JP2005323506A - Protein having hyaluronic acid-synthesizing activity and method for producing hyaluronic acid - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、ヒアルロン酸合成活性を有するタンパク質及びヒアルロン酸の新規な製造方法に関する。 The present invention relates to a protein having hyaluronic acid synthesis activity and a novel method for producing hyaluronic acid.
本出願書類中で使用する略号は以下の通りである。 The abbreviations used in the application documents are as follows.
ＡｃＮＰＶ：Autographa californicaの核多角体病ウイルス
ＤＴＴ：ジチオトレイトール（dithiothreitol）
ＥＤＴＡ：エチレンジアミン四酢酸（ethylenediaminetetraacetic acid）
ＦＣＳ：ウシ胎仔血清（fetal calf serum）
GlcNAc：N-アセチルグルコサミン（N-acetylglucosamine）
GlcUA：グルクロン酸（glucuronic acid）
ＨＡ：ヒアルロン酸
ＨＡａｓｅ：ヒアルロニダーゼ
ＨＡＢＰ：ヒアルロン酸結合性タンパク質
ＨＡ−ＢＳＡ：ウシ血清アルブミンが結合したヒアルロン酸
ＨＡＳ：ヒアルロン合成酵素（hyaluronan synthase）。なお、ヒアルロン酸合成酵素１は「ＨＡＳ１」、ヒアルロン酸合成酵素２は「ＨＡＳ２」、ヒアルロン酸合成酵素３は「ＨＡＳ３」とそれぞれ略記する。
AcNPV: Nuclear polyhedrosis virus of Autographa californica DTT: Dithiothreitol
EDTA: ethylenediaminetetraacetic acid
FCS: fetal calf serum
GlcNAc: N-acetylglucosamine
GlcUA: glucuronic acid
HA: Hyaluronic acid HAase: Hyaluronidase HABP: Hyaluronic acid binding protein HA-BSA: Hyaluronic acid bound with bovine serum albumin HAS: Hyaluronan synthase. Hyaluronic acid synthase 1 is abbreviated as “HAS1”, hyaluronic acid synthase 2 as “HAS2”, and hyaluronic acid synthase 3 as “HAS3”.
ＨＥＰＥＳ：2-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]エタンスルホン酸（2-[4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinyl]ethanesulfonic acid）
ＮＰＶ：核多角体病ウイルス（nuclear polyhedrosis virus）
ＰＢＳ：リン酸緩衝生理食塩液（phosphate buffered saline）
ＳＤＳ：ドデシル硫酸ナトリウム（sodium dodecyl sulfate）
ＵＤＰ：ウリジン5'-二リン酸（uridine 5'-diphosphate）
ＨＡは、GlcUAとGlcNAcの二糖繰り返し構造のみを持つ超高分子多糖体であり、変形性膝関節症の治療薬や白内障手術の補助剤等の医薬品としてのみならず、化粧品や食品の素材等としても非常に有用な物質である。
ＨＡは全ての脊椎動物の様々な組織・器官及び体液中で検出される。脊椎動物以外には、ある種のバクテリア（例えば Streptococcus hyalyticum）の細胞壁多糖成分として検出されるが、昆虫のような無脊椎動物や植物には見いだされていない。
ＨＡ合成活性を有するタンパク質として、バクテリアでは１種類のＨＡＳ（Streptococcus hyalyticum由来のｈａｓ−Ａ）が、アフリカツメガエルではＨＡＳであるＤＧ４２が、哺乳類では３種類のＨＡＳ（ＨＡＳ１、２、３）が見出されている。ＨＡＳ１は非特許文献１に、ＨＡＳ２及びＨＡＳ３は非特許文献２にそれぞれ開示されている。ＨＡＳ２をコードするＤＮＡ（ｃＤＮＡ）については、ヒト由来のものは非特許文献３に、マウス由来のものは非特許文献４にそれぞれ開示されている。正常の組織中では、ＨＡＳ２のmRNA及びタンパク質の生産が最も高く、酵素活性もＨＡＳ２が最も高い傾向にある。
しかしながら、これらの以外の生物に由来する細胞等を用いて、ＨＡ合成活性を有するタンパク質を大量に生産させることについては知られていない。また現在、ＨＡは、鶏冠などの動物資源やストレプトコッカスなどのバクテリアの培養液等から製造されている。しかしながら、これらの生物以外の生物に由来する細胞等を用いて、ＨＡを大量に生産させることについては知られていない。
HEPES: 2- [4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazinyl] ethanesulfonic acid (2- [4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazinyl] ethanesulfonic acid)
NPV: nuclear polyhedrosis virus
PBS: phosphate buffered saline
SDS: sodium dodecyl sulfate
UDP: uridine 5'-diphosphate
HA is an ultra-high-molecular-weight polysaccharide having only GlcUA and GlcNAc disaccharide repeats, and is not only used as a drug for the treatment of knee osteoarthritis or as a supplement for cataract surgery, but also as a material for cosmetics and foods. It is a very useful substance.
HA is detected in various tissues and organs and body fluids of all vertebrates. In addition to vertebrates, it is detected as a cell wall polysaccharide component of certain bacteria (eg, Streptococcus hyalyticum), but it is not found in invertebrates such as insects or plants.
As a protein having HA synthesis activity, one type of HAS (has-A derived from Streptococcus hyalyticum) is found in bacteria, DG42 is a HAS in Xenopus, and three types of HAS (HAS1, 2, 3) are found in mammals. Has been. HAS1 is disclosed in Non-Patent Document 1, and HAS2 and HAS3 are disclosed in Non-Patent Document 2, respectively. Regarding DNA (cDNA) encoding HAS2, those derived from humans are disclosed in Non-Patent Document 3, and those derived from mice are disclosed in Non-Patent Document 4, respectively. In normal tissues, HAS2 mRNA and protein production is highest, and enzyme activity tends to be highest in HAS2.
However, it is not known to produce a large amount of a protein having HA synthesis activity using cells derived from organisms other than these. Currently, HA is produced from animal resources such as chicken crowns and bacterial cultures such as Streptococcus. However, it is not known to produce HA in large quantities using cells derived from organisms other than these organisms.
本発明は、ＨＡ合成活性を有するタンパク質やＨＡの効率的な生産に有用な新規なＮＰＶ、これを保持しておりＨＡ合成活性を有するタンパク質やＨＡの効率的な生産に有用な昆虫細胞、この細胞を用いたＨＡ合成活性を有するタンパク質の効率的な生産方法及びＨＡの効率的な生産方法を提供することを課題とする。 The present invention relates to a novel NPV useful for the efficient production of a protein having HA synthesis activity and HA, an insect cell that retains this and useful for the efficient production of a protein having HA synthesis activity and HA, It is an object of the present invention to provide an efficient production method of a protein having HA synthesis activity using cells and an efficient production method of HA.
本発明の発明者らは上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、特定のウイルスが保持された特定の細胞を用いることにより、ＨＡ合成活性を有するタンパク質やＨＡを効率的に製造することができることを見出し、本発明を完成するに至った。 As a result of intensive studies to solve the above-mentioned problems, the inventors of the present invention can efficiently produce a protein having HA synthesis activity and HA by using a specific cell in which a specific virus is retained. As a result, the present invention has been completed.
すなわち本発明は、ＨＡ合成活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡが保持された、ＮＰＶ（以下、「本発明ウイルス」という。）を提供する。 That is, the present invention provides an NPV (hereinafter referred to as “the virus of the present invention”) in which a DNA encoding a protein having HA synthesis activity is retained.
本発明ウイルスにおいて保持される「ＨＡ合成活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ」は、下記（Ａ）又は（Ｂ）のＤＮＡであることが好ましい。
（Ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ、
（Ｂ）「配列番号２に示されるアミノ酸配列における１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は転位したアミノ酸配列からなり、かつ、ＨＡを合成する活性を有するタンパク質」をコードするＤＮＡ。
The “DNA encoding a protein having HA synthesis activity” retained in the virus of the present invention is preferably the following DNA (A) or (B).
(A) DNA encoding a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2,
(B) DNA encoding “a protein consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 have been deleted, substituted, inserted or rearranged and having an activity of synthesizing HA”.
本発明ウイルスにおいて保持される当該ＤＮＡは、なかでも下記（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡであることが好ましい。
（ａ）配列番号１における塩基番号７〜１６８９で示される塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｂ）配列番号１における塩基番号７〜１６８９で示される塩基配列において、その塩基配列によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列における１若しくは数個のアミノ酸を欠失、置換、挿入または転位させる塩基の変異を有し、かつ、発現されるタンパク質がＨＡを合成する活性を有することを特徴とするＤＮＡ。
In particular, the DNA retained in the virus of the present invention is preferably the following DNA (a) or (b).
(A) DNA comprising a base sequence represented by base numbers 7 to 1689 in SEQ ID NO: 1,
(B) In the base sequence represented by base numbers 7 to 1689 in SEQ ID NO: 1, a base mutation that deletes, substitutes, inserts or transposes one or several amino acids in the amino acid sequence of the protein encoded by the base sequence And a DNA to be expressed has activity of synthesizing HA.
また、このようなＤＮＡを保持するＮＰＶは、ＡｃＮＰＶであることが好ましい。
また本発明は、本発明ウイルスを保持する昆虫由来の細胞（以下、「本発明細胞」という。）を提供する。
Moreover, it is preferable that NPV which hold | maintains such DNA is AcNPV.
The present invention also provides an insect-derived cell carrying the virus of the present invention (hereinafter referred to as “the cell of the present invention”).
さらに本発明は、本発明細胞を生育させ、その生育物からＨＡ合成活性を有するタンパク質を採取する工程を少なくとも含む、ＨＡ合成活性を有するタンパク質の生産方法（以下、「本発明タンパク質生産方法」という。）を提供する。 The present invention further includes a method for producing a protein having HA synthesis activity (hereinafter referred to as “the protein production method of the present invention”), which comprises at least a step of growing the cell of the present invention and collecting a protein having HA synthesis activity from the grown product. .)I will provide a.
さらに本発明は、本発明細胞を生育させ、その生育物からＨＡを採取する工程を少なくとも含む、ＨＡの生産方法（以下、「本発明ＨＡ生産方法」という。）を提供する。 Furthermore, the present invention provides a method for producing HA (hereinafter referred to as “the HA production method of the present invention”) comprising at least a step of growing the cells of the present invention and collecting HA from the growth.
本発明ウイルスは、これを用いることによって、ＨＡ合成活性を有するタンパク質やＨＡの効率的な生産に有用な本発明細胞が提供されることから極めて有用である。また本発明細胞は、これを用いることにより、高いＨＡ合成活性を有するタンパク質やＨＡを効率的に生産でき、またこれによって本発明生産方法が提供されることから極めて有用である。さらに、本発明タンパク質生産方法や本発明ＨＡ生産方法を用いることにより、高いＨＡ合成活性を有するタンパク質やＨＡを簡便、迅速、大量かつ安価に生産することができ、極めて有用である。 The use of the virus of the present invention is extremely useful since it provides a protein of the present invention useful for efficient production of a protein having HA synthesis activity and HA. In addition, the cells of the present invention are extremely useful because they can efficiently produce proteins and HA having high HA synthesis activity, and provide the production method of the present invention. Furthermore, by using the protein production method of the present invention or the HA production method of the present invention, a protein or HA having high HA synthesis activity can be produced simply, rapidly, in large quantities and at low cost, and is extremely useful.
以下、発明を実施するための最良の形態により本発明を詳説する。
本発明ウイルス
本発明ウイルスは、ＨＡ合成活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡが保持された、ＮＰＶである。
Hereinafter, the present invention will be described in detail by the best mode for carrying out the invention.
The virus of the present invention The virus of the present invention is an NPV in which DNA encoding a protein having HA synthesis activity is retained.
本発明ウイルスにおいて保持される「ＨＡ合成活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ」は、ＨＡを合成する活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡである限りにおいて特に限定されない。
例えば、Streptococcus hyalyticum由来のｈａｓ−ＡをコードするＤＮＡ、アフリカツメガエルのＨＡＳであるＤＧ４２の遺伝子Ｘｈａｓ−１及び−２、哺乳類のＨＡＳ（ＨＡＳ１、２、３）をコードするＤＮＡ等を用いることができるが、哺乳類のＨＡＳをコードするＤＮＡであることが好ましい。このＨＡＳは、ヒト由来のＨＡＳであることが好ましい。またＨＡＳは、ＨＡＳ２であることが好ましい。
The “DNA encoding a protein having HA synthesis activity” retained in the virus of the present invention is not particularly limited as long as it is a DNA encoding a protein having an activity to synthesize HA.
For example, DNA encoding has-A derived from Streptococcus hyalyticum, Xhas-1 and -2 of DG42, which is a HAS of Xenopus laevis, DNA encoding HAS (HAS1, 2, 3) of mammals, etc. can be used. Is preferably DNA encoding mammalian HAS. This HAS is preferably a human-derived HAS. The HAS is preferably HAS2.
本発明ウイルスにおいて保持されるＤＮＡは、なかでも、下記（Ａ）又は（Ｂ）のＤＮＡであることが好ましい。
（Ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ、
（Ｂ）「配列番号２に示されるアミノ酸配列における１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は転位したアミノ酸配列からなり、かつ、ＨＡを合成する活性を有するタンパク質」をコードするＤＮＡ。
In particular, the DNA retained in the virus of the present invention is preferably the following DNA (A) or (B).
(A) DNA encoding a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2,
(B) DNA encoding “a protein consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 have been deleted, substituted, inserted or rearranged and having an activity of synthesizing HA”.
ここにいう「配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質」は、ヒト由来のＨＡＳ２（以下、ｈＨＡＳ２という。）である。 The “protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2” herein is a human-derived HAS2 (hereinafter referred to as hHAS2).
天然に存在するタンパク質には、それをコードするＤＮＡの多型や変異の他、生成後のタンパク質の細胞内及び精製中の修飾反応などによってそのアミノ酸配列中にアミノ酸の置換、欠失、挿入又は転位等の変異が起こりうるが、それにもかかわらず変異を有しないタンパク質と実質的に同等の生理、生物学的活性を示すものがあることが知られている。このように「（Ａ）のＤＮＡによってコードされるタンパク質」に対して構造的に若干の差違があってもその機能については大きな違いが認められない「（Ｂ）のＤＮＡによってコードされるタンパク質」は、「（Ａ）のＤＮＡによってコードされるタンパク質」と実質的に同等なものといえる。人為的にタンパク質のアミノ酸配列に上記のような変異を導入した場合も同様であり、この場合にはさらに多種多様の変異体を作製することが可能である。例えば、ヒトインターロイキン２（IL-2）のアミノ酸配列中の、あるシステイン残基をセリンに置換したポリペプチドがインターロイキン２活性を保持することが知られている(Science,224,1431(1984))。また、ある種のタンパク質は、活性には必須でないペプチド領域を有していることが知られている。例えば、細胞外に分泌されるタンパク質に存在するシグナルペプチドや、プロテアーゼの前駆体等に見られるプロ配列などがこれにあたり、これらの領域のほとんどは翻訳後、又は活性型タンパク質への転換に際して除去される。このようなタンパク質は、一次構造上は異なった形で存在しているが、最終的には「（Ａ）のＤＮＡによってコードされるタンパク質」と実質的に同等の機能を有するタンパク質である。上記の「（Ｂ）のＤＮＡによってコードされるタンパク質」は、このようなタンパク質を規定するものである。 A naturally occurring protein includes amino acid substitutions, deletions, insertions or insertions in its amino acid sequence, such as by polymorphisms and mutations in the DNA that encodes it, as well as by modification reactions during the intracellular and purification of the protein after production. It is known that some mutations such as rearrangement may occur, but nonetheless exhibit substantially the same physiological and biological activity as a protein having no mutation. Thus, even if there are some structural differences with respect to the “protein encoded by the DNA of (A)”, there is no significant difference in its function “the protein encoded by the DNA of (B)”. Is substantially equivalent to the “protein encoded by the DNA of (A)”. The same applies when the above mutations are artificially introduced into the amino acid sequence of the protein. In this case, a wider variety of mutants can be prepared. For example, it is known that a polypeptide obtained by substituting a certain cysteine residue with serine in the amino acid sequence of human interleukin 2 (IL-2) retains interleukin 2 activity (Science, 224, 1431 (1984). )). In addition, certain proteins are known to have peptide regions that are not essential for activity. For example, signal peptides present in proteins secreted outside the cell, and pro-sequences found in protease precursors, etc., most of these regions are removed after translation or conversion to active proteins. The Such a protein exists in a different form in the primary structure, but finally has a function substantially equivalent to the “protein encoded by the DNA of (A)”. The above “protein encoded by the DNA of (B)” defines such a protein.
本明細書において「数個のアミノ酸」とは、ＨＡを合成する活性が失われない範囲で変異を起こしてもよいアミノ酸の数を示し、例えば６００アミノ酸残基からなるタンパク質の場合には２〜３０程度、好ましくは２〜１５、より好ましくは２〜８以下の数を示す。 As used herein, “several amino acids” refers to the number of amino acids that may be mutated within a range that does not lose the activity of synthesizing HA. For example, in the case of a protein consisting of 600 amino acid residues, The number is about 30, preferably 2 to 15, more preferably 2 to 8 or less.
（Ｂ）のＤＮＡによってコードされるタンパク質は、ＨＡを合成する活性を有していることが必要である。
このような活性を有するか否かは、例えば、基質としてUDP-GlcNAcとUDP-GlcUAを用い、これに上記（Ａ）又は（Ｂ）のＤＮＡによってコードされるタンパク質を含むと推定されるサンプルを作用・反応させて、ＨＡが合成されたか否かを調べることによって判定することができる。例えば、反応生成物にＨＡを分解する酵素（ヒアルロニダーゼ）を作用させ、これにより反応生成物が分解されたとすれば、反応により生成した物質はＨＡであると判定することができる。より具体的な方法の一例は、後述の実施例を参照されたい。
The protein encoded by the DNA of (B) needs to have an activity of synthesizing HA.
Whether or not it has such an activity is determined by, for example, using UDP-GlcNAc and UDP-GlcUA as substrates and a sample presumed to contain a protein encoded by the DNA of (A) or (B) above. It can be determined by examining whether HA has been synthesized by acting and reacting. For example, if an enzyme (hyaluronidase) that degrades HA is allowed to act on the reaction product and the reaction product is decomposed thereby, the substance produced by the reaction can be determined to be HA. For an example of a more specific method, refer to the examples described later.
また本発明ウイルスにおいて「ＤＮＡが保持された」とは、そのＤＮＡが保持されている限りにおいて、他のＤＮＡ等が更に保持されていることを妨げるものではない。したがって、そのＤＮＡのみならず、更にマーカーペプチド等をコードするＤＮＡ等が保持されていてもよい。 In addition, in the virus of the present invention, “DNA is retained” does not prevent further retention of other DNA or the like as long as the DNA is retained. Therefore, not only the DNA but also DNA encoding a marker peptide or the like may be retained.
例えば、「上記（Ａ）又は（Ｂ）のＤＮＡ」と「マーカーペプチド等をコードするＤＮＡ」とが連結されたＤＮＡが保持されたベクターも、本発明ウイルスに包含される。保持されるＤＮＡをこのようにデザインすると、マーカーペプチド等との融合タンパク質として発現させることができ、その発現されたタンパク質の精製や分析を容易にすることができるというメリットがある。マーカーペプチドとしては、例えばプロテインＡ、インスリンシグナル配列、His、FLAG、CBP（カルモジュリン結合タンパク質）、GST（グルタチオン Ｓ−トランスフェラーゼ）などが挙げられる。例えばプロテインＡとの融合タンパク質は、ＩｇＧを結合させた固相を用いたアフィニティークロマトグラフィーによって簡便に精製することができる。同様に、Hisタグとの融合タンパク質については磁性ニッケルを結合させた固相を用いることができ、FLAGとの融合タンパク質については抗FLAG抗体を結合させた固相を用いることができる。またインスリンシグナルとの融合タンパク質は、細胞外（培地等）に分泌されることから、細胞破砕等の抽出操作が不要となる。 For example, a vector in which a DNA in which “DNA of (A) or (B)” and “DNA encoding a marker peptide” are linked is also included in the virus of the present invention. Designing the retained DNA in this way has the advantage that it can be expressed as a fusion protein with a marker peptide or the like, and purification and analysis of the expressed protein can be facilitated. Examples of the marker peptide include protein A, insulin signal sequence, His, FLAG, CBP (calmodulin binding protein), GST (glutathione S-transferase) and the like. For example, a fusion protein with protein A can be easily purified by affinity chromatography using a solid phase to which IgG is bound. Similarly, a solid phase to which magnetic nickel is bound can be used for a fusion protein with a His tag, and a solid phase to which an anti-FLAG antibody is bound can be used for a fusion protein with FLAG. Further, since the fusion protein with the insulin signal is secreted to the outside of the cell (medium or the like), an extraction operation such as cell disruption is unnecessary.
本発明ウイルスの製造方法は特に限定されず、遺伝子工学的手法によって製造してもよく、化学合成法によって製造してもよい。 The production method of the virus of the present invention is not particularly limited, and may be produced by a genetic engineering technique or may be produced by a chemical synthesis method.
遺伝子工学的手法によって本発明ウイルスを製造する方法は、以下の通りである。より具体的な方法については、実施例を参照されたい。 A method for producing the virus of the present invention by genetic engineering techniques is as follows. See the Examples for more specific methods.
まず、ＨＡ合成活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを用意する。当該ＤＮＡとして、前記（Ａ）のＤＮＡを用いる場合には、まず「配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質」をコードするＤＮＡを用意する。また、前記（Ｂ）のＤＮＡを用いる場合には、まず「配列番号２に示されるアミノ酸配列における１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は転位したアミノ酸配列からなり、かつ、ＨＡを合成する活性を有するタンパク質」をコードするＤＮＡを用意する。これらのＤＮＡは、それぞれ所定のタンパク質をコードするものである限りにおいて特に限定されない。これらのＤＮＡとしては、遺伝暗号の縮重によって種々の異なった塩基配列を有するものが存在するが、いずれの塩基配列を有するＤＮＡをも用いることができる。 First, DNA encoding a protein having HA synthesis activity is prepared. When the DNA of (A) is used as the DNA, first, a DNA encoding “a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2” is prepared. When the DNA of (B) is used, first, “it consists of an amino acid sequence in which one or several amino acids in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 have been deleted, substituted, inserted, or rearranged; A DNA encoding a “protein having activity to synthesize” is prepared. These DNAs are not particularly limited as long as they each encode a predetermined protein. As these DNAs, there are DNAs having various different base sequences due to the degeneracy of the genetic code, but DNAs having any base sequence can be used.
前記（Ａ）の「配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質」をコードするＤＮＡとしては、なかでも、配列番号１における塩基番号７〜１６８９で示される塩基配列によって特定されるＤＮＡが好ましい。この塩基配列を含むＤＮＡは、GenBank accession No. Ｕ５４８０４として登録されている。 As the DNA encoding the “protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2” in (A) above, DNA specified by the base sequence shown by base numbers 7 to 1689 in SEQ ID NO: 1 is particularly preferable. DNA containing this base sequence is registered as GenBank accession No. U54804.
また、前記（Ｂ）の「配列番号２に示されるアミノ酸配列における１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は転位したアミノ酸配列からなり、かつ、ＨＡを合成する活性を有するタンパク質」をコードするＤＮＡとしては、例えば前記（Ａ）のＤＮＡ若しくは当該ＤＮＡに相補的なＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡが例示される。 In addition, “a protein having an amino acid sequence in which one or several amino acids in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 are deleted, substituted, inserted, or rearranged and having an activity of synthesizing HA” in (B) above. Examples of the DNA to be encoded include DNA that hybridizes under stringent conditions with the DNA of (A) or a DNA complementary to the DNA.
ここで「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう（Sambrook, J. et al., Molecular Cloning A Laboratory Manual, second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)等参照）。「ストリンジェントな条件」として具体的には、50％ホルムアミド、４×ＳＳＣ、50mMＨＥＰＥＳ（pH7.0）、10×Denhardt's solution、100μg/mlサケ精子DNAを含む溶液中、42℃でハイブリダイズさせ、次いで室温で２×ＳＳＣ、0.1％ＳＤＳ溶液、50℃下で0.1×ＳＳＣ、0.1％ＳＤＳ溶液で洗浄する条件が挙げられる。 Here, “stringent conditions” refers to conditions under which so-called specific hybrids are formed and non-specific hybrids are not formed (Sambrook, J. et al., Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) etc.). Specifically, the “stringent conditions” are hybridized at 42 ° C. in a solution containing 50% formamide, 4 × SSC, 50 mM HEPES (pH 7.0), 10 × Denhardt's solution, 100 μg / ml salmon sperm DNA, Next, the conditions include washing with 2 × SSC, 0.1% SDS solution at room temperature, and 0.1 × SSC, 0.1% SDS solution at 50 ° C.
このようなＤＮＡをＮＰＶに導入することにより、本発明ウイルスを製造することができる。 The virus of the present invention can be produced by introducing such DNA into NPV.
このようなＤＮＡが導入されるＮＰＶは、ＮＰＶとして分類されるウイルスである限りにおいて特に限定されず、例えばＡｃＮＰＶや、カイコガＮＰＶ（Bombyx mori NPV、BmNPV）等を用いることができる。なかでも、ＡｃＮＰＶであることが好ましい。 NPV into which such DNA is introduced is not particularly limited as long as it is a virus classified as NPV, and for example, AcNPV, Bombyx mori NPV (BmNPV), etc. can be used. Of these, AcNPV is preferable.
ＮＰＶへのＤＮＡの導入は、トランスファーベクターを用いた相同的組換えにより行うことができる。トランスファーベクターの種類も特に限定されず、例えばpPSC8（プロテインサイエンス社）、pFastBac（インビトロジェン社）、pVL1393（ファーミンジェン社）等が例示されるが、なかでもpPSC8が好ましい。これらのトランスファーベクターは、市販のものを用いることもできる。 DNA can be introduced into NPV by homologous recombination using a transfer vector. The type of transfer vector is not particularly limited, and examples thereof include pPSC8 (Protein Science), pFastBac (Invitrogen), pVL1393 (Pharmingen), and among them, pPSC8 is preferable. As these transfer vectors, commercially available ones can also be used.
トランスファーベクターを用いた相同的組換えの方法も特に限定されない。その具体的な一例は、実施例を参照されたい。 A method for homologous recombination using a transfer vector is not particularly limited. For a specific example, see the Examples.
前記（Ａ）又は（Ｂ）のＤＮＡが保持されたＮＰＶが製造されたか否かは、例えば、製造されたＮＰＶの塩基配列を解析して、ＨＡ合成活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡが保持されているか否か、製造されたＮＰＶから発現されたタンパク質が、ＨＡ合成活性を有するタンパク質のアミノ酸配列を有しているか否か、製造されたＮＰＶから発現されたタンパク質がＨＡを合成する活性を有しているか否か、等を調べることによって確認することができる。 Whether or not an NPV retaining the DNA of (A) or (B) has been produced is determined, for example, by analyzing the base sequence of the produced NPV and retaining the DNA encoding a protein having HA synthesis activity. Whether the protein expressed from the produced NPV has the amino acid sequence of a protein having HA synthesis activity, or the protein expressed from the produced NPV has an activity to synthesize HA. It can be confirmed by checking whether or not it is.
本発明ウイルスは、例えば後述する「本発明細胞」の製造に使用することができ、ひいては本発明タンパク質生産方法や本発明ＨＡ生産方法等に利用することができる。
＜２＞本発明細胞
本発明細胞は、本発明ウイルスを保持する昆虫由来の細胞である。
The virus of the present invention can be used, for example, for the production of the “cell of the present invention” described later, and can be used for the protein production method of the present invention, the HA production method of the present invention, and the like.
<2> Present Invention Cell The present invention cell is an insect-derived cell that retains the present virus.
本発明ウイルスについての説明は、前記の通りである。 The description of the virus of the present invention is as described above.
ここで用いる昆虫由来の細胞は、昆虫に由来する細胞であり、ＮＰＶが感染しうる細胞である限りにおいて特に限定されないが、Ｓｆ９細胞であることが好ましい。 The insect-derived cells used here are cells derived from insects and are not particularly limited as long as they are cells that can be infected by NPV, but are preferably Sf9 cells.
本発明ウイルスを昆虫由来の細胞に保持させる方法も特に限定されないが、本発明ウイルスはＮＰＶとしての性質を有しているため、単に本発明ウイルスと昆虫由来の細胞とを接触させるだけで、本発明ウイルスを当該細胞に感染させることができ、本発明ウイルスを当該細胞に保持させることができる。本発明ウイルスと昆虫由来の細胞とを接触させ、当該ウイルスを当該細胞に感染させることによって当該ウイルスを当該細胞に保持させる具体的な方法の一例は、後述の実施例を参照されたい。 The method for retaining the virus of the present invention in insect-derived cells is not particularly limited. However, since the virus of the present invention has properties as an NPV, the present virus is simply contacted with insect-derived cells. The cell can be infected with the inventive virus, and the virus of the present invention can be retained in the cell. For an example of a specific method for retaining the virus by bringing the virus of the present invention into contact with an insect-derived cell and infecting the cell with the virus, refer to the Examples described later.
本発明細胞は、ＨＡ合成活性を有するタンパク質を生産する能力とＨＡを生産する能力を有することから、これらの性質を指標にして、本発明細胞を選択することができる。 Since the cell of the present invention has an ability to produce a protein having HA synthesis activity and an ability to produce HA, the cell of the present invention can be selected using these properties as an index.
本発明細胞は、例えば後述する本発明タンパク質生産方法や本発明ＨＡ生産方法等に利用することができる。
＜３＞本発明タンパク質生産方法
本発明タンパク質生産方法は、本発明細胞を生育させ、その生育物からＨＡ合成活性を有するタンパク質を採取する工程を少なくとも含む、ＨＡ合成活性を有するタンパク質の生産方法である。
The cells of the present invention can be used for, for example, the protein production method of the present invention and the HA production method of the present invention described later.
<3> Protein Production Method of the Present Invention The protein production method of the present invention is a method for producing a protein having HA synthesis activity, comprising at least a step of growing the cell of the present invention and collecting a protein having HA synthesis activity from the grown product. is there.
「本発明細胞」については、前記で説明した通りである。 The “invention cell” is as described above.
本出願書類において「生育」とは、形質転換体である細胞の増殖や、形質転換体である細胞を組み込んだ生物（例えば昆虫等）の生育を含む概念である。また、本出願書類における「生育物」とは、形質転換体を生育させた後の培地（培養液の上清）、培養された細胞自体、細胞を組み込んだ生物（例えば昆虫等）からの分泌物・排出物や、これらの培地、細胞、生物、分泌物・排出物等の抽出物等を包含する概念である。なお、ここでいう抽出物は、上記の培地、細胞、生物、分泌物・排出物等から得られ、かつＨＡ合成活性を有するタンパク質を含有する限りにおいて、特に限定されない。例えば、このような抽出物の一例として、後述する実施例４に示した細胞膜画分等が例示される。 In the present application document, “growth” is a concept including the growth of cells that are transformants and the growth of organisms that incorporate the cells that are transformants (such as insects). In addition, the term “growth” in the present application document refers to secretion from the medium after growing the transformant (the supernatant of the culture solution), the cultured cells themselves, and the organism in which the cells are incorporated (for example, insects). It is a concept that includes substances and effluents, extracts of these media, cells, organisms, secretions and effluents, and the like. The extract herein is not particularly limited as long as it contains a protein obtained from the above-mentioned medium, cells, organisms, secretions / excretions, etc. and having HA synthesis activity. For example, as an example of such an extract, the cell membrane fraction shown in Example 4 described later is exemplified.
生育の条件（培地や培養条件等）は、本発明細胞が生育し、ＨＡＳが生産される限りにおいて特に限定されず、用いるベクターや細胞等に応じて適宜選択することができる。例えば、培養の温度としては２０〜４０℃程度を例示することができる。 The growth conditions (medium, culture conditions, etc.) are not particularly limited as long as the cell of the present invention grows and HAS is produced, and can be appropriately selected according to the vector, cell, etc. used. For example, about 20-40 degreeC can be illustrated as a temperature of culture | cultivation.
本発明細胞の生育時間も、用いる本発明細胞の量、所望するＨＡＳの生産量、その他の生育条件等に応じて適宜調節することができる。 The growth time of the cells of the present invention can also be appropriately adjusted according to the amount of the cells of the present invention used, the desired HAS production amount, other growth conditions, and the like.
生育物からＨＡＳを採取する方法は、生育物の種類に応じて、一般的な方法のなかから当業者が適宜選択し採用することができる。 The method for collecting HAS from the growth can be appropriately selected and employed by those skilled in the art from general methods according to the type of the growth.
例えば、ＨＡＳが、培地（培養液の上清）中に分泌される可溶性の形態で産生される場合には、培地を採取し、これをそのまま用いてもよい。またＨＡＳが細胞質中に分泌される可溶性の形態、又は不溶性（膜結合性）の形態で産生される場合には、窒素キャビテーション装置を用いる方法、ホモジナイズ、ガラスビーズミル法、音波処理、浸透ショック法、凍結融解法等の細胞破砕による抽出、界面活性剤抽出、又はこれらの組み合わせ等の処理操作によってＨＡ合成活性を有するタンパク質を抽出することができ、その抽出物をそのまま用いてもよい。 For example, when HAS is produced in a soluble form secreted into the culture medium (culture supernatant), the culture medium may be collected and used as it is. When HAS is produced in a soluble form secreted into the cytoplasm or in an insoluble (membrane-bound) form, a method using a nitrogen cavitation apparatus, a homogenization, a glass bead mill method, a sonication method, an osmotic shock method, A protein having HA synthesis activity can be extracted by a processing operation such as extraction by cell disruption such as freeze-thaw method, surfactant extraction, or a combination thereof, and the extract may be used as it is.
本発明タンパク質生産方法は、「本発明細胞を生育させ、その生育物からＨＡ合成活性を有するタンパク質を採取する工程」を少なくとも含む限りにおいて、他の工程をさらに含んでいてもよい。例えば、採取されたＨＡ合成活性を有するタンパク質をさらに精製する工程を含んでいてもよい。精製は、不完全な精製（部分精製）であっても、完全な精製であってもよく、ＨＡ合成活性を有するタンパク質の使用目的等に応じて適宜選択することができる。 The protein production method of the present invention may further include other steps as long as it includes at least the step of growing the cells of the present invention and collecting a protein having HA synthesis activity from the growth product. For example, a step of further purifying the collected protein having HA synthesis activity may be included. The purification may be incomplete purification (partial purification) or complete purification, and can be appropriately selected depending on the purpose of use of the protein having HA synthesis activity.
精製方法として具体的には、例えば硫酸アンモニウム（硫安）や硫酸ナトリウム等による塩析、遠心分離、透析、限外濾過法、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、ゲルろ過法、ゲル浸透クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、電気泳動法等や、これらの組み合わせ等の処理操作が挙げられる。 Specific examples of purification methods include salting out with ammonium sulfate (ammonium sulfate) or sodium sulfate, centrifugation, dialysis, ultrafiltration, adsorption chromatography, ion exchange chromatography, hydrophobic chromatography, reverse phase chromatography, Examples thereof include gel filtration, gel permeation chromatography, affinity chromatography, electrophoresis, and combinations thereof.
ＨＡ合成活性を有するタンパク質が製造されたか否かは、採取されたタンパク質のアミノ酸配列、ＨＡの生産能力の有無等を分析することによって確認することができる。 Whether or not a protein having HA synthesis activity has been produced can be confirmed by analyzing the amino acid sequence of the collected protein, the presence or absence of HA production ability, and the like.
本発明タンパク質生産方法によれば、後述の実施例にも示す通り、ＨＡ合成活性を有するタンパク質を極めて効率的に生産することができる。
＜４＞本発明ＨＡ生産方法
本発明ＨＡ生産方法は、本発明細胞を生育させ、その生育物からＨＡを採取する工程を少なくとも含む、ＨＡの生産方法である。
According to the protein production method of the present invention, a protein having HA synthesis activity can be produced very efficiently, as shown in the examples described later.
<4> HA Production Method of the Present Invention The HA production method of the present invention is an HA production method comprising at least a step of growing the cells of the present invention and collecting HA from the growth.
「本発明細胞」については、前記＜２＞で説明した通りである。 The “invention cell” is as described in <2> above.
生育の条件（培地や培養条件等）は、本発明細胞が生育し、ＨＡが生産される限りにおいて特に限定されず、用いるベクターや細胞等に応じて適宜選択することができる。例えば、培養の温度としては２０〜４０℃程度を例示することができる。 The growth conditions (medium, culture conditions, etc.) are not particularly limited as long as the cell of the present invention grows and HA is produced, and can be appropriately selected according to the vector, cell, etc. used. For example, about 20-40 degreeC can be illustrated as a temperature of culture | cultivation.
本発明細胞の生育時間も、用いる本発明細胞の量、所望するＨＡの生産量、その他の生育条件等に応じて適宜調節することができる。 The growth time of the cells of the present invention can also be appropriately adjusted according to the amount of the cells of the present invention used, the desired amount of HA production, other growth conditions, and the like.
本発明細胞の生育の際に、ＨＡの合成の基質となるUDP-GlcNAc及びUDP-GlcUA等の糖ヌクレオチドを存在させておくことが好ましい。特に、「生育物」が、前記＜３＞に示すような培地、細胞、生物、分泌物・排出物等の抽出物である場合には、その生育物中にUDP-GlcNAc及びUDP-GlcUA等の糖ヌクレオチドを存在させておくことが好ましい。 During the growth of the cells of the present invention, it is preferable that sugar nucleotides such as UDP-GlcNAc and UDP-GlcUA that are substrates for HA synthesis are present. In particular, when the “growth” is an extract of medium, cells, organisms, secretions / excretions, etc. as shown in <3> above, UDP-GlcNAc, UDP-GlcUA, etc. are contained in the growth. It is preferable that the sugar nucleotide is present.
したがって、本発明ＨＡ生産方法には、例えば、本発明細胞を生育させて得られ、ＨＡ合成活性を有する生育物又はそのＨＡ合成活性画分と、UDP等のヌクレオチドが結合したGlcNAc及びGlcUAとを接触させる工程を含む、ＨＡの生産方法が包含される。 Therefore, in the HA production method of the present invention, for example, a growth product obtained by growing the cells of the present invention and having HA synthesis activity or an HA synthesis activity fraction thereof, and GlcNAc and GlcUA to which nucleotides such as UDP are bound are combined. A method for producing HA comprising the step of contacting is included.
またＨＡＳの活性を増加させる物質がある場合には、その物質を添加してもよい。 Moreover, when there exists a substance which increases the activity of HAS, you may add the substance.
また、例えば、本発明細胞を担体（例えば、ゲル、ビーズ、膜、プレート、ファイバー等）に固定させ、これに培養液を接触させ反応させてもよい。 In addition, for example, the cells of the present invention may be immobilized on a carrier (eg, gel, bead, membrane, plate, fiber, etc.) and reacted with a culture solution in contact therewith.
生育物からＨＡを採取する方法は、一般的な方法のなかから当業者が適宜選択し採用することができる。例えば、ＨＡが、培地（培養液の上清）中に分泌されてくる場合には、培地を採取し、これをそのまま用いてもよい。 A method for collecting HA from the grown product can be selected and adopted by those skilled in the art from common methods. For example, when HA is secreted into the medium (the culture supernatant), the medium may be collected and used as it is.
本発明ＨＡ生産方法は、「本発明細胞を生育させ、その生育物からＨＡを採取する工程」を少なくとも含む限りにおいて、他の工程をさらに含んでいてもよい。例えば、採取されたＨＡをさらに精製する工程を含んでいてもよい。精製は、不完全な精製（部分精製）であっても、完全な精製であってもよく、ＨＡの使用目的等に応じて適宜選択することができる。 The HA production method of the present invention may further include other steps as long as it includes at least the “step of growing the cells of the present invention and collecting HA from the growth product”. For example, a step of further purifying the collected HA may be included. The purification may be incomplete purification (partial purification) or complete purification, and can be appropriately selected according to the purpose of use of HA and the like.
精製方法としては、ＨＡの精製方法として一般的な方法等を採用することができる。 As a purification method, a general method or the like can be adopted as a purification method of HA.
ＨＡが製造されたか否かは、例えば後述のＨＡ-ＩＢＡ法により確認することができる。詳しくは実施例を参照されたい。 Whether or not HA has been produced can be confirmed, for example, by the HA-IBA method described later. See the Examples for details.
本発明ＨＡ生産方法によれば、後述の実施例にも示す通り、ＨＡを極めて効率的に生産することができる。 According to the HA production method of the present invention, HA can be produced very efficiently as shown in the examples described later.
以下、本発明を実施例により具体的に詳説する。ここでは、ＨＡ合成活性を有するタンパク質の一例としてｈＨＡＳ２を用いた実施例を示す。
＜１＞材料
以下に、本実施例で用いた材料を説明する。
ＤＴＴ、ＨＥＰＥＳ、UDP-GlcNAc、及びUDP-GlcUAはシグマ社から購入した。UDP-[14C]GlcUAはパーキンエルマー社から購入した。
＜２＞方法
１．ｈＨＡＳ２をコードするcDNAのクローニング
ｈＨＡＳ２をコードするcDNAのクローニングは、J. Biol. Chem. 271, 22945-22948 (1996)に記載された方法に従って、ヒト胎児脳cDNAライブラリー（クローンテック(Clontech)社製）を用いたPCRスクリーニングによって行った。
２．ｈＨＡＳ２をコードするcDNAを導入したバキュロウイルスの調製
上記１．で得られたhHAS2をコードするcDNAに、ｈＨＡＳ２のＮ末端にFLAGが連結された融合ポリペプチドが発現されるようFLAG-tagオリゴヌクレオチドを付加した。これを発現させることにより、ｈＨＡＳ２のＮ末端にFLAGが連結された融合ポリペプチドが得られることになる。
Hereinafter, the present invention will be described in detail by way of examples. Here, an example using hHAS2 as an example of a protein having HA synthesis activity is shown.
<1> Materials The materials used in this example are described below.
DTT, HEPES, UDP-GlcNAc, and UDP-GlcUA were purchased from Sigma. UDP- [ 14 C] GlcUA was purchased from PerkinElmer.
<2> Method 1. Cloning of cDNA encoding hHAS2 Cloning of cDNA encoding hHAS2 was carried out according to the method described in J. Biol. Chem. 271, 22945-22948 (1996) (human clone brain cDNA library (Clontech)). By PCR screening using
2. Preparation of baculovirus introduced with cDNA encoding hHAS2 The FLAG-tag oligonucleotide was added to the cDNA encoding hHAS2 obtained in step 1 so that a fusion polypeptide in which FLAG was linked to the N-terminus of hHAS2 was expressed. By expressing this, a fusion polypeptide in which FLAG is linked to the N-terminus of hHAS2 can be obtained.
FLAG-tagが付加されたcDNAをＰＣＲに付し、増幅されたことを確認した後、TAクローニングキット（インビトロジェン（Invitrogen）社製）を用いて当該cDNAが挿入されたプラスミド（pTA-FLAG-hHAS2）をサブクローニングした。 After adding the FLAG-tag-added cDNA to PCR and confirming that it was amplified, a plasmid (pTA-FLAG-hHAS2) into which the cDNA was inserted using a TA cloning kit (Invitrogen). ) Was subcloned.
サブクローニングの後、作製したプラスミドから目的のcDNAを含むフラグメントを切り出し、これをトランスファーベクター（pPSC8）（プロテイン・サイエンス（Protein Science）社製）に導入して、所定の塩基配列を有するクローンを選択した。 After subcloning, a fragment containing the desired cDNA was cut out from the prepared plasmid, and this was introduced into a transfer vector (pPSC8) (Protein Science) to select a clone having a predetermined base sequence. .
選択した発現ベクター（pPSC8-FLAG-hHAS2）とバキュロウイルス（AcNPV）DNA（プロテインサイエンス社）とを昆虫細胞Sf9（インビトロジェン（Invitrogen）社製）にコトランスフェクトした。コトランスフェクトの具体的な方法は以下の通りである。 The selected expression vector (pPSC8-FLAG-hHAS2) and baculovirus (AcNPV) DNA (Protein Science) were co-transfected into insect cells Sf9 (Invitrogen). The specific method of cotransfection is as follows.
1.0 x 106 個のSf9細胞を、底面積25 cm2の細胞培養用フラスコに播き、28℃で１時間静置した。静置後、培養液の上清を取り除き、10 mlのSF-900 II培地（インビトロジェン（Invitrogen）社製）で細胞を２回洗浄した。 1.0 × 10 6 Sf9 cells were seeded in a cell culture flask having a bottom area of 25 cm 2 and allowed to stand at 28 ° C. for 1 hour. After standing, the culture supernatant was removed, and the cells were washed twice with 10 ml of SF-900 II medium (Invitrogen).
この細胞が入ったフラスコに、hHAS2をコードするcDNAを保持する発現ベクター pPSC8-FLAG-hHAS2 2μl（3.4μg/μl）、Linear AcNPV DNA 5μl（17 μg/μl）及びLIPOFECTIN Reagent（（インビトロジェン）Invitrogen社製）5 μlを含有するSF-900II培地 200μlを添加し、静かに揺らした後、28℃で６時間静置培養した。次いで、培養液量が5 mlとなるようにSf900II培地を加え、さらに28℃で5日間、静置培養した。培養後に培養上清を回収し、コトランスフェクション溶液とした。 In the flask containing these cells, expression vector pPSC8-FLAG-hHAS2 holding 2 μl (3.4 μg / μl), cDNA of hHAS2, Linear AcNPV DNA 5 μl (17 μg / μl) and LIPOFECTIN Reagent (Invitrogen) Invitrogen (Manufactured) 200 μl of SF-900II medium containing 5 μl was added, shaken gently, and then statically cultured at 28 ° C. for 6 hours. Subsequently, Sf900II medium was added so that the culture solution volume might be 5 ml, and static culture was further performed at 28 ° C. for 5 days. After culture, the culture supernatant was collected and used as a cotransfection solution.
次いで、組換えウイルスの純化を行った。組換えウイルスの純化は、プラークアッセイ法で行った。具体的な方法は以下の通りである。 Subsequently, the recombinant virus was purified. Recombinant virus was purified by plaque assay. A specific method is as follows.
2.0 x 106 個のSf9細胞を直径60 mmのシャーレに播き、28℃で１時間静置して細胞を底面に接着させた。前記のコトランスフェクション溶液を無血清Sf-900II 培地で１０４、１０５、１０６及び１０７倍に希釈し、これらの溶液をそれぞれ１ mlずつ細胞に添加し、室温で１時間穏やかに振盪した。その後、シャーレ上清（ウイルス液）を取り除き、0.5% SeaKemGTG agarose（BMA社製）を含有するSf-900II 培地 4 ml を流し込んで、28℃で９日間静置培養した。培地ごとに、シャーレにできた組換え体のウイルス粒子を含む多角体(polyhedra)が存在しない感染昆虫細胞のプラーク６個を採取して、各々を１ mlのSf-900 II培地に懸濁させ、ウイルス原液No.１〜６とした。 2.0 × 10 6 Sf9 cells were seeded in a petri dish having a diameter of 60 mm, and left to stand at 28 ° C. for 1 hour to adhere the cells to the bottom surface. The co-transfection solution is diluted 10 4 , 10 5 , 10 6 and 10 7 times with serum-free Sf-900II medium, 1 ml each of these solutions is added to the cells, and gently shaken at room temperature for 1 hour. did. Thereafter, the petri dish supernatant (virus solution) was removed, 4 ml of Sf-900II medium containing 0.5% SeaKemGTG agarose (manufactured by BMA) was poured, and static culture was performed at 28 ° C. for 9 days. For each medium, collect 6 plaques of infected insect cells without polyhedra containing recombinant virus particles in a petri dish and suspend each in 1 ml of Sf-900 II medium. Virus stock solutions Nos. 1-6 were used.
次いで、組換えウイルスの増幅（組換えウイルス液の作製）を行った。具体的な方法は以下の通りである。 Subsequently, amplification of the recombinant virus (production of a recombinant virus solution) was performed. A specific method is as follows.
25 cm2 フラスコに播いた 2.0 x 106 個のSf9細胞に、上記ウイルス原液を0.5 ml ずつ添加して、28℃で１時間静置培養した。培養液量が5 ml となるように 無血清Sf-900 II培地を加え、４日間静置培養し、第１代ウイルス液No.１〜６とした。 0.5 ml of the virus stock solution was added to 2.0 × 10 6 Sf9 cells seeded in a 25 cm 2 flask, and the mixture was statically cultured at 28 ° C. for 1 hour. Serum-free Sf-900 II medium was added so that the culture volume became 5 ml, and static culture was performed for 4 days to obtain first virus solutions No. 1-6.
75cm2フラスコに播いた 6.0 x 106 個のSf9 細胞に、第１代ウイルス液を各々全量加え、28℃で１時間静置培養した。その後、さらに無血清Sf-900 II培地を10 ml加えてさらに４日間静置培養した。培養後、セルスクレイパーを用いて細胞をフラスコ底面から剥がし、3.000 x ｇ、４℃で15分間遠心し、上清と沈殿に分画した。この培養上清を回収し、第２代ウイルス液No.１〜６とした。 The whole amount of the first virus solution was added to 6.0 × 10 6 Sf9 cells seeded in a 75 cm 2 flask, followed by static culture at 28 ° C. for 1 hour. Thereafter, 10 ml of serum-free Sf-900 II medium was further added, followed by further stationary culture for 4 days. After culturing, the cells were detached from the bottom of the flask using a cell scraper, centrifuged at 3.000 × g, 4 ° C. for 15 minutes, and fractionated into a supernatant and a precipitate. This culture supernatant was recovered and designated as second virus solutions No. 1-6.
その後、細胞へのDNAの挿入を確認した。具体的な方法は以下の通りである。 Thereafter, insertion of DNA into the cells was confirmed. A specific method is as follows.
第２代ウイルス液を回収した際に得られた各沈殿を200μlのＴＥ緩衝液（10 mM Tris-HCl, pH 7.5/ 1 mM EDTA）に懸濁させ、QIAamp DNA Mini Kit (QIAGEN社製)のマニュアルに従ってウイルスＤＮＡを抽出した。抽出されたウイルスＤＮＡを鋳型として、以下のプライマー「PSC F2」及び「PSC R2」を用いて、以下の条件でＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）を行った。増幅酵素にはKOD DNA ポリメラーゼ（TOYOBO社）を用いた。 Each precipitate obtained when the second virus solution was collected was suspended in 200 μl of TE buffer (10 mM Tris-HCl, pH 7.5 / 1 mM EDTA), and the QIAamp DNA Mini Kit (QIAGEN) was used. Viral DNA was extracted according to the manual. Using the extracted viral DNA as a template, PCR (polymerase chain reaction) was performed under the following conditions using the following primers “PSC F2” and “PSC R2”. KOD DNA polymerase (TOYOBO) was used as the amplification enzyme.
ＰＣＲは、「94℃で30秒間、50℃で30秒間、74℃で60秒間」のサイクルを３０サイクル繰り返した。 In PCR, a cycle of “94 ° C. for 30 seconds, 50 ° C. for 30 seconds, 74 ° C. for 60 seconds” was repeated 30 cycles.
5μlのＰＣＲ産物をアガロースゲルで電気泳動し、増幅断片の長さを確認した。目的の長さの断片が得られたＰＣＲ産物を精製し、Ｎ末端側とＣ末端側のシークエンスを確認した。シークエンス反応においては、以下のプライマー「PSC F」及び「PSC R」並びにABI Prism Big Dye Terminator Cycle Sequencing Kit Ver.3（Applied Biosystems社製）を用いた。またシークエンスの電気泳動の際にはABI Prism 310 Genetic Analyzer（Applied Biosystems社製）を、シークエンス解析の際にはGenetyx（ゼネティックス社）をそれぞれ用いた。
３．発現物の生産
対数増殖期にある培養昆虫細胞 expresSF+（登録商標；プロテイン・サイエンス（Protein Science）社製）を、1.5 x 106 個/mlとなるように無血清 Sf-900 II培地で希釈し、250 ml 三角フラスコ３本に100 mlずつ用意した。これらに上記第２代ウイルス液（No.２、３、５）を1 mlずつ加え、130 rpm、28℃で72時間振盪培養した。
４．細胞の回収と、細胞膜画分の調製
上記３クローン（No.２、３、５）の感染細胞の培養液（各100ml）を、1300 rpm、４℃で５分間遠心し、沈殿（細胞画分）と培養上清に分離した。培養上清は−80℃で保存した。沈殿（細胞画分）に氷冷したＰＢＳ ３０ mlを加えて再懸濁し、上記と同様に遠心して細胞を集めた。この細胞洗浄操作を２回行い、その細胞残渣に、0.25 M ショ糖、0.5 mM ＤＴＴを含有する氷冷した10 mM HEPES-NaOH緩衝液（pH 7.1）（以下、氷冷ショ糖溶液という。）16mlを加えた。細胞を懸濁させ、 氷冷下で超音波処理装置（IKASONIC U50 control（IKA JAPAN））を用いて80% amp、0.5秒、5分間の条件で超音波処理し、細胞を破砕した。
5 μl of the PCR product was electrophoresed on an agarose gel, and the length of the amplified fragment was confirmed. The PCR product from which a fragment of the desired length was obtained was purified, and the sequences on the N-terminal side and C-terminal side were confirmed. In the sequencing reaction, the following primers “PSC F” and “PSC R” and ABI Prism Big Dye Terminator Cycle Sequencing Kit Ver. 3 (Applied Biosystems) were used. ABI Prism 310 Genetic Analyzer (Applied Biosystems) was used for sequence electrophoresis, and Genetyx (Genetics) was used for sequence analysis.
3. Production of expression product Insect cell culture in the logarithmic growth phase expresSF + (registered trademark; manufactured by Protein Science) is diluted with serum-free Sf-900 II medium to 1.5 x 10 6 cells / ml. 100 ml was prepared for three 250 ml Erlenmeyer flasks. 1 ml of the second virus solution (No. 2, 3, 5) was added to each of these, and cultured with shaking at 130 rpm and 28 ° C. for 72 hours.
4). Cell collection and cell membrane fraction preparation The above 3 clone (No. 2, 3, 5) infected cell culture (100 ml each) was centrifuged at 1300 rpm at 4 ° C for 5 minutes to precipitate (cell fraction). ) And the culture supernatant. The culture supernatant was stored at -80 ° C. 30 ml of ice-cooled PBS was added to the precipitate (cell fraction) and resuspended, and the cells were collected by centrifugation as described above. This cell washing operation was performed twice, and ice-cooled 10 mM HEPES-NaOH buffer (pH 7.1) containing 0.25 M sucrose and 0.5 mM DTT was added to the cell residue (hereinafter referred to as ice-cold sucrose solution). 16ml was added. The cells were suspended, and sonicated using an sonicator (IKASONIC U50 control (IKA JAPAN)) under ice cooling under conditions of 80% amp, 0.5 seconds, and 5 minutes to disrupt the cells.
その細胞破砕懸濁液を超遠心チューブに移し、34,700 rpm（105,000 x ｇ）、４℃で１時間超遠心を行った。得られた沈殿を600μlの氷冷ショ糖溶液に懸濁させて、３クローン（No.２、３、５）の細胞膜画分とした。
５．発現されたタンパク質量の測定
クローンNo.２、３、５の細胞膜画分の全タンパク質量を、ＢＣＡプロテインアッセイキット（PIERCE社製）で測定した結果を表１に示す。
The cell disruption suspension was transferred to an ultracentrifuge tube and ultracentrifuged at 34,700 rpm (105,000 × g) at 4 ° C. for 1 hour. The obtained precipitate was suspended in 600 μl of ice-cold sucrose solution to obtain cell membrane fractions of 3 clones (No. 2, 3, 5).
5). Measurement of the amount of expressed protein Table 1 shows the results of measuring the total protein amount of the cell membrane fractions of clones Nos. 2, 3, and 5 using the BCA protein assay kit (PIERCE).
６．発現されたタンパク質のＨＡＳ活性の測定
１クローンにつき細胞膜画分 30 μl と、反応溶液（5 mM ＤＴＴ、15 mM MgCl2、2 mM UDP-GlcNAc、0.1 mM UDP-GlcUA、25 mM HEPES-NaOH(pH 7.1)）240μlとを混合し、その混液を 90μlずつ３本の反応チューブに分注し、それぞれに0.2μCiのUDP-[14C]GlcUA（10 μl）を添加した。HAase添加群には、同時に各クローンについて１本の反応チューブに１ＴＲＵ（１ＴＲＵ(Turbidity Reducing Unit)は、pH6.0、60℃、30分間に、660nmにおける吸光度を５０％減少させる酵素量を意味する。）の放線菌由来ＨＡａｓｅ（生化学工業株式会社製）を添加した。反応液に20% ＳＤＳを添加し、熱湯水中で５分間加熱処理をして酵素を失活させた。反応液を 50μlずつ 3MM濾紙（ワットマン社製）にスポットし、乾燥させた後、1 M 酢酸アンモニウム(pH 5.5)とエタノールとの混合液（35:65 v/v）を用いて室温で３日間展開した。濾紙を乾燥させた後、スポットした原点を切り抜き、原点の14C放射活性を シンチレーションカウンターLSC-5100（Aloka社製）により測定した。タンパク質量で補正したＨＡＳ活性の測定結果を図１に示す。縦軸は14Cのカウント(cpm)を示し、横軸はＨＡａｓｅの有無（「＋」はＨＡａｓｅ有り、「−」はＨＡａｓｅ無し。）を示す。ＨＡａｓｅ「−」と「＋」における14Cのカウントの差が、ＨＡＳ活性を示すこととなる。
6). Measurement of HAS activity of expressed protein 30 μl of cell membrane fraction per clone and reaction solution (5 mM DTT, 15 mM MgCl 2 , 2 mM UDP-GlcNAc, 0.1 mM UDP-GlcUA, 25 mM HEPES-NaOH (pH 7.1)) 240 μl was mixed, 90 μl of the mixture was dispensed into three reaction tubes, and 0.2 μCi of UDP- [ 14 C] GlcUA (10 μl) was added to each. In the HAase addition group, 1 TRU (1 TRU (Turbidity Reducing Unit) in one reaction tube at the same time for each clone means the amount of enzyme that reduces the absorbance at 660 nm by 50% at pH 6.0, 60 ° C. for 30 minutes. HA) (manufactured by Seikagaku Corporation) was added. 20% SDS was added to the reaction solution, and the enzyme was inactivated by heat treatment in hot water for 5 minutes. 50 μl each of the reaction solution was spotted on 3MM filter paper (Whatman), dried, and then mixed with 1 M ammonium acetate (pH 5.5) and ethanol (35:65 v / v) for 3 days at room temperature. Expanded. After drying the filter paper, the spotted origin was cut out, and the 14 C radioactivity at the origin was measured with a scintillation counter LSC-5100 (Aloka). The measurement result of the HAS activity corrected by the amount of protein is shown in FIG. The vertical axis indicates the count (cpm) of 14 C, and the horizontal axis indicates the presence or absence of HAase (“+” indicates HAase, “−” indicates no HAase). The difference in 14 C count between HAase “−” and “+” indicates HAS activity.
図１に示す通り、いずれのクローンの細胞膜画分においても高いＨＡＳ活性が検知されたことから、hHAS2をコードするcDNAを保持するベクターとバキュロウイルスＡｃＮＰＶとがコトランスフェクトされた細胞によって、高い活性を有するhHASを製造できることが示された。
７．細胞によって生産されたＨＡ量の測定
前記３．で得られたウイルス感染細胞expresSF+の培養液上清（各 100 ml）中におけるＨＡ量を、以下に示すＨＡ−ＩＢＡ法によって測定した。
As shown in FIG. 1, since high HAS activity was detected in the cell membrane fraction of any clone, high activity was obtained by cotransfecting the vector carrying the cDNA encoding hHAS2 and the baculovirus AcNPV. It has been shown that hHAS with can be produced.
7). 2. Measurement of the amount of HA produced by the cells The amount of HA in the culture supernatant (100 ml each) of the virus-infected cell expresSF + obtained in the above was measured by the HA-IBA method shown below.
96ウエルのイムノプレート（Nunc社製）に10 μg/mL ＨＡ−ＢＳＡ（生化学工業株式会社製）を100 μL添加して、４℃で一晩放置してコーティングした。このプレートのウエルをＰＢＳで３回洗浄した後、これに培養液上清（50 μl）及び200 ng/mlのビオチン化HABP（生化学工業株式会社製）（50 μl）を添加して、37℃で１時間インキュベートした。その後ウエルをTween 20を0.05%含有するPBS（Ｔ−ＰＢＳ）で３回洗浄し、0.25 ug/mL ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジン（フナコシ株式会社製）を100 ul添加して、37℃で１時間インキュベートした。その後ウエルをＴ−ＰＢＳで3回洗浄し、H2O2を含有するＯＰＤ（ｏ−フェニレンジアミン）発色液を100μl添加して、室温暗所で30分静置して発色させた。その後、１Ｍ 塩酸を100 μl添加して発色反応を停止させ、492 nm（対照波長 630 nm）の吸光度を測定した。サンプル中のＨＡ濃度は、ＨＡ標準液を用いて同様に測定した吸光度から得られた標準曲線をもとに算出した。 100 μL of 10 μg / mL HA-BSA (manufactured by Seikagaku Corporation) was added to a 96-well immunoplate (manufactured by Nunc), and the coating was allowed to stand overnight at 4 ° C. After the wells of this plate were washed 3 times with PBS, the culture supernatant (50 μl) and 200 ng / ml biotinylated HABP (Seikagaku Corporation) (50 μl) were added thereto. Incubated for 1 hour at ° C. The wells were then washed 3 times with PBS containing 0.05% Tween 20 (T-PBS), 100 ul of 0.25 ug / mL horseradish peroxidase-labeled streptavidin (Funakoshi Co., Ltd.) was added, Incubated for hours. Thereafter, the wells were washed three times with T-PBS, 100 μl of OPD (o-phenylenediamine) coloring solution containing H 2 O 2 was added, and the mixture was allowed to stand for 30 minutes in the dark at room temperature for color development. Thereafter, 100 μl of 1M hydrochloric acid was added to stop the color reaction, and the absorbance at 492 nm (control wavelength: 630 nm) was measured. The HA concentration in the sample was calculated based on a standard curve obtained from the absorbance measured in the same manner using the HA standard solution.
ＨＡ量の測定結果を、ウイルス非感染細胞と、バキュロウイルス（AcNPV）のみを感染させた細胞の培養液上清を用いて同様に測定した結果と併せて表２に示す。 The measurement results of the amount of HA are shown in Table 2 together with the results of measurement in the same manner using the culture supernatant of non-virus-infected cells and cells infected only with baculovirus (AcNPV).
表２に示すように、ウイルス非感染細胞や、バキュロウイルス（AcNPV）のみを感染させた細胞の培養液上清においては、ＨＡは検出されなかった。しかし、hHAS2をコードするcDNAを保持するベクターとバキュロウイルス（AcNPV）とをコトランスフェクトした感染細胞（クローン No.２、３、５）の培養上清では、いずれも高いレベルのＨＡの産生が確認された。
８．動物細胞を用いた場合の参考例
以下に、動物細胞を用いてＨＡＳ２を発現させた際の結果を示す。
As shown in Table 2, HA was not detected in the culture supernatant of non-virus-infected cells or cells infected only with baculovirus (AcNPV). However, the culture supernatant of infected cells (clone No. 2, 3, 5) co-transfected with a vector carrying the cDNA encoding hHAS2 and baculovirus (AcNPV) all produced high levels of HA. confirmed.
8). Reference example in the case of using animal cells The results when HAS2 is expressed using animal cells are shown below.
ｐＦＬＡＧ−ＣＭＶＰベクター（イーストマンコダック社製）に、ＨＡＳ２をコードするｃＤＮＡを挿入し、動物細胞用発現プラスミドｐＦＬＡＧ−ＨＡＳ２を作製した。これをサル腎臓由来のＣＯＳ−１細胞にエレクトロポレーション法によりトランスフェクトした。その細胞を採取し、細胞膜画分のタンパク質量及びＨＡＳ活性を、前記の実施例５．及び６と同様に測定した。 cDNA encoding HAS2 was inserted into a pFLAG-CMVP vector (Eastman Kodak) to prepare an animal cell expression plasmid pFLAG-HAS2. This was transfected into monkey kidney-derived COS-1 cells by electroporation. The cells were collected, and the amount of protein and HAS activity of the cell membrane fraction were measured according to Example 5 above. Measured in the same manner as in Nos.
その結果、動物細胞を用いてＨＡＳ−２を発現させた場合の細胞膜画分のタンパク質量は、培養液２００ ｍｌあたり約５ ｍｇであった。したがって、前記５．に示した結果から明らかな通り、少なくとも本実施例に記載された方法を用いると、従来の動物細胞を用いた方法に比して、培養液あたり約６０倍量のタンパク質が得られるといえる。 As a result, the amount of protein in the cell membrane fraction when HAS-2 was expressed using animal cells was about 5 mg per 200 ml of the culture solution. Therefore, said 5. As is clear from the results shown in the above, it can be said that when at least the method described in this example is used, about 60 times the amount of protein can be obtained per culture solution as compared with the conventional method using animal cells.
また、ＣＯＳ−１細胞で発現させたＨＡＳ−２の活性は、約５０００cpm/ｍｇタンパク質であった。実施例６．に示した通り、本実施例の方法によって発現されたＨＡＳ２の活性は約２０００〜５０００cpm/ｍｇタンパク質であったことから、本発明タンパク質生産方法を用いた場合、従来の方法である動物細胞を用いる場合に比べて、少なくとも約２４〜６０倍の活性に相当するＨＡＳ２が得られるといえる。 The activity of HAS-2 expressed in COS-1 cells was about 5000 cpm / mg protein. Example 6 Since the activity of HAS2 expressed by the method of this example was about 2000 to 5000 cpm / mg protein, when using the protein production method of the present invention, an animal cell which is a conventional method is used. It can be said that HAS2 corresponding to at least about 24 to 60 times the activity is obtained compared to the case.
本発明により、通常ＨＡを全く産生しない昆虫細胞を使って、高いＨＡ合成活性を有するタンパク質を大量に発現させるためのツールや方法が提供されることができる。ＨＡ合成活性を有するタンパク質は、ＨＡの製造、ＨＡ合成活性を有するタンパク質の阻害剤や促進剤のスクリーニング、立体構造解析、診断用キット開発及び酵素療法などに使用しうる。また、本発明によってＨＡを製造するツールや方法も提供される。ＨＡは、医薬品、化粧品、食品などの素材として利用することができる。 According to the present invention, a tool or method for expressing a large amount of a protein having high HA synthesis activity using insect cells that usually do not produce HA at all can be provided. A protein having HA synthesis activity can be used for production of HA, screening for inhibitors and promoters of proteins having HA synthesis activity, three-dimensional structure analysis, development of diagnostic kits, enzyme therapy, and the like. The present invention also provides tools and methods for manufacturing HA. HA can be used as a material for pharmaceuticals, cosmetics, foods and the like.
Claims (7)
（Ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ、
（Ｂ）「配列番号２に示されるアミノ酸配列における１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は転位したアミノ酸配列からなり、かつ、ヒアルロン酸を合成する活性を有するタンパク質」をコードするＤＮＡ。 The nuclear polyhedrosis virus according to claim 1, wherein the DNA encoding a protein having hyaluronic acid synthesis activity is the following DNA (A) or (B):
(A) DNA encoding a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2,
(B) DNA encoding “a protein consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 are deleted, substituted, inserted, or rearranged and having an activity of synthesizing hyaluronic acid” .
（ａ）配列番号１における塩基番号７〜１６８９で示される塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｂ）配列番号１における塩基番号７〜１６８９で示される塩基配列において、その塩基配列によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列における１若しくは数個のアミノ酸を欠失、置換、挿入または転位させる塩基の変異を有し、かつ、発現されるタンパク質がヒアルロン酸を合成する活性を有することを特徴とするＤＮＡ。 The nuclear polyhedrosis virus according to claim 2, wherein the DNA encoding a protein having hyaluronic acid synthesis activity is the following DNA (a) or (b):
(A) DNA comprising a base sequence represented by base numbers 7 to 1689 in SEQ ID NO: 1,
(B) In the base sequence represented by base numbers 7 to 1689 in SEQ ID NO: 1, a base mutation that deletes, substitutes, inserts or transposes one or several amino acids in the amino acid sequence of the protein encoded by the base sequence And a protein to be expressed has an activity of synthesizing hyaluronic acid.
A method for producing hyaluronic acid, comprising at least a step of growing the cell according to claim 5 and collecting hyaluronic acid from the grown product.
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