JP2005003909A - Thin layer oblique illumination method of optical system - Google Patents

Thin layer oblique illumination method of optical system

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JP2005003909A
JP2005003909A JP2003166887A JP2003166887A JP2005003909A JP 2005003909 A JP2005003909 A JP 2005003909A JP 2003166887 A JP2003166887 A JP 2003166887A JP 2003166887 A JP2003166887 A JP 2003166887A JP 2005003909 A JP2005003909 A JP 2005003909A
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Makihiro Tokunaga
万喜洋 徳永
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Japan Science & Technology Agency
独立行政法人 科学技術振興機構
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Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a thin layer oblique illuminating method in which highly sensitive detection of materials and molecules is conducted using light beams and an optical system equivalent to a microscope and low background/high sensitivity observation is made using an optical microscope. <P>SOLUTION: Let d be the thickness of illuminating light beams at a sample, θ be an incident angle of the illuminating light beams at the sample, X be the distance from the center axis of the illuminating light beams at a lens back focus surface, ϕ be an incident angle to a lens of the illuminating light beams and δϕ be one half of objective lens opening angle of the illuminating light beams. In an equation which provides the thickness of the illuminating light beams d at the sample d=2r×cosθ, the incident angle θ of the illuminating light beams to the sample is determined by X and ϕ and an illumination radius r at the sample observation surface is determined by δϕ. Thus, the thickness d of the illuminating light beams is reduced by reducing cosθ and r and by changing the illuminating light beams incident position to the lens in accordance with the illuminating light beams incident angle to the sample. <P>COPYRIGHT: (C)2005,JPO&NCIPI

Description

【0001】 [0001]
【発明の属する技術分野】 BACKGROUND OF THE INVENTION
本発明は、物質や分子を光を使って高感度検出する顕微鏡と同等の光学系の薄層斜光照明法に関する。 The present invention relates to a thin-layer oblique illumination method equivalent optical system and microscope to detect high using light materials and molecules sensitivity.
【0002】 [0002]
【従来の技術】 BACKGROUND OF THE INVENTION
従来、物質や分子を光を使って高感度検出する光学顕微鏡の照明技術は種々のものが提案されており、その内の幾つかを以下に説明する。 Conventionally, lighting technology of the optical microscope to detect substances high and with light molecules sensitivity have been proposed various ones, illustrate some of which are described below. 図10は、蛍光顕微鏡の照明として、現在一般的に使われている落射照明方法の概略図である。 Figure 10 is a lighting of a fluorescent microscope, a schematic diagram of a vertical illumination methods which are currently commonly used. 図に示すように、光源からの照射光6を、照射光5は反射し、蛍光は透過させるダイクロイックミラー7で反射させて、対物レンズ4の中央に入射し、オイル3、カバーガラス2を介して試料溶液1でなる試料観察面を照射するものである。 As shown, the illumination light 6 from a light source, the irradiation light 5 reflected, fluorescence is reflected by a dichroic mirror 7 for transmitting incident on the center of the objective lens 4, the oil 3, through the cover glass 2 it is intended to illuminate the sample viewing surface formed in the sample solution 1 Te.
【0003】 [0003]
また、ガラス表面近傍のみを局所的に照明する方法として、全反射照明法がある。 Further, as a method for locally illuminate only the vicinity of the glass surface, there is a total reflection illumination method. 全反射した際に生じるエバネッセント光(深さ100200nm程度)を使って照明するものである。 It is intended to illuminate with the evanescent light (about depth 100200Nm) generated when the totally reflected. プリズムを使う方法と対物レンズを使う方法があるが、図11に対物レンズ型全反射照明法の概略図を示す。 There is a method to use a method and an objective lens using a prism, but shows a schematic view of an objective lens type total reflection illumination method in FIG. 対物レンズ4の開口数をNA、試料溶液1の屈折率をnとしたとき、開口数(NA)がNA>nの式を満たす対物レンズ4により全反射照明が可能となり、エバネッセント光5が得られる。 When the numerical aperture of the objective lens 4 and NA, the refractive index of the sample solution 1 and n, it is possible to total reflection illuminated by the objective lens 4 to the numerical aperture (NA) satisfies the formula NA> n, obtained evanescent light 5 It is. この方法は、従来、極く限られた利用のみであったが、蛍光色素1分子を蛍光顕微鏡で観察する方法として有用であることが判明し、最近では1分子イメージング用に使用され始めている。 This method, conventionally, but was only available for a limited very, found to be useful as a method of observing the fluorescent dye molecule in a fluorescence microscope, and recently started to be used for single molecule imaging.
【0004】 [0004]
更に、本発明者が提案した既に特許されている光照射切り替え方法の概略を図12に示す。 Further, the outline of the light irradiation switching method the present inventors have been proposed already patent shown in FIG. 12. 1は試料溶液、2はカバーガラス、3はオイル、4は対物レンズ(レンズ群)、5は照射光、6は照射光、7はダイクロイックミラーである。 1 sample solution 2 is a cover glass, 3 oil, 4 denotes an objective lens (lens group), 5 irradiation light 6 irradiation light, 7 is a dichroic mirror. 落射照明から全反射照明の状態への変更を、ミラー等の光学部品を図12(A)→12(B)→図12(C)へと移動することのみで実現することができ、余分な光学系を必要とせず、簡単な原理で照射の切替を行えることができる。 Changes to the state of total reflection illuminated from the epi-illumination, an optical component such as a mirror FIG 12 (A) → 12 (B) → only can be achieved by moving 12 to (C), extra does not require an optical system, it is possible to perform the switching of the irradiation with a simple principle. また、この方法では、入射光位置又は光源位置(例えば光ファイバーの出射位置)をずらすことによっても同等の状態変更を実現することができる(特許文献1参照。)。 Further, in this method, it is possible to achieve the same state changes by shifting the incident position of light or light source position (e.g. optical fiber exit position) (see Patent Document 1.).
【0005】 [0005]
また、他の方法として、通常の光学顕微鏡や落射照明法による蛍光顕微鏡において、セクショニング像や3次元画像を得る方法としては、焦点を連続的に変化させて得た連続画像からデコンボリューションによって計算する方法が用いられている。 Further, as another method, the fluorescence microscope by conventional light microscopy and epi-illumination method, as a method of obtaining a sectioning image or 3-dimensional image is calculated from a continuous image obtained by continuously changing the focal by deconvolution methods are used. これは、試料上の1点から出た光の像が、焦点からはずれた時にどうなるかを予め知っておくことにより、計算によって元の3次元像を計算するものであるが、厚みのある試料や、明るい中にある暗い部分を観察する場合には、この方法では限界がある。 Samples This image of light emitted from one point on the sample, by know beforehand what happens when out of focus, but is to compute the original three-dimensional image by a calculation, a thick or, in the case of observing the dark part is in bright, this method is limited.
【0006】 [0006]
また、他の方法として、セクショニング像や3次元画像を用いる方法としては、現在、共焦点顕微鏡法が広く普及している。 Further, as another method, a method using a sectioning image or 3-dimensional image, now, confocal microscopy is widely used. この方法は、高感度カメラに比べると感度が劣っており、特に蛍光試料の観察においては、レーザー光を1点に集光して照射するために、蛍光色素の退色が早くなったり、生物試料に損傷を与えるなどの難点がある。 This method is inferior in sensitivity as compared to highly sensitive camera, in particular a fluorescent sample observation, in order to irradiate condenses laser light on one point, or become quickly fading of fluorescent dyes, biological samples there is a drawback, such as damage to the.
【0007】 [0007]
【特許文献1】 [Patent Document 1]
特許第3093145号公報【0008】 Japanese Patent No. 3093145 [0008]
【発明が解決しようとする課題】 [Problems that the Invention is to Solve
このように、従来の方法では、厚みのある試料や明るい中にある暗い部分の観察において、高感度、高S/N比を得ることができなかった。 Thus, in the conventional method, in the observation of a dark portion that is in the sample or bright a thick, it was not possible to obtain high sensitivity, high S / N ratio. そこで本発明は、顕微鏡と同等の光学系を用いて光を使って物質や分子を高感度検出することを可能とし、光学顕微鏡における低背景・高感度のセクショニング像や3次元画像を得ることにより、高感度観察を可能にする光学系の薄層斜光照明法を提供することを目的とする。 The present invention allows for sensitive detection of substances or molecules with light using a microscope and equivalent optical system by obtaining the sectioning image or a three-dimensional image of the low background and high sensitivity in the light microscope , and to provide a thin layer oblique illumination method of an optical system that allows sensitive observation.
【0009】 [0009]
【課題を解決するための手段】 In order to solve the problems]
上記課題を解決するために、この発明の請求項1に係る光学系の薄層斜光照明法は、対物レンズあるいはコンデンサーレンズ等を用いたレンズ光学系の斜光照明で、試料への照明光入射角度をレンズ光軸に垂直に近くすることにより、薄い層状の光で試料を照明する薄層斜光照明法において、レンズへの照明光入射位置を、試料への照明光入射角度によって決まる値となるように構成した。 In order to solve the above problems, claim thin layer oblique illumination method of an optical system according to 1, a lens optical system oblique illumination of using an objective lens or a condenser lens, the illumination light incident angle to the sample of the present invention the by nearly perpendicular to the lens optical axis, in a thin layer oblique illumination method for illuminating a sample in a thin layer of light, the illumination light incident position on the lens, to be a value determined by the illumination light incident angle to the sample It was constructed in.
【0010】 [0010]
これにより、レンズを用いた斜光照明において、レンズへの照明光入射位置を、試料への照明光入射角度によって決まる値となるようにして照射領域を絞ることにより、薄い層状の光で試料を照明することができ、光学顕微鏡においては、低背景・高感度のセクショニング像や3次元画像を得ることができる。 Thus, the illumination in the oblique illumination using a lens, the illumination light incident position on the lens, by squeezing the irradiation area as a determined value by the illumination light incident angle to the sample, the sample in the thin layer light it can be, in an optical microscope, it is possible to obtain a sectioning image or a three-dimensional image of the low background and high sensitivity.
【0011】 [0011]
この発明の請求項2に係る光学系の薄層斜光照明法は、対物レンズあるいはコンデンサーレンズ等を用いたレンズ光学系の斜光照明で薄い層状の光で試料を照明する薄層斜光照明法において、焦点位置を変えて異なる高さの試料面を観察する場合には、レンズへの照明光入射角度を、試料観察面の高さと試料への照明光入射角度に応じて変えるように構成した。 Thin layer oblique illumination method of an optical system according to claim 2 of the present invention, in a thin layer oblique illumination method for illuminating a sample with light of a thin layer in the lens optical system oblique illumination of using an objective lens or a condenser lens or the like, when changing the focal position to observe the sample surface in different heights, the illumination light incident angle to the lens, and configured to change in accordance with the illumination light incident angle to the height and the sample of the sample viewing surface.
【0012】 [0012]
これにより、レンズの焦点位置を変えて、試料観察面のカバーガラス表面からの高さを変えても、レンズへの照明光の入射角度を試料観察面の高さと試料への照明光入射角度に応じて変えることにより、薄い層状の光で試料を照明することができ、光学顕微鏡においては、低背景・高感度のセクショニング像や3次元画像を得ることができる。 Thus, by changing the focal position of the lens, changing the height from the cover glass surface of the sample observation surface, the illumination light incident angle of the incident angle of the illumination light to the lens sample observation surface in the height and the sample by varying depending on, it is possible to illuminate the sample with a thin layer of light in an optical microscope, it is possible to obtain a sectioning image or a three-dimensional image of the low background and high sensitivity.
【0013】 [0013]
この発明の請求項3に係る光学系の薄層斜光照明法は、上記請求項1又は請求項2記載の光学系の薄層斜光照明法において、前記レンズとして、試料の屈折率よりも開口数が大きいレンズまたは試料の屈折率に起因する収差を補正したレンズを用いる構成した。 Thin layer oblique illumination method of an optical system according to claim 3 of the present invention, in a thin layer oblique illumination method of the optical system of the claim 1 or claim 2, wherein, as said lens, numerical aperture than the refractive index of the sample It was constructed using a lens that corrects aberration caused by the large lens or the refractive index of the sample.
【0014】 [0014]
これにより、レンズの開口数が大きいほど、レンズへの照明入射角度φを大きくすることができ、試料観察面の高さZを大きく、あるいは試料への照明光入射角度θを大きくできるので、その結果として、より高い位置Zまで観察できる、あるいは照明光の厚さを薄く、あるいは照射範囲を広くすることができる。 Accordingly, as the numerical aperture of the lens is large, it is possible to increase the illumination incident angle φ to the lens, increasing the height Z of the sample viewing surface, or because the illumination light incident angle θ to the sample can be increased, the as a result, it is possible to widen the higher position to Z can be observed, or the thickness of the illumination light, or irradiation range. 更に、試料の屈折率よりもレンズの開口数の大きいレンズを用いることにより、この利点をさらに大きくすることができる。 Further, by using the numerical aperture of the large lenses of the lens than the refractive index of the sample can further increase this advantage. そして、試料の屈折率nとレンズ側の屈折率n'の違いは球面収差が生じるが、この収差を補正したレンズを用いることにより薄層斜光照明の性能を良くすることができる。 The difference in refractive index n 'of the refractive index n and the lens side of the sample is spherical aberration occurs, it is possible to improve the performance of the thin layer oblique illumination by using a lens corrected for this aberration.
【0015】 [0015]
この発明の請求項4に係る光学系の薄層斜光照明法は、上記請求項1乃至請求項3記載の光学系の薄層斜光照明法において、カメラ等の受光素子の受光面、あるいは結像レンズを傾けることにより、試料観察面を傾け、斜光照明光と試料観察面を平行若しくはほぼ平行にして観察可能にする構成とした。 Thin layer oblique illumination method of an optical system according to claim 4 of the invention, in the preceding claims thin layer oblique illumination method of an optical system according to claim 3, the light receiving surface of the light receiving element such as a camera or imaging, by tilting the lens, tilting the sample observation surface, and configured to allow observation by the parallel or substantially parallel to oblique illumination light and sample observation surface.
【0016】 [0016]
この発明の請求項5に係る光学系の薄層斜光照明法は、上記請求項1乃至請求項3記載の光学系の薄層斜光照明法において、カメラ等の受光素子の受光面、あるいは結像レンズを傾けることにより、試料観察面を傾け、斜光照明光と試料観察面を平行若しくはほぼ平行にして観察可能にし、試料観察面を傾ける場合に、レンズに入射する照明光の形を細長くすることにより、試料を照明する薄層光を薄くし試料照明範囲を広くする構成とした。 Thin layer oblique illumination method of an optical system according to a fifth aspect of the invention, in the preceding claims thin layer oblique illumination method of an optical system according to claim 3, the light receiving surface of the light receiving element such as a camera or imaging, by tilting the lens, to tilt the sample observation surface allows observation in the parallel or substantially parallel to oblique illumination light and sample observation surface, in the case of tilting the sample viewing surface, elongating the shape of illumination light incident on the lens by and configured to widen the thinned sample illumination range a thin layer of light that illuminates the sample.
【0017】 [0017]
これにより、試料観察面を傾けている場合には、観察視野の大きさは、カバーガラスに平行な面による照明光の断面形状の照明光進行方向の半径には依存せず、垂直な方向の半径によって決まるので、照明光進行方向に垂直な方向の半径は大きくし、照明光進行方向の半径は小さくした細長い形の入射光を用いると、観察視野を狭めることなく、照明光の厚さを薄くすることができる。 Thus, if the tilting of the sample viewing surface, the size of the observation field of view, the radius of the illumination light traveling direction of the cross-sectional shape of the illumination light by the plane parallel to the cover glass independent, vertical direction since determined by the radius, the direction perpendicular radius illumination beam direction is increased, the radius of the illumination light traveling direction when using incident light of elongated shape with a reduced, without narrowing the observation field, the thickness of the illumination light it can be thinned.
【0018】 [0018]
この発明の請求項6に係る光学系の薄層斜光照明法は、上記請求項1乃至請求項3記載の光学系の薄層斜光照明法において、複数の入射光の使用や、回転等による入射位置の移動によって、偏りのない薄層斜光照明を行う構成とした。 Thin layer oblique illumination method of an optical system according to claim 6 of the present invention, in a thin layer oblique illumination method of the optical system of the claims 1 to 3, wherein, use or multiple incident light, the incident due to the rotation or the like by the movement of the position, and configured to perform unpolarized thin layer oblique illumination.
【0019】 [0019]
この発明の請求項7に係る光学系の薄層斜光照明法は、上記請求項1乃至請求項6の光学系が蛍光顕微鏡や暗視野顕微鏡などの光学顕微鏡、対物レンズを用いたレンズ光学系にも適用可能な構成とした。 Thin layer oblique illumination method of an optical system according to claim 7 of the present invention, the optical microscope of the optical system of the claims 1 to 6 and a fluorescent microscope or dark-field microscope, a lens optical system using the objective lens It was also applicable configuration.
【0020】 [0020]
これにより、光学顕微鏡はもとより各種の顕微鏡及び光を用いた検出において、低背景の画像及び低バックグラウンドのシグナルを得ることができる。 Thus, optical microscopy as well in detection using a variety of microscopes and optical, can be obtained a signal of the image and low background of low background. その結果として、高感度・高いS/N比の画像及びシグナルを得ることができる。 As a result, it is possible to obtain an image and signal high sensitivity and high S / N ratio.
【0021】 [0021]
この発明の請求項8に係る光学系の薄層斜光照明法は、蛍光顕微鏡、原子間力顕微鏡、トンネル顕微鏡、又はフォトトンネル顕微鏡の光学系において、薄層光照明を用いた顕微鏡観察を、焦点位置を移動させながら連続画像を得て、デコンボリューションによってセクショニング画像及び3次元画像を得る構成した。 Thin layer oblique illumination method of an optical system according to claim 8 of the present invention, a fluorescence microscope, atomic force microscope, tunneling microscope, or in the optical system of the photo tunneling microscope, the microscope observation using the thin-layer light illumination, focal position to obtain a continuous image while moving the was constructed to obtain the sectioning image and 3-dimensional image by deconvolution.
【0022】 [0022]
これにより、薄層光照明を用いた顕微鏡観察から、焦点位置を移動させながら連続画像を得て、デコンボリューションによってセクショニング画像及び3次元画像を得ることができ、背景光が低く高画質である。 Thus, from the microscopic observation using a thin-layer light illumination, to obtain a continuous image while moving the focal position, it is possible to obtain a sectioning image and 3-dimensional image by deconvolution, a high-quality low background light. また、試料の照明が薄い層状領域のみの局所的であるので、得られる蛍光像を高感度カメラであるイメージングインテンシファイアーCCDによって観察することにより、蛍光色素1分子を可視化できる。 Further, since the illumination of the sample is only localized in the thin layer region, by observing the fluorescence image obtained by the imaging intensifier CCD is highly sensitive camera can be visualized fluorescent dye molecule.
【0023】 [0023]
【発明の実施の形態】 DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
本発明は、対物レンズあるいはコンデンサーレンズ等のレンズを用いたレンズ光学系の斜光照明において、試料を薄い層状の光で照明することにより、照明光のあたる領域が局所的に制限されて、背景光を低くすることができ、高感度で高いS/N比の画像およびシグナルを得ることができることに依拠するものである。 The present invention provides a lens optical system oblique illumination of using the lens such as an objective lens or condenser lens, by illuminating with light of a thin layer sample, a region exposed to the illumination light is locally restricted, the background light can be lowered, it is to rely on being able to obtain an image and signal a high S / N ratio with high sensitivity. 光学系としては蛍光顕微鏡や暗視野顕微鏡などの光学顕微鏡はもとより、レンズを用いたレンズ光学系にも広く適用できるものである。 The optical system the optical microscope such as a fluorescence microscope and dark field microscopy as well as one in which the lens can be widely applied to a lens optical system using a. 次に、本発明の実施形態を図1乃至図9に基づいて以下に詳述する。 Next, detailed below based on the embodiments of the present invention in FIGS. 1-9.
【0024】 [0024]
図1に照明光の厚さを求める原理を示す。 It shows the principle for determining the thickness of the illumination light in FIG. 図において、試料観察面8での照射半径をr、試料1における照明光5の厚さをd、試料1における照明光5の入射角(又は、照明光5とレンズ光軸とのなす角)をθとすると、 In the figure, the incident angle of the illumination light 5 irradiated radius of the sample viewing surface 8 r, the thickness of the illumination light 5 in the sample 1 d, in the sample 1 (or, the angle between the illumination light 5 and the lens optical axis) and it is referred to as θ,
【数1】 [Number 1]
d=2r・cosθ ・・・・・・・(1) d = 2r · cosθ ······· (1)
の関係式により、試料1における照明光5の厚さdを求めることができる。 The relationship can be obtained the thickness d of the illumination light 5 in the sample 1.
【0025】 [0025]
図2に光学系の対物レンズに関連する部分拡大図を示す。 It shows a partial enlarged view relating to the objective lens of the optical system in FIG. 図において、1は試料媒体(溶液等)、2はカバーガラス、3はオイル、4はレンズ(レンズ群)、5は照射光である。 In FIG, 1 is a sample medium (solution or the like), the second cover glass, 3 oil, 4 lenses (lens group), 5 is irradiation light. 光源からの照射光はダイクロイックミラー(図示なし)で直角に屈折されて照射光5となり、オイル3、カバーガラス2を経て試料媒体1に斜光照明される。 Irradiating light from the light source is illuminated obliquely to the sample medium 1 through the dichroic mirror is refracted at a right angle (not shown) with the irradiation light 5, and the oil 3, a cover glass 2.
【0026】 [0026]
図2において、試料1における照明光5の厚さをd、試料1における照明光5の入射角をθ、レンズ4への照明光入射位置、即ち、レンズ後焦点面9における照明光5のレンズ光軸からの距離をX、照明光5のレンズへの入射角をφ、照明光のレンズ入射の開き角の半分をδφとすると、試料1における照明光5の厚さdを与える式 d=2r・cosθにおいて、試料への照明光の入射角θはXによって決まり、試料観察面での照射半径rはδφによって決まる値であることがわかる。 2, the illumination light incident position of the thickness of the illumination light 5 in the sample 1 d, the incident angle of the illumination light 5 in the sample 1 theta, to the lens 4, i.e., the lens of the illumination light 5 in the lens rear focal plane 9 When the distance from the optical axis X, the angle of incidence of the illumination light 5 lenses phi, half the opening angle of the lens incidence of the illumination light and .delta..phi, wherein providing the thickness d of the illumination light 5 in the sample 1 d = in 2r · cos [theta], the incident angle θ of the illumination light to the sample depends on X, irradiation radius r of the sample viewing surface is found to be a value determined by .delta..phi. 従って、照明光の厚さdを薄くすることは、cosθおよびrを小さくすることに より実現できる。 Therefore, reducing the thickness d of the illumination light can more realized in reducing the cosθ and r.
【0027】 [0027]
cosθを小さくするには、θを90度に近づければ良いが、そのためにXを大きくする。 To reduce the cosθ may be brought closer to θ to 90 degrees, but a larger X for that. 即ち、対物レンズの縁に光を入射し、試料において対物レンズ光軸と垂直に近い角度で斜光照明をおこなう。 That is, the light incident on the edge of the objective lens, performing oblique illumination at an angle nearly perpendicular with the objective lens optical axis in a sample.
【0028】 [0028]
試料観察での照射半径rは、レンズへ4の入射の開き角2δφにより調節されるので、照射半径rを小さくするためには、δφを小さくすれば良い。 Irradiation radius r of the sample observation, because it is regulated by the opening angle 2δφ 4 incident to the lens, in order to reduce the irradiation radius r may be reduced .delta..phi. その際、rを小さくすると観察視野が狭められるので、観察視野の許す範囲において、rを小さくする必要がある。 At that time, since the observation field and to reduce the r is narrowed, the extent permitted by the observation field, it is necessary to reduce the r.
【0029】 [0029]
また、試料1の屈折率をn、レンズの焦点距離をfとすると、試料1への照明光入射角θの照明は、レンズ4への照明光入射位置Xを次の関係式によって決まる値とすることにより得られる。 Further, when the refractive index of the sample 1 n, the focal length of the lens is f, the illumination of the illumination light incident angle θ of the sample 1, and the value determined illumination light incident position X of the lens 4 by the following equation It can be obtained by. 従って、レンズ4への照明光入射位置Xを、試料1への照明光入射角度θによって決まるようにする必要がある。 Therefore, the illumination light incident position X of the lens 4, it is necessary to depend on the illumination light incident angle θ of the sample 1.
【数2】 [Number 2]
X=nf・sinθ ・・・・・・・(2) X = nf · sinθ ······· (2)
尚、(2)式は理論的な式であり、実際的にはレンズ毎に補正した関係を用いる。 Note that (2) is a theoretical equation, in practice using the correction relationship for each lens.
【0030】 [0030]
こうして、レンズを用いた斜光照明において、試料への照明光入射角度をレンズ光軸に垂直に近い角度にし、照射領域を絞ることにより、薄い層状の光で試料を照明することができ、かつ、レンズへの照明光入射位置を、試料への照明光入射角度θによって決まるようにする。 Thus, in oblique illumination with a lens, the illumination light incident angle to the sample to an angle nearly perpendicular to the lens optical axis, by squeezing the irradiation region, it is possible to illuminate the sample with a thin layer of light, and, the illumination light incident position on the lens, so as determined by the illumination light incident angle θ to the sample. そして、光学顕微鏡においては、低背景・高感度のセクショニング像や3次元画像を得ることができる。 Then, the optical microscope can obtain a sectioning image or a three-dimensional image of the low background and high sensitivity.
【0031】 [0031]
次に、レンズの焦点位置を変えて、試料観察面のカバーガラス表面からの高さZを変える場合について図3を参照して説明する。 Next, by changing the focal position of the lens, with reference to FIG. 3 will be described when changing the height Z from the cover glass surface of the sample viewing surface. 図3(A)はレンズ4への照明光5の入射角φでは、試料観察面8のカバーガラス2表面からの高さはZであることを示す。 In FIG. 3 (A) the angle of incidence of the illumination light 5 to the lens 4 phi, the height from the cover glass 2 the surface of the sample viewing surface 8 indicates a Z.
【0032】 [0032]
図3(B)はレンズ4への照明光5の入射角が(φ+△φ)では、試料観察面8のカバーガラス表面からの高さは(Z+△Z)となることを示す。 FIG. 3 (B) the incidence angle of the illumination light 5 to the lens 4 (φ + △ φ), the height from the cover glass surface of the sample viewing surface 8 shows that the (Z + △ Z). それ故、レンズ4の焦点位置を変えてもレンズへの照明光5の入射角φを変えることにより、同じ入射角θで試料1を照明することができる。 Therefore, by also changing the focus position of the lens 4 changes the angle of incidence φ of the illumination light 5 to the lens, it is possible to illuminate the sample 1 at the same angle of incidence theta.
【0033】 [0033]
試料観察面8の高さZが小さい時は、レンズへの照明光入射角度φは0度のままでも薄層照明が可能である。 When the height Z of the sample viewing surface 8 is small, the illumination light incident angle φ of the lens are possible even thin layer illumination remains 0 degrees. また、レンズへの照明光入射角度φを調整することにより、試料観察面8の高さZを大きく、あるいは試料への照明光入射角度θを大きく、照明光の厚みdを薄く、または照射範囲(直径2r)を広くすることが可能となる。 Further, by adjusting the illumination light incident angle φ to the lens, increasing the height Z of the sample observation surface 8, or increase the illumination light incident angle θ to the sample, reducing the thickness d of the illumination light or illumination range, it is possible to increase the (diameter 2r).
【0034】 [0034]
そして、高さZの試料面を観察する場合の照明は、レンズへの照明光入射角度φを、試料への照明光入射角度θ、レンズ焦点距離f、試料の屈折率n、レンズ側の屈折率n'とレンズの特性とによって決まる数値をkとすると、実際的には、1次近似によりφをZに比例させる次の式で得られる。 The illumination in the case of observing a sample surface height Z is the illumination light incident angle φ to the lens, the illumination light incident angle θ to the sample, the lens focal length f, the refractive index of refraction n, the lens side of the sample When a numerical value determined by the characteristics of the rate n 'between the lens and k, in practice, obtained with φ by first order approximation by the following equation to be proportional to Z.
【数3】 [Number 3]
φ=k・Z ・・・・・・・・(3) φ = k · Z ········ (3)
より精度の高い数値が必要とされる場合には、2次以上の近似の関係式を用いることにする。 If a value higher precision is required, to the use of the second or higher approximation equation.
【0035】 [0035]
開口数の大きいレンズを用いるほど照明光を薄くできるが、試料の屈折率nよりも開口数NAが大きいレンズを用いて、試料への照明光入射角度を更に光軸に垂直に近くすることで、より薄い光で照明することができる。 As used numerical aperture larger lenses can reduce the illumination light, but by using a lens numerical aperture NA is larger than the refractive index n of the sample, more nearly perpendicular to the optical axis of the illumination light incident angle to the sample , it can be illuminated with more thin light. レンズの開口数NAが大きいほど、図2において照射光入射範囲Xを大きくすることができ、照明光の入射角θが大きくなるので、その結果として、照明光の厚さdを薄く、あるいは照射光照射範囲2rを広くすることができる。 As the numerical aperture NA of the lens is large, it is possible to increase the irradiation light incidence range X in FIG. 2, the incident angle of the illumination light θ becomes larger, as a result, reduce the thickness d of the illumination light, or radiation it is possible to increase the light irradiation range 2r.
【0036】 [0036]
また、レンズの開口数が大きいほど、レンズへの照明入射角度φを大きくすることができるので、(3)式により、試料観察面8の高さZを大きく、あるいは試料1への照明光入射角度θを大きくできるので、その結果として、より高い位置Zまで観察できる、あるいは照明光の厚さdを薄く、あるいは照射範囲2rを広くすることができる。 Further, as the numerical aperture of the lens is large, it is possible to increase the illumination incident angle φ to the lens, (3), the illumination light incident height Z of the sample observing surface 8 increases, or to the sample 1 since the angle θ can be increased, as a result, it is possible to widen the higher position to Z can be observed, or decreasing the thickness d of the illumination light, or irradiation range 2r.
【0037】 [0037]
更に、試料の屈折率よりもレンズの開口数の大きいレンズを用いることにより、この利点をさらに大きくすることができる。 Further, by using the numerical aperture of the large lenses of the lens than the refractive index of the sample can further increase this advantage. そして、試料の屈折率nとレンズ側の屈折率n'の違いは球面収差が生じるが、この収差を補正したレンズを用いることにより薄層斜光照明の性能を良くすることができる。 The difference in refractive index n 'of the refractive index n and the lens side of the sample is spherical aberration occurs, it is possible to improve the performance of the thin layer oblique illumination by using a lens corrected for this aberration.
【0038】 [0038]
次に、カメラ等の受光素子の受光面を傾ける場合、あるいは結像レンズを傾ける場合について図4を参照して説明する。 Then, when tilting the light receiving surface of the light receiving element such as a camera, or with reference to FIG. 4 will be described tilting the imaging lens. 図4において、1は試料媒体(溶液等)、2はカバーガラス、3はオイル、4はレンズ(レンズ群)、5は照射光、8は試料観察面、9は結像レンズ、10はカメラ等の受光素子11である。 4, 1 is a sample medium (solution or the like), 2 cover glass, 3 oil, the fourth lens (lens group), 5 irradiated light, 8 sample observation plane, the imaging lens 9, the camera 10 it is a light-receiving element 11 and the like. 図では、レンズ系を単純化して描いているが、実際には中間にレンズ群が入って構成されている。 In the figure, although drawn to simplify the lens system, in fact it is constituted by a lens group that contains in the middle.
【0039】 [0039]
図4(A)はカメラ等の受光素子10の受光面を傾けることにより、試料観察面8を傾け、斜光照明光5と試料観察面8を平行、若しくはほぼ平行にして観察することができることを示している。 By tilting the FIG. 4 (A) a light receiving surface of the light receiving element 10 such as a camera, tilting the sample viewing surface 8, to be able to observe the oblique illumination light 5 and a sample viewing surface 8 parallel or in substantially parallel shows.
【0040】 [0040]
また、図4(B)は結像レンズ9を傾けることにより、試料観察面8を傾け、斜光照明光5と試料観察面8を平行もしくはほぼ平行にして観察することができることを示している。 Moreover, by tilting the FIG. 4 (B) an imaging lens 9, tilting the sample observation surface 8, it shows that the oblique illumination light 5 and a sample viewing surface 8 can be observed in the parallel or substantially parallel. 結像レンズ9を傾ける方法では、中間の光学系の変更によっても同等のことを行うことができる。 In the method of tilting the imaging lens 9, it is possible to perform the same thing by changing the intermediate optical system.
【0041】 [0041]
更に、図4(A)の試料観察面8を傾ける場合に、対物レンズ4に入射する照明光の形を細長くし、試料を照明する薄層光をさらに薄くすることができる。 Furthermore, when tilting the sample viewing surface 8 of FIG. 4 (A), elongated in the form of the illumination light incident on the objective lens 4, it is possible to further thin the thin layer light illuminating the sample. このことを図5を参照して説明する。 This will be described with reference to FIG. 5. 符号は上述の例と同一である。 Code is identical to the above example.
【0042】 [0042]
図5(A)は図2と同じ構成であるので説明は省略する。 FIG. 5 (A) Description is omitted of the same configuration as FIG. 図5(B)は試料領域の照射光を上側からみた拡大図である。 Figure 5 (B) is an enlarged view of the irradiation light of the sample area from the upper side. 照明光の厚さdを与える式 d=2r・cosθにおける、rはカバーガラスに平行な面による照明光の断面形状の、照明 光進行方向の半径である。 In the formula d = 2r · cos [theta] to give a thickness d of the illumination light, r is the cross-sectional shape of the illumination light by the plane parallel to the cover glass, an illumination beam direction of the radius. 試料観察面を傾けている場合には、観察視野の大きさはrには依存せず、rに垂直な方向の半径r'によって決まる。 If you are inclined sample viewing surface, the size of the observation field is independent of r, depends on the radius r 'in the direction perpendicular to r. 従って、r'は大きくし、rは小さくした細長い形の入射光を用いると、観察視野を狭めることなく、照明光の厚さdを薄くすることができる。 Therefore, r 'and large, r is the use of the incident light of an elongate shape with a reduced, without narrowing the observation field, it is possible to reduce the thickness d of the illumination light.
【0043】 [0043]
こうして、薄層光照明を用いた顕微鏡観察から、焦点位置を移動させながら連続画像を得て、デコンボリューションによってセクショニング画像及び3次元画像を得ることができる。 Thus, it is possible from the microscopic observation using a thin-layer light illumination, to obtain a continuous image while moving the focal position to obtain a sectioning image and 3-dimensional image by deconvolution. そして、本発明によると従来法とは違って、背景光が低く高画質であることに加え、試料の照明が薄い層状領域のみの局所的である。 Then, unlike the conventional method according to the present invention, in addition to the background light is high quality low, local illumination of the sample is thin layer region only.
【0044】 [0044]
それ故に、試料観察面近傍の領域のみをデコンボリューションの計算対象とすれば良いという計算上・画質上ともに大きな利点がある。 Therefore, there are both significant advantages over computationally-quality that may be only the area of ​​the sample observing the vicinity of the deconvolution with the calculation. 従って、厚みのある試料の観察、明るい中にある暗い部分の観察、1分子観察のような高感度観察の、セクショニング画像及び3次元画像を行うことを可能にする。 Thus, observation of a thick specimen, the observation of the dark portion that is in a bright, high-sensitivity observation such as 1 molecule observation makes it possible to perform the sectioning image and 3-dimensional images.
【0045】 [0045]
更に、図6のように、複数の入射光または回転対称な入射光の使用や、回転等による入射位置の移動によって、複数の照明光5,5'が得られ、偏りのない薄層光照明を行うことができる。 Furthermore, as shown in FIG. 6, use or multiple incident or rotationally symmetrical incident light, by moving the incident position by rotation or the like, a plurality of the illumination light 5, 5 'is obtained, unpolarized thin layer illumination It can be performed.
【0046】 [0046]
次に、本発明を適用して蛍光顕微鏡に薄層斜光照明法を用いた例を図7に示す。 Next, an example of using the applied fluorescent microscope of the present invention a thin layer oblique illumination method shown in FIG. 図において、符号は上述の例と同一物のものには同一符号を付しており、11は受光素子(カメラ)、12は光学フィルタ、13はミラー、14は集光用レンズ、Rは照明レーザー光の可変絞りの内径である。 In the figure, reference numerals to those of the above example the same material are denoted by the same reference numerals, 11 light-receiving element (camera) 12 is an optical filter, 13 a mirror, 14 converging lens, R represents illumination it is the inner diameter of the variable throttle of the laser beam. レーザー光を照明光として用い、集光用レンズ14によってレンズ4の後焦点面9にレーザー光を集光し、試料1における照明光を平行光にする。 Using laser light as illumination light, converging the laser beam is condensed by the optical lens 14 to the focal plane 9 of the lens 4 into parallel light illumination light in the sample 1.
【0047】 [0047]
可変絞り径Rを変えて入射開き角2δφを変化させ、照射半径rを調節する。 Changing the variable aperture diameter R by changing the incident angle of aperture 2Derutafai, adjusting the irradiation radius r. ミラー13と集光用レンズ14を一体としてtx方向に移動させることにより、入射位置Xを調節する。 By moving the tx direction mirror 13 and the condenser lens 14 integrally, to adjust the incident position X. 次に、ミラー13へのレーザー光の入射位置をtφ方向に移動すると、集光用レンズ14を通過後の光路の傾きが変化するので、tφによってレンズ4への入射角φを調節する。 Then, moving the incident position of the laser beam to the mirror 13 in Tifai direction, the inclination of the optical path after passing through the converging lens 14 is changed, to adjust the incident angle φ of the lens 4 by Tifai. 以上の調節によって、試料1における照明光の層の厚さ d=2r・cosθを数ミクロンに設定することができる。 By adjustment of the above, the thickness d = 2r · cosθ layers of the illumination light in the sample 1 can be set to several microns.
【0048】 [0048]
実施例を挙げると、油浸100倍 NA1.4の対物レンズを用い、試料観察面における照射領域の直径2r=30μmの時、試料における入射角θ=80.4°でd=5μm、入射角θ=84.3°でd=3μmとなる。 As in Examples, using an objective lens of the oil immersion 100x NA1.4, when the diameter 2r = 30 [mu] m of the irradiation area on the sample viewing surface, d = 5 [mu] m at an incident angle theta = 80.4 ° in the sample, the incident angle the d = 3 [mu] m at θ = 84.3 °. 油浸60倍 NA1.4の対物レンズを用い、試料観察面における照射領域の直径2r=45μmの時、試料における入射角θ=86.2°でd=3μmとなる。 Using an objective lens of the oil immersion 60x NA1.4, when the diameter 2r = 45 [mu] m of the irradiated area in the sample observation plane, and d = 3 [mu] m at an incident angle theta = 86.2 ° in the sample.
【0049】 [0049]
こうして、薄層斜光照明によって得られる蛍光像を、高感度カメラであるイメージングインテンシファイアーCCDによって観察することにより、蛍光色素1分子を可視化できる。 Thus, the fluorescence image obtained by thin layer oblique illumination, by observing the imaging intensifier CCD is highly sensitive camera can be visualized fluorescent dye molecule.
【0050】 [0050]
また、他の適用例として、蛍光顕微鏡において、試料観察面を傾け、照明光を細長くし、高NA対物レンズを用いて、薄層照明光を薄くする例を説明する。 As another application example, in fluorescence microscopy, tilting the sample viewing surface, and elongated illumination light, using a high NA objective lens, an example thinning the thin layer illumination light. 図7の蛍光顕微鏡において、図4(B)の結像レンズを傾ける方法により試料観察面を傾け、図5の細長い照明光を使う方法を用いる。 In fluorescence microscopy in Fig. 7, tilting the sample observation surface by the method of tilting the imaging lens of FIG. 4 (B), using a method of using an elongate illumination light of FIG.
【0051】 [0051]
カバーガラスでの照明光の断面形状は、短径2r=30μm、長径2r'=100μmにする。 The cross-sectional shape of the illumination light with a cover glass, minor 2r = 30 [mu] m, to the long diameter 2r '= 100 [mu] m. このようにすれば、1辺100μmの観察視野を得ることができ、観察視野を狭めることなく、照明光の厚みを薄くできる。 Thus, it is possible to obtain the observation field of one side 100 [mu] m, without narrowing the observation field can reduce the thickness of the illumination light.
【0052】 [0052]
式 d=2r・cosθから、試料における照明光の層の厚さdは、油浸60倍 NA1.4の対物レンズを用いると、2r=30μm、試料における照明光の入射角θ=86°でd=2μmとなる。 From the equation d = 2r · cos [theta], the thickness d of the layer of the illumination light in a sample, using the objective lens of the oil immersion 60x NA1.4, 2r = 30μm, at an incident angle theta = 86 ° of the illumination light in the sample d = the 2μm. 但し、厚さdが光の波長(可視光で0.4〜0.7μm)に近くなるため、回折現象により光の層の上下に光の広がりが見られ始める。 However, since the thickness d becomes closer to the wavelength of light (0.4~0.7Myuemu visible light), it starts the spread of light was observed at the upper and lower optical layer by the diffraction phenomenon.
【0053】 [0053]
更に、NAの大きい油浸60倍 NA1.45の対物レンズを用いると、試料における入射角θ=87.9°、即ち、カバーガラスとのなす角が3°となり、照明光とカバーガラスとがほとんど平行になる。 Furthermore, the use of larger oil immersion 60x NA1.45 objective lens of NA, the incident angle theta = 87.9 ° in the sample, i.e., the angle becomes the 3 ° of the cover glass, the illuminating light and the cover glass It becomes almost parallel. このように平行に近づけることにより、結像レンズを傾けることによる画質への影響が無視できるようになる。 By thus close parallel, the influence on the picture quality by tilting the imaging lens becomes negligible. 光の厚さdに関しては、理論的には2μmより薄くなるが、回折光による厚みの広がりも強くなる。 With respect to the thickness d of the light, but thinner than 2μm theoretically, even stronger extent in the thickness due to the diffracted light.
【0054】 [0054]
本発明の光学系の薄層斜光照明と従来の斜光照明法による照明光の厚みを実測比較すると、図8の表に示すように、例えば開口数NA=1.4の対物レンズを用いた場合、従来の斜光照明法による照明光の厚みの約半分の厚みが得られた。 When a thin layer oblique illumination and the thickness of the illumination light by the conventional oblique illumination method of the optical system is measured compared to the present invention, as shown in the table of FIG. 8, for example, when using an objective lens of numerical aperture NA = 1.4 , about half the thickness of the thickness of the illumination light by the conventional oblique illumination method is obtained.
【0055】 [0055]
図9には、レンズへの照明入射角度と試料観察面の高さとの関係を例示したものであり、グラフ中の数値2rは、試料観察面での照射領域の直径である。 FIG 9 is an illustration of a relationship between the height of the illumination incident angle and the sample observation surface to the lens, numerical 2r in the graph is the diameter of the irradiation area on the sample viewing surface. 図9(A)は油浸100倍 NA1.4の対物レンズを用い、照明光の厚みd=3μmの例である。 Figure 9 (A) is using an objective lens of the oil immersion 100x NA1.4, an example of a thickness d = 3 [mu] m of the illumination light. 図9(B)は油浸60倍 NA1.4の対物レンズを用い、照明光の厚みd=3μmの例である。 Figure 9 (B) is using an objective lens of the oil immersion 60x NA1.4, an example of a thickness d = 3 [mu] m of the illumination light. 図9(C)は油浸60倍 NA1.4の対物レンズを用い、照明光の厚みd=5μmの例である。 Figure 9 (C) is using an objective lens of the oil immersion 60x NA1.4, an example of a thickness d = 5 [mu] m of the illumination light.
【0056】 [0056]
本発明の薄層斜光照明法を用いた蛍光顕微鏡観察によって、細胞内においても明瞭な1分子イメージングが実現した。 By thin layer oblique illumination method fluorescence microscopy using the present invention, clear single-molecule imaging even in cells was achieved. その結果、分子1個の動きや変化を直接観察できるようになった。 As a result, it has become possible to observe a single movement or change molecules directly. それと共に、分子1個の蛍光強度を得ることによって、蛍光強度から細胞内における分子数を定量することも実現できた。 At the same time, by obtaining a single fluorescence intensity molecule, it was also achieved by quantifying the number of molecules in cells from the fluorescence intensity. 更に、分子数の定量から細胞内における分子間相互作用の結合分子数と結合の強さを求めることを実現できた。 Furthermore, it was realized that for obtaining the strength of coupling the determination of the number of molecules with binding number of molecules of molecular interactions in the cell.
【0057】 [0057]
現在、ナノテクノロジーのバイオへの応用が強い興味を集めているが、1分子レベルの高感度検出を可能にする本発明の薄層斜光照明法は、この分野における重要な要素技術になるものと考えられる。 Currently, application to nanotechnology biotechnology has attracted great interest, thin layer oblique illumination method of the present invention allows sensitive detection of one molecule level, and shall become the important features of this area Conceivable. また、顕微鏡技術としても、新しい顕微鏡法として発展することが期待される。 Further, even microscopic techniques, it is expected to develop as a new microscopy.
【0058】 [0058]
【発明の効果】 【Effect of the invention】
以上のように、本発明の光学系の薄層斜光照明法は、対物レンズを用いた斜光照明において、薄い層状の光で試料を照明することにより、光学顕微鏡はもとより各種の顕微鏡及び光を用いた検出において、低背景の画像及び低バックグラウンドのシグナルを得ることができる。 As described above, a thin layer oblique illumination method of the optical system of the present invention, use in oblique illumination using an objective lens, by illuminating the sample with a thin layer of light, optical microscopy as well various microscopes and optical in detection had, it is possible to obtain signals for images and low background of low background. その結果として、高感度・高いS/N比の画像及びシグナルを得ることができる。 As a result, it is possible to obtain an image and signal high sensitivity and high S / N ratio.
【0059】 [0059]
また、薄層光照明を用いた顕微鏡観察から、焦点位置を移動させながら連続画像を得て、デコンボリューションによってセクショニング画像及び3次元画像を得ることができ、背景光が低く高画質である。 Further, the microscopic observation using a thin-layer light illumination, to obtain a continuous image while moving the focal position, it is possible to obtain a sectioning image and 3-dimensional image by deconvolution, a high-quality low background light. また、試料の照明が薄い層状領域のみの局所的であるので、得られる蛍光像を高感度カメラで観察することにより、蛍光色素1分子を可視化できると共に、分子1個の蛍光強度を得ることによって、蛍光強度から細胞内における分子数を定量することも実現できる。 Further, since the illumination of the sample is only localized in the thin layer region, by observing the fluorescence image obtained by the high-sensitive camera, a fluorescent dye molecule with can be visualized, by obtaining a single fluorescence intensity molecule , it can be realized quantifying the number of molecules in cells from the fluorescence intensity. 更に、分子数の定量から細胞内における分子間相互作用の結合分子数と結合の強さを求めることを実現できる。 Furthermore, it is possible to realize the determination of the strength of the bond from the determination of the number of molecules with binding number of molecules of molecular interactions in the cell.
【図面の簡単な説明】 BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS
【図1】本発明の照明光の厚さを求める原理図。 Principle diagram for determining the thickness of the illumination light of the present invention; FIG.
【図2】光学系の対物レンズに関連する部分拡大図。 Figure 2 is a partial enlarged diagram associated to the optical system of the objective lens.
【図3】対物レンズの焦点位置を変える方法の概略図。 3 is a schematic diagram of a method of changing the focal position of the objective lens.
【図4】受光素子の受光面あるいは結像レンズを傾ける方法の概略図。 Figure 4 is a schematic diagram of a method of inclining the light receiving surface or the image forming lens of the light receiving element.
【図5】対物レンズに入射する照明光の形を細長くする方法の概略図。 Figure 5 is a schematic diagram of a method of elongated shape of the illumination light incident on the objective lens.
【図6】複数の入射光または回転対称な入射光を使用する方法の概略図。 Figure 6 is a schematic diagram of a method of using a plurality of incident light or rotationally symmetrical incident light.
【図7】蛍光顕微鏡の薄層斜光照明法の概略図。 Figure 7 is a schematic diagram of a fluorescence microscopy thin layer oblique illumination method.
【図8】本発明方法と従来方法の照明光の厚さの比較表。 [8] Comparison of the thickness of the illumination light of the present invention a method and a conventional method.
【図9】レンズへの照明入射角度と試料観察面の高さとの関係図。 [9] relationship diagram between the height of the illumination incident angle and the sample observation surface to the lens.
【図10】従来の蛍光顕微鏡の落射照明法の概略図。 Figure 10 is a schematic view of epi-illumination method of conventional fluorescent microscope.
【図11】従来の対物レンズ型全反射照明法の概略図。 Figure 11 is a schematic diagram of a conventional objective lens type total reflection illumination method.
【図12】光照射切り替え方法の概略図。 Figure 12 is a schematic view of a light irradiation switching method.
【符号の説明】 DESCRIPTION OF SYMBOLS
1 試料媒体(溶液等) 1 sample medium (solution or the like)
2 カバーガラス3 オイル4 対物レンズ(レンズ群) 2 cover glass 3 Oil 4 objective lens (lens group)
5,6 照射光7 ダイクロイックミラー8 試料観察面9 結像レンズ10 5,6 irradiation light 7 dichroic mirror 8 sample viewing surface 9 forming lens 10
11 受光素子(カメラ) 11 light-receiving element (camera)
12 光学フィルタ13 ミラー14 集光用レンズ 12 the optical filter 13 mirror 14 light collecting lens

Claims (8)

  1. 対物レンズあるいはコンデンサーレンズ等を用いたレンズ光学系の斜光照明で、試料への照明光入射角度をレンズ光軸に垂直に近くすることにより、薄い層状の光で試料を照明する薄層斜光照明法において、レンズへの照明光入射位置を、試料への照明光入射角度によって決まる値とすることを特徴とする光学系の薄層斜光照明法。 A lens optical system oblique illumination of using an objective lens or a condenser lens or the like to close vertically illumination light incident angle to the sample lens optical axis, a thin layer oblique illumination method for illuminating a sample in a thin layer optical in thin layer oblique illumination method of the optical system, characterized in that the illumination light incident position on the lens, the value determined by the illumination light incident angle to the sample to.
  2. 対物レンズあるいはコンデンサーレンズ等を用いたレンズ光学系の斜光照明で薄い層状の光で試料を照明する薄層斜光照明法において、焦点位置を変えて異なる高さの試料面を観察する場合には、レンズへの照明光入射角度を、試料観察面の高さと試料への照明光入射角度に応じて変えることを特徴とする光学系の薄層斜光照明法。 In the thin layer oblique illumination method for illuminating a sample with a thin layer of light by the lens optical system oblique illumination of using an objective lens or a condenser lens or the like, in the case of observing a sample surface of different heights by changing the focus position, the illumination light incident angle to the lens, a thin layer oblique illumination method of the optical system, characterized in that vary depending on the illumination light incident angle of the sample observation surface to the height and the sample.
  3. 前記レンズとして、試料の屈折率よりも開口数が大きいレンズまたは試料の屈折率に起因する収差を補正したレンズを用いることを特徴とする請求項1又は請求項2記載の光学系の薄層斜光照明法。 As the lens, a thin layer oblique optical system of claim 1 or claim 2, wherein the use of aberration lens corrected due to the refractive index of greater lens or sample numerical aperture than the refractive index of the sample illumination method.
  4. カメラ等の受光素子の受光面、あるいは結像レンズを傾けることにより、試料観察面を傾け、斜光照明光と試料観察面を平行若しくはほぼ平行にして観察可能にすることを特徴とする請求項1乃至請求項3記載の光学系の薄層斜光照明法。 Receiving surface of the light receiving element such as a camera, or by tilting the imaging lens according to claim 1, characterized in that tilting the sample viewing surface, to allow observation by the parallel or substantially parallel to oblique illumination light and sample observation surface or thin layer oblique illumination method of an optical system according to claim 3.
  5. 試料観察面を傾ける場合に、レンズに入射する照明光の形を細長くすることにより、試料を照明する薄層光を薄くし試料照明範囲を広くすることを特徴とする請求項4記載の光学系の薄層斜光照明法。 When tilting the sample observation surface, by elongated shape of the illumination light incident on the lens, the optical system according to claim 4, characterized in that widening the thinned sample illumination range a thin layer of light that illuminates the sample a thin layer of oblique illumination method.
  6. 複数の入射光の使用や、回転等による入射位置の移動によって、偏りのない薄層斜光照明を行うことを特徴とする請求項1乃至請求項3記載の光学系の薄層斜光照明法。 Use or multiple incident light, by moving the incident position by rotation or the like, a thin layer oblique illumination method of the optical system of claims 1 to 3, wherein the performing unpolarized thin layer oblique illumination.
  7. 光学系が蛍光顕微鏡や暗視野顕微鏡などの光学顕微鏡、対物レンズを用いたレンズ光学系であることを特徴とする請求項1乃至請求項6記載の光学系の薄層斜光照明法。 The optical microscope of the optical system and a fluorescent microscope or dark-field microscope, a thin layer oblique illumination method of the optical system of claims 1 to 6, wherein the a lens optical system using the objective lens.
  8. 薄層光照明を用いた顕微鏡観察において、焦点位置を移動させながら連続画像を得て、デコンボリューションによってセクショニング画像及び3次元画像を得ることを特徴とする請求項7記載の光学系の薄層斜光照明法。 In microscopic observation using the thin-layer light illumination, to obtain a continuous image while moving the focus position, a thin layer of an optical system according to claim 7, characterized in that to obtain a sectioning image and 3-dimensional image by deconvolution oblique illumination method.
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