JP2004512145A - Collagen was mineralized for bone and cartilage repair - polysaccharide type substrate - Google Patents

Collagen was mineralized for bone and cartilage repair - polysaccharide type substrate Download PDF

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Abstract

骨、軟骨、または軟質の接合組織のような、組織の増殖を支援するための一定の基質および当該基質を調製するための方法を提供する。 Providing bone, cartilage, or like connective tissue of the soft, a method for preparing a constant matrix and the substrate to support the growth of tissue. 一定の多糖類が一定の酸化剤と反応してその多糖類における糖の環状構造が開環してアルデヒド基が形成される。 Its cyclic structure is ring-opened aldehyde group of the sugar in the polysaccharide is formed a certain polysaccharide reacts with certain oxidizing agents. これらのアルデヒド基は鉱物質化したコラーゲンに対する共役結合を形成するために反応する。 These aldehyde groups react to form a covalent bond to collagen was mineralized. 上記基質は移植または注入が可能であり、あるいは、上記ポリアルデヒド型多糖類および鉱物質化したコラーゲンの各開始材料を原位置において上記基質を形成するために別々に注入することもできる。 The substrate is capable of implantation or injection, or may be injected separately to form the matrix in situ the polyaldehyde type polysaccharides and mineralized the respective starting materials of collagen.

Description

【0001】 [0001]
発明の分野 Field of the invention
本発明は骨、軟骨および軟質組織等の組織の治療的修復用の架橋および鉱物化したコラーゲン−多糖類基質、当該基質の製造方法、および組織を修復するための当該組織の使用方法に関する。 The present invention is bone, cartilage and crosslinking for therapeutic repair of tissue of soft tissue such as and mineralized collagen - polysaccharide substrate, method of manufacturing the substrate, and to the use of the organization for the repair of tissue. 本発明は単独または組織修復用の各種の増殖因子等の別の治療剤との組み合わせにおける移植または注入により投与される架橋および鉱物質化したコラーゲン−多糖類基質を提供する。 The invention alone or tissue repair for the various growth factors different collagen crosslinked and mineralized administered by implantation or injection in combination with a therapeutic agent such as a - providing a polysaccharide substrate.
【0002】 [0002]
発明の背景 Background of the Invention
無制限の供給様式で製造できる自原性の骨に等しい骨の伝導性を提供する一定の骨移植用基質に対する臨床的な要望が存在している。 Clinical desire exists for a given substrate for bone graft to provide a conductive bone equal to autogenous bone which can be produced in unlimited supply manner. 一部の骨置換体が利用可能であるが、多くの物はそれぞれの使用およびX線による評価を複雑にしている物理的な取扱性および吸収性に欠けている材料により構成されている。 It is a part of the bone replacement material is available, and is made of a material lacking in physical handling and absorption properties which complicates the evaluation by many things each use and X-ray.
【0003】 [0003]
同様に、多年にわたる多大の研究にもかかわらず、軟骨組織における軟骨細胞の表現型の分化または維持を支援する一貫して有効な市販製品が存在していない。 Similarly, despite considerable research over many years, consistently effective commercial product does not exist to support the differentiation or maintenance of the phenotype of chondrocytes in cartilage tissue. 損傷した軟骨の修復を容易にするための従来の手法は既存の宿主軟骨の移植および/または各種のプロテーゼの移植を含む。 Conventional techniques for facilitating repair of damaged cartilage comprises implantation of implantation and / or various prosthetic existing host cartilage. これらの方法の制限はドナー組織の利用可能性およびプロテーゼ移植片の制限された寿命である。 These methods limit is limited lifetime of availability and prosthetic grafts donor tissue. さらに最近において、各種の高分子の支持骨格上における成熟した軟骨細胞の生体外培養が軟骨移植材料を発生する目的において採用されているが、この方法はまた広く容認されておらず、その一部の理由は、この方法が2種類の外科処置を含むためであり、その一つは軟骨細胞を収集することであり、他の一つは生体外での増殖後にこれらの細胞を移植することである。 More recently, although in vitro culture of mature chondrocytes in various on scaffold polymer is employed for the purpose of generating a cartilage implant, the method has not also been widely accepted, some the reason is because this method comprising two surgical procedures, one of which is to collect the chondrocytes, the other one by transplanting these cells after growth in vitro is there.
【0004】 [0004]
コラーゲンおよびグリコスアミノグリカンは骨および軟骨の再生における使用に適している2種類の生体材料である。 Collagen and glycosaminoglycans are two kinds of biological material suitable for use in the regeneration of bone and cartilage. コラーゲンを基材とする各種の基質は骨移植処理において使用されている。 Various substrates which collagen as a base has been used in bone grafting process. さらに、I型コラーゲンは、骨形成性の骨芽細胞に対して、良好な細胞接着性を有している。 Furthermore, I-type collagen, against osteogenic osteoblasts, has good cell adhesive properties. また、コラーゲンは増殖における一定の活性なまたは不活性な両方の支持骨格材料として作用する能力を有している。 Moreover, collagen has the ability to act as a constant active or inactive both scaffold in growth.
【0005】 [0005]
骨はリン酸カルシウムの各種の結晶に対して一定の規則的な様式で密接に結合しているI型コラーゲン原線維により構成されていることを特徴としている。 Bone is characterized in that it is constituted by type I collagen fibrils that are closely coupled with a constant regular fashion for various crystals calcium phosphate. 微量成分は一定の高分子の配列構造ならびに鉱物質相に主に付随している一連の小分子を含む。 Minor components includes a series of small molecules that are primarily associated with the array structure and mineral phase of a polymeric.
【0006】 [0006]
骨の特徴の一つは極めて小さい寸法の結晶であることである。 One feature of bone is that it is of very small dimension crystals. 骨の結晶は最小の生物学的に形成されている既知の結晶の内の一つであり、実際に、結晶学者は結晶が数個の単位細胞の厚さのみにより完全に安定になることが予測できない。 Crystal Bone is one of the known crystal have been the smallest biologically formed, in fact, the crystal scholars may become completely stable only by the thickness of a few units cells crystals can not predict. それゆえ、コラーゲン質の骨の構造はその形成、成分、および特性に関して特異的な特徴を有している。 Therefore, the structure of the bone collagenous its formation, has components, and the specific characteristics with respect to properties.
【0007】 [0007]
コラーゲン原線維に付随して一定の規則的な様式で安定に分散しているリン酸カルシウムを含む鉱物質化または鉱化したコラーゲンが米国特許第5,231,169号において開示されており、この特許文献は本明細書に参考文献として含まれる。 Mineralized or mineralized collagen containing calcium phosphate in association with collagen fibrils are stably dispersed in a certain regular manner is disclosed in U.S. Pat. No. 5,231,169, this patent document It is incorporated herein by reference.
【0008】 [0008]
ヒアルロン酸は軟骨細胞外基質における天然成分であり、容易に滅菌処理されて、生体崩壊性であり、広範囲な濃度および方式で製造できる。 Hyaluronic acid is a natural component of the cartilage extracellular matrix, is readily sterilized, is biodegradable, it can be manufactured in a wide range of concentrations and manner. このヒアルロン酸は一般に生体相容性であり、その吸収特性はそれぞれのモノマーの各種のポリマー形態への操作により、最も一般的には、そのグルクロン酸残基におけるカルボン酸基のエステル化により調整できる。 The hyaluronic acid is generally biocompatible, due to its absorption properties operations to various polymeric forms of the respective monomers, most commonly, it can be adjusted by esterification of the carboxylic acid group in the glucuronic acid residue .
【0009】 [0009]
フィブリンを含む生体接着物質は一定の組織接着医療装置として長い経歴を有しており、欧州において(1993年11月9日に発行されている米国特許第5,260,420号)市場で入手可能であると考えられる。 Bioadhesive substance comprising fibrin has a long history as a constant tissue adhesive medical device (U.S. Patent No. 5,260,420 which issued Nov. 9, 1993) in Europe available on the market it is considered to be. この適用範囲を制限している一つの障害はその短い転換期間および存在時間であり、この時間は移植部位に応じて数日間から数週間の範囲である。 One obstacle that limits the application range is its short conversion period and present time, the time ranges from a few days to weeks, depending on the implantation site. このフィブリン接着物質内へのコラーゲン線維の取り込みが報告されている(シエラ(Sierra)他,1993年,トランス・ソサイエテイ・バイオマテリアル(Trans. Soc. Biomater.),16巻,257頁および米国特許第5,290,552号)。 The collagen fiber incorporation into fibrin adhesive material inside has been reported (Sierra (Sierra) Other, 1993, Trans Sosaietei-biomaterials (Trans. Soc. Biomater.), 16 vol., Page 257 and U.S. Pat. No. No. 5,290,552). しかしながら、フィブリン単独の場合に比べてコラーゲン/フィブリンの組成物の場合には比較的に長い凝固時間が必要とされる。 However, longer coagulation time relatively is required in the case of the composition of the collagen / fibrin as compared with the case of fibrin alone.
【0010】 [0010]
従って、望ましくない生体外における培養方法に依存することなく構造の完全性を維持して組織修復のために使用できる生体崩壊性で生体相容性の基質が依然として要望されている。 Thus, biocompatible substrates in biodegradable that can be used for to tissue repair maintain the integrity of the structure there remains a need without depending on the culture method in undesirable vitro.
【0011】 [0011]
発明の概要 Summary of the Invention
本発明は架橋および鉱物質化したコラーゲン−多糖類基質、当該基質を調製するための方法、および骨、軟骨およびその他の軟質接合組織等の組織の修復において移植または注入により上記基質を使用する方法を提供する。 How to use a polysaccharide substrate, a method for preparing the substrate, and bone, the substrate by implantation or injection in cartilage and other soft connective tissue, such as tissue repair - the invention collagen crosslinking and mineralized I will provide a. この鉱物質化したコラーゲンは任意の種類の精製した、天然の、修飾した、または組換えのコラーゲンにより形成できる。 The mineralized collagen was purified any kind, natural, modified, or be formed by collagen recombination. 使用可能な多糖類の種類はヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸、ヘパラン、ヘパラン硫酸、デキストラン、デキストラン硫酸、アルギネート、およびその他の長鎖多糖類を含む。 Polysaccharides available types include hyaluronic acid, chondroitin sulfate, dermatan sulfate, keratan sulfate, heparan, heparan sulfate, dextran, dextran sulfate, alginate, and other long chain polysaccharides. 好ましい実施形態において、この多糖類はヒアルロン酸である。 In a preferred embodiment, the polysaccharide is hyaluronic acid.
【0012】 [0012]
本発明の架橋および鉱物質化したコラーゲン−多糖類基質は組織の増殖を行なうために単独、または増殖因子との組み合わせにおいて使用できる。 Collagen crosslinked and mineralized of the present invention - polysaccharide substrates may be used in combination with alone to perform tissue growth or growth factors.
【0013】 [0013]
本発明の基質と共に使用可能な増殖因子はTGF−β1,2および3、骨形態発生タンパク質(BMP's)、増殖分化因子(DGF's)、およびADMP−1を含むTGF−βの超系統群(superfamily)における各要素、酸性および塩基性の線維芽増殖因子(FGF−1および−2)を含む線維芽増殖因子系統群の各要素、インデイアン、ソニックおよびデザート・ヘッジホッグを含む各種タンパク質のヘッジホッグ(ハリネズミ属)系統群の各要素、IGF−Iおよび−IIを含むインスリン様増殖因子(IGF)系統群の各要素、PDGF−AB、PDGF−BBおよびPDGF−AAを含む血小板由来増殖因子(PDGF)系統群の各要素、IL−1乃至−6を含むインターロイキン(IL)系統群の各要素、およびCS Growth factors which can be used with the substrate of the invention TGF-β1,2 and 3, bone morphogenetic protein (BMP's), super family of TGF-beta, including growth and differentiation factors (DGF's), and ADMP-1 group each element in (superfamily), acidic and basic elements of fibroblast growth factor family including fibroblast growth factor (FGF-1 and -2) of Indeian, of various proteins including sonic and desert hedgehog hedgehog (erinaceus) elements, each element of the IGF-I and insulin-like growth factors including -II (IGF) family of family, PDGF-AB, platelet-derived growth factors including PDGF-BB and PDGF-AA (PDGF) each element of the family, each element of the interleukin (IL) family comprising IL-1 to -6, and CS −1、G−CSF、およびGM−CSFを含むコロニー刺激因子(CSF)系統群の各要素を含むがこれらに限らない。 -1, including the elements of the colony stimulating factor (CSF) family including G-CSF, and GM-CSF is not limited thereto.
【0014】 [0014]
本発明の鉱物質化したコラーゲン−多糖類基質を作成する方法は一定の外因性の多糖類を酸化してアルデヒド基を有する一定の修飾した外因性の多糖類を形成する工程、およびこの修飾した外因性の多糖類を諸条件下において鉱物質化したコラーゲンと反応させて、その各アルデヒド基が鉱物化したコラーゲンと架橋するように反応して一定の架橋した基質を形成する工程を含む。 Mineralized collagen of the present invention - step method of making a polysaccharide substrate to form a constant modified exogenous polysaccharide having an oxidation to aldehyde groups of the polysaccharide certain exogenous, and this modified polysaccharides exogenous reacted with mineralized collagen in various conditions, including the step of its respective aldehyde groups react to form a constant cross-linked substrate to crosslink the mineralized collagen. この方法はさらに一定の増殖因子を上記基質に添加する工程を含むことができる。 The method further certain growth factors may include the step of adding to the substrate. 一定の増殖因子は上記修飾した多糖類を鉱物質化したコラーゲンと反応させる工程の前または後のいずれにおいても添加できる。 Certain growth factors the polysaccharide mentioned above modifications can be added in either before or after the step of reacting the collagen mineralized. この鉱物質化したコラーゲンは米国特許第5,231,169号により分散または可溶化したコラーゲンにより調製される。 The mineralized collagen is prepared by the collagen dispersed or solubilized by U.S. Patent No. 5,231,169.
【0015】 [0015]
本発明は上記基質を所望の組織修復の部位に投与することにより組織の増殖を行なうために一定の架橋および鉱物質化したコラーゲン−多糖類基質を使用する方法も提供する。 The present invention is collagen was certain crosslinking and mineralized to perform the growth of tissue by administering the matrix at the site of desired tissue repair - also provides methods of using the polysaccharide substrate. この一定の増殖因子との組み合わせにおける基質は所望の修復の部位における組織の増殖を誘発するために移植または注入により投与できる。 Substrate in combination with the constant growth factors can be administered by implantation or injection to induce growth of tissue at sites of desired repair. さらに、フィブリンを含む一定の基質を投与して上記基質を組織欠損部位等のような所望の部位に固定できる。 Furthermore, it can fix the substrate to administer a metered substrates including fibrin to a desired site such as the tissue defect site.
【0016】 [0016]
上記の調製された基質は所望の組織増殖の部位に移植できる。 The substrate prepared in the portable to the site of desired tissue growth. また、この多糖類および鉱物質化したコラーゲンの各開始材料は、何らかの増殖因子等と共に、所望の組織増殖の部位に別々に注入することも可能である。 Each starting material of the polysaccharide and mineralized collagen, together with some growth factors such as, can be injected separately into the site of desired tissue growth. その部位において混合することにより、上記基質が原位置において形成され、その部位の形状に一致する。 By mixing at that site, the substrate is formed in situ, which conforms to the shape of the site.
【0017】 [0017]
本明細書において用いられているように、「修復(repair)」は新しい組織の増殖として定められている。 As used herein, "Repair (repair)" is defined as growth of new tissue. この新しい組織は元の損失した組織に対してその表現型または遺伝子型において同一であっても同一でなくてもよい。 The new organization may not be the same in its phenotype or genotype with respect to the original lost tissue. また、本明細書において用いられているように、「組織の再生(regeneration of tissue)」は上記の増殖した新しい組織が元の組織と一致していることを意味する。 Also, as used herein, "tissue regeneration (regeneration of tissue)" means that the new tissue grown above matches the original tissue. また、組織修復は、例えば、一定の関節部の欠損におけるヒアリン関節軟骨の線維軟骨による置換等のような、損失した組織を非同一組織により置換した結果とすることもできる。 Also, tissue repair, for example, may be a result of such, the lost tissue was replaced by non-identical tissues as replacement due fibrocartilage hyaline articular cartilage in defects of a certain joint. なお、修復に関連する基本的な細胞特性は接着、増殖、移動および分化を含む。 The basic cellular properties associated with repair include adhesion, proliferation, migration and differentiation.
【0018】 [0018]
「伝導(conduction)」とは、例えば、骨、軟骨または軟質組織等の宿主組織が上記架橋したコラーゲン−多糖類基質の上または中への既存組織の伸展により増殖することを意味する。 "Conduction (conduction)" is, for example, bone, is host tissue of cartilage or soft tissue such as the crosslinked collagen - means that proliferate by extension of existing tissue onto or medium polysaccharide substrate. この伝導において、各種の修復細胞は上記基質の上または中に移動して周囲の宿主組織と同一の新しい組織を合成および再造形する。 In this conduction, a variety of repair cells synthesize and remodel host tissue and same new tissue around move on or in the substrate. また、この誘発(induction)とは、各種の先祖細胞の増殖および分化が刺激されることを意味する。 Also, the the induction (induction), it means that the proliferation and differentiation of a variety of progenitor cells is stimulated. これらの先祖細胞は周囲の宿主組織と連続的になるように新しい組織を合成および再造形し続ける。 These progenitor cells continue to synthesize and remodel new tissue to be continuous with the surrounding host tissue.
【0019】 [0019]
本明細書において用いられているように、一定の組織の欠損は一定の先天性の状況、外傷、手術、ガンまたはその他の病気の結果とすることができる。 As used herein, the loss of certain tissue can be the result of certain congenital conditions, trauma, surgery, cancer or other diseases.
【0020】 [0020]
また、本明細書において用いられているように、一定の外因性の多糖類とは一定の遊離の多糖類を言う。 Also, as used herein, refers to a polysaccharide certain free from certain exogenous polysaccharide.
【0021】 [0021]
上記鉱物化したコラーゲンの多糖類に対する比率は上記基質の物理的および生物学的な諸特性の両方を変えるために変更可能である。 Ratio polysaccharides of the mineralized collagen can be modified to change both the physical and biological properties of the matrix. この鉱物質化したコラーゲンの割合が高くなるほど、さらに多孔質のスポンジ状の基質が得られる。 The higher the proportion of mineralized collagen increases further porous spongy substrate is obtained. また、多糖類の割合が高くなるほど、高いゲル状の基質が得られる。 Also, as the ratio of the polysaccharide is high, high gel-like matrix is ​​obtained.
【0022】 [0022]
好ましい実施形態の説明 Description of preferred embodiments
本発明の基質を調整する方法は一定の外因性の多糖類における糖の環状部分を開環する工程、および、例えば、一定の選択性的な酸化剤として過ヨウ素酸ナトリウムまたはカリウムを用いて末端のヒドロキシル基をアルデヒドに酸化する工程を含む。 Step substrate method To adjust the ring-opening a cyclic moiety of the sugar in certain exogenous polysaccharide, and, for example, using sodium periodate or potassium as a constant selective oxidizer end of the present invention comprising the step of oxidizing the hydroxyl group to an aldehyde. この様式で製造されるアルデヒド基の量は化学量論的に調整可能である。 The amount of aldehyde groups produced in this manner is stoichiometrically adjusted. 一般的に、上記環状構造の約1%乃至50%がこの様式で開環できる。 Generally, from about 1% to 50% of the annular structure can be ring-opened in this manner. さらに好ましくは、約1%乃至5%の環が開環してアルデヒド基を形成する。 More preferably, form about 1% to 5% of the rings are ring-opened aldehyde group. これらのアルデヒド基はコラーゲンのペプチド鎖におけるアミン部位においてそのコラーゲンと共役的な架橋を形成できる。 These aldehyde groups can form the collagen and covalently crosslinking the amine sites in the peptide chain of collagen. これらのアルデヒド基は別の架橋性の化合物の添加を伴わずに原位置において形成され、この場合の多糖類の主鎖とその主鎖に対して架橋するコラーゲン原線維との間の分子間距離は一定の架橋性の化合物を使用している場合の対応する距離よりも小さいと考えられる。 These aldehyde groups are formed in situ without the addition of another crosslinking compound, the intermolecular distance between the collagen fibrils of crosslinking with respect to the polysaccharide backbone of the case and its backbone considered is smaller than the distance corresponding when using certain crosslinking compounds. 従って、これらの多糖類およびコラーゲンの主鎖は比較的に密接に結合しており、この結合により、骨、軟骨または軟質の接合組織の増殖を支援、実行または誘発する一定の基質を提供するという目的において一定の有利な構造が形成される。 Therefore, the backbone of these polysaccharides and collagen are closely bound relatively, this bond, bone, support the growth of connective tissue of cartilage or soft, of providing a constant substrate to perform or induce certain advantageous structure is formed in the object.
【0023】 [0023]
上記コラーゲンを製造するための開始材料は任意の種類の精製した、天然の、修飾した、または組換えのコラーゲンとすることができる。 Starting material for the production of the collagen was purified any kind, natural, may be a collagen modified or recombinant. 骨の増殖において好ましいコラーゲンはI型コラーゲンであるが、軟骨の増殖において好ましいコラーゲンはII型コラーゲンである。 Preferred collagen in bone growth is Type I collagen, preferably collagen in growth of cartilage is Type II collagen. このコラーゲンは架橋されていてもよく、架橋されていなくてもよいが、上記多糖類のアルデヒド基に対して架橋するために側鎖の各基に対する接近性を高めるためには、このコラーゲンは架橋されていないことが好ましい。 The collagen may be crosslinked, but may not be crosslinked, in order to increase accessibility for each group of the side chain to crosslink with respect to the polysaccharide aldehyde groups, the collagen is cross-linked it is preferable not to have been. 軟骨修復のような、固有の細胞接着部位をマスキングすることが望まれるI型コラーゲンを組織修復のために用いる場合には、これらの接着部位は非細胞接着性の多糖類の使用によりマスキングして細胞同士の相互作用および接着の増加を支援することができる。 Such as cartilage repair, in the case of using type I collagen which it is desired to mask the inherent cell adhesion site for tissue repair, these adhesion sites are masked by the use of non cell-adhesive polysaccharides it can support increased interaction and adhesion between cells.
【0024】 [0024]
上記鉱物質化されるコラーゲンは通常的に分散状態または可溶化したコラーゲンになり、この場合の可溶化は一定の高められたpH値、通常において、少なくとも約pH8、さらに通常的に約pH11乃至pH12であり、一般的に1規定(1N)よりも低い一定の媒体中においてそのコラーゲン供給源を分散することにより達成される。 Collagen is the mineralized becomes usually dispersed state or solubilized collagen, solubilized pH value which is elevated constant in this case, in the normal, at least about pH 8, more usually to about pH11 to pH12 , and the is achieved by dispersing the collagen source in a generally 1N low during a fixed medium than (1N). 一般的に、水酸化ナトリウムが用いられるが、別のアルカリ金属の水酸化物または水酸化アンモニウム等のような、別の水酸化物も有用であると考えられる。 In general, sodium hydroxide is used, such as hydroxide or ammonium hydroxide of another alkali metal, it is considered that another hydroxides are also useful.
【0025】 [0025]
上記コラーゲンの濃度は一般に約1重量%乃至10重量%、さらに通常的に約1重量%乃至5重量%の範囲内にできる。 The concentration of the collagen is generally from about 1 wt% to 10 wt%, still possible to usually from about 1% to the range of 5 wt%. このコラーゲンの媒体は一般に約0.0001乃至0.1規定の範囲内の塩基性の濃度になる。 The medium of collagen to a concentration of the basic generally in the range of about 0.0001 to 0.1N. さらに、このpH値は反応の過程中において一般に約10乃至13、好ましくは約12の範囲内に維持される。 Furthermore, the pH value is generally about 10 to 13 during the course of the reaction, it is preferably maintained in the range of about 12.
【0026】 [0026]
さらに、リン酸塩およびカルシウムが一般に約0.010.2M、好ましくは約0.025M乃至0.075Mの範囲内の一定濃度における溶液として添加される。 Furthermore, phosphate and calcium generally about 0.010.2M, is preferably added as a solution in a certain concentration in the range of from about 0.025M to 0.075 M. また、上記コラーゲン媒体に添加されるこれらの溶液の量は一般に少なくとも10%、通常的に少なくとも25%で約400%以下、一般に約50%乃至150%の範囲内でそのコラーゲン媒体の量を増加する。 Also, increasing the amount of at least 10% to about 400% or less commonly at least 25%, generally from about 50% to the collagen medium in the range of 150% in general the amount of these solutions to be added to the collagen medium to. これにより、このコラーゲンの溶液は一般に4倍以上には希釈されない。 Thus, the solution of the collagen is not diluted to typically 4 times.
【0027】 [0027]
上記の添加速度は比較的に遅く、一般に少なくとも約1時間で約72時間以下、一般に約2時間乃至18時間の範囲内、通常的に約4時間乃至16時間の範囲内である。 The rate of addition of the is relatively slow, typically below at least about 1 hour at about 72 hours, generally in the range of from about 2 hours to 18 hours, in the range of usually from about 4 hours to 16 hours. 例えば、1リットルのコラーゲン分散液の場合に、合計で約1リットルの各試薬が添加され、この添加速度は1時間当たりに50ml乃至150mlの範囲内になる。 For example, in the case of 1 liter collagen dispersion is added each reagent of approximately 1 liter total, the addition rate is within the range of 50ml to 150ml per hour.
【0028】 [0028]
各試薬の添加は一定の化学量論的な比率において行なうことができるが、化学量論的であることは必要ではなく、約50%までの、好ましくは約25%以下の化学量論からの変化が好ましい。 The addition of each reagent may be carried out in certain stoichiometric ratio, it is not necessary that a stoichiometric, up to about 50%, preferably from about 25% or less of the stoichiometric change is preferable. 従って、化学量論的な添加が維持されない場合に、一部の成分が枯渇しても、別の成分の添加が続けられる可能性がある。 Therefore, when the stoichiometric addition is not maintained, even if some of the components are depleted, the addition of another component could be continued.
【0029】 [0029]
上記の反応の過程中に、穏やかな攪拌が維持されて、上記のコラーゲン原線維およびリン酸カルシウムの鉱物質の実質的に均一な混合が確実におこなわれる。 During the course of the reaction, mild agitation is maintained, substantially uniform mixing of the mineral of the collagen fibrils and the calcium phosphate is ensured. また、通常的に約4℃で約40℃以下、好ましくは約15℃乃至30℃の範囲内の穏やかな温度条件が採用される。 Further, about 40 ° C. at usually from about 4 ° C. or less, preferably mild temperature conditions in the range of about 15 ℃ to 30 ° C. are employed. さらに、上記コラーゲンのリン酸カルシウム鉱物質に対する重量比率は一般に約8:2乃至1:1、さらに通常的に約7:3になる。 Further, the weight ratio is generally from about 8 for calcium phosphate mineral of the collagen: 2 to 1: 1, more usually from about 7: becomes 3.
【0030】 [0030]
上記の添加の完了後に、攪拌、例えば、かきまぜ処理が通常的に少なくとも約1時間、さらに通常的に約2時間継続され、この攪拌はさらに続けることも可能である。 After completion of the addition, stirring, for example, stirring treatment usually at least about 1 hour, is continued usually from about 2 hours, it is also possible the stirring is continued further. この攪拌の継続量は上記製品の調製に対して重要ではない。 Continuation of the stirring is not critical to the preparation of the above product.
【0031】 [0031]
上記反応の完了後に、その鉱物質化したコラーゲンが種々の様式で処理可能になる。 After completion of the reaction, collagen the mineralized becomes possible treatment in various ways. この製品はあらゆる未結合の鉱物質または上記媒体中の別の成分を除去すると共にさらに中性のpH値にするために繰り返して洗浄することが可能である。 The product can be further washed repeatedly to the neutral pH value to remove the different components in the mineral or said medium of any unbound. なお、この洗浄は水、塩類溶液等により容易に行なうことができる。 Incidentally, this washing can be performed easily with water, saline solution or the like.
【0032】 [0032]
上記の鉱物質化したコラーゲンはさらに種々の様式で処理できる。 Collagen mineralized above can be processed further in various ways. これらの対象の組成物はホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、各種のクロム塩、ジイソシアネート等のような種々の架橋剤により架橋することができる。 The composition of these objects can be crosslinked formaldehyde, glutaraldehyde, various chromium salts, by various crosslinking agents such as diisocyanates.
【0033】 [0033]
上記のポリアルデヒド型多糖類および鉱物質化したコラーゲンが別々に注入可能な材料であり、これらが接触した時に反応して所望の組織増殖または増殖の部位において原位置で上記基質を形成できることが本発明の一つの特徴である。 A said polyaldehyde type polysaccharides and mineralized collagen injectable material separately, this can be formed the substrate in situ at the site of desired tissue growth or growth reaction to when they are in contact it is one of the characteristics of the invention. この利点は手術的な移植処置が必要でないこと、および流動性の開始材料がその反応の完了前に上記部位の形状に一致することである。 This advantage is not required surgical implantation procedure and the fluidity of the starting material is to conform to the shape of the site prior to completion of the reaction. この結果、予め形成されている固体基質の切断および整形の必要を伴わずに上記部位に対して形状が一致する一定の基質が得られる。 As a result, certain substrates shape matching with respect to the site is obtained without the need for cutting and shaping of the solid substrate which has been previously formed.
【0034】 [0034]
利用可能な上記多糖類の種類はヒアルロン酸、硫酸コンドロイチン、デルマタン、硫酸デキストラン、アルギネート、およびその他の長鎖多糖類を含む。 Available the polysaccharide types of hyaluronic acid, chondroitin sulfate, containing dermatan, dextran sulfate, alginate, and other long chain polysaccharides. 一般的に、この多糖類は約1,000ダルトン(DA)乃至10,000,000ダルトンの一定の平均分子量を有する。 Typically, the polysaccharide will have a constant average molecular weight of about 1,000 daltons (DA) to 10,000,000 daltons.
【0035】 [0035]
上記外因性の多糖類における糖の環状構造の開環のための試薬は過ヨウ素酸カリウムまたはナトリウム等の末端の水酸基をアルデヒドに酸化する任意の選択的酸化性の試薬とすることができる。 The reagent for the ring-opening of the cyclic structure of the sugar in the exogenous polysaccharide may be any selective oxidizing agent which oxidizes a terminal hydroxyl group, such as potassium periodate or sodium aldehyde. さらに、別の試薬は特定の糖酸化酵素を含む。 Furthermore, another reagent comprises a specific sugar oxidases.
【0036】 [0036]
上記の好ましい多糖類はヒアルロン酸である。 Above preferred polysaccharide is hyaluronic acid. この多糖類の鉱物質化したコラーゲンに対する相対比率により種々の物理的および生物学的な特徴がその基質に与えられる。 Various physical and biological characteristics by the relative ratio of the polysaccharide of mineralized collagen is applied to the substrate. さらに、この多糖類の鉱物質化したコラーゲンに対する比率は一定のモル比率の基準または一定の重量比率の基準において特徴付けることができる。 Further, the ratio of the polysaccharide mineralized collagen may be characterized in the reference standard or constant weight ratio of constant molar ratio. 一般的に、鉱物質化したコラーゲンの多糖類に対する重量比率は99:1乃至1:99である。 Generally, the weight ratio of polysaccharide collagen mineralized 99: 1 to one ninety-nine. このことは、ヒアルロン酸において1,000,000ダルトンの一定の平均分子量およびコラーゲン(非鉱物質化状態の重量に基づく)において100,000ダルトンと仮定する場合に、それぞれ、99.9:0.1乃至1:9の一定のモル比率を示している。 This means that if it is assumed that 100,000 daltons constant average molecular weight of 1,000,000 daltons in hyaluronic acid and in the collagen (based on the weight of the non-mineral quality state), respectively, 99.9: 0. 1 to 1: 9 shows a fixed molar ratio of. このモル比率は使用する多糖類およびコラーゲンの実際の分子量により変化し得る。 The molar ratio may vary with the actual molecular weight of the polysaccharide and collagen used. 本明細書において開示されている好ましい実施形態において、上記コラーゲンの多糖類に対する重量比率は9:1乃至約1:9である。 In the preferred embodiment disclosed herein, the weight ratio of the polysaccharide of the collagen 9: 1 to about 1: 9.
【0037】 [0037]
さらに、上記鉱物質化したコラーゲンの多糖類に対する比率は上記基質の物理的および生物学的な両方の諸特性を変化するために変更可能である。 Further, the ratio of polysaccharide collagen the mineralized can be varied to alter the physical and biological both properties of the matrix. 生物学的には、I型コラーゲンの比率を高めることにより骨の組成および構造にさらに密接に近づき、II型コラーゲンの比率を高めることにより軟骨の組成にさらに密接に近づく。 Biological approaches to more closely on the composition and structure of the bone by increasing the proportion of type I collagen, further approaches closely the composition of cartilage by increasing the proportion of type II collagen. 骨形成性の細胞はコラーゲンにおける特定の細胞接着部位に対して相互作用して、分割、移動、および分化して新しい骨を形成する。 Cells of osteogenic interact for a specific cell adhesion sites in the collagen, division, migration, and differentiation to form new bone.
【0038】 [0038]
あるいは、上記の多糖類、好ましくはヒアルロン酸の比率を高めることにより、一定の自然な軟骨基質にさらに密接して近づく。 Alternatively, the polysaccharide, preferably by increasing the ratio of hyaluronic acid and approaches to more closely on certain natural cartilage matrix. 加えて、多糖類の比率を高めると、コラーゲンにおける特定の細胞接着部位の一部がマスキングされ、軟骨組織の発育において重要な別の細胞同士の相互作用および凝集が助長される。 In addition, increasing the proportion of polysaccharide, some specific cell adhesive sites in the collagen are masked, interaction and aggregation of another cell among important in the development of cartilage tissue is promoted.
【0039】 [0039]
本発明の基質と共に使用可能な増殖因子はTGF−β1,2および3、骨形態発生タンパク質(BMP's)、増殖分化因子(DGF's)、およびADMP−1を含むTGF−βの超系統群(superfamily)における各要素、酸性および塩基性の線維芽増殖因子(FGF−1および−2)を含む線維芽増殖因子系統群の各要素、インデイアン、ソニックおよびデザート・ヘッジホッグを含む各種タンパク質のヘッジホッグ(ハリネズミ属)系統群の各要素、IGF−Iおよび−IIを含むインスリン様増殖因子(IGF)系統群の各要素、PDGF−AB、PDGF−BBおよびPDGF−AAを含む血小板由来増殖因子(PDGF)系統群の各要素、IL−1乃至−6を含むインターロイキン(IL)系統群の各要素、およびCS Growth factors which can be used with the substrate of the invention TGF-β1,2 and 3, bone morphogenetic protein (BMP's), super family of TGF-beta, including growth and differentiation factors (DGF's), and ADMP-1 group each element in (superfamily), acidic and basic elements of fibroblast growth factor family including fibroblast growth factor (FGF-1 and -2) of Indeian, of various proteins including sonic and desert hedgehog hedgehog (erinaceus) elements, each element of the IGF-I and insulin-like growth factors including -II (IGF) family of family, PDGF-AB, platelet-derived growth factors including PDGF-BB and PDGF-AA (PDGF) each element of the family, each element of the interleukin (IL) family comprising IL-1 to -6, and CS −1、G−CSF、およびGM−CSFを含むコロニー刺激因子(CSF)系統群の各要素を含むがこれらに限らない。 -1, including the elements of the colony stimulating factor (CSF) family including G-CSF, and GM-CSF is not limited thereto. これら増殖因子の各調製物は市場において、あるいは、組織からまたは組換えの各種供給源からの単離および精製のいずれかにより得られる。 Each preparation of these growth factors in the market, or obtained by any of the isolated and purified from various sources from tissue or recombinant. これらの増殖因子は一定の広い投薬範囲(フェントグラム(fentogram)乃至ミリグラムの範囲)にわたり上記コラーゲン/HA/フィブリンの各種基質に投入できる。 These growth factors can be introduced into various substrates of the collagen / HA / fibrin over a period broad dosage range (phen chromatogram (Fentogram) through the range of milligrams). 費用、安全性および所望の増殖因子の放出プロファイル等の各種の要因により、上記基質に投入される増殖因子の量が決まる。 Cost, the various factors of the release profiles such as safety and the desired growth factors, the amount of growth factor that is introduced into the matrix is ​​determined.
【0040】 [0040]
トロンビンはフィブリノゲンに対応する一定の触媒として作用してフィブリンを生成する。 Thrombin acts as a constant catalyst corresponding to fibrinogen to produce fibrin. 本発明において、これらのフィブリノゲンおよびトロンビンは酸化した外因性の多糖類および鉱物質化したコラーゲンを入れた一定の反応容器に個別に添加される。 In the present invention, these fibrinogen and thrombin are added individually to a predetermined reaction vessel containing polysaccharides and mineralized collagen exogenous oxidized. この実施形態において、最終的な反応が望まれるまで、これらのフィブリノゲンおよびトロンビンを分離し、上記の酸化した外因性の多糖類および鉱物質化したコラーゲンを分離した状態に維持することが望ましい。 In this embodiment, until the final reaction is desired to separate these fibrinogen and thrombin, it is desirable to maintain the separated state polysaccharides and mineralized collagen of oxidized exogenous above.
【0041】 [0041]
上記基質を形成する場合に使用するフィブリノゲンの濃度は好ましくは10mg/ml以上である。 The concentration of fibrinogen used in forming the matrix is ​​preferably at 10mg / ml or more. 一方、上記トロンビンは約0.01NIH単位乃至約100NIH単位/ml、好ましくは約0.1NIH単位乃至2.0NIH単位/mlの一定濃度で上記フィブリノゲンに添加される。 On the other hand, the thrombin is about 0.01NIH units to about 100NIH units / ml, preferably added to the fibrinogen at a fixed concentration of about 0.1NIH units to 2.0NIH units / ml. このトロンビンは種々の供給源から市場において入手可能である。 The thrombin is commercially available in the market from a variety of sources. また、フィブリノゲンは患者の自己血漿または市場の各種の供給源から入手できる。 In addition, fibrinogen is available from a variety of sources of autologous plasma or market of the patient. 本発明による上記基質は所望の形状の各種の金型内における凍結乾燥、湿式堆積処理、および空気乾燥処理により任意の形状に形成できる。 The substrate according to the present invention can be formed into any shape lyophilization, wet-laid process, and by air-drying process in the various molds of the desired shape. また、一定の高い比率の多糖類を含む湿式堆積処理した材料は一定の骨折部分または関節部分の中に注入または直接的に供給するための粘性のゲルとして形成することも可能である。 It is also possible to form a viscous gel for the wet deposition process material to be injected or directly fed into the constant fracture portions or joint portions comprising a polysaccharide constant high proportion. 上述したように、各種の開始材料は注入可能でもあり、別々に注入して所望の組織増殖の部位において混合することにより、不所望な副生成物を形成することなく反応できる。 As described above, various starting materials is also pourable, by mixing at the site of desired tissue growth and injected separately, can react without forming undesirable by-products.
【0042】 [0042]
本発明による基質の有用性は各種の生体外および生体内の両方の試験において示すことができる。 The usefulness of substrates according to the invention can be demonstrated in tests of both various in vitro and in vivo. 生体外の試験においては、ワング(Wong)およびコーン(Cohn),( PNAS USA( PNAS In vitro testing, Wang (Wong) and corn (Cohn), (PNAS USA ( PNAS USA ,72巻,3167頁乃至3171頁,1975年)の方法による一連のコラーゲナーゼ消化により得られる一次胎児ラット頭蓋冠細胞、またはタイベルグ(Thyberg)およびモスカレウスキー(Moskalewski),( セル・テイシュー・リサーチCell USA), 72 vol., 3167, pp to p. 3171, primary fetal rat calvarial cells obtained by a series of collagenase digestion method 1975) or Taiberugu (Thyberg) and Mosca Reus keys, (Moskalewski), (Cell Teishu research (Cell Tissue Tissue Res. Res. ,204巻,77頁乃至94頁,1979年)による一次ラット骨端軟骨、またはブレイン−セラ,O(Blein−Sella O)他,( メソッズ・モレキュラー・バイオロジーMethods , 204, pp. 77 pp to 94 pages, primary rat epiphyseal cartilage by 1979) or Blaine - Sera, O (Blein-Sella O) other, (Mesozzu Molecular Biology (Methods Mol. Mol. Biol. Biol. ),43巻,169頁乃至175頁,1995年)の方法により得られるラビット関節軟骨細胞を上記の各基質内に接種して1週間乃至4週間にわたり従来的な諸条件下において培養する。 ), Vol. 43, 169 pp to 175 pp, cultured in conventional terms conditions the rabbit articular chondrocytes obtained by the method for one week to four weeks was inoculated into each substrate above 1995). その後、これらの培養物を処理して組織学的に評価する。 Then, to evaluate processes these cultures histologically.
【0043】 [0043]
本発明による多糖類−鉱物質化コラーゲンの各基質の特別な利点はこれらの成分が架橋および鉱物質化したコラーゲンに匹敵する増殖因子の結合能力を有しているだけでなく、はるかに高い骨伝導性を有していることである。 A particular advantage of each substrate mineralized collagen not only these components have a binding capacity of growth factors comparable to crosslinking and mineralized collagen, much higher bone - polysaccharides according to the invention it is that it has a conductivity. さらに、この多糖類−鉱物質化コラーゲンは多糖類−鉱物質化コラーゲンに匹敵する骨伝導性を有すると共に、これらは比較的に低い増殖因子放出速度を有しており、このことは上記基質内における増殖因子の保持において有利である。 Further, the polysaccharide - mineralized collagen polysaccharide - and having bone conductivity comparable to mineralized collagen, they have a relatively low growth factor release rate, this is in the matrix it is advantageous in holding growth factor in.
【0044】 [0044]
また、本発明の各基質における軟骨伝導能力は一次ラットの骨髄細胞および間質細胞ならびにレチン酸処理した一次ラットまたはラビットの軟骨細胞またはヒトの間葉幹細胞における接着、移動、増殖および分化の有効な支援により決定できる。 The adhesive in cartilage conduction capability marrow and stromal cells as well as retinoic acid-treated primary rat or rabbit chondrocytes or mesenchymal stem cells of human primary rat at each substrate of the present invention, mobile, effective proliferation and differentiation It can be determined by the support. 骨髄細胞および骨髄間質細胞は全層欠損の肋軟骨下骨髄において見られる早期軟骨先祖細胞に極めて似ている。 Bone marrow cells and bone marrow stromal cells are very similar to early cartilage progenitor cells found in the subchondral bone marrow of full-thickness defects. 生後2週間乃至3週間の近親交配ルイス(Lewis)ラットの長骨から骨髄を採取し、一定の基質に直接的に加えて、標準的な諸条件下において2週間にわたり培養した。 Bone marrow was collected from 2 weeks to 3 weeks of inbreeding Lewis (Lewis) long bones of rats after birth, in addition directly to a certain substrate, and cultured for 2 weeks under standard terms conditions. これらの培養物により増殖した接着性の間質細胞を継代処理して使用のために凍結した。 The adhesion stromal cells grown with these cultures were frozen for passaging process and use. 6代までの継代の各細胞を用いて上記基質上に培養または接種した。 And cultured or seeded onto the substrate using each cell passages up to 6 generations.
【0045】 [0045]
レチン酸処理した軟骨細胞は軟骨形成における後期の段階を示す。 Chondrocytes were treated retinoic acid shows a later stage in cartilage formation. 一次産物のレチン酸処理は各細胞の一定候補の基質上における培養処理または接種処理の前に行なう(デイエツ,U(Dietz, U.)他,1993年, ジャーナル・セル・バイオロジーJ. Retinoic acid treatment of primary product is carried out before the culture treated or inoculated processing on a substrate of a certain candidate of each cell (Deietsu, U (Dietz, U.) Other, 1993, Journal Cell Biology (J. Cell Cell Biol. Biol. ),52(1)巻,57頁乃至68頁)。 ), 52 (1) winding, 57 pp to 68 pages).
【0046】 [0046]
また、別の方法において、初期および後期の段階の各軟骨細胞の生体外調査が、各種の間質細胞による各基質の条件付けを可能にすると共に、これらをさらに成熟した軟骨細胞に置き換えるために、併合されている。 Further, in another method, in vitro studies the chondrocytes early and late stages, thereby allowing the conditioning of the substrate by various stromal cells, to replace these with more mature chondrocytes, It has been merged. この様式において、軟骨形成の初期段階における各基質の進展がこの処理の後期の段階における各作用について調査できる。 In this manner, the progress of each substrate in the early stages of cartilage formation may be examined for each action in the later stages of the process.
【0047】 [0047]
上記基質における細胞の接着および増殖は細胞数およびミトコンドリアの活性に基づく生活能力を測定できる一定のMTSアッセイによりモニターする。 Adhesion and proliferation of cells in the matrix are monitored by certain MTS assay that can measure the viability based on cell number and mitochondrial activity. 各種の間質細胞または軟骨細胞を接着の分析のために血清の存在下または非存在下において各基質上で6時間乃至8時間にわたり培養し、さらに増殖の評価のために1週間乃至2週間にわたり培養する。 And cultured for 6 to 8 hours on each substrate in the presence or absence of serum for analysis of bonding a variety of stromal cells or chondrocytes, for a further 1 week to 2 weeks for assessment of proliferation to culture.
【0048】 [0048]
また、細胞移動の試験において、各基質は多孔質のトランス−ウェル(Trans−well)膜培養インサート物(コーニング社(Corning))の上に塗布または嵌合される。 Further, in the test cell migration, each substrate is porous trans - is applied or fitted to the top of the well (Trans-well) film culture inserts product (Corning (Corning)). 各種の間質細胞がこのトランス−ウェル膜の上部チャンバー内における各基質の上部に接種され、一定の化学誘引物質(増殖因子、PDGF)がその下部チャンバー内に配置される。 Various stromal cells The trans - inoculated at the top of each substrate in the upper chamber of the well layer, certain chemoattractant (growth factor, PDGF) are disposed in the lower chamber. 培養の12時間乃至18時間後に、上記基質を通してトランス−ウェル膜の下面部に移動した細胞がMTSアッセイにより定量される。 After 12 hours to 18 hours of culture, the transformer through the substrate - cells that migrated to the lower surface of the well layer is quantified by MTS assay. さらに、各基質が上部チャンバーから除去され、組織学的に処理されて浸潤の程度が評価される。 Furthermore, each substrate is removed from the upper chamber, the degree of infiltration is assessed histologically processed.
【0049】 [0049]
軟骨形成および骨形成に関連する各種の分化標識の分析がタンパク質および転写の量の両方について評価される。 Analysis of the various differentiation marker associated with chondrogenesis and osteogenesis are evaluated for both the amount of protein and transcription. 分析可能な特定の標識は(1)II型コラーゲンおよびIIA、IIBの各イソ型、(2)アグリカン・プロテオグリカン、(3)IX、XおよびXI型の各コラーゲン、(4)I型コラーゲン、(5)軟骨基質タンパク質(CMP)、(6)カート−1(Cart−1)転写因子、(7)フィブロネクチン(EDA、EDBの各イソ型)、(8)デコリン・プロテオグリカン、(9)リンク・タンパク質、(10)NG−2プロテオグリカン、(11)ビグリカン・プロテオグリカン、(12)アルカリ・ホスファターゼを含む。 Analysis particular label possible (1) II collagen and IIA, each isoform IIB, (2) aggrecan proteoglycans, (3) IX, X and XI type each collagen, (4) I collagen, ( 5) cartilage matrix protein (CMP), (6) Cart -1 (Cart-1) transcription factor, (7) fibronectin (EDA, each isoform of EDB), (8) decorin-proteoglycan, (9) link protein , including (10) NG-2 proteoglycan, (11) biglycan, proteoglycans, and (12) alkaline phosphatase. また、分化はノーザン/PCP分析、ウエスタン・ブロット処理により、あるいは、代謝細胞標識化により測定できる。 Also, differentiation Northern / PCP analyzed by Western blot process or can be measured by metabolic cell labeling.
【0050】 [0050]
上記ノーザン/PCP分析の場合に、RNAが各複合基質上において培養した各種の間質細胞または軟骨細胞から標準的な処置により単離される。 In the case of the Northern / PCP analysis, RNA is isolated by standard treatment of various stromal cells or chondrocytes cultured on the composite substrate. 細胞型に応じて1週間乃至6週間の範囲の最適な培養期間を決定するために時間経過試験が採用できる。 It can be adopted elapsed test time to determine the optimal incubation period of one week to six weeks range depending on the cell type. このようにして単離したRNAはノーザン・ゲルおよび特定のcDNAまたはPCR用の増殖処理した各種プローブによるハイブリッド形成技法により分析される。 Thus isolated RNA is analyzed by hybridization techniques with various probes grown processed for Northern gel and specific cDNA or PCR. このノーザン分析はオートラジオグラフのデンシトメトリー走査およびハウスキーピング遺伝子信号(G3PDH)への正規化により定量化される。 The Northern analysis is quantified by normalization to densitometry scanning and housekeeping gene signals autoradiographs (G3PDH). さらに、このノーザン分析は分析する各種遺伝子の公表されているcDNAシーケンスにより生成される各プライマーによる定量的なPCR分析により補足される。 Furthermore, this Northern analysis is supplemented by quantitative PCR analysis with the primers produced by the cDNA sequence which is published in various genes to be analyzed.
【0051】 [0051]
また、ウエスタン・ブロット処理の場合には、可溶化したタンパク質溶解産物が標準的な技法(スピロ,R.C.(Spiro R. C.)他,1991年, ジャーナル・セル・バイオロジーJ. In the case of western blot processing techniques the protein lysates were solubilized standard (Spiro, R.C. (Spiro R. C.) Other, 1991, Journal Cell Biology (J. Cell. Cell. Biol. Biol. ),115巻,1463頁乃至1473頁)により各種の複合基質上において培養した細胞から単離される。 ), 115 vol isolated from cells cultured in a variety of composite on a substrate by 1463 pages to pages 1473). 各細胞の溶解後に、比較的に強力な変性剤(8M尿素、Gn塩酸(GnHCL))中において各基質を抽出して、基質結合したまたは取り込まれた各種のタンパク質を取り出して調べる。 After lysis of the cells, a relatively strong denaturants extracts each substrate in (8M urea, Gn hydrochloride (GnHCl)) in examined extracts the substrate bound or incorporated various proteins. 各種のタンパク質サンプルが特定のポリクローナルまたはモノクローナルの抗体により標準的なウエスタン・ブロット技法により分析される。 Various protein samples are analyzed by standard Western blotting techniques with antibodies specific polyclonal or monoclonal.
【0052】 [0052]
また、代謝細胞標識化においては、一定の複合基質において培養した細胞が標準的な技法(スピロ(Spiro)他, 同上 )により35 SO In the metabolic cell labeling, certain cells cultured in the composite substrate standard techniques (Spiro (Spiro) Other, supra) by 35 SO 4 35 S−メチオニンまたは , 35 S- methionine or 3 H/ 14 C標識化アミノ酸により代謝的に放射性標識化される。 It is metabolically radiolabeled with H / 14 C-labeled amino acids. さらに、可溶化した細胞および基質に結合したタンパク質が関連のタンパク質に対して特異的な各種の抗体により定量的に免疫沈降処理されて、SDS−PAGE(SDS−PAGE)(スピロ(Spiro)他, 同上 )により分析される。 Furthermore, proteins bound to the solubilized cell and the substrate is quantitatively immunoprecipitated processed by a specific variety of antibodies against the relevant protein, SDS-PAGE (SDS-PAGE) (spiro (Spiro) Other, is analyzed by ibid.). これらの結果の定量はオートラジオグラフのデンシトメトリー走査処理により行なわれ、これらの信号が各種の細胞等価物またはアクチンのようなハウスキーピング・タンパク質に対して正規化される。 These results quantification performed by densitometry scanning process of autoradiographs, these signals are normalized to housekeeping proteins, such as various cell equivalents or actin.
【0053】 [0053]
加えて、生体内における軟骨形成性の分化を支援する本発明の基質の能力が近親交配したラットの軟質組織移植モデルにおいて試験できる。 In addition, it is tested in the soft tissue transplantation model in rats substrate capabilities of the present invention to support the differentiation of chondrogenic was selfed in vivo. ラットの骨髄細胞または間質細胞が高密度で各基質上に接種され、10%のFBS血清および各種の抗生物質を含有しているMEM培地中において一晩にわたり培養された後に、ミリポア(Millipore)拡散チャンバー内に移されて、生後8週間の各レシピエントの腹腔内または皮下に移植される。 Bone marrow cells or stromal cells of rats were inoculated on each substrate at a high density, after being incubated overnight in MEM medium containing 10% FBS serum and various antibiotics, Millipore (Millipore) are transferred to the diffusion chamber, it is implanted intraperitoneally or subcutaneously into each recipient of 8 weeks old. 3週間後に各小室を採取して、軟骨形成について組織学的に評価する。 Each Komuro was taken after three weeks, are assessed histologically for cartilage formation.
【0054】 [0054]
さらに、上記各複合基質の生体内における軟骨表現型を維持する能力を評価するために異系交配のラット内の移植モデルが用いられる。 Furthermore, transplantation model in the rat outbred is used to evaluate the ability to maintain the cartilage phenotype in vivo of each of the composite substrate. 肋軟骨の軟骨細胞が高密度で各基質上に接種されて、1%のラット血清および各種の抗生物質を含有しているハムF−12(Ham's F−12)中において一晩にわたり培養される。 Chondrocytes costal cartilage is inoculated onto each substrate at a high density, cultured overnight in 1% rat serum and Ham F-12 containing various antibiotics (Ham's F-12) in It is. その後、これらの接種された各基質は生後8週間のオスのスプラグ−ドーリー(Sprague−Dawley)種のラットにおいて閉塞性切開(blunt dissection)により形成した後脛骨筋嚢の中に移植される。 Thereafter, the substrate is these inoculation sprag of 8 weeks old male - are implanted into the tibialis posterior capsule formed by occlusive dissection (blunt dissection) in Dawley (Sprague-Dawley) species rats. その後、体外移植組織を14日目および28日目に採取して、基質の相容性、軟骨の増殖、アグリカンおよびII型コラーゲンに対する染色に基づく分化した表現型の維持について組織学的に評価する。 Thereafter, explants were harvested at day 14 and day 28, compatibility of the substrate, cartilage growth, histologically evaluated for the maintenance of differentiated phenotype based on staining for aggrecan and type II collagen .
【0055】 [0055]
加えて、本発明の一定の基質の、周囲の血清、組織流体の中、または各種軟骨先祖細胞の分泌生成物中において見られる細胞外基質タンパク質(各種のプロテオグリカン、タンパク質および増殖因子)に対して相互作用する能力は一定の基質の軟骨伝導性の能力に相関している。 In addition, certain substrates of the present invention, the surrounding serum, in tissue fluid, or for found extracellular matrix proteins in various cartilage progenitor secreted products of the cell (various proteoglycans, proteins and growth factors) the ability to interact is correlated to certain substrates of cartilage conductive capacity. 本発明の各基質の各種細胞外基質タンパク質に対する相互作用はウエスタン・ブロット処理、アフィニティ同時電気泳動技法および各種の結合特性等の当該技術分野における熟練者において知られている各種の手段により測定できる。 Interaction with various extracellular matrix proteins for each substrate of the invention Western blot process may be measured by a variety of means known to those skilled in the art, such as binding properties of affinity simultaneous electrophoretic techniques and various.
【0056】 [0056]
本発明の基質に対して結合している血清タンパク質を定量するために、この基質を増加した量の血清(種々の種および供給源)を含有している培養培地内において培養する。 To quantify the serum protein bound to the substrate of the present invention are cultured in a culture medium containing an amount of serum increased the substrate (various species and sources). 洗浄後に、結合していた各種のタンパク質がSDS−PAGEサンプル緩衝液中における煮沸により溶離し、不溶化した基質が遠心分離により除去される。 After washing, various proteins bound are eluted by boiling in SDS-PAGE sample buffer, insolubilized substrate is removed by centrifugation. その後、ウエスタン・ブロット処理を行ない、フィブロネクチンおよびビトロネクチン等の特定的に結合している各種の成分を確認する。 Thereafter, it performs Western blotted to verify specifically bound to have various components such as fibronectin and vitronectin.
【0057】 [0057]
アフィニティ同時電気泳動法を用いて本発明の基質に結合しているプロテオグリカンを分析する。 Analyzing the proteoglycan binding to a substrate of the present invention using affinity simultaneous electrophoresis. ウシおよびラット(あるいはその他の供給源)から単離した35 SO 35 SO 4 from bovine and rat (or other sources) were isolated 標識化またはヨウ素化したプロテオグリカン(アグリカン)が各種の複合基質またはコラーゲン支持骨格のみを含有しているACEゲル(リー,M.K.(Lee M. K.)他,1991年,88巻,2768頁乃至2772頁)中に投入される。 ACE gels (Lee labeled or iodinated proteoglycan (aggrecan) contain only various composite matrix or collagen scaffold, M.K. (Lee M. K.) Other, 1991, Volume 88, 2768 page to page 2772) are charged into. このコラーゲン支持骨格に対するヒアルロン酸または硫酸デキストランを加えた場合または除いた場合の上記アグリカンの結合親和力はその複合基質における一定の軟骨基質を組織化する能力として考えられる。 The aggrecan binding affinity when this was the case or except adding hyaluronic acid or dextran sulfate to collagen scaffold is considered as the ability to organize certain cartilage matrix in the composite substrate.
【0058】 [0058]
鉱物質化したコラーゲンを基材とする複合基質に対する一定のタンパク質の相互作用の評価は大過剰のコラーゲン・タンパク質により潜在的に妨げられる可能性がある。 Evaluation of the interaction of certain proteins mineralized collagen for the composite substrate that the substrate can potentially be hindered by the large excess of collagen protein. このような鉱物質化したコラーゲンの支持骨格は十分な固有の構造的完全性を有しており、その完全な可溶化を妨げる程度に架橋されているが、一部のコラーゲン・タンパク質は上記SDS−PAGEサンプル緩衝液中に可溶化する可能性がある。 Scaffold such mineralized collagen has sufficient inherent structural integrity, but its full are crosslinked to an extent that prevents the solubilization, a part of the collagen protein the SDS it may be solubilized in -PAGE sample buffer. 従って、このことは、別の結合しているタンパク質、特に細胞合成された各種のコラーゲンの可視化を不明瞭にする可能性があり、ウエスタン・ブロット分析において多量のバックグラウンドを生じると考えられる。 Thus, this could obscure the visualization of other bound to that protein, various collagens that are in particular the cell synthesis is believed to result in large amounts of background in Western blot analysis. それゆえ、別の手法はこの結合性の分析において放射性標識化またはビオチニル化したタンパク質を使用する方法である。 Therefore, another approach is a method using a radiolabeled or biotinylated proteins in the analysis of this binding. 各種の血清タンパク質は上記の各複合基質を伴う培養の前にビオチニル化した後にアビジン基材の各種試薬により現像できる。 Various serum proteins can be developed by various reagents avidin substrate after biotinylated prior to incubation with the composite substrate described above. これら両方の手法は上記支持骨格におけるコラーゲン・タンパク質の影響を伴わずに各種の基質に結合した成分の可視化を可能にする。 Both of these approaches allows visualization of components bound to various substrates without the effects of collagen protein in the scaffold.
【0059】 [0059]
あるいは、I型からII型へのコラーゲンの発現における変化およびII型コラーゲンにおけるIIAからIIBのイソ型の転写のスプライシング(サンデル,L.J.(Sandell, L. J.)他,1991年, ジャーナル・セル・バイオロジーJ. Alternatively, splicing (Sandel transfer from IIA isoform of IIB in the change and type II collagen in the expression of collagen type II from type I, L.J. (Sandell, L. J. ) , 1991; Journal cell Biology (J. Cell Cell Biol. Biol. ),114巻,1307頁乃至1319頁)が一定の軟骨形成性の経路に到る分化を決定するために当該技術分野における熟練者において知られている各種の手段により測定される。 ), 114, pp. 1307 pages to 1319 pages) is measured by a variety of means known to those skilled in the art to determine the leading differentiation in the path of certain chondrogenic. さらに、軟骨に結合したプロテオグリカン、アグリカン(シュミット,T.M.(Schmid, T. M.)他,1985年, ジャーナル・セル・バイオロジーJ. In addition, proteoglycans bound to the cartilage, aggrecan (Schmidt, T.M. (Schmid, T. M. ) Other, 1985, journal Cell Biology (J. Cell Cell Biol. Biol. ),100巻,598頁乃至605頁およびクエットナー,K. ), 100, pp. 598 pages to 605 pages and Kuettona, K. E. E. (Kuettner K. E.),1992年, クリニカル・バイオケミストリーClin. (Kuettner K. E.), 1992 years, Clinical Biochemistry (Clin. Biochem. Biochem. ),25巻,155頁乃至163頁)および一定の軟骨ホメオタンパク質(homeoprotein)転写因子(カート−1(Cart−1))の発現は軟骨細胞の直系に与えられる各種の細胞に対応する標識と考えられる。 ), Vol. 25, expression of the 155 pages to 163 pages) and certain cartilage homeoprotein (Homeoprotein) transcription factor (Cart -1 (Cart-1)) is the label corresponding to the various cells applied to the direct line of chondrocytes Conceivable.
【0060】 [0060]
生体内の試験において、上記基質は生後6週間のオスのスプラグ−ドーリー種のラットにおける頭頂骨内に形成した5mm×3mmの欠損部分の中への移植による一定のラット頭蓋欠損モデルにおける骨の治癒を支援する能力について評価される。 In the in vivo testing, the above-mentioned substrate is a 6-week old male Sprague - bone healing in certain rat cranial defect model by implantation into the defect portion of 5 mm × 3 mm was formed in the parietal bone in Dawley rats They are evaluated for their ability to help. これらの欠損部分はラジオグラフおよび組織学的な分析により28日目において評価されている。 These defect portion has been evaluated in 28 days by radiographic and histologic analysis.
【0061】 [0061]
軟骨修復における生体内モデルはラビットにおける一定の全層関節軟骨欠損部分である(アミエル(Amiel)他,1985年, ジャーナル・ボーン・ジョイント・サージェリーJ. Vivo model in cartilage repair is a constant total thickness articular cartilage defect portion in rabbit (Amiel (Amiel) Other, 1985, Journal Bone Joint Surgery (J. Bone Bone Joint Joint Surg. Surg. ),67A巻,911頁)。 ), 67A winding, 911 pages). 約3.7mmの直径および5mmの深さの寸法の各欠損部分が成育したオスのニュージーランド(New Zeeland)種のホワイト・ラビットにおける内側大腿顆の中心部分に形成される。 About the lost portion of the diameter and 5mm depth dimension of 3.7mm is formed on the central portion of the medial femoral condyle in New Zealand (New Zeeland) species White Rabbit males were grown. その後、これらの欠損部分は基質により充填されるか、対照として未充填状態のまま放置される。 Thereafter, these defect portion is either filled with substrate, it is left unfilled state as controls. さらに、これらの欠損部分は6週間目および12週間目において形態学的におよび組織学的に評価される。 Additionally, these defect portion is evaluated morphologically and histologically at 6 weeks and 12 weeks.
【0062】 [0062]
本発明の基質は、脊椎固定等の外科的切除、外傷、感染、ガンまたは遺伝的な欠損に伴う骨および/または軟骨の欠損部分の治療において使用できる。 Substrate of the present invention can be used surgical removal of spinal fusion such as, trauma, infections, in the treatment of the fracture portion of the bone and / or cartilage associated with cancer or genetic defects. 本発明による基質はその基質の目的とされる用途、その基質の物理的特性およびその基質における鉱物質化したコラーゲンの多糖類に対する重量比率に応じて移植、直接的な供給または注入により供給することができる。 Substrates according to the invention is to supply application is intended for its substrate, implanted according to the weight ratio of polysaccharide collagen mineralized in the physical properties and its substrate in the substrate, by direct supply or injection can.
【0063】 [0063]
本発明の一例の態様において、上記基質はその多糖類に対して比較的に高い一定の割合の鉱物質化したコラーゲンを含有して供給され、一定のスポンジ様の形態であり、脊椎固定における場合のような、新しい骨組織の増殖が望まれる部位において外科的に移植される。 In embodiments an example of the present invention, the substrate is fed contains the polysaccharide collagen mineralized relatively high constant rate with respect to a a sponge-like morphology, if the spinal fusion such as, growth of new bone tissue is surgically implanted at the site to be desired. 一例の態様において、上記基質はさらにBMP−2等の一定の増殖因子を含有している。 In one aspect, the substrate further contains a certain growth factors such as BMP-2. また、一例の態様において、上記基質はこの基質を所望の部位に固定することを容易にするためのフィブリンを含有している。 Further, in one aspect, the substrate contains a fibrin order to facilitate fixing the substrate to the desired site. また、本発明の一例の態様において、上記開始用のポリアルデヒド型の多糖類および鉱物質化したコラーゲンは任意の所望の各種の増殖因子と共に所望の組織増殖部位に別々に注入される。 Further, in one example embodiment of the present invention, collagen polysaccharide and mineralized polyaldehyde type for the start it is injected separately into the desired tissue growth site with growth factors for any desired variety. これらの材料はその所望の部位において上記基質を形成するためにその原位置でそれぞれ反応する。 These materials react each in its original position in order to form the substrate in the desired site.
【0064】 [0064]
本発明の別の態様において、上記基質はその鉱物質化したコラーゲンに対して比較的に高い割合の多糖類を含有しており、一定の粘性のゲルとして形成され、骨の欠損部の充填、骨折修復および歯周欠損部への移植等のような、新しい骨組織の増殖が望まれる一定の部位内に直接的に供給または注入される。 In another aspect of the present invention, the substrate is contained polysaccharide relatively high percentage of the collagen that mineralized, formed as a constant viscous gel, filling defects of bone, fracture repair and as a transplantation or the like into periodontal defect, the growth of new bone tissue is directly supplied or injected into certain sites desired. 本発明のさらに別の態様において、上記基質は一定の比較的に高い割合の多糖類を含有して供給され、一定の粘性ゲルとして形成されて、変性性関節症または慢性関節リウマチ等における、外傷を誘発した軟骨損傷部分または病気を誘発した軟骨損傷部分等のような、軟骨組織の増殖が望まれる一定の部位内に直接的に注入されるか一定の関節鏡処置を介して配給される。 In yet another aspect of the present invention, in the above-mentioned substrate is supplied contain certain relatively high proportion polysaccharides, is formed as a constant viscous gels, degenerative joint disease or rheumatoid arthritis, etc., trauma such as cartilage damaged portion or the like to induce cartilage damaged portions or disease induced, it is delivered via constant arthroscopic procedure or growth of cartilage tissue is directly injected into the fixed portion that is desired.
【0065】 [0065]
当該技術分野における熟練者により理解されるように、骨または軟骨の組織の増殖または増殖を行なうために供給される上記基質の量は処理される骨または軟骨の欠損部分の程度に応じて決まる。 As will be understood by those skilled in the art, the amount of the substrate to be supplied in order to perform the growth or proliferation of tissue bone or cartilage is determined according to the degree of the fracture portion of the bone or cartilage to be processed. さらに、当該技術分野における熟練者により理解されるように、費用、安全性、および所望の増殖因子の放出プロファイルがその基質に投入される増殖因子の種類および量を決める。 Furthermore, as will be appreciated by those skilled in the art, the cost, safety, and determine the type and amount of growth factor release profile of the desired growth factor is introduced into the substrate.
【0066】 [0066]
以下の各種の実施例は例示を目的として示されており、本発明を何ら限定することを目的としていない。 Examples of following various are shown for purposes of illustration and are not intended to limit the invention in any way.
【0067】 [0067]
実施例1 Example 1
移植可能なアミン結合した鉱物質化コラーゲンおよび多糖類原料である鉱物質化したI型コラーゲンおよび多糖類型ポリアルデヒドを米国特許第5,231,169号および同第5,866,165号において開示されている方法によりそれぞれ調製した。 Disclosed in implantable amine bound type I collagen and polysaccharide type polyaldehyde U.S. Patent No. 5,231,169 and the No. 5,866,165 and mineralized a mineralized collagen and polysaccharides raw materials It was prepared by methods have. 鉱物質化したセムドF型コラーゲン(semed F collagen)(63mg/ml)を一定の強力混合器の容器内に同一の容量比率で一定のヒアルロネート−ポリアルデヒド溶液(7mg/ml、5%の反復単位が酸化されている、pH7.5乃至pH9.0)と共に混合した。 Mineralized the Semudo F collagen (semed F collagen) (63mg / ml) to a constant in the same volume ratio in the container of a certain powerful mixer hyaluronate - polyaldehyde solution (7mg / ml, 5% of the repeat units are oxidized, were mixed with pH7.5 to pH 9.0). この混合物にシアノ水素化ホウ素ナトリウム(NaCNBH Sodium cyanoborohydride to the mixture (NaCNBH 3 ,5.0M、1.0MNaOH中)を加えて最終的な濃度を10mMにした。 , 5.0 M, final concentration added in 1.0MNaOH) was 10 mM. その後、この混合物を10秒間にわたり低速で3回混合した。 Then mixed 3 times at low speed This mixture for 10 seconds. この反応は一定の締り嵌め式のポリプロピレン・スクリュー・キャップと共に組み込まれている一定の厚肉型のボトルの中にこのスラリーを注ぎ入れることにより継続し続けた。 The reaction continued to continue by pouring the slurry into a constant thickness of the wall-type bottle which is incorporated with constant interference fit type polypropylene screw cap. このボトルを24時間にわたり暗所中において周囲温度で100回転/分の速度で回転した。 The bottle was rotated at 100 rev / min at ambient temperature in a dark for 24 hours. その後、このスラリーを一定の金型の中に注ぎ入れて凍結乾燥した。 Then lyophilized poured the slurry into a certain mold. このようにして一定の基質が形成され、この基質を脱イオン水により洗浄してNaCNBH Thus certain substrates it is formed, NaCNBH 3 The substrate was washed with deionized water を除去して、再び凍結乾燥した。 It was removed and freeze-dried again. この手順を繰り返して別の各種の酸化した多糖類と共にmCOLにより一連の基質を作成した。 We created a series of substrates by mCOL with another variety oxidized polysaccharide repeat this procedure. さらに、これら基質の表面特性、構造および生物学的活性をmCOLの各種多糖類に対する比率、多糖類の種類、多糖類において生じたアルデヒド基の密度、基質の密度、ならびに、凍結乾燥の処理を変更することにより調整した。 Furthermore, changing the surface properties of these substrates, structure and biological activity ratio for various polysaccharides MCOL, polysaccharide type, the density of the aldehyde groups generated in the polysaccharide, the density of the substrate, as well as, the process of freeze-drying It was adjusted by.
【0068】 [0068]
実施例2 Example 2
移植可能なイミン結合した鉱物質化コラーゲンおよび多糖類上記NaCNBH Mineralized collagen was implantable imine bond and polysaccharides described above NaCNBH 3 を使用しないことを除いて、各基質を上記実施例1において説明されている手順により調製した。 Except not to use, each substrate was prepared by procedures described above in Example 1.
【0069】 [0069]
実施例3 Example 3
フィブリンを伴う注入可能なゲル基質これらのゲル基質をフィブリンジェット(FibrinJet)(商標)外科用密封材配給システムにより調製した。 The injectable gel matrix these gel matrix with fibrin was prepared by fibrin jet (FibrinJet) (TM) surgical sealant delivery system. 一般的な手順の詳細が以下において説明されている。 More general procedures have been described below.
【0070】 [0070]
約100μmの直径のmCOL線維およびフィブリノゲン(mCOL,42mg/ml、フィブリノゲン,21mg/ml、pH7.5)を単一の注射器の中に投入し、トロンビン(1単位乃至5単位/ml(U/ml))を含有している同一容量の活性化ヒアルロネート溶液(7mg/ml、pH7.5)を別の注射器の中に入れた。 MCOL fibers and fibrinogen diameter of about 100μm (mCOL, 42mg / ml, fibrinogen, 21 mg / ml, pH 7.5) was charged in a single syringe, thrombin (1 unit to 5 units / ml (U / ml activation hyaluronate solution (7 mg / ml of the same volume containing a)), pH 7.5) was placed into another syringe. これらの両方の注射器を一定の18Gニードルを連結したフィブリンジェット(FibrinJet)(商標)外科用密封材配給システムに取り付けた。 Attached to both of these syringes certain 18G fibrin jet (FibrinJet) coupled needle (TM) surgical sealant delivery system. これら2種類の組成部分をそれぞれの注射器を通して同時に流し出すことにより、上記針(ニードル)の流出部分において3分以内にゲル基質が形成した。 These by pouring off simultaneously two compositions portions through the respective syringes, the gel matrix is ​​formed within 3 minutes in the outflow portion of the needle (needle).
【0071】 [0071]
上記の手順を繰り返して、mCOL、フィブリノゲン、および別の各種の酸化した多糖類により一連の注入可能なゲル基質を作成した。 Repeat the above procedure was prepared MCOL, fibrinogen, and a series of injectable gel matrix by another various oxidized polysaccharide. さらに、これらゲル基質の表面特性、多孔質構造および生物学的活性をmCOLおよび各種多糖類のフィブリノゲンに対する比率、多糖類の種類、アルデヒド基の密度、最終的な基質の密度およびトロンビンの濃度を変更することにより調整した。 Furthermore, changing the surface properties of these gel matrix, porous structure and biological activity ratio mCOL and various polysaccharides fibrinogen, polysaccharides type, the density of aldehyde group, the concentration of density and thrombin Final substrate It was adjusted by. また、ゲル化時間およびゲル硬度を加えるトロンビンの量により調整した。 Was also adjusted by the amount of thrombin added gelling time and gel hardness.
【0072】 [0072]
実施例4 Example 4
血漿を伴う注入可能なゲル基質上記フィブリノゲンの代わりに血漿を用いたことを除いて、各ゲル基質を実施例3において説明されている方法により調製した。 Except using plasma instead of injectable gel matrix the fibrinogen with Plasma was prepared by the method described each gel matrix in Example 3. 血漿を15分間にわたり3,000rpmで遠心処理した全血にシトレート(クエン酸塩、10重量%)を加えて調製した。 Plasma whole blood centrifuged at 3,000rpm for over 15 minutes citrate (citrate, 10 wt%) was prepared by adding.
【0073】 [0073]
実施例5 Example 5
血漿を伴う注入可能なゲル基質上記トロンビンの代わりに50mMの塩化カルシウム溶液を用いたことを除いて、各ゲル基質を実施例4において説明されている方法により調製した。 50mM calcium chloride solution in place of the injectable gel matrix the thrombin with plasma except for using the compound prepared by the method described each gel matrix in Example 4.
【0074】 [0074]
実施例6 Example 6
全血を伴う注入可能なゲル基質上記血漿の代わりに全血を用いたことを除いて、各基質ゲルを実施例3において説明されている方法により調製した。 But using whole blood instead of injectable gel matrix above plasma with whole blood were prepared by the method described each substrate gel in Example 3.
【0075】 [0075]
実施例7 Example 7
各種増殖因子を伴う移植可能な基質各種の増殖因子を各種の基質に投入する一般的な手順が以下のように説明されている。 The general procedure for introducing growth factors implantable substrate variety with various growth factors to various substrates are described as follows.
【0076】 [0076]
上記の実施例1および実施例2において調製した各基質と同様にmCOLおよび活性な各種多糖類により調製した各基質を用いた。 With each substrate prepared by the substrate as well as mCOL and active various polysaccharides prepared in Examples 1 and 2 above. 乾燥処理前の各基質を5mm×4mm×2mmの寸法を有する立方体に切断した。 Each substrate before drying treatment was cut into cubes having dimensions of 5mm × 4mm × 2mm. 各立方体における水分の取り込みを測定し、各切断片当たりに85±5μlであることが分かった。 Measuring the moisture uptake in each cube was found to be 85 ± 5 [mu] l per each cut piece. さらに、増殖分化因子−5(GDF−5,0.588mg/ml、20mM酢酸中)を各基質試料に各切断片当たりに85μlで滴下により加えた。 Furthermore, growth differentiation factor -5 (GDF-5,0.588mg / ml, 20mM acetic acid) was added dropwise at 85μl per each cut piece to each substrate sample. このGDF−5を投入した各基質試料を5分間にわたりフード中において周囲温度で自然放置した後に、−78℃において凍結し、凍結乾燥した。 The GDF-5 with each substrate sample was charged after natural left at ambient temperature in a hood for 5 minutes, then frozen at -78 ° C., and lyophilized.
【0077】 [0077]
上記の手順を繰り返して、別の各種の酸化した多糖類を伴うmCOLにより作成した各基質に、各種の骨形態発生タンパク質、トランスフェリン増殖因子−β、およびインスリン様増殖因子等のような、種々の濃度の一連の増殖因子を投入した。 Repeat the above steps, each substrate was prepared by mCOL with another variety polysaccharides oxidation of various bone morphogenetic proteins, transferrin growth factors-beta, and the like insulin-like growth factor, various He was charged with a series of growth factors of concentration.
【0078】 [0078]
さらに、上記の手順を繰り返して、別の各種の酸化した多糖類を伴うmCOLにより作成した各基質に、DNA、各種のホルモン、およびサイトカインを投入した。 Further, by repeating the above procedure, each substrate was prepared by mCOL with another variety polysaccharides oxidized, was charged DNA, various hormones, and cytokines.
【0079】 [0079]
実施例8 Example 8
各種増殖因子を伴う移植可能なゲル基質各種の増殖因子を注入可能な各種のゲル基質に投入する一般的な手順が以下のように説明されている。 The general procedure for introducing growth factors implantable gel matrix variety with various growth factors injectable various gel matrix is ​​described as follows.
【0080】 [0080]
mCOL線維(D.I.<100μm,42mg/ml)、フィブリノゲン(21mg/ml)、およびGDF−5(100μg/ml)を単一の注射器の中に投入し、トロンビン(1単位乃至5単位/ml(U/ml))を含有している同一容量の活性化ヒアルロネート溶液(7mg/ml)を別の注射器の中に入れた。 mCOL fibers (D.I. <100μm, 42mg / ml), fibrinogen (21 mg / ml), and GDF-5 to (100 [mu] g / ml) was charged in a single syringe, thrombin (1 unit to 5 units / was charged ml (U / ml)) activation hyaluronate solution of the same volume containing the a (7 mg / ml) in another syringe. これらの両方の注射器を一定の18Gニードルを連結したフィブリンジェット(FibrinJet)(商標)外科用密封材配給システムに取り付けた。 Attached to both of these syringes certain 18G fibrin jet (FibrinJet) coupled needle (TM) surgical sealant delivery system. これら2種類の組成部分をそれぞれの注射器を通して同時に流し出すことにより、上記針の流出部分において3分以内にGDF−5を含有しているゲル基質が形成した。 These by pouring off simultaneously two compositions portions through the respective syringe, gel matrix containing the GDF-5 within 3 minutes in the outflow portion of the needle is formed.
【0081】 [0081]
上記の手順を繰り返して、さらに別の増殖因子、ホルモン、およびサイトカインを含有している一連の注入可能なゲル基質を作成した。 Repeat the above procedure was prepared yet another growth factors, hormones, and a series of injectable gel matrix containing a cytokine.
【0082】 [0082]
実施例9 Example 9
各基質からのGDF−5の比較持続放出性トレーサーとして放射性標識化したGDF−5を用いて、50μg/試験片の比率で予め投入したGDF−5を含む移植可能なmCOL/HAの各基質(5×4×2mm)を上記実施例7において説明されているように調製した。 Each substrate with GDF-5 was radiolabeled as compared sustained release tracers GDF-5 from, 50 [mu] g / each substrate implantable mCOL / HA containing GDF-5 which was previously charged at a ratio of the specimen ( the 5 × 4 × 2mm) were prepared as described in example 7 above. さらに、グルタルアルデヒドにより交差架橋したmCOLおよびヒアルロネート型ポリアルデヒドにより交差架橋したCOL(COL/HA)にも上記GDF−5を同一比率で投入して、これらを対照として用いた。 Further, by introducing the GDF-5 in COL (COL / HA) intersecting crosslinked mCOL and hyaluronate type polyaldehyde crossed crosslinked by glutaraldehyde in the same proportions, with these as a control. これらの基質からのGDF−5の放出速度を調べた。 We examined the rate of release of the GDF-5 from these substrates. 各種類の基質の合計5個の試験片の内の1個の試験片を30mMの酢酸により調整したpH4.0の5.0mlのPBSを入れた2.0mlのポリプロピレン・チューブの中に入れた。 The one test strip of the total of five specimens of each type of substrate was placed in a polypropylene tube 2.0ml containing the PBS of 5.0ml of pH4.0 adjusted with 30mM acetic acid . これらのチューブを37℃において穏やかに振盪した。 The tubes were gently shaken at 37 ° C.. この媒質を一定の指定された時間に新しく取り替えて、それぞれの取り替えた培地における放射能をシンチレーション・カウンターにより検出した。 The medium with newly replaced certain specified time, the radioactivity in each of the replacement medium is detected by scintillation counter. 図において示されているように、mCOL/HAおよびグルタルアルデヒド結合した各基質の両方からのGDF−5の放出はCOL/HAの基質からの放出よりも長い持続時間を示した。 As shown in the figure, the release of GDF-5 from both the substrate bound mCOL / HA and glutaraldehyde showed a longer duration than release from the substrate COL / HA. これらのmCOL/HAおよびグルタルアルデヒド結合した各基質は90%のmCOLを含有しているが、COL/HAの基質は同量の非鉱物質化COLを含有しているので、これらの結果はGDF−5がCOLに対する結合よりもさらに効果的にmCOL線維に対して結合していたことを示している。 These mCOL / HA and each substrate was glutaraldehyde binding contains 90% of MCOL, since substrate COL / HA has contain non mineralized COL same amount, these results GDF -5 indicating that had bound to more effectively mCOL fibers than binding to COL. 従って、mCOL/HAの基質はGDF−5の持続的配給においてCOL/HAの基質よりも優れていると考えられる。 Thus, substrates for mCOL / HA is believed to be superior to substrates COL / HA in sustained delivery of GDF-5.
【0083】 [0083]
さらに、上記の手順を繰り返して、mCOL/HAの各基質から放出される一連の増殖因子、ホルモン、およびサイトカインの速度を決定した。 Further, by repeating the above procedure was determined set of growth factors released from the substrate mCOL / HA, hormones, and the speed of the cytokine.
【0084】 [0084]
実施例10 Example 10
移植可能な各基質の骨伝導性9部のmCOLおよび1部のHAポリアルデヒド(5%の反復単位が酸化されている)を含む各基質を実施例2において説明されているように調製した。 mCOL and 1 part of HA polyaldehyde osteoconductive 9 parts of implantable each substrate (5% of the repeat units are oxidized) was prepared as described in Example 2 each substrate comprising a. 5mm×3mm×2mmの寸法を有する各基質の試料をエタノールにより滅菌処理して生後6週間のスプラグ−ドーリー(Sprague−Dawley)種のオスのラットにおける頭頂骨内に形成した各欠損部分に移植した。 5 mm × 3 mm × 2 mm of the first six and samples sterilized with ethanol for each substrate having dimensions weeks Sprague - were transplanted into each fracture portion formed in the parietal bone in Dawley (Sprague-Dawley) species male rats . これらの欠損部分をラジオグラフおよび組織学的分析により28日目において評価し、これらの結果を表1にまとめた。 These missing portions was evaluated in 28 day by radiographic and histological analysis, it summarizes these results in Table 1. 基質の移植を伴わない欠損部分はラジオグラフにおけるわずかな減少(20±2%)のみを示し、グルタルアルデヒド交差架橋したmCOLにより充填した欠損部分は比較的に高い減少(55±3%)を示し、mCOL/HAにより充填した欠損部分はラジオグラフにおけるさらなる増加(88±3%)を示し、この値はCOL/HAの基質により充填した値(93±4%)と類似していた。 Defect portion without transplantation substrate shows only a slight decrease in the radiograph (20 ± 2%), the deficient part filled by glutaraldehyde cross-crosslinked mCOL represents a relatively high reduction (55 ± 3%) , the deficient part filled by mCOL / HA showed a further increase in radiographs (88 ± 3%), this value was similar to the value obtained by filling a substrate of COL / HA (93 ± 4%). また、組織学的評価はこれらのラジオグラフによる結果に相関していた。 Moreover, histological evaluation was correlated to the results from these radiographs. すなわち、mCOL/HAまたはCOL/HAのいずれかにより充填した欠損部分はmCOLにより充填した値よりも高い骨の形成の評価点を示した(表1)。 That is, the deficient part filled by either mCOL / HA or COL / HA showed scores of bone formation higher than the value that is filled with MCOL (Table 1). これらmCOL/HAおよびCOL/HAの両方の基質は10%のHAを含有しているので、100%のmCOLにより調製したmCOLとは異なっており、これらの結果はコラーゲン基材の各基質に対する10%のHAの導入がそれぞれの骨伝導性を高めたことを示している。 Since substrates of both of these mCOL / HA and COL / HA is containing 10% of HA, 10 is different from MCOL and prepared by 100% MCOL, these results for each substrate collagen-based material % introduction of HA have shown that increased their osteoconductive.
【表1】 [Table 1]
【0085】 [0085]
実施例11 Example 11
細胞の生体外増殖および骨表現型の発現この実施例はmCOL/HA基質が胎児ラットの頭蓋冠細胞(FRCs)の増殖を支援して生体外における骨表現型の発現を示すことを示している。 Ex vivo expansion and this example expression of the bone phenotype of the cell indicates that indicates expression of bone phenotype in growth to support the in vitro mCOL / HA substrate fetal rat calvaria cells (FRCS) . 上記FRCsを生後19日の胎児により調製して増殖し、90%mCOLおよび10%HA(5%の反復単位が酸化されている)を含有する実施例2において説明されている方法により作成した基質の中に接種して、4週間にわたり標準的な諸条件下において培養した。 The FRCs proliferate prepared by fetal 19 days after birth, it was prepared by the method 90% mCOL and 10% HA (5% of the repeat units are oxidized) are described in Example 2 containing a substrate and inoculated into, they were cultured in standard various conditions over a period of 4 weeks. その後、各培養物を細胞増殖およびアルカリ・ホスファターゼ活性(ALP)について評価した。 Thereafter, each culture was assessed for cell proliferation and alkaline phosphatase activity (ALP). これらの結果は上記基質に接種したRFCsが継続的に増殖して、その細胞数が1日目に比べて28日目において9倍に増加したことを示した。 These results are RFCs inoculation into the substrate is continuously grown, it showed that the cell number was increased 9-fold at 28 days compared to day 1. さらに、骨の形成についての一定の標識である、ALPの発現もまた経時的に増加して21日目において最高値に到達し、接種したFPCの分化を誘導するためのmCOL/HAの骨形成における有用性を示している。 Furthermore, a certain labels for bone formation, expression of ALP also reached a maximum at day 21 increased over time, bone formation mCOL / HA for inducing differentiation of inoculated FPC show utility in.
【図面の簡単な説明】 BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS
【図1】 [Figure 1]
実施例9において記載されている3種類の基質からのGDF−5の比較的な放出速度のグラフである。 Is a graph of comparative release rate of the GDF-5 from three substrates described in Example 9.

Claims (29)

  1. 組織の修復を支援するための一定の基質を調製する方法において、一定の外因性の多糖類を酸化してアルデヒド基を有する一定の修飾した外因性の多糖類を形成する工程、および前記修飾した外因性の多糖類を諸条件下において鉱物質化したコラーゲンと反応させて、前記アルデヒド基が鉱物質化したコラーゲンと架橋するように反応して前記基質を形成する工程を含む方法。 A method for preparing a constant matrix for supporting tissue repair, forming a certain modified exogenous polysaccharide having oxidized to an aldehyde group with certain exogenous polysaccharide, and was the modified polysaccharides exogenous reacted with mineralized collagen in various conditions, wherein said aldehyde group comprises a step that react to form said substrate so as to bridge the collagen mineralized.
  2. さらに、前記基質に一定の増殖因子を添加する工程を含む請求項1に記載の方法。 Furthermore, the method of claim 1 including the step of adding a certain growth factors to the substrate.
  3. 前記増殖因子がTGF−βの超系統群における各要素、BMP系統群における各要素、各種の増殖分化因子(GDF's)、ADMP−1、線維芽増殖因子系統群の各要素、各種タンパク質のヘッジホッグ系統群の各要素、インスリン様増殖因子(IGF)系統群の各要素、血小板由来増殖因子(PDGF)系統群の各要素、インターロイキン(IL)系統群の各要素、コロニー刺激因子(CSF)系統群の各要素から成る群から選択される請求項2に記載の方法。 Each element wherein the growth factor is in the super family of TGF-beta, each element in the BMP family, growth differentiation factor for various (GDF's), ADMP-1, each element of the fibroblast growth factor family, the various proteins each element of the hedgehog family, each element of the insulin-like growth factor (IGF) family, each element of the platelet-derived growth factor (PDGF) family, interleukin (IL) each element of family, colony-stimulating factor (CSF ) the method of claim 2 which is selected from the group consisting of the elements of the family.
  4. 前記増殖因子が一定の骨形態発生タンパク質(BMP)である請求項3に記載の方法。 The method of claim 3 wherein the growth factor is a bone morphogenetic protein (BMP).
  5. 前記多糖類がヒアルロン酸、硫酸コンドロイチン、硫酸デルマタン、硫酸ケラタン、ヘパラン、硫酸ヘパラン、デキストラン、硫酸デキストラン、またはアルギネートを含む請求項1に記載の方法。 Wherein the polysaccharide is hyaluronic acid, chondroitin sulfate, dermatan sulfate, keratan sulfate, heparan, The method of claim 1, including heparan sulfate, dextran, dextran sulfate, or alginate.
  6. 前記多糖類がヒアルロン酸を含む請求項5に記載の方法。 The method of claim 5 wherein the polysaccharide comprises hyaluronic acid.
  7. 前記コラーゲンがI型およびII型のコラーゲンから成る群から選択される請求項1に記載の方法。 The method of claim 1, wherein the collagen is selected from the group consisting of type I and type II collagen.
  8. 前記多糖類を酸化する工程が前記多糖類の過ヨウ素酸塩による処理を含む請求項1に記載の方法。 The method of claim 1 step of oxidizing said polysaccharide comprises treatment with periodate of the polysaccharide.
  9. 前記基質を形成するために使用する前記鉱物質化したコラーゲンおよび前記多糖類がそれぞれ99:1乃至1:99の重量比率の範囲内で存在している請求項1に記載の方法。 The mineralized collagen and said polysaccharide is respectively 99 used to form the substrate: The method of claim 1 which is present within the range of weight ratio of 1 to one ninety-nine.
  10. 前記範囲がそれぞれ9:1乃至1:9の重量比率である請求項9に記載の方法。 The range respectively 9: 1 to 1: 9 The method of claim 9 wherein the weight ratio of.
  11. アルデヒド基を含むために前記多糖類における約1%乃至50%の反復単位が酸化される請求項1に記載の方法。 The method of claim 1, from about 1% to 50% of the repeat units in said polysaccharide are oxidized to contain aldehyde groups.
  12. アルデヒド基を含むために前記多糖類における約1%乃至5%の反復単位が酸化される請求項11に記載の方法。 The method of claim 11, from about 1% to 5% of the repeat units in said polysaccharide are oxidized to contain aldehyde groups.
  13. 前記基質が凍結および凍結乾燥により形成される請求項1に記載の方法。 The method of claim 1, wherein the substrate is formed by freezing and lyophilization.
  14. 前記基質が湿式堆積処理および空気乾燥処理により形成される請求項1に記載の方法。 The method of claim 1, wherein the substrate is formed by a wet deposition process and air drying.
  15. さらに、前記基質内においてフィブリンを形成するためにフィブリノゲンおよびトロンビンを添加する工程を含む請求項1に記載の方法。 Furthermore, the method of claim 1 including the step of adding the fibrinogen and thrombin to form fibrin in said matrix.
  16. 前記組織が骨、軟骨および軟質組織から成る群から選択される請求項1に記載の方法。 The method of claim 1, wherein the tissue is selected from the group consisting of bone, cartilage and soft tissue.
  17. 組織の修復を支援するための基質において、一定の外因性の多糖類に共役的に架橋している鉱物質化したコラーゲンを含有しており、前記多糖類が前記鉱物質化したコラーゲンに対する共役結合を形成する当該多糖類における酸化された糖の環状構造を介して前記コラーゲンに対して架橋している基質。 In a substrate for supporting the tissue repair, and contains a collagen mineralized are conjugated crosslinked to a certain exogenous polysaccharide, conjugated bond to collagen in which the polysaccharide has the mineralized substrate are crosslinked to said collagen through the ring structure of the oxidized sugar in the polysaccharide to form a.
  18. さらに、一定の増殖因子を含有する請求項17に記載の基質。 Furthermore, the substrate according to claim 17 which contains a certain growth factors.
  19. 前記増殖因子がTGF−βの超系統群における各要素、骨形態発生タンパク質系統群における各要素、各種の増殖分化因子(GDF's)、ADMP−1、線維芽増殖因子系統群の各要素、各種タンパク質のヘッジホッグ系統群の各要素、インスリン様増殖因子(IGF)系統群の各要素、血小板由来増殖因子(PDGF)系統群の各要素、インターロイキン(IL)系統群の各要素、コロニー刺激因子(CSF)系統群の各要素から成る群から選択される請求項18に記載の基質。 Wherein each element growth factor in the super family of TGF-beta, each element in the bone morphogenetic protein family, growth differentiation factor for various (GDF's), ADMP-1, each element of the fibroblast growth factor family, each element of the hedgehog family of various proteins, each element of the insulin-like growth factor (IGF) family, each element of the platelet-derived growth factor (PDGF) family, interleukin (IL) each element of family, colony stimulating factor (CSF) the substrate of claim 18 which is selected from the group consisting of the elements of the family.
  20. 前記増殖因子が一定の骨形態発生タンパク質である請求項18に記載の基質。 The substrate of claim 18 wherein the growth factor is a bone morphogenetic protein.
  21. 前記多糖類がヒアルロン酸、硫酸コンドロイチン、硫酸デルマタン、硫酸ケラタン、ヘパラン、硫酸ヘパラン、デキストラン、硫酸デキストラン、またはアルギネートを含む請求項17に記載の基質。 Wherein the polysaccharide is hyaluronic acid, chondroitin sulfate, dermatan sulfate, keratan sulfate, heparan The substrate of claim 17, including heparan sulfate, dextran, dextran sulfate, or alginate.
  22. 前記多糖類がヒアルロン酸である請求項21に記載の基質。 The substrate of claim 21 wherein the polysaccharide is hyaluronic acid.
  23. 前記基質が前記鉱物質化したコラーゲンおよび前記多糖類を99:1乃至1:99の範囲内の一定の重量比率で含有している請求項17に記載の基質。 Substrate according to 1 to claim 17 containing at a constant weight ratio in the range 1:99: said substrate is a mineralized collagen and said polysaccharide 99.
  24. 前記コラーゲンがI型およびII型のコラーゲンから成る群から選択される請求項17に記載の基質。 The substrate of claim 17, wherein the collagen is selected from the group consisting of type I and type II collagen.
  25. さらにフィブリンを含有している請求項17に記載の基質。 The substrate of claim 17, further containing fibrin.
  26. 生体内における骨または軟骨組織の増殖を行なう方法において、所望の骨または軟骨の増殖部位に請求項17に記載の一定の基質を投与する工程を含む方法。 A method of performing the growth of bone or cartilage tissue in vivo, comprising administering a constant substrate according to claim 17 for the growth site of the desired bone or cartilage.
  27. 生体内における骨または軟骨組織の増殖を誘発する方法において、所望の骨または軟骨の増殖部位に請求項18に記載の一定の基質を投与する工程を含む方法。 A method of inducing proliferation of bone or cartilage tissue in vivo, comprising administering a constant substrate according to claim 18 for the growth site of the desired bone or cartilage.
  28. 生体内における骨または軟骨組織の増殖を行なう方法において、所望の骨または軟骨の増殖部位に、当該骨または軟骨の増殖を支援するために前記部位に一定の基質を形成するために十分な各量において、 A method of performing the growth of bone or cartilage tissue in vivo, the growth sites desired bone or cartilage, the sufficient amount to form a certain substrate into the site to support the growth of the bone or cartilage in,
    (a)アルデヒド基を有するように修飾されている一定の外因性の多糖類、 (A) modified by being certain exogenous polysaccharide to have an aldehyde group,
    (b)鉱物質化したコラーゲン、および(c)随意的に、一定の増殖因子を投与する工程を含む方法。 (B) mineralized collagen, and (c) optionally, comprising the step of administering certain growth factors.
  29. 生体内における骨または軟骨組織の増殖を誘発する方法において、所望の骨または軟骨の増殖部位に、当該骨または軟骨の増殖を支援するために前記部位に一定の基質を形成するために十分な各量において、 A method of inducing proliferation of bone or cartilage tissue in vivo, the growth sites desired bone or cartilage, each sufficient to form a uniform substrate to the site to support the growth of the bone or cartilage in an amount,
    (a)アルデヒド基を有するように修飾されている一定の外因性の多糖類、 (A) modified by being certain exogenous polysaccharide to have an aldehyde group,
    (b)鉱物質化したコラーゲン、および(c)一定の増殖因子を投与する工程を含む方法。 (B) a method comprising the step of administering mineralized collagen, and (c) certain growth factors.
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