JP2005154282A - Method for producing gas-sealed liposome - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、超音波診断用剤並びに超音波治療薬として有用なガス封入リポソーム及びその製造法に関する。 The present invention relates to an ultrasonic diagnostic agent, a gas-encapsulated liposome useful as an ultrasonic therapeutic agent, and a method for producing the same.
超音波診断装置は、産婦人科、循環器科、泌尿器科などの広い範囲で使用されている。これに対し、超音波イメージング剤として、気体含有微小粒子（マイクロバブル）を投与した後に超音波照射により影像して診断する方法が開発されている（特許文献１〜５参照）。 Ultrasound diagnostic devices are used in a wide range of fields such as obstetrics and gynecology, cardiology, and urology. On the other hand, as an ultrasonic imaging agent, a method has been developed in which a gas-containing microparticle (microbubble) is administered and then imaged and diagnosed by ultrasonic irradiation (see Patent Documents 1 to 5).
しかしながら、従来のマイクロバブルは、アルブミンで形成された巨大粒子中に気体を含有させるものであることから、粒子径が２〜６μmと大きく、深部組織への移行性は低かった。
従って、本発明の目的は、粒子径が小さく、安定したマイクロバブルを簡便な操作で製造する方法、かくして得られたマイクロバブル及びその利用方法を提供することにある。 Accordingly, an object of the present invention is to provide a method for producing stable microbubbles having a small particle size by a simple operation, the microbubbles thus obtained, and a method for using the microbubbles.
そこで本発明者は、種々検討したところ、予め作成したリポソームを懸濁液とし、これを一定の空隙率を有する密封容器に添加し、この空隙部にフッ化物ガス又は窒素ガスを充填し、次いで超音波処理を行えば、粒子径の小さなガス封入リポソームが安定して調製できることを見出した。また、かくして得られたガス封入リポソームの粒子径は、予め作成したリポソームの粒子径に依存するので、粒子径が小さなガス封入リポソームが安定して得られるため、超音波診断剤として有用であることを見出した。またこのガス封入リポソームは、低周波超音波照射により容易に爆発するので、原料リポソームとして標的細胞等に対するリガンドを結合させたものを用いれば、当該細胞等に対するリガンドを有するガス封入リポソームが得られ、このリポソームは標的部位で選択的に爆発させることができ、超音波治療薬や遺伝子導入用組成物として有用であることも見出した。 Therefore, the present inventor made various studies, and prepared a liposome prepared in advance as a suspension, added it to a sealed container having a certain porosity, and filled this gap with fluoride gas or nitrogen gas, It has been found that gas-filled liposomes having a small particle diameter can be stably prepared by sonication. In addition, since the particle size of the gas-encapsulated liposome thus obtained depends on the particle size of the liposome prepared in advance, the gas-encapsulated liposome having a small particle size can be stably obtained, and therefore it is useful as an ultrasonic diagnostic agent. I found. In addition, since this gas-encapsulated liposome easily explodes by low-frequency ultrasonic irradiation, if a ligand bound to a target cell or the like is used as a raw material liposome, a gas-encapsulated liposome having a ligand for the cell or the like is obtained, It has also been found that the liposome can be selectively exploded at the target site and is useful as an ultrasonic therapeutic agent or a composition for gene introduction.
すなわち、本発明は、内容積の２０〜８０％リポソーム懸濁液を含有する密封容器の空隙部にフッ化物ガス又は窒素ガスを充填し、超音波処理することを特徴とするガス封入リポソームの製造法、及びかくして得られるガス封入リポソームを提供するものである。 That is, the present invention provides a gas-filled liposome characterized by filling a void portion of a sealed container containing an internal volume of 20 to 80% of a liposome suspension with a fluoride gas or a nitrogen gas and subjecting it to ultrasonic treatment. Method and the gas-encapsulated liposome thus obtained.
また本発明は、当該ガス封入リポソームを含有する超音波診断用剤を提供するものである。
また本発明は、当該ガス封入リポソームを含有することを特徴とする、投与後標的部位に低周波超音波照射することにより使用される超音波治療薬を提供するものである。
さらに本発明は、当該ガス封入リポソーム、及び遺伝子類を含有することを特徴とする、低周波超音波処理による細胞内遺伝子導入用組成物を提供するものである。
さらにまた、本発明は、当該ガス封入リポソーム、及び遺伝子類を培養細胞に添加し、次いで低周波超音波照射することを特徴とする培養細胞への遺伝子類の導入方法を提供するものである。
さらにまた、本発明は、当該ガス封入リポソーム、及び薬効成分を含有することを特徴とする、投与後標的部位に低周波超音波照射することにより使用される超音波治療薬を提供するものである。
The present invention also provides an ultrasonic diagnostic agent containing the gas-encapsulated liposome.
Moreover, this invention provides the ultrasonic therapeutic agent used by irradiating the target site | part after administration to the low frequency ultrasonic wave characterized by containing the said gas enclosure liposome.
Furthermore, the present invention provides a composition for introducing an intracellular gene by low-frequency sonication, comprising the gas-encapsulated liposome and genes.
Furthermore, the present invention provides a method for introducing genes into cultured cells, which comprises adding the gas-encapsulated liposome and genes to cultured cells and then irradiating with low-frequency ultrasonic waves.
Furthermore, the present invention provides an ultrasonic therapeutic agent used by irradiating a target site after administration with low-frequency ultrasonic waves, characterized by containing the gas-encapsulated liposome and a medicinal component. .
本発明方法によれば、粒子径が原料リポソームに依存するので、小さく、かつ一定の粒子径を有するガス封入リポソームが簡便かつ安定して調製できる。また、小さい粒子径を有することから、細動脈等の血栓や動脈硬化巣へも大量のガス封入リポソームを移行させることができ、従来診断できなかった病巣部の画像化も可能となるとともに、微小血管の血栓や動脈硬化巣の治療が可能となる。
また、本発明のガス封入リポソームは、投与後標的部位に低周波超音波照射することにより、当該部位で内封されたガスの微小気泡によるキャビテーションを生じ爆発作用を有する。従って、血栓や動脈硬化巣等の破壊による治療が可能となる。また、リポソームに病巣部位に対するリガンドを結合させておけば、その治療はより部位特異的になる。in vivo又はin vitroにおいて、ガス封入リポソームと遺伝子類とを同時に標的細胞に作用させ、低周波超音波照射すれば、ガスの微小気泡が生じキャビテーションによって標的細胞に極めて効率良く遺伝子類を導入できる。
According to the method of the present invention, since the particle size depends on the raw material liposome, a gas-encapsulated liposome having a small and constant particle size can be prepared easily and stably. In addition, since it has a small particle size, a large amount of gas-encapsulated liposomes can be transferred to thrombi such as arterioles and arteriosclerotic lesions. Treatment of blood clots and arteriosclerotic lesions becomes possible.
In addition, the gas-encapsulated liposome of the present invention has an explosive effect by irradiating the target site with low-frequency ultrasonic waves after administration, thereby causing cavitation due to gas microbubbles enclosed in the site. Therefore, treatment by destruction of thrombus, arteriosclerotic lesion, etc. becomes possible. In addition, if a ligand for a lesion site is bound to the liposome, the treatment becomes more site-specific. In vivo or in vitro, gas-encapsulated liposomes and genes simultaneously act on target cells, and if they are irradiated with low-frequency ultrasonic waves, gas microbubbles are generated and genes can be introduced into target cells very efficiently by cavitation.
本発明においては、予めリポソームを調製しておくことに特徴がある。本発明に用いられるリポソームとは、基本的に膜構成成分として脂質類を含有するリポソームであり、その内部には薬物、遺伝子類等を有していてもよい。ここでリポソームの膜構成成分として用いられる脂質類としては、リン脂質、グリセロ糖脂質及びスフィンゴ糖脂質の他、これらの脂質に、１級アミノ基、２級アミノ基、３級アミノ基又は第４級アンモニウム基が導入されたカチオン性脂質、これらの脂質にポリアルキレングリコールが導入された脂質、さらに各種細胞、組織等に対するリガンドが結合した脂質類が挙げられる。 The present invention is characterized by preparing liposomes in advance. The liposome used in the present invention is basically a liposome containing lipids as a membrane constituent component, and may have drugs, genes, etc. therein. Here, as lipids used as membrane constituents of the liposome, in addition to phospholipid, glyceroglycolipid and sphingoglycolipid, these lipids include primary amino group, secondary amino group, tertiary amino group or fourth group. Examples include cationic lipids into which quaternary ammonium groups have been introduced, lipids into which polyalkylene glycol has been introduced into these lipids, and lipids to which ligands for various cells, tissues and the like are bound.
リン脂質としては、例えばホスファチジルコリン（大豆ホスファチジルコリン、卵黄ホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン等）、ホスファチジルエタノールアミン（ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン等）、ホスファチジルセリン、ホスファチジン酸、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、リゾホスファチジルコリン、スフィンゴミエリン、卵黄レシチン、大豆レシチン、水素添加リン脂質等の天然又は合成のリン脂質等が挙げられる。 Examples of phospholipids include phosphatidylcholine (soybean phosphatidylcholine, egg yolk phosphatidylcholine, distearoylphosphatidylcholine, dipalmitoylphosphatidylcholine, etc.), phosphatidylethanolamine (distearoylphosphatidylethanolamine, etc.), phosphatidylserine, phosphatidic acid, phosphatidylphosphatidylphosphatidylphosphatidylphosphatidylinositol, Natural or synthetic phospholipids such as sphingomyelin, egg yolk lecithin, soybean lecithin and hydrogenated phospholipid.
グリセロ糖脂質としては、例えばスルホキシリボシルグリセリド、ジグリコシルジグリセリド、ジガラクトシルジグリセリド、ガラクトシルジグリセリド、グリコシルジグリセリド等が挙げられる。スフィンゴ糖脂質としては、例えばガラクトシルセレブロシド、ラクトシルセレブロシド、ガングリオシド等が挙げられる。 Examples of the glyceroglycolipid include sulfoxyribosyl glyceride, diglycosyl diglyceride, digalactosyl diglyceride, galactosyl diglyceride, glycosyl diglyceride and the like. Examples of the glycosphingolipid include galactosyl cerebroside, lactosyl cerebroside, ganglioside and the like.
カチオン性脂質としては、上記リン脂質、グリセロ糖脂質又はスフィンゴ糖脂質に、アミノ基、アルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基、トリアルキルアンモニウム基、モノアシルオキシアルキル−ジアルキルアンモニウム基、ジアシルオキシアルキル−モノアルキルアンモニウム基等の第４級アンモニウム基が導入された脂質が挙げられる。また、ポリアルキレングリコール修飾脂質としては、上記リン脂質、グリセロ糖脂質、スフィンゴ糖脂質に、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール等が修飾した脂質、例えばジ−Ｃ12-24アシル−グリセロール−ホスファチジルエタノールアミン−Ｎ−ＰＥＧ等が挙げられる。 Examples of the cationic lipid include the above phospholipid, glyceroglycolipid or sphingoglycolipid, amino group, alkylamino group, dialkylamino group, trialkylammonium group, monoacyloxyalkyl-dialkylammonium group, diacyloxyalkyl-monoalkylammonium group. And lipids having a quaternary ammonium group such as a group introduced therein. Examples of the polyalkylene glycol-modified lipid include lipids obtained by modifying the above phospholipid, glyceroglycolipid, and sphingoglycolipid with polyethylene glycol, polypropylene glycol, etc., such as di-C 12-24 acyl-glycerol-phosphatidylethanolamine-N. -PEG etc. are mentioned.
また必要に応じて膜安定化剤としてコレステロール類、抗酸化剤としてトコフェロール類、ステアリルアミン、ジセチルホスフェート、ガレグリオシドを用いてもよい。 If necessary, cholesterols may be used as membrane stabilizers, tocopherols, stearylamine, dicetyl phosphate, and galegliosides may be used as antioxidants.
また、標的細胞、標的組織、標的病巣に対するリガンドとしては、トランスフェリン、葉酸、ヒアルロン酸、ガラクトース、マンノースなどの癌細胞に対するリガンド；ＲＧＤペプチド、sigma protein などの血栓に対するリガンド等が挙げられる。また、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体もリガンドとして使用できる。 Examples of ligands for target cells, target tissues, and target lesions include ligands for cancer cells such as transferrin, folic acid, hyaluronic acid, galactose, and mannose; ligands for thrombus such as RGD peptide and sigma protein. Monoclonal antibodies and polyclonal antibodies can also be used as ligands.
また、予め作成されるリポソームの内部には、水相であればよく特に薬効成分、遺伝子類等を含有しなくてもよいが、前記治療薬や遺伝子導入用組成物として使用する場合には、含有していてもよい。このような薬効成分としては、例えばドキソルビシン、５−ＦＵ、シスプラチン、オギザリプラチン等の白金誘導体、タキソール、カンプトテシン等の癌治療薬；ｔ−ＰＡ、ウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ等の血栓治療薬；プロスタグランジン等の動脈硬化症治療薬；動脈閉塞症、バーチャ病に対するＮＦカッパーＢ、デコイ等が挙げられる。また、遺伝子類としては、ＤＮＡ、ＲＮＡ、アンチセンスＤＮＡ、ｓｉＲＮＡ、デコイ、治療用オリゴヌクレオチド等が挙げられる。 In addition, the liposome prepared in advance may be an aqueous phase as long as it does not contain particularly medicinal ingredients, genes, etc., but when used as the therapeutic agent or the gene introduction composition, You may contain. Examples of such medicinal ingredients include platinum derivatives such as doxorubicin, 5-FU, cisplatin, ogisariplatin, and other cancer therapeutic agents such as taxol and camptothecin; thrombotic therapeutic agents such as t-PA, urokinase, and streptokinase; NF kappa B, decoy for arterial occlusion, Virtua disease and the like. Examples of genes include DNA, RNA, antisense DNA, siRNA, decoy, and therapeutic oligonucleotide.
リポソームの製造には、公知のリポソームの調製法を適用することができ、例えばバンガム（Bangham）らのリポソーム調製法［ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー(J. Mol. Biol.), 13, 238(1965)］、エタノール注入法［ジャーナル・オブ・セル・バイオロジー(J. Cell. Biol.), 66, 621(1975)］、フレンチプレス法［フェブス・レター(FEBS Lett.), 99, 210(1979)］、凍結融解法［アーカイブス・オブ・バイオケミストリー・アンド・バイオフィジックス(Arch. Biochem. Biophys.), 212, 186(1981)］、逆相蒸発法［プロシーディング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・ユー・エス・エー(Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 75, 4194(1978)］等が挙げられる。例えば、脂質類等を有機溶媒に溶解し、これに水性溶液を加え、次いで、超音波処理してリポソーム懸濁液を得る。次いで必要によりこれをエクストルーダー及び／又はメンブランフィルターを用いて、整粒する。このとき、粒子径は、１μm以下、さらに１００〜８００nm、特に１００〜６００nmに整粒するのが好ましい。 For the production of liposomes, a known liposome preparation method can be applied. For example, Bangham et al., A liposome preparation method [J. Mol. Biol., 13, 238]. (1965)], ethanol injection method [J. Cell. Biol., 66, 621 (1975)], French press method [FEBS Lett., 99, 210 (1979)], freeze-thaw method [Arch. Biochem. Biophys., 212, 186 (1981)], reverse phase evaporation method [Proceeding of the National] -Academy of Sciences USA (Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 75, 4194 (1978)]. For example, lipids and the like are dissolved in an organic solvent, an aqueous solution is added thereto, and then sonicated to obtain a liposome suspension. Then, if necessary, this is sized using an extruder and / or a membrane filter. At this time, the particle size is preferably 1 μm or less, more preferably 100 to 800 nm, and particularly preferably 100 to 600 nm.
得られたリポソーム懸濁液は密封容器に注入する。このとき、容器の空隙率は内容積の２０〜８０％、さらに３０〜８０％、特に５０〜８０％にするのが好ましい。２０％未満では、得られるリポソームのガス導入率が低すぎる。一方、８０％を超えると経済的でない。 The resulting liposome suspension is injected into a sealed container. At this time, the porosity of the container is preferably 20 to 80% of the internal volume, more preferably 30 to 80%, and particularly preferably 50 to 80%. If it is less than 20%, the gas introduction rate of the resulting liposome is too low. On the other hand, if it exceeds 80%, it is not economical.
この空隙部にフッ化物ガス又は窒素ガスを充填する。フッ化物ガスとしては、硫化ヘキサフルオライド、パーフルオロ炭化水素ガス、例えば、ＣＦ4、Ｃ2Ｆ6、Ｃ3Ｆ8、Ｃ4Ｆ10、Ｃ5Ｆ12、Ｃ6Ｆ14等が挙げられ、Ｃ3Ｆ8、Ｃ4Ｆ10、Ｃ5Ｆ12が特に好ましい。また、窒素ガスも使用できる。充填した後の圧力は１気圧（ゲージ圧）以上、特に１〜１．５気圧が好ましい。充填手段としては、ゴム栓等から注射器等により、注入するのが簡便であるが、注入用シリンダーを用いてもよい。 This void is filled with fluoride gas or nitrogen gas. Examples of the fluoride gas include sulfurized hexafluoride and perfluorohydrocarbon gas such as CF 4 , C 2 F 6 , C 3 F 8 , C 4 F 10 , C 5 F 12 , and C 6 F 14. C 3 F 8 , C 4 F 10 and C 5 F 12 are particularly preferred. Nitrogen gas can also be used. The pressure after filling is preferably 1 atm (gauge pressure) or more, particularly 1 to 1.5 atm. As a filling means, it is easy to inject from a rubber stopper or the like with a syringe or the like, but an injection cylinder may be used.
次いで超音波処理する。超音波処理は、例えば、２０〜５０kHzの超音波を１〜５分照射すればよい。当該超音波処理により、リポソーム内部の水溶液とフッ化物ガス又は窒素ガスとが置換し、ガス封入リポソームが得られる。得られたガス封入リポソームの粒子径は、原料リポソームのそれとほぼ同じである。従って、リポソーム調整時に整粒しておけば、粒子径が一定範囲、例えば１μm以下、さらに５０〜８００nm、特に１００〜６００nmのガス封入リポソームが簡便に得られる。 It is then sonicated. The ultrasonic treatment may be performed, for example, by irradiating 20-50 kHz ultrasonic waves for 1-5 minutes. By the ultrasonic treatment, the aqueous solution inside the liposome is replaced with fluoride gas or nitrogen gas, and gas-encapsulated liposome is obtained. The particle diameter of the obtained gas-encapsulated liposome is almost the same as that of the raw liposome. Therefore, if the particle size is adjusted at the time of preparing the liposome, a gas-encapsulated liposome having a particle size in a certain range, for example, 1 μm or less, 50 to 800 nm, particularly 100 to 600 nm can be easily obtained.
なお、フッ化物ガス又は窒素ガスを充填したリポソーム懸濁液含有密封容器を調製しておき、これを病院等に供給すれば、現場で超音波処理するだけで容易にガス封入リポソームを得ることができる。 If a liposome suspension-containing sealed container filled with fluoride gas or nitrogen gas is prepared and supplied to a hospital or the like, gas-encapsulated liposomes can be easily obtained simply by ultrasonic treatment at the site. it can.
かくして得られたガス封入リポソームは、粒子径が小さく、その粒度分布も一定にすることができるので、微小血管、深部組織等への移行が可能である。従って、ガス封入リポソームを用いれば、従来のマイクロバブルを用いた超音波診断画像よりも、微小血管、深部組織等の画像化が可能になるばかりでなく、その画像もより鮮明になる。本発明のガス封入リポソームを用いた超音波診断は、通常の方法に従って行えばよい。すなわち、本発明のガス封入リポソームを投与後、診断用超音波（２〜６MHz）を照射することにより、組織の画像が得られる。このときの投与法としては、静脈内投与等が挙げられる。 The gas-encapsulated liposome thus obtained has a small particle size and a uniform particle size distribution, so that it can be transferred to microvessels, deep tissues and the like. Therefore, the use of gas-encapsulated liposomes not only enables imaging of microvessels, deep tissues, etc., but also makes the images clearer than conventional ultrasound diagnostic images using microbubbles. The ultrasonic diagnosis using the gas-encapsulated liposome of the present invention may be performed according to a usual method. That is, an image of a tissue can be obtained by irradiating diagnostic ultrasonic waves (2 to 6 MHz) after administration of the gas-encapsulated liposome of the present invention. Examples of the administration method at this time include intravenous administration.
また、本発明のガス封入リポソームは、０．５〜２MHzの共振周波数を含む低周波超音波を照射すると、リポソームの崩壊とガスの微小気泡によるキャビテーションを生じる。このキャビテーションが血栓部位でおこれば血栓が破壊される。従って、リポソームが、標的病巣、例えば血栓や動脈硬化巣に対するリガンドを有する場合には、投与された本発明のガス封入リポソームは、血栓や動脈硬化巣に結合する。この様子は、診断用超音波照射により追跡可能である。ガス封入リポソームが血栓や動脈硬化巣に結合した時点で、その部位に低周波超音波を照射すれば、当該ガス封入リポソームを爆発させ、血栓等を破壊し、治療することができる。このようなガス封入リポソームの爆発により治療できる疾患としては、血栓、動脈硬化症、血管炎、癌組織等が挙げられる。 In addition, when the gas-encapsulated liposome of the present invention is irradiated with a low-frequency ultrasonic wave including a resonance frequency of 0.5 to 2 MHz, the liposome is collapsed and cavitation due to gas microbubbles occurs. If this cavitation occurs at the thrombus site, the thrombus is destroyed. Therefore, when the liposome has a ligand for a target lesion such as a thrombus or arteriosclerotic lesion, the administered gas-encapsulated liposome of the present invention binds to the thrombus or arteriosclerotic lesion. This state can be traced by ultrasonic irradiation for diagnosis. When the gas-encapsulated liposome is bound to the thrombus or arteriosclerotic lesion, if the site is irradiated with low-frequency ultrasound, the gas-encapsulated liposome can be exploded to destroy the thrombus or the like for treatment. Examples of diseases that can be treated by the explosion of such gas-encapsulated liposomes include thrombus, arteriosclerosis, vasculitis, and cancer tissue.
また、前述の如く、本発明のガス封入リポソームには、種々の薬効成分、遺伝子類を内包させることができるので、これらの薬効成分又は遺伝子内包リポソームを用いれば、ガス封入リポソームを投与後、標的部位に到達するのを診断用超音波により追跡し、標的部位に到達した時点で低周波超音波を照射すれば、リポソームに内封されたガスの微小気泡から生じるキャビテーションにより、標的部位で薬効成分又は遺伝子類を放出させ、標的細胞に導入することができる。このとき、薬効成分又は遺伝子類は、本発明のガス封入リポソームに内包されている必要はなく、同時に投与すればよい。ここで遺伝子類導入用リポソームとしては、カチオン性脂質を用いたリポソームを用いるのが好ましい。また、このときプロタミン、ポリリジン等も遺伝子類と同時に投与すると、遺伝子の導入効率はさらに向上する。 In addition, as described above, the gas-encapsulated liposome of the present invention can encapsulate various medicinal ingredients and genes. Therefore, if these medicinal ingredients or gene-encapsulated liposomes are used, the gas-encapsulated liposome can be used as a target after administration. If it reaches the target site with diagnostic ultrasound and irradiates with low-frequency ultrasound when it reaches the target site, the medicinal component at the target site by cavitation generated from the microbubbles of gas enclosed in the liposome Alternatively, genes can be released and introduced into target cells. At this time, the medicinal components or genes do not need to be encapsulated in the gas-encapsulated liposome of the present invention and may be administered simultaneously. Here, as the liposome for gene introduction, it is preferable to use a liposome using a cationic lipid. At this time, if protamine, polylysine, and the like are administered at the same time as the genes, the efficiency of gene introduction is further improved.
ここで遺伝子類は、ガス封入リポソームの爆発により標的細胞への導入効率が向上する。従って、本発明ガス封入リポソームと遺伝子類を投与後、標的部位に低周波超音波照射すれば、標的細胞へ遺伝子類を効率良く導入することができる。また、この遺伝子類の細胞への導入は、in vitro、すなわち、培養細胞に対しても行うことができる。この場合には、本発明のガス封入リポソームと遺伝子類を培養細胞に添加し、次いで低周波超音波照射すればよい。 Here, the efficiency of introduction of genes into target cells is improved by the explosion of gas-encapsulated liposomes. Therefore, genes can be efficiently introduced into target cells by irradiating the target site with low frequency ultrasonic waves after administration of the gas-encapsulated liposomes and genes of the present invention. In addition, introduction of these genes into cells can be performed in vitro, that is, in cultured cells. In this case, the gas-encapsulated liposome of the present invention and genes may be added to the cultured cells and then irradiated with low frequency ultrasonic waves.
なお、薬効成分や遺伝子類を標的細胞、標的組織、標的病巣等に効率良く到達させるには、本発明ガス封入リポソームとして、これらの標的部位に対するリガンドが結合したリポソームを用いるのが好ましい。 In order to efficiently reach the medicinal components and genes to target cells, target tissues, target lesions and the like, it is preferable to use liposomes in which ligands for these target sites are bound as the gas-encapsulated liposomes of the present invention.
次に実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明は何らこれらに限定されるものではない。
以下、実施例で用いる略語は次のとおりである。
ＤＰＰＣ：ジパルミトイルホスファチジルコリン
ＤＰＰＥ：ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン
ＰＥＧ：ポリエチレングリコール
Ｍａｌ：マルトース
ＤＣ−Ｃｈｏｌ：３β−［Ｎ−（Ｎ′，Ｎ′−ジメチルアミノエタン］カルバモイル］コレステロール
ＤＯＰＥ：ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン
ＤＯＴＡＰ：１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン
ＤＰＴＭＡ：Ｎ−［１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド
ＤＤＡＢ：ジドデシルジメチルアンモニウムブロミド
EXAMPLES Next, although an Example is given and this invention is demonstrated in detail, this invention is not limited to these at all.
Hereinafter, abbreviations used in the examples are as follows.
DPPC: Dipalmitoylphosphatidylcholine DPPE: Dipalmitoylphosphatidylethanolamine PEG: Polyethylene glycol Mal: Maltose DC-Chol: 3β- [N- (N ′, N′-dimethylaminoethane] carbamoyl] cholesterol DOPE: Dioleoylphosphatidylethanolamine DOTAP: 1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane DPTMA: N- [1- (2,3-dioleoyloxy) propyl] -N, N, N-trimethylammonium chloride DDAB: didodecyldimethylammonium bromide
実施例１
（１）血栓ターゲティング用リポソームの調製方法
ＤＰＰＣ：コレステロール：ＤＰＰＥ−ＰＥＧ：ＤＰＰＥ−ＰＥＧ−Ｍａｌ（１：１：０．１１：０．０２（m／m））の脂質をクロロホルム：イソプロピルエーテル（１：１v／v）の有機溶媒に溶解し、生理食塩水などの水溶液（又は薬物を含む水溶液）を有機溶媒の１／２容量を加えて（このとき、クロロホルム：イソプロピルエーテル：水溶液＝１：１：１v／v）混和しエマルジョンとした。これを用いて逆相蒸発法（ＲＥＶ法）でリポソームを調製した。エクストルーダーで４００nm、２００nm、１００nmのポリカーボネート膜を通過させて粒径を揃える。ＰＥＧ−リポソームとすることで、長期間（２年間）分散状態で保つことが可能となる。ただし、ガス封入時には、超音波で封入するので、どのようなリポソームでも分散状態が得られるので、ガス封入には脂質組成は関係しない。
ＣＧＧＧＲＧＤＦペプチドをこのリポソーム溶液に加えて１時間室温で反応させた。そのあと、超遠心分離でＲＧＤ修飾ＰＥＧ−リポソームを得た。
Example 1
(1) Preparation method of liposome for thrombus targeting Lipid of DPPC: cholesterol: DPPE-PEG: DPPE-PEG-Mal (1: 1: 0.11: 0.02 (m / m)) is chloroform: isopropyl ether (1 : 1 v / v) dissolved in an organic solvent, and an aqueous solution such as physiological saline (or an aqueous solution containing a drug) is added to 1/2 volume of the organic solvent (in this case, chloroform: isopropyl ether: aqueous solution = 1: 1). : 1 v / v) mixed to make an emulsion. Using this, liposomes were prepared by the reverse phase evaporation method (REV method). The particle size is made uniform by passing through 400, 200 and 100 nm polycarbonate films with an extruder. By using PEG-liposomes, it is possible to maintain a dispersed state for a long period (2 years). However, when encapsulating the gas, since it is encapsulated with ultrasonic waves, a dispersed state can be obtained with any liposome, and therefore the lipid composition is not related to encapsulating the gas.
CGGGRDF peptide was added to the liposome solution and allowed to react for 1 hour at room temperature. Thereafter, RGD-modified PEG-liposomes were obtained by ultracentrifugation.
（２）遺伝子導入用カチオニックリポソームの調製
ｉ）ＤＣ−Ｃｈｏｌリポソーム
ＤＯＰＥ：ＤＣ−Ｃｈｏｌ＝２：３m／mをクロロホルムに溶解し、梨型フラスコ中に入れ、ロータリーエバポレートで回転しながら有機溶媒をエバポレートして脂質の薄い膜を壁に作製した（lipid filmの作製）。生理食塩水などの溶媒で水和（hydration）して、リポソームを作製した。超音波処理によってサイズを小さくする。又は、エクストルーダーで４００nm、２００nm、１００nmのポリカーボネート膜を通過させて粒径を揃える。
(2) Preparation of cationic liposomes for gene transfer i) DC-Chol liposomes DOPE: DC-Chol = 2: 3 m / m was dissolved in chloroform, placed in a pear-shaped flask, and an organic solvent was removed while rotating on a rotary evaporator. Evaporated to produce a thin lipid film on the wall (preparation of lipid film). Liposomes were prepared by hydration with a solvent such as physiological saline. Reduce size by sonication. Alternatively, the particle diameter is made uniform by passing through a 400 nm, 200 nm, and 100 nm polycarbonate film with an extruder.
ii）ＤＯＴＡＰリポソーム
ＤＯＴＡＰ：ＤＯＰＥ＝１：１w／wをクロロホルムに溶解し、梨型フラスコ中に入れ、ロータリーエバポレートで回転しながら有機溶媒をエバポレートして脂質の薄い膜を壁に作製した（lipid filmの作製）。生理食塩水などの溶媒で水和（hydration）して、リポソームを作製した。超音波処理によってサイズを小さくする。又は、エクストルーダーで４００nm、２００nm、１００nmのポリカーボネート膜を通過させて粒径を揃える。
ii) DOTAP liposome DOTAP: DOPE = 1: 1 w / w was dissolved in chloroform, placed in a pear-shaped flask, and an organic solvent was evaporated while rotating on a rotary evaporator to form a thin lipid film on the wall (lipid film) Production). Liposomes were prepared by hydration with a solvent such as physiological saline. Reduce size by sonication. Alternatively, the particle diameter is made uniform by passing through a 400 nm, 200 nm, and 100 nm polycarbonate film with an extruder.
市販のカチオニックリポソームからなる遺伝子導入用の試薬として、以下の試薬を用いた。
LipofectinTM(DOTMA:DOPE=1：1 w/w)
LipofectACETM(DDAB:DOPE=1：1.25 w/w)
The following reagents were used as reagents for gene introduction consisting of commercially available cationic liposomes.
Lipofectin TM (DOTMA: DOPE = 1: 1 w / w)
LipofectACE TM (DDAB: DOPE = 1: 1.25 w / w)
（３）各種リポソームに対するガスの封入法
バイアル瓶（５mL、１０mL、２０mLなど）に容量の３０％（１．５mL、３mL、６mL）に相当するリポソーム水溶液（脂質濃度は５mg／mL）を入れ、パーフルオロプロパンを空気と置換するように入れた。ゴム栓をしてシールしゴム栓を通じて注射器でさらにパーフルオロプロパンを加えた。パーフルオロプロパンは全量で内容積の１．５倍で１．５気圧程度の加圧状態にした。バス型超音波装置（４２kHz）に水を張り静置し、１分間照射処理した。
(3) Gas sealing method for various liposomes An aqueous liposome solution (lipid concentration is 5 mg / mL) corresponding to 30% of the volume (1.5 mL, 3 mL, 6 mL) is placed in a vial (5 mL, 10 mL, 20 mL, etc.) Perfluoropropane was added to replace air. Sealed with a rubber stopper, and further perfluoropropane was added with a syringe through the rubber stopper. The total amount of perfluoropropane was 1.5 times the internal volume and a pressure of about 1.5 atm. Water was applied to a bath-type ultrasonic device (42 kHz) and allowed to stand for irradiation for 1 minute.
（４）血栓の造影
ウサギ腸骨動脈にバルーンカテーテルを導入し、内皮に擦る刺激を与えて人工的に血栓を作製する。ＲＧＤ−ＰＥＧ−リポソームを静注し、診察用超音波装置（３．５MHz）で血栓部位を観測すると輝度が上昇し血栓部位が確認できた。
(4) Imaging of thrombus A balloon catheter is introduced into the rabbit iliac artery, and stimulation is given to the endothelium to artificially create a thrombus. When RGD-PEG-liposome was intravenously injected and the thrombus site was observed with a diagnostic ultrasonic device (3.5 MHz), the brightness increased and the thrombus site was confirmed.
（５）血栓の破砕
試験管内に血栓を作製し上記（３）で得たガス封入ＲＧＤ−ＰＥＧ−リポソームを添加後３０分放置した。リポソーム溶液を除去し、生理食塩水を加えて、１MHzの治療用超音波を照射したところ、表面の破砕が観測された。一方、ガス封入ＰＥＧ−リポソームで同様の操作をした場合、破砕が観測されなかった。この違いは、ＲＧＤペプチドによるガス封入リポソームの血栓への結合が生じたためで、ターゲティングが出来た。
(5) Thrombus crushing A thrombus was prepared in a test tube, and the gas-encapsulated RGD-PEG-liposome obtained in (3) above was added and left for 30 minutes. When the liposome solution was removed, physiological saline was added, and 1 MHz therapeutic ultrasound was irradiated, surface disruption was observed. On the other hand, when the same operation was performed with gas-encapsulated PEG-liposomes, no crushing was observed. This difference was due to the binding of gas encapsulated liposomes to the thrombus by the RGD peptide, which allowed targeting.
（６）４８穴のプレートにヒト膵臓癌ＡｓＰＣ−１細胞（４×１０4細胞／well）を培養し、ＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチド（１８核酸残基）と上記（３）で得たガス封入ＰＥＧ−リポソームを添加し、１MHzの超音波を３秒間パルス照射し、直ちに培養液を３〜４回繰り返し洗浄した。その後、蛍光顕微鏡で細胞内の蛍光強度を観測した。低周波照射により細胞内の蛍光が観測され、その結果、ガス封入リポソームと遺伝子を細胞に添加し、次いで低周波照射すれば標的細胞に目的遺伝子を導入できることが判明した。 (6) Human pancreatic cancer AsPC-1 cells (4 × 10 4 cells / well) are cultured in a 48-well plate, FITC-labeled oligonucleotide (18 nucleic acid residues) and the gas-encapsulated PEG-obtained in (3) above Liposomes were added, 1 MHz ultrasound was pulsed for 3 seconds, and the culture was immediately and repeatedly washed 3-4 times. Thereafter, the fluorescence intensity in the cells was observed with a fluorescence microscope. Intracellular fluorescence was observed by low-frequency irradiation, and as a result, it was found that the target gene can be introduced into the target cells by adding gas-encapsulated liposomes and genes to the cells and then applying low-frequency irradiation.
（７）ルシフェラーゼをコードしたプラスミドＤＮＡとプロタミンを混合し、ＤＮＡ−プロタミン複合体を作製し、コンパクトなサイズにする。４８穴のプレートにAsPC−１細胞（４×１０4細胞／well）培養し、ＤＮＡ−プロタミン複合体（１マイクロg DNA、lipid：DNA＝12:1 w/w）とガス封入ＰＥＧ−リポソームを添加し、１MHzの超音波を３秒間パルス照射し、直ちに培養液を３〜４回繰り返し洗浄し、培養液を加えて２日間培養した。その後、ルシフェラーゼ活性を常法により測定した。得られた結果を表１に示す。 (7) Plasmid DNA encoding luciferase and protamine are mixed to produce a DNA-protamine complex, which is made compact. AsPC-1 cells (4 × 10 4 cells / well) were cultured in a 48-well plate, and DNA-protamine complex (1 microg DNA, lipid: DNA = 12: 1 w / w) and gas-encapsulated PEG-liposome were added. Then, 1 MHz ultrasonic wave was pulse-irradiated for 3 seconds, and the culture medium was immediately washed 3 to 4 times. The culture medium was added and cultured for 2 days. Thereafter, luciferase activity was measured by a conventional method. The obtained results are shown in Table 1.
表１から明らかようにガス封入リポソームと遺伝子を細胞に添加し、次いで低周波超音波照射することにより、遺伝子が効率良く細胞に導入できることがわかった。 As apparent from Table 1, it was found that the gene can be efficiently introduced into the cells by adding the gas-encapsulated liposome and the gene to the cells and then irradiating with low frequency ultrasonic waves.
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