JP2005065632A - Method for multistep enzyme reaction and microreactor for multistep enzyme reaction - Google Patents

Method for multistep enzyme reaction and microreactor for multistep enzyme reaction Download PDF

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Hideaki Maeda
Masaya Miyazaki
Hiroyuki Nakamura
Hajime Shimizu
Yoshiko Yamaguchi
Kenichi Yamashita
浩之 中村
英明 前田
真佐也 宮崎
健一 山下
佳子 山口
肇 清水
Original Assignee
National Institute Of Advanced Industrial & Technology
独立行政法人産業技術総合研究所
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Abstract

PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a method for producing a desired substance in high efficiency in a manner similar to the material-forming step in vivo by continuously carrying out a plurality of enzyme reaction steps and provide a reactor suitable for the production process.
SOLUTION: A plurality of micro-channels each having a different immobilized enzyme are connected in series and a liquid medium containing a raw material is continuously supplied to the micro-channels to perform the multistep enzyme reaction. The microreactor for the multistep enzyme reaction is produced by serially connecting a plurality of units each having a different enzyme immobilized to the unit by modifying the surface in the micro-channel.
COPYRIGHT: (C)2005,JPO&NCIPI

Description

本発明は、マイクロチャネルを利用して、多段階の酵素反応を行う方法及びその反応を行うのに好適な多段階酵素反応用マイクロリアクターに関するものである。 The present invention utilizes microchannels are those of the preferred multistage enzymatic reaction microreactor for carrying out the process and its reaction is carried out the enzymatic reactions of multiple stages.

最近、化学分野、電気機械的分野において、径10〜100μmのキャピラリーやマイクロチャネルを利用して、微量分析、微量合成、微量微生物培養、微量電気泳動、微量電気浸透などの化学的・電気的又は機械的操作を行うことが試みられている(非特許文献1)。 Recently, chemistry, in the electromechanical field, by using a capillary or micro-channel diameter 10 to 100 [mu] m, microanalysis, trace synthesis, trace microbial culture, trace electrophoresis, chemical, such as traces of electro-osmotic and electrical or it has been attempted to perform the mechanical operations (non-patent document 1). これらは、少量の試料を用いて、迅速にそれぞれの方法の結果を確認しうるという利点があるため、各方面への応用がはかられている。 These uses a small amount of sample, for rapid advantage that can see the results of each method, applications are grave to various fields.

そして、これらの中で化学反応を効率的に行うための装置、いわゆるマイクロリアクターについては、流体化学反応の制御性が向上し、反応生成物の収率、純度の改善が予想される上に、リアクターの幅を狭くすることができ、普通サイズのリアクターに比べ、体積当りの表面積の比率を大きくしうるので、化学反応の効率化の手段として注目されている。 The apparatus for efficient chemical reactions among these, the so-called microreactor improves the controllability of the fluid chemical reactions, the yield of the reaction product, on the improvement of purity is expected, it is possible to narrow the width of the reactors, as compared to the full-size reactors, as it can increase the ratio of surface area per volume, it has attracted attention as a means for efficient chemical reactions.

ところで、化学、生化学の分野においては、反応効率を向上させるために触媒を使用する場合が多く、この際触媒効率を向上させることが課題となっている。 Incidentally, the chemical, in the field of biochemistry, may use a catalyst in order to improve the reaction efficiency often, to improve the time catalyst efficiency has become an issue. 例えば光学活性化合物の不斉合成に際し、酵素や有機金属錯体などの有機分子を用いる場合、これらは無機触媒に比べコスト高になるのを免れないので、触媒効率を改善し、使用量の減少や再利用をはかることが実用化の上で必要になってくる。 For example upon asymmetric synthesis of optically active compounds, the case of using the organic molecules such as enzymes or organometallic complexes, because these are not saved from high cost compared to inorganic catalysts, to improve catalyst efficiency, Ya decreases usage possible to achieve the reuse becomes necessary on the practical use.

特に、生体内においては複数の酵素反応が組み合わされ、効率的な物質合成が行われているので、これと同様にして多段階の酵素合成による物質生産を行うことができれば、種々多様の物質を簡単に合成しうる画期的なプロセスを実現できるばかりでなく、化学プロセスの低環境負荷化に大きく寄与できる筈である。 In particular, in vivo are combined more enzyme reactions, since efficient mass synthesis is being performed, if it is possible to perform the material produced by a manner of multistage enzymatic synthesis Similarly, a wide variety of materials not only can achieve a breakthrough process that can easily synthesized, it should largely contribute to the low environmental load of chemical processes.

しかしながら、これまで行われてきたバルク系での酵素反応は、平衡反応であるため、中間生成物が夾雑し、目的物を効率よく得ることが困難であった。 However, the enzyme reaction in the bulk system that have been applied, since an equilibrium reaction, the intermediate product is contaminated, it is difficult to obtain the desired product efficiently. したがって、バルクの反応においては、単一の酵素を用いた一段階反応のみが行われていた。 Therefore, in the bulk of the reaction, only a single step reaction using a single enzyme was done.

本発明は、このような事情のもとで、複数の酵素反応を連続して行うことにより、生体内における物質生成過程と同様にして、所望の物質を効率よく製造しうる方法及びそれを実施するのに好適な反応装置を提供することを目的としてなされたものである。 The present invention is carried out under such circumstances, by continuously performing a plurality of enzymatic reactions, in the same manner as in the material formation process in vivo, the method and it can be efficiently produced the desired material It has been made for the purpose of providing a suitable reactor for.

本発明者らは、先に不活性材料からなる固体表面に、マイクロチャネルを刻設し、そのマイクロチャネルの壁面に触媒能を有する有機分子、例えば酵素分子を固定させたマイクロリアクターを開発したが(特願2002−67023号)、さらに研究を重ねた結果、このマイクロリアクターに異なった酵素分子を固定化し、これを複数組み合わせれば、多段階の酵素反応を行わせることができることを見出し、この知見に基づいて本発明をなすに至った。 The present inventors have found that a solid surface made of previously inert material, engraved microchannels, organic molecules having catalytic ability on the wall of the microchannel has been developed a microreactor for example, by fixing the enzyme molecules (Japanese Patent Application No. 2002-67023), a result of further extensive research, the different enzyme molecules in the microreactor immobilized, by combining a plurality of which, found that it is possible to carry out the enzyme reaction multistep this leading to completion of the present invention based on the finding.

すなわち、本発明は、それぞれ異なった酵素を固定化した複数のマイクロチャネルを直列に連結し、それに原料を含む液体媒体を連続的に供給し、複数段階の酵素反応を行わせることを特徴とする多段階酵素反応方法、及びそれぞれマイクロチャネル内を表面修飾して異なった酵素を固定化した複数のユニットを直列に連結して構成されたことを特徴とする多段階酵素反応用マイクロリアクターを提供するものである。 That is, the present invention provides a plurality of microchannels immobilized different enzymes respectively connected in series, it the liquid medium containing the raw material was continuously fed, characterized in that to perform the enzymatic reaction of a plurality of stages providing multi-step enzymatic reaction process, and a multi-stage enzymatic reaction microreactor, characterized in that it is constituted by connecting a plurality of units immobilized different enzymes by surface modifying the microchannel in series it is intended.

次に本発明を添付図面に従って説明する。 Next the present invention will be described with reference to the accompanying drawings. 図1は、本発明方法を実施するのに好適なマイクロリアクターの構造の1例を示す平面図であり、このマイクロリアクターは不活性材料からなる基板1,1´にマイクロチャネル2,2´が蛇行して刻設され、このマイクロチャネル2の壁面に酵素分子が固定された2個のユニット(I、II)が直列に連結されることによって構成されている。 Figure 1 is a plan view showing an example of the structure of a suitable microreactor for carrying out the present invention method, the microreactor microchannels 2,2' the substrate 1, 1 'made of inert material meandering been engraved, the two units enzyme molecules are fixed (I, II) is formed by being connected in series to the wall surface of the microchannel 2.

そして、ユニットI及びIIのマイクロチャネルの壁面にはそれぞれ異なった酵素分子が固定され、ポンプ3から供給される原料化合物Aは先ずユニットIにおける酵素の作用を受けて中間生成物Bとなり、次いでこれがユニットIIに送られ、ここでさらに酵素の作用を受けて目的生成物Cとなる。 Then, the wall surface of the microchannel units I and II are fixed individually enzyme molecules on the starting material A supplied from the pump 3 is the intermediate product B next is first subjected to the action of the enzyme in the unit I, which is then sent to unit II, the desired product C is further subjected to the action of the enzyme here.

この例においては、ユニットI及びIIにおいて2段階の酵素反応が行われているが、所望ならばさらにユニットの数を増やし、3段階、4段階…の酵素反応を連続して行わせることもできる。 In this example, the units I and II are two-step enzymatic reaction being carried out, increase the number of further units, if desired, three steps can also be performed continuously four stages ... enzymatic reactions .

この各ユニットで基板1として用いる不活性材料は、酵素反応の反応体や溶媒、及びその生成物に対し反応性を示さない材料のことである。 Inert material used as the substrate 1 in this units is that the material not reactive to the reactants and solvent, and the product of the enzymatic reaction. このようなものの例としては、従来のマイクロリアクターのベースとして用いられていた材料、例えばガラス、石英、又はシリカ、Si/SiO 2 、マグネシア、ジルコニア、アルミナ、アパタイト、窒化ケイ素、及びチタン、アルミニウム、イットリウム、タングステンのような金属の酸化物、炭化物、窒化物、ホウ化物、ケイ化物などのセラミックスを挙げることができる。 Examples of such, materials have been used as the basis for a conventional microreactor, for example, glass, quartz, or silica, Si / SiO 2, magnesia, zirconia, alumina, apatite, silicon nitride, and titanium, aluminum, yttrium, oxides of metals such as tungsten, carbide, may be mentioned nitrides, borides, ceramics such as silicides.

このほか上記の要件を満たすものである限り、金属、プラスチックなども用いることができる。 As long as this addition satisfies the above requirements, it is possible to use a metal, plastic, etc. also. このベースの形状としては、板状体が普遍であるが、所望ならば弧状体、球体、粒体などのものを用いることができる。 The shape of the base, but the plate-like body is a universal, arcuate body if desired, spheres, can be used, such as granules.

次に、この基板1の上に設けるマイクロチャネル2はマイクロドリルやレーザを用いる加工やエッチング処理により簡単に刻設することができる。 Next, the microchannel 2 provided on the substrate 1 can be easily engraved by machining or etching process using a micro drill or laser. このマイクロチャネルは幅50〜2000μm、好ましくは100〜400μm、深さ50〜2000μm、好ましくは100〜400μmのサイズで刻設される。 The microchannel width 50 to 2000 m, preferably 100-400, depth 50 to 2000 m, and preferably engraving size of 100-400. このマイクロチャネルの長さには特に制限はなく、使用される基板のサイズに依存するが、通常100〜300mmの範囲で選ばれる。 This particular limitation on the length of the microchannel not, depends on the size of the substrate to be used is selected usually in the range of 100 to 300 mm.

このように刻設されたマイクロチャネル壁面に酵素分子を固定化するには、例えば先ず不活性材料にそれと親和性を有するアミノ基含有化合物をマイクロチャネルの壁面と接触させて壁面にアミノ基含有化合物残基を導入したのち、これに酵素分子を反応させ、固定することによって行うことができる。 To immobilize the enzyme molecules are thus engraved microchannel walls, for example, first the amino group-containing compound is contacted with the wall surface of the microchannel amino group-containing compound to the wall with it with affinity for the inert material After introduction of the residues, which is reacted with an enzyme molecule can be performed by fixing.

すなわち、ガラスや石英や、シリカ、Si/SiO 2のようなシリカ系セラミックスをベースとして用いた場合には、アミノプロピルシランのようなアミノ基含有ケイ素化合物を反応させ、マイクロチャネル壁面のシラノール基にこの化合物の残基を導入し、この残基中のアミノ基に酵素分子を結合させて固定することができる。 That, and glass, quartz, silica, in the case of using a silica-based ceramics such as Si / SiO 2 as the base is reacted with an amino group-containing silicon compounds such as amino propyl silane, silanol groups of the microchannel wall introducing residues of this compound can be fixed by binding an enzyme molecule to the amino group of this residue in.

このアミノ基に酵素分子を結合させるには、例えばコハク酸のようなジカルボン酸を介して直接結合させるか、あるいはグルタルアルデヒドのようなアミノ基反応性架橋剤を結合させたのち、これに酵素分子のアミノ基を結合させる。 To combine the enzyme molecules to the amino group, for example, either associates directly through dicarboxylic acids such as succinic acid, or mixture was allowed to bind the amino-reactive crosslinking agents such as glutaraldehyde, to which the enzyme molecules coupling the amino group of.

また、水酸基含有アルキルシラン誘導体を反応させ、これに酵素分子を脱水縮合させてエステル結合を形成させて結合させることもできるし、ハロゲン化アルキルシラン誘導体を反応させたのち、イミン形成によりチオール含有アミンを導入することもできる。 Further, by reacting a hydroxyl group-containing alkyl silane derivative, to which the enzyme molecule dehydration condensation can either be attached by forming an ester bond, by reacting a halogenated alkylsilane derivatives, thiol-containing amine by imine formation can also be introduced.

このようにして、マイクロチャネルの壁面にアミラーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、ペクチナーゼなどの酵素分子を固定化することができる。 In this way, it is possible to immobilize amylase, protease, lipase, cellulase, hemicellulase, an enzyme molecule such as pectinase on the wall surface of the microchannel.

そのほか、アミノ末端又はカルボキシル末端に連続したヒスチジン残基をもつ酵素分子、例えばカゼインキナーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、乳酸脱水素酵素などの酵素分子は、以下のようにニッケル錯体を介して固定化することができる。 In addition, the enzyme molecules with histidine residues consecutive amino or carboxyl terminus, such as casein kinase, alkaline phosphatase, an enzyme molecule such as lactate dehydrogenase can be immobilized via the nickel complexes as follows .

すなわち、前記のようにアミノ基含有ケイ素化合物で化学修飾したのち、ジカルボン酸無水物、例えば無水コハク酸で処理し、次いで1‐エチル‐3‐アミノプロピルカルボジイミドとN‐ヒドロキシスクシンイミドとの混合物を反応させることにより、N‐ヒドロキシスクシンイミド活性エステルを形成させる。 That is, after chemically modified with an amino group-containing silicon compound as described above, the dicarboxylic acid anhydride, for example treated with succinic anhydride and then a mixture of 1-ethyl-3-aminopropyl carbodiimide and N- hydroxysuccinimide reaction by, to form a N- hydroxysuccinimide active ester.

次いで、この活性エステルに、錯化合物形成剤、例えばN‐(5‐アミノ‐1‐カルボキシペンチル)イミノジ酢酸を反応させたのち、可溶性ニッケル塩、例えば硫酸ニッケルの溶液を反応させて、ニッケル錯体を形成させることにより、チャネル表面にニッケル錯体を固定化する。 Then, this active ester, complex compound-forming agent, for example N-(5-amino-1-carboxypentyl) after iminodiacetic acid is reacted, soluble nickel salts, for example by reacting a solution of nickel sulfate, nickel complexes by forming, immobilizing the nickel complex to the channel surface.

このようにして得られるニッケル錯体を表面に結合したマイクロチャネルに、アミノ末端又はカルボキシル末端に連続したヒスチジン残基をもつ酵素分子を接触させると、この酵素分子は、ニッケル錯体を介して簡単にマイクロチャネル表面に固定化される。 The microchannel bound nickel complexes on the surface thus obtained, is brought into contact with the enzyme molecule with histidine residues consecutive amino or carboxyl terminus, the enzyme molecule is easily micro via nickel complex It is immobilized on the surface of the channel.

このようにしてニッケル錯体を介して固定された酵素分子は、還元処理するか、あるいはイミダゾールやEDTAのようなキレート剤で処理することにより、容易に脱離させることができ、固定化及び脱離反応は可逆的であるので、触媒能が低下した場合などには簡単に新らしい酵素分子と交換することができるので有利である。 Thus the enzyme molecules immobilized through a nickel complex, by treatment with a chelating agent such as or reduction treatment, or imidazole or EDTA, can be easily detached, immobilization and desorption because the reaction is reversible, catalytic ability is advantageous because it can be replaced with a simple new guess enzyme molecule such as when dropped.

本発明においては、このようにしてマイクロチャネルの壁面に酵素分子を固定化したユニットの2個又はそれ以上を前のユニットのマイクロチャネルの排出口と後のユニットのマイクロチャネルの導出口とを連結して構成されたマイクロリアクターを用いて連続的な酵素反応を行う。 In the present invention, thus connecting the two or more outlet microchannel of the microchannel unit outlet and after the previous unit of the unit immobilized enzyme molecules on the wall of the microchannel performing a continuous enzymatic reaction using a microreactor that is configured with.

そして、このように酵素を固定したマイクロチャネルをもつ複数のユニットからなるマイクロリアクターを用いて酵素反応を行うと、マイクロチャネルのもつ体積に対する表面積の比率が大きくなるため、従来の方法に比べ、反応効率を著しく向上させることができる。 When thus performing enzymatic reaction using the microreactor comprising a plurality of units having a microchannel with a fixed enzyme, since the ratio of surface area to volume with the microchannel is increased, compared with the conventional methods, the reaction efficiency can be greatly improved.

また、マイクロチャネル表面に酵素分子を可逆的に固定化しているため、反応終了後、反応液から酵素分子を分離、回収することなく、マイクロチャネルに基質となる原料を継続的に供給することにより、多段階の酵素反応を連続的に行うことができる。 Further, since the reversibly immobilized enzyme molecules into the microchannel surface, after completion of the reaction, separating the enzyme molecules from the reaction mixture, it recovered without, by continuously supplying the material as a substrate in the microchannel , it is possible to perform the enzymatic reaction multistage continuously.

本発明によると、生体内で通常行われている多段階の酵素反応を行うことができるので、高効率で各種有機化合物を製造することができる。 According to the present invention, it is possible to carry out the enzymatic reaction multistage being conducted normally in vivo, it is possible to manufacture various kinds of organic compounds with high efficiency.

次に、実施例により本発明を実施するための最良の形態について説明するが、本発明はこれにより何ら限定されるものではない。 Next will be described the best mode for carrying out the present invention through examples, the present invention is thereby not intended to be limited.

セラミックス基板上に、マイクロドリルを用いた機械加工法により、幅200μm、深さ200μm、長さ40cmのチャネルを作製し、ガラス板と接着することにより、マイクロチャネル構造を有するユニットを作製した。 A ceramic substrate, by machining method using a micro-drill, to form a wide channel 200 [mu] m, depth 200 [mu] m, length 40 cm, by bonding a glass plate to prepare a unit having a micro-channel structure.

このようにして得たユニットのチャネル内を先ず濃硫酸と30%過酸化水素水を体積比7:3の割合で混合した液体で約12時間洗い、表面に付着した有機物などの夾雑物を分解、洗浄した。 In this way, the first concentrated sulfuric acid in the channel of the unit obtained 30% hydrogen peroxide in volume ratio of 7: a mixed liquid at a rate of 3 wash about 12 hours, decompose the contaminants such as organic substances adhering to the surface , and washed. 次に超純水で洗浄した後、3‐アミノプロピルトリエトキシシランとメチルトリエトキシシランを質量比2:8の割合で混合したものを95%エチルアルコールに溶解し、体積比で3%とした溶液で処理した。 Then washed with ultrapure water, 3-aminopropyl triethoxysilane and methyl triethoxysilane mass ratio of 2: 8 in a mixing ratio of dissolved in 95% ethyl alcohol, and 3% by volume It was treated with a solution. 1時間後エチルアルコールで洗浄し、窒素ガスを通したのち、115℃に保った乾燥器内で1時間乾燥することにより、表面修飾を行った。 Washed with ethyl alcohol after 1 hour, after which nitrogen gas had been passed through, by drying 1 hour in was kept at 115 ° C. oven and subjected to surface modification.

次いで、このチャネル内に無水コハク酸をN,N‐ジメチルホルムアミドに1ミリモル/リットルの濃度で溶かした溶液を注入し、30分反応させたのち、N,N‐ジメチルホルムアミドで洗浄したのち、さらに1‐エチル‐3(3‐アミノプロピル)カルボジイミドとN‐ヒドロキシスクシンイミドを各々1ミリモル/リットルになるよう混合した溶液をチャネル内に流してN‐ヒドロキシスクシンイミド活性エステルを調製した。 Then, succinic anhydride within this channel N, injecting a solution of a concentration of 1 mmol / l N- dimethylformamide, after reacting for 30 minutes, N, After washing with N- dimethylformamide, further 1-ethyl-3 (3-aminopropyl) the mixed solution so that the carbodiimide and N- hydroxysuccinimide each 1 mmol / l to flow into the channel was prepared N- hydroxysuccinimide active ester.

このようにして、ユニット2個を調製し、それぞれに5mg/リットルの濃度でリン酸緩衝液に溶解したクエン酸リアーゼとオキサロ酢酸脱炭酸酵素の溶液を流通し、それぞれクエン酸リアーゼとオキサロ酢酸脱炭酸酵素を固定化したユニット2個を作製した。 In this manner, the two units were prepared, each circulating a solution of 5mg / l concentration citrate lyase was dissolved in a phosphate buffer at a oxaloacetate decarboxylase, respectively lyase citric acid and oxaloacetic de two units of immobilizing carbonic enzyme was produced. そして、このクエン酸リアーゼを固定化したユニットのマイクロチャネルの排出口とオキサロ酢酸脱炭酸酵素を固定化したユニットのマイクロチャネルの導入孔をシリコンチューブで連結し、これをプランジャーポンプに接続して図1に示す構造のマイクロリアクターを作製した。 Then, the introduction hole of the microchannel of immobilized unit outlet and oxaloacetate decarboxylase microchannels immobilized units the citrate lyase connected by silicone tubing, connect it to the plunger pump to prepare a microreactor having the structure shown in FIG.

次に、このマイクロチャネルに、100ミリモル/リットルに調整したクエン酸ナトリウム緩衝液(pH7.4)に1ミリモル/リットルの塩化マグネシウムを溶解させたものを通し、2段階の酵素反応を行った。 Next, the microchannel, through which was dissolved magnesium chloride of 1 mmol / l to 100 mmol / l sodium citrate buffer adjusted to (pH 7.4), was carried out a two-step enzyme reactions. シリンジポンプでマイクロチャネル内に注入し、得られた反応生成物を高速液体クロマトグラフで分離・分析した。 Was injected into the microchannel by a syringe pump, the reaction product obtained was separated and analyzed by high performance liquid chromatography. 反応時間はチャネル内の滞留時間として評価した。 The reaction time was evaluated as the residence time in the channel. シリンジポンプによる送液速度を変化させて、滞留時間を変化させた結果、毎分10mlの流量において100%の収率でピルビン酸を得た。 By varying the liquid feed rate by syringe pump, as a result of varying the residence time, to yield pyruvate in 100% yield in the flow rate per minute 10 ml.

実施例1と同様の方法で、市販のフューズドシリカマイクロキャピラリー(内径320μm、長さ40cm)のチャネル表面を化学修飾したものを3本作製した。 In the same manner as in Example 1, a commercially available fused silica microcapillary (inner diameter 320 .mu.m, length 40 cm) was produced three to the channel surface obtained by chemical modification of. それぞれのキャピラリーに5mg/リットルの濃度でリン酸緩衝液に溶解したクエン酸リアーゼとオキサロ酢酸脱炭酸酵素とL−乳酸脱水素酵素の溶液を通し、クエン酸リアーゼ2、オキサロ酢酸脱炭酸酵素2´、L−乳酸脱水素酵素2”を固定化したマイクロリアクターを作製し、これを連結してポンプ3に接続して図2に示すマイクロリアクターを作製した。 Each capillary through a solution of 5mg / l concentration citrate lyase was dissolved in a phosphate buffer at a oxaloacetate decarboxylase and L- lactate dehydrogenase, lyase citrate oxaloacetate decarboxylase 2' , L- lactic acid dehydrogenase 2 "to prepare immobilized microreactor, to produce a microreactor shown in Figure 2 and connected to the pump 3 by connecting them.

上記マイクロチャネルに、100ミリモル/リットルに調整したクエン酸ナトリウム緩衝液(pH7.4)に塩化マグネシウム(1ミリモル/リットル)とNADH(110ミリモル/リットル)を溶解させたものを流通させ、3段階の酵素反応を行った。 The microchannel, was circulated which is dissolved magnesium chloride adjusted sodium citrate buffer 100 mmol / l (pH 7.4) and (1 mmol / l) and NADH (110 mmol / l), 3 steps It was carried out of the enzyme reaction. シリンジポンプでマイクロチャネル内に注入し、得られた反応生成物を高速液体クロマトグラフで分離・分析した。 Was injected into the microchannel by a syringe pump, the reaction product obtained was separated and analyzed by high performance liquid chromatography. 反応時間はチャネル内の滞留時間として評価した。 The reaction time was evaluated as the residence time in the channel. シリンジポンプによる送液速度を変化させて、滞留時間を変化させていったところ、毎分10mlの流量において100%の収率でL−乳酸を得た。 By varying the liquid feed rate by syringe pump, it was carried out by varying the residence time, to give the L- lactic acid in 100% yield in the flow rate per minute 10 ml.

実施例2と同様、市販のフューズドシリカマイクロキャピラリー(内径320μm、長さ40cm)のチャネル表面を化学修飾したものを3本作製した。 As in Example 2, a commercially available fused silica microcapillary (inner diameter 320 .mu.m, length 40 cm) was produced three to the channel surface obtained by chemical modification of. それぞれのキャピラリーに5mg/リットルの濃度でリン酸緩衝液に溶解させたクエン酸リアーゼ、オキサロ酢酸脱炭酸酵素とチロシンフェノールリアーゼの溶液を通し、クエン酸リアーゼ、オキサロ酢酸脱炭酸酵素、チロシンフェノールリアーゼを固定化したマイクロリアクターを作製した。 Each capillary 5mg / liter concentration citrate lyase dissolved in phosphate buffer, passed through a solution of oxaloacetate decarboxylase and tyrosine phenol-lyase, citrate lyase, oxaloacetate decarboxylase, tyrosine phenol-lyase It was produced immobilized microreactor.

上記マイクロチャネルに、100ミリモル/リットルに調整したクエン酸ナトリウム緩衝液(pH7.4)に塩化マグネシウム(1ミリモル/リットル)、塩化アンモニウム(110ミリモル/リットル)、フェノール(110ミリモル/リットル)を溶解させたものを流通させ、3段階の酵素反応を行った。 In the micro channel, magnesium chloride adjusted sodium citrate buffer 100 mmol / l (pH 7.4) (1 mmol / l), ammonium chloride (110 mmol / l), dissolve the phenol (110 mmol / l) allowed to flow that is, were 3 stages of enzymatic reaction. シリンジポンプでマイクロチャネル内に注入し、得られた反応生成物を高速液体クロマトグラフで分離・分析した。 Was injected into the microchannel by a syringe pump, the reaction product obtained was separated and analyzed by high performance liquid chromatography. 反応時間はチャネル内の滞留時間として評価した。 The reaction time was evaluated as the residence time in the channel. シリンジポンプによる送液速度を変化させ、滞留時間を変化させた結果、毎分10mlの流量において98%以上の収率でL−チロシンを得た。 Changing the feed rate by syringe pump, as a result of varying the residence time, to give the L- tyrosine in 98% yield in the flow rate per minute 10 ml.

本発明のマイクロリアクターの1例を示す平面図。 Plan view showing an example of the microreactor of the present invention. 実施例2で用いたマイクロリアクターの構造を示す平面図。 Plan view showing a structure of the microreactor used in Examples 2.

符号の説明 DESCRIPTION OF SYMBOLS

1,1´ 基板 2,2´ マイクロチャネル 3 供給ポンプ 1,1' substrate 2,2' microchannel 3 feed pump

Claims (4)

  1. それぞれ異なった酵素を固定化した複数のマイクロチャネルを直列に連結し、それに原料を含む液体媒体を連続的に供給し、複数段階の酵素反応を行わせることを特徴とする多段階酵素反応方法。 A plurality of microchannels immobilized different enzymes respectively connected in series, it the liquid medium containing the raw material was continuously fed, multi-step enzymatic reaction process, characterized in that to perform the enzymatic reaction of a plurality of stages.
  2. 液体媒体が水溶液、有機溶液又は超臨界流体である請求項1記載の多段階酵素反応方法。 Liquid medium solution, multi-stage enzymatic reaction The method of claim 1 wherein the organic solution or a supercritical fluid.
  3. それぞれマイクロチャネル内を表面修飾して異なった酵素を固定化した複数のユニットを直列に連結して構成されたことを特徴とする多段階酵素反応用マイクロリアクター。 Multi-step enzymatic reaction microreactor, characterized in that it is constituted by connecting a plurality of units immobilized different enzymes by surface modifying the microchannel in series.
  4. マイクロチャネルの幅が50〜2000μmの範囲にある請求項3記載の多段階酵素反応用マイクロリアクター。 Multi-step enzymatic reaction microreactor according to claim 3, wherein the width of the microchannel is in the range of 50 to 2000 m.
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