JP2004321115A

JP2004321115A - Method for introducing foreign material locally in organism and use thereof

Info

Publication number: JP2004321115A
Application number: JP2003122940A
Authority: JP
Inventors: Masamichi Yamamoto; 正道山本; Chikara Meya; 主税目野; Hiroshi Hamada; 博司濱田
Original assignee: Japan Science and Technology Agency
Current assignee: Japan Science and Technology Agency
Priority date: 2003-04-25
Filing date: 2003-04-25
Publication date: 2004-11-18

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a method for introducing a foreign material locally in an organism and the use of the method. <P>SOLUTION: A liquid containing a composite material composed of a substance interacting with a cell and a foreign material is introduced into or ejected against the objective region in an organism to introduce the foreign material into a cell of the objective region. The method is a practical method for easily and surely introducing a foreign material to the objective region in high efficiency, reproducibility and safety at a low cost. <P>COPYRIGHT: (C)2005,JPO&NCIPI

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、生体内における目的の領域の細胞に外来物質を導入する方法であって、外来物質を高効率で安全で簡便に導入する方法、その方法に関する一連の技術、およびその利用に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
昨今のバイオテクノロジーの発展は目覚しく、このような状況下、細胞への核酸等の物質の導入は、細胞を操作するための有用な方法であって、分子生物学や臨床医学等において大きな可能性を有している。
【０００３】
例えば、生体において、細胞に遺伝子を導入するための遺伝子導入法には、レトロウイルスベクターまたはアデノウイルスベクターのようなウイルスベクターを用いる生物学的方法、エレクトロポーレーション（電気穿孔）法、マイクロインジェクション法、プロトプラスト融合法、リン酸カルシウム法等がある。
【０００４】
遺伝子導入において、特に生体に対して実験的、更には臨床的に利用するとき、「導入効率」「安全性」「再現性」「簡便性」「実用性」などが重要なキーワードとしてあげられ、これらが高いことが望まれる。また「安価である」ことも重要である。ここでいう「安全性」とは導入により遺伝子以外の物理的及び化学的影響を細胞に与え無いという意味である。
【０００５】
しかし、ウイルスベクター等を用いる生物学的方法では、成熟リンパ球などの特定の細胞にしか遺伝子を導入することはできず、導入できる遺伝子の大きさにも限界がある。また、抗原性、宿主に対する毒性の心配があったり、ベクター作製に大変時間や労力がかかるといった問題もある。
【０００６】
また、エレクトロポーレーション法では、細胞に電気的なショックを与えて細胞に変形を起こして遺伝子を導入するため危険であり、遺伝子導入効率がよい時の条件は細胞の瀕死状態であるため、安全性が確保されない。さらに、他の遺伝子導入方法を用いても、高い導入効率、高い安全性、及び高い再現性を持って導入することは難しく、問題点は多い。
【０００７】
上記問題点を改善するために、人口ベクターとしてリポソームを用いたリポフェクション法が研究開発されている。リポフェクション法は、細胞膜に類似したリポソームと遺伝子とからなる複合体を細胞に取り込ませて、遺伝子を導入する方法である。そのため、上記の他の遺伝子導入法と比較し、遺伝子導入時の細胞へのダメージが少なく、ｉｎｖｉｔｒｏにおける培養細胞への遺伝子導入に用いられてきた。
【０００８】
リポフェクション法の利点として、例えば、（１）リポソームを構成するリン脂質は、生体膜の主要構成成分であるため毒性が低い、（２）操作が比較的簡便で様々な細胞に適用することができる、（３）導入する核酸等の物質のサイズや、導入先である標的細胞、導入目的、導入方法等に対応して、リポソームの粒子サイズをコントロールしたり、リポソームを標的細胞と相互作用を起こしやすいように改良できる、（４）導入時に電圧印加する必要がなく安全である、といった点が挙げられる。
【０００９】
リポフェクション法は、上記のように、主としてｉｎｖｉｔｒｏにおける培養細胞への遺伝子導入に用いられてきた。また、このリポフェクション法用いた生体内への遺伝子導入方法については、下記の特許文献１〜７等において提案されている。
【００１０】
【特許文献１】
国際公開ＷＯ９７／１７８４４号公報（国際公開１９９７年５月２２日）
【００１１】
【特許文献２】
特表２００２−５０８３３７号（公表２００２年３月１９日）
【００１２】
【特許文献３】
特開２００２−２４１３１３号公報（公開２００２年８月２８日）
【００１３】
【特許文献４】
特表２００１−５２３４６８号（公表２００１年１１月２７日）
【００１４】
【特許文献５】
特表平９−５０５５９３号（公表１９９７年６月３日）
【００１５】
【特許文献６】
国際公開ＷＯ９７／１７８４３号公報（国際公開１９９７年５月２２日）
【００１６】
【特許文献７】
特表２００２−５２５２７０号（公表２００２年８月１３日）
【００１７】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、上記のようなリポフェクション法を用いた従来の遺伝子導入法では、未だに実用性に欠ける点が残されているという問題がある。例えば、リポフェクション法を用いた従来の生体内への遺伝子導入方法では、静脈、動脈、腹腔内、羊水、等に遺伝子と結合したリポソームを注入することで遺伝子導入を行っている。そのため、生体内において目的の領域に確実に遺伝子を導入することは困難であり、導入の効率が低い。
【００１８】
また、最近は遺伝子のみにとどまらず、薬剤としての低分子化合物やタンパク質などをリポソームと結合させた複合体を細胞内に導入する方法も提案されているが、このような遺伝子以外の物質を生体内の微細領域に局所的に導入する方法は開発されていない。
【００１９】
本発明は、上記の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、高い導入効率を持って、さらに安全に簡便で再現性よく、安価に、つまり高い実用性を持って、生体内の目的の領域に確実に外来物質を導入する方法を提供することにある。さらに本発明は、当該方法の様々な利用方法等についても提供する。
【００２０】
【課題を解決するための手段】
本願発明者等は、従来の技術が抱える上記技術的困難さを克服するために、鋭意研究を重ねた結果、リポフェクション法を用いて、マウス胚の微細領域に局所的に高効率で遺伝子導入を実現する新たな方法を開発した。その結果、医学上または産業上有用な方法・物質として、下記Ａ）〜Ｑ）の発明を完成するに至った。
【００２１】
Ａ）生体内に局所的に外来物質を導入するときに、細胞表面と相互作用を起こす物質と上記外来物質との複合体を含んだ複合体含有液を、管状部材の先端から生体内の目的の領域に、注入する、または吹きつけることにより、上記目的の領域の細胞内に上記外来物質を導入することを特徴とする導入方法。
【００２２】
Ｂ）上記Ａ）の導入方法において、上記生体内の目的の領域とは、生体内の細胞空間であるとともに、上記複合体含有液を生体内の目的の領域に注入する場合には、上記管状部材を生体内の細胞空間に突き刺し、上記複合体含有液を充填した構造が、生体内の細胞空間に形成されるように、上記管状部材の先端から生体内の目的の領域に注入することを特徴とする導入方法。
【００２３】
Ｃ）上記Ａ）の導入方法において、上記複合体含有液を生体内の目的の領域に吹きつける場合には、上記管状部材の先端を上記生体の表面にあてがい、上記複合体含有液を上記管状部材の先端から上記生体の表面に吐出させることを特徴とする導入方法。
【００２４】
Ｄ）上記Ａ）〜Ｃ）の何れかの導入方法において、１７０μｍ^３以上１４００μｍ^３以下の微細領域に対して、上記外来物質を導入することを特徴とする導入方法。
【００２５】
Ｅ）上記Ａ〜Ｄ）の何れかの導入方法において、上記管状部材の先端の内径が、上記複合体の大きさ以上であることを特徴とする導入方法。
【００２６】
Ｆ）上記Ａ〜Ｄ）の何れかの導入方法において、上記管状部材の先端の内径が、５０ｎｍ以上であることを特徴とする導入方法。
【００２７】
Ｇ）上記Ａ）〜Ｆ）の何れかの導入方法において、上記外来物質が、核酸、タンパク質、化学物質の少なくとも何れかであることを特徴とする導入方法。
【００２８】
Ｈ）上記Ｇ）の導入方法において、上記核酸が、ＤＮＡ、ＲＮＡ、染色体そのものの少なくとも何れかであることを特徴とする導入方法。
【００２９】
Ｉ）上記Ａ）〜Ｈ）の何れかの導入方法において、上記外来物質には、生体内へ導入したい外来物質に加え、さらに、導入したい外来物質が導入されたことを確認するための指標となりうる指示物質が含まれることを特徴とする導入方法。
【００３０】
Ｊ）上記Ａ）〜Ｉ）の何れかの導入方法において、上記細胞表面を相互作用を起こす物質が、リポソームであることを特徴とする導入方法。
【００３１】
Ｋ）上記Ａ）〜Ｊ）の何れかの導入方法において、上記生体が、哺乳動物の胚または成体であることを特徴とする導入方法。
【００３２】
Ｌ）上記Ａ）〜Ｋ）のいずれかの導入方法で外来物質を導入してなる形質転換体。
【００３３】
Ｍ）哺乳動物の胚または成体である上記Ｌ）に記載の形質転換体。
【００３４】
Ｎ）上記Ａ）〜Ｋ）の何れかの導入方法を行うための導入用キット。
【００３５】
Ｏ）上記Ａ）〜Ｋ）の何れかの導入方法を用いた疾患の治療方法。
【００３６】
Ｐ）上記Ｏ）の治療方法に使用され、上記Ａ）記載の複合体含有液を含んでなる治療薬。
【００３７】
Ｑ）上記Ｏ）の治療方法を行うための治療用キット。
【００３８】
本発明において、「目的の領域」とは、「外来物質を導入する標的細胞が存在する領域」のことであり、これは、肺・心臓・腎臓などの特定の組織や器官であってもよいが、例えば、肺の中のガン化した細胞等のようにターゲットをしぼった細胞（群）であってもかまわない。よって、「目的の領域」を制限する範囲は、その状況下で見ることが可能な１つ以上の細胞（群）である。なお、上記状況下とは、肉眼で観察することのできる状況下でもかまわないが、顕微鏡下やＭＲＩの下等であってもかまわない。
【００３９】
また、本発明に係る導入方法を用いて「複合体含有液を充填した構造」を形成させるとは、複合体含有液が蓄積された「水たまり構造」を細胞空間に形成させることを意味する。
【００４０】
ここで、「水たまり構造」について説明する。生物は細胞の塊なので、３次元的に必ずどこかの面で細胞同士が接触している。細胞が４つ以上集まれれば、安定な構造を形成し、それらは必ず立方体のような形を全体で形成する。そのため、その立方体の重心には３次元的に細胞に取り囲まれた空間ができる。この空間に液を注入すると、周りが細胞に囲まれた、液が蓄積された空間ができる。あるいは、細胞に液を注入すると、限界以上に注入された細胞は破裂するが、破裂した細胞のあった場所は液が蓄積された空間となる。この液が蓄積された空間の構造を、「水たまり構造」と定義する。
【００４１】
複合体含有液を充填させた管状部材を生体内の細胞空間に突き刺し、「複合体含有液を充填した構造」、つまり「水たまり構造」を形成するように、上記管状部材の先端から、複合体含有液を注入すると、上記複合体を含んだ液と目的領域の細胞（標的細胞）とを接触させることができる。よって、目的の領域の細胞内に外来物質を、確実に導入することができる。なお、哺乳類を代表とする生物は、数え切れないほど多数の細胞の集団を用いて各臓器やガン細胞群などを形成している。よって、これらの細胞群中の空間、あるいは細胞に液を注入した場合、「水たまり構造」を形成することができる。
【００４２】
本発明を用いれば、高い導入効率を持って、さらに安全に簡便で再現性よく安価に、生体内の目的領域の細胞に、核酸、タンパク質、化学物質等の外来物資を確実に導入することができる。
【００４３】
【発明の実施の形態】
本発明の実施の一形態について、以下で説明する。なお、本発明は以下の記載に限定されるものではない。
【００４４】
（１）複合体含有液の作製
初めに、細胞表面と相互作用する物質と外来物質との複合体を含む複合体含有液を作製する。
【００４５】
本発明に係る導入方法を用いて生体に導入する外来物質の一例として、核酸、そのなかでも、遺伝子が挙げられる。しかし生体に導入する外来物質は、これに限定されず、遺伝子の他にも、抗体や酵素等のタンパク質、染色体そのものや、化学的薬剤等、細胞に導入できるものであればかまわない。
【００４６】
生体に導入する遺伝子は、構造遺伝子や相同組換えに必要な塩基配列を付加した遺伝子、それらを含有するベクターのようなものであってもよいし、プローブやアンチセンスのようなものでもよい。各種疾患治療用遺伝子など、あらゆる種類の遺伝子であってかまわない。また、ＤＮＡであってもよいし、ＲＮＡであってもよい。ＤＮＡやＲＮＡは１本鎖であっても２本鎖であってもかまわない。なお、遺伝子に、指標物質（選択マーカー）が組み込まれていると、遺伝子が生体内の目的の領域の細胞に導入されたことを確認するのに便利である。また、実験等においては、指標物質そのものを外来物質として、本発明に係る導入方法を用いて導入を行ってもよい。
【００４７】
本発明に係る導入方法を用いる際に使用される細胞表面と相互作用を起こす物質の一例として、リポソーム（脂質小胞）が挙げられる。外来物質を導入するための、リポソームとして使用するものは、例えば、小胞内に外来物質を封入するリポフェクトアミンや、表面に外来物質を結合させて複合体を形成する陽イオンリポソーム、外来物質を内部に保持させ、表面には標的細胞の抗原に結合する特定の抗体を結合させるイムノリポソーム等が挙げられる。なお、これらに限定されることはない。
【００４８】
さらに、特定の温度やｐＨで保持した外来物質を放出する、温度感受性リポソームやｐＨ感受性リポソーム、体内で異物認識されにくいようにシアル酸やポリエチレングリコールで表面修飾した血中滞留型リポソーム等のように様々な特性を持っていてもよいし、導入する遺伝子のサイズや、導入先である細胞、導入目的、導入方法等に応じてリポソームを改良してもよい。
【００４９】
なお、細胞表面と相互作用を起こす物質としては、リポソームに限られず、これ以外にも、細胞と融合することのできる外来物質運搬体を用いて、外来物質を導入してもかまわない。
【００５０】
上記のように、細胞表面と相互作用を起こす物質としてリポソームを用いた場合には、複合体含有液はリポソーム液に相当する。もちろん、複合体含有液はこれに限定されない。複合体含有液は、血清を含有していなければ、細胞への外来物質の導入効率を上げることができるため好ましい。
【００５１】
リポソームと遺伝子との複合体を含む複合体含有液であるリポソーム液は、公知の方法を用いて調製すればよい。例えば、リポソームを懸濁用溶媒に入れて懸濁し、遺伝子を懸濁用溶媒に入れて懸濁し、これら２つの溶液を混合して放置することで、リポソームに遺伝子を取り込ませ、リポソームと遺伝子との複合体を形成させ、リポソーム液を調製する。この懸濁用の溶媒として、例えば、Ｈ_２Ｏや、５％グルコース等があげられるが、これに限定されない。また、リポソーム液の調製方法も、上記方法には限定されない。また、リポソームと遺伝子（ＤＮＡ）の複合体を形成させる際に、リポソームと遺伝子（ＤＮＡ）との重量比は１：０．８であることが好ましいが、これらに限定はされない。また、リポソーム液中の複合体の割合は１．８μｇ／５０μｌであることが好ましいが、これに限定はされない。
【００５２】
なお、リポフェクション法に用いられる試薬等は、様々なキットとして入手可能であり、比較的簡単に、再現性良く様々な細胞に適用できることがうたわれているので、これらキットを用いてもかまわない。
【００５３】
（２）遺伝子導入
本発明に係る導入方法を用いて核酸等の物質を導入する個体の組織に関して、規制はない。よって、核酸等の物質を導入する「目的の領域」とは、肺・心臓・腎臓などの特定の組織や器官であってもよいが、例えば、肺の中の癌化した細胞等のターゲットをしぼった細胞でもかまわない。なお、「目的の領域」を制限する範囲は、その状況下で見ることが可能な１つの細胞以上の細胞（群）である。ここで、上記状況下とは、肉眼で観察することのできる状況下でもかまわないが、顕微鏡下やＭＲＩの下等であってもかまわない。よって、本発明に係る導入方法を用いると、「目的の領域」として、１７０μｍ^３以上の領域、特に好ましくは、１７０μｍ^３以上１４００μｍ^３以下の領域に対して外来物質を導入することができる。
【００５４】
本発明に係る導入方法を用いて遺伝子導入を行う目的の領域の細胞は、全ての動植物の細胞膜を持つあらゆる細胞が対象とすることができる。また、上記目的の領域の細胞は単一のものでも、種々の細胞が混在したものであってもかまわない。例えば、実験として用いるには、分化全能性を持つ受精卵や胚内の細胞が好ましい。なお、胚の時期についても特に限定されないが、全ての脊椎動物で特徴がほぼ同じである初期胚が好ましい。
【００５５】
また、本発明に係る導入方法を用いて核酸等の物質の導入を行う対象となる動物は、特に限定されるものではないが、例えば、実験動物として用いるには小動物が好ましく、特に、モルモット、マウス、ラット等が好ましい。
【００５６】
よって、以下で、本発明に係る導入方法を用いて遺伝子を導入する生体として、哺乳動物の初期胚を用いて説明するが、これに限定されることはない。
【００５７】
哺乳動物の初期胚に遺伝子導入を行うために、上記リポソームと遺伝子との複合体を含んだ複合体含有液を、管状部材に封入し、哺乳動物の初期胚の目的の領域に管状部材の先端をあてがい、上記複合体を含んだ液を目的の領域に上記複合体含有液を注入する。または、哺乳動物の初期胚にあてがって、上記複合体を初期胚の周りに上記複合体含有液を吹きつける。なお、上記哺乳動物の初期胚は、培養液中にあることが好ましい。培養液の一例として、５０％ラット血清５０％ＤＭＥＭ液が挙げられるがこれに限らない。また、初期胚への「注入」または「吹きつけ」は顕微鏡下で行うのが好ましいが、これには限定されない。
【００５８】
管状部材の一例として、先端の外径が１０μｍのガラス製毛細管（毛細管ガラス）が挙げられる。しかし、これに限定されず、注射針等でもかまわない。また、管状部材は、ガラス素材だけでなく、シリコン素材等から形成されていてもかまわない。管状部材の内径は、上記複合体が通り抜けることのできる大きさ以上であればかまわない。つまり、上記複合体の直径と同じ大きさ以上であれば、かまわない。上記複合体が、リポソームと外来物質のとの複合体であると、この複合体の大きさは、数１０ｎｍ以上であることから、管状部材の内径は、数１０ｎｍ以上、特には、５０ｎｍ以上であることが好ましいが、これに限定されない。また、管状部材の外径は、少なくとも導入の対象とする範囲程度に小さくなくてはならない。例えば、哺乳動物の初期胚に用いる場合には、管状部材の先端の外径は、１２μｍ以下、特に１０μｍ以上１２μｍ以下のものが好ましいが、これに限定されない。生体内の広い範囲に注入する場合には、上記に示す数値よりも大きな口径の管状部材を用いてもよいが、細胞の破壊損傷などを考慮した口径の管状部材であることが好ましい。
【００５９】
また、管状部材を用いて複合体液を目的の領域に注入する、または、吹きつける際、管状部材をマニピュレーター、注射器本体等の公知の器具に取り付けて吐出させて、「注入」や「吹きつけ」を行うのが好ましい。しかし、管状部材からの、複合体含有液の吐出方法はこれらには限定されない。また、「注入」や「吹きつけ」は、哺乳動物の初期胚を固定して行うのが好ましい。固定には、ガラス管等を用いればよいが、これには限定されない。
【００６０】
上記複合体含有液を注入する際には、上記管状部材を生体内の細胞空間に突き刺し、管状部材の先端から生体内の目的の領域に上記複合体含有液を注入して、細胞空間に上記複合体含有液を充填した構造が形成されるようにすると好ましい。この「複合体含有液を充填した構造」を形成させる際の条件は、例えば、１つの「複合体含有液を充填した構造」に含まれる複合体含有液を基準にすることができる。１つの哺乳動物の初期胚に対して、上記複合体含有液を０．１ｐｌ〜１ｐｌ注入し、１７０μｍ^３〜１４００μｍ^３の範囲に「複合体含有液を充填した構造」を形成させるのが好ましい。しかし、「複合体含有液を充填した構造」を形成させる際の条件は、これには限定されない。
【００６１】
ここで、「複合体含有液を充填した構造」を形成させるとは、上述した「水たまり構造」を細胞空間に形成させるものである。この「水たまり構造」を形成させることで、後述する実施例からもわかるように、以下の推測が裏付けられた。
【００６２】
これまでに、リポフェクション法において、遺伝子導入の過程の前および同過程進行中に形成される構造については、解明されていない。
【００６３】
遺伝子導入に関しては、遺伝子を結合したリポソーム（周りが脂質構造）が同じ構造を持つ細胞膜にしばらくの時間（正確な時間は不明）接触することにより、このリポソームと細胞膜が融合し、その結果リポソームに結合した遺伝子が細胞膜の中に取り込まれ、取り込まれた細胞中で上記遺伝子が働きだして遺伝子導入が完了すると推測される。ここで、重要なポイントはリポソームと細胞膜が「しばらく接触している」ことであると考えられる。培養細胞の場合、接触、浮遊性の細胞を問わずしばらくディッシュの中に培養液と共に入れておくとディッシュの底に溜まる。同様にリポソームもしばらく培養液の中に入れておくと底に溜まってきて、底になるほど濃度が高くなる。
【００６４】
よって、これらから推測されることはｉｎｖｉｔｒｏでリポフェクションするときに、培養細胞ではディッシュの底で培養細胞とリポソームは互いに「しばらく接触している」と考えられる。しかし、ｉｎｖｉｖｏでは、細胞は、色々な方向を向いており、周りに存在する液も動いている。このような状況下ではリポソームを細胞塊の周りに入れるだけではリポソームと細胞膜とは「しばらく接触している」状況ができるとは考えにくい。よってこれまでｉｎｖｉｖｏにおいて行うリポフェクション法は、遺伝子導入効率が低いと推測される。
【００６５】
これに対して、本発明では、哺乳動物の初期胚へリポソーム液を注入する際に、細胞空間に「水たまり構造」を形成させると、この水たまりはしばらく動きのない液胞としてその場に留まる。よって、この「水たまり構造」に接する細胞はリポソームと「しばらく接触している」ことが可能となる。従って、「水たまり構造」を形成することで、遺伝子導入効率が上がったと推測することがでる。
【００６６】
つまり、本発明に係る導入方法を用いると、細胞とリポソームとを「しばらく接触」させることができるため、従来行われていた方法よりも、確実に目的の領域に遺伝子を導入することができる。
【００６７】
なお、哺乳類を代表とする生物は、数え切れないほど多数の細胞の集団を用いて各臓器やガン細胞群などを形成している。よって、これらの細胞群中の空間、あるいは細胞に液を注入した場合、「水たまり構造」を形成することは可能である。そのため、本発明を、実験時のみならず、臨床時や治療時に用いることも可能である。
【００６８】
なお、臨床時や治療時等に、本発明に係る導入方法を用いた場合において、「水たまり構造」ができているか否かの確認は、次のように行うことができる。すなわち、治療など再現性の必要なものは、複合体含有液の注入に関する処置時に、例えば、ＣＴスキャン等の既存の装置を用いることにより、実際にその処置部位で「水たまり構造」が形成されているか否かを確認することができる。この「水たまり構造」の確認をするための方法は、上記に限定されることはない。
【００６９】
また、上記複合体含有液を吹きつける際には、上記管状部材の先端を生体の表面にあてがい、上記複合体含有液を上記管状部材の先端から生体の表面に吐出させると好ましい。上記「吹きつけ」の条件は、例えば、吹きつける時間と吹きつける複合体含有液と吹きつける範囲とを基準にすることができる。この場合、１つの哺乳動物の初期胚に対して上記複合体含有液を毎秒０．１ｐｌ〜１ｐｌで、３０〜１２０秒間、８μｍ^２〜１２μｍ^２の範囲に吹きつけるのが好ましい。しかし、「吹きつけ」の条件は、これには限定されることはない。
【００７０】
リポソームと遺伝子との複合体含有液の注入が行われた哺乳動物の初期胚、あるいは、上記複合体を吹きつけられた哺乳動物の初期胚を、公知の方法に従い培養すると、初期胚の目的の領域に遺伝子導入が行われる。培養の公知の方法として、初期胚を培養液に入れ、５％二酸化炭素、３７℃で２４時間インキュベートする方法があるが、培養方法は、これに限定はされることはない。
【００７１】
（３）本発明に係る導入方法の利用（有用性）
本発明に係る導入方法は、外来物質を目的の領域に確実に導入できるものであるため、本発明に係る導入方法を用いれば、どのような動植物に対しても、どのような発生段階においても、生体内のどのような部位でも、目的の領域に局所的に外来物質の導入を行うことが可能である。また、本発明に係る導入方法を用いれば、様々な実験、研究、開発において、高効率で、再現性があり、安全性に、安価で、外来物質を導入することが可能である。よって、本発明は、種々の研究上においても、産業上においても利用性（有用性）を発揮することができる。例えば、以下で説明するように、遺伝子導入技術及びその関連技術に利用することができる。
【００７２】
近年、医学、薬学、遺伝子工学、分子生物学等のさまざまな分野において、遺伝子組換え、遺伝子治療、薬物評価や新薬開発等のために動植物の細胞内に遺伝子を導入することが盛んに行われている。
【００７３】
従来の遺伝子導入に関する技術は、導入した遺伝子が生体で目的の領域で発現する確率は、非常に低く、偶然を待つ様なものもあり、そのために実現不可能な実験がほとんどであるということであり、特に、発生段階で異常を来す遺伝子に関しては、生体内での働きを解明することは困難であったが、本発明に係る導入方法を用いることで、これらの問題点を改善することができる。
【００７４】
本発明に係る導入方法を利用することで、例えば、
▲１▼生体内での遺伝子の発生、分化、成長、老化などの時間的変化に伴う遺伝情報の発現の解析、
▲２▼細胞あるいは組織特異的な遺伝情報の発現に関与する遺伝子構造の解析、
▲３▼遺伝子産物の個体レベルでの生理的・病理的役割の解析、
▲４▼疾患モデル動物の作成、
▲５▼外来遺伝子導入に伴って生じた挿入突然変異などを利用した未知の遺伝子の解析、
▲６▼未知の遺伝子の直接的な機能の評価、
といった様々な遺伝子発現の調節機構の解明を、安全に、確実に行うことができる。
【００７５】
また、遺伝子導入の技術を応用発展させ、特定の遺伝子を不活化したノックアウト動物やトランスジェニック動物等を作成することにより、遺伝子の発生段階における役割または生体内での機能を同定することにも、本発明にかかる導入方法を利用することで、安全、確実に行うことができる。
【００７６】
よって、以上のように本発明に係る導入方法は、生命工学の発展に大いに貢献することができる。
【００７７】
また、本発明に係る導入方法を農作物や家畜等へ遺伝子導入の技術を応用することによって、有用な生理活性物質の生産や品種の改良などに利用することも可能である。
【００７８】
また、本発明に係る導入方法は、遺伝子治療、癌治療などの異常細胞への治療的処理等の医学的応用にも有用性を発揮する。
【００７９】
遺伝子治療の標的疾患として、癌、単一遺伝子疾患、感染症、血管系疾患、免疫・炎症系疾患、その他の疾患等ある。これら遺伝子治療は、対象疾患の責任遺伝子が明らかにされていることが前提であり、基本的に、責任遺伝子が劣性なら、異常細胞の欠損遺伝子のかわりに正常な遺伝子を導入して補充させ機能的に正常化させたり、あるいは逆に、責任遺伝子が優性なら、アポトーシス誘導遺伝子を導入して細胞死を導かせたり、異常な遺伝子の発現を妨害する遺伝子を導入する。
【００８０】
本発明に係る導入方法を用いると、臨床時や治療時等において、上記遺伝子治療をｅｘｖｉｖｏでなくても、ｉｎｖｉｖｏで直接的に行うことができる。また、本発明に係る方法を用いると、目的の領域に遺伝子導入を行うことができるので、エコーやＣＴスキャン等を用いた画像診断等を用いることで、異常細胞に焦点をあわせて遺伝子治療を行うことができる。また、安全に、高効率で、さらには、導入する物質のサイズにとらわれずに、遺伝子治療を行うことができる。
【００８１】
また、本発明に係る導入方法は、どのような細胞にも様々な外来物質を導入することが可能であるので、通常、上記のような責任遺伝子がクローニングされていれば、その遺伝子をベクターに組み込み標的細胞内に導入することができる。このような責任遺伝子のクローニングにも、標的細胞内にベクターを導入するのにも、本発明は有用である。
【００８２】
さらに、本発明に係る導入方法を用いると、様々な細胞に様々な外来物質を導入することが可能であるため、標的細胞および、外来物質のレパートリーが広がる。よって、目的の領域が正常細胞でも、本発明を用いることができ、正常細胞を思い通りの性質に安全に確実に変化させることができる。例えば、美容整形の分野に応用することがでできる。一例を挙げると、豊胸手術において、脂肪の含みやすい性質に細胞を変化させる外来物質を胸の細胞に導入することで、胸の細胞の性質を脂肪の含みやすい性質に変化させるといったようなことも可能となる。
【００８３】
【実施例】
本発明の実施例について、実験１ないし実験４に基づいて以下に説明する。
【００８４】
〔実験１〕リポソーム液の作製
リポソームに遺伝子を導入し複合体を形成し、複合体含有液を調製した。ここでは、遺伝子として、乳糖をブドウ糖とガラクトースに分解する酵素であるβ−ガラクトシターゼ、及び／または、外来遺伝子組み込みの際の選択マーカーとして使用される緑色の蛍光タンパク質であるＧＦＰ（ｇｒｅｅｎｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎ）を発現する発現ベクターｐＥＦ−ＢＯＳを用いた。１μｌのリポソームｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に２５μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭを加え攪拌し５分間室温で放置した。これに、２５μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭに０．８μｇの発現ベクターｐＥＦ−ＢＯＳを溶解したものを加え、攪拌し、５分間室温で放置して取り込ませた。この遺伝子が導入されたリポソームからなる複合体を含むリポソーム液が、複合体含有液である。
【００８５】
〔実験２〕マウス胚へのリポソーム液の注入
遺伝子導入を行うために、発生初期（５日から６日胚）のマウス胚に実験１で作製したリポソーム液を注入した。
【００８６】
ここでは、リポソーム液を外径１０μｍ、内径の９μｍの毛細管ガラス（ナリシゲ社）に充填し、マニピュレーター（Ｌｅｉｃａ社）に取り付けた。そして、顕微鏡下において、リポソーム液を、５０％ラット血清（ラット購入はＳＬＣ社）、５０％ＤＭＥＭ液（ＧｉｂｃｏＢＲＬ社）の培養液中にあるマウス胚の内胚葉層の細胞空間に静かに注入した。
【００８７】
ここで、図１を用いて注入の方法の一例を説明する。
【００８８】
図１（ａ）は、リポソーム液注入前の発生初期のマウス胚（５日胚）である。初めに、図１（ｂ）に示すように、右側のガラス管により５日胚を固定し、左側のリポソーム液を充填した毛細管ガラスを、５日胚の細胞層の間にあてがう。そして、５日胚の細胞空間に「水たまり構造」を形成させるように毛細管ガラスからリポソーム液を静かに注入し充填させる。５日胚に「水たまり構造」形成させたら、図１（ｃ）に示すように、５日胚から静かに毛細管ガラスを外す。なお、本図において矢頭が示す部分に「水たまり構造」が、形成されている。図１（ｄ）は、図１（ｃ）から数分後であるが、矢頭が示す「水たまり構造」がしばらくの間維持され、リポソーム液と細胞とがしばらくの間接触していることが示されている。
【００８９】
なお、本実施例では、１つのマウス胚に対して、リポソーム液を約０．１ｐｌ注入することで、約１７０μｍ^３の範囲に「水たまり構造」を形成させた。
【００９０】
このリポソーム液を注入し充填させ「水たまり構造」を形成する処理を行ったマウスの５日胚を、培養液に入れたまま、５％二酸化炭素、３７℃で２４時間インキュベートして培養した。
【００９１】
〔実験３〕遺伝子導入効率
実験２で培養したマウス胚に、遺伝子が導入されたか否かの確認を行った。選択マーカーとして導入したβ−ガラクトシターゼの発現とＧＦＰの発現との確認を行った。
【００９２】
β−ガラクトシターゼに対しては、Ｘ−ｇａｌ（ｓｉｇｍａ社）を用いて、公知の方法に従い染色し、顕微鏡下でマウス胚を観察した。遺伝子導入された細胞は青色染色されることにより、β−ガラクトシターゼを発現する遺伝子が導入されたマウス胚が目視で確認された。この遺伝子導入できたマウス胚を図２（ａ）に示す。本図のマウス胚において、遺伝子が導入された部位は矢頭で示され、線で囲まれている範囲に遺伝子が導入されている。
【００９３】
ＧＦＰに対しては、蛍光顕微鏡下でＵＶを照射し、観察を行った。遺伝子が導入された細胞は緑色であることから、ＧＦＰを発現する遺伝子が導入されたことが確認された。この遺伝子導入できたマウス胚を図２（ｂ）に示す。本図のマウス胚においても、遺伝子が導入された部位は矢頭で示され、線で囲まれている範囲に遺伝子が導入されている。
【００９４】
そして、遺伝子導入が行われた細胞を含むマウス胚の数を計数することによって、マウス胚への遺伝子導入効率を調べた。ここで、遺伝子導入効率とは、上記実験２の処理を行ったマウス胚全個数に対する、実験３で遺伝子導入が確認されたマウス胚の個数を％表示したものである。
【００９５】
上記の実験１〜実験３を繰り返し行い、それぞれ遺伝子導入効率を調べたところ、以下に示す表１のように、実験全体では、６０〜９０％の遺伝子導入効率であった。
【００９６】
【表１】

【００９７】
さらに、顕微鏡下で観察した結果、マウスの胚の内胚葉に対し約１７０μｍ^３範囲の細胞（２〜４細胞程度）に遺伝子を導入できたことが判明した。
【００９８】
また、５日胚に対して、内胚葉層の間にリポソーム液注入する代わりに、マウス胚の表面（内胚葉の表面）に毛細管ガラスに注入したリポソーム液を吹きつけ、それ以外は上記と同様に実験１〜実験３を行った場合には、以下の表２のような遺伝子導入効率となった。この実験では、リポソーム液を１つの５日胚に対して０．１ｐｌ／秒で、８μｍ^２の範囲に吹きつけた。なお、吹きつけ時間（秒）に対する導入効率の変化も確認した。
【００９９】
【表２】

【０１００】
以上の実験結果より、毛細管ガラスからリポソーム液を、マウスの初期胚の表面に吹きつけるよりも、細胞層の間に「水たまり構造」を形成するように吐出した方が、高効率で遺伝子を導入することができることが判明した。
【０１０１】
〔実験４〕８日胚への遺伝子導入効率
マウスの８日胚に対しても上記と同様に、「水たまり構造」を形成する様に、毛細管ガラスを用いてリポソーム液を細胞層間に注入し、遺伝子導入の実験を行った。８日胚に関しては、内胚葉と外胚葉の間に存在する中胚葉の細胞層の間に、上記と同様にリポソーム液を注入し「水たまり構造」を形成させ、遺伝子導入を行う実験を繰り返した。なお、１つの８日胚に対して、リポソーム液を約２０ｐｌ注入することで、約１万μｍ^３の範囲に「水たまり構造」を形成させた。この「水たまり構造」を形成させたマウス胚が図３である。図３（ａ）は、リポソーム液注入前のマウスの８日胚である。図３（ｂ）は、矢頭が示す部分にリポソーム液を注入し、「水たまり構造」を形成させた直後である。図３（ｃ）は、リポソーム液を注入してから数分後のマウス胚であるが、矢頭が示す「水たまり構造」がしばらくの間維持され、リポソーム液と細胞とがしばらくの間接触していることが示されている。
【０１０２】
この８日胚に対する実験により、遺伝子導入範囲を大きくすることで、マウスの８日胚の中胚葉において、約１万μｍ^３の範囲に、約９５〜１００％といった高い効率で遺伝子導入を行うことができた。この遺伝子導入できたマウス胚を図４（ａ）に示す。本図のマウス胚において、遺伝子が導入された部位は矢頭で示され、線で囲まれている範囲に遺伝子が導入されている。
【０１０３】
さらに、８日胚の中胚葉全域に遺伝子を導入することを目的に、同一の実験時に、約１万μｍ^３範囲に「水たまり構造」を形成させる操作を、１つの胚に対して連続して何度も行い遺伝子導入を行った。これにより、中胚葉全域に相当する約２０万μｍ^３範囲に、遺伝子を導入することができた。この遺伝子導入できたマウス胚を図４（ｂ）に示す。本図のマウス胚において、遺伝子が導入された部位は矢頭で示され、線で囲まれている範囲に遺伝子が導入されている。
【０１０４】
以上の実験結果では、導入効率が約１００％である「水たまり構造」は、最小で約１千μｍ^２の範囲、高さが約１０μｍであった。理論的には、これよりもより微小の体積であっても、「水たまり構造」を形成することは可能であると考えられる。また、上記範囲よりも大きな「水たまり構造」は、注入するリポソーム液の量と注入したい細胞群の大きさとにより、無限大まで大きくすることが可能である。
【０１０５】
以上に記述したように、本発明の導入方法を用い、マウス胚の目的の領域にリポソーム液が充填した「水たまり構造」を形成するように、リポソーム液を注入し、リポソーム液とマウス胚の細胞とを接触させることで、マウス胚の目的の領域の細胞内に遺伝子をほぼ確実に導入することができた。このことは、マウスの成体、さらに将来的には、臨床的にヒトの生体に、外来物質を導入する場合に、本発明の導入方法は、利用可能であるということを示しており、十分であると考えられる。
【０１０６】
【発明の効果】
本発明に係る導入方法は、以上のように、生体に局所的に外来物質の導入を行うとき、複合体含有液を、管状部材の先端から生体内の目的の領域に、注入する、または吹きつけることで、目的の領域の細胞内に外来物質を導入しているため、外来物質を確実に標的細胞に導入することができる。さらに、効率、再現性、安全性、利便性が高く安価で行うことのできる実用的な方法であるため、前述したような種々の有用性を有する。従って、本発明は、医学、生化学等の研究分野、遺伝子治療、再生医療等の医療分野において、有効に利用することができるため、非常に優れている。
【図面の簡単な説明】
【図１】（ａ）〜（ｃ）は、マウスの５日胚に、本発明に係る遺伝子導入法を用いて、リポソーム液を注入し、「水たまり構造」を形成させている模式図である。（ｄ）は、リポソーム液を注入してから、数分後のマウス胚である。
【図２】本発明に係る遺伝子導入法を用いて遺伝子を導入したマウスの５日胚の模式図であり、（ａ）はβ−ガラクトシターゼ、（ｂ）はＧＦＰが発現されたことを示す。
【図３】マウスの８日胚を示す模式図であり、（ａ）は、リポソーム液注入前、（ｂ）は、本発明に係る遺伝子導入法を用いてリポソーム液を注入し「水たまり構造」を形成した直後、（ｄ）は、リポソーム液を注入してから数分後である。
【図４】本発明に係る遺伝子導入法を用いて、（ａ）は一部、（ｂ）は広範囲にリポソーム液を注入し、ＧＦＰが発現されたことを示すマウスの８日胚の模式図である。[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to a method for introducing a foreign substance into cells in a target region in a living body, and a method for introducing a foreign substance with high efficiency, safety and convenience, a series of techniques relating to the method, and use thereof. is there.
[0002]
[Prior art]
In recent years, the development of biotechnology has been remarkable, and under such circumstances, introduction of substances such as nucleic acids into cells is a useful method for manipulating cells, and has great potential in molecular biology and clinical medicine. have.
[0003]
For example, in a living body, a gene transfer method for introducing a gene into a cell includes a biological method using a viral vector such as a retrovirus vector or an adenovirus vector, an electroporation (electroporation) method, and a microinjection method. , A protoplast fusion method, a calcium phosphate method and the like.
[0004]
In gene transfer, especially when used experimentally or even clinically for living organisms, "transduction efficiency", "safety", "reproducibility", "simplicity", and "practicality" are important keywords. It is desirable that these are high. It is also important to be "cheap". The term "safety" as used herein means that the introduction does not exert any physical or chemical influence other than the gene on the cells.
[0005]
However, in a biological method using a virus vector or the like, a gene can be introduced only into specific cells such as mature lymphocytes, and the size of the gene that can be introduced is limited. In addition, there is a problem that there is concern about antigenicity and toxicity to a host, and it takes a lot of time and effort to prepare a vector.
[0006]
In addition, the electroporation method is dangerous because an electric shock is applied to the cells to cause the cells to deform and introduce the gene, which is dangerous. Is not secured. Furthermore, even if other gene transfer methods are used, it is difficult to introduce them with high transfer efficiency, high safety, and high reproducibility, and there are many problems.
[0007]
In order to solve the above problems, lipofection methods using liposomes as artificial vectors have been researched and developed. The lipofection method is a method in which a complex consisting of a liposome similar to a cell membrane and a gene is taken into cells and the gene is introduced. Therefore, compared to the other gene transfer methods described above, the cells are less damaged at the time of gene transfer and have been used for gene transfer to cultured cells in vitro.
[0008]
Advantages of the lipofection method include, for example, (1) the phospholipids constituting the liposome are low in toxicity because they are the main components of the biological membrane, and (2) the operation is relatively simple and can be applied to various cells. (3) controlling the particle size of the liposome or causing the liposome to interact with the target cell in accordance with the size of the substance such as the nucleic acid to be introduced, the target cell to which the nucleic acid is to be introduced, the purpose of the introduction, the method of introduction, etc. (4) It is safe because there is no need to apply a voltage at the time of introduction.
[0009]
As described above, the lipofection method has been mainly used for gene transfer into cultured cells in vitro. In addition, methods for introducing a gene into a living body using this lipofection method have been proposed in the following Patent Documents 1 to 7.
[0010]
[Patent Document 1]
International Publication WO97 / 17844 (International Publication May 22, 1997)
[0011]
[Patent Document 2]
Japanese Translation of International Publication No. 2002-508337 (published March 19, 2002)
[0012]
[Patent Document 3]
JP-A-2002-241313 (published August 28, 2002)
[0013]
[Patent Document 4]
Japanese Translation of International Publication No. 2001-523468 (November 27, 2001)
[0014]
[Patent Document 5]
Tokuhyo Hei 9-505593 (published June 3, 1997)
[0015]
[Patent Document 6]
International Publication WO97 / 17843 (International Publication May 22, 1997)
[0016]
[Patent Document 7]
Japanese Translation of International Publication No. 2002-525270 (August 13, 2002)
[0017]
[Problems to be solved by the invention]
However, the conventional gene transfer method using the lipofection method as described above has a problem that practicality still remains. For example, in a conventional method for gene transfer into a living body using the lipofection method, gene transfer is carried out by injecting a liposome combined with a gene into a vein, artery, intraperitoneal cavity, amniotic fluid, or the like. Therefore, it is difficult to reliably introduce a gene into a target region in a living body, and the introduction efficiency is low.
[0018]
Recently, a method has been proposed in which a complex in which a low-molecular-weight compound or protein as a drug is bound to a liposome is introduced into cells as well as a gene, but a substance other than such a gene is produced. No method has been developed for local introduction into microscopic areas in the body.
[0019]
The present invention has been made in view of the above problems, and its object is to provide a high introductory efficiency, more safely, easily and reproducibly, inexpensively, that is, having high practicality, An object of the present invention is to provide a method for reliably introducing a foreign substance into a target region. Further, the present invention also provides various uses of the method.
[0020]
[Means for Solving the Problems]
The present inventors have conducted intensive studies in order to overcome the above-mentioned technical difficulties of the conventional technology, and as a result, using lipofection method, highly efficient gene transfer was locally performed in the fine region of the mouse embryo. A new way to do this has been developed. As a result, the inventions of the following A) to Q) have been completed as medically or industrially useful methods and substances.
[0021]
A) When a foreign substance is locally introduced into a living body, a complex-containing liquid containing a complex of a substance that interacts with a cell surface and the above-mentioned foreign substance is transferred from the distal end of the tubular member to a target in the living body. Introducing the foreign substance into the cells in the target area by injecting or spraying into the area.
[0022]
B) In the introduction method of the above A), the target region in the living body is a cell space in the living body, and when the complex-containing liquid is injected into the target region in the living body, The member is pierced into the cell space in the living body, and the structure filled with the complex-containing liquid is injected into a target region in the living body from the distal end of the tubular member so that the structure is formed in the cell space in the living body. Featured introduction method.
[0023]
C) In the introduction method of the above A), when the complex-containing liquid is sprayed on a target region in the living body, the tip of the tubular member is applied to the surface of the living body, and the complex-containing liquid is applied to the tubular body. An introduction method, wherein the tip of the member is discharged onto the surface of the living body.
[0024]
D) In the introduction method according to any of the above A) to C), ³ More than 1400μm ³ An introduction method characterized by introducing the foreign substance into the following fine regions.
[0025]
E) The introduction method according to any one of the above A to D), wherein the inner diameter of the distal end of the tubular member is equal to or larger than the size of the composite.
[0026]
F) The introduction method according to any one of the above A to D), wherein the inner diameter of the distal end of the tubular member is 50 nm or more.
[0027]
G) The introduction method according to any of the above A) to F), wherein the foreign substance is at least one of a nucleic acid, a protein, and a chemical substance.
[0028]
H) The method according to G), wherein the nucleic acid is at least one of DNA, RNA, and chromosome itself.
[0029]
I) In any one of the above-described methods A) to H), the foreign substance serves as an index for confirming that the foreign substance to be introduced has been introduced in addition to the foreign substance to be introduced into the living body. An introduction method characterized by including an indicator substance which can be used.
[0030]
J) The introduction method according to any one of the above A) to I), wherein the substance that interacts with the cell surface is a liposome.
[0031]
K) The introduction method according to any one of the above A) to J), wherein the living body is a mammalian embryo or an adult.
[0032]
L) A transformant into which a foreign substance has been introduced by any of the above-described methods A) to K).
[0033]
M) The transformant according to L), which is a mammalian embryo or an adult.
[0034]
N) An introduction kit for performing any of the introduction methods of the above A) to K).
[0035]
O) A method for treating a disease using any of the introduction methods A) to K).
[0036]
P) A therapeutic agent which is used in the treatment method of the above O) and comprises the complex-containing solution of the above A).
[0037]
Q) A therapeutic kit for performing the method of the above O).
[0038]
In the present invention, the “target region” refers to a “region where a target cell into which a foreign substance is introduced” is present, and may be a specific tissue or organ such as lung, heart, or kidney. However, for example, cells (group) having a narrowed target, such as cancerous cells in the lungs, may be used. Therefore, the range that limits the “target area” is one or more cells (group) that can be seen under the circumstances. It should be noted that the above-mentioned condition may be a condition that can be observed with the naked eye, but may be a condition under a microscope or under an MRI.
[0039]
Forming the “structure filled with the complex-containing solution” using the introduction method according to the present invention means forming a “puddle structure” in which the complex-containing solution is accumulated in the cell space.
[0040]
Here, the “puddle structure” will be described. Since living organisms are clumps of cells, the cells are always three-dimensionally in contact with each other on some surface. When four or more cells are collected, they form a stable structure, which always forms a cube-like shape as a whole. Therefore, a space surrounded by cells is formed three-dimensionally at the center of gravity of the cube. When a liquid is injected into this space, a space is formed in which the liquid is accumulated, surrounded by cells. Alternatively, when a liquid is injected into the cells, the cells injected more than the limit burst, but the location of the ruptured cells becomes a space where the liquid is accumulated. The structure of the space in which the liquid is accumulated is defined as a “puddle structure”.
[0041]
The tubular member filled with the complex-containing liquid is pierced into a cell space in a living body, and a complex is filled from the distal end of the tubular member so as to form a “structure filled with the complex-containing solution”, that is, a “puddle structure”. When the solution is injected, the solution containing the complex can be brought into contact with cells (target cells) in the target area. Therefore, the foreign substance can be reliably introduced into the cells in the target area. Organisms represented by mammals form an organ, a cancer cell group, and the like using an innumerable population of cells. Therefore, when a liquid is injected into the space in these cell groups or the cells, a “puddle structure” can be formed.
[0042]
By using the present invention, it is possible to reliably introduce foreign substances such as nucleic acids, proteins, and chemical substances into cells in a target region in a living body with high introduction efficiency, furthermore, safely, simply, and reproducibly at low cost. it can.
[0043]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
An embodiment of the present invention will be described below. In addition, this invention is not limited to the following description.
[0044]
(1) Preparation of complex-containing liquid
First, a complex-containing liquid containing a complex of a substance interacting with the cell surface and a foreign substance is prepared.
[0045]
An example of a foreign substance to be introduced into a living body using the introduction method according to the present invention includes a nucleic acid, and among them, a gene. However, the exogenous substance to be introduced into the living body is not limited to this, and may be a protein, such as an antibody or an enzyme, a chromosome itself, or a chemical agent, other than a gene, as long as it can be introduced into cells.
[0046]
The gene to be introduced into a living body may be a structural gene, a gene to which a base sequence necessary for homologous recombination is added, a vector containing them, or a probe or antisense. It may be any kind of gene such as a gene for treating various diseases. Further, it may be DNA or RNA. DNA or RNA may be single-stranded or double-stranded. In addition, it is convenient to confirm that the gene has been introduced into cells in a target region in a living body when an indicator substance (selectable marker) is incorporated in the gene. In an experiment or the like, the indicator substance itself may be introduced as a foreign substance using the introduction method according to the present invention.
[0047]
Liposomes (lipid vesicles) are an example of a substance that interacts with the cell surface used when using the introduction method according to the present invention. Examples of liposomes used for introducing foreign substances include lipofectamine, which encapsulates foreign substances in vesicles, cationic liposomes, which form a complex by binding a foreign substance to the surface, and foreign substances. And an immunoliposome that binds a specific antibody that binds to the antigen of the target cell on the surface. Note that the present invention is not limited to these.
[0048]
Furthermore, such as temperature-sensitive liposomes and pH-sensitive liposomes that release foreign substances held at a specific temperature and pH, and blood-retaining liposomes surface-modified with sialic acid or polyethylene glycol so that foreign substances are hardly recognized in the body. The liposome may have various properties, or may be modified according to the size of the gene to be introduced, the cell to which the gene is to be introduced, the purpose of the introduction, the method of introduction, and the like.
[0049]
The substance that interacts with the cell surface is not limited to liposomes, and other foreign substances may be introduced using a foreign substance carrier that can fuse with cells.
[0050]
As described above, when liposomes are used as a substance that interacts with the cell surface, the complex-containing solution corresponds to a liposome solution. Of course, the complex-containing liquid is not limited to this. It is preferable that the complex-containing liquid does not contain serum, because the efficiency of introducing a foreign substance into cells can be increased.
[0051]
A liposome solution, which is a complex-containing solution containing a complex between a liposome and a gene, may be prepared using a known method. For example, the liposome is suspended in a suspending solvent, the gene is suspended in the suspending solvent, and the two solutions are mixed and allowed to stand. To form a liposome solution. As a solvent for this suspension, for example, H ₂ O and 5% glucose, but are not limited thereto. Further, the method for preparing the liposome solution is not limited to the above method. In forming a complex of liposome and gene (DNA), the weight ratio of liposome to gene (DNA) is preferably 1: 0.8, but is not limited thereto. Further, the ratio of the complex in the liposome solution is preferably 1.8 μg / 50 μl, but is not limited thereto.
[0052]
Reagents and the like used in the lipofection method are available as various kits, and it is stated that they can be applied to various cells with relative ease and good reproducibility. Therefore, these kits may be used.
[0053]
(2) Gene transfer
There is no regulation on the tissue of an individual into which a substance such as a nucleic acid is introduced using the introduction method according to the present invention. Therefore, the “target region” into which a substance such as a nucleic acid is introduced may be a specific tissue or organ such as the lung, heart, or kidney. For example, a target such as cancerous cells in the lung may be used. Squeezed cells can be used. Note that the range that limits the “target area” is one or more cells (group) that can be seen under such circumstances. Here, the above-mentioned condition may be a condition that can be observed with the naked eye, but may be a condition under a microscope or under an MRI. Therefore, when the introduction method according to the present invention is used, 170 μm ³ The above area, particularly preferably 170 μm ³ More than 1400μm ³ Foreign substances can be introduced into the following areas.
[0054]
The cells in the target region for gene transfer using the transfer method according to the present invention can be any cells having cell membranes of all animals and plants. In addition, the cells in the target area may be a single cell or a mixture of various cells. For example, for use as an experiment, fertilized eggs or cells in embryos having totipotency are preferred. The timing of embryos is not particularly limited, but early embryos, which have almost the same characteristics in all vertebrates, are preferred.
[0055]
In addition, animals to which a substance such as a nucleic acid is introduced using the introduction method according to the present invention are not particularly limited.For example, small animals are preferable for use as experimental animals, and in particular, guinea pigs, Mouse, rat and the like are preferred.
[0056]
Therefore, in the following, a living body into which a gene is introduced using the introduction method according to the present invention will be described using an early embryo of a mammal, but is not limited thereto.
[0057]
In order to transfer the gene into the mammalian early embryo, a complex-containing solution containing the complex of the liposome and the gene is sealed in a tubular member, and the tip of the tubular member is placed in a target region of the mammalian early embryo. And inject the liquid containing the complex into the target region. Alternatively, the complex is sprayed around the early embryo by applying the complex to the early embryo of a mammal. It is preferable that the early embryo of the mammal is in a culture solution. An example of the culture solution includes, but is not limited to, 50% rat serum and 50% DMEM solution. The “injection” or “spraying” into the early embryo is preferably performed under a microscope, but is not limited thereto.
[0058]
As an example of the tubular member, a glass capillary tube (capillary glass) having a tip with an outer diameter of 10 μm is exemplified. However, the present invention is not limited to this, and an injection needle or the like may be used. Further, the tubular member may be formed not only of a glass material but also of a silicon material or the like. The inner diameter of the tubular member may be any size as long as the composite can pass through. That is, any size may be used as long as it is equal to or larger than the diameter of the composite. When the complex is a complex of a liposome and a foreign substance, the size of the complex is several tens nm or more, and therefore, the inner diameter of the tubular member is several tens nm or more, particularly, 50 nm or more. Preferably, but not limited to. The outer diameter of the tubular member must be at least as small as the range to be introduced. For example, when used for an early embryo of a mammal, the outer diameter of the distal end of the tubular member is preferably 12 μm or less, particularly preferably 10 μm or more and 12 μm or less, but is not limited thereto. When injecting into a wide range in a living body, a tubular member having a diameter larger than the above numerical value may be used, but a tubular member having a diameter considering cell destruction / damage and the like is preferable.
[0059]
In addition, when injecting or spraying the complex liquid into the target region using the tubular member, the tubular member is attached to a known instrument such as a manipulator or a syringe body and discharged, and “injection” or “spraying” Is preferably performed. However, the method of discharging the composite-containing liquid from the tubular member is not limited to these. Further, “injection” and “spraying” are preferably performed by fixing an early embryo of a mammal. A glass tube or the like may be used for fixing, but is not limited to this.
[0060]
When injecting the complex-containing liquid, the tubular member is pierced into a cell space in a living body, the complex-containing liquid is injected into a target region in a living body from the tip of the tubular member, and the cell space is filled with the complex member-containing liquid. It is preferable to form a structure filled with the complex-containing liquid. The conditions for forming the “structure filled with the complex-containing liquid” can be based on, for example, the complex-containing liquid contained in one “structure filled with the complex-containing liquid”. 0.1 pl to 1 pl of the above-mentioned complex-containing solution was injected into the early embryo of one mammal, and 170 μm ³ ~ 1400μm ³ It is preferable to form a “structure filled with the complex-containing liquid” in the range of (1). However, conditions for forming the “structure filled with the complex-containing liquid” are not limited thereto.
[0061]
Here, forming the “structure filled with the complex-containing liquid” means forming the above-described “puddle structure” in the cell space. By forming this “puddle structure”, the following assumption was supported, as can be seen from the examples described later.
[0062]
To date, the structures formed before and during the process of gene transfer in the lipofection method have not been elucidated.
[0063]
Regarding gene transfer, the liposome to which the gene is attached (the surrounding lipid structure) comes into contact with the cell membrane having the same structure for a while (the exact time is unknown). It is presumed that the bound gene is taken into the cell membrane and the gene works in the taken-up cell to complete the gene transfer. Here, it is considered that the important point is that the liposome and the cell membrane are "in contact for a while". In the case of cultured cells, regardless of whether the cells are in contact or floating, if they are put in a dish with a culture solution for a while, they accumulate at the bottom of the dish. Similarly, the liposome also accumulates at the bottom when it is put in the culture solution for a while, and the concentration becomes higher toward the bottom.
[0064]
Therefore, it is presumed from these that when lipofection is performed in vitro, in the cultured cells, the cultured cells and the liposome are "in contact with each other" at the bottom of the dish. However, in vivo, cells are oriented in various directions, and the fluid around them is also moving. Under such circumstances, it is unlikely that the liposome and the cell membrane will be in a state of "contact for a while" simply by putting the liposome around the cell mass. Therefore, it is assumed that the lipofection method performed so far in vivo has low gene transfer efficiency.
[0065]
On the other hand, in the present invention, when a “puddle structure” is formed in the cell space when a liposome solution is injected into an early embryo of a mammal, the puddle stays in place as a static vacuole for a while. Therefore, cells in contact with the “puddle structure” can “contact with the liposome for a while”. Therefore, it can be inferred that the formation of the "puddle structure" has increased the gene transfer efficiency.
[0066]
That is, when the transfer method according to the present invention is used, the cell can be brought into contact with the liposome for a while, so that the gene can be more reliably introduced into the target region than the method conventionally performed.
[0067]
Organisms represented by mammals form an organ, a cancer cell group, and the like using an innumerable population of cells. Therefore, when a liquid is injected into the space in these cell groups or the cells, it is possible to form a “puddle structure”. Therefore, the present invention can be used not only at the time of an experiment but also at the time of a clinic or treatment.
[0068]
In addition, in the case of using the introduction method according to the present invention at the time of clinic, treatment, or the like, whether or not the “puddle structure” is formed can be confirmed as follows. In other words, for those requiring reproducibility such as treatment, during treatment related to injection of the complex-containing liquid, for example, by using an existing device such as a CT scan, a “puddle structure” is actually formed at the treatment site. Can be checked. The method for confirming the “puddle structure” is not limited to the above.
[0069]
In spraying the complex-containing liquid, it is preferable that the tip of the tubular member is applied to the surface of a living body, and the complex-containing liquid is discharged from the tip of the tubular member to the surface of the living body. The conditions of the above “spraying” can be based on, for example, the time of spraying, the complex-containing solution to be sprayed, and the range of spraying. In this case, the complex-containing solution was applied to the early embryo of one mammal at 0.1 pl to 1 pl per second for 8 to 30 μm for 30 to 120 seconds. ² ~ 12μm ² It is preferable to spray in the range. However, the condition of “blowing” is not limited to this.
[0070]
Injection of the complex-containing solution of the liposome and the gene into the early mammalian embryo, or the early mammalian embryo that has been sprayed with the complex is cultured according to a known method. The gene is introduced into the region. As a known method of culturing, there is a method in which an early embryo is put in a culture solution and incubated at 5% carbon dioxide at 37 ° C. for 24 hours, but the culturing method is not limited thereto.
[0071]
(3) Use of the introduction method according to the present invention (utility)
Since the introduction method according to the present invention can surely introduce a foreign substance into a target region, if the introduction method according to the present invention is used, any animal or plant can be used at any stage of development. In addition, it is possible to locally introduce a foreign substance into a target region at any site in a living body. Further, by using the introduction method according to the present invention, it is possible to introduce a foreign substance with high efficiency, reproducibility, safety, and low cost in various experiments, researches, and developments. Therefore, the present invention can exhibit utility (utility) in various studies and in industry. For example, as described below, it can be used for gene transfer technology and related technologies.
[0072]
In recent years, in various fields such as medicine, pharmacy, genetic engineering, and molecular biology, the introduction of genes into animal and plant cells for gene recombination, gene therapy, drug evaluation, and development of new drugs has been actively performed. ing.
[0073]
Conventional gene-transfer technology is based on the fact that the probability of an introduced gene being expressed in a target region in a living organism is extremely low, and there are some that wait for chance, so that most experiments are not feasible. In particular, it has been difficult to elucidate the function in vivo of genes that cause abnormalities at the developmental stage.However, by using the introduction method according to the present invention, it is possible to improve these problems. Can be.
[0074]
By using the introduction method according to the present invention, for example,
(1) Analysis of the expression of genetic information associated with temporal changes such as gene generation, differentiation, growth, and aging in vivo,
(2) analysis of the gene structure involved in the expression of genetic information specific to cells or tissues,
(3) Analysis of physiological and pathological roles of gene products at the individual level,
(4) Creation of disease model animals,
(5) Analysis of unknown genes using insertion mutations and the like caused by introduction of a foreign gene,
(6) Evaluation of the direct function of unknown genes,
Thus, it is possible to safely and reliably elucidate the regulation mechanism of various gene expressions.
[0075]
In addition, by applying and developing gene transfer technology and creating knockout animals and transgenic animals etc. in which specific genes have been inactivated, it is also possible to identify the role of the genes at the developmental stage or the function in vivo. By using the introduction method according to the present invention, it can be performed safely and reliably.
[0076]
Therefore, as described above, the introduction method according to the present invention can greatly contribute to the development of biotechnology.
[0077]
In addition, by applying the gene transfer technique to agricultural products, livestock, and the like, the introduction method according to the present invention can be used for production of useful physiologically active substances, improvement of varieties, and the like.
[0078]
Further, the introduction method according to the present invention is also useful for medical applications such as therapeutic treatment for abnormal cells such as gene therapy and cancer treatment.
[0079]
Target diseases for gene therapy include cancer, monogenic diseases, infectious diseases, vascular diseases, immune / inflammatory diseases, and other diseases. These gene therapies are based on the assumption that the responsible gene for the target disease has been identified.Basically, if the responsible gene is recessive, the gene can be recruited by introducing a normal gene instead of the defective gene in the abnormal cell. If the responsible gene is dominant, on the other hand, if the responsible gene is dominant, an apoptosis-inducing gene is introduced to induce cell death, or a gene that interferes with abnormal gene expression is introduced.
[0080]
By using the introduction method according to the present invention, the above-described gene therapy can be directly performed in vivo at the time of clinical treatment, treatment, or the like, without using ex vivo. In addition, since the gene can be introduced into a target region by using the method according to the present invention, gene therapy can be performed by focusing on abnormal cells by using image diagnosis using echo, CT scan, or the like. It can be carried out. In addition, gene therapy can be performed safely, efficiently, and regardless of the size of the substance to be introduced.
[0081]
In addition, since the introduction method according to the present invention can introduce various foreign substances into any cells, usually, if the responsible gene as described above has been cloned, the gene is inserted into a vector. It can be introduced into integrated target cells. The present invention is useful for cloning such a responsible gene and for introducing a vector into a target cell.
[0082]
Furthermore, when the introduction method according to the present invention is used, various foreign substances can be introduced into various cells, so that the repertoire of target cells and foreign substances is expanded. Therefore, the present invention can be used even when the target region is a normal cell, and the normal cell can be safely and reliably changed to desired properties. For example, it can be applied to the field of cosmetic surgery. For example, in breast augmentation surgery, a foreign substance that changes cells into a property that easily contains fat is introduced into breast cells to change the properties of breast cells into a property that easily contains fat. Is also possible.
[0083]
【Example】
Examples of the present invention will be described below based on Experiments 1 to 4.
[0084]
[Experiment 1] Preparation of liposome solution
The gene was introduced into the liposome to form a complex, and a complex-containing solution was prepared. Here, β-galactosidase, which is an enzyme that degrades lactose into glucose and galactose, and / or GFP (green fluorescent protein), which is a green fluorescent protein used as a selectable marker when a foreign gene is incorporated, are used as genes. ) Was used in the expression vector pEF-BOS. 25 μl of Opti-MEM was added to 1 μl of liposome lipofectamine 2000 (Invitrogen), and the mixture was stirred and left at room temperature for 5 minutes. To this, a solution prepared by dissolving 0.8 μg of the expression vector pEF-BOS in 25 μl of Opti-MEM was added, stirred, and allowed to stand at room temperature for 5 minutes to be incorporated. The liposome solution containing the complex comprising the liposome into which the gene has been introduced is the complex-containing solution.
[0085]
[Experiment 2] Injection of liposome solution into mouse embryo
In order to perform gene transfer, the liposome solution prepared in Experiment 1 was injected into a mouse embryo at an early stage of development (5 to 6 day embryo).
[0086]
Here, the liposome solution was filled into a capillary glass (Narishige) having an outer diameter of 10 μm and an inner diameter of 9 μm, and attached to a manipulator (Leica). Then, under a microscope, the liposome solution was gently injected into the cell space of the endoderm layer of the mouse embryo in a culture solution of 50% rat serum (rat purchased from SLC) and 50% DMEM solution (Gibco BRL). .
[0087]
Here, an example of the injection method will be described with reference to FIG.
[0088]
FIG. 1A shows a mouse embryo (5-day embryo) at an early stage of development before injection of a liposome solution. First, as shown in FIG. 1 (b), a 5-day embryo is fixed with a glass tube on the right, and a capillary glass filled with a liposome solution on the left is applied between the cell layers of the 5-day embryo. Then, a liposome solution is gently injected and filled from the capillary glass so as to form a “puddle structure” in the cell space of the 5-day embryo. After the “puddle structure” is formed on the 5-day embryo, the capillary glass is gently removed from the 5-day embryo, as shown in FIG. 1 (c). In this drawing, a “puddle structure” is formed at a portion indicated by an arrowhead. FIG. 1 (d) shows that the “puddle structure” indicated by the arrowhead is maintained for a while, and that the liposome solution and the cells are in contact for a while, several minutes after FIG. 1 (c). Have been.
[0089]
In this example, about 0.1 μl of the liposome solution was injected into one mouse embryo to obtain about 170 μm ³ A "puddle structure" was formed in the range.
[0090]
The 5-day embryo of the mouse that had been treated by injecting and filling the liposome solution to form a “puddle structure” was incubated in 5% carbon dioxide and 37 ° C. for 24 hours while being kept in the culture solution and cultured.
[0091]
[Experiment 3] Gene transfer efficiency
It was confirmed whether or not the gene was introduced into the mouse embryo cultured in Experiment 2. The expression of β-galactosidase introduced as a selection marker and the expression of GFP were confirmed.
[0092]
β-galactosidase was stained using X-gal (Sigma) according to a known method, and mouse embryos were observed under a microscope. The transfected cells were stained blue, and the mouse embryo transfected with the gene expressing β-galactosidase was visually confirmed. FIG. 2A shows the mouse embryo into which the gene has been introduced. In the mouse embryo of this figure, the site where the gene was introduced is indicated by an arrowhead, and the gene was introduced in the area surrounded by the line.
[0093]
GFP was irradiated with UV under a fluorescence microscope and observed. Since the cells into which the gene was introduced were green, it was confirmed that the gene expressing GFP was introduced. FIG. 2 (b) shows the mouse embryo into which the gene has been introduced. Also in the mouse embryo of this figure, the site where the gene was introduced is indicated by an arrowhead, and the gene was introduced in the area surrounded by the line.
[0094]
Then, the efficiency of gene transfer into the mouse embryo was examined by counting the number of mouse embryos containing cells into which the gene was transferred. Here, the gene transfer efficiency is a percentage of the number of mouse embryos for which gene transfer was confirmed in Experiment 3 with respect to the total number of mouse embryos subjected to the treatment in Experiment 2 above.
[0095]
Experiments 1 to 3 were repeated to examine the gene transfer efficiency. As shown in Table 1 below, the gene transfer efficiency was 60 to 90% in the entire experiment.
[0096]
[Table 1]

[0097]
Furthermore, as a result of observation under a microscope, the endoderm of the mouse embryo was about 170 μm ³ It was found that the gene could be introduced into a range of cells (about 2 to 4 cells).
[0098]
In addition, instead of injecting the liposome solution between the endoderm layers, the liposome solution injected into the capillary glass is sprayed on the surface of the mouse embryo (the surface of the endoderm) for the 5-day embryo. In addition, when Experiments 1 to 3 were performed, the gene transfer efficiency was as shown in Table 2 below. In this experiment, the liposome solution was applied to one 5-day embryo at 0.1 pl / sec at 8 μm. ² Sprayed on the range. In addition, the change of the introduction efficiency with respect to the spraying time (second) was also confirmed.
[0099]
[Table 2]

[0100]
From the above experimental results, it is more efficient to introduce a gene by discharging a liposome solution from the capillary glass to form a “puddle structure” between cell layers than by spraying it onto the surface of the early mouse embryo It turns out that you can.
[0101]
[Experiment 4] Gene transfer efficiency into 8-day embryo
Similarly to the above, a liposome solution was injected between cell layers using a capillary glass so as to form a “puddle structure” for an 8-day embryo of a mouse, and a gene transfer experiment was performed. For the 8-day embryo, the experiment of injecting the liposome solution between the cell layers of the mesoderm existing between the endoderm and the ectoderm to form a “puddle structure” as described above and repeating gene transfer was repeated. . By injecting about 20 pl of a liposome solution into one 8-day embryo, about 10,000 μm ³ A "puddle structure" was formed in the range. FIG. 3 shows a mouse embryo in which this “puddle structure” was formed. FIG. 3A shows an 8-day embryo of a mouse before injection of the liposome solution. FIG. 3B shows a state immediately after the liposome solution is injected into the portion indicated by the arrowhead to form a “puddle structure”. FIG. 3 (c) shows the mouse embryo several minutes after the injection of the liposome solution. The “puddle structure” indicated by the arrowhead is maintained for a while, and the liposome solution comes into contact with the cells for a while. Is shown.
[0102]
By increasing the gene transfer range in the experiment on the 8-day embryo, about 10,000 μm ³ , The gene transfer could be performed with a high efficiency of about 95 to 100%. FIG. 4A shows the mouse embryo into which the gene has been introduced. In the mouse embryo of this figure, the site where the gene was introduced is indicated by an arrowhead, and the gene was introduced in the area surrounded by the line.
[0103]
Furthermore, in order to introduce the gene into the entire mesoderm of the 8-day embryo, about 10,000 μm ³ The operation of forming a “puddle structure” in the area was performed continuously and many times on one embryo to perform gene transfer. Thereby, about 200,000 μm corresponding to the entire mesodermal area ³ The gene could be introduced into the range. FIG. 4 (b) shows the mouse embryo into which the gene has been introduced. In the mouse embryo of this figure, the site where the gene was introduced is indicated by an arrowhead, and the gene was introduced in the area surrounded by the line.
[0104]
According to the above experimental results, the “puddle structure” having an introduction efficiency of about 100% has a minimum of about 1,000 μm. ² And the height was about 10 μm. Theoretically, it is thought that a puddle structure can be formed even with a smaller volume. The “puddle structure” larger than the above range can be increased to infinity depending on the amount of the liposome solution to be injected and the size of the cell group to be injected.
[0105]
As described above, the liposome solution is injected using the introduction method of the present invention so as to form a “puddle structure” in which the target region of the mouse embryo is filled with the liposome solution. Thus, the gene was almost certainly introduced into the cells in the target region of the mouse embryo. This shows that the introduction method of the present invention can be used when introducing a foreign substance into an adult mouse, and in the future, clinically into a human living body. It is believed that there is.
[0106]
【The invention's effect】
The introduction method according to the present invention, as described above, when locally introducing a foreign substance into a living body, injects or blows the complex-containing liquid from the distal end of the tubular member to a target region in the living body. By attaching, the foreign substance is introduced into the cells in the target region, so that the foreign substance can be surely introduced into the target cells. Furthermore, since it is a practical method that can be performed at low cost with high efficiency, reproducibility, safety, and convenience, it has various usefulness as described above. Therefore, the present invention can be effectively used in research fields such as medicine and biochemistry, and in medical fields such as gene therapy and regenerative medicine.
[Brief description of the drawings]
1 (a) to 1 (c) are schematic diagrams in which a “puddle structure” is formed by injecting a liposome solution into a 5-day embryo of a mouse using the gene transfer method according to the present invention. . (D) is a mouse embryo several minutes after injecting the liposome solution.
FIG. 2 is a schematic view of a 5-day embryo of a mouse into which a gene has been introduced using the gene transfer method according to the present invention, wherein (a) shows that β-galactosidase was expressed, and (b) shows that GFP was expressed. Show.
FIGS. 3A and 3B are schematic diagrams showing an 8-day embryo of a mouse. FIG. 3A is a diagram showing a state before injection of a liposome solution, and FIG. 3B is a diagram showing a “puddle structure” obtained by injecting a liposome solution using the gene transfer method according to the present invention. Immediately after the formation, (d) is a few minutes after the liposome solution was injected.
FIG. 4 is a schematic diagram of an 8 day embryo of a mouse showing that GFP was expressed by injecting a liposome solution in a part and (b) in a wide area using the gene transfer method according to the present invention. It is.

Claims

When introducing a foreign substance locally into the living body,
By injecting or spraying a complex-containing liquid containing a complex of a substance that interacts with a cell surface and the foreign substance from the distal end of the tubular member to a target region in a living body, An introduction method comprising introducing the foreign substance into cells in a region.

The target region in the living body is a cell space in the living body,
When injecting the complex-containing liquid into a target region in a living body, the tubular member is pierced into a cell space in the living body, and a structure filled with the complex-containing liquid is formed in the cell space in the living body. The introduction method according to claim 1, wherein the injection is performed from a distal end of the tubular member to a target region in a living body.

When spraying the complex-containing liquid to a target region in a living body, the tip of the tubular member is applied to the surface of the living body, and the complex-containing liquid is discharged from the tip of the tubular member to the surface of the living body. The introduction method according to claim 1, wherein

4. The method according to claim 1, wherein the foreign substance is introduced into a fine region of 170 μm ³ or more and 1400 μm ³ or less. 5.

The introduction method according to any one of claims 1 to 4, wherein the inner diameter of the distal end of the tubular member is equal to or larger than the size of the composite.

The introduction method according to any one of claims 1 to 4, wherein the inner diameter of the distal end of the tubular member is 50 nm or more.

The introduction method according to any one of claims 1 to 6, wherein the foreign substance is at least one of a nucleic acid, a protein, and a chemical substance.

The method according to claim 7, wherein the nucleic acid is at least one of DNA, RNA, and chromosome itself.

9. The method according to claim 1, wherein the foreign substance includes, in addition to the foreign substance to be introduced into the living body, an indicator substance that can be an index for confirming that the foreign substance to be introduced has been introduced. The introduction method according to any one of the above.

10. The method according to claim 1, wherein the substance that interacts with the cell surface is a liposome.

The method according to any one of claims 1 to 10, wherein the living body is a mammalian embryo or an adult.

A transformant into which a foreign substance has been introduced by the introduction method according to any one of claims 1 to 11.

13. The transformant according to claim 12, which is a mammalian embryo or an adult.

An introduction kit for performing the introduction method according to any one of claims 1 to 11.

A method for treating a disease using the introduction method according to any one of claims 1 to 11.

A therapeutic agent comprising the complex-containing liquid according to claim 1, which is used in the treatment method according to claim 15.

A treatment kit for performing the treatment method according to claim 15.