JP2004500042A - Compositions and methods for tumor-targeted delivery of effector molecules - Google Patents

Abstract

The present application discloses the generation and use of an attenuated tumor-targeted bacteria vector to deliver one or more primary effector molecules to the site of a solid tumor. The primary effector molecules of the invention are used in the methods of the invention to treat solid tumor cancers such as carcinomas, melanomas, lymphomas, sarcomas and the like. The present invention relates to the surprising finding that effector molecules, which can be toxic when administered systemically to a host, can be locally delivered to a tumor by an attenuated tumor target bacterium with reduced toxicity to the host. The present application also discloses the delivery of one or more optional effector molecules (referred to as secondary effector molecules) that can be delivered by the attenuated tumor target bacterium with the primary effector molecule.

Description

【０１１３】
別の具体的実施形態では、本発明の一次エフェクター分子は、抗血管新生因子もしくはその機能性断片である。抗血管新生因子の例として、限定するものではないが、エンドスタチン、アンギオスタチン、アポミグレン、抗血管新生抗トロンビンＩＩＩ、フィブロネクチンの２９ｋＤａ Ｎ末端および４０ｋＤａ Ｃ末端タンパク質分解断片、ｕＰＡ受容体アンタゴニスト、プロラクチンの１６ｋＤａタンパク質分解断片、血小板第４因子の７．８ ｋＤａタンパク質分解断片、１３．４０と称する抗血管新生因子、トロンボスポンジンＩの抗血管新生２２アミノ酸ペプチド断片、ＳＰＡＲＣの抗血管新生２０アミノ酸ペプチド断片、ＲＧＤおよびＮＧＲ含有ペプチド、ラミニン、フィブロネクチン、プロコラーゲンおよびＥＧＦの小さい抗血管新生ペプチド、ならびに、インテグリンα_ｖβ_３およびＶＥＧＦ受容体のペプチドアンタゴニストが挙げられる。
【０１１４】
本発明の好ましい実施形態では、本発明の一次エフェクター分子はエンドスタチンである。天然のエンドスタチンは、コラーゲンＸＶＩＩＩのＣ末端の約１８０アミノ酸からなる（コラーゲンＸＶＩＩＩの２つのスプライス形態をコードするｃＤＮＡは、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＦ１８０１およびＡＦ１８０８２を有する）。
【０１１５】
本発明の別の好ましい実施形態では、本発明の一次エフェクター分子は、プラスミノーゲン断片である（プラスミノーゲンのコード配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＭ−０００３０１およびＡ３３０９６）にみいだすことができる）。アンギオスタチンペプチドは、言うまでもなく、プラスミノーゲンの４つのクリングルドメイン、すなわち、クリングル１〜クリングル４を含む。組換えクリングル１，２および３は、天然ペプチドの抗血管新生特性を有するのに対し、クリングル４にはそのような活性がない（Ｃａｏら、１９９６， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７１：２９４６１−２９５６７）。従って、本発明のアンギオスタチンエフェクター分子は、クリングル１、クリングル２およびクリングル３からなる群より選択される少なくとも１つの、好ましくは、１つ以上のクリングルドメインを含む。具体的実施形態では、本発明の一次エフェクター分子は、４０ ｋＤａイソ型、４２ ｋＤａイソ型、４５ ｋＤａイソ型、またはこれらの組合せからなる群より選択されるヒトアンギオスタチン分子である。別の実施形態では、該一次エフェクター分子は、プラスミノーゲンのクリングル５ドメインであり、これは、アンギオスタチン（アンギオスタチンはクリングルドメイン１〜４からなる）より強力な血管新生阻害物質である。
【０１１６】
別の実施形態では、本発明の一次エフェクター分子は、アンチトロンビンＩＩＩである。アンチトロンビンＩＩＩは、以後アンチトロビンと呼び、これは、タンパク質を血管壁に連結するヘパリン結合ドメインと、トロンビンと相互作用する活性部位ループとを含む。アンチトロンビンをヘパリンと結合させると、タンパク質はコンホメーション変化を引き起こし、これによって、活性ループがトロンビンと相互作用し、その結果、トロンビンによる該ループのタンパク質分解切断が起こる。タンパク質分解切断事象により、アンチトロンビンのコンホメーションにさらに別の変化が起こり、これによって（ｉ）トロンビンとアンチトロンビンとの間の相互作用界面が改変され、（ｉｉ）ヘパリンから複合体が放出される（Ｃａｒｒｅｌｌ， １９９９， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８５：１８６１−１８６２、およびその中の参考文献）。Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙら（１９９９， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８５：１９２６−１９２８）は、切断されたアンチトロンビンが、強力な抗血管新生活性を有することをみいだした。従って、一実施形態では、本発明の抗血管新生因子は、抗血管新生形態のアンチトロンビンである。本発明の方法に従う固形腫瘍への上記タンパク質の送達のために、細菌ベクターを修飾し、全長アンチトロンビンＧｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＭ−０００４８８およびアンチトロンビンの切断を触媒するタンパク質分解酵素を発現させることにより、抗血管新生形態のタンパク質を生成する。タンパク質分解酵素は、トロンビン、膵エラスターゼ、およびヒト好中球エラスターゼからなる群より選択される。好ましい実施形態では、タンパク質分解酵素は膵エラスターゼである。機能性膵エラスターゼの組換え発現の方法は、Ｓｈｉｒａｓｕにより教示されている（Ｓｈｉｒａｓｕら、１９８７， Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １０２：１５５５−１５６３）。
【０１１７】
本発明の別の実施形態では、本発明の一次エフェクター分子は、フィブロネクチンの４０ ｋＤａおよび／または２９ ｋＤａタンパク質分解断片である。これら断片の発現ベクターは、フィブロネクチン前駆体タンパク質をコードする全長核酸配列（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号Ｘ０２７６１）、およびコードされたタンパク質の成熟化についての記載事項（ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）を用いた標準的方法により生成することができる。好ましい実施形態では、フィブロネクチンの４０ ｋＤａおよび／または２９ ｋＤａ断片は、例えば、ｐＴｒｃ９９Ａプラスミドへの挿入により、ｔｒｃプロモーターの制御下で細胞質タンパク質として発現させる。
【０１１８】
本発明の別の実施形態では、本発明の一次エフェクター分子は、ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）受容体のアンタゴニストである。実施形態の一態様では、該アンタゴニストは、ｕＰＡのドミナントネガティブ突然変異体である（例えば、Ｃｒｏｗｌｅｙら、１９９３， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０：５０２１−５０２５）。実施形態の別の態様では、アンタゴニストは、ペプチドアンタゴニストまたはその融合タンパク質である（Ｇｏｏｄｓｏｎら、１９９４， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１：７１２９−７１３３）。実施形態のさらに別の態様では、アンタゴニストは、ドミナントネガティブ可溶性ｕＰＡ受容体である（Ｍｉｎら、１９９６， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５６：２４２８−２４３３）。
【０１１９】
本発明の別の実施形態では、本発明の一次エフェクター分子は、約１２０のアミノ酸からなる、プロラクチンの１６ ｋＤａ Ｎ末端断片、またはその生物学的に活性な断片である（プロラクチンのコード配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＭ₋０００９４８にみいだすことができる）。具体的実施形態では、上記プロラクチン断片は、ジスルフィド結合によるタンパク質の不要な架橋を回避するため、Ｃｙｓ５８→Ｓｅｒ５８突然変異を有する。
【０１２０】
本発明の別の好ましい実施形態では、本発明の一次エフェクター分子は、７．８ ｋＤａ 血小板第４因子断片である。具体的実施形態では、７．８ ｋＤａ 血小板第４因子断片は、融合タンパク質として発現され、該融合タンパク質において、アミノ末端は、大腸菌βグルクロニダーゼの最初の３５アミノ酸からなる。別の実施形態では、血小板第４因子のヘパリン結合性リシンをグルタミン酸残基に突然変異させることにより、強力な抗血管新生活性を有する変異型タンパク質が得られる（Ｍａｉｏｎｅら、１９９１， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５１：２０７７−２０８３）。血小板第４因子のコード配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＭ−００２６１９である。
【０１２１】
本発明の別の好ましい実施形態では、本発明の一次エフェクター分子は、血小板第４因子の抗血管新生１３アミノ酸断片、１３．４０と称する抗血管新生因子、トロンボスポジンＩの抗血管新生２２アミノ酸ペプチド断片、ＳＰＡＲＣの抗血管新生２０アミノ酸ペプチド断片、ラミニン、フィブロネクチン、プロコラーゲンもしくはＥＧＦの小さい抗血管新生ペプチド、またはインテグリンα_ｖβ_３もしくはＶＥＧＦ受容体の小さいペプチドアンタゴニストに相当する小さなペプチドである。具体的実施形態では、小さいペプチドをタンデムに発現させることにより、タンパク質安定性が高まる。小さいペプチドの配列は、ＶＥＧＦ受容体アンタゴニスト（Ｓｏｋｅｒら、１９９３， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７２：３１５８２−３１５８８）を除いて、Ｃａｏ（１９９８， Ｐｒｏｇ． Ｍｏｌ． Ｓｕｂｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ２０：１６１−１７６）により提供されている。極めて好ましい実施形態では、小さいペプチドは、ＲＧＤまたはＮＧＲモチーフを含む。この実施形態の特定の様式では、ＲＧＤまたはＮＧＲモチーフを含むペプチドは、例えば、ＯｍｐＡの１つ以上の細胞外ループをコードする核酸と、読み枠を合わせて該ペプチドをコードする核酸を融合することにより、宿主細菌の細胞表面上に提示される。
【０１２２】
別の具体的実施形態では、本発明の一次エフェクター分子は、細胞傷害性ポリペプチドまたはペプチド、もしくはそれらの機能性断片である。細胞傷害性ポリペプチドまたはペプチドは、例えば、タンパク質合成の干渉または細胞周期の破壊を介して、細胞増殖を阻害することにより、細胞に対して毒性を有するか、または細胞分裂を抑制する。このような物質は、ｒＲＮＡまたはリボ核タンパク質を切断するか、伸長因子を阻害するか、ｍＲＮＡを切断することにより、あるいは、タンパク質合成を、細胞が生存できないようなレベルにまで低下させるその他の機構によって、作用すると考えられる。
【０１２３】
細胞傷害性ポリペプチドまたはペプチドの例として、限定するものではないが、下記のものが挙げられる：バクテリオシンファミリーのメンバー、ベロ毒素、細胞傷害性壊死因子１（ＣＮＦ１；例えば、大腸菌ＣＮＦ１およびＶｉｂｒｉｏ ｆｉｓｃｈｅｒｉ ＣＮＦ１）、細胞傷害性壊死因子２（ＣＮＦ２）、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｉｏｃｉｄａ毒素（ＰＭＴ）、溶血素、ファルネシルトランスフェラーゼの強力な競合阻害物質であるＣＡＡＸテトラペプチド、サポリン、リシン、アブリン、その他のリポソーム不活性化タンパク質（ＲＩＰ）、シュードモナス外毒素、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはタンパク質合成の阻害剤、アンチセンス核酸、その他の代謝阻害物質（例えば、ＤＮアーゼおよびリボヌクレアーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、ホスホリパーゼ等のＤＮＡまたはＲＮＡ切断分子）、プロドラッグ変換酵素（例えば、ＨＳＶ由来のチミジンキナーゼおよび細菌シトシンデアミナーゼ）、光活性化ポルフィリン、リシン、リシンＡ鎖、トウモロコシＲＩＰ、ゲロニン、細胞致死拡大（ｃｙｔｏｌｅｔｈａｌ ｄｉｓｔｅｎｄｉｎｇ）毒素、ジフテリア毒素、ジフテリア毒素Ａ鎖、トリコサンチン、トリチン、アメリカヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質（ＰＡＰ）、ミラビリス（ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）抗ウイルスタンパク質（ＭＡＰ）、ジアンチン３２および３０、アブリン、モノドリン、ブリオジン、志賀毒素（ｓｈｉｇａ）、キュウリの種子からのタンパク質生合成の触媒阻害物質（例えば、国際公開ＷＯ９３／２４６２０を参照）、シュードモナス外毒素、大腸菌熱不安定性毒素、大腸菌熱安定性毒素、ＥａｇｇＥＣ安定性毒素−１（ＥＡＳＴ）、細胞毒素の生物学的に活性の断片、ならびに、当業者には公知のその他の物質。大腸菌およびサルモネラの毒素については、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ａｎｄ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ， Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｎｅｉｄｈａｒｄｔら（編）におけるＯ’ＢｒｉａｎおよびＨｏｌｍｅｓによるＰｒｏｔｅｉｎ Ｔｏｘｉｎｓ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ａｎｄ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、ｐｐ．２７８８−２８０２， ＡＳＭ Ｐｒｅｓｓ， ワシントンＤ．Ｃ．を参照されたい。
【０１２４】
好ましい実施形態では、一次エフェクター分子は、バクテリオシンファミリーのメンバー（例えば、Ｋｏｎｉｓｋｙ， １９８２， Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ３６：１２５−１４４参照）であるが、ただし、該バクテリオシンファミリーのメンバーは、バクテイロシン放出タンパク質（ＢＲＰ）ではない。バクテリオシンファミリーのメンバーの例として、限定するものではないが、ＣｏｌＥ１、ＣｏｌＥ１ａ、ＣｏｌＥ１ｂ、ＣｏｌＥ２、ＣｏｌＥ３、ＣｏｌＥ４、ＣｏｌＥ５、ＣｏｌＥ６、ＣｏｌＥ７、ＣｏｌＥ８、ＣｏｌＥ９、コリシンＡ、コリシンＫ、コリシンＬ、コリシンＭ、クロアシンＤＦ１３、ペスチシンＡ１１２２、スタフィロコクシン１５８０、ブチリシン７４２３、ピオシンＲ１またはＡＰ４１、メガシンＡ−２１６、ミクロシンＭ１５、およびビブリオシン（ＪａｙａｗａｒｄｅｎｅおよびＦａｒｋａｓ−Ｈｉｍｓｌｅｙ， １９７０， Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ ｖｏｌ． １０２ ｐｐ ３８２−３８８）が挙げられる。最も好ましくは、一次エフェクター分子は、コリシンＥ３またはＶであるが、コリシンＡ、Ｅ１、Ｅ２、Ｉａ、Ｉｂ、Ｋ、Ｌ、およびＭ（Ｋｏｎｉｓｋｙ， １９８２， Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ３６：１２５−１４４参照）も、一次エフェクター分子として適している。この実施形態の別の好ましい態様では、バクテリオシンは、クロアシンであり、最も好ましくは、クロアシンＤＦ１３である。
【０１２５】
好ましい実施形態では、一次エフェクター分子は、ＣｏｌＥ１、ＣｏｌＥ２、ＣｏｌＥ３、ＣｏｌＥ４、ＣｏｌＥ５、ＣｏｌＥ６、ＣｏｌＥ７、ＣｏｌＥ８、またはＣｏｌＥ９である。コリシンＥ３（ＣｏｌＥ３）は、白血病細胞モデル系（Ｆｉｓｋａら、１９７８， Ｅｘｐｅｒｉｅｎｔｉａ ３５：４０６−４０）等の哺乳動物細胞（Ｓｍａｒｄａら、１９７８， Ｆｏｌｉａ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ２３：２７２−２７７）に深く細胞傷害性作用を及ぼすことがわかっている。ＣｏｌＥ３の細胞毒性は、タンパク質合成を停止する機能であり、これは、８０Ｓリボソームの阻害により媒介される（Ｔｕｒｎｏｗｓｋｙら、１９７３， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍ． ５２：３２７−３３４）。さらに具体的には、ＣｏｌＥ３は、リボヌクレアーゼ活性（Ｓａｕｎｄｅｒｓ， １９７８， Ｎａｔｕｒｅ ２７４：１１３−１１４）を有する。その天然形態では、ＣｏｌＥ３は、１：１の比で５０ｋＤａおよび１０ｋＤａタンパク質からなる６０ｋＤａタンパク質複合体であり、大きい方のサブユニットはヌクレアーゼ活性を有し、また、小さい方のサブユニットは５０ｋＤａサブユニットの阻害機能を有する。このように、５０ｋＤａタンパク質は、細胞傷害性タンパク質（または毒素）として作用し、１０ｋＤａタンパク質は、抗毒素として作用する。従って、一実施形態では、ＣｏｌＥ３を二次エフェクター分子として用いる場合には、大きい方のＣｏｌＥ３サブユニットもしくはその活性断片を単独で、または小さい方のサブユニットより高いレベルで発現させる。本発明の別の実施形態では、ＣｏｌＥ３ ５０ｋＤａ毒素および１０ｋＤａ抗毒素を、サルモネラ等の弱毒化腫瘍標的細菌内の単一プラスミドにコードさせる。この実施形態では、毒素／抗毒素は、プラスミドを保有するサルモネラの選択系として作用することができ、これにより、該プラスミドを欠失したサルモネラは上記毒素により死滅する。別の実施形態では、１０ｋＤａ抗毒素は、プラスミド上のｃｏｌＥ３毒素から離れて染色体上にあり、他の細菌に対する透過障壁を形成している（以下の第５．６節を参照）。
【０１２６】
本発明の別の好ましい実施形態では、一次エフェクター分子は、クロアシンＤＦ１３である。クロアシンＤＦ１３は、ＣｏｌＥ３と同様に機能する。タンパク質複合体は、６７ｋＤａ分子量である。個々の成分のサイズは、５７ｋＤａおよび９ｋＤａである。リボヌクレアーゼ活性以外に、ＤＦ１３は、細胞カリウムの漏出を引き起こすことができる。
【０１２７】
別の好ましい実施形態では、一次エフェクター分子は、コリシンＶである（Ｐｌａｓｍｉｄｓ， ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ １９８７， Ｋ．Ｇ． Ｈａｒｄｙ編におけるＰｕｇｓｌｅｙ， Ａ．Ｐ．およびＯｕｄｅｇａ， Ｂ．による”Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｓｔｕｄｙｉｎｇ Ｃｏｌｉｃｉｎｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｐｌａｓｍｉｄｓ”；Ｇｉｌｓｏｎ， Ｌ．ら、ＥＭＢＯ Ｊ． ９：３８７５−３８８４）。
【０１２８】
別の実施形態では、一次エフェクター分子は、下記のものである：コリシンＥ２（構造は、ＣｏｌＥ３に類似した二重サブユニットであるが、リボヌクレアーゼ活性ではなく、エンドヌクレアーゼ活性を有する）；イオン透過性チャンネルを形成し、細胞のプロトン駆動力を崩壊させ、細胞死に至らしめるコリシンＡ、Ｅ１、Ｉａ、ＩｂまたはＫ；タンパク質、ＤＮＡおよびＲＮＡ合成を阻害するコリシンＬ；細胞の浸透圧環境を改変することにより、細胞敗血症を引き起こすコリシンＭ；コリシンＢと同様に機能するペスチシンＡ１１２２；細孔形成バクテリオシンであるスタフィコクシン１５８０；未知の標的を介して、ＲＮＡ、ＤＮＡおよびタンパク質合成を間接的に阻害するブチリシン７４２３；ピオシンＰ１、すなわち、溶質輸送からの呼吸を脱共役することにより、細胞を死滅させるバクテリオファージテールタンパク質に似たタンパク質；コリシンＥ２様の作用を有するピオシンＡＰ４１；または細胞内物質の漏出を引き起こすホスホリパーゼであるメガシンＡ−２１６（バクテリオシンの概要については、Ｋｏｎｉｓｋｙ， １９８２， Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ３６：１２５−１４４を参照）：コリシンＡ（Ｐｌａｓｍｉｄｓ， ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ １９８７， Ｋ．Ｇ． Ｈａｒｄｙ編におけるＰｕｇｓｌｅｙ， Ａ．Ｐ．およびＯｕｄｅｇａ， Ｂ．による”Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｓｔｕｄｙｉｎｇ Ｃｏｌｉｃｉｎｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｐｌａｓｍｉｄｓ”）。
【０１２９】
従って、一次エフェクター分子は、本明細書に記載した、または当業者には公知のあらゆるバクテリオシンを含んでよいが、ただし、該バクテリオシンは、バクテリオシン放出タンパク質ではない。
【０１３０】
別の具体的な実施形態では、本発明の一次エフェクター分子は、腫瘍阻害酵素またはその機能性断片である。腫瘍阻害酵素の例として、限定するものではないが、メチオナーゼ、アスパラギナーゼ、リパーゼ、ホスホリパーゼ、プロテアーゼ、リボヌクレアーゼ、ＤＮＡアーゼ、およびグリコシダーゼが挙げられる。好ましい実施形態では、一次エフェクター分子は、メチオナーゼである。
【０１３１】
本発明の一次エフェクター分子は、例えば、癌腫、黒色腫、リンパ腫、肉腫等の固形腫瘍癌を治療または予防する上で有用である。
【０１３２】
本発明は、一次エフェクター分子をコードする核酸分子を提供する。本発明はまた、１つ以上の一次エフェクター分子および場合に応じて、１つ以上の二次エフェクター分子をコードする核酸分子を提供する。本発明は、適したプロモーターに機能的に連結された本発明のエフェクター分子をコードする核酸を提供する。場合に応じて、エフェクター分子をコードする核酸は、転写、翻訳、局在化、安定性等に関与するその他のエレメントに機能的に連結することもできる。
【０１３３】
一次エフェクター分子をコードする核酸分子は、長さが約６〜約１００，０００塩基対である。好ましくは、この核酸分子は、長さが約２０塩基対〜約５０，０００塩基対である。さらに好ましくは、この核酸分子は、長さが約２０塩基対〜約１０，０００塩基対である。さらにまた好ましくは、この核酸分子は、長さが約２０塩基対〜約４，０００塩基対である。
【０１３４】
５．３． 　一次エフェクター分子との共発現のための二次エフェクター分子
本発明の特定の実施形態では、一次エフェクター分子（例えば、ＴＮＦファミリーのメンバー、細胞傷害性ペプチドもしくはポリペプチド、抗血管新生因子、または腫瘍抑制酵素）は、場合に応じて、別の分子、すなわち、二次エフェクター分子と一緒に、細菌ベクター内で共発現させる。二次エフェクター分子は、付加的治療価値を提供し、かつ／または、周囲の環境へ（少なくとも１種の一次エフェクター分子、および、場合に応じて、１以上の二次エフェクター分子を発現させる）修飾細菌ベクターの内容物の放出を促進する。本明細書で用いる用語「付加的治療価値」とは、一次エフェクター分子が提供するもの以外に、二次エフェクター分子が、腫瘍に対し、付加的もしくは相乗的、細胞分裂抑制性、または細胞傷害性作用をもたらすことを指す。従って、二次エフェクター分子は、付加的治療因子および／または放出因子として機能する。好ましくは、二次エフェクター分子は、付加的治療因子もしくは放出因子（または両方）のいずれであっても、所望の部位、すなわち、腫瘍の部位で、優先的または特異的に活性化もしくは発現させる。特定の実施形態では、二次エフェクター分子は、２つの機能を果たす、すなわち、細菌細胞内容物の放出を促進する（例えば、細菌細胞溶解または準溶解を促進することにより）と同時に、治療価値を提供する（例えば、腫瘍細胞に対する細胞毒性により）ことができる。特定の非制限的実施形態では、二次エフェクター分子の細胞毒性は、患者の免疫系が介在しうる；従って、このような二次エフェクター分子は、免疫調節剤として機能することができる。
【０１３５】
本明細書の特定の実施形態では、本発明の弱毒化腫瘍標的細菌ベクターは、抗腫瘍活性を有する少なくとも１種の二次エフェクター分子を発現させるように操作する。すなわち、二次エフェクター分子の発現により、腫瘍または腫瘍細胞の死滅または成長の阻害が起こる。
【０１３６】
二次エフェクター分子は、タンパク質性または核酸分子である。核酸分子は、二本鎖もしくは一本鎖ＤＮＡまたは二本鎖もしくは一本鎖ＲＮＡ、ならびに、三重らせん核酸分子のいずれでもよい。核酸分子は、リボザイム、またはアンチセンス核酸等として機能することができる。
【０１３７】
アンチセンスヌクレオチドは、ｍＲＮＡまたはＤＮＡ等の核酸に、配列特異的に結合するオリゴヌクレオチドである。相補的配列を有するｍＲＮＡに結合すると、アンチセンスは、ｍＲＮＡの翻訳を阻止する（例えば、米国特許第５，１６８，０５３；５，１９０，９３１；５，１３５，９１７；および５，０８７，６１７号参照）。三重らせん分子とは、二重らせんＤＮＡと結合して、共直線性三重らせん分子を形成し、これにより、転写を阻止する一本鎖ＤＮＡを意味する（例えば、米国特許第５，１７６，９９６号を参照）。
【０１３８】
リボザイムは、ｍＲＮＡ等のＲＮＡ基質を特異的に切断することにより、細胞成長もしくは発現を阻害または干渉するＲＮＡ分子である。ＲＮＡ鎖の切断および／または連結に関与するリボザイムとして、少なくとも５クラスのリボザイムが知られている。リボザイムは、任意のＲＮＡ転写産物を標的とすることができ、その転写産物を触媒的に切断することができる（例えば、米国特許第５，２７２，２６２号；米国特許第５，１４４，０１９号；および米国特許第５，１６８，０５３、５，１８０，８１８、５，１１６，７４２および５，０９３，２４６号を参照）。
【０１３９】
一次エフェクター分子についてすでに記載したように、二次エフェクター分子をコードまたは含有する核酸には、機能的連結で、選択したプロモーターを付与する、また、場合に応じて、機能的連結で、転写、翻訳、局在化、安定性および／またはその他に参加する他のエレメントを付与する。さらに、二次エフェクター分子は、一次エフェクター分子および内部リボソーム結合部位と同じプロモーターを用いて、または、一次エフェクター分子とは異なるプロモーターを用いて、発現させることができる。
【０１４０】
二次エフェクター分子をコードする核酸分子は、長さが約６塩基対から約１００，０００塩基対である。好ましくは、核酸分子の長さは、約２０塩基対から約５０，０００塩基対である。より好ましくは、核酸分子の長さは、約２０塩基対から約１０，０００塩基対である。さらにより好ましくは、核酸分子の長さは、約２０塩基対から約４，０００塩基対である。
【０１４１】
下記の二次エフェクター分子をコードするエフェクター分子のヌクレオチド配列は、よく知られている（ＧｅｎＢａｎｋ参照）。二次エフェクター分子（この二次エフェクター分子は、細胞傷害性もしくは細胞分裂抑制因子、またはその生物学的に活性の断片、変異体もしくは誘導体である）をコードする核酸分子は、増幅（例えば、ＰＣＲ）、ゲノムまたはｃＤＮＡライブラリーのプローブハイブリダイゼーション、発現ライブラリーの抗体スクリーニング等の標準的方法により単離してもよいし、化学的に合成しても、または市販の、もしくは他の供給源から得られたものでもよい。
【０１４２】
本明細書に記載した用途で使用する核酸分子およびオリゴヌクレオチドは、当業者には公知である任意の方法により合成することができる（例えば、国際公開ＷＯ９３／０１２８６、米国特許第５，２１８，０８８；５，１７５，２６９；および５，１０９，１２４号参照）。アンチセンス試薬として使用するオリゴヌクレオチドおよびリボザイムの同定は、当業者には公知の方法を含む。
【０１４３】
５．３．１． 　付加的治療価値をもたらす因子
本発明の特定の実施形態では、少なくとも１種の一次エフェクター分子を発現し、かつ好ましくは、サルモネラベクターである本発明の弱毒化腫瘍標的細菌ベクターは、抗腫瘍活性を有する少なくとも１種の二次エフェクター分子を発現する。すなわち、該二次エフェクター分子の発現により、腫瘍もしくは腫瘍細胞の死滅、またはそれらの成長の阻害、あるいは、腫瘍細胞の転移の阻害が起こり、これによって、一次エフェクター分子の細胞傷害性または細胞分裂抑制作用を増強する。一実施形態では、二次エフェクター分子の腫瘍への作用は、一次エフェクター分子の作用に付加的なものである。好ましい実施形態では、この作用は、超付加的または相乗的である、すなわち、一次および二次エフェクター分子を個別に投与した場合の作用を合わせたものより大きい。
【０１４４】
特定の実施形態では、二次エフェクター分子は、タンパク質合成との干渉、または細胞周期の破壊により細胞成長を阻害することによって、細胞に対し、細胞傷害性または細胞分裂抑制性である。このような物質は、例えば、ｒＲＮＡもしくはリボ核タンパク質を切断する、伸張因子を阻害する、ｍＲＮＡを切断する、または、タンパク質合成を細胞が生存できないレベルまで低下させるその他の機構により、作用すると考えられる。このような二次エフェクター分子の例として、限定するものではないが、サポリン、リシン、アブリン、およびその他のタンパク質不活性化リボソーム（ＲＩＰ）が挙げられる。
【０１４５】
別の実施形態では、二次エフェクター分子は、プロドラッグ変換酵素またはこれをコードする核酸、すなわち、薬物の化学的性質を調節して、細胞傷害性薬剤を生成する酵素である。プロドラッグ変換酵素の例は、Ｐａｗｅｌｅｋらにより国際公開ＷＯ９６／４０２３８の第３３頁の表２に一覧が記載されている。尚、この文献は、参照により本明細書に組み入れる。国際公開ＷＯ９６／４０２３８はまた、このようなプロドラッグ変換酵素を含む分泌融合タンパク質の生成方法も教示している。本発明によれば、プロドラッグ変換酵素は、ＢＲＰのような放出因子と共発現させた場合、分泌タンパク質である必要はない（以下の第５．３．２節を参照）。具体的実施形態では、プロドラッグ変換酵素は、マイトマイシンＣおよびポルフィロマイシン（Ｍｕｒｒａｙら、１９９４， Ｊ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｅｘｐ． Ｔｈｅｒａｐｅｕｔ． ２７０：６４５−６４９）に作用するシトクロムｐ４５０ ＮＡＤＰＨオキシドレダクターゼである。別の実施形態では、二次エフェクター分子を、ＢＲＰのような放出因子と共発現させて、補因子（例えば、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ、ＡＴＰ等）の放出を起こすことにより、プロドラッグ変換酵素の活性を増強する。この実施形態の別の態様では、二次エフェクター分子を、ＢＲＰのような放出因子と共発現させて、活性化薬物（例えば、細菌細胞質または周辺細胞質内で活性化され、細菌ベクターから放出された薬物）を放出させる。
【０１４６】
別の実施形態では、二次エフェクター分子は、誘導性酸化窒素シンターゼ（ＮＯＳ）または内皮性酸化窒素シンターゼの阻害剤である。酸化窒素（ＮＯ）は、血管成長の調節および動脈硬化に関与すると考えられている。ＮＯは、酸化窒素シンターゼ（ＮＯＳ）によりＬ−アルギニンから形成され、免疫、炎症および心臓血管応答を調節する。
【０１４７】
別の実施形態では、二次エフェクター分子は、癌遺伝子もしくは増殖因子（例えば、ｂＦＧＦ、ｉｎｔ−２、ｈｓｔ−１／Ｋ−ＦＧＦ、ＦＧＦ−５、ｈｓｔ−２／ＦＧＦ−６、ＦＧＦ−８）または細胞受容体もしくはリガンド等の細胞増殖に関与するタンパク質の生成または活性を阻害することによって、細胞に対し、毒性を有する、または細胞分裂を抑制する。阻害は、転写または翻訳（リボザイムまたは三重らせんＤＮＡである二次エフェクター分子により媒介される）のレベルで、あるいは、タンパク質活性（ドミナントネガティブ突然変異体等の増殖因子経路の阻害剤である二次エフェクター分子により媒介される）のレベルで、行うことができる。
【０１４８】
別の実施形態では、二次エフェクター分子は、サイトカイン、ケモカイン、または免疫調節タンパク質もしくはこれをコードする核酸、例えば、インターロイキン−１（ＩＬ−１）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インターロイキン−４（ＩＬ−４）、インターロイキン−５（ＩＬ−５）、インターロイキン−１０（ＩＬ−１０）、インターロイキン−１５（ＩＬ−１５）、インターロイキン−１８（ＩＬ−１８）；内皮単球活性化タンパク質−２（ＥＭＡＰ２）、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−γ、ＩＦＮ−α、ＭＩＰ−３α、ＳＬＣ、ＭＩＰ−３β、またはＨＬＡ−Ｂ７のようなＭＨＣ遺伝子である。このような免疫調節エフェクター分子の送達は、免疫系を調節し、宿主の抗腫瘍免疫の能力を高めるであろう。あるいは、Ｂ７．１およびＢ７．２等の共刺激分子、ＣＤ２８およびＣＴＬＡ−４両方に対するリガンドをコードする核酸分子も送達することにより、Ｔ細胞性免疫を増強することもできる。さらに別の免疫調節剤は、α−１，３−ガラクトシルトランスファーゼであり、これを腫瘍細胞に発現させると、補体性細胞死を可能とする。さらに、別の免疫調節剤は、腫瘍関連抗原、すなわち、対応する非癌性細胞には発現しないが、腫瘍細胞に特異的に発現する分子、または対応する非癌性細胞よりも高いレベルで、腫瘍細胞に発現する分子である。腫瘍関連抗原の例は、Ｋｕｂｙ， Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， Ｗ．Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ， ニューヨーク、ＮＹ， 第１版（１９９２）、ｐｐ． ５１５−５２０（本明細書に参照により組み入れる）に記載されている。腫瘍関連抗原の他の例は、当業者には公知である。
【０１４９】
別の実施形態では、二次エフェクター分子は、Ｆｌｔ−３リガンドまたはこれをコードする核酸である。別の実施形態では、二次エフェクター分子は、ＢＲＰである。
【０１５０】
具体的実施形態では、二次エフェクター分子は、一次エフェクター分子がＴＮＦファミリーのメンバーのとき、ＴＮＦファミリーメンバーではない。別の具体的実施形態では、二次エフェクター分子は、一次エフェクター分子が抗血管新生因子のとき、抗血管新生因子ではない。別の具体的実施形態では、二次エフェクター分子は、一次エフェクター分子が細胞傷害性ペプチドまたはポリペプチドのとき、細胞傷害性ペプチドまたはポリペプチドではない。別の具体的実施形態では、二次エフェクター分子は、一次エフェクター分子が腫瘍抑制酵素のとき、腫瘍抑制酵素ではない。
【０１５１】
５．３．２． 　腫瘍環境への抗腫瘍エフェクター分子の放出を促進する因子
本発明の他の実施形態では、少なくとも１種の一次エフェクター分子を発現し、かつ好ましくは、サルモネラベクターである本発明の弱毒化腫瘍標的細菌ベクターは、少なくとも１種の二次エフェクター分子を発現するが、該二次エフェクター分子は、細菌細胞膜を透過可能にする、もしくは細胞外環境への細胞内成分の放出を増強する機能を果たし、これによって、一次および／または二次エフェクター分子の送達を増強する。このように、細菌細胞を透過可能にする、または放出を増強する二次エフェクター分子は、「放出因子」と呼ぶ。特定の実施形態では、放出因子は抗腫瘍活性も有するのが有利である。
【０１５２】
本発明の細菌ベクターにより発現させる放出因子は、修飾弱毒化腫瘍標的細菌に内在性のものでも、あるいは、外因性のもの（例えば、弱毒化腫瘍標的細菌にネイティブではない核酸によりコードされたもの）でもよい。放出因子は、プラスミドを含む核酸、または弱毒化腫瘍標的細菌のゲノムに組み込まれた核酸により、コードすることができる。放出因子は、一次エフェクター分子をコードする同じ核酸またはプラスミドでコードしてもよいし、あるいは、別々の核酸またはプラスミドでコードしてもよい。放出因子は、二次エフェクター分子をコードする同じ核酸またはプラスミドでコードしてもよいし、あるいは、別々の核酸またはプラスミドでコードしてもよい。一実施形態では、放出因子は、Ｏｍｐ様タンパク質と融合させた一次エフェクター分子を含む融合タンパク質も発現する細胞内で発現させる。この実施形態では、放出因子の共発現により、細胞周辺腔からの融合タンパク質の放出を増強することができる。
【０１５３】
好ましい実施形態では、このような因子は、バクテリオシン放出タンパク質、すなわち、ＢＲＰ（本明細書では、一般にＢＲＰと呼ぶ）の１つである。本発明で用いるＢＲＰは、限定するものではないが、クロアシンＤＦ１３プラスミド、コリシンＥ１〜Ｅ９プラスミドの１つ、もしくはコリシンＡ、ＮまたはＤプラスミドを含む当業者には公知の任意の供給源に由来するものでよい。好ましい実施形態では、ＢＲＰはクロアシンＤＦ１３（ｐＣｌｏＤＦ１３ ＢＲＰ）から成る。
【０１５４】
一般に、ＢＲＰは、４５〜５２アミノ酸ペプチドであり、これは、初め、シグナルエンドペプチダーゼによって切断されないシグナル配列を含む前駆体分子（ＰｒｅＢＲＰ）として合成される。ＢＲＰ活性は、少なくとも部分的に、デタージェント耐性外膜ホスホリパーゼＡ（ＰｌｄＡ）により媒介されると考えられ、通常、外膜リン脂質の分解の増加に関連している（ＢＲＰの概要については、ｖａｎ ｄｅｒ Ｗａｌら、１９９５， ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｒｅｖｉｅｗ １７：３８１−３９９を参照されたい）。機構に関して制限するわけではないが、ＢＲＰは、周辺細胞質成分の優先的放出を促進するが、これより少ない程度での細胞質成分の放出も検出されている。適度に過剰発現させると、ＢＲＰは細菌膜を脆弱にし、細胞質成分の準溶解および高放出を誘導する。さらに、ＢＲＰは、超高レベルで発現させると、このタンパク質が細菌細胞溶解を引き起こし、溶菌放出により細胞内容物を送達することができると考えられる。この実施形態で、ＢＲＰ発現は、ＢＲＰ活性（例えば、細菌内容物の放出）と相関すると考えられる。例えば、超高ＢＲＰ活性により、実質的にすべての細菌の細菌細胞溶解が起こる。従って、本明細書で用いる「超高発現」は、実質的に全細菌の細菌細胞溶解を引き起こすＢＲＰの発現レベルとして定義される。ＢＲＰを発現しない対照細菌と比較して、適度のＢＲＰ活性は、細菌の溶解を必要とせずに、細菌内容物の部分的または増強された放出を伴う。従って、この実施形態では、ＢＲＰの適度な過剰発現とは、実質的にすべての細菌の細菌溶解を伴なわずに、細胞質成分の放出が増加される発現レベルを意味する。本明細書で用いる実質的にすべての細菌とは、細菌の６０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらにより好ましくは９０％以上、最も好ましくは９０〜１００％を意味する。
【０１５５】
本発明の具体的実施形態では、ＢＲＰタンパク質は、ｐＣｌｏＤＦ１３ＢＲＰ突然変異体であり、その溶菌機能は、そのタンパク質放出機能とは分離されているため、細菌溶解なしに、タンパク質放出を増強する（ｖａｎ ｄｅｒ Ｗａｌら、１９９８， Ａｐｐ． Ｅｎｖ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ６４：３９２−３９８）。この実施形態により、細菌ベクターからのタンパク質放出が長くなると共に、ベクターの頻繁な投与の必要性が減少する。別の具体的実施形態では、本発明のＢＲＰは、Ｃ末端を短くしたｐＣｌｏＤＦ１３ＢＲＰであり、これは、タンパク質放出に加えて、細胞溶解を引き起こす（Ｌｕｉｒｉｎｋら、１９８９， Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １７１：２６７３−２６７９）。
【０１５６】
本発明の別の実施形態では、増強された放出系は、ポーリンタンパク質の過剰発現を含む；例えば、Ｓｕｇａｗａｒａ， Ｅ．およびＮｉｋａｉｄｏ， Ｈ．， １９９２， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６７：２５０７−１１を参照のこと。
【０１５７】
特定の実施形態では、本発明の細菌ベクターによりＢＲＰを発現させる場合、ＢＲＰは、修飾弱毒化腫瘍標的細菌に内在性でも、あるいは、外因性のもの（例えば、弱毒化腫瘍標的細胞にネイティブではない核酸によりコードされたもの）でもよい。ＢＲＰは、プラスミドを含む核酸により、または弱毒化腫瘍標的細胞のゲノムに組み込まれたタンパク質核酸によりコードすることができる。また、ＢＲＰは、一次エフェクター分子をコードする同じ核酸またはプラスミドでコードしてもよいし、あるいは、別々の核酸またはプラスミドでコードしてもよい。さらに、ＢＲＰは、二次エフェクター分子をコードする同じ核酸またはプラスミドでコードしてもよいし、あるいは、別々の核酸またはプラスミドでコードしてもよい。一実施形態では、ＢＲＰ様タンパク質は、Ｏｍｐ様タンパク質と融合させたエフェクター分子を含む融合タンパク質も発現する細胞内で発現させる。この実施形態では、ＢＲＰの共発現により、融合タンパク質の放出を増強することができる。
【０１５８】
本発明の好ましい具体的実施形態では、ＢＲＰをコードする核酸は、コリシンプラスミドによりコードされる。本発明の別の具体的実施形態では、ＢＲＰコード核酸は、ネイティブのＢＲＰプロモーターの制御下で発現させるが、その際のプロモーターは、その正常な宿主（ＢＲＰの場合、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｃｌｏａｃａｅ）においてストレス（例えば、紫外線等のＤＮＡ損傷を起こす条件）に応答するＳＯＳプロモーターであり、しかも、サルモネラにおいて部分的に構成的である。好ましい実施形態では、ＢＲＰコード核酸は、ｐｅｐＴプロモーターの制御下で発現させるが、その際、該プロモーターは、腫瘍環境の嫌気性性質に応答して活性化する（例えば、Ｌｏｍｂａｒｄｏら、１９７７， Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １７９：１９０９−１７）。
【０１５９】
あるいは、プロモーターは、Ｔｎ１０トランスポゾンのｔｅｔプロモーター等の抗生物質誘導プロモーターであることができる。好ましい実施形態では、ｔｅｔプロモーターは、単量体（ｓｉｎｇｌｅｍｅｒ）であり、該単量体は、ドキシサイクリンおよびアンヒドロテトラサイクリン等のテトラサイクリンまたはその類似体の存在に、悉無律的に応答し、遺伝学的に安定したオン−オフスイッチを提供する。別の実施形態では、ｔｅｔプロモーターは、多量体化（例えば、３倍）する。このような多量体は、テトラサイクリンの存在に段階的に応答し、エフェクター分子レベルの制御をより操作しうる系を提供する。次に、本発明の弱毒化腫瘍標的細菌で治療している被験者に、適した用量のテトラサイクリンを投与することにより、プロモーター活性を誘導する。ｔｅｔ誘導性発現系は、当初、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）（ＦａｒｙａｒおよびＧａｔｚ， １９９２， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２１：３４５−３４９）および哺乳動物細胞（ＬａｎｇおよびＦｅｉｎｇｏｌｄ， １９９６， Ｇｅｎｅ １６８：１６９−１７１）等の真核細胞系について記載されていたが、近年の研究で、細菌細胞までその適用性が広がっている。例えば、Ｓｔｉｅｇｅｒら（１９９９， Ｇｅｎｅ ２２６：２４３−２５２）は、ｔｅｔプロモーターに機能的に連結させたｔｅｔ誘導における、ホタル（ｆｉｒｅｆｌｙ）ルシフェラーゼ遺伝子の８０倍誘導を明らかにした。このプロモーターの利点は、非常に低レベルのテトラサイクリン、すなわち、抗生物質活性に必要な用量の約１／１０で、誘導される点である。
【０１６０】
５．４． 　誘導体と類似体
本発明は、さらに、誘導体をコードまたは送達するように修飾された細菌ベクターを包含する。この誘導体として、限定するものではないが、一次および／または二次エフェクター分子、もしくはこれをコードする核酸の断片、類似体、あるいは変異型が挙げられる。誘導体、類似体または変異型は、機能的に活性であり、例えば、全長の、野生型エフェクター分子に関連する１以上の機能活性を示すことができる。一例として、所望の治療特性を有するこのような誘導体、類似体または変異型を用いて、腫瘍成長または腫瘍細胞の分散（転移）を阻害することができる。エフェクター分子の誘導体または類似体は、本明細書に記載したもの等、当業者には公知の方法により、所望の活性について試験することができる。
【０１６１】
特に、野生型エフェクター分子と同じ、もしくはこれより高い抗腫瘍機能を有する分子を提供する置換、付加（例えば、挿入）または欠失により、エフェクター分子コード配列を改変することにより、変異型を作製することができる。例えば、本発明の変異型としては、限定するものではないが、一次アミノ酸配列として、エフェクター分子のアミノ酸配列の全部または一部を含むものが挙げられ、これには、機能的に同等のアミノ酸残基を配列内で、サイレント変化を起こす残基で置換した、改変された配列がある。すなわち、改変された配列は、少なくとも１の保存的置換を有する。
【０１６２】
哺乳動物に由来する一次または二次エフェクターコード核酸のいずれかを改変して、当業者には公知の方法により、細菌コドン使用頻度を用いることができる。好ましいコドン使用頻度は、下記に例示されている：Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ， Ｉｎｃ．，およびＪｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ． ニューヨーク， およびＺｈａｎｇら、１９９１， Ｇｅｎｅ １０５：６１−７２。
【０１６３】
具体的実施形態では、一次または二次エフェクター分子の誘導体、類似体または変異型は、一次または二次エフェクター分子、またはその断片をコードするヌクレオチド配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む。ここで、ハイブリダイゼーションは、ストリンジェントな条件下で、例えば、約４５℃で６ｘ 塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中でフィルターに結合させたＤＮＡとハイブリダイズさせた後、約５０〜６５℃で０．２ ｘ ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中で１回以上洗浄することにより行う。または、高度にストリンジェントな条件下で、例えば、約４５℃で６ｘ ＳＳＣ中でフィルターに結合させた核酸とハイブリダイズさせた後、約６８℃で０．１ ｘ ＳＳＣ／０．２％ＳＤＳ中で１回以上洗浄することにより実施する。あるいは、当業者には公知の他のストリンジェントな条件下で実施することができる（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ， Ｆ．Ｍ．ら、編、１９８９， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ． Ｉ， Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ， Ｉｎｃ．，およびＪｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ． ニューヨーク、ｐａｇｅｓ ６．３．１〜６．３．６および２．１０．３）。
【０１６４】
一次もしくは二次エフェクター分子の誘導体または類似体としては、限定するものではないが、一次もしくは二次エフェクター分子またはその断片に実質的に相同的な領域を含む分子（例えば、様々な実施形態における、挿入または欠失を一切含まない同じサイズのアミノ酸配列に対して、あるいは、アラインメントが当業者には公知のコンピュータ相同性プログラムにより実施されたアラインメント済配列と比較して、少なくとも６０％または７０％または８０％または９０％または９５％同一性）、あるいは、そのコード核酸が、高ストリンジェンシー、中ストリンジェンシーまたは低ストリンジェンシー条件下で、エフェクター分子タンパク質エフェクター分子コード配列にハイブリダイズすることができる分子が挙げられる。
【０１６５】
例えば、一次エフェクター分子の配列と他の既知配列間の、２つのアミノ酸配列または２つの核酸の同一性百分率を決定するために、最適な比較目的に合わせて配列をアラインメントする（例えば、第１アミノ酸または核酸配列の配列にギャップを導入して、第２アミノ酸または核酸配列との最適アラインメントを達成することができる）。次に、対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置にあるアミノ酸残基またはヌクレオチドを比較する。第１配列における位置が、第２配列における対応位置と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドにより占められている場合には、分子は、その位置で同一である。２つの配列間の同一性百分率は、配列が共有する同一位置の数の関数である（すなわち、％同一性＝同一位置の数＃／位置の総数＃（例えば、重複位置）×１００）。一実施形態では、２つの配列は、同じ長さである。
【０１６６】
２つの配列間の同一性百分率は、数学アルゴリズムを用いて達成することができる。２つの配列の比較に用いられる数学アルゴリズムの好ましい非制限的例は、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ， １９９０， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ， ＵＳＡ ８７：２２６４−２２６８のアルゴリズム（ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ， １９９３， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ， ＵＳＡ ９０：５８７３−５８７７に記載されているように修正された）である。このようなアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９０， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２１５：４０３−４１０のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラムに組み込まれている。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索を、ＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、語長＝１２を用いて実施することにより、本発明の核酸分子と相同のヌクレオチド配列を得ることができる。ＢＬＡＳＴタンパク質検索を、ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、語長＝３を用いて実施することにより、本発明のタンパク質分子と相同のアミノ酸配列を得ることができる。比較目的のためにギャップアラインメントを得るためには、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９７， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５：３３８９−３４０２に記載されているように、ギャップＢＬＡＳＴを用いることができる。あるいは、ＰＳＩ−Ｂｌａｓｔを用いて、分子間の距離関係を検出する反復検索を実施してもよい（同上）。ＢＬＡＳＴ、ギャップＢＬＡＳＴ、およびＰＳＩ−Ｂｌａｓｔプログラムを用いる場合には、それぞれのプログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメーターを用いることができる。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．を参照のこと。配列の比較に用いられる数学アルゴリズムの別の好ましい非制限的例は、ＭｙｅｒｓおよびＭｉｌｌｅｒのアルゴリズム， ＣＡＢＩＯＳ（１９８９）である。このようなアルゴリズムは、ＧＣＧ配列アラインメントソフトウエアパッケージの一部である、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれている。ＡＬＩＧＮプログラムを使用してアミノ酸配列を比較する場合には、ＰＡＭ１２０重量残基表、１２のギャップ長ペナルティー、および、４のギャップペナルティーを用いることができる。配列分析のためのさらなるアルゴリズムは、当業者には公知であり、次のものが挙げられる：ＴｏｒｅｌｌｉｓおよびＲｏｂｏｔｔｉ， １９９４， Ｃｏｍｐｕｔ． Ａｐｐｌ． Ｂｉｏｓｃｉ．， １０：３−５に記載されたＡＤＶＡＮＣＥおよびＡＤＡＭ；ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ， １９８８， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ８５：２４４４−８に記載されたＦＡＳＴＡ。ＦＡＳＴＡでは、ｋｔｕｐが、検索の鋭敏性および速度を設定する制御オプションである。ｋｔｕｐ＝２であれば、比較している２つの配列における類似領域は、アラインメント済残基対を調べることによりみつけられる。また、ｋｔｕｐ＝１であれば、単一のアラインメント済アミノ酸を調べる。ｋｔｕｐは、タンパク質配列の場合は、２または１に、ＤＮＡ配列の場合は、１〜６に設定することができる。ｋｔｕｐが指定されていない場合には、デフォルトは、タンパク質については２、ＤＮＡについては６である。ＦＡＳＴＡパラメターのさらに詳細な説明については、
ｈｔｔｐ：／／ｂｉｏｗｅｂ．ｐａｓｔｅｕｒ．ｆｒ／ｄｏｃｓ／ｍａｎ／ｆａｓｔａ．１．ｈｔｍｌ＃ｓｅｃｔ２
を参照されたい。尚、この内容は、本明細書に参照により組み入れる。
【０１６７】
あるいは、タンパク質配列アラインメントは、Ｈｉｇｇｉｎｓら、１９９６， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． ２６６：３８３−４０２に記載されているＣＬＵＳＴＡＬ Ｗアルゴリズムを用いて実施することができる。
【０１６８】
２つの配列間の同一性百分率は、ギャップのあるなしに拘わらず、前述したものと同様の技法を用いて決定することができる。同一性百分率を計算する際には、正確に同じものだけを計数する。
【０１６９】
一次エフェクター分子もしくは二次エフェクター分子、またはその誘導体または類似体は、当業者には公知の様々な方法により生成することができる。これらを生成するための操作は、核酸またはタンパク質レベルで行うことができる。例えば、エフェクター分子をコードする、クローン化されたエフェクター分子コード配列は、当業者には公知の多数の戦略のいずれかによって修飾することが可能である（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｎｕａｌ， 第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ニューヨーク）。該配列は、制限エンドヌクレアーゼを用いて、適切な部位で切断し、次いで、所望であれば、さらに酵素による修飾を施し、単離した後、ｉｎ ｖｉｔｒｏで連結することができる。一次または二次エフェクター分子の誘導体または類似体をコードする修飾エフェクター分子の生成の際、所望の一次または二次エフェクター分子活性がコードされるエフェクター分子コード配列領域において、修飾エフェクター分子コード配列が、翻訳停止シグナルにより中断されない状態で、ネイティブタンパク質と同じ翻訳リーディングフレーム内に残ることを確実にするよう注意しなければならない。
【０１７０】
さらに、エフェクター分子をコードする核酸をｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで突然変異させることにより、翻訳、開始、および／または終結配列を形成および／または破壊する、あるいは、コード領域に変異を発生させる、および／または新しい制限エンドヌクレアーゼ部位を形成する、もしくは既存のものを破壊することにより、ｉｎ ｖｉｔｒｏ修飾をさらに促進することができる。好ましい具体的実施形態では、エフェクター分子コード核酸を突然変異させることにより、例えば、さらに強力な変異型を生成する。当業者には公知の任意の突然変異誘発技法を用いることができ、この技法には、限定するものではないが、下記のものが挙げられる：化学的突然変異誘発、ｉｎ ｖｉｔｒｏ部位指定突然変異誘発（Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎら、１９７８， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２５３：６５５１）、ＴＡＢ（登録商標）リンカー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）の使用、突然変異を含むプライマーを用いるＰＣＲ等。好ましい実施形態では、エフェクター分子の１以上の推定非必須アミノ酸残基の位置において、保存的アミノ酸置換物を作製する。「保存的アミノ酸置換物」とは、アミノ酸残基を、類似した電荷を帯びた側鎖を有するアミノ酸残基で置換したものを意味する。類似した電荷を帯びた側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当業界で定義されている。これらのファミリーとしては、下記のものが挙げられる：塩基性側鎖（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β枝分かれ側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）をそれぞれ有するアミノ酸。あるいは、突然変異は、例えば、飽和突然変異誘発により、コード配列の全部または部分に沿って、ランダムに導入することができ、こうして得られた突然変異体を生物学的活性についてスクリーニングすることにより、活性を保持する突然変異体を同定することができる。突然変異誘発の後、コードタンパク質を発現させ、該タンパク質の活性を決定することができる。
【０１７１】
別の実施形態では、プロテアーゼ切断部位を含むように、本発明のエフェクター分子または融合タンパク質を構築する。
【０１７２】
５．５． 　融合タンパク質
特定の実施形態では、本発明は、融合タンパク質（例えば、別のタンパク質と共有結合している）として構築される一次または二次エフェクター分子を提供する。本発明は、このような融合タンパク質をコードする核酸を提供する。本発明の特定の実施形態では、融合タンパク質をコードする核酸を、適したプロモーターに機能的に連結する。
【０１７３】
特定の実施形態では、エフェクター分子は、別のタンパク質のアミノ酸配列とのペプチド結合を介して、そのアミノ−またはカルボキシ−末端に結合したエフェクター分子もしくはその断片（好ましくは、該エフェクター分子の少なくともドメインもしくはモチーフ、または、該エフェクター分子の少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも２５、少なくとも５０、少なくとも７５、もしくは少なくとも１００のアミノ酸からなる）を含むキメラタンパク質または融合タンパク質として構築される。特定の実施形態では、融合物は、機能的に活性である異種ポリペプチドまたはその断片の少なくとも２、少なくとも６、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも５０、少なくとも７５、もしくは少なくとも１００の連続したアミノ酸を含む。一実施形態では、このようなキメラタンパク質または融合タンパク質は、別のタンパク質のコード配列にフレーム内結合した一次エフェクター分子をコードする核酸（例えば、ＴＮＦコード配列、抗血管新生因子コード配列、腫瘍抑制酵素コード配列、もしくは細胞傷害性ポリペプチドコード配列）の組換え発現により生成する。このようなキメラタンパク質は、当業者には公知の方法により、適正なコードフレーム内で、所望のアミノ酸配列をコードする適切な核酸配列を互いに連結した後、当業者には公知の方法で最適の発現運搬体にキメラ産物を発現することにより、作製することができる。任意の異種ポリペプチドコード配列と融合させたエフェクター分子をコードする核酸部分を含むキメラ核酸を構築してもよい。具体的実施形態は、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも２５、少なくとも５０、もしくは少なくとも１００のアミノ酸からなる一次または二次エフェクター分子の断片、あるいは、全長一次または二次エフェクター分子の１以上の機能活性を示す断片を含むキメラタンパク質に関する。
【０１７４】
具体的実施形態では、融合タンパク質は、ヘキサヒスチジンタグ等のアフィニティータグ、または精製、単離、同定もしくは発現アッセイで用いることができるその他のアフィニティータグを含む。別の具体的実施形態では、融合タンパク質は、メタルプロテアーゼまたはセリン切断部位等のプロテアーゼ部位を含む。この実施形態では、腫瘍部位で活性であるプロテアーゼに対応するプロテアーゼ部位を本発明の融合タンパク質中に構築するのが好ましい場合もある。いくつかの実施形態では、エフェクター分子は、Ｏｍｐ様タンパク質、もしくはその断片（例えば、シグナル配列、リーダー配列、周辺細胞質領域、膜貫通ドメイン、多重膜貫通ドメイン、あるいは、これらの組合せ；以下の第３．１節、Ｏｍｐ様タンパク質の定義を参照）との融合タンパク質として構築する。
【０１７５】
好ましい実施形態では、本発明のエフェクター分子（一次または二次）は、外膜タンパク質（Ｏｍｐ様タンパク質）を含む融合タンパク質として発現させる。細菌外膜タンパク質は、細菌外膜の膜内在性タンパク質であり、多重膜貫通（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｍｅｍｂｒａｎｅ−ｓｐａｎｎｉｎｇ）ドメインを有し、多くの場合、１以上の脂質成分に結合している。外膜タンパク質は、初め、タンパク質を膜に向かわせるアミノ末端シグナルペプチドを有する前駆体の形態で発現し、その際に、シグナルペプチドをシグナルペプチダーゼにより切断して、成熟タンパク質を生成する。一実施形態では、エフェクター分子は、Ｏｍｐ様タンパク質との融合タンパク質として発現させる。この実施形態では、一次エフェクター分子は、細菌の外膜への送達が増強されている。機構に関して制限するわけではないが、本発明者は、Ｏｍｐ様タンパク質が、外膜に対するエフェクター分子のアンカーまたは連結鎖（ｔｅｔｈｅｒ）として働く、あるいは、細菌外膜にタンパク質を局在化させる役割を果たすと考える。一実施形態では、Ｏｍｐ様タンパク質とのエフェクター分子との融合を用いて、周辺細胞質へのエフェクター分子の局在化を増強する。別の実施形態では、Ｏｍｐ様タンパク質とエフェクター分子の融合を用いて、エフェクター分子の放出を増強する。具体的実施形態では、Ｏｍｐ様タンパク質は、ＯｍｐＡ、ＯｍｐＢ、ＯｍｐＣ、ＯｍｐＤ、ＯｍｐＥ、ＯｍｐＦ、ＯｍｐＴ、ポーリン様タンパク質、ＰｈｏＡ、ＰｈｏＥ、ｌａｍＢ、βラクタマーゼ、エンテロトキシン、プロテインＡ、エンドグルカナーゼ、ペプチドグリカン関連リポタンパク質（ＰＡＬ）、ＦｅｐＡ、ＦｈｕＡ、ＮｍｐＡ、ＮｍｐＢ、ＮｍｐＣ、もしくは主要な外膜リポタンパク質（ＬＰＰ等）の少なくとも一部である。本発明の特定の実施形態では、シグナル配列は、疎水性を高めて構築する（例えば、疎水性アミノ酸（例えば、ロイシン）への、シグナル配列内のアミノ酸の挿入または置換による）。実施例については、以下の第７．１〜７．４節を参照のこと。
【０１７６】
本発明の別の実施形態では、本発明の融合タンパク質は、タンパク質分解切断部位を含む。タンパク質分解切断部位は、エフェクター分子に内在的またはＯｍｐ様タンパク質に内在的である、あるいは、タンパク質分解切断部位を融合タンパク質中に構築してもよい。特定の具体的実施形態では、本発明のＯｍｐ様タンパク質は、別々のタンパク質に由来する構造エレメントを含むハイブリッドＯｍｐである。
【０１７７】
上記実施形態の態様例では、Ｏｍｐ様タンパク質はＯｍｐＡである。具体的Ｏｍｐ様タンパク質の構造的立体配置に留意しながら、ＯｍｐＡ様融合タンパク質の構築に用いた同じ原理を他のＯｍｐ様タンパク質に適用することができる。
【０１７８】
例えば、ネイティブＯｍｐＡタンパク質は、該タンパク質の１７０アミノ酸Ｎ末端ドメイン内に８つのアンチパラレル膜貫通β鎖を含む。膜貫通ドメインの各対の間には、膜貫通ドメインの挿入方向に応じて、細胞外または細胞内ループがある。Ｃ末端ドメインは、１５５アミノ酸からなり、これらは、細胞内に位置し、恐らく、細胞周辺腔を占めるペプチドグリカンと接触していると思われる。ＯｍｐＡ融合タンパク質の生成を促進する発現ベクターが作製されている。例えば、Ｈｏｂｏｍら（１９９５， Ｄｅｖ． Ｂｉｏｌ． Ｓｔｒａｎｄ． ８４：２５５−２６２）は、ＯｍｐＡオープンリーディングフレームを含むベクターを開発しており、これは、第３または第４細胞外ループをコードする配列内にリンカーが挿入されている。該ループにより、選択した異種タンパク質のフレーム内挿入が可能になる。
【０１７９】
本発明の一実施形態では、一次エフェクター分子を含むＯｍｐＡ融合タンパク質部分は、周辺細胞質において発現を増強させた。該実施形態の一態様では、融合タンパク質は、成熟前に、シグナル配列、または、一次エフェクター分子もＮ末端に位置するＯｍｐＡの少なくとも１の膜貫通ドメインが続くシグナル配列を含む。シグナル配列は切断され、成熟タンパク質から欠失している。上記実施形態の別の態様では、一次エフェクター分子は、ＯｍｐＡ融合タンパク質のＮ末端にあるため、融合タンパク質が安定している限り、使用したＯｍｐＡの膜貫通ドメインの数は、一次エフェクター分子の位置決定にとって重要ではなくなる。上記実施形態のさらに別の態様では、一次エフェクター分子は、ＯｍｐＡのＮおよびＣ末端ドメインの間に配置し、これによって、可溶性周辺細胞質タンパク質は、周辺細胞質内の周辺細胞質プロテアーゼによる切断の際に、一次エフェクター分子を含有する。この実施形態の特定の態様では、周辺細胞質一次エフェクター分子を発現する細菌ベクターは、ＢＰＲも共発現することにより、細菌細胞からのエフェクター分子の放出を増強する。
【０１８０】
本発明の別の実施形態では、一次エフェクター分子を含むＯｍｐＡ融合タンパク質部分は、細胞外細菌表面にある。該実施形態の一態様では、融合タンパク質は、一次エフェクター分子のＮ末端に位置するＯｍｐＡの偶数または奇数の膜貫通ドメインを含む。上記実施形態の別の態様では、一次エフェクター分子をＯｍｐＡの２つの細胞外ループ間に配置して、細菌細胞による腫瘍細胞への表示を達成する。具体的実施形態では、本発明は、細菌細胞外表面に位置するエフェクター分子融合タンパク質の発現プラスミドを提供する。例えば、Ｔｒｃ（ｌｐｐ）ｏｍｐＡと称されるプラスミドは、切断型ｏｍｐＡ膜貫通配列に融合したｔｒｃプロモーター駆動リポポリタンパク質（ｌｐｐ）アンカー配列を含む。別の例として、上記プラスミドは、ＴｒｃｏｍｐＡと称し、ｔｒｃプロモーター駆動ｏｍｐＡコードシグナル配列を含む。このようなプラスミドは、本発明の１以上のエフェクター分子をコードする核酸を含むように構築することができる。
【０１８１】
場合に応じて、エフェクター分子は、腫瘍に豊富に存在するメタロプロテアーゼまたはセリンプロテアーゼの共通切断部位に先行されるか、もしくは該部位と隣接させることにより、腫瘍環境にエフェクター分子の放出を起こす。一次エフェクター分子が、プロテアーゼ切断部位に先行されるか、隣接させるかは、それぞれ、融合タンパク質内の末端に位置するか、内部に位置するかによる。
【０１８２】
同様の融合タンパク質は、ＯｍｐＡに関して前述した戦略を使用し、任意のＯｍｐ様タンパク質と構築することができる。このような融合タンパク質の構築に際して、当業者には明らかなように、エフェクター分子に融合させるＯｍｐ様タンパク質部分の選択は、エフェクター分子の発現のために望ましい位置（例えば、周辺細胞質に、細胞外に、膜に結合して等）に応じて異なる。一次エフェクター分子に関して、本明細書に記載したこのようなタンパク質構築は、二次エフェクター分子に対しても適切である。
【０１８３】
好ましい実施形態では、エフェクター分子はフェリーペプチドに融合させる。融合タンパク質に用いられるフェリーペプチドは、その生成または導入の拡散範囲（ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ ｌｉｍｉｔｓ）内で、実質的にあらゆる細胞へ、目的とするポリペプチドまたはペプチドの送達を促進することが明らかにされている（例えば、Ｂａｙｌｅｙ， １９９９， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １７：１０６６−１０６７；Ｆｅｒｎａｎｄｅｚら、１９９８， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １６：４１８−４２０；およびＤｅｒｏｓｓｉら、１９９８， Ｔｒｅｎｄｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．８：８４−８７）。従って、弱毒化腫瘍標的細菌が、フェリーペプチドおよびエフェクター分子を含む融合タンパク質を発現するように、該細菌を操作することにより、エフェクター分子が腫瘍細胞によって取り込まれる能力を増強する。具体的実施形態では、弱毒化腫瘍標的細菌は、フェリーペプチドおよびエフェクター分子を含む融合タンパク質をコードする核酸を発現するように操作する。別の実施形態では、弱毒化腫瘍標的細菌は、フェリーペプチドおよびエフェクター分子を含む１以上の融合タンパク質をコードする１以上の核酸分子を発現するように操作する。これらの実施形態によれば、エフェクター分子は、一次または二次エフェクター分子でよい。フェリーペプチドの例として、限定するものではないが、ＨＩＶ ＴＡＴタンパク質に由来するペプチド、アンテナペディアホメオドメイン（ペネトラキシン）、カポジ繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）膜移行性配列（ＭＴＳ）、単純ヘルペスウイルスＶＰ２２、ポリヒスタジン（例えば、ヘキサヒスタジン；６Ｈ）、ポリリシン（例えば、ヘキサリシン；６Ｋ）およびポリアルギニン（例えば、ヘキサアルギニン；６Ｒ）（例えば、Ｂｌａｎｋｅら、１９９６， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９３：８４３７−８４４２）が挙げられる。
【０１８４】
別の好ましい実施形態では、融合タンパク質は、シグナルペプチド、フェリーペプチドおよびエフェクター分子を含む。この実施形態の具体的態様では、弱毒化腫瘍標的細菌は、シグナル配列、フェリーペプチドおよびエフェクター分子を含む１以上の融合タンパク質をコードする１以上の核酸分子を発現するように操作する。この態様によれば、エフェクター分子は、一次または二次エフェクター分子でよい。
【０１８５】
別の好ましい実施形態では、融合タンパク質は、弱毒化腫瘍標的細菌により固形腫瘍癌に送達するための、シグナルペプチド、タンパク質分解切断部位、フェリーペプチドおよびエフェクター分子を含む。具体的実施形態では、弱毒化腫瘍標的細菌は、シグナル配列、タンパク質分解切断部位、フェリーペプチドおよびエフェクター分子を含む１以上の融合タンパク質をコードする１以上の核酸分子を発現するように操作する。この態様によれば、エフェクター分子は、一次または二次エフェクター分子でよい。
【０１８６】
非制限的例として、コリシン活性は、ＨＩＶ ＴＡＴ、単純ヘルペスウイルスＶＰ２２、アンテナペディア、６Ｈ、６Ｋおよび６Ｒに由来する取り込み用ペプチドを添加することにより増強することができる。融合は、Ｃ末端、Ｎ末端または内部のいずれにおいても可能である。内部での融合は、Ｎ末端シグナル配列切断ペプチドの後に融合が続く場合、特に好ましい。融合タンパク質は、さらに、ＯｍｐＡ等のＮ末端シグナル配列、またはｈｌｙＡ等のＣ末端シグナル配列を含む。
【０１８７】
好ましい実施形態では、エフェクター分子を毒素の送達部分に融合させる。様々な毒素が、自己送達能力を有することで知られており、その際、毒素の一部分が、毒素の第２部分の送達因子として働く。例えば、Ｂａｌｌａｒｄら（１９９６， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ　９３：１２５３１−１２５３４）は、哺乳動物細胞の細胞質ゾルコンパートメントへの致死因子（ＬＦ）および浮腫因子のエントリーを媒介する炭疽（ａｎｔｈｒａｘ）保護剤（ＰＡ）が、ＬＦの切断型（ＬＦｎ；２５５アミノ酸残基）へのタンパク質融合物のエントリーも媒介できることを明らかにした。従って、本発明のエフェクター分子は、細胞の外部で機能するものを除き、ＬＦｎ、またはその他の毒素系（限定するものではないが、ジフテリア毒素Ａ鎖残基１−１９３等）（Ｂｌａｎｋｅら、１９９６， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ／ Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９３：８４３７−８４４２）、コレラ毒素、ベロ毒素、大腸菌熱不安定性毒素（ＬＴ）、大腸菌熱安定性毒素（ＳＴ）、腸溶血素、エンテロトキシン、細胞毒素、ＥａｇｇＥＣ安定性毒素１（ＥＡＳＴ）、ＣＮＦ、細胞致死性膨張毒素、α溶血素、β溶血素、およびＳｈｅＡ溶血素に融合することができる（詳しくは、例えば、Ｏ’ＢｒｉｅｎおよびＨｏｌｍｅｓ， １９９６， Ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｏｘｉｎｓ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ａｎｄ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ． Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｎｅｉｄｈａｒｄｔら（編）， ＡＳＭ Ｐｒｅｓｓ， ワシントンＤ．Ｃ．， ｐｐ２７８８−２８０２参照）。具体的実施形態では、一次エフェクター分子を毒素の送達部分に融合する。別の具体的実施形態では、二次エフェクター分子を毒素の送達部分に融合する。
【０１８８】
細菌内で発現させるための融合タンパク質の構築は、当業者には公知であり、このような方法は、本発明の範囲に含まれる（例えば、Ｍａｋｒｉｄｅｓ， Ｓ．， １９９６， Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｒｅｖｓ ６０：５１２−５３８を参照。尚、この文献は、参照により本明細書にその全文を組み入れる）。
【０１８９】
５．６ 　発現運搬体
本発明は１以上の一次エフェクター分子および１以上の任意の二次エフェクター分子をコードするよう設計された弱毒化腫瘍標的細菌を提供する。本発明はプラスミドまたはトランスフェクト可能な核酸にコードされるエフェクター分子を含んでなる弱毒化腫瘍標的細菌を提供する。本発明の好ましい実施形態では、弱毒化腫瘍標的細菌はサルモネラ菌である。サルモネラ菌などの弱毒化腫瘍標的細菌において２以上のエフェクター分子（例えば、一次または二次）が発現される場合には、エフェクター分子は同一のプラスミドもしくは核酸にコードされていてもよいし、または２以上のプラスミドもしくは核酸分子にコードされていてもよい。本発明はまた細菌ゲノムに組み込まれた核酸分子にコードされるエフェクター分子を含んでなる弱毒化腫瘍標的細菌も提供する。組み込まれるエフェクター分子はサルモネラ菌などの弱毒化腫瘍標的細菌の内生のものであってもよいし、またはエフェクター分子をコードする核酸分子が弱毒化腫瘍標的細菌のゲノムに組み込まれるように、弱毒化腫瘍標的細菌に導入してもよい（例えば、プラスミド、トランスフェクト可能な核酸、トランスポゾンなどのようなエフェクター分子をコードする核酸の導入による）。本発明の好ましい実施形態では、弱毒化腫瘍標的細菌はサルモネラ菌である。本発明は適当なプロモーターに機能的に連結されている、エフェクター分子をコードする核酸分子を提供する。エフェクター分子をコードする核酸分子に機能的に連結されているプロモーターは同種（すなわち、天然のもの）または異種（すなわち、エフェクター分子をコードする核酸分子に対して天然のものでない）であってもよい。
【０１９０】
本発明のエフェクター分子をコードするヌクレオチド配列またはその機能的に活性な類似体もしくは断片もしくはその他の誘導体は、挿入されたタンパク質をコードする配列の転写および翻訳のための必須エレメントを含む適当な発現運搬体、例えばプラスミドに挿入してもよい。必須転写および翻訳シグナルはエフェクター分子および／またはそのフランキング領域によって供給されてもよい。あるいは、発現運搬体は、ＤＮＡ操作の分野で公知の種々の方法の１つを用いて、所望のタンパク質をコードする構造ＤＮＡ配列を、好適な翻訳開始および終結シグナルとともに、機能性プロモーターと機能可能な読み取り相で挿入することによって構築する。概論として、Ｓａｍｂｒｏｏｋら， １９８９， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ； Ａｕｓｕｂｅｌら， １９９５， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹを参照。これらの方法はｉｎ ｖｉｔｒｏ組換えＤＮＡおよび合成技術およびｉｎ ｖｉｖｏ組換え（遺伝子組換え）を含み得る。本発明は適当なプロモーターに機能的に連結されている、エフェクター分子をコードする核酸分子を提供する。
【０１９１】
本発明はまた１以上の融合タンパク質および１以上の任意のエフェクター分子をコードするよう改変された弱毒化腫瘍標的細菌も提供する。本発明はプラスミドまたはトランスフェクト可能な核酸にコードされる融合タンパク質を含んでなる弱毒化腫瘍標的細菌を提供する。サルモネラ菌などの弱毒化腫瘍標的細菌において２以上の融合タンパク質および／またはエフェクター分子（例えば、一次または二次）が発現される場合には、融合タンパク質および／もしくはエフェクター分子は同一のプラスミドもしくは核酸にコードされていてもよいし、または２以上のプラスミドもしくは核酸にコードされていてもよい。本発明はまた細菌ゲノムに組み込まれた核酸にコードされる融合タンパク質を含んでなる弱毒化腫瘍標的細菌も提供する。本発明はまた適当なプロモーターに機能的に連結されている融合タンパク質をコードする核酸分子も提供する。本発明の融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、挿入されたタンパク質をコードする配列の転写および翻訳のための必須エレメントを含む適当な発現運搬体、例えばプラスミドに挿入してもよい。
【０１９２】
本発明のある特定の実施形態では、本発明の発現運搬体はプラスミドである。当業者には多数の好適なプラスミドが知られており、また市販のものを入手して本発明の組換え構築物を作製することもできる。
【０１９３】
かかる市販のプラスミドとしては、例えば、ｐＫＫ２２３−３（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｆｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ， Ｕｐｐｓａｌａ， Ｓｗｅｄｅｎ）およびＧＥＭ１（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｂｉｏｔｅｃ， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ， ＵＳＡ）が挙げられる。これらのｐＢＲ３２２「基幹」部分を適当なプロモーターおよび発現されるべき構造配列と組み合わせる。ｐＢＲ３２２は低コピー数プラスミドであると考えられている。高レベルの発現を望む場合には、プラスミドは高コピー数プラスミド、例えば、ｐＵＣ基幹を含むプラスミドであってもよい。ｐＵＣプラスミドとしては、限定されるものではないが、ｐＵＣ１９（例えば、Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎら， １９８５， Ｇｅｎｅ ３３：１０３−１１９参照）およびｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）が挙げられる。
【０１９４】
以下のプラスミドが例として挙げられ、本発明の方法とともに使用できる。細菌性：ｐＢｓ、ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔ、ｐｈｉＸ１７４、ｐｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ、ｐＢｓ ＫＳ、ｐＮＨ８ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８ａ、ｐＮＨ４６ａ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）；ｐＴｒｃ９９Ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）。ｐＢＲ３２２「基幹」を含む市販のプラスミド、例えば、ｐＫＫ２２３−３（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｆｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ， Ｕｐｐｓａｌａ， Ｓｗｅｄｅｎ）およびＧＥＭ１（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｂｉｏｔｅｃ， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ， ＵＳＡ）も使用できる。これらを適当なプロモーターおよび発現されるべき構造配列と組み合わせる。ｐＣＥＴ、ｐＴＳ（本明細書の第６節に記載されるような）。
【０１９５】
本発明の特定の実施形態では、エフェクター分子をコードするプラスミドは本明細書の第６節に記載されるｐＴＳ−ＴＮＦ−αプラスミド、ｐＴＳ−ＢＲＰプラスミド、またはｐＴＳ−ＢＲＰＴＮＦ−αプラスミドである。
【０１９６】
本発明の特定の実施形態では、ＯｍｐＡシグナル配列および一次エフェクタータンパク質を含んでなる、細胞膜周辺腔への分泌のための本発明の融合タンパク質はプラスミドｐＩＮ−ＩＩＩ−ｏｍｐＡ−Ｈｉｎｄにコードされており、これは一次エフェクター分子のコード配列がクローニングされ得るリンカー配列の上流にｏｍｐＡシグナル配列をコードするＤＮＡ配列を含む。好ましい特定の実施形態では、ｐＩＮ−ＩＩＩ−ｏｍｐＡ−Ｈｉｎｄベクターのｌａｃ誘導性プロモーターをｐｅｐＴまたはｔｅｔプロモーターで置換する（Ｒｅｎｔｉｅｒ−Ｄｅｌｒｕｅら（１９８８）， Ｎｕｃ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １６：８７２６参照）。
【０１９７】
本発明はまたエフェクター分子のトランスポゾン媒介性染色体組込みを提供する。本発明の方法には、エフェクター分子をコードする核酸がトランスポゾンカセット中に構築され得る限り、当技術分野で公知のいずれのトランスポゾンプラスミドを用いてもよい。例えば、本発明はトランスポゾンまたはミニトランスポゾンおよびＭＣＳを含んでなるトランスポゾンプラスミドを提供する。
【０１９８】
本発明のある実施形態では、本発明のプラスミドはトランスポゾンプラスミドである、すなわち、注目されるエフェクター分子をコードする配列が挿入されたトランスポゾンを含んでなる。トランスポゾンプラスミドはトランスポゾンカセットを含み、このカセットが細菌ゲノムに組み込まれる。従って、エフェクター分子またはその融合タンパク質をコードする核酸をトランスポゾンカセットに挿入する。このようにして、トランスポゾン挿入によりそのカセットが細菌ゲノムに組み込まれる。エフェクター分子のコード配列はプロモーターに機能的に連結していてもよいし、またはプロモーターなしでもよい。後者の場合には、選択マーカーの発現は細菌ゲノムへのトランスポゾン挿入部位にあるプロモーターによってなされる。トランスポゾンが挿入された細菌のコロニーを本発明の要件に一致する発現レベルについて、例えば、腫瘍の細胞傷害性、静止、退縮を増強するのに十分なレベルのサイトカインを発現するものをスクリーニングする。
【０１９９】
ある実施形態では、トランスポゾンプラスミドがトランスポゾンの他に、トランスポゾンの逆位反復配列の外側に、トランスポゾンとともに運ばれることなく、トランスポゾンの細菌ゲノムへの挿入を触媒するトランスポザーゼ遺伝子を含んでなり、そのようにして安定なトランスポゾン挿入を有する細菌菌株を作製する。
【０２００】
本発明に利用されるトランスポゾンとしては、限定されるものではないが、Ｔｎ７、Ｔｎ９、Ｔｎ１０およびＴｎ５が挙げられる。好ましい実施形態では、トランスポゾンプラスミドはＴｎ１０挿入エレメントの外側に位置するアンピシリン耐性遺伝子を有するｐＮＫ２８８３（ＡＴＣＣ）であり、１以上のエフェクター分子をコードする核酸が２個のＴｎ１０挿入エレメントの間（例えば、トランスポゾンカセット内）に挿入されている。好ましくは、構築物はその他のエレメントをコードするさらなる配列が２個のＴｎ１０挿入エレメントの間に挿入されるように作製する。特定の実施形態では、かかるエレメントは所望により（１）プラスミドを含む細菌の陽性選抜のための選択マーカー（例えば、ＳｅｒＣ、ＡｒｏＡなど）のプロモーターのないコピー；（２）ＢＲＰ遺伝子、（３）１以上の一次エフェクター分子（ＴＮＦ−α、またはその融合タンパク質、例えば、Ｏｍｐ−Ａ−ＴＮＦ−α融合物など）をコードする核酸に機能的に連結されたエフェクター分子（ｔｒｃなど）のプロモーター、（４）１以上のエフェクター分子をコードする核酸のターミネーターを含んでもよい。
【０２０１】
ある実施形態では、必要に応じてプラスミドを操作し、プラスミドにコードされるアンピシリン耐性特性を用いて所望の構築物を有するクローンを選抜した後、プラスミドの喪失によって抗生物質選抜が除去され、ヒト患者への投与のための染色体トランスポゾン挿入部分を有する菌株を選択する（例えば、選択培地にプレーティングすることによる）。
【０２０２】
もう１つの特定の実施形態では、標的特異性が変化したトランスポザーゼ遺伝子およびプロモーターのないｓｅｒＣ遺伝子のコード配列およびＭＣＳを含むミニトランスポゾンを含んでなるプラスミドｐＴＳを用いる。もう１つの特定の実施形態では、標的特異性が変化したトランスポザーゼ遺伝子およびプロモーターのないｓｅｒＣ遺伝子のコード配列、およびアルキル化剤誘導性バクテリオシン放出因子およびＭＣＳを含むミニトランスポゾンを含んでなるプラスミドｐＴＳ−ＢＲＰを用いる。
【０２０３】
好ましい実施形態では、トランスポゾン媒介性染色体組込み体の選抜のためのトランスポゾンプラスミドは以下を含んでなる：
ａ）トランスポゾン挿入配列の外側に（例えば、トランスポゾンカセットの外側に）位置するトランスポゾン切り出しおよび組込みのためのトランスポザーゼ遺伝子；
ｂ）細菌菌株において欠失した選択遺伝子（例えば、ｓｅｒＣ）に相当する野生型コード配列ならびにリボソーム結合部位および野生型遺伝子のターミネーター（ただし、プロモーターは欠く）。この配列は好ましくは左側のＴＮ１０トランスポゾン挿入配列の直後に位置する；
ｃ）所望により、右側および左側の挿入配列の間が放出増強核酸（例えば、ＢＲＰ）をコードする核酸配列である；ならびに
ｄ）右側および左側の挿入配列の間に位置し、プラスミド内に唯一の制限部位を複数含む、エフェクター分子の組込みのためのマルチプルクローニング部位（ＭＣＳ）。ＭＣＳは好ましくは放出増強核酸の直後（使用する場合には）、かつ、右側のＴＮ１０挿入配列の直前に位置する。
【０２０４】
もう１つの実施形態では、宿主染色体へのエフェクター分子のランダムな組込みに起因する遺伝子破壊により、エフェクター挿入の遺伝子位置の適性を確認する。
【０２０５】
さらにもう１つの実施形態では、発現運搬体は抗生物質選抜を必要としない安定な、すなわち、自己維持される染色体外プラスミドである。限定するものではないひとつの実施例では、自己維持型発現運搬体はサルモネラ病原性プラスミドである。
【０２０６】
例えば、本発明のある実施形態では、プラスミド選抜系をサルモネラ菌などの細菌が失っている機能を提供することで維持し、それに基づいて機能を有するサルモネラ菌をそうでないものから選抜することができる。ある実施形態では、本発明のサルモネラ菌は栄養要求性変異菌株であり、発現プラスミドは変異株すなわち生合成酵素機能が欠けたものを提供する。発現プラスミドを含むサルモネラ菌は細胞を所望の細胞、すなわち、発現プラスミドを含むもののみが代謝できる栄養素を欠く増殖培地で増殖させることで選抜できる。この実施形態の非常に好ましい態様では、最も好ましくはａｓｄ遺伝子の欠失によって、本発明のサルモネラ菌はＤＡＰ（メソ−ジアミノピメリン酸）を不可避に要求する。ＤＡＰはグラム陰性菌の周辺細胞質に存在するペプチドグリカンの構成要素であり、完全な細菌外膜に必要である。ＤＡＰがないと細菌細胞は外膜が完全でないために溶解してしまう。ａｓｄ（β−アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ）遺伝子はＤＡＰ生合成経路中の酵素をコードしている。ａｓｄ機能を欠くグラム陰性菌は培養培地にＤＡＰを供給することで増殖させられる。同種または異種プロモーターに機能しうる形で連結したａｓｄ遺伝子配列を保持するプラスミド、例えば、本発明の発現プラスミドはＤＡＰの不在下でａｓｄ活性を欠くグラム陰性菌を増殖させることで選抜できる（例えば、Ｃｕｒｔｉｓｓ， ＩＩＩの米国特許第５，８４０，４８３号参照）。
【０２０７】
その他の非抗生物質選抜系が当技術分野で知られており、かつ、本発明の範囲内にある。例えば、安定な毒素とあまり安定でない抗毒素を含んでなるプラスミドを利用する選抜系を使用してかかるプラスミドを維持する細菌を選抜してもよい。
【０２０８】
もう１つの実施形態では、発現運搬体は非抗生物質的方法で選抜できる染色体外プラスミド、例えば、コリシンプラスミドである。本明細書において、コリシンプラスミドは最低限コリシン毒素および抗コリシンをコードし（コリシン毒素は抗コリシンよりもより安定である）、その結果、コリシンプラスミドを欠く細菌はいずれもコリシン毒素が継続する結果として死滅する。好ましい実施形態では、コリシン毒素はＣｏｌＥ３の大サブユニットであり、抗コリシンはＣｏｌＥ３の小サブユニットである。
【０２０９】
本発明のその他の実施形態では、発現運搬体はλベクター、より詳しくは溶原性λベクターである。好ましい実施形態では、λベクターを含んでなる細菌宿主は３０℃では機能的であるが３７℃ではそうでない温度感受性λリプレッサーをさらに含んでなる。従って、細菌宿主は３０℃で細菌細胞にとって毒性であり得る一次および／または二次エフェクター分子を発現せずにｉｎ ｖｉｖｏで増殖させ操作できる。細菌菌株の患者への導入の際には、λリプレッサーは正常な体温により不活化され、一次エフェクター分子および所望により二次エフェクター分子の発現が活性化される。
【０２１０】
エフェクター分子または融合タンパク質をコードする核酸配列の発現は、エフェクター分子が組換えＤＮＡ分子で形質転換された細菌において発現されるよう第２の核酸配列によって調節できる。例えば、エフェクター分子の発現は当技術分野で公知のいずれかのプロモーター／エンハンサーエレメントによって制御できる。プロモーター／エンハンサーは同種（すなわち、天然のもの）または異種（すなわち、天然のものでない）であってもよい。細菌におけるエフェクター分子、例えば、サイトカイン、または融合タンパク質の発現を制御するために使用できるプロモーターとしては、限定されるものではないが、β−ラクタマーゼプロモーター（Ｖｉｌｌａ−Ｋａｍａｒｏｆｆら， １９７８， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ７５：３７２７−３７３１）、またはｌａｃプロモーター（ＤｅＢｏｅｒら， １９８３， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ８０：２１−２５；Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ， １９８０， ２４２：７４−９４）などの原核生物プロモーターが挙げられる。本発明に包含されるその他のプロモーターとしては、限定されるものではないが、ｌａｃＩ、ｌａｃＺ、Ｔ３、Ｔ７、ｇｐｔ、λＰ_Ｒ、λＰ_Ｌ、ｔｒｃ、ｐａｇＣ、ｓｕｌＡ、ｐｏｌＩＩ（ｄｉｎＡ）、ｒｕｖ、ｒｅｃＡ、ｕｖｒＡ、ｕｖｒＢ、ｕｖｒＤ、ｕｍｕＤＣ、ｌｅｘＡ、ｃｅａ、ｃａａ、およびｒｅｃＮが挙げられる（例えば、Ｓｃｈｎａｒｒら， １９９１，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ ７３：４２３−４３１参照）。好ましい実施形態では、プロモーターはｔｒｃである（例えば、Ａｍａｎｎら， １９８８， Ｇｅｎｅ ６９：３０１−１５参照）。
【０２１１】
一次エフェクター分子がＳＯＳ応答性プロモーターの制御下で発現されるコリシンである特定の実施形態では、弱毒化細菌菌株をコリシンの発現が増加するようｘ線、紫外線、アルカリ化剤または別のＤＮＡ損傷剤で処理してもよい。例示的ＳＯＳ応答性プロモーターとしては、限定されるものではないが、ｒｅｃＡ、ｓｕｌＡ、ｕｍｕＣ、ｄｉｎＡ、ｒｕｖ、ｕｖｒＡ、ｕｖｒＢ、ｕｖｒＤ、ｌｅｘＡ、ｃｅａ、ｃａａ、ｒｃｃＮなどが挙げられる。
【０２１２】
もう１つの好ましい実施形態では、プロモーターは腫瘍環境において増大した活性を有する、例えば、ｐｅｐＴ遺伝子のＰ１プロモーターなどの腫瘍の嫌気環境により活性化されるプロモーターである。Ｐ１プロモーターの活性化はＦＮＲ転写アクチベーターに依存している（Ｓｔｒａｕｃｈら， １９８５， Ｊ， Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １５６：７４３−７５１）。特定の実施形態では、Ｐ１プロモーターは嫌気条件下でｐｅｐＴ２００プロモーターなどの天然のＰ１プロモーターよりも高レベルで誘導される変異体プロモーターであり、嫌気条件に応じてその活性がＦＮＲではなくＣＲＰ−ｃＡＭＰによって誘導される（Ｌｏｍｂａｒｄｏら， １９９７， Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １７９：１９０９−１９１７）。もう１つの実施形態では、嫌気的に誘導されるプロモーター、例えば、ｐｏｔＡＢＣＤプロモーターを用いる。ｐｏｔＡＢＣＤは嫌気条件下でｐｅｐＴから分岐して発現されるオペロンである。ｐｅｐＴ遺伝子においてこの発現にあずかっているプロモーターは単離されており（Ｌｏｍｂａｒｄｏら， １９９７， Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １７９：１９０９−１９１７）、本発明の方法に従って使用できる。
【０２１３】
あるいは、プロモーターはＴｎ１０トランスポゾンのｔｅｔプロモーターなどの抗生物質誘導性プロモーターであってもよい。好ましい実施形態では、ｔｅｔプロモーターは例えば三倍に多量化されている。次いで、プロモーター活性は本発明の弱毒化腫瘍標的細菌で治療された患者に適当な用量のテトラサイクリンを投与することによって誘導される。ｔｅｔ誘導可能な発現系は最初にスチゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）（Ｆａｒｙａｒ ａｎｄ Ｇａｔｚ， １９９２， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２１：３４５−３４９）および哺乳類細胞（Ｌａｎｇ ａｎｄ Ｆｅｉｎｇｏｌｄ， １９９６， Ｇｅｎｅ １６８：１６９−１７１）などの真核細胞系について記載されたが、最近の研究はその適用を細菌細胞にまで拡げている。例えば、Ｓｔｉｅｇｅｒら（１９９９， Ｇｅｎｅ ２２６：２４３−２５２）はｔｅｔプロモーターに機能しうる形で連結される場合のｔｅｔ誘導でホタルルシフェラーゼ遺伝子の８０倍の誘導を示した。このプロモーターの利点は極めて低いレベルのテトラサイクリン、すなわち抗生物質活性に必要とされる用量の約１／１０で誘導されるということである。
【０２１４】
ひとたび、エフェクター分子または融合タンパク質を含んでなるプラスミドを構築し、弱毒化腫瘍標的細菌に導入すれば、エフェクター分子発現または融合タンパク質発現は、限定するものではないが、生物学的活性、酵素活性、ノーザンブロット解析、およびウェスタンブロット解析をはじめとする当技術分野で公知のいずれかの方法によってアッセイできる（Ｓａｍｂｒｏｏｋら， １９８９， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ； Ａｕｓｕｂｅｌら， １９９５， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ参照）。
【０２１５】
５．７． 　組合せ療法
ある実施形態では、固形癌腫瘍を治療するために弱毒化腫瘍標的細菌をその他の公知の癌療法とともに用いる。あるその他の実施形態では、固形癌腫瘍を治療するために１以上のエフェクター分子および／または融合タンパク質をコードする１以上の核酸分子を発現するよう設計された弱毒化腫瘍標的細菌をその他の公知の癌療法とともに用いる。例えば、１以上のエフェクター分子および／または融合タンパク質をコードする１以上の核酸分子を発現するよう設計された弱毒化腫瘍標的細菌を化学療法薬とともに使用してもよい。化学療法薬の例としては、限定されるものではないが、シスプラチン、イホスファミド、タキソールおよびパクリタキソールなどのタキサン、トポイソメラーゼＩ阻害剤（例えば、ＣＰＴ−ＩＩ、トポテカン、９−ＡＣ、およびＧＧ−２１１）、ゲムシタビン、ビノレルビン、オキサリプレチン、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、ロイコボリン、ビノレルビン、テモダール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルチシン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトザントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、およびプロマイシン相同物、およびサイトキサンが挙げられる。あるいは、１以上のエフェクター分子および／または融合タンパク質をコードする１以上の核酸分子を発現するよう設計された弱毒化腫瘍標的細菌を放射線療法（例えば、γ線またはｘ線照射）とともに使用してもよい。治療される癌の種類によっていずれの放射線療法プロトコールを用いてもよい。例えば、限定されるものではないが、ｘ線を照射してもよく、特に、深い腫瘍には高エネルギーメガボルト（１ＭｅＶエネルギー以上の照射）を用いてもよく、皮膚癌には電子ビームおよび正中電圧ｘ線照射を用いてもよい。放射線に組織を曝露するためにラジウム、コバルトおよびその他の元素の放射活性アイソトープなどのγ線放射性ラジオアイソトープを投与してもよい。
【０２１６】
本発明は抗癌剤と弱毒化腫瘍標的細菌の逐次または同時投与を含む。本発明は、相加的または相乗的である、抗癌剤と弱毒化腫瘍標的細菌の組み合わせを包含する。
【０２１７】
本発明はまた、異なる作用部位を有する、１以上の抗癌剤と弱毒化腫瘍標的細菌の組み合わせも包含する。かかる組み合わせは、組み合わせが相乗的であろうと相加的であろうと、これらの治療の二重作用に基づいて改善された治療法を提供する。従って、本発明の新規組合せ療法は単一薬剤療法として用いられるいずれかの薬剤よりも向上した効力をもたらす。
【０２１８】
本発明はまた抗癌剤と１以上のエフェクター分子および／または融合タンパク質をコードする１以上の核酸分子を発現するよう設計された弱毒化腫瘍標的細菌との逐次または同時投与を含む。本発明は、相加的であるか相乗的である、抗癌剤と１以上のエフェクター分子および／または融合タンパク質をコードする１以上の核酸分子を発現するよう設計された弱毒化腫瘍標的細菌との組み合わせを包含する。
【０２１９】
本発明はまた、異なる作用部位を有する、１以上の抗癌剤と、１以上のエフェクター分子および／または融合タンパク質をコードする１以上の核酸分子を発現するよう設計された弱毒化腫瘍標的細菌との組み合わせを包含する。かかる組み合わせは、組み合わせが相乗的であろうと相加的であろうと、これらの治療の二重の作用に基づいて改善された治療法を提供する。従って、本発明の新規組合せ療法は単一薬剤療法として用いられるいずれかの薬剤よりも向上した効力をもたらす。
【０２２０】
５．８ 　送達のための方法および組成物
本発明は、宿主に対する毒性を低下させた弱毒化腫瘍標的細菌によって、宿主の全身に送達されれば有毒であり得る１以上の一次エフェクター分子を腫瘍に局所的に送達できる方法を提供する。ある実施形態では、一次エフェクター分子は肉腫、リンパ腫、癌腫、またはその他の固形腫瘍癌を治療するのに有用である。ある限定するものではない実施形態では、エフェクター分子は腫瘍の部位での局所免疫応答の誘導に有用である。
【０２２１】
本発明によれば、１以上の一次エフェクター分子をコードする核酸分子を含む弱毒化腫瘍標的細菌ベクターおよび所望により１以上の一次エフェクター分子を、固形腫瘍癌を有するヒト患者をはじめとする動物において腫瘍の増殖を阻害するか、腫瘍の容積を減少させるか、または腫瘍細胞の蔓延を防ぐ方法に用いるのが有利である。
【０２２２】
本発明はかかる治療を必要とする動物に、１以上の適当なプロモーターに機能しうる形で連結された１以上の一次エフェクター分子をコードする１以上の核酸分子を含んでなる弱毒化腫瘍標的細菌を含んでなる医薬組成物を投与することを含んでなる、固形腫瘍癌の治療のための１以上の一次エフェクター分子の送達法を提供する。本発明はまたかかる治療を必要とする動物に、１以上の適当なプロモーターに機能しうる形で連結された１以上の一次エフェクター分子および１以上の二次エフェクター分子をコードする１以上の核酸分子を含んでなる弱毒化腫瘍標的細菌を含んでなる医薬組成物を投与することを含んでなる、固形腫瘍癌の治療のための１以上の一次エフェクター分子の送達法を提供する。ある実施形態では、一次エフェクター分子はＴＮＦファミリーのメンバー、細胞傷害性ペプチドまたはポリペプチド、抗血管新生因子、腫瘍阻害酵素、またはその機能的断片である。
【０２２３】
本発明はかかる治療を必要とする動物に、１以上の適当なプロモーターに機能しうる形で連結された本発明の１以上の融合タンパク質をコードする１以上の核酸分子を含んでなる弱毒化腫瘍標的細菌を含んでなる医薬組成物を投与することを含んでなる、固形腫瘍癌の治療のための本発明の１以上の融合タンパク質の送達法を提供する。本発明はまたかかる治療を必要とする動物に、１以上の適当なプロモーターに機能しうる形で連結された本発明の１以上の融合タンパク質および１以上のエフェクター分子をコードする１以上の核酸分子を含んでなる弱毒化腫瘍標的細菌を含んでなる医薬組成物を投与することを含んでなる、固形腫瘍癌の治療のための本発明の１以上の融合タンパク質および１以上のエフェクター分子の送達法を提供する。
【０２２４】
好ましい実施形態では、弱毒化腫瘍標的細菌はサルモネラ菌である。もう１つの実施形態では、弱毒化腫瘍標的細菌は増強された放出系を含んでなる。好ましい実施形態では、動物は哺乳類である。高度に好ましい実施形態では、動物はヒトである。
【０２２５】
本発明はまたサルモネラ菌などの弱毒化腫瘍標的細菌によって送達される、１以上の一次エフェクター分子と所望により１以上の二次エフェクター分子の組み合わせ送達を提供する。本発明はまた１以上の異なる一次エフェクター分子および／または所望により１以上の異なる二次エフェクター分子を保持する、異なる弱毒化腫瘍標的細菌の組み合わせ送達も提供する。
【０２２６】
本発明はまたサルモネラ菌などの弱毒化腫瘍標的細菌により送達される、本発明の１以上の融合タンパク質の送達を提供する。本発明はまた、サルモネラ菌などの弱毒化腫瘍標的細菌によって送達される、本発明の１以上の融合タンパク質と所望により本発明の１以上のエフェクター分子の組み合わせ送達を提供する。本発明はまた１以上の異なる融合タンパク質および／または所望により１以上の異なるエフェクター分子を保持する、異なる弱毒化腫瘍標的細菌の組み合わせ送達を提供する。
【０２２７】
固形腫瘍としては、限定されるものではないが、肉腫、癌腫および限定されるものではないが生殖細胞系腫瘍、中枢神経系の腫瘍、乳癌、前立腺癌、子宮頸癌、子宮癌、肺癌、卵巣癌、精巣癌、甲状腺癌、星状細胞腫、神経膠腫、膵臓癌、胃癌、肝臓癌、大腸癌、黒色腫、腎臓癌、膀胱癌、および中皮腫をはじめとするその他の固形腫瘍癌が挙げられる。患者は好ましくは、限定されるものではないが、ウシ、ブタ、ニワトリ、イヌ、ネコ、ウマなどのような動物をはじめとする動物であり、好ましくは哺乳類であり、最も好ましくはヒトである。本明細書において、固形腫瘍の治療とは、限定されるものではないが、腫瘍増殖を阻害すること、腫瘍細胞増殖を阻害すること、腫瘍容積を減少させること、または腫瘍細胞の身体のその他の部分への蔓延（転移）を阻害することを含む。
【０２２８】
本発明は医薬上許容される担体および１以上の適当なプロモーターに機能しうる形で連結された１以上の一次エフェクター分子をコードする１以上の核酸分子を含んでなる弱毒化腫瘍標的細菌を含んでなる医薬組成物を提供する。本発明は医薬上許容される担体ならびに１以上の適当なプロモーターに機能しうる形で連結された１以上の一次エフェクター分子および１以上の二次エフェクター分子をコードする１以上の核酸分子を含んでなる弱毒化腫瘍標的細菌を含んでなる医薬組成物を提供する。
【０２２９】
本発明は医薬上許容される担体および１以上の適当なプロモーターに機能しうる形で連結された本発明の１以上の融合タンパク質をコードする１以上の核酸分子を含んでなる弱毒化腫瘍標的細菌を含んでなる医薬組成物を提供する。本発明は医薬上許容される担体ならびに１以上の適当なプロモーターに機能しうる形で連結された本発明の１以上の融合タンパク質および１以上のエフェクター分子をコードする１以上の核酸分子を含んでなる弱毒化腫瘍標的細菌を含んでなる医薬組成物を提供する。
【０２３０】
本発明はまた医薬上許容される担体および弱毒化腫瘍標的細菌を含んでなる医薬組成物も提供する。本発明はまた医薬上許容される担体ならびに１以上の一次エフェクター分子および所望により１以上の二次エフェクター分子を含んでなる弱毒化腫瘍標的細菌を含んでなる医薬組成物も提供する。かかる組成物は治療上有効な量の、１以上の一次エフェクター分子および所望により１以上の二次エフェクター分子を含んでなる弱毒化腫瘍標的サルモネラ菌ベクターならびに医薬上許容される担体を含んでなる。本発明はまた医薬上許容される担体ならびに本発明の１以上の融合タンパク質および所望により１以上のエフェクター分子を含んでなる弱毒化腫瘍標的サルモネラ菌を含んでなる医薬組成物も提供する。かかる組成物は治療上有効な量の、本発明の１以上の融合タンパク質および所望により１以上のエフェクター分子を含んでなる弱毒化腫瘍標的サルモネラ菌ベクターならびに医薬上許容される担体を含んでなる。
【０２３１】
特定の実施形態では、「医薬（製薬）上許容される」とは、連邦または州政府の監督官庁によって承認された、または米国薬局方もしくは動物、より詳しくはヒトに使用するためのその他の一般に認められた薬局方に記載されていることを意味する。「担体」とはそれとともに治療薬が投与される希釈剤、佐剤、賦形剤、またはビヒクルを指す。かかる医薬担体は水および、ピーナッツ油、ダイズ油、無機油、ゴマ油、オリーブ油などのような石油、動物、植物からのまたは合成起源のものをはじめとする油などの滅菌液体であってよい。医薬組成物が静脈投与される場合には生理食塩水が好ましい担体である。また、生理食塩水溶液および水性デキストロースおよびグリセロール溶液は特に注射用溶液のための液体担体として使用できる。好適な医薬賦形剤としてはデンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、胡粉、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、グリセロールモノステアレート、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレングリコール、水、エタノールなどが挙げられる。組成物は所望により少量の湿潤剤または乳化剤、またはｐＨ緩衝剤を含んでもよい。これらの組成物は溶液、懸濁液、エマルション、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、徐法性製剤などの形態をとり得る。経口製剤は医薬等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどのような標準的な担体を含み得る。好適な医薬担体の例はＥ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎによる「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」に記載されている。かかる組成物は治療上有効な量の、精製された形態の治療用の弱毒化腫瘍標的細菌を、患者への適当な投与のための形態を提供する好適な量の担体とともに含む。製剤は投与様式に適合するべきである。
【０２３２】
好ましい実施形態では、組成物は慣例の手順に従ってヒト生命体への静脈投与に合わせた医薬組成物として処方される。典型的には、静脈投与用組成物は滅菌等張水性バッファー中の溶液である。必要であれば、組成物はまた沈殿防止剤および注射部位で痛みを和らげるにはリグノカインなどの局所麻酔剤を含んでもよい。一般に、成分は個別にまたは混合して単位用量形態で、例えば、有効薬剤の量を示すアンプルまたはサッシェなどの密閉容器中の凍結乾燥散剤または水を含まない濃縮物として供給される。組成物を点滴によって投与する場合には、滅菌医薬等級水または生理食塩水を含む点滴ボトルで調剤してもよい。組成物を注射によって投与する場合には、成分を投与前に混合できるよう注射用滅菌水または生理食塩水のアンプルが提供され得る。
【０２３３】
固形腫瘍癌の治療または予防に有効である本発明の医薬組成物量は癌の性質によって異なり、標準的な臨床技術によって決定できる。さらに、所望により最適な用量範囲を確認するのを補助するためにｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイを使用してもよい。処方に使用される正確な用量は投与経路、および癌の重篤度によっても異なり、開業医の判断および各患者の状況に従って決定されるべきである。しかしながら、一般には、好適な用量範囲は約１．０ｃ．ｆ．ｕ．／ｋｇないし約１×１０^１０ｃ．ｆ．ｕ．／ｋｇ；所望により約１．０ｃ．ｆ．ｕ．／ｋｇないし約１×１０^８ｃ．ｆ．ｕ．／ｋｇ；所望により約１×１０^２ｃ．ｆ．ｕ．／ｋｇないし約１×１０^８ｃ．ｆ．ｕ．／ｋｇ；所望により約１×１０^４ｃ．ｆ．ｕ．／ｋｇないし１×１０^８ｃ．ｆ．ｕ．／ｋｇ；および所望により約１×１０^４ｃ．ｆ．ｕ．／ｋｇないし約１×１０^１０ｃ．ｆ．ｕ．／ｋｇである。有効な用量はｉｎ ｖｉｔｒｏで得られる用量応答曲線または動物モデル試験系から推定できる。
【０２３４】
種々の送達系が知られており、本発明の医薬組成物を投与するために使用できる。導入方法としては、限定されるものではないが、皮内、筋内、腹腔内、静脈内、皮下、くも膜下腔内、鼻腔内、硬膜外、および経口経路が挙げられる。導入方法はまた腫瘍内（例えば、腫瘍領域への直接投与による）であってもよい。
【０２３５】
組成物はいずれの便宜な経路で、例えば、点滴またはボーラス投与によって、上皮または粘膜皮膚（例えば、口腔粘膜、直腸および腸粘膜など）を介する吸収によって投与してもよいし、その他の生物学的に活性な薬剤とともに投与してもよい。投与は全身性であっても局所であってもよい。さらに、本発明の医薬組成物を脳室内およびくも膜下腔内注射をはじめとするいずれかの好適な経路によって中枢神経系に導入することが望ましい場合もあり、脳室内注射は例えば、Ｏｍｍａｙａリザーバーなどのリザーバーに取り付けた脳室内カテーテルによって容易になり得る。肺投与も例えば、吸入器または噴霧器およびエアロゾル化剤を含む処方の使用によって使用できる。
【０２３６】
特定の実施形態では、本発明の医薬組成物を治療を必要とする領域に局所的に投与することが望ましい場合もあり、これは例えば、限定されるものではないが、手術の際の局所注入、カテーテルによる注入、またはシアラスティック（ｓｉａｌａｓｔｉｃ）膜などの膜もしくは繊維をはじめとする多孔性、非多孔性、もしくはゼラチン状物質であるインプラントによって達成できる。ある実施形態では、悪性腫瘍または新生物もしくは新生物発生前組織の部位（または元の部位）に直接注射によって投与し得る。
【０２３７】
１以上の一次エフェクター分子および所望により１以上の二次エフェクター分子を含んでなる弱毒化腫瘍標的細菌は徐放システムで送達できる。本発明の１以上の融合タンパク質および所望により１以上のエフェクター分子を含んでなる弱毒化腫瘍標的細菌も徐放システムで送達できる。ある実施形態では、ポンプを使用する場合もある（Ｌａｎｇｅｒ，上記； Ｓｅｆｔｏｎ，ＣＲＣ Ｃｒｉｔ． Ｒｅｆ． Ｂｉｏｍｅｄ． Ｅｎｇ． １４：２０１（１９８７）； Ｂｕｃｈｗａｌｄら， １９８０， Ｓｕｒｇｅｒｙ ８８：５０７；およびＳａｕｄｅｋ ら， １９８９， Ｎ． Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ． ３２１：５７４参照）。もう１つの実施形態では、高分子材料を使用する場合もある（Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ， Ｌａｎｇｅｒ ａｎｄ Ｗｉｓｅ（編）， ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ．， Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ， Ｆｌｏｒｉｄａ （１９７４）； Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｄｒｕｇ Ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ， Ｄｒｕｇ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ， Ｓｍｏｌｅｎ ａｎｄ Ｂａｌｌ（編）， Ｗｉｌｅｙ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９８４）； Ｒａｎｇｅｒ ａｎｄ Ｐｅｐｐａｓ， Ｊ． Ｍａｃｒｏｍｏｌ． Ｓｃｉ． Ｒｅｖ． Ｍａｃｒｏｍｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２３：６１（１９８３）参照；Ｌｅｖｙら， １９８５， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２８：１９０； Ｄｕｒｉｎｇら， １９８９， Ａｎｎ． Ｎｅｕｒｏｌ． ２５：３５１；およびＨｏｗａｒｄら， １９８９， Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ． ７１：１０５も参照）。さらにもう１つの実施形態では、徐放システムを治療標的、すなわち、全身用量の一部のみを必要とする脳の近くに置くこともできる（例えば、Ｇｏｏｄｓｏｎ， ｉｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ， 上記， ２巻，１１５−１３８頁（１９８４）参照）。
【０２３８】
その他の徐放システムはＬａｎｇｅｒ （１９９０， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７−１５３３）による総説で論じられており、１以上の一次エフェクター分子および所望により１以上の二次エフェクター分子を含んでなる弱毒化腫瘍標的細菌の投与と関連して使用できる。
【０２３９】
本発明はまた本発明の医薬組成物の１以上の成分を充填した１以上の容器を含んでなる医薬パックまたはキットを提供する。かかる容器に関しては、随意的に、医薬品または生物学的製品の製造、使用または販売を規制する政府機関によって指示される形の通知がある場合もあり、この通知はヒト投与のための製造、使用または販売に関する機関による承認を反映している。
【０２４０】
本発明はまた本発明の医薬組成物および少なくとも１種のその他の既知の癌治療をそれを必要とする動物に投与することを含んでなる固形腫瘍の治療法を提供する。特定の実施形態では、固形腫瘍癌の動物に本発明の医薬組成物および少なくとも１種の化学療法薬を投与する。化学療法薬の例としては、限定されるものではないが、シスプラチン、イホスファミド、タキソールおよびパクリタキソールなどのタキサン、トポイソメラーゼＩ阻害剤（例えば、ＣＰＴ−ＩＩ、トポテカン、９−ＡＣおよびＧＧ−２１１）、ゲムシタビン、ビノレルビン、オキサリプラチン、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、ロイコボリン、ビノレルビン、テモダール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルチシン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、およびプロマイシン相同物、およびサイトキサンが挙げられる。
【０２４１】
本発明は本発明の医薬組成物と化学療法薬などの抗癌剤の逐次または同時投与を含む。特定の実施形態では、本発明の医薬組成物を抗癌剤の投与前に（例えば、２時間、６時間、１２時間、１日、４日、６日、１２日、１４日、１ヶ月または数ヶ月前）投与する。もう１つの特定の実施形態では、本発明の医薬組成物を抗癌剤の投与後に（例えば、２時間、６時間、１２時間、１日、４日、６日、１２日、１４日、１ヶ月または数ヶ月後）投与する。特定の実施形態では、本発明の医薬組成物を抗癌剤と同時に投与する。本発明は、相加的または相乗的である、抗癌剤と１以上のエフェクター分子および／または融合タンパク質をコードする１以上の核酸分子を発現するよう設計された弱毒化腫瘍標的細菌の組み合わせを包含する。
【０２４２】
本発明はまた、異なる作用部位を有する、抗癌剤と１以上のエフェクター分子および／または融合タンパク質をコードする１以上の核酸分子を発現するよう設計された弱毒化腫瘍標的細菌の組み合わせも包含する。かかる組み合わせは、組み合わせが相乗的であろうと相加的であろうと、これらの治療の二重の作用に基づいて改善された治療法を提供する。従って、本発明の新規組合せ療法は単一薬剤療法として用いられる薬剤のいずれかよりも向上した効力をもたらす。
【０２４３】
ある実施形態では、固形腫瘍癌の動物に本発明の医薬組成物を投与し、かつ、放射線療法（例えば、γ線またはｘ線照射）で治療する。特定の実施形態では、本発明は放射線療法では効果がないと示されている癌の治療法または予防法を提供する。医薬組成物は放射線療法と同時に投与してもよい。あるいは、放射線療法を本発明の医薬組成物の投与後に、好ましくは医薬組成物の投与の少なくとも１時間、５時間、１２時間、１日、１週間、１ヶ月、より好ましくは数ヶ月（例えば、３ヶ月まで）後に投与してもよい。
【０２４４】
本発明の医薬組成物の投与の前、同時、またはその後に投与される放射線療法は当技術分野で公知のいずれかの方法で投与できる。治療される癌の種類次第でいずれの放射線療法プロトコールを使用してもよい。例えば、限定されるものではないが、ｘ線照射を投与してもよく、特に、深い腫瘍には高エネルギーメガボルト（１ＭｅＶエネルギーより高い照射）を用いてもよく、皮膚癌には電子ビームおよび正中電圧ｘ線照射を用いてもよい。放射線に組織を曝露するためにラジウム、コバルトおよびその他の元素の放射活性アイソトープなどのγ線放射性ラジオアイソトープを投与してもよい。
【０２４５】
さらに、本発明はまた放射線療法があまりにも毒性を示すか、または示し得る、すなわち、治療を受けている患者にとって受け入れられないか、または耐えがたい副作用をもたらす場合に、放射線療法の代替として癌を医薬組成物で治療する方法を提供する。
【０２４６】
５．９ 　本発明の医薬組成物の治療または予防有用性の証明
本発明の医薬組成物はヒトにおける使用に先立って所望の治療または予防活性について好ましくはｉｎ ｖｉｔｒｏで、次いでｉｎ ｖｉｖｏで試験される。例えば、特定の医薬組成物の投与が指示されるかどうか決定するために使用できるｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイとしては、患者組織サンプルを培養で増殖させ、医薬組成物に曝露するか、あるいはこれを投与し、かかる組成物の組織サンプルに対する作用を観察する、ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞培養アッセイが挙げられる。
【０２４７】
本発明の医薬組成物は免疫細胞を試験医薬組成物または対照と接触させ、試験医薬組成物の免疫細胞の生物学的活性を調節する（例えば、増大させる）能力を調べることによって、活性化された免疫細胞を増強するその能力について試験できる。試験組成物の免疫細胞の生物学的活性を調節する能力はサイトカインまたは抗原の発現を検出すること、免疫細胞の増殖を検出すること、シグナル伝達分子の活性化を検出すること、免疫細胞のエフェクター機能を検出すること、または免疫細胞の分化を検出することで評価できる。これらの活性の測定には当業者に公知の技術を使用できる。例えば、細胞増殖は^３Ｈ−チミジン取込みアッセイおよびトリパンブルー細胞計数によってアッセイできる。サイトカインおよび抗原発現は、例えば、限定されるものではないが、ウェスタンブロット、免疫組織化学放射免疫アッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素免疫吸着アッセイ）、「サンドウィッチ」免疫アッセイ、免疫沈降アッセイ、沈降反応、ゲル内沈降反応、免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ、補体結合アッセイ、免疫放射線アッセイ、蛍光免疫アッセイ、タンパク質Ａ免疫アッセイおよびＦＡＣＳ解析などの技術を用いる競合アッセイおよび非競合アッセイ系をはじめとする免疫アッセイによってアッセイできる。シグナル伝達分子の活性化は、例えば、キナーゼアッセイおよび電気移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）によってアッセイできる。Ｔ細胞のエフェクター機能は、例えば、５１Ｃｒ放出アッセイによって測定できる（例えば、Ｐａｌｌａｄｉｎｏら， １９８７， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ， ４７：５０７４−５０７９およびＢｌａｃｈｅｒｅら， １９９３， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ １４：３５２−３５６参照）。
【０２４８】
本発明の医薬組成物は癌を患う動物において腫瘍形成を低下させるその能力について試験できる。本発明の医薬組成物はまた固形腫瘍癌に関係する１以上の症状を軽減するその能力について試験できる。さらに、本発明の医薬組成物は固形腫瘍癌を患う患者の生存期間を延長するその能力について試験できる。当業者に公知の技術を用いて動物における本発明の医薬組成物の機能を分析できる。
【０２４９】
種々の特定実施形態では、固形腫瘍癌に関与する細胞種のうち代表的な細胞を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイを実施し、本発明の医薬組成物がかかる細胞種に対して所望の作用を及ぼすかどうかを調べることができる。
【０２５０】
治療用の本発明の医薬組成物はヒトにおける試験に先立って、限定されるものではないが、ラット、マウス、ニワトリ、ウシ、サル、ブタ、イヌ、ウサギなどをはじめとする好適な動物モデル系で試験できる。ヒトへの投与に先立つｉｎ ｖｉｖｏ試験のために、当技術分野で公知のいずれの動物モデル系を用いてもよい。
【０２５１】
以下の一連の実施例は例示のために示されるのであって、本発明の範囲を限定するものではない。
【０２５２】
６． 実施例：弱毒化腫瘍標的サルモネラ菌による ＴＮＦ− αの発現
以下の実施例は、ＴＮＦファミリーのメンバーをコードする核酸分子を含有する弱毒化腫瘍標的サルモネラ菌などの細菌がＴＮＦファミリーのメンバーを発現できることを証明する。
【０２５３】
６．１ 　 ＴＮＦ− αプラスミドの構築
本明細書に記載されるプラスミドは本発明の特定の実施形態の実施例を示すためのものである。当業者には明らかであろうが、ｔｒｃプロモーターおよび／またはＴＮＦ−αをコードする核酸などのプロモーターおよび／またはエフェクター分子をコードする核酸は当技術分野で公知の方法によってその他の適当なプロモーターまたはエフェクター分子で置換してもよい。
【０２５４】
ｔｒｃプロモーターを用いる、エフェクター分子をコードする核酸のプラスミドに基づく細菌による発現のために、プラスミドＴｒｃ９９Ａ（Ｐｈａｒｍａｃｉａから市販されている）またはＴｒｃＨｉｓＢ（Ｉｎ Ｖｉｔｒｏｇｅｎから市販されている）を用いた。両プラスミドとも開始コドンとしてのＮｃｏＩ部位とそれに続くマルチプルクローニング部位を用いる。
【０２５５】
６．１．１． 　ｐ ＣＥＴ プラスミド
二重λＰ_ＬまたはλＰ_Ｒプロモーターを用いるエフェクター分子をコードする核酸のプラスミドに基づく細菌による発現のために、以下のようにｐＣＥＴプラスミドを構築した。プラスミドｐＣＥ３３（Ｅｌｖｉｎら， １９９０， Ｇｅｎｅ ８７：１２３−１２６）を逐次、制限酵素ＣｌａＩで切断し、ｍｕｎｇ ｂｅａｎヌクレアーゼで平滑末端とし、次いで制限酵素ＢａｍＨＩで切断した。次いで、得られた１．４ｋｂの断片を２．１ｋｂのｐＵＣ１９（ＧＩＢＣＯから市販されている）のＳｓｐＩ／ＢａｍＨＩ断片に結合してプラスミドｐＣＩを作製した。プラスミドｐＣＩを制限酵素ＢａｍＨＩで切断し、ｍｕｎｇ ｂｅａｎヌクレアーゼで平滑末端とし、次いで制限酵素ＡｆｌＩＩＩで切断した。得られた３．１ｋｂのバンドを単離した。プラスミドＴｒｃＨｉｓＢを制限酵素ＣｌａＩで部分消化し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端とし、次いでＡｆｌＩＩＩで切断した。次いで、得られたミニシストロンおよびターミネーターを含む０．６ｋｂのバンドを３．１ｋｂのｐＣＩ断片に結合してプラスミドｐＣＥＴを得た。ｐＣＥＴは、Ｔｒｃ９９ＡまたはＴｒｃＨｉｓＢと同様に、開始コドンとしてのＮｃｏＩ部位とそれに続くＴｒｃＨｉｓＢマルチプルクローニング部位を用いる。λＰ_ＬまたはλＰ_Ｒプロモーターを含むいずれかのプラスミドを保持する細菌を３０℃で増殖させた。
【０２５６】
６．１．２． 　 ｐＴＳ プラスミド
トランスポゾン媒介性染色体組込みおよびエフェクター分子をコードする核酸のセリン原栄養性選抜を行う、ｐＴＳと示されるプラスミドを以下のように構築した。プラスミドｐＮＫ２８８３（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から市販されている）を制限酵素ＢａｍＨＩで切断し、４．８ｋｂのバンドを単離した。配列ＧＡＡＧＡＴＣＴＴＣＣＧＧＡＧＧＡＧＧＧＧＡＡＡＴＧ（配列番号１）からなる正プライマーおよび配列ＣＧＧＧＡＴＣＣＧＡＧＣＴＣＧＡＧＧＧＣＣＣＧＧＧＡＡＡＧＧＡＴＣＴＡＡＧＡＡＧＡＴＣＣ（配列番号２）からなる逆プライマーを用いるＰＣＲによってネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）株１４０２８（ＡＴＣＣから市販されている）からネズミチフス菌ｓｅｒＣをコードする核酸を単離した。ＰＣＲ反応混合物を制限酵素ＢｇｌＩＩおよびＢａｍＨＩで切断し、１．１ｋｂのＰＣＲ産物を単離して４．８のｐＮＫ２８８３断片に結合してｐＴＳと示されるプラスミドを得た。ｓｅｒＣをコードする核酸のすぐ３’側にエフェクター分子をコードする核酸の挿入のためのクローニング部位が存在した。
【０２５７】
６．１．３． 　 ｐＴＳ−ＴＮＦ− αプラスミド
ｔｒｃプロモーターによって制御されるヒトＴＮＦ−αをコードする核酸のｐＴＳ媒介性染色体組込みのために、プラスミド（ｐＴＳ−ＴＮＦ−α）を以下のように構築した。プラスミドＰＹＡ３３３２は、複製開始点がｃｏｌＥ１プラスミド（例えば、ＢａｚａｒａｌおよびＨｅｌｓｉｎｋｉ， １９７０， Ｂｉｏｃｈｅｍ ９：３９９−４０６参照）の複製開始点で置換されているＡＳＤプラスミドＰＹＡ２７２である（例えば、Ｃｕｒｔｉｓｓ，ＩＩＩの米国特許第５，８４０，４８３号参照）。プラスミドＰＹＡ３３３２を制限酵素ＮｃｏＩで切断し、ｍｕｎｇ ｂｅａｎヌクレアーゼで平滑末端とした。次いで、平滑末端とした断片を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで切断して３．３ｋｂのＤＮＡ断片を単離した。次いで、図１に示される大腸菌最適化ヒトＴＮＦ−αをコードする核酸（Ｐｅｎｎｉｃａら， １９８４ Ｎａｔｕｒｅ ３１２：７２４−７２９；およびＳａｌｚｔｍａｎら， １９９６， Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ １１：１４５−１５３参照）を制限酵素ＮｄｅＩで切断し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端とし、次いで、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで切断した。得られた０．５ｋｂの断片を３．３ｋｂのＰＹＡ３３３２断片に結合してプラスミドＡｓｄ３４ＴＮＦ−αを得た。次いで、Ａｓｄ３４ＴＮＦ−αを制限酵素ＢｇｌＩＩで切断し、ｔｒｃプロモーターによって制御されるＴＮＦ−αをコードする核酸をコードする１．１ｋｂの断片をｐＴＳのＢａｍＨＩ部位に結合してプラスミドｐＴＳ−ＴＮＦ−αを得た。
【０２５８】
６．１．４． 　 ｐＴＳ−ＢＲＰ プラスミド
ＢＲＰをコードする核酸のトランスポゾン媒介性染色体組込みおよびエフェクター分子をコードする核酸のセリン原栄養性選抜を行う、ｐＴＳ−ＢＲＰと示されるプラスミドを以下のように構築した。配列ＣＣＧＡＣＧＣＧＴＴＧＡＣＡＣＣＴＧＡＡＡＡＣＴＧＧＡＧ（配列番号５）からなる正プライマーおよび配列ＣＣＧＡＣＧＣＧＴＧＡＡＡＧＧＡＴＣＴＣＡＡＧＡＡＧＡＴＣ（配列番号６）からなる逆プライマーを用いるＰＣＲによってＢＲＰをコードする核酸をプラスミドｐＳＷＩ（Ｂｉｏ１０１， Ｖｉｓｔａ， ＣＡから市販されている）から単離してＴＯＰＯ−ＴＡクローニングプラスミド（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡから市販されている）にクローニングしてｐＢＲＰ＃５と示されるプラスミドを得た。プラスミドｐＢＲＰ＃５を制限酵素ＡｐａＩおよびＢａｍＨＩで切断し、得られたＢＲＰをコードする核酸を含む０．６ｋｂのバンドを５．９ｋｂのＡｐａＩ／ＢａｍＨＩ ｐｒｏｔｏ−ｐＴＳ断片に結合してプラスミドｐＴＳ−ＢＲＰを得た。エフェクター分子をコードする核酸の挿入のためのクローニング部位はＢＲＰをコードする核酸の５’および３’の両側に存在した。
【０２５９】
６．１．５． 　 ｐＴＳ−ＢＲＰＴＮＦ− αプラスミド
ＢＲＰおよびｔｒｃプロモーターによって制御されるＴＮＦ−αをコードする核酸のｐＴＳ媒介性染色体組込みのために、プラスミド（ｐＴＳ−ＢＲＰＴＮＦ−α）を以下のように構築した。ｐＴＳ−ＴＮＦ−αの構築のために上記に記載したプラスミドＡｓｄ３４ＴＮＦ−αを制限酵素ＢｇｌＩＩで切断し、ｔｒｃプロモーターによって制御されるＴＮＦ−αをコードする核酸をコードする１．１ｋｂの断片をｐＴＳ−ＢＲＰのＢａｍＨＩ部位に結合してプラスミドｐＴＳ−ＢＲＰＴＮＦ−αを得た。
【０２６０】
６．２． 　エフェクター分子をコードする核酸のサルモネラ菌宿主染色体への組込み　本明細書に記載される系は、セリンまたはグリシン栄養要求性のΔｓｅｒＣ−サルモネラ菌株および活発に転写される領域への染色体組込みの際にセリン／グリシン原栄養性を回復するプラスミドを用いる。しかしながら、染色体組込み体を選抜するためにその他の選択マーカーを使用してもよいということは当技術分野では十分に知られており、かかるマーカーは本発明の範囲内にある。例えば、Ｋｌｅｃｋｎｅｒら， １９９１， Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ． ２０４：１３９−１８０参照。
【０２６１】
エフェクター分子をコードする核酸を含むｐＴＳまたはｐＴＳ−ＢＲＰプラスミドを化学的形質転換およびエレクトロポレーションをはじめとする当技術分野で十分に公知のいくつかの手段によってｓｅｒＣ−サルモネラ菌株に導入してもよい。エフェクター分子をコードする核酸の導入後、サルモネラ菌をアンピシリン含有増殖培地で最小限２時間、より好ましくは６時間以上増殖させる。次いで、セリン原栄養性の細菌を選抜できる培地、例えば、Ｍ５６培地、Ａｔｌａｓ，Ｒ．Ｍ．「Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｄｉａ」 Ｌ．Ｃ．Ｐａｒｋｓ，編， ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ， Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ， Ｆｌｏｒｉｄａ， １９９３に細菌をおく。エフェクター分子をコードする核酸の染色体組込みを有する細菌は選抜培地で増殖できる。次いで、エフェクター分子をコードする核酸の発現を以下に示されるように測定する。エフェクター分子をコードする核酸の発現は酵素活性、生物学的活性、ノーザンブロット解析、またはウェスタンブロット解析などの当業者に公知のいくつかの方法のいずれで測定してもよい。
【０２６２】
６．２．１． 　サルモネラ菌によって発現された ＴＮＦ− αの送達および発現
上記のように、ｔｒｃプロモーターによって制御されるＴＮＦ−αをコードする核酸をｐＴＳ−ＢＲＰのＢａｍＨＩ部位に挿入してｐＴＳ−ＢＲＰＴＮＦ−αと示されるプラスミドを得た。当技術分野で公知の標準的な方法によって、プラスミドｐＴＳ−ＢＲＰＴＮＦ−αを、遺伝形質がΔｍｓｂＢ、ΔｐｕｒＩ、ΔｓｅｒＣ（図２）となるようにｓｅｒＣ−として構築したネズミチフス菌の弱毒化菌株、菌株ＶＮＰ２０００９（国際特許ＷＯ９９／１３０５３参照）にエレクトロポレーションした。メカニズムについて限定するものではないが、プラスミドの細菌ゲノムへの組込みによりｓｅｒＣをコードする核酸の活性化が可能となり、ｓｅｒＣ^＋表現型をもたらす。従って、エレクトロポレーションした細菌をアデニンを添加したＭ５６寒天プレートにプレーティングすることでＴＮＦ−αをコードする核酸の染色体組込みを有する細菌を選択した。細菌を、プラスミドの喪失および同時にプラスミドに基づくＴＮＦ−α発現の喪失を示す、アンピシリン耐性の喪失についてさらに特性決定した。
【０２６３】
本発明の腫瘍を標的とする細菌によるＴＮＦ−αの発現を調べて定量するために、ＴＮＦ−αをコードする核酸の染色体組込みを有するサルモネラ菌を一晩増殖させ、培養物の測定したサンプルをウェスタンブロット解析に用いた。特に、ｐＴＳ−ＢＲＰＴＮＦ−αクローン２と示される代表的なｓｅｒＣ^＋アンピシリン感受性クローンからのＴＮＦ−αの発現が図３に示されている。ウェスタンブロット解析により、３．９×１０^７ｃｆｕのｐＴＳ−ＢＲＰＴＮＦ−αクローン２細菌に相当する（レーン１）細菌タンパク質が５０ｎｇより多いＴＮＦ−αを発現するということが示され（レーン５）、このことは１０ｎｇ／１０^７細菌より多いレベルでのＴＮＦ−αの発現を示唆する。従って、ヒトＴＮＦ−αは、サルモネラ菌において、染色体に組み込まれた、ｔｒｃプロモーターによって制御されるＴＮＦ−αをコードする核酸から上手く発現された。
【０２６４】
７． 　 ＯＭＰＡ 融合タンパク質を発現する弱毒化腫瘍標的細菌
種々のシグナルペプチドへの融合によるタンパク質の周辺細胞質局在化はシグナルペプチドとタンパク質の双方に依存している。例えば、タンパク質はタンパク質のアミノ末端へのシグナルペプチドの融合によって細菌の細胞周辺コンパートメントに局在化され得る。限定することはないが、周辺細胞質局在化は、細菌の成分（タンパク質など）が周囲の環境に放出されるために単一の膜のみを通過すればよいので、細菌の成分の放出を促進すると考えられている。対照的に、細胞質内局在化は、成分が周囲の環境に放出されるためには細菌の内膜と外膜の双方を通過することを要求する。さらに、特定のタンパク質の周辺細胞質局在化は生物学的活性を補助する場合もある。
【０２６５】
本発明のエフェクター分子を周辺細胞質に向けるためには当技術分野で公知の種々の方法を使用できる。本実施例はＴＮＦ−α、ＴＲＡＩＬ（ＴＮＦ−α関連アポトーシス誘導性リガンド）、およびインターロイキン−２（ＩＬ−２）などのエフェクター分子のアミノ末端へのｏｍｐＡシグナルペプチドの融合が周辺細胞質局在化とその後のタンパク質のプロセッシングをもたらすということを証明している。
【０２６６】
７．１． 　 ＯＭＰＡ−ＴＮＦ− α融合タンパク質のプロセッシング
４種の異なるクローンにおけるＴＮＦ−α発現、すなわちＪＭ１０９細菌においてプラスミドに基づくｔｒｃプロモーターによって動かされるｏｍｐＡ−ＴＮＦ−α融合タンパク質の発現を全細胞溶解物のウェスタンブロット解析によって調べた。周辺細胞質に局在する酵素であるシグナルペプチダーゼによる前駆体融合タンパク質の成熟ＴＮＦ−αへの切断によって周辺細胞質局在が証明された。４種のクローンすべてにおいて、ＩＰＴＧでの誘導後のＴＮＦ−αの過剰発現により、ＴＮＦ−αが、プロセッシングされていない型とプロセッシングされた型の双方に対応する約２０ｋｄで移動する二重線として現れた（図５、レーン４〜７）。比較のために、染色体に組み込まれたＴＮＦ−αをコードする核酸を有する成熟（プロセッシングされた）型のＴＮＦ−αを発現するサルモネラ菌株を正の対照として用いた（図５、レーン３）。ＴＮＦ−αをコードする核酸を欠いている細菌ではＴＮＦ−α発現は検出されなかった（図５、レーン２）。
【０２６７】
これらの結果は、成熟ヒトＴＮＦ−αタンパク質の大腸菌ｏｍｐＡシグナルペプチドへの融合（図４に示されるような）は大腸菌で発現される場合には周辺細胞質局在およびプロセッシングもたらすということを証明する。さらに、分泌されるタンパク質の過剰発現が細菌宿主にとって毒性であるかどうかは、正常な分泌組織が圧倒的に多いためにわからなかった。プロセッシングされたｏｍｐＡ−ＴＮＦ−α融合タンパク質の発現についてのこの証明は正常な分泌組織は分泌されるタンパク質の高レベル発現に適応できるということを示唆した。
【０２６８】
７．２． 　 ＯＭＰＡ − ＴＲＡＩＬ 融合タンパク質のプロセッシング
ｏｍｐＡシグナルペプチドのＴＮＦファミリーのメンバーを周辺細胞質に局在させる能力を、ＴＮＦファミリーのもう１つのメンバーであるＴＲＡＩＬ（ＴＮＦ−α関連アポトーシス誘導性リガンド）にまで拡張した。これらの実験のために、ヒトＴＲＡＩＬ（ｈＴＲＡＩＬ）の成熟型をコードする、ｔｒｃプロモーターによって動かされるＴＲＡＩＬをコードする核酸をｏｍｐＡシグナルペプチドのコード配列に融合した（図６に示されるように）。一方はＮｃｏＩ部位をコードし、もう一方はＮｄｅＩ部位をコードする２種の異なるｏｍｐＡ／ＴＲＡＩＬ接合点を調べた（ＮｄｅＩを含む配列については図６参照）。両種のクローンのウェスタン解析が図７に示されている。抗ｈＴＲＡＩＬ抗体を用いるウェスタンブロット解析によってＮｃｏＩ接合したｏｍｐＡ−ＴＲＡＩＬを過剰発現する細菌はｈＴＲＡＩＬのプロセッシングされた型（２８．２ｋｄ）とプロセッシングされていない型（３０．２ｋｄ）の双方を発現し（図７、レーン２〜４）、他方、ＮｄｅＩ接合したｏｍｐＡ−ＴＲＡＩＬを過剰発現する細菌はもっぱらプロセッシングされた型を発現する（図７、レーン４〜７）ということが示され、このことはＮｄｅＩ接合がより効率的なプロセッシングをもたらしたということを示唆する。
【０２６９】
これらの結果は、成熟ヒトＴＲＡＩＬタンパク質の大腸菌ｏｍｐＡシグナルペプチドへの融合は周辺細胞質局在およびプロセッシングをもたらすということを証明した。さらに、分泌されるタンパク質の過剰発現が細菌宿主にとって毒性であるかどうかは正常な分泌組織が圧倒的に多いためにわからなかった。プロセッシングされたｏｍｐＡ−ＴＲＡＩＬ融合タンパク質の発現についてのこの証明は正常な分泌組織は分泌されるタンパク質の高レベル発現に適応できるということを示唆した。
【０２７０】
７．３． 　 ＯＭＰＡ（８Ｌ）−ＩＬ−２ 融合タンパク質のプロセッシング
二次エフェクター分子（ＩＬ−２）を融合タンパク質として発現させた。成熟（Ｃ１２５Ａ）ｈＩＬ−２の、ＴＮＦ−αおよびＴＲＡＩＬついて上記で用いたような、野生型ＯｍｐＡシグナル配列への融合ではＩＬ−２のプロセッシングが可能にならなかった。ヒトＩＬ−２サイトカインの周辺細胞質局在およびプロセッシングを調べるために、成熟ヒト（Ｃ１２５Ａ）ＩＬ−２を図８に示されるように、ｏｍｐＡ（８Ｌ）と示される改変ｏｍｐＡシグナルペプチドに融合させた。改変ｏｍｐＡシグナルペプチドはｏｍｐＡシグナルのアミノ酸６〜１７を図８に示されるもので置換することによって改変した。発現およびプロセッシングが図９に示されている（レーン６および７）。各レーンは単一のクローンを表す。ウェスタンブロット解析の結果はｏｍｐＡ（８Ｌ）シグナルペプチドを用いることで、事実上完全なプロセッシングが認められるということを示した（図９、レーン６および７）。
【０２７１】
７．４． 　 ＰＨＯＡ（８Ｌ）−ＩＬ−２ 融合タンパク質のプロセッシング
ヒトＩＬ−２の周辺細胞質局在およびプロセッシングについて第２の融合タンパク質を調べ、７．３．節の融合タンパク質と比較した。図１０中で、ｐｈｏＡ（８Ｌ）と示される改変ｐｈｏＡシグナルペプチドに融合した成熟ヒト（Ｃ１２５Ａ）ＩＬ−２の発現およびプロセッシングを調べた。発現およびプロセッシングが図９に示されている。ｏｍｐＡ（８Ｌ）シグナルペプチドを用いてより完全なプロセッシングが認められたのに対し（図９、レーン６および７）、合成ｐｈｏＡ（８Ｌ）シグナルペプチドでは部分的なプロセッシングしか認められなかった（図９、レーン４および５）。
【０２７２】
これらの結果はＩＬ−２の局在およびプロセッシングが異なるシグナルペプチドによって提供されたということを示す。この結果はまた、種々のシグナルペプチドへの融合によるタンパク質の周辺細胞質局在はシグナルペプチドとタンパク質の双方に依存しているということを証明する。
【０２７３】
融合タンパク質研究の結果は、Ｉｌ−２などの本発明の二次エフェクタータンパク質はＯｍｐＡまたはＰｈｏＡなどのタンパク質シグナルペプチドとの融合によって発現され、細菌の周辺細胞質に局在され得るということを示す。当業者には明らかであろうが、その他のシグナル配列を用いて利用され得るエフェクター分子の周辺細胞質局在を引き起こすこともできる。当業者にはさらに明らかであろうが、本発明のその他のエフェクター分子を本明細書の実施例に記載されるエフェクター分子と置換することもできる。
【０２７４】
８． 　実施例：成熟型の ＴＮＦ− αを発現するサルモネラ （ Δ ＭＳＢＢ 、Δ ＰＵＲＩ） の抗腫瘍効果
以下の実験は、一次エフェクター分子（例えば、ＴＮＦファミリーのメンバー）をコードする核酸を含むサルモネラなどの弱毒化腫瘍標的細菌は哺乳類腫瘍に一次エフェクターを送達することができ、腫瘍体積を減少させることを証明する。
【０２７５】
ＴＮＦ−αのネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）の抗腫瘍効果を高める能力は段階的なネズミ大腸３８癌腫モデルで評価した。これらの実験では、大腸３８腫瘍由来の１ｍｍ^３の腫瘍断片をＣ５７ＢＬ／６マウス腫瘍へ移植し、腫瘍を平均サイズ約０．３ｇまで増殖させ、この時、動物を以下の処理群（ｎ＝１０）に無作為に配置した：１）無処理；２） ネズミチフス菌（ΔｍｓｂＢ、ΔｐｕｒＩ、ｓｅｒＣ）（親株）；および３）ｐＴＳ−ＢＲＰＴＮＦ−α（上記の大腸２）。各群のマウスは処理しないか、あるいは適当な細菌株１×１０^６ｃｆｕの静脈注射を１回施した。細菌接種時から始め、毎週腫瘍サイズを測定した。
【０２７６】
ＴＮＦ−αを発現する弱毒化腫瘍標的サルモネラを施した群では、処理後２週間で腫瘍の退縮が明白であり、処理後４週間以内に動物のうち６個体で完全な退縮が見られた（図１１）。無処理群では腫瘍は徐々に大きくなったが、ネズミチフス菌親株（ΔｍｓｂＢ、ΔｐｕｒＩ、ｓｅｒＣ）で処理した群の腫瘍は処理後３ないし４週の間に部分的退縮を示したが、その後徐々に大きくなった（図１１）。
【０２７７】
これらの結果は、弱毒化腫瘍標的サルモネラがＴＮＦファミリーのメンバーなどのエフェクター分子を発現して腫瘍へ送達できることを証明するものである。このようなサルモネラは腫瘍の治療に有用であり、ＴＮＦファミリーのメンバーを発現しないサルモネラ親株と比較して腫瘍退縮の結果を増強する。
【０２７８】
染色体に組み込まれた核酸からＴＮＦ−αを発現するサルモネラにより完全な腫瘍退縮が示されることは、染色体に組み込まれたエフェクター分子をコードするからから生物学的に有効な発現が生じるということを示す。
【０２７９】
９． 　実施例： ＢＲＰ を発現する細菌による核酸分子の送達の増強
ＢＲＰ活性がサルモネラなどの弱毒化腫瘍標的細菌からのプラスミドの放出を増強することを示すため、プラスミドならびに放出マーカー（ＡＭＰマーカーを有するｐＴｒｃ９９ａ）として用いられる第２のプラスミドにＢＲＰを含んだ弱毒化腫瘍標的サルモネラ株を構築した。ＢＲＰの活性を評価するため、ＢＲＰを含む、あるいは含まないサルモネラを標準法による培養で増殖させた。次ぎに得られた上清から遠心分離および濾過によって残存する細菌を除去した後、明澄な上清をコンピテント細胞に加え、形質転換反応を行った。次ぎにこれらのレシピエント細胞をＬＢ ａｍｐ培地で平板培養し、ＡＭＰマーカープラスミドの取り込みを調べた。ＢＲＰを有するＡＭＰ耐性コロニー数が増加していれば、より多くのプラスミドがＢＲＰ発現株から培地へ放出されたことを示す。
【０２８０】
結果は以下の表２に要約されている。
【０２８１】
【表２】

【０２８２】
これらの結果はＢＲＰが存在すると培地へ分泌されるａｍｐプラスミドの量が増えたことを示している。このように、ＢＲＰ発現細胞由来上清の「レシピエント細胞」への形質転換ではコロニー数が増える。これらの結果は、ＢＲＰが核酸プラスミドを含む二次エフェクター分子の放出を増強したことを示す。従って、これらの結果は、ＢＲＰがプラスミドの放出またはＤＮＡ送達に有用であることを示す。さらに、ＢＲＰを発現し、ＤＮＡを送達することができるこれらのサルモネラ株は集団として複製能を留めていた。
【０２８３】
１０． 　実施例： ＢＲＰ 発現は弱毒化腫瘍標的サルモネラの腫瘍標的化能または腫瘍阻害能を損なわない
以下の実施例は、弱毒化腫瘍標的細菌が１以上のエフェクター分子と共にＢＲＰを発現するよう操作して細菌の腫瘍標的能を阻害することなくエフェクター分子の腫瘍への送達を増強することができることを示す。
【０２８４】
固形腫瘍モデルはＢ１６メラノーマ細胞をＣ５７ＢＬ／６マウスの右後脚の腿に皮下注射することで得た。腫瘍の移植のために、トリプシン処理によりフラスコから細胞を解離させ、洗浄し、リン酸緩衝生理食塩水に２．５×１０^６細胞／ｍｌで懸濁させた。細胞懸濁液０．２ｍｌアリコート（総数５×１０^５細胞／マウス）を第０日目に注射した。腫瘍の体積が１５０ないし２００ｍｍ^３に達した際（移植後約１０日）、マウスを無作為に１０個体の群に分け、各群に異なる処理を施した。対照群（図１２の曲線＃１）には０．２ｍｌのＰＢＳを施した。別の群にはサルモネラＶＮＰ２０００９の弱毒化腫瘍標的株２×１０^６ｃ．ｆ．ｕ．／マウスを含有する０．２ｍｌを施した（図１２の曲線＃２）。第３の群には、その天然プロモーターの制御下にＢＲＰ遺伝子を含むプラスミドであるｐＳＷ１を含む弱毒化腫瘍標的サルモネラ株２×１０^６ｃ．ｆ．ｕ．／マウスを含有する０．２ｍｌを施した（図１２の曲線＃３）。ＢＲＰ遺伝子は大腸菌内ではＳＯＳ誘導性である。しかしながら本発明者らは、メカニズムは特定できないが、ＢＲＰ遺伝子はサルモネラ菌内では部分的に構成的であり、低レベルから中レベルのＢＲＰタンパク質を産生するが、腫瘍環境におけるＳＯＳの性質によってその産生はさらに増強すると信じている。ＢＲＰ発現ＶＮＰ２０００９サルモネラを注射したマウスは非ＢＲＰ発現ＶＮＰ２０００９を注射したものとほぼ同様の抗腫瘍応答を示したが、このことはこれらのサルモネラ菌の生存または腫瘍標的化能がＢＲＰの発現によって変化しないし、腫瘍増殖阻害能も変化しないことを示している。弱毒化腫瘍標的サルモネラ菌におけるＢＲＰ発現の結果は分泌型ＨＳＶチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ＴＫ）の発現の効果と対照的である。ＨＳＶ−ＴＫの発現はＶＮＰ２０００９の腫瘍阻害能の欠損をもたらす（Ｐａｗｅｌｅｋら， １９９７， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５７：４５３７−４５４４）。このようにＢＲＰ系はさならる改変を伴わずに一次および／または二次エフェクター分子の腫瘍への送達を増強するのに使用できる。
【０２８５】
１１． 　実施例： ｐｅｐＴ プロモーター発現運搬体
この実施例はサルモネラ菌などの弱毒化腫瘍標的細菌におけるｐｅｐＴプロモーターの制御下、β−ｇａｌなどのレポーターをコードする核酸分子のｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏ発現を示す。
【０２８６】
１１．１ 　実施例： ｐｅｐＴ−ＢＲＰ− β ＧＡＬ 発現プラスミドの構築
ｐｅｐＴプロモーターは、以下のプライマー：
フォワード：５’−ＡＧＴ ＣＴＡ ＧＡＣ ＡＡＴ ＣＡＧ ＧＣＧ ＡＡＧ ＡＡＣ ＧＧ−３’（配列番号１５）
リバース：５’−ＡＧＣ ＣＡＴ ＧＧＡ ＧＴＣ ＡＣＣ ＣＴＣ ＡＣＴ ＴＴＴ Ｃ−３’（配列番号１６）
を用いて、単離した野生型ネズミチフス菌（ＡＴＣＣ１４０２８）のコロニー由来の領域のＰＣＲ増幅によりクローニングした。
【０２８７】
ＰＣＲ条件は、９５℃にて５分間を１サイクル、９５℃にて１分間、６５℃にて１分間、７２℃にて２分間を３５サイクル、および７２℃にて１０分間を１サイクルであった。このＰＣＲ産物をＰＣＲ２．１クローニングベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｃａｒｌｓｂａｄ， Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）へクローニングし、ＰｅｐＴ／ＰＣＲ２．１と名付けた。
【０２８８】
このＰｅｐＴ／ＰＣＲ２．１ベクターをＮｃｏＩおよびＸｂａＩで切断した。ＰｅｐＴ断片をゲルで単離し、同じ酵素で切断したβ−ｇａｌ Ｚｔｅｒｍベクターへ連結した。Ｚｔｅｒｍ（Ｔｅｍｐｏｒａｒｙ Ｇｅｎｂａｎｋ Ｂａｎｋｉｔ Ｎｏ． ２９６４９５）は、βＧａｌオープンリーディングフレームをｐＵＣ１９へクローニングすることによって作製されたプロモーターのないβ−ｇａｌプラスミドである。得られたプラスミドをｐｅｐＴ−βＧＡＬと名付けた。
【０２８９】
１１．２ 　 ｐｅｐＴ− β ＧＡＬ の ｉｎ ｖｉｔｒｏ 発現と ｐｅｐＴ− β ＧＡＬ 活性の測定
ｐｅｐＴ−βＧＡＬを担持するサルモネラ株ＹＳ１４５６（図１３ＡのＣＣ１４；この菌株の遺伝構成についてはＷＯ９６／４０２３８参照）またはＶＮＰ２０００９（図１３ＡのＣＣ１６）を嫌気または好気条件のいずれかの下でＯＤ_６００が〜０．５ないし０．８まで増殖させた。β−ｇａｌ活性はＢｉｒｇｅおよびＬｏｗ（１９７４， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ８３：４４７−４５７）の方法で測定した。結果は図１３Ａに示しているが、嫌気条件下での細菌の増殖時のβ−ｇａｌ活性が約１４ないし２４倍誘導されたことを示す。
【０２９０】
１１．３ 　 ｐｅｐＴ− β ＧＡＬ の ｉｎ ｖｉｖｏ 発現と ｐｅｐＴ− β ＧＡＬ 活性の測定
ｐｅｐＴ−βｇａｌ発現プラスミド、ＢＲＰ発現プラスミド（ＢＩＯ１０１由来のｐＳＷ１（Ｖｉｓｔａ， Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）、これはその天然プロモーターの制御下にｐＣｌｏＤＦ１３ ＢＲＰコード配列を含む）、または双方の発現プラスミドを担持するサルモネラ株ＹＳ１４５６の細胞を腫瘍担持マウスに静脈注射した。注射後５日目に腫瘍および肝臓をホモジナイズし、細菌を単離してｐｅｐＴ−βｇａｌおよび／またはＢＲＰのプラスミドの存在がこれらの細菌の腫瘍標的化能を阻害しなかったことを示した。さらに、腫瘍および肝臓ホモジネートを用いてβ−ｇａｌ活性を測定し、活性型β−ｇａｌがｉｎ ｖｉｖｏで測定可能かどうか、またｐｅｐＴプロモーターが嫌気性腫瘍環境において誘導されるかどうかを調べた。結果は図１３Ｂに示されており、腫瘍環境における極めて高レベルのｐｅｐＴプロモーター活性を示す。バックグラウンドレベルに対して肝臓のβ−ｇａｌ発現における有意な増強は見られず、これは好気性の肝臓環境におけるｐｅｐＴプロモーターの低活性および／または細菌ベクターの肝臓への標的化能が低いことに帰因するものと思われる。
【０２９１】
１２． 　実施例：テトラサイクリン誘導発現系
この実施例はサルモネラ菌などの弱毒化腫瘍標的細菌のｔｅｔプロモーターの制御下にあるβ−ｇａｌなどのリポーター遺伝子をコードする核酸分子の発現を示す。
【０２９２】
ｔｅｔプロモーターは以下のプライマー：
フォワード：５’−ＧＧＡ ＴＣＣ ＴＴＡ ＡＧＡ ＣＣＣ ＡＣＴ ＴＴＣ ＡＣＡ ＴＴＴ ＡＡＧ−３’（配列番号１７）
リバース：５’−ＧＧＴ ＴＣＣ ＡＴＧ ＧＴＴ ＣＡＣ ＴＴＴ ＴＣＴ ＣＴＡ ＴＣＡ Ｃ−３’（配列番号１８）
を用いてＰＣＲ増幅によりミニ−ＴＮ１０トランスポゾンからクローニングした。
【０２９３】
ＰＣＲ条件は以下の通りであった：９５℃にて５分間を１サイクル、９５℃にて１分間、６０℃にて１分間、７２℃にて２分間を３５サイクル、および７２℃にて１０分間を１サイクル。
【０２９４】
〜４００ｂｐのＰＣＲ断片をゲルで単離し、ＰＣＲ２．１ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングした。ＰＣＲ２．１／ｔｅｔプロモーターベクターをＮｃｏＩおよびＢａｍＨＩで切断した。この〜４００ｂｐのｔｅｔプロモーター断片をゲル単離し、同じ２酵素で切断したプロモーターのないβ−ｇａｌベクターＺｔｅｒｍに連結した。連結混合物を形質転換し、形質転換した細菌をテトラサイクリン／Ｘ−ｇａｌプレート上で平板培養した。陽性コロニーを青色を基に単離した。いくつかの陽性コロニーからの抽出物を作製し、ＢｉｒｇｅおよびＬｏｗ（１９７４， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ８３：４４７−４５７）の方法によりテトラサイクリンの存在下でのβ−ｇａｌ活性に関してアッセイした。１つのクローンを単離し、一定の範囲のテトラサイクリン濃度にわたってβ−ｇａｌ発現に関してアッセイした。アッセイの結果はテトラサイクリンによって用量依存的にβ−ｇａｌ活性が誘導されることを示し、図１４に示されている。
【０２９５】
１３． 　実施例：エンドスタチンを発現する弱毒化腫瘍標的サルモネラ菌による腫瘍増殖の阻害
以下の実施例はエンドスタチンを発現する弱毒化腫瘍標的サルモネラ菌の作製、およびｉｎ ｖｉｖｏにおけるかかるサルモネラ菌による腫瘍治療の効果を示す。
【０２９６】
１３．１ 　エンドスタチン発現プラスミドの構築
エンドスタチンは、以下のプライマー：
フォワード：５’−ＧＴＧ ＴＣＣ ＡＴＧ ＧＧＧ ＣＡＣ ＡＧＣ ＣＡＣ ＣＧＣ ＧＡＣ ＴＴＣ ＣＡＧ−３’（配列番号１９）
リバース：５’−ＡＣＡ ＣＧＡ ＧＣＴ ＣＣＴ ＡＣＴ ＴＧＧ ＡＧＧ ＣＡＧ ＴＣＡ ＴＧＡ ＡＧＣ Ｔ−３’（配列番号２０）
を用いてヒト胎盤ｃＤＮＡライブラリーからＰＣＲ増幅した。
【０２９７】
得られたＰＣＲ産物をＰＣＲ２．１ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）へクローニングした。ヘキサヒスチジン−エンドスタチンは以下のプライマー：
フォワード：５’−ＧＴＧ ＴＣＣ ＡＴＧ ＧＣＴ ＣＧＧ ＣＧＧ ＧＣＡ ＡＧＴ ＧＴＣ ＧＧＧ ＡＣＴ ＧＡＣ ＣＡＴ ＣＡＴ ＣＡＴ ＣＡＴ ＣＡＴ ＣＡＴ ＣＡＣ ＡＧＣ ＣＡＣ ＣＧＣ ＧＡＣ ＴＴＣ−３’（配列番号２１）
リバース：５’−ＧＴＧ ＣＧＧ ＡＴＣ ＣＣＴ ＡＣＴ ＴＧＧ ＡＧＧ ＣＡＧ ＴＣＡ ＴＧＡ ＡＧＣ ＴＧ−３’（配列番号２２）
とともに、鋳型として上記で構築したプラスミドを用いてＰＣＲ増幅した。
【０２９８】
ＰＣＲ増幅条件は、９５℃にて５分間を１サイクル、９５℃にて１分間、５５℃にて１分間、７２℃にて２分間を３０サイクル、および７２℃にて１０分間を１サイクルであった。
【０２９９】
得られた産物はそのアミノ末端にペプチド配列ＭＡＲＲＡＳＶＧＴＤＨＨＨＨＨＨ（配列番号２３）を有するヒトエンドスタチンをコードするＮｃｏＩ（５’）およびＢａｍＨＩ（３’）制限部位を持つＤＮＡ断片であった。
【０３００】
このＰＣＲ産物をＮｃｏＩおよびＢａｍＨＩで切断し、５５０ｂｐの産物をゲルで単離し、同じ酵素で予め切断したｐＴｒｃ９９Ａベクターへ連結した。この連結反応産物を大腸菌ＤＨ５αおよび弱毒化腫瘍標的サルモネラ株ＶＮＰ２０００９へ形質転換した。
【０３０１】
ヘキサヒスチジン−エンドスタチンコード配列もまた、ＮｃｏＩ／ＢａｍＨＩ断片として発現ベクターＹＡ３３３４にクローニングした。ＹＡ３３３４はＣｏｌＥＩの複製起点に置き換えられた複製起点を有する（ＢａｚａｒａｌおよびＨｅｌｓｉｎｋｉ， １９７０， Ｂｉｏｃｈｅｍ ９：３９９−４０６）ａｓｄプラスミドＰＹＡ２７２（Ｃｕｒｔｉｓｓ ＩＩＩ， 米国特許第５，８４０，４８３号）である。陽性クローンから調製したプラスミドＤＮＡを単離し、サルモネラ株８３２４へ形質転換し、これがａｓｄ変異を有するＶＮＰ２０００９である。この菌株はＣｕｒｔｉｓｓ ＩＩＩ（米国特許第５，８４０，４８３号）に記載の方法に従って作製した。
【０３０２】
１３．２ 　弱毒化腫瘍標的サルモネラ菌によるエンドスタチンの ｉｎ ｖｉｔｒｏ 発現
ｐＴｒｃ９９Ａ−ヘキサヒスチジン−エンドスタチンプラスミドを含む種々のサルモネラ菌ＶＮＰ２０００９株および大腸菌ＤＨ５α株を対数増殖中期（Ｏ．Ｄ．_６００が〜０．６ないし０．８）まで増殖させ、この時点で各培養物を分割し、一方にはｔｒｃプロモーター活性の誘導のために０．１ｍＭ ＩＰＴＧを施し、もう一方にはＩＰＴＧは施さなかった。さらに３時間増殖させた後、細菌抽出物を調製し、ヘキサヒスチジン−エンドスタチンの発現を抗ヒスチジン抗体（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を用いてウエスタンブロット解析により確認した。図１５Ａおよび１５Ｂはそれぞれ大腸菌ＤＨ５αおよびサルモネラ菌ＶＮＰ２０００９におけるｐＴｒｃ９９Ａ−ヘキサヒスチジン−エンドスタチン（ＨｅｘＨＩＳ−エンドスタチン）の発現を示すウエスタンブロットの結果を示している。ｔｒｃプロモーターはＩＰＴＧの不在下の大腸菌では活性は見られなかったが、同じプロモーターがサルモネラ菌では構造的に活性であった。ヘキサヒスチジン−エンドスタチンは約２５ｋＤの単一のバンドで現れ、これがこの融合タンパク質の推定分子量である。
【０３０３】
ヘキサヒスチジン−エンドスタチン融合タンパク質は同様に、発現の支配にｔｒｃプロモーターを利用するＹＡ３３３４プラスミドからも発現した。図１６に示されているように抗ヒスチジン抗体を用いて推定分子量２５ｋＤａのタンパク質を検出した。図１６では、サンプルが由来する全ての細菌培養物を０．１ｍＭ ＩＰＴＧで３時間誘導した。
【０３０４】
１３．３ 　 Ｃ３８ ネズミ大腸癌に対するエンドスタチンを発現する弱毒化腫瘍標的サルモネラ菌の効果
２×２×２ｍｍ^３の体積の大腸３８腫瘍断片を９週齢の雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスに皮下移植した。腫瘍体積が１０００ｍｍ^３に達した際、それらを摘出し、２×２×２ｍｍ^３の断片に切断した。これらの断片をもう１回一連のサイクルを経させ、得られた２×２×２ｍｍ^３の断片を雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスの右腿に皮下移植した。腫瘍体積が１５０ないし２００ｍｍ^３に達した際（移植後約２４日後）、マウスを１０個体６群に無作為に分け、各群に異なる処理を施した。１つの対照群には０．２ｍｌのＰＢＳを施した。もう１つの対照群には対照ａｓｄプラスミド（すなわち、上記第５．６に記載のようにａｓｄプラスミドは挿入されていない）を有する弱毒化腫瘍標的サルモネラ菌株ＶＮＰ２０００９を１×１０^６ｃ．ｆ．ｕ．含む０．２ｍｌを施した。第１の実験群にはａｓｄプラスミドにおいてヘキサヒスチジン−エンドスタチン融合タンパク質を発現するＶＮＰ２０００９を１×１０^６ｃ．ｆ．ｕ．含む０．２ｍｌを施した。第２の実験群には第１の群と同じ発現構築物およびさらに発現されるＢＲＰを有するＶＮＰ２０００９を施した。
【０３０５】
図１７はこれらの実験の結果を示したものであり、ヘキサヒスチジン−エンドスタチンを発現するＶＮＰ２０００９株のよる腫瘍抑制の効果を示す。処理後６０日では、エンドスタチンを発現するＶＮＰ２０００９サルモネラ菌の腫瘍サイズ中間値は、対照動物の腫瘍サイズ中間値の約１３％であり、空のベクターを担持するＶＮＰ２０００９サルモネラ菌で処理した動物の腫瘍サイズ中間値より３０％以上低かった。生き残った動物のうちの多くが、正味の腫瘍サイズの小さな変化によって示されるように腫瘍増殖にほとんど変化が無いことを示し、あるものは強い腫瘍抑制を示した。処理の浸透または効果が不十分なことが、エンドスタチン送達系が不十分であることに反映されている可能性が最も高い。このことは、エンドスタチンが封入体に集積することを見出しているＯ’Ｒｅｉｌｌｙら（１９９７， Ｃｅｌｌ ８８：２７７−２８５）と合致する。エンドスタチン送達系はＢＲＰの発現によって増強される。ＢＲＰの発現はその天然プロモーターによって制御されるが、通常は細菌でＳＯＳ応答を示す。ＢＲＰ発現は対照集団の平均腫瘍体積の約６％まで平均腫瘍体積を小さくすることが示された。さらに、ヘキサヒスチジン−エンドスタチンおよびＢＲＰで処理したマウス集団では、数個体のマウスが経時的に腫瘍体積に著しい減少を示し、腫瘍体積は最初の腫瘍体積の約１０以下まで退縮した。ＢＲＰの効果は二重であると考えられ、１つはＢＲＰ自体が抗腫瘍活性を有すること、もう１つはＢＲＰが周辺細胞質内容物の放出、およびエンドスタチンをはじめ細胞質内容物の放出をある程度は促進し、これが封入体でタンパク質が集積するのを防ぐということである。
【０３０６】
１３．４ 　 ＤＬＤ ヒト大腸癌に対するエンドスタチンを発現する弱毒化腫瘍標的サルモネラ菌の効果
対数増殖期まで増殖させたＤＬＤ１細胞培養物にトリプシン処理を施し、ＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ中５×１０^７細胞／ｍｌの懸濁液を再構成した。各々５×１０^６細胞を含む単一の細胞懸濁液のアリコート０．１ｍｌを９週齢の雌ヌードマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ ＲｉｖｅｒからのＮｕ／Ｎｕ−ＣＤ１）の右腿に皮下注射した。マウスを各１０個体３群に無作為に分けた後、注射後１０ないし１５日、または腫瘍体積が２００ないし４００ｍｍ^３に達するまで同期化した。
【０３０７】
第１群のマウスは対照群であり、各々に０．３ｍｌのＰＢＳ注射を施した。第２群のマウスには対照ａｓｄプラスミドを担持する弱毒化腫瘍標的サルモネラ菌ＶＮＰ２を０００９ １×１０^６ｃ．ｆ．ｕ．含む０．３ｍｌを施した。第３群のマウスにはヘキサヒスチジン−エンドスタチン融合タンパク質およびＢＲＰを発現するａｓｄプラスミドを担持する弱毒化腫瘍標的サルモネラ菌ＶＮＰ２０００９を１×１０^６ｃ．ｆ．ｕ．含む０．３ｍｌを施した。腫瘍をモニターし、１週間に２回測定した。図１３は３処理の投与後の腫瘍体積をグラフで表したものであり、ＤＬＤ１ヒト大腸癌の増殖に対する、ヘキサヒスチジン−エンドスタチンを発現する弱毒化腫瘍標的サルモネラ菌の抑制作用が示されている。
【０３０８】
空のベクターＰＹＡ３３３２を担持するＶＮＰ２０００９は腫瘍増殖を有意に阻害することはできなかった。しかし、エンドスタチンおよびＢＲＰを発現するＶＮＰ２０００９は腫瘍増殖を阻害することができた。これらの結果は、エンドスタチンとＢＲＰの組合せがＰＹＡ３３３２ベクターを担持するＶＮＰ２０００９（８３２４株）のいずれかの抗腫瘍作用を増強することを示している。
【０３０９】
１４． 　実施例：弱毒化腫瘍標的サルモネラ菌による抗血管新生因子の発現
以下の実施例は、サルモネラ菌などの弱毒化腫瘍標的細菌を、抗血管新生因子トロンボスポンジンＡＨＲ、血小板第４因子およびアポミグレンを発現するよう操作するために用いられる方法論を示す。
【０３１０】
１４．１ 　トロンボスポンジン ＡＨＲ をコードする核酸配列を含むプラスミドの構築
トロンボスポンジンの抗血管新生相同領域（ＡＨＲ）に相当するペプチド配列ＴｉＰ１３．４０： ＡＹＲＷＲＬＳＨＲＰＫＴＧＦＩＲＶＶＭＹＥＧ（配列番号２４）（例えば、特許出願第Ｃ０７Ｋ−１４／７８参照）を逆転操作し、サルモネラ菌での発現のためにコドンの至適化を行い、ＤＮＡ配列：
ＧＣＧ ＴＡＣ ＣＧＣ ＴＧＧ ＣＧＣ ＣＴＧ ＴＣＣ ＣＡＴ ＣＧＣ ＣＣＧ ＡＡＡ ＡＣＣ ＧＧＣ ＴＴＴ ＡＴＣ ＣＧＣ ＧＴＧ ＧＴＧ ＡＴＧ ＴＡＣ ＧＡＡ ＧＧＣ（配列番号２５）を得た。このペプチドを合成するため相補的オリゴヌクレオチド（オリゴ１３：４０−１およびオリゴ１３：４０−２）を作製した。５’末端において、ＯＭＰＡのプロセッシング領域をコードする配列およびＳｐｅＩ制限部位を付加した。３’末端において、ＢａｍＨＩ制限部位とともに停止コドンを付加した。この２つのオリゴをアニーリングして二本鎖ＤＮＡ断片を作製した。このＤＮＡ断片をＳｐｅＩ／ＢａｍＨＩで切断し、ＳｐｅＩ／ＢａｍＨＩ切断ベクターｐＴｒｃ８０１ＩＬ２に連結して、全長改変ＯｍｐＡリーダー配列を含むプラスミドｐＴｒｃ８０１−１３．４０を作製した。プロセッシングされると、この配列は完全長の１３．４０トロンボスポンジンペプチドとなる。
【０３１１】

（制限部位はイタリックで示し、ＯｍｐＡプロセッシング認識部位は下線で示す）
【０３１２】
１４．２ 　血小板第 ４ 因子ペプチド （４７−７０） をコードする核酸配列を含むプラスミドの構築
血小板第４因子（ＰＦ−４； 例えばＭａｉｏｎｅら， １９９０， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７：７７−７９およびＪｏｕａｎら， １９９９， Ｂｌｏｏｄ ９４：９８４−９９３参照）のＣ末端のアミノ酸残基４７−７０からなるペプチドを、サルモネラ菌での発現のためにコドンの至適化を行った。以下に示されるこのペプチドは、ＣＦＵ−ＧＭ始原細胞上でＰＦ−４の活性阻害に関与するＤＬＱモチーフおよび主なヘパリン結合ドメインである塩基性アミノ酸クラスターを含む。
【０３１３】

シグナルペプチド＝下線・太字
Ｌｙｓ６１、６２、６５、６６＝主なヘパリン結合ドメイン（太字）
ＤＬＱ（７−９、５４−５６）＝ ＣＦＵ−ＧＭ始原細胞に対する阻害活性（太字）
【０３１４】
このペプチドを合成するため、相補的オリゴヌクレオチド（オリゴＰＦ４−１およびオリゴＰＦ４−２）を作製した。５’末端においてＯｍｐＡおよびＳｐｅＩ制限部位のプロセッシング領域コードする配列を付加した。３’末端において、ＢａｍＨＩ制限部位とともに停止コドンを付加した。この２つのオリゴをアニーリングして二本鎖ＤＮＡ断片を作製した。制限切断した後、この断片をＳｐｅＩ／ＢａｍＨＩで制限処理したベクターｐＴｒｃ８０１に連結してプラスミドｐＴｒｃ８０１−ＰＦ４を作製した。プロセッシングされると、この配列は完全長のＰＦ−４（４７−７０）ペプチドとなる。
【０３１５】

（制限部位はイタリックで示し、ＯｍｐＡプロセッシング認識部位は下線で示す）
【０３１６】
１４．３ 　アポミグレンをコードする核酸配列を含むプラスミドの構築
抗血管新生ペプチドアポミグレン
（ＩＹＳＦＤＧＲＤＩＭＴＤＰＳＷＰＱＫＶＩＷＨＧＳＳＰＨＧＶＲＬＶＤＮＹＣＥＡＷＲＴＡＤＴＡＶＴＧＬＡＳＰＬＳＴＧＫＩＬＤＱＫＡＹＳＣＡＮＲＬＩＶＬＣＩＥＮＳＦＭＴＤＡＲＫ（配列番号３１）；例えば、国際公報ＷＯ９９／２９８５６参照）はコラーゲンＸＶのタンパク質分解断片であるレスチンのＣ末端に相当する。オリゴヌクレオチド（オリゴＡｐｏｍ５ＦおよびオリゴＡｐｏｍ６Ｆ）を、ヒトｃＤＮＡ由来のＤＮＡ断片を増幅するように設計した。５’末端において、ＯｍｐＡのプロセッシング領域をコードする配列およびＳｐｅＩ制限部位を付加した。３’末端において、ＢａｍＨＩ制限部位とともに停止コドンを付加した。
【０３１７】

（制限部位はイタリックで示し、ＯｍｐＡプロセッシング認識部位は下線で示す）
【０３１８】
正確なサイズの断片を、鋳型として胎盤ｃＤＮＡを用いてＰＣＲによって得た。ＰＣＲ産物をＳｐｅＩ／ＢａｍＨＩで切断し、改変ｏｍｐＡシグナル配列を含むＳｐｅＩ／ＢａｍＨＩで制限処理したベクターｐＴｒｃ８０１に連結してプラスミドｐＴｒｃ８０１−Ａｐｏｍを作製した。プロセッシングされると、この配列はアポミグレンペプチドとなる。
【０３１９】
１４．４ 　内皮細胞増殖を阻害するサルモネラ菌によって産生される抗血管新生ペプチド
ｐＴｒｃＯｍｐＡ−エンドスタチン、ｐＴｒｃ８０１−ＰＦ４およびｐＴｒｃ８０１−１３．４０プラスミドを弱毒化腫瘍標的サルモネラＶＮＰ２０００９株にエレクトロポレートした。ｐＴｒｃＯｍｐＡ−エンドスタチン、ｐＴｒｃ８０１−ＰＦ４およびｐＴｒｃ８０１−１３．４０を発現するサルモネラ株を、Ｆｅｌｄｍａｎら， ２０００， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ６０：１５０３−１５０６およびＢｌｅｚｉｎｇｅｒら， １９９９， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ． １７：３４３−３４８により記載されてように、抗増殖活性に関してスクリーニングした。各コロニーの培養物５ｍｌを４時間増殖させた。１００ｍｇ／ｍｌゲンタマイシンを含有する１／２０容量のＨＵＶＥＣ培地に細胞ペレットを再懸濁させ、３回連続して凍結／解凍サイクルを行うことで細胞溶菌液を作製した。この溶菌液を遠心分離して明澄化し、０．２ｍｍのシリンジフィルターを用いて濾過除菌した。この溶菌液２５または５０ｍｌを、１００ｍｌ基本培地２％ＦＣＳおよび１０ｎｇ／ｍｌＦＧＦを含有する９６ウェルプレート中のヒト静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）に添加した。対照として空のｐＴｒｃベクターを含むサルモネラ菌を用いた。プレートを７２時間インキュベートし、増殖をＭＳＴアッセイによって測定した（Ｍｏｓｍａｎら， １９８３， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ６５：５５−６３）。
【０３２０】
図１９および２０で得られた予備的結果は、サルモネラ菌によって産生された血小板第４因子ペプチド（ＰＦ４−２）、トロンボスポンジンペプチド１３．４０（１３．４０−３）およびエンドスタチンが４０ないし６０％の抗増殖活性を有すると思われることが示される。
【０３２１】
１５． 　実施例：弱毒化腫瘍標的サルモネラ菌によるバクテリオシンファミリーのメンバーの発現
この実施例はバクテリオシンファミリーのメンバーをコードする核酸を含む、サルモネラ菌などの弱毒化腫瘍標的細菌がバクテリオシンファミリーのメンバーを発現することができることを示す。
【０３２２】
１５．１ 　 ＣＯＬＥ３ プラスミドの構築
本明細書に記載のプラスミドは本発明の特定の実施形態の例を示すものである。当業者には明らかなように、ｔｒｃプロモーターおよび／またはバクテリオシンをコードする核酸のようなプロモーターおよび／またはエフェクター分子をコードする核酸は、当業者に公知の方法によって他の適当なプロモーターまたはエフェクター分子と置き換えてもよい。
【０３２３】
１５．１．１． 　 ｐＥ３． シャトル −１ （ ｓｈｕｔｔｌｅ−１ ）中間体ベクタープラスミド
ｐＥ３．シャトル−１は、複数のクローニング部位及びプラスミドベクターＣｏｌＥ３−ＣＡ３８（配列番号３４）中へのクローニング／選択のためのｌａｃＺ断片を含むカセットを作製するために用いられる中間体ベクターを示す。ＢＲＰのＥ３へのクローニングを容易にするために、ＢＲＰを先ず中間体シャトルベクター上にクローニングした（図２１）。このベクターは、染色体ｌａｃＺ中の突然変異（群）を有する細菌株中のラクトースに関してクローンを選択するために使用できるｌａｃＺ断片を含んでいる。次いで、ＢＲＰ断片を、ｌａｃＺα相補性断片を含むカセットとして、Ｅ３プラスミドＳｍａＩ部位（図２２）中にクローニングした。ｌａｃＺ断片によって、このステップにおけるインサートの選択（すなわち、Ｌａｃ＋）が可能になる。天然に存在するＥ３プラスミドは、抗生物質選択マーカーを有していない（図２３）が、プラスミドの存在の選択は、ハローアッセイ（ｈａｌｏ ａｓｓａｙ；Ｐｕｇｓｌｅｙ， Ａ．Ｐ．及びＯｕｄｅｇａ， Ｂ．、”コリシン類及びそれらのプラスミドの研究方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｓｔｕｄｙｉｎｇ Ｃｏｌｉｃｉｎｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｐｌａｓｍｉｄｓ）”、「Ｐｌａｓｍｉｄｓ， ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ」 １９８７、Ｋ．Ｇ． Ｈａｒｄｙ編集；Ｇｉｌｓｏｎ， Ｌ．ら、ＥＭＢＯ Ｊ． ９：３８７５−３８８４）を用いることによって可能である。このシャトルベクターは、ＢＲＰのＥ３プラスミド上へのクローニングだけでなく、Ｅ３又はＥ３／ＢＲＰと組み合わせうる任意のＤＮＡのクローニングをも容易にするはずである。次いで、新規なＥ３／ＢＲＰプラスミドを、４１．２．９中に形質転換し、活性を試験した。予備的なハロー形成アッセイ（ｈａｌｏ ｆｏｒｍｉｎｇ ａｓｓａｙｓ）によって、プラスミド上のＢＲＰの存在が、この株のＥ３を産生する能力を妨害しないことが証明された。４１．２．９ Ｅ３／ＢＲＰが、４１．２．９ Ｅ３を超えて活性を増大させたか否かを判定するため、各株によって産生されたＥ３の致死ユニット量を測定した（図２４）。４１．２．９ Ｅ３／ＢＲＰは、４１．２．９ Ｅ３単独よりも１００％多い致死ユニットを産生し、これにより、この株が４１．２．９ Ｅ３単独を超える増大した活性を有することが証明された。
【０３２４】
１５．１．２． 　 Ｅ３ 活性に関するハロー「穿刺」アッセイ（ ｈａｌｏ ”ｓｔａｂ” ａｓｓａｙ ）
感受性試験株（ＳＫ５２２）を、ＯＤ_６００が０．８になるまで増殖させる。試験株１００μｌを、（１００×１５ｍｍディッシュに対して）３ｍｌの加温した（約５５℃）ＬＢ軟寒天に添加し、素早くＬＢ寒天プレート上に注ぐ。このプレートを穏やかに揺とうしてプレート全体に均一に広げ、寒天を１０〜１５分間かけて固化させる。Ｅ３活性アッセイが望まれる大腸菌又はサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）のコロニーを、滅菌したつまようじ（ｔｏｏｔｈｐｉｃｋ）で単離し、寒天中に「穿刺（ｓｔａｂｂｅｄ）」する。次いで、この寒天プレートを、逆さまにして３７℃で一晩インキュベートする。次の日、分泌されたコリシンＥ３が感受性株を殺傷するので、ハロー又は透明領域（ｃｌｅａｒｉｎｇ ｚｏｎｅ）がＥ３穿刺の周囲に現れる。コロニーは、さらに誘導されて、アルキル化剤（例えば、マイトマイシン）、紫外線又はＸ線などの多様なＳＯＳ誘導試薬のいずれかによる処理によって、Ｅ３の産生又は分泌を増加させることができる。
【０３２５】
１つのハローアッセイの結果を図２５に示す。ある細菌株がペトリ皿上の細菌巣（ｌａｗｎ）上で増殖した感受性株の存在下でコリシンを分泌すると、分泌されたコリシンは、外側に広がり（ｄｉｆｆｕｓｅｓ ｏｕｔ）、細菌巣中に含まれている細菌細胞を殺傷し、それらを溶解して透明領域又はハローを作りだす。ハローの大きさは、分泌されたコリシン量に対応している。図２５に示される結果は、多数の株を示している。ｃｏｌＥ３−ＣＡ３８プラスミドを含んでいない株の回りには、ハローは絶対に観察されない。誘導剤（ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ）の不存在下では、コリシンはサルモネラ株によって産生される。また、種々のタイプの誘導剤（すなわち、アルキル化剤、紫外線、Ｘ線）によって、全てのハローは用量依存的にその大きさを増すという証拠がある。
【０３２６】
１５．１．３． 　選択的 Ｅ３ クローンのオーバーレイアッセイ
形質転換体を種々の希釈濃度（１：１０，０００まで）でＬＢ上にプレーティングし、３７℃で２時間増殖させる。次いで、感受性試験株をハローアッセイで上記の様に調製し、軟寒天によってオーバーレイを注ぐ。１０分間固化させた後、次いで、プレートを逆さまにし、３７℃で一晩インキュベートする。次いで、次の日に、透明領域の中央に小さなコロニー（又はコロニー群）を伴って、（バクテリオファージのプラークに似た）小さな透明領域が現れる。
【０３２７】
１５．１．４． 　「プラーク」又はハロー精製アッセイ
次に、上記のオーバーレイ寒天の透明領域の中心の小さなコロニーを、滅菌したパスツールピペットを用いて単離する。目に見えるコロニーが無いか、又は１つのハロー中に複数のコロニー群が有る場合のいずれかの場合には、ハロー全体を滅菌したパスツールピペットで吸い取る。コロニー又はハローを５００μｌのＬＢ中に移す。希釈（１：１０，０００まで）を行い、ＬＢ寒天上に戻し、３７℃で２時間増殖させる。次いで、オーバーレイを上述した感受性試験株に注ぐ。次の日、コロニー群の全部又は殆どが、それらの回りにハローを有するはずである。
【０３２８】
１６． 　実施例： Ｅ３ の ｉｎ ｖｉｖｏ 注射、及びサルモネラ中のプラスミド保持率（％）の 測定
下記実施例によって、ｉｎ ｖｉｖｏでのサルモネラ中のｃｏｌＥ３−ＣＡ３８プラスミドの保持を証明する。
【０３２９】
４１．２．９（又は４１．２．９Ｅ３−ＣＡ３８）のいずれかの注射の３０日後の２匹のマウス由来の腫瘍及び肝臓のホモジェネートを、この研究に用いた。下記の記載中において、Ｌ＝肝臓、Ｔ＝腫瘍である。４つ全てのホモジェネートをＣＦＵのためにプレーティングし、コロニー群をｍｓｂＢ ＰＣＲによる分析及びコリシン産生のためにかきとった。４１．２．９に類似するコロニーのほぼ純粋な培養物を全てのホモジェネートから得た。それぞれから、５つのコロニーを、コリシン及びＰＣＲ分析のためにかきとった。さらに４１．２．９ Ｅ３肝臓ホモジェネート中のコリシン産生体（ｐｒｏｄｕｃｅｒｓ）及び非産生体の混合集団であるように見える３０個のコロニーを、さらなる分析のために、４１．２．９ Ｅ３ Ｔ及びＬプレートからかきとった。これらの結果に基づいて、４１．２．９ Ｅ３腫瘍及び肝臓由来のさらに１００個のコロニーをかき取り、コリシン産生及びｍｓｂＢ ＰＣＲについて試験した。分布及びプラスミド保持率を組み合わせた日付（ｃｏｍｂｉｎｄｅｄ ｄａｔｅ）から算出した。
【０３３０】
ｉｎ ｖｉｖｏでのＥ３注射、サルモネラ中のプラスミドの保持率（％）の測定の結果を下記表３に示す。
【０３３１】
【表３】

【０３３２】
ｃｏｌＥ３プラスミドがｉｎ ｖｉｖｏで効果を有するようにするため、及びそれがｉｎ ｖｉｖｏで腫瘍部位に他の遺伝子を運搬するために、ｃｏｌＥ３プラスミドは、ｉｎ ｖｉｖｏで効力を有するように保持されていなければならない。エフェクターの標的は腫瘍であるので、この実験で得られた結果は、驚くべきことであり、また利点を有し、従って、肝臓それ自体への影響は少ないであろう。
【０３３３】
１７． 　実施例： Ｍ２７ 肺腫瘍モデルでの種々の ４１．２．９． 株の腫瘍標的化
下記実験によって、４１．２．９ ｃｏｌＥ３及び４１．２．９ ｃｏｌＥ３ ＢＲＰ及び４１．２．９ ｃｏｌＥ３ ＢＲＰ−ｍ（改変ＢＲＰ）サルモネラ株の腫瘍を標的とする能力を証明する。
【０３３４】
下記表４に列挙されたサルモネラ株をＭ２７肺腫瘍を有する動物に注射し、動物を７日目に犠牲にした。臓器重量を、ｃｆｕ／ｇの算出のために、次の日にアッセイした。腫瘍及び肝臓をホモジェネートし、ｍｓｂＢ上に置き、コロニー形成単位（ｃ．ｆ．ｕ．）を測定した。グループ１、２、４、及び６では、全ての株が、肝臓では６×１０^４〜４×１０^６ｃｆｕ／ｇの範囲で種々の蓄積量を伴って、腫瘍中では約４×１０^８ｃｆｕ／ｇまで蓄積された。表４は、全てのグループのデータをまとめたものであり、平均ｃｆｕ／ｇで示されている。全ての株が良好な腫瘍蓄積量（１０^８ｃ．ｆ．ｕ．／グラム組織より良好）を有することが見出され、全ての株が正の腫瘍対肝臓比を与えた。ＢＲＰ ｃｏｌＥ３は、最良の比を有するが、他の全ての利用可能な株よりも必ずしも良好ではなかった。Ｅ３及びＥ３ ＢＲＰ株は、腫瘍対肝臓比が１００〜２００：１の間で腫瘍において相当に高い濃度まで蓄積する。
【０３３５】
【表４】

^１：ＢＲＰ_ｍとは、９６位（ＧからＡへの変異であり、グリシンからアルギニンへのアミノ酸変化をもたらす）及び１１４位（ＴからＡへの変異であり、セリンからスレオニンへのアミノ酸変化をもたらす）での点突然変異を含む改変ＢＲＰをいう。突然変異体ＢＲＰ_ｍは、もはや同様の溶解（ｑｕａｓｉ ｌｙｓｉｓ）を起こさないが、まだ細菌からのタンパク質分泌能を有する（ｖａｎ ｄｅｒ Ｗａｌ， Ｆ．， Ｋｏｎｉｎｇｓｔｅｉｎ， Ｇ．， Ｔｅｎ Ｈａｇｅｎ， Ｃ．Ｍ．， Ｏｕｄｅｇａ， Ｂ．及びＬｕｉｒｉｎｋ， Ｊ． （１９９８）、大腸菌によるバクテリオシン放出タンパク質（ＢＲＰ）仲介タンパク質放出の最適化：タンパク質放出から致死率及び同様の溶解を切り離すためのｐＣｌｏＤＦ１３誘導性ＢＲＰ遺伝子の無作為突然変異（Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｃｉｎ Ｒｅｌｅａｓｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ （ＢＲＰ）−Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｌｅａｓｅ ｂｙ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ： Ｒａｎｄｏｍ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ ｐＣｌｏＤＦ１３−Ｄｅｒｉｖｅｄ ＢＲＰ Ｇｅｎｅ ｔｏ Ｕｎｃｏｕｐｌｅ Ｌｅｔｈａｌｉｔｙ ａｎｄ Ｑｕａｓｉ−Ｌｙｓｉｓ ｆｒｏｍ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｌｅａｓｅ）， Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ． ６４， ｐｐ． ３９２−３９８）。
【０３３６】
１８． 　実施例： Ｃ３８ ネズミ大腸癌への ４１．２．９／ＣｏｌＥ３ の効力
下記実施例によって、Ｃ３８ネズミ大腸癌の増殖を阻害する４１．２．９／ＣｏｌＥ３の能力を証明する。
【０３３７】
大腸３８腫瘍断片（２×２×２ｍｍ^３）を、Ｃ５７ＢＬ／６マウス（雌、９週令）の皮下に埋め込んだ。腫瘍の体積が１，０００ｍｍ^３に達した後、滅菌条件下でマウスから腫瘍を除去し、小さな断片（約２×２×２ｍｍ^３／断片）に切断し、上記操作を５回繰り返した。腫瘍埋め込みの０日目に腫瘍埋め込み針（ｔｕｍｏｒ ｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｎｅｅｄｌｅ）を用いて、断片をマウスの右脇腹の皮下に埋め込んだ。
【０３３８】
腫瘍体積が１５０〜２００ｍｍ^３に達したときに、動物をサルモネラ投与の０日目に無作為化した。凍結保存されていた４１．２．９及び４１．２．９／ＣｏｌＥ３を室温で解凍し、ＰＢＳで希釈してそれぞれ最終濃度７．５×１０^６ｃｆｕ／ｍｌとした。０．２ｍｌの細菌懸濁液のアリコート（１．５×１０^６ＣＦＵ／マウス）を、０日目に記載のグループのマウスに静脈内投与した。細菌懸濁液を１×１０^３ＣＦＵまで希釈し、ｍｓｂＢプレート上にプレーティングし、一晩インキュベートして、投与された細菌ｃｆｕの数を測定した。実験の終わりまで、週２回腫瘍を測定した。各グループ（ＣｏｌＥ３）の３つの腫瘍を解剖し、ｃｆｕ及びプラスミドの保持率を測定するために処理した。
【０３３９】

【０３４０】
４１．２．９／ＣｏｌＥ３のＣ３８ネズミ大腸癌への効力の結果を図２６に示す。このデータは、ＶＮＰ２０００９（４１．２．９）の静脈内注射によって処置されたマウスがＣ３８ネズミ大腸癌の増殖を有意に阻害することができることを証明している。さらに、マウスをＣｏｌＥ３プラスミドを含有するＶＮＰ２０００９で処置すると、腫瘍退化（すなわち、腫瘍が、実験の初めよりも実験の終わりの方が小さい）が達成された。
【０３４１】
１９． 　実施例：ヌードマウス中の ＤＬＤ１ ヒト大腸癌に対する ＶＮＰ２０００９／ＣｏｌＥ３ の抗腫瘍活性
下記実施例によって、サルモネラ突然変異体４１．２．９に対するＤＬＤ１ヒト大腸癌の増殖を阻害する、サルモネラ突然変異体ＶＮＰ２０００９／ＣｏｌＥ３（４１．２．９／ＣｏｌＥ３）の増大した能力を証明する。
【０３４２】
対数増殖期に増殖したＤＬＤ１細胞をトリプシン処理によって除去し、ＰＢＳで洗浄し、５×１０^７細胞／ｍｌ ＰＢＳに再構成した。細胞懸濁液（０．１ｍｌ）をヌードマウス（Ｎｕ／Ｎｕ−ＣＤ１雌、９週令；Ｃｈａｒｌｅｄ Ｒｉｖｅｒ社より）の右脇腹に、０日目に単回皮下注射した（５×１０^６細胞／マウス）。１０匹の動物を各グループで用い、腫瘍サイズが３００〜４００ｍｍ^３に達する、腫瘍埋め込みの約１０〜１５日後に無作為化し、供試した（ｓｔａｇｅｄ）。サルモネラ突然変異体４１．２．９及び４１．２．９／ＣｏｌＥ３のＣＦＵを１日前に計数した。細菌（４１．２．９及び４１．２．９／ＣｏｌＥ３）を１×１０^７ＣＦＵ／ｍｌに希釈した。０．２ｍｌの細菌懸濁液のアリコート（２×１０^６ＣＦＵ／マウス）を、所定の日にマウスに皮下注射した。細菌懸濁液を１×１０^３ＣＦＵに希釈し、各溶液１００μｌをｍｓｂＢプレート上にプレーティングし、このプレートを一晩インキュベートした。次の日に細菌コロニーを計数した。腫瘍は、週２回測定した。
【０３４３】

　ヌードマウス中のＤＬＤ１ヒト大腸癌に対する４１．２．９／ＣｏｌＥ３の抗腫瘍活性の結果を図２７に示す。コリシンＥ３含有４１．２．９株は、４１．２．９株単独に比べて増大した活性を示す。
【０３４４】
２０． 　実施例： Ｃ５７ＢＬ／６ マウスの Ｂ１６ ネズミ黒色腫に対する ４１．２．９／ＣｏｌＥ３ の効力
下記実施例によって、サルモネラ突然変異体４１．２．９／ＣｏｌＥ３の、Ｂ１６−Ｆ１０黒色腫の増殖を阻害する能力を証明する。
【０３４５】
対数増殖期で増殖するＢ１６−Ｆ１０細胞を、トリプリン処理によって除去し、ＰＢＳで洗浄し、５×１０^６細胞／ｍｌ ＰＢＳに再構成した。細胞懸濁液（０．１ｍｌ）をＣ５７ＢＬ／６マウス（雌、９週令）の右脇腹に０日目に単回皮下注射した（５×１０^５細胞／マウス）。１０匹の動物を各グループで用い、腫瘍体積が１５０〜２００ｍｍ^３に達する９日目に無作為化した。凍結保存されていたサルモネラクローン４１．２．９及び４１．２．９／ＣｏｌＥ３を室温で解凍し、ＰＢＳで希釈してそれぞれ最終濃度７．５×１０^６ｃｆｕ／ｍｌとした。０．２ｍｌの細菌懸濁液のアリコート（１．５×１０^６ＣＦＵ／マウス）を、９日目に所定のグループのマウスに静脈内投与した。細菌懸濁液を１×１０^３ＣＦＵに希釈し、ｍｓｂＢプレート上にプレーティングし、一晩インキュベートして、投与された細菌ｃｆｕの数を測定した。腫瘍は、実験の終わりまで週２回測定した。
【０３４６】

　Ｃ５７ＢＬ／６マウス中のＢ１６ネズミ黒色腫に対する４１．２．９／ＣｏｌＥ３の効力の結果を図２８に示す。データは、４１．２．９（４１．２．９）による静脈内注射によって処置されたマウスが、Ｂ１６ネズミ黒色腫の増殖を有意に阻害できることを証明している。さらに、４１．２．９／ＣｏｌＥ３によって処置されたマウスは、４１．２．９単独に比べて早い時点（最高３７日まで）に腫瘍サイズの有意な減少を示した。より小さい腫瘍サイズは、より容易に他の治療剤（例えば、化学療法剤及びＸ線などの照射）の影響を受け易いので、この知見は非常に重要である。
【０３４７】
２１． 　実施例： ＢＲＰ と組み合わせた ４１．２．９／Ｅ３ の抗腫瘍効力
下記実施例によって、サルモネラ突然変異体４１．２．９におけるＢＲＰとＥ３の共発現が突然変異体の抗腫瘍効力を増加させることを証明する。
【０３４８】
サルモネラ突然変異体４１．２．９におけるＢＲＰとＥ３の共発現は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで細菌から分泌されるＥ３の量を増加させる。ＢＲＰがｉｎ ｖｉｖｏでサルモネラから分泌されるＥ３の量を増加させうる場合には、この追加的な細胞外Ｅ３が腫瘍細胞に容易に利用可能であり、従ってこれらの細胞に対する細胞毒性を増加させるという仮説を立てることができるであろう。この実験では、４つの動物グループ（グループ当たり１０匹の動物）を試験した：

　この実験で用いたモデルは、ヒト肺癌系統ＨＴＢ１７７とした。細胞を１日目にマウスの脇腹の皮下に埋め込んだ。腫瘍がおよそ５００ｍｍ^３に達した１４日目に、動物に上記表に記載の株の１×１０^６ｃｆｕ、又はグループ１の場合には生理食塩水を静脈内注射により注射した。腫瘍体積は、２４日目まで毎週測定した。表５の結果は、４１．２．９が単独で腫瘍増殖を阻害でき（４０％阻害）、一方、Ｅ３との組み合わせは抗腫瘍効力を増大させる（６３％）ことができることを示している。しかしながら、Ｅ３及びＢＲＰの両者を有する株をこのモデルで用いた場合、抗腫瘍効力はさらに増大し（未処置コントロールに比べて６７％阻害）、増大した阻害率は、より早い時点で非常に有意である（表５）。
【０３４９】
【表５】

【０３５０】
結論として、細胞毒性コリシンＥ３及び機能強化された（ｅｎｈａｎｃｅｄ）分泌系ＢＲＰの両者を有するサルモネラによる処置によって、未処置コントロール及び４１．２．９／Ｅ３単独での処置に比べて抗腫瘍効力が増加する。
【０３５１】
２２． 　実施例：コリシン Ｅ３ 含有サルモネラと Ｘ 線処置との組合せ
下記実施例によって、４１．２．９と２つの用量のＸ線との組み合わせが、Ｘ線単独で見られるよりもマウスの生存期間を有意に延長することを証明する。
【０３５２】
スケジュールは次の通りである：０日目に、１００匹のＣ５７Ｂ６雌マウス（５〜７週令）の身体の中心（ｍｉｄ ｂｏｄｙ）の右側の皮下にＢ１６Ｆ１０黒色腫（５×１０^５細胞／マウス）を投与することによって腫瘍を埋め込んだ。、８日目に、コリシンＥ３含有サルモネラ４１．２．９を注射し、１２日目及び２６日目に、Ｘ線を照射した。
【０３５３】
コリシンＥ３含有サルモネラとＸ線処置との組み合わせの結果を表６に示す。
【０３５４】
【表６】

【０３５５】
このデータは、４１．２．９と２つの用量のＸ線との組み合わせが、Ｘ線単独で見られるよりもマウスの生存期間を有意に延長することを証明している。Ｅ３は、４１．２．９＋Ｘ線で見られるよりもマウスの生存期間をさらに延長させた。
【０３５６】
２３． 　実施例：腫瘍標的細菌による細胞傷害性壊死因子の発現
下記実施例によって、腫瘍標的細菌による大腸菌細胞傷害性壊死因子１（ＣＮＦ１）の発現を証明する。
【０３５７】
細胞傷害性壊死因子としては、以下に限定されないが、大腸菌細胞傷害性壊死因子１（ＣＮＦ１；Ｆａｌｂｏら， １９９３， Ｉｎｆｅｃｔ． Ｉｍｍｕｎ． ６１：４９０４−４９１４）、ビブリオ・フィシェリ（Ｖｉｂｒｉｏ ｆｉｓｃｈｅｒｉ）ＣＮＦ１（Ｌｉｎら， １９９８， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍ． ２５０：４６２−４６５）及び大腸菌細胞傷害性壊死因子２（ＣＮＦ２；Ｓｕｇａｉら， １９９９， Ｉｎｆｅｃｔ． Ｉｍｍｕｎ． ６７：６５５０−６５５７）が挙げられる。また、ＣＮＦファミリーとしては、ＣＮＦ２のＮ末端部分と、２７％の同一の残基及び８０％の保存された残基を有するパスツレラ・ムルチオシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｉｏｃｉｄａ）毒素（ＰＭＴ）（Ｏｓｗａｌｄら， １９９４， Ｐｒｏｃ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１：３８１４−３８１８）も挙げられる。
【０３５８】
ＣＮＦ１は、大腸菌１９６（ＡＴＣＣ ７００３３６）から、標準的なＰＣＲを用いて、プライマー、（フォワード）５’−ＧＴＧＴＣＡＴＧＡＡＡＡＴＧＧＧＴＡＡＣＣＡＡＴＧＧＣＡＡＣ−３’（配列番号３５）及び（リバース）５’−ＣＡＣＡＧＡＧＣＴＣＧＣＧＣＴＡＡＣＡＡＡＡＣＡＧＣＡＣＡＡＧＧＧＡＧ−３’（配列番号３６）を用いたＰＣＲによってクローニングした。約３１００ｂｐの産物が得られ、タンパク質の発現並びにＤＮＡクローニング宿主として大腸菌を用いるＤＮＡシーケンシングのためにｐＴｒｃ９９ａのＮｃｏＩ及びＳａｃＩ部位中にクローニングした。ＤＮＡシーケンシングは、エール大学ケックバイオテクノロジー研究室（Ｙａｌｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｋｅｃｋ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）の標準的な方法によって行った。ＤＮＡシーケンシングによって、クローン化ＰＣＲ産物が、３０６５塩基対のうちの６つのほんの小さな配列変異を有するＣＮＦ１であることを確認した。
【０３５９】
ＣＮＦ１プラスミドを、大腸菌ＤＮＡクローニング宿主ＤＨ５α及びサルモネラＹＳ１６４６株（国際公開第ＷＯ９９／１３０５３号）中に電気穿孔した。標準的なＬＤＨアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製、マディソン、ウィスコンシン州、Ｃｙｔｏｔｏｘ ９６（登録商標））を用いて、大腸菌ＤＮＡクローニング宿主及びサルモネラＹＳ１６４９株におけるＣＮＦ１の発現を測定した。図２９は、ＣＮＦ含有プラスミドの存在が細胞毒性の増大をもたらすことを示している。続くアッセイを用いて、ＣＮＦ含有プラスミドを有するサルモネラが多核化（ｍｕｌｔｉｎｕｃｌｅａｔｉｏｎ）（Ｒｙｃｋｅら， １９９０， Ｊ．Ｃｌｉｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ２８：６９４−６９９）などのＣＮＦ１の他の既知の特性をも示すことを示した。ＣＮＦ１に暴露したＨｅｌａ細胞の核を、光学顕微鏡法によって試験した。図３０の結果は、サルモネラ中にＣＮＦ１が存在することによって期待される多核化及び細胞肥大（ｃｅｌｌ ｅｎｌａｒｇｅｍｅｎｔ）がもたらされることを明瞭に示している。
【０３６０】
２４． 　実施例：腫瘍標的細菌によるベロ毒素の発現
下記実施例によって、ベロ毒素ＡＢを発現するように遺伝子操作された腫瘍標的細菌によって産生されるベロ毒素ＡＢの細胞毒性を証明する。
【０３６１】
ベロ毒素（合成（ｓｙｎ．）ＨＳＣ１０毒素、シガ（Ｓｈｉｇａ）毒素、シガ様毒素、シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）毒素）。この毒素は、コリシン産生大腸菌ＨＳＣ１０株から単離されたものであり、元々はコリシンであると考えられていた（Ｆａｒｋａｓ−Ｈｉｍｓｌｅｙら， １９９５， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ９２（１５）： ６９９６−７０００）。それは抗腫瘍活性、特に卵巣癌及び脳腫瘍に対する抗腫瘍活性の長い歴史を有しているが、この抗腫瘍活性は、生きている細菌全体ではなく、精製された調製物と関係している。
【０３６２】
ベロ毒素を、ベロ毒素Ｉの公開されている配列に基づくプライマーを用いて大腸菌ＨＳＣ１０（ＡＴＣＣ ５５２２７）からクローニングし、標準的なＤＮＡシーケンシング法を用いて、エール・ケック・バイオテクノロジー・センター（Ｙａｌｅ Ｋｅｃｋ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｅｎｔｅｒ）でのＤＮＡシーケンシングによって確認した。ベロ毒素の発現は、ベロ毒素Ａ及びＢサブユニットによる多シストロン性のテトラサイクリン誘導性プロモーターの制御下で、ＢＲＰ遺伝子を用いて達成した。このテトラサイクリン誘導性ＢＲＰベロ毒素ＡＢを、ｍｓｂＢ遺伝子を用いる染色体組み込みのためのベクター中にクローニングした。
【０３６３】
２４．１． 　ベクターの構築
２４．１．１． 　 ＡＢ の増幅及びクローニング
ベロ毒素ＡＢ（ＡＢ）は、下記プライマーを用いるＰＣＲによって生成した：
Ｈ１９Ｂ−７：フォワード：５’−ＧＴＧＴＣＣＡＴＧＧＣＴＡＡＡＡＣＡＴＴＡＴＴＡＡＴＡＧＣＴＧＣＡＴＣＧＣ−３’（配列番号３７）；及び
ＱＳＴＸ−Ｒ１：リバース：５’−ＧＴＧＴＣＴＧＣＡＧＡＡＣＴＧＡＣＴＧＡＡＴＴＧＡＧＡＴＧ−３’（配列番号３８）。
【０３６４】
また、これらのプライマーは、ｐｔｒｃ９９ＡのＮｃｏＩ及びＰｓｔＩ部位中にクローニングするための外側のＮｃｏＩ（５’）及びＰｓｔＩ（３’）制限エンドヌクレアーゼ部位を含んでいる。
【０３６５】
２４．１．２． 　 ＴｅｔＢＲＰ の増幅及びクローニング
ＴｅｔＢＲＰ−ＡＢを、中間体ベクターｐＳＰ７２−Ｆ６／Ｒ６中に構築した。ＴｅｔＢＲＰは、次のプライマーを用いてＰＣＲによって生成した：Ｔｅｔ−５’：フォワード５’−ＧＴＧＴＡＧＡＴＣＴＴＴＡＡＧＡＣＣＣＡＣＴＴＴＣＡＣＡＴＴＴＡＡＧＴＴＧ−３’（配列番号３９）及びＢＲＰ−ＴＥＴ−３’：リバース５’−ＣＡＣＡＧＧＡＴＣＣＴＴＡＣＴＧＡＡＣＣＧＣＧＡＴＣＣＣＣＧ−３’（配列番号４０）。これらのプライマーは、ｐＳＰ７２−Ｆ６／Ｒ６ベクターのＢｇｌＩＩ及びＢａｍＨＩ部位中にクローニングするためのＢｇｌＩＩ（５’）及びＢａｍＨＩ（３’）制限エンドヌクレアーゼ部位を含んでいる。
【０３６６】
２４．１．３． 　 ｐＳＰ７２−Ｆ６／Ｒ６−ＴｅｔＢＲＰ 中への ＡＢ のサブクローニング
ｐｔｒｃ９９Ａ−ＡＢを、ｐＳＰ７２Ｆ６／Ｒ６−ＴｅｔＢＲＰ中に挿入するためにＢａｍＨＩ及びＡｖａＩ制限エンドヌクレアーゼで消化してＡＢを除去し、また、ＢａｍＨＩ及びＡｖａＩ制限エンドヌクレアーゼで消化した。ｐＳＰ７２Ｆ６／Ｒ６ベクターは、トランスで（ｉｎ ｔｒａｎｓ）ｌａｃＺ−α相補性のためのβ−ｇａｌ遺伝子の部分の他に、クローニングのための複数の制限エンドヌクレアーゼ部位を含んでいる。ベクター（ｐＳＰ７２Ｆ６／Ｒ６−ＴｅｔＢＲＰ）及びＡＢインサートの両者は、０．８％１ＸＴＡＥアガロースゲル上で分離し、キアーゲン（Ｑｉａｇｅｎ）ゲル抽出キットを用いて精製した。Ｔ４リガーゼを用いて、ベクター及びインサートを連結し、熱ショック法を用いてＤＨ５ａ大腸菌細胞中に形質転換した。この細胞を、１００μｇ／ｍｌのＡｍｐ及び４０μｇ／ｍｌのＸ−ｇａｌを含有するＬＢプレートにプレーティングした。アンピシリン耐性及び機能性β−ｇａｌ遺伝子の存在に基づいて陽性コロニーを選択した（陽性コロニーは青色だった）。
【０３６７】
２４．１．４． 　 ｐＣＤＶ４４２ 中への ＴｅｔＢＲＰ−ＡＢ のサブクローニング
ｐＳＰ７２Ｆ６／Ｒ６−ＴｅｔＢＲＰ−ＡＢを、ｐＣＶＤ４４２ベクター中にサブクローニングするためにＮｏｔＩ及びＳｆｉＩ制限エンドヌクレアーゼで消化し、また、ＮｏｔＩ及びＳｆｉＩ制限エンドヌクレアーゼで消化した。
【０３６８】
２４．１．５． 　 ｍｓｂＢ 染色体ベクター
ＶＮＰ２０００９株の染色体中のＤｍｓｂＢ遺伝子との相同組み換えを行うことができるベクター（国際公開第ＷＯ９９／１３０５３号中のａ．ｋ．ａ． ＹＳ１６４６）を、自殺ベクターｐＣＶＤ４４２（Ｄｏｎｎｅｎｂｅｒｇ及びＫａｐｅｒ， １９９１， Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ５９： ４３１０−４３１７）中に構築した。２つの別の産物としてＶＮＰ２０００９中に存在するｍｓｂＢ欠損の５’及び３’側切片の部分を生産する、ＰＣＲ用のプライマーを設計した（ｍｓｂＢ−５’：フォワード５’−ＧＴＧ ＴＧＡ ＧＣＴ ＣＧＡ ＴＣＡ ＡＣＣ ＡＧＣ ＡＡＧ ＣＣＧ ＴＴＡ ＡＣＣ ＣＴＣ ＴＧＡ Ｃ−３’（配列番号４１）及びリバース５’−ＧＴＧ ＴＧＣ ＡＴＧ ＣＧＧ ＧＧＧ ＧＣＣ ＡＴＡ ＴＡＧ ＧＣＣ ＧＧＧ ＧＡＴ ＴＴＡ ＡＡＴ ＧＣＡ ＡＡＣ ＧＴＣ ＣＧＣ ＣＧＡ ＡＡＣ ＧＣＣ ＧＡＣ ＧＣＡ Ｃ−３’（配列番号４２）；並びにｍｓｂＢ−３’：フォワード５’−ＧＴＧ ＴＧＣ ＡＴＧ ＣＧＧ ＧＧＴ ＴＡＡ ＴＴＡ ＡＧＧ ＧＧＧ ＣＧＧ ＣＣＧ ＣＧＴ ＧＧＴ ＡＴＴ ＧＧＴ ＴＧＡ ＡＣＣ ＧＡＣ ＧＧＴ ＧＣＴ ＣＡＴ ＧＡＣ ＡＴＣ ＧＣ−３’（配列番号４３）及びリバース５’−ＧＴＧ ＴＣＴ ＣＧＡ ＧＧＡ ＴＡＴ ＣＡＴ ＴＣＴ ＧＧＣ ＣＴＣ ＴＧＡ ＣＧＴ ＴＧＴ Ｇ−３’（配列番号４４））。また、これらのプライマーは、これらの２つの断片が共通のＳｐｈＩ部位を介して結合するときに、ｐＣＶＤ４４２のＳａｃＩ及びＳａｌＩ部位中へのクローニングを容易にするために、外側のＳａｃＩ（５’）及びＡｃａＩ（３’）制限エンドヌクレアーゼ部位を含み、抗生物質耐性を伴わない安定な染色体組み込みのためのＤＮＡ断片のＤｍｓｂＢ中へのクローニングを容易にするために、内部のＮｏｔＩ、ＰａｃＩ、ＳｐｈＩ、ＳｆｉＩ、ＳｗａＩ及びＤｒａＩを生成する（図３１）。このベクターをｐＣＶＤ４４２−ｍｓｂＢと呼ぶ（図３２及び３３を参照されたい）。
【０３６９】
Ｔｅｔ−ＢＲＰ−ＡＢをｐＣＶＤ４４２−ｍｓｂＢ中にクローニングするために、Ｔｅｔ−ＢＲＰ−ＡＢプラスミドＤＮＡを制限消化し、適当なＤＮＡを精製し、Ｔ４リガーゼを用いて、これら２つの構成要素を含む連結反応を行った。次いで、連結反応物をＤＨ５１ ｐｉｒに形質転換し、コロニーをＴｅｔ−ＢＲＰ−ＡＢの存在及び配向でスクリーニングした。Ｔｅｔ−ＢＲＰ−ＡＢクローンをＳＭ１０ １ ｐｉｒ株（前記Ｄｏｎｎｅｎｂｅｒｇ及びＫａｐｅｒ， １９９１）中に形質転換し、そのプラスミドをｐＣＶＤ４４２−Ｔｅｔ−ＢＲＰ−ＡＢと称した。ＳＭ１０ １ ｐｉｒのコロニーを、ＰＣＲによるＴｅｔ−ＢＲＰ−ＡＢ遺伝子についてスクリーニングし、サルモネラ株に対する交配ドナー（ｍａｔｉｎｇ ｄｏｎｏｒ）として用いるために、ＳＭ１０ １ ｐｉｒクローンｐＣＶＤ４４２−Ｔｅｔ−ＢＲＰ−ＡＢを選択した。ｐＣＶＤ４４２−Ｔｅｔ−ＢＲＰ−ＡＢを含有するＳＭ１０ １ ｐｉｒを、標準的な方法（Ｄａｖｉｓ， Ｒ． Ｗ．， Ｂｏｔｓｔｅｉｎ， Ｄ．，及びＲｏｔｈ， Ｊ． Ｒ．， １９８０，最新細菌遺伝学（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ）によって、サルモネラＹＳ５０１０１株（Ｄｉｆｃｏ ＭａｃＣｏｎｋｅｙ寒天に対する増強された耐性を有するテトラサイクリン耐性ＹＳ８２株（前記Ｌｏｗら， １９９９）の自然発生誘導体）と交配し、５０μｇ／ｍＬのカルベニシリン（ｃａｒｂ）及び３００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン（ｓｔｒｅｐ）を含むプレート上で選択した。得られたＹＳ５０１０２−ｐＣＶＤ４４２−Ｔｅｔ−ＢＲＰ−ＡＢクローンを、ＰＣＲによりｐＣＶＤ４４２−Ｔｅｔ−ＢＲＰ−ＡＢ遺伝子についてチェックした。
【０３７０】
２４．２． 　 ４１．２．９−Ｔｅｔ−ＢＲＰ−ＡＢ 株を生産するために染色体に組み込まれた ｐＣＶＤ４４２−Ｔｅｔ−ＢＲＰ−ＡＢ の ４１．２．９ （ ＹＳ１６４６ ）中への送達
ドナーとしてＹＳ５０１０２−Ｔｅｔ−ＢＲＰ−ＡＢ株を用い、バクテリオファージＰ２２（突然変異体ＨＴ１０５／１ ｉｎｔ−２０１；Ｄａｖｉｓら， １９８０）によって、カルベニシリン耐性を４１．２．９に形質導入した。ｐＣＶＤ４４２由来のｂｌａ及びｓａｃＢ遺伝子の存在によって、ＤｍｓｂＢ及びＤｍｓｂＢ−Ｔｅｔ−ＢＲＰ−ＡＢ遺伝子の両者を含む４１．２．９−ｐＣＶＤ−Ｔｅｔ−ＢＲＰ−ＡＢ−１を表すｃａｒｂ^ｒ（又はａｍｐ^ｒ）ｓｕｃ^ｓ株の選択が可能になる（図３３、＃３）。４１．２．９−Ｔｅｔ−ＢＲＰ−ＡＢ−１株をＬＢスクロース上にプレーティングし、ｓｕｃ^ｒ ｃａｒｂ^ｓ誘導体を選択し、ＤｍｓｂＢ遺伝子を除去し、ＬＢ−スクロース寒天プレートを、ＮａＣｌ無しで作製する以外は、前記Ｄｏｎｎｅｎｂｅｒｇ及びＫａｐｅｒ， １９９１（図３３、＃４）の方法に従ってＤｍｓｂＢ−Ｔｅｔ−ＢＲＰ−ＡＢ遺伝子を残し、プレートを３０℃でインキュベートした。これらのプレート上でコロニーが増殖した後、それらをｍｓｂＢプレートにグリッドを据え（ｇｒｉｄｄｅｄ）、抗生物質及びスクロースマーカーの両方を欠損したクローンの存在を検出するために、複製をカルベニシリン又はスクロースのいずれかを含有するプレートにプレーティングした。得られたクローンを、ＰＣＲによりＴｅｔ−ＢＲＰ−ＡＢ遺伝子の存在についてチェックした。染色体に組み込まれたＴｅｔ−ＢＲＰ−ＡＢを含有し、スクロース感受性及びカルベニシリン耐性を欠損している１つの誘導体を、４１．２．９−Ｔｅｔ−ＢＲＰ−ベロ毒素ＡＢと表示した。
【０３７１】
標準的なＬＤＨ細胞毒性アッセイ（Ｃｙｔｏｔｏｘ^９６（登録商標）；Ｐｒｏｍｅｇａ社製、マディソン、ウイスコンシン州）を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏで４１．２．９−Ｔｅｔ−ＢＲＰ−ベロ毒素ＡＢの細胞毒性を試験した。結果を図３４に示す。この結果は、ベロ毒素発現クローン２６及び３１の毒性特性を証明している。クローン２６及び３１は、テトラサイクリンで処理しなかったときよりもテトラサイクリンで処理したときの方が有意に高い細胞毒性率（％）を有していた。
【０３７２】
２５． 　実施例：腫瘍標的細菌による溶血素の発現
下記実施例によって、腫瘍標的細菌を遺伝子操作して溶血素などの溶血性タンパク質を、構成的に又は誘導性制御下で発現できることを証明する。
【０３７３】
溶血素は、赤血球細胞を溶解させる能力を有する、周知の細胞毒性タンパク質である（例えば、Ｂｅｕｔｉｎ， １９９１， Ｍｅｄ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １８０：１６７−１８２）を参照されたい）。ＳｈｅＡ（Ｇｅｎｂａｎｋ番号ＥＣＯ２３８９５４）は、殆どが野生型大腸菌で見出される、通常は発現されないサイレントな溶血素である（Ｆｅｒｎａｎｄｅｚら， １９９８， ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ． １６８：８５−９０）。ＳｈｅＡ（ａ．ｋ．ａ． ｈｌｙＥ；Ｇｅｎｂａｎｋ番号Ｕ５７４３０）は、野生型大腸菌（２５０７株、エール大学大腸菌遺伝子保存センター（Ｙａｌｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｅ． ｃｏｌｉ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｅｒ））から、下記プライマー（フォワード）５’−ＴＴＴＴＴＴＣＣＡＴ ＧＧＣＴＡＴＴＡＴＧ ＡＣＴＧＡＡＡＴＣＧ ＴＴＧＣＡＧＡＴＡＡ ＡＡＣＧＧ−３’（配列番号４５）及び（リバース）５’−ＴＴＴＴＴＴＡＡＧＣ ＴＴＣＣＣＧＧＧＴＣ ＡＧＡＣＴＴＣＡＧＧ ＴＡＣＣＴＣＡＡＡＧ ＡＧＴＧＴＣ−３’（配列番号４６）を用いたＰＣＲによって、標準的なＰＣＲ条件下でクローニングした。正しいサイズのＰＣＲ産物を、部分的に構成性のｔｒｃプロモーター下に置くために、ｐｔｒｃ９９ａ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）のＮｃｏＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ部位中にクローニングした。また、ＰＣＲ産物をＮｃｏＩ及びＥｃｏＲＶによって切断したｔｅｔ−ｂｇａｌ−Ｚ−ｔｅｒｍベクター（前記）中にクローニングした。次いで、大腸菌ＤＨ５ａ（Ｇｉｂｃｏ社製）を、そのプラスミドで形質転換し、０．２μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを添加した及び添加しない血液寒天培地（５％ヒツジ血液を有するトリプシン性ダイズ寒天培地；ＢｉｏＭｅｒｉｅｕｘ社製、ロンバード、イリノイ州）にプレーティングした。溶血を示すコロニーの周りの透明なハローを含むコロニーを陽性コロニーとして取り上げた。陽性コロニーを標準的なプラスミド精製に付し、サルモネラＹＳ５０１に形質転換し、再度ハローについてスクリーニングした。
【０３７４】
構成性のハロー形成を、テトラサイクリンの添加によって又は添加無しにハローが観察される、ｔｒｃ９９ａ構築物について図３５（２Ａ及び２Ｂ）に示す。テトラサイクリン依存性ハロー形成を、テトラサイクリンの添加を伴わずにハローが観察されない、テトラサイクリン−プロモーター誘導性ＳｈｅＡについて図３５（３Ａ及び３Ｂ）に示す。これらの結果は、腫瘍標的細菌が、構成的に又は誘導性制御下で、溶血性タンパク質を発現できることを証明している。
【０３７５】
２６． 　実施例：腫瘍標的細菌によるメチオナーゼの発現
下記実施例によって、サルモネラなどの弱毒化腫瘍標的細菌を遺伝子操作して、メチオナーゼを発現させることができることを証明する。
【０３７６】
メチオナーゼは、腫瘍増殖に必要な必須アミノ酸であるメチオニンを分解する酵素である。腫瘍増殖を阻害するための又はメチオナーゼをコードするＤＮＡ若しくはウイルスベクターを投与するための精製メチオナーゼの投与に関しては報告されている（Ｘｕ及びＴａｎによる国際公開第ＷＯ００／２９５８９号）。Ｘｕ及びＴａｎは、メチオナーゼの送達のための腫瘍特異的細菌ベクターの使用方法を開示しておらず、精製タンパク質によって効力を達成するためには、大量のメチオナーゼが必要である。メチオナーゼを直接腫瘍に送達する新規な方法は、腫瘍標的細菌を用いて酵素を発現させる。
【０３７７】
Ｇｅｎｂａｎｋ番号Ｌ４３１３３に基づくニュードマス・プティダ（Ｐｎｅｕｄｏｍａｓ ｐｕｔｉｄａ）から、下記プライマーを、メチオナーゼ用に生成した：
フォワード：ＭＥＴＨ−ＸＨＯＩ
５’−ＣＣＧＣＴＣＧＡＧＡＴＧＣＡＣＧＧＣＴＣＣＡＡＣＡＡＧＣＴＣＣＣＡ−３’（配列番号４７）；及び
リバース：ＭＥＴＨ−ＢＡＭ
５’−ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＴＴＡＧＧＣＡＣＴＣＧＣＣＴＴＧＡＧＴＧＣＣＴＧ−３’（配列番号４８）
上記列挙したプライマー（４ｍＭ）及び鋳型として、ニュードマス・プティダの単離されたコロニーを用いて、メチオナーゼの配列を下記条件下でのＰＣＲによって増幅した：
９４℃、５分間を１サイクル、次いで９４℃にて１分間、６０℃にて１分間及び７２℃で２分間を３５サイクル。７２℃、１０分間の最終増幅工程は、ＰＣＲ反応の最後の工程として行った。ＰＣＲ産物を０．８％１Ｘ ＴＡＥアガロースゲル上で分離し、メチオナーゼの予想されるサイズ（約１１９６ｂｐ）からなるＰＣＲ産物を同定した。バンドを、ゲルから切り取り、キアーゲンゲル抽出キットを用いて精製した。
【０３７８】
ｐＳＰ７２ベクター及び上記で得られた単離したゲル精製メチオナーゼ遺伝子の両者を制限酵素Ｘｈｏ Ｉ及びＢａｍ ＨＩで消化した。消化したベクター及びメチオナーゼを、０．８％１ＸＴＡＥアガロースゲル上で分離した。線状化ベクターに対応する消化生成物及び消化されたメチオナーゼ遺伝子をゲルから切り取り、キアーゲンゲル抽出キットを用いて精製した。線状化ベクター及びインサート（メチオナーゼ）をＴ４リガーゼを用いて一緒に連結した。連結混合物を、熱ショック法によってＤｈ５ａ大腸菌細胞中に形質転換した。細胞を、回収した後、１００ｍｇ／ｍＬのアンピシリン（Ａｍｐ）を含有するＬＢ培地にプレーティングして、完全なｐＳＰ７２ベクターを含有する細胞を選択した。Ａｍｐ耐性コロニーを同定し、キアーゲンミニ−プレップキット（Ｑｉａｇｅｎ ｍｉｎｉ−ｐｒｅｐ ｋｉｔ）を用いたプラスミド調製並びに酵素Ｅｃｏ ＲＩ及びＢｓｐ ＨＩによる制限消化によって、メチオナーゼ遺伝子を含有するｐＳＰ７２ベクターの存在を確認した。クローン＃９を、配列決定のために、エール大学医学部（Ｙａｌｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）のエール・シーケンシング・ファシリティー（Ｙａｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｆａｃｉｌｉｔｙ）に送った。ＳＰ６（フォワード）及びＴ７（リバース）シーケンシング・プライマーの両者を用いて配列決定がなされた。結果は、配列が、ＰＣＲによってＴＡＡに変わっているＴＧＡ停止コドンを除いて、公表されているメチオナーゼの配列と１００％一致することを証明している。
【０３７９】
メチオナーゼ活性は、Ｈｏｒｉら， １９９６， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５６：２１１６−２１２２に記載のメチオナーゼアッセイを用いて測定できる。
【０３８０】
２７． 　実施例：弱毒化腫瘍標的細菌での ＴＡＴ 融合物としてのアポチン（ ａｐｏｐｔｉｎ ）タンパク質の発現
下記実施例によって、弱毒化腫瘍標的細菌を遺伝子操作して、エフェクター分子、並びにＴＡＴ、アンテナペディア（ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａ）、ＶＰ２２、及びカポジ（Ｋａｐｏｓｉ）ＦＧＦ ＭＴＳなどのフェリー・ペプチド（ｆｅｒｒｙ ｐｅｐｔｉｄｅ）を含む融合タンパク質を発現させ分泌させることができることを証明する。
【０３８１】
２７．１． 　 ＴＡＴ− アポチンベクターの構築
カナリア・ウイルス（ＣＡＶ）タンパク質であるアポチンは、アデノウイルスベクターによって送達されたときに、新生物細胞中でアポトーシスを誘導することが知られている（例えば、Ｎｏｔｅｂｏｒｎら， １９９９， Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ６：８８２−８９２を参照されたい）。
【０３８２】
サルモネラの細胞質中で転写されるが、腫瘍細胞の核に輸送され、アポトーシスを引き起こす能力を有するタンパク質を生産するために、アポチンタンパク質をヒト免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ）ＴＡＴタンパク質から誘導されるペプチドに融合した（例えば、Ｓｃｈｗａｒｔｚｅら， １９９９， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８５：１５６９−２５７２を参照されたい）。ＴＡＴタンパク質融合物は、正電荷を増加させ、タンパク質精製を容易にもするポリヒスチジン（ヘキサヒスチジン）アミノ酸と融合した場合に、機能性であることも示されているので（前記Ｓｃｈｗａｒｔｚｅら， １９９９）、ＴＡＴ−アポチン融合物を、ヘキサヒスチジンによって及びそれ無しで生産した（図３６Ａ及びＢ）。さらに、ＴＡＴ−アポチン融合物は、ＯｍｐＡ−８Ｌシグナル配列によって及びそれ無しに生産できる（図３６Ａ及びＣ）。
【０３８３】
アポチン及びヘキサヒスチジン・アポチンは、オーバーラップ・オリゴヌクレオチドを用いて構築される。アポチンをコードする核酸配列は、下記オリゴヌクレオチドを用いるＰＣＲによって生成した：

ＴＡＰ ２−ＴＡＰ６オリゴヌクレオチド及びＴＡＰ６Ｈ１オリゴヌクレオチド

を用いて、ＴＡＴ−アポチン融合タンパク質のヘキサヒスチジン含有バージョンをコードする核酸配列を生成した。ＴＡＰ６オリゴヌクレオチド及びｏｍｐ８ＬＦ１オリゴヌクレオチド

を用いてＰＣＲにより、ＴＡＰ１−ＴＡＰ６オリゴヌクレオチドのＰＣＲ産物から、ＴＡＴ−アポチン融合タンパク質のＯｍｐＡ８Ｌ含有バージョンをコードする核酸配列を生成した。
【０３８４】
各オリゴヌクレオチドを、４μＭ濃度の保存溶液に調製した。予め混合されたＰＣＲ反応ビーズ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製、Ｒｅａｄｙ−ｔｏ−ｇｏ ｂｅａｄｓ）を用い、各オリゴヌクレオチドの２μｌを使用した。ＰＣＲ反応は、９５℃で５分間を１サイクル；９５℃で１分間、６０℃で１分間、７２℃で１分間を３５サイクル；及び７２℃で１０分間を１サイクルから構成されていた。次いで、ＰＣＲ産物を、フェノール／クロロホルムで抽出し、エタノールで沈殿させ、水中に再び溶解し、Ｎｃｏ Ｉ及びＨｉｎｄ ＩＩＩによる制限消化に付した。制限消化されたＰＣＲ産物を、ゲル電気泳動によって分離し、正しいサイズの産物（ＴＡＴ−アポチン及びヘキサヒスチジン−ＴＡＴ−アポチンに対して、それぞれ約４２０及び４５０ｂｐ）をゲルから切り取り、標準的な分子生物学的方法を用いて単離した。これらの産物をＮｃｏ Ｉ及びＨｉｎｄ ＩＩＩ消化されたｐｔｒｃ９９ａ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）中に連結し、ｐｔｒｃ９９ａ−ＴＡＴ−アポチン構築物を得た。ＴＡＴ−アポチン（図３７）及びヘキサヒスチジンＴＡＴ−アポチン（図３８）の両者の正しいＤＮＡ配列を得た。
【０３８５】
２７．２． 　 ＴＡＴ− アポチンの分泌及び取り込みの証明
弱毒化腫瘍標的細菌を、当業界で公知の標準的な方法によって（例えば、熱ショック又は電気穿孔によって）ｐｔｒｃ９９ａ−ＴＡＴ−アポチン構築物によって形質転換し、培地中で培養する。当業者に公知の方法（例えば、ウエスタンブロット分析又はＥＬＩＳＡ）を用いて、ＴＡＴ−アポチンの存在について、細菌培養物からの上清を試験する。一旦、細菌培養物の上清中のＴＡＴ−アポチンの存在が確認されたなら、細菌培養上清を哺乳動物細胞（例えば、ＮＩＨ３Ｔ３、ＣＨＯ、２９３、及び２９３Ｔ細胞）と共にインキュベートし、細胞内部のＴＡＴ−アポチンの存在を、当業者に公知のアポチンアッセイによって確認する。
【０３８６】
２７．３． 　腫瘍内への ＴＡＴ− アポチンの取り込みの証明
ＴＡＴ−アポチン又はアポチンを発現するように遺伝子操作された弱毒化腫瘍標的細菌を、Ｂ１６腫瘍モデルに静脈内投与する。マウスは、細菌の投与後数日で犠牲にし、臓器重量を測定する。当業者に公知のアポトーシスアッセイ（例えば、ＤＮＡラダーリング（ＤＮＡ ｌａｄｄｅｒｉｎｇ）及びフルオレセインｉｎ ｓｉｔｕ細胞死検出キット（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ社製、マンハイム、ドイツ）を用いてＴＡＴ−アポチン又はアポチンの存在及び局在について腫瘍をアッセイする。さらに、腫瘍のサイズをアッセイし、ＴＡＴ−アポチンの抗腫瘍活性を測定する。また、腫瘍をホモジェネートし、プレーティングして、コロニー形成単位（ｃ．ｆ．ｕ．）を測定する。
【０３８７】
２８． 　実施例：マウスの Ｍ２７ 肺癌の増殖に対する ＶＮＰ２０００９ と化学療法剤との組合せの効力
下記実施例によって、化学療法剤と組み合わせた弱毒化腫瘍標的細菌の投与が、相乗的又は相加的に働いて、肺癌などの固形腫瘍の増殖を阻害できることを証明する。
【０３８８】
２８．１． 　マウスの Ｍ２７ 肺癌の増殖に対する ＶＮＰ２０００９ とサイトキサン（ ｃｙｔｏｘａｎ ）又は ＶＮＰ２０００９ とマイトマイシン Ｃ との組合せの効力
液体窒素保存されたＭ２７ネズミ肺癌細胞（１×１０^６／ｍｌ×１ｍｌ）を、３７℃で細胞を素早く解凍することによって正常な状態に戻し、３７℃、５％ＣＯ_２で１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を含有するＤＭＥＭ培養培地１０ｍｌで培養した。細胞を２世代継代させた後、対数増殖期にあるＭ２７細胞をトリプシン処理によって取り出し、１×ＰＢＳで洗浄し、腫瘍埋め込みのために、１×ＰＢＳで２．５×１０^６細胞／ｍｌに再構成した。Ｍ２７細胞懸濁液を、０日目に、１００匹のＣ５７ＢＬ／６マウス（雌、８週令、２０ｇ；５×１０^５細胞／マウス）の右脇腹の皮下に埋め込んだ。マウスを、各グループが１０匹のマウスからなるように、無作為に１０のグループに分けた。
【０３８９】
サルモネラＶＮＰ２０００９株を、本発明者の標準的な希釈方法によって、１×ＰＢＳで５×１０^６ＣＦＵ／ｍｌに希釈した。各マウスに、下記表６に従って１２日目に、希釈したサルモネラ（１×１０^６ＣＦＵ／マウス）０．２ｍｌを静脈内投与した。注射した細菌の実数を測定するため、５×１０^６ＣＦＵ／ｍｌの細菌懸濁液を、さらに１×１０^３ＣＦＵ／ｍｌに希釈し、栄養寒天培地（ＭｓｂＢプレート；国際公開第ＷＯ９９／１３０５３号）上にプレーティングした。形成されたコロニーを翌日計数した。
【０３９０】
マイトマイシンＣ（Ｓｉｇｍａ社製）及びサイトキサン（Ｓｉｇｍａ社製）を、下記表７に従ってマウスに投与した。マイトマイシンＣの２回目の用量を２２日目に組み合わせグループには投与したが、腫瘍のサイズが大きいために、マイトマイシンＣ単独で処置されたグループには投与しなかった。ＶＮＰ２０００９＋サイトキサンで処置したグループで、重篤な中毒反応が観察されたので、シプロ（Ｃｉｐｒｏ；Ｂａｙｅｒ Ｉｎｃ．社製、ウエストハーベン、コネチカット州）２００ｍｐｋを、ＶＮＰ２０００９単独又はＶＮＰ２０００９＋化学療法剤で処置した各マウスに投与した。実験の終わりまで、腫瘍体積を週２回測定した。動物の行動、外観及び死亡率を毎日観察した。マウスは、清潔で、一定温度の実験室に保持した。床敷きを週２回取り換え、マウスには十分な食物と飲料水を与えた。
【０３９１】
【表７】

【０３９２】
図３９に示すように、ＶＮＰ２０００９＋サイトキサンによる組み合わせ処理は、ＶＮＰ２０００９処置単独又はサイトキサン処置単独よりもＭ２７肺癌の増殖を強く阻害した。図４０に示すように、ＶＮＰ２０００９＋マイトマイシンＣの組み合わせは、マイトマイシンＣ単独よりもＭ２７肺癌の増殖を強く阻害した。しかしながら、ＶＮＰ２０００９＋マイトマイシンＣの組み合わせは、ＶＮＰ２０００９処置単独よりもＭ２７肺癌の増殖を強く阻害しなかった（図４０）。これらの結果は、化学療法剤と組み合わせた弱毒化腫瘍標的細菌の投与が、相乗的又は相加的に働き、肺癌などの固形腫瘍の増殖を阻害できることを示唆している。
【０３９３】
２８．２． 　マウスの Ｍ２７ 肺癌の増殖に対する ＶＮＰ２０００９ とシスプラチンとの組合せの効力
液体窒素保存されたＭ２７ネズミ肺癌細胞（１×１０^６／ｍｌ×１ｍｌ）を、３７℃で素早く細胞を解凍することによって正常な状態に戻し、３７℃、５％ＣＯ_２でウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を含有するＤＭＥＭ培養培地２５ｍｌで培養した。細胞を２世代継代させた後、対数増殖期（約９０〜９５％飽和）にあるＭ２７細胞を、トリプシン処理によって取り出し、１×ＰＢＳで洗浄し、腫瘍埋め込みのために、１×ＰＢＳで２．５×１０^６細胞／ｍｌに再構成した。Ｍ２７細胞懸濁液（０．２ｍｌ）を、０日目に、３６匹のＣ５７ＢＬ／６マウス（雌、８週令、２０ｇ；５×１０^５細胞／マウス）の右脇腹の皮下に埋め込んだ。マウスを、各グループが９匹のマウスからなるように、無作為にグループ分けした。
【０３９４】
サルモネラＶＮＰ２０００９株を、本発明者の標準的な希釈方法によって１×ＰＢＳで５×１０^６ＣＦＵ／ｍｌに希釈した。下記表８に従って１２日目にサルモネラ（１×１０^６ＣＦＵ／マウス）０．２ｍｌを、各マウスに尾静脈経由で投与した。注射した細菌の実数を測定するために、５×１０^６ＣＦＵ／ｍｌの細菌懸濁液を、１×１０^３ＣＦＵ／ｍｌにさらに希釈し、ＭｓＢｂプレート上にプレーティングした。形成されたコロニーを翌日計数した。
【０３９５】
細菌注射の２日後の１４日目に、マウスにシスプラチンを投与した（下記表８）。シスプラチンを、投与前に、正常生理食塩水で０．５ｍｇ／ｍｌに希釈した。腫瘍体積は、実験の終わりまで週２回測定した。動物の行動、外観及び死亡率を毎日観察した。マウスは、清潔で、一定温度の実験室内に保持した。床敷きは週２回取り換え、マウスには十分な食物と飲料水を与えた。
【０３９６】
【表８】

【０３９７】
図４１に示すように、ＶＮＰ２０００９＋シスプラチンによる組み合わせ処置は、ＶＮＰ２０００９処置単独又はシスプラチン処置単独よりもＭ２７肺癌の増殖を強く阻害した。これらの結果は、シスプラチンなどの化学療法剤と組み合わせた弱毒化腫瘍標的細菌の投与は、相乗的又は相加的に働き、肺癌などの固形腫瘍の増殖を阻害できることを示唆している。
【０３９８】
本発明は、本明細書中に記載された特定の実施態様によってその範囲を限定されるものではない。実際に、先行する記載及び添付の図面から、本明細書中に記載されているものの他に、本発明の多様な変形が存在することは、当業者には明らかであろう。そのような変形は、特許請求の範囲内に入ることを意図する。
【０３９９】
種々の刊行物が本明細書中で引用されており、それらの開示は、参照によってそれらの全体が本明細書中に組み入れられる。
【図面の簡単な説明】
【図１】
成熟ヒトＴＮＦ−αのコード配列を示す図である。ＤＮＡ配列（配列番号３）とタンパク質配列（配列番号４）の両方を示す。
【図２】
サルモネラＶＮＰ２０００９ ｓｅｒＣ株の誘導を示す図である。
【図３】
ネズミチフス菌における、染色体に組み込まれたｔｒｃプロモーター駆動ＴＮＦ−α遺伝子からのＴＮＦ−α発現を示す図である。
【図４】
成熟ヒトＴＮＦ−α（ヌクレオチド６７−５４３）との合成ＯｍｐＡシグナル配列（ヌクレオチド１−６３）融合物のコード配列を示す図である。融合構築物についてのＤＮＡ配列（配列番号７）とタンパク質配列（配列番号８）の両配列を示す。
【図５】
大腸菌（ＪＭ１０９株）におけるＯｍｐＡ／ＴＮＦ−α融合タンパク質の周辺細胞質局在化およびプロセシングを示す図である。
【図６】
成熟ヒトＴＲＡＩＬ（ヌクレオチド６７−８０１）とのＯｍｐＡシグナル配列（ヌクレオチド１−６３）融合物のコード配列を示す図である。融合構築物についてのＤＮＡ配列（配列番号９）とタンパク質配列（配列番号１０）の両配列を示す。
【図７】
大腸菌（ＪＭ１０９株）におけるＯｍｐＡ ＴＲＡＩＬ融合タンパク質の発現およびプロセシングを示す図である。
【図８】
成熟（Ｃ１２５Ａ）ヒトＩＬ−２（ヌクレオチド６４−４６２）との修飾ＯｍｐＡシグナル配列（ヌクレオチド１−６３）融合物のコード配列を示す図である。融合構築物についてのＤＮＡ配列（配列番号１１）とタンパク質配列（配列番号１２）の両配列を示す。
【図９】
ｐｈｏＡ（８Ｌ）またはｏｍｐＡ （８Ｌ）合成シグナルペプチドに融合した成熟ヒトＩＬ−２の発現およびプロセシングを示す図である。
【図１０】
成熟（Ｃ１２５Ａ）ヒトＩＬ−２（ヌクレオチド６４−４６２）との修飾ｐｈｏＡシグナル配列（ヌクレオチド１−６３）融合物のコード配列を示す図である。融合構築物についてのＤＮＡ配列（配列番号１３）とタンパク質配列（配列番号１４）の両配列を示す。
【図１１】
ヒトＴＮＦ−αの成熟形態を発現するネズミチフス菌弱毒化株のｉｎ ｖｉｖｏ抗腫瘍効力を示す図である。
【図１２】
ＢＲＰ発現がｉｎ ｖｉｖｏ抗腫瘍効力に及ぼす影響を示す図である。同図は、（１）ＰＢＳ対照；（２）ＶＮＰ２０００９；および（３）ＢＲＰ遺伝子を含むｐＳＷ１プラスミドを保有するＶＮＰ２０００９で治療した、Ｂ１６黒色腫を有するＣ５７ＢＬ／６マウス集団の時間経過に対する平均腫瘍サイズを示したグラフである。
【図１３】
サルモネラにおける、ｐｅｐＴプロモーターの制御下でのβ−ｇａｌ遺伝子発現の嫌気性菌誘導を示す図である。図１３Ａは、２株のサルモネラ、ＹＳ１４５６およびＶＮＰ２０００９の嫌気性条件に応答するβ−ｇａｌ発現のｉｎ ｖｉｔｒｏ誘導を示す図である。図１３Ｂは、ＢＲＰ、β−ｇａｌ、もしくはＢＲＰとβ−ｇａｌを発現するＶＮＰ２０００９サルモネラの、腫瘍対肝細胞におけるβ−ｇａｌのｉｎ ｖｉｖｏ誘導を示す図である。
【図１４】
サルモネラにおける、Ｔｅｔプロモーターの制御下でのβ−ｇａｌ遺伝子発現のテトラサイクリン誘導を示す図である。用量応答は、約０．１５μｇ／ｍｌの濃度までテトラサイクリンに対し線形応答を示すが、これを超えると、応答の低下がみられ、これは恐らく、テトラサイクリンの抗生物質作用によるものと考えられる。
【図１５】
ｐＴｒｃ９９ａベクターからのヘキサヒスチジン−エンドスタチン（ヘキサＨＩＳ−エンドスタチン）発現を示す図である。図１５Ａは、サルモネラ（ＶＮＰ２０００９）に形質転換させた３つの独立したクローンからのヘキサＨＩＳ−エンドスタチンの発現を示す図である。図１５Ｂは、大腸菌（ＤＨ５α）に形質転換させた５つの独立したクローンからのヘキサＨＩＳ−エンドスタチンの発現を示す図である。偶数番号のレーンは、非誘導培養物からの抽出物を、また、奇数番号のレーンは、対応するＩＰＴＧ誘導培養物からの抽出物をそれぞれ示す。
【図１６】
プラスミドＹＡ３３３４からのヘキサＨＩＳ−エンドスタチンの発現を示す図である。ａｓｄ系（ｔｒｃプロモーターを用いる）におけるヘキサＨＩＳ−エンドスタチンは、抗ヒスチジン抗体を用いたウェスタン分析によりヘキサＨＩＳ−エンドスタチン（〜２５ｋＤ）の適正サイズのバンドを発現することができる。
【図１７】
Ｃ３８マウス大腸癌に対するエンドスタチンを発現するＶＮＰ２０００９細胞の効力を示す図である。同図は、（１）ＰＢＳ対照；（２）空のＹＡ３３３４ベクターを保有するａｓｄ⁻ＶＮＰ２０００９；（３）ヘキサヒスチジン−エンドスタチンを発現するａｓｄ⁻ＶＮＰ２０００９；および（４）ヘキサヒスチジン−エンドスタチンとＢＲＰを発現するＶＮＰ２０００９でそれぞれ治療した、確立されたＣ３８腫瘍を有するマウス集団の時間経過に対する平均腫瘍サイズを示すグラフである。
【図１８】
ＤＬＤ１ヒト大腸癌に対するエンドスタチンを発現するＶＮＰ２０００９細胞の効力を示す図である。同図は、（１）ＰＢＳ対照；（２）空のＹＡ３３３４ベクターを保有するａｓｄ⁻ＶＮＰ２０００９；および（３）ヘキサヒスチジン−エンドスタチンとＢＲＰを発現するＶＮＰ２０００９でそれぞれ治療した、確立されたＤＬＤ１腫瘍を有するヌードマウス集団の時間経過に対する平均腫瘍サイズを示すグラフである。
【図１９】
内皮細胞に対するヒトエンドスタチンを発現する弱毒化腫瘍標的サルモネラからの溶解物の抗増殖活性を示す図である。同図は、ｂＦＧＦおよび８ ｘ １０^８細菌に相当する溶解物に応答するヒト静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）増殖の阻害を示す。対照として、空のｐＴｒｃベクターを含むサルモネラを使用した。各データの点数は、４回反復して行なった代表的実験からの平均値である。サンプルを細菌数で基準化した。
【図２０】
内皮細胞に対する血小板第４因子ペプチド（血小板第４因子のアミノ酸４７−７０）およびトロンボスポンジンペプチド（１３．４０）を発現する弱毒化腫瘍標的サルモネラからの溶解物の抗増殖活性を示す図である。同図は、ｂＦＧＦおよび８ ｘ １０^８細菌に相当する溶解物に応答するヒト静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）増殖の阻害を示す。対照として、空のｐＴｒｃベクターを含むサルモネラを使用した。各データの点数は、４回反復して行なった代表的実験からの平均値である。サンプルを細菌数で基準化した。
【図２１】
ｐＥ３．シャトル−１ベクターの構築を示す図である。
【図２２】
ＣｏｌＥ３−ＣＡ３８ベクター（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＦ１２９２７０）の構築を示す図である。ＣｏｌＥ３−ＣＡ３８ベクターのヌクレオチド配列を配列番号１に示す。ＣｏｌＥ３−ＣＡ３８ベクターは、配列番号２〜５にそれぞれ示すように、５つのオープンリーディングフレームを含む。
【図２３】
Ｃｏｌ Ｅ３−ＣＡ３８／ＢＲＰ−１ベクターの構築を示す図である。
【図２４】
各株によって産生されたコリシンＥ３の致死単位の量を示す棒グラフである。
【図２５】
紫外線またはＸ線に暴露された各種菌株についてのハロー（ｈａｌｏ）アッセイを示す図である。
【図２６】
Ｃ３８マウス大腸癌に対する４１．２．９／Ｃｏｌ Ｅ３の効力を示す図である。
【図２７】
ＮＵ／ＮｕマウスにおけるＤＬＤ１ヒト大腸癌に対する４１．２．９／Ｃｏｌ／Ｅ３の抗腫瘍活性を示す図である。
【図２８】
Ｂ１６マウス黒色腫に対する４１．２．９／Ｃｏｌ Ｅ３の効力を示す図である。
【図２９】
クローン化大腸菌ＣＮＦ１を発現するサルモネラの細胞毒性を示す図である。
【図３０】
ＣＮＦに暴露されたＨｅＬａ細胞（Ａ）は、正常なＨｅＬａ細胞（Ｂ）と比べて、腫脹および多核形成を示す。
【図３１】
３’から５’方向（図３２のマップからわかるように）のｐＣＶＤ４４２−ｍｓｂＢベクターのｍｓｂＢ部分を示す図であり、該部分は、ｍｓｂＢの中央に欠失を有し、かつその箇所に内部Ｎｏｔ１、ＰａｃＩ、ＳｐｈＩ、ＳｆｉＩ、ＳｗａＩおよびＤｒａＩポリリンカーを含む（配列番号６１）。図３２参照。
【図３２】
ＤｍｓｂＢ領域にＤＮＡをクローン化し、続いて染色体に挿入するためのｐＣＶＤ４４２−ｍｓｂＢベクターの制限マップおよび概略図である。ＭｓｂＢｄｅｌは、ＤｍｓｂＢの５’および３’領域であり；ｍｏｂ ＲＰ４は、プラスミドを１つの株から別の株に転移させるための可動化エレメントである。ｂｌａは、カルベニシリンおよびアンピシリン等のｂ−ラクタム抗生物質に対する感受性を賦与するβラクタマーゼである。ＳａｃＢは、スクロースに対する感受性を賦与する遺伝子である。
【図３３】
１）ｐＣＶＤ４４２−Ｔｅｔ−ＢＲＰ−ＡＢベクター、２）サルモネラＹＳ５０１０２におけるＤｍｓｂＢ染色体コピーによる相同的組換え、３）サルモネラＹＳ５０１０２への染色体組込みと、これに続く株ＶＮＰ２０００９へのファージ形質導入、４）株４１．２．９−Ｔｅｔ−ＢＲＰ−ＡＢをもたらすスクロース分離を示す図である。ＯｒｉＲ６Ｋはプラスミド複製起点であり；ｍｏｂ ＲＰ４は、プラスミドを１つの株から別の株に転移させるための可動化エレメントである。ａｍｐは、カルベニシリンおよびアンピシリン等のｂ−ラクタム抗生物質に対する感受性を賦与するβラクタマーゼである。ｓａｃＢは、スクロースに対する感受性を賦与する遺伝子である。定尺度で表示していないことに注意。
【図３４】
ＳＫＯＶ３細胞（平均数＝８）に７２時間暴露した後の、陽性および陰性対照（ＨＳＣ１０および４１．２．９）と比較したｔｅｔＢＲＰＡＢクローン＃２６およびクローン＃３１の細胞毒性％を示す図である。ベロ毒素の発現は、テトラサイクリンにより誘導した（クローン２６および３１を参照）。テトラサイクリン治療あり（＋）；およびテトラサイクリン治療なし（−）。大腸菌株ＨＳＣ１０は、細胞毒性％の陽性対照として使用した。
【図３５】
テトラサイクリンの不在下（１Ａ）およびテトラサイクリンの存在下（１Ｂ）で、弱毒化腫瘍標的サルモネラの、血液寒天上でのハロー形成を示す。また、テトラサイクリンの不在下（２Ａ）およびテトラサイクリンの存在下（２Ｂ）で、構成的にＳｈｅＡ．を発現するよう操作された弱毒化腫瘍標的サルモネラについてのハロー形成を示す。さらに、テトラサイクリンの不在下（３Ａ）およびテトラサイクリンの存在下（３Ｂ）で、テトラサイクリン誘導性ＳｈｅＡ．を発現するよう操作された弱毒化腫瘍標的サルモネラについてのハロー形成を示す。
【図３６】
（Ａ）ヘキサヒスタジンタグを含まないＴＡＴ−アポプチン融合タンパク質を示す。（Ｂ）ヘキサヒスタジンタグを含むＴＡＴ−アポプチン融合タンパク質を示す。（Ｃ）ＯｍｐＡ−８Ｌシグナル配列を含むＴＡＴ−アポプチン融合タンパク質を示す。
【図３７】
ＴＡＴ−アポプチン融合タンパク質のコード配列を示す図である。ＤＮＡ（配列番号５７）およびタンパク質（配列番号５８）の両配列を示す。
【図３８】
ヘキサヒスチジン−ＴＡＴ−アポプチン融合タンパク質のコード配列を示す図である。ＤＮＡ（配列番号５９）およびタンパク質（配列番号６０）の両配列を示す。
【図３９】
Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおけるＭ２７肺癌増殖に対するＶＮＰ２０００９／サイトキサン組合せ治療の効力を示す図である。
【図４０】
Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおけるＭ２７肺癌増殖に対するＶＮＰ２０００９／マイトマイシン組合せ治療の効力を示す図である。
【図４１】
Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおけるＭ２７肺癌増殖に対するＶＮＰ２０００９／シスプラチン組合せ治療の効力を示す図である。[0001]
This application claims priority to US Provisional Patent Applications 60 / 157,500, 60 / 157,581, and 60 / 157,637, filed October 4, 1999, the contents of each of which are incorporated by reference. The entirety of which is incorporated herein.
[0002]
1 . Field of the invention
The present invention relates to the delivery of one or more primary effector molecule (s) to a solid tumor to treat or inhibit the solid tumor. In particular, the present invention relates to an attenuated tumor-targeted bacterium as a vector for delivering one or more primary effector molecule (s) to a suitable site of action, eg, a site of a solid tumor. the preparation and use of a targeted bacteria, such as Salmonella. In particular, the attenuated tumor target bacteria of the present invention are facultative aerobic bacteria or facultative anaerobic bacteria that have been modified to encode one or more primary effector molecule (s). The primary effector molecule (s) of the invention includes members of the TNF cytokine family, anti-angiogenic factors, and cytotoxic polypeptides or peptides. The primary effector molecules of the invention are useful in the treatment of solid tumor cancers, such as, for example, carcinomas, melanomas, lymphomas, sarcomas, or metastases derived from these tumors. The present invention further reduces primary effector molecule (s), such as members of the TNF family, anti-angiogenic factors, and cytotoxic polypeptides or peptides, to reduce toxicity and immunological complications to the host. It relates to the surprising discovery that attenuated tumor-targeted bacteria can be delivered locally to tumors. The invention also relates to one or more optional effector molecule (s) ("secondary effector molecule") that can be delivered by an attenuated tumor-targeting bacterium along with the primary effector molecule (s). ). The secondary effector molecule (s) may provide additional anti-tumor therapeutic activity, enhance the release of the primary effector molecule (s) from the attenuated tumor target bacterium, and / or It enhances the uptake of the primary effector molecule (s) at the site of action, eg, at the site of a solid tumor.
[0003]
2 . Background of the Invention
A neoplasm, or tumor, is a neoplastic mass that results from abnormal cell growth and can be benign or malignant. Benign tumors generally remain localized. Malignant tumors generally have the potential to infiltrate and destroy adjacent tissue, spread to distant sites and cause death (reviewed in Robins and Angell, 1976, Basic Pathology, 2d Ed, WB Saunders Co., Philadelphia, pp. 68-122). A tumor is said to have spread when it has spread from one organ or tissue to another.
[0004]
A major problem in solid tumor cancer chemotherapy is the delivery of therapeutic agents, eg, drugs, at concentrations sufficient to eradicate tumor cells while simultaneously minimizing damage to normal cells. Accordingly, research in many laboratories has been directed to the design of biological delivery systems, such as antibodies, cytokines, and viruses for targeted delivery of drugs, prodrug converting enzymes, and / or genes into tumor cells. (See, for example, Crystal, RG, 1995, Science 270: 404-110).
[0005]
2.1 . Cellular immunity and cytokines
One strategy for treating cancer involves enhancing or activating a cellular immune response. Successful induction of a cellular immune response directed to an autologous tumor offers several advantages over conventional chemotherapy: 1) immune recognition is highly specific and exclusively directed to the tumor; ) Immune surveillance can suppress proliferation at metastatic sites; 3) Diversity of immune response and recognition can compensate for different resistance mechanisms used by tumor cells; 4) Clones of cytotoxic T cells Sexual growth can occur more rapidly than a growing tumor, resulting in an anti-tumor mechanism that ultimately represses the tumor; and 5) memory responses can prevent recurrence of the disease before physical detection. It can be suppressed at an early stage. Clinical studies of responders show that animal models show that successful immunotherapy involves the activation of CD8 + T cells (Class I response), although there is evidence for involvement of CD4 + T cells, macrophages, and NK cells We support the results from. See, for example, Chapoval et al. , 1998, J. Mol. Immunol, 161: 6977-684; Golub et al. , 1998, J. Mol. Clin. Invest. 102: 561-575; Kikuchi et al. , 1999, Int. J. Cancer 80 :. 425-430; Pan et al. , 1995, Int. J, Cancer 80: 425-430; Saffran et al. , 1998, Cancer Gene Ther. 5: 321-330; and Zimmermann et al. , 1999, Eur. J. Immunol. 29: 284-290.
[0006]
2.2 . Cytokine tumor necrosis factor ( TNF )family
The most characterized member of the TNF family is TNF-α. TNF-α is known to exert pleiotropic effects on the immune system. TNF-α is a cytokine that can directly exert potent cytotoxic effects on tumor cells. TNF-α is generally mediated by other mechanisms, such as stimulation of proliferation and differentiation, and prevention of apoptosis in monocytes (eg, Mangan et al., 1991, J. Immunol. 146: 1541-1546; and Ostensen et al. al, 1987, J. Immunol. 138: 4185-4191), promotes tissue factor-like procoagulant activity and suppresses endothelial cell surface anticoagulant activity, which ultimately leads to clot formation in tumors ( Beutler and Cerami, 1989, Ann. Rev. Immunol. 7: 625-655; and Vassallli, P., 1992, Ann, Rev. Immunol. 10: 411-452). However, as a result of these properties, systemic administration of TNF-α has fatal consequences for the host due to generalized intravascular coagulation.
[0007]
Other cytokines have been implicated in the antitumor response. IL-2 is a class I cytokine and is also thought to play a role in antitumor responses. For example, spontaneously regressing melanoma has been associated with elevated intratumoral levels of TNF-α and IL-2. See, for example, Beutler and Cerami, 1989, Annu, Rev. Immunol. 7; 625-655; Lowes et al. , 1997, J.A. Invest. Dermatol. 108: 914-919; Mangan et al. , 1991, J.A. Immunol. 146: 1541-1546; Scherich et al. , 1987, J.A. Immunol. 138: 1786-1790.
[0008]
Both TNF-α and IL-2 aid in lymphocyte homing, and IL-2 induces tumor infiltration of natural killer (NK) cells, T-cells, and lymphokine-activated killer (LAK) cells (Eg, Etter et al., 1998, Cytokine 10: 395-403; Reinhardt et al., 1997, Blood 89: 3837-46; Chen et al., 1997, J. Neuropathol. Exp, Neurol. 56: 541-50; Vora et al., 1996, Clin. Exp. Immunol. 105: 155-62; Luscinskase et al., 1996, J. Immunol. 157: 326-35; Kjaergarard et. al., 1998, Scand. J. Immunol. 47, 532-540; Johansson et al., 1996, Nat. Immun. 15: 87-97; and Watanabe et al., 1997, Am. J. Pathol. 1869-80). In the presence of both TNF-α and IL-2, the cytolytic activity of NK and LAK cells is increased even when directed to a TNF-insensitive cell line (see, eg, Ostsensen et al., 1987, J. Immunol. 138: 4185-4191). However, therapeutic levels of IL-2 have also been shown to be toxic to the host.
[0009]
Clearly, the dose-limiting toxicity resulting from systemic cytokine administration poses a significant barrier to realizing the cytokine's potential in treating cancer. In addition, systemic cytokine delivery, in addition to undesirable clinical side effects, results in reduced syngeneic T cell homing, and thus may oppose targeted immunotherapy. Addison et al. , 1998. Gene Ther. 5: 1400-1409; Albertini et al. , 1997, Clin. Cancer Res. 3: 1277-1288; Becker et al. , 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. ScL USA 93: 7826-7831; Book et al. , 1998, J. Mol. Neuroimmunol. 92: 50-59; Cao et al. , 1998. J. Cancer Res. Clin. Oncol. 124: 88-92; D'Angelica et al. , 1999. Cancer Immunol. Immunother. 47: 265-271; Deszo et al. , 1996, Clin. Cancer Res. 2: 1543-1552; Kjaergaard et al. , 1998, Scand. J. Immunol. 47: 532-540; Ostensen et al. , 1987, J.A. Immunol. 138: 4185-4191; and Schirrmacher et al. , 1998, Clin. Cancer Res. 4: 2635-2645.
[0010]
2.3 . Delivery of cytokines
Recent experimental animal and clinical studies have attempted to avoid systemic toxicity of cytokines and to administer higher doses by sub-systemic or alternative delivery methods of cytokines. In a murine model, sarcoma-180 tumors have been treated with administration of a membrane-fused liposome-encapsulated TNF-α gene and systemic administration of polyethylene glycol-encapsulated TNF-α that can localize to the tumor vasculature (Tsutsumi et al. , 1996, Jpn. J. Cancer Res. 87: 1078-1085). Tumor sensitization to TNF-α by endothelial monocyte activating polypeptide II has also been reported (Marvin et al., 1999, J. Surg, Res. 63: 248-255; Wu et al., 1996, Cancer). Res, 59: 205-212).
[0011]
In clinical studies, complete tumor eradication has been observed after administration of high dose TNF-α to patients by isolated limb perfusion in combination with interferon-α or melphalan. However, this technique poses a significant danger to the patient if the cytokine is not completely removed after treatment. Furthermore, these treatments require limb isolation, which itself poses a risk to the patient. Eggermont et al. , 1997, Semin. Oncol. 24: 547-555 Fraker et al. , 1995, Cancer J. et al. Sci. Am. 1: 122-130; Lejeune et al. , 1998, Curr. Opin, Immunol. 10: 573-580; Marvin et al, 1996, J. Am. Surg. Res. 63: 248-255; Mizuguchi et al. , 1998, Cancer Res. 58: 5725-5730; Tsutsumi et al. , 1996, Jpn. J. Cancer Res. 87: 1078-1085; and Wu et al. , 1996, Cancer Res. 59, 205-212.
[0012]
Carrier et al. , 1992, J. Mol. Immunol. 148: 1176-81, Saltzman et al. , 1997, Cancer Biother. Radiopharm. 12: 37-45, Saltzman et al. , 1997, J.A. Pediat. Previous studies by Surgery 32: 301-306 reported that IL-1β (Carrier) and IL-2 (Saltzman) could be delivered directly to the liver and spleen, sites of natural Salmonella infection, to serve as vaccine strains, Alternatively, the use of attenuated Salmonella strains to affect liver metastasis has been reported. The Saltzman study used oral administration of Salmonella, where bacteria are taken up by GALT (gut associated lymphoid tissue) and transported to the liver and spleen, however, these infections are natural infections Limited to the site.
[0013]
2.4 . Angiogenesis and tumor formation
Another strategy for treating cancer involves inhibiting angiogenesis. Angiogenesis is the process of proliferation of new capillaries from existing blood vessels. Novel capillaries are established when endothelial cells of existing blood vessels degrade and proliferate the basement membrane near them using proteolytic enzymes such as matrix metalloproteinases, migrate into surrounding stromal tissue, Formed by the process of forming This angiogenic process is very tightly regulated by the interaction of negative and positive factors, and in adults is usually restricted to the female reproductive cycle and wound repair (Malonne et al., 1999, Clin). Exp.Metastasis 17: 1-14). Dysregulation of angiogenesis has been linked to a number of human disorders including diabetic retinopathy, psoriasis, rheumatoid arthritis, cardiovascular disease, and tumorigenesis (Folkman, 1995, Nat. Med. 1: 27-31). .
[0014]
Angiogenesis is the most important process for tumor growth and metastasis. Tumor formation is divided into two stages, the prevascular and vascular stages. Studies have shown that cells from pre-vascular tumors grow as fast as cells from vascularized tumors. However, pre-vascular tumors were 2-3 mm³Rarely proliferates above that, because there is an equilibrium between cell proliferation and cell death, the latter resulting from the hypoxic nature of pre-vascular tumors (Folkman, 1995, Nat. Med. 1: 27-31). The switch from anterior vessel to vascular stage is from a net balance where a negative factor predominates to a positive factor such as fibroblast growth factor (FGF) and vascular endothelial growth factor (VEGF) dominant. Requires a shift in the balance of regulators of angiogenesis (Cao, 1998, Prog. Mol. Subcell. Biol. 20: 161-176). The shift in balance between regulators is the result of up-regulation of angiogenic factors and concomitant down-regulation of anti-angiogenic factors (Folkman, 1995, N. Eng. J. Med. 333: 1775-1763).
[0015]
2.5 . Anti-angiogenic factor
It has been postulated that anti-angiogenic factors are present based on several related phenomena, which often result in primary tumors inhibiting the growth of their metastases (Cao, 1998, Prog. Mol. Subcell. Biol). 20: 161-176). The first of these factors to be isolated is mouse angiostatin, a 38 kDa proteolytic fragment of plasminogen that is released into circulation by primary Lewis lung carcinoma tumors and prevents the growth of secondary metastases (O'Reilly et al., 1994, Cell 79: 315-328). In humans, the 40, 42 and 45 kDa peptides produced by restriction proteolysis of plasminogen with metalloelastase have anti-angiogenic activity comparable to mouse angiostatin (O'Reilly et al., 1994). , Cell 79: 315-328). Plasminogen itself does not have such activity. It is also possible that tumor-associated macrophages are responsible for the production of angiostatin since the tumor cells themselves have no detectable angiostatin mRNA. Macrophage metalloelastase expression is induced by granulocyte colony stimulating factor (GM-CSF) secreted by tumor cells (Dong et al., 1997, Cell 83: 801-810). In certain tumors, angiostatin production is catalyzed by serine proteases rather than metalloelastase, and serine proteases are produced directly by tumor cells (Gately et al., 1997, Cancer Res. 56: 4887-4890). Administering angiostatin at a concentration of 100 mg / kg / day to experimental mice bearing primary tumors resulted in potent inhibition of tumor growth without toxic side effects. Tumors regrow within two weeks of discontinuing this angiostatin treatment, indicating that the treatment regresses to a dormant state rather than dying completely (O'Reilly et al., 1996, Nat. Med. 2: 689-692).
[0016]
Following the discovery of angiostatin, other angiogenesis inhibitors, including some angiogenesis inhibitory peptides, were discovered and isolated. A more potent inhibitor of angiogenesis than angiostatin is kringle 5, a peptide containing the fifth kringle domain of plasminogen (angiostatin contains kringle domains 1-4). Kringle 5 can be produced by proteolysis of plasminogen, and the recombinant form is also active (Cao et al., 1997, J. Biol, Chem. 272: 22924-22928).
[0017]
Endostatin was isolated in a manner analogous to the isolation of angiostatin (O'Reilly et al., 1997, Cell 88: 1-20), the source of which was murine hemangioendothelioma rather than Lewis lung carcinoma. This peptide has an apparent molecular weight of 20 kDa and its sequence is collagen XVIII, a region called NC1 that diverges between various collagen molecules (Oh et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 4229-4233; and corresponds to the C-terminus of Rehn et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 4234-4238 (O'ReilIy et al., 1997, Cell 88: 1). -20). In mice, the growth of Lewis lung carcinoma metastases was suppressed by administering 0.3 mg / kg / day of recombinant endostatin, and the primary tumor regressed to a dormant state when this peptide was administered at 20 mg / kg / day. I do. Functional recombinant endostatin can be produced from inclusion bodies, by denaturation and refolding in vitro, or by sustained release of a subcutaneously administered endostatin inclusion body formulation in vivo (O'Reilly). et al., 1997, Cell 88: 1-20). An alternative to endostatin delivery, consisting of intramuscular administration of an endostatin expression plasmid, results in only partial inhibition of tumor growth in a mouse model system (Blezinger et al., 1999, Nat. Biotech. 17: 343). 348). Similarly, intravenously delivered liposome-complexed endostatin or angiotensin encoding plasmids resulted in partial inhibition of tumor growth in a nude mouse model of breast cancer (Chen et al., 1999, Cancer). Res. 59: 3308-3312).
[0018]
Recently, a novel anti-angiogenic activity has been ascribed to the C-terminal truncated peptide of Serpin (a serine protease inhibitor) antithrombin (O'Reilly et al., 1999, Science 285: 1926-1925). Although full-length antithrombin has no intrinsic antiangiogenic activity, cleavage of the C-terminal reactive loop of the protein by thrombin causes antithrombin to acquire potent angiogenic activity. Hereinafter, this proteolytic fragment is referred to as anti-angiogenic anti-thrombin.
[0019]
Other angiogenesis inhibiting peptides known in the art include fibronectin 29 kDa N-terminal and 40 kDa C-terminal proteolytic fragments (Homandberg et al., 1985, J. Am. Pathol. 120: 327-332); prolactin A 16-kDa proteolytic fragment (Clapp et al., 1993, Endocrinology 133: 1292-1299); and a 7.8-kDa proteolytic fragment of platelet factor 4 (Gupta et al., 1995, Proc. Natl. Acad. Acid. Acid. : 7799-7803).
[0020]
In addition to naturally occurring proteolytic fragments that have shown anti-angiogenic effects, several synthetic peptides representing regions of known extracellular matrix proteins have been evaluated for activity in inhibiting angiogenesis. Synthetic peptides that have been shown to be functional endothelial inhibitors, ie, angiogenesis inhibitors, include 13 amino acid peptides corresponding to fragments of platelet factor 4 (Maione et al., 1990, Cancer Res. 51). : 2077-2083); a 14 amino acid peptide corresponding to a fragment of collagen I (Tolma et al., 1993, J. Cell Biol. 122: 497-511); a 19 amino acid peptide corresponding to a fragment of thrombospondin I (Tolsma) et al., 1993, J. Cell Biol. 122: 497-511); and secretion whose expression in human melanoma cells leads to reduced cell invasion in vitro and reduced tumorigenicity in an in vivo nude mouse model. Rich in sex cysteine 20 amino acid peptide corresponding to a fragment of SPARC which is an extracellular matrix glycoprotein (Ledda et al., 1996, Nature Med, 3: 171-176) (Sage et al., 1995, J. Cell. Biochem. 57: 1329). -1334).
[0021]
Other peptides that inhibit angiogenesis and have less than 10 amino acids, corresponding to laminin, fibronectin, procollagen, and fragments of EGF, have also been described (Cao, 1998, Prog. Mol. Subcell. Biol. 20: 161-). 176).
[0022]
Small fibronectin peptides that inhibit angiogenesis generally contain the motif RGD. RGD is a peptide motif (amino acids Arg-Gly-Asp) used by proteins to recognize and bind to integrin molecules. Integrin alpha_vβ₃Is associated with angiogenic blood vessels, and inhibition of its activity by a monoclonal antibody blocks angiogenesis (Brooks et al., 1994, Science 264: 569-571). This has been confirmed by studies showing that administration of a cyclic pentapeptide containing an RGD motif inhibits the activity of vitronectin receptor-type integrins and blocks retinal neovascularization (Hammes et al., 1996, Nature Medicine 2). : 529-533). The anti-angiogenic effects of integrin blockers such as cyclic pentapeptides and monoclonal antibodies have been shown to promote tumor regression by inducing apoptosis of angiogenic blood vessels (Brooks et al., 1994, Cell 79: 1157-1164). Peptides containing the RGD motif and another integrin binding motif NGR (amino acids Asn-Gln-Arg) showed significantly enhanced antitumor activity.
[0023]
Inhibition of the activity of another type of cell surface receptor, the urokinase plasminogen activator (uPA) receptor, also results in inhibition of angiogenesis. The uPA receptor initiates the proteolytic cascade necessary for the angiogenic basement membrane infiltration step upon ligand binding. Inhibition of the uPA receptor by receptor antagonists is angiogenesis, tumor growth (Min, et al., 1996, Cancer Res. 56: 2428-2433) and metastasis (Crowley et al., 1993, Proc, Natl. Acad. Sci. , USA 90: 5021-5025). Such antagonists have been identified by bacteriophage peptide representation of the random peptide (Goodson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 7129-7133). A dominant negative form of the receptor ligand, uPA, has also been identified (Min et al., 1996, Cancer Res. 56: 2428-2433).
[0024]
Although the discovery of angiostatin, endostatin and other anti-angiogenic peptides has led to exciting new approaches to the treatment of cancer, the reality of therapeutic courses involving one or more of these peptides is the reality of mass production of peptides. Gender (for a 65 kg or 143 lb average person, resulting from the cost and / or effort of producing about 1.3 or 6.5 grams of protein per day for some peptides) and the duration of treatment (regressing tumors to regression) You have to keep it to keep it). Two major reasons why these peptides must be administered in such large amounts are, firstly, that most of the molecules that degrade in the bloodstream and, secondly, escape from degradation are very limited. Only the affected part reaches the tumor. Thus, the ability to deliver anti-angiogenic proteins or peptides more efficiently to tumor sites and in a more cost-effective and patient-friendly manner would be of great benefit to the field of tumor therapy.
[0025]
2.6 . Bacteriocin family
Colicin E3 (hereinafter referred to as ColE3) is a bacteriocin, a bacterial proteinaceous toxin with selective activity, whose host is immune to the toxin. Bacteriocins can be encoded by the host genome or plasmid, can have a broad or narrow range of hosts, and can have simple or multi-subunit structures containing one or two subunits (Konisky). , 1982, Ann. Rev. Microbiol. 36: 125-144). In addition, the bacteriocin host has immunity to bacteriocin. This immunity is found in all cells of a given host population, even if they do not express bacteriocin.
[0026]
The cytotoxicity of ColE3 results from its inhibition of protein synthesis (Nomura, 1963, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 28: 315-324). The target of ColE3 activity is the 16S component of the bacterial ribosome, which is common to the 30S and 70S ribosomes (Bowman et al., 1971, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 68: 964-968), Its activity results in ribosome degradation (Meyhack, 1970, Proc. Natl. Acad. Sci. USA). The activity of ColE3 is unique among ribonucleases and does not result in total degradation of RNA, but cleaves the mRNA molecule at the 49th nucleotide from the end to separate tRNA from mRNA and thereby inhibit translation. Occurs. The ribonuclease activity of ColE3 is in the molecule itself, not through other proteins (Saunders, 1978, Nature 274: 113-114). ColE3 can also cross the inner and outer membrane of target cells.
[0027]
In its natural form, ColE3 is a 60 kDa protein complex consisting of a 50: 1 and 10 kDa protein in a 1: 1 ratio, with the large subunit having nuclease activity and the small subunit having the inhibitory function of the 50 kDa subunit. Thus, the 50 kDa protein acts as a cytotoxic protein (ie, a toxin) and the 10 kDa protein acts as an antitoxin. The 50 kDa subunit contains at least two functional domains, an N-terminal region required for translocation across the target cell membrane, and a C-terminal region with catalytic (RNAse) activity. Within the host organism, the activity of the large subunit is inhibited by the small subunit. These subunits are thought to dissociate as the toxin enters the target cell as a result of its interaction with the outer membrane of the target cell (Konisky, 1982, Ann. Rev, Microbiol. 36: 125). -144).
[0028]
The toxicity of the large subunit of ColE3 has been used to prevent the out-diffusion of cloned genes in microorganisms. Diaz et al. (1994, Mol. Microbiol. 13: 855-861) express these two components of ColE3 as coding sequences with small (antitoxic) subunits integrated into the chromosome and large subunits from plasmids. Isolated to be expressed. A bacterium with a small subunit integrated into the chromosome is immunized against a plasmid expressing the ColE3 large subunit, but the plasmid is transported out to another recipient lacking the small subunit. , The cells are killed.
[0029]
Colicin E3 (ColE3) has also been shown to have a large cytotoxic effect on mammalian cells, including leukemia cell model systems (see Fiska et al., 1979, Experimentia 35; 406-407) (Smarda, et al., 1978, Folia Microbiol, 23: 272-277). ColE3 activity targets the 40S subunit of the 80S mammalian ribosome (Tumowsky et al., 1973, Biochem. Biophys. Res. Comm. 52: 327-334).
[0030]
2.7 . Bacterial infection and cancer
Early clinical observations reported cases of regression of certain cancers in patients infected with bacteria. Nauts et al. , 1953, Acta Medica. Scandinavica 145: 1-102, (Suppl. 276); and Shear, 1950, J. Am. A. M. A. 142: 383-390. Since these observations, Lee et al. , 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. ScL USA 89: 1847-1851 (Lee et al.) And Jones et al. , 1992, Infect, Immun. 60: 2475-2480 (Jones et al.) Isolated a mutant of Salmonella typhimurium that could infiltrate HEp-2 (human epidermoid carcinoma) cells in vitro in significantly greater numbers than wild-type strains. did. These "hyperinvasive" mutants were isolated under conditions of aerobic growth of bacteria that normally suppress the ability of the wild-type strain to invade HEp-2 animal cells. However, hyperinvasive Salmonella as described by Lee et al. And Jones et al. Carries a risk of pan-invasive infection and can lead to widespread bacterial infection in cancer patients.
[0031]
Carswell et al. , 1975, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72: 3666-3669 increases serum levels of TNF in mice injected with attenuated M. bovis vaccine (bacillus Calmette-Guerin) (BCG), and TNF-positive serum increases sarcoma Meth A and other transplanted tumors in mice Showed necrosis. As a result of such observations, immunization of cancer patients with BCG injection is currently used in some cancer treatment protocols. A review of BCG treatment includes Sosnowski, 1994, Compr. Ther. 20: 695-701; Barth and Morton, 1995, Cancer 75 (Suppl. 2): 726-734; Frivberg, 1993, Med. Oncol. Tumor. See Pharmacother, 10: 31-36.
[0032]
However, TNF-α-mediated septic shock is among the major concerns associated with bacteria and can have toxic or lethal consequences for the host (Bone, 1992, JAMA 268: 3452-3455; Dinarello et al.). al., 1993, JAMA 269: 1829-1835). Furthermore, dose-limiting systemic toxicity of TNF-α has been a major barrier to effective clinical use. Modifications that reduce this form of the immune response would be useful if the levels of TNF-α were not toxic and more effective concentrations and / or duration of the therapeutic vector could be used.
[0033]
2.8 . Tumor target bacteria
Genetically modified Salmonella is capable of targeting tumors, has antitumor activity, and is useful in delivering effector genes, such as herpes simplex thymidine kinase (HSV TK), to solid tumors Is shown (Pawelek et al., WO 96/40238).
[0034]
2.9 . Modified bacterial lipid A by TNF -Reduced induction of α
Altering the lipid composition of tumor-targeting bacteria that alters the immune response as a result of reduced induction of TNFα production was suggested by Pawelek et al. (Pawelek et al., WO 96/40238). Provided a method for isolating genes from Rhodobacter responsible for monophosphoryl lipid A (MLA) production. MLA acts as an antagonist of septic shock. Also, Pawelek et al., Mutated firA encoding the third enzyme UDP-3-O (R-30 hydroxylmyristoyl) -glucosamine-acyltransferase in lipid A biosynthesis (Kelley et al., 1993, J. Biol, Chem. , 268; 19866-19874), including the use of genetic modifications in the lipid A biosynthetic pathway. Have shown that mutations in the firA gene induce low levels of TNFα.
[0035]
In Escherichia coli, the gene msbB (mlt) responsible for terminal myristylation of lipid A has been identified (Engel, et al., 1992, J. Bacteriol. 174: 6394-6403; Karow and Geogopoulos). , J. Bacterial. 174: 702-710; Somerville et al., 1996, J. Clin. Invest. 97: 359-365). Genetic disruption of this gene results in stable unconditional mutations that reduce the induction of TNFα (Somerville et al, 1996, J. Clin. Invest. 97: 359-365; Somerville, WO 97 / 25061). However, these references do not suggest that disruption of the msbB gene in the tumor-targeted Salmonella vector will result in bacteria that are less pathogenic and more susceptible to chelators.
[0036]
The problems associated with using bacteria as gene delivery vectors are, in addition to the general ability of bacteria to kill normal mammalian cells directly, those those that over-stimulate the immune system via TNFα, which have toxic consequences for the host. Concentration (Bone, 1992, JAMA 268: 3452-3455; and Dinarello et al., 1993, JAMA 269: 1829-1835). In addition to these factors, resistance to antibiotics can greatly complicate coping with the presence of bacteria in the human body (Tshape, 1996, DWT Dtsch Tierarztl Wochenschr 1996 103: 273-7). Ramos et al., 1996, Enferm Infec. Microbiol. Clin. 14: 345-51).
[0037]
Hone and Powell, W097 / 18837 ("Hone and Powell"), discloses a method for producing Gram-negative bacteria with non-pyrogenic lipid A or LPS.
[0038]
Maskell, W098 / 33923, describes a mutant strain of Salmonella that has a mutation in the msbB gene that induces TNFα at lower levels compared to the wild-type strain.
[0039]
Bermudes et al., WO 99/13053, teach compositions and methods for genetically disrupting the msbB gene in Salmonella, which have a reduced ability to induce TNFα compared to wild-type and have reduced pathogenicity. Produces low Salmonella. In certain embodiments, some such mutant Salmonella have increased susceptibility to chelators as compared to wild-type Salmonella. Low et al. , 1999, Nature Biotech, 17: 37-47.
[0040]
Citation or identification of any reference in Section 2 or any section of this application shall not be construed as an admission that such reference is available as prior art to the present invention.
[0041]
3. Summary of the Invention
The present invention provides a method for delivering one or more primary effector molecules to a solid tumor. In one embodiment, the method provides for the delivery of high levels of one or more primary effector molecules. In particular, the present invention provides a primary effector molecule that can induce a toxic or undesirable effect (eg, an undesirable immune effect) when administered systemically to a host, a Salmonella having reduced host toxicity. Methods for local delivery to tumors by attenuated tumor-targeting bacteria such as The present invention provides attenuated tumor-targeting bacteria (eg, as vectors) for delivering one or more primary effector molecules and optionally one or more secondary effector molecules to a suitable site of action (eg, a solid tumor site). , Salmonella). In particular, an attenuated tumor target bacterium of the present invention may comprise a facultative aerobic bacterium or a facultative anaerobic engineered to encode one or more primary effector molecules and optionally one or more secondary effector molecules. It is a sex bacterium.
[0042]
The present invention provides attenuated tumor targeting bacteria that have been genetically engineered to express a nucleic acid molecule encoding a primary effector molecule at the site of a solid tumor. In certain embodiments, the attenuated tumor target bacterium is genetically engineered to express a nucleic acid molecule encoding one primary effector molecule. In another embodiment, the attenuated tumor target bacterium is genetically engineered to express one or more nucleic acid molecules encoding one or more primary effector molecules. According to this embodiment, one bacterial strain is engineered to express one or more nucleic acid molecules encoding one or more primary effector molecules at the site of a solid tumor. In another embodiment, two or more attenuated tumor target bacterial strains are genetically engineered to express one or more nucleic acid molecules encoding one or more primary effector molecules. In a mode of this embodiment, the attenuated tumor target bacterial strain is of the same species. In another mode of this embodiment, the attenuated tumor target bacterial strain is of a different species (eg, Listeria and Salmonella).
[0043]
The primary effector molecules of the present invention are useful for treating solid tumor cancers, such as carcinomas, melanomas, lymphomas, sarcomas. As used herein, "treating a solid tumor" or "treating a solid tumor" refers to inhibiting the growth of a tumor or tumor cells, reducing the volume of a tumor, killing tumor cells, or treating a tumor. Preventing cell spread (metastasis). In certain embodiments, the primary effector molecules of the invention elicit a local immune response at the site of a tumor, thereby inhibiting the growth of the tumor or tumor cells, killing the tumor cells, or other body parts of the tumor cells. Prevent transfer to Thus, the primary effector molecule provides a tumor therapeutic effect.
[0044]
Primary effector molecules can be derived from any known organism, including but not limited to animals, plants, bacteria, fungi, protists, viruses. In a preferred mode of one embodiment of the invention, the primary effector molecule is from a mammal. In a more preferred mode of this embodiment, the primary effector molecule is of human origin. Primary effector molecules of the present invention include members of the TNF family, anti-angiogenic factors, cytotoxic polypeptides or peptides, tumor-inhibiting enzymes, and functional fragments thereof.
[0045]
In certain embodiments, the primary effector molecule of the invention is a member of the TNF family or a functional fragment thereof. Examples of members of the TNF family include, but are not limited to, tumor necrosis factor α (TNF-α), tumor necrosis factor β (TNF-β), TNF-α-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL), TNF-α Associated activation-induced cytokines (TRANCE), TNF-α-related weak apoptosis inducers (TWEAK), CD40 ligand (CD40L), LT-α (lymphotoxin α), LT-β (lymphotoxin β), OX40L (OX40) Ligands), FasL, CD27L (CD27 ligand), CD30L (CD30 ligand), 4-1BBL, APRIL (proliferation inducing ligand), LIGHT (29 kDa type II transmembrane protein produced by activated T cells), TL1 (tumor Necrosis factor-like cytokine), TNFSF 16, TNFSF17, and AITR-L, a ligand of a TNFR family member that is activated by activation. In a preferred embodiment, the primary effector molecules of the invention are tumor necrosis factor α (TNF-α), tumor necrosis factor β (TNF-β), TNF-α-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL), TNF-α-related activation And TNF-α-related weak apoptosis inducer (TWEAK), and CD40 ligand (CD40L), or a functional fragment thereof.
[0046]
In another specific embodiment, the primary effector molecule of the invention is an anti-angiogenic factor or a functional fragment thereof. Examples of anti-angiogenic factors include, but are not limited to, endostatin, angiostatin, anti-angiogenic antithrombin III, 29 kDa N-terminal and 40 kDa C-terminal proteolytic fragments of fibronectin, uPA receptor antagonist, 16 kDa protein of prolactin A degradation fragment, a 7.8 kDa protein degradation fragment of platelet factor 4, an anti-angiogenic 24 amino acid fragment of platelet factor 4, an anti-angiogenic factor called 13.40, an anti-angiogenic 22 amino acid peptide fragment of thrombospondin I, Anti-angiogenic 20 amino acid peptide fragment of SPARC, peptides including RGD and NGR, small anti-angiogenic peptide of laminin, fibronectin, procollagen or EGF, and integrin α_vβ₃And VEGF receptor peptide antagonists. In a preferred embodiment of the invention, the primary effector molecule of the invention is a functional fragment of endostatin, apomigren or thrombospondin I.
[0047]
In another specific embodiment, the primary effector molecule of the invention is a cytotoxic polypeptide or peptide, or a functional fragment thereof. Examples of cytotoxic polypeptides or peptides include, but are not limited to, members of the bacteriocin family, verotoxin, cytotoxic necrosis factor 1 (CNF1), cytotoxic necrosis factor 2 (CNF2), Pasteurella multicidida toxin (PMT), CAAX tetrapeptide, a potent competitive inhibitor of Pseudomonas endotoxin, hemolysin, farnesyltransferase, cyclin inhibitor, Raf kinase inhibitor, CDC kinase inhibitor, caspase, p53, p16 and p21. In a preferred embodiment, the primary effector molecule is a member of the bacteriocin family, provided that the member of the bacteriocin family is not a bacteriocin releasing protein (BRP). Examples of members of the bacteriocin family include, but are not limited to, ColE1, ColE1a, ColE1b, ColE2, ColE3, ColE4, ColE5, ColE6, ColE7, ColE8, ColE9, colicin A, colicin K, colicin L, colicin M, There are cloacin DF13, pestisin A1122, staphylococcin 1580, butyricin 7423, pyocin R1 or AP41, megacin A-216, and vibriosin. In certain embodiments, the primary effector molecule is colicin E3.
[0048]
In another specific embodiment, the primary effector molecule of the invention is a tumor inhibiting enzyme or a functional fragment thereof. Examples of tumor inhibiting enzymes include, but are not limited to, methionase, asparaginase, lipase, phospholipase, protease, ribonuclease (excluding colE3), DNAase, and glycosidase. In a preferred embodiment, the primary effector molecule is a methionase.
[0049]
The present invention also provides a method for local combined delivery of one or more primary effector molecules and one or more secondary effector molecules to a solid tumor by an attenuated tumor-targeting bacterium (eg, Salmonella). In certain embodiments, the attenuated tumor target bacterium is genetically engineered to express one nucleic acid molecule encoding one primary effector molecule and one secondary effector molecule. In another embodiment, the attenuated tumor target bacterium is engineered to express one or more nucleic acid molecules encoding one or more primary effector molecules and one or more secondary effector molecules. According to this embodiment, one bacterial strain is engineered to express one or more nucleic acid molecules encoding one or more primary effector molecules and one or more secondary effector molecules at the site of a solid tumor. . In another embodiment, the two or more attenuated tumor target bacterial strains express one or more nucleic acid molecules encoding one or more primary effector molecules and one or more secondary effector molecules at the site of the solid tumor. Genetically manipulated to In a mode of this embodiment, the attenuated tumor target bacterial strain is of the same species. In another mode of this embodiment, the attenuated tumor target bacterial strain is of a different species (eg, Listeria and Salmonella).
[0050]
The secondary effector molecule of the invention provides additional anti-tumor therapeutic activity and, in addition to the attenuated primary effector molecule, is delivered by the method of the invention to facilitate the release of the primary effector molecule from the target bacterium, and / or It also enhances internalization at the site of action (eg, the site of a solid tumor). The secondary effector molecules of the invention can be used to treat solid tumor cancers, such as carcinomas, melanomas, lymphomas, sarcomas, as well as primary effector molecules, as well as molecules delivered by the methods of the invention (eg, cytotoxins, Enzymes, antitumor proteins including but not limited to bacteriocins, prodrug converting enzymes, antisense molecules, ribozymes, antigens, etc.).
[0051]
Secondary effector molecules can be derived from any known organism, including but not limited to animals, plants, bacteria, fungi, protists, viruses. In certain embodiments, the secondary effector molecule is from a bacterium or virus. In some preferred embodiments of the invention, the secondary effector molecule is of bacterial origin (eg, BRP). In another preferred embodiment of the invention, the secondary effector molecule is from a virus (eg, TAT). In yet another preferred embodiment of the invention, the secondary effector molecule is from a mammal. In some preferred embodiments, the secondary effector molecule is from a human.
[0052]
The present invention provides an attenuated tumor target bacterium comprising an effector molecule encoded by a plasmid or transfectable nucleic acid. In a preferred embodiment of the invention, the attenuated tumor target bacterium is Salmonella. If two or more effector molecules (eg, primary or secondary) are expressed in an attenuated tumor target bacterium (eg, Salmonella), those effector molecules may be encoded by the same plasmid or nucleic acid, May be encoded by a plasmid or nucleic acid. The invention also provides an attenuated tumor target bacterium comprising an effector molecule encoded by a nucleic acid that is integrated into the bacterial genome. The effector molecule that is incorporated may be endogenous to the attenuated tumor target bacterium (eg, Salmonella) or may encode an effector molecule (eg, a plasmid, transfectable nucleic acid, transposon). May be introduced into an attenuated tumor target bacterium. As a result, the nucleic acid encoding the effector molecule becomes integrated into the genome of the attenuated tumor target bacterium. The invention provides a nucleic acid molecule encoding an effector molecule operably linked to a suitable promoter. A promoter operably linked to a nucleic acid encoding an effector molecule can be homologous (ie, native) or heterologous (ie, not native to the nucleic acid encoding the effector molecule). Examples of suitable promoters include, but are not limited to, Tet promoter, trc, pepT, lac, sulA, pol II (dinA), ruv, recA, uvrB, uvrD, umuDC, lexA, cea, caa, recN, And pagC.
[0053]
The invention also provides a method for local delivery of one or more fusion proteins consisting of a signal sequence and an effector molecule by an attenuated tumor target bacterium. In a preferred embodiment, the attenuated tumor target bacterium is an Omp-like protein or a portion thereof (eg, a signal sequence, a leader sequence, a periplasmic region, a transmembrane domain, a multiple transmembrane domain, or a combination thereof; See section 3.1 below for the definition of "protein") and are engineered to express one or more nucleic acid molecules encoding one or more fusion proteins consisting of an effector molecule. Although not limited with respect to the mechanism of action, the present invention contemplates that the Omp-like protein acts to anchor or tether the effector molecule to the outer membrane, or acts to localize the effector molecule to the bacterial outer membrane. Can be In some embodiments, the effector molecule has increased delivery to the bacterial outer membrane. In certain embodiments, fusing an effector molecule to an Omp-like protein increases the localization of the effector molecule to the periplasm. Examples of Omp-like proteins include, but are not limited to, OmpA, OmpB, OmpC, OmpD, OmpE, OmpF, OmpT, porin-like protein, PhoA, PhoE, lamB, β-lactamase, enterotoxin, protein A, endoglucanase, Examples include at least a portion of each of the peptidoglycan-associated lipoproteins (PAL), FepA, FhuA, NmpA, NmpB, NmpC, and major outer membrane lipoproteins (eg, LLP). In another embodiment of the invention, the fusion protein of the invention comprises a proteolytic cleavage site. The proteolytic cleavage site may be endogenous to the effector molecule or Omp-like protein, or a proteolytic cleavage site may be constructed in the fusion protein.
[0054]
The present invention also provides a method for local delivery of one or more fusion proteins consisting of a ferry peptide and an effector molecule to a solid tumor by an attenuated tumor target bacterium. Ferry peptides used in fusion proteins have been found to enhance delivery of the polypeptide or peptide of interest to almost any cell within the diffusion range of its production or introduction (eg, Bayley, 1999, Nature Biotechnology 17). Fernandez et al., 1998, Nature Biotechnology 16: 418-420; Derossi et al., 1998, Trends Cell Biol. 8: 84-87). Thus, engineering attenuated tumor target bacteria to express a fusion protein consisting of a ferry peptide and an effector molecule enhances the ability of the effector molecule to be internalized into tumor cells. In certain embodiments, the attenuated tumor target bacterium is genetically engineered to express one nucleic acid molecule encoding one fusion protein consisting of a ferry peptide and an effector molecule. In another embodiment, the attenuated tumor target bacterium is genetically engineered to express one or more nucleic acid molecules encoding one or more fusion proteins consisting of a ferry peptide and an effector molecule. According to these embodiments, the effector molecule can be a primary or secondary effector molecule. Examples of ferry peptides include, but are not limited to, HIV TAT protein, Antennapedia homeodomain (Penetraxin), Kaposi fibroblast growth factor (FGF) membrane translocating sequence (MTS), and herpes simplex virus VP22.
[0055]
The present invention also provides a method for local delivery of one or more fusion proteins consisting of a signal sequence, a ferry peptide and an effector molecule to a solid tumor by an attenuated tumor target bacterium. In certain embodiments, the attenuated tumor target bacterium is genetically engineered to express one or more nucleic acid molecules encoding one or more fusion proteins consisting of a signal sequence, a ferry peptide, and an effector molecule. In this embodiment, the effector molecule can be a primary or secondary effector molecule.
[0056]
The invention also provides a method for local delivery of one or more fusion proteins consisting of a signal sequence, a proteolytic cleavage site, a ferry peptide and an effector molecule to a solid tumor by an attenuated tumor target bacterium. In certain embodiments, the attenuated tumor target bacterium is genetically engineered to express one or more nucleic acid molecules encoding one or more fusion proteins consisting of a signal sequence, a proteolytic cleavage site, a ferry peptide and an effector molecule. Is done. In this embodiment, the effector molecule can be a primary or secondary effector molecule.
[0057]
In some embodiments, one bacterial strain is engineered to express one or more nucleic acid molecules encoding a fusion protein of the invention at the site of a solid tumor. In some other embodiments, the two or more attenuated tumor target bacterial strains are genetically engineered to express one or more nucleic acid molecules encoding one or more fusion proteins of the invention at the site of the solid tumor. Is done. In a mode of these embodiments, the attenuated tumor target bacterial strain is of the same species. In another mode of these embodiments, the attenuated tumor target bacterial strain is of a different species (eg, Listeria and Salmonella).
[0058]
The invention also provides a method for local delivery of one or more fusion proteins of the invention and one or more effector molecules of the invention to a site of a solid tumor by an attenuated tumor target bacterium. Preferably, expression of both the fusion protein and the effector molecule at the site of the solid tumor by the attenuated tumor target bacterium will increase the growth of the tumor or tumor cell compared to when only the fusion protein or the effector molecule is expressed. The level of inhibition is improved.
[0059]
The present invention also provides for the expression of primary and optionally secondary effector molecules in attenuated tumor target bacteria such as Salmonella with enhanced release systems. In a preferred embodiment of the invention, the enhanced release is associated with the expression of the release factor by the attenuated tumor target bacterium. In one embodiment, such release increases the release of effector molecules from the cytoplasm or periplasmic space. The release factor may be endogenous to the attenuated tumor target bacterium or exogenous (ie, encoded by a nucleic acid molecule that is not naturally present in the attenuated tumor target bacterium). The release factor may be encoded by a nucleic acid consisting of a plasmid or by a nucleic acid that is integrated into the genome of the attenuated tumor target bacterium. The release factor can be encoded by the same nucleic acid or plasmid that encodes the primary effector molecule, or by a separate nucleic acid or plasmid. The release factor can be encoded by the same nucleic acid or plasmid that encodes the secondary effector molecule, or by a separate nucleic acid or plasmid. In a preferred embodiment, the release factor is a bacteriocin releasing protein (BRP). In certain embodiments, the BRP is of the cloasin DF13 plasmid, of the colicin E1-E9 plasmid, or of the colicin A, N or D plasmid. In a preferred embodiment, the BRP is that of cloacin DF13 (pCloDF13 BRP). In another embodiment of the invention, the enhanced release system comprises overexpression of a porin protein.
[0060]
The present invention also provides for expression of a fusion protein of the invention in an attenuated tumor target bacterium, such as Salmonella, having an enhanced release system. In certain embodiments, the release factor is expressed in a cell that expresses a fusion protein consisting of a primary effector molecule fused to an Omp-like protein. In this embodiment, co-expression of the release factor enhances release of the fusion protein from the periplasmic space.
[0061]
In one embodiment, the invention provides high levels of effector molecules or fusion proteins using a modified attenuated tumor-targeting bacterial strain that selectively accumulates in tumors while expressing the effector molecules or fusion proteins. A method for delivering is provided. In a particular manner, the modified attenuated tumor target bacterial strain selectively amplifies effector molecules within the tumor. The teachings in the following segments are, for simplicity, specifically with respect to Salmonella, but the compositions and methods of the present invention are not in any way limited to Salmonella, and any other teachings to which the teachings apply. It includes bacteria. Specifically, the present invention provides attenuated tumor target bacteria that are facultative aerobic bacteria or facultative anaerobic bacteria. Examples of attenuated tumor target bacteria include, but are not limited to, E. coli (including enteric E. coli), Salmonella spp. Shigella spp. , Yersinia enterocolitica, Listeria monocytogenes, Mycoplasma hominis, and Streptococcus spp. Is mentioned.
[0062]
The invention further provides a pharmaceutical composition comprising a pharmaceutically acceptable carrier and an attenuated tumor target bacterium genetically engineered to contain one or more nucleic acid molecules encoding one or more primary effector molecules. I will provide a. The present invention further provides an attenuated tumor target that has been genetically engineered to include a pharmaceutically acceptable carrier and one or more nucleic acid molecules encoding one or more primary effector molecules and one or more secondary effector molecules. And a pharmaceutical composition comprising bacteria. The present invention further provides a medicament comprising a pharmaceutically acceptable carrier and an attenuated tumor target bacterium genetically engineered to contain one or more nucleic acid molecules encoding one or more fusion proteins of the present invention. A composition is provided. In addition, the present invention provides a pharmaceutically acceptable carrier and one or more nucleic acid molecules encoding one or more fusion proteins of the present invention and one or more effector molecules (ie, primary and / or secondary molecules). And an attenuated tumor target bacterium genetically engineered to comprise: In a preferred embodiment, the attenuated tumor target bacterium is Salmonella.
[0063]
The pharmaceutical composition of the present invention is useful for treating a solid tumor. Solid tumors include sarcomas, carcinomas, lymphomas, and other solid tumor cancers (eg, germ cell tumors, central nervous system tumors, breast cancer, prostate cancer, cervical cancer, uterine cancer, lung cancer, ovarian cancer, testicular cancer Thyroid cancer, astrocytoma, glioma, pancreatic cancer, stomach cancer, liver cancer, colorectal cancer, melanoma, kidney cancer, bladder cancer, mesothelioma).
[0064]
The present invention provides a method of delivering a primary effector molecule for the treatment of a solid tumor cancer, the method comprising providing one or more animals, preferably mammals, and most preferably humans, in need of such treatment. Administering a pharmaceutical composition comprising an attenuated tumor target bacterium that has been genetically engineered to contain one or more nucleic acid molecules encoding a primary effector molecule. The present invention also provides a method of delivering a primary effector molecule for the treatment of a solid tumor cancer, the method comprising administering to an animal, preferably a mammal, most preferably a human, one in need of such treatment. Administering a pharmaceutical composition comprising an attenuated tumor target bacterium genetically engineered to include one or more nucleic acid molecules encoding the above primary effector molecule and one or more secondary effector molecules. . The present invention also provides a method of delivering a primary effector molecule for the treatment of a solid tumor cancer, the method comprising administering to an animal, preferably a mammal, most preferably a human, one in need of such treatment. Administering a pharmaceutical composition comprising an attenuated tumor-targeted bacterium that has been genetically engineered to contain one or more nucleic acid molecules encoding a fusion protein of the invention as described above. Further, the present invention provides a method of delivering a primary effector molecule for the treatment of solid tumor cancer, which method comprises providing an animal, preferably a mammal, most preferably a human, in need of such treatment. Containing an attenuated tumor-targeted bacterium engineered to contain one or more fusion proteins of the invention and one or more nucleic acid molecules encoding one or more effector molecules (ie, primary and / or secondary molecules). Administering a pharmaceutical composition. In a preferred embodiment, the attenuated tumor target bacterium is Salmonella. In a particular manner, the attenuated tumor target bacterium comprises an enhanced release system.
[0065]
In some embodiments, an attenuated tumor target bacterium that has been genetically engineered to express one or more effector molecules and / or one or more nucleic acid molecules encoding a fusion protein can be used in other known cancer treatments. Can be used with law. For example, an attenuated tumor-targeted bacterium engineered to express one or more effector molecules and / or one or more nucleic acid molecules encoding a fusion protein is used with a chemotherapeutic agent. Examples of chemotherapeutic agents include, but are not limited to, cisplatin, ifosfamide, paclitaxol, taxanes, topoisomerase I inhibitors (eg, CPT-11, topotecan, 9-AC, and GG-211), gemcitabine (gemcitabine), vinorelbine (vinorelbine), oxaliplatin (oxaliplatin), 5- fluorouracil (5-FU), Reukoborin (leucovorin), vinorelbine (vinorelbine), Temodar (temodal), taxol, cytochalasin (cytochalasin) B, gramicidin D, emetin, mitomycin, etoposide, tenoposide, vincristine, vinblastine, colchicine, doxorubici , Daunorubicin, dihydroxyanthracindione, mitoxantrone, mithramycin, actinomycin D, 1-dehydrotestosterone, melphalan, glucocorticoids, procaine, tetracaine, lidocaine, propranolol, and puromycin homologs, and cytoxane. No. Alternatively, an attenuated tumor-targeted bacterium engineered to express one or more effector molecules and / or one or more nucleic acid molecules encoding a fusion protein is used in conjunction with radiation therapy.
[0066]
The present invention provides for the sequential or concurrent administration of an anticancer agent and an attenuated tumor target bacterium that has been genetically engineered to express one or more nucleic acid molecules encoding one or more effector molecules and / or fusion proteins. Including. The present invention provides an additive or synergistic combination of an anti-cancer agent with an attenuated tumor target bacterium that has been genetically engineered to express one or more nucleic acid molecules encoding one or more effector molecules and / or fusion proteins. And combinations.
[0067]
The present invention also provides an attenuated tumor-targeted bacterium genetically engineered to express an anticancer agent and one or more nucleic acid molecules encoding one or more effector molecules and / or fusion proteins, each having a different site of action. And a combination of Such combinations, whether the combination is additive or synergistic, provide improved treatment based on the dual action of these therapeutic agents. Thus, the novel combination therapies of the present invention provide improved efficacy compared to either drug used as a single drug therapy.
[0068]
3.1. Definitions and abbreviations
As used herein, the term "Salmonella" includes all Salmonella species, such as Salmonella typhi, S. cholerae, and S. Enteritidis. Also, for example, Salmonella serotypes such as Salmonella typhimurium, which is a subgroup of S. Enteritidis and is generally called Salmonella typhimurium, are included.
[0069]
Analogs: As used herein, the term “analog” has a similar or identical function as a primary or secondary effector molecule, but does not necessarily include the similar or identical amino acid sequence of a primary or secondary effector molecule, or , Polypeptides that do not necessarily have a similar or identical structure of a primary or secondary effector molecule. A polypeptide comprising a similar amino acid sequence refers to a polypeptide that satisfies at least one of the following: (a) at least 30%, at least 30%, relative to the amino acid sequence of the primary or secondary effector molecule described herein; 35%, at least 40%, at least 45%, at least 50%, at least 55%, at least 60%, at least 65%, at least 70%, at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95% Or a polypeptide having an amino acid sequence that is at least 99% identical; (b) at least 5 consecutive amino acid residues, at least 10 consecutive amino acid residues, at least 15 consecutive amino acid residues, at least 20 consecutive amino acid residues Amino acid residues, at least 25 contiguous Amino acid residues, at least 40 consecutive amino acid residues, at least 50 consecutive amino acid residues, at least 60 consecutive amino acid residues, at least 70 consecutive amino acid residues, at least 80 consecutive amino acid residues, A primary or secondary effector molecule as described herein of at least 90 contiguous amino acid residues, at least 100 contiguous amino acid residues, at least 125 contiguous amino acid residues, or at least 150 contiguous amino acid residues A polypeptide encoded by a nucleotide sequence that hybridizes under stringent conditions to the nucleotides encoding; (c) at least 30% relative to the nucleotides encoding the primary or secondary effector molecules described herein. , At least 35% At least 40%, at least 45%, at least 50%, at least 55%, at least 60%, at least 65%, at least 70%, at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, or at least A polypeptide encoded by a nucleotide sequence that is 99% identical. A polypeptide having a similar structure to the primary or secondary effector molecule described herein is a polypeptide having a secondary, tertiary or quaternary structure similar to the primary or secondary effector molecule described herein. Means The structure of the polypeptide can be determined by methods known to those of skill in the art, including, but not limited to, peptide sequencing, X-ray crystallography, nuclear magnetic resonance, circular dichroism. And crystallographic electron microscopy.
[0070]
Anti-angiogenesis factor: An anti-angiogenesis factor is a proteinaceous molecule having anti-angiogenic activity, or a nucleic acid encoding such a proteinaceous molecule. In a preferred embodiment, the anti-angiogenic factor is a peptide fragment, or a truncated fragment of a larger protein.
[0071]
Attenuation: Attenuation is a modification that reduces the virulence of a microorganism or vector. The result of the attenuation is to reduce the risk of toxicity and other side effects when the microorganism or vector is administered to a patient.
[0072]
Bacteriocins: Bacteriocins are bacterial proteinaceous toxins that have selective activity in that the bacterial host is immune to the toxin. Bacteriocins are encoded by bacterial host genomes or plasmids, are toxic to a broad or narrow range of other bacteria, are simple structures of one or two subunits, or are multisubunit structures. It is. Further, a host that expresses a bacteriocin has immunity to the bacteriocin.
[0073]
Chelator sensitivity: Chelator sensitivity is defined as the effective concentration at which bacterial growth is affected, or the survival of the bacteria as determined by the recoverable colony forming units (cfu) It is defined as the concentration at which performance decreases.
[0074]
Derivative: As used herein, the term “derivative” as used in the expression “derivative of a polypeptide” refers to the substitution of amino acid residues, the introduction of deletions or additions, or the covalent attachment of any type of molecule to a polypeptide. , A polypeptide comprising the amino acid sequence of a polypeptide, such as a modified primary or secondary effector molecule. As used herein, the term "derivative" as used in the expression "derivative of a primary or secondary effector molecule" refers to such a modification, for example, by the covalent attachment of any type of molecule to said primary or secondary effector molecule. Designated primary or secondary effector molecule. For example, without limitation, primary or secondary effector molecules can be modified, for example, by proteolytic cleavage, ligation with cellular ligands or other proteins, and the like. Derivatives of primary or secondary effector molecules can be modified by chemical modification (eg, acylation, phosphorylation, carboxylation, glucosylation, selenium modification and sulphation) using techniques known to those skilled in the art. . In addition, derivatives of the primary or secondary effector molecule may include one or more non-classical amino acids. Polypeptide derivatives have similar or identical functions as the primary or secondary effector molecules described herein. In the present specification, “msbB⁻The term "derivative" as used in the expression "derivative of an attenuated tumor target Salmonella mutant" is a modification as defined on page 17 of International Publication No. WO 99/13053, which is hereby incorporated by reference in its entirety. msbB⁻Lumonella mutant.
[0075]
Fragment: As used herein, the term “fragment” refers to at least two consecutive amino acid residues, at least five consecutive amino acid residues, at least ten consecutive amino acid residues of the amino acid sequence of a primary or secondary effector molecule. At least 15 consecutive amino acid residues, at least 20 consecutive amino acid residues, at least 25 consecutive amino acid residues, at least 40 consecutive amino acid residues, at least 50 consecutive amino acid residues, at least 60 consecutive amino acid residues Amino acid residues, at least 70 consecutive amino acid residues, at least 80 consecutive amino acid residues, at least 90 consecutive amino acid residues, at least 100 consecutive amino acid residues, at least 125 consecutive amino acid residues, At least 150 contiguous amino acid residues Both the 175 contiguous amino acid residues, means a peptide or polypeptide comprising at least 200 contiguous amino acid residues, or at least 250 contiguous amino acid residues, the amino acid sequence.
[0076]
Functional fragment: As used herein, the term “functional fragment” refers to at least one function of the above-mentioned primary or secondary effector molecule (eg, enzymatic activity, anti-angiogenic activity, or anti-tumor activity of the effector molecule, etc.). ) Means fragments of the primary or secondary effector molecule.
[0077]
Fusion protein: means a polypeptide comprising the amino acid sequence of a primary or secondary effector molecule, or a functional fragment or derivative thereof, and the amino acid sequence of a heterologous polypeptide (eg, a non-primary or non-secondary effector molecule).
[0078]
Omp-like protein: As used herein, the term “Omp-like protein” refers to any bacterial outer membrane protein or portion thereof (eg, signal sequence, leader sequence, periplasmic region, transmembrane domain, multiple transmembrane domain, Or a combination thereof). In a specific embodiment, the Omp-like protein is OmpA, OmpB, OmpC, OmpD, OmpE, OmpF, OmpT, porin-like protein, PhoA, PhoE, lamB, β-lactamase, enterotoxin, protein A, endoglucanase, peptidoglycan-binding lipoprotein. (PAL), FepA, FhuA, NmpA, NmpB, NmpC, or at least a portion of a major outer membrane lipoprotein (eg, LLP).
[0079]
Purified: As used herein, a “purified” attenuated tumor target bacterial strain is substantially free of contaminating proteins or amino acids (eg, debris from dead bacteria) or media. An attenuated tumor-targeting bacterial strain substantially free of contaminating proteins or amino acids is also an attenuated tumor-targeting bacterium containing no more than about 30%, 20%, 10%, or 5% (dry weight) of contaminating proteins or amino acids. Also means.
[0080]
Release factor: As used herein, release factor refers to any protein or portion thereof that enhances the release of bacterial components. In one embodiment, the release factor is a bacteriocin releasing protein. Release factors include, but are not limited to, bacteriocin release protein (BRP) encoded by the cloacin D13 plasmid, BRP encoded by the colicin E1-E9 plasmid, or encoded by the colicin A, N or D plasmid. BRP to be used.
[0081]
Septic shock: Septic shock is a condition of internal organ failure due to a complex cytokine cascade initiated by TNF-α. The relative ability of a microorganism or vector to induce TNF-α is used as one measure of its relative ability to induce septic shock.
[0082]
Tumor-targeted: Tumor target is defined as the ability to preferentially localize and replicate to cancerous target cells or tissues as compared to non-cancerous counterpart cells or tissues. Thus, tumor-targeting bacteria such as Salmonella preferentially bind, infect, and / or remain viable to cancerous target cells or the tumor environment.
[0083]
Virulence: virulence is a relative term that refers to the general ability to cause disease and includes the ability to kill normal cells or induce septic shock (see specific definition below).
[0084]
As used herein, the strain names VNP20009 (International Publication Number WO 99/13053), YS1646 and 41.2.9 are used interchangeably and have been deposited with the American Type Culture Collection, respectively, and have been assigned accession number 202165. Refers to a strain. The strain names YS1456 and 8.7 are used interchangeably and refer to strains deposited with the American Type Culture Collection, respectively, and given accession number 202164.
[0085]
The invention will be better understood by reference to the following detailed description, examples of specific embodiments, and the accompanying drawings.
[0086]
4. BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES
See the end of the specification for a brief description of the figures.
[0087]
5. Detailed description of the invention
The present invention uses an attenuated tumor-targeting bacterial strain to deliver high levels of therapeutic primary effector molecules to tumors. The present invention provides the advantage of avoiding the potential systemic toxicity of certain primary effector molecules (eg, septic shock caused by TNF-α). The present invention delivers one or more primary effector molecules and, optionally, one or more secondary effector molecules to a solid tumor. More specifically, the present invention provides for the delivery of one or more primary effector molecules and optionally one or more secondary effector molecules to a suitable site of action, for example, a site of a solid tumor. The vector includes, for example, preparing and using an attenuated tumor target bacterium such as Salmonella. Specifically, the attenuated tumor target bacteria of the invention are facultative aerobic or facultative anaerobic bacteria, which comprise one or more primary effector molecules and, optionally, one or more secondary effector molecules. It has been engineered to encode a next effector molecule.
[0088]
The delivery systems based on attenuated tumor targeting bacteria described herein provide for the localized delivery of one or more effector molecules to the site of a solid tumor. The present invention provides for a primary effector molecule that, when administered systemically to a host, may be toxic or may induce undesirable side effects (eg, unwanted immunity) by providing Salmonella with reduced toxicity to the host. The present invention provides a safe and effective method that can be locally delivered to a tumor by an attenuated tumor-targeting bacterium. The invention also provides for the combined delivery of one or more primary effector molecules, and optionally one or more secondary effector molecules, delivered by an attenuated tumor-targeting bacterium, such as Salmonella. The invention further provides for the combined delivery of different attenuated tumor-targeting bacteria, carrying one or more different primary effector molecules and, optionally, one or more different secondary effector molecules.
[0089]
The invention also provides a method of locally delivering one or more fusion proteins, including effector molecules, by an attenuated tumor targeting bacterium engineered to express the fusion protein at the site of a solid tumor. In one embodiment, the attenuated tumor target bacterium is engineered to express a fusion protein consisting of a signal peptide and an effector molecule. In another embodiment, the attenuated tumor target bacterium is engineered to express a fusion protein consisting of a signal peptide, a proteolytic cleavage site, and an effector molecule. In another embodiment, the attenuated tumor target bacterium is engineered to express a fusion protein consisting of a ferry peptide and an effector molecule. In yet another embodiment, the attenuated tumor target bacterium is engineered to express a fusion protein consisting of a signal peptide, a ferry peptide, and an effector molecule. In yet another embodiment, the attenuated tumor target bacterium is engineered to express a fusion protein consisting of a signal peptide, a proteolytic cleavage site, a ferry peptide, and an effector molecule. The attenuated tumor target bacterium is engineered to express one or more fusion proteins of the invention and one or more effector molecules of the invention.
[0090]
The present invention also provides a pharmaceutical composition comprising a pharmaceutically acceptable carrier and an attenuated tumor target bacterium engineered to contain one or more nucleic acid molecules encoding one or more effector molecules. I do. Further, the present invention provides an attenuated tumor target engineered to include a pharmaceutically acceptable carrier and one or more nucleic acid molecules encoding one or more primary effector molecules and one or more secondary effector molecules. And a pharmaceutical composition comprising a bacterium. In addition, the present invention provides a pharmaceutically acceptable carrier, an attenuated tumor target bacterium engineered to include one or more nucleic acid molecules encoding one or more fusion proteins and one or more effector molecules, And a pharmaceutical composition comprising:
[0091]
The present invention is a method of treating solid tumor cancer in an animal, comprising treating an attenuated tumor target bacterium engineered to express one or more nucleic acid molecules encoding one or more primary effector molecules. A method comprising administering to the animal in need. The present invention also provides a method of treating solid tumor cancer in an animal, wherein the animal in need of such treatment comprises one or more primary effector molecules and one or more secondary effector molecules encoding one or more secondary effector molecules. Provided by administering an attenuated tumor target bacterium that has been engineered to express a nucleic acid molecule of the invention. Further, the present invention is a method of treating solid tumor cancer in an animal, the method comprising administering to an animal in need of such treatment one or more fusion proteins and one or more nucleic acids encoding one or more effector molecules. There is provided a method comprising administering an attenuated tumor target bacterium engineered to include a molecule. Preferably, the animal is a mammal (eg, a dog, cat, horse, cow, monkey, or pig), and more preferably, the animal is a human. Examples of solid tumor cancers include, but are not limited to, sarcomas, carcinomas, and lymphomas, and other solid tumor cancers include, but are not limited to, breast, prostate, cervical, uterine, and lung cancer , Ovarian, testis, thyroid, astrocytoma, glioma, pancreatic, gastric, liver, colon, central nervous system, germ cell, kidney, bladder, and mesothelial Is mentioned.
[0092]
While not intending to be limited to a particular mechanism of action, the present inventors have determined that, according to the present invention, delivery of an attenuated tumor-targeting bacterial vector comprising an effector molecule will achieve targeted expression of the effector molecule at the site of the tumor. Think.
[0093]
For clarity, the detailed description is divided into the following subsections: bacterial vectors; primary effector molecules for tumor treatment; secondary effector molecules for co-expression with primary effector molecules; derivatives and analogs; Fusion proteins; expression vectors; and methods and compositions for delivery.
[0094]
5.1. Bacteria vector
In the method of the present invention, any attenuated tumor target bacteria can be used. More specifically, the attenuated tumor target bacterium used in the method of the present invention is a facultative aerobic bacterium or a facultative anaerobic bacterium. Examples of attenuated tumor target bacteria that are facultative aerobic bacteria or facultative anaerobic bacteria used in the method of the present invention include, but are not limited to, Escherichia coli, Salmonella spp. Salmonella spp.), Shigella spp., Yersinia enterocolitica, Listeria monocytogenes, Human mycoplasma spp., Mycoplasma spp. And Mycoplasma spp. No.
[0095]
Factors that contribute to attenuation and tumor targeting are described herein and can be used to construct or select suitable bacterial strains for use in the methods of the invention. For example, a method for selecting and isolating tumor target bacteria is described in Section 6.1 of International Publication No. WO96 / 40238, and a method for attenuating bacteria is described in Section 6.2 of the same. Have been. This document is incorporated herein by reference in its entirety. Examples of attenuated tumor target bacteria are also described in International Application WO 99/13053, which is incorporated herein by reference in its entirety. In certain embodiments of the invention, the bacteria may be attenuated or highly attenuated by modifying the bacteria in a manner known to those of skill in the art.
[0096]
The present invention provides for one or more primary effector molecules (eg, a TNF family member, a cytotoxic peptide or polypeptide, a tumor inhibitory enzyme, or an anti-angiogenic factor) alone or in combination with one or more secondary effector molecules. An attenuated tumor target bacterium is provided as a vector to be delivered in combination. The present invention also provides an attenuated tumor-targeting bacterium as a vector that delivers one or more fusion proteins of the invention, alone or in combination with one or more effector molecules. In a preferred embodiment of the invention, the attenuated tumor target bacterium engineered to express one or more nucleic acid molecules encoding effector molecules and / or fusion proteins is Salmonella.
[0097]
The following sections teach specifically with respect to Salmonella, but the compositions and methods of the present invention are not limited to Salmonella in any way, and include any other bacteria to which the teachings apply. Suitable bacterial species include, but are not limited to, Escherichia coli, such as intestinal tissue invasive E. coli, Salmonella sp., Shigella sp. Here, the bacteria are facultative aerobic bacteria or facultative anaerobic bacteria.
[0098]
5.1.1 Salmonella vector
According to the teachings of the present invention, any attenuated tumor target bacterium may be modified to encode one or more primary effector molecules and, optionally, one or more secondary effector molecules, to provide one or more of the present invention. Novel attenuated tumor-target bacteria useful for delivering effector molecules to solid tumors can be generated. Further, by modifying any attenuated tumor target bacterium according to the teachings of the present invention to encode one or more fusion proteins of the present invention and, optionally, one or more effector molecules of the present invention, Novel attenuated tumor-targeting bacteria useful for delivering fusion proteins and effector molecules to solid tumors can be created.
[0099]
Bacteria such as Salmonella are pathogens that cause human and animal disease. One of the diseases that can be caused by Salmonella is sepsis, which is severe due to the high mortality associated with the attack of septic shock (Bone, 1993, Clinical Microbiol. Revs. 6: 57-68). Is a problem. Therefore, in the present invention, in order to use the Salmonella vector safely, the pathogenicity of a bacterial vector such as Salmonella is reduced (attenuated). In the present invention, attenuating is performed by modifying the microbial vector to reduce the pathogenicity of the microbial vector. Administering to a patient and still being able to achieve the same results as administering a high titer parental microbial vector. As a result, the risk of toxic shock or other side effects from administering the vector to the patient can be reduced. Bacteria thus attenuated can be isolated by a number of techniques. For example, attenuation can be achieved by the deletion or disruption of a DNA sequence encoding a virulence factor that ensures bacterial survival in host cells, particularly macrophages and neutrophils. Such deletion or disruption techniques are known to those skilled in the art and include, for example, homologous recombination, chemical mutagenesis, radiation mutagenesis, or transposon mutagenesis. Virulence factors associated with survival in macrophages, for example, typically respond specifically to stress signals, such as acidification, or to host cell defense mechanisms, such as macropinocytosis, specifically within macrophages. Expressed (Fields et al., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 5189-5193). Table 4 of International Publication No. WO 96/40238 exemplarily lists the Salmonella virulence factors whose attenuation results in attenuation.
[0100]
Another method of attenuating bacterial vectors, such as Salmonella, is to modify bacterial substituents that cause bacterial toxicity. For example, lipopolysaccharide (LPS) or endotoxin is a major cause of the pathological effects of bacterial sepsis. The component of LPS that causes this response is lipid A ("LA"). Eliminating or reducing the toxic effects of LA results in attenuated bacteria, 1) reducing the risk of septic shock in patients and 2) being able to tolerate higher levels of bacterial vectors.
[0101]
Modification of the LA content of bacteria such as Salmonella can be achieved by introducing mutations into the LPS biosynthetic pathway. Several enzymatic steps in LPS biosynthesis, and the loci that regulate them within Salmonella, and corresponding mutants have been identified (Raetz, 1993, J. Bacteriol. 175: 5745-5753 and therein). References). One example of such a mutant is firA, which is a mutation in the gene encoding the enzyme UDP-3-O (R-30 hydroxymyristoyl) -glycosamine N-acyltransferase, Regulates the third step in endotoxin biosynthesis (Kelley et al., 1993, J. Biol. Chem. 268: 19866-19874). Bacterial strains carrying this type of mutation produce lipid A, which differs from wild-type lipid A in that it contains a seventh fatty acid, hexadecanoic acid (Roy and Coleman, 1994, J. Bacteriol). 176: 1639-1646). Roy and Coleman, besides blocking the third step in endotoxin biosynthesis,⁻The mutation was also shown to reduce the enzymatic activity of lipid A 4 'kinase, which regulates the sixth step of lipid A biosynthesis.
[0102]
In addition to attenuation, the bacterial vectors of the invention are tumor-targeted. That is, the bacterium preferentially binds to, infects, and / or remains viable with respect to the tumor or tumor cell relative to normal tissue, non-tumor or non-tumor cells. Suitable methods for obtaining attenuated tumor target bacteria are described in WO 61/40238, section 6.1 (pages 25-32; tumor targeting) and section 6.2.2 (pages 43-51). Attenuation), which is incorporated herein by reference. Since the vectors thus obtained are highly specific and superinfectious, the difference between the number of infected bacteria present in the target tumor or tumor cells and that in the non-cancerous counterparts is due to the microbial culture. As the dilution increases, positive results can be obtained using lower titer microbial vectors. It is also possible to produce attenuated tumor target Salmonella or non-Salmonella bacterial vectors using the techniques described in WO 96/40238.
[0103]
One example of an attenuated tumor target bacterium having an LSP pathway mutation is the msbB described in WO 99/13053.⁻It is a Salmonella mutant. This document is incorporated herein by reference. In particular, msbB⁻See Section 6.1.2 for a description of the characteristics of Salmonella mutants. msbB⁻One feature of Salmonella is its reduced ability to induce a TNF-α response as compared to a wild-type bacterial vector. msbB⁻Salmonella induces TNF-α expression at a level of about 5% to about 40% as compared to the level of induction of a wild-type bacterial vector.
[0104]
TNF-α responses induced by whole bacteria or isolated or purified LPS can be assessed in vitro or in vivo using a commercially available assay device, such as an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). . Relative activity is determined using a comparison of TNF-α production per colony forming unit (cfu) or based on μg / kg. Lower levels of TNF-α per unit indicate that induction of TNF-α production is reduced. In a preferred embodiment, msbB⁻The Salmonella vector is modified to include one or more primary effector molecules of the invention and, optionally, one or more secondary effector molecules.
[0105]
The present invention also provides the msbB⁻Also encompasses the use of derivatives of the attenuated tumor target Salmonella mutant. According to the teachings of the present invention, msbB⁻By modifying a derivative of an attenuated tumor target Salmonella mutant and encoding one or more primary effector molecules, and optionally one or more secondary effector molecules, one or more effector molecules of the invention Novel tumor-target bacteria useful for delivering E. coli to solid tumors can be created.
[0106]
The stability of the attenuated phenotype is important so that it does not revert to a more virulent phenotype during treatment of the patient. Such stability can be obtained, for example, by providing for the virulence gene to be destroyed by deletion or other non-reverting mutations at the chromosomal level, rather than epistatically.
[0107]
Another method of securing an attenuated phenotype is, for example, the msbB⁻Mutations in the pathway for lipid A production, such as mutations (WO 99/13053), Bochner, 1980, J. Am. Bacteriol. 143: 926-933, one or more mutations of one or more nutrients or metabolites to auxotrophic mutants, such as uracil biosynthesis, purine biosynthesis, and arginine biosynthesis Is to manipulate the bacteria so that they are attenuated in a way. In a preferred embodiment, a tumor target msbB encoding or expressing at least one primary effector molecule⁻Salmonella is also auxotrophic for purines. In certain embodiments, an attenuated tumor target bacterium encoding or expressing at least one primary effector molecule is attenuated by the presence of a mutation in AroA, msbB, PurI or SerC. In another embodiment, the attenuated tumor target bacterium encoding at least one primary effector molecule is attenuated by the presence of a deletion in AroA, msbB, PurI or SerC.
[0108]
Thus, the method of the present invention comprises expressing and delivering one or more primary effector molecules and optionally one or more secondary effector molecules to any solid tumor cancer using any attenuated tumor target bacterium. Can be. In a preferred embodiment, the attenuated tumor target bacterium is constructed to express one or more primary effector molecules and, optionally, one or more secondary effector molecules. Further, the methods of the present invention can be used to express and deliver one or more fusion proteins and, optionally, one or more effector molecules, to a solid tumor cancer using any attenuated tumor-targeted bacterium. In a preferred embodiment, the attenuated tumor target bacterium is constructed to express one or more fusion proteins and, optionally, one or more effector molecules.
[0109]
5.2. Primary effector molecules for tumor treatment
The present invention achieves delivery of primary (and, optionally, secondary) effector molecules by attenuated tumor-targeting bacteria, such as Salmonella. The effector molecules of the present invention are proteinaceous molecules (eg, proteins, including but not limited to peptides, polypeptides, proteins, post-translationally modified proteins, etc.). The invention further provides a nucleic acid molecule encoding a primary effector molecule of the invention.
[0110]
The primary effector molecule can be from any known organism, such as, but not limited to, animals, plants, bacteria, fungi, and protists, or viruses. In a preferred embodiment of the invention, the primary effector molecule is from a mammal. In a further preferred embodiment, the primary effector molecule is from a human. Primary effector molecules of the invention include members of the TNF family, anti-angiogenic factors, cytotoxic polypeptides or peptides, tumor-inhibiting enzymes, and functional fragments thereof.
[0111]
In a specific embodiment, the primary effector molecule of the invention is a member of the TNF family or a functional fragment thereof. Examples of members of the TNF family include, but are not limited to, tumor necrosis factor α (TNF-α), tumor necrosis factor β (TNF-β), TNF-α-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL), TNF- cytokines induced by α-related activation (TRANCE), TNF-α-related weak apoptosis inducers (TWEAK), CD40 ligand (CD40L), LT-α, LT-α, LT-β, OX4OL, CD4OL, FasL, CD27L, CD30L, 4-1BBL, APRIL, LIGHT, TL1, TNFSF16, TNFSF16, TNSF17 and AITR-L. In a preferred embodiment, the primary effector molecule of the present invention comprises tumor necrosis factor α (TNF-α), tumor necrosis factor β (TNF-β), TNF-α-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL), TNF-α-related activity. Or TNF-α-related weak apoptosis inducer (TWEAK), CD40 ligand (CD40L), or a functional fragment thereof. These are described in detail, for example, in Kwon, B. et al., Which describes members of the TNF family. Et al., 1999, Curr. Opin. Immunol. 11: 340-345. Also, Table 1 below lists classical and standardized names of example members of the TNF family. In a preferred embodiment of the present invention, the primary effector molecule of the present invention comprises tumor necrosis factor α (TNF-α), tumor necrosis factor β (TNF-β), TNF-α-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL), TNF- It is a cytokine induced by α-related activation (TRANCE), a TNF-α-related weak apoptosis inducer (TWEAK), or a CD40 ligand (CD40L).
[0112]
[Table 1]

[0113]
In another specific embodiment, the primary effector molecule of the invention is an anti-angiogenic factor or a functional fragment thereof. Examples of anti-angiogenic factors include, but are not limited to, endostatin, angiostatin, apomigren, anti-angiogenic antithrombin III, 29 kDa N-terminal and 40 kDa C-terminal proteolytic fragments of fibronectin, uPA receptor antagonist, prolactin 16 kDa proteolytic fragment, 7.8 kDa proteolytic fragment of platelet factor 4, an anti-angiogenic factor designated as 13.40, anti-angiogenic 22 amino acid peptide fragment of thrombospondin I, anti-angiogenic 20 amino acid peptide fragment of SPARC , RGD and NGR containing peptides, small anti-angiogenic peptides of laminin, fibronectin, procollagen and EGF, and integrin α_vβ₃And VEGF receptor peptide antagonists.
[0114]
In a preferred embodiment of the invention, the primary effector molecule of the invention is endostatin. Natural endostatin consists of about 180 amino acids at the C-terminus of collagen XVIII (cDNAs encoding two splice forms of collagen XVIII have Genbank accession numbers AF1801 and AF18082).
[0115]
In another preferred embodiment of the invention, the primary effector molecule of the invention is a plasminogen fragment (the coding sequence of plasminogen can be found in Genbank accession numbers NM-000301 and A33096). The angiostatin peptide, needless to say, contains the four kringle domains of plasminogen, namely kringle 1 to kringle 4. Recombinant kringles 1, 2 and 3 have the anti-angiogenic properties of the native peptide, whereas kringle 4 does not have such activity (Cao et al., 1996, J. Biol. Chem. 271: 29461-29567). ). Accordingly, the angiostatin effector molecule of the present invention comprises at least one, preferably one or more kringle domains selected from the group consisting of kringle 1, kringle 2 and kringle 3. In a specific embodiment, the primary effector molecule of the invention is a human angiostatin molecule selected from the group consisting of a 40 kDa isoform, a 42 kDa isoform, a 45 kDa isoform, or a combination thereof. In another embodiment, the primary effector molecule is the kringle 5 domain of plasminogen, which is a more potent angiogenesis inhibitor than angiostatin (angiostatin consists of kringle domains 1-4).
[0116]
In another embodiment, the primary effector molecule of the invention is antithrombin III. Antithrombin III is hereafter referred to as antitrobin, which contains a heparin binding domain that connects the protein to the vessel wall and an active site loop that interacts with thrombin. Binding of antithrombin to heparin causes the protein to undergo a conformational change, whereby the active loop interacts with thrombin, resulting in proteolytic cleavage of the loop by thrombin. The proteolytic cleavage event causes yet another change in the conformation of antithrombin, which alters (i) the interaction interface between thrombin and antithrombin, and (ii) releases the complex from heparin (Carrell, 1999, Science 285: 1861-1862, and references therein). O'Reilly et al. (1999, Science 285: 1926-1928) have found that truncated antithrombin has potent anti-angiogenic activity. Thus, in one embodiment, the anti-angiogenic factor of the invention is an anti-angiogenic form of antithrombin. For delivery of the protein to solid tumors according to the methods of the present invention, the bacterial vector is modified to express the full-length antithrombin Genbank accession number NM-000488 and a proteolytic enzyme that catalyzes the cleavage of antithrombin. Produces an angiogenic form of the protein. The proteolytic enzyme is selected from the group consisting of thrombin, pancreatic elastase, and human neutrophil elastase. In a preferred embodiment, the proteolytic enzyme is pancreatic elastase. Methods for recombinant expression of functional pancreatic elastase are taught by Shirasu (Shirasu et al., 1987, J. Biochem. 102: 1555-1563).
[0117]
In another embodiment of the invention, the primary effector molecule of the invention is a 40 kDa and / or 29 kDa proteolytic fragment of fibronectin. Expression vectors for these fragments can be generated by standard methods using the full-length nucleic acid sequence encoding the fibronectin precursor protein (Genbank accession number X02761) and the description of the encoded protein maturation (description). it can. In a preferred embodiment, a 40 kDa and / or 29 kDa fragment of fibronectin is expressed as a cytoplasmic protein under control of the trc promoter, for example, by insertion into the pTrc99A plasmid.
[0118]
In another embodiment of the invention, the primary effector molecule of the invention is an antagonist of the urokinase plasminogen activator (uPA) receptor. In one aspect of the embodiment, the antagonist is a dominant negative mutant of uPA (eg, Crowley et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5021-5025). In another aspect of the embodiment, the antagonist is a peptide antagonist or a fusion protein thereof (Goodson et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 7129-7133). In yet another aspect of the embodiment, the antagonist is a dominant negative soluble uPA receptor (Min et al., 1996, Cancer Res. 56: 2428-2433).
[0119]
In another embodiment of the invention, the primary effector molecule of the invention is a 16 kDa N-terminal fragment of prolactin, or a biologically active fragment thereof, consisting of about 120 amino acids (the coding sequence of prolactin is: Genbank registration number NM₋000948). In a specific embodiment, the prolactin fragment has a Cys58 → Ser58 mutation to avoid unnecessary cross-linking of the protein by disulfide bonds.
[0120]
In another preferred embodiment of the invention, the primary effector molecule of the invention is a 7.8 kDa platelet factor 4 fragment. In a specific embodiment, the 7.8 kDa platelet factor 4 fragment is expressed as a fusion protein, wherein the amino terminus consists of the first 35 amino acids of E. coli β-glucuronidase. In another embodiment, mutating the heparin-binding lysine of platelet factor 4 to a glutamic acid residue results in a mutant protein having potent anti-angiogenic activity (Maione et al., 1991, Cancer Res. 51: 2077-2083). The coding sequence for platelet factor 4 is Genbank accession number NM-002619.
[0121]
In another preferred embodiment of the invention, the primary effector molecule of the invention comprises an anti-angiogenic 13 amino acid fragment of platelet factor 4, an anti-angiogenic factor designated 13.40, an anti-angiogenic 22 amino acid of thrombosporin I Peptide fragment, anti-angiogenic 20 amino acid peptide fragment of SPARC, laminin, small anti-angiogenic peptide of fibronectin, procollagen or EGF, or integrin α_vβ₃Alternatively, it is a small peptide corresponding to a small peptide antagonist of the VEGF receptor. In a specific embodiment, protein stability is increased by expressing small peptides in tandem. The sequence of the small peptide was identical to Cao (1998, Prog. Mol. Subcell. Biol. 20: 161-176), except for the VEGF receptor antagonist (Soker et al., 1993, J. Biol. Chem. 272: 31582-31588). Provided by In a highly preferred embodiment, the small peptide contains an RGD or NGR motif. In a particular mode of this embodiment, the peptide comprising the RGD or NGR motif is fused, for example, in frame with a nucleic acid encoding one or more extracellular loops of OmpA, to the nucleic acid encoding the peptide. Is displayed on the cell surface of the host bacterium.
[0122]
In another specific embodiment, the primary effector molecule of the invention is a cytotoxic polypeptide or peptide, or a functional fragment thereof. Cytotoxic polypeptides or peptides are toxic to cells or inhibit cell division, for example, by inhibiting cell proliferation, through interference with protein synthesis or disruption of the cell cycle. Such substances may cleave rRNA or ribonucleoproteins, inhibit elongation factors, cleave mRNA, or other mechanisms that reduce protein synthesis to a level where cells cannot survive. It is thought to work.
[0123]
Examples of cytotoxic polypeptides or peptides include, but are not limited to: members of the bacteriocin family, verotoxin, cytotoxic necrosis factor 1 (CNF1; eg, E. coli CNF1 and Vibrio fischeri). CNF1), cytotoxic necrosis factor 2 (CNF2), Pasteurella multicidida toxin (PMT), haemolysin, CAAX tetrapeptide which is a potent competitive inhibitor of farnesyltransferase, saporin, ricin, abrin, and other liposome-inactivating proteins (RIP), Pseudomonas exotoxin, inhibitors of DNA, RNA or protein synthesis, antisense nucleic acids, and other metabolic inhibitors (eg, DNase and ribonuclease, protease, lipase) DNA or RNA-cleaving molecules such as zeolites and phospholipases), prodrug converting enzymes (eg, thymidine kinase and bacterial cytosine deaminase from HSV), photoactivated porphyrin, ricin, ricin A chain, maize RIP, gelonin, cell killing expansion ( (Cytothal distance toxin), diphtheria toxin, diphtheria toxin A chain, trichosanthin, tritin, pokeweed antiviral protein (PAP), mirabilis antiviral protein (MAP), dianthin 32 and 30, abrin, monodrine, bryodin, Shiga Toxins (shiga), catalytic inhibitors of protein biosynthesis from cucumber seeds (see, for example, WO 93/24620), Pseudomonas exotoxin, E. coli Labile toxin, E. coli heat stable toxin, EaggEC stability toxin -1 (EAST), fragments of biologically active cytotoxin, and other materials known to those skilled in the art. For E. coli and Salmonella toxins, for example,Escherichia and Salmonella, Cellular and Molecular BiologyBy O'Brian and Holmes in Neidhardt et al.Protein Toxins of Escherichia coli and SalmonellaPp. 2788-2802, ASM Press, Washington, D.C. C. Please refer to.
[0124]
In a preferred embodiment, the primary effector molecule is a member of the bacteriocin family (see, eg, Konisky, 1982, Ann. Rev. Microbiol. 36: 125-144), provided that the member of the bacteriocin family is bacteirosin. Not a release protein (BRP). Examples of members of the bacteriocin family include, but are not limited to, ColE1, ColE1a, ColE1b, ColE2, ColE3, ColE4, ColE5, ColE6, ColE7, ColE8, ColE9, colicin A, colicin K, colicin L, colicin M, Cloacin DF13, pestisin A1122, staphylococcin 1580, butyricin 7423, pyocin R1 or AP41, megacin A-216, microcin M15, and vibriosin (Jayawardene and Farkas-Hisley, 1970, J. Bacteriology 102 vol. 38-3. ). Most preferably, the primary effector molecule is colicin E3 or V, but colicin A, E1, E2, Ia, Ib, K, L, and M (Konisky, 1982, Ann. Rev. Microbiol. 36: 125-144). ) Are also suitable as primary effector molecules. In another preferred aspect of this embodiment, the bacteriocin is cloacin, most preferably cloacin DF13.
[0125]
In a preferred embodiment, the primary effector molecule is ColE1, ColE2, ColE3, ColE4, ColE5, ColE6, ColE7, ColE8, or ColE9. Colicin E3 (ColE3) has a deep cytotoxic effect on mammalian cells (Smarda et al., 1978, Folia Microbiol. 23: 272-277) such as a leukemia cell model system (Fiska et al., 1978, Experientia 35: 406-40). Is known to have ColE3 cytotoxicity is a function that arrests protein synthesis, which is mediated by inhibition of the 80S ribosome (Turnowsky et al., 1973, Biochem. Biophys. Res. Comm. 52: 327-334). More specifically, ColE3 has ribonuclease activity (Saunders, 1978, Nature 274: 113-114). In its native form, ColE3 is a 60 kDa protein complex consisting of 50 kDa and 10 kDa proteins in a 1: 1 ratio, with the larger subunit having nuclease activity and the smaller subunit being a 50 kDa subunit. It has an inhibitory function. Thus, the 50 kDa protein acts as a cytotoxic protein (or toxin) and the 10 kDa protein acts as an antitoxin. Thus, in one embodiment, when ColE3 is used as a secondary effector molecule, the larger ColE3 subunit or active fragment thereof is expressed alone or at a higher level than the smaller subunit. In another embodiment of the invention, the ColE3 50 kDa toxin and the 10 kDa antitoxin are encoded on a single plasmid in an attenuated tumor target bacterium such as Salmonella. In this embodiment, the toxin / antitoxin can act as a selection system for Salmonella carrying the plasmid, whereby Salmonella lacking the plasmid is killed by the toxin. In another embodiment, the 10 kDa antitoxin is on the chromosome away from the colE3 toxin on the plasmid, forming a permeability barrier to other bacteria (see Section 5.6 below).
[0126]
In another preferred embodiment of the invention, the primary effector molecule is cloacin DF13. Croasin DF13 functions similarly to ColE3. The protein complex has a 67 kDa molecular weight. The size of the individual components is 57 kDa and 9 kDa. In addition to ribonuclease activity, DF13 can cause the leakage of cellular potassium.
[0127]
In another preferred embodiment, the primary effector molecule is colicin V (Plasmids, a Practical Approach 1987, KG Hardy, eds., Edited by Pugsley, AP and Oudega, Budapest, Canada). Plasmids "; Gilson, L. et al., EMBO J. 9: 3875-3884).
[0128]
In another embodiment, the primary effector molecule is: colicin E2 (a dual subunit similar in structure to ColE3, but having endonuclease activity rather than ribonuclease activity); Colicin A, E1, Ia, Ib or K, which forms channels, disrupts the proton driving force of cells and leads to cell death; colicin L, which inhibits protein, DNA and RNA synthesis; altering the osmotic environment of cells Colicin M, which causes cell sepsis; Pesticin A1122, which functions similarly to colicin B; Staphycoccin 1580, a pore-forming bacteriocin; indirectly inhibits RNA, DNA and protein synthesis via unknown targets Butyricin 7423; Pyocin P1, ie solute transport Proteins that resemble bacteriophage tail proteins that kill cells by uncoupling their respiration; pyocin AP41, which has colicin E2-like action; or megacin A-216, a phospholipase that causes leakage of intracellular substances. For an overview of Singh, see Konisky, 1982, Ann. Rev. Microbiol. 36: 125-144): Colicin A (Plasmids, a Practical Approach 1987, Pugsley, Og. "Methods for Studying Colicins and Their Plasmids" by J., B.).
[0129]
Accordingly, the primary effector molecule may include any bacteriocin described herein or known to those of skill in the art, provided that the bacteriocin is not a bacteriocin releasing protein.
[0130]
In another specific embodiment, the primary effector molecule of the invention is a tumor inhibitory enzyme or a functional fragment thereof. Examples of tumor inhibiting enzymes include, but are not limited to, methionase, asparaginase, lipase, phospholipase, protease, ribonuclease, DNAase, and glycosidase. In a preferred embodiment, the primary effector molecule is a methionase.
[0131]
The primary effector molecules of the present invention are useful in treating or preventing solid tumor cancers, such as, for example, carcinomas, melanomas, lymphomas, sarcomas, and the like.
[0132]
The present invention provides a nucleic acid molecule encoding a primary effector molecule. The invention also provides nucleic acid molecules encoding one or more primary effector molecules and, optionally, one or more secondary effector molecules. The invention provides a nucleic acid encoding an effector molecule of the invention operably linked to a suitable promoter. Optionally, the nucleic acid encoding the effector molecule can also be operably linked to other elements involved in transcription, translation, localization, stability, etc.
[0133]
Nucleic acid molecules encoding primary effector molecules are from about 6 to about 100,000 base pairs in length. Preferably, the nucleic acid molecule is from about 20 base pairs to about 50,000 base pairs in length. More preferably, the nucleic acid molecule is from about 20 base pairs to about 10,000 base pairs in length. Still more preferably, the nucleic acid molecule is from about 20 base pairs to about 4,000 base pairs in length.
[0134]
5.3. Secondary effector molecules for co-expression with primary effector molecules
In certain embodiments of the invention, the primary effector molecule (eg, a member of the TNF family, a cytotoxic peptide or polypeptide, an anti-angiogenic factor, or a tumor suppressor enzyme) is optionally another molecule, ie, , Together with the secondary effector molecule, in a bacterial vector. The secondary effector molecule provides additional therapeutic value and / or modifies the surrounding environment (expressing at least one primary effector molecule and, optionally, one or more secondary effector molecules) Promotes the release of the contents of the bacterial vector. As used herein, the term “additional therapeutic value” refers to the additional or synergistic, cytostatic, or cytotoxic effect of a secondary effector molecule on a tumor in addition to that provided by the primary effector molecule. Refers to providing an effect. Thus, the secondary effector molecule functions as an additional therapeutic and / or release factor. Preferably, the secondary effector molecule, whether an additional therapeutic or release factor (or both), is preferentially or specifically activated or expressed at the desired site, ie, at the site of the tumor. In certain embodiments, the secondary effector molecule serves two functions: to promote the release of bacterial cell contents (eg, by promoting bacterial cell lysis or sub-lysis) while at the same time providing therapeutic value. (Eg, by cytotoxicity to tumor cells). In certain non-limiting embodiments, the cytotoxicity of the secondary effector molecule can be mediated by the patient's immune system; therefore, such secondary effector molecules can function as immunomodulators.
[0135]
In certain embodiments herein, the attenuated tumor-targeting bacterial vector of the invention is engineered to express at least one secondary effector molecule having anti-tumor activity. That is, expression of the secondary effector molecule results in death or inhibition of growth of the tumor or tumor cell.
[0136]
Secondary effector molecules are proteinaceous or nucleic acid molecules. The nucleic acid molecule can be any of double- or single-stranded DNA or double- or single-stranded RNA, as well as triple-helical nucleic acid molecules. The nucleic acid molecule can function as a ribozyme, an antisense nucleic acid, or the like.
[0137]
Antisense nucleotides are oligonucleotides that bind sequence-specifically to nucleic acids such as mRNA or DNA. When bound to mRNA having a complementary sequence, the antisense blocks translation of the mRNA (eg, US Pat. Nos. 5,168,053; 5,190,931; 5,135,917; and 5,087,617). No.). A triple helical molecule is a single stranded DNA that binds to double helical DNA to form a colinear triple helical molecule, thereby blocking transcription (see, eg, US Pat. No. 5,176,996). No.).
[0138]
Ribozymes are RNA molecules that inhibit or interfere with cell growth or expression by specifically cleaving RNA substrates such as mRNA. As ribozymes involved in RNA strand cleavage and / or ligation, at least five classes of ribozymes are known. Ribozymes can target any RNA transcript and can catalytically cleave the transcript (eg, US Pat. No. 5,272,262; US Pat. No. 5,144,019). And U.S. Patent Nos. 5,168,053, 5,180,818, 5,116,742 and 5,093,246).
[0139]
As already described for the primary effector molecule, the nucleic acid encoding or containing the secondary effector molecule is operably linked, conferring the selected promoter, and optionally, functionally linked, transcription, translation, And other elements that participate in localization, stability and / or others. Further, the secondary effector molecule can be expressed using the same promoter as the primary effector molecule and the internal ribosome binding site, or using a different promoter than the primary effector molecule.
[0140]
Nucleic acid molecules encoding secondary effector molecules are from about 6 base pairs to about 100,000 base pairs in length. Preferably, the length of the nucleic acid molecule is from about 20 base pairs to about 50,000 base pairs. More preferably, the length of the nucleic acid molecule is from about 20 base pairs to about 10,000 base pairs. Even more preferably, the length of the nucleic acid molecule is from about 20 base pairs to about 4,000 base pairs.
[0141]
The nucleotide sequences of effector molecules encoding the following secondary effector molecules are well known (see GenBank). A nucleic acid molecule encoding a secondary effector molecule, which is a cytotoxic or cytostatic factor, or a biologically active fragment, variant or derivative thereof, is amplified (eg, by PCR). ), Probe hybridization of genomic or cDNA libraries, antibody screening of expression libraries, etc., can be isolated chemically, synthesized chemically, or obtained from commercial or other sources. May be used.
[0142]
Nucleic acid molecules and oligonucleotides for use in the applications described herein can be synthesized by any method known to those of skill in the art (eg, WO 93/01286, US Pat. No. 5,218,088). 5,175,269; and 5,109,124). Identification of oligonucleotides and ribozymes used as antisense reagents includes methods known to those skilled in the art.
[0143]
5.3.1. Factors that provide additional therapeutic value
In certain embodiments of the invention, the attenuated tumor-targeting bacterial vector of the invention, which expresses at least one primary effector molecule and is preferably a Salmonella vector, comprises at least one secondary tumor-acting agent having anti-tumor activity. Express effector molecules. That is, the expression of the secondary effector molecule causes death of the tumor or tumor cell, or inhibition of their growth, or inhibition of metastasis of the tumor cell, whereby the cytotoxicity or cytostatic inhibition of the primary effector molecule is caused. Enhances action. In one embodiment, the effect of the secondary effector molecule on the tumor is in addition to the effect of the primary effector molecule. In a preferred embodiment, this effect is superadditive or synergistic, ie, greater than the combined effect of the primary and secondary effector molecules when administered separately.
[0144]
In certain embodiments, the secondary effector molecule is cytotoxic or cytostatic to cells by interfering with protein synthesis or inhibiting cell growth by disrupting the cell cycle. Such substances may act, for example, by cleaving rRNA or ribonucleoprotein, inhibiting elongation factors, cleaving mRNA, or other mechanisms that reduce protein synthesis to a level at which cells cannot survive. . Examples of such secondary effector molecules include, but are not limited to, saporin, ricin, abrin, and other protein-inactivated ribosomes (RIPs).
[0145]
In another embodiment, the secondary effector molecule is a prodrug converting enzyme or a nucleic acid encoding the same, ie, an enzyme that modulates the chemical properties of a drug to produce a cytotoxic agent. Examples of prodrug converting enzymes are listed in Table 2 on page 33 of WO96 / 40238 by Powelek et al. This document is incorporated herein by reference. WO 96/40238 also teaches how to produce secretory fusion proteins containing such prodrug converting enzymes. According to the present invention, the prodrug converting enzyme need not be a secreted protein when co-expressed with a release factor such as BRP (see Section 5.3.2 below). In a specific embodiment, the prodrug converting enzyme is cytochrome p450 NADPH oxidoreductase that acts on mitomycin C and porphyromycin (Murray et al., 1994, J. Pharmacol. Exp. Therapeut. 270: 645-649). In another embodiment, the secondary effector molecule is co-expressed with a release factor such as BRP to cause the release of cofactors (eg, NADH, NADPH, ATP, etc.), thereby increasing the activity of the prodrug converting enzyme. Strengthen. In another aspect of this embodiment, the secondary effector molecule is co-expressed with a release factor such as BRP to activate the activating drug (eg, activated in the bacterial or periplasm and released from the bacterial vector). Drug).
[0146]
In another embodiment, the secondary effector molecule is an inhibitor of inducible nitric oxide synthase (NOS) or endothelial nitric oxide synthase. Nitric oxide (NO) is thought to be involved in regulating blood vessel growth and in arteriosclerosis. NO is formed from L-arginine by nitric oxide synthase (NOS) and regulates immune, inflammatory and cardiovascular responses.
[0147]
In another embodiment, the secondary effector molecule is an oncogene or growth factor (eg, bFGF, int-2, hst-1 / K-FGF, FGF-5, hst-2 / FGF-6, FGF-8). Alternatively, by inhibiting the production or activity of a protein involved in cell proliferation, such as a cell receptor or a ligand, the compound has toxicity to cells or suppresses cell division. Inhibition can be at the level of transcription or translation (mediated by a secondary effector molecule, which is a ribozyme or triple helix DNA), or it can be a protein activity (a secondary effector that is an inhibitor of a growth factor pathway, such as a dominant negative mutant). (Mediated by a molecule).
[0148]
In another embodiment, the secondary effector molecule is a cytokine, chemokine, or immunomodulatory protein or nucleic acid encoding the same, such as interleukin-1 (IL-1), interleukin-2 (IL-2), interleukin-2. Leukin-4 (IL-4), interleukin-5 (IL-5), interleukin-10 (IL-10), interleukin-15 (IL-15), interleukin-18 (IL-18); endothelium MHC genes such as monocyte activating protein-2 (EMAP2), GM-CSF, IFN-γ, IFN-α, MIP-3α, SLC, MIP-3β, or HLA-B7. Delivery of such immunomodulatory effector molecules will modulate the immune system and enhance the host's ability to anti-tumor immunity. Alternatively, T-cell immunity can be enhanced by delivering nucleic acid molecules encoding ligands for both CD28 and CTLA-4, costimulatory molecules such as B7.1 and B7.2. Yet another immunomodulator is α-1,3-galactosyltransferase, which, when expressed in tumor cells, enables complement cell death. In addition, another immunomodulatory agent is a tumor-associated antigen, i.e., a molecule that is not expressed on the corresponding non-cancerous cells but is specifically expressed on tumor cells, or at a higher level than the corresponding non-cancerous cells It is a molecule expressed in tumor cells. Examples of tumor-associated antigens are described in Kuby, Immunology, W.W. H. Freeman and Company, New York, NY, First Edition (1992), pp. 515-520, which are incorporated herein by reference. Other examples of tumor-associated antigens are known to those skilled in the art.
[0149]
In another embodiment, the secondary effector molecule is a Flt-3 ligand or a nucleic acid encoding the same. In another embodiment, the secondary effector molecule is BRP.
[0150]
In a specific embodiment, the secondary effector molecule is not a TNF family member when the primary effector molecule is a member of the TNF family. In another specific embodiment, the secondary effector molecule is not an anti-angiogenic factor when the primary effector molecule is an anti-angiogenic factor. In another specific embodiment, the secondary effector molecule is not a cytotoxic peptide or polypeptide when the primary effector molecule is a cytotoxic peptide or polypeptide. In another specific embodiment, the secondary effector molecule is not a tumor suppressor enzyme when the primary effector molecule is a tumor suppressor enzyme.
[0151]
5.3.2. Factors that promote release of antitumor effector molecules into the tumor environment
In another embodiment of the present invention, the attenuated tumor targeting bacterial vector of the present invention, which expresses at least one primary effector molecule, and preferably is a Salmonella vector, expresses at least one secondary effector molecule. However, the secondary effector molecules serve to permeate bacterial cell membranes or to enhance the release of intracellular components into the extracellular environment, thereby enhancing the delivery of primary and / or secondary effector molecules. I do. Thus, secondary effector molecules that allow bacterial cells to permeate or enhance release are termed "release factors." In certain embodiments, the release agent advantageously also has anti-tumor activity.
[0152]
The release factor expressed by the bacterial vector of the present invention may be endogenous to the modified attenuated tumor target bacterium or exogenous (eg, encoded by a nucleic acid that is not native to the attenuated tumor target bacterium). May be. The release factor can be encoded by a nucleic acid, including a plasmid, or integrated into the genome of the attenuated tumor target bacterium. The release factor may be encoded on the same nucleic acid or plasmid encoding the primary effector molecule, or may be encoded on a separate nucleic acid or plasmid. The release factor may be encoded on the same nucleic acid or plasmid encoding the secondary effector molecule, or may be encoded on a separate nucleic acid or plasmid. In one embodiment, the release factor is expressed in a cell that also expresses a fusion protein that includes a primary effector molecule fused to the Omp-like protein. In this embodiment, co-expression of the release factor can enhance release of the fusion protein from the periplasmic space.
[0153]
In a preferred embodiment, such an agent is one of the bacteriocin-releasing proteins, ie, BRP (generally referred to herein as BRP). The BRP used in the present invention is derived from any source known to those of skill in the art, including but not limited to the cloacin DF13 plasmid, one of the colicin E1-E9 plasmids, or the colicin A, N or D plasmid. Things are fine. In a preferred embodiment, the BRP consists of Croasin DF13 (pCloDF13 BRP).
[0154]
Generally, BRP is a 45-52 amino acid peptide, which is initially synthesized as a precursor molecule containing a signal sequence that is not cleaved by signal endopeptidase (PreBRP). BRP activity is thought to be mediated, at least in part, by detergent-resistant outer membrane phospholipase A (PldA) and is usually associated with increased degradation of outer membrane phospholipids (for a summary of BRP, van der Wal et al., 1995, FEMS Microbiology Review 17: 381-399). While not limiting with regard to mechanism, BRP promotes preferential release of peripheral cytoplasmic components, but to a lesser extent release of cytoplasmic components has also been detected. When moderately overexpressed, BRP weakens bacterial membranes and induces sub-lysis and high release of cytoplasmic components. In addition, it is believed that BRP, when expressed at very high levels, can cause bacterial cell lysis and deliver cell contents by lytic release. In this embodiment, BRP expression is believed to correlate with BRP activity (eg, release of bacterial content). For example, ultra-high BRP activity results in bacterial cell lysis of virtually all bacteria. Thus, "ultra-high expression" as used herein is defined as the level of BRP expression that causes bacterial cell lysis of substantially all bacteria. As compared to control bacteria that do not express BRP, moderate BRP activity is accompanied by a partial or enhanced release of bacterial contents without requiring lysis of the bacteria. Thus, in this embodiment, moderate overexpression of BRP means an expression level at which the release of cytoplasmic components is increased without bacteriolysis of substantially all bacteria. As used herein, substantially all bacteria means at least 60%, preferably at least 70%, more preferably at least 80%, even more preferably at least 90%, most preferably 90-100% of the bacteria. I do.
[0155]
In a specific embodiment of the invention, the BRP protein is a pCloDF13BRP mutant whose lytic function is separate from its protein release function, thus enhancing protein release without bacterial lysis (van der Wal et al., 1998, App. Env. Microbiol. 64: 392-398). This embodiment prolongs protein release from the bacterial vector and reduces the need for frequent administration of the vector. In another specific embodiment, the BRP of the invention is pCloDF13BRP with a truncated C-terminus, which causes cell lysis in addition to protein release (Luilink et al., 1989, J. Bacteriol. 171: 2673-. 2679).
[0156]
In another embodiment of the invention, the enhanced release system comprises overexpression of a porin protein; see, eg, Sugawara, E. et al. And Nikaido, H .; , 1992, J. Mol. Biol. Chem. 267: 2507-11.
[0157]
In certain embodiments, when expressing BRP with a bacterial vector of the invention, the BRP may be endogenous to the modified attenuated tumor target bacterium or exogenous (eg, not native to the attenuated tumor target cell). (Encoded by a nucleic acid). BRP can be encoded by a nucleic acid, including a plasmid, or by a protein nucleic acid integrated into the genome of an attenuated tumor target cell. Also, the BRP may be encoded by the same nucleic acid or plasmid that encodes the primary effector molecule, or may be encoded by a separate nucleic acid or plasmid. Further, the BRP may be encoded on the same nucleic acid or plasmid encoding the secondary effector molecule, or may be encoded on a separate nucleic acid or plasmid. In one embodiment, the BRP-like protein is expressed in a cell that also expresses a fusion protein that includes an effector molecule fused to the Omp-like protein. In this embodiment, co-expression of BRP can enhance the release of the fusion protein.
[0158]
In a preferred specific embodiment of the invention, the nucleic acid encoding BRP is encoded by a colicin plasmid. In another specific embodiment of the invention, the BRP-encoding nucleic acid is expressed under the control of a native BRP promoter, wherein the promoter is stressed (eg, for BRP, Enterococcus cloacae) in its normal host. SOS promoter that responds to DNA damage such as ultraviolet rays) and is partially constitutive in Salmonella. In a preferred embodiment, the BRP-encoding nucleic acid is expressed under the control of the pepT promoter, where the promoter is activated in response to the anaerobic nature of the tumor environment (see, eg, Lombardo et al., 1977, J. Am. Bacteriol. 179: 1909-17).
[0159]
Alternatively, the promoter can be an antibiotic-inducible promoter, such as the Tn10 transposon tet promoter. In a preferred embodiment, the tet promoter is a singlemer that responds randomly to the presence of tetracycline or an analog thereof, such as doxycycline and anhydrotetracycline, and Provide a stable on-off switch. In another embodiment, the tet promoter multimerizes (eg, triples). Such multimers respond stepwise to the presence of tetracycline, providing a system that can better manipulate the control of effector molecules. Next, promoter activity is induced by administering an appropriate dose of tetracycline to a subject being treated with the attenuated tumor target bacterium of the present invention. The tet-inducible expression system was initially based on Schizosaccharomyces pombe (Faryar and Gatz, 1992, Current Genetics 21: 345-349) and mammalian cells (Lang and Feingold, 1996, 1969-1996). ), But recent studies have extended its applicability to bacterial cells. For example, Stieger et al. (1999, Gene 226: 243-252) revealed an 80-fold induction of the firefly luciferase gene in tet induction operably linked to the tet promoter. The advantage of this promoter is that it induces very low levels of tetracycline, ie, about 1/10 of the dose required for antibiotic activity.
[0160]
5.4. Derivatives and analogs
The invention further includes bacterial vectors that have been modified to encode or deliver the derivative. Derivatives include, but are not limited to, primary and / or secondary effector molecules, or fragments, analogs, or variants of the nucleic acids that encode them. Derivatives, analogs or variants are functionally active, eg, can exhibit one or more functional activities associated with a full-length, wild-type effector molecule. As an example, such derivatives, analogs or variants having the desired therapeutic properties can be used to inhibit tumor growth or tumor cell dispersion (metastasis). Derivatives or analogs of the effector molecules can be tested for the desired activity by methods known to those skilled in the art, such as those described herein.
[0161]
In particular, variants are created by altering the effector molecule coding sequence by substitution, addition (eg, insertion) or deletion that provides a molecule having the same or higher anti-tumor function as the wild-type effector molecule. be able to. For example, the mutants of the present invention include, but are not limited to, those containing all or part of the amino acid sequence of the effector molecule as the primary amino acid sequence, including functionally equivalent amino acid residues. There are modified sequences in which a group is substituted in the sequence with a residue that causes a silent change. That is, the modified sequence has at least one conservative substitution.
[0162]
Either the primary or secondary effector-encoding nucleic acids from mammals can be modified to use bacterial codon usage by methods known to those skilled in the art. Preferred codon usage is exemplified below: Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates, Inc. , And John Wiley & Sons, Inc. New York, and Zhang et al., 1991, Gene 105: 61-72.
[0163]
In specific embodiments, a derivative, analog or variant of a primary or secondary effector molecule comprises a nucleotide sequence that hybridizes to a nucleotide sequence encoding a primary or secondary effector molecule, or a fragment thereof. Here, hybridization is carried out under stringent conditions, for example, at about 45 ° C., in 6 × sodium chloride / sodium citrate (SSC), after hybridization with the DNA bound to the filter, at about 50-65 ° C. And washing at least once in 0.2 × SSC / 0.1% SDS. Alternatively, under highly stringent conditions, for example, hybridizing with the nucleic acid bound to the filter in 6 × SSC at about 45 ° C., and then in 0.1 × SSC / 0.2% SDS at about 68 ° C. Washing is performed once or more. Alternatively, it can be performed under other stringent conditions known to those skilled in the art (eg, Ausubel, FM et al., Eds., 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. I, Green Publishing Associates, Inc., and John Wiley & Sons, Inc. New York, pages 6.3.1-6.3.6 and 2.10.3).
[0164]
Derivatives or analogs of a primary or secondary effector molecule include, but are not limited to, a molecule comprising a region substantially homologous to a primary or secondary effector molecule or a fragment thereof (eg, in various embodiments, For amino acid sequences of the same size without any insertions or deletions, or at least 60% or 70% or less compared to aligned sequences performed by computer homology programs known to those skilled in the art. 80% or 90% or 95% identity) or, alternatively, a molecule whose encoding nucleic acid is capable of hybridizing under high stringency, medium stringency or low stringency conditions to an effector molecule protein effector molecule coding sequence. No.
[0165]
For example, to determine the percent identity of two amino acid sequences or two nucleic acids between the sequence of a primary effector molecule and another known sequence, the sequences are aligned for optimal comparison purposes (eg, the first amino acid sequence). Alternatively, gaps can be introduced in the sequence of the nucleic acid sequence to achieve optimal alignment with the second amino acid or nucleic acid sequence). The amino acid residues or nucleotides at corresponding amino acid positions or nucleotide positions are then compared. If a position in the first sequence is occupied by the same amino acid residue or nucleotide as the corresponding position in the second sequence, then the molecules are identical at that position. The percent identity between two sequences is a function of the number of identical positions shared by the sequences (ie,% identity = number of identical positions # / total number of positions # (eg, duplicate positions) x 100). In one embodiment, the two sequences are the same length.
[0166]
The percent identity between two sequences can be achieved using a mathematical algorithm. Preferred, non-limiting examples of mathematical algorithms used to compare two sequences are described in Karlin and Altschul, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci, USA 87: 2264-2268 (modified as described in Karlin and Altschul, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci, USA 90: 5873-5877). Such an algorithm is described in Altschul et al., 1990, J. Am. Mol. Biol. 215: 403-410 at NBLAST and XBLAST programs. By performing a BLAST nucleotide search using the NBLAST program, score = 100, wordlength = 12, a nucleotide sequence homologous to the nucleic acid molecules of the invention can be obtained. By performing a BLAST protein search using the XBLAST program, score = 50, wordlength = 3, an amino acid sequence homologous to the protein molecule of the present invention can be obtained. To obtain gap alignments for comparison purposes, see Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402, gap BLAST can be used. Alternatively, an iterative search for detecting the distance relationship between molecules may be performed using PSI-Blast (Id.). When using BLAST, gap BLAST, and PSI-Blast programs, default parameters of the respective programs (for example, XBLAST and NBLAST) can be used. http: // www. ncbi. nlm. nih. gov. checking ... Another preferred non-limiting example of a mathematical algorithm used for comparing sequences is the algorithm of Myers and Miller, CABIOS (1989). Such an algorithm is incorporated into the ALIGN program (version 2.0), which is part of the GCG sequence alignment software package. When comparing amino acid sequences using the ALIGN program, a PAM120 weight residue table, a gap length penalty of 12, and a gap penalty of 4 can be used. Additional algorithms for sequence analysis are known to those of skill in the art and include the following: Torellis and Robotti, 1994, Comput. Appl. Biosci. ADVANCE and ADAM described in Pearson and Lipman, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. 85: 2444-8. In FASTA, ktup is a control option that sets the sensitivity and speed of the search. If ktup = 2, similar regions in the two sequences being compared can be found by examining the aligned residue pairs. If ktup = 1, a single aligned amino acid is examined. ktup can be set to 2 or 1 for a protein sequence and 1 to 6 for a DNA sequence. If ktup is not specified, the default is 2 for proteins and 6 for DNA. For a more detailed description of the FASTA parameters, see
http: // bioweb. pasteur. fr / docs / man / fasta. 1. html # sect2
Please refer to. This content is incorporated herein by reference.
[0167]
Alternatively, protein sequence alignments are described in Higgins et al., 1996, Methods Enzymol. 266: 383-402, using the CLUSTAL W algorithm.
[0168]
The percent identity between two sequences, with or without gaps, can be determined using techniques similar to those described above. In calculating percent identity, count only the exact same.
[0169]
Primary or secondary effector molecules, or derivatives or analogs thereof, can be produced by various methods known to those skilled in the art. The operations for producing them can be performed at the nucleic acid or protein level. For example, a cloned effector molecule coding sequence that encodes an effector molecule can be modified by any of a number of strategies known to those of skill in the art (Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual). , Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York). The sequence can be cut at the appropriate site using a restriction endonuclease, followed by further enzymatic modification, if desired, isolated, and ligated in vitro. Upon generation of a modified effector molecule that encodes a derivative or analog of a primary or secondary effector molecule, the modified effector molecule coding sequence is translated in the effector molecule coding sequence region where the desired primary or secondary effector molecule activity is encoded. Care must be taken to ensure that they remain in the same translational reading frame as the native protein, without being interrupted by a stop signal.
[0170]
Furthermore, the nucleic acid encoding the effector molecule is mutated in vitro or in vivo to form and / or destroy translation, initiation, and / or termination sequences, or to mutate the coding region, and / or Alternatively, in vitro modifications can be further facilitated by forming new restriction endonuclease sites or disrupting existing ones. In a preferred specific embodiment, the effector molecule-encoding nucleic acid is mutated, for example, to produce a more potent variant. Any mutagenesis technique known to those skilled in the art can be used, including, but not limited to: chemical mutagenesis, in vitro site-directed mutagenesis. (Hutchinson et al., 1978, J. Biol. Chem. 253: 6551), use of a TAB® linker (Pharmacia), PCR using primers containing mutations, and the like. In a preferred embodiment, conservative amino acid substitutions are made at one or more predicted non-essential amino acid residues in the effector molecule. By "conservative amino acid substitution" is meant an amino acid residue substituted with an amino acid residue having a similarly charged side chain. Families of amino acid residues having side chains with similar charges have been defined in the art. These families include the following: basic side chains (eg, lysine, arginine, histidine), acidic side chains (eg, aspartic acid, glutamic acid), uncharged electrode side chains (eg, glycine, asparagine). Glutamine, serine, threonine, tyrosine, cysteine), non-polar side chains (eg, alanine, valine, leucine, isoleucine, proline, phenylalanine, methionine, tryptophan), β-branched side chains (eg, threonine, valine, isoleucine), And amino acids having aromatic side chains (eg, tyrosine, phenylalanine, tryptophan, histidine). Alternatively, mutations can be introduced randomly, for example, by saturation mutagenesis, along all or part of the coding sequence, and by screening the resulting mutants for biological activity, Mutants that retain activity can be identified. After mutagenesis, the encoded protein can be expressed and the activity of the protein determined.
[0171]
In another embodiment, an effector molecule or fusion protein of the invention is constructed to include a protease cleavage site.
[0172]
5.5. Fusion protein
In certain embodiments, the invention provides a primary or secondary effector molecule constructed as a fusion protein (eg, covalently linked to another protein). The present invention provides nucleic acids encoding such fusion proteins. In certain embodiments of the invention, the nucleic acid encoding the fusion protein is operably linked to a suitable promoter.
[0173]
In certain embodiments, the effector molecule is an effector molecule or fragment thereof attached to its amino- or carboxy-terminus via a peptide bond to the amino acid sequence of another protein (preferably, at least a domain or A motif, or consisting of at least 5, at least 10, at least 25, at least 50, at least 75, or at least 100 amino acids of the effector molecule). In certain embodiments, the fusion is at least 2, at least 6, at least 10, at least 20, at least 30, at least 50, at least 75, or at least 100 contiguous of the functionally active heterologous polypeptide or fragment thereof. Contains amino acids. In one embodiment, such a chimeric or fusion protein is a nucleic acid encoding a primary effector molecule linked in-frame to the coding sequence of another protein (eg, a TNF coding sequence, an anti-angiogenic factor coding sequence, a tumor suppressor enzyme). Coding sequence, or cytotoxic polypeptide coding sequence). Such a chimeric protein can be obtained by ligating appropriate nucleic acid sequences encoding desired amino acid sequences to each other in an appropriate coding frame by a method known to those skilled in the art. It can be produced by expressing the chimeric product in an expression vehicle. Chimeric nucleic acids may be constructed that include a nucleic acid portion encoding an effector molecule fused to any heterologous polypeptide coding sequence. Specific embodiments are fragments of a primary or secondary effector molecule consisting of at least 5, at least 10, at least 25, at least 50, or at least 100 amino acids, or one or more functional activities of a full-length primary or secondary effector molecule. Chimeric proteins containing the indicated fragments.
[0174]
In a specific embodiment, the fusion protein comprises an affinity tag, such as a hexahistidine tag, or other affinity tag that can be used in a purification, isolation, identification or expression assay. In another specific embodiment, the fusion protein comprises a protease site, such as a metal protease or serine cleavage site. In this embodiment, it may be preferable to construct a protease site in the fusion protein of the invention that corresponds to a protease that is active at the tumor site. In some embodiments, the effector molecule is an Omp-like protein, or a fragment thereof (eg, a signal sequence, a leader sequence, a periplasmic region, a transmembrane domain, a multiple transmembrane domain, or a combination thereof; .1, see definition of Omp-like protein).
[0175]
In a preferred embodiment, the effector molecule (primary or secondary) of the invention is expressed as a fusion protein comprising an outer membrane protein (Omp-like protein). Bacterial outer membrane proteins are integral membrane proteins of the bacterial outer membrane, have multiple membrane-spanning domains, and are often bound to one or more lipid components. Outer membrane proteins are initially expressed in the form of a precursor with an amino-terminal signal peptide that directs the protein to the membrane, where the signal peptide is cleaved by a signal peptidase to produce the mature protein. In one embodiment, the effector molecule is expressed as a fusion protein with an Omp-like protein. In this embodiment, the primary effector molecule has enhanced bacterial delivery to the outer membrane. While not limiting with respect to the mechanism, the present inventors have determined that Omp-like proteins act as anchors or tethers of effector molecules to the outer membrane, or serve to localize proteins to the bacterial outer membrane. Think. In one embodiment, fusion of the effector molecule with an Omp-like protein is used to enhance localization of the effector molecule to the periplasm. In another embodiment, fusion of an Omp-like protein and an effector molecule is used to enhance release of the effector molecule. In specific embodiments, the Omp-like protein is OmpA, OmpB, OmpC, OmpD, OmpE, OmpF, OmpT, porin-like protein, PhoA, PhoE, lamB, β-lactamase, enterotoxin, protein A, endoglucanase, peptidoglycan-associated lipoprotein. (PAL), FepA, FhuA, NmpA, NmpB, NmpC, or at least a portion of a major outer membrane lipoprotein (such as LPP). In certain embodiments of the invention, the signal sequence is constructed with increased hydrophobicity (eg, by insertion or substitution of an amino acid in the signal sequence with a hydrophobic amino acid (eg, leucine)). See Sections 7.1-7.4 below for examples.
[0176]
In another embodiment of the invention, the fusion proteins of the invention comprise a proteolytic cleavage site. The proteolytic cleavage site may be endogenous to the effector molecule or to the Omp-like protein, or a proteolytic cleavage site may be constructed in the fusion protein. In certain specific embodiments, an Omp-like protein of the invention is a hybrid Omp that includes structural elements from separate proteins.
[0177]
In an example aspect of the above embodiment, the Omp-like protein is OmpA. The same principles used to construct the OmpA-like fusion protein can be applied to other Omp-like proteins, keeping in mind the structural configuration of the specific Omp-like protein.
[0178]
For example, the native OmpA protein contains eight antiparallel transmembrane β-strands within the 170 amino acid N-terminal domain of the protein. There are extracellular or intracellular loops between each pair of transmembrane domains, depending on the direction of insertion of the transmembrane domain. The C-terminal domain consists of 155 amino acids, which are located intracellularly and are likely in contact with peptidoglycans occupying the periplasmic space. Expression vectors have been created to facilitate the production of OmpA fusion proteins. For example, Hobom et al. (1995, Dev. Biol. Strand. 84: 255-262) have developed a vector containing the OmpA open reading frame, which contains a sequence encoding the third or fourth extracellular loop. Has a linker inserted. The loop allows for in-frame insertion of the selected heterologous protein.
[0179]
In one embodiment of the invention, the OmpA fusion protein portion comprising the primary effector molecule has enhanced expression in the periplasm. In one aspect of this embodiment, the fusion protein comprises a signal sequence prior to maturation, or a signal sequence followed by at least one transmembrane domain of OmpA, where the primary effector molecule is also located at the N-terminus. The signal sequence has been truncated and deleted from the mature protein. In another aspect of the above embodiment, since the primary effector molecule is at the N-terminus of the OmpA fusion protein, the number of OmpA transmembrane domains used will determine the location of the primary effector molecule, as long as the fusion protein is stable. Is not important to you. In yet another aspect of the above embodiment, the primary effector molecule is located between the N and C-terminal domains of OmpA, whereby the soluble periplasmic protein is cleaved by periplasmic proteases in the periplasm. Contains primary effector molecule. In a particular aspect of this embodiment, the bacterial vector expressing the periplasmic primary effector molecule enhances release of the effector molecule from the bacterial cell by co-expressing BPR as well.
[0180]
In another embodiment of the invention, the OmpA fusion protein portion comprising the primary effector molecule is on the surface of an extracellular bacterium. In one aspect of this embodiment, the fusion protein comprises an even or odd transmembrane domain of OmpA located at the N-terminus of the primary effector molecule. In another aspect of the above embodiment, a primary effector molecule is placed between the two extracellular loops of OmpA to achieve bacterial cell display to tumor cells. In a specific embodiment, the present invention provides an expression plasmid for an effector molecule fusion protein located on the bacterial extracellular surface. For example, a plasmid called Trc (lpp) ompA contains a trc promoter-driven lipopolyprotein (lpp) anchor sequence fused to a truncated ompA transmembrane sequence. As another example, the plasmid is called TrcompA and contains a trc promoter driven ompA coding signal sequence. Such a plasmid can be constructed to include a nucleic acid encoding one or more effector molecules of the invention.
[0181]
Optionally, the effector molecule is preceded by or adjacent to a common cleavage site for a metalloprotease or serine protease that is abundant in the tumor, thereby causing release of the effector molecule into the tumor environment. Whether the primary effector molecule precedes or is adjacent to the protease cleavage site depends on whether it is located terminally or internally within the fusion protein, respectively.
[0182]
Similar fusion proteins can be constructed with any Omp-like protein using the strategy described above for OmpA. In constructing such a fusion protein, it will be apparent to those skilled in the art that the selection of the Omp-like protein portion to be fused to the effector molecule depends on the desired location for expression of the effector molecule (eg, in the periplasm, extracellularly, extracellularly). , Attached to the membrane, etc.). With respect to primary effector molecules, such protein constructions described herein are also suitable for secondary effector molecules.
[0183]
In a preferred embodiment, the effector molecule is fused to a ferry peptide. The ferry peptide used in the fusion protein has been shown to facilitate delivery of the polypeptide or peptide of interest to virtually any cell within the diffusion limits of its production or introduction ( For example, Bayley, 1999, Nature Biotechnology 17: 1066-1067; Fernandez et al., 1998, Nature Biotechnology 16: 418-420; and Derossi et al., 1998, Trends Cell Biol. Thus, engineering an attenuated tumor target bacterium to express a fusion protein comprising the ferry peptide and the effector molecule enhances the ability of the effector molecule to be taken up by tumor cells. In a specific embodiment, the attenuated tumor target bacterium is engineered to express a nucleic acid encoding a fusion protein comprising a ferry peptide and an effector molecule. In another embodiment, the attenuated tumor target bacterium is engineered to express one or more nucleic acid molecules encoding one or more fusion proteins including a ferry peptide and an effector molecule. According to these embodiments, the effector molecule may be a primary or secondary effector molecule. Examples of ferry peptides include, but are not limited to, peptides derived from the HIV TAT protein, antennapedia homeodomain (Penetraxin), Kaposi fibroblast growth factor (FGF) membrane translocating sequence (MTS), herpes simplex virus VP22 Polyhistine (eg, hexahistazine; 6H), polylysine (eg, hexalysine; 6K) and polyarginine (eg, hexaarginine; 6R) (eg, Blanke et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 8437-8442).
[0184]
In another preferred embodiment, the fusion protein comprises a signal peptide, a ferry peptide and an effector molecule. In a particular aspect of this embodiment, the attenuated tumor target bacterium is engineered to express one or more nucleic acid molecules encoding one or more fusion proteins including a signal sequence, a ferry peptide and an effector molecule. According to this aspect, the effector molecule may be a primary or secondary effector molecule.
[0185]
In another preferred embodiment, the fusion protein comprises a signal peptide, a proteolytic cleavage site, a ferry peptide and an effector molecule for delivery to a solid tumor cancer by an attenuated tumor target bacterium. In a specific embodiment, the attenuated tumor target bacterium is engineered to express one or more nucleic acid molecules encoding one or more fusion proteins including a signal sequence, a proteolytic cleavage site, a ferry peptide and an effector molecule. According to this aspect, the effector molecule may be a primary or secondary effector molecule.
[0186]
As a non-limiting example, colicin activity can be enhanced by adding uptake peptides from HIV TAT, herpes simplex virus VP22, Antennapedia, 6H, 6K and 6R. Fusions can be at the C-terminus, the N-terminus, or internally. Internal fusions are particularly preferred when the fusion follows the N-terminal signal sequence cleavage peptide. The fusion protein further includes an N-terminal signal sequence such as OmpA, or a C-terminal signal sequence such as hlyA.
[0187]
In a preferred embodiment, the effector molecule is fused to a toxin delivery moiety. Various toxins are known for their ability to self-deliver, wherein a portion of the toxin serves as a delivery factor for a second portion of the toxin. For example, Ballard et al. (1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA $ 93: 12531-12534) report that anthrax mediates entry of lethal factor (LF) and edema factor into the cytosolic compartment of mammalian cells. It has been shown that protective agents (PA) can also mediate entry of protein fusions into truncated forms of LF (LFn; 255 amino acid residues). Thus, the effector molecules of the present invention include LFn, or other toxin systems, including but not limited to diphtheria toxin A chain residues 1-193, except those that function outside the cell (Blanke et al., 1996). Natl. Acad / Sci. USA 93: 8437-8442), cholera toxin, verotoxin, Escherichia coli heat-labile toxin (LT), Escherichia coli heat-stable toxin (ST), intestinal hemolysin, enterotoxin, cytotoxin, It can be fused to EggEC stable toxin 1 (EAST), CNF, cell-lethal swelling toxin, alpha-hemolysin, beta-hemolysin, and SheA-hemolysin (see, for example, O'Brien and Holmes, 1996, Protein). C. toxins of Escherichia coli and Salmonella. Cellular and Molecular Biology, Neidhardt et al. (eds.), ASM Press, Washington, DC, pp. 2788-2802). In a specific embodiment, the primary effector molecule is fused to a toxin delivery moiety. In another specific embodiment, a secondary effector molecule is fused to the toxin delivery moiety.
[0188]
Construction of fusion proteins for expression in bacteria is known to those of skill in the art, and such methods are within the scope of the present invention (eg, Makrides, S., 1996, Microbiol. Revs 60: 512). -538, which is hereby incorporated by reference in its entirety).
[0189]
5.6 Expression carrier
The present invention provides attenuated tumor-targeting bacteria designed to encode one or more primary effector molecules and one or more optional secondary effector molecules. The present invention provides an attenuated tumor target bacterium comprising an effector molecule encoded by a plasmid or transfectable nucleic acid. In a preferred embodiment of the invention, the attenuated tumor target bacterium is Salmonella. If more than one effector molecule (eg, primary or secondary) is expressed in an attenuated tumor target bacterium, such as Salmonella, the effector molecule may be encoded on the same plasmid or nucleic acid, or May be encoded by a plasmid or nucleic acid molecule. The invention also provides an attenuated tumor target bacterium comprising an effector molecule encoded by a nucleic acid molecule integrated into the bacterial genome. The effector molecule incorporated may be endogenous to the attenuated tumor target bacterium, such as Salmonella, or the nucleic acid molecule encoding the effector molecule may be integrated into the genome of the attenuated tumor target bacterium. It may be introduced into the target bacterium (eg, by introduction of a nucleic acid encoding an effector molecule such as a plasmid, transfectable nucleic acid, transposon, etc.). In a preferred embodiment of the invention, the attenuated tumor target bacterium is Salmonella. The invention provides for a nucleic acid molecule encoding an effector molecule operably linked to a suitable promoter. A promoter operably linked to a nucleic acid molecule encoding an effector molecule can be homologous (ie, native) or heterologous (ie, not native to the nucleic acid molecule encoding the effector molecule). .
[0190]
The nucleotide sequence encoding the effector molecule of the present invention, or a functionally active analog or fragment or other derivative thereof, may comprise a suitable expression vector containing essential elements for transcription and translation of the inserted protein encoding sequence. It may be inserted into the body, for example a plasmid. Essential transcription and translation signals may be provided by the effector molecule and / or its flanking regions. Alternatively, the expression vehicle can function, using one of a variety of methods known in the art of DNA manipulation, to convert a structural DNA sequence encoding the desired protein into a functional promoter, along with suitable translation initiation and termination signals. By inserting in the correct reading phase. For a review, see Sambrook et al., 1989, Molecular Biology: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, Columbia, Colorville, Colorado, USA. These methods can include in vitro recombinant DNA and synthetic techniques and in vivo recombination (genetical recombination). The invention provides for a nucleic acid molecule encoding an effector molecule operably linked to a suitable promoter.
[0191]
The invention also provides attenuated tumor targeting bacteria that have been modified to encode one or more fusion proteins and one or more optional effector molecules. The present invention provides an attenuated tumor target bacterium comprising a fusion protein encoded by a plasmid or transfectable nucleic acid. When two or more fusion proteins and / or effector molecules (eg, primary or secondary) are expressed in an attenuated tumor target bacterium, such as Salmonella, the fusion proteins and / or effector molecules are encoded on the same plasmid or nucleic acid. Or encoded by more than one plasmid or nucleic acid. The invention also provides an attenuated tumor target bacterium comprising a fusion protein encoded by a nucleic acid integrated into the bacterial genome. The invention also provides a nucleic acid molecule encoding the fusion protein operably linked to a suitable promoter. The nucleotide sequence encoding the fusion protein of the present invention may be inserted into a suitable expression vehicle, such as a plasmid, which contains the essential elements for transcription and translation of the inserted protein-encoding sequence.
[0192]
In certain embodiments of the invention, the expression vehicles of the invention are plasmids. Numerous suitable plasmids are known to those of skill in the art, and commercially available ones may be obtained to make the recombinant constructs of the present invention.
[0193]
Such commercially available plasmids include, for example, pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Sweden) and GEM1 (Promega Biotec, Madison, WI, USA). These pBR322 "backbone" portions are combined with a suitable promoter and the structural sequence to be expressed. pBR322 is believed to be a low copy number plasmid. If high levels of expression are desired, the plasmid may be a high copy number plasmid, for example, a plasmid containing a pUC backbone. pUC plasmids include, but are not limited to, pUC19 (see, for example, Yanisch-Perron et al., 1985, Gene 33: 103-119) and pBluescript (Stratagene).
[0194]
The following plasmids are given by way of example and can be used with the method of the present invention. Bacterial: pBs, phagescript, phiX174, pbluescriptSK, pBs KS, pNH8a, pNH16a, pNH18a, pNH46a (Stratagene); pTrc99A, pKK223-3, pKK233p, RDR540p. Commercially available plasmids containing pBR322 "backbone" can also be used, for example, pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Sweden) and GEM1 (Promega Biotec, Madison, WI, USA). These are combined with a suitable promoter and the structural sequence to be expressed. pCET, pTS (as described in Section 6 herein).
[0195]
In certain embodiments of the invention, the plasmid encoding the effector molecule is a pTS-TNF-α plasmid, a pTS-BRP plasmid, or a pTS-BRPTNF-α plasmid described in Section 6 herein.
[0196]
In a particular embodiment of the invention, the fusion protein of the invention for secretion into the periplasmic space, comprising an OmpA signal sequence and a primary effector protein, is encoded on the plasmid pIN-III-ompA-Hind, It contains the DNA sequence encoding the ompA signal sequence upstream of the linker sequence from which the coding sequence for the primary effector molecule can be cloned. In a particular preferred embodiment, the lac-inducible promoter of the pIN-III-ompA-Hind vector is replaced by a pepT or tet promoter (see Rentier-Delrue et al. (1988), Nuc. Acids Res. 16: 8726).
[0197]
The invention also provides for transposon-mediated chromosomal integration of effector molecules. For the method of the present invention, any transposon plasmid known in the art may be used, so long as the nucleic acid encoding the effector molecule can be constructed in a transposon cassette. For example, the invention provides a transposon plasmid comprising a transposon or mini-transposon and MCS.
[0198]
In one embodiment of the invention, the plasmid of the invention is a transposon plasmid, ie comprises a transposon into which a sequence encoding the effector molecule of interest has been inserted. The transposon plasmid contains a transposon cassette that integrates into the bacterial genome. Thus, the nucleic acid encoding the effector molecule or its fusion protein is inserted into a transposon cassette. In this way, the cassette is integrated into the bacterial genome by transposon insertion. The coding sequence for the effector molecule may be operably linked to the promoter or it may be without a promoter. In the latter case, expression of the selectable marker is driven by a promoter at the site of transposon insertion into the bacterial genome. Transposon-inserted bacterial colonies are screened for expression levels consistent with the requirements of the invention, eg, those that express sufficient levels of cytokines to enhance tumor cytotoxicity, stasis, and regression.
[0199]
In one embodiment, the transposon plasmid comprises, in addition to the transposon, a transposase gene outside the transposon inverted repeat that catalyzes the insertion of the transposon into the bacterial genome without being carried with the transposon. To produce a bacterial strain with a stable transposon insertion.
[0200]
Transposons utilized in the present invention include, but are not limited to, Tn7, Tn9, Tn10 and Tn5. In a preferred embodiment, the transposon plasmid is pNK2883 (ATCC), which has an ampicillin resistance gene located outside the Tn10 insertion element, and the nucleic acid encoding one or more effector molecules is between two Tn10 insertion elements (eg, a transposon). (In the cassette). Preferably, the construct is made such that additional sequences encoding other elements are inserted between the two Tn10 insertion elements. In certain embodiments, such elements optionally include (1) a promoterless copy of a selectable marker (eg, SerC, AroA, etc.) for positive selection of bacteria containing the plasmid; (2) the BRP gene; A promoter of an effector molecule (such as trc) operably linked to a nucleic acid encoding a primary effector molecule (such as TNF-α or a fusion protein thereof, for example, an Omp-A-TNF-α fusion); ) May include a terminator for a nucleic acid encoding one or more effector molecules.
[0201]
In one embodiment, the plasmid is manipulated as needed, and the plasmid-encoded ampicillin resistance properties are used to select a clone with the desired construct, followed by loss of the plasmid, eliminating antibiotic selection and allowing human patients to A strain having a chromosomal transposon insertion for administration of is selected (eg, by plating on a selective medium).
[0202]
In another particular embodiment, a plasmid pTS comprising a transposase gene with altered target specificity and a coding sequence of a promoterless serC gene and a minitransposon comprising MCS is used. In another particular embodiment, a plasmid pTS- comprising a coding sequence for a transposase gene and a promoterless serC gene with altered target specificity, and a minitransposon comprising an alkylating agent-inducible bacteriocin-releasing factor and MCS. Use BRP.
[0203]
In a preferred embodiment, the transposon plasmid for selection of a transposon-mediated chromosomal integrant comprises:
a) a transposase gene for transposon excision and integration located outside the transposon insertion sequence (eg, outside the transposon cassette);
b) A wild-type coding sequence corresponding to the selection gene deleted in the bacterial strain (eg, serC) and a ribosome binding site and a terminator for the wild-type gene, but lacking the promoter. This sequence is preferably located immediately after the TN10 transposon insertion sequence on the left;
c) optionally, between the right and left insert sequences is a nucleic acid sequence encoding a release enhancing nucleic acid (eg, BRP);
d) Multiple cloning site (MCS) for integration of effector molecules, located between the right and left inserts and containing multiple unique restriction sites in the plasmid. The MCS is preferably located immediately after the release enhancing nucleic acid (if used) and immediately before the TN10 insertion sequence on the right.
[0204]
In another embodiment, gene disruption due to random integration of the effector molecule into the host chromosome confirms the suitability of the gene location for effector insertion.
[0205]
In yet another embodiment, the expression vehicle is a stable, ie, self-maintained, extrachromosomal plasmid that does not require antibiotic selection. In one non-limiting example, the self-sustaining expression carrier is a Salmonella virulence plasmid.
[0206]
For example, in one embodiment of the present invention, a plasmid selection system may be maintained by providing a function that has been lost by a bacterium, such as Salmonella, and a Salmonella bacterium having a function based thereon may be selected from those that do not. In one embodiment, the Salmonella of the present invention is an auxotrophic mutant strain, and the expression plasmid provides a mutant strain, ie, one lacking biosynthetic enzyme function. Salmonella bacteria containing an expression plasmid can be selected by growing the cells in a desired medium, ie, a growth medium lacking nutrients that only those containing the expression plasmid can metabolize. In a highly preferred aspect of this embodiment, the Salmonella of the invention inevitably requires DAP (meso-diaminopimelic acid), most preferably by deletion of the asd gene. DAP is a component of peptidoglycan present in the periplasm of Gram-negative bacteria and is required for a complete bacterial outer membrane. Without DAP, bacterial cells lyse due to incomplete outer membrane. The asd (β-aspartate semialdehyde dehydrogenase) gene encodes an enzyme in the DAP biosynthetic pathway. Gram-negative bacteria lacking asd function are grown by supplying DAP to the culture medium. Plasmids carrying an asd gene sequence operably linked to a homologous or heterologous promoter, such as the expression plasmids of the invention, can be selected by growing Gram-negative bacteria lacking asd activity in the absence of DAP (eg, Curtiss, III, U.S. Pat. No. 5,840,483).
[0207]
Other non-antibiotic selection systems are known in the art and are within the scope of the present invention. For example, a selection system utilizing a plasmid comprising a stable toxin and a less stable antitoxin may be used to select for bacteria that maintain such a plasmid.
[0208]
In another embodiment, the expression vehicle is an extrachromosomal plasmid, such as a colicin plasmid, that can be selected by non-antibiotic methods. As used herein, a colicin plasmid encodes, at a minimum, a colicin toxin and an anti-colicin (the colicin toxin is more stable than an anti-colicin), so that any bacteria lacking the colicin plasmid will result in continued colicin toxin. To die. In a preferred embodiment, the colicin toxin is a large subunit of ColE3 and the anti-colicin is a small subunit of ColE3.
[0209]
In another embodiment of the invention, the expression vehicle is a lambda vector, more particularly a lysogenic lambda vector. In a preferred embodiment, the bacterial host comprising the λ vector further comprises a temperature sensitive λ repressor that is functional at 30 ° C but not at 37 ° C. Thus, a bacterial host can be grown and manipulated at 30 ° C. in vivo without expressing primary and / or secondary effector molecules that can be toxic to bacterial cells. Upon introduction of the bacterial strain into the patient, the lambda repressor is inactivated by normal body temperature and the expression of the primary and, if desired, secondary effector molecules is activated.
[0210]
Expression of a nucleic acid sequence encoding an effector molecule or fusion protein can be regulated by a second nucleic acid sequence such that the effector molecule is expressed in bacteria transformed with the recombinant DNA molecule. For example, expression of an effector molecule can be controlled by any promoter / enhancer element known in the art. A promoter / enhancer can be homologous (ie, native) or heterologous (ie, non-natural). Promoters that can be used to control the expression of effector molecules, such as cytokines, or fusion proteins in bacteria include, but are not limited to, the β-lactamase promoter (Villa-Kamaroff et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci.U.S.A. 75: 3727-3731), or the lac promoter (DeBoer et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 80: 21-25; Scientific American, 1980, 242: 74-94). Other promoters encompassed by the present invention include, but are not limited to, lacI, lacZ, T3, T7, gpt, λP_R, ΛP_L, Trc, pagC, sulA, polII (dinA), ruv, recA, uvrA, uvrB, uvrD, umuDC, lexA, cea, caa, and recN (see, for example, Schnarr et al., 1991, Biochimie 73: 423-431). ). In a preferred embodiment, the promoter is trc (see, for example, Amann et al., 1988, Gene 69: 301-15).
[0211]
In certain embodiments, where the primary effector molecule is colicin expressed under the control of an SOS-responsive promoter, attenuated bacterial strains may be exposed to x-rays, ultraviolet light, alkalizing agents or other DNA damaging agents to increase expression of colicin. May be processed. Exemplary SOS-responsive promoters include, but are not limited to, recA, sulA, umuC, dinA, ruv, uvrA, uvrB, uvrD, lexA, cea, caa, rccN, and the like.
[0212]
In another preferred embodiment, the promoter is a promoter that has increased activity in the tumor environment, eg, is activated by the anaerobic environment of the tumor, such as the P1 promoter of the pepT gene. Activation of the P1 promoter is dependent on the FNR transcriptional activator (Strouch et al., 1985, J, Bacteriol. 156: 743-751). In certain embodiments, the P1 promoter is a mutant promoter that is induced at a higher level than a native P1 promoter, such as the pepT200 promoter, under anaerobic conditions, and whose activity is dependent on anaerobic conditions by CRP-cAMP rather than FNR. Induced (Lombardo et al., 1997, J. Bacteriol. 179: 1909-1917). In another embodiment, an anaerobically induced promoter, for example, the potABCD promoter is used. potABCD is an operon divergently expressed from pepT under anaerobic conditions. The promoter responsible for this expression in the pepT gene has been isolated (Lombardo et al., 1997, J. Bacteriol. 179: 1909-1917) and can be used according to the methods of the present invention.
[0213]
Alternatively, the promoter may be an antibiotic-inducible promoter, such as the Tn10 transposon tet promoter. In a preferred embodiment, the tet promoter is, for example, triplicated. Promoter activity is then induced by administering an appropriate dose of tetracycline to a patient treated with the attenuated tumor target bacterium of the present invention. The tet-inducible expression system was first developed by Schizosaccharomyces pombe (Faryar and Gatz, 1992, Current Genetics 21: 345-349) and mammalian cells (Lang and Feingold, 691, 1996, 1976, 1991). Although eukaryotic cell lines have been described, recent studies have extended their application to bacterial cells. For example, Stieger et al. (1999, Gene 226: 243-252) showed an 80-fold induction of the firefly luciferase gene upon tet induction when operably linked to the tet promoter. The advantage of this promoter is that it is induced at very low levels of tetracycline, ie about 1/10 of the dose required for antibiotic activity.
[0214]
Once a plasmid comprising an effector molecule or fusion protein has been constructed and introduced into an attenuated tumor target bacterium, expression of the effector molecule or fusion protein can be, but is not limited to, biological activity, enzymatic activity, It can be assayed by any method known in the art, including Northern blot analysis and Western blot analysis (Sambrook et al., 1989, Molecular Biology: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor; Cold Spring Harbor; Et al., 1995, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing, New Y. ork, NY).
[0215]
5.7. Combination therapy
In certain embodiments, attenuated tumor target bacteria are used with other known cancer therapies to treat solid cancer tumors. In certain other embodiments, an attenuated tumor target bacterium designed to express one or more effector molecules and / or one or more nucleic acid molecules encoding a fusion protein to treat a solid cancer tumor is treated by other known techniques. Use with cancer therapy. For example, an attenuated tumor target bacterium designed to express one or more nucleic acid molecules encoding one or more effector molecules and / or fusion proteins may be used with a chemotherapeutic agent. Examples of chemotherapeutic agents include, but are not limited to, taxanes such as cisplatin, ifosfamide, taxol and paclitaxol, topoisomerase I inhibitors (eg, CPT-II, topotecan, 9-AC, and GG-211). Gemcitabine, vinorelbine, oxalipretin, 5-fluorouracil (5-FU), leucovorin, vinorelbine, temodar, cytochalasin B, gramicidin D, emetine, mitomycin, etoposide, tenoposide, vincristine, vinblastine, cortisin, doxorubicin, daunorubicin, daunorubicin, daunorubicin, and daunorubicin. Anthracindione, mitozantrone, mitramycin, actinomycin D, 1-dehydrotestosterone, glucocorticoid, procaine, tetracaine, lidocaine , Propranolol, and puromycin homologues, and Cytoxan and the like. Alternatively, an attenuated tumor target bacterium designed to express one or more nucleic acid molecules encoding one or more effector molecules and / or fusion proteins may be used in conjunction with radiation therapy (eg, gamma or x-ray irradiation). Good. Any radiation therapy protocol may be used depending on the type of cancer being treated. For example, but not by way of limitation, x-rays may be irradiated, especially high energy megavolts (irradiation above 1 MeV energy) may be used for deep tumors, and electron beam and mid-voltage for skin cancers. X-ray irradiation may be used. Gamma-emitting radioisotopes, such as radioactive isotopes of radium, cobalt and other elements, may be administered to expose the tissue to radiation.
[0216]
The invention includes the sequential or simultaneous administration of an anticancer agent and an attenuated tumor target bacterium. The invention encompasses a combination of an anticancer agent and an attenuated tumor target bacterium that is additive or synergistic.
[0217]
The invention also encompasses a combination of one or more anti-cancer agents and attenuated tumor target bacteria having different sites of action. Such combinations, whether the combination is synergistic or additive, provide improved therapies based on the dual effects of these treatments. Thus, the novel combination therapy of the present invention provides improved efficacy over any drug used as a single drug therapy.
[0218]
The invention also includes the sequential or co-administration of an anticancer agent and an attenuated tumor target bacterium designed to express one or more effector molecules and / or one or more nucleic acid molecules encoding a fusion protein. The present invention relates to the combination of an anticancer agent and an attenuated tumor target bacterium designed to express one or more nucleic acid molecules encoding one or more effector molecules and / or fusion proteins, which is additive or synergistic. Is included.
[0219]
The present invention also provides a combination of one or more anti-cancer agents with different sites of action and an attenuated tumor target bacterium designed to express one or more nucleic acid molecules encoding one or more effector molecules and / or fusion proteins. Is included. Such combinations, whether the combination is synergistic or additive, provide improved therapies based on the dual effects of these treatments. Thus, the novel combination therapy of the present invention provides improved efficacy over any drug used as a single drug therapy.
[0220]
5.8 Methods and compositions for delivery
The present invention provides a method by which an attenuated tumor target bacterium with reduced toxicity to the host can locally deliver one or more primary effector molecules to the tumor, which may be toxic if delivered systemically to the host. In certain embodiments, the primary effector molecule is useful for treating sarcomas, lymphomas, carcinomas, or other solid tumor cancers. In one non-limiting embodiment, the effector molecule is useful for inducing a local immune response at the site of the tumor.
[0221]
According to the present invention, an attenuated tumor-targeting bacterial vector comprising a nucleic acid molecule encoding one or more primary effector molecules, and optionally one or more primary effector molecules, can be used to treat tumors in animals, including human patients with solid tumor cancers. It is advantageously used in a method of inhibiting the growth of, reducing the volume of, or preventing the spread of tumor cells.
[0222]
The present invention relates to an attenuated tumor-targeting bacterium comprising one or more nucleic acid molecules encoding one or more primary effector molecules operably linked to one or more suitable promoters in an animal in need of such treatment. Providing a method for delivering one or more primary effector molecules for the treatment of solid tumor cancer, comprising administering a pharmaceutical composition comprising: The present invention also provides an animal in need of such treatment with one or more nucleic acid molecules encoding one or more primary effector molecules and one or more secondary effector molecules operably linked to one or more suitable promoters. A method of delivering one or more primary effector molecules for the treatment of solid tumor cancer, comprising administering a pharmaceutical composition comprising an attenuated tumor target bacterium comprising: In certain embodiments, the primary effector molecule is a member of the TNF family, a cytotoxic peptide or polypeptide, an anti-angiogenic factor, a tumor inhibitory enzyme, or a functional fragment thereof.
[0223]
The present invention relates to an animal in need of such a treatment, wherein the attenuated tumor comprises one or more nucleic acid molecules encoding one or more fusion proteins of the invention operably linked to one or more suitable promoters. There is provided a method of delivering one or more fusion proteins of the invention for the treatment of solid tumor cancer, comprising administering a pharmaceutical composition comprising a target bacterium. The present invention also provides one or more nucleic acid molecules encoding one or more fusion proteins and one or more effector molecules of the present invention operably linked to one or more suitable promoters in an animal in need of such treatment. A method of delivering one or more fusion proteins and one or more effector molecules of the invention for the treatment of solid tumor cancer, comprising administering a pharmaceutical composition comprising an attenuated tumor-targeting bacterium comprising I will provide a.
[0224]
In a preferred embodiment, the attenuated tumor target bacterium is Salmonella. In another embodiment, the attenuated tumor target bacterium comprises an enhanced release system. In a preferred embodiment, the animal is a mammal. In a highly preferred embodiment, the animal is a human.
[0225]
The invention also provides for the combined delivery of one or more primary effector molecules and optionally one or more secondary effector molecules delivered by an attenuated tumor-targeting bacterium, such as Salmonella. The present invention also provides for the combined delivery of different attenuated tumor-targeting bacteria, carrying one or more different primary effector molecules and / or optionally one or more different secondary effector molecules.
[0226]
The invention also provides for the delivery of one or more fusion proteins of the invention delivered by an attenuated tumor target bacterium such as Salmonella. The invention also provides for the combined delivery of one or more fusion proteins of the invention and optionally one or more effector molecules of the invention, delivered by an attenuated tumor-targeting bacterium, such as Salmonella. The invention also provides for the combined delivery of different attenuated tumor-targeting bacteria, carrying one or more different fusion proteins and / or optionally one or more different effector molecules.
[0227]
Solid tumors include, but are not limited to, sarcomas, carcinomas and, but not limited to, germ cell tumors, tumors of the central nervous system, breast, prostate, cervical, uterine, lung, ovarian Other solid tumor cancers including cancer, testicular, thyroid, astrocytoma, glioma, pancreatic, gastric, liver, colorectal, melanoma, kidney, bladder, and mesothelioma Is mentioned. The patient is preferably an animal, including but not limited to animals such as cows, pigs, chickens, dogs, cats, horses, etc., preferably a mammal, and most preferably a human. As used herein, treatment of a solid tumor includes, but is not limited to, inhibiting tumor growth, inhibiting tumor cell growth, reducing tumor volume, or other treatment of tumor cells in the body. Including inhibiting the spread to parts (metastasis).
[0228]
The present invention includes an attenuated tumor targeting bacterium comprising a pharmaceutically acceptable carrier and one or more nucleic acid molecules encoding one or more primary effector molecules operably linked to one or more suitable promoters. A pharmaceutical composition comprising: The invention includes a pharmaceutically acceptable carrier and one or more nucleic acid molecules encoding one or more primary effector molecules and one or more secondary effector molecules operably linked to one or more suitable promoters. A pharmaceutical composition comprising an attenuated tumor target bacterium.
[0229]
The invention relates to an attenuated tumor-targeting bacterium comprising one or more nucleic acid molecules encoding one or more fusion proteins of the invention operably linked to a pharmaceutically acceptable carrier and one or more suitable promoters. A pharmaceutical composition comprising: The invention includes a pharmaceutically acceptable carrier and one or more nucleic acid molecules encoding one or more fusion proteins of the invention and one or more effector molecules operably linked to one or more suitable promoters. A pharmaceutical composition comprising an attenuated tumor target bacterium.
[0230]
The present invention also provides a pharmaceutical composition comprising a pharmaceutically acceptable carrier and an attenuated tumor target bacterium. The invention also provides a pharmaceutical composition comprising a pharmaceutically acceptable carrier and an attenuated tumor targeting bacterium comprising one or more primary effector molecules and optionally one or more secondary effector molecules. Such compositions comprise a therapeutically effective amount of an attenuated tumor-targeted Salmonella vector comprising one or more primary effector molecules and optionally one or more secondary effector molecules, and a pharmaceutically acceptable carrier. The present invention also provides a pharmaceutically acceptable carrier and a pharmaceutical composition comprising an attenuated tumor target Salmonella comprising one or more fusion proteins of the invention and optionally one or more effector molecules. Such compositions comprise a therapeutically effective amount of an attenuated tumor-targeted Salmonella vector comprising one or more fusion proteins of the invention and optionally one or more effector molecules, and a pharmaceutically acceptable carrier.
[0231]
In certain embodiments, “pharmaceutically acceptable” refers to a compound approved by a federal or state regulatory authority, or other commonly used for use in the United States Pharmacopeia or animals, and more particularly, humans. Means listed in recognized pharmacopeias. "Carrier" refers to a diluent, adjuvant, excipient, or vehicle with which the therapeutic is administered. Such pharmaceutical carriers can be sterile liquids, such as water and oils, including those of petroleum, animal, plant or synthetic origin, such as peanut oil, soybean oil, mineral oil, sesame oil, olive oil and the like. Physiological saline is a preferred carrier when the pharmaceutical composition is administered intravenously. Saline solutions and aqueous dextrose and glycerol solutions can also be employed as liquid carriers, particularly for injectable solutions. Suitable pharmaceutical excipients include starch, glucose, lactose, sucrose, gelatin, malt, rice, flour, chalk, silica gel, sodium stearate, glycerol monostearate, talc, sodium chloride, dried skim milk, glycerol, propylene glycol, Water, ethanol and the like. The composition may optionally contain minor amounts of wetting or emulsifying agents, or pH buffering agents. These compositions may take the form of solutions, suspensions, emulsions, tablets, pills, capsules, powders, sustained release formulations and the like. Oral formulations can include standard carriers such as pharmaceutical grades of mannitol, lactose, starch, magnesium stearate, sodium saccharine, cellulose, magnesium carbonate, and the like. Examples of suitable pharmaceutical carriers are described in E.I. W. Described in "Remington's Pharmaceutical Sciences" by Martin. Such compositions comprise a therapeutically effective amount of the purified form of the therapeutic attenuated tumor target bacterium, together with a suitable amount of carrier which provides the form for proper administration to the patient. The formulation should suit the mode of administration.
[0232]
In a preferred embodiment, the compositions are formulated as pharmaceutical compositions adapted for intravenous administration to human organisms according to conventional procedures. Typically, compositions for intravenous administration are solutions in sterile isotonic aqueous buffer. Where necessary, the composition may also include a suspending agent and a local anesthetic such as lignocaine to ease pain at the site of the injection. Generally, the components are provided individually or mixed together in unit dosage form, for example, as a lyophilized powder or a water-free concentrate, in a closed container such as an ampoule or sachet, representing the quantity of active agent. Where the composition is administered by infusion, it may be dispensed with an infusion bottle containing sterile pharmaceutical grade water or saline. Where the composition is administered by injection, an ampoule of sterile water for injection or saline can be provided so that the ingredients may be mixed prior to administration.
[0233]
The amount of the pharmaceutical composition of the present invention that is effective in treating or preventing solid tumor cancer depends on the nature of the cancer and can be determined by standard clinical techniques. In addition, in vitro assays may optionally be employed to help identify optimal dosage ranges. The precise dose to be employed in the formulation will also depend on the route of administration, and the severity of the cancer, and should be decided according to the judgment of the practitioner and each patient's circumstances. However, in general, a suitable dose range is about 1.0 c. f. u. / Kg to about 1 × 10¹⁰c. f. u. / Kg; about 1.0 c. f. u. / Kg to about 1 × 10⁸c. f. u. / Kg; about 1 × 10 if desired²c. f. u. / Kg to about 1 × 10⁸c. f. u. / Kg; about 1 × 10 if desired⁴c. f. u. / Kg to 1 × 10⁸c. f. u. / Kg; and optionally about 1 × 10⁴c. f. u. / Kg to about 1 × 10¹⁰c. f. u. / Kg. Effective doses can be extrapolated from dose response curves obtained in vitro or from animal model test systems.
[0234]
Various delivery systems are known and can be used to administer the pharmaceutical compositions of the invention. Methods of introduction include, but are not limited to, intradermal, intramuscular, intraperitoneal, intravenous, subcutaneous, intrathecal, intranasal, epidural, and oral routes. The method of introduction may also be intratumoral (eg, by direct administration to the tumor area).
[0235]
The compositions may be administered by any convenient route, for example, by infusion or bolus administration, by absorption through the epithelial or mucosal skin (eg, oral mucosa, rectum and intestinal mucosa, etc.), and by other biological agents. May be administered together with the active agent. Administration can be systemic or local. In addition, it may be desirable to introduce the pharmaceutical compositions of the present invention into the central nervous system by any suitable route, including intraventricular and intrathecal injections, such as Ommaya reservoirs. Can be facilitated by an intraventricular catheter attached to the reservoir. Pulmonary administration can also be used, for example, by use of a formulation that includes an inhaler or nebulizer and an aerosolizing agent.
[0236]
In certain embodiments, it may be desirable to administer the pharmaceutical compositions of the invention locally to the area in need of treatment, including, but not limited to, local injection during surgery. Injection by a catheter, or by a porous, non-porous, or gelatinous material, including membranes or fibers, such as sialastic membranes. In certain embodiments, it may be administered by direct injection at the site (or original site) of the malignant tumor or neoplastic or pre-neoplastic tissue.
[0237]
Attenuated tumor targeting bacteria comprising one or more primary effector molecules and optionally one or more secondary effector molecules can be delivered in a sustained release system. Attenuated tumor targeting bacteria comprising one or more fusion proteins of the invention and, optionally, one or more effector molecules, can also be delivered in a sustained release system. In some embodiments, a pump may be used (Langer, supra; Sefton, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14: 201 (1987); Buchwald et al., 1980, Surgary 88: 507; and Saudek et al., 1989. , N. Engl. J. Med. 321: 574). In another embodiment, a polymer material may be used (Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds.), CRC Press., Boca Ratton, Florida, (1974); ControlledDrugBridge. Performance, Smolen and Ball (eds.), Wiley, New York (1984); Ranger and Peppas, J. Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61 (1983); During et al., 1989, Ann. Neurol. 25: 351; and Howard et al., 1989, J. Neurosurg. 71: 105). In yet another embodiment, a sustained release system can be placed near the therapeutic target, ie, the brain, where only a portion of the systemic dose is required (eg, Goodson, in Medical Applications of Controlled Release, supra, 2). Vol. 115-138 (1984)).
[0238]
Other sustained release systems are discussed in the review by Langer (1990, Science 249: 1527-1533) and comprise an attenuated tumor target bacterium comprising one or more primary effector molecules and optionally one or more secondary effector molecules. Can be used in connection with the administration of
[0239]
The present invention also provides a pharmaceutical pack or kit comprising one or more containers filled with one or more components of the pharmaceutical composition of the present invention. For such containers, optionally, there may be a notice in the form directed by a governmental body that regulates the manufacture, use or sale of pharmaceuticals or biological products, and this notice may be in effect for manufacture, use or use for human administration. Or reflects agency approval for sale.
[0240]
The present invention also provides a method of treating a solid tumor comprising administering a pharmaceutical composition of the invention and at least one other known cancer treatment to an animal in need thereof. In certain embodiments, a solid tumor cancer animal is administered a pharmaceutical composition of the present invention and at least one chemotherapeutic agent. Examples of chemotherapeutic agents include, but are not limited to, taxanes such as cisplatin, ifosfamide, taxol and paclitaxol, topoisomerase I inhibitors (eg, CPT-II, topotecan, 9-AC and GG-211), Gemcitabine, vinorelbine, oxaliplatin, 5-fluorouracil (5-FU), leucovorin, vinorelbine, temodal, cytochalasin B, gramicidin D, emetin, mitomycin, etoposide, tenoposide, vincristine, vinblastine, cortisin, doxorubicin, daunorubicin, daunorubicin, daunorubicin, daunorubicin, daunorubicin, daunorubicin, daunorubicin, and daunorubicin ON, mitoxantrone, mitramycin, actinomycin D, 1-dehydrotestosterone, glucocorticoid, procaine, tetracaine, lidocaine , Propranolol, and puromycin homologues, and Cytoxan and the like.
[0241]
The invention includes the sequential or simultaneous administration of a pharmaceutical composition of the invention and an anti-cancer agent such as a chemotherapeutic agent. In certain embodiments, a pharmaceutical composition of the present invention is administered prior to administration of an anticancer agent (eg, 2 hours, 6 hours, 12 hours, 1 day, 4 days, 6 days, 12 days, 14 days, 1 month or several months). Before) administration. In another particular embodiment, the pharmaceutical composition of the invention is administered after administration of the anticancer agent (eg, 2 hours, 6 hours, 12 hours, 1 day, 4 days, 6 days, 12 days, 14 days, 1 month or Several months later). In certain embodiments, a pharmaceutical composition of the present invention is administered contemporaneously with an anticancer agent. The present invention encompasses a combination of an anticancer agent and an attenuated tumor-targeting bacterium designed to express one or more nucleic acid molecules encoding one or more effector molecules and / or fusion proteins, which is additive or synergistic. .
[0242]
The invention also encompasses a combination of an anti-cancer agent and an attenuated tumor target bacterium designed to express one or more nucleic acid molecules encoding one or more effector molecules and / or fusion proteins having different sites of action. Such combinations, whether the combination is synergistic or additive, provide improved therapies based on the dual effects of these treatments. Thus, the novel combination therapies of the present invention provide improved efficacy over any of the agents used as single agent therapies.
[0243]
In certain embodiments, an animal with a solid tumor cancer is administered a pharmaceutical composition of the invention and is treated with radiation therapy (eg, gamma or x-irradiation). In certain embodiments, the present invention provides a method of treating or preventing cancer that has been shown to be ineffective with radiation therapy. The pharmaceutical composition may be administered simultaneously with the radiation therapy. Alternatively, radiation therapy may be administered after administration of the pharmaceutical composition of the invention, preferably for at least 1 hour, 5 hours, 12 hours, 1 day, 1 week, 1 month, more preferably several months (eg, It may be administered after up to 3 months).
[0244]
The radiation therapy administered before, simultaneously with, or after administration of the pharmaceutical composition of the present invention can be administered by any method known in the art. Any radiation therapy protocol may be used depending on the type of cancer being treated. For example, but not by way of limitation, x-ray radiation may be administered, particularly high energy megavolts (irradiation above 1 MeV energy) may be used for deep tumors, and electron beam and median for skin cancer. Voltage x-ray irradiation may be used. Gamma-emitting radioisotopes, such as radioactive isotopes of radium, cobalt and other elements, may be administered to expose the tissue to radiation.
[0245]
Furthermore, the present invention also relates to the use of cancer as a replacement for radiation therapy if the radiation therapy is or is too toxic, i.e., results in unacceptable or intolerable side effects for the patient being treated. Methods for treating with the compositions are provided.
[0246]
5.9 Demonstration of therapeutic or prophylactic utility of the pharmaceutical composition of the present invention
The pharmaceutical compositions of the invention are preferably tested in vitro and then in vivo for the desired therapeutic or prophylactic activity prior to use in humans. For example, in vitro assays that can be used to determine whether administration of a particular pharmaceutical composition is indicated include growing a patient tissue sample in culture and exposing or administering the pharmaceutical composition; In vitro cell culture assays that observe the effect of such compositions on tissue samples are included.
[0247]
A pharmaceutical composition of the invention is activated by contacting immune cells with a test pharmaceutical composition or control and determining the ability of the test pharmaceutical composition to modulate (eg, increase) the biological activity of the immune cells. Can be tested for their ability to enhance immune cells. The ability of the test composition to modulate the biological activity of immune cells includes detecting the expression of cytokines or antigens, detecting proliferation of immune cells, detecting activation of signaling molecules, effector of immune cells It can be evaluated by detecting function or detecting differentiation of immune cells. Techniques known to those skilled in the art can be used for measuring these activities. For example, cell growth³It can be assayed by the H-thymidine incorporation assay and trypan blue cell counting. Cytokine and antigen expression can be, for example, but not limited to, Western blot, immunohistochemical radioimmunoassay, ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay), "sandwich" immunoassay, immunoprecipitation assay, sedimentation reaction, gel precipitation. It can be assayed by immunoassays including competition and non-competitive assay systems using techniques such as reactions, immunodiffusion assays, agglutination assays, complement fixation assays, immunoradiometric assays, fluorescent immunoassays, protein A immunoassays and FACS analysis. . Activation of a signaling molecule can be assayed, for example, by a kinase assay and an electromobility shift assay (EMSA). Effector function of T cells can be measured, for example, by a 51Cr release assay (see, eg, Palladino et al., 1987, Cancer Res, 47: 5074-5079 and Blachere et al., 1993, J. Immunotherapy 14: 352-356).
[0248]
The pharmaceutical compositions of the invention can be tested for their ability to reduce tumor formation in animals with cancer. A pharmaceutical composition of the invention can also be tested for its ability to reduce one or more symptoms associated with solid tumor cancer. In addition, the pharmaceutical compositions of the present invention can be tested for their ability to prolong the survival of patients with solid tumor cancer. The function of the pharmaceutical composition of the present invention in animals can be analyzed using techniques known to those skilled in the art.
[0249]
In various specific embodiments, in vitro assays are performed using representative cells of cell types involved in solid tumor cancer to determine whether the pharmaceutical compositions of the invention have the desired effect on such cell types. You can find out if.
[0250]
Prior to testing in humans, therapeutic pharmaceutical compositions of the invention may be used in suitable animal model systems, including, but not limited to, rats, mice, chickens, cows, monkeys, pigs, dogs, rabbits, and the like. Can be tested with Any animal model system known in the art may be used for in vivo testing prior to administration to humans.
[0251]
The following series of examples is provided by way of illustration and does not limit the scope of the invention.
[0252]
6. Example: Attenuated tumor target by Salmonella TNF- α expression
The following examples demonstrate that bacteria such as the attenuated tumor target Salmonella containing a nucleic acid molecule encoding a TNF family member can express a TNF family member.
[0253]
6.1 　 TNF- Construction of α plasmid
The plasmids described herein are illustrative of particular embodiments of the present invention. As will be apparent to those skilled in the art, nucleic acids encoding a promoter and / or effector molecule, such as a nucleic acid encoding the trc promoter and / or TNF-α, may be obtained by other methods known in the art using any other suitable promoter or effector. It may be replaced by a molecule.
[0254]
For plasmid-based bacterial expression of nucleic acid encoding effector molecules using the trc promoter, plasmid Trc99A (commercially available from Pharmacia) or TrcHisB (commercially available from In Vitrogen) was used. Both plasmids use an NcoI site as a start codon followed by a multiple cloning site.
[0255]
6.1.1. p CET Plasmid
Double λP_LOr λP_RThe pCET plasmid was constructed as follows for plasmid-based bacterial expression of nucleic acid encoding effector molecules using a promoter. Plasmid pCE33 (Elvin et al., 1990, Gene 87: 123-126) was sequentially cut with the restriction enzyme ClaI, blunt-ended with mung bean nuclease, and then cut with the restriction enzyme BamHI. The resulting 1.4 kb fragment was then ligated to a 2.1 kb SspI / BamHI fragment of pUC19 (commercially available from GIBCO) to create plasmid pCI. Plasmid pCI was cut with the restriction enzyme BamHI, blunt-ended with mung bean nuclease, and then cut with the restriction enzyme AflIII. The resulting 3.1 kb band was isolated. Plasmid TrcHisB was partially digested with restriction enzyme ClaI, blunt-ended with T4 DNA polymerase, and then cut with AflIII. Next, the resulting 0.6 kb band containing the minicistron and the terminator was ligated to the 3.1 kb pCI fragment to obtain plasmid pCET. pCET, like Trc99A or TrcHisB, uses an NcoI site as an initiation codon followed by a TrcHisB multiple cloning site. λP_LOr λP_RBacteria carrying any plasmid containing the promoter were grown at 30 ° C.
[0256]
6.1.2. 　 pTS Plasmid
A plasmid designated pTS, which performs transposon-mediated chromosomal integration and serine prototrophy selection of nucleic acid encoding effector molecules, was constructed as follows. Plasmid pNK2883 (commercially available from American Type Culture Collection (ATCC)) was cut with the restriction enzyme BamHI and the 4.8 kb band was isolated. A PCR from Salmonella typhimurium C. typhimurium, a commercial strain of Salmonella typhimurium C. typhimurium from S. typhimurium C. typhimurium on a commercial strain of Salmonella typhimuriumC. The nucleic acid was isolated. The PCR reaction mixture was cut with the restriction enzymes BglII and BamHI, and the 1.1 kb PCR product was isolated and ligated to the 4.8 pNK2883 fragment to obtain a plasmid designated pTS. Immediately 3 'to the nucleic acid encoding serC there was a cloning site for insertion of the nucleic acid encoding the effector molecule.
[0257]
6.1.3. 　 pTS-TNF- α plasmid
For pTS-mediated chromosomal integration of nucleic acid encoding human TNF-α controlled by the trc promoter, a plasmid (pTS-TNF-α) was constructed as follows. Plasmid PYA3332 is an ASD plasmid PYA272 in which the origin of replication has been replaced by the origin of replication of the colE1 plasmid (see, eg, Bazalal and Helsinki, 1970, Biochem 9: 399-406) (see, eg, the US patent of Curtiss, III) No. 5,840,483). Plasmid PYA3332 was digested with restriction enzyme NcoI and blunt-ended with mung bean nuclease. Next, the blunt-ended fragment was digested with the restriction enzyme HindIII to isolate a 3.3 kb DNA fragment. The nucleic acid encoding E. coli optimized human TNF-α shown in FIG. 1 (see Pennica et al., 1984 Nature 312: 724-729; and Salztman et al., 1996, Cancer Biotherapy 11: 145-153) is then restricted with the restriction enzyme NdeI. The DNA was cleaved, blunt-ended with T4 DNA polymerase, and then cut with the restriction enzyme HindIII. The obtained 0.5 kb fragment was ligated to a 3.3 kb PYA3332 fragment to obtain plasmid Asd34TNF-α. Next, Asd34TNF-α was digested with restriction enzyme BglII, and a 1.1 kb fragment encoding a nucleic acid encoding TNF-α controlled by a trc promoter was ligated to the BamHI site of pTS to convert plasmid pTS-TNF-α. Obtained.
[0258]
6.1.4. 　 pTS-BRP Plasmid
A plasmid designated pTS-BRP, which performs transposon-mediated chromosomal integration of nucleic acid encoding BRP and serine prototrophic selection of nucleic acid encoding effector molecules, was constructed as follows. A nucleic acid encoding BRP is isolated from plasmid pSWI (Bio101, Vista, CA) by PCR using a forward primer consisting of the sequence CCGACGCGTTGACACCTGAAACTGGAG (SEQ ID NO: 5) and a reverse primer consisting of the sequence CCGACGCGTGAAAGGATCTCAAGAAGATC (SEQ ID NO: 6). And cloned into a TOPO-TA cloning plasmid (commercially available from InVitrogen, Carlsbad, CA) to obtain a plasmid designated pBRP # 5. Plasmid pBRP # 5 was digested with restriction enzymes ApaI and BamHI, and the resulting 0.6 kb band containing the BRP-encoding nucleic acid was ligated to a 5.9 kb ApaI / BamHI proto-pTS fragment to convert plasmid pTS-BRP. Obtained. Cloning sites for insertion of the nucleic acid encoding the effector molecule were located on both sides 5 'and 3' of the nucleic acid encoding BRP.
[0259]
6.1.5. 　 pTS-BRPTNF- α plasmid
For pTS-mediated chromosomal integration of nucleic acid encoding TNF-α controlled by the BRP and trc promoters, a plasmid (pTS-BRPTNF-α) was constructed as follows. For the construction of pTS-TNF-α, the plasmid Asd34TNF-α described above is digested with the restriction enzyme BglII, and a 1.1 kb fragment encoding the nucleic acid encoding TNF-α controlled by the trc promoter is converted into pTS-TNF-α. The plasmid pTS-BRPTNF-α was obtained by binding to the BamHI site of BRP.
[0260]
6.2. Integration of the nucleic acid encoding the effector molecule into the Salmonella host chromosomeThe system described herein employs a serine or glycine auxotrophic ΔserC-Salmonella strain and a plasmid that restores serine / glycine prototrophy upon chromosomal integration into actively transcribed regions. However, it is well known in the art that other selectable markers may be used to select for chromosomal integrants, and such markers are within the scope of the present invention. See, for example, Kleckner et al., 1991, Meth. Enzymol. 204: 139-180.
[0261]
A pTS or pTS-BRP plasmid containing a nucleic acid encoding an effector molecule may be introduced into the serC-Salmonella strain by several means well known in the art, including chemical transformation and electroporation. . After introduction of the nucleic acid encoding the effector molecule, the Salmonella is grown in a growth medium containing ampicillin for a minimum of 2 hours, more preferably 6 hours. Then, a medium capable of selecting serine prototrophic bacteria, for example, M56 medium, Atlas, R.A. M. "Handbook of Microbiological Media" C. Parks, Ed., CRC Press, Boca Raton, Florida, 1993. Bacteria with chromosomal integration of nucleic acid encoding effector molecules can grow on selective media. The expression of the nucleic acid encoding the effector molecule is then measured as shown below. Expression of a nucleic acid encoding an effector molecule may be measured by any of several methods known to those of skill in the art, such as enzymatic activity, biological activity, Northern blot analysis, or Western blot analysis.
[0262]
6.2.1. Expressed by Salmonella TNF- Delivery and expression of α
As described above, a nucleic acid encoding TNF-α controlled by the trc promoter was inserted into the BamHI site of pTS-BRP to obtain a plasmid designated as pTS-BRPTNF-α. Plasmid pTS-BRPTNF-α was constructed by standard methods known in the art as a serC- such that the genetic traits are ΔmsbB, ΔpurI, ΔserC (FIG. 2), an attenuated strain of Salmonella typhimurium, strain VNP20009. (See International Patent WO99 / 13053). Although not limited by mechanism, integration of the plasmid into the bacterial genome allows activation of the nucleic acid encoding serC,⁺Brings the phenotype. Therefore, bacteria having the chromosomal integration of the nucleic acid encoding TNF-α were selected by plating the electroporated bacteria on an M56 agar plate supplemented with adenine. Bacteria were further characterized for loss of plasmid and loss of ampicillin resistance indicating concomitant loss of plasmid-based TNF-α expression.
[0263]
To examine and quantify the expression of TNF-α by the tumor-targeting bacteria of the present invention, Salmonella harboring the chromosomal integration of nucleic acid encoding TNF-α was grown overnight and the measured sample of the culture was subjected to Western blotting. Used for blot analysis. In particular, a representative serC designated pTS-BRPTNF-α clone 2⁺The expression of TNF-α from ampicillin-sensitive clones is shown in FIG. By Western blot analysis, 3.9 × 10⁷It was shown that the bacterial protein corresponding to the cfu pTS-BRPTNF-α clone 2 bacterium (lane 1) expresses more than 50 ng of TNF-α (lane 5), which is 10 ng / 10⁷Suggests expression of TNF-α at a higher level than bacteria. Therefore, human TNF-α was successfully expressed in Salmonella from a chromosomally integrated nucleic acid encoding TNF-α controlled by the trc promoter.
[0264]
7. 　 OMPA Attenuated tumor targeting bacteria expressing fusion proteins
Periplasmic localization of proteins by fusion to various signal peptides depends on both signal peptides and proteins. For example, the protein can be localized to the bacterial periplasmic compartment by fusion of a signal peptide to the amino terminus of the protein. Without limitation, periplasmic localization facilitates release of bacterial components (such as proteins) because they only need to pass through a single membrane to be released into the surrounding environment It is believed that. In contrast, intracytoplasmic localization requires that components pass through both the inner and outer membrane of bacteria in order to be released into the surrounding environment. In addition, periplasmic localization of certain proteins may aid biological activity.
[0265]
Various methods known in the art can be used to direct the effector molecules of the invention to the periplasm. This example demonstrates that fusion of the ompA signal peptide to the amino terminus of effector molecules such as TNF-α, TRAIL (TNF-α-related apoptosis-inducing ligand), and interleukin-2 (IL-2) results in periplasmic localization. And subsequent processing of the protein.
[0266]
7.1. 　 OMPA-TNF- Processing of alpha fusion protein
TNF-α expression in four different clones, ie, the expression of the ompA-TNF-α fusion protein driven by a plasmid-based trc promoter in JM109 bacteria, was examined by Western blot analysis of whole cell lysates. Cleavage of the precursor fusion protein to mature TNF-α by signal peptidase, an enzyme located in the periplasm, demonstrated periplasmic localization. In all four clones, overexpression of TNF-α after induction with IPTG caused TNF-α to become a doublet migrating at approximately 20 kd, corresponding to both unprocessed and processed forms. (Figure 5, lanes 4-7). For comparison, a Salmonella strain expressing the mature (processed) form of TNF-α with the nucleic acid encoding TNF-α integrated into the chromosome was used as a positive control (FIG. 5, lane 3). No TNF-α expression was detected in bacteria lacking the nucleic acid encoding TNF-α (FIG. 5, lane 2).
[0267]
These results demonstrate that fusion of the mature human TNF-α protein to the E. coli ompA signal peptide (as shown in FIG. 4) results in periplasmic localization and processing when expressed in E. coli. Furthermore, it was not known whether overexpression of secreted proteins would be toxic to bacterial hosts due to the predominance of normal secretory tissues. This evidence for expression of the processed ompA-TNF-α fusion protein suggested that normal secretory tissues could accommodate high level expression of secreted proteins.
[0268]
7.2. 　 OMPA − TRAIL Processing of fusion proteins
The ability of the ompA signal peptide to localize members of the TNF family to the periplasm has been extended to another member of the TNF family, TRAIL, a TNF-α-related apoptosis-inducing ligand. For these experiments, a nucleic acid encoding TRAIL, driven by the trc promoter, encoding the mature form of human TRAIL (hTRAIL), was fused to the coding sequence of the ompA signal peptide (as shown in FIG. 6). One encoded an NcoI site and the other examined two different ompA / TRAIL junctions encoding an NdeI site (see FIG. 6 for sequences containing NdeI). Western analysis of both clones is shown in FIG. Bacteria overexpressing NcoI-conjugated ompA-TRAIL by Western blot analysis using an anti-hTRAIL antibody expressed both the processed (28.2 kd) and unprocessed (30.2 kd) forms of hTRAIL (FIG. 7, lanes 2-4), whereas NdeI conjugated ompA-TRAIL overexpressing bacteria are shown to express exclusively the processed form (FIG. 7, lanes 4-7), indicating that NdeI conjugation. Has resulted in more efficient processing.
[0269]
These results demonstrated that fusion of the mature human TRAIL protein to the E. coli ompA signal peptide resulted in periplasmic localization and processing. Furthermore, it was not known whether overexpression of secreted proteins was toxic to bacterial hosts due to the predominance of normal secretory tissues. This evidence for expression of the processed ompA-TRAIL fusion protein suggested that normal secretory tissues could accommodate high level expression of secreted proteins.
[0270]
7.3. 　 OMPA (8L) -IL-2 Processing of fusion proteins
The secondary effector molecule (IL-2) was expressed as a fusion protein. Fusion of mature (C125A) hIL-2 to the wild-type OmpA signal sequence, as used above for TNF-α and TRAIL, did not allow IL-2 processing. To examine the periplasmic localization and processing of human IL-2 cytokine, mature human (C125A) IL-2 was fused to a modified ompA signal peptide designated ompA (8L), as shown in FIG. The modified ompA signal peptide was modified by replacing amino acids 6-17 of the ompA signal with those shown in FIG. Expression and processing are shown in FIG. 9 (lanes 6 and 7). Each lane represents a single clone. Western blot analysis showed that virtually complete processing was observed using the ompA (8L) signal peptide (Figure 9, lanes 6 and 7).
[0271]
7.4. 　 PHOA (8L) -IL-2 Processing of fusion proteins
The second fusion protein was examined for periplasmic localization and processing of human IL-2 and 7.3. Compared to the nodal fusion protein. In FIG. 10, the expression and processing of mature human (C125A) IL-2 fused to a modified phoA signal peptide designated phoA (8L) was examined. Expression and processing are shown in FIG. More complete processing was observed with the ompA (8L) signal peptide (FIG. 9, lanes 6 and 7), whereas only partial processing was observed with the synthetic phoA (8L) signal peptide (FIG. 9). , Lanes 4 and 5).
[0272]
These results indicate that the localization and processing of IL-2 was provided by different signal peptides. This result also demonstrates that periplasmic localization of the protein by fusion to various signal peptides is dependent on both the signal peptide and the protein.
[0273]
The results of fusion protein studies indicate that secondary effector proteins of the invention, such as Il-2, can be expressed by fusion with a protein signal peptide, such as OmpA or PhoA, and can be localized in the periplasm of bacteria. As will be apparent to one of skill in the art, other signal sequences can be used to cause periplasmic localization of effector molecules that can be utilized. As will be further apparent to those skilled in the art, other effector molecules of the invention can be substituted for the effector molecules described in the Examples herein.
[0274]
8. Example: Mature type TNF- Salmonella expressing α ( Δ MSBB , Δ PURI) Antitumor effect of
The following experiments demonstrate that attenuated tumor target bacteria, such as Salmonella, containing nucleic acids encoding primary effector molecules (eg, members of the TNF family) can deliver primary effectors to mammalian tumors and reduce tumor volume. Prove.
[0275]
The ability of TNF-α to increase the antitumor effect of Salmonella typhimurium was evaluated in a graded murine colon 38 carcinoma model. In these experiments, 1 mm from a colon 38 tumor was used.³Were implanted into C57BL / 6 mouse tumors and tumors were allowed to grow to an average size of about 0.3 g, at which time animals were randomly placed in the following treatment groups (n = 10): 1) untreated 2) Salmonella typhimurium (ΔmsbB, ΔpurI, serC) (parent strain); and 3) pTS-BRPTNF-α (large intestine 2 as described above). Mice in each group are either untreated or have an appropriate bacterial strain of 1 × 10⁶One intravenous injection of cfu was given. Starting at the time of bacterial inoculation, tumor size was measured weekly.
[0276]
In the group receiving the attenuated tumor target Salmonella expressing TNF-α, tumor regression was evident 2 weeks after treatment, and complete regression was seen in 6 of the animals within 4 weeks after treatment ( (FIG. 11). Tumors gradually grew in the untreated group, whereas tumors in the group treated with the Salmonella typhimurium parent strains (ΔmsbB, ΔpurI, serC) showed partial regression between 3 and 4 weeks after treatment, but gradually thereafter. It became larger (FIG. 11).
[0277]
These results demonstrate that the attenuated tumor target Salmonella can express and deliver effector molecules, such as members of the TNF family, to tumors. Such Salmonellas are useful for treating tumors and enhance the outcome of tumor regression compared to a Salmonella parent strain that does not express a member of the TNF family.
[0278]
Salmonella expressing TNF-α from a chromosomally integrated nucleic acid shows complete tumor regression, indicating that biologically effective expression results because it encodes a chromosomally integrated effector molecule. .
[0279]
9. Example: BRP Of nucleic acid molecule delivery by bacteria that express DNA
To show that BRP activity enhances the release of plasmids from attenuated tumor target bacteria such as Salmonella, attenuated tumors containing BRP in the plasmid as well as a second plasmid used as a release marker (pTrc99a with an AMP marker) A target Salmonella strain was constructed. To evaluate BRP activity, Salmonella with or without BRP were grown in culture by standard methods. Next, the remaining bacteria were removed from the resulting supernatant by centrifugation and filtration, and the clear supernatant was added to the competent cells to perform a transformation reaction. Next, these recipient cells were plated on an LB amp medium, and the uptake of the AMP marker plasmid was examined. An increase in the number of AMP-resistant colonies having BRP indicates that more plasmid was released from the BRP-expressing strain into the medium.
[0280]
The results are summarized in Table 2 below.
[0281]
[Table 2]

[0282]
These results indicate that the presence of BRP increased the amount of amp plasmid secreted into the medium. As described above, the number of colonies increases in the transformation of the supernatant derived from BRP-expressing cells into “recipient cells”. These results indicate that BRP enhanced the release of secondary effector molecules, including nucleic acid plasmids. Thus, these results indicate that BRP is useful for plasmid release or DNA delivery. In addition, these Salmonella strains capable of expressing BRP and delivering DNA remained replication competent as a population.
[0283]
10. Example: BRP Expression does not impair the tumor-targeting or tumor-inhibitory potential of the attenuated tumor target Salmonella
The following examples demonstrate that attenuated tumor-targeting bacteria can be engineered to express BRP with one or more effector molecules to enhance the delivery of effector molecules to the tumor without inhibiting the tumor-targeting ability of the bacteria. Show.
[0284]
The solid tumor model was obtained by subcutaneous injection of B16 melanoma cells into the right hind leg thigh of C57BL / 6 mice. For tumor implantation, cells were dissociated from the flask by trypsinization, washed, and 2.5 × 10 5 in phosphate buffered saline.⁶Suspended at cells / ml. 0.2 ml aliquot of cell suspension (total 5 × 10⁵Cells / mouse) were injected on day 0. Tumor volume of 150-200mm³(At about 10 days after transplantation), the mice were randomly divided into groups of 10 individuals and different treatments were applied to each group. The control group (curve # 1 in FIG. 12) received 0.2 ml of PBS. Another group includes 2 x 10 attenuated tumor target strains of Salmonella VNP20009.⁶c. f. u. / Mouse containing 0.2 ml (curve # 2 in FIG. 12). The third group includes an attenuated tumor target Salmonella strain 2 × 10 containing pSW1, a plasmid containing the BRP gene under the control of its native promoter.⁶c. f. u. / Mouse containing 0.2 ml (curve # 3 in FIG. 12). The BRP gene is SOS-inducible in E. coli. However, we have not identified the mechanism, but the BRP gene is partially constitutive in Salmonella and produces low to moderate levels of BRP protein, but its production is due to the nature of SOS in the tumor environment. I believe it will be even stronger. Mice injected with BRP-expressing VNP20009 Salmonella showed almost the same anti-tumor response as those injected with non-BRP-expressing VNP20009, indicating that the survival or tumor targeting ability of these Salmonella was not altered by BRP expression. This shows that the ability to inhibit tumor growth does not change. The result of BRP expression in the attenuated tumor target Salmonella is in contrast to the effect of secreted HSV thymidine kinase (HSV-TK) expression. HSV-TK expression results in a loss of the tumor-inhibiting potential of VNP20009 (Pawelek et al., 1997, Cancer Res. 57: 4537-4544). Thus, the BRP system can be used to enhance the delivery of primary and / or secondary effector molecules to tumors without further modification.
[0285]
11. Example: pepT Promoter expression carrier
This example demonstrates the in vitro and in vivo expression of a reporter-encoding nucleic acid molecule such as β-gal under the control of the pepT promoter in an attenuated tumor target bacterium such as Salmonella.
[0286]
11.1 Example: pepT-BRP- β GAL Construction of expression plasmid
The pepT promoter has the following primers:
Forward: 5'-AGT CTA GAC AAT CAG GCG AAG AAC GG-3 '(SEQ ID NO: 15)
Reverse: 5'-AGC CAT GGA GTC ACC CTC ACT TTT C-3 '(SEQ ID NO: 16)
Was cloned by PCR amplification of a region derived from a colony of the isolated wild-type Salmonella typhimurium (ATCC14028).
[0287]
The PCR conditions were 1 cycle at 95 ° C. for 5 minutes, 1 cycle at 95 ° C., 1 cycle at 65 ° C., 35 cycles at 2 minutes at 72 ° C., and 1 cycle at 72 ° C. for 10 minutes. Was. This PCR product was cloned into a PCR2.1 cloning vector (Invitrogen, Carlsbad, California) and named PepT / PCR2.1.
[0288]
This PepT / PCR2.1 vector was cut with NcoI and XbaI. The PepT fragment was isolated on a gel and ligated into a β-gal Zterm vector cut with the same enzymes. Zterm (Temporary Genbank Bankit No. 296495) is a promoterless β-gal plasmid created by cloning the βGal open reading frame into pUC19. The resulting plasmid was named pepT-βGAL.
[0289]
11.2 　 pepT- β GAL of in in vitro Expression and pepT- β GAL Activity measurement
Salmonella strain YS1456 carrying pepT-βGAL (CC14 in FIG. 13A; see WO96 / 40238 for the genetic makeup of this strain) or VNP20009 (CC16 in FIG. 13A) under either anaerobic or aerobic conditions.₆₀₀Grew to ~ 0.5 to 0.8. β-gal activity was measured by the method of Birge and Low (1974, J. Mol. Biol. 83: 447-457). The results, shown in FIG. 13A, show that β-gal activity was induced approximately 14 to 24 fold during bacterial growth under anaerobic conditions.
[0290]
11.3 　 pepT- β GAL of in Vivo Expression and pepT- β GAL Activity measurement
pepT-βgal expression plasmid, BRP expression plasmid (pSW1 from BIO101 (Vista, California), which contains the pCloDF13 BRP coding sequence under the control of its natural promoter), or cells of Salmonella strain YS1456 carrying both expression plasmids Was injected intravenously into tumor-bearing mice. Five days after injection, tumors and liver were homogenized and bacteria were isolated to show that the presence of pepT-βgal and / or BRP plasmids did not inhibit the tumor targeting ability of these bacteria. Furthermore, β-gal activity was measured using tumor and liver homogenates to determine whether active β-gal could be measured in vivo and whether the pepT promoter was induced in an anaerobic tumor environment. The results are shown in FIG. 13B and show very high levels of pepT promoter activity in the tumor environment. There was no significant enhancement in liver β-gal expression relative to background levels, due to the low activity of the pepT promoter in the aerobic liver environment and / or the poor ability of bacterial vectors to target the liver. It seems to be attributable.
[0291]
12. Example: Tetracycline-induced expression system
This example shows the expression of a nucleic acid molecule encoding a reporter gene such as β-gal under the control of the tet promoter of an attenuated tumor target bacterium such as Salmonella.
[0292]
The tet promoter has the following primers:
Forward: 5'-GGA TCC TTA AGA CCC ACT TTC ACA TTT AAG-3 '(SEQ ID NO: 17)
Reverse: 5'-GGT TCC ATG GTT CAC TTT TCT CTA TCA C-3 '(SEQ ID NO: 18)
Was cloned from the mini-TN10 transposon by PCR amplification.
[0293]
The PCR conditions were as follows: 1 cycle at 95 ° C for 5 minutes, 1 cycle at 95 ° C, 1 minute at 60 ° C, 35 cycles of 2 minutes at 72 ° C, and 10 cycles at 72 ° C. One minute cycle.
[0294]
A ~ 400 bp PCR fragment was gel isolated and cloned into a PCR2.1 vector (Invitrogen). The PCR2.1 / tet promoter vector was cut with NcoI and BamHI. The ~ 400 bp tet promoter fragment was gel isolated and ligated into the promoterless β-gal vector Zterm cut with the same two enzymes. The ligation mixture was transformed and the transformed bacteria were plated on tetracycline / X-gal plates. Positive colonies were isolated based on blue color. Extracts from several positive colonies were made and assayed for β-gal activity in the presence of tetracycline by the method of Birge and Low (1974, J. Mol. Biol. 83: 447-457). One clone was isolated and assayed for β-gal expression over a range of tetracycline concentrations. The results of the assay show that tetracycline induces β-gal activity in a dose-dependent manner and is shown in FIG.
[0295]
13. Example: Inhibition of tumor growth by attenuated tumor target Salmonella expressing endostatin
The following examples demonstrate the production of an attenuated tumor target Salmonella expressing endostatin and the effect of treating tumors with such Salmonella in vivo.
[0296]
13.1 Construction of endostatin expression plasmid
Endostatin has the following primers:
Forward: 5'-GTG TCC ATG GGG CAC AGC CAC CGC GAC TTC CAG-3 '(SEQ ID NO: 19)
Reverse: 5'-ACA CGA GCT CCT ACT TGG AGG CAG TCA TGA AGC T-3 '(SEQ ID NO: 20)
Was used to perform PCR amplification from a human placenta cDNA library.
[0297]
The obtained PCR product was cloned into a PCR2.1 vector (Invitrogen). Hexahistidine-endostatin has the following primers:
Forward: 5'-GTG TCC ATG GCT CGG CGG GCA AGT GTC GGG ACT GAC CAT CAT CAT CAT CAT CAT CAC AGC CAC CGC GAC TTC-3 '(SEQ ID NO: 21)
Reverse: 5'-GTG CGG ATC CCT ACT TGG AGG CAG TCA TGA AGC TG-3 '(SEQ ID NO: 22)
At the same time, PCR amplification was performed using the plasmid constructed above as a template.
[0298]
The PCR amplification conditions were 1 cycle at 95 ° C for 5 minutes, 1 cycle at 95 ° C, 1 cycle at 55 ° C, 30 cycles at 2 minutes at 72 ° C, and 1 cycle at 72 ° C for 10 minutes. there were.
[0299]
The resulting product was a DNA fragment with NcoI (5 ') and BamHI (3') restriction sites encoding human endostatin having the peptide sequence MARRASVGTDHHHHHH (SEQ ID NO: 23) at its amino terminus.
[0300]
The PCR product was cut with NcoI and BamHI, and the 550 bp product was gel isolated and ligated into the pTrc99A vector that had been previously cut with the same enzymes. The ligation product was transformed into E. coli DH5α and the attenuated tumor target Salmonella strain VNP20009.
[0301]
The hexahistidine-endostatin coding sequence was also cloned into the expression vector YA3334 as an NcoI / BamHI fragment. YA3334 is an asd plasmid PYA272 (Curtiss III, U.S. Pat. No. 5,840,483) having an origin of replication replaced by the ColEI origin of replication (Bazaral and Helsinki, 1970, Biochem 9: 399-406). Plasmid DNA prepared from the positive clone was isolated and transformed into Salmonella strain 8324, which is VNP20009 with asd mutation. This strain was prepared according to the method described in Curtiss III (US Pat. No. 5,840,483).
[0302]
13.2 Endostatin by Salmonella attenuated tumor target in in vitro Expression
Various Salmonella strains VNP20009 and Escherichia coli DH5α containing the pTrc99A-hexahistidine-endostatin plasmid were subjected to mid-logarithmic growth (OD.₆₀₀Were grown to ０．６0.6-0.8), at which point each culture was split, one receiving 0.1 mM IPTG for induction of trc promoter activity and the other receiving no IPTG. Was. After further growing for 3 hours, bacterial extracts were prepared and the expression of hexahistidine-endostatin was confirmed by Western blot analysis using an anti-histidine antibody (Clontech, Palo Alto, California). FIGS. 15A and 15B show the results of Western blots showing the expression of pTrc99A-hexahistidine-endostatin (HexHIS-endostatin) in E. coli DH5α and Salmonella VNP20009, respectively. The trc promoter was not active in E. coli in the absence of IPTG, but the same promoter was structurally active in Salmonella. Hexahistidine-endostatin appears in a single band at approximately 25 kD, which is the estimated molecular weight of the fusion protein.
[0303]
The hexahistidine-endostatin fusion protein was also expressed from the YA3334 plasmid, which utilizes the trc promoter to control expression. As shown in FIG. 16, a protein having an estimated molecular weight of 25 kDa was detected using an anti-histidine antibody. In FIG. 16, all bacterial cultures from which the samples were derived were induced with 0.1 mM IPTG for 3 hours.
[0304]
13.3 　 C38 Effect of Salmonella attenuated tumor target expressing endostatin on murine colon cancer
2 × 2 × 2mm³Volume of the large intestine 38 tumor fragment was implanted subcutaneously in 9-week-old female C57BL / 6 mice. Tumor volume is 1000mm³When they reach 2x2x2mm³Cut into fragments. These fragments were subjected to another series of cycles and the resulting 2 × 2 × 2 mm³Was subcutaneously implanted into the right thigh of female C57BL / 6 mice. Tumor volume 150-200mm³(Approximately 24 days after transplantation), the mice were randomly divided into 6 groups of 10 individuals, and different treatments were applied to each group. One control group received 0.2 ml of PBS. Another control group contained 1 × 10 5 attenuated tumor target Salmonella strain VNP200009 having a control asd plasmid (ie, no asd plasmid inserted as described in 5.6 above).⁶c. f. u. 0.2 ml. The first experimental group contained 1 × 10 VNP200009 expressing the hexahistidine-endostatin fusion protein in the asd plasmid.⁶c. f. u. 0.2 ml. The second experimental group received the same expression construct as the first group and VNP 200009 with BRP to be further expressed.
[0305]
FIG. 17 shows the results of these experiments, and shows the effect of the VNP20009 strain expressing hexahistidine-endostatin on tumor suppression. At 60 days post-treatment, the median tumor size of VNP20009 Salmonella expressing endostatin is about 13% of the median tumor size of control animals, and the median tumor size of animals treated with VNP20009 Salmonella carrying the empty vector. It was 30% lower than the value. Many of the surviving animals showed little change in tumor growth as indicated by small changes in net tumor size, and some showed strong tumor suppression. Insufficient treatment penetration or effect is most likely reflected by an inadequate endostatin delivery system. This is consistent with O'Reilly et al. (1997, Cell 88: 277-285) finding that endostatin accumulates in inclusion bodies. The endostatin delivery system is enhanced by the expression of BRP. The expression of BRP is controlled by its native promoter, but usually shows an SOS response in bacteria. BRP expression was shown to reduce the mean tumor volume to about 6% of the mean tumor volume of the control population. Furthermore, in the mouse population treated with hexahistidine-endostatin and BRP, several mice showed a significant decrease in tumor volume over time, with the tumor volume regressing to about 10 or less of the original tumor volume. The effects of BRP are considered to be dual, one is that BRP itself has antitumor activity, and the other is that BRP releases some of the peripheral cytoplasmic content and some of the cytoplasmic content including endostatin. Promotes, which prevents protein accumulation in the inclusion bodies.
[0306]
13.4 　 DLD Effect of Salmonella attenuated tumor target expressing endostatin on human colon cancer
DLD1 cell cultures grown to log phase are trypsinized, washed with PBS, and 5 × 10 5 in PBS.⁷The cells / ml suspension was reconstituted. 5 × 10 each⁶An aliquot of 0.1 ml of a single cell suspension containing cells was injected subcutaneously into the right thigh of 9-week-old female nude mice (Nu / Nu-CD1 from Charles River). After randomly dividing the mice into 3 groups of 10 individuals each, 10 to 15 days after injection, or a tumor volume of 200 to 400 mm³Synchronized until reaching.
[0307]
The first group of mice was the control group and each received a 0.3 ml PBS injection. A second group of mice received the attenuated tumor target Salmonella VNP2 carrying the control asd plasmid 0009 1 × 10⁶c. f. u. 0.3 ml. A third group of mice received 1 × 10 5 attenuated tumor target Salmonella VNP 200009 carrying the hexahistidine-endostatin fusion protein and the asd plasmid expressing BRP.⁶c. f. u. 0.3 ml. Tumors were monitored and measured twice a week. FIG. 13 is a graph showing the tumor volume after administration of the three treatments, and shows the inhibitory effect of attenuated tumor target Salmonella expressing hexahistidine-endostatin on the growth of DLD1 human colorectal cancer.
[0308]
VNP20009 carrying the empty vector PYA3332 failed to significantly inhibit tumor growth. However, VNP20009 expressing endostatin and BRP was able to inhibit tumor growth. These results indicate that the combination of endostatin and BRP enhances the antitumor effect of any of VNP20009 (strain 8324) carrying the PYA3332 vector.
[0309]
14． Example: Expression of anti-angiogenic factors by attenuated tumor target Salmonella
The following examples show the methodology used to engineer attenuated tumor target bacteria, such as Salmonella, to express the anti-angiogenic factors thrombospondin AHR, platelet factor 4, and apomigren.
[0310]
14.1 Thrombospondin AHR Of a plasmid containing a nucleic acid sequence encoding
The peptide sequence TiP13.40 corresponding to the anti-angiogenic homology region (AHR) of thrombospondin: AYRWRLSHRPKTGFIRVVMYEG (SEQ ID NO: 24) (see, for example, Patent Application No. C07K-14 / 78) is reverse-operated to express Salmonella expression. Codon optimization was performed for the DNA sequence:
GCG TAC CGC TGG CGC CTG TCC CAT CGC CCG AAA ACC GGGC TTT ATC CGC GTG GTG ATG TAC GAA GGC (SEQ ID NO: 25) was obtained. To synthesize this peptide, complementary oligonucleotides (oligo 13: 40-1 and oligo 13: 40-2) were prepared. At the 5 'end, a sequence encoding the processing region of OMPA and a SpeI restriction site were added. At the 3 'end, a stop codon was added along with a BamHI restriction site. The two oligos were annealed to produce a double-stranded DNA fragment. This DNA fragment was digested with SpeI / BamHI and ligated to the SpeI / BamHI digested vector pTrc801IL2 to prepare a plasmid pTrc801-13.40 containing a full-length modified OmpA leader sequence. When processed, this sequence becomes the full-length 13.40 thrombospondin peptide.
[0311]

(Restriction sites are shown in italics, OmpA processing recognition sites are underlined)
[0312]
14.2 Platelets 4 Factor peptide (47-70) Of a plasmid containing a nucleic acid sequence encoding
A peptide consisting of the C-terminal amino acid residues 47-70 of platelet factor 4 (PF-4; see, for example, Maione et al., 1990, Science 247: 77-79 and Jouan et al., 1999, Blood 94: 984-993), Codon optimization was performed for expression in Salmonella. This peptide, shown below, contains a DLQ motif involved in inhibiting the activity of PF-4 on CFU-GM progenitors and a basic amino acid cluster that is the main heparin binding domain.
[0313]

Signal peptide = underlined / bold
Lys61, 62, 65, 66 = main heparin binding domain (bold)
DLQ (7-9, 54-56) = inhibitory activity on CFU-GM progenitor cells (bold)
[0314]
To synthesize this peptide, complementary oligonucleotides (oligo PF4-1 and oligo PF4-2) were prepared. At the 5 'end, sequences encoding the processing regions of the OmpA and SpeI restriction sites were added. At the 3 'end, a stop codon was added along with a BamHI restriction site. The two oligos were annealed to produce a double-stranded DNA fragment. After restriction digestion, this fragment was ligated to vector pTrc801 restricted with SpeI / BamHI to prepare plasmid pTrc801-PF4. When processed, this sequence becomes the full length PF-4 (47-70) peptide.
[0315]

(Restriction sites are shown in italics, OmpA processing recognition sites are underlined)
[0316]
14.3 Construction of plasmid containing nucleic acid sequence encoding Apomigren
Anti-angiogenic peptide Apomiglen
(For example, IYSFDGRDIMTDPSWPQKVIWHGSSPHGVRLVDNYCEAWRTADTAVTGLASPLSTGKILDQKAYSCANRLIVLCIENSFMMTDARK (SEQ ID NO: 31); see, for example, International Publication WO99 / 29856, a proteolytic fragment of collagen XV, corresponding to the proteolytic end of collagen XV). Oligonucleotides (oligo Apom5F and oligo Apom6F) were designed to amplify DNA fragments derived from human cDNA. At the 5 'end, a sequence encoding the processing region of OmpA and a SpeI restriction site were added. At the 3 'end, a stop codon was added along with a BamHI restriction site.
[0317]

(Restriction sites are shown in italics, OmpA processing recognition sites are underlined)
[0318]
Correct size fragments were obtained by PCR using placental cDNA as a template. The PCR product was digested with SpeI / BamHI and ligated to a vector pTrc801 restricted with SpeI / BamHI containing a modified ompA signal sequence to prepare plasmid pTrc801-Apom. When processed, this sequence becomes an apomigren peptide.
[0319]
14.4 Anti-angiogenic peptides produced by Salmonella that inhibit endothelial cell proliferation
The pTrcOmpA-endostatin, pTrc801-PF4 and pTrc801-13.40 plasmids were electroporated into an attenuated tumor target Salmonella VNP20009 strain. Salmonella strains expressing pTrcOmpA-endostatin, pTrc801-PF4 and pTrc801-13.40 were obtained from Feldman et al., 2000, Cancer Res. 60: 1503-1506 and Blezinger et al., 1999, Nature Biotech. 17: 343-348. Screened for antiproliferative activity. A 5 ml culture of each colony was grown for 4 hours. The cell pellet was resuspended in 1/20 volume of HUVEC medium containing 100 mg / ml gentamicin and a cell lysate was prepared by three consecutive freeze / thaw cycles. The lysate was clarified by centrifugation, and the bacteria were removed by filtration using a 0.2 mm syringe filter. 25 or 50 ml of this lysate was added to human venous endothelial cells (HUVEC) in a 96-well plate containing 100 ml basal medium 2% FCS and 10 ng / ml FGF. Salmonella containing an empty pTrc vector was used as a control. Plates were incubated for 72 hours and proliferation was measured by the MST assay (Mosman et al., 1983, J. Immunol. Methods 65: 55-63).
[0320]
The preliminary results obtained in FIGS. 19 and 20 indicate that platelet factor 4 peptide (PF4-2), thrombospondin peptide 13.40 (13.40-3) and endostatin produced by Salmonella were 40-60. % Of antiproliferative activity.
[0321]
15. Example: Expression of Bacteriocin Family Members by Attenuated Tumor Target Salmonella
This example demonstrates that an attenuated tumor target bacterium, such as Salmonella, can express a bacteriocin family member, including a nucleic acid encoding a bacteriocin family member.
[0322]
15.1 　 COLE3 Plasmid construction
The plasmids described herein are illustrative of particular embodiments of the present invention. As will be apparent to those skilled in the art, nucleic acids encoding a promoter and / or effector molecule, such as a nucleic acid encoding a trc promoter and / or bacteriocin, can be prepared by other methods known to those skilled in the art. May be replaced by
[0323]
15.1.1. 　 pE3. shuttle -1 ( shuttle-1 ) Intermediate vector plasmid
pE3. Shuttle-1 represents an intermediate vector used to create a cassette containing multiple cloning sites and a lacZ fragment for cloning / selection into plasmid vector ColE3-CA38 (SEQ ID NO: 34). To facilitate cloning of BRP into E3, BRP was first cloned on an intermediate shuttle vector (FIG. 21). This vector contains a lacZ fragment that can be used to select clones for lactose in bacterial strains with the mutation (s) in chromosome lacZ. The BRP fragment was then cloned into the E3 plasmid SmaI site (FIG. 22) as a cassette containing the lacZα complementary fragment. The lacZ fragment allows for the selection of the insert at this step (ie, Lac +). The naturally occurring E3 plasmid does not have an antibiotic selectable marker (FIG. 23), but the selection for the presence of the plasmid is determined by the halo assay (Pugsley, AP and Oudega, B., "Colicin" And Methods for Studying Their Plasmids (Methods for Studying Colicins and Their Plasmids) "," Plasmids, a Practical Approach "1987, KG Hardy, eds. Is possible. This shuttle vector should facilitate not only the cloning of BRP onto the E3 plasmid, but also any DNA that can be combined with E3 or E3 / BRP. The new E3 / BRP plasmid was then transformed into 41.2.9 and tested for activity. Preliminary halo forming assays demonstrated that the presence of BRP on the plasmid did not interfere with the ability of this strain to produce E3. To determine whether 41.2.9 E3 / BRP increased activity beyond 41.2.9 E3, the amount of lethal units of E3 produced by each strain was measured (FIG. 24). 41.2.9 E3 / BRP produces 100% more lethal units than 41.2.9 E3 alone, which indicates that this strain has increased activity over 41.2.9 E3 alone. Proven.
[0324]
15.1.2. 　 E3 Halo "puncture" assay for activity ( halo "Stab" assay )
Susceptibility test strain (SK522)₆₀₀Proliferate to 0.8. Add 100 μl of test strain to 3 ml of warm (about 55 ° C.) LB soft agar (for a 100 × 15 mm dish) and quickly pour onto LB agar plate. The plate is gently shaken to spread evenly over the plate and the agar is allowed to solidify for 10-15 minutes. Colonies of E. coli or Salmonella for which an E3 activity assay is desired are isolated with a sterile toothpick and "stabbed" in agar. The agar plate is then incubated upside down at 37 ° C. overnight. The next day, a halo or a clearing zone appears around the E3 puncture as secreted colicin E3 kills the susceptible strain. Colonies can be further induced to increase E3 production or secretion by treatment with any of a variety of SOS inducing reagents such as alkylating agents (eg, mitomycin), ultraviolet light or X-rays.
[0325]
The results of one halo assay are shown in FIG. When a bacterial strain secretes colicin in the presence of a sensitive strain grown on a bacterial nest on a petri dish, the secreted colicin diffuses out and is contained in the bacterial nest. Kill the bacterial cells and lyse them to create a clear area or halo. The size of the halo corresponds to the amount of colicin secreted. The results shown in FIG. 25 indicate a large number of strains. No halo is observed around the strain that does not contain the colE3-CA38 plasmid. In the absence of induction, colicin is produced by Salmonella strains. There is also evidence that all types of inducers (ie, alkylating agents, ultraviolet light, X-rays) increase the size of all halos in a dose-dependent manner.
[0326]
15.1.3. Selective E3 Clone overlay assay
Transformants are plated on LB at various dilutions (up to 1: 10,000) and grown at 37 ° C. for 2 hours. The susceptibility test strain is then prepared in a halo assay as described above and the overlay is poured with soft agar. After setting for 10 minutes, the plate is then inverted and incubated at 37 ° C. overnight. The next day, a small clear area (similar to bacteriophage plaque) appears, with a small colony (or colony group) in the center of the clear area.
[0327]
15.1.4. "Plaque" or halo purification assays
Next, a small colony in the center of the clear area of the overlay agar is isolated using a sterile Pasteur pipette. If there are no visible colonies or if there are multiple colonies in one halo, the entire halo is blotted with a sterile Pasteur pipette. Transfer colonies or halos into 500 μl LB. Make dilutions (up to 1: 10,000), put back on LB agar and grow at 37 ° C. for 2 hours. The overlay is then poured onto the susceptibility test strain described above. The next day, all or most of the colony population should have halos around them.
[0328]
16. Example: E3 of in Vivo Injection and the percentage of plasmid retention in Salmonella Measurement
The following example demonstrates the retention of the colE3-CA38 plasmid in Salmonella in vivo.
[0329]
Tumor and liver homogenates from two mice 30 days after either injection of 41.2.9 (or 41.2.9E3-CA38) were used in this study. In the following description, L = liver, T = tumor. All four homogenates were plated for CFU and colonies were scraped for analysis by msbB PCR and colicin production. Nearly pure cultures of colonies similar to 41.2.9 were obtained from all homogenates. From each, five colonies were picked for colicin and PCR analysis. An additional 30 colonies that appeared to be a mixed population of colicin producers and non-producers in the 41.2.9 E3 liver homogenate were identified for further analysis by 41.2.9 E3 T and L. I scraped it from the plate. Based on these results, another 100 colonies from 41.2.9 E3 tumors and liver were scraped and tested for colicin production and msbB PCR. The distribution and plasmid retention were calculated from the combined date.
[0330]
The results of the in vivo E3 injection and the measurement of the retention (%) of the plasmid in Salmonella are shown in Table 3 below.
[0331]
[Table 3]

[0332]
In order for the colE3 plasmid to have an effect in vivo, and for it to carry other genes to the tumor site in vivo, the colE3 plasmid must be retained to be effective in vivo. . Since the target of the effector is a tumor, the results obtained in this experiment are surprising and have advantages, and therefore will have little effect on the liver itself.
[0333]
17． Example: M27 Various types of lung tumor models 41.2.9. Tumor targeting of strains
The following experiments demonstrate the ability of 41.2.9 colE3 and 41.2.9 colE3 BRP and 41.2.9 colE3 BRP-m (modified BRP) Salmonella strains to target tumors.
[0334]
The Salmonella strains listed in Table 4 below were injected into animals bearing M27 lung tumors and animals were sacrificed on day 7. Organ weights were assayed the following day for calculation of cfu / g. Tumors and liver were homogenized, placed on msbB, and colony forming units (cfu) were measured. For groups 1, 2, 4, and 6, all strains were 6 × 10 5 in liver⁴~ 4 × 10⁶Approximately 4x10 in tumors with varying accumulations in the cfu / g range⁸Accumulated to cfu / g. Table 4 summarizes the data for all groups and is shown as average cfu / g. All strains had good tumor accumulation (10⁸c. f. u. / Gm tissue), and all strains gave positive tumor to liver ratios. BRP colE3 has the best ratio, but not always better than all other available strains. The E3 and E3 BRP strains accumulate to significantly higher concentrations in tumors with tumor to liver ratios between 100-200: 1.
[0335]
[Table 4]

¹: BRP_mAre at position 96 (mutation from G to A, resulting in an amino acid change from glycine to arginine) and at position 114 (mutation from T to A, resulting in an amino acid change from serine to threonine). Refers to a modified BRP containing a point mutation. Mutant BRP_mNo longer causes the same lysis, but still has the ability to secrete proteins from bacteria (van der Wal, F., Koningstein, G., Ten Hagen, CM, Oudega, B. and Luirlink, J. (1998), Optimization of bacteriocin-releasing protein (BRP) -mediated protein release by E. coli: Randomization of the pCloDF13-inducible BRP gene to decouple lethality and similar lysis from protein release. Bacteriocin Release Protein (BRP)-Measured Protein Release by Escherichia coli: Random Mutagenesis of pCloDF13 Derived BRP Gene to Uncouple Lethality and Quasi-Lysis from Protein Release), Applied and Environmental Microbiology, Vol. 64, pp. 392-398).
[0336]
18. Example: C38 For murine colon cancer 41.2.9 / ColE3 Effect
The following example demonstrates the ability of 412.9 / ColE3 to inhibit the growth of C38 murine colon cancer.
[0337]
Colon 38 tumor fragment (2 × 2 × 2 mm³) Was implanted subcutaneously in C57BL / 6 mice (female, 9 weeks old). The tumor volume is 1,000mm³After reaching, the tumor was removed from the mouse under sterile conditions and a small fragment (about 2 x 2 x 2 mm³/ Fragment) and the above operation was repeated 5 times. Fragments were implanted subcutaneously on the right flank of mice using a tumor implantation needle on day 0 of tumor implantation.
[0338]
Tumor volume is 150-200mm³Animals were randomized on Day 0 of Salmonella dosing when was reached. The frozen cryopreserved 41.2.9 and 41.2.9 / ColE3 were thawed at room temperature, diluted with PBS and each had a final concentration of 7.5 × 10 4.⁶cfu / ml. Aliquots of 0.2 ml of bacterial suspension (1.5 × 10⁶CFU / mouse) was administered intravenously on day 0 to the mice in the groups described. 1 × 10 bacterial suspension³Diluted to CFU, plated on msbB plates and incubated overnight to determine the number of bacterial cfu administered. Tumors were measured twice weekly until the end of the experiment. Three tumors from each group (ColE3) were dissected and processed to determine cfu and plasmid retention.
[0339]

[0340]
The results of the efficacy of 412.9 / ColE3 on C38 murine colon cancer are shown in FIG. This data demonstrates that mice treated by intravenous injection of VNP20009 (41.2.9) can significantly inhibit the growth of C38 murine colon cancer. In addition, treatment of mice with VNP 200009 containing the ColE3 plasmid achieved tumor regression (ie, the tumor was smaller at the end of the experiment than at the beginning of the experiment).
[0341]
19. Example: In a nude mouse DLD1 Against human colorectal cancer VNP20009 / ColE3 Antitumor activity of
The following example demonstrates the increased ability of Salmonella mutant VNP20009 / ColE3 (41.2.9 / ColE3) to inhibit the growth of DLD1 human colorectal cancer against Salmonella mutant 41.2.9.
[0342]
DLD1 cells grown in logarithmic growth phase were removed by trypsinization, washed with PBS and 5 × 10 5⁷Reconstituted in cells / ml PBS. A single subcutaneous injection of the cell suspension (0.1 ml) was performed on the right flank of nude mice (Nu / Nu-CD1 female, 9 weeks old; from Charles River) on day 0 (5 × 10 5).⁶Cells / mouse). Ten animals were used in each group and the tumor size was 300-400 mm³Approximately 10-15 days after tumor implantation, reaching and randomized and staged. The CFU of Salmonella mutants 412.9 and 412.9 / ColE3 were counted one day before. 1 × 10 bacteria (41.2.9 and 41.2.9 / ColE3)⁷Diluted to CFU / ml. Aliquots of 0.2 ml of bacterial suspension (2 × 10⁶(CFU / mouse) was injected subcutaneously into mice on the indicated days. 1 × 10 bacterial suspension³Diluted in CFU, plated 100 μl of each solution on msbB plate and incubated the plate overnight. The next day bacterial colonies were counted. Tumors were measured twice a week.
[0343]

FIG. 27 shows the results of the antitumor activity of 412.9 / ColE3 against DLD1 human colorectal cancer in nude mice. The 41.2.9 strain containing colicin E3 shows increased activity as compared to the 41.2.9 strain alone.
[0344]
20. Example: C57BL / 6 of mouse B16 For murine melanoma 41.2.9 / ColE3 Effect
The following examples demonstrate the ability of the Salmonella mutant 41.2.9 / ColE3 to inhibit the growth of B16-F10 melanoma.
[0345]
B16-F10 cells growing in logarithmic growth phase were removed by triplin treatment, washed with PBS and 5x10⁶Reconstituted in cells / ml PBS. A single subcutaneous injection of the cell suspension (0.1 ml) was performed on the right flank of C57BL / 6 mice (female, 9 weeks old) on day 0 (5 × 10 6).⁵Cells / mouse). Ten animals were used in each group and tumor volumes were 150-200 mm.³Was randomized on the 9th day. The cryopreserved Salmonella clones 41.2.9 and 41.2.9 / ColE3 were thawed at room temperature, diluted with PBS and each had a final concentration of 7.5 × 10⁶cfu / ml. Aliquots of 0.2 ml of bacterial suspension (1.5 × 10⁶CFU / mouse) was administered intravenously on day 9 to a given group of mice. 1 × 10 bacterial suspension³Diluted in CFU, plated on msbB plates and incubated overnight to determine the number of bacterial cfu administered. Tumors were measured twice weekly until the end of the experiment.
[0346]

The results of the efficacy of 412.9 / ColE3 against B16 murine melanoma in C57BL / 6 mice are shown in FIG. The data demonstrate that mice treated by intravenous injection with 412.9 (41.2.9) can significantly inhibit the growth of B16 murine melanoma. In addition, mice treated with 41.2.9 / ColE3 showed a significant decrease in tumor size at an earlier time point (up to 37 days) compared to 41.2.9 alone. This finding is very important because smaller tumor sizes are more easily affected by other therapeutic agents (eg, chemotherapeutic agents and irradiation such as X-rays).
[0347]
21. Example: BRP Combined with 41.2.9 / E3 Antitumor efficacy of
The following example demonstrates that co-expression of BRP and E3 in Salmonella mutant 41.2.9 increases the antitumor efficacy of the mutant.
[0348]
Co-expression of B3 with E3 in Salmonella mutant 41.2.9 increases the amount of E3 secreted from bacteria in vitro. If BRP could increase the amount of E3 secreted from Salmonella in vivo, this additional extracellular E3 would be readily available to tumor cells, thus increasing cytotoxicity to these cells. You can make a hypothesis. In this experiment, four groups of animals (10 animals per group) were tested:

モ デ ル The model used in this experiment was human lung cancer line HTB177. Cells were implanted subcutaneously on the flanks of mice on day 1. Tumor is about 500mm³On the 14th day that the animals reached 1 × 10 5 of the strains listed in the table above⁶cfu, or saline in the case of group 1, was injected by intravenous injection. Tumor volume was measured weekly until day 24. The results in Table 5 show that 41.2.9 alone can inhibit tumor growth (40% inhibition), while in combination with E3 can increase antitumor efficacy (63%). However, when strains with both E3 and BRP were used in this model, the antitumor efficacy was further increased (67% inhibition compared to untreated controls), and the increased inhibition was very significant at earlier time points. (Table 5).
[0349]
[Table 5]

[0350]
In conclusion, treatment with Salmonella having both cytotoxic colicin E3 and enhanced secreted BRP increased antitumor efficacy compared to untreated controls and treatment with 412.9 / E3 alone. I do.
[0351]
22. Example: colicin E3 With salmonella X Combination with line treatment
The examples below demonstrate that the combination of 41.2.9 and two doses of X-ray significantly increases the survival of mice than is seen with X-ray alone.
[0352]
The schedule is as follows: On day 0, B16F10 melanoma (5 × 10 5) subcutaneously on the right side of the mid body of 100 C57B6 female mice (5-7 weeks old).⁵(Cells / mouse). On day 8, Salmonella 41.2.9 containing colicin E3 was injected and X-rays were irradiated on days 12 and 26.
[0353]
Table 6 shows the results of the combination of colicin E3-containing Salmonella and X-ray treatment.
[0354]
[Table 6]

[0355]
This data demonstrates that the combination of 41.2.9 and two doses of X-rays significantly prolongs the survival of mice than is seen with X-rays alone. E3 further prolonged the survival of mice than seen with 41.2.9+ X-rays.
[0356]
23. Example: Expression of cytotoxic necrosis factor by tumor target bacteria
The following example demonstrates the expression of E. coli cytotoxic necrosis factor 1 (CNF1) by tumor target bacteria.
[0357]
Examples of cytotoxic necrosis factor include, but are not limited to, Escherichia coli cytotoxic necrosis factor 1 (CNF1; Falbo et al., 1993, Infect. Immun. 61: 4904-4914), Vibrio fischeri CNF1 (Lin). Commun. 250: 462-465) and E. coli cytotoxic necrosis factor 2 (CNF2; Sugai et al., 1999, Infect. Immun. 67: 6550-6557). Also included in the CNF family are Pasteurella multiocida toxin (PMT), which has 27% identical residues and 80% conserved residues with the N-terminal portion of CNF2 (Oswald et al., 1994, Proc. Acad. Sci. USA 91: 3814-3818).
[0358]
CNF1 was obtained from E. coli 196 (ATCC 700336) using standard PCR using primers, (forward) 5'-GTGTCATGAAAATGGGGTAACCAATGGCAAC-3 '(SEQ ID NO: 35) and (reverse) 5'-CACAGAGCTCGCGCTAACAAAAACAGCACAAGGGAG-3' 36), and cloned by PCR. A product of about 3100 bp was obtained and cloned into the NcoI and SacI sites of pTrc99a for protein expression and DNA sequencing using E. coli as the DNA cloning host. DNA sequencing was performed according to standard methods from the Yale University Keck Biotechnology laboratory. DNA sequencing confirmed that the cloned PCR product was CNF1 with only a small sequence variation of 6 out of 3065 base pairs.
[0359]
The CNF1 plasmid was electroporated into the E. coli DNA cloning host DH5α and Salmonella strain YS1646 (WO 99/13053). CNF1 expression was measured in an E. coli DNA cloning host and Salmonella strain YS1649 using a standard LDH assay (Promega, Cytotox 96®, Madison, Wis.). FIG. 29 shows that the presence of the CNF-containing plasmid results in increased cytotoxicity. Using subsequent assays, it is shown that Salmonella harboring a CNF-containing plasmid also exhibits other known properties of CNF1, such as multinucleation (Rycke et al., 1990, J. Clin. Microbiol. 28: 694-699). Indicated. The nuclei of Hela cells exposed to CNF1 were examined by light microscopy. The results in FIG. 30 clearly show that the presence of CNF1 in Salmonella leads to the expected multinucleation and cell enlargement.
[0360]
24. Example: Expression of Vero Toxin by Tumor Targeting Bacteria
The following examples demonstrate the cytotoxicity of verotoxin AB produced by tumor-targeting bacteria engineered to express verotoxin AB.
[0361]
Vero toxin (syn. HSC10 toxin, Shiga toxin, Shiga-like toxin, Shigella toxin). This toxin was isolated from colicin-producing E. coli HSC10 strain and was originally thought to be colicin (Farkas-Himsley et al., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. 92 (15): 6996). -7000). Although it has a long history of antitumor activity, particularly against ovarian cancer and brain tumors, this antitumor activity is associated with purified preparations rather than whole living bacteria.
[0362]
Verotoxin was cloned from E. coli HSC10 (ATCC 55227) using primers based on the published sequence of Verotoxin I, and using standard DNA sequencing techniques at the Yale Keck Biotechnology Center (Yale). DNA sequencing on a Keck Biotechnology Center). Vero toxin expression was achieved using the BRP gene under the control of a polycistronic tetracycline-inducible promoter by the Vero toxin A and B subunits. This tetracycline-inducible BRP verotoxin AB was cloned into a vector for chromosomal integration using the msbB gene.
[0363]
24.1. Vector construction
24.1.1. 　 AB Amplification and cloning
Verotoxin AB (AB) was generated by PCR using the following primers:
H19B-7: forward: 5'-GTGTCCATGGCTAAAACATTTATAATAGCTGCATCGC-3 '(SEQ ID NO: 37); and
QSTX-R1: reverse: 5'-GTGTCTGCAGAAACTGACTGAATTGAGATG-3 '(SEQ ID NO: 38).
[0364]
These primers also contain outer NcoI (5 ') and PstI (3') restriction endonuclease sites for cloning into the NcoI and PstI sites of ptrc99A.
[0365]
24.1.2. 　 TetBRP Amplification and cloning
TetBRP-AB was constructed in the intermediate vector pSP72-F6 / R6. TetBRP was generated by PCR using the following primers: Tet-5 ': forward 5'-GTGTAGATTCTTTAAGACCCACTTTCACATTTTAAGTGG-3' (SEQ ID NO: 39) and BRP-TET-3 ': reverse 5'-CACAGAGATCCTTACGAACCCGCGATCCCCG-3' (sequence). No. 40). These primers contain BglII (5 ') and BamHI (3') restriction endonuclease sites for cloning into the BglII and BamHI sites of the pSP72-F6 / R6 vector.
[0366]
24.1.3. 　 pSP72-F6 / R6-TetBRP Into AB Subcloning of
ptrc99A-AB was digested with BamHI and AvaI restriction endonuclease to remove AB for insertion into pSP72F6 / R6-TetBRP and digested with BamHI and AvaI restriction endonuclease. The pSP72F6 / R6 vector contains multiple restriction endonuclease sites for cloning, as well as a portion of the β-gal gene for lacZ-α complementation in trans. Both the vector (pSP72F6 / R6-TetBRP) and the AB insert were separated on a 0.8% 1 × TAE agarose gel and purified using a Qiagen gel extraction kit. The vector and insert were ligated using T4 ligase and transformed into DH5a E. coli cells using the heat shock method. The cells were plated on LB plates containing 100 μg / ml Amp and 40 μg / ml X-gal. Positive colonies were selected based on ampicillin resistance and the presence of a functional β-gal gene (positive colonies were blue).
[0367]
24.1.4. 　 pCDV442 Into TetBRP-AB Subcloning of
pSP72F6 / R6-TetBRP-AB was digested with NotI and SfiI restriction endonucleases for subcloning into the pCVD442 vector and with NotI and SfiI restriction endonucleases.
[0368]
24.1.5. 　 msbB Chromosome vector
A vector capable of performing homologous recombination with the DmsbB gene in the chromosome of the VNP 200009 strain (aka YS1646 in WO 99/13053) was replaced with a suicide vector pCVD442 (Donnenberg and Kaper, 1991, Infection and). Immunity 59: 4310-4317). Primers for PCR were designed to produce portions of the 5 'and 3' sections of the msbB deletion present in VNP20009 as two separate products (msbB-5 ': forward 5'-GTG TGA GCT CGA TCA ACC AGC AAG CCG TTA ACC CTC TGA C-3 ′ (SEQ ID NO: 41) and reverse 5′-GTG TGC ATG CGG GGG GCC ATA TAG GCC GGG GAT TTA AAT GCA AAC GTC CGC CCA GCC GCC GAC GCC GCC 42); and msbB-3 ′: forward 5′-GTG TGC ATG CGG GGT TAA TTA AGG GGG CGG CCG CGT GGT ATT GGT TGA ACC GAC GGT GCT CAT GAC ATC GC-3 ′ SEQ ID NO: 43) and reverse 5'-GTG TCT CGA GGA TATCAT TCT GGC CTC TGA CGT TGT G-3 '(SEQ ID NO: 44)). Also, these primers are used to facilitate cloning of pCVD442 into the SacI and SalI sites when these two fragments bind through a common SphI site, so that the outer SacI (5 ′) and To facilitate the cloning of DNA fragments into DmsbB for stable chromosomal integration without antibiotic resistance containing an AcaI (3 ') restriction endonuclease site, internal NotI, PacI, SphI, SfiI, Generate SwaI and DraI (FIG. 31). This vector is called pCVD442-msbB (see FIGS. 32 and 33).
[0369]
To clone Tet-BRP-AB into pCVD442-msbB, the Tet-BRP-AB plasmid DNA was restricted, the appropriate DNA was purified, and the ligation reaction containing these two components was performed using T4 ligase. Was done. The ligation reaction was then transformed into DH51 pi and colonies were screened for the presence and orientation of Tet-BRP-AB. The Tet-BRP-AB clone was transformed into SM101 pi strain (Donnenberg and Kaper, 1991, supra) and the plasmid was designated pCVD442-Tet-BRP-AB. SM101 pi colonies were screened for the Tet-BRP-AB gene by PCR and the SM101 pi clone pCVD442-Tet-BRP-AB was selected for use as a mating donor for the Salmonella strain. SM101 pir containing pCVD442-Tet-BRP-AB was prepared by standard methods (Davis, RW, Botstein, D. and Roth, JR, 1980, Advanced Bacterial Genetics). ), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor), a naturally occurring derivative of Salmonella strain YS50101 (a tetracycline resistant strain YS82 with enhanced resistance to Difco MacConkey agar (Low et al., 1999) / 50 g). Selection was performed on plates containing mL carbenicillin (carb) and 300 μg / mL streptomycin (strep). The resulting YS50102-pCVD442-Tet-BRP-AB clone was checked for pCVD442-Tet-BRP-AB gene by PCR.
[0370]
24.2. 　 41.2.9-Tet-BRP-AB Integrated into the chromosome to produce the strain pCVD442-Tet-BRP-AB of 41.2.9 ( YS1646 ) Delivery in
Carbenicillin resistance was transduced to 41.2.9 by bacteriophage P22 (mutant HT105 / 1 int-201; Davis et al., 1980) using the YS50102-Tet-BRP-AB strain as a donor. Carb representing 41.2.9-pCVD-Tet-BRP-AB-1 containing both DmsbB and DmsbB-Tet-BRP-AB genes due to the presence of the bla and sacB genes from pCVD442.^r(Or amp^r) Suc^sSelection of the strain becomes possible (FIG. 33, # 3). 41.2.9-Tet-BRP-AB-1 strain was plated on LB sucrose and suc^r carb^sDerivatives were selected, the DmsbB gene was removed, and LB-sucrose agar plates were prepared without NaCl, except that the DmsbB-Tet-BRP-AB gene was prepared according to the method of Donnenberg and Kaper, 1991 (FIG. 33, # 4). And the plate was incubated at 30 ° C. After the colonies grew on these plates, they were gridded to msbB plates and replicated to either carbenicillin or sucrose to detect the presence of clones lacking both antibiotic and sucrose markers. Were plated on plates containing The resulting clone was checked for the presence of the Tet-BRP-AB gene by PCR. One derivative containing Tet-BRP-AB integrated into the chromosome and lacking sucrose sensitivity and carbenicillin resistance was designated 41.2.9-Tet-BRP-Verotoxin AB.
[0371]
Standard LDH cytotoxicity assay (Cytotox⁹⁶The cytotoxicity of 412.9-Tet-BRP-Verotoxin AB was tested in vitro using (registered trademark); Promega, Madison, WI. The results are shown in FIG. This result demonstrates the toxic properties of Vero toxin expressing clones 26 and 31. Clones 26 and 31 had significantly higher cytotoxicity (%) when treated with tetracycline than when not treated with tetracycline.
[0372]
25. Example: Expression of hemolysin by tumor target bacteria
The following examples demonstrate that tumor targeting bacteria can be genetically engineered to express hemolytic proteins, such as hemolysin, constitutively or under inducible control.
[0373]
Hemolysin is a well-known cytotoxic protein that has the ability to lyse red blood cells (see, eg, Beutin, 1991, Med. Microbiol. Immunol. 180: 167-182). SheA (Genbank number ECO238954) is a normally unexpressed silent hemolysin found mostly in wild-type E. coli (Fernandez et al., 1998, FEMS Microbiol Lett. 168: 85-90). SheA (aka hlyE; Genbank number U57430) was obtained from wild-type E. coli (strain 2507, Yale University E. coli Genetic Stock Center) using the following primer (forward) 5′- TTTTTTCCAT GGCTATTATG ACTGAAATCG TTGCAGATAAAACCG-3 '(SEQ ID NO: 45) and (Reverse) 5'-TTTTTAAGC TTCCCGGGTC AGACTTCAGGGTCTCAAG AGTGTC-3' using standard PCR and PCR conditions (SEQ ID NO: 46). Correct size PCR products were cloned into the NcoI and HindIII sites of ptrc99a (Pharmacia) in order to place it under the partially constitutive trc promoter. In addition, the PCR product was cloned into the tet-bgal-Z-term vector (described above) cut with NcoI and EcoRV. Then, Escherichia coli DH5a (manufactured by Gibco) was transformed with the plasmid, and a blood agar medium with and without the addition of 0.2 μg / ml tetracycline (trypsin soybean agar medium with 5% sheep blood; manufactured by BioMerieux) , Lombard, Illinois). Colonies containing a clear halo around colonies showing hemolysis were picked as positive colonies. Positive colonies were subjected to standard plasmid purification, transformed into Salmonella YS501 and screened again for halos.
[0374]
Constitutive halo formation is shown in Figure 35 (2A and 2B) for the trc99a construct, where halos are observed with or without the addition of tetracycline. Tetracycline-dependent halo formation is shown in FIG. 35 (3A and 3B) for tetracycline-promoter-inducible SheA, where no halo is observed without the addition of tetracycline. These results demonstrate that tumor target bacteria can express hemolytic proteins constitutively or under inducible control.
[0375]
26. Example: Expression of methionase by tumor target bacteria
The following examples demonstrate that attenuated tumor target bacteria such as Salmonella can be engineered to express methionase.
[0376]
Methionase is an enzyme that degrades methionine, an essential amino acid required for tumor growth. The administration of purified methionase to inhibit tumor growth or to administer DNA or viral vectors encoding methionase has been reported (WO 00/29589 by Xu and Tan). Xu and Tan do not disclose how to use tumor-specific bacterial vectors for delivery of methionase, and large amounts of methionase are required to achieve efficacy with the purified protein. A novel method of delivering methionase directly to tumors uses tumor-targeting bacteria to express the enzyme.
[0377]
The following primers were generated for methionase from Pneudomas putida based on Genbank number L43133:
Forward: METH-XHOI
5'-CCGCTCGAGATGCACGGCTCCAACAAGCTCCCA-3 '(SEQ ID NO: 47); and
Reverse: METH-BAM
5'-CGCGGATCCTTAGGCACTCGCCTTGAGTGCCCTG-3 '(SEQ ID NO: 48)
The methionase sequence was amplified by PCR under the following conditions using the above listed primers (4 mM) and the isolated colonies of Newdomus putida as template:
One cycle of 94 ° C for 5 minutes, then 35 cycles of 94 ° C for 1 minute, 60 ° C for 1 minute and 72 ° C for 2 minutes. A final amplification step at 72 ° C. for 10 minutes was performed as the last step of the PCR reaction. The PCR products were separated on a 0.8% 1X TAE agarose gel and a PCR product consisting of the expected size of methionase (about 1196 bp) was identified. Bands were excised from the gel and purified using a Qiagen gel extraction kit.
[0378]
Both the pSP72 vector and the isolated gel purified methionase gene obtained above were digested with the restriction enzymes Xho I and Bam HI. The digested vector and methionase were separated on a 0.8% 1XTAE agarose gel. The digestion product corresponding to the linearized vector and the digested methionase gene were excised from the gel and purified using a Qiagen gel extraction kit. The linearized vector and insert (methionase) were ligated together using T4 ligase. The ligation mixture was transformed into Dh5a E. coli cells by heat shock. After harvesting the cells, they were plated on LB medium containing 100 mg / mL ampicillin (Amp) to select cells containing the complete pSP72 vector. Amp resistant colonies were identified and the presence of the methionase gene-containing pSP72 vector was confirmed by plasmid preparation using a Qiagen mini-prep kit and restriction digestion with the enzymes Eco RI and Bsp HI. Clone # 9 was sent to the Yale Sequencing Facility of Yale University School of Medicine for sequencing. Sequencing was performed using both SP6 (forward) and T7 (reverse) sequencing primers. The results demonstrate that the sequence is 100% identical to the published methionase sequence except for the TGA stop codon, which has been changed to TAA by PCR.
[0379]
Methionase activity can be measured using the methionase assay described in Hori et al., 1996, Cancer Research 56: 2116-2122.
[0380]
27. Example: with attenuated tumor target bacteria TAT Apotin as fusion ( apoptin ) Protein expression
The attenuated tumor target bacterium has been genetically engineered to effector molecules and a fusion protein comprising a ferry peptide, such as TAT, antennapedia, VP22, and Kaposi FGF MTS, according to the following examples. Can be expressed and secreted.
[0381]
27.1. 　 TAT- Construction of apotin vector
Apotin, a canary virus (CAV) protein, is known to induce apoptosis in neoplastic cells when delivered by an adenovirus vector (eg, Noteborn et al., 1999, Gene Therapy 6: 882). -892).
[0382]
An apotin protein derived from the human immunodeficiency virus (HIV) TAT protein to produce a protein that is transcribed in the cytoplasm of Salmonella, but is transported to the nucleus of tumor cells and has the ability to trigger apoptosis (See, e.g., Schwartze et al., 1999, Science 285: 1569-1572). TAT protein fusions have also been shown to be functional when fused with polyhistidine (hexahistidine) amino acids, which increase the positive charge and also facilitate protein purification (Schwartz et al., 1999, supra). , A TAT-apotin fusion was produced with and without hexahistidine (FIGS. 36A and B). In addition, TAT-apotin fusions can be produced with and without the OmpA-8L signal sequence (FIGS. 36A and C).
[0383]
Apotin and hexahistidine apotin are constructed using overlapping oligonucleotides. The nucleic acid sequence encoding apotin was generated by PCR using the following oligonucleotides:

TAP 2-TAP6 oligonucleotide and TAP6H1 oligonucleotide

Was used to generate a nucleic acid sequence encoding a hexahistidine-containing version of the TAT-apotin fusion protein. TAP6 oligonucleotide and omp8LF1 oligonucleotide

The nucleic acid sequence encoding the OmpA8L-containing version of the TAT-apotin fusion protein was generated from the TAP1-TAP6 oligonucleotide PCR product by PCR using.
[0384]
Each oligonucleotide was prepared as a stock solution having a concentration of 4 μM. Using PCR reaction beads (Pharmacia, Ready-to-go beads) mixed in advance, 2 μl of each oligonucleotide was used. The PCR reaction consisted of one cycle at 95 ° C for 5 minutes; 35 cycles of 95 ° C for 1 minute, 60 ° C for 1 minute, 72 ° C for 1 minute; and 1 cycle at 72 ° C for 10 minutes. The PCR product was then extracted with phenol / chloroform, precipitated with ethanol, redissolved in water and subjected to restriction digestion with Nco I and Hind III. The restriction digested PCR products were separated by gel electrophoresis and the correct size products (about 420 and 450 bp for TAT-apotin and hexahistidine-TAT-apotin, respectively) were excised from the gel and standard molecular Was isolated using biological methods. These products were ligated into Nco I and Hind III digested ptrc99a (Pharmacia) to obtain a ptrc99a-TAT-apotin construct. Correct DNA sequences were obtained for both TAT-apotin (FIG. 37) and hexahistidine TAT-apotin (FIG. 38).
[0385]
27.2. 　 TAT- Evidence for secretion and uptake of apotin
Attenuated tumor target bacteria are transformed with the ptrc99a-TAT-apotin construct by standard methods known in the art (eg, by heat shock or electroporation) and cultured in culture. The supernatant from the bacterial culture is tested for the presence of TAT-apotin using methods known to those skilled in the art (eg, Western blot analysis or ELISA). Once the presence of TAT-apotin in the supernatant of the bacterial culture is confirmed, the bacterial culture supernatant is incubated with mammalian cells (eg, NIH3T3, CHO, 293, and 293T cells) and the TAT inside the cells -The presence of apotin is confirmed by an apotin assay known to the person skilled in the art.
[0386]
27.3. Into the tumor TAT- Proof of Apotin uptake
TAT-apotin or an attenuated tumor target bacterium engineered to express apotin is administered intravenously to a B16 tumor model. Mice are sacrificed several days after bacterial administration and organ weights are determined. Tumors were tested for the presence and localization of TAT-apotin or apotin using apoptosis assays known to those skilled in the art (eg, DNA laddering and fluorescein in situ cell death detection kit (Boehringer Mannheim, Mannheim, Germany)). In addition, the size of the tumor is assayed, the antitumor activity of TAT-apotin is determined, and the tumor is homogenized and plated to determine colony forming units (cfu). .
[0387]
28. Example: mouse M27 Against lung cancer growth VNP20009 Efficacy of Combination with Chemotherapy
The following examples demonstrate that administration of attenuated tumor target bacteria in combination with chemotherapeutic agents can act synergistically or additively to inhibit the growth of solid tumors such as lung cancer.
[0388]
28.1. of mouse M27 Against lung cancer growth VNP20009 And cytoxane ( cytoxan ) Or VNP20009 And mitomycin C Efficacy of combination with
M27 murine lung cancer cells preserved in liquid nitrogen (1 × 10⁶/ Ml × 1 ml) was returned to normal by quickly thawing the cells at 37 ° C., 37 ° C., 5% CO 2₂Was cultured in 10 ml of DMEM culture medium containing 10% fetal calf serum (FCS). After passage of the cells for two generations, M27 cells in the logarithmic growth phase were removed by trypsinization, washed with 1 × PBS, and 2.5 × 10 5 in 1 × PBS for tumor implantation.⁶Reconstituted to cells / ml. On day 0, 100 C57BL / 6 mice (female, 8 weeks old, 20 g; 5 × 10⁵(Cells / mouse) subcutaneously on the right flank. The mice were randomly divided into 10 groups, with each group consisting of 10 mice.
[0389]
Salmonella VNP 200009 strain was prepared in 5 × 10 5 in 1 × PBS by our standard dilution method.⁶Diluted to CFU / ml. Each mouse received diluted Salmonella (1 × 10 5) on day 12 according to Table 6 below.⁶(CFU / mouse) 0.2 ml was administered intravenously. 5 × 10 to determine the actual number of bacteria injected⁶The bacterial suspension at CFU / ml was further added to 1 × 10³It was diluted to CFU / ml and plated on nutrient agar medium (MsbB plate; WO 99/13053). The formed colonies were counted the next day.
[0390]
Mitomycin C (manufactured by Sigma) and cytoxan (manufactured by Sigma) were administered to mice according to Table 7 below. A second dose of mitomycin C was administered to the combination group on day 22, but not to the group treated with mitomycin C alone due to the large size of the tumor. Since severe toxic reactions were observed in the group treated with VNP20009 + cytoxane, 200 mpk of Cipro (Bayer Inc., West Haven, Conn.) Was treated with VNP20009 alone or VNP20009 + chemotherapeutic agent. Each mouse was administered. Tumor volume was measured twice a week until the end of the experiment. Animal behavior, appearance and mortality were observed daily. Mice were kept in a clean, constant temperature laboratory. The bedding was changed twice a week and the mice were given sufficient food and drinking water.
[0391]
[Table 7]

[0392]
As shown in FIG. 39, the combination treatment with VNP20009 + cytoxane inhibited M27 lung cancer growth more strongly than VNP20009 treatment alone or cytoxane treatment alone. As shown in FIG. 40, the combination of VNP20009 + mitomycin C more strongly inhibited the growth of M27 lung cancer than mitomycin C alone. However, the combination of VNP20009 + mitomycin C did not inhibit M27 lung cancer growth more strongly than VNP20009 treatment alone (Figure 40). These results suggest that administration of the attenuated tumor target bacteria in combination with a chemotherapeutic agent can act synergistically or additively and inhibit the growth of solid tumors such as lung cancer.
[0393]
28.2. of mouse M27 Against lung cancer growth VNP20009 Efficacy of the combination of cisplatin and cisplatin
M27 murine lung cancer cells preserved in liquid nitrogen (1 × 10⁶/ Ml × 1 ml) was returned to normal by quickly thawing the cells at 37 ° C., 37 ° C., 5% CO 2₂Was cultured in 25 ml of DMEM culture medium containing fetal calf serum (FCS). After the cells have been passaged for two generations, M27 cells in the logarithmic growth phase (about 90-95% saturation) are removed by trypsinization, washed with 1 × PBS, and washed with 1 × PBS for tumor implantation. .5 × 10⁶Reconstituted to cells / ml. M27 cell suspension (0.2 ml) was added on day 0 to 36 C57BL / 6 mice (female, 8 weeks old, 20 g; 5 × 10 5⁵(Cells / mouse) subcutaneously on the right flank. Mice were randomly grouped such that each group consisted of 9 mice.
[0394]
Salmonella VNP20009 strain was prepared in 5 × 10 5 in 1 × PBS by our standard dilution method.⁶Diluted to CFU / ml. According to Table 8 below, Salmonella (1 × 10⁶(CFU / mouse) 0.2 ml was administered to each mouse via the tail vein. To determine the actual number of bacteria injected, 5 × 10⁶CFU / ml bacterial suspension was added to 1 × 10³Further diluted to CFU / ml and plated on MsBb plates. The formed colonies were counted the next day.
[0395]
On day 14, two days after bacterial injection, mice were administered cisplatin (Table 8 below). Cisplatin was diluted to 0.5 mg / ml with normal saline before administration. Tumor volume was measured twice weekly until the end of the experiment. Animal behavior, appearance and mortality were observed daily. Mice were kept in a clean, constant temperature laboratory. The bedding was changed twice a week and the mice were given sufficient food and drinking water.
[0396]
[Table 8]

[0397]
As shown in FIG. 41, the combination treatment with VNP20009 + Cisplatin more strongly inhibited the growth of M27 lung cancer than VNP20009 treatment alone or Cisplatin treatment alone. These results suggest that administration of attenuated tumor-targeting bacteria in combination with a chemotherapeutic agent such as cisplatin may act synergistically or additively and inhibit the growth of solid tumors such as lung cancer.
[0398]
The invention is not to be limited in scope by the specific embodiments described herein. Indeed, it will be apparent to one skilled in the art, from the preceding description and the accompanying drawings, that there are various modifications of the invention other than those described herein. Such modifications are intended to fall within the scope of the appended claims.
[0399]
Various publications are cited herein, the disclosures of which are incorporated herein by reference in their entirety.
[Brief description of the drawings]
FIG.
FIG. 2 shows the coding sequence of mature human TNF-α. Both the DNA sequence (SEQ ID NO: 3) and the protein sequence (SEQ ID NO: 4) are shown.
FIG. 2
FIG. 2 shows the induction of Salmonella VNP20009 serC strain.
FIG. 3
FIG. 2 is a diagram showing TNF-α expression from a trc promoter-driven TNF-α gene integrated into a chromosome in Salmonella typhimurium.
FIG. 4
FIG. 3 shows the coding sequence of a synthetic OmpA signal sequence (nucleotides 1-63) fusion with mature human TNF-α (nucleotides 67-543). Both the DNA sequence (SEQ ID NO: 7) and the protein sequence (SEQ ID NO: 8) for the fusion construct are shown.
FIG. 5
FIG. 2 shows the periplasmic localization and processing of the OmpA / TNF-α fusion protein in Escherichia coli (JM109 strain).
FIG. 6
FIG. 3 shows the coding sequence of the OmpA signal sequence (nucleotides 1-63) fusion with mature human TRAIL (nucleotides 67-801). Both the DNA sequence (SEQ ID NO: 9) and the protein sequence (SEQ ID NO: 10) for the fusion construct are shown.
FIG. 7
FIG. 2 shows the expression and processing of an OmpA TRAIL fusion protein in E. coli (JM109 strain).
FIG. 8
FIG. 3 shows the coding sequence of a modified OmpA signal sequence (nucleotides 1-63) fusion with mature (C125A) human IL-2 (nucleotides 64-462). Both the DNA sequence (SEQ ID NO: 11) and the protein sequence (SEQ ID NO: 12) for the fusion construct are shown.
FIG. 9
FIG. 3 shows expression and processing of mature human IL-2 fused to phoA (8L) or ompA (8L) synthetic signal peptide.
FIG. 10
FIG. 3 shows the coding sequence of a modified phoA signal sequence (nucleotides 1-63) fusion with mature (C125A) human IL-2 (nucleotides 64-462). Both the DNA sequence (SEQ ID NO: 13) and the protein sequence (SEQ ID NO: 14) for the fusion construct are shown.
FIG. 11
FIG. 2 shows the in vivo antitumor efficacy of an attenuated Salmonella typhimurium expressing a mature form of human TNF-α.
FIG.
FIG. 3 shows the effect of BRP expression on in vivo antitumor efficacy. The figure shows mean tumor size over time for a population of C57BL / 6 mice bearing B16 melanoma treated with (1) PBS control; (2) VNP20009; and (3) VNP20009 carrying the pSW1 plasmid containing the BRP gene. FIG.
FIG. 13
FIG. 2 shows anaerobic induction of β-gal gene expression under the control of the pepT promoter in Salmonella. FIG. 13A shows in vitro induction of β-gal expression in response to anaerobic conditions of two strains of Salmonella, YS1456 and VNP20009. FIG. 13B shows the in vivo induction of β-gal in tumor versus hepatocytes of BRP, β-gal, or VNP20009 Salmonella expressing BRP and β-gal.
FIG. 14
FIG. 4 shows the tetracycline induction of β-gal gene expression under the control of the Tet promoter in Salmonella. The dose response shows a linear response to tetracycline up to a concentration of about 0.15 μg / ml, above which there is a diminished response, presumably due to the antibiotic action of tetracycline.
FIG.
FIG. 3 shows the expression of hexahistidine-endostatin (hex-HIS-endostatin) from the pTrc99a vector. FIG. 15A shows the expression of hexa-HIS-endostatin from three independent clones transformed into Salmonella (VNP 20009). FIG. 15B shows the expression of hexa-HIS-endostatin from five independent clones transformed into E. coli (DH5α). Even-numbered lanes show extracts from uninduced cultures, and odd-numbered lanes show extracts from corresponding IPTG-induced cultures.
FIG.
FIG. 9 shows the expression of hexa-HIS-endostatin from plasmid YA3334. Hex-HIS-endostatin in the asd system (using the trc promoter) can express an appropriate size band of hexa-HIS-endostatin (チ ン 25 kD) by Western analysis using an anti-histidine antibody.
FIG.
FIG. 2 shows the efficacy of VNP20009 cells expressing endostatin against C38 mouse colorectal cancer. The figure shows (1) PBS control; (2) asd carrying empty YA3334 vector.⁻VNP20009; (3) asd expressing hexahistidine-endostatin⁻Figure 4 is a graph showing the mean tumor size over time of a population of mice with established C38 tumors, treated with VNP20009; and (4) VNP20009 expressing hexahistidine-endostatin and BRP, respectively.
FIG.
FIG. 2 shows the efficacy of VNP20009 cells expressing endostatin against DLD1 human colorectal cancer. The figure shows (1) PBS control; (2) asd carrying empty YA3334 vector.⁻FIG. 3 is a graph showing the mean tumor size over time of a population of nude mice bearing established DLD1 tumors treated with VNP20009; and (3) VNP20009 expressing hexahistidine-endostatin and BRP, respectively.
FIG.
FIG. 4 shows the antiproliferative activity of lysates from an attenuated tumor target Salmonella expressing human endostatin on endothelial cells. The figure shows that bFGF and 8 × 10⁸Figure 4 shows inhibition of human venous endothelial cell (HUVEC) proliferation in response to lysates corresponding to bacteria. As a control, Salmonella containing an empty pTrc vector was used. The score for each data is the average value from a representative experiment performed in four replicates. Samples were normalized by bacterial count.
FIG.
FIG. 3 shows the antiproliferative activity of lysates from attenuated tumor target Salmonella expressing platelet factor 4 peptide (amino acids 47-70 of platelet factor 4) and thrombospondin peptide (13.40) on endothelial cells . The figure shows that bFGF and 8 × 10⁸Figure 4 shows inhibition of human venous endothelial cell (HUVEC) proliferation in response to lysates corresponding to bacteria. As a control, Salmonella containing an empty pTrc vector was used. The score for each data is the average value from a representative experiment performed in four replicates. Samples were normalized by bacterial count.
FIG. 21
pE3. FIG. 2 shows the construction of shuttle-1 vector.
FIG. 22
FIG. 2 shows the construction of ColE3-CA38 vector (GenBank accession number AF129270). The nucleotide sequence of the ColE3-CA38 vector is shown in SEQ ID NO: 1. The ColE3-CA38 vector contains five open reading frames, as shown in SEQ ID NOs: 2-5, respectively.
FIG. 23
It is a figure which shows construction of Col E3-CA38 / BRP-1 vector.
FIG. 24
4 is a bar graph showing the amount of lethal units of colicin E3 produced by each strain.
FIG. 25
FIG. 2 shows a halo assay for various strains exposed to ultraviolet light or X-rays.
FIG. 26
It is a figure which shows the effect of 412.9 / Col E3 with respect to C38 mouse colon cancer.
FIG. 27
It is a figure which shows 41.2.9 / Col / E3 antitumor activity with respect to DLD1 human colon cancer in NU / Nu mouse | mouth.
FIG. 28
FIG. 4 shows the efficacy of 412.9 / Col E3 on B16 mouse melanoma.
FIG. 29
FIG. 3 shows the cytotoxicity of Salmonella expressing cloned E. coli CNF1.
FIG. 30
HeLa cells exposed to CNF (A) show swelling and multinucleation compared to normal HeLa cells (B).
FIG. 31
FIG. 33 shows the msbB portion of the pCVD442-msbB vector in the 3 ′ to 5 ′ direction (as can be seen from the map of FIG. 32), which has a deletion in the middle of msbB and an internal Not1 at that location. , PacI, SphI, SfiI, SwaI and DraI polylinkers (SEQ ID NO: 61). See FIG.
FIG. 32
FIG. 2 is a restriction map and schematic of the pCVD442-msbB vector for cloning DNA into the DmsbB region and subsequently inserting it into the chromosome. MsbBdel is the 5 'and 3' region of DmsbB; mob RP4 is a mobilizing element for transferring plasmids from one strain to another. bla is a β-lactamase that confers sensitivity to b-lactam antibiotics such as carbenicillin and ampicillin. SacB is a gene that confers sucrose sensitivity.
FIG. 33
1) pCVD442-Tet-BRP-AB vector, 2) homologous recombination by DmsbB chromosome copy in Salmonella YS50102, 3) chromosomal integration into Salmonella YS50102, followed by phage transduction into strain VNP20009, 4) strain 41. FIG. 2 shows sucrose separation leading to 2.2.9-Tet-BRP-AB. OriR6K is a plasmid origin of replication; mob RP4 is a mobilization element for transferring a plasmid from one strain to another. amp is a beta-lactamase that confers sensitivity to b-lactam antibiotics such as carbenicillin and ampicillin. sacB is a gene that confers sensitivity to sucrose. Note that it is not shown to scale.
FIG. 34
FIG. 4 shows the% cytotoxicity of tetBRPAB clone # 26 and clone # 31 compared to positive and negative controls (HSC10 and 41.2.9) after exposure to SKOV3 cells (mean number = 8) for 72 hours. Vero toxin expression was induced by tetracycline (see clones 26 and 31). With tetracycline treatment (+); and without tetracycline treatment (-). E. coli strain HSC10 was used as a positive control for% cytotoxicity.
FIG. 35
Figure 3 shows halo formation of attenuated tumor target Salmonella on blood agar in the absence (1A) and in the presence (1B) of tetracycline. In addition, in the absence of tetracycline (2A) and in the presence of tetracycline (2B), SheA. 1 shows halo formation for an attenuated tumor target Salmonella engineered to express. Furthermore, in the absence of tetracycline (3A) and in the presence of tetracycline (3B), tetracycline-inducible SheA. 1 shows halo formation for an attenuated tumor target Salmonella engineered to express.
FIG. 36
(A) shows a TAT-apoptin fusion protein without a hexahistazine tag. (B) shows a TAT-apoptin fusion protein containing a hexahistazine tag. (C) shows a TAT-apoptin fusion protein containing the OmpA-8L signal sequence.
FIG. 37
FIG. 4 shows the coding sequence of the TAT-apoptin fusion protein. The sequences of both DNA (SEQ ID NO: 57) and protein (SEQ ID NO: 58) are shown.
FIG. 38
FIG. 3 shows the coding sequence of the hexahistidine-TAT-apoptin fusion protein. The sequences of both DNA (SEQ ID NO: 59) and protein (SEQ ID NO: 60) are shown.
FIG. 39
FIG. 3 shows the efficacy of VNP20009 / cytoxane combination treatment on M27 lung cancer growth in C57BL / 6 mice.
FIG. 40
FIG. 2 shows the efficacy of VNP20009 / mitomycin combination treatment on M27 lung cancer growth in C57BL / 6 mice.
FIG. 41
FIG. 3 shows the efficacy of VNP20009 / cisplatin combination treatment on M27 lung cancer growth in C57BL / 6 mice.

Claims (99)

An attenuated tumor-targeted bacterium that is a facultative aerobic bacterium or a facultative anaerobic bacterium, comprising one or more nucleic acid molecules encoding one or more primary effector molecules operably linked to one or more promoters. A facultative aerobic bacterium or facultative anaerobic comprising one or more nucleic acid molecules encoding one or more primary effector molecules and one or more secondary effector molecules operably linked to one or more promoters An attenuated tumor target bacterium that is a bacterium. 3. The attenuated tumor target bacterium according to claim 1 or 2, wherein at least one of the primary effector molecules is a member of the TNF family. A member of the TNF family is composed of tumor necrosis factor α (TNF-α), tumor necrosis factor β (TNF-β), TNF-α-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL), cytokines induced by TNF-α-related activation ( TRANCE), TNF-α-related weak apoptosis inducer (TWEAK), CD40 ligand (CD40L), LT-α, LT-β, OX40L, CD40L, FasL, CD27L, CD30L, 4-1BBL, APRIL, LIGHT, TL1, 4. The attenuated tumor target bacterium according to claim 3, which is TNFSF16, TNFSF17, or AITR-L. 3. The attenuated tumor targeting bacterium according to claim 1 or 2, wherein at least one of the primary effector molecules is an anti-angiogenic factor. Anti-angiogenic factors include endostatin, angiostatin, anti-angiogenic antithrombin III, 29 kDa N-terminal and 40 kDa C-terminal proteolytic fragments of fibronectin, uPA receptor antagonist, 16 kDa proteolytic fragment of prolactin, 7 of platelet factor 4 0.8 kDa proteolytic fragment, anti-angiogenic 24 amino acid fragment of platelet factor 4, anti-angiogenic factor designated as 13.40, anti-angiogenic 22 amino acid peptide fragment of thrombospondin I, anti-angiogenic 20 amino acid peptide fragment of SPARC , a peptide antagonist of the peptide, laminin, fibronectin, small anti-angiogenic peptides of procollagen or EGF or integrin alpha _v beta ₃ or VEGF receptor, including RGD and NGR, Attenuated tumor target bacterium according to Motomeko 5. 3. The attenuated tumor target bacterium of claim 1 or 2, wherein at least one of the primary effector molecules is a member of the bacteriocin family, provided that the bacteriocin is not a BRP. The members of the bacteriocin family are ColE1, ColE1a, ColE1b, ColE2, ColE3, ColE4, ColE5, ColE6, ColE7, ColE8, ColE9, colicin A, colicin K, colicin L, colicin M, cloasin DF13, pesticin A1122. The attenuated tumor target bacterium according to claim 7, which is syn 1580, butyricin 7423, pyocin R1 or AP41, megacin A-216, vibriosin, or microcin M15. 3. The attenuated tumor-target bacterium according to claim 1 or 2, wherein the primary effector molecule is a tumor-inhibiting enzyme. 10. The attenuated tumor-target bacterium according to claim 9, wherein the tumor-inhibiting enzyme is methionase, asparaginase, lipase, phospholipase, protease, DNAase, or glycosidase. The attenuated tumor target bacterium according to claim 1 or 2, wherein the primary effector molecule is hemolysin, verotoxin, CNF1, CNF2, or PMT. 3. The attenuated tumor target bacterium according to claim 1 or 2, wherein the primary effector molecule is derived from an animal, a plant, a bacterium, or a virus. 3. The attenuated tumor-targeting bacterium according to claim 2, wherein the secondary effector molecule is an immunomodulator, an antitumor protein, a prodrug converting enzyme, an antisense molecule, a ribozyme, or an antigen. The attenuated tumor target bacterium according to claim 1 or 2, wherein the attenuated tumor target bacterium is Salmonella. 2. The attenuated tumor target bacterium of claim 1, wherein the attenuated tumor target bacterium further comprises an enhanced release system. 3. The attenuated tumor-target bacterium according to claim 2, wherein the secondary effector molecule is a bacteriocin-releasing factor (BRP). An attenuated tumor-targeting bacterium that is a facultative aerobic bacterium or a facultative anaerobic bacterium, comprising one or more nucleic acid molecules encoding one or more fusion proteins operably linked to one or more promoters. Wherein the fusion protein comprises a signal sequence and an effector molecule. An attenuated tumor-targeting bacterium that is a facultative aerobic bacterium or a facultative anaerobic bacterium, comprising one or more nucleic acid molecules encoding one or more fusion proteins operably linked to one or more promoters. And the fusion protein comprises a ferry peptide and an effector molecule. 20. The attenuated tumor targeting bacterium of claim 18, wherein the fusion protein further comprises a signal sequence. 20. The attenuated tumor target bacterium according to claim 17 or 19, wherein the signal sequence is an OmpA-like protein. The ferry peptide is derived from HIV TAT protein, antennapedia homeodomain (penetraxin), Kaposi fibroblast growth factor (FGF) membrane translocating sequence (MTS), herpes simplex virus VP22, hexahistidine, hexalysine, or hexaarginine 20. The attenuated tumor target bacterium according to claim 13 or 19. 20. The attenuated tumor target bacterium according to claim 17, 18 or 19, wherein the effector molecule is a primary or secondary effector molecule. 20. The attenuated tumor of claim 17, 18, or 19, wherein the attenuated tumor target bacterium further comprises one or more nucleic acid molecules encoding one or more effector molecules operably linked to one or more promoters. Tumor target bacteria. 24. The attenuated tumor-target bacterium of claim 23, wherein the effector molecule is a primary or secondary effector molecule. A facultative aerobic or anaerobic bacterium comprising a pharmaceutically acceptable carrier and one or more nucleic acid molecules encoding one or more primary effector molecules operably linked to one or more promoters. And a certain attenuated tumor target bacterium. A facultative carrier comprising a pharmaceutically acceptable carrier and one or more nucleic acid molecules encoding one or more primary effector molecules and one or more secondary effector molecules operably linked to one or more promoters. An attenuated tumor target bacterium which is an aerobic bacterium or a facultative anaerobic bacterium. 27. The pharmaceutical composition according to claim 25 or 26, wherein at least one of the primary effector molecules is a member of the TNF family. A member of the TNF family is composed of tumor necrosis factor α (TNF-α), tumor necrosis factor β (TNF-β), TNF-α-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL), cytokines induced by TNF-α-related activation ( TRANCE), TNF-α-related weak apoptosis inducer (TWEAK), CD40 ligand (CD40L), LT-α, LT-β, OX40L, CD40L, FasL, CD27L, CD30L, 4-1BBL, APRIL, LIGHT, TL1, 28. The pharmaceutical composition according to claim 27, which is TNFSF16, TNFSF17, or AITR-L. 27. The pharmaceutical composition according to claim 25 or 26, wherein at least one of the primary effector molecules is an anti-angiogenic factor. Anti-angiogenic factors include endostatin, angiostatin, anti-angiogenic antithrombin III, 29 kDa N-terminal and 40 kDa C-terminal proteolytic fragments of fibronectin, uPA receptor antagonist, 16 kDa proteolytic fragment of prolactin, 7 of platelet factor 4 0.8 kDa proteolytic fragment, anti-angiogenic 24 amino acid fragment of platelet factor 4, anti-angiogenic factor designated as 13.40, anti-angiogenic 22 amino acid peptide fragment of thrombospondin I, anti-angiogenic 20 amino acid peptide fragment of SPARC , a peptide antagonist of the peptide, laminin, fibronectin, small anti-angiogenic peptides of procollagen or EGF or integrin alpha _v beta ₃ or VEGF receptor, including RGD and NGR, The pharmaceutical composition according to Motomeko 29. 27. The pharmaceutical composition according to claim 25 or 26, wherein at least one of the primary effector molecules is a member of the bacteriocin family, except that the bacteriocin is not a BRP. The members of the bacteriocin family are ColE1, ColE1a, ColE1b, ColE2, ColE3, ColE4, ColE5, ColE6, ColE7, ColE8, ColE9, colicin A, colicin K, colicin L, colicin M, cloasin DF13, pesticin A1122. 32. The pharmaceutical composition according to claim 31, which is syn 1580, butyricin 7423, pyocin Rl or AP41, megacin A-216, vibriosin, or microcin M15. 27. The pharmaceutical composition according to claim 25 or 26, wherein the primary effector molecule is a tumor inhibiting enzyme. 34. The pharmaceutical composition according to claim 33, wherein the tumor inhibitory enzyme is methionase, asparaginase, lipase, phospholipase, protease, DNAase, or glycosidase. 27. The pharmaceutical composition according to claim 25 or 26, wherein the at least one primary effector molecule is hemolysin, verotoxin, CNF1, CNF2, or PMT. 27. The pharmaceutical composition according to claim 25 or 26, wherein the primary effector molecule is derived from an animal, a plant, a bacterium, or a virus. 27. The pharmaceutical composition according to claim 26, wherein the secondary effector molecule is an immunomodulator, an anti-tumor protein, a prodrug converting enzyme, an antisense molecule, a ribozyme, or an antigen. The pharmaceutical composition according to claim 25 or 26, wherein the attenuated tumor target bacterium is Salmonella. 26. The pharmaceutical composition of claim 25, wherein the attenuated tumor target bacterium further comprises an enhanced release system. 27. The pharmaceutical composition according to claim 26, wherein the secondary effector molecule is a bacteriocin releasing factor. A facultative aerobic bacterium or a facultative anaerobic bacterium comprising a pharmaceutically acceptable carrier and one or more nucleic acid molecules encoding one or more fusion proteins operably linked to one or more promoters. A pharmaceutical composition comprising an attenuated tumor target bacterium, wherein the fusion protein comprises a signal sequence and an effector molecule. A facultative aerobic bacterium or a facultative anaerobic bacterium comprising a pharmaceutically acceptable carrier and one or more nucleic acid molecules encoding one or more fusion proteins operably linked to one or more promoters. A pharmaceutical composition comprising an attenuated tumor target bacterium, wherein the fusion protein comprises a ferry peptide and an effector molecule. 43. The pharmaceutical composition according to claim 42, wherein the fusion protein further comprises a signal sequence. 44. The pharmaceutical composition according to claim 41 or 43, wherein the signal sequence is an OmpA-like protein. The ferry peptide is derived from HIV TAT protein, antennapedia homeodomain (penetraxin), Kaposi fibroblast growth factor (FGF) membrane translocating sequence (MTS), herpes simplex virus VP22, hexahistidine, hexalysine, or hexaarginine A pharmaceutical composition according to claim 42 or 43. 44. The pharmaceutical composition according to claim 41, 42 or 43, wherein the effector molecule is a primary or secondary effector molecule. 44. The pharmaceutical composition of claim 41, 42 or 43, wherein the attenuated tumor target bacterium further comprises one or more nucleic acid molecules encoding one or more effector molecules operably linked to one or more promoters. object. A method of delivering one or more primary effector molecules to a subject in need of such treatment for the treatment of solid tumor cancer, comprising the steps of: providing a pharmaceutically acceptable carrier and one or more promoters functionally. Administering an attenuated tumor target bacterium that is a facultative aerobic bacterium or a facultative anaerobic bacterium comprising one or more nucleic acid molecules encoding one or more primary effector molecules linked to the bacterium. The above method comprising: A method of delivering one or more primary effector molecules and one or more secondary effector molecules to a subject in need of such treatment for the treatment of a solid tumor cancer, comprising: a pharmaceutically acceptable carrier; Facultative aerobic bacteria or facultative anaerobics, comprising one or more nucleic acid molecules encoding one or more primary effector molecules and one or more secondary effector molecules operably linked to one or more promoters Administering a pharmaceutical composition comprising an attenuated tumor target bacterium that is a bacterium. 50. The method of claim 48 or 49, wherein at least one of the primary effector molecules is a member of the TNF family. A member of the TNF family is composed of tumor necrosis factor α (TNF-α), tumor necrosis factor β (TNF-β), TNF-α-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL), cytokines induced by TNF-α-related activation ( TRANCE), TNF-α-related weak apoptosis inducer (TWEAK), CD40 ligand (CD40L), LT-α, LT-β, OX40L, CD40L, FasL, CD27L, CD30L, 4-1BBL, APRIL, LIGHT, TL1, 51. The method of claim 50, wherein the method is TNFSF16, TNFSF17, or AITR-L. 50. The method of claim 48 or 49, wherein at least one of the primary effector molecules is an anti-angiogenic factor. Anti-angiogenic factors include endostatin, angiostatin, anti-angiogenic antithrombin III, 29 kDa N-terminal and 40 kDa C-terminal proteolytic fragments of fibronectin, uPA receptor antagonist, 16 kDa proteolytic fragment of prolactin, 7 of platelet factor 4 0.8 kDa proteolytic fragment, anti-angiogenic 24 amino acid fragment of platelet factor 4, anti-angiogenic factor designated as 13.40, anti-angiogenic 22 amino acid peptide fragment of thrombospondin I, anti-angiogenic 20 amino acid peptide fragment of SPARC , a peptide antagonist of the peptide, laminin, fibronectin, small anti-angiogenic peptides of procollagen or EGF or integrin alpha _v beta ₃ or VEGF receptor, including RGD and NGR, The method according to Motomeko 52. 50. The method of claim 48 or 49, wherein at least one of the primary effector molecules is a member of the bacteriocin family, except that the bacteriocin is not a BRP. The members of the bacteriocin family are ColE1, ColE1a, ColE1b, ColE2, ColE3, ColE4, ColE5, ColE6, ColE7, ColE8, ColE9, colicin A, colicin K, colicin L, colicin M, cloasin DF13, pesticin A1122. 55. The method of claim 54, wherein the method is syn 1580, butyricin 7423, pyocin Rl or AP41, megacin A-216, vibriosin, or microcin M15. 50. The method of claim 48 or 49, wherein at least one of the primary effector molecules is a tumor inhibiting enzyme. 57. The method of claim 56, wherein the tumor inhibiting enzyme is a methionase, asparaginase, lipase, phospholipase, protease, DNAase, or glycosidase. 50. The method of claim 48 or 49, wherein at least one of the primary effector molecules is hemolysin, verotoxin, CNF1, CNF2, or PMT. 50. The method of claim 48 or 49, wherein at least one of the primary effector molecules is from an animal, plant, bacterium, or virus. 50. The method of claim 49, wherein at least one of the secondary effector molecules is an anti-tumor protein, a prodrug converting enzyme, an antisense molecule, a ribozyme, or an antigen. 50. The method of claim 48 or 49, wherein the attenuated tumor target bacterium is Salmonella. 49. The method of claim 48, wherein the attenuated tumor target bacterium further comprises an enhanced release system. 50. The method of claim 49, wherein the secondary effector molecule is a bacteriocin releasing factor. A method of delivering one or more fusion proteins to a subject in need of such treatment for the treatment of solid tumor cancer, comprising the steps of: providing a pharmaceutically acceptable carrier and one or more promoters functionally. Administering a pharmaceutical composition comprising a facultative aerobic bacterium or a facultative anaerobic attenuated tumor target bacterium comprising one or more nucleic acid molecules encoding one or more fusion proteins linked thereto. Wherein the fusion protein comprises a signal sequence and an effector molecule. A method of delivering one or more fusion proteins to a subject in need of such treatment for the treatment of solid tumor cancer, comprising the steps of: providing a pharmaceutically acceptable carrier and one or more promoters functionally. Administering a pharmaceutical composition comprising a facultative aerobic bacterium or a facultative anaerobic attenuated tumor target bacterium comprising one or more nucleic acid molecules encoding one or more fusion proteins linked thereto. Wherein the fusion protein comprises a ferry peptide and an effector molecule. 66. The method of claim 65, wherein the fusion protein further comprises a signal sequence. 67. The method according to claim 64 or 66, wherein the signal sequence is an OmpA-like protein. The ferry peptide is derived from HIV TAT protein, antennapedia homeodomain (penetraxin), Kaposi fibroblast growth factor (FGF) membrane translocating sequence (MTS), herpes simplex virus VP22, hexahistidine, hexalysine, or hexaarginine 67. The method of claim 65 or 66. 67. The method of claim 64, 65 or 66, wherein the effector molecule is a primary or secondary effector molecule. 67. The method of claim 64, 65 or 66, wherein the attenuated tumor target bacterium further comprises one or more nucleic acid molecules encoding one or more effector molecules operably linked to one or more promoters. A method of treating a solid tumor cancer in an animal comprising: a pharmaceutically acceptable carrier and one or more nucleic acid molecules encoding one or more primary effector molecules operably linked to one or more promoters. A pharmaceutical composition comprising a facultative aerobic bacterium or an attenuated tumor target bacterium that is a facultative anaerobic bacterium, and administering one or more chemotherapeutic agents. A method of treating a solid tumor cancer in an animal, comprising: a pharmaceutically acceptable carrier, one or more primary effector molecules and one or more secondary effector molecules operably linked to one or more promoters. Administering a facultative aerobic bacterium or an attenuated tumor target bacterium that is a facultative anaerobic bacterium containing one or more nucleic acid molecules encoding the bacterium, and administering one or more chemotherapeutic agents. The above method comprising: 73. The method of claim 71 or 72, wherein at least one of the primary effector molecules is a member of the TNF family. A member of the TNF family is composed of tumor necrosis factor α (TNF-α), tumor necrosis factor β (TNF-β), TNF-α-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL), cytokines induced by TNF-α-related activation ( TRANCE), TNF-α-related weak apoptosis inducer (TWEAK), CD40 ligand (CD40L), LT-α, LT-β, OX40L, CD40L, FasL, CD27L, CD30L, 4-1BBL, APRIL, LIGHT, TL1, 74. The method of claim 73, wherein the method is TNFSF16, TNFSF17, or AITR-L. 73. The method of claim 71 or 72, wherein at least one of the primary effector molecules is an anti-angiogenic factor. Anti-angiogenic factors include endostatin, angiostatin, anti-angiogenic antithrombin III, 29 kDa N-terminal and 40 kDa C-terminal proteolytic fragments of fibronectin, uPA receptor antagonist, 16 kDa proteolytic fragment of prolactin, 7 of platelet factor 4 0.8 kDa proteolytic fragment, anti-angiogenic 24 amino acid fragment of platelet factor 4, anti-angiogenic factor designated as 13.40, anti-angiogenic 22 amino acid peptide fragment of thrombospondin I, anti-angiogenic 20 amino acid peptide fragment of SPARC , a peptide antagonist of the peptide, laminin, fibronectin, small anti-angiogenic peptides of procollagen or EGF or integrin alpha _v beta ₃ or VEGF receptor, including RGD and NGR, The method according to Motomeko 75. 73. The method of claim 71 or 72, wherein at least one of the primary effector molecules is a member of the bacteriocin family, except that the bacteriocin is not a BRP. The members of the bacteriocin family are ColE1, ColE1a, ColE1b, ColE2, ColE3, ColE4, ColE5, ColE6, ColE7, ColE8, ColE9, colicin A, colicin K, colicin L, colicin M, cloasin DF13, pesticin A1122. 78. The method of claim 77, wherein the method is syn 1580, butyricin 7423, pyocin Rl or AP41, megacin A-216, vibriosin, or microcin M15. 73. The method of claim 71 or 72, wherein at least one of the primary effector molecules is a tumor inhibiting enzyme. 80. The method of claim 79, wherein the tumor inhibiting enzyme is a methionase, asparaginase, lipase, phospholipase, protease, DNAase, or glycosidase. 73. The method of claim 71 or 72, wherein at least one of the primary effector molecules is hemolysin, verotoxin, CNF1, CNF2, or PMT. 73. The method of claim 71 or 72, wherein the primary effector molecule is from an animal, plant, bacterium, or virus. 83. The method of claim 82, wherein the secondary effector molecule is an immunomodulator, an anti-tumor protein, a prodrug converting enzyme, an antisense molecule, a ribozyme, or an antigen. 73. The method of claim 71 or 72, wherein the attenuated tumor target bacterium is Salmonella. 72. The method of claim 71, wherein the attenuated tumor target bacterium further comprises an enhanced release system. 73. The method of claim 72, wherein the secondary effector molecule is a bacteriocin releasing factor. A method of treating a solid tumor cancer in an animal comprising a pharmaceutically acceptable carrier and one or more nucleic acid molecules encoding one or more fusion proteins operably linked to one or more promoters. Administering an attenuated tumor target bacterium that is a facultative aerobic bacterium or a facultative anaerobic bacterium, and one or more chemotherapeutic agents, the fusion protein comprising a signal sequence. And the effector molecule. A method of treating a solid tumor cancer in an animal comprising a pharmaceutically acceptable carrier and one or more nucleic acid molecules encoding one or more fusion proteins operably linked to one or more promoters. And administering an attenuated tumor target bacterium that is a facultative aerobic bacterium or a facultative anaerobic bacterium, and one or more chemotherapeutic agents, wherein the fusion protein is a ferry peptide. And the effector molecule. 89. The method of claim 88, wherein the fusion protein further comprises a signal sequence. The method according to claim 87 or 89, wherein the signal sequence is an OmpA-like protein. The ferry peptide is derived from HIV TAT protein, antennapedia homeodomain (penetraxin), Kaposi fibroblast growth factor (FGF) membrane translocating sequence (MTS), herpes simplex virus VP22, hexahistidine, hexalysine, or hexaarginine A method according to claim 88 or 89. 90. The method of claim 87, 88 or 89, wherein the effector molecule is a primary or secondary effector molecule. 90. The method of claim 87, 88 or 89, wherein the attenuated tumor target bacterium further comprises one or more nucleic acid molecules encoding one or more effector molecules operably linked to one or more promoters. A method of treating a solid tumor cancer in an animal, comprising administering a pharmaceutical composition comprising a pharmaceutically acceptable carrier and an attenuated tumor target bacterium, and one or more chemotherapeutic agents. The above method. A fusion protein consisting of an OmpA-like protein and an effector molecule. A fusion protein consisting of a signal sequence, a ferry peptide and an effector molecule. 97. The fusion protein according to claim 96, wherein the signal sequence is an OmpA-like protein. Ferry peptide is derived from HIV TAT protein, antennapedia homeodomain (penetraxin), Kaposi fibroblast growth factor (FGF) membrane translocating sequence (MTS), herpes simplex virus VP22, hexahistidine, hexalysine, or hexaarginine The fusion protein of claim 96. 97. The fusion protein according to claim 95 or 96, wherein the effector molecule is a primary or secondary effector molecule.

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