JP2005504020A - Nuclease resistant chimeric oligonucleotide - Google Patents

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    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07HSUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids

Abstract

本発明は、新規なヌクレアーゼ耐性オリゴマー化合物、及びオリゴマー化合物の該耐性を高めるための新規な方法に関する。本発明の好ましい実施態様では、オリゴマー化合物は、該オリゴマー化合物の3’又は5’末端のいずれかに、修飾糖部分を含有する少なくとも1つの修飾ヌクレオシドを含み、さらに、ホスホジエステル以外である、少なくとも1つのヌクレオシド間連結基を含む。本発明の他の好ましい実施態様は、オリゴマー化合物のヌクレアーゼ耐性を強化する方法であって、修飾糖部分を含有する、少なくとも1つの修飾ヌクレオシドを、オリゴマー化合物の3’又は5’末端のいずれかに組み入れることを含む方法を包含する。The present invention relates to a novel nuclease-resistant oligomeric compound and a novel method for increasing the resistance of oligomeric compounds. In a preferred embodiment of the invention, the oligomeric compound comprises at least one modified nucleoside containing a modified sugar moiety at either the 3 ′ or 5 ′ end of the oligomeric compound, and is at least one other than a phosphodiester, Contains one internucleoside linking group. Another preferred embodiment of the present invention is a method for enhancing the nuclease resistance of an oligomeric compound, wherein at least one modified nucleoside containing a modified sugar moiety is attached to either the 3 ′ or 5 ′ end of the oligomeric compound. Includes methods that include incorporating.

Description

【0001】
関連出願へのクロスリファレンス
本出願は、2001年12月10日出願の米国特許出願第10/013,295号;2001年11月28日出願の米国特許出願第09/996,292号;および2001年7月3日出願の米国仮特許出願第60/302,682号の恩典を主張する。
【0002】
発明の分野
本発明は、新規なヌクレアーゼ耐性オリゴマー化合物およびオリゴマー化合物のヌクレアーゼ耐性を増加させる新規な方法に関する。
【0003】
発明の背景
生体系におけるアンチセンスオリゴヌクレオチド(ON)の効力および配列特異的性質は、酵素分解へのそれらの耐性に依存する。したがって、強力なアンチセンス薬を設計する場合、高い結合親和性およびミスマッチ感受性などの特徴とヌクレアーゼ耐性とを組み合わせることが不可欠である。未修飾ホスホジエステルアンチセンスオリゴヌクレオチドは、加水分解酵素を含有する体液中で速やかに分解されるが(Shaw,J.P.; Kent,K.; Bird,J.; Fishback,J.; Froehler,B. Nucleic Acids Res. 1991,19,747-750; Woolf,T.M.; Jennings,C.G.B.; Rebagliati,M; Melton,D.A. Nucleic Acids Res. 1990,18,1763-1769)、2’−デオキシホスホロチオエートオリゴヌクレオチドなどの修飾アンチセンスオリゴヌクレオチド薬の最初に作られたものも、酵素分解を受けた(Maier,M.; Bleicher,K.; Kalthoff,H.; Bayer,E. Biomed.Pept., Proteins Nucleic Acids 1995,1,235-241; Agrawal,S.; Temsamani,J.; Tang,J.Y. Proc.Natl.Acad.Sci. 1991,88,7595-7599)。生体系に存在する種々のヌクレアーゼに対する広範な安定性は、修飾オリゴヌクレオチドによって最も良く達成することができる。3’エキソヌクレアーゼ活性は、主に、血清含有培地中および種々の真核細胞系における酵素分解の原因となっているので、3’末端に位置する修飾は、オリゴヌクレオチドのヌクレアーゼ耐性に有意に寄与する(Shaw,J.-P.; Kent,K.; Bird,J.; Fishback,J.; Froehler,B. Nucleic Acids Res. 1991,19,747-750; Maier,M.; Bleicher,K.; Kalthoff,H.; Bayer,E. Biomed.Pept., Proteins Nucleic Acids 1995,1,235-241)。
【0004】
広範な修飾が、オリゴヌクレオチドのホスホジエステル結合および糖部分に行われてきているが、複素環式塩基部分への修飾は、塩基対特異性に必要とされる特異的水素結合モチーフを維持する要望のために、比較的限られている(概説については、Herdewijn,P. Antisense Nucleic Acids Drug Dev. 2000,10,297-310 を参照されたい)。2’位は、ヌクレアーゼ耐性および結合親和性双方を増大させる利点を与えるので、誘導体化にとって魅力的である(Manoharan,M. Biochim.Biophys.Acta 1999,1489,117-130; Kawasaki,A.M.; Casper,M.D.; Prakash,T.P.; Manalili,S.; Sasmor,H.; Manoharan,M.; Cook,P.D. Nucleosides Nucleotides 1999,18,1419-1420)。
【0005】
アンチセンスオリゴヌクレオチドのそれらの相補的標的鎖への結合親和性を増大させるように設計されたきわめて多数の核酸塩基修飾が、最近紹介されている(Beaucage,S.L.; Iyer,R.P. Tetrahedron 1993;49,6123-94; Cook,P.D. Annu.Rep.Med.Chem. 1998,33,313-325; Goodchild,J. Bioconjugate Chemistry, 1990;1,165-87; Uhlmann,E.; Peyman,A. Chem.Rev. 1990,90,543-84. 概説については、Uhlmann,E.; Peyman,A. Chem.Rev. 1990,90,543-584; Milligan,J.F.; Matteucci,M.D.; Martin,J.C. J.Med.Chem. 1993,36,1923-37; Cook,P.D. Antisense medicinal chemistry. In: Antisense Research and Application, A Handbook of Experimental Pharmacology (ed. Crooke,S.t.), pp.51-101. Springer-Verlag, New York, 1998 を参照されたい)。若干の複素環修飾は、増加した水素結合および/または塩基スタッキング相互作用によって核酸の結合親和性を増大させることが分かっている。このような複素環修飾の例には、2,6−ジアミノプリンが含まれるが、これは、チミジンとの第3位の水素結合、およびピリミジン塩基のC5位の水素原子のプロピニル基での置換を可能にし、増加したスタッキング相互作用を生じる(Chollet,A.; Chollet-Damerius,A.; Kawashima,E.H. Chem.Scripta 1986,26,37-40; Wagner,R.W.; Matteucci,M.D.; Lewis,J.G.; Guttierrez,A.J.; Moulds,C.; Froehler,B.C. Science 1993,260,1510-1513)。
【0006】
より最近では、フェノキサジン、フェノチアジン(Lin,K.-Y.; Jones,R.J.; Matteucci,M. J.Am.Chem.Soc. 1995,117,3873-3874)およびテトラフルオロフェノキサジン(Wang,J.; Lin,K.-Y., Matteucci,M. Tetrahedron Lett. 1998,39,8385-8388)などのいくつかの三環式シトシン類似体が開発され、グアニンにハイブリッド形成すること、しかもテトラフルオロフェノキサジンの場合はアデニンともハイブリッド形成することが分かっている。これら三環式シトシン類似体は、伸長したスタッキング相互作用によってらせんの熱安定性を増大させることも分かっている。
【0007】
三環式シトシン類似体のらせんを安定化する性質は、剛性フェノキサジンスカホールドに取り付けられたアミノエトキシ部分を含むシトシン類似体であるG−クランプで更に向上する(Lin,K.-Y.; Matteucci,M. J.Am.Chem.Soc. 1998,120,8531-8532)。結合研究は、単一のG−クランプが、モデルオリゴヌクレオチドのその相補的標的DNAまたはRNAへの結合親和性を、単一修飾について知られている最も高い親和性増大である5−メチルシトシン(dC5me)に相対して18°までのΔTで増大させるということを示している。このTデータは、dC5meと比較したところ、完全に対合した配列と誤対合配列との間になお一層大きい差を示すので、らせん安定性の増加は、オリゴヌクレオチドの結合特異性に影響することはない。束縛されたアミノ基は、相補的グアニンのフーグスティーン面、すなわちO6と相互作用する追加の水素結合ドナーとして役立ちうる。したがって、G−クランプの増加した親和性は、伸長した塩基スタッキングと追加の水素結合との組合せによって媒介されると考えられる。
【0008】
フェノキサジン誘導体の増大した結合親和性は、それらの影響されない配列特異性と一緒に、それら誘導体を、アンチセンスに基づいたより強力な薬物の開発に有効な核酸塩基類似体にする。有望なデータは、フェノキサジン置換を含有するヘプタヌクレオチドが、RNアーゼHを活性化することができ、細胞内取込みを促し、そして増加したアンチセンス活性を示すということを実証している in vitro 実験に由来している(Lin,K.-Y.; Matteucci,M. J.Am.Chem.Soc. 1998,120,8531-8532)。単一置換が、20マーの2’−デオキシホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの in vitro 力価を有意に向上させることが示されたところでは、この活性増大は、G−クランプの場合になお一層顕著であった(Flanagan,W.M.; Wolf,J.J.; Olson,P.; Grant,D.; Lin,K.-Y.; Wagner,R.W.; Matteucci,M. Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 1999,96,3513-3518)。
【0009】
生体系におけるオリゴヌクレオチドの効力および配列特異性は、一部分は、それらのヌクレアーゼ安定性に依存する。生体系に存在する多数のヌクレアーゼへの耐性は、修飾オリゴヌクレオチドによって最も良く達成される。したがって、修飾ヌクレオチドを設計する場合、酵素分解へのそれらの耐性を評価し且つ最適化することが不可欠である。
【0010】
発明の概要
本発明は、新規なヌクレアーゼ耐性オリゴマー化合物、及びオリゴマー化合物のヌクレアーゼ耐性を増強するための新規な方法に関する。
【0011】
好ましい実施態様では、本発明の化合物は、式V:
【0012】
【化1】

Figure 2005504020
【0013】
で示されるオリゴマー化合物に関する、上記式において、
nは3〜約50であり;各Yは、独立的に、ヌクレオシド間連結基であり;Yは酸素又はヌクレオシド間連結基であり;Yは酸素又はヌクレオシド間連結基であり;各Bxは任意に保護される複素環塩基部分であり;各Aは、独立的に、水素又は糖置換基であり;Wは水素、ヒドロキシル保護基又は
【0014】
【化2】
Figure 2005504020
【0015】
から成る群から選択される修飾ヌクレオシドであり;Wは水素、ヒドロキシル保護基又は
【0016】
【化3】
Figure 2005504020
【0017】
から成る群から選択される修飾ヌクレオシドであり;各Aは、独立的に、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アルカリール、O−アルキル、O−アリール、アミノ、置換アミノ、−SH、−SA、チオールエーテル、F、又はモルホリノであり;各Aは、独立的に、H、硫黄保護基、アリール、アルカリール、置換若しくは非置換C−C10アルキル、置換若しくは非置換C−C10アルケニル、置換若しくは非置換C−C10アルキニル、又はアルカリールであり、前記置換基はOA又はSAであり;各Aは、独立的に、H、窒素保護基、置換若しくは非置換C−C10アルキル、置換若しくは非置換C−C10アルケニル、置換若しくは非置換C−C10アルキニル、又はアルカリールであり、前記置換基はOA又はSAであり;各Aは、独立的に、水素、C−C10アルキル、シクロアルキル又はアリールであり;各Vは、独立的に、O又はSであり;WとWの少なくとも1つは、水素でも又はヒドロキシル保護基でもなく、少なくとも1つのヌクレオシド間連結基は、ホスホジエステル連結基ではない。
【0018】
ある一定の好ましい実施態様では、式Vで示される化合物のヌクレオシド間連結基は、リン含有ヌクレオシド間連結基である。さらにより好ましい実施態様では、式Vで示される化合物の少なくとも1つのヌクレオシド間連結基は、ホスホジエステル以外であり、より好ましくは、式Vで示される化合物のヌクレオシド間連結基の90%より多くが、非リン含有ヌクレオシド間連結基である。なお一層好ましい実施態様では、式Vで示される化合物のヌクレオシド間連結基の90%より多くが、ホスホロチオエート連結基である。
【0019】
本発明のある一定の他の実施態様では、式Vで示されるオリゴマー化合物は、ギャップマー、ヘミマー又は逆ギャップマーを含む。より好ましい実施態様では、式Vで示されるオリゴマー化合物は、ギャップマー、ヘミマー又は逆ギャップマーの少なくとも1つの領域に少なくとも1つの2’−O−CHCH−O−CH糖置換基を含む。
【0020】
本発明の他の実施態様では、式Vで示されるオリゴマー化合物は、Bxが多環状複素環塩基部分である、少なくとも1つのヌクレオシドを含む。より好ましい実施態様では、式Vで示されるオリゴマー化合物は、Bxが、独立的に、式:
【0021】
【化4】
Figure 2005504020
【0022】
で示される、少なくとも1つのヌクレオシドを含む、上記式において、
はO又はSであり;AはCH、N−CH、O又はSであり;各A及びAは水素であるか、又はA及びAの一方は水素であり、A及びAの他方は、式:
【0023】
【化5】
Figure 2005504020
【0024】
から成る群から選択される、上記式において、
Gは、−CN、−OA10、−SA10、−N(H)A10、−ON(H)A10又は−C(=NH)N(H)A10であり;Qは、H、−NHA10、−C(=O)N(H)A10、−C(=S)N(H)A10又は−C(=NH)N(H)A10であり;各Qは、独立的に、H又はPgであり;A10はH、Pg、置換若しくは非置換C−C10アルキル、アセチル、ベンジル、−(CHp3NH、−(CHp3N(H)Pg、D若しくはLα−アミノ酸、又はD、L若しくはラセミα−アミノ酸に由来するペプチドであり;Pgは窒素、酸素又はチオール保護基であり;各P1は、独立的に、2〜約6であり;P2は1〜約3であり;そしてP3は1〜約4である。
【0025】
本発明の他の好ましい実施態様では、式VのYはヌクレオシド間連結基であり、式VのWは修飾ヌクレオシドである。本発明の他の実施態様では、式VのYはヌクレオシド間連結基であり、式VのWは修飾ヌクレオシドである。
【0026】
本発明のある一定の好ましい実施態様では、式Vの各糖置換基は、独立的に、−O−CHCHOCH、−O(CHON(CH、−O−(CH−O−(CH−N(CH、−O−CH、−OCHCHCHNH、−CH−CH=CH、又はフルオロである。
【0027】
他の好ましい実施態様では、本発明は、オリゴマー化合物のヌクレアーゼ耐性を強化する方法であって、該オリゴマー化合物の3’又は5’末端のいずれかに少なくとも1つの修飾ヌクレオシドを与えて、式VのW及びWの少なくとも1つが水素でもなく、またヒドロキシル保護基でもないような、式Vで示される修飾オリゴマー化合物を得ることを含む方法に関する。
【0028】
好ましい態様の詳細な説明
本発明の文脈中において、「オリゴマー」および「オリゴマー化合物」という用語は、特異的配列中に互いに接続される複数の天然に存在するまたは天然に存在しないヌクレオシドを意味する。この「オリゴマー」および「オリゴマー化合物」という用語には、オリゴマー化合物を領域に分ける二つ以上のタイプのヌクレオシド間結合が存在しているオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド類似体、オリゴヌクレオシドおよびキメラオリゴマー化合物が含まれる。オリゴマー化合物は、典型的には、天然に存在するまたは合成の野生型オリゴヌクレオチドと構造的に区別しうるが、機能的になお交換可能である。したがって、オリゴマー化合物には、所望のRNAまたはDNA鎖の構造および/または機能を模擬するように、例えば、標的にハイブリッド形成することによって有効に機能する全てのこのような構造が含まれる。
【0029】
本発明の文脈中において、「オリゴヌクレオチド」という用語は、リボ核酸(RNA)またはデオキシリボ核酸(DNA)またはその模擬体のオリゴマーまたはポリマーを意味する。この用語には、天然に存在する核酸塩基、糖およびヌクレオシド間(主鎖)共有結合を含んでなるオリゴヌクレオチド、更には、天然に存在しない部分を有する同様に機能するオリゴヌクレオチドが含まれる。このような修飾されたまたは置換されたオリゴヌクレオチドは、例えば、増大した細胞内取込み、増大した核酸標的への親和性およびヌクレアーゼの存在下の増加した安定性などの望ましい性質ゆえに、しばしば、天然の形より好適である。
【0030】
当該技術分野において知られているように、ヌクレオシドは塩基−糖組合せである。ヌクレオシドの塩基部分は、通常は、複素環式塩基である。このような複素環式塩基の最も一般的な二つのクラスは、プリンおよびピリミジンである。ヌクレオチドは、ヌクレオシドであって、そのヌクレオシドの糖部分に共有結合したリン酸基を更に包含するヌクレオシドである。ペントフラノシル糖を包含するそれらヌクレオシドについて、リン酸基は、糖の2’か、3’かまたは5’ヒドロキシル部分に連結することができる。オリゴヌクレオチドを形成する場合、これらリン酸基は、隣接するヌクレオシドを互いに共有結合させて、直鎖状ポリマー化合物を形成する。順次に、この直鎖状ポリマー構造のそれぞれの末端を更に接続して、環状構造を形成することができる。しかしながら、概して、開放直鎖状構造が好適である。オリゴヌクレオチド構造内では、これらリン酸基は、一般的には、オリゴヌクレオチドのヌクレオシド間主鎖を形成しているといわれている。RNAおよびDNAの通常の結合または主鎖は、3’〜5’ホスホジエステル結合である。
【0031】
本発明において有用な好ましいオリゴマー化合物の具体的な例には、修飾された主鎖または天然に存在しないヌクレオシド間結合を有するものが含まれる。本明細書中に定義されるように、修飾された主鎖には、主鎖中にリン原子を有するもの、および主鎖中にリン原子を有していないものが含まれる。本明細書の目的のために、および当該技術分野において時々論及されるように、ヌクレオシド間主鎖中にリン原子を有していない修飾オリゴヌクレオチドも、オリゴヌクレオシドであるとみなすことができる。
【0032】
好ましい修飾オリゴヌクレオチド主鎖には、例えば、ホスホロチオエート;キラルホスホロチオエート;ホスホロジチオエート;ホスホトリエステル;アミノアルキルホスホトリエステル;3’−アルキレンホスホネート、5’−アルキレンホスホネートおよびキラルホスホネートを含めたメチルおよび他のアルキルホスホネート;ホスフィネート;3’−アミノホスホロアミデートおよびアミノアルキルホスホロアミデートを含めたホスホロアミデート;チオノホスホロアミデート;チオノアルキルホスホネート;チオノアルキルホスホトリエステル;通常の3’−5’結合を有するセレノホスフェートおよびボラノホスフェート、これらの2’−5’連結類似体、および1個またはそれを超えるヌクレオチド間結合が3’−3’、5’−5’または2’−2’結合である逆方向極性を有するものが含まれる。逆方向極性を有する好ましいオリゴヌクレオチドは、大部分の3’−ヌクレオチド間結合に単一の3’−3’結合、すなわち、非塩基性であってよい(核酸塩基が欠失しているまたは核酸塩基の代わりにヒドロキシル基を有する)単一逆ヌクレオシド残基を含む。種々の塩、混合塩および遊離酸の形も包含される。
【0033】
代表的なリン含有結合
ホスホロジチオエート(−O−P(S)(S)−O−);
ホスホロチオエート(−O−P(S)(O)−O−);
ホスホロアミデート(−O−P(O)(NJ)−O−);
ホスホネート(−O−P(J)(O)−O−);
ホスホトリエステル(−O−P(OJ)(O)−O−);
ホホスホロアミデート(−O−P(O)(NJ)−S−);
チオノアルキルホスホネート(−O−P(S)(J)−O−);
チオノアルキルホスホトリエステル(−O−P(O)(OJ)−S−);
ホスホロアミデート(−N(J)−P(O)(O)−O−);
ボラノホスフェート(−R−P(O)(O)−J−)
式中、Jは、一般的には、水素またはアルキル基、または一つのタイプの結合から別のものへと変化する一層複雑な基である置換基を示す。
【0034】
上記のリン含有結合の製造を教示している代表的な米国特許には、各々が本明細書中に援用され且つ若干のものは本出願と同一所有される、米国特許第3,687,808号;第4,469,863号;第4,476,301号;第5,023,243号;第5,177,196号;第5,188,897号;第5,264,423号;第5,276,019号;第5,278,302号;第5,286,717号;第5,321,131号;第5,399,676号;第5,405,939号;第5,453,496号;第5,455,233号;第5,466,677号;第5,476,925号;第5,519,126号;第5,536,821号;第5,541,306号;第5,550,111号;第5,563,253号;第5,571,799号;第5,587,361号;第5,194,599号;第5,565,555号;第5,527,899号;第5,721,218号;第5,672,697号;および第5,625,050号が含まれるが、これに制限されるわけではない。
【0035】
リン原子をその中に包含しない好ましい修飾主鎖は、短鎖アルキルまたはシクロアルキルヌクレオシド間結合、混合ヘテロ原子およびアルキルまたはシクロアルキルヌクレオシド間結合、または一つまたはそれを超える短鎖ヘテロ原子または複素環のヌクレオシド間結合によって形成されるものである。これらには、モルホリノ結合(ヌクレオシドの糖部分から一部分形成される)を有するもの;シロキサン主鎖;スルフィド、スルホキシドおよびスルホン主鎖;ホルムアセチルおよびチオホルムアセチル主鎖;メチレンホルムアセチルおよびチオホルムアセチル主鎖;リボアセチル主鎖;アルケン含有主鎖;スルファメート主鎖;メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノ主鎖;スルホネートおよびスルホンアミド主鎖;アミド主鎖;およびN、O、SおよびCHの混合成分部分を有するその他が含まれる。
【0036】
代表的なリン不含結合
チオジエステル(−O−C(O)−S−);
チオノカルバメート(−O−C(O)(NJ)−S−);
シロキサン(−O−Si(J)−O−);
カルバメート(−O−C(O)−NH−および−NH−C(O)−O−);
スルファメート(−O−S(O)(O)−N−および−N−S(O)(O)−N−);
モルホリノスルファミド(−O−S(O)(N(モルホリノ)−);
スルホンアミド(−O−SO−NH−);
スルフィド(−CH−S−CH−);
スルホネート(−O−SO−CH−);
N,N’−ジメチルヒドラジン(−CH−N(CH)−N(CH)−);
チオホルムアセタール(−S−CH−O−);
ホルムアセタール(−O−CH−O−);
チオケタール(−S−C(J)−O−);および
ケタール(−O−C(J)−O−);
アミン(−NH−CH−CH−);
ヒドロキシルアミン(−CH−N(J)−O−);
ヒドロキシルイミン(−CH=N−O−);および
ヒドラジニル(−CH−N(H)−N(H)−)。
【0037】
式中、Jは、一般的には、水素またはアルキル基、または一つのタイプの結合から別のものへと変化する一層複雑な基である置換基を示す。
上記のオリゴヌクレオシドの製造を教示している代表的な米国特許には、各々が本明細書中に援用され且つ若干のものは本出願と同一所有される、米国特許第5,034,506号;第5,166,315号;第5,185,444号;第5,214,134号;第5,216,141号;第5,235,033号;第5,264,562号;第5,264,564号;第5,405,938号;第5,434,257号;第5,466,677号;第5,470,967号;第5,489,677号;第5,541,307号;第5,561,225号;第5,596,086号;第5,602,240号;第5,610,289号;第5,602,240号;第5,608,046号;第5,610,289号;第5,618,704号;第5,623,070号;第5,663,312号;第5,633,360号;第5,677,437号;第5,792,608号;第5,646,269号;および第5,677,439号が含まれるが、これに制限されるわけではない。
【0038】
ある一定の好ましいオリゴヌクレオチド模擬体において、ヌクレオチド単位の糖およびヌクレオシド間結合、すなわち、主鎖は両方とも、新規な基で置換される。塩基単位は、適当な核酸標的化合物とのハイブリダイゼーションのために維持される。優れたハイブリダイゼーション特性を有することが分かっているオリゴヌクレオチド模擬体である一つのこのようなオリゴマー化合物を、ペプチド核酸(PNA)と称する。PNA化合物において、オリゴヌクレオチドの糖−主鎖は、アミド含有主鎖、具体的には、アミノエチルグリシン主鎖で置換される。核酸塩基は保持され、主鎖のアミド部分のアザ窒素原子に直接的にまたは間接的に結合している。PNA化合物の製造を教示している代表的な米国特許には、各々が本明細書中に援用される米国特許第5,539,082号;第5,714,331号;および第5,719,262号が含まれるが、これに制限されるわけではない。PNA化合物の更に別の教示は、Nielsen et al., Science, 1991,254,1497-1550 に見出されうる。
【0039】
本発明の好ましい化合物の中には、ホスホロチオエート主鎖を有するオリゴヌクレオチド、およびヘテロ原子主鎖、具体的には、上に挙げられた米国特許第5,489,677号の−CH−NH−O−CH−、−CH−N(CH)−O−CH−[メチレン(メチルイミノ)MMI主鎖としてまたはより一般的には、メチレンイミノとして知られる]、−CH−O−N(CH)−CH−、−CH−N(CH)−N(CH)−CH−および−O−N(CH)−CH−CH−、および上に挙げられた米国特許第5,602,240号のアミド主鎖を有するオリゴヌクレオチドがある。更に好適なのは、上に挙げられた米国特許第5,034,506号のモルホリノ主鎖構造を有するオリゴヌクレオチドである。
【0040】
本明細書中で用いられる「Bx」は、複素環式塩基部分を示すものである。本発明にしたがう複素環式塩基部分(しばしば、当該技術分野において単純に「塩基」または「核酸塩基」と称される)には、天然に存在するまたは天然に存在しない核酸塩基が含まれる。この塩基の一つのまたはそれを超える官能基は、保護基を有することができる。本明細書中で用いられる「未修飾」または「天然の」核酸塩基には、アデニン(A)およびグアニン(G)のプリン塩基、およびチミン(T)、シトシン(C)およびウラシル(U)のピリミジン塩基が含まれる。修飾核酸塩基には、5−メチルシトシン(5−me−C)、5−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、2−アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの6−メチルおよび他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの2−プロピルおよび他のアルキル誘導体、2−チオウラシル、2−チオチミンおよび2−チオシトシン、5−ハロウラシルおよびシトシン、5−プロピニル(−C≡C−CH)ウラシルおよびシトシン、およびピリミジン塩基の他のアルキニル誘導体、6−アゾウラシル、シトシンおよびチミン、5−ウラシル(プソイドウラシル)、4−チオウラシル、8−ハロ、8−アミノ、8−チオール、8−チオアルキル、8−ヒドロキシルおよび他の8−置換アデニンおよびグアニン、5−ハロ、特に、5−ブロモ、5−トリフルオロメチルおよび他の5−置換ウラシルおよびシトシン、7−メチルグアニンおよび7−メチルアデニン、2−F−アデニン、2−アミノアデニン、8−アザグアニンおよび8−アザアデニン、7−デアザグアニンおよび7−デアザアデニン、および3−デアザグアニンおよび3−デアザアデニンなどの他の合成および天然の核酸塩基が含まれる。更に別の修飾核酸塩基には、フェノキサジンシチジン(1H−ピリミド[5,4−b][1,4]ベンゾキサジン−2(3H)−オン)、フェノチアジンシチジン(1H−ピリミド[5,4−b][1,4]ベンゾチアジン−2(3H)−オン)、置換フェノキサジンシチジン(例えば、9−(2−アミノエトキシ)−H−ピリミド[5,4−b][1,4]ベンゾキサジン−2(3H)−オン)のようなG−クランプ、カルバゾールシチジン(2H−ピリミド[4,5−b]インドール−2−オン)、ピリドインドールシチジン(H−ピリド[3’,2’:4,5]ピロロ[2,3−d]ピリミジン−2−オン)のような三環式ピリミジンが含まれる。修飾核酸塩基には、プリンまたはピリミジン塩基が、他の複素環、例えば、7−デアザアデニン、7−デアザグアノシン、2−アミノピリジンおよび2−ピリドンで置換されているものが含まれる。
【0041】
更に別の核酸塩基には、米国特許第3,687,808号に開示されたもの、The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering, pages 858-859, Kroschwitz,J.I., ed. John Wiley & Sons, 1990 に開示されたもの、Englisch et al., Angewandte Chemie,International Edition, 1991,30,613 によって開示されたもの、および Sanghvi,Y.S., Chapter 15, Antisense Research and Applications, pages 289-302, Crooke,S.T. and Lebleu,B., ed., CRC Press, 1993 によって開示されたものが含まれる。ある一定のこれら核酸塩基は、本発明のオリゴマー化合物の結合親和性を増加させるのに特に有用である。これらには、5−置換ピリミジン、6−アザピリミジン、および2−アミノプロピルアデニン、5−プロピニルウラシルおよび5−プロピニルシトシンを含めたN−2、N−6およびO−6置換プリンが含まれる。5−メチルシトシン置換は、核酸二重らせん安定性を0.6〜1.2℃増加させることが分かっており(Sanghvi,Y.S., Crooke,S.T. and Lebleu,B., eds., Antisense Research and Applications, CRC Press, Boca Raton, 1993,pp.276-278)、現在のところ、より具体的には、2’−O−メトキシエチル糖修飾と組み合わされた場合でも、好適な塩基置換である。
【0042】
ある一定の上記修飾核酸塩基並びに他の修飾核酸塩基の製造を教示する代表的な米国特許には、上記の米国特許第3,687,808号、並びに、各々が本明細書中に援用され且つ若干のものは本出願と同一所有される米国特許第4,845,205号;第5,130,302号;第5,134,066号;第5,175,273号;第5,367,066号;第5,432,272号;第5,457,187号;第5,459,255号;第5,484,908号;第5,502,177号;第5,525,711号;第5,552,540号;第5,587,469号;第5,594,121号;第5,596,091号;第5,614,617号;第5,645,985号;第5,830,653号;第5,763,588号;第6,005,096号;第5,681,941号;および第5,750,692号が含まれるが、これに制限されるわけではない。
【0043】
本発明の一つの側面において、オリゴマー化合物は、多環式複素環式塩基部分を含む一つまたはそれを超える複素環式塩基部分を有して製造される。本明細書中で用いられる多環式複素環式塩基部分という用語は、少なくとも3個またはそれを超える縮合環を含む化合物を包含する意味である。多数の三環式および若干の四環式の複素環式化合物が製造されていて、オリゴマー化合物中の天然に存在する複素環式塩基部分の代わりに代用されている。得られたオリゴマー化合物は、例えば、標的鎖への修飾鎖の結合性を増加させるアンチセンス用途に用いられてきている。より多くの研究された修飾は、グアノシンに集中していて、一般的には、シチジン類似体と称される。
【0044】
本発明の一つの側面において、多環式複素環式塩基部分は、式
【0045】
【化6】
Figure 2005504020
【0046】
を有する。
第2鎖中または同じ鎖中の他のところのグアノシンと3個の水素結合を作る代表的なシトシン類似体には、1,3−ジアザフェノキサジン−2−オン(R10=O,R11〜R14=H)[Kurchavov, et al., Nucleosides and Nucleotides, 1997,16,1837-1846]、1,3−ジアザフェノチアジン−2−オン(R10=S,R11〜R14=H)[Lin,K.-Y.; Jones,R.J.; Matteucci,M. J.Am.Chem.Soc. 1995,117,3873-3874]および6,7,8,9−テトラフルオロ−1,3−ジアザフェノキサジン−2−オン(R10=O,R11〜R14=F)[Wang,J.; Lin,K.-Y., Matteucci,M. Tetrahedron Lett. 1998,39,8385-8388]が含まれる。オリゴヌクレオチド中に包含されると、これら塩基修飾は、相補的グアニンとハイブリッド形成することが分かっており、この後者は、アデニンとハイブリッド形成することおよび伸長したスタッキング相互作用によってらせん熱安定性を増大させることも分かっている。
【0047】
更に別の、らせんを安定化させる性質が、アミノエトキシ部分を有するシトシン類似体が剛性1,3−ジアザフェノキサジン−2−オンスカホールドに取り付けられた場合に認められている(R10=O,R11=−O−(CH−NH,R12−14=H,この類似体は、「G−クランプ」という具体的な名称を与えられている)[Lin,K.-Y.; Matteucci,M. J.Am.Chem.Soc. 1998,120,8531-8532]。結合研究は、単一の包含が、モデルオリゴヌクレオチドのその相補的標的DNAまたはRNAへの結合親和性を、単一修飾について知られている最も高い親和性増大でもある5−メチルシトシン(dC5me)に相対して18℃までのΔTで増大させうるということを示した。もう一方において、らせん安定性の増加は、それらオリゴヌクレオチドの特異性に影響することはない。このTデータは、dC5meと比較して、完全な対合配列と誤対合配列との間になお一層大きい差を示す。束縛されたアミノ基は、相補的グアニンのフーグスティーン面、すなわちO6と相互作用することによって4個の水素結合を形成する追加の水素結合ドナーとして役立つということが示唆された。これは、G−クランプの増加した親和性が、伸長した塩基スタッキングと追加の特異的水素結合との組合せによって媒介されるということを意味している。
【0048】
本発明にしたがう更に別の多環式複素環式塩基部分およびそれらの使用方法は、2000年5月22日発行の米国特許第6,028,183号および1999年12月28日発行の米国特許第6,007,992号に開示され、この両者の内容は、本出願と共通に譲渡され且つ本明細書中に援用される。このような化合物には、次の式
【0049】
【化7】
Figure 2005504020
【0050】
を有するものが含まれる。
式中、R11には、(CHN−(CH−O−;HN−(CH−;Ph−CH−O−C(=O)−N(H)−(CH−;HN−;フルオレニル−CH−O−C(=O)−N(H)−(CH−;フタルイミジル−CH−O−C(=O)−N(H)−(CH−;Ph−CH−O−C(=O)−N(H)−(CH−O−;Ph−CH−O−C(=O)−N(H)−(CH−O−;(CHN−N(H)−(CH−O−;フルオレニル−CH−O−C(=O)−N(H)−(CH−O−;フルオレニル−CH−O−C(=O)−N(H)−(CH−O−;HN−(CH−O−CH−;N−(CH−O−CH−;HN−(CH−O−およびNHC(=NH)NH−が含まれる。
【0051】
更に開示されるのは、式
【0052】
【化8】
Figure 2005504020
【0053】
を有する多環式複素環式化合物である。
式中、R10aは、O、SまたはN−CHであり;
11aは、A(Z)X1であり、ここにおいて、Aはスペーサーであり、そしてZは、独立して、検出可能な標識に結合されてよい基を結合している標識結合性基であるが、R11aは、アミン、保護されたアミン、ニトロまたはシアノではなく;
X1は、1、2または3であり;そして
は、独立して、−CH=、−N=、−C(C1−8アルキル)=または−C(ハロゲン)=であるが、隣接したRが両方とも−N=であることはないし、または二つの隣接したRは一緒になって、次の構造
【0054】
【化9】
Figure 2005504020
【0055】
(式中、Rcは、独立して、−CH=、−N=、−C(C1−8アルキル)=または−C(ハロゲン)=であるが、隣接したRが両方とも−N=であることはない)
を有する環を形成する。
【0056】
フェノキサジン誘導体の増大した結合親和性は、それらの影響されない配列特異性と一緒に、これら多環式複素環式塩基部分を、アンチセンスに基づいたより強力な薬物の開発に有効な核酸塩基類似体にする。事実、有望なデータは、フェノキサジン置換を含有するヘプタヌクレオチドが、RNアーゼHを活性化することができ、細胞内取込みを促し、そして増加したアンチセンス活性を示すということを実証している in vitro 実験に由来している[Lin,K.-Y.; Matteucci,M. J.Am.Chem.Soc. 1998,120,8531-8532]。単一置換が、20マーの2’−デオキシホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの in vitro 力価を有意に向上させることが示されたところでは、複素環式塩基部分がG−クランプであった場合、活性増大はなお一層顕著であった[Flanagan,W.M.; Wolf,J.J.; Olson,P.; Grant,D.; Lin,K.-Y.; Wagner,R.W.; Matteucci,M. Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 1999,96,3513-3518]。それにもかかわらず、オリゴヌクレオチド設計を最適にするためにおよび生物学的活性へのこれら多環式複素環式塩基修飾の影響をより良く理解するためには、オリゴマーのヌクレアーゼ安定性へのそれらの作用を評価することが重要である。
【0057】
本発明にしたがう三環式および四環式ヘテロアリール化合物を含む更に別の多環式複素環式塩基部分には、式
【0058】
【化10】
Figure 2005504020
【0059】
(式中、R14はNOであり、またはR14およびR12は両方とも、独立して、−CHである)
を有するものが含まれる。これら化合物の合成は、1995年7月18日発行の米国特許第5,434,257号、1996年3月26日発行の米国特許第5,502,177号および1997年7月8日発行の米国特許第5,646,269号に開示され、これらの内容は、本出願と共通に譲渡され且つ本明細書中に援用される。
【0060】
この「257号,177号および269号」特許にも開示された、本発明にしたがう更に別の多環式複素環式塩基部分には、式
【0061】
【化11】
Figure 2005504020
【0062】
(式中、aおよびbは、独立して、0または1であり、但し、aおよびbの合計は0または1であり;
Aは、N、CまたはCHであり;
Xは、S、O、C=O、NHまたはNCH、Rであり;
Yは、C=Oであり;
Zは、Aと一緒になって、5個または6個の環原子を含むアリールまたはヘテロアリール環構造を形成し、ここにおいて、このヘテロアリール環は、1個のO環ヘテロ原子、1個のN環ヘテロ原子、1個のS環ヘテロ原子、炭素原子で隔てられた1個のOおよび1個のNの環ヘテロ原子、C原子で隔てられた1個のSおよび1個のNの環ヘテロ原子、炭素原子で隔てられた2個のN環ヘテロ原子、または少なくとも2個は炭素原子で隔てられている3個のN環ヘテロ原子を含み、そしてこのアリールまたはヘテロアリール環の炭素原子は、H以外で未置換であり、または少なくとも1個の非架橋環炭素原子は、R20または=Oで置換されていて;または
Zは、Aと一緒になって、6個の環原子を含むアリール環構造を形成し、ここにおいて、アリール環炭素原子は、H以外で未置換であり、または少なくとも1個の非架橋環炭素原子は、Rまたは=Oで置換されていて;
は、独立して、H、C1−6アルキル、C2−6アルケニル、C2−6アルキニル、NO、N(R、CNまたはハロであり、またはRは、隣接したZ基Rと一緒になって、フェニル環を完成し;
20は、独立して、H、C1−6アルキル、C2−6アルキル、C2−6アルケニル、C2−6アルキニル、NO、N(R21、CNまたはハロであり、またはR20は、隣接したR20と一緒になって、5個または6個の環原子を含有する環、およびその互変異性体、溶媒和化合物および塩を完成し;
21は、独立して、Hまたは保護基であり;
は、保護基またはHである)
を有するもの;およびそれらの互変異性体、溶媒和化合物および塩が含まれる。
【0063】
この「257号,177号および269号」特許に含まれるより具体的な例は、式
【0064】
【化12】
Figure 2005504020
【0065】
(式中、R16は、各々独立して、水素および種々の置換基より選択される)
を有する化合物である。
本発明は、好ましいヌクレオシド間結合が3’,5’−結合である複数の連結したヌクレオシドを含むオリゴマー化合物を提供する。或いは、2’,5’−結合を用いることができる(1998年7月14日出願の米国特許出願第09/115,043号に記載のような)。2’,5’−結合は、一つのヌクレオチドサブユニットの糖部分の2’位を、隣接したヌクレオチドサブユニットの糖部分の5’位と共有結合によって連結するものである。
【0066】
本明細書中に記載の化合物は、不斉中心を有してよい。特に断らない限り、キラルの形、ジアステレオマーおよびラセミ体は全て、本発明中に包含される。幾何異性体は、本明細書中に記載の化合物中にも存在してよいが、このような安定な異性体は全て、本発明によって包含される。非対称的に置換された炭素原子を含有する本発明による化合物を、光学活性体またはラセミ体で、または合成によって単離することができるということは理解されるであろう。
【0067】
本発明は、中間体または最終化合物中に存在する原子の同位体を全て包含する。同位体には、同じ原子番号であるが、異なった質量数を有する原子が含まれる。例として、制限することなく、水素の同位体には、トリチウムおよびジュウテリウムが含まれる。
【0068】
本明細書中で用いられる「糖置換基」という用語は、選択された糖部分の2’位、3’位または5’位に取り付けられている保護されていてよい基を意味する。糖置換基は、複素環式塩基に、例えば、アミノ官能基における取り付けによって取り付けられてもいる。
【0069】
本発明にしたがう糖置換基の代表的なリストには、ヒドロキシル、C−C20アルキル、C−C20アルケニル、C−C20アルキニル、C−C20アリール、O−アルキル、O−アルケニル、O−アルキニル、O−アルキルアミノ、O−アルキルアルコキシ、O−アルキルアミノアルキル、O−アルキルイミダゾール、S−アルキル、S−アルケニル、S−アルキニル、NH−アルキル、NH−アルケニル、NH−アルキニル、N−ジアルキル、O−アリール、S−アリール、NH−アリール、O−アラルキル、S−アラルキル、NH−アラルキル、N−フタルイミド、ハロゲン(特に、フルオロ)、アミノ、チオール、ケト、カルボキシル、ニトロ、ニトロソ、ニトリル、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、イミダゾール、アジド、ヒドラジノ、ヒドロキシルアミノ、イソシアナト、スルホキシド、スルホン、スルフィド、ジスルフィド、シリル、アリール、複素環、炭素環、インターカレーター、レポーター基、コンジュゲート、ポリアミン、ポリアミド、ポリアルキレングリコール、および式(O−アルキル)(但し、mは1〜約10である)を有するポリエーテルが含まれる。これらポリエーテルの中で好ましいのは、直鎖状および環状のポリエチレングリコール(PEG)、および(PEG)含有基であり、例えば、各々本明細書中にそのまま援用される、Ouchi et al.(Drug Design and Discovery 1992,9,93)、Ravasio et al.(J.Org.Chem. 1991,56,4329)および Delgardo et al.(Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 1992,9,249)によって開示されているものおよびクラウンエーテルなどがあげられる。更に別の糖修飾は、Cook,P.D., Anti-Cancer Drug Design, 1991,6,585-607 に開示されている。フルオロ、O−アルキル、O−アルキルアミノ、O−アルキルイミダゾール、O−アルキルアミノアルキルおよびアルキルアミノ置換基は、本明細書中にそのまま援用される1995年3月6日出願の、Oligomeric Compounds having Pyrimidine Nucleotide(s) with 2' and 5' Substitutions という表題の米国特許出願第08/398,901号に記載されている。
【0070】
本発明にしたがう更に別の糖置換基には、基−SRおよび−N(R(式中、Rは、各々独立して、水素、保護基、または置換または未置換のアルキル、アルケニルまたはアルキニルである)が含まれる。2’−S−Rヌクレオシドは、本明細書中にそのまま援用される1997年9月23日発行の米国特許第5,670,633号に開示されている。2’−SRモノマーシントンの包含は、Hamm et al., J.Org.Chem., 1997,62,3415-3420 によって開示されている。2’−N(Rヌクレオシドは、Goettingen,M., J.Org.Chem., 1996,61,6273-6281; および Polushin et al., Tetrahedron Lett., 1996,37,3227-3230 によって開示されている。
【0071】
更に代表的な糖置換基には、式IまたはIIのいずれかの構造を有する基が含まれうる。

【0072】
【化13】
Figure 2005504020
【0073】
[式中、Zは、O、SまたはNHであり;
Jは、単結合、OまたはC(=O)であり;
Eは、C−C10アルキル、N(R)(R)、N(R)(R)、N=C(R5a)(R6a)、N=C(R5a)(R7a)であるまたは式III
【0074】
【化14】
Figure 2005504020
【0075】
を有し;
、R、R11およびR12は、各々独立して、水素、C(O)R13、置換または未置換のC−C10アルキル、置換または未置換のC−C10アルケニル、置換または未置換のC−C10アルキニル、アルキルスルホニル、アリールスルホニル、化学官能基またはコンジュゲート基であり、ここにおいて、これら置換基は、ヒドロキシル、アミノ、アルコキシ、カルボキシ、ベンジル、フェニル、ニトロ、チオール、チオアルコキシ、ハロゲン、アルキル、アリール、アルケニルおよびアルキニルより選択され;
または場合により、R11およびR12は一緒に、それらが取り付けられている窒素原子と共にフタルイミド部分を形成する;
13は、各々独立して、置換または未置換のC−C10アルキル、トリフルオロメチル、シアノエチルオキシ、メトキシ、エトキシ、t−ブトキシ、アリルオキシ、9−フルオレニルメトキシ、2−(トリメチルシリル)−エトキシ、2,2,2−トリクロロエトキシ、ベンジルオキシ、ブチリル、イソブチリル、フェニルまたはアリールであり;
は、水素、窒素保護基または−T−Lであり;
5aは、水素、窒素保護基または−T−Lであり;
Tは、結合または連結部分であり;
Lは、化学官能基、コンジュゲート基または固体支持体であり;
およびRは、各々独立して、水素、窒素保護基、置換または未置換のC−C10アルキル、置換または未置換のC−C10アルケニル、置換または未置換のC−C10アルキニル(ここにおいて、この置換は、ヒドロキシル、アミノ、アルコキシ、カルボキシ、ベンジル、フェニル、ニトロ、チオール、チオアルコキシ、ハロゲン、アルキル、アリール、アルケニル、アルキニルである);NH 、N(R14)(R15)、グアニジノまたはアシル(但し、このアシルは、酸アミドまたはエステルである)であり;
またはRおよびRは一緒に、窒素保護基であるか、又はNおよびOより選択される追加のヘテロ原子を包含してよい環構造中に接続されるか、または化学官能基であり;
14およびR15は、各々独立して、H、C−C10アルキル、窒素保護基であるか、またはR14およびR15は一緒に、窒素保護基であり;
またはR14およびR15は、NおよびOより選択される追加のヘテロ原子を包含してよい環構造中に接続される;
は、OX、SXまたはN(X)であり;
Xは、各々独立して、H、C−Cアルキル、C−Cハロアルキル、C(=NH)N(H)R16、C(=O)N(H)R16またはOC(=O)N(H)R16であり;
16は、HまたはC−Cアルキルであり;
、ZおよびZは、約4〜約7個の炭素原子を有するまたは約3〜約6個の炭素原子および1個または2個のヘテロ原子を有する環系を含み、ここにおいて、このヘテロ原子は、酸素、窒素および硫黄より選択され、そしてこの環系は、脂肪族、不飽和脂肪族、芳香族、または飽和または不飽和の複素環式であり;
は、1〜約10個の炭素原子を有するアルキルまたはハロアルキル、2〜約10個の炭素原子を有するアルケニル、2〜約10個の炭素原子を有するアルキニル、6〜約14個の炭素原子を有するアリール、N(R)(R)OR、ハロ、SRまたはCNであり;
は、各々独立して、1〜10の整数であり;
は、各々独立して、0または1であり;
は、0または1〜10の整数であり;
は、1〜10の整数であり;
は、0、1または2であり;そして
が0である場合、qは1より大であるという条件付きである]。
【0076】
式Iの代表的な糖置換基は、本明細書中にそのまま援用される、1998年8月7日出願の "Capped 2'-Oxyethoxy Oligonucleotides," という表題の米国特許出願第09/130,973号に開示されている。
【0077】
式IIの代表的な環状糖置換基は、本明細書中にそのまま援用される、1998年7月27日出願の "RNA Targeted 2'-Modified Oligonucleotides that are Conformationally Preorganized," という表題の米国特許出願第09/123,108号に開示されている。
【0078】
特に好ましい糖置換基には、O[(CHp1O]p2CH、O(CHp1OCH、O(CHp1NH、O(CHp1CH、O(CHp1ONHおよびO(CHp1ON[(CHp1CH)](式中、p1およびp2は、1〜約10である)が含まれる。
【0079】
本発明の若干の好ましいオリゴマー化合物は、次の糖置換基、すなわち、C−C10低級アルキル、置換された低級アルキル、アルカリール、アラルキル、O−アルカリールまたはO−アラルキル、SH、SCH、OCN、Cl、Br、CN、CF、OCF、SOCH、SOCH、ONO、NO、N、NH、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリール、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、RNA切断基、レポーター基、インターカレーター、オリゴマー化合物の薬物動態学的性質を向上させる基またはオリゴマー化合物の薬力学的性質を向上させる基、および類似の性質を有する他の糖置換基の内の一つを有する少なくとも一つのヌクレオシドを含有する。好ましい修飾には、2’−メトキシエトキシ(2’−O−(2−メトキシエチル)または2’−MOEとしても知られる2’−O−CHCHOCH)[Martin et al., Helv.Chim.Acta, 1995,78,486]、すなわち、アルコキシアルコキシ基が含まれる。更に好ましい修飾は、2’−ジメチルアミノオキシエトキシ、すなわち、2’−DMAOEとしても知られるO(CHON(CH基である。代表的なアミノオキシ糖置換基は、本明細書中にそのまま援用される、1999年6月25日出願の "Aminooxy-Functionalized Oligomers" という表題の同一所有される米国特許出願第09/344,260号;および1999年8月9日出願の "Aminooxy-Functionalized Oligomers and Methods for Making Same;" という表題の米国特許出願第09/370,541号に記載されている。
【0080】
他の好ましい修飾には、2’−メトキシ(2’−O−CH)、2’−アミノプロポキシ(2’−OCHCHCHNH)および2’−フルオロ(2’−F)が含まれる。類似した修飾は、ヌクレオシドおよびオリゴマー上の他の位置に、具体的には、3’末端ヌクレオシド上の糖の3’位、または2’−5’連結したオリゴマーのような2’位からの結合を有するヌクレオシドの3’位および5’末端ヌクレオシドの5’位に行われてもよい。オリゴマーは、ペントフラノシル糖の代わりにシクロブチル部分のような糖模擬体を有してもよい。このような修飾された糖構造の製造を教示する代表的な米国特許には、各々が本明細書中に援用され且つ若干のものは同一所有される米国特許第4,981,957号;第5,118,800号;第5,319,080号;第5,359,044号;第5,393,878号;第5,446,137号;第5,466,786号;第5,514,785号;第5,519,134号;第5,567,811号;第5,576,427号;第5,591,722号;第5,597,909号;第5,610,300号;第5,627,0531号;第5,639,873号;第5,646,265号;第5,658,873号;第5,670,633号;および第5,700,920号、および本明細書中にも援用される1995年6月5日出願の同一所有される米国特許出願第08/468,037号が含まれるが、これに制限されるわけではない。
【0081】
式IIIに示される代表的なグアニジノ糖置換基は、本明細書中にそのまま援用される、2000年7月7日出願の "Guinidinium Functionalized Oligomers and Methods" という表題の同一所有される米国特許出願第09/612,531号に開示されている。
【0082】
代表的なアセトアミド糖置換基は、本明細書中にそのまま援用される、1999年8月19日出願の "2'-O-Acetamido Modified Monomers and Oligomers" という表題の米国特許出願第09/378,568号に開示されている。
【0083】
代表的なジメチルアミノエチルオキシエチル糖置換基は、本明細書中にそのまま援用される、1999年8月6日出願の "2'-O-Dimethylaminoethyloxyethyl-Modified Oligonucleotides" という表題の国際特許出願PCT/US99/17895号に開示されている。
【0084】
更に好ましい修飾には、2’−ヒドロキシル基が、糖環の3’または4’炭素原子に連結することによって二環式糖部分を形成しているロックド核酸(Locked Nucleic Acids)(LNA)が含まれる。この結合は、好ましくは、2’酸素原子と4’炭素原子とを架橋するメチレン(−CH2−)n基(式中、nは1または2である)である。LNAおよびその製造は、WO98/39352号およびWO99/14226号に記載されている。
【0085】
所定の化合物中の全ての位置が均一に修飾される必要はないが、実際上、前述の修飾の二つ以上が、単一化合物中にまたはオリゴヌクレオチド内の単一ヌクレオシドにでも包含されてよい。
【0086】
本発明は、更に、キメラ化合物であるオリゴマー化合物を包含する。本発明の文脈中の「キメラ」オリゴマー化合物または「キメラ」は、少なくとも一つのモノマー単位、すなわち、オリゴヌクレオチド化合物の場合はヌクレオチドで各々が成っている二つまたはそれを超える化学的に異なる領域を含有するオリゴマー化合物、具体的には、オリゴヌクレオチドである。キメラオリゴヌクレオチドは、典型的には、ヌクレアーゼ分解への増加した耐性、増加した細胞内取込みおよび/または標的核酸への増加した結合親和性をオリゴヌクレオチドに与えるようにそのオリゴヌクレオチドが修飾されている少なくとも一つの領域を含有する。オリゴヌクレオチドのもう一つの領域は、RNA:DNAまたはRNA:RNAハイブリッドを切断することができる酵素への基質として役立つことができる。例として、RNアーゼHは、RNA:DNA二重らせんのRNA鎖を切断する細胞性エンドヌクレアーゼである。したがって、RNアーゼHの活性化は、RNA標的の切断を引き起こし、それによって、遺伝子発現のオリゴヌクレオチド阻害効率を大きく増大させる。その結果として、キメラオリゴヌクレオチドを用いる場合、同じ標的領域にハイブリッド形成するホスホロチオエートデオキシオリゴヌクレオチドと比較してより短いオリゴヌクレオチドで、しばしば、比較しうる結果を得ることができる。RNA標的の切断は、ゲル電気泳動と、必要ならば、当該技術分野において知られている関連核酸ハイブリダイゼーション技術によって常套的に検出することができる。
【0087】
本発明のキメラオリゴマー化合物は、上記のような二つまたはそれを超えるオリゴヌクレオチド、修飾オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシドおよび/またはオリゴヌクレオチド模擬体の複合構造として形成されてよい。このような化合物は、当該技術分野においてハイブリッドまたはギャップマー(gapmers)とも称されている。このようなハイブリッド構造の製造を教示している代表的な米国特許には、各々が本明細書中にそのまま援用され且つ若干のものは本出願と同一所有される米国特許第5,013,830号;第5,149,797号;第5,220,007号;第5,256,775号;第5,366,878号;第5,403,711号;第5,491,133号;第5,565,350号;第5,623,065号;第5,652,355号;第5,652,356号;および第5,700,922号が含まれるが、これに制限されるわけではない。
【0088】
ある一定の態様において、本発明のオリゴマー化合物は、「ギャップマー」、「逆ギャップマー」または「ヘミマー(hemimers)」を含めたキメラオリゴヌクレオチドでありうる。「ヘミマー」の場合、オリゴヌクレオチドの一つの末端(5’かまたは3’)領域は、修飾ヌクレオシドを含有する。オリゴヌクレオチドの両末端が修飾ヌクレオシドを含有する場合、そのオリゴヌクレオチドを「ギャップマー」と称し、修飾された5’および3’末端領域を「ウィング(wings)」と称する。ギャップマーの場合、5’および3’ウィングは、同じまたは異なった方式で修飾されたヌクレオシドを含有することができる。「逆ギャップマー」の場合、オリゴヌクレオチドの中心領域は、修飾ヌクレオシドを含有する。
【0089】
本発明は、オリゴマー化合物のヌクレアーゼ耐性を増大させるのに有用である化合物および方法を提供する。より詳しくは、本発明は、増大したヌクレアーゼ耐性を示すオリゴマー化合物、およびオリゴマー化合物のヌクレアーゼ安定性を向上させる方法に関する。上記のように、酵素分解への耐性は、アンチセンスオリゴヌクレオチド治療薬の重要な特徴であり、アンチセンスオリゴヌクレオチド薬の効力は、生体系に存在するヌクレアーゼの活性によって妨害されている。驚くべきことに、オリゴマー化合物のある一定の修飾は、それらのヌクレアーゼ安定性を増大させるということが発見された。修飾ヌクレオシドの包含を伴う、オリゴマー化合物のヌクレアーゼ安定性を増加させる新規な方法も発見された。
【0090】
本発明は、医薬品として有用でありうるヌクレアーゼ耐性オリゴマー化合物に関する。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、遺伝子産物が疾患をもたらすその遺伝子の発現の選択的阻害を引き起こすことができるある一定の核酸標的配列に、予想可能な方法で結合するように設計することができる。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、mRNA上の特定の相補的領域に結合することにより、スプライシング、ポリアデニル化、正しいRNAフォールディング、mRNAのトランスロケーションおよび翻訳開始、またはmRNAに沿ったリボソーム移動のような過程の破壊によってタンパク質生合成を阻害することができる。本発明のオリゴマー化合物は、典型的に、増大したヌクレアーゼ耐性を示すので、特定の疾患の処置のための治療的用途において有効なアンチセンスオリゴヌクレオチドとして用いることができる。本発明の方法は、オリゴマー化合物のヌクレアーゼ耐性の増大によって治療薬としてのアンチセンスオリゴヌクレオチドの効力を増加させるのに用いることもできる。
【0091】
本発明の好ましい態様は、少なくとも一つの修飾された5’または3’末端ヌクレオシドまたはヌクレオチドと、ホスホジエステル以外の少なくとも一つのヌクレオシド間連結基を含み、そしてギャップマー、ヘミマーおよび逆ギャップマーの配置の修飾された2’置換基および一つまたはそれを超える修飾核酸塩基を含んでいてよいヌクレアーゼ耐性オリゴマー化合物を包含する。
【0092】
三環式シトシン類似体フェノキサジンおよび9−(アミノエトキシ)フェノキサジン(G−クランプ)は、オリゴヌクレオチドのヌクレアーゼ耐性を有意に増大させることが分かった。フェノキサジンおよびG−クランプを、天然のホスホジエステル主鎖を有するモデルオリゴマー中に包含させて、ヘビ毒ホスホジエステラーゼで処理後の酵素分解を監視した。3’末端におけるフェノキサジンかまたはG−クランプの単独包含は、3’エキソヌクレアーゼ攻撃からオリゴヌクレオチドを完全に防御した。修飾オリゴヌクレオチドは、ウシ腸管粘膜ホスホジエステラーゼによる天然DNAフラグメントの分解を用量依存方式で遅らせることができるので、フェノキサジンおよびG−クランプを含有するオリゴヌクレオチドのヌクレアーゼ耐性が、酵素の活性部位への低い結合親和性によって引き起こされるとは考えられない。フェノキサジンとG−クランプとの間には、ヌクレアーゼ耐性へのそれらの作用およびヌクレアーゼ活性を阻害するそれらの能力に関して、有意差が認められなかった。
【0093】
グアニジニル部分は、三環式シトシン類似体(G−クランプ)の2’位かまたはフェノキサジン環系に束縛された第一アミノ基の合成後グアニジニル化によってオリゴヌクレオチドに加えることができる。前者のアミノ基は、固体支持体上に選択的に脱保護し且つグアニジニル化することができるが、G−クランプのアミノエトキシ束縛は、オリゴヌクレオチドの脱保護および支持体からの切断後に水溶液中でグアニジニル化することができる。どちらの方法も、種々のグアニジニル修飾オリゴヌクレオチドを合成し且つ特性決定するのに成功して用いられている。第一アミンの、第一アミンより有意に高いpKαを有するグアニジニウム部分への変換は、オリゴヌクレオチドに陽電荷を導入させ、これは、広いpH範囲にわたって維持される。2’位における陽イオン残基の導入は、オリゴヌクレオチドのヌクレアーゼ耐性を大きく増大させる(Prakash,T.P.; Kawasaki,A.M.; Vasquez,G.; Fraser,A.S.; Casper,M.D.; Cook,P.D.; Manoharan,M. Nucleosides Nucleotides 1999,181,1381-1382)。グアニジニルG−クランプヌクレオチドを含有する十量体二重らせんのX線結晶解析研究は、束縛されたグアニジニウムのイミノまたはアミノ窒素と、相補的グアニン塩基のN7との間に追加のフーグスティーン結合を示したが、これは、合計5個の水素結合数を含有する核酸二重らせん内の単一塩基対の最初の知見であった。
【0094】
オリゴマー化合物の製造に現在選択される方法は、支持基剤を使用する。支持基剤を用いて、最初のヌクレオシドまたはより大きいヌクレオシドシントンを取り付け、次に、それを繰り返し伸長させて、最終オリゴマー化合物を生じる。支持基剤は、不溶性であるようにまたはいろいろな溶媒中で変化しうる溶解度を有するように選択されて、成長しているオリゴマーを所望のように、溶液中に入れないまたは溶液中で保持させることができる。伝統的な固体支持体は、不溶性であり、常套的には、試薬および溶媒が反応しおよび/または成長している鎖を洗浄している間、最終オリゴマーを切断して分離するまで反応容器中に入っている。より最近のアプローチは、合成における所望の時点で、結合したオリゴマーを沈殿させることおよび溶解させることを可能にする可溶性ポリマー支持体を含めた可溶性支持体を導入している(Gravert et al., Chem.Rev., 1997,97,489-510)。
【0095】
本発明の方法にしたがう代表的な支持基剤には、制限されることなく、制御多孔質ガラス(CPG);オキサリル制御多孔質ガラス(例えば、Alul, et al., Nucleic Acids Research 1991,19,1527 を参照されたい);TENTAGEL Support(例えば、Wright, et al., Tetrahedron Letters 1993,34,3373 を参照されたい);または Perceptive Biosystems から入手可能なポリスチレン/ジビニルベンゼンのコポリマーPOROSが含まれる。可溶性支持基剤である5〜20kDaの分子量のポリ(エチレングリコール)の使用は、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの大規模合成について、Bonora et al., Organic Process Research & Development, 2000,4,225-231 に記載されている。このような合成のための装置は、例えば、Applied Biosystems(Foster City, CA)を含めたいくつかの販売業者によって販売されている。当該技術分野において知られているこのような合成のためのいずれか他の手段を、更にまたは代わりに用いることができる。類似した技法を用いて、ホスホロチオエート誘導体およびアルキル化誘導体のようなオリゴヌクレオチドを製造することは周知である。
【0096】
活性リン組成物(例えば、活性リン含有置換基を有する化合物)は、オリゴマー化合物の合成のためのカップリング反応において用いることができる。本明細書中で用いられる「活性リン組成物」という用語は、別のモノマーまたはオリゴマー化合物のヒドロキシル基と反応性であってリン含有ヌクレオチド間結合を形成する活性リン含有置換基を有する、モノマーおよびオリゴマーを包含する。このような活性リン基は、活性リン原子をPIII原子価状態で含有する。このような活性リン原子は、当該技術分野において知られていて、ホスホロアミダイト、H−ホスホネート、リン酸トリエステルおよびキラル補助部分(chiral auxiliaries)が含まれるが、これに制限されるわけではない。好ましい合成固相合成法は、ホスホロアミダイトを活性ホスフェートとして利用する。ホスホロアミダイトは、PIII化学を利用する。中間体ホスフィット化合物は、引き続き、既知の方法を用いてP状態に酸化されて、好ましい態様において、ホスホジエステルまたはホスホロチオエートヌクレオシド間結合を生じる。更に別のホスフェートおよびホスフィットは、Tetrahedron Report Number 309 (Beaucage and Iyer, Tetrahedron, 1992,48,2223-2311) に開示されている。
【0097】
活性リンを含有するモノマーまたはオリゴマーの代表的なリストには、式
【0098】
【化15】
Figure 2005504020
【0099】
(式中、Bxは、各々独立して、複素環式塩基部分または保護された複素環式塩基部分であり;そして
17は、各々独立して、H、保護されたヒドロキシル基、糖置換基または保護された置換基であり;
は、ヒドロキシル保護基、ヌクレオシド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチドであり;
18は、N(L)Lであり;
およびLは、各々独立して、C1−6アルキルであり;
またはLおよびLは、互いに接続して、LおよびLが取り付けられている窒素原子を含めた4〜7員複素環式環系を形成し、ここにおいて、この環系は、O、NおよびSより選択される少なくとも1個の追加のヘテロ原子を包含してよく;そして
19はXであり;
は、Pg−O−、Pg−S−、C−C10直鎖または分岐状鎖アルキル、CH(CHp5−O−またはR2021−N−であり;
p5は、0〜10であり;
Pgは保護基であり;
20およびR21は、各々独立して、水素、C−C10アルキル、シクロアルキルまたはアリールであり;
または場合により、R20およびR21は、それらが取り付けられている窒素原子と一緒に、O、SおよびNより選択される追加のヘテロ原子を包含してよい環状部分を形成し;または
18およびR19は、R18およびR19が取り付けられているリン原子と一緒に、キラル補助部分(chiral auxiliary)を形成する)
を有するものが含まれる。
【0100】
酸化前および後のヌクレオチド間結合のリン原子に取り付けられている基(R18およびR19)には、モルホリンのような窒素含有環状部分が含まれうる。このような酸化したヌクレオシド間結合には、ホスホロモルホリドチオエート結合(Wilk et al., Nucleosides and nucleotides, 1991,10,319-322)が含まれる。本発明にしたがう更に別の環状部分には、オキソ、アシル、アルコキシ、アルコキシカルボニル、アルキル、アルケニル、アルキニル、アミノ、アミド、アジド、アリール、ヘテロアリール、カルボン酸、シアノ、グアニジノ、ハロ、ハロアルキル、ハロアルコキシ、ヒドラジノ、ODMT、アルキルスルホニル、ニトロ、スルフィド、スルホン、スルホンアミド、チオールおよびチオアルコキシなどの基で置換されていてよい単環式、二環式または三環式の環部分が含まれる。窒素を包含する好ましい二環式環構造は、フタルイミドである。
【0101】
本明細書の文脈中において、アルキル(概して、C1−C20)基、アルケニル(概して、C2−C20)基およびアルキニル(概して、C2−C20)基には、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、ヘプチル基、オクチル基、ノニル基、デシル基、ウンデシル基、ドデシル基、トリデシル基、テトラデシル基、ペンタデシル基、ヘキサデシル基、ヘプタデシル基、オクタデシル基、ノナデシル基、エイコシル基および他の高級炭素アルキル基を含めた、置換されたおよび未置換の直鎖、分岐鎖および脂環式炭化水素が含まれるが、これに制限されるわけではない。追加の例には、2−メチルプロピル基、2−メチル−4−エチルブチル基、2,4−ジエチルブチル基、3−プロピルブチル基、2,8−ジブチルデシル基、6,6−ジメチルオクチル基、6−プロピル−6−ブチルオクチル基、2−メチルブチル基、2−メチルペンチル基、3−メチルペンチル基、2−エチルヘキシル基および他の分岐状鎖基、アリル基、クロチル基、プロパルギル基、2−ペンテニル基、およびπ結合を含有する他の不飽和基、シクロヘキサン基、シクロペンタン基、アダマンタン基、並びに他の脂環式基、3−ペンテン−2−オン基、3−メチル−2−ブタノール基、2−シアノオクチル基、3−メトキシ−4−ヘプタナール基、3−ニトロブチル基、4−イソプロポキシドデシル基、4−アジド−2−ニトロデシル基、5−メルカプトノニル基、4−アミノ−1−ペンテニル基、更には、他の置換された基が含まれる。代表的なアルキル置換基は、本明細書中にそのまま援用される米国特許第5,212,295号の段落12の41〜50行に開示されている。
【0102】
多くの化学官能基は、本発明の化合物中に保護された形で導入した後、脱保護して、最終の所望の化合物を形成することができる。複素環式塩基、例えば、ヌクレオシド間結合および糖置換基に、一つ以上の位置または2’位、3’位および5’位で直接的にまたは間接的に取り付けられた基。保護基は、反復するオリゴヌクレオチド合成中に成長しているオリゴマー化合物中に位置する官能基を保護するように選択することができ、他の位置は、必要とされるように選択的に脱保護することができる。概して、保護基は、より大きい分子の化学官能基を特定の反応条件に不活性にさせ、そしてその後、分子の残り部分を実質的に損傷することなく、このような官能基から除去することができる(Greene and Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 3rd ed, John Wiley & Sons, New York, 1999)。例えば、アミノ基の窒素原子は、フタルイミド基として、9−フルオレニルメトキシカルボニル(FMOC)基として、およびトリフェニルメチルスルフェニル基、t−BOC基またはベンジル基で保護することができる。カルボキシル基は、アセチル基として保護することができる。代表的なヒドロキシル保護基は、Beaucage et al., Tetrahedron 1992,48,2223 によって記載されている。好ましいヒドロキシル保護基は、トリチル、モノメトキシトリチル、ジメトキシトリチル、トリメトキシトリチル、9−フェニルキサンチン−9−イル(Pixyl)および9−(p−メトキシフェニル)キサンチン−9−イル(MOX)のような、酸に反応活性である。
【0103】
化学官能基は、それらを前駆体に包含させることによって「保護される」こともできる。例えば、アジド基は、容易にアミンに変換されるので、アジド基をアミンの「保護された」形とみなして用いることができる。オリゴヌクレオチド合成に利用される更に代表的な保護基は、Agrawal, et al., Protocols for Oligonucleotide Conjugates, Eds, Humana Press; New Jersey, 1994; Vol.26 pp.1-72 に考察されている。
【0104】
ヒドロキシル保護基の例には、t−ブチル、t−ブトキシメチル、メトキシメチル、テトラヒドロピラニル、1−エトキシエチル、1−(2−クロロエトキシ)エチル、2−トリメチルシリルエチル、p−クロロフェニル、2,4−ジニトロフェニル、ベンジル、2,6−ジクロロベンジル、ジフェニルメチル、p,p=−ジニトロベンズヒドリル、p−ニトロベンジル、トリフェニルメチル、トリメチルシリル、トリエチルシリル、t−ブチルジメチルシリル、t−ブチルジフェニルシリル、トリフェニルシリル、ベンゾイルホルメート、アセテート、クロロアセテート、トリクロロアセテート、トリフルオロアセテート、ピバロエート、ベンゾエート、p−フェニルベンゾエート、9−フルオレニルメチルカーボネート、メシラートおよびトシラートが含まれるが、これに制限されるわけではない。
【0105】
チオール(硫黄)保護基の例には、ベンジル、置換されたベンジル、ジフェニルメチル、フェニル、t−ブチル、メトキシメチル、チアゾリジン類、アセチルおよびベンゾイルが含まれるが、これに制限されるわけではない。更に別のチオール保護基は、Greene and Wuts, 同書に詳しく説明されている。
【0106】
追加のアミノ保護基には、2−トリメチルシリルエトキシカルボニル(Teoc)、1−メチル−1−(4−ビフェニリル)エトキシカルボニル(Bpoc)、t−ブトキシカルボニル(BOC)、アリルオキシカルボニル(Alloc)、9−フルオレニルメチルオキシカルボニル(Fmoc)およびベンジルオキシカルボニル(Cbz)などのカルバメート保護基;ホルミル、アセチル、トリハロアセチル、ベンゾイルおよびニトロフェニルアセチルなどのアミド保護基;2−ニトロベンゼンスルホニルなどのスルホンアミド保護基;フタルイミドおよびジチアスクシノイルなどのイミン保護基および環状イミド保護基が含まれるが、これに制限されるわけではない。これらアミノ保護基の均等物も、本発明の化合物および方法によって包含される。
【0107】
若干の好ましいアミノ保護基は、酸処理に安定性であるので、反応性アミノ基を選択的に置換に利用可能にする塩基処理で選択的に除去することができる。このような基の例は、Fmoc(E.Atherton and R.C.Sheppard in The Peptides, S.Udenfriend, J.Meienhofer, Eds., Academic Press, Orlando, 1987, volume 9, p.1)、およびNsc基で代表される種々の置換スルホニルエチルカルバメート(Samukov et al., Tetrahedron Lett, 1994,35:7821; Verhart and Tesser, Rec.Trav.Chim.Pays-Bas, 1987,107:621)である。
【0108】
若干の特に好ましい態様において、オリゴマー化合物のヌクレオシド成分は、保護されていてよいホスホロチオエートヌクレオシド間結合によって互いに連結されている。ホスフィット結合、ホスホジエステル結合およびホスホロチオエート結合などのリン含有ヌクレオシド間結合のための代表的な保護基には、β−シアノエチル基、ジフェニルシリルエチル基、δ−シアノブテニル基、シアノp−キシリル(CPX)基、N−メチル−N−トリフルオロアセチルエチル(META)基、アセトキシフェノキシエチル(APE)基およびブテン−4−イル基が含まれる。例えば、米国特許第4,725,677号および再発行34,069号(β−シアノエチル);Beaucage,S.L. and Iyer,R.P., Tetrahedron, 49 No.10, pp.1925-1963(1993); Beaucage,S.L. and Iyer,R.P., Tetrahedron, 49 No.46, pp.10441-10488(1993); Beaucage,S.L. and Iyer,R.P., Tetrahedron, 48 No.12, pp. を参照されたい。
【0109】
本発明は、更に、本発明のオリゴマー化合物を包含する医薬組成物および製剤を包含する。本発明の医薬組成物は、局所性または全身性の処置が望まれるかどうかおよび処置される部位に依存して多くの方法で投与することができる。投与は、局所(眼を含めた、および膣および直腸供給を含めた粘膜へ)、肺(例えば、ネブライザーによるを含めて、散剤またはエアゾル剤の吸入または吹入による)、気管内、鼻腔内、表皮および経皮、経口または非経口投与であってよい。非経口投与には、静脈内、動脈内、皮下、腹腔内または筋肉内の注射または注入;または頭蓋内、例えば、鞘内(intrathecal)または脳室内投与が含まれる。少なくとも一つの2’−O−メトキシエチル修飾を有するオリゴヌクレオチドは、経口投与に特に有用であると考えられる。
【0110】
局所投与用の医薬組成物および製剤には、経皮パッチ剤、軟膏剤、ローション剤、クリーム剤、ゲル剤、滴剤、坐剤、噴霧剤、液剤および散剤が含まれうる。慣用的な医薬担体、水性、粉末または油状の基剤、増粘剤等は、必要であるまたは望まれることがありうる。被覆コンドーム、グローブ等も有用でありうる。好ましい局所製剤には、本発明のオリゴマー化合物が、脂質、リポソーム、脂肪酸、脂肪酸エステル、ステロイド、キレート化剤およびサーファクタントなどの局所供給剤(topical delivery agents)との混合物であるものが含まれる。好ましい脂質およびリポソームには、中性(例えば、ジオレオイルホスファチジルDOPEエタノールアミン、ジミリストイルホスファチジルコリンDMPC、ジステアロイルホスファチジルコリン)、陰性(例えば、ジミリストイルホスファチジルグリセロールDMPG)および陽イオン性(例えば、ジオレオイルテトラメチルアミノプロピルDOTAPおよびジオレオイルホスファチジルエタノールアミンDOTMA)が含まれる。本発明のオリゴマー化合物は、リポソームに内包されていてよいしまたはそれと、具体的には、陽イオンリポソームと複合体を形成してよい。或いは、オリゴマー化合物は、脂質と、具体的には、陽イオン脂質と複合体形成してよい。好ましい脂肪酸およびエステルには、アラキドン酸、オレイン酸、エイコサン酸、ラウリン酸、カプリル酸、カプリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプレート、トリカプレート、モノオレイン、ジラウリン、1−モノカプリン酸グリセリル、1−ドデシルアザシクロヘプタン−2−オン、アシルカルニチン、アシルコリン、またはそのC1−10アルキルエステル(例えば、イソプロピルミリステートIPM)、モノグリセリド、ジグリセリドまたは薬学的に許容しうる塩が含まれるが、これに制限されるわけではない。局所製剤は、本明細書中にそのまま援用される、1999年5月20日出願の米国特許出願第09/315,298号に詳細に記載されている。
【0111】
経口投与用の組成物および製剤には、散剤または顆粒剤、ミクロ粒子、ナノ粒子、水中または非水性基剤中の懸濁剤または水剤、カプセル剤、ゲルカプセル剤、サシェ剤、錠剤またはミニ錠剤が含まれる。増粘剤、着香剤、希釈剤、乳化剤、分散助剤または結合剤が、望ましいと考えられる。好ましい経口製剤は、本発明のオリゴマー化合物が、一つまたはそれを超える浸透促進剤、サーファクタントおよびキレート化剤と一緒に投与されるものである。好ましいサーファクタントには、脂肪酸および/またはそのエステルまたは塩、胆汁酸および/またはその塩が含まれる。好ましい胆汁酸/塩には、ケノデオキシコール酸(CDCA)およびウルソデオキシケノデオキシコール酸(UDCA)、コール酸、デヒドロコール酸、デオキシコール酸、グルコール酸、グリコール酸、グリコデオキシコール酸、タウロコール酸、タウロデオキシコール酸、タウロ−24,25−ジヒドロフシジン酸ナトリウム、グリコジヒドロフシジン酸ナトリウムが含まれる。好ましい脂肪酸には、アラキドン酸、ウンデカン酸、オレイン酸、ラウリン酸、カプリル酸、カプリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプレート、トリカプレート、モノオレイン、ジラウリン、グリセリル1−モノカプレート、1−ドデシルアザシクロヘプタン−2−オン、アシルカルニチン、アシルコリン、またはそのモノグリセリド、ジグリセリドまたは薬学的に許容しうる(例えば、ナトリウム)塩が含まれる。更に好ましいのは、浸透促進剤の組合せ、例えば、胆汁酸/塩と組み合わせた脂肪酸/塩である。特に好ましい組合せは、ラウリン酸のナトリウム塩、カプリン酸およびUDCAである。更に別の浸透促進剤には、ポリオキシエチレン−9−ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン−20−セチルエーテルが含まれる。本発明のオリゴマー化合物は、噴霧乾燥された粒子を含めた粒状の形で経口供給されてよいし、またはミクロ粒子またはナノ粒子を形成するように複合体形成されてよい。オリゴヌクレオチド複合体形成剤(complexing agents)には、ポリアミノ酸;ポリイミン;ポリアクリレート;ポリアルキルアクリレート、ポリオキセタン、ポリアルキルシアノアクリレート;陽イオン化ゼラチン、アルブミン、デンプン、アクリレート、ポリエチレングリコール(PEG)およびデンプン;ポリアルキルシアノアクリレート;DEAEで誘導体化されたポリイミン、ポルラン(pollulans)、セルロースおよびデンプンが含まれる。特に好ましい複合体形成剤には、キトサン、N−トリメチルキトサン、ポリ−L−リシン、ポリヒスチジン、ポリオルニチン、ポリスペルミン、プロタミン、ポリビニルピリジン、ポリチオジエチルアミノメチルエチレンP(TDAE)、ポリアミノスチレン(例えば、p−アミノ)、ポリ(メチルシアノアクリレート)、ポリ(エチルシアノアクリレート)、ポリ(ブチルシアノアクリレート)、ポリ(イソブチルシアノアクリレート)、ポリ(イソヘキシルシアノアクリレート)、DEAE−メタクリレート、DEAE−ヘキシルアクリレート、DEAE−アクリルアミド、DEAE−アルブミンおよびDEAE−デキストラン、ポリメチルアクリレート、ポリヘキシルアクリレート、ポリ(D,L−乳酸)、ポリ(DL−乳酸コグリコール酸(PLGA)、アルギネートおよびポリエチレングリコール(PEG)が含まれる。オリゴヌクレオチドの経口製剤およびそれらの製造は、各々が本明細書中にそのまま援用される、米国特許出願第08/886,829号(1997年7月1日出願)、同第09/108,673号(1998年7月1日出願)、同第09/256,515号(1999年2月23日出願)、同第09/082,624号(1998年5月21日出願)および同第09/315,298号(1999年5月20日出願)に詳細に記載されている。
【0112】
非経口、鞘内または脳室内投与用の組成物および製剤には、緩衝剤、希釈剤、並びに浸透促進剤、担体化合物および他の薬学的に許容しうる担体または賦形剤などがあるがこれに制限されるわけではない他の適当な添加剤を含有してもよい滅菌水溶液が含まれてよい。
【0113】
本発明の医薬組成物には、液剤、エマルジョンおよびリポソーム含有製剤が含まれるが、これに制限されるわけではない。これら組成物は、予備成形された液体、自己乳化性固体および自己乳化性半固体が含まれるがこれに制限されるわけではない種々の成分から生じてよい。
【0114】
本発明の医薬製剤は、好都合には、単位剤形で与えられてよく、製薬産業において周知の慣用的な技法によって製造することができる。このような技法は、活性成分を、一つまたは複数の医薬担体または賦形剤と一緒にする工程を包含する。概して、製剤は、活性成分と液状担体または微粉固体担体または双方とを、均一に且つ密に一緒にした後、必要ならば製品を造形することによって製造される。
【0115】
本発明の組成物は、錠剤、カプセル剤、ゲルカプセル剤、液状シロップ剤または軟質ゲル剤、坐剤および浣腸剤などがあるがこれに制限されるわけではないいずれかの多数の可能な剤形に製剤化することができる。本発明の組成物は、水性基剤、非水性基剤または混合基剤中の懸濁剤として製剤化することもできる。水性懸濁剤は、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトールおよび/またはデキストランを含めた、懸濁剤の粘度を増加させる物質を更に含有してよい。この懸濁剤は、安定化剤も含有してよい。
【0116】
本発明の一つの態様において、医薬組成物は、フォーム剤として製剤化し且つ用いることができる。医薬フォーム剤には、エマルジョン、ミクロエマルジョン、クリーム剤、ゼリー剤およびリポソームなどがあるがこれに制限されるわけではない製剤が含まれる。基本的に性質は似ているが、これら製剤は、最終製品の成分およびコンシステンシーが異なる。このような組成物および製剤の製造は、概して、製薬および製剤技術業者に知られており、本発明の組成物の製剤に応用することができる。
【0117】
本発明の組成物は、エマルジョンとして製造し且つ製剤化することができる。エマルジョンは、典型的には、一つの液体が別の液体中に、通常は0.1μm直径を超える液体粒子の形で分散した不均一系である。(Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker(Eds.), 1988, Marcel Dekker,Inc., New York, N.Y., volume 1,p.199; Rosoff, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker(Eds.), 1988, Marcel Dekker,Inc., New York, N.Y., volume 1,p.245; Bolck in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker(Eds.), 1988, Marcel Dekker,Inc., New York, N.Y., volume 2,p.335; Higuchi et al., in Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PA, 1985,p.301)。エマルジョンは、しばしば、互いに密に混合され且つ分散した二つの不混和液相を含んで成る二相系である。概して、エマルジョンは、油中水(w/o)かまたは水中油(o/w)の種類であってよい。水性相が、大部分の油相中で微細に分割されて、微細な液体粒子として分散している場合、得られた組成物を、油中水(w/o)エマルジョンと称する。或いは、油相が、大部分の水性相中で微細に分割されて、微細な液体粒子として分散している場合、得られた組成物を、水中油(o/w)エマルジョンと称する。エマルジョンは、分散相及び、水性相中、油相中の溶液としてまたはそれ自体別の相として存在してよい活性薬物に加えて、追加の成分を含有してよい。乳化剤、安定化剤、色素および酸化防止剤などの医薬賦形剤も、必要に応じてエマルジョン中に存在してよい。医薬エマルジョンは、例えば、油中水中油(o/w/o)および水中油中水(w/o/w)エマルジョンの場合のような、二つより多い相を含んで成る多重エマルジョンであってもよい。このような複合製剤は、しばしば、単純な二成分エマルジョンが与えないような、ある種の利点を与える。o/wエマルジョンの個々の油粒子が、小さい水粒子を閉じ込めている多重エマルジョンは、w/o/wエマルジョンを構成する。同様に、油状連続相中に安定化した水の小球中に閉じ込められた油粒子の系は、o/w/oエマルジョンを与える。
【0118】
エマルジョンは、熱力学的安定性がないまたは少ないことを特徴とする。しばしば、エマルジョンの分散相または不連続相は、乳化剤の手段または製剤の粘度によって、外部相または連続相中に充分に分散し且つこの形で維持される。エマルジョンの相のどちらかは、エマルジョン型軟膏基剤およびクリーム剤の場合のように、半固体または固体であってよい。エマルジョンを安定化させる他の手段は、エマルジョンのどちらかの相中に包含されてよい乳化剤の使用を伴う。乳化剤は、広範囲に、4種類、すなわち、合成サーファクタント、天然に存在する乳化剤、吸収基剤および微細分散固体に分類することができる(Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker(Eds.), 1988, Marcel Dekker,Inc., New York, N.Y., volume 1,p.199)。
【0119】
界面活性剤としても知られる合成サーファクタントは、エマルジョンの製剤に広く応用されており、文献に概説されている(Rieger, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker(Eds.), 1988, Marcel Dekker,Inc., New York, N.Y., volume 1,p.285; Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker(Eds.), Marcel Dekker,Inc., New York, N.Y., 1988, volume 1,p.199)。サーファクタントは、典型的には、両親媒性であり、親水性部分と疎水性部分を含む。サーファクタントの親水性対疎水性の比率は、親水親油バランス(HLB)と称されていて、製剤の製造においてサーファクタントを分類し且つ選択する場合に有効な手段である。サーファクタントは、親水基の性状に基づく異なったクラス、すなわち、非イオン性、陰イオン性、陽イオン性および両性に分類することができる(Rieger, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker(Eds.), 1988, Marcel Dekker,Inc., New York, N.Y., volume 1,p.285)。
【0120】
エマルジョン製剤に用いられる天然に存在する乳化剤には、ラノリン、蜜蝋、ホスファチド、レシチンおよびアラビアゴムが含まれる。吸収基剤は、水を吸収してw/oエマルジョンを形成しうるような親水性を有するが、なお、無水ラノリンおよび親水ワセリンのように、それらの半固体コンシステンシーを保持する。微粉固体は、良好な乳化剤として、特に、サーファクタントとの組合せでおよび粘稠な製剤中で用いられてもいる。これらには、重金属水酸化物のような極性無機固体;ベントナイト、アタパルジャイト、ヘクトライト、カオリン、モンモリロナイト、コロイドケイ酸アルミニウムおよびコロイドケイ酸アルミニウムマグネシウムなどの非膨潤性クレー;炭素またはグリセリルトリステアレートなどの顔料および無極性固体が含まれる。
【0121】
種々の非乳化性材料も、エマルジョン製剤中に包含され、エマルジョンの性質に寄与する。これらには、脂肪、油、ロウ、脂肪酸、脂肪アルコール、脂肪エステル、保湿剤、親水コロイド、保存剤および酸化防止剤が含まれる(Bolck, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker(Eds.), 1988, Marcel Dekker,Inc., New York, N.Y., volume 1,p.335; Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker(Eds.), 1988, Marcel Dekker,Inc., New York, N.Y., volume 1,p.199)。親水コロイドまたはヒドロコロイドには、多糖類などの天然に存在するガムおよび合成ポリマー(例えば、アラビアゴム、寒天、アルギン酸、カラジーナン、グアーゴム、カラヤゴムおよびトラガカントゴム)、セルロース誘導体(例えば、カルボキシメチルセルロースおよびカルボキシプロピルセルロース)、および合成ポリマー(例えば、カルボマー(carbomers)、セルロースエーテルおよびカルボキシビニルポリマー)が含まれる。これらは、水中で分散しまたは膨潤して、分散相液体粒子の周りに強い界面膜を形成することによっておよび外部相の粘度を増加させることによってエマルジョンを安定化させるコロイド溶液を形成する。
【0122】
エマルジョンは、しばしば、微生物の成長を容易に支持することがありうる炭水化物、タンパク質、ステロールおよびホスファチドなどの多くの成分を含有するので、これら製剤は、しばしば、保存剤を包含する。エマルジョン製剤中に含まれる一般的に用いられる保存剤には、メチルパラベン、プロピルパラベン、第四級アンモニウム塩、塩化ベンズアルコニウム、p−ヒドロキシ安息香酸エステルおよびホウ酸が含まれる。さらに酸化防止剤も、一般的に、製剤の劣化を防止するためにエマルジョン製剤に加えられる。用いられる酸化防止剤は、トコフェロール、アルキルガレート、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエンなどのフリーラジカルスカベンジャー、またはアスコルビン酸およびメタ重亜硫酸ナトリウムなどの還元剤、およびクエン酸、酒石酸およびレシチンなどの酸化防止相乗剤であってよい。
【0123】
皮膚科的、経口および非経口の経路によるエマルジョン製剤の適用およびそれらの製造方法は、文献に概説されている(Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker(Eds.), 1988, Marcel Dekker,Inc., New York, N.Y., volume 1,p.199)。経口供給用のエマルジョン製剤は、製剤化の容易さ、吸収およびバイオアベイラビリティーの見地からの効力の理由ゆえに、きわめて広範囲に用いられてきている。(Rosoff, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker(Eds.), 1988, Marcel Dekker,Inc., New York, N.Y., volume 1,p.245; Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker(Eds.), 1988, Marcel Dekker,Inc., New York, N.Y., volume 1,p.199)。鉱油基剤緩下剤、油溶性ビタミンおよび高脂肪栄養製剤は、o/wエマルジョンとして一般的に経口投与されてきた材料の中にある。
【0124】
本発明の一つの態様において、オリゴマー化合物および核酸の組成物は、ミクロエマルジョンとして製剤化される。ミクロエマルジョンは、単一の光学的に等方性で熱力学的に安定な溶液である、水、油および両親媒性物質の系として定義することができる(Rosoff, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker(Eds.), 1988, Marcel Dekker,Inc., New York, N.Y., volume 1,p.245)。典型的には、ミクロエマルジョンは、最初に、油をサーファクタント水溶液中に分散させた後、透明な系を形成するのに充分な量の第四成分、概して、中間鎖長アルコールを加えることによって製造される系である。したがって、ミクロエマルジョンは、界面活性分子の界面膜によって安定化される二つの不混和液の、熱力学的に安定で、等方性によって透明な分散液としても記載されている(Leung and Shah, in: Controlled Release of Drugs: Polymers and Aggregate Systems, Rosoff,M., Ed., 1989, VCH Publishers, New York, pages 185-215)。ミクロエマルジョンは、一般的には、油、水、サーファクタント、コサーファクタントおよび電解質が含まれる3〜5種類の成分の組合せによって製造される。そのミクロエマルジョンが、油中水(w/o)タイプであるか水中油(o/w)タイプであるかは、用いられる油およびサーファクタントの性質、およびサーファクタント分子の極性ヘッドおよび炭化水素テールの構造および幾何学的充填率に依存する(Schott, in Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PA, 1985,p.271)。
【0125】
相図を利用した現象学的アプローチは、広範囲に研究されており、ミクロエマルジョンを製剤化する方法の包括的知識を当業者に与えている(Rosoff, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker(Eds.), 1988, Marcel Dekker,Inc., New York, N.Y., volume 1,p.245; Bolck, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker(Eds.), 1988, Marcel Dekker,Inc., New York, N.Y., volume 1,p.335)。慣用的なエマルジョンと比較して、ミクロエマルジョンは、自然に形成される熱力学的に安定な液体粒子の製剤として、水に不溶性の薬物を可溶化する利点を与える。
【0126】
ミクロエマルジョンの製造に用いられるサーファクタントには、イオン性サーファクタント、非イオン性サーファクタント、Brij 96、ポリオキシエチレンオレイルエーテル、ポリグリセロール脂肪酸エステル、テトラグリセロールモノラウレート(ML310)、テトラグリセロールモノオレエート(MO310)、ヘキサグリセロールモノオレエート(PO310)、ヘキサグリセロールペンタオレエート(PO500)、デカグリセロールモノカプレート(MCA750)、デカグリセロールモノオレエート(MO750)、デカグリセロールセキオレエート(sequioleate)(SO750)、デカグリセロールデカオレエート(DAO750)が単独でまたはコサーファクタントとの組合せとして含まれるが、これに制限されるわけではない。このコサーファクタント、通常は、エタノール、1−プロパノールおよび1−ブタノールなどの短鎖アルコールは、サーファクタント膜中に浸透し、その結果、サーファクタント分子の間で生じるボイド空間のために破壊された膜を生じることによって、界面流動性を増加させるのに役立つ。ミクロエマルジョンは、しかしながら、コサーファクタントを使用することなく製造することができるので、アルコール不含の自己乳化性ミクロエマルジョン系が当該技術分野において知られている。水性相は、典型的には、水、薬物の水溶液、グリセロール、PEG300、PEG400、ポリグリセロール、プロピレングリコール、およびエチレングリコール誘導体であってよいが、これに制限されるわけではない。油相には、Captex 300、Captex 335、Capmul MCM、脂肪酸エステル、中位の鎖(C8−C12)のモノ−、ジ−およびトリグリセリド、ポリオキシエチル化グリセリル脂肪酸エステル、脂肪アルコール、ポリグリコール化グリセリド、飽和ポリグリコール化C8−C10グリセリド、植物油およびシリコーン油などの材料が含まれうるが、これに制限されるわけではない。
【0127】
ミクロエマルジョンは、薬物可溶化および増大した薬物吸収の見地から、特に興味深い。脂質基剤のミクロエマルジョン(o/wおよびw/o双方)は、ペプチドを含めた薬物の経口バイオアベイラビリティーを強化させるために提案されている(Constantinides et al., Pharmaceutical Research, 1994,11,1385-1390; Ritschel, Met.Find.Exp.Clin.Pharmacol., 1993,13,205)。ミクロエマルジョンは、向上した薬物可溶化、酵素加水分解からの薬物の保護、サーファクタントに誘導される膜流動性および透過性の変化によって可能な薬物吸収増大、浸透の容易さ、固体剤形にまさる経口投与の容易さ、向上した臨床的力価、および減少した毒性の利点を与える(Constantinides et al., Pharmaceutical Research, 1994,11,1385; Ho et al., J.Pharm.Sci., 1996,85,138-143)。しばしば、ミクロエマルジョンは、それらの成分が周囲温度で一緒になった場合に、自然に形成されることがありうる。これは、熱不安定性の薬物、ペプチドまたはオリゴヌクレオチドを製剤化する場合に特に好都合でありうる。ミクロエマルジョンは、化粧品用途および医薬用途双方における活性成分の経皮供給にも有効であった。本発明のミクロエマルジョン組成物および製剤は、オリゴヌクレオチドおよび核酸の胃腸管からの増大した全身性吸収を容易にし、更には、胃腸管、膣、口腔および他の投与部位内でのオリゴヌクレオチドおよび核酸の局所性細胞内取込みを向上させることが期待される。
【0128】
本発明のミクロエマルジョンは、本発明のオリゴマー化合物および核酸の製剤の性質を向上させるためにおよび吸収を高めるために、ソルビタンモノステアラート(Grill 3)、Labrasol および浸透促進剤などの追加の成分および添加剤を含有してもよい。本発明のミクロエマルジョンに用いられる浸透促進剤は、大まかな5種類、すなわち、サーファクタント、脂肪酸、胆汁酸塩、キレート化剤および非キレート化非サーファクタントの内の一つに属するとして分類することができる(Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991,p.92)。これらクラスは各々、上に論じられた。
【0129】
薬物の製剤化について研究され且つ用いられてきたミクロエマルジョンの他にも、多数の組織的なサーファクタント構造が存在する。これらには、単分子層、ミセル、二分子層および小胞が含まれる。リポソームなどの小胞は、それらが提供する、それらの特異性および作用期間ゆえに、薬物供給の見地からきわめて興味をひいている。本発明で用いられる「リポソーム」という用語は、一つまたは複数の球状層に配列した両親媒性脂質を含んでなる小胞を意味する。
【0130】
リポソームは、親油性材料から形成される膜と水性内部を有する単層または多重層の小胞である。この水性部分は、供給される組成物を含有する。陽イオンリポソームは、細胞壁に融合することができるという利点を有する。非陽イオンリポソームは、効率よくというように細胞壁と融合することはできないが、in vivo でマクロファージによって取り込まれる。無傷の哺乳動物皮膚を越えるためには、脂質小胞は、適当な経皮的勾配の影響下において、各々50nm未満の直径を有する一連の細孔を通過しなければならない。したがって、きわめて変形性であり且つこのような細孔を通過することができるリポソームを使用することが望まれる。
【0131】
リポソームの更なる利点には、下記が含まれる:天然リン脂質から得られるリポソームは、生体適合性であり且つ生物分解性である;リポソームは、広範囲の水溶性および脂質可溶性の薬物を包含することができる;リポソームは、それらの内部区画中に内包された薬物を代謝および分解から保護することができる(Rosoff, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker(Eds.), 1988, Marcel Dekker,Inc., New York, N.Y., volume 1,p.245)。リポソーム製剤の製造における重要な問題は、脂質表面電荷、小胞サイズおよびリポソームの水性容量(aqueous volume)である。
【0132】
リポソームは、作用部位への活性成分の輸送および供給に有用である。リポソーム膜は、構造的に生体膜に似ているので、リポソームが組織に適用されると、リポソームは細胞膜と合体し始める。リポソームと細胞の合体が進行するにつれて、リポソーム内容物は細胞中に移され、そこで活性剤が作用しうる。
【0133】
リポソーム製剤は、多数の薬物の供給様式としての広範囲の研究の焦点になっている。局所投与について、リポソームは他の製剤にまさるいくつかの利点を与えるということがますます証明されている。このような利点には、投与される薬物の高い全身性吸収に関連する減少した副作用、所望の標的部位における投与される薬物の増加した蓄積、および親水性および疎水性双方の種々の薬物を皮膚中に投与する能力が含まれる。
【0134】
いくつかの報告は、高分子量DNAを含めた薬剤を皮膚中に供給するリポソームの能力を詳述している。鎮痛薬、抗体、ホルモンおよび高分子量DNAを含めた化合物は、皮膚に投与されている。大部分の用途は、上部表皮の標的指向(ターゲッティング)をもたらした。
【0135】
リポソームは、二つの大まかなクラスに分類される。陽イオンリポソームは、陰電荷DNA分子と相互作用して安定な複合体を形成する陽電荷リポソームである。陽電荷のDNA/リポソーム複合体は、陰電荷細胞表面に結合し、そしてエンドソーム中に取り込まれる。エンドソーム内の酸性pHのために、リポソームは破裂し、それらの内容物が細胞質中に放出される(Wang et al., Biochem.Biophys.Res.Commun., 1987,147,980-985)。
【0136】
pH感受性または陰電荷であるリポソームは、DNAと複合体を形成するよりもむしろDNAを捕捉する。DNAも脂質も、同様に帯電しているので、複合体形成よりもむしろ反発が生じる。それにもかかわらず、若干のDNAは、これらリポソームの水性内部中に捕捉される。pH感受性リポソームは、チミジンキナーゼ遺伝子をコードするDNAを培養中の細胞単層に供給するのに用いられている。外因性遺伝子の発現は、標的細胞中で検出された(Zhou et al., Journal of Controlled Release, 1992,19,269-274)。
【0137】
一つの主要なタイプのリポソーム組成物は、天然に由来するホスファチジルコリン以外のリン脂質を包含する。中性リポソーム組成物は、例えば、ジミリストイルホスファチジルコリン(DMPC)またはジパルミトイルホスファチジルコリン(DPPC)から形成されうる。陰イオンリポソーム組成物は、概して、ジミリストイルホスファチジルグリセロールから形成されるが、陰イオン性融合誘導リポソームは、主に、ジオレイルホスファチジルエタノールアミン(DOPE)から形成される。別のタイプのリポソーム組成物は、ホスファチジルコリン(PC)、例えば、ダイズPCおよび卵PCなどから形成される。別のタイプは、リン脂質および/またはホスファチジルコリンおよび/またはコレステロールの混合物から形成される。
【0138】
いくつかの研究は、皮膚へのリポソーム薬製剤の局所供給を評価している。インターフェロンを含有するリポソームのモルモット皮膚への適用は、皮膚ヘルペス潰瘍の減少をもたらしたが、他の手段による(例えば、溶液としてまたはエマルジョンとしての)インターフェロンの供給は、無効であった(Weiner et al., Journal of Drug Targeting, 1992,2,405-410)。更に、追加の研究は、リポソーム製剤の一部として投与されたインターフェロンの効力を、水性系を用いたインターフェロンの投与に対して調べ、リポソーム製剤が水性投与より優れていたと結論づけた(du Plessis et al., Antiviral research, 1992,18,259-265)。
【0139】
非イオンリポソーム系も調べて、皮膚への薬物の供給、特に、非イオンサーファクタントおよびコレステロールを含む系におけるそれらの有用性を決定した。NovasomeTMI(グリセリルジラウレート/コレステロール/ポリオキシエチレン−10−ステアリルエーテル)および NovasomeTMII(グリセリルジステアレート/コレステロール/ポリオキシエチレン−10−ステアリルエーテル)を含む非イオンリポソーム製剤を用いて、サイクロスポリンAをマウス皮膚の真皮中に供給した。結果は、このような非イオンリポソーム系が、皮膚の異なった層中へのサイクロスポリンAの沈着を促進する場合に有効であったことを示した(Hu et al., S.T.P.Pharma.Sci., 1994,4,6,466)。
【0140】
リポソームには、特殊化された脂質が、リポソーム中に包含された場合に、このような特殊化された脂質を欠いたリポソームに比べて増大した循環寿命を生じる、一つまたはそれを超える特殊化された脂質を含むリポソームを意味する、本明細書中で用いられる用語である「立体的に安定化された」リポソームも含まれる。立体的に安定化されたリポソームの例は、リポソームの小胞形成脂質部分の一部分が、(A)モノシアロガングリオシドGM1などの一つまたはそれを超える糖脂質を含むもの、または(B)ポリエチレングリコール(PEG)部分などの一つまたはそれを超える親水性ポリマーで誘導体化されているものである。いずれの特定の理論によっても拘束されたくはないが、当該技術分野において、ガングリオシド、スフィンゴミエリン、またはPEGで誘導体化された脂質を含有する立体的に安定化されたリポソームについては少なくとも、これら立体的に安定化されたリポソームの増大した循環半減期が、細網内皮系(RES)の細胞中への減少した取込みに由来しているということが考えられる(Allen et al., FEBS Letters, 1987,223,42; Wu et al., Cancer Research, 1993,53,3765)。
【0141】
一つまたはそれを超える糖脂質を含む種々のリポソームは、当該技術分野において知られている。Papahadjopoulos et al.(Ann.N.Y.Acad.Sci., 1987,507,64)は、リポソームの血中半減期を向上させるモノシアロガングリオシドGM1、硫酸ガラクトセレブロシドおよびホスファチジルイノシトールの能力を報告した。これら知見は、Gabizon et al.(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A., 1988,85,6949)によって説明された。双方とも Allen et al., による米国特許第4,837,028号およびWO88/04924号は、(1)スフィンゴミエリンおよび(2)ガングリオシドGM1または硫酸ガラクトセレブロシドエステルを含むリポソームを開示している。米国特許第5,543,152号(Webb et al.)は、スフィンゴミエリンを含むリポソームを開示している。1,2−sn−ジミリストイルホスファチジルコリンを含むリポソームは、WO97/13499号(Lim et al.)に開示されている。
【0142】
一つまたはそれを超える親水性ポリマーで誘導体化された脂質を含む多数のリポソームおよびそれらの製造方法が、当該技術分野において知られている。Sunamoto et al.(Bull.Chem.Soc.Jpn., 1980,53,2778)は、PEG部分を含有する非イオンデタージェント2C1215Gを含むリポソームを記載した。Illum et al.(FEBS Lett., 1984,167,79)は、ポリマー性グリコールでのポリスチレン粒子の親水性コーティングが、有意に増大した血中半減期をもたらすということに注目した。ポリアルキレングリコール(例えば、PEG)のカルボン酸基の取り付けによって修飾された合成リン脂質は、Sears(米国特許第4,426,330号および第4,534,899号)によって記載されている。Klibanov et al.(FEBS Lett., 1990,268,235)は、PEGまたはPEGステアレートで誘導体化されたホスファチジルエタノールアミン(PE)を含むリポソームが、血中循環半減期の有意の増加を有するということを示す実験を記載した。Blume et al.(Biochimica et Biophysica Acta, 1990,1029,91)は、このような知見を、他のPEGで誘導体化されたリン脂質、例えば、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン(DSPE)およびPEGの組合せから形成されるDSPE−PEGへと拡大させた。共有結合したPEG部分を外表面上に有するリポソームは、Fisher による欧州特許EP0445131B1号およびWO90/04384号に記載されている。1〜20モルパーセントの、PEGで誘導体化されたPEを含有するリポソーム組成物およびそれらの使用方法は、Woodle et al.(米国特許第5,013,556号および第5,356,633号)および Martin et al.(米国特許第5,213,804号および欧州特許EP0496813B1号)によって記載されている。若干数の他の脂質−ポリマーコンジュゲートを含むリポソームが、WO91/05545号および米国特許第5,225,212号(双方とも Martin et al. による)およびWO94/20073号(Zalipsky et al.)に開示されている。PEG修飾セラミド脂質を含むリポソームは、WO96/10391号(Choi et al.)に記載されている。米国特許第5,540,935号(Miyazaki et al.)および同第5,556,948号(Tagawa et al.)は、官能基部分で表面上に更に誘導体化されうるPEG含有リポソームを記載している。
【0143】
核酸を含む限られた数のリポソームが、当該技術分野において知られている。Thierry et al. によるWO96/40062号は、高分子量核酸をリポソーム中に内包する方法を記載している。Tagawa et al. による米国特許第5,264,221号は、タンパク質に結合したリポソームを開示し、そしてこのようなリポソームの内容物がアンチセンスRNAを包含しうるということを主張している。Rahman et al., による米国特許第5,665,710号は、オリゴデオキシヌクレオチドをリポソーム中に内包する若干の方法を記載している。Love et al., によるWO97/04787号は、raf遺伝子に標的指向するアンチセンスオリゴヌクレオチドを含むリポソームを開示している。
【0144】
トランスファーソーム(transfersomes)は、また別のタイプのリポソームであり、薬物供給ビヒクルにとって魅力的な候補であるきわめて変形性の脂質凝集体である。トランスファーソームは、きわめて変形性の脂質液体粒子であるので、その液体粒子より小さい細孔を介して容易に浸透することができる脂質液体粒子として記載することができる。トランスファーソームは、それらが用いられる環境に適応性であり、例えば、それらは、自己最適化性(皮膚の細孔の形状に適応できる)、自己修復性であり、しばしば、フラグメント化することなくそれらの標的に達する、そしてしばしば、自己ローディングする。トランスファーソームを作るために、表面端活性化因子(surface edge-activators)、通常は、サーファクタントを、標準的なリポソーム組成物に加えることは可能である。トランスファーソームは、皮膚に血清アルブミンを供給するのに用いられてきている。トランスファーソームに媒介される血清アルブミン供給は、血清アルブミン含有溶液の皮下注射と同程度に有効であることが分かっている。
【0145】
サーファクタントは、エマルジョン(ミクロエマルジョンを含めた)およびリポソームなどの製剤で広く応用されている。天然および合成双方の多数の異なったタイプのサーファクタントの性質を分類し且つ格付けする最も一般的な方法は、親水/親油バランス(HLB)の使用による。親水基(「ヘッド」としても知られる)の性状は、製剤中で用いられるいろいろなサーファクタントを分類する最も有用な手段を与える(Rieger, in Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Dekker,Inc., New York, N.Y., 1988, p.285)。
【0146】
サーファクタント分子がイオン化されない場合、それは、非イオンサーファクタントとして分類される。非イオンサーファクタントは、医薬製品および化粧品で広く応用されていて、広範囲のpH値にわたって使用できる。概して、それらのHLB値は、それらの構造に依存して2〜約18である。非イオンサーファクタントには、エチレングリコールエステル、プロピレングリコールエステル、グリセリルエステル、ポリグリセリルエステル、ソルビタンエステル、スクロースエステルおよびエトキシル化エステルなどの非イオン性エステルが含まれる。脂肪アルコールエトキシレート、プロポキシル化アルコールおよびエトキシル化/プロポキシル化ブロックポリマーなどの非イオン性アルカノールアミドおよびエーテルも、このクラスに含まれる。ポリオキシエチレンサーファクタントは、非イオンサーファクタントクラスで最も一般的なメンバーである。
【0147】
サーファクタント分子が、水中に溶解したまたは分散した時に陰電荷を有する場合、そのサーファクタントは陰イオン性として分類される。陰イオンサーファクタントには、石けんなどのカルボキシラート、アシルラクチレート、アミノ酸のアシルアミド、アルキルスルフェートおよびエトキシル化アルキルスルフェートなどの硫酸のエステル、アルキルベンゼンスルホネートなどのスルホネート、アシルイセチオネート、アシルタウレートおよびスルホスクシネート、およびホスフェートが含まれる。陰イオンサーファクタントクラスの最も重要なメンバーは、アルキルスルフェートおよび石けんである。
【0148】
サーファクタント分子が、水中に溶解したまたは分散した時に陽電荷を有する場合、そのサーファクタントは陽イオン性として分類される。陽イオンサーファクタントには、第四級アンモニウム塩およびエトキシル化アミンが含まれる。第四級アンモニウム塩は、このクラスで最も用いられるメンバーである。
【0149】
サーファクタント分子に、陽電荷または陰電荷のいずれもを有する能力がある場合、そのサーファクタントは両性として分類される。両性サーファクタントには、アクリル酸誘導体、置換アルキルアミド、N−アルキルベタインおよびホスファチドが含まれる。薬物製品、製剤およびエマルジョンでのサーファクタントの使用は概説されている(Rieger, in Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Dekker,Inc., New York, N.Y., 1988, p.285)。
【0150】
一つの態様において、本発明は、動物の皮膚への核酸、特に、オリゴマー化合物の有効な供給を行うのに、種々の浸透促進剤を用いている。大部分の薬物は、溶液中にイオン化された形およびイオン化されない形の両方で存在している。しかしながら、通常は、脂質可溶性または親油性の薬物だけが、容易に細胞膜を越える。越えるべき膜が浸透促進剤で処理されているならば、非親油性薬物でも細胞膜を越えることができるということが発見されている。細胞膜を越えた非親油性薬物の拡散を助けることに加えて、浸透促進剤は、親油性薬物の透過性も増大させる。浸透促進剤は、大まかな5種類、すなわち、サーファクタント、脂肪酸、胆汁酸塩、キレート化剤および非キレート化非サーファクタントの内の一つに属するように分類することができる(Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991,p.92)。上述の浸透促進剤のクラスは各々、下に更に詳細に記載される。
【0151】
本発明に関連して、サーファクタント(または「界面活性剤」)は、水溶液中に溶解した場合に、その水溶液の表面張力またはその水溶液と別の液体との間の界面張力を減少させる化学物質であり、粘膜を介するオリゴヌクレオチドの吸収が増大するという結果を伴う。胆汁酸塩および脂肪酸に加えて、これら浸透促進剤には、例えば、ラウリル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレン−9−ラウリルエーテルおよびポリオキシエチレン−20−セチルエーテル(Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991,p.92);およびFC43などのペルフルオロ化学エマルジョンが含まれる。Takahashi et al., J.Pharm.Pharmacol., 1988,40,252)。
【0152】
浸透促進剤として作用する種々の脂肪酸およびそれらの誘導体には、例えば、オレイン酸、ラウリン酸、カプリン酸(n−デカン酸)、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプレート、トリカプレート、モノオレイン(1−モノオレオイル−rac−グリセロール)、ジラウリン、カプリル酸、アラキドン酸、グリセロール1−モノカプレート、1−ドデシルアザシクロヘプタン−2−オン、アシルカルニチン、アシルコリン、それらのC1−10アルキルエステル(例えば、メチル、イソプロピルおよびt−ブチル)、およびそれらのモノ−およびジグリセリド(すなわち、オレエート、ラウレート、カプレート、ミリステート、パルミテート、ステアレート、リノレエート等)(Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991,p.92; Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990,7,1-33; El Hariri et al., J.Pharm.Pharmacol., 1992,44,651-654)が包含される。
【0153】
胆汁の生理学的役割には、脂質および脂溶性ビタミンの分散および吸収の促進が含まれる(Brunton, Chapter 38 in: Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 9th Ed., Hardman et al. Eds., McGraw-Hill, New York, 1996,pp.934-935)。種々の天然の胆汁酸塩およびそれらの合成誘導体は、浸透促進剤として作用する。したがって、「胆汁酸塩」という用語には、いずれかの天然に存在する胆汁成分並びにいずれかのそれらの合成誘導体が含まれる。本発明の胆汁酸塩には、例えば、コール酸(またはその薬学的に許容しうるナトリウム塩、コール酸ナトリウム)、デヒドロコール酸(デヒドロコール酸ナトリウム)、デオキシコール酸(デオキシコール酸ナトリウム)、グルコール酸(グルコール酸ナトリウム)、グリコール酸(グリココール酸ナトリウム)、グリコデオキシコール酸(グリコデオキシコール酸ナトリウム)、タウロコール酸(タウロコール酸ナトリウム)、タウロデオキシコール酸(タウロデオキシコール酸ナトリウム)、ケノデオキシコール酸(ケノデオキシコール酸ナトリウム)、ウルソデオキシコール酸(UDCA)、タウロ−24,25−ジヒドロフシジン酸ナトリウム(STDHF)、グリコジヒドロフシジン酸ナトリウムおよびポリオキシエチレン−9−ラウリルエーテル(POE)が含まれる(Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991,page 92; Swinyard, Chapter 31 In: Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990,pages 782-783; Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990,7,1-33; Yamamoto et al., J.Pharm.Exp.Ther., 1992,263,25; Yamashita et al., J.Pharm.Sci., 1990,79,579-583)。
【0154】
本発明に関連して用いられるキレート化剤は、それと複合体を形成することによって溶液から金属イオンを除去する化合物として定義することができ、粘膜を介するオリゴヌクレオチドの吸収が増大するという結果を伴う。本発明における浸透促進剤としてのそれらの使用に関して、キレート化剤は、大部分の特性決定されたDNAヌクレアーゼが、触媒作用のために二価の金属イオンを必要とし、したがって、キレート化剤によって阻害されるので、DNアーゼ阻害剤としても役立つという追加の利点を有する(Jarrett,J. Chromatogr., 1993,618,315-339)。本発明のキレート化剤には、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム(EDTA)、クエン酸、サリチレート(例えば、サリチル酸ナトリウム、5−メトキシサリチレートおよびホモバニレート)、コラーゲンのN−アシル誘導体、ラウレス−9、およびβ−ジケトンのN−アミノアシル誘導体(エナミン)が含まれるが、これに制限されるわけではない(Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991,page 92; Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990,7,1-33; Buur et al., J.Control Rel, 1990,14,43-51)。
【0155】
本明細書中で用いられる非キレート化非サーファクタント浸透促進性化合物は、キレート化剤としてもサーファクタントとしても無意味な活性を示すが、それにもかかわらず、消化器粘膜を介するオリゴヌクレオチドの吸収を増大させる化合物として定義することができる(Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990,7,1-33)。このクラスの浸透促進剤には、例えば、不飽和環状尿素、1−アルキルアルカノンおよび1−アルケニルアザシクロアルカノン誘導体(Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991,page 92);およびジクロフェナクナトリウム、インドメタシンおよびフェニルブタゾンなどの非ステロイド系抗炎症薬(Yamashita et al., J.Pharm.Pharmacol., 1987,39,621-626)が含まれる。
【0156】
細胞レベルでのオリゴヌクレオチドの取込みを増大させる薬剤も、本発明の医薬組成物および他の組成物に加えることができる。例えば、リポフェクチン(Junichi et al., 米国特許第5,705,188号)などの陽イオン脂質、陽イオングリセロール誘導体、およびポリリシン(Lollo et al., PCT出願WO97/30731号)などのポリカチオン分子も、オリゴヌクレオチドの細胞内取込みを増大させることが知られている。
【0157】
エチレングリコールおよびプロピレングリコールなどのグリコール類、2−ピロールなどのピロール類、アゾン類およびリモネンおよびメントンなどのテルペン類を含めた、他の薬剤を、投与される核酸の浸透を促進するのに利用することができる。
【0158】
本発明のある種の組成物は、製剤中に担体化合物も包含する。本明細書中で用いられる「担体化合物」または「担体」は、不活性である(すなわち、それ自体は生物学的活性を有していない)が、生物学的活性を有する核酸のバイオアベイラビリティーを、例えば、生物学的に活性な核酸を分解することまたは循環からのその除去を促進することによって減少させる in vivo 過程で、核酸として認識される核酸またはその類似体を意味することができる。核酸および担体化合物の、典型的には、過剰の後者物質を含む共投与は、おそらくは、共通の受容体への担体化合物と核酸との間の競合のために、肝、腎臓または他の循環外貯蔵器に回収される核酸の量の実質的減少を引き起こすことがありうる。例えば、肝組織中の部分ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの回収は、それを、ポリイノシン酸、硫酸デキストラン、ポリシチジン酸または4−アセトアミド−4’−イソチアシアノ−スチルベン−2,2’−ジスルホン酸と共投与した場合に減少することがありうる(Miyao et al., Antisense Res.Dev., 1995,5,115-121; Takakura et al., Antisense & Nucl.Acid Drug Dev., 1996,6,177-183)。
【0159】
担体化合物とは対照的に、「医薬担体」または「賦形剤」は、一つまたはそれを超える核酸を動物に供給するための薬学的に許容しうる溶媒、懸濁化剤またはいずれか他の薬理学的に不活性なビヒクルである。賦形剤は、液体または固体であってよく、計画される投与方式を考慮して、核酸とある一定の医薬組成物の他の成分とを組み合わせた場合の所望の嵩、コンシステンシー等を与えるように選択される。典型的な医薬担体には、結合剤(例えば、プレゲル化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース等);充填剤(例えば、ラクトースおよび他の糖類、微結晶性セルロース、ペクチン、ゼラチン、硫酸カルシウム、エチルセルロース、ポリアクリレートまたはリン酸水素カルシウム等);滑沢剤(例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、シリカ、コロイド二酸化ケイ素、ステアリン酸、金属ステアリン酸塩類、水素化植物油、トウモロコシデンプン、ポリエチレングリコール、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム等);崩壊剤(例えば、デンプン、デンプングリコラートナトリウム等);および湿潤剤(例えば、ラウリル硫酸ナトリウム等)が含まれるが、これに制限されるわけではない。
【0160】
核酸と有害な反応をしない、非経口的でない(non-parenteral)投与に適した薬学的に許容しうる有機または無機賦形剤を、本発明の組成物を製剤化するのに用いることもできる。適当な薬学的に許容しうる担体には、水、塩溶液、アルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、ラクトース、アミロース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、粘性パラフィン、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン等が含まれるが、これに制限されるわけではない。
【0161】
核酸の局所投与用製剤には、滅菌および非滅菌の、水溶液、アルコールなどの一般溶媒中の非水溶液、または液体または固形油基剤中の核酸の溶液が含まれうる。これら溶液は、緩衝剤、希釈剤および他の適当な添加剤も含有してよい。核酸と有害な反応をしない、非経口的でない投与に適した薬学的に許容しうる有機または無機賦形剤を用いることができる。
【0162】
適当な薬学的に許容しうる賦形剤には、水、塩溶液、アルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、ラクトース、アミロース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、粘性パラフィン、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン等が含まれるが、これに制限されるわけではない。
【0163】
本発明の組成物は、更に、医薬組成物中で慣用的に見出される他の補助成分を、それらの技術分野で確立された使用レベルで含有してよい。したがって、例えば、これら組成物は、追加の相容性で薬学的に活性な材料、例えば、止痒薬、収斂薬、局所麻酔薬または抗炎症薬などを含有してよいし、または本発明の組成物の種々の剤形を物理的に製剤化する場合に有用な、色素、着香剤、保存剤、酸化防止剤、乳白剤、増粘剤および安定化剤などの追加の材料を含有してよい。しかしながら、このような材料は、加えられる場合、本発明の組成物の成分の生物学的活性を過度に妨げるべきではない。これら製剤は、滅菌し、そして所望ならば、製剤の一つまたは複数の核酸と有害な反応をしない補助剤、例えば、滑沢剤、保存剤、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧に影響を与える塩類、緩衝剤、着色剤、着香剤および/または芳香物質等と混合することができる。
【0164】
水性懸濁剤は、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトールおよび/またはデキストランを含めた、懸濁剤の粘度を増加させる物質を含有してよい。この懸濁剤は、安定化剤も含有してよい。
【0165】
本発明の化合物は、取込み、分配および/または吸収を助けるための、例えば、リポソーム、受容体標的指向分子、経口、直腸、局所用のまたは他の製剤のような、他の分子、分子構造または化合物の混合物と混合する、カプセルに内包する、コンジュゲートするまたはそれ以外の形式で会合することもできる。このような取込み、分配および/または吸収を助ける製剤の製造を教示する代表的な米国特許には、各々が本明細書中に援用される、米国特許第5,108,921号;第5,354,844号;第5,416,016号;第5,459,127号;第5,521,291号;第5,543,158号;第5,547,932号;第5,583,020号;第5,591,721号;第4,426,330号;第4,534,899号;第5,013,556号;第5,108,921号;第5,213,804号;第5,227,170号;第5,264,221号;第5,356,633号;第5,395,619号;第5,416,016号;第5,417,978号;第5,462,854号;第5,469,854号;第5,512,295号;第5,527,528号;第5,534,259号;第5,543,152号;第5,556,948号;第5,580,575号;および第5,595,756号が含まれるが、これに制限されるわけではない。
【0166】
本発明のオリゴマー化合物は、いずれかの薬学的に許容しうる塩、エステル、またはこのようなエステルの塩、またはヒトを含めた動物への投与で、その生物学的に活性な代謝産物または残渣を(直接的にまたは間接的に)与えることができるいずれか他の化合物を包含する。したがって、例えば、この開示は、本発明の化合物のプロドラッグおよび薬学的に許容しうる塩、このようなプロドラッグの薬学的に許容しうる塩、および他の生物学的同等物にも及ぶ。
【0167】
「プロドラッグ」という用語は、内因性酵素または他の化学物質および/または状態の作用によって体内またはその細胞内で活性型(すなわち、薬物)に変換される不活性型で製造される治療薬を意味する。具体的には、本発明のオリゴヌクレオチドのプロドラッグバージョンは、1993年12月9日公開の Gosselin et al. によるWO93/24510号または Imbach et al. によるWO94/26764号およびU.S.5,770,713号に開示された方法にしたがって、SATA[(S−アセチル−2−チオエチル)ホスフェート]誘導体として製造される。
【0168】
「薬学的に許容しうる塩」という用語は、本発明の化合物の生理学的におよび薬学的に許容しうる塩、すなわち、親化合物の所望の生物学的活性を保持し且つそれに望ましくない毒物学的効果を与えない塩を意味する。
【0169】
薬学的に許容しうる塩基付加塩は、アルカリ金属およびアルカリ土類金属または有機アミンのような、金属またはアミンで形成される。陽イオンとして用いられる金属の例は、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム等である。適当なアミンの例は、N,N’−ジベンジルエチレンジアミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、ジシクロヘキシルアミン、エチレンジアミン、N−メチルグルカミンおよびプロカインである(例えば、Berge et al., "Pharmaceutical Salts," J. of Pharma Sci., 1977,66,1-19 を参照されたい)。この酸性化合物の塩基付加塩は、遊離酸の形と充分な量の所望の塩基とを慣用法で接触させて塩を生じることによって製造される。遊離酸の形は、塩の形と酸とを慣用法で接触させ且つ遊離酸を単離することによって再生することができる。遊離酸の形は、極性溶媒への溶解度などの一定の物理的性質が、それらのそれぞれの塩の形とある程度異なるが、それ以外では、これら塩は、本発明の目的のそれぞれの遊離酸に等しい。本明細書中で用いられる「薬学的付加塩」には、本発明の組成物の一つの成分の酸の形の薬学的に許容しうる塩が含まれる。これらには、アミンの有機酸塩または無機酸塩が含まれる。好ましい酸塩は、塩酸塩、酢酸塩、サリチル酸塩、硝酸塩およびリン酸塩である。他の適当な薬学的に許容しうる塩は、当業者に周知であり、種々の無機酸または有機酸、例えば、無機酸、例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸またはリン酸などとの;有機カルボン酸、スルホン酸、スルホ若しくはホスホ酸(sulfo and phospho acids)、またはN−置換スルファミン酸、例えば、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、コハク酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、メチルマレイン酸、フマル酸、リンゴ酸、酒石酸、乳酸、シュウ酸、グルコン酸、グルカル酸、グルクロン酸、クエン酸、安息香酸、ケイ皮酸、マンデル酸、サリチル酸、4−アミノサリチル酸、2−フェノキシ安息香酸、2−アセトキシ安息香酸、エンボン酸(embonic acid)、ニコチン酸またはイソニコチン酸との;および天然のタンパク質合成に関与する20α−アミノ酸などのアミノ酸、例えば、グルタミン酸またはアスパラギン酸との、そして更に、フエニル酢酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、2−ヒドロキシエタンスルホン酸、エタン−1,2−ジスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、4−メチルベンゼンスルホン酸、ナフタレン−2−スルホン酸、ナフタレン−1,5−ジスルホン酸、2−または3−ホスホグリセリン酸、グルコース−6−リン酸、N−シクロヘキシルスルファミン酸(シクラメートの形成で)との、またはアスコルビン酸などの他の酸有機化合物とのような塩基性塩が含まれる。化合物の薬学的に許容しうる塩は、薬学的に許容しうる陽イオンで製造することもできる。適当な薬学的に許容しうる陽イオンは、当業者に周知であり、アルカリ、アルカリ土類、アンモニウムおよび第四級アンモニウムの陽イオンが含まれる。炭酸塩または炭酸水素塩も可能である。
【0170】
オリゴマー化合物について、薬学的に許容しうる塩の好ましい例には、(a)ナトリウム、カリウム、アンモニウム、マグネシウム、カルシウム、スペルミンおよびスペルミジンなどのポリアミン等のような陽イオンで形成される塩;(b)無機酸、例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸、硝酸等で形成される酸付加塩;(c)有機酸、例えば、酢酸、シュウ酸、酒石酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、グルコン酸、クエン酸、リンゴ酸、アスコルビン酸、安息香酸、タンニン酸、パルミチン酸、アルギン酸、ポリグルタミン酸、ナフタレンスルホン酸、メタンスルホン酸、p−トルエンスルホン酸、ナフタレンジスルホン酸、ポリガラクツロン酸等などで形成される塩;および(d)塩素、臭素およびヨウ素などの元素陰イオンから形成される塩が含まれるが、これに制限されるわけではない。
【0171】
本明細書中に示される材料、方法および実施例は、例示するためのものであり、本発明の範囲を制限するものではない。本明細書中に挙げられた公報、特許出願、特許および他の参考文献は全て、本明細書中にそのまま援用される。特に断らない限り、専門用語および科学用語は全て、それら技術分野で認められる意味を有するものである。
【0172】
実施例1
5’−O−DMT−L−チミジン(2)。
【0173】
【化16】
Figure 2005504020
【0174】
化合物1(800mg,3.3mmol,(Smejkal,J. et al. Collect.Czech.Chem.Commun. 1964,29,2809-2813 および Jung,M.E. et al. Tetrahedron Lett. 1998,39,4615-4618 にしたがって製造される))を、高真空下のP上において40℃で一晩乾燥させた。次に、それを無水ピリジン(10mL)と共蒸発させた。得られた残留物を、ピリジン(9mL)中にアルゴン雰囲気下で溶解させた。4−ジメチルアミノピリジン(40mg,0.33mmol)および塩化DMT(DMT−Cl,1.33g,3.93mmol)をその混合物に加え、反応混合物を室温で、出発物質が全て消失するまで(12時間)撹拌した。メタノール(0.5mL)を加え、溶媒を真空中で除去した。残留物をクロマトグラフィーによって分離し、6:4の酢酸エチル:ヘキサンで溶離して、2(1.42g,79%)を生じた。
=0.17(6:4の酢酸エチル:ヘキサンで)。
MS(ES)m/z543(M−H)。
【0175】
実施例2
5’−O−DMT−L−チミジン−3’−O−[(2−シアノエチル)−N,N−ジイソプロピルホスホロアミダイト](3)。
化合物2(1.00g,1.84mmol)を、トルエン(20mL)と共蒸発させた。その残留物に、N,N−ジイソプロピルアミンテトラゾリド(0.16g,0.92mmol)を加え、高真空下のP上において40℃で一晩乾燥させた。乾燥した反応混合物を、無水アセトニトリル:CHCl(9:2mL)中に溶解させ、2−シアノエチル−N,N,N’,N’−テトライソプロピルホスホロアミダイト(1.2mL,3.68mmol)を加えた。反応混合物を、不活性雰囲気下において周囲温度で4時間撹拌した。反応の進行は、TLC(1:1のヘキサン:酢酸エチル)によって監視した。溶媒を蒸発させ、残留物を酢酸エチル(70mL)中に溶解させ、5%水性NaHCO(40mL)で洗浄した。酢酸エチル層を、無水NaSO上で乾燥させ、濃縮した。得られた残留物を、クロマトグラフィーによって分離して(溶離剤として3:2の酢酸エチル:ヘキサン)、3を泡状物(0.82g,60.3%)として生じた。
=0.47(3:2の酢酸エチル:ヘキサン)。
31P NMR(CDCl)δ149.98,149.57ppm;
MS(API−ES)m/z743.3(M−H)
【0176】
実施例3
5’−O−DMT−L−チミジン−3’−O−スクシニルCPG(4)。
化合物2(0.2g,0.37mmol)を、無水コハク酸(0.074g,0.73mmol)およびDMAP(0.023g,0.19mmol)と混合した。その混合物を、真空中においてP上で一晩乾燥させた。これに、Cl−CH−CH−Cl(1.1mL)およびトリエチルアミン(0.2mL,1.46mmol)を加えた。反応混合物を60℃で2時間加熱した。その反応混合物をCHCl(20mL)で希釈し、5%水性クエン酸(20mL)、水(20mL)およびブライン(20mL)で洗浄した。有機相を、無水NaSO上で乾燥させ、真空中で濃縮して(0.22g,93%)泡状物とした。
=0.23(CHCl:MeOH中の5%MeOH)。
得られた残留物を、次の反応にそのまま用いた。
【0177】
【数1】
Figure 2005504020
【0178】
スクシニル誘導体(0.19g,0.25mmol)を、真空中のP上において40℃で一晩乾燥させた。無水DMF(0.62mL)を加えた後、2−(1H−ベンゾトリアゾール)−1−イル)−1,1,3,3−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート(0.081g,0.25mmol)およびN−メチルモルホリン(55μL,0.5mmol)を加えた。旋回させて透明溶液を生じた。これに、無水DMF(2.4mL)および活性CPG(1.08g,115.2mmol/g,粒度120/200,平均細孔直径520Å)を加えた。次に、それを振とう機上で18時間振とうさせた。アリコートを取り、負荷能力を推定した。機能付加されたCPGを濾過し、DMF、CHCNおよびEtOで充分に洗浄した。真空中で一晩乾燥させた。機能付加されたCPG(3)を、キャッピング溶液(2mL,CapA,無水酢酸/ルチジン/THF,2mL,CapB,N−メチルイミダゾール/THF,Perspective Biosystems Inc.)中に懸濁させ、振とう機上で2時間振とうさせた。濾過し、CHCNおよびEtOで洗浄した。真空中で乾燥させ、そして負荷能力を標準法によって決定した。最終負荷能力52.62μmol/g。
【0179】
実施例4
5’−O−DMT−L−N−ベンゾイル−2’−デオキシアデノシン−3’−O−[(2−シアノエチル)−N,N−ジイソプロピルホスホロアミダイト](5)。
1−クロロ−5,3−ビス(トリル)−2−デオキシL−リボースを、[Jung,M.E. et al. Tetrahedron Lett. 1990,31,6983-6986; Gosselin,G. et al. Tetrahedron Lett. 1997,38,4199-4202, Nucleosides & Nucleotides 1998,17,1731-1738]に記載のように製造する。次に、これを、Vorbruggen 条件下においてN−ベンゾイルアデニンとカップリングさせて、N−ベンゾイル−5’,3’−トリル−1−アデノシンを生じる。メチルアミンでのトリル基の脱保護は、L−アデノシンを生じる。次に、それを、塩化ベンゾイル、TMSCl、ピリジンおよび水性アンモニアの存在下の一時的な保護条件下においてN−ベンゾイル−L−アデノシンに変換する。ピリジン中DMTClの存在下での5’−トリチル化および3’位におけるホスフィチル化は、化合物5を生じる。
【0180】
実施例5
5’−O−DMT−L−N−ベンゾイル−5−メチル−2’−デオキシシチジン−3’−O−[(2−シアノエチル)−N,N−ジイソプロピルホスホロアミダイト](6)
化合物2を、参考文献手順[Divakar,K.J. et al. J.Chem.Soc.Perk.Trans. 1 1982,1171-1176]にしたがって、5’−O−DMT−L−5−メチルシチジンに変換する。次に、それを、参考文献手順[Bhat,V. et al. Nucleosides Nucleotides 1989,8,179-183]にしたがって、N−ベンゾイル誘導体に変換する。次に、これを、3’位においてホスフィチル化して、化合物6を生じる。
【0181】
実施例6
5’−O−DMT−L−N−イソブチリル−2’−デオキシグアノシン−3’−O−[(2−シアノエチル)−N,N−ジイソプロピルホスホロアミダイト](7)
1−クロロ−5,3−ビス(トリル)−2−デオキシL−リボースを、Jung,M.E. et al. Tetrahedron Lett. 1997,38,4199-4202 および Gosselin,G. et al. Nucleosides & Nucleotides 1998,17,1731-1738 に記載のように製造する。次に、これを、4−クロロ−2−アミノピロロ[2,3−d]ピリミジン[Davoll,J. et al. J.Chem.Soc. 1960,131-138 によって記載の手順にしたがって製造される]と、NaHおよびアセトニトリルの下でカップリングさせる[Ramasamy,K. et al. J.Hetrocyclic Chem., 1988,25,1893-1897]。次に、これを、80℃において水性アンモニアで処理して、L−2’−デオキシグアノシンを生じる。これを、塩化イソブチリル、ピリジンおよびTMSClの存在下の一時的な保護条件下においてL−N−イソブチリル−2’−デオキシグアノシンに変換する[Ti,G.S. et al. J.Am.Chem.Soc., 1982,104,1316-1319]。次に、これを、DMTCl、DMAPおよびピリジンの存在下で5’−O−DMT−L−N−イソブチリル−2’−デオキシグアノシンに変換後、3’位にホスフィチル化して、化合物7を生じる。
【0182】
実施例7
5’−O−DMT−L−5−(1−プロピニル)ウリジン−3’−O−[(2−シアノエチル)−N,N−ジイソプロピルホスファミダイト](8)
1−クロロ−5,3−ビス(トリル)−2−デオキシL−リボースを、Jung,M.E. et al. Tetrahedron Lett. 1997,38,4199-4202 および Gosselin,G. et al. Nucleosides & Nucleotides 1998,17,1731-1738 に記載のように製造する。次に、これを、Vorbruggen 条件下において5−ヨードウラシルとカップリングさせて、L−5−(ヨード)−5’,3’−トリル−1−ウリジンを生じる。次に、これをプロピン[Switzer C. et al., Bioorg.Med.Chem.Lett. 1996,6,815-818 に記載の]とカップリングさせて、L−5−(プロピニル)−5’,3’−トリルウリジンを生じる。5’位および3’位の保護基の脱保護は、L−5−(プロピニル)ウリジンを生じる。この化合物を、DMTCl、DMAPおよびピリジンで5’−O−DMT化合物に変換後、ホスフィチル化して、標題化合物8を生じる。
【0183】
実施例8
5’−O−DMT−L−5−(1−プロピニル)シチジン−3’−O−[(2−シアノエチル)−N,N−ジイソプロピルホスホロアミダイト](9)
5’−O−DMT−L−5−(1−プロピニル)ウリジン(化合物7について記載の手順にしたがって製造される)を、参考文献手順[Divakar,K.J. et al. J.Chem.Soc.Perk.Trans. 1 1982,1171-1176]にしたがって、5’−O−DMT−L−5−(1−プロピニル)シチジンに変換する。これを、3’位にホスフィチル化して、化合物9を生じる。
【0184】
実施例9
5’−O−DMT−L−3(2−デオキシ−β−D−エリトロペントフラノシル)(9I)−1H−ピリミド[5,4−b]ベンゾキサジン−2(3H)−オン−3’−O−[(2−シアノエチル)−N,N−ジイソプロピルホスホロアミダイト](10)
L−5−ブロモウリジンを、5−ブロモウリジンおよび1−クロロ−5,3−ビス(トリル)−2−デオキシL−リボースから、Vorbruggen 条件下で得る。これを、参考文献手順[Lin,K-Y. et al J.Am.Chem.Soc. 1995,117,3873-3874, Matteucci,M.D. et al. 94−US10536]にしたがって、5,3−ビス(トリル)−L−3(2−デオキシ−β−D−エリトロペントフラノシル)(9I)−1H−ピリミド[5,4−b]ベンゾキサジン−2(3H)−オンに変換する。次に、これを、メチルアミンで脱保護し、5’位にトリチル化し、そして3’位にホスフィチル化して、化合物10を生じる。
【0185】
実施例10
5’−O−DMT−L−N−ベンゾイル−2’−デオキシアデノシン−3’−O−スクシニルCPG(11)。
5’−O−DMT−L−N−ベンゾイル−2’−デオキシアデノシン(化合物5の合成に記載のように製造される)を、無水コハク酸およびDMAPの存在下のジクロロエタン中において60℃で、3’−O−スクシニル誘導体に変換する。このスクシニル誘導体を、2−(1H−ベンゾトリアゾール)−1−イル)−1,1,3,3−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレートおよびN−メチルモルホリンの存在下のDMF中においてアミノアルキルCPGにカップリングさせて、化合物11を生じる。
【0186】
実施例11
5’−O−DMT−L−N−ベンゾイル−5−メチル−2’−デオキシシチジン−3’−O−スクシニルCPG(12)。
5’−O−DMT−L−N−ベンゾイル−5−メチル−2’−デオキシシチジン(化合物6の合成に記載のように製造される)を、無水コハク酸およびDMAPの存在下のジクロロエタン中において60℃で、3’−O−スクシニル誘導体に変換する。このスクシニル誘導体を、2−(1H−ベンゾトリアゾール)−1−イル)−1,1,3,3−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレートおよびN−メチルモルホリンの存在下のDMF中においてアミノアルキルCPGにカップリングさせて、化合物12を生じる。
【0187】
実施例12
5’−O−DMT−L−N−イソブチリル−2’−デオキシグアノシン−3’−O−スクシニルCPG(13)。
5’−O−DMT−L−N−イソブチリル−2’−デオキシグアノシン(化合物7の合成に記載のように製造される)を、無水コハク酸およびDMAPの存在下のジクロロエタン中において60℃で、3’−O−スクシニル誘導体に変換する。このスクシニル誘導体を、2−(1H−ベンゾトリアゾール)−1−イル)−1,1,3,3−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレートおよびN−メチルモルホリンの存在下のDMF中においてアミノアルキルCPGにカップリングさせて、化合物13を生じる。
【0188】
実施例13
5’−O−DMT−L−5−(1−プロピニル)ウリジン−3’−O−スクシニルCPG(14)。
5’−O−DMT−L−5−(1−プロピニル)ウリジン(化合物8の合成に記載のように製造される)を、無水コハク酸およびDMAPの存在下のジクロロエタン中において60℃で、3’−O−スクシニル誘導体に変換する。このスクシニル誘導体を、2−(1H−ベンゾトリアゾール)−1−イル)−1,1,3,3−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレートおよびN−メチルモルホリンの存在下のDMF中においてアミノアルキルCPGにカップリングさせて、化合物14を生じる。
【0189】
実施例14
5’−O−DMT−L−5−(1−プロピニル)シチジン−3’−O−スクシニルCPG(15)。
5’−O−DMT−L−5−(1−プロピニル)シチジン(化合物8の合成に記載のように製造される)を、無水コハク酸およびDMAPの存在下のジクロロエタン中において60℃で、3’−O−スクシニル誘導体に変換する。このスクシニル誘導体を、2−(1H−ベンゾトリアゾール)−1−イル)−1,1,3,3−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレートおよびN−メチルモルホリンの存在下のDMF中においてアミノアルキルCPGにカップリングさせて、化合物15を生じる。
【0190】
実施例15
5’−O−DMT−L−3(2−デオキシ−β−D−エリトロペントフラノシル)(9I)−1H−ピリミド[5,4−b]ベンゾキサジン−2(3H)−オン−3’−O−スクシニルCPG(16)。
5’−O−DMT−L−3(2−デオキシ−β−D−エリトロペントフラノシル)(9I)−1H−ピリミド[5,4−b]ベンゾキサジン−2(3H)−オン(化合物10の合成に記載のように製造される)を、無水コハク酸およびDMAPの存在下のジクロロエタン中において60℃で、3’−O−スクシニル誘導体に変換する。このスクシニル誘導体を、2−(1H−ベンゾトリアゾール)−1−イル)−1,1,3,3−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレートおよびN−メチルモルホリンの存在下のDMF中においてアミノアルキルCPGにカップリングさせて、化合物16を生じる。
【0191】
実施例16
L−チミジン修飾を含有するオリゴヌクレオチドの合成
アミダイト3を、無水アセトニトリル中に溶解させて0.1M溶液を生じ、Expedite Nucleic Acid Synthesis システム(Millipore 8909)に装填して、オリゴヌクレオチドを合成した。カップリング効率は98%を超えた。修飾されたアミダイト(3)のカップリングのために、カップリング時間を10分に延長し、この工程を2回行った。Millipore によって供給されるプロトコールにおける他の工程は全てそのまま用いた。合成の完了後、CPGを水性アンモニア(30重量%)中に室温で2時間懸濁させて、オリゴヌクレオチドをCPGから脱保護した。CPGを濾過し、濾液を55℃で6時間加熱して、全ての保護基の脱保護を完了した。アンモニアをスピードバクコンセントレーター(speed vac concentrator)で除去後、生成物を高速液体クロマトグラフィー(HPLC,Waters,C−4,7.8X300mm,A=50mM酢酸トリエチルアンモニウム,pH=7,B=アセトニトリル,55分以内に5〜60%B,流速2.5mL/分,λ=260nm)によって精製した。水性80%酢酸での脱トリチル化および蒸発後、Waters C−4カラムでのHPLCによって脱塩して、2’−修飾オリゴヌクレオチド(表I)を生じた。オリゴヌクレオチドは、HPLC、CGEおよび質量分析法によって分析した。
【0192】
実施例17
【0193】
【表1】
Figure 2005504020
【0194】
=L−チミジン,全て P=S,C=2’−O−MOE5MeC,A=2’−O−MOE A,T=2’−O−MOE5MeU,G=2’−O−MOE G,Waters C−4,3.9x300mm,溶媒A=50mmTEAAc,pH7;溶媒B=CHCN;55分以内に5〜60%Bの勾配;流速1.5mL/分,λ=260nm。
【0195】
実施例18
【0196】
【表2】
Figure 2005504020
【0197】
=L−チミジン,全て P=S,C=2’−O−MOE5MeC,A=2’−O−MOE A,T=2’−O−MOE5MeU,G=2’−O−MOE G。
L−異性体配置による結合親和性損失を克服するために、本発明者は、L/D−キメラ中に2’−O−MOE(2’−O−(2−メトキシエチル))修飾も包含させ、そして得られたキメラ化合物のRNA標的への結合親和性を評価した。Tm分析は、キメラ中のL−チミジンと一緒の2’−O−MOE修飾の包含が、RNA結合に対するL−チミジンによる親和性損失を補うということを示した。したがって、2’−O−MOEおよび2’−デオキシホスホロチオエートの組合せのL−チミジンキャップから成るデゼイナーのオリゴヌクレオチド構築体は、優れたアンチセンスオリゴヌクレオチド薬のために好ましい性質を提供する。
【0198】
実施例19
【0199】
【表3】
Figure 2005504020
【0200】
=L−シチジン,A=L−アデノシン,全て P=S,C=2’−O−MOE5MeC,A=2’−O−MOE A,T=2’−O−MOE5MeU,G=2’−O−MOE G。
【0201】
実施例20
新規な核酸塩基を有するL−ヌクレオシドおよびそれから誘導されるオリゴヌクレオチド
【0202】
【化17】
Figure 2005504020
【0203】
実施例21
5’−O−DMT−2’,3’−ジデオキシ−N−[4−(CPG−スクシニル)メチルエステル]ベンゾイルシチジン(29)。
2’,3’−ジデオキシシチジン26[Horwitz,J.P. et al. J.Org.Chem. 1967,32,817-818 の参考文献手順によって製造される]を、TBDMSClおよびピリジンの存在下において5’−O−シリル誘導体に変換する。次に、これを、ピリジン中の4−(ヒドロキシメチル)ベンゾイルクロリドで処理して、化合物27(スキーム3)を生じる。化合物27を、1,2−ジクロロエタン中において無水コハク酸およびDMAPで処理して、スクシニル誘導体を生じる。このスクシニル誘導体を、DMF中のTBTUおよび4−メチルモルホリンの存在下においてアミノアルキルCPGとカップリングさせて、化合物28を生じる。化合物28を、THF中においてトリエチルアミントリヒドロフルオリドおよびトリエチルアミンで脱シリル化する。次に、それを、ピリジン中のDMTClおよびDMAPでトリチル化して、化合物29を生じる。
【0204】
スキーム3
【0205】
【化18】
Figure 2005504020
【0206】
実施例22
5’−O−DMT−2’,3’−ジデオキシ−N−[4−(CPG−スクシニル)メチルエステル]ベンゾイルアデノシン(33)。
2’,3’−ジデオキシアデノシン30[Horwitz,J.P. et al. J.Org.Chem. 1967,32,817-818 の参考文献手順によって製造される]を、TBDMSClおよびピリジンの存在下において5’−O−シリル誘導体に変換する。次に、これを、ピリジン中の4−(ヒドロキシメチル)ベンゾイルクロリドで処理して、化合物31(スキーム4)を生じる。化合物31を、1,2−ジクロロエタン中、無水コハク酸、DMAPで処理して、スクシニル誘導体を生じる。このスクシニル誘導体を、DMF中のTBTUおよび4−メチルモルホリンの存在下においてアミノアルキルCPGとカップリングさせて、化合物32を生じる。化合物32を、THF中においてトリエチルアミントリヒドロフルオリドおよびトリエチルアミンで脱シリル化する。次に、それを、ピリジン中の塩化DMTおよびDMAPでトリチル化して、化合物33を生じる。
【0207】
スキーム4
【0208】
【化19】
Figure 2005504020
【0209】
実施例23
2’,3’−ジデオキシオリゴヌクレオチドの合成
オリゴヌクレオチド34(SEQ ID NO:16)および35(SEQ ID NO:17)を、化合物17〜25(SEQ ID NO:8〜15)の合成について用いられた手順にしたがって、固体支持体29および33をそれぞれ用いて製造する。
【0210】
実施例24
【0211】
【表4】
Figure 2005504020
【0212】
=2,−3’−ジデオキシシチジン,A=2,−3’−ジデオキシアデノシン,全て P=S,C=2’−O−MOE5MeC,A=2’−O−MOE A,T=2’−O−MOE5MeU,G=2’−O−MOE G。
【0213】
実施例25
5’−O−DMT−2’,3’−ジデオキシ−2’,3’−ジデヒドロ−N−[4−(CPG−スクシニル)メチルエステル]ベンゾイルシチジン(39)。
2’,3’−ジデオキシ−2’,3’−ジデヒドロシチジン36[Chu,C.K. et al. J.Org.Chem. 1989,54,217-225 に報告された手順にしたがって製造される]を、TBDMSClの存在下のピリジンにおいて5’−O−シリル誘導体に変換する。次に、これを、ピリジン中の4−(ヒドロキシメチル)ベンゾイルクロリドで処理して、化合物37(スキーム5)を生じる。化合物37を、1,2−ジクロロエタン中、無水コハク酸、DMAPで処理して、スクシニル誘導体を生じる。このスクシニル誘導体を、DMF中のTBTUおよび4−メチルモルホリンの存在下においてアミノアルキルCPGとカップリングさせて、化合物38を生じる。化合物38を、THF中においてトリエチルアミントリヒドロフルオリドおよびトリエチルアミンで脱シリル化する。次に、それを、ピリジン中の塩化DMTおよびDMAPでトリチル化して、化合物39を生じる。
【0214】
スキーム5
【0215】
【化20】
Figure 2005504020
【0216】
実施例26
5’−O−DMT−2’,3’−ジデヒドロ−2’,3’−ジデオキシ−N−[4−(CPG−スクシニル)メチルエステル]ベンゾイルアデノシン(43)。
2’,3’−ジデオキシ−2’,3’−ジデヒドロアデノシン40[Chu,C.K. et al. J.Org.Chem. 1989,54,217-225 に報告された手順にしたがって製造される]を、TBDMSClおよびピリジンの存在下において5’−O−シリル誘導体に変換する。次に、これを、ピリジン中の4−(ヒドロキシメチル)ベンゾイルクロリドで処理して、化合物41(スキーム6)を生じる。化合物41を、1,2−ジクロロエタン中、無水コハク酸、DMAPで処理して、スクシニル誘導体を生じる。このスクシニル誘導体を、DMF中のTBTUおよび4−メチルモルホリンの存在下においてアミノアルキルCPGとカップリングさせて、化合物42を生じる。化合物42を、THF中においてトリエチルアミントリヒドロフルオリドおよびトリエチルアミンで脱シリル化する。次に、それを、ピリジン中のDMTClおよびDMAPでトリチル化して、化合物43を生じる。
【0217】
スキーム6
【0218】
【化21】
Figure 2005504020
【0219】
実施例27
【0220】
【表5】
Figure 2005504020
【0221】
=2,3’−ジデヒドロ−2’,3’−ジデオキシシチジン,A=2,3’−ジデヒドロ−2’,3’−ジデオキシアデノシン,全て P=S,C=2’−O−MOE5MeC,A=2’−O−MOE A,T=2’−O−MOE5MeU,G=2’−O−MOE G。
【0222】
実施例28
5’−O−DMT−2’,3’−ジデオキシ−2’−フルオロ−N−[4−(CPG−スクシニル)メチルエステル]ベンゾイルシチジン(50)。
2’,3’−ジデオキシ−2’−フルオロウリジン46[Martin J.A. et al. J.Med.Chem. 1990,33,2137-2145 に報告されたように製造される]を、報告された手順[参考文献:Divakar,K.J. et al. J.Chem.Soc.Perk.Trans. 1 1982,1171-1176]にしたがって、2’,3’−ジデオキシ−2’−フルオロシチジン47(スキーム7)に変換する。化合物47を、TBDMSClおよびピリジンの存在下において5’−O−シリル誘導体に変換する。次に、これを、ピリジン中の4−(ヒドロキシメチル)ベンゾイルクロリドで処理して、化合物48を生じる。化合物48を、1,2−ジクロロエタン中、無水コハク酸、DMAPで処理して、スクシニル誘導体を生じる。このスクシニル誘導体を、DMF中のTBTUおよび4−メチルモルホリンの存在下においてアミノアルキルCPGとカップリングさせて、化合物49を生じる。化合物49を、THF中においてトリエチルアミントリヒドロフルオリドおよびトリエチルアミンで脱シリル化する。次に、それを、ピリジン中のDMTClおよびDMAPでトリチル化して、化合物50を生じる。
【0223】
スキーム7
【0224】
【化22】
Figure 2005504020
【0225】
実施例29
【0226】
【表6】
Figure 2005504020
【0227】
=2’,3’−ジデオキシ−2’−フルオロシチジン,全て P=S,C=2’−O−MOE5MeC,A=2’−O−MOE A,T=2’−O−MOE5MeU,G=2’−O−MOE G。
【0228】
実施例30
5’−O−DMT−2’,3’−デオキシ−3’−フルオロ−N−[4−(CPG−スクシニル)メチルエステル]ベンゾイルシチジン(56)。
2’,3’−ジデオキシ−3’−フルオロウリジン52[Zaitseva,G.V. et al. Bioorg.Khim. 1988,14,1275-1281 に報告された手順にしたがって製造される]を、報告された手順[参考文献:Divakar,K.J. et al. J.Chem.Soc.Perk.Trans. 1 1982,1171-1176]にしたがって、2’,3’−ジデオキシ−3’−フルオロシチジン53(スキーム8)に変換する。化合物53を、TBDMSClおよびピリジンの存在下において5’−O−シリル誘導体に変換する。次に、これを、ピリジン中の4−(ヒドロキシメチル)ベンゾイルクロリドで処理して、化合物54を生じる。化合物54を、1,2−ジクロロエタン中、無水コハク酸、DMAPで処理して、スクシニル誘導体を生じる。このスクシニル誘導体を、DMF中のTBTUおよび4−メチルモルホリンの存在下においてアミノアルキルCPGとカップリングさせて、化合物55を生じる。化合物55を、THF中においてトリエチルアミントリヒドロフルオリドおよびトリエチルアミンで脱シリル化する。次に、それを、ピリジン中の塩化DMTおよびDMAPでトリチル化して、化合物56を生じる。
【0229】
スキーム8
【0230】
【化23】
Figure 2005504020
【0231】
実施例31
【0232】
【表7】
Figure 2005504020
【0233】
=2’,3’−ジデオキシ−3’−フルオロシチジン,全て P=S,C=2’−O−MOE5MeC,A=2’−O−MOE A,T=2’−O−MOE5MeU,G=2’−O−MOE G。
【0234】
実施例32
5’−O−DMT−3’−デオキシ−2’−O−[2−(メトキシ)エチル]−N−[4−(CPG−スクシニル)メチルエステル]ベンゾイルシチジン(62)。
5’−O−TBDMS−N−ベンゾイル−5−メチルシチジン58を、参考文献手順[Reese,C.B. et al. Tetrahedron Lett. 1999,55,5635-5640]にしたがって合成する。次に、化合物58を、報告された手順[Danel,K. et al. J.Med.Chem. 1996,39,2427-2431]にしたがって59に変換する。化合物59を、TBDMSClおよびピリジンの存在下において5’−O−シリル誘導体に変換する。次に、これを、ピリジン中の4−(ヒドロキシメチル)ベンゾイルクロリドで処理して、化合物60を生じる。化合物60を、1,2−ジクロロエタン中、無水コハク酸、DMAPで処理して、スクシニル誘導体を生じる。このスクシニル誘導体を、DMF中のTBTUおよび4−メチルモルホリンの存在下においてアミノアルキルCPGとカップリングさせて、化合物61を生じる。化合物61を、THF中においてトリエチルアミントリヒドロフルオリドおよびトリエチルアミンで脱シリル化する。次に、それを、ピリジン中のDMTClおよびDMAPでトリチル化して、化合物62を生じる。
【0235】
スキーム9
【0236】
【化24】
Figure 2005504020
【0237】
実施例33
【0238】
【表8】
Figure 2005504020
【0239】
=3’−デオキシ−2’−O−[2−(メトキシ)エチル]−5−メチルシチジン,全て P=S,C=2’−O−MOE5MeC,A=2’−O−MOE A,T=2’−O−MOE5MeU,G=2’−O−MOE G。
【0240】
実施例34
N−トリフルオロアセチルピロリジン−2−(DMT)メタノール−3−O−[(2−シアノエチル)−N,N−ジイソプロピルホスホロアミダイト](67)。
化合物64を、参考文献手順[Huwe,C.M. et al. Synthesis, 1997,1,61-67]にしたがって合成する。次に、それを、エタノール中のトリフルオロ酢酸エチルの存在下においてトリフルオロメチル誘導体65に変換する。化合物65をトリチル化して、化合物66を生じる。化合物66をホスフィチル化して、化合物67を生じる。
【0241】
実施例35
3−O−(CPG−スクシニル)−N−トリフルオロアセチルピロリジン−2−(DMT)メタノール(68)。
化合物66を、1,2−ジクロロエタン中、無水コハク酸、DMAPで処理して、スクシニル誘導体を生じる。このスクシニル誘導体を、DMF中のTBTUおよび4−メチルモルホリンの存在下においてアミノアルキルCPGとカップリングさせて、化合物68を生じる。
【0242】
スキーム10
【0243】
【化25】
Figure 2005504020
【0244】
実施例36
【0245】
【表9】
Figure 2005504020
【0246】
=3−ヒドロキシ−2−ピロリジンメタノール,全て P=S,C=2’−O−MOE5MeC,A=2’−O−MOE A,T=2’−O−MOE5MeU,G=2’−O−MOE G。
【0247】
実施例37
1−[2−(O−スクシニルCPG)−1−[2−ヒドロキシ−1−(O−DMT−メチル)エトキシ]エチル]シトシン(76)。
化合物73を、報告された手順(スキーム11)[参考文献:Bessodes,M. et al. Tetrahedron Lett. 1985,26(10),1305-1306]にしたがって製造する。これを、ピリジン中の1,3−ジクロロ−1,1,3,3−テトライソプロピルジシロキサンの存在下でシリル化化合物に変換後、環外アミノ基をDMF中の無水安息香酸でベンゾイル化して、化合物74を生じる。化合物74をスクシニル化して、スクシニル誘導体を生じる。このスクシニル誘導体を、DMF中のTBTUおよび4−メチルモルホリンの存在下においてアミノアルキルCPGとカップリングさせて、化合物75を生じる。これを脱シリル化し、そしてトリチル化して、化合物76を生じる。
【0248】
スキーム11
【0249】
【化26】
Figure 2005504020
【0250】
実施例38
1−[2−O−(アセチル)−1−[2−[(2−シアノエチル)−N,N−ジイソプロピルホスホロアミダイト]−1−(O−DMT−メチル)エトキシ]エチル]シトシン(79)。
化合物73を、ピリジン中の1,3−ジクロロ−1,1,3,3−テトライソプロピルジシロキサンでシリル化して、化合物77を生じる。次に、これを、ピリジン中の塩化アセチルでアセチル化して、化合物78を生じる。化合物78を、THF中のTEA.3HFおよびTEAで脱シリル化する。これを、DMTCl、DMAPおよびピリジンでトリチル化後、ホスフィチル化して、化合物79を生じる。
【0251】
スキーム12
【0252】
【化27】
Figure 2005504020
【0253】
実施例39
【0254】
【表10】
Figure 2005504020
【0255】
=1−[2−ヒドロキシ−1−[2−ヒドロキシ−1−(ヒドロキシメチル)エトキシ]エチルシトシン,全て P=S,C=2’−O−MOE5MeC,A=2’−O−MOE A,T=2’−O−MOE5MeU,G=2’−O−MOE G。
【0256】
実施例40
1−[2−O−(アセチル)−1−[2−[(2−シアノエチル)−N,N−ジイソプロピルホスホロアミダイト]−1−(O−DMT−メチル)チオエチル]エチル]シトシン(86)。
化合物82を、参考文献手順[Nake,T. et al. J.Am.Chem.Soc. 2000,122,7233-7243]にしたがって合成する。これを83に変換後、ビシナルジオールの切断について報告された手順を行い、その後、このようにして得られたアルデヒドを還元する[Bessodes,M. et al. Tetrahedron Lett. 1985,26(10),1305-1306]。化合物83を、ピリジン中の1,3−ジクロロ−1,1,3,3−テトライソプロピルジシロキサンでシリル化して、化合物84を生じる。次に、これを、ピリジン中の塩化アセチルでアセチル化して、化合物85を生じる。化合物85を、THF中のTEA.3HFおよびTEAで脱シリル化する。これを、DMTCl、DMAPおよびピリジンでトリチル化後、ホスフィチル化して、化合物86生じる。
【0257】
スキーム13
【0258】
【化28】
Figure 2005504020
【0259】
実施例41
1−[2−(O−スクシニル−CPG)−1−[2−ヒドロキシ−1−(O−DMT−メチル)チオエチル]エチル]シトシン(89)。
化合物83を、ピリジン中の1,3−ジクロロ−1,1,3,3−テトライソプロピルジシロキサンの存在下でシリル化化合物に変換後、環外アミノ基をDMF中の無水安息香酸でベンゾイル化して、化合物87を生じる。化合物87をスクシニル化して、スクシニル誘導体を生じる。このスクシニル誘導体を、DMF中のTBTUおよび4−メチルモルホリンの存在下においてアミノアルキルCPGとカップリングさせて、化合物88を生じる。これを脱シリル化後、トリチル化して、化合物89を生じる。
【0260】
スキーム14
【0261】
【化29】
Figure 2005504020
【0262】
実施例42
【0263】
【表11】
Figure 2005504020
【0264】
=1−[2−ヒドロキシ−1−[2−ヒドロキシ−1−(ヒドロキシメチル)チオエチル]エチルシトシン,全て P=S,C=2’−O−MOE5MeC,A=2’−O−MOE A,T=2’−O−MOE5MeU,G=2’−O−MOE G。
【0265】
実施例43
5’−O−DMT−2’,3’−ジデオキシ−3’−(N−アセチル)アミノ−N−[4−(CPG−スクシニル)メチルエステル]ベンゾイルシチジン(95)。
化合物92を、文献に報告された手順(参考文献:Krenitsky,T.A. etal. J.Med.Chem. 1983,26(6),891-895)にしたがって製造する。次に、これを、DMTClおよびピリジンで選択的にトリチル化して、5’−O−DMT誘導体を生じ、これをアセチル化して、アセチル化生成物を生じる。N位のアセチル基を水性アンモニアで室温において選択的に除去して、化合物93を生じる。次に、これを、ピリジン中の4−(ヒドロキシメチル)ベンゾイルクロリドで処理して、化合物94を生じる。化合物94を、1,2−ジクロロエタン中、無水コハク酸、DMAPで処理して、スクシニル誘導体を生じる。このスクシニル誘導体を、DMF中のTBTUおよび4−メチルモルホリンの存在下においてアミノアルキルCPGとカップリングさせて、化合物95を生じる。
【0266】
スキーム15
【0267】
【化30】
Figure 2005504020
【0268】
実施例44
【0269】
【表12】
Figure 2005504020
【0270】
=2’,3’−ジデオキシ−3’−(アミノ)シチジン,全て P=S,C=2’−O−MOE5MeC,A=2’−O−MOE A,T=2’−O−MOE5MeU,G=2’−O−2’−O−MOE G。
【0271】
実施例45
5’−O−DMT−2’−デオキシ−3’−S−フェニル−3’−チオ−N−[4−(CPG−スクシニル)メチルエステル]ベンゾイルシチジン(101)。
2’−デオキシ−3’−S−フェニル−3’−チオウリジン97[Kawakami,H. et al. Heterocycles, 1991,32(12),2451-2470に報告されたように製造]を、報告された手順[Divakar,K.J. et al. J.Chem.Soc.Perk.Trans. 1 1982,1171-1176]にしたがって、2’−デオキシ−3−S−フェニル−3−チオシチジン98(スキーム7)に変換する。化合物98を、TBDMSClおよびピリジンの存在下で5’−O−シリル誘導体に変換する。次に、これを、ピリジン中の4−(ヒドロキシメチル)ベンゾイルクロリドで処理して、化合物99を生じる。化合物99を、1,2−ジクロロエタン中、無水コハク酸、DMAPで処理して、スクシニル誘導体を生じる。このスクシニル誘導体を、DMF中のTBTUおよび4−メチルモルホリンの存在下においてアミノアルキルCPGとカップリングさせて、化合物100を生じる。化合物100を、THF中においてトリエチルアミントリヒドロフルオリドおよびトリエチルアミンで脱シリル化する。次に、それを、ピリジン中のDMTClおよびDMAPでトリチル化して、化合物101を生じる。
【0272】
スキーム16
【0273】
【化31】
Figure 2005504020
【0274】
実施例46
【0275】
【表13】
Figure 2005504020
【0276】
=2’−デオキシ−3’−S−フェニル−3’−チオシチジン,全て P=S,C=2’−O−MOE5MeC,A=2’−O−MOE A,T=2’−O−MOE5MeU,G=2’−O−2’−O−MOE G。
【0277】
実施例47
5’−O−DMT−3’−デオキシ−2’−S−フェニル−2’−チオ−N−[4−(CPG−スクシニル)メチルエステル]ベンゾイルシチジン(107)。
3’−デオキシ−2’−S−フェニル−2’−チオウリジン103[Kawakami,H. et al. Heterocycles, 1991,32(12),2451-2470に報告されたように製造]を、報告された手順[Divakar,K.J. et al. J.Chem.Soc.Perk.Trans. 1 1982,1171-1176]にしたがって、2’,3’−ジデオキシ−2’−フルオロシチジン104(スキーム17)に変換する。化合物104を、TBDMSClおよびピリジンの存在下で5’−O−シリル誘導体に変換する。次に、これを、ピリジン中の4−(ヒドロキシメチル)ベンゾイルクロリドで処理して、化合物105を生じる。化合物105を、1,2−ジクロロエタン中、無水コハク酸、DMAPで処理して、スクシニル誘導体を生じる。このスクシニル誘導体を、DMF中のTBTUおよび4−メチルモルホリンの存在下においてアミノアルキルCPGとカップリングさせて、化合物106を生じる。化合物106を、THF中においてトリエチルアミントリヒドロフルオリドおよびトリエチルアミンで脱シリル化する。次に、それを、ピリジン中のDMTClおよびDMAPでトリチル化して、化合物107を生じる。
【0278】
スキーム17
【0279】
【化32】
Figure 2005504020
【0280】
実施例48
【0281】
【表14】
Figure 2005504020
【0282】
=3’−デオキシ−2’−S−フェニル−2’−チオシチジン,全て P=S,C=2’−O−MOE5MeC,A=2’−O−MOE A,T=2’−O−MOE5MeU,G=2’−O−2’−O−MOE G。
【0283】
実施例49
5’−O−DMT−1[2,3−デオキシ−2−N−モルホリノ−β−D−グリセロ−ペント−2−エノフラノシル]−シトシン−N−[4−(CPG−スクシニル)メチルエステル]ベンゾイル(113)。
1[2,3−デオキシ−2−N−モルホリノ−β−D−グリセロ−ペント−2−エノフラノシル]ウラシル109[Kandasamy,S. et al. Tetrahedron, 1996,52(13),4877-4882 に報告されたように製造される]を、報告された手順[Divakar,K.J. et al. J.Chem.Soc.Perk.Trans. 1 1982,1171-1176]にしたがって、2’,3’−ジデオキシ−2’−フルオロシチジン110(スキーム18)に変換する。化合物110を、TBDMSClおよびピリジンの存在下で5’−O−シリル誘導体に変換する。次に、これを、ピリジン中の4−(ヒドロキシメチル)ベンゾイルクロリドで処理して、化合物111を生じる。化合物111を、1,2−ジクロロエタン中、無水コハク酸、DMAPで処理して、スクシニル誘導体を生じる。このスクシニル誘導体を、DMF中のTBTUおよび4−メチルモルホリンの存在下においてアミノアルキルCPGとカップリングさせて、化合物112を生じる。化合物112を、THF中においてトリエチルアミントリヒドロフルオリドおよびトリエチルアミンで脱シリル化する。次に、それを、ピリジン中の塩化DMTおよびDMAPでトリチル化して、化合物113を生じる。
【0284】
スキーム18
【0285】
【化33】
Figure 2005504020
【0286】
実施例50
【0287】
【表15】
Figure 2005504020
【0288】
=1[2,3−デオキシ−2−N−モルホリノ−β−D−グリセロペント−2−エノフラノシル]シトシン,全て P=S,C=2’−O−MOE5MeC,A=2’−O−MOE A,T=2’−O−MOE5MeU,G=2’−O−2’−O−MOE G。
【0289】
実施例51
9−(アミノエトキシ)フェノキサジンヌクレオシド(G−クランプ)、G−クランプスクシネート154で置換されたCPG樹脂の製造
2’−デオキシヌクレオシドG−クランプ(化合物152,0.51g,0684mmol)を、真空中において50℃で一晩乾燥後、無水DCM/Pyr(5:1)中に溶解させ、0.103g(1.03mmol)の無水コハク酸をその溶液に加えた。その後、1mLのDMF中の41.5mg(0.34mmol)DMAPを加え、混合物を一晩撹拌した。反応の完了(TLC)後、溶媒を真空中で蒸発させ、残りの黄色油状物をDCM中に溶解させ、10%水性NAHCO、10%水性クエン酸およびブラインで2回洗浄した。NaSO上で乾燥後、有機相を真空中で蒸発させて、黄色固体(0.45g,75%)を生じた。
MS(HR−FAB)m/z897.256(M+Na)
【0290】
【化34】
Figure 2005504020
【0291】
実施例52
G−クランプ−スクシニル−LCAA−CPG156
131mg(0.15mmol)のG−クランプスクシネートを、DMF中に溶解させ、68μL(0.4mmol)DIEAを加えた。次に、DMF中の57mg(0.15mmol)HATU溶液を、その混合物に撹拌しながら加えた。予め活性化させるために、撹拌を約1分間続けた後、その混合物を、1gのLCAA−CPG(初期負荷能力:115μmol/g)に加え、懸濁液を一晩振とうさせた。次に、樹脂を、各々DMF、DCMおよびCHCNで3回洗浄し、そして5mlのMeOH中の0.24mL(2mmol)トリフルオロ酢酸エチルおよび0.28ml(2mmol)TEAと一緒に樹脂を振とうさせることにより、樹脂の未反応アミノ基をキャッピングした。最後に、樹脂を、MeOH、CHCNおよびDCMで洗浄し、真空中で乾燥させた。G−クランプスクシネートでの負荷能力は、DMT検定によって決定した(最終負荷能力:65μmol/g)。
【0292】
実施例53
2’−デオキシフェノキサジンCPG
2’−デオキシフェノキサジンCPGを、上の実施例52に示された手順にしたがって合成した。
【0293】
実施例54
オリゴヌクレオチド合成
G−クランプおよびフェノキサジン単位を含有するオリゴヌクレオチドの固相合成は、標準的なホスホロアミダイト化学および Applied Biosystems(Perkin Elmer Corp.)DNA/RNAシンセサイザー380Bを用いて行った。オリゴヌクレオチドの切断および脱保護は、40%水性MeNHおよび28〜30%水性NH(1:1)の溶液を室温で4時間用いて行った。オリゴヌクレオチドは、逆相HPLCにより、306 Piston Pump System、811C Dynamic Mixer、170 Diode Array Detector および215 Liquid Handler を、Gilson(Middleton, Wi)製の Unipoint Software と一緒に用いて精製した。HPLC条件は、次の通りであった。カラム:Waters Deltapak C18逆相(300x3.9mm,15μ,300Å);溶媒A:HO中0.1M NHOAc;溶媒B:CHCN/HO(80:20)中0.1M NHOAc;勾配:0〜40分0〜50%B。クロマトグラフィー精製後、オリゴヌクレオチドは、RP−HPLCによって脱塩し、凍結乾燥させ、そして−20℃で貯蔵した。
【0294】
実施例55
固体支持体へのグアニジニル化
スキーム21に概略されるように、本発明者は、二つの異なった戦略を用いて、グアニジニウム部分を導入した。一つの戦略は、第一級アミノ基を選択的に保護後、固体支持体(A)にグアニジニル化を行うことである。2’−O−(アミノヘキシル)官能基の場合、支持体に結合したオリゴヌクレオチドを、THF中1.2MのnBuNH/HCOOH溶液中に10mgのPd[(Ph−CH=CH)CO]および26mgのP(Ph)の1.0mLで50℃において1.5時間処理することによって、アリルオキシカルボニル(Alloc)保護基を選択的に除去した。Allocの除去後、それら支持体に結合したオリゴヌクレオチドを、DCM、アセトン、N,N−ジエチルジチオカルバミン酸ナトリウム(ddtcNa)、HO、アセトン、DCM、ジエチルエーテルで洗浄し、真空中で乾燥させた。グアニジニル化の前に、樹脂を、DMF中10%DIEA溶液中に懸濁させ、5分間振とうし、そしてDMFで、次にDCMで洗浄した。次に、DMF中のDIEAおよび1H−ピラゾール−1−カルボキサミジン塩酸塩の1.0M溶液を、支持体に結合したオリゴヌクレオチドに加え、その懸濁液を室温で5時間振とうした。オリゴヌクレオチドの最終的な脱保護および切断には、樹脂を濃アンモニア水で55℃において1時間処理した。CPG支持体からの分離およびアンモニアの蒸発後、その水溶液を、0.45μmナイロン66フィルターを介して濾過し、更に分析するために−20℃で凍結貯蔵した。
【0295】
スキーム20
【0296】
【化35】
Figure 2005504020
【0297】
スキーム20。
修飾ヌクレオチド2’−O−(グアニジニルヘキシル)−5−メチルウリジン(A);9−グアニジニルエトキシフェノキサジンヌクレオチド(B)
【0298】
【化36】
Figure 2005504020
【0299】
スキーム21。
(A)反応条件:(i)THF中1.2MのnBuNH/HCOOH中に10mgのPd[(Ph−CH=CH)CO]、26mgのP(Ph)の1.0mL、50℃、1.5時間;(ii)DCM、アセトン、N,N−ジエチルジチオカルバミン酸ナトリウム(ddtcNa)、HO、アセトン、DCM、ジエチルエーテルで洗浄する;(iii)DMF中1.0Mの1H−ピラゾール−1−カルボキサミジン塩酸塩およびDIEA、室温、5時間。
(B)(i)40%水性CH−NH/濃水性NH(1:1)、55℃、1時間;(ii)1.0M水性NaCO中1.0Mの1H−ピラゾール−1−カルボキサミジン塩酸塩、それぞれ、ON−3、ON−4については室温で3時間、およびON−5、ON−6については55℃で12時間。
【0300】
実施例56
溶液中の完全に脱保護されたオリゴヌクレオチドのグアニジニル化
塩基に反応活性なトリフルオロアセチル基(Tfa)は、オリゴヌクレオチドの合成および脱保護の条件に相容性であり、これを、G−クランプの第一級アミノ基の保護のために選択した。オリゴヌクレオチドを脱保護し、固体支持体から切断後、40%水性CH−NHおよび濃水性アンモニア(AMA)の1:1混合物を用いることによってグアニジニル化したが、これは、きわめて求核性の第一級アミノ基とのアシル−またはアクリロニトリル付加物の形成を防止する。脱保護工程中のシトシンにおけるアミノ基転移を免れるために、N−ベンゾイルで保護されたCの代わりにN−アセチルで保護されたCを、オリゴヌクレオチド合成に用いた。これらオリゴマーをRP−HPLCで精製し且つES−MSで分析後、オリゴヌクレオチドを、2mLの1.0M水性NaCO溶液中の2mmol(297mg)の1H−ピラゾール−1−カルボキサミジン塩酸塩の1〜2μmolで室温において3時間処理することによって、G−クランプの第一級アミノ基をグアニジニル化した。次に、それらオリゴヌクレオチドを、ゲルクロマトグラフィー(Sephadex G25)で、次にRP−HPLCで精製し、そしてキャピラリーゲル電気泳動(CGE)およびエレクトロスプレー質量分析法(ES−MS)で分析した。この研究中に合成されたグアニジニル修飾オリゴヌクレオチドを、表XVIに要約する。
【0301】
興味深いことに、ON−5(SEQ ID NO:38)またはON−6(SEQ ID NO:39)のような自己相補的配列の場合、上記の条件は、グアニジニルG−クランプオリゴマーの低分子画分だけを生じた。明らかに、相補的グアニンとの塩基対相互作用に関与している第一級アミノ基を有するこれらパリンドロームオリゴヌクレオチドの二本鎖構造は、グアニジニル化を妨げた。水素結合相互作用を破壊し且つ二重らせん形成を防止するために、反応は、55℃の高温および約12時間の長い反応時間で行った。これら条件を用いて、ON−5(SEQ ID NO:38)およびON−6(SEQ ID NO:39)のアミノ基の完全なグアニジニル化を、検出可能な副反応を全く引き起こすことなく達成した。
【0302】
第一級アミノ基のグアニジニル化は、該当するオリゴマーの疎水性を僅かに増加させたが、これは、RP−HPLC分析によって、保持時間の僅かな変化として検出されると考えられる。未修飾のG−クランプON−2(SEQ ID NO:35)と比較したON−3のTデータは、相補的RNAおよびDNAに対して、それぞれ5.9°Kおよび5.7°Kのハイブリダイゼーション親和性の減少を示す(表XVII)。これら知見は、グアニジニルG−クランプと相補的グアニンとの間の追加の水素結合の形成に反駁すると考えられるが、自己相補的ON−5(SEQ ID NO:38)の二重らせんの結晶学的X線解析で認められる別の構造的詳細によって説明されると考えられる[Wilds,C.J.; Maier,M.A.;Tereshko,V.; Manoharan,M.; Egli,M. 準備中]。修飾された塩基対CおよびGは、二重らせん中の他の塩基対に相対して若干の座屈を示したが、これは、ワトソン・クリック型およびフーグスティーン型双方の水素結合の幾何学的境界内のグアニジニウム−エトキシ部分に適応するための変化した立体必要条件の結果であると考えられる。平面外のゆがみは、親G−クランプ含有ON−2(SEQ ID NO:35)と比較してグアニジニル修飾ON−3(SEQ ID NO:36)について認められる親和性の損失に原因になっていると考えることができる。
【0303】
要するに、オリゴヌクレオチドの合成後修飾のために、1H−ピラゾール−1−カルボキサミジン塩酸塩を用いることによって第一級アミノ官能基をグアニジニウム基に変換することを伴う二つの方法が開発された。固体支持体上の反応には、アミノ基をAllocで保護したが、これは、支持体からオリゴヌクレオチドを切断することなく選択的に除去することができ、このグアニジニル化は、DMF中10%DIEA中で行った。もう一方では、水溶液中での合成後グアニジニル化のために、第一級アミノ基をTfaで保護したが、これは、オリゴヌクレオチドの脱保護および切断の条件下で容易に除去することができる。これら方法を用いて、主溝かまたは副溝に面してグアニジニウム部分を有するいくつかの修飾オリゴヌクレオチドを製造し且つ分析した。
【0304】
実施例57
【0305】
【表16】
Figure 2005504020
【0306】
実施例58
【0307】
【表17】
Figure 2005504020
【0308】
実施例59
グアニジニルG−クランプ修飾
グアニジニルG−クランプ修飾を、グアノシンのO6およびN7フーグスティーン型結合部位への追加の水素結合を考慮して設計した(図1B)。単一の単位を含有するDNAオリゴマーのRNA標的への結合研究は、野生型DNAに相対して、元のG−クランプ修飾について認められるΔTより僅かに低い16℃の融解温度の増加を示した。この修飾の構造的性質を調べるために、本発明者は、配列GCGTATMOEACGC(SEQ ID NO:41)(但し、CはグアニジノG−クランプであり、2’−O−メトキシエチルチミンがTMOEである)(図1C)を有する修飾十量体二重らせんのX線結晶構造を決定した。Altmann,K.-H.; Dean,N.M.; Fabbro,D.; Freier,S.M.; Geiger,T.; Haner,R.; Husken,D.; Martin,P.; Monia,B.P.; Muller,M.; Natt,F.; Nicklin,P.; Phillips,J.; Pieles,U.; Sasmor,H.; Moser H.E. Chimia 1996,50,168-176; Teplova,M.; Minasov,G.; Tereshko,V.; Inamati,G.B.; Cook,P.D.; Manoharan,M.; Egli,M. Nature Struct.Biol. 1999,6,535-539。オリゴヌクレオチドの合成および精製は、標準法にしたがって行った。この十量体二重らせんの結晶は、商業的に入手可能なスクリーンを用いた懸滴蒸気拡散法によって成長させた(Hampton Researchm, Laguna Niguel, CA)[懸滴蒸気拡散:2μL液体粒子(1.2mM DNA,5%MPD,20mMカコジル酸Na pH6.0,6mMスペルミン・4HCl,40mM NaCl,6mM KCl,10mM MgClを、1mLの35%v/vMPDのレザバーに対して平衡させた。空間群P2;細胞寸法a=24.52Å,b=43.02Å,c=46.68Å)。データ収集は、シンクロトロン源で行った[結晶(0.7x0.2x0.2mm)を、液体粒子からナイロンループで拾い、冷N流(120K)中に移した。高分解能および低分解能データセットを、Advanced Photon Source, Argonne, IL におけるDND−CATの5−IDビーム線(λ=0.978Å)で、MARCCD検出器を用いて集めた。データを組込み、DENZO/SCALEPACK10と併合した。20〜1Åの全ての反射の全Rmergeは4.7%であったが(Otwinowski,Z.; Minor,W. Methods Enzymol. 1997,276,307-326)、データ収集および精密統計を表XVIIIに挙げる。構造は、DNA十量体を初期モデルとして用いた分子置換によって解明し、プログラムCNS12およびSHELX−9713で精密にした。10%の反射を用い且つ22%に達しさせてRfreeを監視した後、全ての反射を、最終回の等方性精密に包含させた;Brunger,A.T. Crystallography & NMR System (CNS), Version 0.9, Yale University, New Haven, CT, 1998[Sheldrick,G.M.; Schneider,T.R. Methods Enzymol. 1997,277,319-343; Egli,M.; Tereshko,V.; Teplova,M.; Minasov,G.; Joachimiak,A.; Sanishvili,R.; Weeks,C.M.; Miller,R.; Maier,M.A.; An,H.Y.; Cook,P.D.; Manoharan,M. Biopolymers: Nucleic Acids Sciences 1998,48,234-252; Clarke,N.D.: Beamer,L.J.; Goldberg,H.R.; Berkower,C.; Pabo,C.O. Science 1991,254,267-270; Rich,A. In The Chemical Bond: Structure and Dynamics; Zewail,A. Ed.; Academic Press, New York, 1992; pp31-86; Pabo,C.O.; Sauer,R.T. Annu.Rev.Biochem. 1992,61,1053-1059; Lin,K.-Y.; Jones,R.J.; Matteucci,M.D. J.Am.Chem.Soc. 1995,117,3873-3874]。
【0309】
この二重らせんの全体構造は、この二重らせんの6位および16位の2’−O−メトキシエチルチミン単位の結果としてA形である。A形環境は、アンチセンス目的の核酸修飾の構造を研究するのに望ましい。塩基対C12−G9の場合に示されるように(図2)、これら複素環の周りの電子密度は、明らかに、束縛されたグアニジニウムのアミノ窒素およびイミノ窒素と、それぞれ、グアノシンのO6およびN7との間に形成される二つのフーグスティーン型水素結合を示している。この水素結合長さは2.88Åおよび2.86Åであり、塩基対C2−G19中の該当する水素結合の長さは、それぞれ、2.92Åおよび2.87Åである。フェノキサジン環および束縛された基の個々の原子の周りの電子密度の特質は、この修飾が充分に規則的であり且つランダムなコンホメーションをとらないということを示している。二重らせんには、修飾された塩基対の若干の座屈が他の塩基対に相対して存在する。G−クランプとGとの間の塩基対のこの平面外ゆがみは、グアニジニウム−エトキシ部分によって与えられる幾何学的境界内のワトソン・クリック型およびフーグスティーン型双方の水素結合の幾何学的形を最適にする必要条件の結果でありうる。更に、認められる配置は、GのO6と、G−クランプのエトキシリンカー酸素との間の立体接触を免れるのに役立つ(図1および図2)。
【0310】
G−クランプの存在は、シトシンとその5’−隣接塩基(それぞれ、G1およびG11)との間のスタッキングと比較して、GpC段階での鎖内スタッキングをかなり改善させる。G1とC2との間のオーバーラップを図3に示す。「シトシンコア」は、グアノシン塩基への比較的小さいスタッキングを示すが、フェノキサジン環系の残部は、事実上、グアノシン塩基全体を覆っている。しかしながら、G−クランプと塩基との間の5’側へのスタッキングは改善されるが、3’−隣接塩基へのスタッキングは、修飾塩基の包含によって影響されない。
【0311】
強い負のポテンシャル部位である主溝の中心にある陽電荷グアニジニウム部分の配置は、安定性に有意の静電的寄与をもたらすと考えられる。更に、対向鎖からのグアニジニウム基およびリン酸基は、比較的接近した間隔にある。Cのイミノ窒素とリン酸基のO2P酸素との間の平均距離は、5.8Åである。直接的塩架橋には長すぎるが、水分子はグアニジニウム基とリン酸基を連結する。C12の場合、単一水分子は、グアニジニウムイミノ窒素間に結合した水と、残基C8およびG9のO2P酸素との間の接触を媒介する。
【0312】
陽電荷アミンとグアノシンのフーグスティーン型結合部位との相互作用は周知である。例えば、二重らせんDNAに結合したλリプレッサーのX線結晶解析研究は、リシンとGのO6位との間の特異的接触を示した[Clarke,N.D.; Beamer,L.J.; Goldberg,H.R.; Berkower,C.; Pabo,C.O. Science 1991,254,267-270; Rich,A. In The Chemical Bond: Structure and Dynamics; Zewail,A. Ed.; Academic Press, New York, 1992,31-86; Pabo,C.O.; Sauer,R.T. Annu.Rev.Biochem. 1992,61,1053-1059]。グアニジルG−クランプの本構造は、タンパク質−核酸相互作用におけるグアニンのN7位およびO6位でのアルギニン分岐の二座配位(bidentate)水素結合に似ている[Clarke,N.D.; Beamer,L.J.; Goldberg,H.R.; Berkower,C.; Pabo,C.O. Science 1991,254,267-270; Rich,A. In The Chemical Bond: Structure and Dynamics; Zewail,A. Ed.; Academic Press, New York, 1992,31-86; Pabo,C.O.; Sauer,R.T. Annu.Rev.Biochem. 1992,61,1053-1059]。認められる構造は、おそらくは、伸長したグアニジニルエトキシスペーサーアームの結果としての立体構造のために、C−G塩基対の若干の座屈を示す。G−クランプとグアニジノG−クランプとのTデータの比較は、グアニジニル化が、全体の安定性に僅かしか作用しないと考えられるということを示した。
【0313】
この修飾の二つの決定的な安定化因子は、水素結合数の増加および改善されたスタッキング相互作用である。安定性に更に寄与するのは、好都合な静電的相互作用および充分に規則的な水ネットワークである。これら寄与の一つが、他のものより重要な役割を果たしているかどうか見分けることは難しい。フェノキサジン部分を単独で有するオリゴマーの結合研究は、2〜7℃の中程度のTの増加を示した[Lin,K.-Y.; Jones,R.J.; Matteucci,M.D. J.Am.Chem.Soc. 1995,117,3873-3874]。安定性は、いくつかのフェノキサジン基が、同じ鎖上に一緒にクラスター形成された場合に最も多く増加し、三環式−三環式スタッキング相互作用を可能にした。非環式G−クランプ修飾の場合、結合の増大は認められなかった。フェノキサジンおよび束縛されたアミノ基の双方が存在した場合のみ、結合の劇的改善が認められた[Lin,K.-Y.; Matteucci,M.D. J.Am.Chem.Soc. 1998,120,8531-8532; Flanagan,W.M.; Wolf,J.J.; Olson,P.; Grant,D.; Lin,K.; Wagner,R.W.; Matteucci,M.D. Proc.Natl.Acad.Sci. USA 1999,96,3513-3518]。明らかに、グアニジニウム基からの水素結合は、スタッキング相互作用および安定な水ネットワークの形成を可能にする位置にグアニジノG−クランプ修飾を維持している。これは、核酸二重らせん内の単一塩基対が、合計5個の水素結合にワトソン・クリック型およびフーグスティーン型結合を組み合わせていることの最初の報告である。
【0314】
実施例60
反射データおよび精密統計。
【0315】
【表18】
Figure 2005504020
【0316】
実施例61
c−rafメッセージに標的指向するG−クランプ修飾オリゴヌクレオチドの合成
【0317】
【表19】
Figure 2005504020
【0318】
=G−クランプ修飾。
実施例62
修飾MDM−2オリゴヌクレオチドの in vivo 安定性
【0319】
【表20】
Figure 2005504020
【0320】
=G−クランプ修飾。
合成される選択された修飾オリゴヌクレオチドの in vivo 安定性を、BALB/cマウスにおいて決定する。5mg/kgのオリゴヌクレオチドの単回静脈内投与後、血液試料をいろいろな時間間隔で採取し、CGEで分析する。
【0321】
調べられる各々のオリゴヌクレオチドについて、約25g体重の9匹の雄BALB/cマウス(Charles River, Wilmington,MA)を用いる。1週間順化後、それらマウスに、リン酸緩衝化生理食塩水(PBS)、pH7.0中で投与されるオリゴヌクレオチド(5mg/kg)の単回尾静脈注射を行う。1回の眼窩後採血(投与後0.25時間、0.5時間、2時間かまたは4時間)および終末採血(投与後1時間、3時間、8時間かまたは24時間)を、各々の群から集める。終末採血(約0.6〜0.8mL)は、ケタミン/キシラジン麻酔後に心臓穿刺によって集める。この血液をEDTA被覆採集管に移し、遠心分離して血漿を得る。最後に、肝および腎臓を各々のマウスから採取する。血漿および組織ホモジネートを分析に用いて、無傷のオリゴヌクレオチド含量をCGEによって決定する。試料は全て、採取後直ちにドライアイス上で凍結させ、分析するまで−80℃で貯蔵する。
【0322】
CGE分析は、親MDM−2と比較して、G−クランプ修飾含有オリゴマーの相対ヌクレアーゼ耐性を示した(一様に、2’−デオキシホスホロチオエートオリゴヌクレオチドはマウスMDM−2に集中した)。G−クランプ修飾のヌクレアーゼ耐性のために、修飾オリゴヌクレオチドは、血漿中において一層安定であることが判明しているが、ISIS11061(SEQ ID NO:42)は安定ではなかった。同様の知見が、腎臓および肝組織で認められる。これは、G−クランプ修飾が、血漿、腎臓および肝において、エキソヌクレアーゼおよびエンドヌクレアーゼに対する優れたヌクレアーゼ耐性を与えるということを意味している。したがって、より長い作用期間を有するオリゴヌクレオチドは、G−クランプ修飾および他の類似のモチーフ双方をそれらの構造中に包含することによって設計することができる。5mg/kgのオリゴヌクレオチドの静脈内ボーラス投与後1時間に、血漿中に無傷のまま残っている完全長オリゴヌクレオチドの百分率のプロットを決定して、血漿中における安定性を評価する。
【0323】
5mg/kgのオリゴヌクレオチドの静脈内ボーラス投与後24時間に、組織中に無傷のまま残っている完全長オリゴヌクレオチドの百分率のプロットを決定する。マウス肝試料およびマウス腎試料双方における24時間後の試験オリゴヌクレオチドおよび標準ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドのCGEトレースを評価する。未修飾の親の標準と比較したところ、本発明のオリゴヌクレオチドについて一層多量の無傷のオリゴヌクレオチドが存在する。最大安定性は、5’および3’両末端がCでキャッピングされた時に認められた。
【0324】
実施例63
G−クランプ修飾オリゴヌクレオチドを用いたbEND細胞におけるc−rafメッセージの制御
【0325】
【表21】
Figure 2005504020
【0326】
=G−クランプ修飾。
若干のオリゴヌクレオチドの活性を評価するために、in vitro 細胞培養検定を用いて、bEND細胞におけるc−raf発現の細胞性レベルを測定する。
【0327】
細胞および試薬
脳内皮腫であるbEND.3細胞系を、Dr. Werner Risau(Max-Planck Institute)より入手する。Opti−MEM、トリプシン−EDTAおよび高グルコース含有DMEMは、Gibco−BRL(Grand Island, NY)より購入する。Dulbecco=s PBSは、Irvine Scientific(Irvine, CA)より購入する。無菌の12ウェル組織培養プレートおよび Facsflow 溶液は、Becton Dickinson(Mansfield, MA)より購入する。超純粋ホルムアルデヒドは、Polysciences(Warrington, PA)より購入する。NAP−5カラムは、Pharmacia(Uppsala, Sweden)より購入する。
【0328】
オリゴヌクレオチド処理
細胞を、4.5g/Lのグルコースおよび10%FBSを含有するDMEMを含む12ウェルプレート中において約75%密集まで成長させる。細胞を、37℃に予め暖められた Opti−MEMで3回洗浄する。オリゴヌクレオチドを、陽イオン脂質(Lipofectin 試薬(GIBCO/BRL))と予め混合し、所望の濃度まで連続希釈し、そして洗浄された細胞上に入れ、37℃で4時間インキュベーションする。次に、培地を除去し、普通の成長培地と交換して24時間おいて、mRNAのノーザンブロット分析を行う。
【0329】
ノーザンブロット分析
ノーザンブロット分析によるmRNAレベルの決定のために、オリゴヌクレオチド処理の開始後24時間に、全RNAを、グアニジニウムイソチオシアネート法[Monia et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 1996,93,15481-15484]によって細胞から調製する。全RNAを、細胞溶解産物のCsClクッションでの遠心分離によって単離する。ノーザンブロット分析、RNA定量およびG3PDHmRNAレベルへの規格化は、報告された手順[Dean and McKay, Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 1994,91,11762-11766]にしたがって行う。
【0330】
bEND細胞において、G−クランプオリゴヌクレオチドは、濃度の関数としてのc−rafメッセージ活性の減少を示した。これら修飾オリゴヌクレオチドが活性を保持したということは、増加した in vivo ヌクレアーゼ活性も示すこれらオリゴヌクレオチドについて、少ない回数で投薬する可能性がある。G−クランプ修飾オリゴヌクレオチドは全て、親11061オリゴヌクレオチド(SEQ ID NO:42)の活性を保持し、そしてなお一層活性を向上させた。
【0331】
実施例64
化合物201(R’=CN,n=1,スキーム22a,表XX)。
スキーム22a
【0332】
【化37】
Figure 2005504020
【0333】
【表22】
Figure 2005504020
【0334】
実施例65
化合物248(R’=NHCbz,n=0,スキーム22)。
化合物248を、化合物246(1mmol)およびN−(2−ヒドロキシエチル)カルバミン酸ベンジル(1mmol)から、参考文献手順[Lin and Matteucci, J.Am.Chem.Soc., 1998,120,8531-8532]にしたがって製造する。
【0335】
実施例66
化合物249(n=0,スキーム22b)。
化合物248(1mmol)は、ピリジン中のDMT−Cl(1モル当量)での処理で、対応する5’−O−DMT誘導体を生じる。このDMT誘導体を、TEAの存在下においてトリフルオロ酢酸エチルと一緒に撹拌して、化合物248のN−トリフルオロアセチル−5’−O−DMT誘導体を得る。得られた生成物のフリーの3’−ヒドロキシ官能基を、無水ピリジン中の無水酢酸と反応させて、完全に保護されたヌクレオシド249を得る。
【0336】
スキーム22b
【0337】
【化38】
Figure 2005504020
【0338】
実施例67
化合物250(n=0,スキーム22b)。
酢酸エチル中の化合物249(1mmol)およびギ酸アンモニウム(5mmol)の懸濁液を、アルゴン下において脱酸素化し、そして活性炭上10%パラジウム(10mol%)を、アルゴン下の懸濁液中に加える。反応混合物を周囲温度で10分間撹拌して、化合物250を得る。
【0339】
実施例68
化合物206(n=0,R=Me,スキーム22c,表XX)。
無水THF中の化合物250(1mmol)を、1,1’−カルボニルジイミダゾール(CDI,1mmol)と一緒に、アルゴン下において周囲温度で2時間撹拌する。2時間後、反応混合物を氷浴上で冷却し、無水メチルアミンガスを反応混合物中に10分間通気する。得られた混合物を30分間撹拌して、化合物206を得る。
【0340】
スキーム22c
【0341】
【化39】
Figure 2005504020
【0342】
実施例69
化合物206a(n=0,R=Me,スキーム22c)。
化合物3の合成について実施例2に記載のような、化合物206の3’−ヒドロキシ基のホスフィチル化は、化合物206aを生じる。
【0343】
実施例70
化合物207(n=0,R=Me,スキーム22c,表XX)。
化合物207を、化合物250、1,1’−チオカルボニルジイミダゾールおよびメチルアミンから、化合物206の合成について実施例68に記載されたのと同様の反応条件下で得る。
【0344】
実施例71
化合物207a(n=0,R=Me,スキーム22c)。
化合物3の合成について実施例2に記載のような、化合物207の3’−ヒドロキシ基のホスフィチル化は、化合物207aを生じる。
【0345】
実施例72
化合物202(n=0,m=0,スキーム22c,表XX)。
化合物250(1mmol)を、DIEAの存在下の無水DCM中においてN−ベンジルオキシカルボニル−2−アミノエタノール−O−メタンスルホネート(1mmol)と一緒に一晩撹拌する。このようにして得られた第二級アミンに、実施例59に記載のように転移水素化を行って、ベンジルオキシカルボニル保護を除去する。次に、未保護アミンを、DIEAの存在下のDCM中においてトリフルオロ酢酸エチルと一緒に撹拌して、所望の化合物202を得る。
【0346】
実施例73
化合物202a(n=0,m=0,スキーム22c)。
化合物3の合成について実施例2に記載のような、化合物202のホスフィチル化は、化合物202aを生じる。
【0347】
実施例74
化合物208a(n=0,スキーム22d,表XX)。
化合物250(1mmol)およびTEA(1mmol)を、化合物A(1mmol,スキーム1d)の溶液中に加え、得られた混合物を周囲温度で撹拌して、化合物208aを得る。
【0348】
スキーム22d
【0349】
【化40】
Figure 2005504020
【0350】
実施例75
化合物208b(n=0,スキーム22d)。
実施例2に記載のような、化合物208aのホスフィチル化は、化合物208bを生じる。
【0351】
実施例76
化合物201a(n=1,スキーム22e)。
化合物201と、ピリジン中のDMTClとの反応は、化合物201aを生じる。
【0352】
スキーム22e
【0353】
【化41】
Figure 2005504020
【0354】
実施例77
化合物209(n=1,スキーム22e,表XX)。
化合物201aを、THF中のアンモニアおよび塩化アンモニウムで、圧力下の高温において処理して、化合物209を得る[Granik, Russ.Chem.Rev., 1983,52,377-393]。
【0355】
実施例78
化合物209a(n=1,スキーム22e)。
2−シアノエトキシカルボニルオキシスクシンイミド(2mmol)およびDIEAを、DCM中の化合物209(1mmol)の溶液中に加え、得られた混合物を周囲温度で撹拌して、化合物209aを得る。
【0356】
実施例79
化合物209b(n=0,スキーム22e)。
化合物3の合成について実施例2に記載のような、化合物209aのホスフィチル化は、化合物209bを生じる。
【0357】
実施例80
化合物252(スキーム23a)。
所望の束縛部分(tether)Xを有するフェノキサジンヌクレオシド252を、[Lin and Matteucci, J.Am.Chem.Soc., 1998,120,8531-8532]による参考文献手順にしたがって、5−ブロモ−3’−O−TBDMS−5’−O−DMT−dU(251)から5段階で合成する。
【0358】
実施例81
化合物253(スキーム23a)。
スキーム23a
【0359】
【化42】
Figure 2005504020
【0360】
化合物252(1mmol)とエタノール(1mmol)との、DIEAの存在下のアセトニトリル中の Mitsunobu アルキル化条件(各1mmolのPhPおよびDEAD)下における反応は、化合物253を生じる。
【0361】
実施例82
化合物254(スキーム23a)。
化合物253を、真空下においてP上で充分に乾燥後、アルゴン下の反応容器中に入れる。凍結浴上に置かれた無水ピリジン中のTMG(10mmol)を、無水HSで45分間飽和させる。45分後、得られた溶液を、アルゴン下において化合物253が入っている予冷された容器中に入れ、密封する。次に、この密封された容器を、周囲温度に達しさせ、周囲温度で3日間貯蔵する。クロロクス浴(chlorox bath)中にHSを通気して除去し、真空下において反応混合物からピリジンを除去する。残留物は、標準的な処理および精製後、化合物254を生じる。
【0362】
実施例83
化合物210a(n=1,スキーム23a,表XXI)。
化合物254(X=O−(CH−CN)を、THF中のTBAFで処理して、3’−O−TBDMS基を除去する。得られた3’−OH基に、実施例2に記載の条件下においてホスフィチル化を行って、化合物210aを得る。
【0363】
【表23】
Figure 2005504020
【0364】
実施例84
化合物210b(n=0,スキーム23b,表XXI)。
化合物254(1mmol,n=0,スキーム23b)を、THF中のTBAFで処理して、3’−O−保護を除去する。得られた生成物に、酢酸エチル中のPd−C(10%)およびギ酸アンモニウムを用いて転移水素化を行って(詳細については、実施例67を参照されたい)、側鎖部分からベンジルオキシカルボニル保護を除去する。次に、このようにして形成される遊離アミンおよび環窒素を、ピリジン中のトリフルオロ酢酸エチル(10mmol)と一緒に化合物(1mmol)を周囲温度で撹拌することによってトリフルオロアセトアミドとして保護する。最後に、得られたトリフルオロアセトアミド誘導体を、化合物3の合成について実施例2に記載のようにホスフィチル化して、所望のホスホロアミダイト210bを得る。
【0365】
スキーム23b
【0366】
【化43】
Figure 2005504020
【0367】
実施例85
化合物255(n=0,スキーム23b)。
化合物254(n=0,1mmol)を、ピリジン中のトリフルオロ酢酸エチル(5mmol)と一緒に撹拌する。形成されるトリフルオロアセトアミドを精製後、実施例67に記載のように酢酸エチル中のPd−C(10%)の存在下においてギ酸アンモニウム(10mmol)と一緒に撹拌して、化合物255を得る。
【0368】
実施例86
化合物215a(n=0,R=Me,スキーム23b,表XXI)。
化合物255(1mmol)を、実施例68に記載のようにCDIおよびメチルアミンと反応させる。このようにして得られた尿素誘導体を、THF中のTBAFと一緒に撹拌して、3’=O−保護を除去する。3’−O−TBDMSの脱保護後、得られた生成物を、無水ピリジン中の過剰のトリフルオロ酢酸エチルと一緒に撹拌することによって、その環窒素においてトリフルオロアセチル化する。化合物3の合成について実施例2に記載の条件下におけるこのトリフルオロアセトアミド誘導体のホスフィチル化は、化合物215aを生じる。
【0369】
実施例87
化合物216a(n=0,R=Me,スキーム23b,表XXI)。
化合物216aを、化合物255、1,1’−チオカルボニルジイミダゾールおよびメチルアミンから、化合物215aの合成について実施例86に記載のように合成する。
【0370】
実施例88
化合物256(m=0,n=0,スキーム23b)。
化合物256を、化合物255(1mmol)およびN−ベンジルオキシカルボニル−2−アミノエタノール−O−メタンスルホネート(1mmol)から、実施例72に記載のように製造する。
【0371】
実施例89
化合物211a(m=0,n=0,スキーム23b,表XXI)。
化合物256を、THF中のTBAFと一緒に撹拌して、3’−OH基上のTBDMS保護を除去する。脱保護後、その3’−OH基を、化合物3の合成について実施例2に記載のようにホスフィチル化して、化合物211aを得る。
【0372】
実施例90
化合物257(n=0,スキーム23c)。
化合物257を、化合物255から、実施例74に記載の条件下で得る。
【0373】
実施例91
化合物217a(n=0,スキーム23c,表XXI)。
化合物217aを、化合物257から、化合物211aの製造について実施例89に記載のように製造する。
【0374】
スキーム23c
【0375】
【化44】
Figure 2005504020
【0376】
実施例92
化合物258(n=1,スキーム23d)。
化合物258を、化合物252から、実施例77および78に記載のように合成する。
【0377】
スキーム23d
【0378】
【化45】
Figure 2005504020
【0379】
実施例93
化合物218a(n=1,スキーム23d,表XXI)。
このホスホロアミダイト218aを、化合物258から、化合物210aの化合物253からの製造について実施例81および83に記載されたのと同一条件下で合成する。
【0380】
実施例94
化合物262(スキーム24)。
2−アミノ−3−メトキシ−ベンゼンチオール[Inoue et al., Chem.Pharm.Bull., 1997,45,1008-1028]を、NaHCOの存在下においてBocOと反応させ、次に、ピリジン中のAcOと反応させて、化合物262を得る。
【0381】
スキーム24
【0382】
【化46】
Figure 2005504020
【0383】
実施例95
化合物263(スキーム24)。
真空下においてP上で充分に乾燥後、無水ジクロロメタン中の化合物262を、TMS−Iで5分間処理して、化合物263を得る。
【0384】
実施例96
化合物264(スキーム24)。
選択された束縛部分を、化合物263のヒドロキシル官能基に、PhPおよびDEADの存在下(Mitsunobu アルキル化)で取り付けて、化合物264を得る。
【0385】
実施例97
化合物265(スキーム24)。
化合物264を、DCM中のTFAと一緒に30分間撹拌して、化合物265を得る。
【0386】
実施例98
化合物267(スキーム25a)。
化合物267を、化合物266および化合物265から、報告された手順[Lin et al., J.Am.Chem.Soc., 1995,117,3873-3874]にしたがって合成する。
【0387】
スキーム25a
【0388】
【化47】
Figure 2005504020
【0389】
実施例99
化合物268(スキーム25b,表XXII)。
三環式ヌクレオシド268を、化合物267から、報告された手順[Lin and Matteucci, J.Am.Chem.Soc., 1998,120,8531-8532]にしたがって製造する。
【0390】
スキーム25b
【0391】
【化48】
Figure 2005504020
【0392】
【表24】
Figure 2005504020
【0393】
【表25】
Figure 2005504020
【0394】
実施例100
化合物219(X=O[CHCN,スキーム25b,表XXII)。
化合物268(X=O[CHCN,スキーム25a)を、実施例2に記載の条件下でホスフィチル化して、化合物219を得る。
【0395】
実施例101
化合物220[X=O(CHN(COCF)[CH]N(H)COCF],スキーム25b,表XXII)。
化合物220(明記の)を、化合物268(X=O[CHNHCbz)およびN−ベンジルオキシカルボニルアミノエタノール−O−メチルスルホネートから、実施例67、72および73に記載のように製造する。
【0396】
実施例102
化合物224(X=O[CHNHCONHCH,スキーム25b,表XXII)。
化合物224(明記の)を、化合物268(X=O[CHNHCbz)、CDIおよびメチルアミンから、実施例67、68および69に記載のように合成する。
【0397】
実施例103
化合物225(X=O[CHNHCSNHCH,スキーム25b,表XXII)。
化合物224(明記の)を、化合物268(X=O[CHNHCbz)、1,1’−チオカルボニルジイミダゾールおよびメチルアミンから、実施例67、70および71に記載のように合成する。
【0398】
実施例104
化合物226(X=O[CHNHC[NH]NH,スキーム25b,表XXII)。
化合物226(明記の)を、化合物268(X=O[CHNHCbz)および化合物A(スキーム22dを参照されたい)から、実施例67、74および75に記載のように合成する。
【0399】
実施例105
化合物227(X=O[CHCHC[NH]NH,スキーム25b,表XXII)。
化合物227(明記の)を、化合物268(X=O[CHCN)から、実施例77、78および79に記載のように合成する。
【0400】
実施例106
化合物270(スキーム26)。
選択された束縛部分(表XXIVに規定される)を用いた、PhPおよびDEADの存在下における化合物269[Bigge,C.F. et al., PCT Int.Appl. (1997), 280pp CODEN PIXXD2 WO9723216A1 19970703]のヒドロキシル官能基のアルキル化は、化合物270を生じる。
【0401】
実施例107
化合物271(スキーム26)。
化合物271(1mmol)を、10%酢酸を含有する酢酸エチル中に溶解させ、得られた溶液を脱酸素化後、10mol%のPd−C(10%)と混合して圧力下で接触水素添加を行って、化合物271を得る。
【0402】
スキーム26
【0403】
【化49】
Figure 2005504020
【0404】
実施例108
化合物273(スキーム27a)。
化合物272を、化合物266および化合物271から、実施例88および98に記載のように得る。
【0405】
スキーム27a
【0406】
【化50】
Figure 2005504020
【0407】
実施例109
化合物237(X=O[CHN(フタロイル),スキーム27b,表XXIV)。
実施例2に記載されたのと同一条件下における化合物273(X=O[CHN(フタロイル),スキーム27a)のホスフィチル化は、化合物237を生じる。
【0408】
【表26】
Figure 2005504020
【0409】
実施例110
化合物238(X=O[CHN{COCF}[CHNH{COCF},スキーム27b,表XXIV)。
化合物273(X=O[CHN{フタロイル},スキーム27a)を、ヒドラジンで処理して、側鎖からフタロイル保護を除去する。このようにして形成された対応する遊離アミンを、実施例64に記載のように塩基の存在下においてN−ベンゾイルオキシカルボニルアミノエタノール−O−メタンスルホネートと反応させた後、ホスフィチル化して(実施例2)、化合物238を生じる。
【0410】
スキーム27b
【0411】
【化51】
Figure 2005504020
【0412】
実施例111
化合物242(X=O[CHNHCONHCH,スキーム27b,表XXII)。
化合物273(X=O[CHN{フタロイル},スキーム27a)を、ヒドラジンで処理して、側鎖からフタロイル保護を除去する。所望の化合物242は、実施例68および69に記載のように、形成された遊離アミノ基とCDIおよびメチルアミンとを反応させることによって得る。
【0413】
実施例112
化合物243(X=O[CHNHCSNHCH,スキーム27b,表XXII)。
化合物273(X=O[CHN{フタロイル},スキーム27a)を、ヒドラジンで処理して、側鎖からフタロイル保護を除去する。所望の化合物243は、実施例68および69に記載のように、形成された遊離アミノ基と1,1’−チオカルボニルジイミダゾールおよびメチルアミンとを反応させることによって得る。
【0414】
実施例113
化合物244(X=O[CHNHC{NH}NH,スキーム27b,表XXII)。
化合物273(X=O[CHN{フタロイル},スキーム27a)を、ヒドラジンで処理して、側鎖からフタロイル保護を除去する。所望の化合物243は、アミノ化合物および化合物A(スキーム22dを参照されたい)から、実施例67、74および75に記載のように製造する。
【0415】
実施例114
化合物245(X=O[CHCHC[NH]NH,スキーム27b,表XXII)。
化合物227(明記の)を、化合物273(X=O[CHCN)から、実施例77、78および79に記載のように合成する。
【0416】
実施例115
化合物284(スキーム28)。
参考文献手順[Pal,B.C. et al., Nucleosides & Nucleotides, 1988,7,1-21]にしたがって製造された化合物283を、NaHCOの存在下の水性メタノール中においてBocOと一緒に撹拌して、環窒素をBocとして保護する。次に、Bocで保護されたヌクレオシドを、無水ピリジン中でアセチル化して、化合物284を得る。
【0417】
スキーム28
【0418】
【化52】
Figure 2005504020
【0419】
実施例116
化合物285(R=[フタロイル]N[CH−,スキーム28)。
N−(フタロイル)エチレンジアミンを、化合物284のカルボキシル基に、HATUおよびHOATの存在下のペプチドカップリング条件下においてカップリングさせて、化合物285を得る。
【0420】
実施例117
化合物286(R=[フタロイル]N[CH−,スキーム28)。
化合物285に、ジクロロメタン中のTFA処理を30分間施して、Boc保護を除去する。環窒素の脱保護後、得られた化合物を、0.1M LiOHを含有する水性THF中において0℃で撹拌して、化合物286(明記の)を得る。
【0421】
実施例118
化合物287(R=[フタロイル]N[CH−,スキーム28)。
無水ピリジン中の化合物287(1mmol)を、DMAP(10mol%)の存在下においてDMT−Cl(1mmol)で処理して、対応する5’−O−DMT誘導体を得る。ジメトキシトリチル化後、得られた生成物を、DIEAの存在下の無水ジクロロメタン中の過剰のトリフルオロ酢酸エチルと一緒に撹拌して、化合物287を得る。
【0422】
実施例119
化合物274(R=[フタロイル]N[CH−,スキーム28,表XXV)。
化合物3の合成について実施例2に記載の条件下での化合物287のホスフィチル化は、化合物274を生じる。
【0423】
【表27】
Figure 2005504020
【0424】
実施例120
選択された修飾を有するオリゴヌクレオチドのヌクレアーゼ耐性
フェノキサジン151およびG−クランプ152の両ヌクレオシドを、以前に公表された手順[Lin,K.-Y.; Jones,R.J.; Matteucci,M. J.Am.Chem.Soc., 1995,117,3873-3874; Lin,K.-Y.; Matteucci,M. J.Am.Chem.Soc., 1998,120,8531-8532]を改変することによって製造した。スクシネート153および154、および対応する置換された固体支持体155および156は、スキーム19に概略されたように製造した。CPG支持体を用いて、二つのシチジン類似体151および152を、T18dCの配列をそれぞれ有する二つのモデルオリゴヌクレオチド157および158(dC=フェノキサジン(SEQ ID NO:62)またはG−クランプデオキシリボヌクレオシド(SEQ ID NO:63))の3’末端に包含させた。固相オリゴヌクレオチド合成は、標準的なホスホロアミダイト化学を用いて行った。G−クランプ含有オリゴヌクレオチド158の脱保護は、MeNH(40%水性)およびNH(20〜30%水性)の1:1溶液で、室温において4時間行った。これらオリゴヌクレオチドは、逆相HPLCで精製し且つ脱塩した。
【0425】
ヘビ毒ホスホジエステラーゼ(SVPD)およびウシ腸管粘膜ホスホジエステラーゼ(BIPD)を、in vitro ヌクレアーゼ耐性研究のための加水分解酵素として利用した。どちらの酵素も、主に、3’エキソヌクレアーゼ活性を示す。未修飾の19マーオリゴチミジレート(オリゴヌクレオチド159)(SEQ ID NO:64)を、対照として用いた。オリゴヌクレオチド試料を、SVPD(2.5単位/μmol基質)またはBIPD(0.55単位/μmol基質)と一緒に、50mMトリス−HCl、8mM MgCl緩衝液、pH7.5中において37℃でインキュベートした。ある一定の時点で、10μlのアリコートを取り出し、沸騰水中で2分間加熱して酵素を失活させた。次に、それら試料を、Millipore 0.025μm VSメンブランを用いた Nanopure 脱イオン水に対する膜透析によって脱塩し、それらを分析するまで凍結貯蔵した。酵素分解の進行は、キャピラリーゲル電気泳動(CGE)によって監視した。
【0426】
SVPDを加水分解酵素としたヌクレアーゼ耐性研究の結果を、図4に示す。予想されるように、未修飾対照オリゴヌクレオチド159(インサート)は、末端ヌクレオチドの逐次的除去によって速やかに分解された。適用された条件下において、このオリゴヌクレオチドのt1/2には、約3分で達した。20分間のインキュベーション後、完全長オリゴマーは、一連のより短いフラグメントへとほぼ完全に分解された。対照的に、複素環修飾を3’末端に有する修飾オリゴヌクレオチド157および158は、8時間のインキュベーション時間後でも、ほとんど分解されなかった。分解速度およびCGEプロフィールによれば、これら二つのオリゴマーの3’エキソヌクレアーゼ耐性には大差がない。加水分解酵素としてのBIPDに対するヌクレアーゼ耐性のきわめて類似の結果が、修飾オリゴヌクレオチド157および158双方について得られた。
【0427】
もう一組の実験で、ヌクレアーゼ活性へのフェノキサジンおよびG−クランプ両オリゴヌクレオチドの阻害作用を調べた。未修飾オリゴヌクレオチド159を、BIPDと一緒にインキュベートし、フルオレセインで5’標識されている19マーオリゴチミジレートの分解を、いろいろな量のオリゴヌクレオチド157および158それぞれの存在下で追跡した。オリゴヌクレオチド試料を、BIPD(0.55単位/μmol基質)と一緒に、50mMトリス−HCl、8mM MgCl、pH7.5中において37℃でインキュベートした。ある一定の時点で、10μlのアリコートを取り、200μLのdHO中に直接的に希釈後、CGE分析をした。核酸分解活性へのこれら修飾オリゴヌクレオチドの影響を、全体の酵素反応速度を調べることによって決定した。したがって、分解生成物は全て、各々の時点で定量し、それらの分解段階(n−x)を考慮して秤量し、要約して、加水分解された結合数を得た。酵素反応速度は、加水分解されたホスホジエステル結合の数からインキュベーション時間の関数として図式的に決定した。
【0428】
本研究のこのもう一つの項目は、これら三環式塩基修飾を3’末端に有するオリゴヌクレオチドが、なぜこのような異例のヌクレアーゼ耐性を示すのかという疑問によって進められた。したがって、それらが基質として認識されるか否か、すなわち、そられが酵素の活性部位に結合し且つ天然のDNAフラグメントの分解に影響を与えることができるか否かを決定することを計画した。図5において、未修飾オリゴヌクレオチド159の酵素分解速度を、オリゴヌクレオチド157および158の濃度の関数として示す。この図より、これら修飾オリゴヌクレオチドの存在は、酵素反応に明白な阻害作用を有するということが明らかである。再度、フェノキサジンおよびG−クランプの二つの誘導体の間には、検出可能な有意の差がない。両方とも、0.2μMを超える濃度で、オリゴヌクレオチド159の分解過程を遅くすることができる。IC50値には約0.5μMで達し、しかも5μMおよびそれを超える濃度では、酵素反応はほぼ完全に妨げられる。
【0429】
実施例121
選択された修飾を有するオリゴヌクレオチドのヌクレアーゼ耐性
フェノキサジン151およびG−クランプ152の両ヌクレオシドを、以前に公表された手順[Lin,K.-Y.; Jones,R.J.; Matteucci,M. J.Am.Chem.Soc., 1995,117,3873-3874; Lin,K.-Y.; Matteucci,M. J.Am.Chem.Soc., 1998,120,8531-8532]を改変することによって製造した。スクシネート153および154、および対応する置換された固体支持体155および156は、スキーム19に概略されたように製造した。CPG支持体を用いて、二つのシチジン類似体151および152を、T18dCの配列をそれぞれ有する二つのモデルオリゴヌクレオチド157および158(dC=フェノキサジン(SEQ ID NO:62)またはG−クランプデオキシリボヌクレオシド(SEQ ID NO:63))の3’末端に包含させた。固相オリゴヌクレオチド合成は、標準的なホスホロアミダイト化学を用いて行った。G−クランプ含有オリゴヌクレオチド158の脱保護は、MeNH(40%水性)およびNH(20〜30%水性)の1:1溶液で、室温において4時間行った。これらオリゴヌクレオチドは、逆相HPLCで精製し且つ脱塩した。
【0430】
ヘビ毒ホスホジエステラーゼ(SVPD)およびウシ腸管粘膜ホスホジエステラーゼ(BIPD)を、in vitro ヌクレアーゼ耐性研究のための加水分解酵素として利用した。どちらの酵素も、主に、3’エキソヌクレアーゼ活性を示す。未修飾の19マーオリゴチミジレート(オリゴヌクレオチド159)(SEQ ID NO:64)を、対照として用いた。オリゴヌクレオチド試料を、SVPD(2.5単位/μmol基質)またはBIPD(0.55単位/μmol基質)と一緒に、50mMトリス−HCl、8mM MgCl緩衝液、pH7.5中において37℃でインキュベートした。ある一定の時点で、10μlのアリコートを取り出し、沸騰水中で2分間加熱して酵素を失活させた。次に、それら試料を、Millipore 0.025μm VSメンブランを用いた Nanopure 脱イオン水に対する膜透析によって脱塩し、それらを分析するまで凍結貯蔵した。酵素分解の進行は、キャピラリーゲル電気泳動(CGE)によって監視した。
【0431】
SVPDを加水分解酵素としたヌクレアーゼ耐性研究の結果を、図4に示す。予想されるように、未修飾対照オリゴヌクレオチド159(インサート)は、末端ヌクレオチドの逐次的除去によって速やかに分解された。適用された条件下において、このオリゴヌクレオチドのt1/2には、約3分で達した。20分間のインキュベーション後、完全長オリゴマーは、一連のより短いフラグメントへとほぼ完全に分解された。対照的に、複素環修飾を3’末端に有する修飾オリゴヌクレオチド157および158は、8時間のインキュベーション時間後でも、ほとんど分解されなかった。分解速度およびCGEプロフィールによれば、これら二つのオリゴマーの3’エキソヌクレアーゼ耐性には大差がない。加水分解酵素としてのBIPDに対するヌクレアーゼ耐性のきわめて類似の結果が、修飾オリゴヌクレオチド157および158双方について得られた。
【0432】
もう一組の実験で、ヌクレアーゼ活性へのフェノキサジンおよびG−クランプ両オリゴヌクレオチドの阻害作用を調べた。未修飾オリゴヌクレオチド159を、BIPDと一緒にインキュベートし、フルオレセインで5’標識されている19マーオリゴチミジレートの分解を、いろいろな量のオリゴヌクレオチド157および158それぞれの存在下で追跡した。オリゴヌクレオチド試料を、BIPD(0.55単位/μmol基質)と一緒に、50mMトリス−HCl、8mM MgCl、pH7.5中において37℃でインキュベートした。ある一定の時点で、10μlのアリコートを取り、200μLのdHO中に直接的に希釈後、CGE分析をした。核酸分解活性へのこれら修飾オリゴヌクレオチドの影響を、全体の酵素反応速度を調べることによって決定した。したがって、分解生成物は全て、各々の時点で定量し、それらの分解段階(n−x)を考慮して秤量し、要約して、加水分解された結合数を得た。酵素反応速度は、加水分解されたホスホジエステル結合の数からインキュベーション時間の関数として図式的に決定した。
【0433】
本研究のこのもう一つの項目は、これら三環式塩基修飾を3’末端に有するオリゴヌクレオチドが、なぜこのような異例のヌクレアーゼ耐性を示すのかという疑問によって進められた。したがって、それらが基質として認識されるか否か、すなわち、そられが酵素の活性部位に結合し且つ天然のDNAフラグメントの分解に影響を与えることができるか否かを決定することを計画した。図5において、未修飾オリゴヌクレオチド159の酵素分解速度を、オリゴヌクレオチド157および158の濃度の関数として示す。この図より、これら修飾オリゴヌクレオチドの存在は、酵素反応に明白な阻害作用を有するということが明らかである。再度、フェノキサジンおよびG−クランプの二つの誘導体の間には、検出可能な有意の差がない。両方とも、0.2μMを超える濃度で、オリゴヌクレオチド159の分解過程を遅くすることができる。IC50値には約0.5μMで達し、しかも5μMおよびそれを超える濃度では、酵素反応はほぼ完全に妨げられる。
【0434】
ヌクレアーゼ耐性データは、双方の複素環修飾が、それらの天然のホスホジエステル主鎖にもかかわらず、3’エキソヌクレアーゼ攻撃をほぼ完全に防ぐということを示している。明らかに、この酵素は、修飾核酸塩基フェノキサジンまたはG−クランプを3’末端に含有するオリゴヌクレオチドを消化することができない。認められた高いヌクレアーゼ安定性には、主に、いろいろな理由があると考えられる。嵩高な複素環部分はどちらも、この酵素が3’末端に結合することを立体障害によって簡単に妨げるので、これらオリゴヌクレオチドは基質として認識されない、またはそれらは、加水分解されないで酵素の活性部位に結合するということになり、これが、酵素の活性に直接的に影響を与えると考えられる。天然のDNAフラグメントの酵素分解で認められた速度減少は、フェノキサジン残基およびG−クランプ残基を含有するオリゴヌクレオチドが、酵素の活性部位に結合できるということを示している。しかしながら、3’末端ヌクレオチドホスホジエステル結合の加水分解は、不自然な三環式塩基部分の存在のために妨げられる。約0.5μMolのIC50値での阻害作用の用量依存性は、これら修飾オリゴヌクレオチドの結合が競合的で且つ可逆的であるということを示唆している。
【0435】
オリゴヌクレオチド157と158とのヌクレアーゼ耐性の間には、検出可能な差がなく、認められた安定化作用は、主に、嵩高な複素環の存在のためであるということが示される。しかしながら、このデータでは、G−クランプ部分の陽電荷アミノ束縛部分が、オリゴヌクレオチド158のヌクレアーゼ耐性にどの程度寄与しているかは、依然として不明である。以前の研究において、2’−O−アミノアルキルなどの糖部分の陽イオン修飾は、ホスホジエステルオリゴヌクレオチドを酵素分解から効率よく守ることができるということが分かっている[Manoharan,M.; Tivel,K.L.; Anrade,L.K., Cook,P.D. Tetrahedron Lett. 1995,36,3647-3650; Teplova,M.; Wallace,S.C.; Tereshko,V.; Minasov,G.; Symonas,A.M.; Cook,P.D.; Manoharan,M.; Egli,M. PNAS 1999,96,14240-14245]。2’−アミノプロピル修飾オリゴヌクレオチドとエキソヌクレアーゼ(DNAポリメラーゼIクレノウフラグメント)との間に形成される複合体の結晶構造研究は、このアミノプロピル残基が、3’ホスホジエステル結合の加水分解を触媒するのに必要とされる金属イオンの結合を妨げるということを示している。しかしながら、G−クランプ残基のアミノ束縛は、主溝に突出しているが、この2’修飾は二重らせんの浅溝に向いている。後者の陽電荷が、エキソヌクレアーゼの金属結合を妨げることがありうるか否かは、依然として調べられている。
【0436】
実施例122
SVPDによる分解
オリゴヌクレオチドを、2μMの最終濃度で、ヘビ毒ホスホジエステラーゼ(0.005U/ml)と一緒に、50mMトリス−HCl、pH7.5、8mM MgCl中において37℃でインキュベートした。全反応容量は100μLであった。各々の時点で、各々の反応混合物からの10μLアリコートを、500μLミクロ遠心管に入れ、沸騰水浴中に2分間置いた。次に、それら試料を氷上で冷却し、容量全体が管の底にいくように急速回転させ、そして60mmペトリ皿中の水中に浮遊している Millipore 0.025ミクロンフィルターディスク(Bedford, MA)で脱塩した。そのメンブラン上で30〜60分後、試料を200μLの蒸留HOで希釈し、ゲル充填キャピラリー電気泳動によって分析した。オリゴヌクレオチドおよび代謝産物は、eCAPssDNA100−Rゲル(Beckman No.477621)および Tris-Borate Urea 緩衝液(Beckman No.338481)を含む100μmID30cmコーティングキャピラリー(Beckman No.477477)を用いた Beckman P/ACE MDQキャピラリー電気泳動装置を用いて分離し且つ分析した。これら試料は、動電学的に、5〜10秒間に5〜10kVの電界強さを用いて注入した。分離ウォッシュは、40℃において15kVの印加電圧で行った。完全長オリゴヌクレオチドの百分率は、Caesar v.6ソフトウェア(Senetec Software, New Jersey)を用いた組込み後、異なった長さのオリゴヌクレオチドの吸光係数の差を補正することによって計算した。
【0437】
実施例123
L/D−オリゴヌクレオチドキメラの in vivo ヌクレアーゼ安定性および結合親和性
天然に存在するD−オリゴヌクレオチドは、ヌクレアーゼによってきわめて急速に分解されるが、鏡像異性体のL−DNAオリゴマーは、ヌクレアーゼの作用への増大した耐性を有する。しかしながら、L−DNAは、天然のRNAおよびDNAとは全くかまたは弱くしかハイブリッド形成しないことが判明している。Damha および Capobianco[Damha,M.J.; Giannaris,P.A.; Marfey,P. Biochemistry, 1994,33,7877-7885; Capobianco,m.L.; Garbesi,A.; Arcamone,F.; Maschera,B.; Palu,G. Nucleic Acids Symp.Series 1991,24,274]は、独立して、末端L単位を有するキメラL/D−オリゴマーが、ヒト血清中において適切な二重らせん形成能力と優れた酵素的安定性を与えたということを示している[Damha,M.J.; Giannaris,P.A.; Marfey,P. Biochemistry, 1994,33,7877-7885; Capobianco,m.L.; Garbesi,A.; Arcamone,F.; Maschera,B.; Palu,G. Nucleic Acids Symp.Series 1991,24,274]。
【0438】
ここで、本発明者は、マウスにおけるL/D−オリゴヌクレオチドキメラの in vivo ヌクレアーゼ安定性を報告する。本発明者は、新規な経路[Jung,E.M.; Xu,Y. Tetrahedron Lett. 1997,24,4199-4202]から合成された、L−チミジンから誘導されるホスホロアミダイトおよびCPGを合成した。20マーホスホロチオエートオリゴヌクレオチドISIS−120745(マウスICAM−1にアンチセンス)に、L−2’−デオキシチミジンで3’位および5’位にキャッピングした。次に、このオリゴヌクレオチドを、BalbCマウスにIVボーラス投与した。24時間後、マウスを屠殺し、いろいろな器官からオリゴヌクレオチドを単離した。いろいろな器官中に存在する完全長オリゴヌクレオチドの百分率を、CGEで分析した。主要器官全てから、そこでは親オリゴヌクレオチドが完全に分解されていたので、>90%の無傷のL−チミジンキャップ付きオリゴヌクレオチドを単離した(図6および図7)。
【図面の簡単な説明】
【0439】
【図1】図1Aは、三環式シトシン類似体G−クランプの構造を示し、図1Bは、相補的グアノシンにハイブリッド形成したグアニジニルG−クランプを示し、そして図1Cは、x線結晶解析に用いられたパリンドローム十量体二重らせんを示す。CとGとの間に形成される5個の水素結合を、水平線で示している。Cは、グアニジニルG−クランプを意味し、は、2’−O−MOE−Tを意味する。
【図2】図2は、Åで示される距離を有する細い実線によって示されている5個の水素結合の形成を確認する、グアニジニルG−クランプヌクレオシド類似体およびグアノシンの周囲の(1.25σで輪郭を描いた)フーリエ(2F−F)総和電子密度地図を示す。
【図3】図3は、フェノキサジン環へほぼ垂直線に沿って見た、グアニジニルG−クランプ核酸塩基類似体とグアノシンとの間に生じる塩基スタッキングを示す。
【図4】図4は、CGE分析によって決定されるオリゴヌクレオチド157(白三角)および158(黒丸)のSVPDでの分解を、インキュベーション時間の関数としておよび未修飾対照オリゴヌクレオチド159(黒菱形)の分解と比較して示す。
【図5】図5は、オリゴヌクレオチド159のBIPDでの加水分解速度を、共インキュベートされたオリゴヌクレオチド157(白三角)および158(黒丸)の濃度の関数として示す。
【図6A】図6Aは、BalbCマウスに投与前の完全長L/Dキメラオリゴヌクレオチドの相対単位を示す。
【図6B】図6Bは、BalbCマウス中へのIVボーラスによる25mg/kg用量の投与後1時間に肝中に存在した完全長L/Dキメラオリゴヌクレオチドの相対単位を示す。
【図6C】図6Cは、BalbCマウス中へのIVボーラスによる25mg/kg用量の投与後1時間に腎臓中に存在した完全長L/Dキメラオリゴヌクレオチドの相対単位を示す。
【図6D】図6Dは、BalbCマウス中へのIVボーラスによる25mg/kg用量の投与後1時間に脾臓中に存在した完全長L/Dキメラオリゴヌクレオチドの相対単位を示す。
【図6E】図6Eは、BalbCマウス中へのIVボーラスによる25mg/kg用量の投与後1時間に肺中に存在した完全長L/Dキメラオリゴヌクレオチドの相対単位を示す。
【図7A】図7Aは、BalbCマウスに投与前の完全長L/Dキメラオリゴヌクレオチドの相対単位を示す。
【図7B】図7Bは、BalbCマウス中へのIVボーラスによる25mg/kg用量の投与後24時間に肝中に存在した完全長L/Dキメラオリゴヌクレオチドの相対単位を示す。
【図7C】図7Cは、BalbCマウス中へのIVボーラスによる25mg/kg用量の投与後24時間に腎臓中に存在した完全長L/Dキメラオリゴヌクレオチドの相対単位を示す。
【図7D】図7Dは、BalbCマウス中へのIVボーラスによる25mg/kg用量の投与後24時間に脾臓中に存在した完全長L/Dキメラオリゴヌクレオチドの相対単位を示す。
【図7E】図7Eは、BalbCマウス中へのIVボーラスによる25mg/kg用量の投与後24時間に肺中に存在した完全長L/Dキメラオリゴヌクレオチドの相対単位を示す。[0001]
Cross-reference to related applications
This application is filed on US patent application Ser. No. 10 / 013,295 filed Dec. 10, 2001; U.S. patent application Ser. No. 09 / 996,292 filed Nov. 28, 2001; and filed Jul. 3, 2001. Claims the benefit of US Provisional Patent Application No. 60 / 302,682.
[0002]
Field of Invention
The present invention relates to novel nuclease resistant oligomeric compounds and novel methods for increasing the nuclease resistance of oligomeric compounds.
[0003]
Background of the Invention
The potency and sequence-specific nature of antisense oligonucleotides (ON) in biological systems depend on their resistance to enzymatic degradation. Therefore, when designing powerful antisense drugs, it is essential to combine features such as high binding affinity and mismatch sensitivity with nuclease resistance. Unmodified phosphodiester antisense oligonucleotides are rapidly degraded in body fluids containing hydrolases (Shaw, JP; Kent, K .; Bird, J .; Fishback, J .; Froehler, B. Nucleic Acids Res. 1991, 19, 747-750; Woolf, TM; Jennings, CGB; Rebagliati, M; Melton, DA Nucleic Acids Res. 1990, 18, 1763-1769) Modified antisense oligos such as 2'-deoxyphosphorothioate oligonucleotides The first of the nucleotide drugs was also subjected to enzymatic degradation (Maier, M .; Bleicher, K .; Kalthoff, H .; Bayer, E. Biomed. Pept., Proteins Nucleic Acids 1995, 1,235-241; Agrawal, S .; Temsamani, J .; Tang, JY Proc. Natl. Acad. Sci. 1991, 88, 7595-7599). Extensive stability against various nucleases present in biological systems can best be achieved with modified oligonucleotides. Since 3 ′ exonuclease activity is mainly responsible for enzymatic degradation in serum-containing media and in various eukaryotic cell systems, modifications located at the 3 ′ end significantly contribute to the nuclease resistance of oligonucleotides. (Shaw, J.-P .; Kent, K .; Bird, J .; Fishback, J .; Froehler, B. Nucleic Acids Res. 1991, 19, 747-750; Maier, M .; Bleicher, K .; Kalthoff Bayer, E. Biomed. Pept., Proteins Nucleic Acids 1995, 1,235-241).
[0004]
Although extensive modifications have been made to the phosphodiester linkage and sugar moiety of oligonucleotides, modifications to the heterocyclic base moiety are desired to maintain the specific hydrogen-bonding motif required for base pair specificity. Are relatively limited (see Herdewijn, P. Antisense Nucleic Acids Drug Dev. 2000, 10, 297-310 for a review). The 2 ′ position is attractive for derivatization because it offers the advantage of increasing both nuclease resistance and binding affinity (Manoharan, M. Biochim. Biophys. Acta 1999, 1489, 117-130; Kawasaki, AM; Casper , MD; Prakash, TP; Manalili, S .; Sasmor, H .; Manoharan, M .; Cook, PD Nucleosides Nucleotides 1999, 18, 1419-1420).
[0005]
A large number of nucleobase modifications designed to increase the binding affinity of antisense oligonucleotides to their complementary target strands have recently been introduced (Beaucage, SL; Iyer, RP Tetrahedron 1993; 49, 6123-94; Cook, PD Annu. Rep. Med. Chem. 1998, 33, 313-325; Goodchild, J. Bioconjugate Chemistry, 1990; 1,165-87; Uhlmann, E .; Peyman, A. Chem. Rev. 1990, 90, 543 -84. For review, see Uhlmann, E .; Peyman, A. Chem. Rev. 1990,90,543-584; Milligan, JF; Matteucci, MD; Martin, JCJMed.Chem. 1993,36,1923-37; Cook , PD Antisense medicinal chemistry. In: Antisense Research and Application, A Handbook of Experimental Pharmacology (ed. Crooke, St), pp. 51-101. Springer-Verlag, New York, 1998). Some heterocyclic modifications have been found to increase nucleic acid binding affinity through increased hydrogen bonding and / or base stacking interactions. Examples of such heterocyclic modifications include 2,6-diaminopurine, which is the substitution of a hydrogen bond at position 3 with thymidine and the hydrogen atom at position C5 of the pyrimidine base with a propynyl group. Resulting in increased stacking interactions (Chollet, A .; Chollet-Damerius, A .; Kawashima, EH Chem. Scripta 1986, 26, 37-40; Wagner, RW; Matteucci, MD; Lewis, JG; Guttierrez, AJ; Molds, C .; Froehler, BC Science 1993, 260, 1510-1513).
[0006]
More recently, phenoxazine, phenothiazine (Lin, K.-Y .; Jones, RJ; Matteucci, MJAm. Chem. Soc. 1995, 117, 3873-3874) and tetrafluorophenoxazine (Wang, J .; Lin , K.-Y., Matteucci, M. Tetrahedron Lett. 1998,39,8385-8388) and other tricyclic cytosine analogues have been developed to hybridize to guanine and to the tetrafluorophenoxazine In some cases, it has been found to hybridize with adenine. These tricyclic cytosine analogs have also been shown to increase the thermal stability of the helix through extended stacking interactions.
[0007]
The helical stabilizing properties of tricyclic cytosine analogs are further enhanced with G-clamp, a cytosine analog containing an aminoethoxy moiety attached to a rigid phenoxazine scaffold (Lin, K.-Y .; Matteucci, MJAm. Chem. Soc. 1998, 120, 8531-8532). Binding studies show that a single G-clamp increases the binding affinity of a model oligonucleotide to its complementary target DNA or RNA, the highest affinity increase known for a single modification, 5-methylcytosine ( dC5meΔT up to 18 ° relative tomIt shows that it increases. This TmThe data is dC5meIncrease in helical stability does not affect the binding specificity of the oligonucleotide, as it shows an even greater difference between perfectly matched and mispaired sequences. The constrained amino group can serve as an additional hydrogen bond donor that interacts with the Hoogsteen face of complementary guanine, ie, O6. Thus, the increased affinity of G-clamp is believed to be mediated by a combination of extended base stacking and additional hydrogen bonding.
[0008]
The increased binding affinity of phenoxazine derivatives, together with their unaffected sequence specificity, makes them effective nucleobase analogs for the development of more potent drugs based on antisense. Promising data demonstrate that heptanucleotides containing phenoxazine substitutions can activate RNase H, promote intracellular uptake and show increased antisense activity (Lin, K.-Y .; Matteucci, MJAm. Chem. Soc. 1998, 120, 8531-8532). This increase in activity was even more pronounced with the G-clamp where single substitutions were shown to significantly improve the in vitro potency of 20-mer 2'-deoxyphosphorothioate oligonucleotides. (Flanagan, WM; Wolf, JJ; Olson, P .; Grant, D .; Lin, K.-Y .; Wagner, RW; Matteucci, M. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1999, 96, 3513 -3518).
[0009]
The potency and sequence specificity of oligonucleotides in biological systems depends in part on their nuclease stability. Resistance to numerous nucleases present in biological systems is best achieved with modified oligonucleotides. Therefore, when designing modified nucleotides, it is essential to evaluate and optimize their resistance to enzymatic degradation.
[0010]
Summary of the Invention
The present invention relates to novel nuclease resistant oligomeric compounds and novel methods for enhancing the nuclease resistance of oligomeric compounds.
[0011]
In a preferred embodiment, the compounds of the invention have the formula V:
[0012]
[Chemical 1]
Figure 2005504020
[0013]
In the above formula relating to the oligomeric compound represented by
n is 3 to about 50;1Are independently an internucleoside linking group; Y2Is an oxygen or internucleoside linking group; Y3Are oxygen or internucleoside linking groups; each Bx is an optionally protected heterocyclic base moiety;1Are independently hydrogen or a sugar substituent;1Is hydrogen, hydroxyl protecting group or
[0014]
[Chemical formula 2]
Figure 2005504020
[0015]
A modified nucleoside selected from the group consisting of: W2Is hydrogen, hydroxyl protecting group or
[0016]
[Chemical 3]
Figure 2005504020
[0017]
A modified nucleoside selected from the group consisting of:2Are independently alkyl, alkenyl, alkynyl, aryl, alkaryl, O-alkyl, O-aryl, amino, substituted amino, -SH, -SA3, Thiol ether, F, or morpholino; each A3Is independently H, sulfur protecting group, aryl, alkaryl, substituted or unsubstituted C1-C10Alkyl, substituted or unsubstituted C2-C10Alkenyl, substituted or unsubstituted C2-C10Alkynyl or alkaryl, wherein the substituent is OA5Or SA5Each A4Are independently H, nitrogen protecting group, substituted or unsubstituted C1-C10Alkyl, substituted or unsubstituted C2-C10Alkenyl, substituted or unsubstituted C2-C10Alkynyl or alkaryl, wherein the substituent is OA5Or SA5Each A5Is independently hydrogen, C1-C10Alkyl, cycloalkyl or aryl; each V1Are independently O or S; W1And W2At least one is not hydrogen or a hydroxyl protecting group and at least one internucleoside linking group is not a phosphodiester linking group.
[0018]
In certain preferred embodiments, the internucleoside linking group of the compound of formula V is a phosphorus-containing internucleoside linking group. In an even more preferred embodiment, at least one internucleoside linking group of the compound of formula V is other than a phosphodiester, more preferably more than 90% of the internucleoside linking group of the compound of formula V. , A non-phosphorus-containing internucleoside linking group. In an even more preferred embodiment, more than 90% of the internucleoside linking groups of the compound of formula V are phosphorothioate linking groups.
[0019]
In certain other embodiments of the invention, the oligomeric compound of formula V comprises a gapmer, hemimer or reverse gapmer. In a more preferred embodiment, the oligomeric compound of formula V has at least one 2'-O-CH in at least one region of a gapmer, hemimer or reverse gapmer.2CH2-O-CH3Contains sugar substituents.
[0020]
In another embodiment of the invention, the oligomeric compound of formula V comprises at least one nucleoside, wherein Bx is a polycyclic heterocyclic base moiety. In a more preferred embodiment, the oligomeric compound of formula V is such that Bx is independently of the formula:
[0021]
[Formula 4]
Figure 2005504020
[0022]
In the above formula comprising at least one nucleoside represented by
A6Is O or S; A7Is CH2, N-CH3, O or S; each A8And A9Is hydrogen or A8And A9One of these is hydrogen and A8And A9The other is the formula:
[0023]
[Chemical formula 5]
Figure 2005504020
[0024]
In the above formula, selected from the group consisting of:
G is -CN, -OA10, -SA10, -N (H) A10, -ON (H) A10Or -C (= NH) N (H) A10Q1H, -NHA10, -C (= O) N (H) A10, -C (= S) N (H) A10Or -C (= NH) N (H) A10Each Q2Are independently H or Pg; A10Is H, Pg, substituted or unsubstituted C1-C10Alkyl, acetyl, benzyl,-(CH2)p3NH2,-(CH2)p3N (H) Pg, D or Lα-amino acids, or peptides derived from D, L or racemic α-amino acids; Pg is a nitrogen, oxygen or thiol protecting group; each P1 is independently P2 is 1 to about 3; and P3 is 1 to about 4.
[0025]
In another preferred embodiment of the invention, Y of formula V3Is an internucleoside linking group, and W of formula V1Is a modified nucleoside. In another embodiment of the invention, Y of formula V2Is an internucleoside linking group, and W of formula V2Is a modified nucleoside.
[0026]
In certain preferred embodiments of the invention, each sugar substituent of formula V is independently —O—CH2CH2OCH3, -O (CH2)2ON (CH3)2, -O- (CH2)2-O- (CH2)2-N (CH3)2, -O-CH3, -OCH2CH2CH2NH2, -CH2-CH = CH2Or fluoro.
[0027]
In another preferred embodiment, the present invention provides a method for enhancing the nuclease resistance of an oligomeric compound, wherein at least one modified nucleoside is provided at either the 3 ′ or 5 ′ end of the oligomeric compound, W1And W2Relates to a process comprising obtaining a modified oligomeric compound of formula V such that at least one of is not hydrogen nor a hydroxyl protecting group.
[0028]
Detailed Description of the Preferred Embodiment
In the context of the present invention, the terms “oligomer” and “oligomer compound” mean a plurality of naturally occurring or non-naturally occurring nucleosides connected to each other in a specific sequence. The terms "oligomer" and "oligomer compound" include oligonucleotides, oligonucleotide analogs, oligonucleosides and chimeric oligomeric compounds in which there are two or more types of internucleoside linkages that divide the oligomeric compound into regions. It is. Oligomeric compounds are typically structurally distinguishable from naturally occurring or synthetic wild-type oligonucleotides, but are still functionally interchangeable. Thus, oligomeric compounds include all such structures that function effectively, for example, by hybridization to a target, to mimic the structure and / or function of the desired RNA or DNA strand.
[0029]
In the context of the present invention, the term “oligonucleotide” means an oligomer or polymer of ribonucleic acid (RNA) or deoxyribonucleic acid (DNA) or mimetics thereof. This term includes oligonucleotides comprising naturally occurring nucleobases, sugars and internucleoside (backbone) covalent bonds, as well as similarly functioning oligonucleotides having non-naturally occurring moieties. Such modified or substituted oligonucleotides are often natural due to desirable properties such as increased intracellular uptake, increased affinity for nucleic acid targets and increased stability in the presence of nucleases. More preferred than shape.
[0030]
As is known in the art, a nucleoside is a base-sugar combination. The base portion of the nucleoside is usually a heterocyclic base. The two most common classes of such heterocyclic bases are purines and pyrimidines. A nucleotide is a nucleoside that further includes a phosphate group covalently linked to the sugar portion of the nucleoside. For those nucleosides that include a pentofuranosyl sugar, the phosphate group can be linked to the 2 ', 3' or 5 'hydroxyl moiety of the sugar. When forming an oligonucleotide, these phosphate groups covalently bond adjacent nucleosides together to form a linear polymer compound. In turn, each end of this linear polymer structure can be further connected to form a cyclic structure. In general, however, an open linear structure is preferred. Within the oligonucleotide structure, these phosphate groups are generally said to form the internucleoside backbone of the oligonucleotide. The normal linkage or backbone of RNA and DNA is a 3 'to 5' phosphodiester linkage.
[0031]
Specific examples of preferred oligomeric compounds useful in the present invention include those having a modified backbone or non-naturally occurring internucleoside linkage. As defined herein, modified backbones include those that have a phosphorus atom in the backbone and those that do not have a phosphorus atom in the backbone. For the purposes of this specification, and as sometimes discussed in the art, modified oligonucleotides that do not have a phosphorus atom in the internucleoside backbone can also be considered to be oligonucleosides.
[0032]
Preferred modified oligonucleotide backbones include, for example, phosphorothioates; chiral phosphorothioates; phosphorodithioates; phosphotriesters; aminoalkyl phosphotriesters; methyl, including 3′-alkylene phosphonates, 5′-alkylene phosphonates and chiral phosphonates, and Other alkyl phosphonates; phosphinates; phosphoramidates including 3'-amino phosphoramidates and aminoalkyl phosphoramidates; thionophosphoramidates; thionoalkylphosphonates; thionoalkylphosphotriesters; Selenophosphates and boranophosphates having a 3'-5 'linkage, 2'-5' linked analogs thereof, and one or more internucleotide linkages of 3'-3 ', 5'- 'Or 2'-2' include those having a reverse polarity which is the binding. Preferred oligonucleotides with reverse polarity may be single 3'-3 'linkages, i.e. non-basic for most 3'-nucleotide linkages (nucleobase deleted or nucleic acid It contains a single reverse nucleoside residue (with a hydroxyl group instead of a base). Various salts, mixed salts and free acid forms are also encompassed.
[0033]
Typical phosphorus-containing bond
Phosphorodithioate (—O—P (S) (S) —O—);
Phosphorothioate (—O—P (S) (O) —O—);
Phosphoramidate (-O-P (O) (NJ2) -O-);
Phosphonate (—O—P (J) (O) —O—);
Phosphotriester (-OP (OJ) (O) -O-);
Phophosphoroamidate (-OP (O) (NJ) -S-);
Thionoalkyl phosphonate (—O—P (S) (J) —O—);
Thionoalkylphosphotriester (—O—P (O) (OJ) —S—);
Phosphoramidate (-N (J) -P (O) (O) -O-);
Boranophosphate (-R5-P (O) (O) -J-)
In the formula, J generally represents a substituent that is a hydrogen or alkyl group or a more complex group that changes from one type of bond to another.
[0034]
Representative US patents that teach the production of the above phosphorus-containing linkages include US Pat. No. 3,687,808, each incorporated herein by reference and some of which are the same as the present application. No. 4,469,863; 4,476,301; 5,023,243; 5,177,196; 5,188,897; 5,264,423; 5,276,019; 5,278,302; 5,286,717; 5,321,131; 5,399,676; 5,405,939; No. 5,455,233; No. 5,466,677; No. 5,476,925; No. 5,519,126; No. 5,536,821; No. 5,541 No.5,550,111; No.5,563,253; No.5 No. 571,799; No. 5,587,361; No. 5,194,599; No. 5,565,555; No. 5,527,899; No. 5,721,218; 697; and 5,625,050, but are not limited thereto.
[0035]
Preferred modified backbones that do not include a phosphorus atom therein are short chain alkyl or cycloalkyl internucleoside bonds, mixed heteroatoms and alkyl or cycloalkyl internucleoside bonds, or one or more short heteroatoms or heterocycles. It is formed by the internucleoside bond. These include morpholino linkages (partially formed from the sugar portion of the nucleoside); siloxane backbones; sulfide, sulfoxide and sulfone backbones; formacetyl and thioformacetyl backbones; methyleneformacetyl and thioformacetyl backbones Riboacetyl backbone; alkene-containing backbone; sulfamate backbone; methyleneimino and methylenehydrazino backbone; sulfonate and sulfonamide backbone; amide backbone; and N, O, S and CH2Others having a mixed component portion.
[0036]
Typical phosphorus-free bond
Thiodiester (—O—C (O) —S—);
Thionocarbamate (—O—C (O) (NJ) —S—);
Siloxane (-O-Si (J)2-O-);
Carbamates (—O—C (O) —NH— and —NH—C (O) —O—);
Sulfamate (—O—S (O) (O) —N— and —N—S (O) (O) —N—);
Morpholinosulfamide (-O-S (O) (N (morpholino)-));
Sulfonamide (-O-SO2-NH-);
Sulfide (-CH2-S-CH2-);
Sulfonate (-O-SO2-CH2-);
N, N'-dimethylhydrazine (-CH2-N (CH3) -N (CH3)-);
Thioform acetal (-S-CH2-O-);
Formacetal (-O-CH2-O-);
Thioketal (-SC (J)2-O-); and
Ketal (-O-C (J)2-O-);
Amine (-NH-CH2-CH2-);
Hydroxylamine (-CH2-N (J) -O-);
Hydroxylimine (—CH═N—O—); and
Hydrazinyl (-CH2-N (H) -N (H)-).
[0037]
In the formula, J generally represents a substituent that is a hydrogen or alkyl group or a more complex group that changes from one type of bond to another.
Representative US patents that teach the preparation of the above oligonucleosides include US Pat. No. 5,034,506, each incorporated herein and some of which are the same as the present application. 5,166,315; 5,185,444; 5,214,134; 5,216,141; 5,235,033; 5,264,562; 5,264,564; 5,405,938; 5,434,257; 5,466,677; 5,470,967; 5,489,677; No. 541,307; No. 5,561,225; No. 5,596,086; No. 5,602,240; No. 5,610,289; No. 5,602,240; No. 046; No. 5,610,289; No. 5,618,704 No. 5,623,070; No. 5,663,312; No. 5,633,360; No. 5,677,437; No. 5,792,608; No. 5,646,269; No. 5,677,439 is included, but is not limited thereto.
[0038]
In certain preferred oligonucleotide mimetics, both the sugar and internucleoside linkages of the nucleotide units, ie the backbone, are both replaced with new groups. Base units are maintained for hybridization with the appropriate nucleic acid target compound. One such oligomeric compound that is an oligonucleotide mimetic known to have excellent hybridization properties is referred to as a peptide nucleic acid (PNA). In PNA compounds, the sugar-backbone of an oligonucleotide is replaced with an amide-containing backbone, specifically an aminoethylglycine backbone. The nucleobase is retained and bound directly or indirectly to the aza nitrogen atom of the main chain amide moiety. Representative US patents that teach the preparation of PNA compounds include US Pat. Nos. 5,539,082; 5,714,331; and 5,719, each incorporated herein by reference. No. 262, but is not limited thereto. Further teachings of PNA compounds can be found in Nielsen et al., Science, 1991, 254, 1497-1550.
[0039]
Among the preferred compounds of the present invention are oligonucleotides having a phosphorothioate backbone, and heteroatom backbones, specifically the —CH of US Pat. No. 5,489,677 cited above.2-NH-O-CH2-, -CH2-N (CH3) -O-CH2-[Methylene (methylimino) as the MMI backbone or more commonly known as methyleneimino], -CH2-O-N (CH3) -CH2-, -CH2-N (CH3) -N (CH3) -CH2-And -O-N (CH3) -CH2-CH2-And oligonucleotides having the amide backbone of U.S. Pat. No. 5,602,240 listed above. Further preferred are oligonucleotides having the morpholino backbone structure of US Pat. No. 5,034,506 listed above.
[0040]
As used herein, “Bx” refers to a heterocyclic base moiety. A heterocyclic base moiety in accordance with the present invention (often referred to simply in the art as a “base” or “nucleobase”) includes naturally occurring or non-naturally occurring nucleobases. One or more functional groups of this base can have protecting groups. As used herein, "unmodified" or "natural" nucleobases include adenine (A) and guanine (G) purine bases, and thymine (T), cytosine (C) and uracil (U). Pyrimidine base is included. Modified nucleobases include 5-methylcytosine (5-me-C), 5-hydroxymethylcytosine, xanthine, hypoxanthine, 2-aminoadenine, adenine and 6-methyl and other alkyl derivatives of guanine, adenine and guanine 2-propyl and other alkyl derivatives of 2-thiouracil, 2-thiothymine and 2-thiocytosine, 5-halouracil and cytosine, 5-propynyl (—C≡C—CH3) Uracil and cytosine and other alkynyl derivatives of pyrimidine bases, 6-azouracil, cytosine and thymine, 5-uracil (pseudouracil), 4-thiouracil, 8-halo, 8-amino, 8-thiol, 8-thioalkyl, 8 Hydroxyl and other 8-substituted adenines and guanines, 5-halo, in particular 5-bromo, 5-trifluoromethyl and other 5-substituted uracils and cytosines, 7-methylguanine and 7-methyladenine, 2-F Other synthetic and natural nucleobases such as adenine, 2-aminoadenine, 8-azaguanine and 8-azaadenine, 7-deazaguanine and 7-deazaadenine, and 3-deazaguanine and 3-deazaadenine are included. Still other modified nucleobases include phenoxazine cytidine (1H-pyrimido [5,4-b] [1,4] benzoxazin-2 (3H) -one), phenothiazine cytidine (1H-pyrimido [5,4-b ] [1,4] benzothiazin-2 (3H) -one), substituted phenoxazine cytidine (eg, 9- (2-aminoethoxy) -H-pyrimido [5,4-b] [1,4] benzoxazine-2 (3H) -one), such as G-clamp, carbazole cytidine (2H-pyrimido [4,5-b] indol-2-one), pyridoindole cytidine (H-pyrido [3 ′, 2 ′: 4, 5] tricyclic pyrimidines such as pyrrolo [2,3-d] pyrimidin-2-one). Modified nucleobases include those in which the purine or pyrimidine base is replaced with other heterocycles such as 7-deazaadenine, 7-deazaguanosine, 2-aminopyridine and 2-pyridone.
[0041]
Still other nucleobases include those disclosed in US Pat. No. 3,687,808, The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering, pages 858-859, Kroschwitz, JI, ed. John Wiley & Sons, 1990. Disclosed, Englisch et al., Angewandte Chemie, International Edition, 1991, 30, 613, and Sanghvi, YS, Chapter 15, Antisense Research and Applications, pages 289-302, Crooke, ST and Lebleu, B , ed., CRC Press, 1993. Certain of these nucleobases are particularly useful for increasing the binding affinity of the oligomeric compounds of the invention. These include 5-substituted pyrimidines, 6-azapyrimidines, and N-2, N-6 and O-6 substituted purines including 2-aminopropyladenine, 5-propynyluracil and 5-propynylcytosine. 5-methylcytosine substitution has been shown to increase nucleic acid duplex stability by 0.6-1.2 ° C (Sanghvi, YS, Crooke, ST and Lebleu, B., eds., Antisense Research and Applications , CRC Press, Boca Raton, 1993, pp. 276-278), presently more preferred base substitutions, even more specifically when combined with 2'-O-methoxyethyl sugar modification.
[0042]
Representative US patents that teach the manufacture of certain such modified nucleobases, as well as other modified nucleobases, include the aforementioned US Pat. No. 3,687,808, and each of which is incorporated herein by reference and Some are commonly owned U.S. Pat. Nos. 4,845,205; 5,130,302; 5,134,066; 5,175,273; 5,367, No. 066; No. 5,432,272; No. 5,457,187; No. 5,459,255; No. 5,484,908; No. 5,502,177; No. 5,525,711 No. 5,552,540; No. 5,587,469; No. 5,594,121; No. 5,596,091; No. 5,614,617; No. 5,645,985; No. 5,830,653; No. 5,763,588; No. 05,096; No. 5,681,941; and although No. 5,750,692 are included, but are not limited thereto.
[0043]
In one aspect of the invention, the oligomeric compound is prepared with one or more heterocyclic base moieties including a polycyclic heterocyclic base moiety. As used herein, the term polycyclic heterocyclic base moiety is meant to encompass compounds containing at least three or more fused rings. A number of tricyclic and some tetracyclic heterocyclic compounds have been prepared and substituted for the naturally occurring heterocyclic base moieties in the oligomeric compounds. The resulting oligomeric compounds have been used for antisense applications that increase the binding properties of modified strands to target strands, for example. The more studied modifications are concentrated on guanosine and are commonly referred to as cytidine analogs.
[0044]
In one aspect of the invention, the polycyclic heterocyclic base moiety is of the formula
[0045]
[Chemical 6]
Figure 2005504020
[0046]
Have
Representative cytosine analogs that make three hydrogen bonds with guanosine elsewhere in the second chain or in the same chain include 1,3-diazaphenoxazin-2-one (R10= O, R11~ R14= H) [Kurchavov, et al., Nucleosides and Nucleotides, 1997, 16, 1837-1846], 1,3-diazaphenothiazin-2-one (R10= S, R11~ R14= H) [Lin, K.-Y .; Jones, RJ; Matteucci, MJAm. Chem. Soc. 1995, 117, 3873-3874] and 6,7,8,9-tetrafluoro-1,3-dia Zaphenoxazin-2-one (R10= O, R11~ R14= F) [Wang, J .; Lin, K.-Y., Matteucci, M. Tetrahedron Lett. 1998, 39, 8385-8388]. When included in oligonucleotides, these base modifications have been shown to hybridize with complementary guanine, which increases helical thermal stability by hybridizing with adenine and extended stacking interactions I also know that
[0047]
Yet another helical stabilizing property has been observed when a cytosine analog having an aminoethoxy moiety is attached to a rigid 1,3-diazaphenoxazin-2-one scaffold (R10= O, R11= -O- (CH2)2-NH2, R12-14= H, this analog has been given the specific name “G-clamp”) [Lin, K.-Y .; Matteucci, MJAm. Chem. Soc. 1998, 120, 8531-8532] . Binding studies have shown that 5-methylcytosine (dC5), where single inclusion is also the highest affinity increase known for a single modification, the binding affinity of a model oligonucleotide to its complementary target DNA or RNA.meΔT up to 18 ° C relative tomIt was shown that it can be increased. On the other hand, increased helical stability does not affect the specificity of the oligonucleotides. This TmThe data is dC5meCompared with, it shows an even greater difference between perfect and mispaired sequences. It has been suggested that the constrained amino group serves as an additional hydrogen bond donor that forms four hydrogen bonds by interacting with the Hoogsteen face of complementary guanine, ie, O6. This means that the increased affinity of G-clamp is mediated by a combination of extended base stacking and additional specific hydrogen bonding.
[0048]
Still other polycyclic heterocyclic base moieties according to the present invention and methods for their use are described in US Pat. No. 6,028,183 issued May 22, 2000 and US Patent issued December 28, 1999. No. 6,007,992, the contents of both of which are commonly assigned to this application and incorporated herein. Such compounds include the following formula:
[0049]
[Chemical 7]
Figure 2005504020
[0050]
Are included.
Where R11(CH3)2N- (CH2)2-O-; H2N- (CH2)3-; Ph-CH2-O-C (= O) -N (H)-(CH2)3-; H2N-; fluorenyl-CH2-O-C (= O) -N (H)-(CH2)3-; Phthalimidyl-CH2-O-C (= O) -N (H)-(CH2)3-; Ph-CH2-O-C (= O) -N (H)-(CH2)2-O-; Ph-CH2-O-C (= O) -N (H)-(CH2)3-O-; (CH3)2NN (H)-(CH2)2-O-; fluorenyl-CH2-O-C (= O) -N (H)-(CH2)2-O-; fluorenyl-CH2-O-C (= O) -N (H)-(CH2)3-O-; H2N- (CH2)2-O-CH2-; N3-(CH2)2-O-CH2-; H2N- (CH2)2-O- and NH2C (= NH) NH- is included.
[0051]
Further disclosed is the formula
[0052]
[Chemical 8]
Figure 2005504020
[0053]
It is a polycyclic heterocyclic compound having
Where R10aIs O, S or N-CH3Is;
R11aA (Z)X1Where A is a spacer and Z is independently a label binding group attached to a group that may be attached to a detectable label, while R11aIs not an amine, protected amine, nitro or cyano;
X1 is 1, 2 or 3; and
RbAre independently -CH =, -N =, -C (C1-8Alkyl) = or —C (halogen) =, but adjacent RbAre not both —N═ or two adjacent RbTogether, the following structure
[0054]
[Chemical 9]
Figure 2005504020
[0055]
(Wherein Rc is independently -CH =, -N =, -C (C1-8Alkyl) = or —C (halogen) =, but adjacent RbAre not both -N =)
To form a ring having
[0056]
The increased binding affinity of phenoxazine derivatives, together with their unaffected sequence specificity, makes these polycyclic heterocyclic base moieties effective for the development of more potent drugs based on antisense. To. In fact, promising data demonstrates that heptanucleotides containing phenoxazine substitutions can activate RNase H, promote intracellular uptake and exhibit increased antisense activity in Derived from in vitro experiments [Lin, K.-Y .; Matteucci, MJAm. Chem. Soc. 1998, 120, 8531-8532]. Where a single substitution has been shown to significantly improve the in vitro potency of 20-mer 2'-deoxyphosphorothioate oligonucleotides, when the heterocyclic base moiety is a G-clamp, the increased activity is Even more prominent [Flanagan, WM; Wolf, JJ; Olson, P .; Grant, D .; Lin, K.-Y .; Wagner, RW; Matteucci, M. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1999, 96, 3513-3518]. Nevertheless, in order to optimize oligonucleotide design and to better understand the impact of these polycyclic heterocyclic base modifications on biological activity, their nuclease stability on oligomer stability It is important to evaluate the effect.
[0057]
Still other polycyclic heterocyclic base moieties, including tricyclic and tetracyclic heteroaryl compounds according to the present invention include
[0058]
Embedded image
Figure 2005504020
[0059]
(Wherein R14Is NO2Or R14And R12Are both independently —CH3Is)
Are included. The synthesis of these compounds is described in US Pat. No. 5,434,257 issued July 18, 1995, US Pat. No. 5,502,177 issued March 26, 1996, and July 8, 1997. No. 5,646,269, the contents of which are commonly assigned to this application and incorporated herein.
[0060]
Still another polycyclic heterocyclic base moiety according to the present invention disclosed in the "257, 177 and 269" patents has the formula
[0061]
Embedded image
Figure 2005504020
[0062]
Wherein a and b are independently 0 or 1, provided that the sum of a and b is 0 or 1;
A is N, C or CH;
X is S, O, C = O, NH or NCH2, R6Is;
Y is C = O;
Z together with A forms an aryl or heteroaryl ring structure containing 5 or 6 ring atoms, wherein the heteroaryl ring is one O-ring heteroatom, one N ring heteroatom, 1 S ring heteroatom, 1 O and 1 N ring heteroatom separated by carbon atom, 1 S and 1 N ring separated by C atom A heteroatom, two N-ring heteroatoms separated by carbon atoms, or at least two N-ring heteroatoms separated by carbon atoms, and the carbon atoms of the aryl or heteroaryl ring are , Non-H, or at least one unbridged ring carbon atom is R20Or substituted with = O; or
Z, together with A, forms an aryl ring structure containing 6 ring atoms, wherein the aryl ring carbon atoms are unsubstituted other than H, or at least one unbridged ring carbon The atom is R6Or substituted with = O;
R6Are independently H, C1-6Alkyl, C2-6Alkenyl, C2-6Alkynyl, NO2, N (R3)2, CN or halo, or R6Is an adjacent Z group R6Together with you to complete the phenyl ring;
R20Are independently H, C1-6Alkyl, C2-6Alkyl, C2-6Alkenyl, C2-6Alkynyl, NO2, N (R21)2, CN or halo, or R20Is the adjacent R20To complete a ring containing 5 or 6 ring atoms, and tautomers, solvates and salts thereof;
R21Are independently H or a protecting group;
R3Is a protecting group or H)
And tautomers, solvates and salts thereof.
[0063]
More specific examples included in this "257, 177 and 269" patent are the formulas
[0064]
Embedded image
Figure 2005504020
[0065]
(Wherein R16Are each independently selected from hydrogen and various substituents)
It is a compound which has this.
The present invention provides oligomeric compounds comprising a plurality of linked nucleosides wherein the preferred internucleoside linkage is a 3 ', 5'-linkage. Alternatively, 2 ', 5'-linkages can be used (as described in US patent application Ser. No. 09 / 115,043 filed Jul. 14, 1998). A 2 ', 5'-linkage is a covalent linkage of the 2' position of the sugar moiety of one nucleotide subunit to the 5 'position of the sugar moiety of an adjacent nucleotide subunit.
[0066]
The compounds described herein may have asymmetric centers. Unless otherwise noted, all chiral forms, diastereomers, and racemates are included in the present invention. Geometric isomers may also exist in the compounds described herein, but all such stable isomers are encompassed by the present invention. It will be understood that the compounds according to the invention containing asymmetrically substituted carbon atoms can be isolated in optically active or racemic forms or by synthesis.
[0067]
The present invention includes all isotopes of atoms occurring in the intermediates or final compounds. Isotopes include those atoms having the same atomic number but different mass numbers. By way of example, and without limitation, isotopes of hydrogen include tritium and deuterium.
[0068]
The term “sugar substituent” as used herein means an optionally protected group attached to the 2 ′, 3 ′ or 5 ′ position of a selected sugar moiety. The sugar substituent is also attached to the heterocyclic base, for example by attachment at an amino functional group.
[0069]
A representative list of sugar substituents according to the present invention includes hydroxyl, C1-C20Alkyl, C2-C20Alkenyl, C2-C20Alkynyl, C5-C20Aryl, O-alkyl, O-alkenyl, O-alkynyl, O-alkylamino, O-alkylalkoxy, O-alkylaminoalkyl, O-alkylimidazole, S-alkyl, S-alkenyl, S-alkynyl, NH-alkyl NH-alkenyl, NH-alkynyl, N-dialkyl, O-aryl, S-aryl, NH-aryl, O-aralkyl, S-aralkyl, NH-aralkyl, N-phthalimide, halogen (especially fluoro), amino, Thiol, keto, carboxyl, nitro, nitroso, nitrile, trifluoromethyl, trifluoromethoxy, imidazole, azide, hydrazino, hydroxylamino, isocyanato, sulfoxide, sulfone, sulfide, disulfide, silyl, aryl, heterocycle, carbocycle Intercalator, a reporter group, a conjugate, polyamine, polyamide, polyalkylene glycol, and wherein (O-alkyl)m(Where m is from 1 to about 10). Preferred among these polyethers are linear and cyclic polyethylene glycol (PEG) and (PEG) containing groups, for example, Ouchi et al. (Drug, each incorporated herein by reference in its entirety. Design and Discovery 1992, 9, 93), Ravasio et al. (J. Org. Chem. 1991, 56, 4329) and Delgardo et al. (Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 1992, 9, 249) And crown ether. Yet another sugar modification is disclosed in Cook, P.D., Anti-Cancer Drug Design, 1991, 6,585-607. Fluoro, O-alkyl, O-alkylamino, O-alkylimidazole, O-alkylaminoalkyl and alkylamino substituents are described in Oligomeric Compounds having Pyrimidine, filed Mar. 6, 1995, which is incorporated herein in its entirety. U.S. patent application Ser. No. 08 / 398,901 entitled Nucleotide (s) with 2 'and 5' Substitutions.
[0070]
Yet another sugar substituent according to the invention includes the group -SR.1And -N (R1)2(Wherein R1Each independently is hydrogen, a protecting group, or substituted or unsubstituted alkyl, alkenyl, or alkynyl). 2'-SR1Nucleosides are disclosed in US Pat. No. 5,670,633 issued September 23, 1997, incorporated herein in its entirety. 2'-SR1Inclusion of monomer synthons is disclosed by Hamm et al., J. Org. Chem., 1997, 62, 3415-3420. 2'-N (R1)2Nucleosides are disclosed by Goettingen, M., J. Org. Chem., 1996, 61, 6273-6281; and Polushin et al., Tetrahedron Lett., 1996, 37, 3227-3230.
[0071]
Further exemplary sugar substituents can include groups having either the structure of Formula I or II.
:
[0072]
Embedded image
Figure 2005504020
[0073]
[Where Z0Is O, S or NH;
J is a single bond, O or C (═O);
E is C1-C10Alkyl, N (R5) (R6), N (R5) (R7), N = C (R5a) (R6a), N = C (R5a) (R7a) Or formula III
[0074]
Embedded image
Figure 2005504020
[0075]
Having
R8, R9, R11And R12Are each independently hydrogen, C (O) R13, Substituted or unsubstituted C1-C10Alkyl, substituted or unsubstituted C2-C10Alkenyl, substituted or unsubstituted C2-C10Alkynyl, alkylsulfonyl, arylsulfonyl, chemical functional group or conjugate group, where these substituents are hydroxyl, amino, alkoxy, carboxy, benzyl, phenyl, nitro, thiol, thioalkoxy, halogen, alkyl, aryl Selected from alkenyl and alkynyl;
Or, optionally, R11And R12Together form a phthalimide moiety with the nitrogen atom to which they are attached;
R13Are each independently substituted or unsubstituted C1-C10Alkyl, trifluoromethyl, cyanoethyloxy, methoxy, ethoxy, t-butoxy, allyloxy, 9-fluorenylmethoxy, 2- (trimethylsilyl) -ethoxy, 2,2,2-trichloroethoxy, benzyloxy, butyryl, isobutyryl, Phenyl or aryl;
R5Is hydrogen, nitrogen protecting group or -TL;
R5aIs hydrogen, nitrogen protecting group or -TL;
T is a bond or linking moiety;
L is a chemical functional group, a conjugate group or a solid support;
R6And R7Each independently represents hydrogen, a nitrogen protecting group, substituted or unsubstituted C1-C10Alkyl, substituted or unsubstituted C2-C10Alkenyl, substituted or unsubstituted C2-C10Alkynyl (wherein this substitution is hydroxyl, amino, alkoxy, carboxy, benzyl, phenyl, nitro, thiol, thioalkoxy, halogen, alkyl, aryl, alkenyl, alkynyl); NH3 +, N (R14) (R15), Guanidino or acyl, where acyl is an acid amide or ester;
Or R6And R7Together are nitrogen protecting groups or are connected in a ring structure that may include additional heteroatoms selected from N and O, or are chemical functional groups;
R14And R15Are independently H, C1-C10Alkyl, nitrogen protecting group or R14And R15Together are nitrogen protecting groups;
Or R14And R15Are connected in a ring structure that may include additional heteroatoms selected from N and O;
Z4Is OX, SX or N (X)2Is;
X is independently H, C1-C8Alkyl, C1-C8Haloalkyl, C (= NH) N (H) R16, C (= O) N (H) R16Or OC (= O) N (H) R16Is;
R16Is H or C1-C8Is alkyl;
Z1, Z2And Z3Includes a ring system having about 4 to about 7 carbon atoms or having about 3 to about 6 carbon atoms and 1 or 2 heteroatoms, wherein the heteroatoms are oxygen, nitrogen, And the ring system is aliphatic, unsaturated aliphatic, aromatic, or saturated or unsaturated heterocyclic;
Z5Has 1 to about 10 carbon atoms alkyl or haloalkyl, 2 to about 10 carbon atoms alkenyl, 2 to about 10 carbon atoms alkynyl, 6 to about 14 carbon atoms Aryl, N (R5) (R6) OR5, Halo, SR5Or CN;
q1Are each independently an integer from 1 to 10;
q2Are each independently 0 or 1;
q3Is 0 or an integer from 1 to 10;
q4Is an integer from 1 to 10;
q5Is 0, 1 or 2; and
q3Q is 0, q4Is conditional on being greater than 1.]
[0076]
Representative sugar substituents of formula I are incorporated by reference herein and are hereby incorporated by reference in their entirety as US patent application Ser. No. 09 / 130,973 entitled “Capped 2′-Oxyethoxy Oligonucleotides,” filed Aug. 7, 1998. Is disclosed.
[0077]
A representative cyclic sugar substituent of formula II is a US patent application entitled "RNA Targeted 2'-Modified Oligonucleotides that are Conformationally Preorganized," filed July 27, 1998, incorporated herein by reference in its entirety. No. 09 / 123,108.
[0078]
Particularly preferred sugar substituents include O [(CH2)p1O]p2CH3, O (CH2)p1OCH3, O (CH2)p1NH2, O (CH2)p1CH3, O (CH2)p1ONH2And O (CH2)p1ON [(CH2)p1CH3]]2Wherein p1 and p2 are 1 to about 10.
[0079]
Some preferred oligomeric compounds of the present invention have the following sugar substituents: C1-C10Lower alkyl, substituted lower alkyl, alkaryl, aralkyl, O-alkaryl or O-aralkyl, SH, SCH3, OCN, Cl, Br, CN, CF3, OCF3, SOCH3, SO2CH3, ONO2, NO2, N3, NH2, Heterocycloalkyl, heterocycloalkaryl, aminoalkylamino, polyalkylamino, substituted silyl, RNA cleaving groups, reporter groups, intercalators, groups that improve the pharmacokinetic properties of oligomeric compounds or pharmacodynamics of oligomeric compounds It contains at least one nucleoside having a group that improves properties and one of the other sugar substituents having similar properties. Preferred modifications include 2'-O-CH, also known as 2'-methoxyethoxy (2'-O- (2-methoxyethyl) or 2'-MOE).2CH2OCH3) [Martin et al., Helv. Chim. Acta, 1995, 78, 486], ie, alkoxyalkoxy groups. A more preferred modification is 2'-dimethylaminooxyethoxy, ie O (CH, also known as 2'-DMAOE.2)2ON (CH3)2It is a group. Representative aminooxy sugar substituents are incorporated herein by reference in their entirety, and commonly owned US patent application Ser. No. 09 / 344,260 entitled “Aminooxy-Functionalized Oligomers” filed Jun. 25, 1999. And US patent application Ser. No. 09 / 370,541, filed Aug. 9, 1999, entitled “Aminooxy-Functionalized Oligomers and Methods for Making Same;”.
[0080]
Other preferred modifications include 2'-methoxy (2'-O-CH3) 2'-aminopropoxy (2'-OCH)2CH2CH2NH2) And 2'-fluoro (2'-F). Similar modifications are linked to other positions on the nucleoside and oligomer, specifically from the 3 'position of the sugar on the 3' terminal nucleoside, or the 2 'position such as a 2'-5' linked oligomer. May be performed at the 3 ′ position of the nucleoside having a 5 ′ position of the 5 ′ terminal nucleoside. The oligomer may have a sugar mimic such as a cyclobutyl moiety instead of a pentofuranosyl sugar. Representative US patents that teach the manufacture of such modified sugar structures include US Pat. No. 4,981,957, each incorporated herein and some of which are the same. No. 5,118,800; No. 5,319,080; No. 5,359,044; No. 5,393,878; No. 5,446,137; No. 5,466,786; No. 514,785; No. 5,519,134; No. 5,567,811; No. 5,576,427; No. 5,591,722; No. 5,597,909; No. 300; No. 5,627,0531; No. 5,639,873; No. 5,646,265; No. 5,658,873; No. 5,670,633; and No. 5,700,920 Issue and June 5, 1995, which is also incorporated herein. Including but U.S. Patent Application Serial No. 08 / 468,037, which is commonly owned, but are not limited thereto.
[0081]
Representative guanidino sugar substituents shown in Formula III are commonly incorporated U.S. patent application entitled "Guinidinium Functionalized Oligomers and Methods" filed July 7, 2000, which is incorporated herein by reference in its entirety. 09 / 612,531.
[0082]
Representative acetamide sugar substituents are described in US patent application Ser. No. 09/378, filed Aug. 19, 1999, entitled “2′-O-Acetamido Modified Monomers and Oligomers”, which is incorporated herein by reference in its entirety. No. 568.
[0083]
Representative dimethylaminoethyloxyethyl sugar substituents are listed in the international patent application PCT / PCT entitled “2′-O-Dimethylaminoethyloxyethyl-Modified Oligonucleotides” filed Aug. 6, 1999, incorporated herein by reference in its entirety. It is disclosed in US99 / 17895.
[0084]
Further preferred modifications include Locked Nucleic Acids (LNA) in which a 2'-hydroxyl group is linked to the 3 'or 4' carbon atom of the sugar ring to form a bicyclic sugar moiety. It is. This bond is preferably a methylene (-CH2-) n group (wherein n is 1 or 2) bridging a 2 'oxygen atom and a 4' carbon atom. LNA and its manufacture are described in WO 98/39352 and WO 99/14226.
[0085]
It is not necessary for all positions in a given compound to be uniformly modified, but in practice two or more of the aforementioned modifications may be included in a single compound or even in a single nucleoside within an oligonucleotide. .
[0086]
The present invention further includes oligomeric compounds that are chimeric compounds. A “chimeric” oligomeric compound or “chimera” in the context of the present invention refers to at least one monomer unit, ie two or more chemically distinct regions each consisting of nucleotides in the case of oligonucleotide compounds. The oligomer compound to be contained, specifically, an oligonucleotide. A chimeric oligonucleotide is typically modified to give the oligonucleotide an increased resistance to nuclease degradation, increased cellular uptake and / or increased binding affinity to the target nucleic acid. Contains at least one region. Another region of the oligonucleotide can serve as a substrate for an enzyme capable of cleaving RNA: DNA or RNA: RNA hybrids. As an example, RNase H is a cellular endonuclease that cleaves the RNA strand of an RNA: DNA double helix. Thus, activation of RNase H causes cleavage of the RNA target, thereby greatly increasing the oligonucleotide inhibition efficiency of gene expression. Consequently, when using chimeric oligonucleotides, comparable results can often be obtained with shorter oligonucleotides compared to phosphorothioate deoxyoligonucleotides that hybridize to the same target region. The cleavage of the RNA target can be routinely detected by gel electrophoresis and, if necessary, associated nucleic acid hybridization techniques known in the art.
[0087]
The chimeric oligomeric compounds of the present invention may be formed as a composite structure of two or more oligonucleotides, modified oligonucleotides, oligonucleosides and / or oligonucleotide mimetics as described above. Such compounds are also referred to in the art as hybrids or gapmers. Representative US patents teaching the manufacture of such hybrid structures include US Pat. No. 5,013,830, each incorporated herein by reference in its entirety and some of which are co-owned with the present application. No. 5,149,797; No. 5,220,007; No. 5,256,775; No. 5,366,878; No. 5,403,711; No. 5,491,133; 5,565,350; 5,623,065; 5,652,355; 5,652,356; and 5,700,922. Do not mean.
[0088]
In certain embodiments, the oligomeric compounds of the invention may be chimeric oligonucleotides including “gapmers”, “reverse gapmers” or “hemimers”. In the case of “hemimers”, one terminal (5 ′ or 3 ′) region of the oligonucleotide contains a modified nucleoside. When both ends of an oligonucleotide contain modified nucleosides, the oligonucleotide is referred to as a “gapmer” and the modified 5 ′ and 3 ′ end regions are referred to as “wings”. In the case of gapmers, the 5 'and 3' wings can contain nucleosides modified in the same or different manner. In the case of “reverse gapmers”, the central region of the oligonucleotide contains a modified nucleoside.
[0089]
The present invention provides compounds and methods that are useful for increasing the nuclease resistance of oligomeric compounds. More particularly, the present invention relates to oligomeric compounds that exhibit increased nuclease resistance and methods for improving the nuclease stability of oligomeric compounds. As noted above, resistance to enzymatic degradation is an important feature of antisense oligonucleotide therapeutics, and the efficacy of antisense oligonucleotide drugs is hindered by the activity of nucleases present in biological systems. Surprisingly, it has been discovered that certain modifications of the oligomeric compounds increase their nuclease stability. A new method for increasing the nuclease stability of oligomeric compounds involving the inclusion of modified nucleosides has also been discovered.
[0090]
The present invention relates to nuclease resistant oligomeric compounds that may be useful as pharmaceuticals. Antisense oligonucleotides can be designed to bind in a predictable manner to certain nucleic acid target sequences that can cause selective inhibition of the expression of that gene by which the gene product causes disease. Antisense oligonucleotides disrupt processes such as splicing, polyadenylation, correct RNA folding, mRNA translocation and translation initiation, or ribosome movement along the mRNA by binding to specific complementary regions on the mRNA. Can inhibit protein biosynthesis. Since the oligomeric compounds of the present invention typically exhibit increased nuclease resistance, they can be used as effective antisense oligonucleotides in therapeutic applications for the treatment of certain diseases. The methods of the invention can also be used to increase the efficacy of antisense oligonucleotides as therapeutic agents by increasing the nuclease resistance of oligomeric compounds.
[0091]
A preferred embodiment of the present invention comprises at least one modified 5 ′ or 3 ′ terminal nucleoside or nucleotide and at least one internucleoside linking group other than a phosphodiester, and a gapmer, hemimer and reverse gapmer arrangement. Includes nuclease resistant oligomeric compounds that may contain modified 2 ′ substituents and one or more modified nucleobases.
[0092]
The tricyclic cytosine analogs phenoxazine and 9- (aminoethoxy) phenoxazine (G-clamp) were found to significantly increase the nuclease resistance of oligonucleotides. Phenoxazine and G-clamp were included in a model oligomer with a natural phosphodiester backbone to monitor enzymatic degradation after treatment with snake venom phosphodiesterase. Inclusion of either phenoxazine at the 3 'end or G-clamp alone completely protected the oligonucleotide from 3' exonuclease attack. Modified oligonucleotides can delay the degradation of natural DNA fragments by bovine intestinal mucosal phosphodiesterase in a dose-dependent manner, so that the nuclease resistance of oligonucleotides containing phenoxazine and G-clamp is low binding to the active site of the enzyme It is not thought to be caused by affinity. There was no significant difference between phenoxazine and G-clamp in terms of their effect on nuclease resistance and their ability to inhibit nuclease activity.
[0093]
A guanidinyl moiety can be added to an oligonucleotide by post-synthesis guanidinylation of a primary amino group bound to the 2 'position of a tricyclic cytosine analog (G-clamp) or to a phenoxazine ring system. While the former amino group can be selectively deprotected and guanidinylated on a solid support, the amino-ethoxy bond of the G-clamp is in aqueous solution after deprotection of the oligonucleotide and cleavage from the support. Can be guanidinylated. Both methods have been successfully used to synthesize and characterize various guanidinyl modified oligonucleotides. PK of primary amine is significantly higher than primary amineαConversion to a guanidinium moiety having a causes a positive charge to be introduced into the oligonucleotide, which is maintained over a wide pH range. Introduction of a cationic residue at the 2 ′ position greatly increases the nuclease resistance of the oligonucleotide (Prakash, TP; Kawasaki, AM; Vasquez, G .; Fraser, AS; Casper, MD; Cook, PD; Manoharan, M Nucleosides Nucleotides 1999,181,1381-1382). X-ray crystallographic studies of a decameric double helix containing a guanidinyl G-clamp nucleotide show an additional Hoogsteen bond between the bound guanidinium imino or amino nitrogen and the complementary guanine base N7. As shown, this was the first finding of a single base pair within a nucleic acid duplex that contained a total of 5 hydrogen bonds.
[0094]
The currently selected method for the production of oligomeric compounds uses a supporting base. A supporting base is used to attach the first nucleoside or larger nucleoside synthon, which is then repeatedly extended to yield the final oligomeric compound. The supporting base is selected to be insoluble or to have a solubility that can be varied in a variety of solvents, allowing the growing oligomer to not enter or remain in solution as desired. be able to. Traditional solid supports are insoluble and are routinely in the reaction vessel until the final oligomers are cleaved and separated while the reagents and solvents are reacted and / or washing the growing chains. In. More recent approaches have introduced soluble supports, including soluble polymer supports that allow the bound oligomers to precipitate and dissolve at the desired point in the synthesis (Gravert et al., Chem. Rev., 1997,97,489-510).
[0095]
Exemplary supporting bases according to the method of the present invention include, but are not limited to, controlled porous glass (CPG); oxalyl controlled porous glass (eg, Alul, et al., Nucleic Acids Research 1991, 19, 1527); TENTAGEL Support (see, eg, Wright, et al., Tetrahedron Letters 1993, 34, 3373); or the polystyrene / divinylbenzene copolymer POROS available from Perceptive Biosystems. The use of a 5 to 20 kDa molecular weight poly (ethylene glycol), a soluble support base, is described in Bonora et al., Organic Process Research & Development, 2000, 4, 225-231 for large scale synthesis of phosphorothioate oligonucleotides. Yes. Equipment for such synthesis is sold by several vendors including, for example, Applied Biosystems (Foster City, CA). Any other means for such synthesis known in the art can additionally or alternatively be used. It is well known to produce oligonucleotides such as phosphorothioate derivatives and alkylated derivatives using similar techniques.
[0096]
An active phosphorus composition (for example, a compound having an active phosphorus-containing substituent) can be used in a coupling reaction for the synthesis of an oligomer compound. As used herein, the term “active phosphorus composition” refers to a monomer having an active phosphorus-containing substituent that is reactive with the hydroxyl group of another monomer or oligomeric compound to form a phosphorus-containing internucleotide linkage. Includes oligomers. Such active phosphorus groups have active phosphorus atoms as PIIIContains in valence state. Such active phosphorus atoms are known in the art and include, but are not limited to, phosphoramidites, H-phosphonates, phosphate triesters and chiral auxiliaries. . A preferred synthetic solid phase synthesis method utilizes phosphoramidites as the active phosphate. The phosphoramidite is PIIIUse chemistry. The intermediate phosphite compound continues to be synthesized using known methods.VOxidized to a state, in a preferred embodiment, produces a phosphodiester or phosphorothioate internucleoside linkage. Still other phosphates and phosphites are disclosed in Tetrahedron Report Number 309 (Beaucage and Iyer, Tetrahedron, 1992, 48, 2223-2311).
[0097]
A representative list of monomers or oligomers containing active phosphorus includes the formula
[0098]
Embedded image
Figure 2005504020
[0099]
Wherein Bx are each independently a heterocyclic base moiety or a protected heterocyclic base moiety; and
R17Are each independently H, a protected hydroxyl group, a sugar substituent or a protected substituent;
W3Is a hydroxyl protecting group, nucleoside, nucleotide, oligonucleoside or oligonucleotide;
R18N (L1) L2Is;
L1And L2Are each independently C1-6Is alkyl;
Or L1And L2Are connected to each other and L1And L2Forms a 4-7 membered heterocyclic ring system including the nitrogen atom to which is attached, wherein the ring system includes at least one additional heteroatom selected from O, N and S You can; and
R19Is X1Is;
X1Are Pg-O-, Pg-S-, C1-C10Linear or branched alkyl, CH3(CH2)p5-O- or R20R21-N-;
p5 is 0-10;
Pg is a protecting group;
R20And R21Each independently represents hydrogen, C1-C10Alkyl, cycloalkyl or aryl;
Or, optionally, R20And R21Together with the nitrogen atom to which they are attached form a cyclic moiety that may include additional heteroatoms selected from O, S and N; or
R18And R19Is R18And R19Together with the phosphorus atom to which is attached forms a chiral auxiliary)
Are included.
[0100]
Groups attached to the phosphorus atom of the internucleotide linkage before and after oxidation (R18And R19) Can include nitrogen-containing cyclic moieties such as morpholine. Such oxidized internucleoside linkages include phosphoromorpholide thioate linkages (Wilk et al., Nucleosides and nucleotides, 1991, 10, 319-322). Still other cyclic moieties according to the invention include oxo, acyl, alkoxy, alkoxycarbonyl, alkyl, alkenyl, alkynyl, amino, amide, azide, aryl, heteroaryl, carboxylic acid, cyano, guanidino, halo, haloalkyl, halo Included are monocyclic, bicyclic, or tricyclic ring moieties that may be substituted with groups such as alkoxy, hydrazino, ODMT, alkylsulfonyl, nitro, sulfide, sulfone, sulfonamide, thiol and thioalkoxy. A preferred bicyclic ring structure including nitrogen is phthalimide.
[0101]
In the context of this specification, alkyl (generally C1-C20), alkenyl (typically C2-C20) and alkynyl (generally C2-C20) groups include methyl, ethyl, propyl, butyl Group, pentyl group, hexyl group, heptyl group, octyl group, nonyl group, decyl group, undecyl group, dodecyl group, tridecyl group, tetradecyl group, pentadecyl group, hexadecyl group, heptadecyl group, octadecyl group, nonadecyl group, eicosyl group and This includes, but is not limited to, substituted and unsubstituted straight chain, branched chain, and alicyclic hydrocarbons, including other higher carbon alkyl groups. Additional examples include 2-methylpropyl, 2-methyl-4-ethylbutyl, 2,4-diethylbutyl, 3-propylbutyl, 2,8-dibutyldecyl, 6,6-dimethyloctyl. 6-propyl-6-butyloctyl group, 2-methylbutyl group, 2-methylpentyl group, 3-methylpentyl group, 2-ethylhexyl group and other branched chain groups, allyl group, crotyl group, propargyl group, 2 -Pentenyl groups, and other unsaturated groups containing π bonds, cyclohexane groups, cyclopentane groups, adamantane groups, and other alicyclic groups, 3-penten-2-one groups, 3-methyl-2-butanol Group, 2-cyanooctyl group, 3-methoxy-4-heptanal group, 3-nitrobutyl group, 4-isopropoxide decyl group, 4-azido-2-nitrodecyl group , 5-Merukaputononiru group, 4-amino-1-pentenyl group, further include other substituted groups. Exemplary alkyl substituents are disclosed in US Pat. No. 5,212,295, paragraph 12, lines 41-50, incorporated herein in its entirety.
[0102]
Many chemical functional groups can be introduced into the compounds of the present invention in protected form and then deprotected to form the final desired compound. Heterocyclic bases such as groups attached directly or indirectly to one or more positions or 2 ', 3' and 5 'positions to internucleoside linkages and sugar substituents. Protecting groups can be selected to protect functional groups located in the growing oligomeric compound during repetitive oligonucleotide synthesis, and other positions can be selectively deprotected as required. can do. In general, protecting groups can cause larger molecular chemical functional groups to be inert to specific reaction conditions and then removed from such functional groups without substantially damaging the rest of the molecule. Yes (Greene and Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 3rd ed, John Wiley & Sons, New York, 1999). For example, the nitrogen atom of the amino group can be protected as a phthalimide group, as a 9-fluorenylmethoxycarbonyl (FMOC) group, and with a triphenylmethylsulfenyl group, t-BOC group or benzyl group. The carboxyl group can be protected as an acetyl group. Exemplary hydroxyl protecting groups are described by Beaucage et al., Tetrahedron 1992, 48, 2223. Preferred hydroxyl protecting groups are trityl, monomethoxytrityl, dimethoxytrityl, trimethoxytrityl, 9-phenylxanthin-9-yl (Pixyl) and 9- (p-methoxyphenyl) xanthin-9-yl (MOX). It is reactive to acid.
[0103]
Chemical functional groups can also be “protected” by including them in the precursor. For example, since an azide group is easily converted to an amine, the azide group can be used as a “protected” form of the amine. Further representative protecting groups utilized in oligonucleotide synthesis are discussed in Agrawal, et al., Protocols for Oligonucleotide Conjugates, Eds, Humana Press; New Jersey, 1994; Vol.26 pp.1-72.
[0104]
Examples of hydroxyl protecting groups include t-butyl, t-butoxymethyl, methoxymethyl, tetrahydropyranyl, 1-ethoxyethyl, 1- (2-chloroethoxy) ethyl, 2-trimethylsilylethyl, p-chlorophenyl, 2, 4-dinitrophenyl, benzyl, 2,6-dichlorobenzyl, diphenylmethyl, p, p = -dinitrobenzhydryl, p-nitrobenzyl, triphenylmethyl, trimethylsilyl, triethylsilyl, t-butyldimethylsilyl, t-butyl Diphenylsilyl, triphenylsilyl, benzoylformate, acetate, chloroacetate, trichloroacetate, trifluoroacetate, pivaloate, benzoate, p-phenylbenzoate, 9-fluorenylmethyl carbonate, mesylate and Including but tosylate, but are not limited to this.
[0105]
Examples of thiol (sulfur) protecting groups include, but are not limited to, benzyl, substituted benzyl, diphenylmethyl, phenyl, t-butyl, methoxymethyl, thiazolidines, acetyl and benzoyl. Additional thiol protecting groups are described in detail in Greene and Wuts, ibid.
[0106]
Additional amino protecting groups include 2-trimethylsilylethoxycarbonyl (Teoc), 1-methyl-1- (4-biphenylyl) ethoxycarbonyl (Bpoc), t-butoxycarbonyl (BOC), allyloxycarbonyl (Alloc), 9 Carbamate protecting groups such as fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc) and benzyloxycarbonyl (Cbz); amide protecting groups such as formyl, acetyl, trihaloacetyl, benzoyl and nitrophenylacetyl; sulfonamide protection such as 2-nitrobenzenesulfonyl Groups; including but not limited to imine protecting groups and cyclic imide protecting groups such as phthalimide and dithiasuccinoyl. Equivalents of these amino protecting groups are also encompassed by the compounds and methods of the present invention.
[0107]
Some preferred amino protecting groups are stable to acid treatment and can therefore be selectively removed by base treatment making the reactive amino group selectively available for substitution. Examples of such groups are Fmoc (E. Atherton and RCS Heppard in The Peptides, S. Udenfriend, J. Meienhofer, Eds., Academic Press, Orlando, 1987, volume 9, p. 1), and the Nsc group Various representative sulfonylethyl carbamates (Samukov et al., Tetrahedron Lett, 1994, 35: 7821; Verhart and Tesser, Rec. Trav. Chim. Pays-Bas, 1987, 107: 621).
[0108]
In some particularly preferred embodiments, the nucleoside components of the oligomeric compound are linked to each other by an optionally protected phosphorothioate internucleoside bond. Representative protecting groups for phosphorus-containing internucleoside linkages such as phosphite, phosphodiester and phosphorothioate linkages include β-cyanoethyl, diphenylsilylethyl, δ-cyanobutenyl, cyano p-xylyl (CPX). Groups, N-methyl-N-trifluoroacetylethyl (META) group, acetoxyphenoxyethyl (APE) group and buten-4-yl group. For example, US Pat. No. 4,725,677 and Reissue 34,069 (β-cyanoethyl); Beaucage, SL and Iyer, RP, Tetrahedron, 49 No. 10, pp.1925-1963 (1993); Beaucage, See SL and Iyer, RP, Tetrahedron, 49 No. 46, pp. 10441-10488 (1993); Beaucage, SL and Iyer, RP, Tetrahedron, 48 No. 12, pp.
[0109]
The invention further encompasses pharmaceutical compositions and formulations that include the oligomeric compounds of the invention. The pharmaceutical compositions of the present invention can be administered in a number of ways depending upon whether local or systemic treatment is desired and upon the area to be treated. Administration can be topical (including the eye and to mucosa including vaginal and rectal supply), lung (eg, by inhalation or insufflation of powder or aerosol, including by nebulizer), intratracheal, intranasal, It may be epidermal and transdermal, oral or parenteral administration. Parenteral administration includes intravenous, intraarterial, subcutaneous, intraperitoneal or intramuscular injection or infusion; or intracranial, eg, intrathecal or intraventricular administration. Oligonucleotides with at least one 2'-O-methoxyethyl modification are believed to be particularly useful for oral administration.
[0110]
Pharmaceutical compositions and formulations for topical administration may include transdermal patches, ointments, lotions, creams, gels, drops, suppositories, sprays, liquids and powders. Conventional pharmaceutical carriers, aqueous, powder or oily bases, thickeners and the like may be necessary or desirable. Coated condoms, gloves and the like may also be useful. Preferred topical formulations include those where the oligomeric compounds of the invention are a mixture with topical delivery agents such as lipids, liposomes, fatty acids, fatty acid esters, steroids, chelating agents and surfactants. Preferred lipids and liposomes include neutral (eg, dioleoylphosphatidyl DOPE ethanolamine, dimyristoyl phosphatidylcholine DMPC, distearoyl phosphatidylcholine), negative (eg, dimyristoyl phosphatidylglycerol DMPG) and cationic (eg, dioleoyl). Tetramethylaminopropyl DOTAP and dioleoylphosphatidylethanolamine DOTMA). The oligomeric compound of the present invention may be encapsulated in a liposome or, specifically, may form a complex with a cationic liposome. Alternatively, the oligomeric compound may be complexed with a lipid, specifically a cationic lipid. Preferred fatty acids and esters include arachidonic acid, oleic acid, eicosanoic acid, lauric acid, caprylic acid, capric acid, myristic acid, palmitic acid, stearic acid, linoleic acid, linolenic acid, dicaprate, tricaprate, monoolein, dilaurin Glyceryl 1-monocaprate, 1-dodecylazacycloheptan-2-one, acylcarnitine, acylcholine, or C thereof1-10Alkyl esters (eg, isopropyl myristate IPM), monoglycerides, diglycerides or pharmaceutically acceptable salts are included, but are not limited thereto. Topical formulations are described in detail in US patent application Ser. No. 09 / 315,298, filed May 20, 1999, which is incorporated herein in its entirety.
[0111]
Compositions and formulations for oral administration include powders or granules, microparticles, nanoparticles, suspensions or solutions in water or non-aqueous bases, capsules, gel capsules, sachets, tablets or mini Tablets are included. Thickeners, flavoring agents, diluents, emulsifiers, dispersion aids or binders may be desirable. Preferred oral formulations are those in which the oligomeric compounds of the invention are administered together with one or more penetration enhancers, surfactants and chelating agents. Preferred surfactants include fatty acids and / or esters or salts thereof, bile acids and / or salts thereof. Preferred bile acids / salts include chenodeoxycholic acid (CDCA) and ursodeoxychenodeoxycholic acid (UDCA), cholic acid, dehydrocholic acid, deoxycholic acid, glycolic acid, glycolic acid, glycodeoxycholic acid, taurocholic acid, taurodeoxycholic Acid, sodium tauro-24,25-dihydrofusidate, sodium glycodihydrofusidate. Preferred fatty acids include arachidonic acid, undecanoic acid, oleic acid, lauric acid, caprylic acid, capric acid, myristic acid, palmitic acid, stearic acid, linoleic acid, linolenic acid, dicaprate, tricaprate, monoolein, dilaurin, glyceryl 1-monocaprate, 1-dodecylazacycloheptan-2-one, acylcarnitine, acylcholine, or a monoglyceride, diglyceride or pharmaceutically acceptable (eg, sodium) salt thereof is included. Further preferred are penetration enhancer combinations, for example fatty acids / salts in combination with bile acids / salts. A particularly preferred combination is sodium salt of lauric acid, capric acid and UDCA. Still other penetration enhancers include polyoxyethylene-9-lauryl ether, polyoxyethylene-20-cetyl ether. The oligomeric compounds of the present invention may be delivered orally in particulate form, including spray dried particles, or may be complexed to form microparticles or nanoparticles. Oligonucleotide complexing agents include polyamino acids; polyimines; polyacrylates; polyalkyl acrylates, polyoxetanes, polyalkyl cyanoacrylates; cationic gelatin, albumin, starch, acrylate, polyethylene glycol (PEG) and starch Polyalkyl cyanoacrylates; DEAE derivatized polyimines, pollulans, cellulose and starch. Particularly preferred complexing agents include chitosan, N-trimethylchitosan, poly-L-lysine, polyhistidine, polyornithine, polyspermine, protamine, polyvinylpyridine, polythiodiethylaminomethylethylene P (TDAE), polyaminostyrene (eg, , P-amino), poly (methyl cyanoacrylate), poly (ethyl cyanoacrylate), poly (butyl cyanoacrylate), poly (isobutyl cyanoacrylate), poly (isohexyl cyanoacrylate), DEAE-methacrylate, DEAE-hexyl acrylate DEAE-acrylamide, DEAE-albumin and DEAE-dextran, polymethyl acrylate, polyhexyl acrylate, poly (D, L-lactic acid), poly (DL-lactic acid coglyco Nucleic acid (PLGA), alginate, and polyethylene glycol (PEG) are included The oral formulations of oligonucleotides and their manufacture are described in US patent application Ser. No. 08 / 886,829, each incorporated herein by reference in its entirety. (Filed on July 1, 1997), 09 / 108,673 (filed on July 1, 1998), 09 / 256,515 (filed on February 23, 1999), 09 / No. 082,624 (filed May 21, 1998) and 09 / 315,298 (filed May 20, 1999).
[0112]
Compositions and formulations for parenteral, intrathecal or intracerebroventricular administration include buffers, diluents, penetration enhancers, carrier compounds and other pharmaceutically acceptable carriers or excipients. Sterile aqueous solutions may be included that may contain other suitable additives that are not so limited.
[0113]
The pharmaceutical composition of the present invention includes, but is not limited to, solutions, emulsions and liposome-containing preparations. These compositions may result from a variety of components including, but not limited to, preformed liquids, self-emulsifying solids and self-emulsifying semisolids.
[0114]
The pharmaceutical formulations of the present invention may conveniently be presented in unit dosage form and can be prepared by conventional techniques well known in the pharmaceutical industry. Such techniques include the step of bringing into association the active ingredient with one or more pharmaceutical carriers or excipients. In general, the formulations are prepared by uniformly and intimately bringing into association the active ingredient with liquid carriers or finely divided solid carriers or both, and then if necessary shaping the product.
[0115]
The compositions of the present invention can be any of a number of possible dosage forms including, but not limited to, tablets, capsules, gel capsules, liquid syrups or soft gels, suppositories and enemas. Can be formulated. The compositions of the invention can also be formulated as suspensions in aqueous, non-aqueous or mixed bases. Aqueous suspensions may further contain substances that increase the viscosity of the suspension including, for example, sodium carboxymethylcellulose, sorbitol and / or dextran. This suspension may also contain stabilizers.
[0116]
In one embodiment of the invention, the pharmaceutical composition can be formulated and used as a foam. Pharmaceutical foams include formulations such as, but not limited to, emulsions, microemulsions, creams, jellies and liposomes. Although fundamentally similar in nature, these formulations differ in the final product components and consistency. The manufacture of such compositions and formulations is generally known to pharmaceutical and formulation artisans and can be applied to formulating the compositions of the present invention.
[0117]
The composition of the present invention can be manufactured and formulated as an emulsion. Emulsions are typically heterogeneous systems in which one liquid is dispersed in another liquid, usually in the form of liquid particles larger than 0.1 μm diameter. (Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, NY, volume 1, p.199; Rosoff, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, NY, volume 1, p. 245; Bolck in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, NY, volume 2, p.335; Higuchi et al., In Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PA, 1985, p.301). Emulsions are often two-phase systems comprising two immiscible liquid phases that are intimately mixed and dispersed with each other. In general, the emulsion may be of the water-in-oil (w / o) or oil-in-water (o / w) type. If the aqueous phase is finely divided in most oil phases and dispersed as fine liquid particles, the resulting composition is referred to as a water-in-oil (w / o) emulsion. Alternatively, if the oil phase is finely divided in most aqueous phases and dispersed as fine liquid particles, the resulting composition is referred to as an oil-in-water (o / w) emulsion. Emulsions may contain additional components in addition to the dispersed phase and the active drug that may be present in the aqueous phase, as a solution in the oil phase or as a separate phase itself. Pharmaceutical excipients such as emulsifiers, stabilizers, dyes and antioxidants may also be present in the emulsion if desired. A pharmaceutical emulsion is a multiple emulsion comprising more than two phases, such as in the case of an oil-in-water-in-oil (o / w / o) and water-in-oil-in-water (w / o / w) emulsion, for example. Also good. Such complex formulations often offer certain advantages that a simple two-component emulsion does not provide. Multiple emulsions in which the individual oil particles of the o / w emulsion confine small water particles constitute a w / o / w emulsion. Similarly, a system of oil particles trapped in water globules stabilized in an oily continuous phase gives an o / w / o emulsion.
[0118]
Emulsions are characterized by lack or little thermodynamic stability. Often, the dispersed or discontinuous phase of the emulsion is well dispersed and maintained in this form in the external or continuous phase by means of emulsifiers or the viscosity of the formulation. Either of the emulsion phases may be semi-solid or solid, as is the case with emulsion-type ointment bases and creams. Another means of stabilizing the emulsion involves the use of emulsifiers that may be included in either phase of the emulsion. Emulsifiers can be broadly classified into four types: synthetic surfactants, naturally occurring emulsifiers, absorbent bases and finely dispersed solids (Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.)). , 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, NY, volume 1, p.199).
[0119]
Synthetic surfactants, also known as surfactants, have been widely applied in emulsion formulations and have been reviewed in the literature (Rieger, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, NY, volume 1, p.285; Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), Marcel Dekker, Inc., New York, NY, 1988, volume 1, p. 199). Surfactants are typically amphiphilic and include a hydrophilic portion and a hydrophobic portion. The hydrophilic to hydrophobic ratio of a surfactant is referred to as hydrophilic-lipophilic balance (HLB) and is an effective means for classifying and selecting surfactants in the preparation of a formulation. Surfactants can be classified into different classes based on the nature of the hydrophilic group, namely nonionic, anionic, cationic and amphoteric (Rieger, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds. ), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, NY, volume 1, p.285).
[0120]
Naturally occurring emulsifiers used in emulsion formulations include lanolin, beeswax, phosphatides, lecithin and gum arabic. Absorbent bases have hydrophilic properties that can absorb water to form w / o emulsions, but still retain their semi-solid consistency, like anhydrous lanolin and hydrophilic petrolatum. Finely divided solids are also used as good emulsifiers, especially in combination with surfactants and in viscous formulations. These include polar inorganic solids such as heavy metal hydroxides; non-swelling clays such as bentonite, attapulgite, hectorite, kaolin, montmorillonite, colloidal aluminum silicate and colloidal aluminum magnesium silicate; carbon or glyceryl tristearate, etc. Pigments and nonpolar solids.
[0121]
Various non-emulsifying materials are also included in the emulsion formulation and contribute to the properties of the emulsion. These include fats, oils, waxes, fatty acids, fatty alcohols, fatty esters, humectants, hydrocolloids, preservatives and antioxidants (Bolck, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.) , 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, NY, volume 1, p.335; Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, NY , volume 1, p.199). Hydrocolloids or hydrocolloids include naturally occurring gums and synthetic polymers such as polysaccharides such as gum arabic, agar, alginic acid, carrageenan, guar gum, gum karaya and tragacanth, cellulose derivatives such as carboxymethylcellulose and carboxypropylcellulose. ), And synthetic polymers such as carbomers, cellulose ethers and carboxyvinyl polymers. They disperse or swell in water to form a colloidal solution that stabilizes the emulsion by forming a strong interfacial film around the dispersed phase liquid particles and by increasing the viscosity of the external phase.
[0122]
Since emulsions often contain many ingredients such as carbohydrates, proteins, sterols and phosphatides that can easily support microbial growth, these formulations often include preservatives. Commonly used preservatives included in emulsion formulations include methyl paraben, propyl paraben, quaternary ammonium salts, benzalkonium chloride, p-hydroxybenzoate and boric acid. In addition, antioxidants are also commonly added to emulsion formulations to prevent formulation degradation. Antioxidants used are free radical scavengers such as tocopherol, alkyl gallate, butylated hydroxyanisole, butylated hydroxytoluene, or reducing agents such as ascorbic acid and sodium metabisulfite, and oxidations such as citric acid, tartaric acid and lecithin It may be a preventive synergist.
[0123]
The application of emulsion formulations by dermatological, oral and parenteral routes and methods for their preparation are reviewed in the literature (Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker , Inc., New York, NY, volume 1, p.199). Emulsion formulations for oral delivery have been used quite extensively because of their ease of formulation, absorption and bioavailability for reasons of efficacy. (Rosoff, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, NY, volume 1, p.245; Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, NY, volume 1, p. 199). Mineral oil base laxatives, oil-soluble vitamins and high fat nutritional products are among the materials that have been commonly administered orally as o / w emulsions.
[0124]
In one embodiment of the invention, the oligomeric compound and nucleic acid composition is formulated as a microemulsion. A microemulsion can be defined as a system of water, oil and amphiphile, a single optically isotropic and thermodynamically stable solution (Rosoff, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, NY, volume 1, p. 245). Typically, microemulsions are made by first dispersing the oil in an aqueous surfactant solution and then adding an amount of a fourth component, generally a medium chain length alcohol, sufficient to form a clear system. System. Thus, microemulsions are also described as thermodynamically stable and isotropically transparent dispersions of two immiscible liquids that are stabilized by an interfacial membrane of surface-active molecules (Leung and Shah, in: Controlled Release of Drugs: Polymers and Aggregate Systems, Rosoff, M., Ed., 1989, VCH Publishers, New York, pages 185-215). Microemulsions are generally produced by a combination of 3 to 5 components including oil, water, surfactant, cosurfactant and electrolyte. Whether the microemulsion is a water-in-oil (w / o) type or an oil-in-water (o / w) type, the nature of the oil and surfactant used and the structure of the polar head and hydrocarbon tail of the surfactant molecule And depending on the geometric filling factor (Schott, in Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PA, 1985, p. 271).
[0125]
The phenomenological approach using phase diagrams has been extensively studied, giving the person skilled in the art comprehensive knowledge of how to formulate microemulsions (Rosoff, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker ( Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, NY, volume 1, p. 245; Bolck, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, NY, volume 1, p.335). Compared to conventional emulsions, microemulsions offer the advantage of solubilizing water-insoluble drugs as a formulation of naturally formed thermodynamically stable liquid particles.
[0126]
Surfactants used to produce the microemulsions include ionic surfactants, nonionic surfactants, Brij 96, polyoxyethylene oleyl ether, polyglycerol fatty acid esters, tetraglycerol monolaurate (ML310), tetraglycerol monooleate (MO310). ), Hexaglycerol monooleate (PO310), hexaglycerol pentaoleate (PO500), decaglycerol monocaprate (MCA750), decaglycerol monooleate (MO750), decaglycerol sequioleate (SO750), deca Glycerol decaoleate (DAO750) is included alone or in combination with a cosurfactant, but is not limited to this. Yes. This cosurfactant, usually short-chain alcohols such as ethanol, 1-propanol and 1-butanol, penetrates into the surfactant membrane, resulting in a membrane that is destroyed due to the void space that occurs between the surfactant molecules. This helps to increase interfacial fluidity. Since microemulsions can, however, be prepared without the use of cosurfactants, alcohol-free self-emulsifying microemulsion systems are known in the art. The aqueous phase may typically be, but is not limited to, water, aqueous drug solutions, glycerol, PEG300, PEG400, polyglycerol, propylene glycol, and ethylene glycol derivatives. The oil phase includes Captex 300, Captex 335, Capmul MCM, fatty acid esters, medium chain (C8-C12) mono-, di- and triglycerides, polyoxyethylated glyceryl fatty acid esters, fatty alcohols, polyglycolized glycerides May include, but are not limited to, materials such as saturated polyglycolated C8-C10 glycerides, vegetable oils and silicone oils.
[0127]
Microemulsions are of particular interest in terms of drug solubilization and increased drug absorption. Lipid-based microemulsions (both o / w and w / o) have been proposed to enhance the oral bioavailability of drugs, including peptides (Constantinides et al., Pharmaceutical Research, 1994, 11, 1385-1390; Ritschel, Met. Find. Exp. Clin. Pharmacol., 1993, 13, 205). Microemulsions provide improved drug solubilization, protection of the drug from enzymatic hydrolysis, increased drug absorption possible by changes in surfactant-induced membrane fluidity and permeability, ease of penetration, and oral over solid dosage forms Provides ease of administration, improved clinical potency, and reduced toxicity benefits (Constantinides et al., Pharmaceutical Research, 1994, 11, 1385; Ho et al., J. Pharm. Sci., 1996, 85, 138 -143). Often, microemulsions can form spontaneously when their components come together at ambient temperature. This can be particularly advantageous when formulating thermolabile drugs, peptides or oligonucleotides. Microemulsions were also effective for transdermal delivery of active ingredients in both cosmetic and pharmaceutical applications. The microemulsion compositions and formulations of the present invention facilitate increased systemic absorption of oligonucleotides and nucleic acids from the gastrointestinal tract, as well as oligonucleotides and nucleic acids in the gastrointestinal tract, vagina, oral cavity and other administration sites. It is expected to improve local cellular uptake.
[0128]
The microemulsions of the present invention comprise additional components such as sorbitan monostearate (Grill 3), Labrasol and penetration enhancers to improve the formulation properties of the oligomeric compounds and nucleic acids of the present invention and to enhance absorption. An additive may be contained. The penetration enhancers used in the microemulsions of the present invention can be classified as belonging to one of five broad categories: surfactants, fatty acids, bile salts, chelating agents and non-chelating non-surfactants. (Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p. 92). Each of these classes has been discussed above.
[0129]
In addition to the microemulsions that have been studied and used for drug formulation, there are a number of systematic surfactant structures. These include monolayers, micelles, bilayers and vesicles. Vesicles such as liposomes are of great interest from a drug supply standpoint because of their specificity and duration of action they provide. As used herein, the term “liposome” means a vesicle comprising amphipathic lipids arranged in one or more spherical layers.
[0130]
Liposomes are unilamellar or multilamellar vesicles with a membrane formed from a lipophilic material and an aqueous interior. This aqueous portion contains the supplied composition. Cationic liposomes have the advantage that they can be fused to the cell wall. Non-cationic liposomes cannot efficiently fuse with the cell wall, but are taken up by macrophages in vivo. In order to cross intact mammalian skin, lipid vesicles must pass through a series of pores each having a diameter of less than 50 nm under the influence of a suitable transdermal gradient. Therefore, it is desirable to use liposomes that are highly deformable and can pass through such pores.
[0131]
Additional advantages of liposomes include: Liposomes obtained from natural phospholipids are biocompatible and biodegradable; liposomes encompass a wide range of water-soluble and lipid-soluble drugs. Liposomes can protect drugs encapsulated in their internal compartment from metabolism and degradation (Rosoff, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc. , New York, NY, volume 1, p.245). Important issues in the production of liposome formulations are lipid surface charge, vesicle size and aqueous volume of liposomes.
[0132]
Liposomes are useful for transporting and delivering active ingredients to the site of action. Since the liposome membrane is structurally similar to a biological membrane, when the liposome is applied to tissue, the liposome begins to coalesce with the cell membrane. As the liposome and cell coalescence proceeds, the liposome contents are transferred into the cell where the active agent can act.
[0133]
Liposomal formulations have been the focus of extensive research as a delivery mode for many drugs. For topical administration, it is increasingly proven that liposomes offer several advantages over other formulations. These benefits include reduced side effects associated with high systemic absorption of the administered drug, increased accumulation of the administered drug at the desired target site, and various hydrophilic and hydrophobic drugs on the skin. Includes the ability to administer.
[0134]
Several reports detail the ability of liposomes to deliver drugs, including high molecular weight DNA, into the skin. Compounds including analgesics, antibodies, hormones and high molecular weight DNA have been administered to the skin. Most applications have resulted in targeting of the upper epidermis.
[0135]
Liposomes fall into two broad classes. Cationic liposomes are positively charged liposomes that interact with negatively charged DNA molecules to form stable complexes. The positively charged DNA / liposome complex binds to the negatively charged cell surface and is taken up into the endosome. Due to the acidic pH within the endosome, the liposomes are ruptured and their contents are released into the cytoplasm (Wang et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 1987, 147, 980-985).
[0136]
Liposomes that are pH sensitive or negatively charged capture DNA rather than complex with DNA. Since both DNA and lipid are similarly charged, repulsion occurs rather than complex formation. Nevertheless, some DNA is trapped in the aqueous interior of these liposomes. pH sensitive liposomes have been used to supply DNA encoding the thymidine kinase gene to cell monolayers in culture. Exogenous gene expression was detected in target cells (Zhou et al., Journal of Controlled Release, 1992, 19, 269-274).
[0137]
One major type of liposomal composition includes phospholipids other than naturally derived phosphatidylcholines. Neutral liposome compositions can be formed, for example, from dimyristoyl phosphatidylcholine (DMPC) or dipalmitoyl phosphatidylcholine (DPPC). Anionic liposome compositions are generally formed from dimyristoyl phosphatidylglycerol, whereas anionic fusion-derived liposomes are primarily formed from dioleyl phosphatidylethanolamine (DOPE). Another type of liposome composition is formed from phosphatidylcholine (PC), such as soy PC and egg PC. Another type is formed from a mixture of phospholipid and / or phosphatidylcholine and / or cholesterol.
[0138]
Several studies have evaluated the topical delivery of liposomal drug formulations to the skin. Application of liposomes containing interferon to guinea pig skin resulted in a reduction in cutaneous herpes ulcers, but delivery of interferon by other means (eg, as a solution or as an emulsion) was ineffective (Weiner et al , Journal of Drug Targeting, 1992, 2,405-410). In addition, additional studies investigated the efficacy of interferon administered as part of a liposomal formulation versus administration of interferon using an aqueous system and concluded that the liposomal formulation was superior to aqueous administration (du Plessis et al , Antiviral research, 1992, 18, 259-265).
[0139]
Nonionic liposome systems were also examined to determine their utility in the delivery of drugs to the skin, particularly in systems containing nonionic surfactants and cholesterol. NovasomeTMI (glyceryl dilaurate / cholesterol / polyoxyethylene-10-stearyl ether) and NovasomeTMCyclosporin A was delivered into the dermis of mouse skin using a nonionic liposome formulation containing II (glyceryl distearate / cholesterol / polyoxyethylene-10-stearyl ether). The results showed that such non-ionic liposome systems were effective in promoting the deposition of cyclosporin A in different layers of the skin (Hu et al., STPPharma. Sci. , 1994, 4, 6, 466).
[0140]
Liposomes contain one or more specializations that, when included in the liposome, result in increased circulation lifetime when included in the liposome compared to liposomes lacking such specialized lipids. Also included are “sterically stabilized” liposomes, the term used herein, which refers to liposomes containing a modified lipid. An example of a sterically stabilized liposome is one in which a portion of the vesicle-forming lipid portion of the liposome is (A) monosialoganglioside GM1Such as those containing one or more glycolipids, or (B) those derivatized with one or more hydrophilic polymers such as polyethylene glycol (PEG) moieties. While not wishing to be bound by any particular theory, it is at least known in the art that sterically stabilized liposomes containing lipids derivatized with gangliosides, sphingomyelin, or PEG are at least these steric. It is thought that the increased circulating half-life of the liposomes stabilized in the vesicles is due to decreased uptake of reticuloendothelial system (RES) into cells (Allen et al., FEBS Letters, 1987, 223,42; Wu et al., Cancer Research, 1993, 53, 3765).
[0141]
Various liposomes containing one or more glycolipids are known in the art. Papahadjopoulos et al. (Ann.N.Y.Acad.Sci., 1987, 507, 64) is a monosialoganglioside G that improves the blood half-life of liposomes.M1Reported the ability of galactocerebroside sulfate and phosphatidylinositol. These findings were explained by Gabizon et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1988, 85, 6949). U.S. Pat. No. 4,837,028 and WO88 / 04924, both by Allen et al., Describe (1) sphingomyelin and (2) ganglioside GM1Alternatively, liposomes containing sulfated galactocerebroside esters are disclosed. US Pat. No. 5,543,152 (Webb et al.) Discloses liposomes containing sphingomyelin. Liposomes containing 1,2-sn-dimyristoylphosphatidylcholine are disclosed in WO 97/13499 (Lim et al.).
[0142]
Numerous liposomes comprising lipids derivatized with one or more hydrophilic polymers and methods for their production are known in the art. Sunamoto et al. (Bull. Chem. Soc. Jpn., 1980, 53, 2778) is a non-ionic detergent 2C containing a PEG moiety.12A liposome containing 15G was described. Illum et al. (FEBS Lett., 1984, 167, 79) noted that hydrophilic coating of polystyrene particles with polymeric glycols resulted in a significantly increased blood half-life. Synthetic phospholipids modified by attachment of carboxylic acid groups of polyalkylene glycols (eg PEG) are described by Sears (US Pat. Nos. 4,426,330 and 4,534,899). Klibanov et al. (FEBS Lett., 1990,268,235) showed that liposomes containing phosphatidylethanolamine (PE) derivatized with PEG or PEG stearate have a significant increase in circulating half-life. The experiment shown is described. Blume et al. (Biochimica et Biophysica Acta, 1990, 1029, 91) has taken this finding from a combination of phospholipids derivatized with other PEGs, such as distearoylphosphatidylethanolamine (DSPE) and PEG. Expanded to the DSPE-PEG formed. Liposomes with covalently attached PEG moieties on the outer surface are described by Fisher in European Patent EP 0445131B1 and WO 90/04384. Liposome compositions containing 1 to 20 mole percent PE derivatized with PEG and methods for their use are described in Woodle et al. (US Pat. Nos. 5,013,556 and 5,356,633). And Martin et al. (US Pat. No. 5,213,804 and European Patent EP 0 968 413 B1). Liposomes containing some other lipid-polymer conjugates are described in WO 91/05545 and US Pat. No. 5,225,212 (both by Martin et al.) And WO 94/20073 (Zalipsky et al.). It is disclosed. Liposomes containing PEG-modified ceramide lipids are described in WO 96/10391 (Choi et al.). US Pat. Nos. 5,540,935 (Miyazaki et al.) And 5,556,948 (Tagawa et al.) Describe PEG-containing liposomes that can be further derivatized on the surface with functional moieties. ing.
[0143]
A limited number of liposomes containing nucleic acids are known in the art. WO 96/40062 by Thierry et al. Describes a method of encapsulating high molecular weight nucleic acids in liposomes. U.S. Pat. No. 5,264,221 by Tagawa et al. Discloses liposomes bound to proteins and claims that the contents of such liposomes can include antisense RNA. US Pat. No. 5,665,710 by Rahman et al., Describes several methods for encapsulating oligodeoxynucleotides in liposomes. WO 97/04787 by Love et al., Discloses liposomes comprising antisense oligonucleotides targeted to the raf gene.
[0144]
Transfersomes are another type of liposome, a highly deformable lipid aggregate that is an attractive candidate for drug delivery vehicles. Since transfersomes are highly deformable lipid liquid particles, they can be described as lipid liquid particles that can easily penetrate through smaller pores than the liquid particles. Transfersomes are adaptable to the environment in which they are used, for example, they are self-optimizing (can adapt to the shape of the skin pores), self-healing, and often without fragmentation Reach the target, and often self-loading. To make transfersomes, surface edge-activators, usually surfactants, can be added to a standard liposome composition. Transfersomes have been used to supply serum albumin to the skin. Transfersome-mediated serum albumin delivery has been found to be as effective as subcutaneous injection of serum albumin-containing solutions.
[0145]
Surfactants are widely applied in formulations such as emulsions (including microemulsions) and liposomes. The most common method of classifying and grading the properties of many different types of surfactants, both natural and synthetic, is through the use of hydrophilic / lipophilic balance (HLB). The nature of the hydrophilic group (also known as the “head”) provides the most useful means of classifying the various surfactants used in the formulation (Rieger, in Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Dekker, Inc., New York, NY) , 1988, p.285).
[0146]
If the surfactant molecule is not ionized, it is classified as a non-ionic surfactant. Nonionic surfactants are widely applied in pharmaceutical products and cosmetics and can be used over a wide range of pH values. In general, their HLB values are from 2 to about 18, depending on their structure. Nonionic surfactants include nonionic esters such as ethylene glycol esters, propylene glycol esters, glyceryl esters, polyglyceryl esters, sorbitan esters, sucrose esters and ethoxylated esters. Nonionic alkanolamides and ethers such as fatty alcohol ethoxylates, propoxylated alcohols and ethoxylated / propoxylated block polymers are also included in this class. Polyoxyethylene surfactant is the most common member in the non-ionic surfactant class.
[0147]
If a surfactant molecule has a negative charge when dissolved or dispersed in water, the surfactant is classified as anionic. Anionic surfactants include carboxylates such as soaps, acyl lactylates, acylamides of amino acids, esters of sulfuric acids such as alkyl sulfates and ethoxylated alkyl sulfates, sulfonates such as alkyl benzene sulfonates, acyl isethionates, acyl taurates and Sulfosuccinate and phosphate are included. The most important members of the anionic surfactant class are alkyl sulfates and soaps.
[0148]
If the surfactant molecule has a positive charge when dissolved or dispersed in water, the surfactant is classified as cationic. Cationic surfactants include quaternary ammonium salts and ethoxylated amines. Quaternary ammonium salts are the most used members of this class.
[0149]
A surfactant is classified as amphoteric if it has the ability to have either a positive or negative charge. Amphoteric surfactants include acrylic acid derivatives, substituted alkylamides, N-alkylbetaines and phosphatides. The use of surfactants in drug products, formulations and emulsions has been reviewed (Rieger, in Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 1988, p.285).
[0150]
In one embodiment, the present invention uses various penetration enhancers to provide an effective supply of nucleic acids, particularly oligomeric compounds, to the skin of animals. Most drugs are present in solution in both ionized and non-ionized forms. However, normally only lipid soluble or lipophilic drugs easily cross cell membranes. It has been discovered that non-lipophilic drugs can cross cell membranes if the membrane to be crossed is treated with a penetration enhancer. In addition to helping the diffusion of non-lipophilic drugs across cell membranes, penetration enhancers also increase the permeability of lipophilic drugs. Penetration enhancers can be classified as belonging to one of five broad categories: surfactants, fatty acids, bile salts, chelating agents and non-chelating non-surfactants (Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p.92). Each of the above penetration enhancer classes is described in more detail below.
[0151]
In the context of the present invention, a surfactant (or “surfactant”) is a chemical substance that, when dissolved in an aqueous solution, reduces the surface tension of the aqueous solution or the interfacial tension between the aqueous solution and another liquid. Yes, with the consequence of increased absorption of the oligonucleotide through the mucosa. In addition to bile salts and fatty acids, these penetration enhancers include, for example, sodium lauryl sulfate, polyoxyethylene-9-lauryl ether and polyoxyethylene-20-cetyl ether (Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p. 92); and perfluorochemical emulsions such as FC43. Takahashi et al., J. Pharm. Pharmacol., 1988, 40, 252).
[0152]
Various fatty acids and their derivatives that act as penetration enhancers include, for example, oleic acid, lauric acid, capric acid (n-decanoic acid), myristic acid, palmitic acid, stearic acid, linoleic acid, linolenic acid, dicaprate , Tricaprate, monoolein (1-monooleoyl-rac-glycerol), dilaurin, caprylic acid, arachidonic acid, glycerol 1-monocaprate, 1-dodecylazacycloheptan-2-one, acylcarnitine, acylcholine, those C1-10Alkyl esters (eg, methyl, isopropyl and t-butyl) and their mono- and diglycerides (ie, oleate, laurate, caprate, myristate, palmitate, stearate, linoleate, etc.) (Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p. 92; Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33; El Hariri et al., J. Pharm. Pharmacol., 1992, 44, 651-654) Is done.
[0153]
The physiological role of bile includes promoting the dispersion and absorption of lipids and fat-soluble vitamins (Brunton, Chapter 38 in: Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 9th Ed., Hardman et al. Eds., McGraw -Hill, New York, 1996, pp.934-935). Various natural bile salts and their synthetic derivatives act as penetration enhancers. Thus, the term “bile salt” includes any naturally occurring bile component as well as any of their synthetic derivatives. The bile salts of the present invention include, for example, cholic acid (or its pharmaceutically acceptable sodium salt, sodium cholate), dehydrocholic acid (sodium dehydrocholate), deoxycholic acid (sodium deoxycholate), Glucholic acid (sodium glycolate), glycolic acid (sodium glycocholate), glycodeoxycholic acid (sodium glycodeoxycholate), taurocholic acid (sodium taurocholate), taurodeoxycholic acid (sodium taurodeoxycholate), chenodeoxychol Acids (sodium chenodeoxycholic acid), ursodeoxycholic acid (UDCA), sodium tauro-24,25-dihydrofusidate (STDHF), sodium glycodihydrofusidate and polyoxyethylene-9- Uryl ether (POE) is included (Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, page 92; Swinyard, Chapter 31 In: Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., Gennaro, ed., Mack Publishing Co. , Easton, PA, 1990, pages 782-783; Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33; Yamamoto et al., J. Pharm. Exp. Ther., 1992, 263, 25; Yamashita et al., J. Pharm. Sci., 1990, 79, 579-583).
[0154]
The chelating agent used in connection with the present invention can be defined as a compound that removes metal ions from solution by forming a complex with it, with the result that increased absorption of the oligonucleotide through the mucosa. . With regard to their use as penetration enhancers in the present invention, chelating agents are those where most characterized DNA nucleases require divalent metal ions for catalysis and are therefore inhibited by chelating agents. As such, it has the added advantage of also serving as a DNase inhibitor (Jarrett, J. Chromatogr., 1993, 618, 315-339). Chelating agents of the present invention include ethylenediaminetetraacetic acid disodium (EDTA), citric acid, salicylates (eg, sodium salicylate, 5-methoxysalicylate and homovanillate), N-acyl derivatives of collagen, laureth-9, and This includes, but is not limited to, N-aminoacyl derivatives of β-diketones (enamines) (Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, page 92; Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33; Buur et al., J. Control Rel, 1990, 14, 43-51).
[0155]
Non-chelated non-surfactant penetration enhancing compounds used herein exhibit meaningless activity as both chelating agents and surfactants, but nevertheless increase the absorption of oligonucleotides through the digestive mucosa (Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33). This class of penetration enhancers includes, for example, unsaturated cyclic ureas, 1-alkylalkanones and 1-alkenylazacycloalkanone derivatives (Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, page 92); And non-steroidal anti-inflammatory drugs such as sodium diclofenac, indomethacin and phenylbutazone (Yamashita et al., J. Pharm. Pharmacol., 1987, 39, 621-626).
[0156]
Agents that increase the uptake of oligonucleotides at the cellular level can also be added to the pharmaceutical and other compositions of the present invention. For example, cationic lipids such as lipofectin (Junichi et al., US Pat. No. 5,705,188), cationic glycerol derivatives, and polycationic molecules such as polylysine (Lollo et al., PCT application WO 97/30731). Are also known to increase intracellular uptake of oligonucleotides.
[0157]
Other drugs, including glycols such as ethylene glycol and propylene glycol, pyrroles such as 2-pyrrole, azones and terpenes such as limonene and menthone, are utilized to facilitate penetration of the administered nucleic acid. be able to.
[0158]
Certain compositions of the present invention also include a carrier compound in the formulation. As used herein, a “carrier compound” or “carrier” is inactive (ie, has no biological activity in itself), but bioavailability of a nucleic acid with biological activity. Can be meant a nucleic acid or analog thereof that is recognized as a nucleic acid in an in vivo process, for example, by degrading a biologically active nucleic acid or facilitating its removal from the circulation. Co-administration of a nucleic acid and a carrier compound, typically including an excess of the latter, is likely due to competition between the carrier compound and the nucleic acid for a common receptor, possibly due to liver, kidney or other extracirculatory events. It can cause a substantial reduction in the amount of nucleic acid recovered in the reservoir. For example, recovery of a partial phosphorothioate oligonucleotide in liver tissue can be achieved when it is co-administered with polyinosinic acid, dextran sulfate, polycytidic acid or 4-acetamido-4'-isothiacyano-stilbene-2,2'-disulfonic acid. May decrease (Miyao et al., Antisense Res. Dev., 1995, 5, 115-121; Takakura et al., Antisense & Nucl. Acid Drug Dev., 1996, 6, 177-183).
[0159]
In contrast to a carrier compound, a “pharmaceutical carrier” or “excipient” is a pharmaceutically acceptable solvent, suspending agent or any other for supplying one or more nucleic acids to an animal. Is a pharmacologically inert vehicle. Excipients can be liquid or solid and give the desired bulk, consistency, etc. when the nucleic acid is combined with other ingredients of a certain pharmaceutical composition in view of the planned mode of administration. Selected as Typical pharmaceutical carriers include binders (eg pregelatinized corn starch, polyvinylpyrrolidone or hydroxypropylmethylcellulose); fillers (eg lactose and other sugars, microcrystalline cellulose, pectin, gelatin, calcium sulfate, Ethyl cellulose, polyacrylate or calcium hydrogen phosphate); lubricants (eg, magnesium stearate, talc, silica, colloidal silicon dioxide, stearic acid, metal stearates, hydrogenated vegetable oil, corn starch, polyethylene glycol, benzoic acid Sodium, sodium acetate, etc.); disintegrants (eg, starch, sodium starch glycolate, etc.); and wetting agents (eg, sodium lauryl sulfate, etc.), but are not limited thereto. .
[0160]
Pharmaceutically acceptable organic or inorganic excipients suitable for non-parenteral administration that do not deleteriously react with nucleic acids can also be used to formulate the compositions of the invention. . Suitable pharmaceutically acceptable carriers include water, salt solution, alcohol, polyethylene glycol, gelatin, lactose, amylose, magnesium stearate, talc, silicic acid, viscous paraffin, hydroxymethylcellulose, polyvinylpyrrolidone and the like. However, it is not limited to this.
[0161]
Formulations for topical administration of nucleic acids can include sterile and non-sterile aqueous solutions, non-aqueous solutions in common solvents such as alcohol, or solutions of nucleic acids in liquid or solid oil bases. These solutions may also contain buffering agents, diluents and other suitable additives. Pharmaceutically acceptable organic or inorganic excipients suitable for non-parenteral administration that do not deleteriously react with nucleic acids can be used.
[0162]
Suitable pharmaceutically acceptable excipients include water, salt solution, alcohol, polyethylene glycol, gelatin, lactose, amylose, magnesium stearate, talc, silicic acid, viscous paraffin, hydroxymethylcellulose, polyvinylpyrrolidone, etc. However, it is not limited to this.
[0163]
The compositions of the present invention may further contain other adjunct ingredients conventionally found in pharmaceutical compositions, at levels of use established in their art. Thus, for example, these compositions may contain additional compatible and pharmaceutically active materials such as antipruritics, astringents, local anesthetics or anti-inflammatory agents, or of the present invention Contains additional materials such as pigments, flavoring agents, preservatives, antioxidants, opacifiers, thickeners and stabilizers useful in physically formulating the various dosage forms of the composition. It's okay. However, such materials should not unduly interfere with the biological activity of the components of the composition of the present invention when added. These formulations are sterilized and, if desired, adjuvants that do not deleteriously react with one or more nucleic acids of the formulation, such as lubricants, preservatives, stabilizers, wetting agents, emulsifiers, osmotic pressure. It can be mixed with affecting salts, buffers, colorants, flavoring agents and / or fragrances and the like.
[0164]
Aqueous suspensions may contain substances that increase the viscosity of the suspension, including, for example, sodium carboxymethyl cellulose, sorbitol, and / or dextran. This suspension may also contain stabilizers.
[0165]
The compounds of the present invention may be other molecules, molecular structures or to aid uptake, distribution and / or absorption, such as, for example, liposomes, receptor targeting molecules, oral, rectal, topical or other formulations. It can also be mixed with a mixture of compounds, encapsulated, conjugated or otherwise associated. Representative US patents that teach the manufacture of formulations that aid in such uptake, distribution, and / or absorption include US Pat. Nos. 5,108,921, each incorporated herein by reference. 354,844; 5,416,016; 5,459,127; 5,521,291; 5,543,158; 5,547,932; 5,583 No. 020; No. 5,591,721; No. 4,426,330; No. 4,534,899; No. 5,013,556; No. 5,108,921; No. 5,213,804 No. 5,227,170; No. 5,264,221; No. 5,356,633; No. 5,395,619; No. 5,416,016; No. 5,417,978; No. 5,462,854; No. 5,469,854; No. 5,51 , 295; 5,527,528; 5,534,259; 5,543,152; 5,556,948; 5,580,575; and 5,595, 756 is included, but is not limited to this.
[0166]
The oligomeric compounds of the invention can be any pharmaceutically acceptable salt, ester, or salt of such an ester, or its biologically active metabolite or residue upon administration to an animal, including a human. Any other compound capable of providing (directly or indirectly). Thus, for example, this disclosure extends to prodrugs and pharmaceutically acceptable salts of compounds of the invention, pharmaceutically acceptable salts of such prodrugs, and other biological equivalents.
[0167]
The term “prodrug” refers to a therapeutic agent produced in an inactive form that is converted to the active form (ie, drug) in the body or in its cells by the action of endogenous enzymes or other chemicals and / or conditions. means. Specifically, prodrug versions of the oligonucleotides of the present invention are disclosed in Gosselin et al. Published WO 9/24510 or Imbach et al. Published WO 9/24564 and U.S. Pat. S. According to the method disclosed in US Pat. No. 5,770,713, it is produced as a SATA [(S-acetyl-2-thioethyl) phosphate] derivative.
[0168]
The term “pharmaceutically acceptable salts” refers to physiologically and pharmaceutically acceptable salts of the compounds of the invention, ie, those that retain the desired biological activity of the parent compound and are undesirable in it. It means a salt that does not give a positive effect.
[0169]
Pharmaceutically acceptable base addition salts are formed with metals or amines, such as alkali and alkaline earth metals or organic amines. Examples of metals used as cations are sodium, potassium, magnesium, calcium and the like. Examples of suitable amines are N, N′-dibenzylethylenediamine, chloroprocaine, choline, diethanolamine, dicyclohexylamine, ethylenediamine, N-methylglucamine and procaine (see, eg, Berge et al., “Pharmaceutical Salts,” J. of Pharma Sci., 1977, 66, 1-19). The base addition salt of this acidic compound is prepared by contacting the free acid form with a sufficient amount of the desired base in the conventional manner to produce a salt. The free acid form can be regenerated by contacting the salt form with the acid in a conventional manner and isolating the free acid. The free acid forms differ in certain physical properties, such as solubility in polar solvents, to some extent from their respective salt forms, but otherwise these salts are associated with each free acid for purposes of the present invention. equal. As used herein, “pharmaceutical addition salts” include the pharmaceutically acceptable salts of the acid forms of one component of the compositions of the invention. These include organic or inorganic acid salts of amines. Preferred acid salts are hydrochlorides, acetates, salicylates, nitrates and phosphates. Other suitable pharmaceutically acceptable salts are well known to those skilled in the art and include various inorganic or organic acids such as inorganic acids such as hydrochloric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid or phosphoric acid; Organic carboxylic acids, sulfonic acids, sulfo and phospho acids, or N-substituted sulfamic acids such as acetic acid, propionic acid, glycolic acid, succinic acid, maleic acid, hydroxymaleic acid, methylmaleic acid, fumaric acid Acid, malic acid, tartaric acid, lactic acid, oxalic acid, gluconic acid, glucaric acid, glucuronic acid, citric acid, benzoic acid, cinnamic acid, mandelic acid, salicylic acid, 4-aminosalicylic acid, 2-phenoxybenzoic acid, 2-acetoxy With benzoic acid, embonic acid, nicotinic acid or isonicotinic acid; and 20α-amino involved in natural protein synthesis Amino acids such as glutamic acid or aspartic acid, and also phenylacetic acid, methanesulfonic acid, ethanesulfonic acid, 2-hydroxyethanesulfonic acid, ethane-1,2-disulfonic acid, benzenesulfonic acid, 4-methyl With benzenesulfonic acid, naphthalene-2-sulfonic acid, naphthalene-1,5-disulfonic acid, 2- or 3-phosphoglyceric acid, glucose-6-phosphate, N-cyclohexylsulfamic acid (in the formation of cyclamate), Or basic salts such as with other acid organic compounds such as ascorbic acid. Pharmaceutically acceptable salts of the compounds can also be prepared with pharmaceutically acceptable cations. Suitable pharmaceutically acceptable cations are well known to those skilled in the art and include alkali, alkaline earth, ammonium and quaternary ammonium cations. Carbonates or bicarbonates are also possible.
[0170]
Preferred examples of pharmaceutically acceptable salts for oligomeric compounds include (a) salts formed with cations such as polyamines such as sodium, potassium, ammonium, magnesium, calcium, spermine and spermidine; ) Acid addition salts formed with inorganic acids such as hydrochloric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, phosphoric acid, nitric acid; (c) Organic acids such as acetic acid, oxalic acid, tartaric acid, succinic acid, maleic acid, fumaric Acid, gluconic acid, citric acid, malic acid, ascorbic acid, benzoic acid, tannic acid, palmitic acid, alginic acid, polyglutamic acid, naphthalenesulfonic acid, methanesulfonic acid, p-toluenesulfonic acid, naphthalenedisulfonic acid, polygalacturonic acid, etc. And (d) elemental anions such as chlorine, bromine and iodine. Salts formed include, but is not limited thereto.
[0171]
The materials, methods, and examples provided herein are for purposes of illustration and are not intended to limit the scope of the invention. All publications, patent applications, patents and other references cited herein are hereby incorporated by reference in their entirety. Unless otherwise noted, all technical and scientific terms have their art-recognized meanings.
[0172]
Example 1
5'-O-DMT-L-thymidine (2).
[0173]
Embedded image
Figure 2005504020
[0174]
Compound 1 (800 mg, 3.3 mmol, (Smejkal, J. et al. Collect.Czech. Chem. Commun. 1964,29,2809-2813 and Jung, ME et al. Tetrahedron Lett. 1998,39,4615-4618 Thus produced)) under high vacuum2O5Above dried at 40 ° C. overnight. It was then coevaporated with anhydrous pyridine (10 mL). The resulting residue was dissolved in pyridine (9 mL) under an argon atmosphere. 4-Dimethylaminopyridine (40 mg, 0.33 mmol) and DMT chloride (DMT-Cl, 1.33 g, 3.93 mmol) were added to the mixture and the reaction mixture was at room temperature until all starting material disappeared (12 h Agitation). Methanol (0.5 mL) was added and the solvent was removed in vacuo. The residue was separated by chromatography eluting with 6: 4 ethyl acetate: hexanes to give 2 (1.42 g, 79%).
Rf= 0.17 (with 6: 4 ethyl acetate: hexanes).
MS (ES+) M / z 543 (M-H).
[0175]
Example 2
5'-O-DMT-L-thymidine-3'-O-[(2-cyanoethyl) -N, N-diisopropyl phosphoramidite] (3).
Compound 2 (1.00 g, 1.84 mmol) was coevaporated with toluene (20 mL). To the residue was added N, N-diisopropylamine tetrazolide (0.16 g, 0.92 mmol) and P under high vacuum.2O5Above dried at 40 ° C. overnight. The dried reaction mixture was washed with anhydrous acetonitrile: CH2Cl2(9: 2 mL) and 2-cyanoethyl-N, N, N ′, N′-tetraisopropyl phosphoramidite (1.2 mL, 3.68 mmol) was added. The reaction mixture was stirred at ambient temperature for 4 hours under an inert atmosphere. The progress of the reaction was monitored by TLC (1: 1 hexane: ethyl acetate). The solvent was evaporated and the residue was dissolved in ethyl acetate (70 mL) and 5% aqueous NaHCO3.3Washed with (40 mL). The ethyl acetate layer was washed with anhydrous Na2SO4Dry above and concentrate. The resulting residue was separated by chromatography (3: 2 ethyl acetate: hexane as eluent) to give 3 as a foam (0.82 g, 60.3%).
Rf= 0.47 (3: 2 ethyl acetate: hexane).
31P NMR (CDCl3) Δ 149.98, 149.57 ppm;
MS (API-ES) m / z 743.3 (M-H)
[0176]
Example 3
5'-O-DMT-L-thymidine-3'-O-succinyl CPG (4).
Compound 2 (0.2 g, 0.37 mmol) was mixed with succinic anhydride (0.074 g, 0.73 mmol) and DMAP (0.023 g, 0.19 mmol). The mixture is dissolved in vacuum2O5Dried over night. To this, Cl-CH2-CH2-Cl (1.1 mL) and triethylamine (0.2 mL, 1.46 mmol) were added. The reaction mixture was heated at 60 ° C. for 2 hours. The reaction mixture is CH2Cl2Dilute with (20 mL) and wash with 5% aqueous citric acid (20 mL), water (20 mL) and brine (20 mL). The organic phase is anhydrous Na2SO4Dry above and concentrate in vacuo (0.22 g, 93%) to a foam.
Rf= 0.23 (CH2Cl2: 5% MeOH in MeOH).
The obtained residue was directly used in the next reaction.
[0177]
[Expression 1]
Figure 2005504020
[0178]
The succinyl derivative (0.19 g, 0.25 mmol) was dissolved in P2O5Above dried at 40 ° C. overnight. After adding anhydrous DMF (0.62 mL), 2- (1H-benzotriazol) -1-yl) -1,1,3,3-tetramethyluronium tetrafluoroborate (0.081 g, 0.25 mmol) And N-methylmorpholine (55 μL, 0.5 mmol) were added. Swirl to produce a clear solution. To this was added anhydrous DMF (2.4 mL) and active CPG (1.08 g, 115.2 mmol / g, particle size 120/200, average pore diameter 520 mm). Then it was shaken for 18 hours on a shaker. An aliquot was taken to estimate the load capacity. Filter the functionalized CPG, DMF, CH3CN and Et2Wash thoroughly with O. Dry overnight in vacuum. The functionalized CPG (3) was suspended in a capping solution (2 mL, CapA, acetic anhydride / lutidine / THF, 2 mL, CapB, N-methylimidazole / THF, Perspective Biosystems Inc.) and shaken on a shaker. And shake for 2 hours. Filter and CH3CN and Et2Washed with O. Dry in vacuum and load capacity was determined by standard methods. Final loading capacity 52.62 μmol / g.
[0179]
Example 4
5'-O-DMT-L-N4-Benzoyl-2'-deoxyadenosine-3'-O-[(2-cyanoethyl) -N, N-diisopropyl phosphoramidite] (5).
1-Chloro-5,3-bis (tolyl) -2-deoxy L-ribose [Jung, ME et al. Tetrahedron Lett. 1990, 31, 6983-6986; Gosselin, G. et al. Tetrahedron Lett. 1997 , 38, 4199-4202, Nucleosides & Nucleotides 1998, 17, 1731-1738]. This is then converted to N under Vorbruggen conditions.4-Coupled with benzoyladenine, N4Yields benzoyl-5 ', 3'-tolyl-1-adenosine. Deprotection of the tolyl group with methylamine yields L-adenosine. It is then subjected to N under temporary protection conditions in the presence of benzoyl chloride, TMSCl, pyridine and aqueous ammonia.4-Convert to benzoyl-L-adenosine. 5'-tritylation in the presence of DMTCl in pyridine and phosphitylation at the 3 'position yields compound 5.
[0180]
Example 5
5'-O-DMT-L-N4-Benzoyl-5-methyl-2'-deoxycytidine-3'-O-[(2-cyanoethyl) -N, N-diisopropyl phosphoramidite] (6)
Compound 2 is converted to 5′-O-DMT-L-5-methylcytidine according to the reference procedure [Divakar, KJ et al. J. Chem. Soc. Perk. Trans. 1 1982, 1171-1176]. . It is then applied according to the reference procedure [Bhat, V. et al. Nucleosides Nucleotides 1989, 8, 179-183].4-Convert to a benzoyl derivative. This is then phosphitylated at the 3 'position to yield compound 6.
[0181]
Example 6
5'-O-DMT-L-N2-Isobutyryl-2'-deoxyguanosine-3'-O-[(2-cyanoethyl) -N, N-diisopropyl phosphoramidite] (7)
1-Chloro-5,3-bis (tolyl) -2-deoxy L-ribose was synthesized from Jung, ME et al. Tetrahedron Lett. 1997, 38, 4199-4202 and Gosselin, G. et al. Nucleosides & Nucleotides 1998, Manufactured as described in 17,1731-1738. This is then 4-chloro-2-aminopyrrolo [2,3-d] pyrimidine [prepared according to the procedure described by Davoll, J. et al. J. Chem. Soc. 1960, 131-138] With NaH and acetonitrile [Ramasamy, K. et al. J. Hetrocyclic Chem., 1988, 25, 1893-1897]. This is then treated with aqueous ammonia at 80 ° C. to yield L-2′-deoxyguanosine. This is treated with L-N under temporary protection conditions in the presence of isobutyryl chloride, pyridine and TMSCl.2Convert to isobutyryl-2'-deoxyguanosine [Ti, G.S. et al. J. Am. Chem. Soc., 1982, 104, 1316-1319]. This is then reacted with 5'-O-DMT-L-N in the presence of DMTCl, DMAP and pyridine.2Conversion to isobutyryl-2'-deoxyguanosine followed by phosphitylation at the 3 'position to give compound 7.
[0182]
Example 7
5'-O-DMT-L-5- (1-propynyl) uridine-3'-O-[(2-cyanoethyl) -N, N-diisopropylphosphamidite] (8)
1-Chloro-5,3-bis (tolyl) -2-deoxy L-ribose was synthesized from Jung, ME et al. Tetrahedron Lett. 1997, 38, 4199-4202 and Gosselin, G. et al. Nucleosides & Nucleotides 1998, Manufactured as described in 17,1731-1738. This is then coupled with 5-iodouracil under Vorbruggen conditions to yield L-5- (iodo) -5 ', 3'-tolyl-1-uridine. This is then coupled with propyne (as described in Switzerland C. et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 1996, 6, 815-818) to give L-5- (propynyl) -5 ′, 3 ′. -Produces tolyluridine. Deprotection of the protecting groups at the 5 'and 3' positions yields L-5- (propynyl) uridine. This compound is converted to the 5'-O-DMT compound with DMTCl, DMAP and pyridine, followed by phosphitylation to give the title compound 8.
[0183]
Example 8
5'-O-DMT-L-5- (1-propynyl) cytidine-3'-O-[(2-cyanoethyl) -N, N-diisopropyl phosphoramidite] (9)
5′-O-DMT-L-5- (1-propynyl) uridine (prepared according to the procedure described for compound 7) was prepared according to the reference procedure [Divakar, KJ et al. J. Chem. Soc. Perk. Trans. 1 1982, 1171-1176] to convert to 5′-O-DMT-L-5- (1-propynyl) cytidine. This is phosphitylated to the 3 'position to give compound 9.
[0184]
Example 9
5′-O-DMT-L-3 (2-deoxy-β-D-erythropentofuranosyl) (9I) -1H-pyrimido [5,4-b] benzoxazine-2 (3H) -one-3 ′ -O-[(2-cyanoethyl) -N, N-diisopropyl phosphoramidite] (10)
L-5-bromouridine is obtained from 5-bromouridine and 1-chloro-5,3-bis (tolyl) -2-deoxy L-ribose under Vorbruggen conditions. This is obtained according to the reference procedure [Lin, KY. Et al J. Am. Chem. Soc. 1995, 117, 3873-3874, Matteucci, MD et al. 94-US10536], 5,3-bis (tolyl). Convert to -L-3 (2-deoxy-β-D-erythropentofuranosyl) (9I) -1H-pyrimido [5,4-b] benzoxazin-2 (3H) -one. This is then deprotected with methylamine, tritylated at the 5 'position, and phosphitylated at the 3' position to give compound 10.
[0185]
Example 10
5'-O-DMT-L-N4-Benzoyl-2'-deoxyadenosine-3'-O-succinyl CPG (11).
5'-O-DMT-L-N4-Benzoyl-2'-deoxyadenosine (prepared as described in the synthesis of compound 5) is converted to a 3'-O-succinyl derivative at 60 ° C in dichloroethane in the presence of succinic anhydride and DMAP. . This succinyl derivative is converted to an aminoalkyl CPG in DMF in the presence of 2- (1H-benzotriazol) -1-yl) -1,1,3,3-tetramethyluronium tetrafluoroborate and N-methylmorpholine. Coupling yields compound 11.
[0186]
Example 11
5'-O-DMT-L-N4-Benzoyl-5-methyl-2'-deoxycytidine-3'-O-succinyl CPG (12).
5'-O-DMT-L-N4-Benzoyl-5-methyl-2'-deoxycytidine (prepared as described in the synthesis of compound 6) 3'-O-succinyl at 60 ° C in dichloroethane in the presence of succinic anhydride and DMAP Convert to derivative. This succinyl derivative is converted to an aminoalkyl CPG in DMF in the presence of 2- (1H-benzotriazol) -1-yl) -1,1,3,3-tetramethyluronium tetrafluoroborate and N-methylmorpholine. Coupling yields compound 12.
[0187]
Example 12
5'-O-DMT-L-N2-Isobutyryl-2'-deoxyguanosine-3'-O-succinyl CPG (13).
5'-O-DMT-L-N2-Isobutyryl-2'-deoxyguanosine (prepared as described in the synthesis of compound 7) is converted to a 3'-O-succinyl derivative in dichloroethane in the presence of succinic anhydride and DMAP at 60 ° C. . This succinyl derivative is converted to an aminoalkyl CPG in DMF in the presence of 2- (1H-benzotriazol) -1-yl) -1,1,3,3-tetramethyluronium tetrafluoroborate and N-methylmorpholine. Coupling yields compound 13.
[0188]
Example 13
5'-O-DMT-L-5- (1-propynyl) uridine-3'-O-succinyl CPG (14).
5′-O-DMT-L-5- (1-propynyl) uridine (prepared as described in the synthesis of compound 8) was prepared at 60 ° C. in dichloroethane in the presence of succinic anhydride and DMAP at 3 ° C. Convert to the '-O-succinyl derivative. This succinyl derivative is converted to an aminoalkyl CPG in DMF in the presence of 2- (1H-benzotriazol) -1-yl) -1,1,3,3-tetramethyluronium tetrafluoroborate and N-methylmorpholine. Coupling yields compound 14.
[0189]
Example 14
5'-O-DMT-L-5- (1-propynyl) cytidine-3'-O-succinyl CPG (15).
5′-O-DMT-L-5- (1-propynyl) cytidine (prepared as described in the synthesis of compound 8) was prepared at 60 ° C. in dichloroethane in the presence of succinic anhydride and DMAP at 3 ° C. Convert to the '-O-succinyl derivative. This succinyl derivative is converted to an aminoalkyl CPG in DMF in the presence of 2- (1H-benzotriazol) -1-yl) -1,1,3,3-tetramethyluronium tetrafluoroborate and N-methylmorpholine. Coupling yields compound 15.
[0190]
Example 15
5′-O-DMT-L-3 (2-deoxy-β-D-erythropentofuranosyl) (9I) -1H-pyrimido [5,4-b] benzoxazine-2 (3H) -one-3 ′ -O-succinyl CPG (16).
5′-O-DMT-L-3 (2-deoxy-β-D-erythropentofuranosyl) (9I) -1H-pyrimido [5,4-b] benzoxazin-2 (3H) -one (compound 10 Is converted to the 3′-O-succinyl derivative in dichloroethane in the presence of succinic anhydride and DMAP at 60 ° C. This succinyl derivative is converted to an aminoalkyl CPG in DMF in the presence of 2- (1H-benzotriazol) -1-yl) -1,1,3,3-tetramethyluronium tetrafluoroborate and N-methylmorpholine. Coupling yields compound 16.
[0191]
Example 16
Synthesis of oligonucleotides containing L-thymidine modifications
Amidite 3 was dissolved in anhydrous acetonitrile to produce a 0.1M solution and loaded into the Expedite Nucleic Acid Synthesis system (Millipore 8909) to synthesize oligonucleotides. Coupling efficiency exceeded 98%. For the coupling of the modified amidite (3), the coupling time was extended to 10 minutes and this step was performed twice. All other steps in the protocol supplied by Millipore were used as is. After completion of synthesis, CPG was suspended in aqueous ammonia (30 wt%) at room temperature for 2 hours to deprotect the oligonucleotide from CPG. CPG was filtered and the filtrate was heated at 55 ° C. for 6 hours to complete the deprotection of all protecting groups. After removing the ammonia with a speed vac concentrator, the product was subjected to high performance liquid chromatography (HPLC, Waters, C-4, 7.8 × 300 mm, A = 50 mM triethylammonium acetate, pH = 7, B = acetonitrile, Purified by 5-60% B, flow rate 2.5 mL / min, λ = 260 nm within 55 minutes. After detritylation with aqueous 80% acetic acid and evaporation, desalting by HPLC on a Waters C-4 column yielded 2'-modified oligonucleotides (Table I). Oligonucleotides were analyzed by HPLC, CGE and mass spectrometry.
[0192]
Example 17
[0193]
[Table 1]
Figure 2005504020
[0194]
T*= L-thymidine, all P = S, Co= 2'-O-MOE5MeC, Ao= 2'-O-MOE A, To= 2'-O-MOE5MeU, Go= 2'-O-MOE G,aWaters C-4, 3.9 × 300 mm, solvent A = 50 mm TEAAc, pH 7; solvent B = CH3CN; gradient of 5-60% B within 55 minutes; flow rate 1.5 mL / min, λ = 260 nm.
[0195]
Example 18
[0196]
[Table 2]
Figure 2005504020
[0197]
T*= L-thymidine, all P = S, Co= 2'-O-MOE5MeC, Ao= 2'-O-MOE A, To= 2'-O-MOE5MeU, Go= 2'-O-MOE G.
In order to overcome the binding affinity loss due to L-isomer configuration, we also include 2′-O-MOE (2′-O- (2-methoxyethyl)) modifications in L / D-chimeras. And the binding affinity of the resulting chimeric compound to the RNA target was evaluated. Tm analysis showed that inclusion of 2'-O-MOE modification with L-thymidine in the chimera compensated for the affinity loss by L-thymidine for RNA binding. Thus, a designer oligonucleotide construct consisting of an L-thymidine cap in combination of 2'-O-MOE and 2'-deoxyphosphorothioate provides favorable properties for a superior antisense oligonucleotide drug.
[0198]
Example 19
[0199]
[Table 3]
Figure 2005504020
[0200]
C*= L-cytidine, A*= L-adenosine, all P = S, Co= 2'-O-MOE5MeC, Ao= 2'-O-MOE A, To= 2'-O-MOE5MeU, Go= 2'-O-MOE G.
[0201]
Example 20
L-nucleosides having novel nucleobases and oligonucleotides derived therefrom
[0202]
Embedded image
Figure 2005504020
[0203]
Example 21
5'-O-DMT-2 ', 3'-dideoxy-N4-[4- (CPG-succinyl) methyl ester] benzoyl cytidine (29).
2 ′, 3′-dideoxycytidine 26 [prepared by the reference procedure of Horwitz, JP et al. J. Org. Chem. 1967, 32,817-818] was prepared in the presence of TBDMSCl and pyridine 5′-O—. Convert to silyl derivative. This is then treated with 4- (hydroxymethyl) benzoyl chloride in pyridine to give compound 27 (Scheme 3). Compound 27 is treated with succinic anhydride and DMAP in 1,2-dichloroethane to give the succinyl derivative. This succinyl derivative is coupled with aminoalkyl CPG in the presence of TBTU and 4-methylmorpholine in DMF to give compound 28. Compound 28 is desilylated with triethylamine trihydrofluoride and triethylamine in THF. It is then tritylated with DMTCl and DMAP in pyridine to give compound 29.
[0204]
Scheme 3
[0205]
Embedded image
Figure 2005504020
[0206]
Example 22
5'-O-DMT-2 ', 3'-dideoxy-N4-[4- (CPG-succinyl) methyl ester] benzoyl adenosine (33).
2 ′, 3′-dideoxyadenosine 30 [prepared by the reference procedure of Horwitz, JP et al. J. Org. Chem. 1967, 32,817-818] Convert to silyl derivative. This is then treated with 4- (hydroxymethyl) benzoyl chloride in pyridine to give compound 31 (Scheme 4). Compound 31 is treated with succinic anhydride, DMAP in 1,2-dichloroethane to give the succinyl derivative. This succinyl derivative is coupled with aminoalkyl CPG in the presence of TBTU and 4-methylmorpholine in DMF to give compound 32. Compound 32 is desilylated with triethylamine trihydrofluoride and triethylamine in THF. It is then tritylated with DMT chloride and DMAP in pyridine to give compound 33.
[0207]
Scheme 4
[0208]
Embedded image
Figure 2005504020
[0209]
Example 23
Synthesis of 2 ', 3'-dideoxy oligonucleotides
Oligonucleotides 34 (SEQ ID NO: 16) and 35 (SEQ ID NO: 17) were converted to solid supports 29 and 33 according to the procedure used for the synthesis of compounds 17-25 (SEQ ID NO: 8-15). Are manufactured using each.
[0210]
Example 24
[0211]
[Table 4]
Figure 2005504020
[0212]
C*= 2, -3'-dideoxycytidine, A*= 2, -3'-dideoxyadenosine, all P = S, Co= 2'-O-MOE5MeC, Ao= 2'-O-MOE A, To= 2'-O-MOE5MeU, Go= 2'-O-MOE G.
[0213]
Example 25
5'-O-DMT-2 ', 3'-dideoxy-2', 3'-didehydro-N4-[4- (CPG-succinyl) methyl ester] benzoyl cytidine (39).
2 ′, 3′-dideoxy-2 ′, 3′-didehydrocytidine 36 [prepared according to the procedure reported in Chu, CK et al. J. Org. Chem. 1989, 54, 217-225] In pyridine in the presence of 5'-O-silyl derivatives. This is then treated with 4- (hydroxymethyl) benzoyl chloride in pyridine to give compound 37 (Scheme 5). Compound 37 is treated with succinic anhydride, DMAP in 1,2-dichloroethane to give the succinyl derivative. This succinyl derivative is coupled with aminoalkyl CPG in the presence of TBTU and 4-methylmorpholine in DMF to give compound 38. Compound 38 is desilylated with triethylamine trihydrofluoride and triethylamine in THF. It is then tritylated with DMT chloride and DMAP in pyridine to give compound 39.
[0214]
Scheme 5
[0215]
Embedded image
Figure 2005504020
[0216]
Example 26
5'-O-DMT-2 ', 3'-didehydro-2', 3'-dideoxy-N4-[4- (CPG-succinyl) methyl ester] benzoyl adenosine (43).
2 ', 3'-dideoxy-2', 3'-didehydroadenosine 40 [prepared according to the procedure reported in Chu, CK et al. J. Org. Chem. 1989, 54, 217-225] And converted to a 5′-O-silyl derivative in the presence of pyridine. This is then treated with 4- (hydroxymethyl) benzoyl chloride in pyridine to give compound 41 (Scheme 6). Compound 41 is treated with succinic anhydride, DMAP in 1,2-dichloroethane to give the succinyl derivative. This succinyl derivative is coupled with aminoalkyl CPG in the presence of TBTU and 4-methylmorpholine in DMF to give compound 42. Compound 42 is desilylated with triethylamine trihydrofluoride and triethylamine in THF. It is then tritylated with DMTCl and DMAP in pyridine to give compound 43.
[0217]
Scheme 6
[0218]
Embedded image
Figure 2005504020
[0219]
Example 27
[0220]
[Table 5]
Figure 2005504020
[0221]
C*= 2,3'-didehydro-2 ', 3'-dideoxycytidine, A*= 2,3'-didehydro-2 ', 3'-dideoxyadenosine, all P = S, Co= 2'-O-MOE5MeC, Ao= 2'-O-MOE A, To= 2'-O-MOE5MeU, Go= 2'-O-MOE G.
[0222]
Example 28
5'-O-DMT-2 ', 3'-dideoxy-2'-fluoro-N4-[4- (CPG-succinyl) methyl ester] benzoyl cytidine (50).
2 ′, 3′-dideoxy-2′-fluorouridine 46 [prepared as reported in Martin JA et al. J. Med. Chem. 1990, 33, 2137-2145] was used in the reported procedure [ Reference: Divakar, KJ et al. J. Chem. Soc. Perk. Trans. 1 1982, 1171-1176] to convert to 2 ′, 3′-dideoxy-2′-fluorocytidine 47 (Scheme 7) . Compound 47 is converted to a 5'-O-silyl derivative in the presence of TBDMSCl and pyridine. This is then treated with 4- (hydroxymethyl) benzoyl chloride in pyridine to give compound 48. Compound 48 is treated with succinic anhydride, DMAP in 1,2-dichloroethane to give the succinyl derivative. This succinyl derivative is coupled with aminoalkyl CPG in the presence of TBTU and 4-methylmorpholine in DMF to give compound 49. Compound 49 is desilylated with triethylamine trihydrofluoride and triethylamine in THF. It is then tritylated with DMTCl and DMAP in pyridine to give compound 50.
[0223]
Scheme 7
[0224]
Embedded image
Figure 2005504020
[0225]
Example 29
[0226]
[Table 6]
Figure 2005504020
[0227]
C*= 2 ', 3'-dideoxy-2'-fluorocytidine, all P = S, Co= 2'-O-MOE5MeC, Ao= 2'-O-MOE A, To= 2'-O-MOE5MeU, Go= 2'-O-MOE G.
[0228]
Example 30
5'-O-DMT-2 ', 3'-deoxy-3'-fluoro-N4-[4- (CPG-succinyl) methyl ester] benzoyl cytidine (56).
2 ′, 3′-dideoxy-3′-fluorouridine 52 [prepared according to the procedure reported in Zaitseva, GV et al. Bioorg. Khim. 1988, 14, 1275-1281] Reference: Divakar, KJ et al. J. Chem. Soc. Perk. Trans. 1 1982, 1171-1176] to convert to 2 ′, 3′-dideoxy-3′-fluorocytidine 53 (Scheme 8) . Compound 53 is converted to a 5'-O-silyl derivative in the presence of TBDMSCl and pyridine. This is then treated with 4- (hydroxymethyl) benzoyl chloride in pyridine to give compound 54. Compound 54 is treated with succinic anhydride, DMAP in 1,2-dichloroethane to give the succinyl derivative. This succinyl derivative is coupled with aminoalkyl CPG in the presence of TBTU and 4-methylmorpholine in DMF to give compound 55. Compound 55 is desilylated with triethylamine trihydrofluoride and triethylamine in THF. It is then tritylated with DMT chloride and DMAP in pyridine to give compound 56.
[0229]
Scheme 8
[0230]
Embedded image
Figure 2005504020
[0231]
Example 31
[0232]
[Table 7]
Figure 2005504020
[0233]
C*= 2 ', 3'-dideoxy-3'-fluorocytidine, all P = S, Co= 2'-O-MOE5MeC, Ao= 2'-O-MOE A, To= 2'-O-MOE5MeU, Go= 2'-O-MOE G.
[0234]
Example 32
5'-O-DMT-3'-deoxy-2'-O- [2- (methoxy) ethyl] -N4-[4- (CPG-succinyl) methyl ester] benzoyl cytidine (62).
5'-O-TBDMS-N4-Benzoyl-5-methylcytidine 58 is synthesized according to the reference procedure [Reese, C.B. et al. Tetrahedron Lett. 1999, 55, 5635-5640]. Compound 58 is then converted to 59 according to the reported procedure [Danel, K. et al. J. Med. Chem. 1996, 39, 2427-2431]. Compound 59 is converted to a 5'-O-silyl derivative in the presence of TBDMSCl and pyridine. This is then treated with 4- (hydroxymethyl) benzoyl chloride in pyridine to give compound 60. Compound 60 is treated with succinic anhydride, DMAP in 1,2-dichloroethane to give the succinyl derivative. This succinyl derivative is coupled with aminoalkyl CPG in the presence of TBTU and 4-methylmorpholine in DMF to give compound 61. Compound 61 is desilylated with triethylamine trihydrofluoride and triethylamine in THF. It is then tritylated with DMTCl and DMAP in pyridine to give compound 62.
[0235]
Scheme 9
[0236]
Embedded image
Figure 2005504020
[0237]
Example 33
[0238]
[Table 8]
Figure 2005504020
[0239]
C*= 3'-deoxy-2'-O- [2- (methoxy) ethyl] -5-methylcytidine, all P = S, Co= 2'-O-MOE5MeC, Ao= 2'-O-MOE A, To= 2'-O-MOE5MeU, Go= 2'-O-MOE G.
[0240]
Example 34
N-trifluoroacetylpyrrolidine-2- (DMT) methanol-3-O-[(2-cyanoethyl) -N, N-diisopropyl phosphoramidite] (67).
Compound 64 is synthesized according to reference procedures [Huwe, C.M. et al. Synthesis, 1997, 1,61-67]. It is then converted to the trifluoromethyl derivative 65 in the presence of ethyl trifluoroacetate in ethanol. Compound 65 is tritylated to yield compound 66. Compound 66 is phosphitylated to give compound 67.
[0241]
Example 35
3-O- (CPG-succinyl) -N-trifluoroacetylpyrrolidine-2- (DMT) methanol (68).
Compound 66 is treated with succinic anhydride, DMAP in 1,2-dichloroethane to give the succinyl derivative. This succinyl derivative is coupled with aminoalkyl CPG in the presence of TBTU and 4-methylmorpholine in DMF to yield compound 68.
[0242]
Scheme 10
[0243]
Embedded image
Figure 2005504020
[0244]
Example 36
[0245]
[Table 9]
Figure 2005504020
[0246]
B*= 3-hydroxy-2-pyrrolidinemethanol, all P = S, Co= 2'-O-MOE5MeC, Ao= 2'-O-MOE A, To= 2'-O-MOE5MeU, Go= 2'-O-MOE G.
[0247]
Example 37
1- [2- (O-Succinyl CPG) -1- [2-hydroxy-1- (O-DMT-methyl) ethoxy] ethyl] cytosine (76).
Compound 73 is prepared according to the reported procedure (Scheme 11) [reference: Bessodes, M. et al. Tetrahedron Lett. 1985, 26 (10), 1305-1306]. This was converted to a silylated compound in the presence of 1,3-dichloro-1,1,3,3-tetraisopropyldisiloxane in pyridine, and the exocyclic amino group was benzoylated with benzoic anhydride in DMF. This yields compound 74. Compound 74 is succinylated to give a succinyl derivative. This succinyl derivative is coupled with aminoalkyl CPG in the presence of TBTU and 4-methylmorpholine in DMF to give compound 75. This is desilylated and tritylated to yield compound 76.
[0248]
Scheme 11
[0249]
Embedded image
Figure 2005504020
[0250]
Example 38
1- [2-O- (acetyl) -1- [2-[(2-cyanoethyl) -N, N-diisopropylphosphoramidite] -1- (O-DMT-methyl) ethoxy] ethyl] cytosine (79) .
Compound 73 is silylated with 1,3-dichloro-1,1,3,3-tetraisopropyldisiloxane in pyridine to yield compound 77. This is then acetylated with acetyl chloride in pyridine to yield compound 78. Compound 78 was prepared using TEA. Desilylate with 3HF and TEA. This is tritylated with DMTCl, DMAP and pyridine followed by phosphitylation to give compound 79.
[0251]
Scheme 12
[0252]
Embedded image
Figure 2005504020
[0253]
Example 39
[0254]
[Table 10]
Figure 2005504020
[0255]
C*= 1- [2-hydroxy-1- [2-hydroxy-1- (hydroxymethyl) ethoxy] ethylcytosine, all P = S, Co= 2'-O-MOE5MeC, Ao= 2'-O-MOE A, To= 2'-O-MOE5MeU, Go= 2'-O-MOE G.
[0256]
Example 40
1- [2-O- (acetyl) -1- [2-[(2-cyanoethyl) -N, N-diisopropylphosphoramidite] -1- (O-DMT-methyl) thioethyl] ethyl] cytosine (86) .
Compound 82 is synthesized according to the reference procedure [Nake, T. et al. J. Am. Chem. Soc. 2000, 122, 7233-7243]. This is converted to 83, followed by the reported procedure for cleavage of vicinal diol, followed by reduction of the aldehyde thus obtained [Bessodes, M. et al. Tetrahedron Lett. 1985, 26 (10) , 1305-1306]. Compound 83 is silylated with 1,3-dichloro-1,1,3,3-tetraisopropyldisiloxane in pyridine to yield compound 84. This is then acetylated with acetyl chloride in pyridine to yield compound 85. Compound 85 was prepared from TEA. Desilylate with 3HF and TEA. This is tritylated with DMTCl, DMAP and pyridine followed by phosphitylation to give compound 86.
[0257]
Scheme 13
[0258]
Embedded image
Figure 2005504020
[0259]
Example 41
1- [2- (O-Succinyl-CPG) -1- [2-hydroxy-1- (O-DMT-methyl) thioethyl] ethyl] cytosine (89).
Compound 83 was converted to a silylated compound in the presence of 1,3-dichloro-1,1,3,3-tetraisopropyldisiloxane in pyridine and then the exocyclic amino group was benzoylated with benzoic anhydride in DMF. To yield compound 87. Compound 87 is succinylated to give a succinyl derivative. This succinyl derivative is coupled with aminoalkyl CPG in the presence of TBTU and 4-methylmorpholine in DMF to give compound 88. This is desilylated and then tritylated to yield compound 89.
[0260]
Scheme 14
[0261]
Embedded image
Figure 2005504020
[0262]
Example 42
[0263]
[Table 11]
Figure 2005504020
[0264]
C*= 1- [2-hydroxy-1- [2-hydroxy-1- (hydroxymethyl) thioethyl] ethylcytosine, all P = S, Co= 2'-O-MOE5MeC, Ao= 2'-O-MOE A, To= 2'-O-MOE5MeU, Go= 2'-O-MOE G.
[0265]
Example 43
5'-O-DMT-2 ', 3'-dideoxy-3'-(N-acetyl) amino-N4-[4- (CPG-succinyl) methyl ester] benzoyl cytidine (95).
Compound 92 is prepared according to procedures reported in the literature (reference: Krenitsky, T.A. etal. J. Med. Chem. 1983, 26 (6), 891-895). This is then selectively tritylated with DMTCl and pyridine to give a 5'-O-DMT derivative, which is acetylated to give the acetylated product. N4The acetyl group at the position is selectively removed with aqueous ammonia at room temperature to yield compound 93. This is then treated with 4- (hydroxymethyl) benzoyl chloride in pyridine to give compound 94. Compound 94 is treated with succinic anhydride, DMAP in 1,2-dichloroethane to give the succinyl derivative. This succinyl derivative is coupled with aminoalkyl CPG in the presence of TBTU and 4-methylmorpholine in DMF to give compound 95.
[0266]
Scheme 15
[0267]
Embedded image
Figure 2005504020
[0268]
Example 44
[0269]
[Table 12]
Figure 2005504020
[0270]
C*= 2 ', 3'-dideoxy-3'-(amino) cytidine, all P = S, Co= 2'-O-MOE5MeC, Ao= 2'-O-MOE A, To= 2'-O-MOE5MeU, Go= 2'-O-2'-O-MOE G.
[0271]
Example 45
5'-O-DMT-2'-deoxy-3'-S-phenyl-3'-thio-N4-[4- (CPG-succinyl) methyl ester] benzoyl cytidine (101).
2′-deoxy-3′-S-phenyl-3′-thiouridine 97 [prepared as reported in Kawakami, H. et al. Heterocycles, 1991, 32 (12), 2451-2470] was reported Convert to 2′-deoxy-3-S-phenyl-3-thiocytidine 98 (Scheme 7) according to the procedure [Divakar, KJ et al. J. Chem. Soc. Perk. Trans. 1 1982, 1171-1176]. . Compound 98 is converted to a 5'-O-silyl derivative in the presence of TBDMSCl and pyridine. This is then treated with 4- (hydroxymethyl) benzoyl chloride in pyridine to give compound 99. Compound 99 is treated with succinic anhydride, DMAP in 1,2-dichloroethane to give the succinyl derivative. This succinyl derivative is coupled with aminoalkyl CPG in the presence of TBTU and 4-methylmorpholine in DMF to give compound 100. Compound 100 is desilylated with triethylamine trihydrofluoride and triethylamine in THF. It is then tritylated with DMTCl and DMAP in pyridine to give compound 101.
[0272]
Scheme 16
[0273]
Embedded image
Figure 2005504020
[0274]
Example 46
[0275]
[Table 13]
Figure 2005504020
[0276]
C*= 2'-deoxy-3'-S-phenyl-3'-thiocytidine, all P = S, Co= 2'-O-MOE5MeC, Ao= 2'-O-MOE A, To= 2'-O-MOE5MeU, Go= 2'-O-2'-O-MOE G.
[0277]
Example 47
5'-O-DMT-3'-deoxy-2'-S-phenyl-2'-thio-N4-[4- (CPG-succinyl) methyl ester] benzoyl cytidine (107).
3′-deoxy-2′-S-phenyl-2′-thiouridine 103 [prepared as reported in Kawakami, H. et al. Heterocycles, 1991, 32 (12), 2451-2470] was reported Convert to 2 ′, 3′-dideoxy-2′-fluoro cytidine 104 (Scheme 17) according to the procedure [Divakar, KJ et al. J. Chem. Soc. Perk. Trans. 1 1982, 1171-1176]. Compound 104 is converted to a 5'-O-silyl derivative in the presence of TBDMSCl and pyridine. This is then treated with 4- (hydroxymethyl) benzoyl chloride in pyridine to give compound 105. Compound 105 is treated with succinic anhydride, DMAP in 1,2-dichloroethane to give the succinyl derivative. This succinyl derivative is coupled with aminoalkyl CPG in the presence of TBTU and 4-methylmorpholine in DMF to give compound 106. Compound 106 is desilylated with triethylamine trihydrofluoride and triethylamine in THF. It is then tritylated with DMTCl and DMAP in pyridine to give compound 107.
[0278]
Scheme 17
[0279]
Embedded image
Figure 2005504020
[0280]
Example 48
[0281]
[Table 14]
Figure 2005504020
[0282]
C*= 3'-deoxy-2'-S-phenyl-2'-thiocytidine, all P = S, Co= 2'-O-MOE5MeC, Ao= 2'-O-MOE A, To= 2'-O-MOE5MeU, Go= 2'-O-2'-O-MOE G.
[0283]
Example 49
5'-O-DMT-1 [2,3-deoxy-2-N-morpholino-β-D-glycero-pent-2-enofuranosyl] -cytosine-N4-[4- (CPG-succinyl) methyl ester] benzoyl (113).
1 [2,3-deoxy-2-N-morpholino-β-D-glycero-pent-2-enofuranosyl] uracil 109 [Kandasamy, S. et al. Tetrahedron, 1996, 52 (13), 4877-4882 2 ′, 3′-dideoxy-2 according to the reported procedure [Divakar, KJ et al. J. Chem. Soc. Perk. Trans. 1 1982, 1171-1176]. Convert to '-Fluorocytidine 110 (Scheme 18). Compound 110 is converted to a 5'-O-silyl derivative in the presence of TBDMSCl and pyridine. This is then treated with 4- (hydroxymethyl) benzoyl chloride in pyridine to give compound 111. Compound 111 is treated with succinic anhydride, DMAP in 1,2-dichloroethane to give the succinyl derivative. This succinyl derivative is coupled with aminoalkyl CPG in the presence of TBTU and 4-methylmorpholine in DMF to give compound 112. Compound 112 is desilylated with triethylamine trihydrofluoride and triethylamine in THF. It is then tritylated with DMT chloride and DMAP in pyridine to give compound 113.
[0284]
Scheme 18
[0285]
Embedded image
Figure 2005504020
[0286]
Example 50
[0287]
[Table 15]
Figure 2005504020
[0288]
C*= 1 [2,3-deoxy-2-N-morpholino-β-D-glyceropent-2-enofuranosyl] cytosine, all P = S, Co= 2'-O-MOE5MeC, Ao= 2'-O-MOE A, To= 2'-O-MOE5MeU, Go= 2'-O-2'-O-MOE G.
[0289]
Example 51
Preparation of CPG resin substituted with 9- (aminoethoxy) phenoxazine nucleoside (G-clamp), G-clamp succinate 154
2′-Deoxynucleoside G-clamp (Compound 152, 0.51 g, 0684 mmol) was dried in vacuo at 50 ° C. overnight and then dissolved in anhydrous DCM / Pyr (5: 1) to give 0.103 g (1 0.03 mmol) of succinic anhydride was added to the solution. Then 41.5 mg (0.34 mmol) DMAP in 1 mL DMF was added and the mixture was stirred overnight. After completion of the reaction (TLC), the solvent was evaporated in vacuo and the remaining yellow oil was dissolved in DCM and 10% aqueous NaHCO 3.3Washed twice with 10% aqueous citric acid and brine. Na2SO4After drying above, the organic phase was evaporated in vacuo to yield a yellow solid (0.45 g, 75%).
MS (HR-FAB) m / z 897.256 (M + Na)+.
[0290]
Embedded image
Figure 2005504020
[0291]
Example 52
G-clamp-succinyl-LCAA-CPG156
131 mg (0.15 mmol) of G-clamp succinate was dissolved in DMF and 68 μL (0.4 mmol) DIEA was added. A 57 mg (0.15 mmol) HATU solution in DMF was then added to the mixture with stirring. To pre-activate, stirring was continued for about 1 minute, after which the mixture was added to 1 g LCAA-CPG (initial load capacity: 115 μmol / g) and the suspension was shaken overnight. The resin is then washed with DMF, DCM and CH, respectively.3Capping the unreacted amino groups of the resin by washing 3 times with CN and shaking the resin with 0.24 mL (2 mmol) ethyl trifluoroacetate and 0.28 ml (2 mmol) TEA in 5 ml MeOH. did. Finally, the resin is MeOH, CH3Washed with CN and DCM and dried in vacuo. The loading capacity with G-clamp succinate was determined by DMT assay (final loading capacity: 65 μmol / g).
[0292]
Example 53
2'-deoxyphenoxazine CPG
2'-deoxyphenoxazine CPG was synthesized according to the procedure shown in Example 52 above.
[0293]
Example 54
Oligonucleotide synthesis
Solid phase synthesis of oligonucleotides containing G-clamp and phenoxazine units was performed using standard phosphoramidite chemistry and Applied Biosystems (Perkin Elmer Corp.) DNA / RNA synthesizer 380B. Oligonucleotide cleavage and deprotection is achieved with 40% aqueous MeNH2And 28-30% aqueous NH3A (1: 1) solution was used at room temperature for 4 hours. Oligonucleotides were purified by reverse phase HPLC using a 306 Piston Pump System, 811C Dynamic Mixer, 170 Diode Array Detector and 215 Liquid Handler with Unipoint Software from Gilson (Middleton, Wi). The HPLC conditions were as follows: Column: Waters Deltapak C18Reverse phase (300 × 3.9 mm, 15 μ, 300 mm); Solvent A: H20.1M NH in O4OAc; Solvent B: CH3CN / H20.1M NH in O (80:20)4OAc; Gradient: 0-40 min 0-50% B. After chromatographic purification, the oligonucleotides were desalted by RP-HPLC, lyophilized and stored at -20 ° C.
[0294]
Example 55
Guanidinylation to solid supports
As outlined in Scheme 21, the inventor introduced the guanidinium moiety using two different strategies. One strategy is to perform guanidinylation of the solid support (A) after selectively protecting the primary amino group. In the case of the 2'-O- (aminohexyl) functional group, the oligonucleotide attached to the support is 1.2M nBuNH in THF.2/ 10 mg Pd in HCOOH solution2[(Ph-CH = CH)2CO]3And 26 mg P (Ph)3Allyloxycarbonyl (Alloc) protecting group was selectively removed by treatment with 1.0 mL of the solution at 50 ° C. for 1.5 hours. After removal of Alloc, the oligonucleotides bound to these supports were washed with DCM, acetone, sodium N, N-diethyldithiocarbamate (ddcNa+), H2Washed with O, acetone, DCM, diethyl ether and dried in vacuo. Prior to guanidinylation, the resin was suspended in a 10% DIEA solution in DMF, shaken for 5 minutes and washed with DMF and then with DCM. Next, a 1.0 M solution of DIEA and 1H-pyrazole-1-carboxamidine hydrochloride in DMF was added to the oligonucleotides bound to the support and the suspension was shaken at room temperature for 5 hours. For final deprotection and cleavage of the oligonucleotide, the resin was treated with concentrated aqueous ammonia at 55 ° C. for 1 hour. After separation from the CPG support and evaporation of ammonia, the aqueous solution was filtered through a 0.45 μm nylon 66 filter and stored frozen at −20 ° C. for further analysis.
[0295]
Scheme 20
[0296]
Embedded image
Figure 2005504020
[0297]
Scheme 20.
Modified nucleotide 2'-O- (guanidinylhexyl) -5-methyluridine (A); 9-guanidinylethoxyphenoxazine nucleotide (B)
[0298]
Embedded image
Figure 2005504020
[0299]
Scheme 21.
(A) Reaction conditions: (i) 1.2M nBuNH in THF2/ 10 mg Pd in HCOOH2[(Ph-CH = CH)2CO]326 mg P (Ph)31.0 mL, 50 ° C., 1.5 hours; (ii) DCM, acetone, sodium N, N-diethyldithiocarbamate (ddtcNa+), H2Wash with O, acetone, DCM, diethyl ether; (iii) 1.0 M 1H-pyrazole-1-carboxamidine hydrochloride and DIEA in DMF, room temperature, 5 h.
(B) (i) 40% aqueous CH3-NH2/ Concentrated aqueous NH3(1: 1), 55 ° C., 1 hour; (ii) 1.0 M aqueous Na2CO3Medium 1.0 M 1H-pyrazole-1-carboxamidine hydrochloride, 3 hours at room temperature for ON-3, ON-4 and 12 hours at 55 ° C. for ON-5, ON-6, respectively.
[0300]
Example 56
Guanidinylation of fully deprotected oligonucleotides in solution.
The base reactive trifluoroacetyl group (Tfa) is compatible with oligonucleotide synthesis and deprotection conditions and was selected for protection of the primary amino group of the G-clamp. After deprotecting the oligonucleotide and cleaving from the solid support, 40% aqueous CH3-NH2And guanidinylation by using a 1: 1 mixture of concentrated aqueous ammonia (AMA), which prevents the formation of acyl- or acrylonitrile adducts with highly nucleophilic primary amino groups. To avoid transamination at cytosine during the deprotection step, N-acetyl protected C was used in oligonucleotide synthesis instead of N-benzoyl protected C. After these oligomers were purified by RP-HPLC and analyzed by ES-MS, the oligonucleotides were washed with 2 mL 1.0 M aqueous Na2CO3The primary amino group of the G-clamp was guanidinylated by treatment with 1-2 μmol of 2 mmol (297 mg) of 1H-pyrazole-1-carboxamidine hydrochloride in solution at room temperature for 3 hours. The oligonucleotides were then purified by gel chromatography (Sephadex G25) and then by RP-HPLC and analyzed by capillary gel electrophoresis (CGE) and electrospray mass spectrometry (ES-MS). The guanidinyl modified oligonucleotides synthesized during this study are summarized in Table XVI.
[0301]
Interestingly, in the case of self-complementary sequences such as ON-5 (SEQ ID NO: 38) or ON-6 (SEQ ID NO: 39), the above conditions are such that the small molecule fraction of guanidinyl G-clamp oligomers. Only produced. Apparently, the double-stranded structure of these palindromic oligonucleotides with primary amino groups involved in base pairing interactions with complementary guanines prevented guanidinylation. In order to break the hydrogen bonding interaction and prevent double helix formation, the reaction was conducted at a high temperature of 55 ° C. and a long reaction time of about 12 hours. Using these conditions, complete guanidinylation of the amino groups of ON-5 (SEQ ID NO: 38) and ON-6 (SEQ ID NO: 39) was achieved without causing any detectable side reaction.
[0302]
Guanidinylation of the primary amino group slightly increased the hydrophobicity of the corresponding oligomer, which is believed to be detected by RP-HPLC analysis as a slight change in retention time. ON-3 T compared to unmodified G-clamp ON-2 (SEQ ID NO: 35)mThe data shows a decrease in hybridization affinity of 5.9 ° K and 5.7 ° K for complementary RNA and DNA, respectively (Table XVII). Although these findings are believed to refute the formation of additional hydrogen bonds between the guanidinyl G-clamp and the complementary guanine, the crystallography of the self-complementary ON-5 (SEQ ID NO: 38) double helix. Presumably explained by another structural detail found in X-ray analysis [Wilds, CJ; Maier, MA; Tereshko, V .; Manoharan, M .; Modified base pair C*And G showed some buckling relative to other base pairs in the double helix, which is a guanidinium within the geometric boundaries of both Watson-Crick and Hoogsteen hydrogen bonds. -It is thought to be the result of altered steric requirements to accommodate the ethoxy moiety. Out-of-plane distortion is due to the loss of affinity observed for guanidinyl-modified ON-3 (SEQ ID NO: 36) compared to parent G-clamp containing ON-2 (SEQ ID NO: 35). Can be considered.
[0303]
In summary, two methods have been developed for post-synthesis modification of oligonucleotides involving the conversion of primary amino functions to guanidinium groups by using 1H-pyrazole-1-carboxamidine hydrochloride. For reactions on solid supports, the amino group was protected with Alloc, which can be selectively removed without cleaving the oligonucleotide from the support, and this guanidinylation is a 10% DIEA in DMF. Went in. On the other hand, the primary amino group was protected with Tfa for post-synthesis guanidinylation in aqueous solution, which can be easily removed under conditions of oligonucleotide deprotection and cleavage. Using these methods, several modified oligonucleotides with guanidinium moieties facing either the main or minor groove were produced and analyzed.
[0304]
Example 57
[0305]
[Table 16]
Figure 2005504020
[0306]
Example 58
[0307]
[Table 17]
Figure 2005504020
[0308]
Example 59
Guanidinyl G-clamp modification
A guanidinyl G-clamp modification was designed to allow for additional hydrogen bonding to the guanosine O6 and N7 Hoogsteen binding sites (FIG. 1B). A binding study of a DNA oligomer containing a single unit to an RNA target has shown that the ΔT observed for the original G-clamp modification relative to wild-type DNA.mIt showed a slightly lower increase in melting temperature of 16 ° C. In order to investigate the structural nature of this modification, the inventors have determined that the sequence GC*GTATMOEACGC (SEQ ID NO: 41) (however, C*Is a guanidino G-clamp and 2'-O-methoxyethylthymine is TMOEThe X-ray crystal structure of the modified decameric double helix with (Figure 1C) was determined. Altmann, K.-H .; Dean, NM; Fabbro, D .; Freier, SM; Geiger, T .; Haner, R .; Husken, D .; Martin, P .; Monia, BP; Muller, M .; Natt, F .; Nicklin, P .; Phillips, J .; Pieles, U .; Sasmor, H .; Moser HE Chimia 1996,50,168-176; Teplova, M .; Minasov, G .; Tereshko, V .; Inamati Cook, PD; Manoharan, M .; Egli, M. Nature Struct. Biol. 1999, 6, 535-539. Oligonucleotide synthesis and purification were performed according to standard methods. This decameric double helix crystal was grown by the hanging drop vapor diffusion method using a commercially available screen (Hampton Researchm, Laguna Niguel, CA) [hanging drop vapor diffusion: 2 μL liquid particles (1 .2 mM DNA, 5% MPD, 20 mM Nacocodylate pH 6.0, 6 mM spermine · 4HCl, 40 mM NaCl, 6 mM KCl, 10 mM MgCl2Was equilibrated against 1 mL of 35% v / v MPD reservoir. Space group P212121Cell dimensions a = 24.52 cm, b = 43.02 cm, c = 46.68 cm). Data collection was performed with a synchrotron source [crystals (0.7 × 0.2 × 0.2 mm) were picked from the liquid particles with a nylon loop and cooled N2Transferred into a stream (120K). High and low resolution data sets were collected using a MARCCD detector at the DND-CAT 5-ID beamline (λ = 0.978) at Advanced Photon Source, Argonne, IL. Embedded data, DENZO / SCALEPACK10Merged. Total R of all reflections from 20 to 1 cmmergeWas 4.7% (Otwinowski, Z .; Minor, W. Methods Enzymol. 1997, 276, 307-326), but data collection and precision statistics are listed in Table XVIII. The structure is elucidated by molecular replacement using the DNA decamer as an initial model, and the program CNS12And SHELX-9713And made it precise. Using 10% reflection and reaching 22% RfreeAll reflections were included in the final round of isotropic precision; Brunger, AT Crystallography & NMR System (CNS), Version 0.9, Yale University, New Haven, CT, 1998 [Sheldrick, GM; Schneider, TR Methods Enzymol. 1997,277,319-343; Egli, M .; Tereshko, V .; Teplova, M .; Minasov, G .; Joachimiak, A .; Sanishvili, R .; Weeks, CM; Miller, R. ; Maier, MA; An, HY; Cook, PD; Manoharan, M. Biopolymers: Nucleic Acids Sciences 1998, 48, 234-252; Clarke, ND: Beamer, LJ; Goldberg, HR; Berkower, C .; Pabo, CO Science 1991 , 254,267-270; Rich, A. In The Chemical Bond: Structure and Dynamics; Zewail, A. Ed .; Academic Press, New York, 1992; pp31-86; Pabo, CO; Sauer, RT Annu. Rev. Biochem. 1992, 61, 1053-1059; Lin, K.-Y .; Jones, RJ; Matteucci, MDJAm. Chem. Soc. 1995, 117, 3873-3874].
[0309]
The overall structure of this double helix is in the A form as a result of the 2'-O-methoxyethylthymine units at the 6 and 16 positions of this double helix. The A-type environment is desirable for studying the structure of nucleic acid modifications for antisense purposes. Base pair C12*As shown in the case of -G9 (FIG. 2), the electron density around these heterocycles is clearly between the bound amino and imino nitrogens of guanidinium and O6 and N7 of guanosine, respectively. 2 shows two Hoogsteen-type hydrogen bonds formed. The hydrogen bond lengths are 2.88 and 2.86, and the base pair C2*The corresponding hydrogen bond lengths in -G19 are 2.92 and 2.87, respectively. The nature of the electron density around the individual atoms of the phenoxazine ring and the bound group indicates that this modification is sufficiently regular and does not assume a random conformation. In double helices, there is some buckling of modified base pairs relative to other base pairs. This out-of-plane distortion of the base pair between the G-clamp and the G causes both Watson-Crick and Hoogsteen-type hydrogen bond geometries within the geometric boundaries provided by the guanidinium-ethoxy moiety. It can be a result of the requirements to be optimized. Furthermore, the observed configuration helps to avoid steric contact between the O 6 of G and the ethoxy linker oxygen of the G-clamp (FIGS. 1 and 2).
[0310]
The presence of G-clamp is compared to the stacking between cytosine and its 5'-adjacent bases (G1 and G11, respectively).*Significantly improves intra-chain stacking at the stage. G1 and C2*The overlap between is shown in FIG. A “cytosine core” exhibits a relatively small stacking to a guanosine base, but the rest of the phenoxazine ring system effectively covers the entire guanosine base. However, stacking to the 5 'side between the G-clamp and the base is improved, but stacking to the 3'-adjacent base is not affected by inclusion of the modified base.
[0311]
The placement of the positively charged guanidinium moiety in the center of the main groove, which is a strong negative potential site, is thought to provide a significant electrostatic contribution to stability. Furthermore, the guanidinium and phosphate groups from the opposing chain are relatively close together. C*The average distance between the imino nitrogen and the O2P oxygen of the phosphate group is 5.8 cm. Although too long for direct salt crosslinking, water molecules link guanidinium and phosphate groups. C12*In this case, a single water molecule mediates contact between the water bound between the guanidiniumimino nitrogen and the O2P oxygen of residues C8 and G9.
[0312]
The interaction of positively charged amines with Hoogsteen-type binding sites on guanosine is well known. For example, X-ray crystallographic studies of a lambda repressor bound to a double helix DNA showed specific contact between lysine and the O6 position of G [Clarke, ND; Beamer, LJ; Goldberg, HR; Berkower , C .; Pabo, CO Science 1991, 254, 267-270; Rich, A. In The Chemical Bond: Structure and Dynamics; Zewail, A. Ed .; Academic Press, New York, 1992, 31-86; Pabo, CO; Sauer, RT Annu. Rev. Biochem. 1992, 61, 1053-1059]. This structure of the guanidyl G-clamp resembles the bidentate hydrogen bonding of the arginine branch at the N7 and O6 positions of guanine in protein-nucleic acid interactions [Clarke, ND; Beamer, LJ; Goldberg , HR; Berkower, C .; Pabo, CO Science 1991, 254, 267-270; Rich, A. In The Chemical Bond: Structure and Dynamics; Zewail, A. Ed .; Academic Press, New York, 1992, 31-86; Pabo, CO; Sauer, RT Annu. Rev. Biochem. 1992, 61, 1053-1059]. The observed structure is probably due to the conformation as a result of the extended guanidinyl ethoxy spacer arm.*-Shows some buckling of G base pairs. T between G-clamp and guanidino G-clampmComparison of data indicated that guanidinylation appears to have a minor effect on overall stability.
[0313]
Two critical stabilizing factors of this modification are an increased number of hydrogen bonds and an improved stacking interaction. Further contributing to stability is favorable electrostatic interactions and a well-regulated water network. It is difficult to tell if one of these contributions plays a more important role than the other. Binding studies of oligomers having a phenoxazine moiety alone have shown moderate T at 2-7 ° C.m[Lin, K.-Y .; Jones, R.J .; Matteucci, M.D. J. Am. Chem. Soc. 1995, 117, 3873-3874]. Stability was most increased when several phenoxazine groups were clustered together on the same chain, allowing tricyclic-tricyclic stacking interactions. In the case of acyclic G-clamp modification, no increase in binding was observed. Only when both phenoxazine and a constrained amino group were present, a dramatic improvement in binding was observed [Lin, K.-Y .; Matteucci, MDJAm. Chem. Soc. 1998, 120, 8531-8532. Flanagan, WM; Wolf, JJ; Olson, P .; Grant, D .; Lin, K .; Wagner, RW; Matteucci, MD Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1999, 96, 3513-3518]. Clearly, the hydrogen bonds from the guanidinium group maintain the guanidino G-clamp modification in a position that allows the formation of stacking interactions and a stable water network. This is the first report that a single base pair in a nucleic acid double helix combines a total of five hydrogen bonds with Watson-Crick and Hoogsteen bonds.
[0314]
Example 60
Reflection data and precision statistics.
[0315]
[Table 18]
Figure 2005504020
[0316]
Example 61
Synthesis of G-clamp modified oligonucleotides targeting the c-raf message
[0317]
[Table 19]
Figure 2005504020
[0318]
C*= G-clamp modification.
Example 62
In vivo stability of modified MDM-2 oligonucleotides
[0319]
[Table 20]
Figure 2005504020
[0320]
C*= G-clamp modification.
In vivo stability of selected modified oligonucleotides to be synthesized is determined in BALB / c mice. After a single intravenous dose of 5 mg / kg oligonucleotide, blood samples are taken at various time intervals and analyzed by CGE.
[0321]
For each oligonucleotide examined, nine male BALB / c mice (Charles River, Wilmington, Mass.) Weighing about 25 g are used. After acclimatization for one week, the mice are given a single tail vein injection of oligonucleotide (5 mg / kg) administered in phosphate buffered saline (PBS), pH 7.0. One retro-orbital bleed (0.25, 0.5, 2 or 4 hours after dosing) and terminal bleed (1, 3, 8 or 24 hours after dosing) for each group Collect from. Terminal blood collection (approximately 0.6-0.8 mL) is collected by cardiac puncture after ketamine / xylazine anesthesia. This blood is transferred to an EDTA-coated collection tube and centrifuged to obtain plasma. Finally, liver and kidney are collected from each mouse. Plasma and tissue homogenates are used for analysis and intact oligonucleotide content is determined by CGE. All samples are frozen on dry ice immediately after collection and stored at −80 ° C. until analysis.
[0322]
CGE analysis showed relative nuclease resistance of oligomers containing G-clamp modifications compared to the parent MDM-2 (uniformly, 2'-deoxyphosphorothioate oligonucleotides were concentrated in mouse MDM-2). Due to the nuclease resistance of the G-clamp modification, the modified oligonucleotide has been found to be more stable in plasma, while ISIS 11061 (SEQ ID NO: 42) was not stable. Similar findings are found in kidney and liver tissue. This means that the G-clamp modification confers excellent nuclease resistance to exonucleases and endonucleases in plasma, kidney and liver. Thus, oligonucleotides with longer durations of action can be designed by including both G-clamp modifications and other similar motifs in their structure. One hour after intravenous bolus administration of 5 mg / kg oligonucleotide, a plot of the percentage of full-length oligonucleotide remaining intact in plasma is determined to assess plasma stability.
[0323]
A plot of the percentage of full length oligonucleotide remaining intact in the tissue 24 hours after intravenous bolus administration of 5 mg / kg oligonucleotide is determined. CGE traces of test and standard phosphorothioate oligonucleotides after 24 hours in both mouse liver and mouse kidney samples are evaluated. There is a greater amount of intact oligonucleotide for the oligonucleotides of the present invention when compared to the unmodified parent standard. Maximum stability is C at both 5 'and 3' ends.*Recognized when capped at.
[0324]
Example 63
Control of c-raf messages in bEND cells using G-clamp modified oligonucleotides
[0325]
[Table 21]
Figure 2005504020
[0326]
C*= G-clamp modification.
To assess the activity of some oligonucleotides, an in vitro cell culture assay is used to measure the cellular level of c-raf expression in bEND cells.
[0327]
Cells and reagents
BEND. Three cell lines are obtained from Dr. Werner Risau (Max-Planck Institute). Opti-MEM, trypsin-EDTA and high glucose-containing DMEM are purchased from Gibco-BRL (Grand Island, NY). Dulbecco = s PBS is purchased from Irvine Scientific (Irvine, CA). Sterile 12-well tissue culture plates and Facsflow solutions are purchased from Becton Dickinson (Mansfield, MA). Ultrapure formaldehyde is purchased from Polysciences (Warrington, PA). NAP-5 columns are purchased from Pharmacia (Uppsala, Sweden).
[0328]
Oligonucleotide treatment
Cells are grown to approximately 75% confluence in 12 well plates with DMEM containing 4.5 g / L glucose and 10% FBS. Cells are washed 3 times with Opti-MEM pre-warmed to 37 ° C. Oligonucleotides are premixed with cationic lipid (Lipofectin reagent (GIBCO / BRL)), serially diluted to the desired concentration, and placed on washed cells and incubated at 37 ° C. for 4 hours. Next, the culture medium is removed and replaced with a normal growth medium, and 24 hours later, Northern blot analysis of mRNA is performed.
[0329]
Northern blot analysis
For determination of mRNA levels by Northern blot analysis, total RNA was quantified by the guanidinium isothiocyanate method [Monia et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1996, 24 hours after the start of oligonucleotide treatment. 93,15481-15484] from the cells. Total RNA is isolated by centrifugation of the cell lysate with a CsCl cushion. Northern blot analysis, RNA quantification and normalization to G3PDH mRNA levels are performed according to reported procedures [Dean and McKay, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1994, 91, 11762-11766].
[0330]
In bEND cells, G-clamp oligonucleotides showed a decrease in c-raf message activity as a function of concentration. The fact that these modified oligonucleotides retain activity may be dosed less frequently for those oligonucleotides that also exhibit increased in vivo nuclease activity. All G-clamp modified oligonucleotides retained the activity of the parent 11061 oligonucleotide (SEQ ID NO: 42) and further improved the activity.
[0331]
Example 64
Compound 201 (R '= CN, n = 1, scheme 22a, Table XX).
Scheme 22a
[0332]
Embedded image
Figure 2005504020
[0333]
[Table 22]
Figure 2005504020
[0334]
Example 65
Compound 248 (R '= NHCbz, n = 0, scheme 22).
Compound 248 was prepared from compound 246 (1 mmol) and benzyl N- (2-hydroxyethyl) carbamate (1 mmol) from a reference procedure [Lin and Matteucci, J. Am. Chem. Soc., 1998, 120, 8531-8532. To manufacture.
[0335]
Example 66
Compound 249 (n = 0, scheme 22b).
Compound 248 (1 mmol) is treated with DMT-Cl (1 molar equivalent) in pyridine to yield the corresponding 5'-O-DMT derivative. This DMT derivative is stirred with ethyl trifluoroacetate in the presence of TEA to give the N-trifluoroacetyl-5'-O-DMT derivative of compound 248. The free 3'-hydroxy functionality of the resulting product is reacted with acetic anhydride in anhydrous pyridine to give the fully protected nucleoside 249.
[0336]
Scheme 22b
[0337]
Embedded image
Figure 2005504020
[0338]
Example 67
Compound 250 (n = 0, scheme 22b).
A suspension of compound 249 (1 mmol) and ammonium formate (5 mmol) in ethyl acetate is deoxygenated under argon and 10% palladium on activated carbon (10 mol%) is added into the suspension under argon. The reaction mixture is stirred at ambient temperature for 10 minutes to give compound 250.
[0339]
Example 68
Compound 206 (n = 0, R = Me, Scheme 22c, Table XX).
Compound 250 (1 mmol) in anhydrous THF is stirred with 1,1'-carbonyldiimidazole (CDI, 1 mmol) for 2 hours at ambient temperature under argon. After 2 hours, the reaction mixture is cooled on an ice bath and anhydrous methylamine gas is bubbled through the reaction mixture for 10 minutes. The resulting mixture is stirred for 30 minutes to give compound 206.
[0340]
Scheme 22c
[0341]
Embedded image
Figure 2005504020
[0342]
Example 69
Compound 206a (n = 0, R = Me, scheme 22c).
Phosphitylation of the 3'-hydroxy group of compound 206, as described in Example 2 for the synthesis of compound 3, yields compound 206a.
[0343]
Example 70
Compound 207 (n = 0, R = Me, Scheme 22c, Table XX).
Compound 207 is obtained from compound 250, 1,1'-thiocarbonyldiimidazole and methylamine under reaction conditions similar to those described in Example 68 for the synthesis of compound 206.
[0344]
Example 71
Compound 207a (n = 0, R = Me, scheme 22c).
Phosphitylation of the 3'-hydroxy group of compound 207, as described in Example 2 for the synthesis of compound 3, yields compound 207a.
[0345]
Example 72
Compound 202 (n = 0, m = 0, scheme 22c, Table XX).
Compound 250 (1 mmol) is stirred overnight with N-benzyloxycarbonyl-2-aminoethanol-O-methanesulfonate (1 mmol) in anhydrous DCM in the presence of DIEA. The secondary amine thus obtained is subjected to transfer hydrogenation as described in Example 59 to remove the benzyloxycarbonyl protection. The unprotected amine is then stirred with ethyl trifluoroacetate in DCM in the presence of DIEA to give the desired compound 202.
[0346]
Example 73
Compound 202a (n = 0, m = 0, scheme 22c).
Phosphitylation of compound 202, as described in Example 2 for the synthesis of compound 3, yields compound 202a.
[0347]
Example 74
Compound 208a (n = 0, scheme 22d, Table XX).
Compound 250 (1 mmol) and TEA (1 mmol) are added into a solution of compound A (1 mmol, Scheme 1d) and the resulting mixture is stirred at ambient temperature to give compound 208a.
[0348]
Scheme 22d
[0349]
Embedded image
Figure 2005504020
[0350]
Example 75
Compound 208b (n = 0, scheme 22d).
Phosphitylation of compound 208a, as described in Example 2, yields compound 208b.
[0351]
Example 76
Compound 201a (n = 1, scheme 22e).
Reaction of compound 201 with DMTCl in pyridine yields compound 201a.
[0352]
Scheme 22e
[0353]
Embedded image
Figure 2005504020
[0354]
Example 77
Compound 209 (n = 1, scheme 22e, Table XX).
Compound 201a is treated with ammonia and ammonium chloride in THF at elevated temperature under pressure to give compound 209 [Granik, Russ. Chem. Rev., 1983, 52, 377-393].
[0355]
Example 78
Compound 209a (n = 1, scheme 22e).
2-Cyanoethoxycarbonyloxysuccinimide (2 mmol) and DIEA are added into a solution of compound 209 (1 mmol) in DCM and the resulting mixture is stirred at ambient temperature to give compound 209a.
[0356]
Example 79
Compound 209b (n = 0, scheme 22e).
Phosphitylation of compound 209a, as described in Example 2 for the synthesis of compound 3, yields compound 209b.
[0357]
Example 80
Compound 252 (Scheme 23a).
The phenoxazine nucleoside 252 with the desired tether X is prepared according to the bibliographic procedure according to [Lin and Matteucci, J. Am. Chem. Soc., 1998, 120, 8531-8532]. It is synthesized in 5 steps from '-O-TBDMS-5'-O-DMT-dU (251).
[0358]
Example 81
Compound 253 (Scheme 23a).
Scheme 23a
[0359]
Embedded image
Figure 2005504020
[0360]
Mitsunobu alkylation conditions of compound 252 (1 mmol) and ethanol (1 mmol) in acetonitrile in the presence of DIEA (1 mmol each of Ph3Reaction under P and DEAD) yields compound 253.
[0361]
Example 82
Compound 254 (Scheme 23a).
Compound 253 is converted to P under vacuum.2O5After thoroughly drying above, place in a reaction vessel under argon. TMG (10 mmol) in anhydrous pyridine placed on a freezing bath was dissolved in anhydrous H2Saturate with S for 45 minutes. After 45 minutes, the resulting solution is placed in a pre-cooled container containing compound 253 under argon and sealed. The sealed container is then allowed to reach ambient temperature and stored at ambient temperature for 3 days. H in the chlorox bath2S is removed by aeration and pyridine is removed from the reaction mixture under vacuum. The residue yields compound 254 after standard processing and purification.
[0362]
Example 83
Compound 210a (n = 1, scheme 23a, Table XXI).
Compound 254 (X═O— (CH2)3-CN) is treated with TBAF in THF to remove the 3'-O-TBDMS group. The obtained 3'-OH group is phosphitylated under the conditions described in Example 2 to give compound 210a.
[0363]
[Table 23]
Figure 2005504020
[0364]
Example 84
Compound 210b (n = 0, scheme 23b, Table XXI).
Compound 254 (1 mmol, n = 0, scheme 23b) is treated with TBAF in THF to remove the 3'-O-protection. The resulting product was subjected to transfer hydrogenation using Pd—C (10%) and ammonium formate in ethyl acetate (see Example 67 for details) and the benzyloxy group from the side chain moiety. Remove carbonyl protection. The free amine and ring nitrogen thus formed are then protected as trifluoroacetamide by stirring compound (1 mmol) with ethyl trifluoroacetate (10 mmol) in pyridine at ambient temperature. Finally, the resulting trifluoroacetamide derivative is phosphitylated as described in Example 2 for the synthesis of compound 3 to give the desired phosphoramidite 210b.
[0365]
Scheme 23b
[0366]
Embedded image
Figure 2005504020
[0367]
Example 85
Compound 255 (n = 0, scheme 23b).
Compound 254 (n = 0, 1 mmol) is stirred with ethyl trifluoroacetate (5 mmol) in pyridine. After purification of the formed trifluoroacetamide, stirring with ammonium formate (10 mmol) in the presence of Pd—C (10%) in ethyl acetate as described in Example 67 gives compound 255.
[0368]
Example 86
Compound 215a (n = 0, R = Me, Scheme 23b, Table XXI).
Compound 255 (1 mmol) is reacted with CDI and methylamine as described in Example 68. The urea derivative thus obtained is stirred with TBAF in THF to remove the 3 '= O-protection. After deprotection of 3'-O-TBDMS, the resulting product is trifluoroacetylated at its ring nitrogen by stirring with excess ethyl trifluoroacetate in anhydrous pyridine. Phosphitylation of this trifluoroacetamide derivative under the conditions described in Example 2 for the synthesis of compound 3 yields compound 215a.
[0369]
Example 87
Compound 216a (n = 0, R = Me, Scheme 23b, Table XXI).
Compound 216a is synthesized from compound 255, 1,1'-thiocarbonyldiimidazole and methylamine as described in Example 86 for the synthesis of compound 215a.
[0370]
Example 88
Compound 256 (m = 0, n = 0, scheme 23b).
Compound 256 is prepared as described in Example 72 from compound 255 (1 mmol) and N-benzyloxycarbonyl-2-aminoethanol-O-methanesulfonate (1 mmol).
[0371]
Example 89
Compound 211a (m = 0, n = 0, scheme 23b, Table XXI).
Compound 256 is stirred with TBAF in THF to remove the TBDMS protection on the 3'-OH group. After deprotection, the 3'-OH group is phosphitylated as described in Example 2 for the synthesis of compound 3 to give compound 211a.
[0372]
Example 90
Compound 257 (n = 0, scheme 23c).
Compound 257 is obtained from compound 255 under the conditions described in Example 74.
[0373]
Example 91
Compound 217a (n = 0, scheme 23c, Table XXI).
Compound 217a is prepared from compound 257 as described in Example 89 for the preparation of compound 211a.
[0374]
Scheme 23c
[0375]
Embedded image
Figure 2005504020
[0376]
Example 92
Compound 258 (n = 1, scheme 23d).
Compound 258 is synthesized from compound 252 as described in Examples 77 and 78.
[0377]
Scheme 23d
[0378]
Embedded image
Figure 2005504020
[0379]
Example 93
Compound 218a (n = 1, scheme 23d, Table XXI).
This phosphoramidite 218a is synthesized from compound 258 under the same conditions as described in Examples 81 and 83 for the preparation of compound 210a from compound 253.
[0380]
Example 94
Compound 262 (Scheme 24).
2-amino-3-methoxy-benzenethiol [Inoue et al., Chem. Pharm. Bull., 1997, 45, 1008-1028]3In the presence of2Reacted with O, then Ac in pyridine2Reaction with O gives compound 262.
[0381]
Scheme 24
[0382]
Embedded image
Figure 2005504020
[0383]
Example 95
Compound 263 (Scheme 24).
P under vacuum2O5After drying well above, compound 262 in anhydrous dichloromethane is treated with TMS-I for 5 minutes to give compound 263.
[0384]
Example 96
Compound 264 (Scheme 24).
The selected binding moiety is attached to the hydroxyl function of compound 263 with Ph3Attachment in the presence of P and DEAD (Mitsunobu alkylation) gives compound 264.
[0385]
Example 97
Compound 265 (Scheme 24).
Compound 264 is stirred with TFA in DCM for 30 minutes to give compound 265.
[0386]
Example 98
Compound 267 (Scheme 25a).
Compound 267 is synthesized from compound 266 and compound 265 according to the reported procedure [Lin et al., J. Am. Chem. Soc., 1995, 117, 3873-3874].
[0387]
Scheme 25a
[0388]
Embedded image
Figure 2005504020
[0389]
Example 99
Compound 268 (Scheme 25b, Table XXII).
The tricyclic nucleoside 268 is prepared from compound 267 according to the reported procedure [Lin and Matteucci, J. Am. Chem. Soc., 1998, 120, 8531-8532].
[0390]
Scheme 25b
[0390]
Embedded image
Figure 2005504020
[0392]
[Table 24]
Figure 2005504020
[0393]
[Table 25]
Figure 2005504020
[0394]
Example 100
Compound 219 (X═O [CH2]3CN, Scheme 25b, Table XXII).
Compound 268 (X═O [CH2]3CN, Scheme 25a) is phosphitylated under the conditions described in Example 2 to give compound 219.
[0395]
Example 101
Compound 220 [X═O (CH2)2N (COCF3) [CH2] N (H) COCF3], Scheme 25b, Table XXII).
Compound 220 (specified) is converted to compound 268 (X═O [CH2]2NHCbz) and N-benzyloxycarbonylaminoethanol-O-methylsulfonate as described in Examples 67, 72 and 73.
[0396]
Example 102
Compound 224 (X═O [CH2]2NHCONHCH3, Scheme 25b, Table XXII).
Compound 224 (specified) is converted to compound 268 (X═O [CH2]2Synthesized from NHCbz), CDI and methylamine as described in Examples 67, 68 and 69.
[0397]
Example 103
Compound 225 (X═O [CH2]2NHCSNHCH3, Scheme 25b, Table XXII).
Compound 224 (specified) is converted to compound 268 (X═O [CH2]2From NHCbz), 1,1'-thiocarbonyldiimidazole and methylamine as described in Examples 67, 70 and 71.
[0398]
Example 104
Compound 226 (X═O [CH2]2NHC [NH] NH3, Scheme 25b, Table XXII).
Compound 226 (specified) is converted to compound 268 (X═O [CH2]2Synthesized from NHCbz) and Compound A (see Scheme 22d) as described in Examples 67, 74 and 75.
[0399]
Example 105
Compound 227 (X═O [CH2]3CH2C [NH] NH3, Scheme 25b, Table XXII).
Compound 227 (specified) is converted to compound 268 (X═O [CH2]3CN) and synthesized as described in Examples 77, 78 and 79.
[0400]
Example 106
Compound 270 (Scheme 26).
Ph with the selected binding moiety (defined in Table XXIV)3Alkylation of the hydroxyl function of compound 269 in the presence of P and DEAD [Bigge, C.F. et al., PCT Int. Appl. (1997), 280 pp CODEN PIXXD2 WO9723216A1 19970703] yields compound 270.
[0401]
Example 107
Compound 271 (Scheme 26).
Compound 271 (1 mmol) was dissolved in ethyl acetate containing 10% acetic acid, the resulting solution was deoxygenated, mixed with 10 mol% Pd-C (10%) and catalytic hydrogenation under pressure To give compound 271.
[0402]
Scheme 26
[0403]
Embedded image
Figure 2005504020
[0404]
Example 108
Compound 273 (Scheme 27a).
Compound 272 is obtained from compound 266 and compound 271 as described in Examples 88 and 98.
[0405]
Scheme 27a
[0406]
Embedded image
Figure 2005504020
[0407]
Example 109
Compound 237 (X═O [CH2]2N (phthaloyl), Scheme 27b, Table XXIV).
Compound 273 under the same conditions as described in Example 2 (X═O [CH2]2Phosphitylation of N (phthaloyl), scheme 27a) gives compound 237.
[0408]
[Table 26]
Figure 2005504020
[0409]
Example 110
Compound 238 (X═O [CH2]2N {COCF3} [CH2]2NH {COCF3}, Scheme 27b, Table XXIV).
Compound 273 (X═O [CH2]2N {phthaloyl}, Scheme 27a) is treated with hydrazine to remove phthaloyl protection from the side chain. The corresponding free amine thus formed is reacted with N-benzoyloxycarbonylaminoethanol-O-methanesulfonate in the presence of a base as described in Example 64 and then phosphitylated (Example 2) yielding compound 238.
[0410]
Scheme 27b
[0411]
Embedded image
Figure 2005504020
[0412]
Example 111
Compound 242 (X = O [CH2]2NHCONHCH3, Scheme 27b, Table XXII).
Compound 273 (X═O [CH2]2N {phthaloyl}, scheme 27a) is treated with hydrazine to remove phthaloyl protection from the side chain. The desired compound 242 is obtained by reacting the formed free amino group with CDI and methylamine as described in Examples 68 and 69.
[0413]
Example 112
Compound 243 (X═O [CH2]2NHCSNHCH3, Scheme 27b, Table XXII).
Compound 273 (X═O [CH2]2N {phthaloyl}, scheme 27a) is treated with hydrazine to remove phthaloyl protection from the side chain. The desired compound 243 is obtained by reacting the formed free amino group with 1,1'-thiocarbonyldiimidazole and methylamine as described in Examples 68 and 69.
[0414]
Example 113
Compound 244 (X = O [CH2]2NHC {NH} NH3, Scheme 27b, Table XXII).
Compound 273 (X═O [CH2]2N {phthaloyl}, scheme 27a) is treated with hydrazine to remove phthaloyl protection from the side chain. The desired compound 243 is prepared from the amino compound and compound A (see Scheme 22d) as described in Examples 67, 74 and 75.
[0415]
Example 114
Compound 245 (X═O [CH2]3CH2C [NH] NH3, Scheme 27b, Table XXII).
Compound 227 (specified) is converted to compound 273 (X═O [CH2]3CN) and synthesized as described in Examples 77, 78 and 79.
[0416]
Example 115
Compound 284 (Scheme 28).
Compound 283, prepared according to the reference procedure [Pal, B.C. et al., Nucleosides & Nucleotides, 1988, 7, 1-21], was converted to NaHCO 3.3In aqueous methanol in the presence of2Stir with O to protect the ring nitrogen as Boc. The Boc protected nucleoside is then acetylated in anhydrous pyridine to give compound 284.
[0417]
Scheme 28
[0418]
Embedded image
Figure 2005504020
[0419]
Example 116
Compound 285 (R = [phthaloyl] N [CH2]3-, Scheme 28).
N- (phthaloyl) ethylenediamine is coupled to the carboxyl group of compound 284 under peptide coupling conditions in the presence of HATU and HOAT to give compound 285.
[0420]
Example 117
Compound 286 (R = [phthaloyl] N [CH2]3-, Scheme 28).
Compound 285 is treated with TFA in dichloromethane for 30 minutes to remove Boc protection. After deprotection of the ring nitrogen, the resulting compound is stirred at 0 ° C. in aqueous THF containing 0.1 M LiOH to give compound 286 (specified).
[0421]
Example 118
Compound 287 (R = [phthaloyl] N [CH2]3-, Scheme 28).
Compound 287 (1 mmol) in anhydrous pyridine is treated with DMT-Cl (1 mmol) in the presence of DMAP (10 mol%) to give the corresponding 5'-O-DMT derivative. After dimethoxytritylation, the resulting product is stirred with excess ethyl trifluoroacetate in anhydrous dichloromethane in the presence of DIEA to give compound 287.
[0422]
Example 119
Compound 274 (R = [phthaloyl] N [CH2]3-, Scheme 28, Table XXV).
Phosphitylation of compound 287 under the conditions described in Example 2 for the synthesis of compound 3 yields compound 274.
[0423]
[Table 27]
Figure 2005504020
[0424]
Example 120
Nuclease resistance of oligonucleotides with selected modifications
Both nucleosides of phenoxazine 151 and G-clamp 152 were prepared using previously published procedures [Lin, K.-Y .; Jones, RJ; Matteucci, MJAm. Chem. Soc., 1995, 117, 3873-3874; Lin, K.-Y .; Matteucci, MJAm. Chem. Soc., 1998, 120, 8531-8532]. Succinates 153 and 154, and corresponding substituted solid supports 155 and 156, were prepared as outlined in Scheme 19. Using a CPG support, the two cytidine analogs 151 and 152 are converted to T18dC*Two model oligonucleotides 157 and 158 (dC*= Phenoxazine (SEQ ID NO: 62) or G-clamp deoxyribonucleoside (SEQ ID NO: 63)). Solid phase oligonucleotide synthesis was performed using standard phosphoramidite chemistry. Deprotection of oligonucleotide 158 containing G-clamp is2(40% aqueous) and NH3(20-30% aqueous) 1: 1 solution at room temperature for 4 hours. These oligonucleotides were purified by reverse phase HPLC and desalted.
[0425]
Snake venom phosphodiesterase (SVPD) and bovine intestinal mucosal phosphodiesterase (BIPD) were utilized as hydrolases for in vitro nuclease resistance studies. Both enzymes mainly exhibit 3 'exonuclease activity. Unmodified 19-mer oligothymidylate (oligonucleotide 159) (SEQ ID NO: 64) was used as a control. Oligonucleotide samples were mixed with SVPD (2.5 units / μmol substrate) or BIPD (0.55 units / μmol substrate) with 50 mM Tris-HCl, 8 mM MgCl.2Incubation at 37 ° C. in buffer, pH 7.5. At certain time points, 10 μl aliquots were removed and heated in boiling water for 2 minutes to inactivate the enzyme. The samples were then desalted by membrane dialysis against Nanopure deionized water using a Millipore 0.025 μm VS membrane and stored frozen until they were analyzed. The progress of enzymatic degradation was monitored by capillary gel electrophoresis (CGE).
[0426]
The results of a nuclease resistance study using SVPD as a hydrolase are shown in FIG. As expected, the unmodified control oligonucleotide 159 (insert) was rapidly degraded by sequential removal of the terminal nucleotides. Under the applied conditions, this oligonucleotide t1/2Was reached in about 3 minutes. After 20 minutes incubation, the full-length oligomer was almost completely degraded into a series of shorter fragments. In contrast, modified oligonucleotides 157 and 158 with heterocyclic modifications at the 3 'end were hardly degraded even after an incubation time of 8 hours. According to the degradation rate and CGE profile, the 3 'exonuclease resistance of these two oligomers is not very different. Very similar results of nuclease resistance to BIPD as a hydrolase were obtained for both modified oligonucleotides 157 and 158.
[0427]
In another set of experiments, the inhibitory effect of both phenoxazine and G-clamp oligonucleotides on nuclease activity was examined. Unmodified oligonucleotide 159 was incubated with BIPD and degradation of 19-mer oligothymidylate 5'-labeled with fluorescein was followed in the presence of varying amounts of oligonucleotides 157 and 158, respectively. Oligonucleotide samples were mixed with BIPD (0.55 units / μmol substrate) with 50 mM Tris-HCl, 8 mM MgCl.2And incubated at 37 ° C. in pH 7.5. At a certain time point, take a 10 μl aliquot and add 200 μl dH2After direct dilution in O, CGE analysis was performed. The effect of these modified oligonucleotides on nucleolytic activity was determined by examining the overall enzymatic reaction rate. Therefore, all degradation products were quantified at each time point, weighed taking into account their degradation stage (nx) and summarized to obtain the number of hydrolyzed bonds. The enzymatic reaction rate was determined graphically as a function of incubation time from the number of hydrolyzed phosphodiester bonds.
[0428]
This other part of the study was driven by the question of why these oligonucleotides with a tricyclic base modification at the 3 'end show such unusual nuclease resistance. Therefore, it was planned to determine whether they are recognized as substrates, ie whether they can bind to the active site of the enzyme and affect the degradation of natural DNA fragments. In FIG. 5, the rate of enzymatic degradation of unmodified oligonucleotide 159 is shown as a function of the concentration of oligonucleotides 157 and 158. From this figure, it is clear that the presence of these modified oligonucleotides has a clear inhibitory effect on the enzymatic reaction. Again, there are no detectable significant differences between the two derivatives of phenoxazine and G-clamp. Both can slow down the degradation process of oligonucleotide 159 at concentrations above 0.2 μM. IC50 values are reached at about 0.5 μM, and at concentrations of 5 μM and above, the enzyme reaction is almost completely prevented.
[0429]
Example 121
Nuclease resistance of oligonucleotides with selected modifications
Both nucleosides of phenoxazine 151 and G-clamp 152 were prepared using previously published procedures [Lin, K.-Y .; Jones, RJ; Matteucci, MJAm. Chem. Soc., 1995, 117, 3873-3874; Lin, K.-Y .; Matteucci, MJAm. Chem. Soc., 1998, 120, 8531-8532]. Succinates 153 and 154, and corresponding substituted solid supports 155 and 156, were prepared as outlined in Scheme 19. Using a CPG support, the two cytidine analogs 151 and 152 are converted to T18dC*Two model oligonucleotides 157 and 158 (dC*= Phenoxazine (SEQ ID NO: 62) or G-clamp deoxyribonucleoside (SEQ ID NO: 63)). Solid phase oligonucleotide synthesis was performed using standard phosphoramidite chemistry. Deprotection of oligonucleotide 158 containing G-clamp is2(40% aqueous) and NH3(20-30% aqueous) 1: 1 solution at room temperature for 4 hours. These oligonucleotides were purified by reverse phase HPLC and desalted.
[0430]
Snake venom phosphodiesterase (SVPD) and bovine intestinal mucosal phosphodiesterase (BIPD) were utilized as hydrolases for in vitro nuclease resistance studies. Both enzymes mainly exhibit 3 'exonuclease activity. Unmodified 19-mer oligothymidylate (oligonucleotide 159) (SEQ ID NO: 64) was used as a control. Oligonucleotide samples were mixed with SVPD (2.5 units / μmol substrate) or BIPD (0.55 units / μmol substrate) with 50 mM Tris-HCl, 8 mM MgCl.2Incubation at 37 ° C. in buffer, pH 7.5. At certain time points, 10 μl aliquots were removed and heated in boiling water for 2 minutes to inactivate the enzyme. The samples were then desalted by membrane dialysis against Nanopure deionized water using a Millipore 0.025 μm VS membrane and stored frozen until analyzed. The progress of enzymatic degradation was monitored by capillary gel electrophoresis (CGE).
[0431]
The results of a nuclease resistance study using SVPD as a hydrolase are shown in FIG. As expected, the unmodified control oligonucleotide 159 (insert) was rapidly degraded by sequential removal of the terminal nucleotides. Under the applied conditions, this oligonucleotide t1/2Was reached in about 3 minutes. After 20 minutes incubation, the full-length oligomer was almost completely degraded into a series of shorter fragments. In contrast, modified oligonucleotides 157 and 158 with heterocyclic modifications at the 3 'end were hardly degraded even after an incubation time of 8 hours. According to the degradation rate and CGE profile, the 3 'exonuclease resistance of these two oligomers is not very different. Very similar results of nuclease resistance to BIPD as a hydrolase were obtained for both modified oligonucleotides 157 and 158.
[0432]
In another set of experiments, the inhibitory effect of both phenoxazine and G-clamp oligonucleotides on nuclease activity was examined. Unmodified oligonucleotide 159 was incubated with BIPD and degradation of 19-mer oligothymidylate 5'-labeled with fluorescein was followed in the presence of varying amounts of oligonucleotides 157 and 158, respectively. Oligonucleotide samples were mixed with BIPD (0.55 units / μmol substrate) with 50 mM Tris-HCl, 8 mM MgCl.2And incubated at 37 ° C. in pH 7.5. At a certain time point, take a 10 μl aliquot and add 200 μl dH2After direct dilution in O, CGE analysis was performed. The effect of these modified oligonucleotides on nucleolytic activity was determined by examining the overall enzymatic reaction rate. Therefore, all degradation products were quantified at each time point, weighed taking into account their degradation stage (nx) and summarized to obtain the number of hydrolyzed bonds. The enzymatic reaction rate was determined graphically as a function of incubation time from the number of hydrolyzed phosphodiester bonds.
[0433]
This other part of the study was driven by the question of why these oligonucleotides with a tricyclic base modification at the 3 'end show such unusual nuclease resistance. Therefore, it was planned to determine whether they are recognized as substrates, ie whether they can bind to the active site of the enzyme and affect the degradation of natural DNA fragments. In FIG. 5, the rate of enzymatic degradation of unmodified oligonucleotide 159 is shown as a function of the concentration of oligonucleotides 157 and 158. From this figure, it is clear that the presence of these modified oligonucleotides has a clear inhibitory effect on the enzymatic reaction. Again, there are no detectable significant differences between the two derivatives of phenoxazine and G-clamp. Both can slow down the degradation process of oligonucleotide 159 at concentrations above 0.2 μM. IC50 values are reached at about 0.5 μM, and at 5 μM and above, the enzymatic reaction is almost completely prevented.
[0434]
Nuclease resistance data indicate that both heterocyclic modifications almost completely prevent 3 'exonuclease attack despite their natural phosphodiester backbone. Apparently, this enzyme is unable to digest oligonucleotides containing a modified nucleobase phenoxazine or G-clamp at the 3 'end. There are a number of reasons for the high nuclease stability observed. Both bulky heterocyclic moieties simply prevent the enzyme from binding to the 3 ′ end by steric hindrance, so these oligonucleotides are not recognized as substrates, or they are not hydrolyzed into the active site of the enzyme. It is considered that this directly affects the activity of the enzyme. The rate reduction observed with the enzymatic degradation of natural DNA fragments indicates that oligonucleotides containing phenoxazine and G-clamp residues can bind to the active site of the enzyme. However, hydrolysis of the 3 'terminal nucleotide phosphodiester bond is hampered by the presence of an unnatural tricyclic base moiety. The dose dependence of the inhibitory effect with an IC50 value of about 0.5 μMol suggests that the binding of these modified oligonucleotides is competitive and reversible.
[0435]
There is no detectable difference between the nuclease resistance of oligonucleotides 157 and 158, indicating that the observed stabilizing effect is mainly due to the presence of a bulky heterocycle. However, to this data, it is still unclear how much the positively charged amino-bound portion of the G-clamp portion contributes to the nuclease resistance of oligonucleotide 158. Previous studies have shown that cationic modification of sugar moieties such as 2'-O-aminoalkyl can efficiently protect phosphodiester oligonucleotides from enzymatic degradation [Manoharan, M .; Tivel, KL; Anrade, LK, Cook, PD Tetrahedron Lett. 1995, 36, 3647-3650; Teplova, M .; Wallace, SC; Tereshko, V .; Minasov, G .; Symonas, AM; Cook, PD; Manoharan, M Egli, M. PNAS 1999, 96, 14240-14245]. Crystal structure studies of the complex formed between the 2'-aminopropyl modified oligonucleotide and exonuclease (DNA polymerase I Klenow fragment) have shown that this aminopropyl residue can hydrolyze the 3 'phosphodiester bond. It shows that it prevents the binding of metal ions required to catalyze. However, although the amino-restraint of the G-clamp residue protrudes into the main groove, this 2 'modification is directed to the double-helix shallow groove. Whether the latter positive charge can interfere with exonuclease metal binding is still being investigated.
[0436]
Example 122
Decomposition by SVPD
Oligonucleotides are mixed with snake venom phosphodiesterase (0.005 U / ml) at a final concentration of 2 μM in 50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 8 mM MgCl.2Incubated at 37 ° C. Total reaction volume was 100 μL. At each time point, a 10 μL aliquot from each reaction mixture was placed in a 500 μL microcentrifuge tube and placed in a boiling water bath for 2 minutes. The samples are then cooled on ice, rapidly rotated so that the entire volume is at the bottom of the tube, and with a Millipore 0.025 micron filter disc (Bedford, MA) suspended in water in a 60 mm Petri dish. Desalted. After 30-60 minutes on the membrane, the sample is diluted with 200 μL of distilled H2Dilute with O and analyze by gel-filled capillary electrophoresis. Oligonucleotides and metabolites were Beckman P / ACE MDQ capillary using a 100 μm ID 30 cm coated capillary (Beckman No. 477477) containing eCAP ssDNA100-R gel (Beckman No. 477621) and Tris-Borate Urea buffer (Beckman No. 338487). Separation and analysis were performed using an electrophoresis apparatus. These samples were injected electrokinetically with a field strength of 5-10 kV for 5-10 seconds. The separation wash was performed at 40 ° C. with an applied voltage of 15 kV. The percentage of full-length oligonucleotides was calculated by correcting for differences in extinction coefficients of different length oligonucleotides after incorporation using Caesar v.6 software (Senetec Software, New Jersey).
[0437]
Example 123
In vivo nuclease stability and binding affinity of L / D-oligonucleotide chimeras
Naturally occurring D-oligonucleotides are degraded very rapidly by nucleases, whereas enantiomeric L-DNA oligomers have increased resistance to nuclease action.1. However, L-DNA has been found to hybridize with natural RNA and DNA only at all or only weakly. Damha and Capobianco [Damha, MJ; Giannaris, PA; Marfey, P. Biochemistry, 1994, 33, 7877-7885; Capobianco, mL; Garbesi, A .; Arcamone, F .; Maschera, B .; Palu, G. Nucleic Acids Symp. Series 1991, 24, 274] independently stated that chimeric L / D-oligomers with terminal L units provided adequate double-helix formation ability and excellent enzymatic stability in human serum. [Damha, MJ; Giannaris, PA; Marfey, P. Biochemistry, 1994, 33, 7877-7885; Capobianco, mL; Garbesi, A .; Arcamone, F .; Maschera, B .; Palu, G. Nucleic Acids Symp. Series 1991, 24, 274].
[0438]
Here we report the in vivo nuclease stability of L / D-oligonucleotide chimeras in mice. The present inventors synthesized phosphoramidites derived from L-thymidine and CPG synthesized from a novel pathway [Jung, E.M .; Xu, Y. Tetrahedron Lett. 1997, 24, 4199-4202]. The 20-mer phosphorothioate oligonucleotide ISIS-120745 (antisense to mouse ICAM-1) was capped with L-2'-deoxythymidine at positions 3 'and 5'. This oligonucleotide was then administered IV boluses to BalbC mice. After 24 hours, mice were sacrificed and oligonucleotides were isolated from various organs. The percentage of full-length oligonucleotides present in various organs was analyzed by CGE. From all major organs, where the parent oligonucleotide was completely degraded,> 90% intact L-thymidine capped oligonucleotides were isolated (FIGS. 6 and 7).
[Brief description of the drawings]
[0439]
FIG. 1A shows the structure of a tricyclic cytosine analog G-clamp, FIG. 1B shows a guanidinyl G-clamp hybridized to a complementary guanosine, and FIG. 1C shows an x-ray crystallographic analysis. Shown is the palindromic decameric double helix used. C*The five hydrogen bonds formed between G and G are indicated by horizontal lines. C*Means guanidinyl G-clamp;TMeans 2'-O-MOE-T.
FIG. 2 shows the guanidinyl G-clamp nucleoside analog and guanosine surrounding (at 1.25σ) confirming the formation of five hydrogen bonds, indicated by the thin solid line with the distance indicated by Å. Fourier (2F)0-Fc) Show the total electron density map.
FIG. 3 shows the base stacking that occurs between guanidinyl G-clamped nucleobase analogs and guanosine, viewed almost along the vertical line to the phenoxazine ring.
FIG. 4 shows degradation of oligonucleotides 157 (open triangles) and 158 (filled circles) with SVPD as determined by CGE analysis as a function of incubation time and of unmodified control oligonucleotide 159 (filled diamonds). Shown in comparison with decomposition.
FIG. 5 shows the hydrolysis rate of oligonucleotide 159 at BIPD as a function of the concentration of co-incubated oligonucleotides 157 (open triangles) and 158 (filled circles).
FIG. 6A shows the relative units of full length L / D chimeric oligonucleotides before administration to BalbC mice.
FIG. 6B shows the relative units of full length L / D chimeric oligonucleotides present in the liver 1 hour after administration of a 25 mg / kg dose with IV bolus into BalbC mice.
FIG. 6C shows the relative units of full length L / D chimeric oligonucleotides present in the kidney 1 hour after administration of a 25 mg / kg dose by IV bolus into BalbC mice.
FIG. 6D shows the relative units of full length L / D chimeric oligonucleotides present in the spleen 1 hour after administration of a 25 mg / kg dose by IV bolus into BalbC mice.
FIG. 6E shows the relative units of full length L / D chimeric oligonucleotides present in the lung 1 hour after administration of a 25 mg / kg dose by IV bolus into BalbC mice.
FIG. 7A shows the relative units of full length L / D chimeric oligonucleotides prior to administration to BalbC mice.
FIG. 7B shows the relative units of full-length L / D chimeric oligonucleotides present in the liver 24 hours after administration of a 25 mg / kg dose by IV bolus into BalbC mice.
FIG. 7C shows the relative units of full length L / D chimeric oligonucleotides present in the kidney 24 hours after administration of a 25 mg / kg dose by IV bolus into BalbC mice.
FIG. 7D shows the relative units of full length L / D chimeric oligonucleotides present in the spleen 24 hours after administration of a 25 mg / kg dose by IV bolus into BalbC mice.
FIG. 7E shows the relative units of full-length L / D chimeric oligonucleotides present in the lung 24 hours after administration of a 25 mg / kg dose with an IV bolus into BalbC mice.

Claims (101)

式V:
Figure 2005504020
で示されるオリゴマー化合物、
上記式中:
nは3〜約50であり;
各Yは、独立的に、ヌクレオシド間連結基であり;
は、酸素又はヌクレオシド間連結基であり;
は、酸素又はヌクレオシド間連結基であり;
各Bxは、任意に保護される複素環塩基部分であり;
各Aは、独立的に、水素又は糖置換基であり;
は、水素、ヒドロキシル保護基又は、
Figure 2005504020
から成る群から選択される修飾ヌクレオシドであり;
は、水素、ヒドロキシル保護基又は、
Figure 2005504020
から成る群から選択される修飾ヌクレオシドであり;
各Aは、独立的に、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アルカリール、O−アルキル、O−アリール、アミノ、置換アミノ、−SH、−SA、チオールエーテル、F、又はモルホリノであり;
各Aは、独立的に、H、硫黄保護基、アリール、アルカリール、置換若しくは非置換C−C10アルキル、置換若しくは非置換C−C10アルケニル、置換若しくは非置換C−C10アルキニル、又はアルカリールであり、上記置換はOA又はSAである;
各Aは、独立的に、H、窒素保護基、置換若しくは非置換C−C10アルキル、置換若しくは非置換C−C10アルケニル、置換若しくは非置換C−C10アルキニル、又はアルカリールであり、上記置換はOA又はSAである;
各Aは、独立的に、水素、C−C10アルキル、シクロアルキル又はアリールであり;
各Vは、独立的に、O又はSであり;
この場合に、WとWの少なくとも1つは、水素でもなく、またヒドロキシル保護基でもない、そして少なくとも1つのヌクレオシド間連結基は、ホスホジエステル連結基ではない。
Formula V:
Figure 2005504020
An oligomer compound represented by
In the above formula:
n is 3 to about 50;
Each Y 1 is independently an internucleoside linking group;
Y 2 is oxygen or an internucleoside linking group;
Y 3 is oxygen or an internucleoside linking group;
Each Bx is an optionally protected heterocyclic base moiety;
Each A 1 is independently hydrogen or a sugar substituent;
W 1 is hydrogen, a hydroxyl protecting group or
Figure 2005504020
A modified nucleoside selected from the group consisting of:
W 2 is hydrogen, a hydroxyl protecting group or
Figure 2005504020
A modified nucleoside selected from the group consisting of:
Each A 2 is independently alkyl, alkenyl, alkynyl, aryl, alkaryl, O-alkyl, O-aryl, amino, substituted amino, —SH, —SA 3 , thiol ether, F, or morpholino;
Each A 3 is independently H, sulfur protecting group, aryl, alkaryl, substituted or unsubstituted C 1 -C 10 alkyl, substituted or unsubstituted C 2 -C 10 alkenyl, substituted or unsubstituted C 2 -C 10 alkynyl, or alkaryl, where the substitution is OA 5 or SA 5 ;
Each A 4 is independently H, nitrogen protecting group, substituted or unsubstituted C 1 -C 10 alkyl, substituted or unsubstituted C 2 -C 10 alkenyl, substituted or unsubstituted C 2 -C 10 alkynyl, or A reel, the substitution is OA 5 or SA 5 ;
Each A 5 is independently hydrogen, C 1 -C 10 alkyl, cycloalkyl or aryl;
Each V 1 is independently O or S;
In this case, at least one of W 1 and W 2 is neither hydrogen nor a hydroxyl protecting group, and at least one internucleoside linking group is not a phosphodiester linking group.
nが、約8〜約30である、請求項1記載のオリゴマー化合物。The oligomeric compound of claim 1, wherein n is from about 8 to about 30. nが、約15〜約25である、請求項1記載のオリゴマー化合物。The oligomeric compound of claim 1, wherein n is from about 15 to about 25. 前記ヌクレオシド間連結基の各々が、リン含有ヌクレオシド間連結基である、請求項1記載のオリゴマー化合物。The oligomeric compound according to claim 1, wherein each of the internucleoside linking groups is a phosphorus-containing internucleoside linking group. 前記リン含有ヌクレオシド間連結基の各々が、独立的に、ホスホジエステル、ホスホロチオエート、キラル・ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、メチルホスホネート、アルキルホスホネート、5’−アルキレンホスホネート、キラル・ホスホネート、ホスフィネート、ホスホルアミデート、3’−アミノホスホルアミデート、アミノアルキルホスホルアミデート、チオノホスホルアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、セレノホスフェート、及びボラノホスフェートから成る群から選択される、請求項4記載のオリゴマー化合物。Each of the phosphorus-containing internucleoside linking groups is independently phosphodiester, phosphorothioate, chiral phosphorothioate, phosphorodithioate, phosphotriester, aminoalkyl phosphotriester, methyl phosphonate, alkyl phosphonate, 5′-alkylene phosphonate Chiral phosphonates, phosphinates, phosphoramidates, 3'-aminophosphoramidates, aminoalkyl phosphoramidates, thionophosphoramidates, thionoalkylphosphonates, thionoalkylphosphotriesters, selenophosphates, And the oligomeric compound of claim 4 selected from the group consisting of: and boranophosphate. 前記ヌクレオシド間連結基のいずれも、ホスホジエステル・ヌクレオシド間連結基ではない、請求項5記載のオリゴマー化合物。The oligomeric compound according to claim 5, wherein none of the internucleoside linking groups is a phosphodiester internucleoside linking group. 前記ヌクレオシド間連結基の90%より多くが、ホスホロチオエート・ヌクレオシド間連結基である、請求項5記載のオリゴマー化合物。6. The oligomeric compound of claim 5, wherein more than 90% of the internucleoside linking groups are phosphorothioate internucleoside linking groups. 前記ヌクレオシド間連結基の少なくとも1つが、非リン含有ヌクレオシド間連結基である、請求項1記載のオリゴマー化合物。The oligomeric compound according to claim 1, wherein at least one of the internucleoside linking groups is a non-phosphorus-containing internucleoside linking group. 前記ヌクレオシド間連結基の90%より多くが、非リン含有ヌクレオシド間連結基である、請求項8記載のオリゴマー化合物。9. The oligomeric compound of claim 8, wherein more than 90% of the internucleoside linking groups are non-phosphorus containing internucleoside linking groups. 前記非リン含有ヌクレオシド間連結基の各々が、独立的に、モルホリノ、シロキサン、スルフィド、スルホキシド、スルホン、ホルムアセチル、チオホルムアセチル、メチレンホルムアセチル、チオホルムアセチル、スルファメート、メチレンイミノ、メチレンヒドラジノ、スルホネート、スルホンアミド、及びアミドから成る群から選択される、請求項9記載のオリゴマー化合物。Each of the non-phosphorus-containing internucleoside linking groups is independently morpholino, siloxane, sulfide, sulfoxide, sulfone, formacetyl, thioformacetyl, methyleneformacetyl, thioformacetyl, sulfamate, methyleneimino, methylenehydrazino, 10. The oligomeric compound of claim 9, selected from the group consisting of sulfonates, sulfonamides, and amides. 前記ヌクレオシド間連結基の各々が、独立的に、−CH−NH−O−CH−、−CH−N(CH)−O−CH−若しくは−CH−O−N(CH)−CH−、−CH−N(CH)−N(CH)−CH−、又は−O−N(CH)−CH−CH−である、請求項10記載のオリゴマー化合物。Each of the internucleoside linking groups independently represents —CH 2 —NH—O—CH 2 —, —CH 2 —N (CH 3 ) —O—CH 2 —, or —CH 2 —O—N (CH 3) -CH 2 -, - CH 2 -N (CH 3) -N (CH 3) -CH 2 -, or -O-N (CH 3) -CH 2 -CH 2 - which is, according to claim 10, wherein Oligomeric compound. 前記オリゴマー化合物が、ギャップマー、ヘミマー又は逆ギャップマーである、請求項1記載のオリゴマー化合物。The oligomeric compound according to claim 1, wherein the oligomeric compound is a gapmer, hemimer or reverse gapmer. 前記ギャップマー、ヘミマー又は逆ギャップマーの少なくとも1つの領域において、少なくとも1つの2’−O−CHCH−O−CH糖置換基を含む、請求項12記載のオリゴマー化合物。The gapmer, at least one region of hemimer or reverse gapmer comprises at least one 2'-O-CH 2 CH 2 -O-CH 3 sugar substituents, claim 12 oligomeric compound according. Bxが多環状複素環塩基部分である、少なくとも1つのヌクレオシドを含む、請求項1記載のオリゴマー化合物。The oligomeric compound of claim 1, comprising at least one nucleoside wherein Bx is a polycyclic heterocyclic base moiety. 前記多環状複素環塩基部分の各々が、独立的に、式:
Figure 2005504020
で示され、上記式において、
がO又はSであり;
がCH、N−CH、O又はSであり;
各A及びAが水素であるか、又はA及びAの一方が水素であり、A及びAの他方が
Figure 2005504020
[式中、Gは−CN、−OA10、−SA10、−N(H)A10、−ON(H)A10若しくは−C(=NH)N(H)A10であり;QはH、−NHA10、−C(=O)N(H)A10、−C(=S)N(H)A10若しくは−C(=NH)N(H)A10であり;各Qは、独立的に、H若しくはPgであり;A10は、H、Pg、置換若しくは非置換C−C10アルキル、アセチル、ベンジル、−(CHp3NH、−(CHp3N(H)Pg、D若しくはLα−アミノ酸、又はD、L若しくはラセミα−アミノ酸に由来するペプチドであり;Pgは窒素、酸素若しくはチオール保護基であり;各p1は、独立的に、2〜約6であり;p2は1〜約3であり;そしてp3は1〜約4である]
から成る群から選択される、請求項14記載のオリゴマー化合物。
Each of the polycyclic heterocyclic base moieties is independently of the formula:
Figure 2005504020
In the above formula,
A 6 is O or S;
A 7 is CH 2 , N—CH 3 , O or S;
Each A 8 and A 9 is hydrogen, or one of A 8 and A 9 is hydrogen and the other of A 8 and A 9 is
Figure 2005504020
[Wherein G is —CN, —OA 10 , —SA 10 , —N (H) A 10 , —ON (H) A 10 or —C (═NH) N (H) A 10 ; Q 1 Are H, —NHA 10 , —C (═O) N (H) A 10 , —C (═S) N (H) A 10, or —C (═NH) N (H) A 10 ; 2 is independently H or Pg; A 10 is H, Pg, substituted or unsubstituted C 1 -C 10 alkyl, acetyl, benzyl, — (CH 2 ) p 3 NH 2 , — (CH 2 ) p3 N (H) Pg, D or Lα-amino acid, or a peptide derived from D, L or racemic α-amino acid; Pg is a nitrogen, oxygen or thiol protecting group; each p1 is independently 2 To about 6; p2 is from 1 to about 3; and p3 is from 1 to about 4]
15. The oligomeric compound of claim 14, selected from the group consisting of:
がヌクレオシド間連結基であり、Wが修飾ヌクレオシドである、請求項1記載のオリゴマー化合物。The oligomeric compound according to claim 1 , wherein Y 3 is an internucleoside linking group and W 1 is a modified nucleoside. がヌクレオシド間連結基であり、Wが修飾ヌクレオシドである、請求項1記載のオリゴマー化合物。The oligomeric compound according to claim 1, wherein Y 2 is an internucleoside linking group and W 2 is a modified nucleoside. 前記Bxの各々が、独立的に、アデニニル、グアニニル、チミニル、シトシニル、ウラシリル、5−メチルシトシニル(5−me−C)、5−ヒドロキシメチルシトシニル、キサンチニル、ヒポキサンチニル、2−アミノアデニニル、アデニニル及びグアニニルのアルキル誘導体、2−チオウラシリル、2−チオチミニル、2−チオシトシニル、5−ハロウラシリル、5−ハロシトシニル、5−プロピニルウラシリル、5−プロピニルシトシニル、6−アゾウラシリル、6−アゾシトシニル、6−アゾチミニル、5−ウラシリル(プソイドウラシル)、4−チオウラシリル、8−置換アデニニル及びグアニニル、5−置換ウラシリル及びシトシニル、7−メチルグアニニル、7−メチルアデニニル、8−アザグアニニル、8−アザアデニニル、7−デアザグアニニル、7−デアザアデニニル、3−デアザグアニニル及び3−デアザアデニニルから成る群から選択される、請求項1記載のオリゴマー化合物。Each of the Bx is independently an adenylyl, guanylyl, thyminyl, cytosynyl, urasilyl, 5-methylcytosinyl (5-me-C), 5-hydroxymethylcytosynyl, xanthinyl, hypoxanthinyl, 2-aminoadenynyl, adenynyl and guanylyl; Alkyl derivatives, 2-thiourasilyl, 2-thiothyminyl, 2-thiocytosinyl, 5-halourasilyl, 5-halocytosinyl, 5-propynylurasilyl, 5-propynylcytosinyl, 6-azourasilyl, 6-azocytosinyl, 6-azothyminyl, 5-urasilyl (Pseudouracil), 4-thiourasilyl, 8-substituted adenylyl and guaninyl, 5-substituted urasilyl and cytosynyl, 7-methylguaninyl, 7-methyladenyl, 8-azaguaninyl, 8-azaadeninyl 7 Deazaguaniniru, 7- Deazaadeniniru, 3- Deazaguaniniru and 3 is selected from the group consisting of Deazaadeniniru, wherein oligomeric compound of claim 1. 各糖置換基が、独立的に、C−C20アルキル、C−C20アルケニル、C−C20アルキニル、C−C20アリール、−O−アルキル、−O−アルケニル、−O−アルキニル、−O−アルキルアミノ、−O−アルキルアルコキシ、−O−アルキルアミノアルキル、−O−アルキルイミダゾール、−OH、−SH、−S−アルキル、−S−アルケニル、−S−アルキニル、−N(H)−アルキル、−N(H)−アルケニル、−N(H)−アルキニル、−N(アルキル)、−O−アリール、−S−アリール、−NH−アリール、−O−アラルキル、−S−アラルキル、−N(H)−アラルキル、フタルイミド(Nにおいて結合)、ハロゲン、アミノ、ケト(−C(=O)−R)、カルボキシル(−C(=O)OH)、ニトロ(−NO)、ニトロソ(−N=O)、シアノ(−CN)、トリフルオロメチル(−CF)、トリフルオロメトキシ(−O−CF)、イミダゾール、アジド(−N)、ヒドラジノ(−N(H)−NH)、アミノオキシ(−O−NH)、イソシアナト(−N=C=O)、スルホキシド(−S(=O)−R)、スルホン(−S(=O)−R)、ジスルフィド(−S−S−R)、シリル、ヘテロサイクリル、カルボサイクリル、インターカレーター、レポーター基、コンジュゲート基、ポリアミン、ポリアミド、ポリアルキレングリコール、又は式(−O−アルキル)(式中、mは1〜約10である)で示されるポリエーテルであり、この場合、各Rは、独立的に、水素、保護基、又は置換若しくは非置換アルキル、アルケニル又はアルキニルであり、これらにおいて、置換基はハロアルキル、アルケニル、アルコキシ、チオアルコキシ、ハロアルコキシ又はアリール、並びにハロゲン、ヒドロキシル、アミノ、アジド、カルボキシ、シアノ、ニトロ、メルカプト、スルフィド基、スルホニル基及びスルホキシド基から選択される;
或いは、各糖置換基が、式I又はIIのいずれかを有する:
Figure 2005504020
上記式において、
はO、S若しくはNHであり;
Jは単結合、O若しくはC(=O)であり;
EはC−C10アルキル、N(R)(R)、N(R)(R)、N=C(R5a)(R6a)、N=C(R5a)(R7a)であるか、又は式III:
Figure 2005504020
を有する;
各R、R、R11及びR12は、独立的に、水素、C(O)R13、置換若しくは非置換C−C10アルキル、置換若しくは非置換C−C10アルケニル、置換若しくは非置換C−C10アルキニル、アルキルスルホニル、アリールスルホニル、化学官能基若しくはコンジュゲート基であり、この場合、置換基は、ヒドロキシル、アミノ、アルコキシ、カルボキシ、ベンジル、フェニル、ニトロ、チオール、チオアルコキシ、ハロゲン、アルキル、アリール、アルケニル及びアルキニルから選択される;
又は任意に、R11とR12は一緒に、それらが結合する窒素原子と共にフタルイミド部分を形成する;
各R13は、独立的に、置換若しくは非置換C−C10アルキル、トリフルオロメチル、シアノエチルオキシ、メトキシ、エトキシ、t−ブトキシ、アリルオキシ、9−フルオレニルメトキシ、2−(トリメチルシリル)−エトキシ、2,2,2−トリクロロエトキシ、ベンジルオキシ、ブチリル、イソ−ブチリル、フェニル又はアリールであり;
は、水素、窒素保護基又は−T−Lであり;
5aは、水素、窒素保護基又は−T−Lであり;
Tは、結合又は連結部分であり;
Lは、化学官能基、コンジュゲート基又は固体支持体であり;
各RとRは、独立的に、H、窒素保護基、置換若しくは非置換C−C10アルキル、置換若しくは非置換C−C10アルケニル、置換若しくは非置換C−C10アルキニルであり、これらにおいて、置換基は、ヒドロキシル、アミノ、アルコキシ、カルボキシ、ベンジル、フェニル、ニトロ、チオール、チオアルコキシ、ハロゲン、アルキル、アリール、アルケニル、アルキニル、NH 、N(R14)(R15)、グアニジノ及びアシルから選択され、前記アシルは、酸アミド又はエステルである;
或いは、RとRは一緒に、窒素保護基であるか、又はN及びOから選択される付加的ヘテロ原子を任意に包含する環構造として結合するか、又は化学官能基である;
各R14とR15は、独立的に、H、C−C10アルキル、窒素保護基であるか、又はR14とR15は一緒に、窒素保護基である;
或いは、R14とR15は、N及びOから選択される付加的ヘテロ原子を任意に包含する環構造として結合する;
は、OX、SX、又はN(X)であり;
各Xは、独立的に、H、C−Cアルキル、C−Cハロアルキル、C(=NH)N(H)R16、C(=O)N(H)R16又はOC(=O)N(H)R16である;
16は、H又はC−Cアルキルであり;
、Z及びZは、約4〜約7個の炭素原子を有するか又は約3〜約6個の炭素原子と1若しくは2個のヘテロ原子とを有し、前記ヘテロ原子が酸素、窒素及び硫黄から選択される環系を含み、前記環系は脂肪族、不飽和脂肪族、芳香族、又は飽和若しくは不飽和複素環式であり;
は、1〜約10個の炭素原子を有するアルキル若しくはハロアルキル、2〜約10個の炭素原子を有するアルケニル、2〜約10個の炭素原子を有するアルキニル、6〜約14個の炭素原子を有するアリール、N(R)(R)OR、ハロ、SR又はCNであり;
各q1は、独立的に、1〜10の整数であり;
各q2は、独立的に、0又は1であり;
q3は0又は1〜10の整数であり;
q4は、1〜10の整数であり;
q5は、0、1又は2から選択される;ただし、q3が0であるときに、q4は1より大きい、請求項1記載のオリゴマー化合物。
Each sugar substituents, independently, C 1 -C 20 alkyl, C 2 -C 20 alkenyl, C 2 -C 20 alkynyl, C 5 -C 20 aryl, -O- alkyl, -O- alkenyl, -O -Alkynyl, -O-alkylamino, -O-alkylalkoxy, -O-alkylaminoalkyl, -O-alkylimidazole, -OH, -SH, -S-alkyl, -S-alkenyl, -S-alkynyl,- N (H) -alkyl, -N (H) -alkenyl, -N (H) -alkynyl, -N (alkyl) 2 , -O-aryl, -S-aryl, -NH-aryl, -O-aralkyl, -S-aralkyl, -N (H) -aralkyl, phthalimide (bonded at N), halogen, amino, keto (-C (= O) -R), carboxyl (-C (= O) OH), nitro (-NO 2), nitroso (-N = O), cyano (-CN), trifluoromethyl (-CF 3), trifluoromethoxy (-O-CF 3), imidazole, azido (-N 3), hydrazino (—N (H) —NH 2 ), aminooxy (—O—NH 2 ), isocyanato (—N═C═O), sulfoxide (—S (═O) —R), sulfone (—S (═O) ) 2 -R), disulfide (—S—S—R), silyl, heterocyclyl, carbocyclyl, intercalator, reporter group, conjugate group, polyamine, polyamide, polyalkylene glycol, or formula (—O— alkyl) m (wherein, m is a polyether represented by 1 to about 10), where each R is independently hydrogen, a protecting group, or a substituted or unsubstituted alkyl, a Kenyl or alkynyl, in which the substituents are haloalkyl, alkenyl, alkoxy, thioalkoxy, haloalkoxy or aryl, and halogen, hydroxyl, amino, azide, carboxy, cyano, nitro, mercapto, sulfide group, sulfonyl group and sulfoxide Selected from the group;
Alternatively, each sugar substituent has either formula I or II:
Figure 2005504020
In the above formula,
Z 0 is O, S or NH;
J is a single bond, O or C (= O);
E is C 1 -C 10 alkyl, N (R 5 ) (R 6 ), N (R 5 ) (R 7 ), N = C (R 5a ) (R 6a ), N = C (R 5a ) (R 7a ) or formula III:
Figure 2005504020
Having:
Each R 8 , R 9 , R 11 and R 12 is independently hydrogen, C (O) R 13 , substituted or unsubstituted C 1 -C 10 alkyl, substituted or unsubstituted C 2 -C 10 alkenyl, substituted Or an unsubstituted C 2 -C 10 alkynyl, alkylsulfonyl, arylsulfonyl, chemical functional group or conjugate group, where the substituents are hydroxyl, amino, alkoxy, carboxy, benzyl, phenyl, nitro, thiol, thio Selected from alkoxy, halogen, alkyl, aryl, alkenyl and alkynyl;
Or optionally, R 11 and R 12 together form a phthalimide moiety with the nitrogen atom to which they are attached;
Each R 13 is independently substituted or unsubstituted C 1 -C 10 alkyl, trifluoromethyl, cyanoethyloxy, methoxy, ethoxy, t-butoxy, allyloxy, 9-fluorenylmethoxy, 2- (trimethylsilyl)- Ethoxy, 2,2,2-trichloroethoxy, benzyloxy, butyryl, iso-butyryl, phenyl or aryl;
R 5 is hydrogen, a nitrogen protecting group, or -TL;
R 5a is hydrogen, a nitrogen protecting group, or -TL;
T is a bond or linking moiety;
L is a chemical functional group, a conjugate group or a solid support;
Each R 6 and R 7 is independently H, nitrogen protecting group, substituted or unsubstituted C 1 -C 10 alkyl, substituted or unsubstituted C 2 -C 10 alkenyl, substituted or unsubstituted C 2 -C 10 alkynyl. In which the substituents are hydroxyl, amino, alkoxy, carboxy, benzyl, phenyl, nitro, thiol, thioalkoxy, halogen, alkyl, aryl, alkenyl, alkynyl, NH 3 + , N (R 14 ) (R 15 ), selected from guanidino and acyl, wherein the acyl is an acid amide or ester;
Alternatively, R 6 and R 7 together are a nitrogen protecting group, or are attached as a ring structure optionally including additional heteroatoms selected from N and O, or are chemical functional groups;
Each R 14 and R 15 is independently H, C 1 -C 10 alkyl, a nitrogen protecting group, or R 14 and R 15 together are a nitrogen protecting group;
Alternatively, R 14 and R 15 are attached as a ring structure optionally including additional heteroatoms selected from N and O;
Z 4 is OX, SX, or N (X) 2 ;
Each X is independently H, C 1 -C 8 alkyl, C 1 -C 8 haloalkyl, C (═NH) N (H) R 16 , C (═O) N (H) R 16 or OC ( = O) N (H) R 16 ;
R 16 is H or C 1 -C 8 alkyl;
Z 1 , Z 2 and Z 3 have from about 4 to about 7 carbon atoms, or from about 3 to about 6 carbon atoms and 1 or 2 heteroatoms, wherein the heteroatoms are oxygen A ring system selected from nitrogen and sulfur, said ring system being aliphatic, unsaturated aliphatic, aromatic, or saturated or unsaturated heterocyclic;
Z 5 is alkyl or haloalkyl having 1 to about 10 carbon atoms, alkenyl having 2 to about 10 carbon atoms, alkynyl having 2 to about 10 carbon atoms, 6 to about 14 carbon atoms Aryl having the following formula: N (R 5 ) (R 6 ) OR 5 , halo, SR 5 or CN;
Each q1 is independently an integer from 1 to 10;
Each q2 is independently 0 or 1;
q3 is 0 or an integer from 1 to 10;
q4 is an integer from 1 to 10;
The oligomeric compound according to claim 1, wherein q5 is selected from 0, 1 or 2; provided that q4 is greater than 1 when q3 is 0.
前記糖置換基の各々が、独立的に、−O−CHCHOCH、−O(CHON(CH、−O−(CH−O−(CH−N(CH、−O−CH、−OCHCHCHNH、−CH−CH=CH、又はフルオロである、請求項19記載のオリゴマー化合物。Each of the sugar substituents is independently —O—CH 2 CH 2 OCH 3 , —O (CH 2 ) 2 ON (CH 3 ) 2 , —O— (CH 2 ) 2 —O— (CH 2 ) 2 -N (CH 3) 2 , -O-CH 3, -OCH 2 CH 2 CH 2 NH 2, -CH 2 -CH = CH 2, or fluoro, claim 19 oligomeric compound according. オリゴマー化合物のヌクレアーゼ耐性を強化する方法であって、前記オリゴマー化合物の3’又は5’末端に少なくとも1つの修飾ヌクレオシドを与えて、式V:
Figure 2005504020
で示される修飾オリゴマー化合物を得ることを含み、上記式において、
nは、3〜約50であり;
各Yは、独立的に、ヌクレオシド間連結基であり;
は、酸素又はヌクレオシド間連結基であり;
は、酸素又はヌクレオシド間連結基であり;
各Bxは、任意に保護される複素環塩基部分であり;
各Aは、独立的に、水素又は糖置換基であり;
は、水素、ヒドロキシル保護基又は、
Figure 2005504020
から成る群から選択される修飾ヌクレオシドであり;
は、水素、ヒドロキシル保護基又は、
Figure 2005504020
から成る群から選択される修飾ヌクレオシドであり;
各Aは、独立的に、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アルカリール、O−アルキル、O−アリール、アミノ、置換アミノ、−SH、−SA、チオールエーテル、F、又はモルホリノであり;
各Aは、独立的に、H、硫黄保護基、アリール、アルカリール、置換若しくは非置換C−C10アルキル、置換若しくは非置換C−C10アルケニル、置換若しくは非置換C−C10アルキニル、又はアルカリールであり、この場合、前記置換はOA又はSAである;
各Aは、独立的に、H、窒素保護基、置換若しくは非置換C−C10アルキル、置換若しくは非置換C−C10アルケニル、置換若しくは非置換C−C10アルキニル、又はアルカリールであり、この場合、前記置換はOA又はSAである;
各Aは、独立的に、水素、C−C10アルキル、シクロアルキル又はアリールであり;
各Vは、独立的に、O又はSであり;
この場合、W及びWの少なくとも一方は水素でもなく、またヒドロキシル保護基でもない方法。
A method for enhancing the nuclease resistance of an oligomeric compound, wherein at least one modified nucleoside is provided at the 3 ′ or 5 ′ end of the oligomeric compound to obtain a compound of formula V:
Figure 2005504020
In which the modified oligomeric compound represented by:
n is from 3 to about 50;
Each Y 1 is independently an internucleoside linking group;
Y 2 is oxygen or an internucleoside linking group;
Y 3 is oxygen or an internucleoside linking group;
Each Bx is an optionally protected heterocyclic base moiety;
Each A 1 is independently hydrogen or a sugar substituent;
W 1 is hydrogen, a hydroxyl protecting group or
Figure 2005504020
A modified nucleoside selected from the group consisting of:
W 2 is hydrogen, a hydroxyl protecting group or
Figure 2005504020
A modified nucleoside selected from the group consisting of:
Each A 2 is independently alkyl, alkenyl, alkynyl, aryl, alkaryl, O-alkyl, O-aryl, amino, substituted amino, —SH, —SA 3 , thiol ether, F, or morpholino;
Each A 3 is independently H, sulfur protecting group, aryl, alkaryl, substituted or unsubstituted C 1 -C 10 alkyl, substituted or unsubstituted C 2 -C 10 alkenyl, substituted or unsubstituted C 2 -C 10 alkynyl, or alkaryl, in which case the substitution is OA 5 or SA 5 ;
Each A 4 is independently H, nitrogen protecting group, substituted or unsubstituted C 1 -C 10 alkyl, substituted or unsubstituted C 2 -C 10 alkenyl, substituted or unsubstituted C 2 -C 10 alkynyl, or A reel, in which case the substitution is OA 5 or SA 5 ;
Each A 5 is independently hydrogen, C 1 -C 10 alkyl, cycloalkyl or aryl;
Each V 1 is independently O or S;
In this case, at least one of W 1 and W 2 is neither hydrogen nor a hydroxyl protecting group.
nが、約8〜約30である、請求項21記載の方法。The method of claim 21, wherein n is from about 8 to about 30. nが、約15〜約25である、請求項21記載の方法。The method of claim 21, wherein n is from about 15 to about 25. 前記ヌクレオシド間連結基の各々が、リン含有ヌクレオシド間連結基である、請求項21記載の方法。24. The method of claim 21, wherein each of the internucleoside linking groups is a phosphorus-containing internucleoside linking group. 前記リン含有ヌクレオシド間連結基の各々が、ホスホジエステル、ホスホロチオエート、キラル・ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、メチルホスホネート、アルキルホスホネート、5’−アルキレンホスホネート、キラル・ホスホネート、ホスフィネート、ホスホルアミデート、3’−アミノホスホルアミデート、アミノアルキルホスホルアミデート、チオノホスホルアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、セレノホスフェート及びボラノホスフェートから成る群から選択される、請求項24記載の方法。Each of the phosphorus-containing internucleoside linking groups is a phosphodiester, phosphorothioate, chiral phosphorothioate, phosphorodithioate, phosphotriester, aminoalkylphosphotriester, methylphosphonate, alkylphosphonate, 5′-alkylenephosphonate, chiral phosphonate Phosphinates, phosphoramidates, 3'-aminophosphoramidates, aminoalkyl phosphoramidates, thionophosphoramidates, thionoalkylphosphonates, thionoalkylphosphotriesters, selenophosphates and boranophosphates 25. The method of claim 24, selected from the group consisting of: 前記ヌクレオシド間連結基のいずれも、ホスホジエステルヌクレオシド間連結基ではない、請求項25記載の方法。26. The method of claim 25, wherein none of the internucleoside linking groups is a phosphodiester internucleoside linking group. 前記ヌクレオシド間連結基の90%より多くが、ホスホジエステルヌクレオシド間連結基である、請求項25記載の方法。26. The method of claim 25, wherein more than 90% of the internucleoside linking groups are phosphodiester internucleoside linking groups. 前記ヌクレオシド間連結基の少なくとも1つが、非リン含有ヌクレオシド間連結基である、請求項21記載の方法。24. The method of claim 21, wherein at least one of the internucleoside linking groups is a non-phosphorus containing internucleoside linking group. 前記ヌクレオシド間連結基の90%より多くが、非リン含有ヌクレオシド間連結基である、請求項28記載の方法。30. The method of claim 28, wherein more than 90% of the internucleoside linking groups are non-phosphorus containing internucleoside linking groups. 前記非リン含有ヌクレオシド間連結基の各々が、独立的に、モルホリノ、シロキサン、スルフィド、スルホキシド、スルホン、ホルムアセチル、チオホルムアセチル、メチレンホルムアセチル、チオホルムアセチル、スルファメート、メチレンイミノ、メチレンヒドラジノ、スルホネート、スルホンアミド、及びアミドから成る群から選択される、請求項29記載の方法。Each of the non-phosphorus-containing internucleoside linking groups is independently morpholino, siloxane, sulfide, sulfoxide, sulfone, formacetyl, thioformacetyl, methyleneformacetyl, thioformacetyl, sulfamate, methyleneimino, methylenehydrazino, 30. The method of claim 29, selected from the group consisting of sulfonates, sulfonamides, and amides. 前記ヌクレオシド間連結基の各々が、独立的に、−CH−NH−O−CH−、−CH−N(CH)−O−CH−、−CH−O−N(CH)−CH−、−CH−N(CH)−N(CH)−CH−、又は−O−N(CH)−CH−CH−である、請求項30記載の方法。Each of the internucleoside linking groups independently represents —CH 2 —NH—O—CH 2 —, —CH 2 —N (CH 3 ) —O—CH 2 —, —CH 2 —O—N (CH 3) -CH 2 -, - CH 2 -N (CH 3) -N (CH 3) -CH 2 -, or -O-N (CH 3) -CH 2 -CH 2 - which is, according to claim 30, wherein the method of. 前記オリゴマー化合物が、ギャップマー、ヘミマー又は逆ギャップマーである、請求項21記載の方法。24. The method of claim 21, wherein the oligomeric compound is a gapmer, hemimer, or reverse gapmer. オリゴマー化合物が、前記ギャップマー、ヘミマー又は逆ギャップマーの少なくとも1つの領域において、少なくとも1つの2’−O−CHCH−O−CH糖置換基を含む、請求項32記載の方法。Oligomeric compounds, the gapmer, at least one region of hemimer or reverse gapmer comprises at least one 2'-O-CH 2 CH 2 -O-CH 3 sugar substituent method of claim 32, wherein. Bxが多環状複素環塩基部分である、少なくとも1つのヌクレオシドを含む、請求項21記載の方法。24. The method of claim 21, comprising at least one nucleoside wherein Bx is a polycyclic heterocyclic base moiety. 前記多環状複素環塩基部分の各々が、独立的に、式:
Figure 2005504020
で示され、上記式において、
がO又はSであり;
がCH、N−CH、O又はSであり;
各A及びAが水素であるか、又はA及びAの一方が水素であり、A及びAの他方が
Figure 2005504020
[式中、Gは−CN、−OA10、−SA10、−N(H)A10、−ON(H)A10若しくは−C(=NH)N(H)A10であり;QはH、−NHA10、−C(=O)N(H)A10、−C(=S)N(H)A10若しくは−C(=NH)N(H)A10であり;各Qは、独立的に、H若しくはPgであり;A10は、H、Pg、置換若しくは非置換C−C10アルキル、アセチル、ベンジル、−(CHp3NH、−(CHp3N(H)Pg、D若しくはLα−アミノ酸、又はD、L若しくはラセミα−アミノ酸に由来するペプチドであり;Pgは窒素、酸素若しくはチオール保護基であり;各p1は、独立的に、2〜約6であり;p2は1〜約3であり;そしてp3は1〜約4である]
から成る群から選択される、請求項34記載の方法。
Each of the polycyclic heterocyclic base moieties is independently of the formula:
Figure 2005504020
In the above formula,
A 6 is O or S;
A 7 is CH 2 , N—CH 3 , O or S;
Each A 8 and A 9 is hydrogen, or one of A 8 and A 9 is hydrogen and the other of A 8 and A 9 is
Figure 2005504020
[Wherein G is —CN, —OA 10 , —SA 10 , —N (H) A 10 , —ON (H) A 10 or —C (═NH) N (H) A 10 ; Q 1 Are H, —NHA 10 , —C (═O) N (H) A 10 , —C (═S) N (H) A 10, or —C (═NH) N (H) A 10 ; 2 is independently H or Pg; A 10 is H, Pg, substituted or unsubstituted C 1 -C 10 alkyl, acetyl, benzyl, — (CH 2 ) p 3 NH 2 , — (CH 2 ) p3 N (H) Pg, D or Lα-amino acid, or a peptide derived from D, L or racemic α-amino acid; Pg is a nitrogen, oxygen or thiol protecting group; each p1 is independently 2 To about 6; p2 is from 1 to about 3; and p3 is from 1 to about 4]
35. The method of claim 34, selected from the group consisting of:
がヌクレオシド間連結基であり、Wが修飾ヌクレオシドである、請求項21記載の方法。Y 3 is an internucleoside linking group, W 1 is a modified nucleosides The method of claim 21, wherein. がヌクレオシド間連結基であり、Wが修飾ヌクレオシドである、請求項21記載の方法。The method of claim 21, wherein Y 2 is an internucleoside linking group and W 2 is a modified nucleoside. 前記Bxの各々が、独立的に、アデニニル、グアニニル、チミニル、シトシニル、ウラシリル、5−メチルシトシニル(5−me−C)、5−ヒドロキシメチルシトシニル、キサンチニル、ヒポキサンチニル、2−アミノアデニニル、アデニニル及びグアニニルのアルキル誘導体、2−チオウラシリル、2−チオチミニル、2−チオシトシニル、5−ハロウラシリル、5−ハロシトシニル、5−プロピニルウラシリル、5−プロピニルシトシニル、6−アゾウラシリル、6−アゾシトシニル、6−アゾチミニル、5−ウラシリル(プソイドウラシル)、4−チオウラシリル、8−置換アデニニル及びグアニニル、5−置換ウラシリル及びシトシニル、7−メチルグアニニル、7−メチルアデニニル、8−アザグアニニル、8−アザアデニニル、7−デアザグアニニル、7−デアザアデニニル、3−デアザグアニニル及び3−デアザアデニニルから成る群から選択される、請求項21記載の方法。Each of the Bx is independently an adenylyl, guanylyl, thyminyl, cytosynyl, urasilyl, 5-methylcytosinyl (5-me-C), 5-hydroxymethylcytosynyl, xanthinyl, hypoxanthinyl, 2-aminoadenynyl, adenynyl and guanylyl; Alkyl derivatives, 2-thiourasilyl, 2-thiothyminyl, 2-thiocytosinyl, 5-halourasilyl, 5-halocytosinyl, 5-propynylurasilyl, 5-propynylcytosinyl, 6-azourasilyl, 6-azocytosinyl, 6-azothyminyl, 5-urasilyl (Pseudouracil), 4-thiourasilyl, 8-substituted adenylyl and guaninyl, 5-substituted urasilyl and cytosynyl, 7-methylguaninyl, 7-methyladenyl, 8-azaguaninyl, 8-azaadeninyl 7 Deazaguaniniru, 7- Deazaadeniniru, 3- Deazaguaniniru and 3 is selected from the group consisting of Deazaadeniniru The method of claim 21, wherein. 各糖置換基が、独立的に、C−C20アルキル、C−C20アルケニル、C−C20アルキニル、C−C20アリール、−O−アルキル、−O−アルケニル、−O−アルキニル、−O−アルキルアミノ、−O−アルキルアルコキシ、−O−アルキルアミノアルキル、−O−アルキルイミダゾール、−OH、−SH、−S−アルキル、−S−アルケニル、−S−アルキニル、−N(H)−アルキル、−N(H)−アルケニル、−N(H)−アルキニル、−N(アルキル)、−O−アリール、−S−アリール、−NH−アリール、−O−アラルキル、−S−アラルキル、−N(H)−アラルキル、フタルイミド(Nにおいて結合)、ハロゲン、アミノ、ケト(−C(=O)−R)、カルボキシル(−C(=O)OH)、ニトロ(−NO)、ニトロソ(−N=O)、シアノ(−CN)、トリフルオロメチル(−CF)、トリフルオロメトキシ(−O−CF)、イミダゾール、アジド(−N)、ヒドラジノ(−N(H)−NH)、アミノオキシ(−O−NH)、イソシアナト(−N=C=O)、スルホキシド(−S(=O)−R)、スルホン(−S(=O)−R)、ジスルフィド(−S−S−R)、シリル、ヘテロサイクリル、カルボサイクリル、インターカレーター、レポーター基、コンジュゲート基、ポリアミン、ポリアミド、ポリアルキレングリコール、又は式(−O−アルキル)(式中、mは1〜約10である)で示されるポリエーテルであり、この場合、各Rは、独立的に、水素、保護基、又は置換若しくは非置換アルキル、アルケニル又はアルキニルであり、これらにおいて、置換基はハロアルキル、アルケニル、アルコキシ、チオアルコキシ、ハロアルコキシ又はアリール、並びにハロゲン、ヒドロキシル、アミノ、アジド、カルボキシ、シアノ、ニトロ、メルカプト、スルフィド基、スルホニル基及びスルホキシド基から選択される;
或いは、各糖置換基が、式I又はIIのいずれかを有する:
Figure 2005504020
上記式において、
はO、S若しくはNHであり;
Jは単結合、O若しくはC(=O)であり;
EはC−C10アルキル、N(R)(R)、N(R)(R)、N=C(R5a)(R6a)、N=C(R5a)(R7a)であるか、又は式III:
Figure 2005504020
を有する;
各R、R、R11及びR12は、独立的に、水素、C(O)R13、置換若しくは非置換C−C10アルキル、置換若しくは非置換C−C10アルケニル、置換若しくは非置換C−C10アルキニル、アルキルスルホニル、アリールスルホニル、化学官能基若しくはコンジュゲート基であり、この場合、置換基は、ヒドロキシル、アミノ、アルコキシ、カルボキシ、ベンジル、フェニル、ニトロ、チオール、チオアルコキシ、ハロゲン、アルキル、アリール、アルケニル及びアルキニルから選択される;
又は任意に、R11とR12は一緒に、それらが結合する窒素原子と共にフタルイミド部分を形成する;
各R13は、独立的に、置換若しくは非置換C−C10アルキル、トリフルオロメチル、シアノエチルオキシ、メトキシ、エトキシ、t−ブトキシ、アリルオキシ、9−フルオレニルメトキシ、2−(トリメチルシリル)−エトキシ、2,2,2−トリクロロエトキシ、ベンジルオキシ、ブチリル、イソ−ブチリル、フェニル又はアリールであり;
は、水素、窒素保護基又は−T−Lであり;
5aは、水素、窒素保護基又は−T−Lであり;
Tは、結合又は連結部分であり;
Lは、化学官能基、コンジュゲート基又は固体支持体であり;
各RとRは、独立的に、H、窒素保護基、置換若しくは非置換C−C10アルキル、置換若しくは非置換C−C10アルケニル、置換若しくは非置換C−C10アルキニルであり、これらにおいて、置換基は、ヒドロキシル、アミノ、アルコキシ、カルボキシ、ベンジル、フェニル、ニトロ、チオール、チオアルコキシ、ハロゲン、アルキル、アリール、アルケニル、アルキニル、NH 、N(R14)(R15)、グアニジノ及びアシルから選択され、前記アシルは、酸アミド又はエステルである;
或いは、RとRは一緒に、窒素保護基であるか、又はN及びOから選択される付加的ヘテロ原子を任意に包含する環構造として結合するか、又は化学官能基である;
各R14とR15は、独立的に、H、C−C10アルキル、窒素保護基であるか、又はR14とR15は一緒に、窒素保護基である;
或いは、R14とR15は、N及びOから選択される付加的ヘテロ原子を任意に包含する環構造として結合する;
は、OX、SX、又はN(X)であり;
各Xは、独立的に、H、C−Cアルキル、C−Cハロアルキル、C(=NH)N(H)R16、C(=O)N(H)R16又はOC(=O)N(H)R16である;
16はH又はC−Cアルキルであり;
、Z及びZは、約4〜約7個の炭素原子を有するか又は約3〜約6個の炭素原子と1若しくは2個のヘテロ原子とを有し、前記ヘテロ原子が酸素、窒素及び硫黄から選択される環系を含み、前記環系は脂肪族、不飽和脂肪族、芳香族、又は飽和若しくは不飽和複素環式であり;
は、1〜約10個の炭素原子を有するアルキル若しくはハロアルキル、2〜約10個の炭素原子を有するアルケニル、2〜約10個の炭素原子を有するアルキニル、6〜約14個の炭素原子を有するアリール、N(R)(R)OR、ハロ、SR又はCNであり;
各q1は、独立的に、1〜10の整数であり;
各q2は、独立的に、0又は1であり;
q3は0又は1〜10の整数であり;
q4は、1〜10の整数であり;
q5は、0、1又は2から選択される;ただし、q3が0であるときに、q4は1より大きい、請求項21記載の方法。
Each sugar substituents, independently, C 1 -C 20 alkyl, C 2 -C 20 alkenyl, C 2 -C 20 alkynyl, C 5 -C 20 aryl, -O- alkyl, -O- alkenyl, -O -Alkynyl, -O-alkylamino, -O-alkylalkoxy, -O-alkylaminoalkyl, -O-alkylimidazole, -OH, -SH, -S-alkyl, -S-alkenyl, -S-alkynyl,- N (H) -alkyl, -N (H) -alkenyl, -N (H) -alkynyl, -N (alkyl) 2 , -O-aryl, -S-aryl, -NH-aryl, -O-aralkyl, -S-aralkyl, -N (H) -aralkyl, phthalimide (bonded at N), halogen, amino, keto (-C (= O) -R), carboxyl (-C (= O) OH), nitro (-NO 2), nitroso (-N = O), cyano (-CN), trifluoromethyl (-CF 3), trifluoromethoxy (-O-CF 3), imidazole, azido (-N 3), hydrazino (—N (H) —NH 2 ), aminooxy (—O—NH 2 ), isocyanato (—N═C═O), sulfoxide (—S (═O) —R), sulfone (—S (═O) ) 2 -R), disulfide (—S—S—R), silyl, heterocyclyl, carbocyclyl, intercalator, reporter group, conjugate group, polyamine, polyamide, polyalkylene glycol, or formula (—O— alkyl) m (wherein, m is a polyether represented by 1 to about 10), where each R is independently hydrogen, a protecting group, or a substituted or unsubstituted alkyl, a Kenyl or alkynyl, in which the substituents are haloalkyl, alkenyl, alkoxy, thioalkoxy, haloalkoxy or aryl, and halogen, hydroxyl, amino, azide, carboxy, cyano, nitro, mercapto, sulfide group, sulfonyl group and sulfoxide Selected from the group;
Alternatively, each sugar substituent has either formula I or II:
Figure 2005504020
In the above formula,
Z 0 is O, S or NH;
J is a single bond, O or C (= O);
E is C 1 -C 10 alkyl, N (R 5 ) (R 6 ), N (R 5 ) (R 7 ), N = C (R 5a ) (R 6a ), N = C (R 5a ) (R 7a ) or formula III:
Figure 2005504020
Having:
Each R 8 , R 9 , R 11 and R 12 is independently hydrogen, C (O) R 13 , substituted or unsubstituted C 1 -C 10 alkyl, substituted or unsubstituted C 2 -C 10 alkenyl, substituted Or an unsubstituted C 2 -C 10 alkynyl, alkylsulfonyl, arylsulfonyl, chemical functional group or conjugate group, where the substituents are hydroxyl, amino, alkoxy, carboxy, benzyl, phenyl, nitro, thiol, thio Selected from alkoxy, halogen, alkyl, aryl, alkenyl and alkynyl;
Or optionally, R 11 and R 12 together form a phthalimide moiety with the nitrogen atom to which they are attached;
Each R 13 is independently substituted or unsubstituted C 1 -C 10 alkyl, trifluoromethyl, cyanoethyloxy, methoxy, ethoxy, t-butoxy, allyloxy, 9-fluorenylmethoxy, 2- (trimethylsilyl)- Ethoxy, 2,2,2-trichloroethoxy, benzyloxy, butyryl, iso-butyryl, phenyl or aryl;
R 5 is hydrogen, a nitrogen protecting group, or -TL;
R 5a is hydrogen, a nitrogen protecting group, or -TL;
T is a bond or linking moiety;
L is a chemical functional group, a conjugate group or a solid support;
Each R 6 and R 7 is independently H, nitrogen protecting group, substituted or unsubstituted C 1 -C 10 alkyl, substituted or unsubstituted C 2 -C 10 alkenyl, substituted or unsubstituted C 2 -C 10 alkynyl. In which the substituents are hydroxyl, amino, alkoxy, carboxy, benzyl, phenyl, nitro, thiol, thioalkoxy, halogen, alkyl, aryl, alkenyl, alkynyl, NH 3 + , N (R 14 ) (R 15 ), selected from guanidino and acyl, wherein the acyl is an acid amide or ester;
Alternatively, R 6 and R 7 together are a nitrogen protecting group, or are attached as a ring structure optionally including additional heteroatoms selected from N and O, or are chemical functional groups;
Each R 14 and R 15 is independently H, C 1 -C 10 alkyl, a nitrogen protecting group, or R 14 and R 15 together are a nitrogen protecting group;
Alternatively, R 14 and R 15 are attached as a ring structure optionally including additional heteroatoms selected from N and O;
Z 4 is OX, SX, or N (X) 2 ;
Each X is independently H, C 1 -C 8 alkyl, C 1 -C 8 haloalkyl, C (═NH) N (H) R 16 , C (═O) N (H) R 16 or OC ( = O) N (H) R 16 ;
R 16 is H or C 1 -C 8 alkyl;
Z 1 , Z 2 and Z 3 have from about 4 to about 7 carbon atoms, or from about 3 to about 6 carbon atoms and 1 or 2 heteroatoms, wherein the heteroatoms are oxygen A ring system selected from nitrogen and sulfur, said ring system being aliphatic, unsaturated aliphatic, aromatic, or saturated or unsaturated heterocyclic;
Z 5 is alkyl or haloalkyl having 1 to about 10 carbon atoms, alkenyl having 2 to about 10 carbon atoms, alkynyl having 2 to about 10 carbon atoms, 6 to about 14 carbon atoms Aryl having the following formula: N (R 5 ) (R 6 ) OR 5 , halo, SR 5 or CN;
Each q1 is independently an integer from 1 to 10;
Each q2 is independently 0 or 1;
q3 is 0 or an integer from 1 to 10;
q4 is an integer from 1 to 10;
22. The method of claim 21, wherein q5 is selected from 0, 1 or 2; provided that q4 is greater than 1 when q3 is 0.
前記糖置換基の各々が、独立的に、−O−CHCHOCH、−O(CHON(CH、−O−(CH−O−(CH−N(CH、−O−CH、−OCHCHCHNH、−CH−CH=CH、又はフルオロである、請求項39記載の方法。Each of the sugar substituents is independently —O—CH 2 CH 2 OCH 3 , —O (CH 2 ) 2 ON (CH 3 ) 2 , —O— (CH 2 ) 2 —O— (CH 2 ) 2 -N (CH 3) 2 , -O-CH 3, -OCH 2 CH 2 CH 2 NH 2, a -CH 2 -CH = CH 2, or fluoro, the method of claim 39. オリゴヌクレオチドのヌクレアーゼ耐性を強化する方法であって、3’又は5’末端のいずれかに少なくとも1つの修飾ヌクレオシドを有する前記オリゴヌクレオチドを調製することを含み、前記ヌクレオシドがその上に三環状複素環塩基部分を含む方法。A method for enhancing the nuclease resistance of an oligonucleotide comprising preparing said oligonucleotide having at least one modified nucleoside at either the 3 'or 5' end, wherein said nucleoside is a tricyclic heterocycle A method comprising a base moiety. 前記修飾ヌクレオシドが前記オリゴヌクレオチドの5’−末端に存在する、請求項41記載の方法。42. The method of claim 41, wherein the modified nucleoside is present at the 5'-end of the oligonucleotide. 前記修飾ヌクレオシドが前記オリゴヌクレオチドの3’−末端に存在する、請求項41記載の方法。42. The method of claim 41, wherein the modified nucleoside is present at the 3'-end of the oligonucleotide. 強化されたヌクレアーゼ耐性を有する前記オリゴヌクレオチドが、式:
Figure 2005504020
[式中、各Yは、独立的に、ヌクレオシド間連結基であり;BX、BX及びBXの各々が複素環塩基部分であり、BX及びBXの少なくとも1つは三環状塩基部分である;各Aは、独立的に、水素又は2’−置換基であり;Tは水素又はヒドロキシル保護基であり;Tは水素又はヒドロキシル保護基であり;nは2〜約50である]
で示される、請求項41記載の方法。
Said oligonucleotide having enhanced nuclease resistance has the formula:
Figure 2005504020
Wherein each Y 1 is independently an internucleoside linking group; each of BX 1 , BX 2 and BX 3 is a heterocyclic base moiety, and at least one of BX 1 and BX 3 is tricyclic Each A 1 is independently hydrogen or a 2′-substituent; T 1 is hydrogen or a hydroxyl protecting group; T 2 is hydrogen or a hydroxyl protecting group; About 50]
42. The method of claim 41, wherein
BXが三環状複素環塩基部分である、請求項44記載の方法。45. The method of claim 44, wherein BX 1 is a tricyclic heterocyclic base moiety. BXが三環状複素環塩基部分である、請求項44記載の方法。BX 3 is tricyclic heterocyclic base moiety The method of claim 44. 前記三環状複素環塩基部分の各々が、式:
Figure 2005504020
で示され、上記式において、
はO又はSであり;
はCH、NCH、O又はSであり;
各A及びAは水素であるか、又はA及びAの一方は水素であり、A及びAの他方は、
Figure 2005504020
[式中、Gは−CN、−OA20、−SA20、−N(H)A20、−ON(H)A20若しくは−C(=NH)N(H)A20であり;QはH、−NHA20、−C(=O)N(H)A20、−C(=S)N(H)A20若しくは−C(=NH)N(H)A20であり;各Qは、独立的に、H若しくはPgであり;A20は、H、Pg、置換若しくは非置換C−C10アルキル、アセチル、ベンジル、−(CHp3NH、−(CHp3N(H)Pg、D若しくはLα−アミノ酸、又はD、L若しくはラセミα−アミノ酸に由来するペプチドであり;Pgは窒素、酸素若しくはチオール保護基であり;各p1は、独立的に、2〜約6であり;p2は1〜約3であり;そしてp3は1〜約4である]
から成る群から選択される、請求項44記載の方法。
Each of the tricyclic heterocyclic base moieties has the formula:
Figure 2005504020
In the above formula,
A 6 is O or S;
A 7 is CH 2 , NCH 3 , O or S;
Each A 8 and A 9 is hydrogen, or one of A 8 and A 9 is hydrogen and the other of A 8 and A 9 is
Figure 2005504020
[Wherein G 1 is —CN, —OA 20 , —SA 20 , —N (H) A 20 , —ON (H) A 20 or —C (═NH) N (H) A 20 ; 1 is H, —NHA 20 , —C (═O) N (H) A 20 , —C (═S) N (H) A 20 or —C (═NH) N (H) A 20 ; Q 2 are, each independently, is H or Pg; A 20 is H, Pg, substituted or unsubstituted C 1 -C 10 alkyl, acetyl, benzyl, - (CH 2) p3 NH 2, - (CH 2 ) P3 N (H) Pg, D or Lα-amino acid, or a peptide derived from D, L or racemic α-amino acid; Pg is a nitrogen, oxygen or thiol protecting group; each p1 is independently 2 to about 6; p2 is 1 to about 3; and p3 is 1 to about 4]
45. The method of claim 44, wherein the method is selected from the group consisting of:
がO又はSであり;
がO又はSであり;
がHであり;
が−O−(CH−N(H)A21、−O−(CH−ON(H)A21又は−O−(CH−C(=NH)N(H)A21、−O−(CH−C(=NH)N(H)A21、−O−(CH−C(=O)N(H)A21、−O−(CH−C(=S)N(H)A21、又は−O−(CH−N(H)C(=NH)N(H)A21であり;
21が水素又はアミノ保護基である、請求項47記載の方法。
A 6 is O or S;
A 7 is O or S;
A 9 is H;
A 8 is —O— (CH 2 ) 2 —N (H) A 21 , —O— (CH 2 ) 2 —ON (H) A 21, or —O— (CH 2 ) 2 —C (═NH) N (H) A 21, -O- ( CH 2) 3 -C (= NH) N (H) A 21, -O- (CH 2) 2 -C (= O) N (H) A 21, -O - (CH 2) be 2 -C (= S) N ( H) A 21, or -O- (CH 2) 2 -N ( H) C (= NH) N (H) A 21;
A 21 is hydrogen or an amino protecting group, The method of claim 47.
がOである、請求項48記載の方法。A 6 is O, and The method of claim 48, wherein. 及びAが両方ともOである、請求項48記載の方法。Both A 6 and A 7 is O, and The method of claim 48, wherein. 前記ヌクレオシド間連結基の各々が、リン含有ヌクレオシド間連結基である、請求項44記載の方法。45. The method of claim 44, wherein each of the internucleoside linking groups is a phosphorus-containing internucleoside linking group. 前記リン含有ヌクレオシド間連結基の各々が、ホスホジエステル、ホスホロチオエート、キラル・ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、メチルホスホネート、アルキルホスホネート、5’−アルキレンホスホネート、キラル・ホスホネート、ホスフィネート、ホスホルアミデート、3’−アミノホスホルアミデート、アミノアルキルホスホルアミデート、チオノホスホルアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、セレノホスフェート、及びボラノホスフェートから成る群から選択される、請求項51記載の方法。Each of the phosphorus-containing internucleoside linking groups is a phosphodiester, phosphorothioate, chiral phosphorothioate, phosphorodithioate, phosphotriester, aminoalkylphosphotriester, methylphosphonate, alkylphosphonate, 5′-alkylenephosphonate, chiral phosphonate Phosphinates, phosphoramidates, 3'-aminophosphoramidates, aminoalkyl phosphoramidates, thionophosphoramidates, thionoalkylphosphonates, thionoalkylphosphotriesters, selenophosphates, and boranophosphates 52. The method of claim 51, wherein the method is selected from the group consisting of: 前記ヌクレオシド間連結基の90%より多くが、ホスホジエステル・ヌクレオシド間連結基である、請求項44記載の方法。45. The method of claim 44, wherein more than 90% of the internucleoside linking groups are phosphodiester internucleoside linking groups. 前記ヌクレオシド間連結基の少なくとも1つが、非リン含有ヌクレオシド間連結基である、請求項44記載の方法。45. The method of claim 44, wherein at least one of the internucleoside linking groups is a non-phosphorus containing internucleoside linking group. 前記ヌクレオシド間連結基の90%より多くが、非リン含有ヌクレオシド間連結基である、請求項54記載の方法。55. The method of claim 54, wherein more than 90% of the internucleoside linking groups are non-phosphorus containing internucleoside linking groups. 前記非リン含有ヌクレオシド間連結基の各々が、独立的に、モルホリノ、シロキサン、スルフィド、スルホキシド、スルホン、ホルムアセチル、チオホルムアセチル、メチレンホルムアセチル、チオホルムアセチル、スルファメート、メチレンイミノ、メチレンヒドラジノ、スルホネート、スルホンアミド、及びアミドから成る群から選択される、請求項55記載の方法。Each of the non-phosphorus-containing internucleoside linking groups is independently morpholino, siloxane, sulfide, sulfoxide, sulfone, formacetyl, thioformacetyl, methyleneformacetyl, thioformacetyl, sulfamate, methyleneimino, methylenehydrazino, 56. The method of claim 55, selected from the group consisting of sulfonates, sulfonamides, and amides. 前記非リン含有ヌクレオシド間連結基の各々が、独立的に、−CH−NH−O−CH−、−CH−N(CH)−O−CH−、−CH−O−N(CH)−CH−、−CH−N(CH)−N(CH)−CH−及び−O−N(CH)−CH−CH−から成る群から選択される、請求項56記載の方法。Each of the non-phosphorus-containing internucleoside linking groups is independently —CH 2 —NH—O—CH 2 —, —CH 2 —N (CH 3 ) —O—CH 2 —, —CH 2 —O—. N (CH 3) -CH 2 - , - CH 2 -N (CH 3) -N (CH 3) -CH 2 - selected from the group consisting of - and -O-N (CH 3) -CH 2 -CH 2 57. The method of claim 56, wherein: 前記オリゴマー化合物が、ギャップマー、ヘミマー又は逆ギャップマーである、請求項44記載の方法。45. The method of claim 44, wherein the oligomeric compound is a gapmer, hemimer, or reverse gapmer. 前記オリゴマー化合物が、前記ギャップマー、ヘミマー又は逆ギャップマーの少なくとも1つの領域において、少なくとも1つの2’−O−CHCH−O−CH置換基を含む、請求項58記載の方法。The oligomeric compounds, the gapmer, at least one region of hemimer or reverse gapmer comprises at least one 2'-O-CH 2 CH 2 -O-CH 3 substituents method of claim 58, wherein. nが約8〜約30である、請求項44記載の方法。45. The method of claim 44, wherein n is about 8 to about 30. nが約15〜約25である、請求項44記載の方法。45. The method of claim 44, wherein n is about 15 to about 25. 三環状複素環塩基部分ではない前記Bx及びBxの各々と、前記Bxの各々が、独立的に、アデニニル、グアニニル、チミニル、シトシニル、ウラシリル、5−メチルシトシニル(5−me−C)、5−ヒドロキシメチルシトシニル、キサンチニル、ヒポキサンチニル、2−アミノアデニニル、アデニニル及びグアニニルのアルキル誘導体、2−チオウラシリル、2−チオチミニル、2−チオシトシニル、5−ハロウラシリル、5−ハロシトシニル、5−プロピニルウラシリル、5−プロピニルシトシニル、6−アゾウラシリル、6−アゾシトシニル、6−アゾチミニル、5−ウラシリル(プソイドウラシル)、4−チオウラシリル、8−置換アデニニル及びグアニニル、5−置換ウラシリル及びシトシニル、7−メチルグアニニル、7−メチルアデニニル、8−アザグアニニル、8−アザアデニニル、7−デアザグアニニル、7−デアザアデニニル、3−デアザグアニニル及び3−デアザアデニニルから成る群から選択される、請求項44記載の方法。Each of said Bx 1 and Bx 3 that is not a tricyclic heterocyclic base moiety and each of said Bx 2 is independently adeninyl, guaninyl, thyminyl, cytosynyl, urasilyl, 5-methylcytosinyl (5-me-C), 5-hydroxymethylcytosinyl, xanthinyl, hypoxanthinyl, 2-aminoadenynyl, adenylyl and guaninyl alkyl derivatives, 2-thiourasilyl, 2-thiothyminyl, 2-thiocytosinyl, 5-halourasilyl, 5-halocytosinyl, 5-propynylurasilyl, 5- Propynylcytosinyl, 6-azourasilyl, 6-azocytosinyl, 6-azothyminyl, 5-urasilyl (pseudouracil), 4-thiourasilyl, 8-substituted adenylyl and guaninyl, 5-substituted urasilyl and cytosynyl, 7-methylguaninyl 7- Mechiruadeniniru, 8 Azaguaniniru, 8 Azaadeniniru, 7 Deazaguaniniru, 7- Deazaadeniniru, 3- Deazaguaniniru and 3 is selected from the group consisting of Deazaadeniniru The method of claim 44. 各糖置換基が、独立的に、C−C20アルキル、C−C20アルケニル、C−C20アルキニル、C−C20アリール、−O−アルキル、−O−アルケニル、−O−アルキニル、−O−アルキルアミノ、−O−アルキルアルコキシ、−O−アルキルアミノアルキル、−O−アルキルイミダゾール、−OH、−SH、−S−アルキル、−S−アルケニル、−S−アルキニル、−N(H)−アルキル、−N(H)−アルケニル、−N(H)−アルキニル、−N(アルキル)、−O−アリール、−S−アリール、−NH−アリール、−O−アラルキル、−S−アラルキル、−N(H)−アラルキル、フタルイミド(Nにおいて結合)、ハロゲン、アミノ、ケト(−C(=O)−R)、カルボキシル(−C(=O)OH)、ニトロ(−NO)、ニトロソ(−N=O)、シアノ(−CN)、トリフルオロメチル(−CF)、トリフルオロメトキシ(−O−CF)、イミダゾール、アジド(−N)、ヒドラジノ(−N(H)−NH)、アミノオキシ(−O−NH)、イソシアナト(−N=C=O)、スルホキシド(−S(=O)−R)、スルホン(−S(=O)−R)、ジスルフィド(−S−S−R)、シリル、ヘテロサイクリル、カルボサイクリル、インターカレーター、レポーター基、コンジュゲート基、ポリアミン、ポリアミド、ポリアルキレングリコール、又は式(−O−アルキル)(式中、mは1〜約10である)で示されるポリエーテルであり、この場合、各Rは、独立的に、水素、保護基、又は置換若しくは非置換アルキル、アルケニル又はアルキニルであり、これらにおいて、置換基はハロアルキル、アルケニル、アルコキシ、チオアルコキシ、ハロアルコキシ又はアリール、並びにハロゲン、ヒドロキシル、アミノ、アジド、カルボキシ、シアノ、ニトロ、メルカプト、スルフィド基、スルホニル基及びスルホキシド基から選択される;
或いは、各糖置換基が、式I又はIIのいずれかを有する:
Figure 2005504020
上記式において、
はO、S若しくはNHであり;
Jは単結合、O若しくはC(=O)であり;
EはC−C10アルキル、N(R)(R)、N(R)(R)、N=C(R5a)(R6a)、N=C(R5a)(R7a)であるか、又は式III又はIV:
Figure 2005504020
のいずれかを有する;
各R、R、R10、R11及びR12は、独立的に、水素、C(O)R13、置換若しくは非置換C−C10アルキル、置換若しくは非置換C−C10アルケニル、置換若しくは非置換C−C10アルキニル、アルキルスルホニル、アリールスルホニル、化学官能基若しくはコンジュゲート基であり、この場合、置換基は、ヒドロキシル、アミノ、アルコキシ、カルボキシ、ベンジル、フェニル、ニトロ、チオール、チオアルコキシ、ハロゲン、アルキル、アリール、アルケニル及びアルキニルから選択される;
又は任意に、RとR10は一緒に、それらが結合する窒素原子と共にフタルイミド部分を形成する;
又は任意に、R11とR12は一緒に、それらが結合する窒素原子と共にフタルイミド部分を形成する;
各R13は、独立的に、置換若しくは非置換C−C10アルキル、トリフルオロメチル、シアノエチルオキシ、メトキシ、エトキシ、t−ブトキシ、アリルオキシ、9−フルオレニルメトキシ、2−(トリメチルシリル)−エトキシ、2,2,2−トリクロロエトキシ、ベンジルオキシ、ブチリル、イソ−ブチリル、フェニル又はアリールであり;
は、水素、窒素保護基又は−T−Lであり;
5aは、水素、窒素保護基又は−T−Lであり;
Tは、結合又は連結部分であり;
Lは、化学官能基、コンジュゲート基又は固体支持体であり;
各RとRは、独立的に、H、窒素保護基、置換若しくは非置換C−C10アルキル、置換若しくは非置換C−C10アルケニル、置換若しくは非置換C−C10アルキニルであり、これらにおいて、置換基は、ヒドロキシル、アミノ、アルコキシ、カルボキシ、ベンジル、フェニル、ニトロ、チオール、チオアルコキシ、ハロゲン、アルキル、アリール、アルケニル、アルキニル、NH 、N(R14)(R15)、グアニジノ及びアシルから選択され、前記アシルは、酸アミド又はエステルである;
或いは、RとRは一緒に、窒素保護基であるか、又はN及びOから選択される付加的ヘテロ原子を任意に包含する環構造として結合するか、又は化学官能基である;
各R14とR15は、独立的に、H、C−C10アルキル、窒素保護基であるか、又はR14とR15は一緒に、窒素保護基である;
或いは、R14とR15は、N及びOから選択される付加的ヘテロ原子を任意に包含する環構造として結合する;
は、OX、SX、又はN(X)であり;
各Xは、独立的に、H、C−Cアルキル、C−Cハロアルキル、C(=NH)N(H)R16、C(=O)N(H)R16又はOC(=O)N(H)R16であり;
16はH又はC−Cアルキルであり;
、Z及びZは、約4〜約7個の炭素原子を有するか又は約3〜約6個の炭素原子と1若しくは2個のヘテロ原子とを有し、前記ヘテロ原子が酸素、窒素及び硫黄から選択される環系を含み、前記環系は脂肪族、不飽和脂肪族、芳香族、又は飽和若しくは不飽和複素環式であり;
は、1〜約10個の炭素原子を有するアルキル若しくはハロアルキル、2〜約10個の炭素原子を有するアルケニル、2〜約10個の炭素原子を有するアルキニル、6〜約14個の炭素原子を有するアリール、N(R)(R)OR、ハロ、SR又はCNであり;
各q1は、独立的に、1〜10の整数であり;
各q2は、独立的に、0又は1であり;
q3は0又は1〜10の整数であり;
q4は1〜10の整数であり;
q5は0、1又は2から選択される;ただし、q3が0であるときに、q4は1より大きい、請求項41記載の方法。
Each sugar substituents, independently, C 1 -C 20 alkyl, C 2 -C 20 alkenyl, C 2 -C 20 alkynyl, C 5 -C 20 aryl, -O- alkyl, -O- alkenyl, -O -Alkynyl, -O-alkylamino, -O-alkylalkoxy, -O-alkylaminoalkyl, -O-alkylimidazole, -OH, -SH, -S-alkyl, -S-alkenyl, -S-alkynyl,- N (H) -alkyl, -N (H) -alkenyl, -N (H) -alkynyl, -N (alkyl) 2 , -O-aryl, -S-aryl, -NH-aryl, -O-aralkyl, -S-aralkyl, -N (H) -aralkyl, phthalimide (bonded at N), halogen, amino, keto (-C (= O) -R), carboxyl (-C (= O) OH), nitro (-NO 2), nitroso (-N = O), cyano (-CN), trifluoromethyl (-CF 3), trifluoromethoxy (-O-CF 3), imidazole, azido (-N 3), hydrazino (—N (H) —NH 2 ), aminooxy (—O—NH 2 ), isocyanato (—N═C═O), sulfoxide (—S (═O) —R), sulfone (—S (═O) ) 2 -R), disulfide (—S—S—R), silyl, heterocyclyl, carbocyclyl, intercalator, reporter group, conjugate group, polyamine, polyamide, polyalkylene glycol, or formula (—O— alkyl) m (wherein, m is a polyether represented by 1 to about 10), where each R is independently hydrogen, a protecting group, or a substituted or unsubstituted alkyl, a Kenyl or alkynyl, in which the substituents are haloalkyl, alkenyl, alkoxy, thioalkoxy, haloalkoxy or aryl, and halogen, hydroxyl, amino, azide, carboxy, cyano, nitro, mercapto, sulfide group, sulfonyl group and sulfoxide Selected from the group;
Alternatively, each sugar substituent has either formula I or II:
Figure 2005504020
In the above formula,
Z 0 is O, S or NH;
J is a single bond, O or C (= O);
E is C 1 -C 10 alkyl, N (R 5 ) (R 6 ), N (R 5 ) (R 7 ), N = C (R 5a ) (R 6a ), N = C (R 5a ) (R 7a ) or formula III or IV:
Figure 2005504020
Any of
Each R 8 , R 9 , R 10 , R 11 and R 12 is independently hydrogen, C (O) R 13 , substituted or unsubstituted C 1 -C 10 alkyl, substituted or unsubstituted C 2 -C 10. alkenyl, substituted or unsubstituted C 2 -C 10 alkynyl, alkylsulfonyl, arylsulfonyl, a chemical functional group or a conjugate group, wherein the substituents are hydroxyl, amino, alkoxy, carboxy, benzyl, phenyl, nitro, Selected from thiol, thioalkoxy, halogen, alkyl, aryl, alkenyl and alkynyl;
Or optionally, R 9 and R 10 together form a phthalimide moiety with the nitrogen atom to which they are attached;
Or optionally, R 11 and R 12 together form a phthalimide moiety with the nitrogen atom to which they are attached;
Each R 13 is independently substituted or unsubstituted C 1 -C 10 alkyl, trifluoromethyl, cyanoethyloxy, methoxy, ethoxy, t-butoxy, allyloxy, 9-fluorenylmethoxy, 2- (trimethylsilyl)- Ethoxy, 2,2,2-trichloroethoxy, benzyloxy, butyryl, iso-butyryl, phenyl or aryl;
R 5 is hydrogen, a nitrogen protecting group, or -TL;
R 5a is hydrogen, a nitrogen protecting group, or -TL;
T is a bond or linking moiety;
L is a chemical functional group, a conjugate group or a solid support;
Each R 6 and R 7 is independently H, nitrogen protecting group, substituted or unsubstituted C 1 -C 10 alkyl, substituted or unsubstituted C 2 -C 10 alkenyl, substituted or unsubstituted C 2 -C 10 alkynyl. In which the substituents are hydroxyl, amino, alkoxy, carboxy, benzyl, phenyl, nitro, thiol, thioalkoxy, halogen, alkyl, aryl, alkenyl, alkynyl, NH 3 + , N (R 14 ) (R 15 ), selected from guanidino and acyl, wherein the acyl is an acid amide or ester;
Alternatively, R 6 and R 7 together are a nitrogen protecting group, or are attached as a ring structure optionally including additional heteroatoms selected from N and O, or are chemical functional groups;
Each R 14 and R 15 is independently H, C 1 -C 10 alkyl, a nitrogen protecting group, or R 14 and R 15 together are a nitrogen protecting group;
Alternatively, R 14 and R 15 are attached as a ring structure optionally including additional heteroatoms selected from N and O;
Z 4 is OX, SX, or N (X) 2 ;
Each X is independently H, C 1 -C 8 alkyl, C 1 -C 8 haloalkyl, C (═NH) N (H) R 16 , C (═O) N (H) R 16 or OC ( = O) N (H) R 16 ;
R 16 is H or C 1 -C 8 alkyl;
Z 1 , Z 2 and Z 3 have from about 4 to about 7 carbon atoms, or from about 3 to about 6 carbon atoms and 1 or 2 heteroatoms, wherein the heteroatoms are oxygen A ring system selected from nitrogen and sulfur, said ring system being aliphatic, unsaturated aliphatic, aromatic, or saturated or unsaturated heterocyclic;
Z 5 is alkyl or haloalkyl having 1 to about 10 carbon atoms, alkenyl having 2 to about 10 carbon atoms, alkynyl having 2 to about 10 carbon atoms, 6 to about 14 carbon atoms Aryl having the following formula: N (R 5 ) (R 6 ) OR 5 , halo, SR 5 or CN;
Each q1 is independently an integer from 1 to 10;
Each q2 is independently 0 or 1;
q3 is 0 or an integer from 1 to 10;
q4 is an integer from 1 to 10;
42. The method of claim 41, wherein q5 is selected from 0, 1 or 2; provided that q4 is greater than 1 when q3 is 0.
前記2’−置換基が、−O−CHCHOCH、−O(CHON(CH、−O−(CH−O−(CH−N(CH、−O−CH、−OCHCHCHNH、−CH−CH=CH、又はフルオロである、請求項63記載の方法。The 2′-substituent is —O—CH 2 CH 2 OCH 3 , —O (CH 2 ) 2 ON (CH 3 ) 2 , —O— (CH 2 ) 2 —O— (CH 2 ) 2 —N. (CH 3) 2, -O- CH 3, -OCH 2 CH 2 CH 2 NH 2, a -CH 2 -CH = CH 2, or fluoro, method of claim 63. 式:
Figure 2005504020
で示されるオリゴマー化合物、
上記式において、
各Yは、独立的に、ヌクレオシド間連結基であり;
各Aは、独立的に、水素又は2’−置換基であり;
は、水素又はヒドロキシル保護基であり;
は、水素又はヒドロキシル保護基であり;
nは2〜約50であり;
Bx、Bx及びBxの各々は、複素環塩基部分であり、Bx、Bx及びBxの少なくとも1つは、式:
Figure 2005504020
で示される三環状複素環塩基部分であり、この式において、
10はSであり、A11はCH、O若しくはSである;又は
10はOであり、A11はCHである;
12及びA13の一方は水素であり、A12及びA13の他方は、式:
Figure 2005504020
で示される基である、この場合、
各A及びAは水素であるか、又はA及びAの一方は水素であり、A及びAの他方は、
Figure 2005504020
[式中、Gは、−CN、−OA20、−SA20、−N(H)A20、−ON(H)A20若しくは−C(=NH)N(H)A20であり;Qは、H、−NHA20、−C(=O)N(H)A20、−C(=S)N(H)A20若しくは−C(=NH)N(H)A20であり;各Qは、独立的に、H若しくはPgであり;A20は、H、Pg、置換若しくは非置換C−C10アルキル、アセチル、ベンジル、−(CHp3NH、−(CHp3N(H)Pg、D若しくはLα−アミノ酸、又はD、L若しくはラセミα−アミノ酸に由来するペプチドであり;Pgは、窒素、酸素若しくはチオール保護基であり;各p1は、独立的に、2〜約6であり;p2は1〜約3であり;そしてp3は1〜約4である]
から成る群から選択される。
formula:
Figure 2005504020
An oligomer compound represented by
In the above formula,
Each Y 1 is independently an internucleoside linking group;
Each A 1 is independently hydrogen or a 2′-substituent;
T 1 is hydrogen or a hydroxyl protecting group;
T 2 is hydrogen or a hydroxyl protecting group;
n is 2 to about 50;
Each of Bx 4 , Bx 5 and Bx 6 is a heterocyclic base moiety, and at least one of Bx 4 , Bx 5 and Bx 6 has the formula:
Figure 2005504020
A tricyclic heterocyclic base moiety represented by the formula:
A 10 is S and A 11 is CH 2 , O or S; or A 10 is O and A 11 is CH 2 ;
One of A 12 and A 13 is hydrogen and the other of A 12 and A 13 is of the formula:
Figure 2005504020
In this case,
Each A 8 and A 9 is hydrogen, or one of A 8 and A 9 is hydrogen and the other of A 8 and A 9 is
Figure 2005504020
Wherein G 1 is —CN, —OA 20 , —SA 20 , —N (H) A 20 , —ON (H) A 20 or —C (═NH) N (H) A 20 ; Q 1 is H, —NHA 20 , —C (═O) N (H) A 20 , —C (═S) N (H) A 20 or —C (═NH) N (H) A 20 Each Q 2 is independently H or Pg; A 20 is H, Pg, substituted or unsubstituted C 1 -C 10 alkyl, acetyl, benzyl, — (CH 2 ) p3 NH 2 , — ( CH 2) p3 N (H) Pg, D or Lα- amino, or D, a peptide derived from L or racemic α- amino acid; Pg is a nitrogen, an oxygen or a thiol protecting group; each p1 is independently 2 is about 2; p2 is 1 to about 3; and p3 is 1 to about 4. ]
Selected from the group consisting of
13がHであり;
12が、−O−(CH−N(H)A21、−O−(CH−ON(H)A21若しくは−O−(CH−C(=NH)N(H)A21、−O−(CH−C(=NH)N(H)A21、−O−(CH−C(=O)N(H)A21、−O−(CH−C(=S)N(H)A21又は−O−(CH−N(H)C(=NH)N(H)A21であり、A21が、水素又はアミノ保護基である、請求項65記載のオリゴマー化合物。
A 13 is H;
A 12 is —O— (CH 2 ) 2 —N (H) A 21 , —O— (CH 2 ) 2 —ON (H) A 21, or —O— (CH 2 ) 2 —C (═NH). N (H) A 21, -O- (CH 2) 3 -C (= NH) N (H) A 21, -O- (CH 2) 2 -C (= O) N (H) A 21, - O— (CH 2 ) 2 —C (═S) N (H) A 21 or —O— (CH 2 ) 2 —N (H) C (═NH) N (H) A 21 , wherein A 21 is 66. The oligomeric compound of claim 65, which is a hydrogen or amino protecting group.
10がSである、請求項66記載のオリゴマー化合物。A 10 is S, claim 66 oligomeric compound according. 11がOである、請求項67記載のオリゴマー化合物。A 11 is O, and claim 67 oligomeric compound according. Bx及びBxの少なくとも1つが三環状複素環塩基部分である、請求項65記載のオリゴマー化合物。At least one bx 4 and Bx 6 is a tricyclic heterocyclic base moiety, claim 65 oligomeric compound according. 前記ヌクレオシド間連結基の各々が、リン含有ヌクレオシド間連結基である、請求項65記載のオリゴマー化合物。66. The oligomeric compound of claim 65, wherein each of the internucleoside linking groups is a phosphorus-containing internucleoside linking group. 前記リン含有ヌクレオシド間連結基の各々が、ホスホジエステル、ホスホロチオエート、キラル・ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、メチルホスホネート、アルキルホスホネート、5’−アルキレンホスホネート、キラル・ホスホネート、ホスフィネート、ホスホルアミデート、3’−アミノホスホルアミデート、アミノアルキルホスホルアミデート、チオノホスホルアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、セレノホスフェート及びボラノホスフェートから成る群から選択される、請求項70記載のオリゴマー化合物。Each of the phosphorus-containing internucleoside linking groups is a phosphodiester, phosphorothioate, chiral phosphorothioate, phosphorodithioate, phosphotriester, aminoalkylphosphotriester, methylphosphonate, alkylphosphonate, 5′-alkylenephosphonate, chiral phosphonate Phosphinates, phosphoramidates, 3'-aminophosphoramidates, aminoalkyl phosphoramidates, thionophosphoramidates, thionoalkylphosphonates, thionoalkylphosphotriesters, selenophosphates and boranophosphates 71. The oligomeric compound of claim 70, selected from the group consisting of: 前記ヌクレオシド間連結基の90%より多くが、ホスホジエステル・ヌクレオシド間連結基である、請求項65記載のオリゴマー化合物。66. The oligomeric compound of claim 65, wherein more than 90% of the internucleoside linking groups are phosphodiester internucleoside linking groups. 前記ヌクレオシド間連結基の少なくとも1つが、非リン含有ヌクレオシド間連結基である、請求項65記載のオリゴマー化合物。66. The oligomeric compound of claim 65, wherein at least one of the internucleoside linking groups is a non-phosphorus containing internucleoside linking group. 前記ヌクレオシド間連結基の90%より多くが、非リン含有ヌクレオシド間連結基である、請求項73記載のオリゴマー化合物。74. The oligomeric compound of claim 73, wherein more than 90% of the internucleoside linking groups are non-phosphorus containing internucleoside linking groups. 前記非リン含有ヌクレオシド間連結基の各々が、独立的に、モルホリノ、シロキサン、スルフィド、スルホキシド、スルホン、ホルムアセチル、チオホルムアセチル、メチレンホルムアセチル、チオホルムアセチル、スルファメート、メチレンイミノ、メチレンヒドラジノ、スルホネート、スルホンアミド、及びアミドから成る群から選択される、請求項74記載のオリゴマー化合物。Each of the non-phosphorus-containing internucleoside linking groups is independently morpholino, siloxane, sulfide, sulfoxide, sulfone, formacetyl, thioformacetyl, methyleneformacetyl, thioformacetyl, sulfamate, methyleneimino, methylenehydrazino, 75. The oligomeric compound of claim 74, selected from the group consisting of sulfonates, sulfonamides, and amides. 前記非リン含有ヌクレオシド間連結基の各々が、独立的に、−CH−NH−O−CH−、−CH−N(CH)−O−CH−、−CH−O−N(CH)−CH−、−CH−N(CH)−N(CH)−CH−、及び−O−N(CH)−CH−CH−から成る群から選択される、請求項75記載のオリゴマー化合物。Each of the non-phosphorus-containing internucleoside linking groups is independently —CH 2 —NH—O—CH 2 —, —CH 2 —N (CH 3 ) —O—CH 2 —, —CH 2 —O—. N (CH 3) -CH 2 - , - CH 2 -N (CH 3) -N (CH 3) -CH 2 -, and -O-N (CH 3) -CH 2 -CH 2 - from the group consisting of 76. The oligomeric compound of claim 75, selected. オリゴマー化合物が、ギャップマー、ヘミマー又は逆ギャップマーである、請求項65記載のオリゴマー化合物。66. The oligomeric compound of claim 65, wherein the oligomeric compound is a gapmer, hemimer or reverse gapmer. オリゴマー化合物が、前記ギャップマー、ヘミマー又は逆ギャップマーの少なくとも1つの領域において、少なくとも1つの2’−O−CHCH−O−CH置換基を含む、請求項77記載のオリゴマー化合物。Oligomeric compounds, the gapmer, at least one region of hemimer or reverse gapmer comprises at least one 2'-O-CH 2 CH 2 -O-CH 3 substituents, claim 77 oligomeric compound according. nが約8〜約30である、請求項65記載のオリゴマー化合物。66. The oligomeric compound of claim 65, wherein n is about 8 to about 30. nが約15〜約25である、請求項65記載のオリゴマー化合物。66. The oligomeric compound of claim 65, wherein n is from about 15 to about 25. 三環状複素環塩基部分ではない前記Bx及びBxの各々と、前記Bxの各々が、独立的に、アデニニル、グアニニル、チミニル、シトシニル、ウラシリル、5−メチルシトシニル(5−me−C)、5−ヒドロキシメチルシトシニル、キサンチニル、ヒポキサンチニル、2−アミノアデニニル、アデニニル及びグアニニルのアルキル誘導体、2−チオウラシリル、2−チオチミニル、2−チオシトシニル、5−ハロウラシリル、5−ハロシトシニル、5−プロピニルウラシリル、5−プロピニルシトシニル、6−アゾウラシリル、6−アゾシトシニル、6−アゾチミニル、5−ウラシリル(プソイドウラシル)、4−チオウラシリル、8−置換アデニニル及びグアニニル、5−置換ウラシリル及びシトシニル、7−メチルグアニニル、7−メチルアデニニル、8−アザグアニニル、8−アザアデニニル、7−デアザグアニニル、7−デアザアデニニル、3−デアザグアニニル及び3−デアザアデニニルから成る群から選択される、請求項65記載のオリゴマー化合物。Each of said Bx 1 and Bx 3 that is not a tricyclic heterocyclic base moiety and each of said Bx 2 is independently adeninyl, guaninyl, thyminyl, cytosynyl, urasilyl, 5-methylcytosinyl (5-me-C), 5-hydroxymethylcytosinyl, xanthinyl, hypoxanthinyl, 2-aminoadenynyl, adenylyl and guaninyl alkyl derivatives, 2-thiourasilyl, 2-thiothyminyl, 2-thiocytosinyl, 5-halourasilyl, 5-halocytosinyl, 5-propynylurasilyl, 5- Propynylcytosinyl, 6-azourasilyl, 6-azocytosinyl, 6-azothyminyl, 5-urasilyl (pseudouracil), 4-thiourasilyl, 8-substituted adenylyl and guaninyl, 5-substituted urasilyl and cytosynyl, 7-methylguaninyl 7- Mechiruadeniniru, 8 Azaguaniniru, 8 Azaadeniniru, 7 Deazaguaniniru, 7- Deazaadeniniru, 3- Deazaguaniniru and 3 is selected from the group consisting of Deazaadeniniru claim 65 oligomeric compound according. 各糖置換基が、独立的に、C−C20アルキル、C−C20アルケニル、C−C20アルキニル、C−C20アリール、−O−アルキル、−O−アルケニル、−O−アルキニル、−O−アルキルアミノ、−O−アルキルアルコキシ、−O−アルキルアミノアルキル、−O−アルキルイミダゾール、−OH、−SH、−S−アルキル、−S−アルケニル、−S−アルキニル、−N(H)−アルキル、−N(H)−アルケニル、−N(H)−アルキニル、−N(アルキル)、−O−アリール、−S−アリール、−NH−アリール、−O−アラルキル、−S−アラルキル、−N(H)−アラルキル、フタルイミド(Nにおいて結合)、ハロゲン、アミノ、ケト(−C(=O)−R)、カルボキシル(−C(=O)OH)、ニトロ(−NO)、ニトロソ(−N=O)、シアノ(−CN)、トリフルオロメチル(−CF)、トリフルオロメトキシ(−O−CF)、イミダゾール、アジド(−N)、ヒドラジノ(−N(H)−NH)、アミノオキシ(−O−NH)、イソシアナト(−N=C=O)、スルホキシド(−S(=O)−R)、スルホン(−S(=O)−R)、ジスルフィド(−S−S−R)、シリル、ヘテロサイクリル、カルボサイクリル、インターカレーター、レポーター基、コンジュゲート基、ポリアミン、ポリアミド、ポリアルキレングリコール、又は式(−O−アルキル)(式中、mは1〜約10である)で示されるポリエーテルであり、この場合、各Rは、独立的に、水素、保護基、又は置換若しくは非置換アルキル、アルケニル又はアルキニルであり、これらにおいて、置換基はハロアルキル、アルケニル、アルコキシ、チオアルコキシ、ハロアルコキシ又はアリール、並びにハロゲン、ヒドロキシル、アミノ、アジド、カルボキシ、シアノ、ニトロ、メルカプト、スルフィド基、スルホニル基及びスルホキシド基から選択される;
或いは、各糖置換基が、式I又はIIのいずれかを有する:
Figure 2005504020
上記式において、
はO、S若しくはNHであり;
Jは単結合、O若しくはC(=O)であり;
EはC−C10アルキル、N(R)(R)、N(R)(R)、N=C(R5a)(R6a)、N=C(R5a)(R7a)であるか、又は式III又はIV:
Figure 2005504020
のいずれかを有する;
各R、R、R10、R11及びR12は、独立的に、水素、C(O)R13、置換若しくは非置換C−C10アルキル、置換若しくは非置換C−C10アルケニル、置換若しくは非置換C−C10アルキニル、アルキルスルホニル、アリールスルホニル、化学官能基若しくはコンジュゲート基であり、この場合、置換基は、ヒドロキシル、アミノ、アルコキシ、カルボキシ、ベンジル、フェニル、ニトロ、チオール、チオアルコキシ、ハロゲン、アルキル、アリール、アルケニル及びアルキニルから選択される;
又は任意に、RとR10は一緒に、それらが結合する窒素原子と共にフタルイミド部分を形成する;
又は任意に、R11とR12は一緒に、それらが結合する窒素原子と共にフタルイミド部分を形成する;
各R13は、独立的に、置換若しくは非置換C−C10アルキル、トリフルオロメチル、シアノエチルオキシ、メトキシ、エトキシ、t−ブトキシ、アリルオキシ、9−フルオレニルメトキシ、2−(トリメチルシリル)−エトキシ、2,2,2−トリクロロエトキシ、ベンジルオキシ、ブチリル、イソ−ブチリル、フェニル又はアリールであり;
は、水素、窒素保護基又は−T−Lであり;
5aは、水素、窒素保護基又は−T−Lであり;
Tは、結合又は連結部分であり;
Lは、化学官能基、コンジュゲート基又は固体支持体であり;
各RとRは、独立的に、H、窒素保護基、置換若しくは非置換C−C10アルキル、置換若しくは非置換C−C10アルケニル、置換若しくは非置換C−C10アルキニルであり、これらにおいて、置換基は、ヒドロキシル、アミノ、アルコキシ、カルボキシ、ベンジル、フェニル、ニトロ、チオール、チオアルコキシ、ハロゲン、アルキル、アリール、アルケニル、アルキニル、NH 、N(R14)(R15)、グアニジノ及びアシルから選択され、前記アシルは、酸アミド又はエステルである;
或いは、RとRは一緒に、窒素保護基であるか、又はN及びOから選択される付加的ヘテロ原子を任意に包含する環構造として結合するか、又は化学官能基である;
各R14とR15は、独立的に、H、C−C10アルキル、窒素保護基であるか、又はR14とR15は一緒に、窒素保護基である;
或いは、R14とR15は、N及びOから選択される付加的ヘテロ原子を任意に包含する環構造として結合する;
は、OX、SX、又はN(X)であり;
各Xは、独立的に、H、C−Cアルキル、C−Cハロアルキル、C(=NH)N(H)R16、C(=O)N(H)R16又はOC(=O)N(H)R16であり;
16はH又はC−Cアルキルであり;
、Z及びZは、約4〜約7個の炭素原子を有するか又は約3〜約6個の炭素原子と1若しくは2個のヘテロ原子とを有し、前記ヘテロ原子が酸素、窒素及び硫黄から選択される環系を含み、前記環系は脂肪族、不飽和脂肪族、芳香族、又は飽和若しくは不飽和複素環式であり;
は、1〜約10個の炭素原子を有するアルキル若しくはハロアルキル、2〜約10個の炭素原子を有するアルケニル、2〜約10個の炭素原子を有するアルキニル、6〜約14個の炭素原子を有するアリール、N(R)(R)OR、ハロ、SR又はCNであり;
各q1は、独立的に、1〜10の整数であり;
各q2は、独立的に、0又は1であり;
q3は0又は1〜10の整数であり;
q4は、1〜10の整数であり;
q5は、0、1又は2から選択される;ただし、q3が0であるときに、q4は1より大きい、請求項65記載のオリゴマー化合物。
Each sugar substituents, independently, C 1 -C 20 alkyl, C 2 -C 20 alkenyl, C 2 -C 20 alkynyl, C 5 -C 20 aryl, -O- alkyl, -O- alkenyl, -O -Alkynyl, -O-alkylamino, -O-alkylalkoxy, -O-alkylaminoalkyl, -O-alkylimidazole, -OH, -SH, -S-alkyl, -S-alkenyl, -S-alkynyl,- N (H) -alkyl, -N (H) -alkenyl, -N (H) -alkynyl, -N (alkyl) 2 , -O-aryl, -S-aryl, -NH-aryl, -O-aralkyl, -S-aralkyl, -N (H) -aralkyl, phthalimide (bonded at N), halogen, amino, keto (-C (= O) -R), carboxyl (-C (= O) OH), nitro (-NO 2), nitroso (-N = O), cyano (-CN), trifluoromethyl (-CF 3), trifluoromethoxy (-O-CF 3), imidazole, azido (-N 3), hydrazino (—N (H) —NH 2 ), aminooxy (—O—NH 2 ), isocyanato (—N═C═O), sulfoxide (—S (═O) —R), sulfone (—S (═O) ) 2 -R), disulfide (—S—S—R), silyl, heterocyclyl, carbocyclyl, intercalator, reporter group, conjugate group, polyamine, polyamide, polyalkylene glycol, or formula (—O— alkyl) m (wherein, m is a polyether represented by 1 to about 10), where each R is independently hydrogen, a protecting group, or a substituted or unsubstituted alkyl, a Kenyl or alkynyl, in which the substituents are haloalkyl, alkenyl, alkoxy, thioalkoxy, haloalkoxy or aryl, and halogen, hydroxyl, amino, azide, carboxy, cyano, nitro, mercapto, sulfide group, sulfonyl group and sulfoxide Selected from the group;
Alternatively, each sugar substituent has either formula I or II:
Figure 2005504020
In the above formula,
Z 0 is O, S or NH;
J is a single bond, O or C (= O);
E is C 1 -C 10 alkyl, N (R 5 ) (R 6 ), N (R 5 ) (R 7 ), N = C (R 5a ) (R 6a ), N = C (R 5a ) (R 7a ) or formula III or IV:
Figure 2005504020
Any of
Each R 8 , R 9 , R 10 , R 11 and R 12 is independently hydrogen, C (O) R 13 , substituted or unsubstituted C 1 -C 10 alkyl, substituted or unsubstituted C 2 -C 10. alkenyl, substituted or unsubstituted C 2 -C 10 alkynyl, alkylsulfonyl, arylsulfonyl, a chemical functional group or a conjugate group, wherein the substituents are hydroxyl, amino, alkoxy, carboxy, benzyl, phenyl, nitro, Selected from thiol, thioalkoxy, halogen, alkyl, aryl, alkenyl and alkynyl;
Or optionally, R 9 and R 10 together with the nitrogen atom to which they are attached form a phthalimide moiety;
Or optionally, R 11 and R 12 together form a phthalimide moiety with the nitrogen atom to which they are attached;
Each R 13 is independently substituted or unsubstituted C 1 -C 10 alkyl, trifluoromethyl, cyanoethyloxy, methoxy, ethoxy, t-butoxy, allyloxy, 9-fluorenylmethoxy, 2- (trimethylsilyl)- Ethoxy, 2,2,2-trichloroethoxy, benzyloxy, butyryl, iso-butyryl, phenyl or aryl;
R 5 is hydrogen, a nitrogen protecting group, or -TL;
R 5a is hydrogen, a nitrogen protecting group, or -TL;
T is a bond or linking moiety;
L is a chemical functional group, a conjugate group or a solid support;
Each R 6 and R 7 is independently H, nitrogen protecting group, substituted or unsubstituted C 1 -C 10 alkyl, substituted or unsubstituted C 2 -C 10 alkenyl, substituted or unsubstituted C 2 -C 10 alkynyl. In which the substituents are hydroxyl, amino, alkoxy, carboxy, benzyl, phenyl, nitro, thiol, thioalkoxy, halogen, alkyl, aryl, alkenyl, alkynyl, NH 3 + , N (R 14 ) (R 15 ), selected from guanidino and acyl, wherein the acyl is an acid amide or ester;
Alternatively, R 6 and R 7 together are a nitrogen protecting group, or are attached as a ring structure optionally including additional heteroatoms selected from N and O, or are chemical functional groups;
Each R 14 and R 15 is independently H, C 1 -C 10 alkyl, a nitrogen protecting group, or R 14 and R 15 together are a nitrogen protecting group;
Alternatively, R 14 and R 15 are attached as a ring structure optionally including additional heteroatoms selected from N and O;
Z 4 is OX, SX, or N (X) 2 ;
Each X is independently H, C 1 -C 8 alkyl, C 1 -C 8 haloalkyl, C (═NH) N (H) R 16 , C (═O) N (H) R 16 or OC ( = O) N (H) R 16 ;
R 16 is H or C 1 -C 8 alkyl;
Z 1 , Z 2 and Z 3 have from about 4 to about 7 carbon atoms, or from about 3 to about 6 carbon atoms and 1 or 2 heteroatoms, wherein the heteroatoms are oxygen A ring system selected from nitrogen and sulfur, said ring system being aliphatic, unsaturated aliphatic, aromatic, or saturated or unsaturated heterocyclic;
Z 5 is alkyl or haloalkyl having 1 to about 10 carbon atoms, alkenyl having 2 to about 10 carbon atoms, alkynyl having 2 to about 10 carbon atoms, 6 to about 14 carbon atoms Aryl having the following formula: N (R 5 ) (R 6 ) OR 5 , halo, SR 5 or CN;
Each q1 is independently an integer from 1 to 10;
Each q2 is independently 0 or 1;
q3 is 0 or an integer from 1 to 10;
q4 is an integer from 1 to 10;
66. The oligomeric compound of claim 65, wherein q5 is selected from 0, 1 or 2; provided that q4 is greater than 1 when q3 is 0.
前記2’−置換基が、−O−CHCHOCH、−O(CHON(CH、−O−(CH−O−(CH−N(CH、−O−CH、−OCHCHCHNH、−CH−CH=CH、又はフルオロである、請求項81記載のオリゴマー化合物。The 2′-substituent is —O—CH 2 CH 2 OCH 3 , —O (CH 2 ) 2 ON (CH 3 ) 2 , —O— (CH 2 ) 2 —O— (CH 2 ) 2 —N. (CH 3) 2, -O- CH 3, -OCH 2 CH 2 CH 2 NH 2, -CH 2 -CH = CH 2, or fluoro, 81. oligomeric compound according. 式:
Figure 2005504020
で示されるオリゴマー化合物、
上記式において、
各Yは、独立的に、ヌクレオシド間連結基であり;
各Aは、独立的に、水素又は2’−置換基であり;
は、水素又はヒドロキシル保護基であり;
は、水素又はヒドロキシル保護基であり;
nは、2〜約50であり;
Bx、Bx及びBxの各々は、複素環塩基部分であり、Bx、Bx及びBxの少なくとも1つは、式:
Figure 2005504020
で示される三環状複素環塩基部分であり、上記式において、
15は、O又はSであり;
16は、Hであり;
17は、式:
Figure 2005504020
[式中、Gは、−CN、−OA20、−SA20、−N(H)A20、−ON(H)A20又は−C(=NH)N(H)A20であり;Qは、H、−NHA20、−C(=O)N(H)A20、−C(=S)N(H)A20又は−C(=NH)N(H)A20であり;各Qは、独立的に、H又はPgであり;A20は、H、Pg、置換若しくは非置換C−C10アルキル、アセチル、ベンジル、−(CHp3NH、−(CHp3N(H)Pg、D若しくはLα−アミノ酸、又はD、L若しくはラセミα−アミノ酸に由来するペプチドであり;Pgは窒素、酸素若しくはチオール保護基であり;各p1は、独立的に、2〜約6であり;p2は1〜約3であり;p3は1〜約4である]で示される基であるか、或いはA17はHであり、A16は、−O−(CHp1C(=NH)N(H)A20、−O−(CHp1N(H)−C(=O)N(H)A20、又は−O−(CHp1N(H)−C(=S)N(H)A20から成る群から選択される。
formula:
Figure 2005504020
An oligomer compound represented by
In the above formula,
Each Y 1 is independently an internucleoside linking group;
Each A 1 is independently hydrogen or a 2′-substituent;
T 1 is hydrogen or a hydroxyl protecting group;
T 2 is hydrogen or a hydroxyl protecting group;
n is 2 to about 50;
Each of Bx 7 , Bx 8 and Bx 9 is a heterocyclic base moiety, and at least one of Bx 7 , Bx 8 and Bx 9 has the formula:
Figure 2005504020
A tricyclic heterocyclic base moiety represented by the formula:
A 15 is O or S;
A 16 is H;
A 17 has the formula:
Figure 2005504020
[Wherein G 1 is —CN, —OA 20 , —SA 20 , —N (H) A 20 , —ON (H) A 20, or —C (═NH) N (H) A 20 ; Q 1 is H, —NHA 20 , —C (═O) N (H) A 20 , —C (═S) N (H) A 20 or —C (═NH) N (H) A 20 Each Q 2 is independently H or Pg; A 20 is H, Pg, substituted or unsubstituted C 1 -C 10 alkyl, acetyl, benzyl, — (CH 2 ) p3 NH 2 , — ( CH 2) p3 N (H) Pg, D or Lα- amino, or D, a peptide derived from L or racemic α- amino acid; Pg is nitrogen, oxygen or thiol protecting group; each p1 is independently 2 to about 6; p2 is 1 to about 3; p3 is 1 to about 4. Or, alternatively A 17 is H, A 16 is, -O- (CH 2) p1 C (= NH) N (H) A 20, -O- (CH 2) p1 N (H) -C (= O) N (H) A 20 , or —O— (CH 2 ) p1 N (H) —C (═S) N (H) A 20 .
16がHであり;
17が−O−(CH−N(H)A21、−O−(CH−ON(H)A21若しくは−O−(CH−C(=NH)N(H)A21、−O−(CH−C(=NH)N(H)A21、−O−(CH−C(=O)N(H)A21、−O−(CH−C(=S)N(H)A21又は−O−(CH−N(H)C(=NH)N(H)A21であり、A21は水素又はアミノ保護基である、請求項84記載のオリゴマー化合物。
A 16 is H;
A 17 is —O— (CH 2 ) 2 —N (H) A 21 , —O— (CH 2 ) 2 —ON (H) A 21, or —O— (CH 2 ) 2 —C (═NH) N (H) A 21, -O- ( CH 2) 3 -C (= NH) N (H) A 21, -O- (CH 2) 2 -C (= O) N (H) A 21, -O - (CH 2) 2 -C ( = S) N (H) a 21 or -O- (CH 2) 2 -N ( H) C (= NH) a N (H) a 21, a 21 is hydrogen 85. The oligomeric compound of claim 84, which is an amino protecting group.
15がSである、請求項84記載のオリゴマー化合物。A 15 is S, 84. oligomeric compound according. 15がOである、請求項84記載のオリゴマー化合物。A 15 is O, and 84. The oligomeric compound according. 前記ヌクレオシド間連結基の各々が、リン含有ヌクレオシド間連結基である、請求項84記載のオリゴマー化合物。85. The oligomeric compound of claim 84, wherein each of the internucleoside linking groups is a phosphorus-containing internucleoside linking group. 前記リン含有ヌクレオシド間連結基の各々が、独立的に、ホスホジエステル、ホスホロチオエート、キラル・ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、メチルホスホネート、アルキルホスホネート、5’−アルキレンホスホネート、キラル・ホスホネート、ホスフィネート、ホスホルアミデート、3’−アミノホスホルアミデート、アミノアルキルホスホルアミデート、チオノホスホルアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、セレノホスフェート、及びボラノホスフェートから成る群から選択される、請求項88記載のオリゴマー化合物。Each of the phosphorus-containing internucleoside linking groups is independently phosphodiester, phosphorothioate, chiral phosphorothioate, phosphorodithioate, phosphotriester, aminoalkyl phosphotriester, methyl phosphonate, alkyl phosphonate, 5′-alkylene phosphonate Chiral phosphonates, phosphinates, phosphoramidates, 3'-aminophosphoramidates, aminoalkyl phosphoramidates, thionophosphoramidates, thionoalkylphosphonates, thionoalkylphosphotriesters, selenophosphates, 90. The oligomeric compound of claim 88, selected from the group consisting of: and boranophosphate. 前記ヌクレオシド間連結基の90%より多くが、ホスホジエステル・ヌクレオシド間連結基である、請求項84記載のオリゴマー化合物。85. The oligomeric compound of claim 84, wherein more than 90% of the internucleoside linking groups are phosphodiester internucleoside linking groups. 前記ヌクレオシド間連結基の少なくとも1つが、非リン含有ヌクレオシド間連結基である、請求項84記載のオリゴマー化合物。85. The oligomeric compound of claim 84, wherein at least one of the internucleoside linking groups is a non-phosphorus containing internucleoside linking group. 前記ヌクレオシド間連結基の90%より多くが、非リン含有ヌクレオシド間連結基である、請求項91記載のオリゴマー化合物。92. The oligomeric compound of claim 91, wherein more than 90% of the internucleoside linking groups are non-phosphorus containing internucleoside linking groups. 前記非リン含有ヌクレオシド間連結基の各々が、独立的に、モルホリノ、シロキサン、スルフィド、スルホキシド、スルホン、ホルムアセチル、チオホルムアセチル、メチレンホルムアセチル、チオホルムアセチル、スルファメート、メチレンイミノ、メチレンヒドラジノ、スルホネート、スルホンアミド、及びアミドから成る群から選択される、請求項92記載のオリゴマー化合物。Each of the non-phosphorus-containing internucleoside linking groups is independently morpholino, siloxane, sulfide, sulfoxide, sulfone, formacetyl, thioformacetyl, methyleneformacetyl, thioformacetyl, sulfamate, methyleneimino, methylenehydrazino, 94. The oligomeric compound of claim 92, selected from the group consisting of sulfonates, sulfonamides, and amides. 前記非リン含有ヌクレオシド間連結基の各々が、独立的に、−CH−NH−O−CH−、−CH−N(CH)−O−CH−、−CH−O−N(CH)−CH−、−CH−N(CH)−N(CH)−CH−及び−O−N(CH)−CH−CH−から成る群から選択される、請求項93記載のオリゴマー化合物。Each of the non-phosphorus-containing internucleoside linking groups is independently —CH 2 —NH—O—CH 2 —, —CH 2 —N (CH 3 ) —O—CH 2 —, —CH 2 —O—. N (CH 3) -CH 2 - , - CH 2 -N (CH 3) -N (CH 3) -CH 2 - selected from the group consisting of - and -O-N (CH 3) -CH 2 -CH 2 94. The oligomeric compound of claim 93. 前記オリゴマー化合物が、ギャップマー、ヘミマー又は逆ギャップマーである、請求項84記載のオリゴマー化合物。85. The oligomeric compound of claim 84, wherein the oligomeric compound is a gapmer, hemimer or reverse gapmer. オリゴマー化合物が、前記ギャップマー、ヘミマー又は逆ギャップマーの少なくとも1つの領域において、少なくとも1つの2’−O−CHCH−O−CH置換基を含む、請求項95記載のオリゴマー化合物。Oligomeric compounds, the gapmer, at least one region of hemimer or reverse gapmer comprises at least one 2'-O-CH 2 CH 2 -O-CH 3 substituents, 95. The oligomeric compound according. nが約8〜約30である、請求項84記載のオリゴマー化合物。85. The oligomeric compound of claim 84, wherein n is about 8 to about 30. nが約15〜約25である、請求項84記載のオリゴマー化合物。85. The oligomeric compound of claim 84, wherein n is about 15 to about 25. 前記Bxの各々と、三環状複素環塩基部分ではない前記Bx及びBxの各々が、独立的に、アデニニル、グアニニル、チミニル、シトシニル、ウラシリル、5−メチルシトシニル(5−me−C)、5−ヒドロキシメチルシトシニル、キサンチニル、ヒポキサンチニル、2−アミノアデニニル、アデニニル及びグアニニルのアルキル誘導体、2−チオウラシリル、2−チオチミニル、2−チオシトシニル、5−ハロウラシリル、5−ハロシトシニル、5−プロピニルウラシリル、5−プロピニルシトシニル、6−アゾウラシリル、6−アゾシトシニル、6−アゾチミニル、5−ウラシリル(プソイドウラシル)、4−チオウラシリル、8−置換アデニニル及びグアニニル、5−置換ウラシリル及びシトシニル、7−メチルグアニニル、7−メチルアデニニル、8−アザグアニニル、8−アザアデニニル、7−デアザグアニニル、7−デアザアデニニル、3−デアザグアニニル及び3−デアザアデニニルから成る群から選択される、請求項84記載のオリゴマー化合物。Each of said Bx 2 and each of said Bx 1 and Bx 3 that is not a tricyclic heterocyclic base moiety is independently adenyl, guanylyl, thyminyl, cytosynyl, urasilyl, 5-methylcytosinyl (5-me-C), 5-hydroxymethylcytosinyl, xanthinyl, hypoxanthinyl, 2-aminoadenynyl, adenylyl and guaninyl alkyl derivatives, 2-thiourasilyl, 2-thiothyminyl, 2-thiocytosinyl, 5-halourasilyl, 5-halocytosinyl, 5-propynylurasilyl, 5- Propynylcytosinyl, 6-azourasilyl, 6-azocytosinyl, 6-azothyminyl, 5-urasilyl (pseudouracil), 4-thiourasilyl, 8-substituted adenylyl and guaninyl, 5-substituted urasilyl and cytosynyl, 7-methylguaninyl 7- Mechiruadeniniru, 8 Azaguaniniru, 8 Azaadeniniru, 7 Deazaguaniniru, 7- Deazaadeniniru, 3- Deazaguaniniru and 3 is selected from the group consisting of Deazaadeniniru, 84. oligomeric compound according. 各糖置換基が、独立的に、C−C20アルキル、C−C20アルケニル、C−C20アルキニル、C−C20アリール、−O−アルキル、−O−アルケニル、−O−アルキニル、−O−アルキルアミノ、−O−アルキルアルコキシ、−O−アルキルアミノアルキル、−O−アルキルイミダゾール、−OH、−SH、−S−アルキル、−S−アルケニル、−S−アルキニル、−N(H)−アルキル、−N(H)−アルケニル、−N(H)−アルキニル、−N(アルキル)、−O−アリール、−S−アリール、−NH−アリール、−O−アラルキル、−S−アラルキル、−N(H)−アラルキル、フタルイミド(Nにおいて結合)、ハロゲン、アミノ、ケト(−C(=O)−R)、カルボキシル(−C(=O)OH)、ニトロ(−NO)、ニトロソ(−N=O)、シアノ(−CN)、トリフルオロメチル(−CF)、トリフルオロメトキシ(−O−CF)、イミダゾール、アジド(−N)、ヒドラジノ(−N(H)−NH)、アミノオキシ(−O−NH)、イソシアナト(−N=C=O)、スルホキシド(−S(=O)−R)、スルホン(−S(=O)−R)、ジスルフィド(−S−S−R)、シリル、ヘテロサイクリル、カルボサイクリル、インターカレーター、レポーター基、コンジュゲート基、ポリアミン、ポリアミド、ポリアルキレングリコール、又は式(−O−アルキル)(式中、mは1〜約10である)で示されるポリエーテルであり、この場合、各Rは、独立的に、水素、保護基、又は置換若しくは非置換アルキル、アルケニル又はアルキニルであり、これらにおいて、置換基はハロアルキル、アルケニル、アルコキシ、チオアルコキシ、ハロアルコキシ又はアリールから選択される)、並びにハロゲン、ヒドロキシル、アミノ、アジド、カルボキシ、シアノ、ニトロ、メルカプト、スルフィド基、スルホニル基及びスルホキシド基から選択される;
或いは、各糖置換基が、式I又はIIのいずれかで示され、式中、
は、O、S若しくはNHであり;
Jは、単結合、O若しくはC(=O)であり;
Eは、C−C10アルキル、N(R)(R)、N(R)(R)、N=C(R5a)(R6a)、N=C(R5a)(R7a)であるか、又は式III若しくはIV:
Figure 2005504020
のいずれかを有する;
各R、R、R10、R11及びR12は、独立的に、水素、C(O)R13、置換若しくは非置換C−C10アルキル、置換若しくは非置換C−C10アルケニル、置換若しくは非置換C−C10アルキニル、アルキルスルホニル、アリールスルホニル、化学官能基若しくはコンジュゲート基であり、この場合、置換基は、ヒドロキシル、アミノ、アルコキシ、カルボキシ、ベンジル、フェニル、ニトロ、チオール、チオアルコキシ、ハロゲン、アルキル、アリール、アルケニル及びアルキニルから選択される;
又は任意に、RとR10は一緒に、それらが結合する窒素原子と共にフタルイミド部分を形成する;
又は任意に、R11とR12は一緒に、それらが結合する窒素原子と共にフタルイミド部分を形成する;
各R13は、独立的に、置換若しくは非置換C−C10アルキル、トリフルオロメチル、シアノエチルオキシ、メトキシ、エトキシ、t−ブトキシ、アリルオキシ、9−フルオレニルメトキシ、2−(トリメチルシリル)−エトキシ、2,2,2−トリクロロエトキシ、ベンジルオキシ、ブチリル、イソーブチリル、フェニル又はアリールであり;
は、水素、窒素保護基又は−T−Lであり;
5aは、水素、窒素保護基又は−T−Lであり;
Tは、結合又は連結部分であり;
Lは、化学官能基、コンジュゲート基又は固体支持体であり;
各RとRは、独立的に、H、窒素保護基、置換若しくは非置換C−C10アルキル、置換若しくは非置換C−C10アルケニル、置換若しくは非置換C−C10アルキニルであり、これらにおいて、置換基は、ヒドロキシル、アミノ、アルコキシ、カルボキシ、ベンジル、フェニル、ニトロ、チオール、チオアルコキシ、ハロゲン、アルキル、アリール、アルケニル、アルキニル、NH 、N(R14)(R15)、グアニジノ及びアシルから選択され、前記アシルは、酸アミド又はエステルである;
或いは、RとRは一緒に、窒素保護基であるか、又はN及びOから選択される付加的ヘテロ原子を任意に包含する環構造として結合するか、又は化学官能基である;
各R14とR15は、独立的に、H、C−C10アルキル、窒素保護基であるか、又はR14とR15は一緒に、窒素保護基である;
或いは、R14とR15は、N及びOから選択される付加的ヘテロ原子を任意に包含する環構造として結合する;
は、OX、SX、又はN(X)であり;
各Xは、独立的に、H、C−Cアルキル、C−Cハロアルキル、C(=NH)N(H)R16、C(=O)N(H)R16又はOC(=O)N(H)R16であり;
16は、H又はC−Cアルキルであり;
、Z及びZは、約4〜約7個の炭素原子を有するか又は約3〜約6個の炭素原子と1若しくは2個のヘテロ原子とを有し、前記ヘテロ原子が酸素、窒素及び硫黄から選択される環系を含み、前記環系は脂肪族、不飽和脂肪族、芳香族、又は飽和若しくは不飽和複素環式であり;
は、1〜約10個の炭素原子を有するアルキル若しくはハロアルキル、2〜約10個の炭素原子を有するアルケニル、2〜約10個の炭素原子を有するアルキニル、6〜約14個の炭素原子を有するアリール、N(R)(R)OR、ハロ、SR又はCNであり;
各q1は、独立的に、1〜10の整数であり;
各q2は、独立的に、0又は1であり;
q3は0又は1〜10の整数であり;
q4は、1〜10の整数であり;
q5は、0、1又は2から選択される;ただし、q3が0であるときに、q4は1より大きい、請求項84記載のオリゴマー化合物。
Each sugar substituents, independently, C 1 -C 20 alkyl, C 2 -C 20 alkenyl, C 2 -C 20 alkynyl, C 5 -C 20 aryl, -O- alkyl, -O- alkenyl, -O -Alkynyl, -O-alkylamino, -O-alkylalkoxy, -O-alkylaminoalkyl, -O-alkylimidazole, -OH, -SH, -S-alkyl, -S-alkenyl, -S-alkynyl,- N (H) -alkyl, -N (H) -alkenyl, -N (H) -alkynyl, -N (alkyl) 2 , -O-aryl, -S-aryl, -NH-aryl, -O-aralkyl, -S-aralkyl, -N (H) -aralkyl, phthalimide (bonded at N), halogen, amino, keto (-C (= O) -R), carboxyl (-C (= O) OH), nitro (-NO 2), nitroso (-N = O), cyano (-CN), trifluoromethyl (-CF 3), trifluoromethoxy (-O-CF 3), imidazole, azido (-N 3), hydrazino (—N (H) —NH 2 ), aminooxy (—O—NH 2 ), isocyanato (—N═C═O), sulfoxide (—S (═O) —R), sulfone (—S (═O) ) 2 -R), disulfide (—S—S—R), silyl, heterocyclyl, carbocyclyl, intercalator, reporter group, conjugate group, polyamine, polyamide, polyalkylene glycol, or formula (—O— alkyl) m (wherein, m is a polyether represented by 1 to about 10), where each R is independently hydrogen, a protecting group, or a substituted or unsubstituted alkyl, a Kenyl or alkynyl, in which the substituent is selected from haloalkyl, alkenyl, alkoxy, thioalkoxy, haloalkoxy or aryl), and halogen, hydroxyl, amino, azide, carboxy, cyano, nitro, mercapto, sulfide groups , A sulfonyl group and a sulfoxide group;
Alternatively, each sugar substituent is represented by either formula I or II, wherein
Z 0 is O, S or NH;
J is a single bond, O or C (═O);
E is C 1 -C 10 alkyl, N (R 5 ) (R 6 ), N (R 5 ) (R 7 ), N = C (R 5a ) (R 6a ), N = C (R 5a ) ( R 7a ) or of formula III or IV:
Figure 2005504020
Any of
Each R 8 , R 9 , R 10 , R 11 and R 12 is independently hydrogen, C (O) R 13 , substituted or unsubstituted C 1 -C 10 alkyl, substituted or unsubstituted C 2 -C 10. alkenyl, substituted or unsubstituted C 2 -C 10 alkynyl, alkylsulfonyl, arylsulfonyl, a chemical functional group or a conjugate group, wherein the substituents are hydroxyl, amino, alkoxy, carboxy, benzyl, phenyl, nitro, Selected from thiol, thioalkoxy, halogen, alkyl, aryl, alkenyl and alkynyl;
Or optionally, R 9 and R 10 together form a phthalimide moiety with the nitrogen atom to which they are attached;
Or optionally, R 11 and R 12 together form a phthalimide moiety with the nitrogen atom to which they are attached;
Each R 13 is independently substituted or unsubstituted C 1 -C 10 alkyl, trifluoromethyl, cyanoethyloxy, methoxy, ethoxy, t-butoxy, allyloxy, 9-fluorenylmethoxy, 2- (trimethylsilyl)- Ethoxy, 2,2,2-trichloroethoxy, benzyloxy, butyryl, isobutyryl, phenyl or aryl;
R 5 is hydrogen, a nitrogen protecting group, or -TL;
R 5a is hydrogen, a nitrogen protecting group, or -TL;
T is a bond or linking moiety;
L is a chemical functional group, a conjugate group or a solid support;
Each R 6 and R 7 is independently H, nitrogen protecting group, substituted or unsubstituted C 1 -C 10 alkyl, substituted or unsubstituted C 2 -C 10 alkenyl, substituted or unsubstituted C 2 -C 10 alkynyl. In which the substituents are hydroxyl, amino, alkoxy, carboxy, benzyl, phenyl, nitro, thiol, thioalkoxy, halogen, alkyl, aryl, alkenyl, alkynyl, NH 3 + , N (R 14 ) (R 15 ), selected from guanidino and acyl, wherein the acyl is an acid amide or ester;
Alternatively, R 6 and R 7 together are a nitrogen protecting group, or are attached as a ring structure optionally including additional heteroatoms selected from N and O, or are chemical functional groups;
Each R 14 and R 15 is independently H, C 1 -C 10 alkyl, a nitrogen protecting group, or R 14 and R 15 together are a nitrogen protecting group;
Alternatively, R 14 and R 15 are attached as a ring structure optionally including additional heteroatoms selected from N and O;
Z 4 is OX, SX, or N (X) 2 ;
Each X is independently H, C 1 -C 8 alkyl, C 1 -C 8 haloalkyl, C (═NH) N (H) R 16 , C (═O) N (H) R 16 or OC ( = O) N (H) R 16 ;
R 16 is H or C 1 -C 8 alkyl;
Z 1 , Z 2 and Z 3 have from about 4 to about 7 carbon atoms, or from about 3 to about 6 carbon atoms and 1 or 2 heteroatoms, wherein the heteroatoms are oxygen A ring system selected from nitrogen and sulfur, said ring system being aliphatic, unsaturated aliphatic, aromatic, or saturated or unsaturated heterocyclic;
Z 5 is alkyl or haloalkyl having 1 to about 10 carbon atoms, alkenyl having 2 to about 10 carbon atoms, alkynyl having 2 to about 10 carbon atoms, 6 to about 14 carbon atoms Aryl having the following formula: N (R 5 ) (R 6 ) OR 5 , halo, SR 5 or CN;
Each q1 is independently an integer from 1 to 10;
Each q2 is independently 0 or 1;
q3 is 0 or an integer from 1 to 10;
q4 is an integer from 1 to 10;
85. The oligomeric compound of claim 84, wherein q5 is selected from 0, 1 or 2; provided that q4 is greater than 1 when q3 is 0.
前記2’−置換基が、−O−CHCHOCH、−O(CHON(CH、−O−(CH−O−(CH−N(CH、−O−CH、−OCHCHCHNH、−CH−CH=CH、又はフルオロである、請求項100記載のオリゴマー化合物。The 2′-substituent is —O—CH 2 CH 2 OCH 3 , —O (CH 2 ) 2 ON (CH 3 ) 2 , —O— (CH 2 ) 2 —O— (CH 2 ) 2 —N. (CH 3) 2, -O- CH 3, -OCH 2 CH 2 CH 2 NH 2, a -CH 2 -CH = CH 2, or fluoro, claim 100 oligomeric compound according.
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