した。そして、フローサイトメトリーでの1〜8本目の測定値と故意に1時間遅くらせてから連続的に解析した同一のサンプル群である9〜16本目の測定値とを比較した。 A third normal healthy individual who agrees to participate in this study and who can provide blood, will collect 30 ml of venous blood with a syringe containing 1 ml of Novo Heparin (Aventis, USA: 10000 units / 10 ml). went. Thereafter, the same operation procedure as described above was performed. However, with respect to the human plasma concentration in RPMI Medium in which the mononuclear cell fraction-precipitated cells are suspended, in this case, plasma is added so as to be 5% to make a total of 16 ml of cell suspension. Prepared. And the measured value of the 1st-8th in flow cytometry was compared with the measured value of the 9th-16th which is the same sample group analyzed continuously after deliberately delaying for 1 hour.
4人目の正常健康者で、本研究への参加に同意した者より、ノボ・ヘパリン(Aventis,USA:10000単位/10ml)1ml入り注射器にて30mlの静脈採血を行った。以下、上記と同様の操作手順に従って行った。ただし、単核球分画沈澱細胞を懸濁するRPMI Medium内のヒト血漿濃度に関して、この場合25%になるように血漿を加え、全体を16mlの細胞液とし、同様に16本のサンプルを準備した。そして、フローサイトメトリーで1〜8本目の測定値と故意に1時間遅らせてから連続的に解析した同一のサンプル群である9〜16本目の測定値とを比較した。 A fourth normal healthy person who agreed to participate in this study collected 30 ml of venous blood with a 1 ml syringe containing Novo heparin (Aventis, USA: 10000 units / 10 ml). Thereafter, the same operation procedure as described above was performed. However, with respect to the human plasma concentration in RPMI Medium in which mononuclear cell fraction-precipitated cells are suspended, in this case, plasma is added to 25% to make the whole 16 ml of cell solution, and 16 samples are similarly prepared. did. And the measured value of the 1st-8th by flow cytometry was compared with the measured value of the 9th-16th which is the same sample group analyzed continuously after deliberately delaying for 1 hour.
本実験系での実施例1から実施例4までの結果のまとめと結論を以下に記載する。
16本のサンプルを準備し、フローサイトメトリーでの1〜8本目の解析と故意に1時間遅らせてから連続的に解析した同一のサンプル群である9〜16本目を測定値と比較検討した結果より、まず、沈澱細胞群(単核球分画)を懸濁するRPMI Medium内のヒト血漿濃度に関して、5%の場合には、前方散乱を縦軸に側方散乱を横軸にとって描いたグラフ上の単球、マクロファージ、樹状細胞が多く集まったAゲート内の細胞が、時間経過とともに左下方へと外れていき(アポトーシスを表わす)、フローサイトメーターで解析を行った最初のサンプルでは、全体の6.9%がゲート内に入っていたはずが、約1時間後には、4.8%にまで減少した。さらに、CD14のMFI値にも変化が生じた。同一サンプルであるにもかかわらず、TLR3においては、1時間経過後に+46%もの差異を生じ、TLR9においては、−67%の差異が生じた。その他TLR1で+23%の違いがでた。以上のことより、避けられない抗原抗体反応の時間経過内に、1サンプル〜9サンプルにおいても、そのヒトの血液中の細胞状態をそのまま反映したものになっていない可能性が大きく、正確性を欠くことが判る。
A summary and conclusion of the results from Example 1 to Example 4 in this experimental system are described below.
16 samples were prepared, and the results of comparison with the measured values of the 9th to 16th samples, which were the same sample group that was analyzed after the 1st to 8th analysis by flow cytometry and intentionally delayed for 1 hour First, with respect to the human plasma concentration in RPMI Medium in which the precipitated cell group (mononuclear cell fraction) is suspended, in the case of 5%, a graph depicting forward scatter on the vertical axis and side scatter on the horizontal axis In the first sample analyzed by the flow cytometer, the cells in the A gate where a large amount of monocytes, macrophages, and dendritic cells gathered moved away to the lower left with time (indicating apoptosis). 6.9% of the total should have been inside the gate, but after about 1 hour it decreased to 4.8%. Furthermore, a change occurred in the MFI value of CD14. In spite of the same sample, TLR3 produced a difference of + 46% after 1 hour, and TLR9 produced a difference of -67%. In addition, there was a + 23% difference in TLR1. From the above, it is highly possible that even in the time course of the antigen-antibody reaction, which is unavoidable, even in 1 to 9 samples, the cell state in the human blood is not reflected as it is. I understand that I lack it.
次に、沈澱細胞群(単核球分画)を懸濁するRPMI Medium内のヒト血漿濃度に関して、25%の場合にも、Aゲート内の細胞が、時間経過とともに左下方へと外れていき、全体の6.4%あった細胞群が4.9%に減少した。HLA−A,B,C分子発現に−28%の差異を生じ、TLR2で、−41%もの差異が出た。また、TLR9では、+35%の違いが生じ、ヒト血漿濃度を高濃度にしても、アポトーシスは避けられず、これらレセプター群の連続的測定において、そのヒトの血液中の細胞状態をそのまま反映したものになっていない可能性は大きい。 Next, regarding the human plasma concentration in the RPMI Medium in which the precipitated cell group (mononuclear cell fraction) is suspended, the cells in the A gate move downward to the lower left as time passes. The cell group that was 6.4% of the total decreased to 4.9%. There was a -28% difference in HLA-A, B, C molecule expression, and a -41% difference in TLR2. Moreover, in TLR9, a difference of + 35% occurs, and even if the human plasma concentration is high, apoptosis is unavoidable, and in the continuous measurement of these receptor groups, the cell state in the human blood is directly reflected. There is a great possibility that it is not.
一方、RPMI Medium内のヒト血漿濃度を10%と20%にした場合、10%では、Aゲート内細胞数割合が、6.2%から4.7%へと減少するにもかかわらず(20%では、Aゲート内細胞数割合が、3.5%から3.8%と減少することはなかったが)、すべての測定結果が、±20%以内におさまり、特に、HLA−A,B,C分子発現量に時間的変化が起こっていないということは、細胞へのストレスの少なさを意味したものである。
したがって、フローサイトメトリーによって、これらレセプター群を連続的に測定することにおいて、抗原抗体反応時間、解析時間を合わせた時間経過があるとしても、そのヒトの血液中の細胞状態をそのまま反映したものに近い状態になっている可能性が大きいのは、RPMI Medium内のヒト血漿濃度を10%〜20%にし、単核球分画を混濁させ、測定を行った場合であると判断できる。
On the other hand, when the human plasma concentration in RPMI Medium is 10% and 20%, the percentage of cells in the A gate decreases from 6.2% to 4.7% at 10% (20% %, The ratio of the number of cells in the A gate did not decrease from 3.5% to 3.8%), but all the measurement results were within ± 20%, especially HLA-A, B , The fact that there is no temporal change in the C molecule expression level means that there is less stress on the cells.
Therefore, by continuously measuring these receptor groups by flow cytometry, even if there is a time course that combines the antigen-antibody reaction time and the analysis time, it reflects the cellular state of the human blood as it is. It is possible to determine that the possibility of being in a close state is large when the human plasma concentration in RPMI Medium is 10% to 20%, the mononuclear cell fraction is turbid, and the measurement is performed.
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