JP2004535801A - 筋特異的発現ベクター - Google Patents
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Abstract
本発明は、筋肉またはミオサイトでの持続性発現を達成するために有用な筋特異的なエンハンサーおよびプロモーター要素の新規の組み合わせを目的とする。筋特異的プロモーター要素は、筋肉クレアチン・キナーゼ・プロモーター、トロポニンIプロモーター、骨格α-アクチン・プロモーター、またはデスミン・プロモーターに由来する。筋特異的エンハンサー要素は、トロポニンI内部調節要素、筋肉クレアチン・キナーゼ・エンハンサー、またはデスミン・エンハンサーのいずれかに由来する。
Description
【技術分野】
【０００１】
本願は2001年5月24日に出願された米国特許仮出願第60/293,304号の優先権を主張するものである。
【０００２】
発明の詳細
発明の分野
本発明は、組織特異的発現ベクターを利用した遺伝子治療法に関する。本発明はさらに、導入遺伝子を筋肉へ輸送するために使用される発現ベクターに関する。より具体的には、本発明は、導入遺伝子の筋肉中での発現を増強させ持続させる転写調節要素に関する。
【０００３】
【背景技術】
【０００４】
発明の背景
遺伝子治療とは、既存の異常を修正するか、または細胞に対して新たに有益な機能をもたらす外因性遺伝物質の細胞内輸送である。直接注入に際して迅速にアクセス可能であること、比較的容易且つ低侵襲的な方法であるが故に、筋肉は遺伝子治療のための重要な標的組織である。さらに、筋肉では、細胞代謝回転率が高い組織と比較して、発現持続性をより大きくすることが可能である。例えば、骨格筋は、遺伝子治療をいろいろな治療に適用する上での標的組織として研究されている。筋肉により分泌されるタンパク質の産生から恩恵を受けていると思われる遺伝子産物の異常により引き起こされる多数の既知の疾患が存在する。家族性高コレステロール血症、血友病、ゴーシェ病およびファブリー病、並びにII型糖尿病はほんの僅かな例である。そのような疾患の多くは、遺伝子治療で改善される可能性がある(Siatskasら、J. Inherit. Metab. Dis. 2001, 24 (Suppl. 2): 25〜41; Barrangerら、Expert Opin. Biol. Ther. 2001, 1(5): 857〜867; Barrangerら、Neurochem. Res. 1999, 24(5): 601〜615)。
【０００５】
外因性遺伝物質を種々の組織および器官、並びにとりわけ筋肉組織に輸送するために、種々の発現ベクターが開発されてきた。総説としては、「Gene Expression Systems」（J.M. FernandezおよびJ.P. Hoeffler編、Academic Press, San Diego, CA, 1999）を参照されたい。概して、各発現系には特定の欠点が有り、インビボにて所望の発現レベルを持続可能な様式で得ることは難関である。
【０００６】
例えば、レトロウイルスベクターの核酸を宿主ゲノムに組み込むことができ、その結果、ベクターにより運ばれる導入遺伝子の持続発現が可能となる。しかし、レトロウイルスベクターの感染力は、進行中の細胞増殖に依存する。故に、これらのベクターのインビボ輸送は不十分であると思われる。それに対して、アデノウイルス遺伝子導入ベクターを全身注入により輸送する場合、導入遺伝子の高レベル発現が観察されている(Rosefeldら、Science 1991, 252: 431〜434)ものの、そのような発現は一過性であると思われ、注入を繰り返し行うことが必要となると考えられる。宿主免疫反応を無効にすることにより、さらにウイルスベクターの効果が制限される可能性がある(Yangら、Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1994, 91: 4407〜4411; Kozarskyら、J. Biol. Chem. 1994, 269: 13695〜13702)。裸のプラスミドDNAの注入のような、非ウイルス性遺伝子導入法も同様に記述されているが、遺伝子導入レベルは一般的に低く、臨床適用には不十分である(Maloneら、J. Biol. Chem. 1994, 269: 29903〜29907; Hickmanら、Hum. Gene Ther. 1994, 5: 1477〜1483)。
【０００７】
筋肉は非常に血管が発達しているが、導入遺伝子産物の循環系への分泌はいささか不十分であると思われる。分泌が低いことに加え、筋特異的ベクター由来の導入遺伝子の発現レベルが潜在的に低いことにより、遺伝子治療の適用範囲が循環する治療用タンパク質量が低くても足るものに制限されてしまう可能性がある。遺伝子治療に関する別の課題は、高度に標的化された方法により、作用物を選択組織に輸送することであると思われる。筋肉のような大きくて分散化された組織への効果的なトランスフェクションには、通常、全身輸送が必要とされる。しかし、ほとんどの既知のウイルス性および非ウイルス性の発現ベクターは、全身投与後の異所性発現と関連した副作用を伴う可能性がある。組織特異的発現により、この問題を克服できる。標的組織だけで活性なプロモーターおよびエンハンサーのような転写調節要素を利用することにより、組織特異的発現を実現できる。
【０００８】
従って、本発明の主な目的は、筋肉組織における導入遺伝子の持続発現に最適な発現ベクターを提供することである。本発明の別の目的は、種々の発現系において持続性且つ適当な発現レベルを制御できるエンハンサー/プロモーターの組み合わせを提供することである。
【０００９】
これらの目的は、導入遺伝子の転写を持続的な方法によって促進するキメラ調節要素を作製するための、筋特異的プロモーターと筋特異的エンハンサー由来の最小配列を組み合せることにより実現される。得られたキメラ調節要素は、筋肉における導入遺伝子の発現による遺伝子治療のほか、トランスフェクトされた、ミオサイトのような筋細胞における外因性タンパク質の長期発現が必要とされるその他の適用に対しても有効である。本発明の種々の筋特異的エンハンサー/プロモーターの組み合わせは、培養細胞またはインビボにおける遺伝子発現のための、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス(AVV)、レトロウイルス、およびプラスミドを基礎としたベクターとの関連において有用であるかもしれない。
【発明の開示】
【００１０】
発明の概要
本発明により、導入遺伝子の発現を筋肉に標的化するのに有用なキメラ調節要素が提供される。本発明のキメラ調節要素には、筋肉において選択的に導入遺伝子の持続性発現を可能とする筋特異的プロモーターおよび筋特異的エンハンサーの組み合わせが含まれる。
【００１１】
本発明はまた、1つまたは複数の操作可能に連結された本発明の組織特異的な調節要素を含む組換え型導入遺伝子を対象とする。導入遺伝子に操作可能に連結された筋特異的プロモーターおよびエンハンサーを含む組織特異的調節要素により、ミオサイトおよび特に、心筋細胞においてその発現が促進される。関連するコードDNA配列の発現を筋肉に標的化する組換え型ウイルスベクターに導入遺伝子を挿入してもよい。本発明において有用な筋特異的プロモーターには、哺乳類筋肉クレアチン・キナーゼ(MCK)プロモーター、または哺乳類デスミン(DES)プロモーターが含まれる。または、プロモーター要素は、哺乳類MCKプロモーター、哺乳類トロポニンI(TNNI2)プロモーターまたは哺乳類骨格α-アクチン(ASKA)プロモーターからなる群より選択される。ある特定の態様において、プロモーターはヒト・プロモーターである。他の態様において、プロモーターはマウス・プロモーターである。ある態様において、プロモーターは短縮されている。
【００１２】
本発明において有用な組織特異的エンハンサーは、哺乳類MCKエンハンサー、哺乳類DESエンハンサー、および脊椎動物トロポニンI IRE(TNI IREは、以下、FIREとする)エンハンサーからなる群より選択される。ある態様において、エンハンサーは哺乳類MCKエンハンサーまたは哺乳類デスミン(DEは、以下、DESとする)エンハンサーである。他の態様において、エンハンサーは哺乳類DESエンハンサーまたは脊椎動物FIREエンハンサーである。筋特異的な調節要素を提供するために、これらの筋特異的エンハンサー要素の1つまたは複数を、本発明の筋特異的プロモーターと組み合せて使用してもよい。ある態様において、エンハンサーはヒトまたはマウスに由来する。その他の態様において、FIREエンハンサーはトリ・エンハンサーである。ある態様において、FIREプロモーターはウズラ・プロモーターである。ある態様において、エンハンサー/エンハンサーまたはエンハンサー/プロモーターの組み合わせは異種である、即ち、2つ以上の種に由来する。他の態様において、エンハンサーおよびプロモーターは同一種に由来する。ある態様において、エンハンサー要素は短縮されている。
【００１３】
特定の態様において、本発明の調節要素は、DESプロモーターと操作可能に連結されたMCKエンハンサーを少なくとも1つ含む。関連する態様において、調節要素はさらに、少なくとも1つのFIREエンハンサーを含み、選択的に少なくとも1つのDESエンハンサーを含む。その他の態様において、本発明の調節要素は、MCKプロモーターまたはDESプロモーターに連結したMCKエンハンサーを少なくとも2つ含む。さらにもう一つの態様において、調節要素はDESプロモーターに連結したDESエンハンサーを少なくとも2つ含む。
【００１４】
本発明には、本発明の調節要素を含有するベクターが含まれる。一部の態様において、調節要素は非ウイルス性のプラスミドを基礎としたベクターに組み込まれる。その他の例示的態様において、本発明の調節要素はアデノウイルス、アデノ随伴ウイルス(AAV)、またはヒト免疫不全ウイルス(HIV)のようなレンチウイルスを含むレトロウイルスに由来するもののようなウイルスベクターに組み込まれる。本発明にはまた、本発明のベクターを利用して、筋肉組織を感染させる方法が包含される。
【００１５】
本発明にはさらに、本発明のエンハンサー/プロモーターの組み合わせを含む核酸でトランスフェクトした細胞が含まれる。
【００１６】
本発明のさらなる目的および利点は、以降の説明の中で部分的に述べられ、そしてその説明から部分的に明らかになる、または本発明を実践することにより分かると思われる。本発明の目的および利点は、特に添付の特許請求の範囲に示される要素および組み合わせにより理解されおよび実現される。
【００１７】
前述の一般的な説明と後述の詳細な説明の両方ともに例示および説明に過ぎず、特許請求の範囲に記載されるようには、本発明を限定するものではないことを理解されるべきである。
【００１８】
発明の詳細な説明
「筋特異的」という用語は、必要に応じて、「組織特異的」または「組織選択的」と同じ意味で使用され、それらの由来にかかわらず筋肉組織または筋細胞において導入遺伝子の発現を排他的または選択的に促進させる、プロモーターおよびエンハンサーのような調節要素の能力を指す。
【００１９】
本明細書で使用される「ミオサイト」という用語は、適当な条件の下で筋特異的な表現型を発現できるような、前駆筋芽細胞から分化した細胞を指す。最終分化したミオサイトは互いに融合して、筋繊維の主要な構成成分である管状筋細胞を形成する。「ミオサイト」という用語はまた、脱分化したミオサイトを指す。その用語には、細胞が初代であるか継代であるかにかかわらず、インビボの細胞およびエクスビボの培養細胞が含まれる。
【００２０】
核酸のハイブリダイゼーションと関連して「ストリンジェントな条件」という用語は、その条件で有意に同一であるかまたは相同である配列を有するオリゴヌクレオチドがハイブリダイズできる、即ち相補的に結合できる、インキュベーションおよび洗浄の条件を指すものである。その条件は、少なくとも20ヌクレオチド長であって且つ少なくとも約70%が同一である配列がハイブリダイズできるよう選択される。ストリンジェントな条件は当技術分野において周知であり、それらの例は「Current Protocols in Molecular Biology」Ausubelら編、John Wiley & Sons, Inc. 1995、およびSambrookら、「Molecular Cloning: A Laboratory Manual」第2版. Cold Spring Harbor Press 1989において見出せる。2つの配列間の同一性の割合は、Altshulら、J. Mol. Biol. 1990, 215: 403〜410に説明されているように、Basic Local Alignment Tool(BLAST)を利用して決定される。
【００２１】
「導入遺伝子」という用語は、「挿入遺伝子」または「発現遺伝子」、および必要に応じて「遺伝子」と同じ意味で使用される。「導入遺伝子」は、細胞に導入された場合、例えば、治療的に有用なタンパク質の発現のような、有益な特性を細胞に付与するよう、適当な条件の下で転写され得るポリヌクレオチドを指す。必要に応じて「導入遺伝子」という用語には、コード配列とポリアデニル化シグナル、プロモーター、エンハンサー、リプレッサーなどのような、任意の非コード調節配列の組み合わせが含まれると理解されるべきである。
【００２２】
「トランスフェクション」という用語は、「遺伝子導入」、「形質転換」、および「形質導入」という用語と同じ意味で使用され、ポリヌクレオチドの細胞内導入を意味する。「トランスフェクション効率」とは、トランスフェクションされた細胞により取り込まれた導入遺伝子の相対量を指す。実際には、トランスフェクション効率は、トランスフェクション操作後に発現したレポーター遺伝子産物の量により推定される。
【００２３】
本明細書で使用される「トランスフェクション媒体」とは、細胞壁を越えるポリヌクレオチドの移送を容易にできる物質を記述する。
【００２４】
「ベクター」という用語は、「導入遺伝子輸送ベクター」、「発現ベクター」、「発現モジュール」、「発現カセット」、「発現構築物」および必要に応じて、「本発明の核酸」と同じ意味で使用される。「ベクター」は、「宿主細胞」と呼ばれる細胞中にトランスフェクトすることができ、結果としてその配列の全てまたは一部が転写される、ウイルス性または非ウイルス性の、原核生物または真核生物の、DNAまたはRNA配列を指す。転写産物が発現されることは必ずしも必要ではない。ベクターがコード配列を有する導入遺伝子を含んでいることもまた、必ずしも必要ではない。ベクターには、異なるウイルス、細菌、または哺乳類の遺伝子に由来する要素の複合物として組み立てられることが多い。ベクターは、選択マーカーをコードする配列、細菌におけるそれらの増殖を促進させる配列、または特定の細胞種においてのみ発現する1つ若しくは複数の転写単位のような種々のコード配列および非コード配列が含まれる。例えば、哺乳類発現ベクターには、細菌におけるベクターの増殖を促進させる原核生物の配列および真核細胞においてのみ発現する1つまたは複数の真核生物の転写単位の双方が含まれることが多い。発現ベクターの設計は、形質転換される宿主細胞の選択、所望のタンパク質の発現レベルなどのような要因に依存し得ることは、当業者により理解される。
【００２５】
「プロモーター」という用語は、「プロモーター要素」および「プロモーター配列」と同じ意味で使用される。同様に、「エンハンサー」という用語は、「エンハンサー要素」および「エンハンサー配列」と同じ意味で使用される。「プロモーター」は、導入遺伝子のコード配列の転写を開始するのに十分な導入遺伝子の最小配列を指す。プロモーターは構成性であっても誘導性であってもよい。構成性プロモーターは、導入遺伝子の発現をサイトメガロウイルス・プロモーター(CMV) (Boshartら、Cell 1985, 41: 521)のそれに匹敵するレベルで促進させる場合、強力なプロモーターであると考えられる。プロモーターを、適当な細胞内調節因子と結合した場合、プロモーター依存的な転写を促進(「エンハンサー」)するまたは抑制(「リプレッサー」)する、他の調節配列/要素と結合してもよい。プロモーター、エンハンサー、またはリプレッサーは、これらの要素が導入遺伝子の転写率または効率を制御するかまたはそれらに影響を及ぼす場合、導入遺伝子に「操作可能に連結されている」と言われる。例えば、導入遺伝子のコード配列の5'末端近位のプロモーター配列は通常、導入遺伝子と操作可能に連結されている。本明細書にて使用される「調節要素」という用語は、「調節配列」と同じ意味で使用され、プロモーター、エンハンサー、およびその他の発現制御要素、またはそのような要素の任意の組み合わせを指す。
【００２６】
プロモーターは、それらが制御する遺伝子の5'(上流)に位置している。真核生物のプロモーターの多くは、2種類の認識配列、すなわちTATAボックスおよびその上流のプロモーター要素を含んでいる。転写開始部位の25〜30塩基対上流に位置するTATAボックスは、RNA合成が正しい部位から開始されるようRNAポリメラーゼIIの制御に関与していると考えられている。その一方で、その上流のプロモーター要素は、転写が開始される割合を決定している。これらの要素はその方向に関係なく作用できるが、TATAボックスの100〜200塩基対上流内に位置している必要がある。
【００２７】
エンハンサー要素は、連結された同種または異種のプロモーター由来の転写を最大1000倍まで刺激することができる。エンハンサー要素はしばしば、たとえその方向が逆向きであっても活性のままである(Liら、J. Bio. Chem. 1990, 266: 6562〜6570)。さらに、プロモーター要素とは異なり、エンハンサーは転写開始部位の下流であっても、例えばイントロン内、またはプロモーターからかなり離れている場合でさえも活性で有り得る(Yutzeyら、Mol. and Cell. Bio. 1989, 9:1397〜1405)。
【００２８】
当技術分野において周知であるように、プロモーター機能を喪失させることなく、この距離をいくつか変化させて調節できる。同様に、導入遺伝子に対する調節要素の位置を、機能を喪失させることなく有意に変化させることができる。調節要素の複数コピーは、協調して作用できる。典型的には、発現ベクターは、5'から3'の方向で、プロモーター配列に先行する1つまたは複数のエンハンサー配列を、その全てが後ろにポリアデニル化シグナルの続く導入遺伝子に操作可能に連結されるように含んでいる。
【００２９】
細胞遺伝子のエンハンサーの多くは、特定の組織または細胞種においてのみ機能する。さらに、いくつかのエンハンサーは、ホルモンまたは金属イオンのようなインデューサーの存在により作り出される特定の条件下でのみ活性になる。細胞エンハンサーの特異性に関するこれらの相違により、真核生物発現ベクター中に組み込まれるプロモーターおよびエンハンサー要素の選択は、組換え遺伝子が発現される細胞種により決定される。
【００３０】
ウイルス由来のエンハンサー要素は、一般的に宿主範囲が広く、種々の組織で活性である。例えば、SV40初期遺伝子エンハンサーは、種々の哺乳動物種由来の多くの細胞種で無差別に活性であって、このエンハンサーを組み入れたベクターは本質的に広く利用されている(Dijkemaら、EMBO J. 1985, 4: 761)。さまざまな細胞で活性な2つの他のエンハンサー/プロモーターの組み合わせは、ラウス肉腫ウイルスゲノムの長い末端反復(LTR)(Gormanら、Proc. Natl. Sci. U.S.A. 1982, 79: 6777) およびCMV (Boshartら、Cell 1985, 41: 521) に由来する。
【００３１】
調節要素はお互いにまたは導入遺伝子に対して異種であってもよく、即ち、それらは異なる種に由来していてもよい。さらに、それらは宿主以外の種に由来していてもよい。それらはまた、同じ種であるが異なる遺伝子に由来していてもよい。または、それらは単一遺伝子に由来していてもよい。
【００３２】
デスミン調節要素
デスミンは、Z板の周囲に生ずる中間径フィラメントのファミリーに属する筋特異的な細胞骨格タンパク質であり、隣接する筋原繊維の側方配列を維持するように機能している可能性がある。種々の中間径フィラメントの発現は、発達上調節され、組織特異性を示す。例えば、ビメンチンは全ての間葉派生物のほか、筋肉および神経組織の前駆体;上皮細胞のケラチン;グリア細胞のグリア繊維性酸性タンパク質;および神経細胞の神経フィラメントで発現している。他方、デスミンは平滑骨格筋だけで発現している。
【００３３】
分化および未分化の筋原細胞および非筋原細胞において、デスミン上流の調節配列(転写開始部位に対して、上流2255ntから下流75ntの間)の制御下のクロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ(CAT)の一過性発現を比較することにより、上流228ntから下流1ntの間のヒト・デスミン・プロモーター領域は、管状筋細胞および筋芽細胞での低レベル発現に十分であるが、繊維芽細胞またはヒーラ細胞ではそうでないことが明らかにされている(Liら、J. Bio. Chem. 1990, 266: 6562〜6570)。同一の転写開始領域が別のデスミン陽性器官で利用されていることから、同一のプロモーターが起源の異なる骨格筋、心筋および平滑筋細胞では活性であることが示唆される(van Groningenら、Biochim. Biophys. Acta 1994,1217: 107〜109)。従って、このプロモーターは筋特異的である。マウス、ヒト、ハムスターおよびラット・デスミンのプロモーター配列は高度に保存されており、従って、種々の哺乳動物種由来の相同体が同様の活性を有すると予測される。
【００３４】
ヒト・デスミン(DES)プロモーターは、以下のプライマーを用いて、上流2194ntから下流1ntの5'上流領域をpCR-Blunt II TOPO (Invitrogen社, Carlsbad, CA)中にクローニングすることにより得られた:
次いで、デスミン・プロモーターをPst I部位(上流228(-228))で切断した。切断されたDESプロモーターの配列は、配列番号:19に示されている。
【００３５】
ヒト配列の上流973から693ntの間に位置する280塩基対のエンハンサーには、他の筋特異的エンハンサーに対して相同ないくつかの配列が含まれている。他の筋特異的エンハンサーと異なり、デスミン(DES)エンハンサーは、筋芽細胞のほかに、管状筋細胞でも機能できる。DESエンハンサーには、二つの異なる領域が含まれており、一方の領域(上流973から848ntの間)は分化した管状筋細胞で活性であり、他方の領域(上流847から693ntの間)は未分化の筋芽細胞で活性である。上流1738から693ntの間の領域を欠失させることにより、結果として、連結させたCAT遺伝子の発現が分化した筋細胞では20倍以上減少し、未分化の筋芽細胞では8倍以上減少する。この280塩基対のエンハンサーは、方向、位置、および距離に非依存的であり、並びにデスミン・プロモーターかまたはHSV tkおよびヒト・ビメンチンのような異種プロモーターのいずれかを、C2.7管状筋細胞では約14〜50倍に、そしてC2.7筋芽細胞では約9〜16倍に活性化することができる(Liら、J. Bio. Chem. 1990, 266: 6562〜6570)。
【００３６】
ヒト筋特異的な243塩基対のDESエンハンサーの配列(上流973から731)は、配列番号:21に示されている。以下のプライマーを用いて、エンハンサーを増幅した:
【００３７】
筋肉クレアチン・キナーゼ調節要素
筋肉クレアチン・キナーゼ(MCK)遺伝子は、全ての横紋筋で極めて活性である。クレアチン・キナーゼは、収縮およびイオン輸送系内のATPの再生に関して重要な役割を演じている。それは解糖も呼吸もない場合に、ホスホクレアチンのリン酸基をADPに転移させてATPを形成させることにより、筋肉の収縮を可能とする。クレアチン・キナーゼには、4つの既知のイソ型が存在する:脳クレアチン・キナーゼ(CKB)、筋肉クレアチン・キナーゼ(MCK)、および2つのミトコンドリア型(CKMi)。MCKは、そのmRNAが全ての骨格筋繊維種で発現している、最も豊富な非ミトコンドリア性mRNAであり、心筋においても同様に極めて活性が高い。MCK遺伝子は筋芽細胞で発現していないが、筋芽細胞がミオサイトに最終分化する場合に、転写活性化される。MCK遺伝子の調節領域は横紋筋特異的な活性を示し、インビボおよびインビトロの広範囲にわたってその特性が示される。MCK遺伝子の主な既知の調節領域には、マウスでは転写開始部位の5'側、約1.1kbに位置する筋特異的エンハンサーと358塩基対近位にあるプロモーターが含まれる。MCK発現を調節するさらなる配列は、転写開始部位の5'側、3.3kbより上流且つ3.3kbの第一イントロン内に分布している。ヒトおよびマウス・プロモーターおよびエンハンサー要素を含む哺乳類のMCK調節要素は、Hauserら、Mol. Therapy 2000, 2:16〜25に記載されている。
【００３８】
マウスMCKプロモーター(上流496から下流37)は増幅するのが困難であることが判明した、その結果、プロモーターを3段階で作製した。第一段階として、485塩基対の産物を増幅するために、プライマー対MCK S7-MCK S11を使用した。第二段階として、189塩基対の産物を増幅するために、プライマー対MCK S9-MCK S12を使用した。第三段階として、533塩基対のプロモーターを増幅するために、MCK S11-MCK S12プライマーを用いて2つの産物を連結した。
MCKプロモーターの配列は、配列番号:18に示されている。
【００３９】
筋特異的な206塩基対のマウスMCKエンハンサー(上流1256から1051)を、以下のプライマーを用いて増幅した:
MCKエンハンサーの配列は、配列番号:20に示されている。
【００４０】
トロポニン I 調節要素
ヘテロ二量体であるトロポニン複合体は、横紋筋の細いフィラメントに位置しており、収縮を調節するカルシウム感受性の分子スイッチとして機能している。それは3つのサブユニットから成る。トロポニンI(TnI)は、骨格筋収縮の際のアクトミオシンATPaseのカルシウムを介した調節に関与するタンパク質複合体の阻害サブユニットである。3つの既知のイソ型が存在する:骨格遅筋トロポニンI(TNNI1)、骨格速筋トロポニンI(TNNI2)、および心筋トロポニンI(TNNI3)。以前の研究により、ウズラTnI遺伝子をマウスの多能性細胞中に、または確定した(determined)筋原性細胞株中に導入した場合、適当な時期、特異性、および転写レベルを含む、正確であり筋繊維特異的な発現様式が示されることが実証されている。さらに、トランスジェニックマウス中に導入されたTnI遺伝子は、正常な発達および組織特異的な様式を示す。
【００４１】
ウズラでは、TnIプロモーター(TNNI2)は、上流530と下流60nt以内に位置している。ヒトでは、プロモーター配列は、上流146と下流19nt以内に位置している。TNI2プロモーターの配列は、配列番号:23に示されている。ヒトTNI2プロモーターを、以下のプライマーを用いて増幅した:
【００４２】
ウズラTnI遺伝子のイントロン内に、重要な調節エンハンサーが同定されている(Yutzeyら、Mol. and Cell. Bio. 1989, 9: 1397〜1405)。FIRE(第一内部調節要素)と呼ばれるこの領域は、下流643から781ntにかけて伸びており、E-ボックス、MEF-2様配列、CCACボックスおよびCAGG配列を含む、少なくとも4つの調節要素が含有されていることが明らかにされている(Nakayamaら、Mol. Cell. Bio. 1996, 16: 2408〜2417)。FIREエンハンサーは、位置-および方向-非依存的であり、且つ一連の異種プロモーターに筋特異的な発現様式を与えることが知られており、一方、FIREの非存在下では、ウズラTnIプロモーター領域(上流530から下流60)単独で筋特異的発現を誘導することはできない。従って、発現の組織特異性を、FIREにより制御できる。
【００４３】
139塩基対のウズラFIREエンハンサーを、以下の一連の合成オリゴヌクレオチド(Fire 1〜Fire 5)をアニールすることにより組み立てた:
トリFIREエンハンサーの配列は、配列番号:22に示されている。
【００４４】
骨格α - アクチン調節要素
アクチン多重遺伝子ファミリーは、重合して微小繊維を形成する豊富なタンパク質であって、次いで、この微小繊維が細胞形態、分裂、および運動性の維持に関して重要な役割を果たしている。脊椎動物では少なくとも6つのアクチンのイソ型が存在する:骨格-αアクチン(SkA)および心筋αアクチンは横紋筋で発現している、血管α-アクチンおよび腸内γ-アクチンは平滑筋で発現している、並びに細胞質β-およびγ-アクチンは非筋細胞で発現している。同一胚組織の多くで、SkAは心筋α-アクチンと共発現している。それは胎児心筋および胎児心室で昂進し、出生後の発育の間、これらの組織で抑制される。成人の骨格筋では、SkAは主要なイソ型である。アクチン遺伝子のコード配列は進化を通じて高度に保存されている(Alonsoら、J. Mol. Evol. 1987,194: 193〜206)が、5'および3'UTRはアクチンの異なるイソ型間では高度に保存されておらず、従って、これらの領域より通常、アイソタイプ特異的なプローブが提供される可能性がある。SkA遺伝子のいくつかの5'上流領域は、例えばヒト、マウス、ラットおよびニワトリで進化的に保存されている。ヒトおよび齧歯類の5'上流領域250nt以内の配列のうち、約73%が類似している(Taylorら、Genomics 1988, 3: 323〜336)。
【００４５】
トランスフェクション実験の結果から、時期および組織特異的な発現の双方には、ラット(Melloulら、EMBO 1984, 3: 983〜990)およびニワトリ(Grichnickら、Nucleic Acid Res. 1986, 14: 1683〜1701)SkA遺伝子の転写開始部位の上流配列で十分であることが実証されている。SkA遺伝子プロモーターの近接領域(上流153から87)は、L8細胞において筋形成の間、その遺伝子の転写の増加を調節するのに必須である。
【００４６】
ヒトα-骨格アクチン(ASKA)プロモーターの配列(上流481から下流34)は、配列番号:23に示されている。そのプロモーターを、以下のプライマーを用いて増幅した:
【００４７】
キメラ調節要素
本発明は、1つまたは複数の上述の組織特異的な調節要素を含む、組換え型導入遺伝子を対象とする。本発明の組織特異的なキメラ調節要素により、ミオサイトおよび特に、心筋細胞において導入遺伝子の発現が促進される。関連するコードDNA配列の発現を筋肉に標的化する組換え型ウイルスまたは非ウイルスベクターに導入遺伝子を挿入してもよい。ある態様において、プロモーター要素は、哺乳類筋肉クレアチン・キナーゼ(MCK)プロモーターおよび哺乳類デスミン(DES)プロモーターからなる群より選択される。または、プロモーター要素は、哺乳類MCKプロモーター、哺乳類トロポニンI(TNNI2)プロモーター、および哺乳類骨格α-アクチン(ASKA)プロモーターからなる群より選択される。ある特定の態様において、プロモーターはヒト・プロモーターである。その他の態様において、プロモーターはマウス・プロモーターである。ある態様において、プロモーターは短縮されている。
【００４８】
本発明の組織特異的な調節要素には、哺乳類MCKエンハンサー、哺乳類DES(DEとしても知られている)エンハンサー、および脊椎動物トロポニンI IRE(FIRE、TNI IREとしても知られている)エンハンサーからなる群より選択される、少なくとも1つのエンハンサーが含まれる。これらの筋特異的なエンハンサー要素の1つまたは複数を、本発明のプロモーター要素と組み合せて使用してもよい。ある態様において、エンハンサーはヒトまたはマウスに由来する。その他の態様において、FIREエンハンサーはトリ・エンハンサーである。特定の態様において、FIREプロモーターはウズラ・プロモーターである。ある態様において、エンハンサー/エンハンサーまたはエンハンサー/プロモーターの組み合わせは異種である、即ち、その要素は2以上の種に由来する。その他として、それらは同一種に由来する。ある態様において、既知の転写リプレッサーの結合部位が欠失するように、エンハンサー要素を切断する。
【００４９】
特定の態様において、本発明の調節要素には、DESプロモーターと操作可能に連結されたMCKエンハンサーが少なくとも1つ含まれる。その他の態様において、調節要素にはさらに、少なくとも1つのFIREエンハンサーが含まれ、選択的に、少なくとも1つのDESエンハンサーが含まれる。その他の態様において、調節要素にはMCKプロモーターまたはDESプロモーターに連結したMCKエンハンサーが少なくとも2つ含まれる。さらにもう一つの態様において、調節要素にはDESプロモーターに連結したDESエンハンサーが少なくとも2つ含まれる。
【００５０】
当然のことながら、本発明の調節要素は、本明細書に記載の特定の配列に限定されることはなく、それらの構造的および機能的類似体/相同体も含まれる。そのような類似体には、切断、欠失、挿入のほか、特異的変異誘発によるか、またはランダム変異誘発のいずれかにより導入される1つまたは複数のヌクレオチドの置換が含まれてもよい。既知の転写リプレッサーに対する1つまたは複数の結合部位を欠失させるために、切断することができる。さらに、そのような配列は、本発明の配列と高い同一性を示す、天然に存在する配列に由来してもよい。20ヌクレオチドまたはそれより大きい核酸が、ストリンジェントな条件の下で、本発明のプロモーター/エンハンサー配列とハイブリダイズする場合、そのプロモーター/エンハンサー配列と高い同一性を有すると考えられる。または、核酸が例えば、Altshulら、J. Mol. Biol. 1990, 215: 403〜410,Needlemanらのアルゴリズム, J. Mol. Biol. 1970, 48: 444〜453, またはMeyersらのアルゴリズム, Comput. Appl. Biosci. 1988, 4: 11〜17に記載のBasic Local Alignment Tool(BLAST)のような標準的なアライメント・アルゴリズムによる決定により、少なくとも60%、 65%、 70%、 75%、 80%、 85%、 90%、 95%またはそれ以上の割合の同一性を有する少なくとも20ヌクレオチドの連続配列を含む場合、本発明のプロモーター/エンハンサー配列と高い同一性を有すると考えられる。限定ではないが類似体の例として、例えば様々な種に由来する相同的なプロモーター配列および相同的なエンハンサー配列が本明細書に記載されている。
【００５１】
本発明にはさらに、本発明の調節要素を含有するベクターが含まれる。一般的には、本発明の調節要素の任意のベクターでの使用に関する制限は知られていない。ある態様において、調節要素は非ウイルス性のプラスミドを基としたベクターに組み込まれる。その他の例示的態様において、本発明の調節要素はアデノウイルス、アデノ随伴ウイルス(AAV)、またはヒト免疫不全ウイルス(HIV)のようなレンチウイルスを含むレトロウイルスに由来するようなウイルスベクターに組み込まれる。
【００５２】
本発明において、導入遺伝子には、糖尿病、または筋肉系、筋肉疲労、若しくは筋肉修復の疾患および病気に関与するタンパク質をコードするDNA配列が含まれてもよい。本発明のベクターには、治療用ポリペプチドをコードする配列を含有する導入遺伝子が含まれてもよい。遺伝子治療に関して、そのような導入遺伝子は所望の治療成果を基にして選択される。それは例えば、抗体、ホルモン、酵素、受容体、若しくは関心のある他のタンパク質または例えば、TGF-β受容体、グルカゴン様ペプチド1、ジストロフィン、レプチン、インスリン、プレプロインスリン、フォリスタチン、PTH、FSH、IGF、EGF、TGF-β、骨形成タンパク質、その他の組織増殖および調節因子、増殖ホルモン、並びに血液凝固因子のようなそれらの断片をコードしてもよい。例えば、リソソーム蓄積症の治療では、グルコセレブロシダーゼ、α-ガラクトシダーゼ、β-グルクロニダーゼ、α-リズロニダーゼ(Alpha-Liduronidase)、イズロネートスルファターゼ、α-N-アセチルガラクトサミニダーゼ、スフィンゴミエリナーゼおよびα-グルコシダーゼのような酵素をコードする導入遺伝子を使用できる。家族性高コレステロール血症の治療では、例えば、LDL受容体をコードする導入遺伝子を使用できる(Kobayashiら、J. Biol. Chem. 271: 6852〜6860)。
【００５３】
本発明には、本発明のベクターを使用して筋肉組織にトランスフェクトする方法が包含される。当然のことながら、本発明のベクターは、被験者に投与されるトランスフェクション媒体の種類により、または投与法により限定されることはない。トランスフェクション媒体には、細胞表面およびポリヌクレオチド自体の帯電を減少させるか、または細胞壁の透過性を増加させる化合物が含まれてもよい。例としては、陽イオン性リポソーム、リン酸カルシウム、ポリリジン、血管内皮増殖因子(VEGF)などが含まれる。例えば、塩化ナトリウム、糖質、または多価アルコールを含有する高張液をまた、細胞外浸透圧を増加させ、これによりトランスフェクション効率を増加させるために使用できる。トランスフェクション媒体にはまた、タンパク質分解酵素およびリパーゼのような酵素、温和な界面活性剤および細胞膜の透過性を増加させる他の化合物が含まれてもよい。本発明の方法は、任意の特定のトランスフェクション媒体の組成物に限定されることはなく、被験者に対して毒性がないか、またはその毒性が許容限界内である限り、任意の適当な媒体を用いて本発明の方法を実践できる。限定ではないが適当なトランスフェクション媒体が本明細書に列挙されている。
【００５４】
本発明にはまた、本発明のエンハンサー/プロモーターの組み合わせを含有するDNAを用いてトランスフェクトした細胞が含まれる。単離した核酸を用いて細胞をトランスフェクトするための標準的な方法は、当業者に周知である。トランスフェクトした細胞を、例えば、導入遺伝子の同一性を確認するために;生合成および導入遺伝子によりコードされるタンパク質の細胞内輸送を研究するために;または後に被験者へ再移植する目的で細胞をエクスビボで培養するためなどに、使用できる。インビボ筋肉注射およびミオサイトのエクスビボ・トランスフェクションの方法は、当技術分野において周知である。例えば、Shahら、Transplantation 1999, 31: 641〜642; Dalyら、Human Gene Therapy 1999, 10: 85〜94を参照されたい。
【００５５】
本発明のベクターと共に使用できる宿主細胞は、全ての筋肉種、例えば骨格筋、心筋、平滑筋などに見られるミオサイトである。ミオサイトは、以下に限定さないが、ヒト、オランウータン、サル、チンパンジー、イヌ、ネコ、ラット、ウサギ、マウス、ウマ、ウシ、ブタ、ゾウなどを含む任意の脊椎動物種に見られ、且つ単離できる。または、宿主細胞を、原核細胞、例えばベクターを増幅させるために使用される、大腸菌のような細菌性細胞とすることができる。
【００５６】
特定の環境では、完全に分化した筋芽細胞よりもむしろ間葉前駆体細胞または筋芽細胞のようなミオサイトの前駆細胞を使用することが望ましいと考えられる。そのような細胞を単離できる組織の例には、胎盤、臍帯、骨髄、皮膚、筋肉、骨膜または軟骨膜が含まれる。ミオサイトは、そのような細胞を例えば、組織培養でそれらの分化を誘導させることにより得ることができる。本発明には、ミオサイトの前駆体/前駆細胞だけでなく、ミオサイトに分化転換できる細胞、例えば脂肪細胞および繊維芽細胞もまた包含される。
【００５７】
ミオサイトが分化される、発達のある段階まで導入遺伝子の発現が抑制されるように、治療用導入遺伝子を含有する本発明のベクターを胚に注入することも望ましいと考えられる。例えば、Gene Expression Systems, Eds. J. M. FernandezおよびJ. P. Hoeffler, Academic Press, San Diego, CA, 1999を参照されたい。
【００５８】
本発明の他の態様は、本明細書を考慮し本明細書に開示されている本発明を実践することにより当業者には明らかである。本明細書および本実施例は単なる例示に過ぎず、本発明の真の範囲および精神は添付の特許請求の範囲により示されると意図される。試験動物で代表的に実験が行われているが、ヒトでも同様の結果が期待される。ヒトへの注入を目的として使用される正確なパラメータは、当業者により容易に決定され得る。
【００５９】
実施例
実施例 1: ベクター構築
制限酵素、T4 DNAリガーゼ、DNAポリメラーゼIおよび大断片(Klenow)は、New England BioLabs社(Beverly, MA)から購入した。
【００６０】
マウスおよびヒトゲノムDNAは、Clontech社(Palo Alto, CA)から購入した。ゲノムDNAからの調節要素のPCR増幅を、発明の詳細な説明に示されているプライマーを用い、登録商標VentR DNAポリメラーゼ(New England BioLabs社, Beverly, MA)を使って以下のように実施した:94℃で4分間、45℃で2分間、および68℃で5分間を1サイクル、その後、94℃で1分間、55℃で2分間、および68℃で5分間を34サイクル。サルウイルス40(SV40)エンハンサー由来の72塩基対の繰り返しを含有するSV72エンハンサー要素は、Liら、Gene Therapy 2001, 8: 494〜497に記載されている。ファージミドまたはプラスミドベクター中にクローニングされるDNA制限断片を、DEAE紙を用いてアガロースゲルから単離し、Sambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual,第2版, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989に記載されているようにクローニングした。
【００６１】
種々のエンハンサーの複数コピーを、標準的な組換えDNA法を用い、登録商標Litmus 28(New England BioLabs社, Beverly, MA)のSpe IとBsiW I部位間にクローニングした。ヒトα骨格アクチン・プロモーター(ASKA; 上流481から下流34)およびヒト・トロポニン・プロモーター(TNNI2;上流146から下流19)を、登録商標Litmus 28のEcoR IとBamH I間にクローニングし、一方、ヒト筋肉クレアチン・キナーゼ・プロモーター(MCK;上流496から下流37)およびヒト・デスミン・プロモーター(DES;上流2194から下流1)を、pCR-Blunt II-TOPO(Invitrogen社, Carlsbad, CA)中にクローニングした。デスミン・プロモーターを、エンハンサーと結合させる前に、Pst I(上流228)部位でトランケートした。プロモーターおよびエンハンサー要素の完全性を検証するために塩基配列解析を行った。
【００６２】
分泌型アルカリフォスファターゼ(SEAP)レポーター遺伝子を転写させる筋肉キメラを生成するために、筋特異的なプロモーター・キメラをpCFA-HI-SEAP発現ベクター中に導入する上で、標準的なクローニング方法を利用した。pCF1-SEAPとしても知られるpCFA-HI-SEAPプラスミドは、Yewら、Hum. Gen. Ther. 1997, 8: 575〜584に記載されている。
【００６３】
全てのプラスミドを、Qiagen plasmid Maxi kit(Qiagen社, Valencia, CA)を用いて調製した。動物に注入する前に、内毒素を除去するため、登録商標Triton X-100(Sigma-Aldrich社, St. Louis, MO)を用いてプラスミドを抽出した。
【００６４】
作製したプラスミドの一覧が表1に示されており、ここで「L28」は登録商標Litmus 28を表し;「HI」はハイブリッドイントロン(配列は、MacGregorら、Nucleic Acids Research 1989, 17: 2365に記載されている)を表し;「＞」はエンハンサー配列が順向き(5'→3')であることを表し;「＜」はエンハンサー配列が逆向き(3'→5')であることを表し;および必要に応じて、括弧内の数値は、挿入されているエンハンサー要素の数を表しているか、またはもとの遺伝子におけるプロモーターのヌクレオチドの位置を表している。
【００６５】
実施例 2: マウスでの短期間発現
BALB/Cマウスの前脛骨筋中に、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)50μl中の試験プラスミド50μgを注入した。各試験プラスミドまたは対照群に対し、マウス5匹を使用した。対照動物では、Liら、Gene Therapy 2001, 8: 494〜497に記載されているCMVプロモーター/エンハンサー(上流522から1)を含有するプラスミドを使用した。
【００６６】
トランスフェクションの全体的効率を、動物の血清中のSEAP濃度を測定することにより評価した。注入後7日で、血液を眼窩内採取した。血清を65℃まで加熱して内在性アルカリフォスファターゼを変性させ、Sigma-Aldrich社(St. Louis, MO)のアルカリフォスファターゼ試薬および標準品としてCalbiochem社(LaJolla, CA)のヒト胎盤アルカリフォスファターゼを用い、製造元の使用説明書に従って、SEAP活性を定量した。観測されたSEAP発現レベルを、CMV対照との比率として標準化した。
【００６７】
各群の平均値として算出した、種々のプロモーター/エンハンサー・キメラのSEAP発現レベルが図1に示されている。図1に示されているように、切断型デスミン・プロモーター・構築物であるDC-308、DC-309、DC-310、およびDC-312は、CMV対照の3分の1を越える発現レベルを示した。ASKAキメラであるDC-276並びにMCKキメラであるDC-300およびDC-301は、SEAPをデスミン・プロモーター・構築物の発現レベルの約半分発現したが、その他の発現は、CMV対照の10%未満であった。
【００６８】
実施例 3: ラットでの長期間発現
種々のエンハンサー/プロモーターの組み合わせにおける発現の持続性を調べるため、Sprague Dawleyラットの腸骨静脈中に、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)500μl中の試験プラスミド500μgを注入した。各試験プラスミドまたは対照群に対し、ラット5匹を使用した。対照動物では、Liら、Gene Therapy 2001, 8: 494〜497に記載されているCMVプロモーター/エンハンサー(上流522から1)を含有するプラスミドを使用した。注入後1日、7日、および21日で、血液を採取し、実施例1に記載されているように、血清のSEAP活性を定量した。
【００６９】
種々のプロモーター/エンハンサー・キメラ間でSEAP発現レベルを比較した。各群の平均値として算出した、SEAP発現レベルが図2、および一覧形式として表2に示されている。明示されているように、CMV対照に匹敵するSEAP発現レベルが、試験した全てのキメラで7日までに得られたが、DC-301は21日まで、最大の発現持続性を示した。DC-308、DC-310、およびDC-312に関しては、SEAP発現レベルはマウスよりもラットで僅かに高かった。デスミンまたはMCKプロモーターのいずれかに連結されたデスミンまたはMCKエンハンサーにより、良好な持続性発現が得られた。このことが、図2においては、以下の構築物で例証されている:DC-301、DC-308、DC-310、DC-317、DC-318、およびDC-320。
【００７０】
本明細書は、本明細書中に引用されている参考文献の開示を参照して完全に理解されると思われ、その全てが、その全体において参照として本明細書に組み入れられる。本明細書中の態様は、本発明の態様を説明するものであって、本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。当業者は、その他の多くの態様が特許請求の範囲に記載されている本発明により包含されること、および本明細書および本実施例は単なる例示に過ぎず、本発明の真の範囲および精神は添付の特許請求の範囲により示されるものであることを認識する。
【００７１】
（表１）試験プラスミド一覧表
【００７２】
（表２）時間関数で表したラットでのSEAP発現(ng/ml)
【図面の簡単な説明】
【００７３】
【図１】種々のエンハンサー/プロモーターの組み合わせを含む試験プラスミドを筋肉注射した後の、血清中に分泌されたアルカリフォスファターゼ(SEAP)の量を示す図表である。試験プラスミドあたりマウス5匹を使用した。注射から3日後に測定した血清SEAP量を、ヒト・サイトメガロウイルス(CMV)プロモーターおよびエンハンサー要素を含むプラスミドを注射した対照群に対する百分率として表している。試験プラスミドは表1に示されている。
【図２】種々のエンハンサー/プロモーターの組み合わせを含むプラスミドを全身投与後、3週間までの血清SEAPの発現量を表すグラフを示す。投与から3日、7日および21日後に血清SEAP量を測定した。試験プラスミドあたりラット5匹を使用した。試験プラスミドは表1に示されている。
【０００１】
本願は2001年5月24日に出願された米国特許仮出願第60/293,304号の優先権を主張するものである。
【０００２】
発明の詳細
発明の分野
本発明は、組織特異的発現ベクターを利用した遺伝子治療法に関する。本発明はさらに、導入遺伝子を筋肉へ輸送するために使用される発現ベクターに関する。より具体的には、本発明は、導入遺伝子の筋肉中での発現を増強させ持続させる転写調節要素に関する。
【０００３】
【背景技術】
【０００４】
発明の背景
遺伝子治療とは、既存の異常を修正するか、または細胞に対して新たに有益な機能をもたらす外因性遺伝物質の細胞内輸送である。直接注入に際して迅速にアクセス可能であること、比較的容易且つ低侵襲的な方法であるが故に、筋肉は遺伝子治療のための重要な標的組織である。さらに、筋肉では、細胞代謝回転率が高い組織と比較して、発現持続性をより大きくすることが可能である。例えば、骨格筋は、遺伝子治療をいろいろな治療に適用する上での標的組織として研究されている。筋肉により分泌されるタンパク質の産生から恩恵を受けていると思われる遺伝子産物の異常により引き起こされる多数の既知の疾患が存在する。家族性高コレステロール血症、血友病、ゴーシェ病およびファブリー病、並びにII型糖尿病はほんの僅かな例である。そのような疾患の多くは、遺伝子治療で改善される可能性がある(Siatskasら、J. Inherit. Metab. Dis. 2001, 24 (Suppl. 2): 25〜41; Barrangerら、Expert Opin. Biol. Ther. 2001, 1(5): 857〜867; Barrangerら、Neurochem. Res. 1999, 24(5): 601〜615)。
【０００５】
外因性遺伝物質を種々の組織および器官、並びにとりわけ筋肉組織に輸送するために、種々の発現ベクターが開発されてきた。総説としては、「Gene Expression Systems」（J.M. FernandezおよびJ.P. Hoeffler編、Academic Press, San Diego, CA, 1999）を参照されたい。概して、各発現系には特定の欠点が有り、インビボにて所望の発現レベルを持続可能な様式で得ることは難関である。
【０００６】
例えば、レトロウイルスベクターの核酸を宿主ゲノムに組み込むことができ、その結果、ベクターにより運ばれる導入遺伝子の持続発現が可能となる。しかし、レトロウイルスベクターの感染力は、進行中の細胞増殖に依存する。故に、これらのベクターのインビボ輸送は不十分であると思われる。それに対して、アデノウイルス遺伝子導入ベクターを全身注入により輸送する場合、導入遺伝子の高レベル発現が観察されている(Rosefeldら、Science 1991, 252: 431〜434)ものの、そのような発現は一過性であると思われ、注入を繰り返し行うことが必要となると考えられる。宿主免疫反応を無効にすることにより、さらにウイルスベクターの効果が制限される可能性がある(Yangら、Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1994, 91: 4407〜4411; Kozarskyら、J. Biol. Chem. 1994, 269: 13695〜13702)。裸のプラスミドDNAの注入のような、非ウイルス性遺伝子導入法も同様に記述されているが、遺伝子導入レベルは一般的に低く、臨床適用には不十分である(Maloneら、J. Biol. Chem. 1994, 269: 29903〜29907; Hickmanら、Hum. Gene Ther. 1994, 5: 1477〜1483)。
【０００７】
筋肉は非常に血管が発達しているが、導入遺伝子産物の循環系への分泌はいささか不十分であると思われる。分泌が低いことに加え、筋特異的ベクター由来の導入遺伝子の発現レベルが潜在的に低いことにより、遺伝子治療の適用範囲が循環する治療用タンパク質量が低くても足るものに制限されてしまう可能性がある。遺伝子治療に関する別の課題は、高度に標的化された方法により、作用物を選択組織に輸送することであると思われる。筋肉のような大きくて分散化された組織への効果的なトランスフェクションには、通常、全身輸送が必要とされる。しかし、ほとんどの既知のウイルス性および非ウイルス性の発現ベクターは、全身投与後の異所性発現と関連した副作用を伴う可能性がある。組織特異的発現により、この問題を克服できる。標的組織だけで活性なプロモーターおよびエンハンサーのような転写調節要素を利用することにより、組織特異的発現を実現できる。
【０００８】
従って、本発明の主な目的は、筋肉組織における導入遺伝子の持続発現に最適な発現ベクターを提供することである。本発明の別の目的は、種々の発現系において持続性且つ適当な発現レベルを制御できるエンハンサー/プロモーターの組み合わせを提供することである。
【０００９】
これらの目的は、導入遺伝子の転写を持続的な方法によって促進するキメラ調節要素を作製するための、筋特異的プロモーターと筋特異的エンハンサー由来の最小配列を組み合せることにより実現される。得られたキメラ調節要素は、筋肉における導入遺伝子の発現による遺伝子治療のほか、トランスフェクトされた、ミオサイトのような筋細胞における外因性タンパク質の長期発現が必要とされるその他の適用に対しても有効である。本発明の種々の筋特異的エンハンサー/プロモーターの組み合わせは、培養細胞またはインビボにおける遺伝子発現のための、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス(AVV)、レトロウイルス、およびプラスミドを基礎としたベクターとの関連において有用であるかもしれない。
【発明の開示】
【００１０】
発明の概要
本発明により、導入遺伝子の発現を筋肉に標的化するのに有用なキメラ調節要素が提供される。本発明のキメラ調節要素には、筋肉において選択的に導入遺伝子の持続性発現を可能とする筋特異的プロモーターおよび筋特異的エンハンサーの組み合わせが含まれる。
【００１１】
本発明はまた、1つまたは複数の操作可能に連結された本発明の組織特異的な調節要素を含む組換え型導入遺伝子を対象とする。導入遺伝子に操作可能に連結された筋特異的プロモーターおよびエンハンサーを含む組織特異的調節要素により、ミオサイトおよび特に、心筋細胞においてその発現が促進される。関連するコードDNA配列の発現を筋肉に標的化する組換え型ウイルスベクターに導入遺伝子を挿入してもよい。本発明において有用な筋特異的プロモーターには、哺乳類筋肉クレアチン・キナーゼ(MCK)プロモーター、または哺乳類デスミン(DES)プロモーターが含まれる。または、プロモーター要素は、哺乳類MCKプロモーター、哺乳類トロポニンI(TNNI2)プロモーターまたは哺乳類骨格α-アクチン(ASKA)プロモーターからなる群より選択される。ある特定の態様において、プロモーターはヒト・プロモーターである。他の態様において、プロモーターはマウス・プロモーターである。ある態様において、プロモーターは短縮されている。
【００１２】
本発明において有用な組織特異的エンハンサーは、哺乳類MCKエンハンサー、哺乳類DESエンハンサー、および脊椎動物トロポニンI IRE(TNI IREは、以下、FIREとする)エンハンサーからなる群より選択される。ある態様において、エンハンサーは哺乳類MCKエンハンサーまたは哺乳類デスミン(DEは、以下、DESとする)エンハンサーである。他の態様において、エンハンサーは哺乳類DESエンハンサーまたは脊椎動物FIREエンハンサーである。筋特異的な調節要素を提供するために、これらの筋特異的エンハンサー要素の1つまたは複数を、本発明の筋特異的プロモーターと組み合せて使用してもよい。ある態様において、エンハンサーはヒトまたはマウスに由来する。その他の態様において、FIREエンハンサーはトリ・エンハンサーである。ある態様において、FIREプロモーターはウズラ・プロモーターである。ある態様において、エンハンサー/エンハンサーまたはエンハンサー/プロモーターの組み合わせは異種である、即ち、2つ以上の種に由来する。他の態様において、エンハンサーおよびプロモーターは同一種に由来する。ある態様において、エンハンサー要素は短縮されている。
【００１３】
特定の態様において、本発明の調節要素は、DESプロモーターと操作可能に連結されたMCKエンハンサーを少なくとも1つ含む。関連する態様において、調節要素はさらに、少なくとも1つのFIREエンハンサーを含み、選択的に少なくとも1つのDESエンハンサーを含む。その他の態様において、本発明の調節要素は、MCKプロモーターまたはDESプロモーターに連結したMCKエンハンサーを少なくとも2つ含む。さらにもう一つの態様において、調節要素はDESプロモーターに連結したDESエンハンサーを少なくとも2つ含む。
【００１４】
本発明には、本発明の調節要素を含有するベクターが含まれる。一部の態様において、調節要素は非ウイルス性のプラスミドを基礎としたベクターに組み込まれる。その他の例示的態様において、本発明の調節要素はアデノウイルス、アデノ随伴ウイルス(AAV)、またはヒト免疫不全ウイルス(HIV)のようなレンチウイルスを含むレトロウイルスに由来するもののようなウイルスベクターに組み込まれる。本発明にはまた、本発明のベクターを利用して、筋肉組織を感染させる方法が包含される。
【００１５】
本発明にはさらに、本発明のエンハンサー/プロモーターの組み合わせを含む核酸でトランスフェクトした細胞が含まれる。
【００１６】
本発明のさらなる目的および利点は、以降の説明の中で部分的に述べられ、そしてその説明から部分的に明らかになる、または本発明を実践することにより分かると思われる。本発明の目的および利点は、特に添付の特許請求の範囲に示される要素および組み合わせにより理解されおよび実現される。
【００１７】
前述の一般的な説明と後述の詳細な説明の両方ともに例示および説明に過ぎず、特許請求の範囲に記載されるようには、本発明を限定するものではないことを理解されるべきである。
【００１８】
発明の詳細な説明
「筋特異的」という用語は、必要に応じて、「組織特異的」または「組織選択的」と同じ意味で使用され、それらの由来にかかわらず筋肉組織または筋細胞において導入遺伝子の発現を排他的または選択的に促進させる、プロモーターおよびエンハンサーのような調節要素の能力を指す。
【００１９】
本明細書で使用される「ミオサイト」という用語は、適当な条件の下で筋特異的な表現型を発現できるような、前駆筋芽細胞から分化した細胞を指す。最終分化したミオサイトは互いに融合して、筋繊維の主要な構成成分である管状筋細胞を形成する。「ミオサイト」という用語はまた、脱分化したミオサイトを指す。その用語には、細胞が初代であるか継代であるかにかかわらず、インビボの細胞およびエクスビボの培養細胞が含まれる。
【００２０】
核酸のハイブリダイゼーションと関連して「ストリンジェントな条件」という用語は、その条件で有意に同一であるかまたは相同である配列を有するオリゴヌクレオチドがハイブリダイズできる、即ち相補的に結合できる、インキュベーションおよび洗浄の条件を指すものである。その条件は、少なくとも20ヌクレオチド長であって且つ少なくとも約70%が同一である配列がハイブリダイズできるよう選択される。ストリンジェントな条件は当技術分野において周知であり、それらの例は「Current Protocols in Molecular Biology」Ausubelら編、John Wiley & Sons, Inc. 1995、およびSambrookら、「Molecular Cloning: A Laboratory Manual」第2版. Cold Spring Harbor Press 1989において見出せる。2つの配列間の同一性の割合は、Altshulら、J. Mol. Biol. 1990, 215: 403〜410に説明されているように、Basic Local Alignment Tool(BLAST)を利用して決定される。
【００２１】
「導入遺伝子」という用語は、「挿入遺伝子」または「発現遺伝子」、および必要に応じて「遺伝子」と同じ意味で使用される。「導入遺伝子」は、細胞に導入された場合、例えば、治療的に有用なタンパク質の発現のような、有益な特性を細胞に付与するよう、適当な条件の下で転写され得るポリヌクレオチドを指す。必要に応じて「導入遺伝子」という用語には、コード配列とポリアデニル化シグナル、プロモーター、エンハンサー、リプレッサーなどのような、任意の非コード調節配列の組み合わせが含まれると理解されるべきである。
【００２２】
「トランスフェクション」という用語は、「遺伝子導入」、「形質転換」、および「形質導入」という用語と同じ意味で使用され、ポリヌクレオチドの細胞内導入を意味する。「トランスフェクション効率」とは、トランスフェクションされた細胞により取り込まれた導入遺伝子の相対量を指す。実際には、トランスフェクション効率は、トランスフェクション操作後に発現したレポーター遺伝子産物の量により推定される。
【００２３】
本明細書で使用される「トランスフェクション媒体」とは、細胞壁を越えるポリヌクレオチドの移送を容易にできる物質を記述する。
【００２４】
「ベクター」という用語は、「導入遺伝子輸送ベクター」、「発現ベクター」、「発現モジュール」、「発現カセット」、「発現構築物」および必要に応じて、「本発明の核酸」と同じ意味で使用される。「ベクター」は、「宿主細胞」と呼ばれる細胞中にトランスフェクトすることができ、結果としてその配列の全てまたは一部が転写される、ウイルス性または非ウイルス性の、原核生物または真核生物の、DNAまたはRNA配列を指す。転写産物が発現されることは必ずしも必要ではない。ベクターがコード配列を有する導入遺伝子を含んでいることもまた、必ずしも必要ではない。ベクターには、異なるウイルス、細菌、または哺乳類の遺伝子に由来する要素の複合物として組み立てられることが多い。ベクターは、選択マーカーをコードする配列、細菌におけるそれらの増殖を促進させる配列、または特定の細胞種においてのみ発現する1つ若しくは複数の転写単位のような種々のコード配列および非コード配列が含まれる。例えば、哺乳類発現ベクターには、細菌におけるベクターの増殖を促進させる原核生物の配列および真核細胞においてのみ発現する1つまたは複数の真核生物の転写単位の双方が含まれることが多い。発現ベクターの設計は、形質転換される宿主細胞の選択、所望のタンパク質の発現レベルなどのような要因に依存し得ることは、当業者により理解される。
【００２５】
「プロモーター」という用語は、「プロモーター要素」および「プロモーター配列」と同じ意味で使用される。同様に、「エンハンサー」という用語は、「エンハンサー要素」および「エンハンサー配列」と同じ意味で使用される。「プロモーター」は、導入遺伝子のコード配列の転写を開始するのに十分な導入遺伝子の最小配列を指す。プロモーターは構成性であっても誘導性であってもよい。構成性プロモーターは、導入遺伝子の発現をサイトメガロウイルス・プロモーター(CMV) (Boshartら、Cell 1985, 41: 521)のそれに匹敵するレベルで促進させる場合、強力なプロモーターであると考えられる。プロモーターを、適当な細胞内調節因子と結合した場合、プロモーター依存的な転写を促進(「エンハンサー」)するまたは抑制(「リプレッサー」)する、他の調節配列/要素と結合してもよい。プロモーター、エンハンサー、またはリプレッサーは、これらの要素が導入遺伝子の転写率または効率を制御するかまたはそれらに影響を及ぼす場合、導入遺伝子に「操作可能に連結されている」と言われる。例えば、導入遺伝子のコード配列の5'末端近位のプロモーター配列は通常、導入遺伝子と操作可能に連結されている。本明細書にて使用される「調節要素」という用語は、「調節配列」と同じ意味で使用され、プロモーター、エンハンサー、およびその他の発現制御要素、またはそのような要素の任意の組み合わせを指す。
【００２６】
プロモーターは、それらが制御する遺伝子の5'(上流)に位置している。真核生物のプロモーターの多くは、2種類の認識配列、すなわちTATAボックスおよびその上流のプロモーター要素を含んでいる。転写開始部位の25〜30塩基対上流に位置するTATAボックスは、RNA合成が正しい部位から開始されるようRNAポリメラーゼIIの制御に関与していると考えられている。その一方で、その上流のプロモーター要素は、転写が開始される割合を決定している。これらの要素はその方向に関係なく作用できるが、TATAボックスの100〜200塩基対上流内に位置している必要がある。
【００２７】
エンハンサー要素は、連結された同種または異種のプロモーター由来の転写を最大1000倍まで刺激することができる。エンハンサー要素はしばしば、たとえその方向が逆向きであっても活性のままである(Liら、J. Bio. Chem. 1990, 266: 6562〜6570)。さらに、プロモーター要素とは異なり、エンハンサーは転写開始部位の下流であっても、例えばイントロン内、またはプロモーターからかなり離れている場合でさえも活性で有り得る(Yutzeyら、Mol. and Cell. Bio. 1989, 9:1397〜1405)。
【００２８】
当技術分野において周知であるように、プロモーター機能を喪失させることなく、この距離をいくつか変化させて調節できる。同様に、導入遺伝子に対する調節要素の位置を、機能を喪失させることなく有意に変化させることができる。調節要素の複数コピーは、協調して作用できる。典型的には、発現ベクターは、5'から3'の方向で、プロモーター配列に先行する1つまたは複数のエンハンサー配列を、その全てが後ろにポリアデニル化シグナルの続く導入遺伝子に操作可能に連結されるように含んでいる。
【００２９】
細胞遺伝子のエンハンサーの多くは、特定の組織または細胞種においてのみ機能する。さらに、いくつかのエンハンサーは、ホルモンまたは金属イオンのようなインデューサーの存在により作り出される特定の条件下でのみ活性になる。細胞エンハンサーの特異性に関するこれらの相違により、真核生物発現ベクター中に組み込まれるプロモーターおよびエンハンサー要素の選択は、組換え遺伝子が発現される細胞種により決定される。
【００３０】
ウイルス由来のエンハンサー要素は、一般的に宿主範囲が広く、種々の組織で活性である。例えば、SV40初期遺伝子エンハンサーは、種々の哺乳動物種由来の多くの細胞種で無差別に活性であって、このエンハンサーを組み入れたベクターは本質的に広く利用されている(Dijkemaら、EMBO J. 1985, 4: 761)。さまざまな細胞で活性な2つの他のエンハンサー/プロモーターの組み合わせは、ラウス肉腫ウイルスゲノムの長い末端反復(LTR)(Gormanら、Proc. Natl. Sci. U.S.A. 1982, 79: 6777) およびCMV (Boshartら、Cell 1985, 41: 521) に由来する。
【００３１】
調節要素はお互いにまたは導入遺伝子に対して異種であってもよく、即ち、それらは異なる種に由来していてもよい。さらに、それらは宿主以外の種に由来していてもよい。それらはまた、同じ種であるが異なる遺伝子に由来していてもよい。または、それらは単一遺伝子に由来していてもよい。
【００３２】
デスミン調節要素
デスミンは、Z板の周囲に生ずる中間径フィラメントのファミリーに属する筋特異的な細胞骨格タンパク質であり、隣接する筋原繊維の側方配列を維持するように機能している可能性がある。種々の中間径フィラメントの発現は、発達上調節され、組織特異性を示す。例えば、ビメンチンは全ての間葉派生物のほか、筋肉および神経組織の前駆体;上皮細胞のケラチン;グリア細胞のグリア繊維性酸性タンパク質;および神経細胞の神経フィラメントで発現している。他方、デスミンは平滑骨格筋だけで発現している。
【００３３】
分化および未分化の筋原細胞および非筋原細胞において、デスミン上流の調節配列(転写開始部位に対して、上流2255ntから下流75ntの間)の制御下のクロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ(CAT)の一過性発現を比較することにより、上流228ntから下流1ntの間のヒト・デスミン・プロモーター領域は、管状筋細胞および筋芽細胞での低レベル発現に十分であるが、繊維芽細胞またはヒーラ細胞ではそうでないことが明らかにされている(Liら、J. Bio. Chem. 1990, 266: 6562〜6570)。同一の転写開始領域が別のデスミン陽性器官で利用されていることから、同一のプロモーターが起源の異なる骨格筋、心筋および平滑筋細胞では活性であることが示唆される(van Groningenら、Biochim. Biophys. Acta 1994,1217: 107〜109)。従って、このプロモーターは筋特異的である。マウス、ヒト、ハムスターおよびラット・デスミンのプロモーター配列は高度に保存されており、従って、種々の哺乳動物種由来の相同体が同様の活性を有すると予測される。
【００３４】
ヒト・デスミン(DES)プロモーターは、以下のプライマーを用いて、上流2194ntから下流1ntの5'上流領域をpCR-Blunt II TOPO (Invitrogen社, Carlsbad, CA)中にクローニングすることにより得られた:
【００３５】
ヒト配列の上流973から693ntの間に位置する280塩基対のエンハンサーには、他の筋特異的エンハンサーに対して相同ないくつかの配列が含まれている。他の筋特異的エンハンサーと異なり、デスミン(DES)エンハンサーは、筋芽細胞のほかに、管状筋細胞でも機能できる。DESエンハンサーには、二つの異なる領域が含まれており、一方の領域(上流973から848ntの間)は分化した管状筋細胞で活性であり、他方の領域(上流847から693ntの間)は未分化の筋芽細胞で活性である。上流1738から693ntの間の領域を欠失させることにより、結果として、連結させたCAT遺伝子の発現が分化した筋細胞では20倍以上減少し、未分化の筋芽細胞では8倍以上減少する。この280塩基対のエンハンサーは、方向、位置、および距離に非依存的であり、並びにデスミン・プロモーターかまたはHSV tkおよびヒト・ビメンチンのような異種プロモーターのいずれかを、C2.7管状筋細胞では約14〜50倍に、そしてC2.7筋芽細胞では約9〜16倍に活性化することができる(Liら、J. Bio. Chem. 1990, 266: 6562〜6570)。
【００３６】
ヒト筋特異的な243塩基対のDESエンハンサーの配列(上流973から731)は、配列番号:21に示されている。以下のプライマーを用いて、エンハンサーを増幅した:
筋肉クレアチン・キナーゼ調節要素
筋肉クレアチン・キナーゼ(MCK)遺伝子は、全ての横紋筋で極めて活性である。クレアチン・キナーゼは、収縮およびイオン輸送系内のATPの再生に関して重要な役割を演じている。それは解糖も呼吸もない場合に、ホスホクレアチンのリン酸基をADPに転移させてATPを形成させることにより、筋肉の収縮を可能とする。クレアチン・キナーゼには、4つの既知のイソ型が存在する:脳クレアチン・キナーゼ(CKB)、筋肉クレアチン・キナーゼ(MCK)、および2つのミトコンドリア型(CKMi)。MCKは、そのmRNAが全ての骨格筋繊維種で発現している、最も豊富な非ミトコンドリア性mRNAであり、心筋においても同様に極めて活性が高い。MCK遺伝子は筋芽細胞で発現していないが、筋芽細胞がミオサイトに最終分化する場合に、転写活性化される。MCK遺伝子の調節領域は横紋筋特異的な活性を示し、インビボおよびインビトロの広範囲にわたってその特性が示される。MCK遺伝子の主な既知の調節領域には、マウスでは転写開始部位の5'側、約1.1kbに位置する筋特異的エンハンサーと358塩基対近位にあるプロモーターが含まれる。MCK発現を調節するさらなる配列は、転写開始部位の5'側、3.3kbより上流且つ3.3kbの第一イントロン内に分布している。ヒトおよびマウス・プロモーターおよびエンハンサー要素を含む哺乳類のMCK調節要素は、Hauserら、Mol. Therapy 2000, 2:16〜25に記載されている。
【００３８】
マウスMCKプロモーター(上流496から下流37)は増幅するのが困難であることが判明した、その結果、プロモーターを3段階で作製した。第一段階として、485塩基対の産物を増幅するために、プライマー対MCK S7-MCK S11を使用した。第二段階として、189塩基対の産物を増幅するために、プライマー対MCK S9-MCK S12を使用した。第三段階として、533塩基対のプロモーターを増幅するために、MCK S11-MCK S12プライマーを用いて2つの産物を連結した。
【００３９】
筋特異的な206塩基対のマウスMCKエンハンサー(上流1256から1051)を、以下のプライマーを用いて増幅した:
【００４０】
トロポニン I 調節要素
ヘテロ二量体であるトロポニン複合体は、横紋筋の細いフィラメントに位置しており、収縮を調節するカルシウム感受性の分子スイッチとして機能している。それは3つのサブユニットから成る。トロポニンI(TnI)は、骨格筋収縮の際のアクトミオシンATPaseのカルシウムを介した調節に関与するタンパク質複合体の阻害サブユニットである。3つの既知のイソ型が存在する:骨格遅筋トロポニンI(TNNI1)、骨格速筋トロポニンI(TNNI2)、および心筋トロポニンI(TNNI3)。以前の研究により、ウズラTnI遺伝子をマウスの多能性細胞中に、または確定した(determined)筋原性細胞株中に導入した場合、適当な時期、特異性、および転写レベルを含む、正確であり筋繊維特異的な発現様式が示されることが実証されている。さらに、トランスジェニックマウス中に導入されたTnI遺伝子は、正常な発達および組織特異的な様式を示す。
【００４１】
ウズラでは、TnIプロモーター(TNNI2)は、上流530と下流60nt以内に位置している。ヒトでは、プロモーター配列は、上流146と下流19nt以内に位置している。TNI2プロモーターの配列は、配列番号:23に示されている。ヒトTNI2プロモーターを、以下のプライマーを用いて増幅した:
ウズラTnI遺伝子のイントロン内に、重要な調節エンハンサーが同定されている(Yutzeyら、Mol. and Cell. Bio. 1989, 9: 1397〜1405)。FIRE(第一内部調節要素)と呼ばれるこの領域は、下流643から781ntにかけて伸びており、E-ボックス、MEF-2様配列、CCACボックスおよびCAGG配列を含む、少なくとも4つの調節要素が含有されていることが明らかにされている(Nakayamaら、Mol. Cell. Bio. 1996, 16: 2408〜2417)。FIREエンハンサーは、位置-および方向-非依存的であり、且つ一連の異種プロモーターに筋特異的な発現様式を与えることが知られており、一方、FIREの非存在下では、ウズラTnIプロモーター領域(上流530から下流60)単独で筋特異的発現を誘導することはできない。従って、発現の組織特異性を、FIREにより制御できる。
【００４３】
139塩基対のウズラFIREエンハンサーを、以下の一連の合成オリゴヌクレオチド(Fire 1〜Fire 5)をアニールすることにより組み立てた:
【００４４】
骨格α - アクチン調節要素
アクチン多重遺伝子ファミリーは、重合して微小繊維を形成する豊富なタンパク質であって、次いで、この微小繊維が細胞形態、分裂、および運動性の維持に関して重要な役割を果たしている。脊椎動物では少なくとも6つのアクチンのイソ型が存在する:骨格-αアクチン(SkA)および心筋αアクチンは横紋筋で発現している、血管α-アクチンおよび腸内γ-アクチンは平滑筋で発現している、並びに細胞質β-およびγ-アクチンは非筋細胞で発現している。同一胚組織の多くで、SkAは心筋α-アクチンと共発現している。それは胎児心筋および胎児心室で昂進し、出生後の発育の間、これらの組織で抑制される。成人の骨格筋では、SkAは主要なイソ型である。アクチン遺伝子のコード配列は進化を通じて高度に保存されている(Alonsoら、J. Mol. Evol. 1987,194: 193〜206)が、5'および3'UTRはアクチンの異なるイソ型間では高度に保存されておらず、従って、これらの領域より通常、アイソタイプ特異的なプローブが提供される可能性がある。SkA遺伝子のいくつかの5'上流領域は、例えばヒト、マウス、ラットおよびニワトリで進化的に保存されている。ヒトおよび齧歯類の5'上流領域250nt以内の配列のうち、約73%が類似している(Taylorら、Genomics 1988, 3: 323〜336)。
【００４５】
トランスフェクション実験の結果から、時期および組織特異的な発現の双方には、ラット(Melloulら、EMBO 1984, 3: 983〜990)およびニワトリ(Grichnickら、Nucleic Acid Res. 1986, 14: 1683〜1701)SkA遺伝子の転写開始部位の上流配列で十分であることが実証されている。SkA遺伝子プロモーターの近接領域(上流153から87)は、L8細胞において筋形成の間、その遺伝子の転写の増加を調節するのに必須である。
【００４６】
ヒトα-骨格アクチン(ASKA)プロモーターの配列(上流481から下流34)は、配列番号:23に示されている。そのプロモーターを、以下のプライマーを用いて増幅した:
キメラ調節要素
本発明は、1つまたは複数の上述の組織特異的な調節要素を含む、組換え型導入遺伝子を対象とする。本発明の組織特異的なキメラ調節要素により、ミオサイトおよび特に、心筋細胞において導入遺伝子の発現が促進される。関連するコードDNA配列の発現を筋肉に標的化する組換え型ウイルスまたは非ウイルスベクターに導入遺伝子を挿入してもよい。ある態様において、プロモーター要素は、哺乳類筋肉クレアチン・キナーゼ(MCK)プロモーターおよび哺乳類デスミン(DES)プロモーターからなる群より選択される。または、プロモーター要素は、哺乳類MCKプロモーター、哺乳類トロポニンI(TNNI2)プロモーター、および哺乳類骨格α-アクチン(ASKA)プロモーターからなる群より選択される。ある特定の態様において、プロモーターはヒト・プロモーターである。その他の態様において、プロモーターはマウス・プロモーターである。ある態様において、プロモーターは短縮されている。
【００４８】
本発明の組織特異的な調節要素には、哺乳類MCKエンハンサー、哺乳類DES(DEとしても知られている)エンハンサー、および脊椎動物トロポニンI IRE(FIRE、TNI IREとしても知られている)エンハンサーからなる群より選択される、少なくとも1つのエンハンサーが含まれる。これらの筋特異的なエンハンサー要素の1つまたは複数を、本発明のプロモーター要素と組み合せて使用してもよい。ある態様において、エンハンサーはヒトまたはマウスに由来する。その他の態様において、FIREエンハンサーはトリ・エンハンサーである。特定の態様において、FIREプロモーターはウズラ・プロモーターである。ある態様において、エンハンサー/エンハンサーまたはエンハンサー/プロモーターの組み合わせは異種である、即ち、その要素は2以上の種に由来する。その他として、それらは同一種に由来する。ある態様において、既知の転写リプレッサーの結合部位が欠失するように、エンハンサー要素を切断する。
【００４９】
特定の態様において、本発明の調節要素には、DESプロモーターと操作可能に連結されたMCKエンハンサーが少なくとも1つ含まれる。その他の態様において、調節要素にはさらに、少なくとも1つのFIREエンハンサーが含まれ、選択的に、少なくとも1つのDESエンハンサーが含まれる。その他の態様において、調節要素にはMCKプロモーターまたはDESプロモーターに連結したMCKエンハンサーが少なくとも2つ含まれる。さらにもう一つの態様において、調節要素にはDESプロモーターに連結したDESエンハンサーが少なくとも2つ含まれる。
【００５０】
当然のことながら、本発明の調節要素は、本明細書に記載の特定の配列に限定されることはなく、それらの構造的および機能的類似体/相同体も含まれる。そのような類似体には、切断、欠失、挿入のほか、特異的変異誘発によるか、またはランダム変異誘発のいずれかにより導入される1つまたは複数のヌクレオチドの置換が含まれてもよい。既知の転写リプレッサーに対する1つまたは複数の結合部位を欠失させるために、切断することができる。さらに、そのような配列は、本発明の配列と高い同一性を示す、天然に存在する配列に由来してもよい。20ヌクレオチドまたはそれより大きい核酸が、ストリンジェントな条件の下で、本発明のプロモーター/エンハンサー配列とハイブリダイズする場合、そのプロモーター/エンハンサー配列と高い同一性を有すると考えられる。または、核酸が例えば、Altshulら、J. Mol. Biol. 1990, 215: 403〜410,Needlemanらのアルゴリズム, J. Mol. Biol. 1970, 48: 444〜453, またはMeyersらのアルゴリズム, Comput. Appl. Biosci. 1988, 4: 11〜17に記載のBasic Local Alignment Tool(BLAST)のような標準的なアライメント・アルゴリズムによる決定により、少なくとも60%、 65%、 70%、 75%、 80%、 85%、 90%、 95%またはそれ以上の割合の同一性を有する少なくとも20ヌクレオチドの連続配列を含む場合、本発明のプロモーター/エンハンサー配列と高い同一性を有すると考えられる。限定ではないが類似体の例として、例えば様々な種に由来する相同的なプロモーター配列および相同的なエンハンサー配列が本明細書に記載されている。
【００５１】
本発明にはさらに、本発明の調節要素を含有するベクターが含まれる。一般的には、本発明の調節要素の任意のベクターでの使用に関する制限は知られていない。ある態様において、調節要素は非ウイルス性のプラスミドを基としたベクターに組み込まれる。その他の例示的態様において、本発明の調節要素はアデノウイルス、アデノ随伴ウイルス(AAV)、またはヒト免疫不全ウイルス(HIV)のようなレンチウイルスを含むレトロウイルスに由来するようなウイルスベクターに組み込まれる。
【００５２】
本発明において、導入遺伝子には、糖尿病、または筋肉系、筋肉疲労、若しくは筋肉修復の疾患および病気に関与するタンパク質をコードするDNA配列が含まれてもよい。本発明のベクターには、治療用ポリペプチドをコードする配列を含有する導入遺伝子が含まれてもよい。遺伝子治療に関して、そのような導入遺伝子は所望の治療成果を基にして選択される。それは例えば、抗体、ホルモン、酵素、受容体、若しくは関心のある他のタンパク質または例えば、TGF-β受容体、グルカゴン様ペプチド1、ジストロフィン、レプチン、インスリン、プレプロインスリン、フォリスタチン、PTH、FSH、IGF、EGF、TGF-β、骨形成タンパク質、その他の組織増殖および調節因子、増殖ホルモン、並びに血液凝固因子のようなそれらの断片をコードしてもよい。例えば、リソソーム蓄積症の治療では、グルコセレブロシダーゼ、α-ガラクトシダーゼ、β-グルクロニダーゼ、α-リズロニダーゼ(Alpha-Liduronidase)、イズロネートスルファターゼ、α-N-アセチルガラクトサミニダーゼ、スフィンゴミエリナーゼおよびα-グルコシダーゼのような酵素をコードする導入遺伝子を使用できる。家族性高コレステロール血症の治療では、例えば、LDL受容体をコードする導入遺伝子を使用できる(Kobayashiら、J. Biol. Chem. 271: 6852〜6860)。
【００５３】
本発明には、本発明のベクターを使用して筋肉組織にトランスフェクトする方法が包含される。当然のことながら、本発明のベクターは、被験者に投与されるトランスフェクション媒体の種類により、または投与法により限定されることはない。トランスフェクション媒体には、細胞表面およびポリヌクレオチド自体の帯電を減少させるか、または細胞壁の透過性を増加させる化合物が含まれてもよい。例としては、陽イオン性リポソーム、リン酸カルシウム、ポリリジン、血管内皮増殖因子(VEGF)などが含まれる。例えば、塩化ナトリウム、糖質、または多価アルコールを含有する高張液をまた、細胞外浸透圧を増加させ、これによりトランスフェクション効率を増加させるために使用できる。トランスフェクション媒体にはまた、タンパク質分解酵素およびリパーゼのような酵素、温和な界面活性剤および細胞膜の透過性を増加させる他の化合物が含まれてもよい。本発明の方法は、任意の特定のトランスフェクション媒体の組成物に限定されることはなく、被験者に対して毒性がないか、またはその毒性が許容限界内である限り、任意の適当な媒体を用いて本発明の方法を実践できる。限定ではないが適当なトランスフェクション媒体が本明細書に列挙されている。
【００５４】
本発明にはまた、本発明のエンハンサー/プロモーターの組み合わせを含有するDNAを用いてトランスフェクトした細胞が含まれる。単離した核酸を用いて細胞をトランスフェクトするための標準的な方法は、当業者に周知である。トランスフェクトした細胞を、例えば、導入遺伝子の同一性を確認するために;生合成および導入遺伝子によりコードされるタンパク質の細胞内輸送を研究するために;または後に被験者へ再移植する目的で細胞をエクスビボで培養するためなどに、使用できる。インビボ筋肉注射およびミオサイトのエクスビボ・トランスフェクションの方法は、当技術分野において周知である。例えば、Shahら、Transplantation 1999, 31: 641〜642; Dalyら、Human Gene Therapy 1999, 10: 85〜94を参照されたい。
【００５５】
本発明のベクターと共に使用できる宿主細胞は、全ての筋肉種、例えば骨格筋、心筋、平滑筋などに見られるミオサイトである。ミオサイトは、以下に限定さないが、ヒト、オランウータン、サル、チンパンジー、イヌ、ネコ、ラット、ウサギ、マウス、ウマ、ウシ、ブタ、ゾウなどを含む任意の脊椎動物種に見られ、且つ単離できる。または、宿主細胞を、原核細胞、例えばベクターを増幅させるために使用される、大腸菌のような細菌性細胞とすることができる。
【００５６】
特定の環境では、完全に分化した筋芽細胞よりもむしろ間葉前駆体細胞または筋芽細胞のようなミオサイトの前駆細胞を使用することが望ましいと考えられる。そのような細胞を単離できる組織の例には、胎盤、臍帯、骨髄、皮膚、筋肉、骨膜または軟骨膜が含まれる。ミオサイトは、そのような細胞を例えば、組織培養でそれらの分化を誘導させることにより得ることができる。本発明には、ミオサイトの前駆体/前駆細胞だけでなく、ミオサイトに分化転換できる細胞、例えば脂肪細胞および繊維芽細胞もまた包含される。
【００５７】
ミオサイトが分化される、発達のある段階まで導入遺伝子の発現が抑制されるように、治療用導入遺伝子を含有する本発明のベクターを胚に注入することも望ましいと考えられる。例えば、Gene Expression Systems, Eds. J. M. FernandezおよびJ. P. Hoeffler, Academic Press, San Diego, CA, 1999を参照されたい。
【００５８】
本発明の他の態様は、本明細書を考慮し本明細書に開示されている本発明を実践することにより当業者には明らかである。本明細書および本実施例は単なる例示に過ぎず、本発明の真の範囲および精神は添付の特許請求の範囲により示されると意図される。試験動物で代表的に実験が行われているが、ヒトでも同様の結果が期待される。ヒトへの注入を目的として使用される正確なパラメータは、当業者により容易に決定され得る。
【００５９】
実施例
実施例 1: ベクター構築
制限酵素、T4 DNAリガーゼ、DNAポリメラーゼIおよび大断片(Klenow)は、New England BioLabs社(Beverly, MA)から購入した。
【００６０】
マウスおよびヒトゲノムDNAは、Clontech社(Palo Alto, CA)から購入した。ゲノムDNAからの調節要素のPCR増幅を、発明の詳細な説明に示されているプライマーを用い、登録商標VentR DNAポリメラーゼ(New England BioLabs社, Beverly, MA)を使って以下のように実施した:94℃で4分間、45℃で2分間、および68℃で5分間を1サイクル、その後、94℃で1分間、55℃で2分間、および68℃で5分間を34サイクル。サルウイルス40(SV40)エンハンサー由来の72塩基対の繰り返しを含有するSV72エンハンサー要素は、Liら、Gene Therapy 2001, 8: 494〜497に記載されている。ファージミドまたはプラスミドベクター中にクローニングされるDNA制限断片を、DEAE紙を用いてアガロースゲルから単離し、Sambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual,第2版, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989に記載されているようにクローニングした。
【００６１】
種々のエンハンサーの複数コピーを、標準的な組換えDNA法を用い、登録商標Litmus 28(New England BioLabs社, Beverly, MA)のSpe IとBsiW I部位間にクローニングした。ヒトα骨格アクチン・プロモーター(ASKA; 上流481から下流34)およびヒト・トロポニン・プロモーター(TNNI2;上流146から下流19)を、登録商標Litmus 28のEcoR IとBamH I間にクローニングし、一方、ヒト筋肉クレアチン・キナーゼ・プロモーター(MCK;上流496から下流37)およびヒト・デスミン・プロモーター(DES;上流2194から下流1)を、pCR-Blunt II-TOPO(Invitrogen社, Carlsbad, CA)中にクローニングした。デスミン・プロモーターを、エンハンサーと結合させる前に、Pst I(上流228)部位でトランケートした。プロモーターおよびエンハンサー要素の完全性を検証するために塩基配列解析を行った。
【００６２】
分泌型アルカリフォスファターゼ(SEAP)レポーター遺伝子を転写させる筋肉キメラを生成するために、筋特異的なプロモーター・キメラをpCFA-HI-SEAP発現ベクター中に導入する上で、標準的なクローニング方法を利用した。pCF1-SEAPとしても知られるpCFA-HI-SEAPプラスミドは、Yewら、Hum. Gen. Ther. 1997, 8: 575〜584に記載されている。
【００６３】
全てのプラスミドを、Qiagen plasmid Maxi kit(Qiagen社, Valencia, CA)を用いて調製した。動物に注入する前に、内毒素を除去するため、登録商標Triton X-100(Sigma-Aldrich社, St. Louis, MO)を用いてプラスミドを抽出した。
【００６４】
作製したプラスミドの一覧が表1に示されており、ここで「L28」は登録商標Litmus 28を表し;「HI」はハイブリッドイントロン(配列は、MacGregorら、Nucleic Acids Research 1989, 17: 2365に記載されている)を表し;「＞」はエンハンサー配列が順向き(5'→3')であることを表し;「＜」はエンハンサー配列が逆向き(3'→5')であることを表し;および必要に応じて、括弧内の数値は、挿入されているエンハンサー要素の数を表しているか、またはもとの遺伝子におけるプロモーターのヌクレオチドの位置を表している。
【００６５】
実施例 2: マウスでの短期間発現
BALB/Cマウスの前脛骨筋中に、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)50μl中の試験プラスミド50μgを注入した。各試験プラスミドまたは対照群に対し、マウス5匹を使用した。対照動物では、Liら、Gene Therapy 2001, 8: 494〜497に記載されているCMVプロモーター/エンハンサー(上流522から1)を含有するプラスミドを使用した。
【００６６】
トランスフェクションの全体的効率を、動物の血清中のSEAP濃度を測定することにより評価した。注入後7日で、血液を眼窩内採取した。血清を65℃まで加熱して内在性アルカリフォスファターゼを変性させ、Sigma-Aldrich社(St. Louis, MO)のアルカリフォスファターゼ試薬および標準品としてCalbiochem社(LaJolla, CA)のヒト胎盤アルカリフォスファターゼを用い、製造元の使用説明書に従って、SEAP活性を定量した。観測されたSEAP発現レベルを、CMV対照との比率として標準化した。
【００６７】
各群の平均値として算出した、種々のプロモーター/エンハンサー・キメラのSEAP発現レベルが図1に示されている。図1に示されているように、切断型デスミン・プロモーター・構築物であるDC-308、DC-309、DC-310、およびDC-312は、CMV対照の3分の1を越える発現レベルを示した。ASKAキメラであるDC-276並びにMCKキメラであるDC-300およびDC-301は、SEAPをデスミン・プロモーター・構築物の発現レベルの約半分発現したが、その他の発現は、CMV対照の10%未満であった。
【００６８】
実施例 3: ラットでの長期間発現
種々のエンハンサー/プロモーターの組み合わせにおける発現の持続性を調べるため、Sprague Dawleyラットの腸骨静脈中に、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)500μl中の試験プラスミド500μgを注入した。各試験プラスミドまたは対照群に対し、ラット5匹を使用した。対照動物では、Liら、Gene Therapy 2001, 8: 494〜497に記載されているCMVプロモーター/エンハンサー(上流522から1)を含有するプラスミドを使用した。注入後1日、7日、および21日で、血液を採取し、実施例1に記載されているように、血清のSEAP活性を定量した。
【００６９】
種々のプロモーター/エンハンサー・キメラ間でSEAP発現レベルを比較した。各群の平均値として算出した、SEAP発現レベルが図2、および一覧形式として表2に示されている。明示されているように、CMV対照に匹敵するSEAP発現レベルが、試験した全てのキメラで7日までに得られたが、DC-301は21日まで、最大の発現持続性を示した。DC-308、DC-310、およびDC-312に関しては、SEAP発現レベルはマウスよりもラットで僅かに高かった。デスミンまたはMCKプロモーターのいずれかに連結されたデスミンまたはMCKエンハンサーにより、良好な持続性発現が得られた。このことが、図2においては、以下の構築物で例証されている:DC-301、DC-308、DC-310、DC-317、DC-318、およびDC-320。
【００７０】
本明細書は、本明細書中に引用されている参考文献の開示を参照して完全に理解されると思われ、その全てが、その全体において参照として本明細書に組み入れられる。本明細書中の態様は、本発明の態様を説明するものであって、本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。当業者は、その他の多くの態様が特許請求の範囲に記載されている本発明により包含されること、および本明細書および本実施例は単なる例示に過ぎず、本発明の真の範囲および精神は添付の特許請求の範囲により示されるものであることを認識する。
【００７１】
（表１）試験プラスミド一覧表
（表２）時間関数で表したラットでのSEAP発現(ng/ml)
【図面の簡単な説明】
【００７３】
【図１】種々のエンハンサー/プロモーターの組み合わせを含む試験プラスミドを筋肉注射した後の、血清中に分泌されたアルカリフォスファターゼ(SEAP)の量を示す図表である。試験プラスミドあたりマウス5匹を使用した。注射から3日後に測定した血清SEAP量を、ヒト・サイトメガロウイルス(CMV)プロモーターおよびエンハンサー要素を含むプラスミドを注射した対照群に対する百分率として表している。試験プラスミドは表1に示されている。
【図２】種々のエンハンサー/プロモーターの組み合わせを含むプラスミドを全身投与後、3週間までの血清SEAPの発現量を表すグラフを示す。投与から3日、7日および21日後に血清SEAP量を測定した。試験プラスミドあたりラット5匹を使用した。試験プラスミドは表1に示されている。
Claims (41)
- プロモーターおよびエンハンサー要素が操作可能に連結された、以下の要素を含む、遺伝子発現のための組換え型筋特異的調節要素:
(a)哺乳類筋肉クレアチン・キナーゼ(MCK)プロモーターおよび哺乳類デスミン(DES)プロモーターからなる群より選択されるプロモーター要素;並びに
(b)哺乳類MCKエンハンサー、哺乳類DESエンハンサー、および脊椎動物トロポニンI IRE (FIRE)エンハンサーからなる群より選択される少なくとも1つのエンハンサー要素。 - プロモーター要素がヒト・プロモーターである、請求項1記載の調節要素。
- プロモーター要素がマウス由来である、請求項1記載の調節要素。
- MCKプロモーターに配列番号:18のヒトMCKプロモーターが含まれる、請求項1記載の調節要素。
- DESプロモーターに配列番号:19のヒトDESプロモーターが含まれる、請求項1記載の調節要素。
- エンハンサー要素がヒト・エンハンサーである、請求項1記載の調節要素。
- エンハンサー要素がマウス・エンハンサーである、請求項1記載の調節要素。
- MCKエンハンサーに配列番号:20のマウスMCKエンハンサーが含まれる、請求項1記載の調節要素。
- DESエンハンサーに配列番号:21のヒトDESエンハンサーが含まれる、請求項1記載の調節要素。
- FIREエンハンサーがトリ・エンハンサーである、請求項1記載の調節要素。
- FIREエンハンサーが哺乳類エンハンサーである、請求項1記載の調節要素。
- FIREエンハンサーがヒト・エンハンサーである、請求項1記載の調節要素。
- FIREエンハンサーに配列番号:22のウズラ・トロポニンIエンハンサーが含まれる、請求項1記載の調節要素。
- プロモーターおよびエンハンサー要素が同一種に由来する、請求項1記載の調節要素。
- プロモーターおよびエンハンサー要素が異なる種に由来する、請求項1記載の調節要素。
- 少なくとも1つのMCKエンハンサーおよびDESプロモーターを含有する、請求項1記載の調節要素。
- 少なくとも1つのMCKエンハンサー、少なくとも1つのFIREエンハンサー、およびDESプロモーターを含有する、請求項1記載の調節要素。
- 少なくとも1つのMCKエンハンサー、少なくとも1つのFIREエンハンサー、少なくとも1つのDESエンハンサー、およびDESプロモーターを含有する、請求項1記載の調節要素。
- 少なくとも2つのMCKエンハンサーおよびMCKプロモーターを含有する、請求項1記載の調節要素。
- 少なくとも2つのMCKエンハンサーおよびDESプロモーターを含有する、請求項1記載の調節要素。
- 少なくとも2つのDESエンハンサーおよびDESプロモーターを含有する、請求項1記載の調節要素。
- 請求項1記載の調節要素を含有するベクター。
- プラスミドおよびウイルスベクターからなる群より選択される、請求項22記載のベクター。
- ウイルスベクターが、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、およびレトロウイルスからなる群より選択されるウイルスに由来する、請求項23記載のベクター。
- レトロウイルスがレンチウイルスである、請求項24記載のベクター。
- 筋肉が請求項22記載のベクターによりトランスフェクトされる、筋肉中で遺伝子を発現させる方法。
- 請求項22記載のベクターを含有するトランスフェクト宿主細胞。
- 宿主細胞が原核細胞である、請求項27記載のトランスフェクト宿主細胞。
- 宿主細胞が哺乳類細胞である、請求項27記載のトランスフェクト宿主細胞。
- 宿主細胞がミオサイトである、請求項27記載のトランスフェクト宿主細胞。
- 強力な構成性プロモーターが哺乳類MCKプロモーター、哺乳類トロポニンI(TNNI2)プロモーター、および哺乳類骨格α-アクチン(ASKA)プロモーターからなる群より選択され、且つ筋特異的エンハンサーが哺乳類トロポニンI内部調節要素(FIRE)、哺乳類筋肉クレアチン・キナーゼ(MCK)エンハンサー、および哺乳類デスミン(DES)エンハンサーからなる群より選択される、強力な構成性プロモーターおよび1つまたは複数の筋特異的エンハンサー要素を含有する、コード配列の発現に有用な組換え型導入遺伝子。
- プロモーターが、既知の転写リプレッサーに対する1つまたは複数の結合部位が欠失している切断型プロモーターである、請求項31記載の組換え型導入遺伝子。
- 請求項31記載の導入遺伝子を含有するベクター。
- ベクターが、プラスミドおよびウイルスベクターからなる群より選択される、請求項33記載のベクター。
- ウイルスベクターが、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、およびレトロウイルスから選択されるウイルスに由来する、請求項33記載のベクター。
- レトロウイルスがレンチウイルスである、請求項35記載のベクター。
- 筋肉が請求項33記載のベクターによりトランスフェクトされる、筋肉中で遺伝子を発現させる方法。
- 請求項33記載のベクターを含有するトランスフェクト宿主細胞。
- 宿主細胞が原核細胞である、請求項38記載のトランスフェクト宿主細胞。
- 宿主細胞が哺乳類細胞である、請求項38記載のトランスフェクト宿主細胞。
- 宿主細胞がミオサイトである、請求項38記載のトランスフェクト宿主細胞。
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2021168663A (ja) * | 2014-01-21 | 2021-10-28 | フレイエ ユニヴェルシテイト ブリュッセルVrije Universiteit Brussel | 筋特異的核酸調節エレメント並びにその方法及び使用 |
Families Citing this family (62)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20030157064A1 (en) * | 2001-11-09 | 2003-08-21 | Pascal Neuville | Chimeric promoters for controlling expression in muscle cells |
| US20080044393A1 (en) * | 2004-07-16 | 2008-02-21 | White Robert L | Retinal dystrophin transgene and methods of use thereof |
| US8557969B2 (en) | 2004-12-01 | 2013-10-15 | The Regents Of The University Of Michigan | Compositions and methods for regulating cardiac performance |
| WO2008054713A2 (en) * | 2006-10-30 | 2008-05-08 | Thomas Jefferson University | Tissue specific gene therapy treatment |
| US20120322861A1 (en) | 2007-02-23 | 2012-12-20 | Barry John Byrne | Compositions and Methods for Treating Diseases |
| CA2834729A1 (en) | 2011-04-06 | 2012-10-11 | Universite Pierre Et Marie Curie (Paris 6) | A skeletal muscle-specific enhancer |
| KR20150020250A (ko) | 2012-06-19 | 2015-02-25 | 유니버시티 오브 플로리다 리서치 파운데이션, 인코포레이티드 | 당뇨병을 치료하기 위한 조성물 및 방법 |
| WO2014028762A1 (en) | 2012-08-15 | 2014-02-20 | University Of Virginia Patent Foundation | Compositions and methods for treating peripheral arterial disease |
| AU2013364158A1 (en) | 2012-12-20 | 2015-07-09 | Sarepta Therapeutics, Inc. | Improved exon skipping compositions for treating muscular dystrophy |
| US9217148B2 (en) | 2013-03-14 | 2015-12-22 | Sarepta Therapeutics, Inc. | Exon skipping compositions for treating muscular dystrophy |
| KR20240094032A (ko) | 2013-03-14 | 2024-06-24 | 사렙타 쎄러퓨틱스 인코퍼레이티드 | 근육 이영양증의 치료를 위한 엑손 스키핑 조성물 |
| US20160220647A1 (en) * | 2013-09-09 | 2016-08-04 | University Of Washington Through Its Center For Commercialization | Proteins for targeting neuronal nitric oxide synthase to muscle sarcolemma and related methods of use |
| RU2739593C2 (ru) | 2015-03-05 | 2020-12-28 | Петер Унд Траудль Энгельхорн-Штифтунг Цур Фёрдерунг Дер Лебенсвиссеншафтен | Система презентации пептидов на клеточной поверхности |
| GB201508025D0 (en) | 2015-05-11 | 2015-06-24 | Ucl Business Plc | Fabry disease gene therapy |
| CN104894651B (zh) * | 2015-06-29 | 2017-04-12 | 天津诺禾医学检验所有限公司 | 微量起始dna的高通量测序文库构建方法及其所构建的高通量测序文库 |
| MX2018012545A (es) | 2016-04-14 | 2019-06-10 | Benitec Biopharma Ltd | Reactivos para el tratamiento de distrofia muscular oculofaríngea (opmd) y su uso. |
| EP3471544B1 (en) | 2016-06-21 | 2021-12-22 | The Curators Of The University Of Missouri | Modified dystrophin proteins |
| TWI832036B (zh) | 2017-08-03 | 2024-02-11 | 美商航海家醫療公司 | 用於aav之遞送之組合物及方法 |
| TWI804518B (zh) | 2017-10-16 | 2023-06-11 | 美商航海家醫療公司 | 肌萎縮性脊髓側索硬化症(als)之治療 |
| US20200237799A1 (en) | 2017-10-16 | 2020-07-30 | Voyager Therapeutics, Inc. | Treatment of amyotrophic lateral sclerosis (als) |
| JP7381494B2 (ja) * | 2018-02-05 | 2023-11-15 | オーデンツ セラピューティクス，インコーポレーテッド | 転写調節要素及びその使用 |
| US20210346519A1 (en) * | 2018-02-07 | 2021-11-11 | Genethon | Hybrid regulatory elements |
| CA3097192A1 (en) | 2018-04-27 | 2019-10-31 | Voyager Therapeutics, Inc. | Methods for measuring the potency of aadc viral vectors |
| WO2019222329A1 (en) | 2018-05-15 | 2019-11-21 | Voyager Therapeutics, Inc. | Compositions and methods for delivery of aav |
| SG11202011296VA (en) | 2018-05-15 | 2020-12-30 | Voyager Therapeutics Inc | Compositions and methods for the treatment of parkinson's disease |
| EP3807404A1 (en) | 2018-06-13 | 2021-04-21 | Voyager Therapeutics, Inc. | Engineered 5' untranslated regions (5' utr) for aav production |
| AU2019299861A1 (en) | 2018-07-02 | 2021-01-14 | Voyager Therapeutics, Inc. | Treatment of amyotrophic lateral sclerosis and disorders associated with the spinal cord |
| EP3861113A1 (en) | 2018-10-04 | 2021-08-11 | Voyager Therapeutics, Inc. | Methods for measuring the titer and potency of viral vector particles |
| EP3861107A1 (en) | 2018-10-05 | 2021-08-11 | Voyager Therapeutics, Inc. | Engineered nucleic acid constructs encoding aav production proteins |
| WO2020077165A1 (en) | 2018-10-12 | 2020-04-16 | Voyager Therapeutics, Inc. | Compositions and methods for delivery of aav |
| US20210395777A1 (en) | 2018-10-15 | 2021-12-23 | Voyager Therapeutics, Inc. | EXPRESSION VECTORS FOR LARGE-SCALE PRODUCTION OF rAAV IN THE BACULOVIRUS/Sf9 SYSTEM |
| KR20210093954A (ko) | 2018-11-16 | 2021-07-28 | 아스텔라스세이야쿠 가부시키가이샤 | 유트로핀 유전자를 표적으로 하여 근이영양증을 치료하는 방법 |
| MX2021008542A (es) | 2019-01-18 | 2021-11-12 | Voyager Therapeutics Inc | Métodos y sistemas para la producción de partículas de aav. |
| CN113631706A (zh) | 2019-02-28 | 2021-11-09 | 贝尼泰克知识产权控股股份有限公司 | 用于治疗眼咽肌营养不良(opmd)的组合物和方法 |
| CN113747926A (zh) * | 2019-04-08 | 2021-12-03 | 吉尼松公司 | 用于肌肉表达的杂合启动子 |
| US20240124889A1 (en) | 2019-05-07 | 2024-04-18 | Voyager Therapeutics, Inc. | Compositions and methods for the vectored augmentation of protein destruction, expression and/or regulation |
| JP2022534627A (ja) | 2019-05-28 | 2022-08-02 | アステラス製薬株式会社 | Ｄｍｐｋ遺伝子を標的とした筋ジストロフィーの治療方法 |
| EP4013874A1 (en) | 2019-08-16 | 2022-06-22 | Modalis Therapeutics Corporation | Method for treating muscular dystrophy by targeting lama1 gene |
| US20220333133A1 (en) | 2019-09-03 | 2022-10-20 | Voyager Therapeutics, Inc. | Vectorized editing of nucleic acids to correct overt mutations |
| WO2021202651A1 (en) | 2020-04-01 | 2021-10-07 | Voyager Therapeutics, Inc. | Redirection of tropism of aav capsids |
| BR112022020753A2 (pt) | 2020-04-15 | 2022-12-20 | Voyager Therapeutics Inc | Compostos de ligação a tau |
| KR20230022175A (ko) | 2020-05-13 | 2023-02-14 | 보이저 테라퓨틱스, 인크. | Aav 캡시드의 향성 방향변경 |
| WO2021230385A1 (en) | 2020-05-15 | 2021-11-18 | Astellas Pharma Inc. | Method for treating muscular dystrophy by targeting utrophin gene |
| WO2021247995A2 (en) | 2020-06-04 | 2021-12-09 | Voyager Therapeutics, Inc. | Compositions and methods of treating neuropathic pain |
| EP4211251A1 (en) * | 2020-09-11 | 2023-07-19 | Aldevron, L.L.C. | Muscle-specific hybrid promoter |
| WO2022073041A2 (en) | 2020-09-30 | 2022-04-07 | NGGT, Inc. | Dual functional expression vectors and methods of use thereof |
| US12071633B2 (en) | 2020-10-13 | 2024-08-27 | Kriya Therapeutics, Inc. | Viral vector constructs for delivery of nucleic acids encoding cytokines and uses thereof for treating cancer |
| AR124143A1 (es) | 2020-11-25 | 2023-02-15 | Astellas Pharma Inc | Método para tratar la distrofia muscular mediante el direccionamiento al gen dmpk |
| WO2022164923A1 (en) | 2021-01-26 | 2022-08-04 | Kriya Therapeutics, Inc. | Vector constructs for delivery of nucleic acids encoding therapeutic anti-tnf antibodies and methods of using the same |
| KR20230144588A (ko) | 2021-02-12 | 2023-10-16 | 머랜드 파마슈티칼스, 인크. | 저산소증 및 허혈-관련 장애의 치료를 위한 작용제, 조성물 및 방법 |
| US20240141383A1 (en) | 2021-03-04 | 2024-05-02 | Kriya Therapeutics, Inc. | Viral vector constructs incorporating dna for inhibiting toll like receptors and methods of using the same |
| WO2023023055A1 (en) | 2021-08-16 | 2023-02-23 | Renagade Therapeutics Management Inc. | Compositions and methods for optimizing tropism of delivery systems for rna |
| CA3231523A1 (en) | 2021-09-14 | 2023-03-23 | Renagade Therapeutics Management Inc. | Acyclic lipids and methods of use thereof |
| WO2023044333A1 (en) | 2021-09-14 | 2023-03-23 | Renagade Therapeutics Management Inc. | Cyclic lipids and methods of use thereof |
| EP4405396A2 (en) | 2021-09-20 | 2024-07-31 | Voyager Therapeutics, Inc. | Compositions and methods for the treatment of her2 positive cancer |
| WO2023133561A1 (en) | 2022-01-09 | 2023-07-13 | Kriya Therapeutics, Inc. | Vector constructs for delivery of nucleic acids encoding therapeutic anti-igf-1r antibodies and methods of using the same |
| WO2023178067A1 (en) * | 2022-03-16 | 2023-09-21 | Rutgers, The State University Of New Jersey | Controlled muscle‐specific gene delivery |
| WO2023196931A1 (en) | 2022-04-07 | 2023-10-12 | Renagade Therapeutics Management Inc. | Cyclic lipids and lipid nanoparticles (lnp) for the delivery of nucleic acids or peptides for use in vaccinating against infectious agents |
| WO2023220695A2 (en) | 2022-05-13 | 2023-11-16 | Voyager Therapeutics, Inc. | Compositions and methods for the treatment of her2 positive cancer |
| WO2023250388A1 (en) | 2022-06-22 | 2023-12-28 | Voyager Therapeutics, Inc. | Tau binding compounds |
| WO2024015329A1 (en) * | 2022-07-11 | 2024-01-18 | Vita Therapeutics, Inc. | Manufacturing of therapeutic satellite cells for treating muscular dystrophy |
| WO2024059739A1 (en) | 2022-09-15 | 2024-03-21 | Voyager Therapeutics, Inc. | Tau binding compounds |
Family Cites Families (7)
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|---|---|---|---|---|
| US5266488A (en) * | 1988-04-06 | 1993-11-30 | The Regents Of The University Of California | Troponin T gene promoter and derivatives thereof |
| US5795872A (en) * | 1995-09-19 | 1998-08-18 | Pharmadigm, Inc. | DNA construct for immunization |
| US5858351A (en) * | 1996-01-18 | 1999-01-12 | Avigen, Inc. | Methods for delivering DNA to muscle cells using recombinant adeno-associated virus vectors |
| US5846528A (en) * | 1996-01-18 | 1998-12-08 | Avigen, Inc. | Treating anemia using recombinant adeno-associated virus virions comprising an EPO DNA sequence |
| WO1999055564A1 (en) * | 1998-04-24 | 1999-11-04 | Univ Florida | Materials and methods for gene therapy |
| EP1287125B1 (en) * | 2000-04-28 | 2009-07-29 | Asklepios Biopharmaceutical, Inc. | Dna sequences encoding dystrophin minigenes and methods of use thereof |
| US6593110B2 (en) * | 2000-05-04 | 2003-07-15 | California Institute Of Technology | Checkpoint-activating oligonucleotides |
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-
2007
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Cited By (2)
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