JP2004528307A - サイトカインにより媒介される炎症性状態の治療のためのピルベートおよび/またはその誘導体の使用方法 - Google Patents

サイトカインにより媒介される炎症性状態の治療のためのピルベートおよび/またはその誘導体の使用方法 Download PDF

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    • Y02A50/408Medical treatment of vector-borne diseases characterised by the agent the vector-borne disease being caused by a protozoa
    • Y02A50/411Medical treatment of vector-borne diseases characterised by the agent the vector-borne disease being caused by a protozoa of the genus Plasmodium, i.e. Malaria

Abstract

本発明は、サイトカインにより媒介される炎症状態を治療するために、α-ケトアルカン酸(ピルベート)および/またはその誘導体の化合物を含む治療用組成物を使用する方法に関する。化合物はα-ケトアルカン酸、α-ケトアルカン酸の生理学的に許容される塩、α-ケトアルカン酸のエステル、またはα-ケトアルカン酸のアミドである。生理pH値でエステルのエノール共鳴型を誘導し、安定化するための成分についても開示する。サイトカインにより媒介される炎症状態は、例えば、炎症の「早期」(腫瘍壊死因子(TNF)、インターロイキン-1β)または「遅発」(高移動度群B-1(HMGB-1))媒介物質により媒介される。サイトカインにより媒介される例示的な炎症状態としては、局所および全身性炎症、炎症性腸疾患(クローン病および潰瘍性大腸炎)、慢性関節リウマチ、喘息(喘息発作重積状態を含む)、敗血症または敗血症性ショックが挙げられ、さらに炎症性の皮膚状態、例えば、乾癬または湿疹が挙げられるが、これらに限定されるものではない。

Description

【背景技術】
【0001】
関連出願の相互参照
本願は、米国特許法§119(e)の下、「内毒素血症、敗血症および他のTHFにより媒介される炎症状態の治療のためのピルビン酸エステル組成物の使用(USE OF PYRUVATE ESTER COMPOSITION FOR THE TREATMENT OF ENDOTOXEMIA, SEPSIS AND OTHER TNF-MEDIATED INFLAMMATORY CONDITIONS)」と題する2001年3月15日に出願された米国特許仮出願第60/276,279号の利益を主張する。この特許出願については参照により全体を本明細書に組み込むものとする。
【0002】
連邦政府支援の研究または開発に関する声明
本発明に至る研究の一部は、国立衛生研究所、助成金番号第ROI GM57226-02および国防高等研究計画局(DARPA)、助成金番号第N65236-00-1-5434による助成金の下、米国政府の支援により実行された。そのため、米国政府は本発明において所定の権利を有する。
【0003】
発明の背景
炎症時、内毒素または他の炎症誘発性刺激に応答してサイトカインが無数の細胞型から分泌される。例示的なサイトカインとしては腫瘍壊死因子(TNF)、インターフェロン-γ(IFN-γ)、インターロイキン-1β(IL-β)および高移動度群(high mobility group)B-1(HMGB-1)が挙げられる。TNFはTNF受容体ファミリーの1つの受容体と相互作用する細胞関連または分泌蛋白質として機能し、その受容体は細胞内部、TNF受容体関連因子の成分と連絡する。
【0004】
サイトカインは広範囲の様々な疾患状態および症状の重要で決定的な炎症媒介物質である。例えば、TNFにより媒介される炎症により、細胞の損傷が起こり、内皮細胞上で凝結原活性が発生することにより様々な細胞障害が引き起こされ(Poberら、J.Immunol. (1986) 136(5) :1680-7)、好中球とリンパ球の接着性が増大し(Poberら、J.Immunol. (1987) 138(10):3319-24)、およびマクロファージ、好中球および血管内皮細胞からの血小板活性化因子の放出が刺激される(Camussiら、J.Exp.Med.(1987)166(5):1390-404)。
【0005】
過剰のまたは調節されていないTNF産生または活性は、慢性関節リウマチ、リウマチ様脊椎炎、骨関節症、通風性関節炎および他の関節炎状態、敗血症、敗血症性ショック、内毒素ショック、グラム陰性敗血症、毒素ショック症候群、成人呼吸窮迫症候群、大脳マラリア、慢性肺炎症疾患、珪肺症、肺サルコイドーシス、骨再吸収疾患、再灌流傷害、移植片対宿主拒絶、同種異系移植片拒絶、感染による発熱および筋痛症、感染または悪性腫瘍による悪液質、後天性免疫不全症候群(AIDS)による悪疫質、AIDS関連合併症(ARC)、ケロイド形成、はん痕組織形成、クローン病、潰瘍性大腸性および乾癬の媒介または悪化に関係する。
【0006】
例えば、特定のサイトカインに媒介される状態について詳細に説明すると、播種性細菌感染は敗血症、750,000人において発症する破局的臨床症候群を引き起こし、発症した人の約30%の死亡率に関連する(Angusら、Crit.Care.Med.、(2001)29(7):1303-10)。抗生物質は感染を根絶できるが、先天性免疫システムにより全身に放出された媒介物質は、微小血管高透過性、凝固異常、臓器不全、組織損傷および致死性ショックを含む敗血症の特徴的な徴候を媒介する(Marchallら、Crit.Care Med.(2001)29(7 Supp):S99-106)。特定の免疫誘導媒介物質の活性および機構、並びに得られるサイトカインカスケードの時間調整の役割についてはかなり理解が進んでいる。それにもかかわらず、敗血症に対する効果的な臨床治療の開発が、生存率を向上させるためには前述した作用物質を敗血症の発現前に、または症候群の発症後直ちに、与えなければならないという判断、典型的な臨床状況に適用することは明らかに困難なシナリオにより妨げられている。
【0007】
致命的な敗血症の全身性炎症媒介物質は「早期(early)」および「遅発(late)」成分を有している。TNFは致死性ショックおよび組織損傷の圧倒的な早期媒介物質である。TNFは急性感染の開始後2時間以内に放出され、「サイトカインカスケード」における他の炎症誘発性媒介物質の放出を促進する。高移動度群B-1(HMGB-1)、最初に非染色体DNA結合蛋白質として同定された細胞質ゾルおよび核蛋白質は最近では、敗血症関連致死率の「遅発」媒介物質として包含された。HMGB-1は内毒素により刺激されたマクロファージにより放出されるが、12〜18時間の遅延の後のみであった。敗血症様の全身性サイトカイン応答を誘発する実験モデルである内毒素血症のマウス血清中で、HMGB-1の出現における同様の遅延が見られる(Wangら、Science(1999)285:248〜251)。抗HMGB-1抗体は、早期サイトカイン応答が最高点に達し消散した後に抗体投与を開始した場合でも、遅延内毒素致死率に対し重要な防御を付与する(Wangら、Science(1999)285:248〜251)。HMGB-1の他のサイトカイン活性としてはマクロファージを刺激してTNF、IL-1β、および他の炎症性産物を放出させること、平滑筋細胞の走化性を誘発すること、急性肺損傷および致死性を媒介することが含まれる(Abrahamら、J.Exp.Med. (2000) 165:2590〜2954)。今日入手可能なほとんどの薬物標的は、炎症応答の早期に放出されるTNFおよびIL-1βなどのいわゆる「警告相」サイトカインである。臨床環境では、敗血症を認識して特定の治療を始めるには典型的には多くの時間がかかる。したがって、これらの早期の炎症誘発性サイトカインに対する作用物質が多くの臨床試験において試験した場合、効果がないことが立証されることは驚くべきことではない(Abrahamら、Lancet(1998)351(9107):929-33;Fisherら、JAMA(1994)271(23):1836-43)。
【0008】
早期および遅発相媒介物質の両方のサイトカインの産生または活性を阻害、抑制または中和する組成物を用いてサイトカインにより媒介された炎症状態を特に改善することが有益であると思われる。
【発明の開示】
【0009】
発明の概要
本発明は、炎症および他のサイトカインにより媒介された状態中の有害なサイトカイン効果を改善する方法に関する。1つの局面では、本発明は病原性全身性傷害の「早期」(腫瘍壊死因子(TNF)およびインターロイキン-1β(IL-1β))および「遅延期」(高移動度群B-1(HMGB-1))媒介物質の放出を減少させることにより内毒素に誘発される致死性を妨害する。本発明の方法はまた、前述したものより広い治療窓を提供する。
【0010】
本発明は、サイトカインにより媒介される炎症状態の治療のために、α-ケトアルカン酸および/またはその誘導体の1つ(とりわけα-ケトアルカン酸の生理学的に許容される塩、α-ケトアルカン酸のエステル、またはα-ケトアルカン酸のアミドを含む)を含む組成物を患者に投与することを特徴とする。適したα-ケトアルカン酸にはC3〜C8直鎖状または分枝状α-ケトアルカン酸、例えばピルビン酸が含まれる。α-ケトアルカン酸の生理学的に許容される塩はNa、K、Ca++、Mg、NH4 などを含む。
【0011】
好ましくは、本明細書で開示する方法において使用される治療用作用物質は有効量のα-ケトアルカン酸のエステル、例えばC3〜C8直鎖状または分枝状α-ケトアルカン酸エステルである。例えば、α-ケトブチラート、α-ケトペンタノエート、α-ケト-3-メチル-ブチラート、α-ケト-4-メチル-ペンタノエートまたはα-ケトヘキサノエートである。ピルベートが好ましい。分子のエステル位では様々な官能基が適しており、例えば、アルキル、アラルキル、アルコキシル、カルボキシアルキル、グリセリルまたはジヒドロキシアセトンである。特定の例としては、エチル、プロピル、ブチル、カルボキシメチル、アセトキシメチル、カルベトキシメチルおよびエトキシメチルが挙げられる。エチルエステルが好ましい。チオールエステル(例えば、式中チオール部分がシステインまたはホモシステインである)もまた含まれる。
【0012】
好ましい態様では、開示した方法において使用する薬学的組成物はピルビン酸エチル、ピルビン酸プロピル、ピルビン酸カルボキシメチル、ピルビン酸アセトキシメチル、ピルビン酸カルベトキシメチメチル、ピルビン酸エトキシメチル、α-ケトブチル酸エチル、α-ケトペンタン酸エチル、α-ケト-3-メチルブチル酸エチル、α-ケト-4-メチル-ペンタン酸エチル、またはα-ケト-ヘキサン酸エチルを含む。ピルビン酸エチルがより好ましい。
【0013】
さらに他の局面では、本明細書で開示した方法において使用する治療用作用物質は、有効量のα-ケトアルカン酸のアミドである。本発明の方法において使用するのに適したα-ケトアルカン酸のアミドは、以下の構造式RCOCONR1NR2を有する化合物を含む。Rはアルキル基であり;R1およびR2はそれぞれ-H、アルキル、アラルキル、アルコキシアルキル、カルボキシアルキルまたは-CHR3COOHであり;R3は天然のアミノ酸の側鎖である。好ましくは、α-ケトアルカン酸のアミドはピルブアミドである。
【0014】
他の局面では、エステル誘導体を使用する場合、生理pH値でエステルのエノール共鳴型を誘導し安定化するための成分が組成物中に含まれる。安定化成分は陽イオン物質であり、好ましくは二価の陽イオンであり、最も好ましくはカルシウムまたはマグネシウムである。この組成物はさらに、薬学的に許容される不活性担体物質を含む。その担体物質中では、エステルのエノール共鳴型が生理pH値で安定化される。
【0015】
本発明の組成物中の薬学的に許容される不活性担体は、哺乳類に治療用作用物質を投与するのに安全であると一般に認識される任意の担体物質とすることができ、例えば注入用緩衝液、経口投与のための錠剤、または現場送達のためのゲル、ミセル、リポソーム形態のものである。送達溶液の例としては、等張または高張生理食塩水;重炭酸緩衝液、リン酸緩衝液またはクエン酸緩衝液、血漿増量剤、またはミクロコロイドまたは微結晶溶液が挙げられる。
【0016】
本発明の方法により治療できる状態としては、局所または全身性炎症、炎症性腸疾患(クローン病および潰瘍性大腸炎)、慢性関節リウマチ、喘息(喘息発作重積状態を含む)、敗血症および敗血症性ショックが挙げられるが、これらに限定されるものではない。本発明の方法はまた、皮膚の炎症状態、例えば乾癬および湿疹の治療を含む。
【0017】
本発明の他の特徴および利点は、添付の図面を参照する、本発明の好ましい態様の以下の説明および請求の範囲から明らかになると思われる。
【0018】
発明の詳細な説明
思いがけず、α-ケトアルカン酸および/またはその誘導体の1つを含む組成物はサイトカインにより媒介される炎症状態を改善することができることが発見された。本発明の方法を、例えばマウス敗血症の標準マウスモデルにおいて試験したところ、敗血症が確立された後24時間に、ピルベートの誘導体の第1の用量を投与した場合でさえも、腹膜炎により引き起こされた致命的な敗血症からピルビン酸エチルにより哺乳類が救出されることが示された。ピルベートおよび/またはその誘導体の防護作用を担う正確な機構は解明されていないままである。それにもかかわらず、例示的な誘導体、ピルビン酸エチルは、LPSにより刺激されたマクロファージからのTNFおよびHMGB-1の両方の放出を阻害すること、および炎症誘発性p38 MAPキナーゼおよびNF-κBシグナル伝達経路の活性化を抑制することが本明細書中で示されている。これらのデータにより、確立した敗血症を患う患者においてピルベートおよび/またはその誘導体を使用する治療は、炎症の臨床的な徴候発症後であっても延期できることができることが示唆される。
【0019】
急性内毒素血症および致死性多微生物細菌性腹膜炎のマウスモデルにおいてピルビン酸エチルにより得られる治療上の恩恵の基本に関するいくつかの糸口を得ようとして、2つの重要な炎症誘発性シグナル伝達カスケードの活性化に対する化合物の効果を評価した。これらの研究から、LPSにより刺激したマクロファージをピルビン酸エチルと共にインキュベートすると、2つの本質的な経路、P38 MAPキナーゼおよびNF-κBを介するシグナル伝達が阻害されることが明らかになった。内毒素、サイトカインおよび細胞損傷の産物によりマクロファージが活性化されると、TNFの転写および活性化マクロファージの他の産物を増強する転写因子であるNF-κBの核転位が起こる(Senftlebenら、Crit.Care Med.(2002)30(1 Suppl):S18-26)。マクロファージが活性化されると、TNF mRNAを安定化し、TNF翻訳効率を増大させることに関係している経路である、p38 MAPキナーゼのリン酸化も起こる(Adamsら、Prog. Med. Chem.(2001)38:1-60)。
【0020】
遅延内毒素致死性の遅発段階媒介物質、HMGB-1は、ヌクレオソーム構造を安定化する転写因子としてのみ以前知られていたサイトゾルおよび核蛋白質である。HMGB-1は活性化マクロファージにより放出されるが、12-18時間のかなりの遅れの後のみであった。致命的な内毒素血症中には同様の動力学的課程が観察される(Wangら、Science (1999) 285:248-251)。HMGB-1放出のこの動力学的な遅れにより、早期TNF応答の下流で抗HMGB-1抗体の適用が可能となり、致死性の遅発媒介物質を標的とすることができる治療アプローチが示唆される。本研究によりピルビン酸エチルがマクロファージからのHMGB-1の放出を著しく阻害すること、および敗血症マウスにおいて血清HMGBレベルを減少させることがわかった。マクロファージはサイトゾル中に多量のHMGB-1を含み、サイトゾルはHMGB-1の予め形成されたプールを提供し、HMGB-1は活性化中に放出されうる。マクロファージからのHMGB-1の放出を調節する機構は不可解であるが、本データにより、ピルビン酸エチルが活性化されたマクロファージからのサイトゾル蛋白質の放出を阻害することが示される。ピルビン酸エチルによるHMGB-1の放出の阻害は特異的であった。というのはピルビン酸エチルは細胞内HMGB-1蛋白質の発現または安定性に影響しなかったからである。本研究により、NF-κBおよびp38 MAPK経路を通るシグナル伝達のピルビン酸エチルによる阻害は、LPAにより刺激された細胞からのHMGB-1の放出を抑制するピルビン酸エチルの能力の基礎となる可能性が示される。さらに、局所マクロファージ環境におけるTNFの阻害はHMGB-1放出の阻害に寄与する。TNFはHMGB-1放出の強力な誘発物質であるからである。
【0021】
合わせて、これらの結果から、ピルベートおよび/またはその誘導体は過剰のTNF-αおよびHMGB-1により媒介される疾患に対する治療能力を有することが明らかになる。好ましくは、ピルビン酸エチルは比較的毒性のない食物添加物であり、観察された効果は治療上達成可能な、安全なレベルで生じる。ピルビン酸エチルは、ショック治療用の蘇生薬として広く使用されるリンガー型晶質流体、カルシウムおよびカリウム含有平衡塩溶液中で投与することができる。
【0022】
したがって、本発明の第一の目的は、α-ケトアルカン酸および/またはその誘導体を含む改良組成物を使用して、炎症状態、特にサイトカインにより媒介される炎症状態を治療するための新規方法を提供することである。
【0023】
前述の目的を達成するために、本発明の目的に従うと、本明細書で具体化され、広く記述されるように、本発明の1つの組成物は、生理pHでそのエステルのα-ケト官能性のエノール化を誘導するのに十分な濃度の生物学的に安全な有機または無機陽イオンと混合される、図1に示した分子構造によるα-ケトアルカン酸エステルを含む。好ましい態様では、組成物はα-ケトプロピオン酸(ピルビン酸)のアルキルエステルを含み、そのエステルはエチル類似体であり、陽イオンは二価陽イオン、特にカルシウムまたはマグネシウムのいずれかである。本発明の組成物の特に好ましい製剤では、エステル化合物は約7〜8のpHのリンガー液中でカルシウムイオンと混合されたピルビン酸エチルである。
【0024】
本発明の治療用組成物は薬学的に許容される不活性担体物質中に溶解して慣例法により、経口で、局所的に(例えば、軟膏、ゲルまたはクリーム)、または非経口で(例えば、鼻腔内に、皮下に、筋肉内に、静脈内に、管腔内に、動脈内に、膣内に、経尿道でまたは直腸に)投与してもよい。例えば、本発明の治療用組成物は、生物分解可能な生体適合性ポリマーを使用した持続放出製剤中で、またはミセル、ゲル、リポソーム、または緩衝溶液を用いた現場送達により投与してもよい。
【0025】
好ましくは、薬学的組成物は、本明細書で記述しているように緩衝液中に溶解した、例えば10 mMから200 mM、好ましくは20 mMから90 mMの濃度のα-ケトアルカン酸の注入剤(infusate)として、体重1kgあたり1mg〜200mg/日の速度で投与する。より好ましくは、薬学的組成物は、緩衝液中、α-ケトアルカン酸の濃度が約28mM、用量が体重1kgあたり100mg〜150mg/日のα-ケトアルカン酸の注入剤として投与される。巨丸剤形態では、活性作用物質は同様の用量、例えば体重1kgあたり1mg/日〜200mg/日のα-ケトアルカン酸で投与することができる。この場合、用量はアリコートに分割され、1日に1〜4度送達され(総用量、体重1kgあたり1mg/日〜200mg/日に対する)、それに応じてα-ケトアルカン酸の濃度が調節される。本発明の組成物中のエノール化剤は、投与する組成物中の活性エステル作用物質量のα-ケト官能基のエノール化を誘導するのに適した濃度である。最適用量および投与様式は従来のプロトコルにより容易に決定することができる。
【0026】
例示的なサイトカインにより媒介される炎症状態としては、局所および全身性炎症状態、炎症性腸疾患(クローン病および潰瘍性大腸炎)、慢性関節リウマチ、喘息(喘息発作重積状態を含む)、内毒素血症、敗血症および敗血症性ショック、および皮膚の炎症状態、例えば乾癬および湿疹が挙げられるが、これらの限定されるものではない。
【0027】
以下の実施例は本発明の利点を説明し、当業者が本発明を実施し使用するのを支援するために提供するものである。これらの実施例はいかなる意味においても開示の範囲を限定するものではない。
【0028】
例示的な材料および方法
動物実験
雄の週齢6〜8週のBalb/Cマウス(20〜25g)をHarlen Sprague-Dawley(インジアナ州インジアナポリス所在)から購入し、7日間、25℃で、12時間の明/暗サイクルで収容して順応させた。動物を無作為にグループ分けし(1グループ10匹のマウス)、特定の実験に割り当てた。全ての動物実験は北海岸大学病院およびニューヨーク大学医学部の動物実験委員会により認可されたプロトコルの下、国立衛生研究所ガイドラインに従い実施した。
【0029】
内毒素ショック
保存濃度10 mg/mlで滅菌した発熱物質を含まない生理食塩水中に溶解した内毒素(大腸菌(Escherichia coli)リポ多糖類、LPS 0111:B4;ミズーリ州セントルイス所在のSigma Chemical Co.)をマウスに注入した。各実験で使用する直前20分間、LPS溶液を超音波処理した。マウスはLD75用量のLPSを受けた(5 mg/kg、腹腔内)。LPS投与後異なる時間に血液を収集し、室温で2時間凝固させ、20分間1,500gで遠心分離した。血清試料を分析前に20℃で保存した。注入後3週間まで致死率を記録し、さらに遅発死が生じることがないことを確認した。
【0030】
盲腸の結紮およびせん刺(CLP)
Wichtermanら(J.Surg.Res.(1980)29(2):189-201)により記述されているように盲腸結紮およびせん刺(CLP)を実施した。簡単に説明すると、1.0 g/kgの用量で20 mg/mlのキシラジンを筋内投与することによりマウスに麻酔をかけ、中線切開を実施し、盲腸を単離した。回盲弁から離して盲腸先端から5.0mmのレベルに、6〜0のプロレン縫合結紮を配置した。結紮した盲腸断端に22ゲージ針で一度せん刺し、便を押し出し(1mmm)、せん刺部位の開通性を確認した。その後、盲腸を通常の腹腔内の位置に戻し、腹部を2層、それぞれ腹膜および筋膜の6-0プロレンの連続の縫合糸で閉じ、流体の漏れを妨害した。動物はすべて、手術後12時間に、1度の用量として抗生物質(プリメキシン、0.5 mg/kg s/c)を受けた。動物はすべて、1度の注入剤として、手術後24時間に通常の生理食塩水による救急蘇生を受けた。処置後1週間までの間、致死率を記録した。生存したものについては3週間追跡し、遅発死亡率が生じないことを確認した。
【0031】
ピルビン酸エチル溶液:
ナトリウム(130 mM)、カリウム(4 mM)、カルシウム(2.7 mM)、塩素(130 mM)、およびピルビン酸エチル(28 mM)を用いて、pH7.0のピルビン酸エチル溶液を調製した。マウスに注入するために、溶液を希釈し各注入容積が1度の用量あたり0.4mlとなるようにした。
【0032】
細胞培養
アメリカタイプカルチャーコレクション(American Type Culture Collection)(ATCC番号TIB-71、ATCC、メリーランド州ロックヴィル)(61)から入手したBALB/cマウスマクロファージ様RAW264.7細胞を、5%のCO2を含む加湿インキュベータ中で、10%の熱で不活性化した胎児ウシ血清(Gemini、カルフォルニア州カルバサス)、2mMのグルタミン(Cat. #25030-149、Gibco BRL、メリーランド州ロックヴィル)および抗生物質-抗真菌物質混合物(Cat. #15240-062、Gibco BRL、メリーランド州ロックヴィル)が添加されたRPMI 1640(Life Technologies、ニューヨーク州グランドアイランド)中で培養した。細胞を機械的に除去し血清を含まないOpti-MEM I 培地(Life Technologies、ニューヨーク州グランドアイランド)に再懸濁し、75%の集密度で実験を実施した。
【0033】
サイトカイン測定
マウス血清およびRAW264.7細胞培養物からの条件培地中のTNF濃度をELISA(最小検出可能濃度=10 pg/ml)により測定した。組換えマウスTNF標準をR&D Systems(Inc. ミネソタ州ミネアポリス所在)から入手し、0.1% ウシ血清アルブミン溶液(BSA、ミズーリ州セントルイス所在のSigma Chemical Co.からの低内毒素グレード)中に溶解した。マウスTNFに対するモノクローナル抗体をカルフォルニア州カマリロ所在のBiosource International、Inc.から購入した。ヒトTNFモノクローナル抗体、ヒトTNF抗血清およびマウスTNF抗血清は、Dr.Christine Metzにより調製され寄贈された。マウス血清IL-6およびIL-1βレベルをELISAキット(R&D Systems、Inc.ミネソタ州ミネアポリス所在)を用いて測定した。HMGB-1はWangら、1999により前述されているようにウエスタンブロットにより分析した。簡単に説明すると、血清または細胞培養物条件培地を最初にセントリコン(centricon)YM-100(マサチューセッツ州ベッドフォード所在のMillipore Corp.)を通して濾過し、試料から凝固中に形成された細胞細片および高分子複合体を除去した。その後、試料をセントリコンYM-30を用いて15倍に濃縮し、12% SDS-ポリアクリルアミドゲル(SDS-PAGE)にかけた。蛋白質は免疫−ブロットPVDF膜(Bio-rad、カリフォルニア州ヘラクレス所在)に電気ブロッティングし、HMGB-1はポリクローナル241抗体およびウサギ西洋ワサビペルオキシダーゼ二次抗体(Amersham、ニュージャージー州ピッツキャタウエイ所在)を用いて分析した。r-HMGB-1を用いて標準曲線を作成し、30kDバンドの強度をデンシトメトリーにより分析した。
【0034】
核抽出物調製
使用する前日に、6ウェル組織培養プレートでウェルあたり1×106の密度で細胞を蒔いた。指示した時間に刺激した後、細胞をインキュベータから除去し、直ちに氷上に配置した。細胞を2 mlのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)を用いて1度洗浄し、ゴムスクラッパーを用いて2%のFBSを含む1mlのPBS中に収集した。細胞を1.5mlの管に移し、14,000gで10秒間遠心分離した。ペレットを600 μlの緩衝液I(10mM pH=7.8のTris HCl、10mM KCl、1.5mM MgCl2、0.3M ショ糖、500μM フェニルメチルスルホニルフルオリド、1.0mM バナジン酸ナトリウム、1mM ジチオトレイトール、およびプロテアーゼ阻害剤カクテル(Sigma-Aldrich カタログ# p-8340)中に再懸濁させ、15分間インキュベートした。38.3μlの10% NP40を添加し、管を10秒間、最高速度でボルテックスした。300gで3分間遠心分離することにより核を単離した。上清を吸引し、核ペレットを80μLの緩衝液II(10mM pH=7.8 Tris.HCl、420mM KCl、1.5mM MgCl2、20%グリセロール)中に静かに再懸濁させた。15分間インキュベートした後、核抽出物を14,000gで10分間遠分離することにより清澄化した。上清を新しい管に移し、市販のブラッドフォード(Bradford)アッセイ法(Bio-Rad Protein Assay、カリフォルニア州ヘラクレス所在)を用いて蛋白質濃度を決定した。核抽出物を-80℃で凍結させた。
【0035】
電気泳動移動度シフトアッセイ法(EMSA)
二本鎖NF-κBオリゴヌクレオチドの配列は以下の通りであった。
オリゴヌクレオチドはT4ポリヌクレオチドキナーゼ(Promega、ウイスコンシン州マジソン所在)を使用してγ -32Pアデノシン三リン酸(New England Nuclear、マサチューセッツ州ボストン所在)で末端標識した。1ngのコウシ胸腺DNAの存在下、20分間室温で、バンドシフト緩衝液(13mM pH=8.0 HEPES、65mM NaCl、1mM DTT、0.14mM EDTA、8%グリセロール)中、3μgの核蛋白質/反応物をγ -32P標識NF-κBプローブと共にインキュベートした。競合反応のために、100倍モル過剰の非放射性オリゴヌクレオチドを標識プローブと同時に添加した。放射標識したプローブを添加する前1時間、核抽出物を2μLの抗p65および抗p50(Santa Cruz Biotechnology)と共にインキュベートすることによりスーパーシフトアッセイ法を実施した。結合反応混合物を4%の未変性ポリアクリルアミド電気泳動(PAGE)ゲル上で電気泳動した。PAGE後、ゲルを乾燥させ、増感スクリーンを用いて一晩中-80℃でXAR-5フィルム(Kodak、ニューヨーク州ロチェスター所在)に曝露した。
【0036】
総RNA抽出物およびRNアーゼ保護アッセイ法
製造者の指示(Tel-Test“B”Inc、テキサス州フレンドウッド所在)に従いRNAゾルBを使用することにより、総RNAを培養細胞から抽出した。RNAの完全性を1.2% アガロース/17% ホルムアルデヒドゲル上での電気泳動により立証した。製造者の指示に従いPharMingen(カルフォルニア州サンディエゴ所在)からのRNアーゼ保護アッセイキットを用いてRAW細胞中のTNFおよびシクロフィリンmRNAのレベルを測定した。アンチセンスRNAブローブをT7 RNAポリメラーゼを使用してα -32P-UTP(800Ci/mmol、Amersham、イリノイ州)で標識した。TNFの保護された転写物は287bpであり、対照の転写物(シクロフィリン)は105bpである。MSP I(New England Bio Labs、マサチューセッツ州ベヴァリー所在)で消化したpBR-322プラスミドDNAおよびγ -32P-dCTP(800Ci/mmol、Amersham)で末端標識したクレノウ(Klenow)(Strategene、カリフォルニア州ラホーヤ)を用いて分子量マーカーを調製した。mRNAレベルはインスタントイメージャ(InstantImager)(Packerd Instrument Co.、コネチカット州メリデン)を用いて測定した。
【0037】
統計解析
図および本文中のデータは全て、1つの条件あたり少なくとも20匹の動物に対する平均±SEMで表されている。グループ間の差違の重要性は、適宜、両側スチューデントのt検定、一方向ANOVA後最小有意差検定もしくはフィッシャーのLSD抽出検定、またはカイ二乗検定により決定した。FD4クリアランスデータは統計分析を行う前に対数変換された。差はp<0.05であると有意であると考えた。
【0038】
実施例1
溶液中でのピルビン酸エステルの安定性
ピルビン酸エチルはカルシウム塩の存在下、ピルビン酸ナトリウムよりも安定な水溶液を提供する。この知見は、水酸化ナトリウム、または他の適した無機アルカリで生理pH値まで滴定したピルビン酸類似体1モル当量あたり少なくとも0.2当量のカルシウムを含むリンガー液に溶解することにより、図1Aに示すような他のピルビン酸エステル類似体の研究にまで広げることができる。NMR、安定性およびその後の生物学研究において使用するための特定の「ピルベート化」リンガー溶液を表1に示す。他の例示的な緩衝溶液を表2に示す。
【0039】
この実施例におけるピルベート類似体は、均一溶液を得るのに十分な任意の濃度の図1に示した任意の類似体と置換してもよく、または比較目的で、対照物質と置換してもよいことを理解すべきである。例えば、ピルビン酸、乳酸(「乳酸化」リンガー溶液の場合のように)および他の参照または不活性ケト酸類似体などである。カルシウム陽イオンもまた、例えばマグネシウムまたは、カルシウムの代用となり水溶液中でピルビン酸エステルエノレートとの遷移配位複合体の形成を安定化させることができる任意の他の生物学的に安全な陽イオンにより置換してもよい。
【0040】
(表1)リンガーピルビン酸エチル溶液(REPS)の成分
【0041】
(表2)クエン酸ピルビン酸エチル溶液の成分
(pH4〜5に調節)
【0042】
実施例2
腸上皮損傷のインビトロモデルにおける炎症に対するピルビン酸エチル効果
サイトカインにより誘発された腸上皮高透過性状態におけるカルシウム塩溶液(REPS)の安定化に対するピルビン酸エチルの効果を試験するために、炎症性腸疾患(すなわち、クローン病または潰瘍性大腸炎)の症例において起こるような、炎症による腸上皮損傷のインビトロモデルを使用した。
【0043】
例示的な材料および方法としては以下のものが挙げられるが、重要でない変更は可能である:Caco-2ヒト腸細胞(105細胞/ウェル)を12ウェルトランスウェル(Transwell)二室チャンバ(COSTAR、Corning、ニューヨーク州)内の透過可能なフィルタ上で培養し、週2回給餌した。播種後21〜28日の間に集密単層を用いて透過性試験を実施した。透過性プローブはFITC標識デキストラン(4400 Da;FD4)であった。化合物をHEPES緩衝DMEM完全培地(pH 6.8)に溶解しフィルタ(0.45μmの細孔サイズ)を通過させることにより、FD4の滅菌保存溶液(25mg/ml)を調製した。透過性試験のために、培地をTranswellチャンバの先端および基底外側から吸引した。FD4溶液(200μl)を先端室に添加した。Transwellチャンバの基底外側上の培地を500μlの対照培地またはサイトミックスを含む培地(1ng/ml IL-1β+10ng/ml TNF-α+1000U/ml IFN-γ)、またはサイトミックスと濃度勾配をつけたピルビン酸エチルを含む培地と交換した。24時間および48時間のインキュベーションの後、以前記述されているように(Menconiら、Am.J.Physiol.(1997)272:G1007-G1021)、FD4濃度を分光蛍光測定により決定するために基底外側室から30μlの培地を吸引した。単層の透過性は以前に記述されたように計算される(Menconiら、Am.J.Physiol.(1997)272:G1007-G1021)クリアランス(C)で表した。48時間での結果を図に示す(P<0.01対サイトミックスのみを示す)
【0044】
図2に示されるように、最高濃度のピルビン酸エチルはどちらも、サイトミックスにより誘発される高透過性を著しく減少させた(P<0.001)。ピルビン酸エチル、ヒトCaco-2腸細胞単層を炎症誘発性サイトカインのカクテルと共にインキュベートする際に観察される透過性の増加を妨げる。
【0045】
実施例3
ピルビン酸エチル前処理によりインビボでのTNFおよびHMGB1の放出が減少することにより内毒素致死性が妨害される
ピルビン酸エチル(EP)の初期評価を、マウス内毒素血症の標準モデルにおける致命的な全身性炎症における治療溶液として実施した。Balb/cマウスは、致命的な内毒素血症の発症(大腸菌リポ多糖、LPS、5mg LPS/kg、腹腔内)30分前に1回のピルビン酸エチルの投与(マウスの体重1kgあたり40mgのピルビン酸エチル)を受けた。ピルビン酸エチル前処理によりBALB/cマウスは致命的な内毒素血症から防護された(ピルビン酸エチル生存率=20/20対ビヒクル対照生存率3/20;P<0.005)(図3A)。ピルビン酸エチル前処理により、傾眠、下痢、起毛、ハドリングおよび自発運動性抑制を含む内毒素罹患率の臨床的な発現が防止された。ピルビン酸エチル処理を行った動物では遅発死亡はその後3週間の観察期間中には起こらず、ピルビン酸エチルが致死性内毒素血症に対し完全な持続性防護を付与すること、致命的な病状の始まりを単に遅らせるだけではないことが示される。内毒素血症マウスをピルビン酸エチルにより前処理すると、両方のTNFの血清レベル(ビヒクル処理=17+/-4ng TNF/ml対ピルビン酸エチル処理=39+/-6ng TNF/ml;P<0.05)(図3B)および内毒素血症開始後20時間に測定した血清HMGB1(図3C)が著しく減少した。ピルビン酸エチルはまた、IL-1αおよびIL6のピーク血清レベルを減少させ(データ示さず)、ピルビン酸エチルが致死性の早期(TNF)および遅発(HMGB-1)媒介物質の放出を減少させることにより内毒素致死性を妨げることが示される。
【0046】
実施例4
ピルビン酸エチルの遅延投与はHMGB1放出を阻害することにより内毒素血症の致死性を妨げる
内毒素血症の発症後のピルビン酸エチルの遅延投与の治療効果を評価した。内毒素血症マウスにおけるピルビン酸エチルの投与を内毒素血症の発症後4時間に開始した。この場合、臨床的な徴候はすでに明らかになっており、例えば、下痢、起毛および自然活性抑制が見られた(図4A)。特に、この最初の用量は、内毒素血症の発症後最初の1〜2時間に起こる血清TNFの早期ピーク後に投与された。この遅延処理プロトコル(LPS後4時間、8時間、12時間、24時間および30時間に40mgのピルビン酸エチル/kg、腹腔内)では、ビヒクルによる処理に比べ、ピルビン酸エチルによる生存率が著しく増加した(ビヒクル生存率=5/20;ピルビン酸生存率=17/20;P<0.005)。遅延させた内毒素致死性の媒介物質としてのHMGB-1の役割と一致して、LPS注入後4時間に開始したピルビン酸エチルによる内毒素血症マウスの遅延処理により、内毒素血症の発症後20時間に測定したHMGB-1の全身性放出が著しく減少した(図4B)。ピルビン酸エチル処理は罹患率の臨床徴候を逆転させ、3週間の観察期間中には遅発死亡は起こらず、ピルビン酸エチルによる遅延処理により致死性内毒素血症に対し著しい防護が付与されることが示された。
【0047】
実施例5
ピルビン酸エチルの遅延投与により敗血症の致死性が妨げられる
盲腸の外科的せん孔により引き起こされた腹膜炎の標準化モデルにおける致死性敗血症に対する治療としてのピルビン酸エチルの効力を試験した。腹膜炎を患うマウスに、腹膜炎発症後24時間にピルビン酸エチル投与(40mgのピルビン酸エチル/kg、腹腔内)を開始した。この時点で各グループのマウスの10%がすでに死亡していた。3週間の確認モニタリング中、ビヒクル処理した対照の生存率は5/17であった。対照的にピルビン酸エチル処理により、敗血症マウスの生存率が著しく改善され、14/17の生存率が得られた;P<0.05。致死性敗血症に対する防護はピルビン酸エチル用量に依存した。というのは、ピルビン酸エチル用量が低いと、著しく死を回避することができなかったからである(図4C)。我々の知る限りでは、敗血症が定着した24時間後に適用して敗血症マウスを救う他の実験治療薬は報告されていない。
【0048】
実施例6
ピルビン酸エチルはマクロファージ培養物中においてTNFの合成を阻害する
マクロファージによるTNF合成に対するピルビン酸エチルの効果を決定するために、マウスマクロファージ様RAW264.7細胞を内毒素で刺激し、TNFを条件培地中で測定した。ピルビン酸エチルはマクロファージ培養物中でTNF放出を著しく阻害した(図5A)。50%のTNF応答を抑制するピルビン酸エチルの濃度は3.4mMであり、これは臨床的に達成可能な濃度であった。試験したピルビン酸エチルの最高用量では、TNFの合成は完全には阻害されなかった。これはこの作用物質が飽和量存在しても、マクロファージが依然としていくらかのレベルのTNFを産生できることを示した。マクロファージにおけるTNFのピルビン酸エチル阻害はまた、TNF mRNAの量を著しく減少させ(図5B)、これにより、ピルビン酸エチルが活性化マクロファージにおけるTNF遺伝子転写の定常状態レベルを抑制するように作用することが示された。
【0049】
実施例7
ピルビン酸エチルはNF-κBおよびp38 MAP キナーゼを介するシグナル伝達を阻害する
NF-κBおよびp38 MAPK経路を介するシグナル伝達は、TNFおよび他の炎症誘発性サイトカイン遺伝子の発現の増大につながるマクロファージ活性化における重要な段階である。TNF mRNAの抑制により、ピルビン酸エチルがNF-κBの核転位を阻害することができる可能性が示唆された。この転写因子はTNF 遺伝子転写の主体となる調節因子であるからである。以前の研究と一致して、LPS曝露後15分および4時間のEMSAにより示されるように(図6A)、LPSはNF-κBの著しい活性化を誘発した。ピルビン酸エチルは濃度依存様式で、NF-κBシグナル伝達のLPSにより誘発される活性化を著しく妨害した。NF-κB活性化のピルビン酸エチル阻害はLPS曝露後少なくとも4時間持続し、これにより阻害は完全であり、単に経路の活性化の遅延を意味するものではないことが示された。NF-κBに対するピルビン酸エチル効果の特異性は追加のスーパーシフトおよび競合アッセイ法により確立された(図6B)。この中で、抗p-65抗体は、複合体中のRel p65の存在と一致する複合体の電気泳動移動度のスーパーシフトを誘導した。核抽出物を100倍モル過剰の未標識(非放射性)NF-κB(未標識HIF1ではない)で前処理すると、放射性プローブの電気泳動シフトが妨害された。ピルビン酸エチルもまた、ピルビン酸エチル濃度依存様式でLPSにより誘導されるリン酸化およびそれに続くp38 MAPKの活性化を阻害した(図6C)。ピルビン酸エチルによるp38 MAPKの活性化阻害の特異性を決定するために、総p38MAPKの細胞内安定性および濃度を評価すると、ピルビン酸エチルはp38MAPKの総レベルにはそれほど影響しないことが観察された(図6D)。合わせて、これらの結果から、ピルビン酸エチルが、これらの重要な経路を介するシグナル伝達を抑制することによりマクロファージの活性化を阻害することが示される。
【0050】
実施例8
ピルビン酸エチルはHMGB-1の放出を減少させる
ピルビン酸エチルがマクロファージからのHMGB-1の放出を直接阻害するのかどうかについて決定するために、一晩中内毒素に曝露したマクロファージ培養物により調整した培地でHMGB-1放出を測定した。ピルビン酸エチルは濃度依存様式でLPSにより誘発されたHMGB-1の放出を著しく妨害した(図7A)。活性化マクロファージにより放出されたHMGB-1のほとんどが前もって形成された細胞関連蛋白質として存在し、そのためピルビン酸エチルがHMGB1の放出を阻害したのかまたはHMGB-1の総細胞レベルを抑制したのかという可能性について識別するために、マクロファージ中の総細胞関連HMGB-1レベルを測定した。RAW264.7細胞を1mM、5mMまたは10mMのピルビン酸エチルで処理し、総細胞関連HMGB-1蛋白質レベルを分析した(図7B)。ピルビン酸エチルは総細胞内HMGB1蛋白質濃度にそれほど影響しなかったが、これはピルビン酸エチルが蛋白質合成または安定性に影響を与えずにHMGB1の放出を著しく阻害したことを示した。
【0051】
本発明について特定の態様を用いて説明してきたが、当業者であれば前述の説明を考えて多くの代替、改変および変更が可能であることは明らかであると思われる。したがって、本発明は、添付の特許請求の範囲の精神および広い範囲から逸脱しない限り、そのような代替、改変および変更全てを含むものであると考えられる。
【図面の簡単な説明】
【0052】
【図1】本発明の組成物中の好ましいα-ケトアルカン酸エステルおよびアミドの構造を示す図である。
【図2】IFN-γ(1000U/ml)、IL-1β(1nM)およびTNF-α(10ng/ml)を含むサイトカインのカクテル(「サイトミックス(cytomix)」)(「サイト(Cyto)」)で48時間インキュベートしたCaco-2単層の透過性に対するピルビン酸エチルの効果を示した棒グラフである。REPSはサイトカインにより誘発された腸上皮の高透過性をブロックする。
【図3】インビボでTNFおよびHMGB-1放出を減少させることにより内毒素致死性を防ぐ場合のピルビン酸エチル前処理の効果を示した図である。(a)EPによる前処理後(1回のEP用量が40mg/kg、腹腔内、t=-30分にて)、致死用量の内毒素(5mg LPS/kg、腹腔内、時間=0hrにて)に曝露したマウスのカプラン・メイア(Kaplan-Meier)プロット。EPは致死性に対してかなりの防護を付与した(P<0.05)。(b) ピルビン酸エチル前処理によりLPS後2時間で血清TNFの放出が著しく減衰される。(c)ピルビン酸エチルはLPS後20時間で、血清HMGB-1レベルを著しく阻害する。ビヒクル処理した内毒素血症動物に比べ、EPのTNFおよびHMGB-1に対してはP<0.05;2度繰り返した実験ではn=5。
【図4】内毒素血症および敗血症HMGB-1の致死率を減衰させる場合のピルビン酸エチルの遅延投与の効果を示したものである。(a)致死用量のLPS(3.75mg LPS/kg;腹腔内)およびピルビン酸エチルの遅延投与(40 mg/kg;腹腔内)を受けた、すなわちLPS注入後4時間で開始し、8時間、12時間、24時間および30時間に繰り返し投与されたマウスのカプラン・メイアプロット。(b)HMGB-1放出を20時間で収集した血清のウエスタンブロットにより分析した。LPSはインビボでHMGB-1の放出を誘発し(レーン4、5、6)、ピルビン酸エチル(レーン7、8、9)による遅延処理により血清HMGB-1の放出が著しく妨害される。(c)時間=0時間で盲腸せん孔により誘発された腹膜炎の発症後24時間に開始したピルビン酸エチル(40mg/kg、腹腔内)による処理を行った盲腸せん孔を有する敗血症マウスのカプラン・メイアプロット。内毒素血症およびCLPモデルの両方で、ピルビン酸エチルの遅延投与により生存率が著しく増加したことに注意すべきである。
【図5】ピルビン酸エチルがTNF転写および合成を阻害することが示されている。(a)LPSにより刺激されたマクロファージ培養物によるTNF放出に対するピルビン酸エチルの影響を、50ng/mlまたは100ng/mlのLPSにより刺激したマクロファージ条件培地上でELISAにより測定した。マクロファージ培養物からのTNF応答の50%を阻害したピルビン酸エチルの濃度(ピルビン酸エチルEC50)は3.4mMであり、臨床的に達成可能な濃度であることに注意すべきである。(b)ピルビン酸エチルはTNF遺伝子の転写を妨害する。TNF転写に対するピルビン酸エチルの効果をリボヌクレアーゼ防護アッセイ法(RPA III(登録商標)、アンビオン(Ambion)、テキサス州オースチン)により分析した。ピルビン酸エチルは、ピルビン酸エチル濃度依存様式でTNFのLPSにより誘発される転写を妨害する。
【図6】マクロファージ培養物におけるNF-κBおよびp38MAPK経路の、LPSにより誘発される活性化がピルビン酸エチルにより妨害されることが示されている。(a)示した濃度のピルビン酸エチルの存在下、LPSによりRAW264.7細胞を刺激した。NF-κBの活性化を、32P標識したNF-κBプローブを用いて15分および4時間にEMSAにより分析した。ピルビン酸エチルはピルビン酸エチル濃度依存様式でNF-κBの活性化を抑制した。実験を3度繰り返した。(b)スーパーシフトおよび競合試験。LPSにより刺激し、p65-Relに対する抗体と共にインキュベートしNF-κB複合体の特定のスーパーシフトを誘発したマクロファージの核抽出物。競合分析のために、核抽出物を100倍モル過剰の未標識(非放射性)NF-κBまたはHIF-1プローブと共にインキュベートした。(c)RAW264.7細胞を、指示した濃度のピルビン酸エチルの存在下、LPSにより刺激した。製造業者(マサチューセッツ州ベヴァリーCat.#9210、New England Biolabs)に従いリン酸化(thr180/tyr182)p38MAPKに対する抗体を用い、ウエスタンブロットによりP38MAPKのリン酸化を分析した。(d)p38 MAPKの総量をウエスタンブロットにより視覚化する。ピルビン酸エチルは総p38MPKの細胞内レベルに影響を与えずにマクロファージ培養物中のp38MAPKのリン酸化を妨害する。
【図7】ピルビン酸エチルがHMGB-1の放出を阻害することが示されている。(a)LPS添加後24時間の条件培地のウエスタンブロットから証明されるように、ピルビン酸エチルはマクロファージ培養物からのHMGB-1の放出を阻害する。(b)HMGB-1の総細胞関連レベルに対するピルビン酸エチルの効果の分析。ピルビン酸エチルは処理後10時間または20時間のいずれにおいてもHMGB-1の細胞内安定性およびレベルに影響しなかったことに注意すべきである。ピルビン酸エチルがHMGB-1の放出を特異的に妨害することが示唆される。

Claims (27)

  1. サイトカインに媒介される炎症状態を患う患者を治療するための、
    (a)サイトカインにより媒介された炎症状態を患う患者を提供する段階と、
    (b)該患者に、α-ケトアルカン酸化合物を含む有効量の組成物を投与し、化合物が薬学的に許容される不活性担体物質中に溶解されたエα-ケトアルカン酸、生理学的に許容されるα-ケトアルカン酸の塩、α-ケトアルカン酸のエステル、またはα-ケトアルカン酸のアミドである段階と、
    を含む治療方法。
  2. サイトカインが、炎症状態における早期媒介物質である、請求項1記載の方法。
  3. サイトカインが、炎症状態における遅発媒介物質である、請求項1記載の方法。
  4. 組成物が、炎症状態の発症後24時間に投与される、請求項1記載の方法。
  5. サイトカインにより媒介される炎症状態が腫瘍壊死因子により媒介される、請求項1記載の方法。
  6. サイトカインにより媒介される炎症状態が、インターロイキン-1βにより媒介される、請求項1記載の方法。
  7. サイトカインにより媒介される炎症状態が、高移動度群B-1により媒介される、請求項1記載の方法。
  8. α-ケトアルカン酸化合物がC3〜C8の直鎖または分枝である、請求項1記載の方法。
  9. α-ケトアルカン酸化合物が、α-ケトブチラート、α-ケトペンタノエート、α-ケト-3-メチル-ブチラート、α-ケト-4-メチル-ペンタノエートまたはα-ケトヘキサノエートからなる群から選択されてもよい、請求項8記載の方法。
  10. α-ケトアルカン酸化合物がピルビン酸である、請求項1記載の方法。
  11. 生理学的に許容される塩が、Na+、K+、Ca++、Mg+、およびNH4 +からなる群から選択されてもよい、請求項1記載の方法。
  12. α−ケトアルカン酸化合物が、アルキル、アラルキル、アルコキシル、カルボキシアルキル、グリセリルまたはジヒドロキシアセトンからなる群から選択されてもよい、請求項1記載の方法。
  13. α−ケトアルカン酸化合物のエステルが、エチル、プロピル、ブチル、カルボキシメチル、アセトキシメチル、カルベトキシメチルおよびエトキシメチルからなる群から選択されてもよい、請求項1記載の方法。
  14. α−ケトアルカン酸化合物のエステルが、ピルビン酸エチルである、請求項1記載の方法。
  15. α−ケトアルカン酸化合物のアミドが、構造式RCOCONR1R2
    (式中、
    Rがアルキル基であり;
    R1およびR2がそれぞれ-H、アルキル、アラルキル、アルコキシアルキル、カルボキシアルキルまたは-CHR3COOHであり;
    R3が天然のアミノ酸の側鎖である)
    を有する、請求項1記載の方法。
  16. α−ケトアルカン酸化合物のアミドが、ピルブアミドである、請求項1記載の方法。
  17. 担体物質が、生理pH値で酸のα-ケト官能基のエノール化を誘導し、安定化させるための生物学的に安全な成分をさらに含む、請求項1記載の方法。
  18. エステルのα-ケト官能基のエノール化を誘導し、安定化させるための成分が、無機、二価陽イオンである、請求項17記載の方法。
  19. 二価陽イオンが、カルシウムまたはマグネシウムである、請求項18記載の方法。
  20. エステルのα-ケトアルカン酸部分が、α-ケトプロピオン酸である、請求項1記載の方法。
  21. α-ケトアルカン酸エステル化合物がピルビン酸エチルであり、二価陽イオンがカルシウムであり、不活性担体物質が7〜8のpH範囲のリンガー溶液である、請求項1記載の方法。
  22. 不活性担体物質が、カリウムイオンを付加した等張生理食塩水のリンガー溶液である、請求項1記載の方法。
  23. α-ケトアルカン酸エステル化合物が、2-ケト-酪酸エチル、2-ケトペンタン酸エチル、2-ケト-3-メチル-酪酸エチル、2-ケト-4-メチルペンタン酸エチルおよび2-ケト-ヘキサン酸エチルからなる群から選択される、請求項1記載の方法。
  24. α-ケトアルカン酸エステル化合物が、カルシウムおよびマグネシウムからなる群から選択される陽イオンを含む塩溶液に混合されている、請求項1記載の方法。
  25. 炎症状態が、局所および全身性炎症、炎症性腸疾患(クローン病および潰瘍性大腸炎)、慢性関節リウマチ、喘息(喘息発作重積状態を含む)、敗血症または敗血症性ショックを含む、請求項1記載の方法。
  26. 炎症状態が皮膚状態である、請求項1記載の方法。
  27. 皮膚状態が乾癬または湿疹である、請求項26記載の方法。
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