JP2004024852A - Cornea endothelium-like sheet and manufacturing method therefor - Google Patents

Cornea endothelium-like sheet and manufacturing method therefor Download PDF

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JP2004024852A
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Japanese (ja)
Inventor
Yutaka Ishino
Shigeru Kinoshita
Takahiro Nakamura
Yoichiro Sano
中村 隆宏
佐野 洋一郎
木下 茂
石野 豊
Original Assignee
Amniotec:Kk
株式会社アムニオテック
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Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a transplanting material applicable to therapy of various diseases each requiring the transplantation of a cornea endothelium. <P>SOLUTION: After breeding of collected cornea endothelium cells, the cells are seeded on an amnion and cultivated to obtain a cornea endothelium-like sheet in which a cell layer comprising cornea endothelium originating cells formed on the amnion is formed. <P>COPYRIGHT: (C)2004,JPO

Description

【0001】 [0001]
【産業上の利用分野】 BACKGROUND OF THE INVENTION
本発明は角膜内皮様シート、及びその作製方法に関する。 The present invention relates to a corneal endothelium-like sheet, and a manufacturing method thereof. 本発明で提供される角膜内皮様シートは角膜内皮の移植が必要とされる疾患、例えば水疱性角膜症、角膜浮腫、角膜白斑、円錐角膜等の治療における移植材料として利用できる。 Corneal endothelium-like sheet provided by the present invention can be used as implant materials diseases such bullous keratopathy, corneal edema, corneal vitiligo, in the treatment of such keratoconus needed transplantation of corneal endothelium.
【0002】 [0002]
【従来の技術】 BACKGROUND OF THE INVENTION
近年、眼内手術件数の増加により術後に角膜内皮に不可逆的な障害を生じ角膜混濁をきたす疾患が急増している。 In recent years, diseases causing a corneal opacity caused irreversible damage to the corneal endothelium is rapidly increasing in the post-operative due to an increase in intraocular surgery number. 現在のところ、これら角膜内皮疾患に対する治療として用いられているのは全層角膜移植術である。 Currently, have been used as treatment for these corneal endothelial disorder is full-thickness keratoplasty. しかし、全層角膜移植術後の内皮型拒絶反応は現在も眼科臨床の場において最大の問題となっており、拒絶反応を防止する新たな治療法の開発が待たれている。 However, endothelial rejection full thickness corneal transplantation surgery is currently also the biggest problems in ophthalmic clinical setting, the development of new therapies to prevent rejection is awaited.
一方、正常の前眼部は免疫抑制環境であることは良く知られている。 On the other hand, it is well known anterior segment of the normal is an immunosuppressive environment. この免疫抑制環境を構成する因子として角膜、虹彩から産生されるtransforming growth factor beta(TGF−β)、vasoactvie intestinal peptide(VIP)等の免疫抑制物質が重要な役割を果たしている。 Cornea as a factor constituting the immunosuppressive environment, transforming growth factor beta produced from the iris (TGF-β), immunosuppressants such as vasoactvie intestinal peptide (VIP) plays an important role. また、前眼部組織からのこれら免疫抑制物質の産生は実質内を走行する角膜知覚神経と密接に関連しており、全層角膜移植における角膜知覚神経の切断によりその産生が抑制されることが報告されている(Streilein JW, Bradley D, Sano Y, Sonoda Y: Immunosuppressive properties of tissues obtained from eyes with experimentally manipulated corneas. Invest Ophthalmol Vis Sci. 37(2):413−424, 1996. Sano Y, Streilein JW: Effects of corneal surgical wounds on ocular immune Furthermore, production of these immunosuppressive substances from the anterior segment tissues is closely related to corneal sensory nerves traveling intraparenchymal, is that the production is suppressed by cutting the corneal sensory nerves in all layers keratoplasty the reported (Streilein JW, Bradley D, Sano Y, Sonoda Y:. immunosuppressive properties of tissues obtained from eyes with experimentally manipulated corneas Invest Ophthalmol Vis Sci 37 (2):. 413-424, 1996. Sano Y, Streilein JW : Effects of corneal surgical wounds on ocular immune rivilege. In: Nussenblatt RB, Whitcup SM, Caspi RR, and Gery I eds. Advances in Ocular immunology. Amsterdam, ELSEVIER:207−210, 1994.)。 rivilege In:... Nussenblatt RB, Whitcup SM, Caspi RR, and Gery I eds Advances in Ocular immunology Amsterdam, ELSEVIER: 207-210, 1994.). 従って、これまで全層角膜移植が行われていた角膜内皮疾患に対し、前眼部の免疫抑制環境の破綻を最小限にとどめるべく、障害された内皮細胞のみを健常な内皮細胞と置き換えることができれば拒絶反応の抑制が期待できる理想的な術式となる。 Therefore, contrary to the corneal endothelium diseases full thickness corneal transplantation has been performed, to keep the collapse of immunosuppressive environment of the anterior segment to a minimum, to replace only the impaired endothelial cells to healthy endothelial cells an ideal surgical procedures suppression of rejection can be expected if possible.
さらに、角膜裏面だけを置き換えるため、手術後の角膜乱視が少なく、早期からの視力回復が望める。 In addition, in order to replace only the cornea back, corneal astigmatism less after surgery, overlooking eyesight recovery from an early stage.
【0003】 [0003]
【発明が解決しようとする課題】 [Problems that the Invention is to Solve
角膜内皮細胞を移植するためにはそのキャリアとしての基質が不可欠であることから、基質上に角膜内皮細胞が層をなしたシートをin vitroで作製する必要がある。 To implant corneal endothelial cells since the substrate serving as the carrier is essential, there sheets corneal endothelial cells were layered on the substrate must be prepared by in vitro. これまで角膜内皮細胞は増殖能を持たないとされていたが、in vitroではその増殖が確認されており(Hyldahl L: Primary cell cultures from human embryonic corneas. J Cell Sci. 66: 343−351, 1984. Senoo T, Obara Y, Joyce N: EDTA: A promoter of proliferation in human corneal endothelium. Invest Ophthalmol Vis Sci. 41: 2930−2935, 2000. Miyata K, Drake J, Osakabe Y,et al.: Effect of donor age on morphologic variation of Until now, the corneal endothelial cells had been not to have the ability to grow, in the in vitro the growth has been confirmed (Hyldahl L:. Primary cell cultures from human embryonic corneas J Cell Sci 66:. 343-351, 1984 . Senoo T, Obara Y, Joyce N: EDTA:. A promoter of proliferation in human corneal endothelium Invest Ophthalmol Vis Sci 41:. 2930-2935, 2000. Miyata K, Drake J, Osakabe Y, et al .: Effect of donor age on morphologic variation of ultured human corneal endothelial cells. Cornea. 20: 59−63, 2001 )、適切な基質や培養条件を見出せば角膜内皮細胞シートを作成することが可能であると考えられる。 .. Ultured human corneal endothelial cells Cornea 20: 59-63, 2001), it may be possible to create a corneal endothelial cell sheet if find a suitable substrate and culture conditions. 一方、角膜内皮細胞層の周辺部に幹細胞の存在が示唆されはじめている(Bednarz J, Engelmann K: Indication for precursor cells in the adult human corneal endothelium. Invest Ophthalmol Vis Sci. 42(suppl): S274, 2001.)。 On the other hand, the corneal endothelial cell layer of the peripheral part to stem there is beginning to be suggested (Bednarz J of cells, Engelmann K:. Indication for precursor cells in the adult human corneal endothelium Invest Ophthalmol Vis Sci 42 (suppl):. S274, 2001. ). 従って、高い増殖能をもった角膜内皮幹細胞をin vitroで培養し増殖させることができれば、わずかに得られた角膜内皮細胞から移植用材料として利用可能な角膜内皮シートを作製できる可能性がある。 Therefore, high if proliferative capacity corneal endothelial stem cells having cultured in vitro it is possible to grow, it is possible that the available corneal endothelium sheet can be prepared as a slightly graft material from the corneal endothelial cells obtained. 特に、自己の残存した角膜内皮細胞を用いれば拒絶反応を全く生じない角膜移植術の開発に発展することが期待される。 In particular, it is expected to develop in the development of corneal transplantation does not cause any rejection by using the corneal endothelial cells self remaining. 本発明は以上の背景の下になされたものであって、角膜内皮疾患に対する治療としての角膜内皮移植術に使用できる角膜内皮様シートを提供することを目的とする。 The present invention was made under the above background, and an object thereof is to provide a corneal endothelium-like sheet that can be used for corneal endothelium transplantation as a treatment for corneal endothelial disorders.
【0004】 [0004]
【課題を解決するための手段】 In order to solve the problems]
本発明者らは以上の課題に鑑み鋭意検討を行った。 The present inventors have conducted intensive studies in view of the above problems. 具体的にはin vitroでの角膜内皮細胞の培養に適した基質の選定、及び高い細胞密度の細胞層を形成させる方法を検討した。 Specifically we discussed a method for forming a corneal endothelial cell selection of substrates suitable for culturing, and high cell layer of cell density in in vitro. まず、角膜内皮細胞を採取し、in vitroで培養して増殖させた。 First, the corneal endothelial cells were harvested and grown in culture in the in vitro. 増殖した細胞を継代培養するとともに、適宜遠心処理することによって細胞密度の高い細胞浮遊液を作製した。 As well as subcultured cells grown to produce a high cell suspension cell density by appropriate centrifugation. 次に、基質(キャリア)としてコラーゲンを主成分とする羊膜を採用し、その上に細胞浮遊液を播種し、所定時間培養した。 Then, the amniotic membrane mainly composed of collagen as a substrate (carrier) employed, seeded cell suspension thereon, a predetermined time culture. その結果、角膜内皮細胞由来の細胞が生体と類似した形態の単層化した細胞層が形成され、この細胞層の形態を観察したところ生体の角膜内皮細胞層と同等の細胞密度を有し、かつ角膜内皮細胞層と同様に略六角形状の細胞が規則正しく単層化して構成されるものであった。 As a result, cell layer cells derived from corneal endothelial cells were monolayered of similar form with the living body is formed, having a corneal endothelial cell layer and the equivalent cell density of the biological observation of the form of the cell layer, and it was achieved substantially hexagonal cells similar to the corneal endothelial cell layer is constituted by regularly single layer of. 一方、得られた羊膜及び細胞層からなるシート状組成物を角膜内皮細胞層を一部切除した家兎に移植したところ良好な生着が認められ、当該組成物を角膜内皮細胞移植用の材料として好適に利用できることが確認された。 On the other hand, it observed resulting amnion and sheet composition good engraftment was implanted in a part excised rabbit corneal endothelial cell layer consisting of cells layer, the composition for corneal endothelial cell transplantation material It can be suitably used as was confirmed. 本発明は以上の知見に基づきなされたものであって次の構成を提供する。 The present invention was made based on the above findings provides the following configurations.
[1] コラーゲン層と、該コラーゲン層上に形成された細胞層であって、角膜内皮由来の細胞からなる細胞層と、を備える角膜内皮様シート。 [1] and collagen layers, a cell layer formed on the collagen layer, a corneal endothelium-like sheet comprising a cell layer consisting of corneal endothelial cells from the.
[2] 前記コラーゲン層が羊膜由来である、[1]に記載の角膜内皮様シート。 [2] wherein the collagen layer is derived from amniotic membrane, corneal endothelium-like sheet described in [1].
[3] 前記コラーゲン層が上皮を除去した羊膜からなる、[1]に記載の角膜内皮様シート。 [3] consists of amniotic membrane wherein the collagen layer is removed epithelium, corneal endothelium-like sheet described in [1].
[4] 角膜内皮由来の細胞からなる細胞層を備える角膜内皮様シート。 [4] corneal endothelium-like sheet comprising a cell layer consisting of corneal endothelial cells derived from.
[5] 前記細胞層が一層構造である、[1]〜[4]のいずれかに記載の角膜内皮様シート。 [5] The cell layer is a single layer structure, [1] the corneal endothelium-like sheet according to any one of - [4].
[6] 前記細胞層の細胞密度が約2,000〜約4,000個/mm である、[1]〜[5]のいずれかに記載の角膜内皮様シート。 [6] The cell density of the cell layer is about 2,000 to about 4,000 / mm 2, [1] the corneal endothelium-like sheet according to any one of to [5].
[7] 前記角膜内皮由来の細胞の平面視形状が略六角形である、[1]〜[6]のいずれかに記載の角膜内皮様シート。 [7] The corneal endothelium-derived plan view shape of the cells are substantially hexagonal, [1] the corneal endothelium-like sheet according to any one of to [6].
[8] 前記細胞層において、前記角膜内皮由来の細胞が規則的に整列している、[1]〜[7]のいずれかに記載の角膜内皮様シート。 [8] in said cell layer, the corneal endothelium-derived cells are regularly aligned, [1] the corneal endothelium-like sheet according to any one of - [7].
[9] 以下のステップを含んでなる、角膜内皮様シートの作製方法、 [9] comprising the following steps, a method for manufacturing a corneal endothelium-like sheet,
a)採取した角膜内皮細胞を培養して増殖させるステップ、 a) step of growing by culturing a corneal endothelial cells collected,
b)増殖した角膜内皮細胞を回収して細胞浮遊液を作製するステップ、及びc)前記細胞浮遊液をコラーゲン層上に播種し、培養するステップ。 b) the step of proliferating corneal endothelial cells were harvested to prepare a cell suspension, and c) the cell suspension was seeded on a collagen layer and culturing step.
[10] 前記ステップb)の後に、次のステップが行われる、[9]に記載の角膜内皮様シートの作製方法、 [10] after the step b), the following steps are performed, a method for manufacturing a corneal endothelium-like sheet described in [9],
b−1)遠心処理によって前記細胞浮遊液の細胞密度を高めるステップ。 The step of increasing the cell density of the cell suspension by b-1) centrifugation.
[11] 前記ステップc)において、細胞浮遊液を播種した後に遠心処理する、ことを特徴とする[9]又は[10]に記載の角膜内皮様シートの作製方法。 [11] In the above step c), the centrifugal treatment after seeding cell suspension, a method for manufacturing a corneal endothelium-like sheet having the constitution [9] or [10] that.
[12] 前記ステップc)が以下のステップを含んでなる、[9]又は[10]に記載の角膜内皮様シートの作製方法。 [12] The step c) comprises the following steps, [9] or [10] a method for manufacturing a corneal endothelium-like sheet according to.
c−1)培養容器内に、培養液を通過可能なポアサイズの膜からなる底面を有する容器を留置するステップ、 To c-1) culture vessel, the step of placing a container having a bottom made of a film that can be passed through a pore size of the culture solution,
c−2)前記容器の前記底面上にコラーゲン層を形成するステップ、 c-2) forming a collagen layer on the bottom surface of the container,
c−3)前記細胞浮遊液をコラーゲン層上に播種するステップ、 c-3) the step of cell suspension is seeded on a collagen layer,
c−4)遠心処理するステップ、及びc−5)培養するステップ。 c-4) Step centrifuging, and c-5) the step of culturing.
[13] 前記コラーゲン層が羊膜由来である、[9]〜[12]のいずれかに記載の角膜内皮様シートの作製方法。 [13] wherein the collagen layer is derived from amniotic membrane, [9] to a method for manufacturing a corneal endothelium-like sheet according to any one of [12].
[14] 前記コラーゲン層が上皮を除去した羊膜からなる、[9]〜[12]のいずれかに記載の角膜内皮様シートの作製方法。 [14] consists of amniotic membrane wherein the collagen layer is removed epithelium [9] to a method for manufacturing a corneal endothelium-like sheet according to any one of [12].
尚、本明細書において「角膜内皮様シート」とは角膜内皮細胞層に類似する特徴を有し、角膜内皮細胞層の再建のために移植に供され得る組成物を意味する用語として使用される。 In the present specification, "corneal endothelium-like sheet" has characteristics similar to the corneal endothelial cell layer is used as a term to mean a composition which can be subjected to transplantation for reconstruction of corneal endothelial cell layer . また、特に記載のない限り、「角膜内皮細胞」とは角膜内皮細胞層に含まれる細胞を包括した表現として使用され、即ち角膜内皮幹細胞をも含む。 Further, unless otherwise specified, the term "corneal endothelial cells" is used as a representation that encompass cells contained in corneal endothelial cell layer, also including words corneal endothelial stem cells.
【0005】 [0005]
【発明の実施の形態】 DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
本発明は角膜内皮様シートに関し、その構成はコラーゲン層と、該コラーゲン層上に形成された細胞層であって、角膜内皮由来の細胞からなる細胞層とを備える。 The present invention relates to a corneal endothelium-like sheet, and its configuration is the collagen layer, a cell layer formed on the collagen layer, and a cell layer consisting of corneal endothelial cells derived from.
ここでのコラーゲン層を構成するコラーゲンの種類は特に限定されないが、コラーゲン層が羊膜由来であることが好ましい。 Although here the type of collagen that constitutes the collagen layer of the not particularly limited, but preferably the collagen layer is derived from amniotic membrane. 更には、コラーゲン層が羊膜から掻爬処理などにより上皮を除去したものからなることが好ましい。 Furthermore, it is preferable to consist of collagen layer was removed epithelium due scraping process from amniotic membrane. コラーゲン層がこのような上皮を除去した羊膜を原材料としたものであることは、コラーゲン層に羊膜上皮層の細胞が含まれていないことを調べることによって確認できる。 It collagen layer is obtained by a raw material amnion is removed such epithelium can be confirmed by examining that does not contain cells of amniotic epithelial layer to the collagen layer. 羊膜としてヒト羊膜を用いることが特に好ましい。 It is particularly preferable to use a human amniotic membrane as amniotic membrane. 尚、「羊膜由来である」とは広く羊膜を出発原料としていることを意味する。 Incidentally, this means that you are widely amniotic starting material as "amnion is derived".
一方、本発明において「角膜内皮由来の細胞」とは、採取した角膜内皮細胞を培養した結果、増殖、分化等をすることによって生じた細胞をいう。 On the other hand, the "corneal endothelial cells derived from" in the present invention, as a result of culturing the collected corneal endothelial cells, proliferation, refers to a cell produced by differentiation or the like.
【0006】 [0006]
本発明の角膜内皮様シートは、好ましくは以下の性状ないし特徴のいくつかを備えるものである。 Corneal endothelium-like sheet of the present invention are preferably those comprising a number of the following properties or characteristics. 特に好ましくは、以下の全ての性状ないし特徴を備えるものである。 Particularly preferred are those having all of the properties or characteristics described below.
(1)細胞層が一層構造(単層構造)である。 (1) cell layer is a single layer structure (single layer structure). これは生体の角膜内皮細胞層が備える特徴の一つである。 This is one of the characteristics of the corneal endothelial cell layer of the living body.
(2)生体の角膜内皮細胞層の細胞密度はヒト新生児で約4,000細胞/mm といわれ、成長、加齢とともに低下し、成人では正常な状態で約2,000〜約3,000細胞/mm である。 (2) cell density of the corneal endothelial cell layer in the body is said to be about 4,000 cells / mm 2 in human neonates, growth, decreases with age, approximately in a normal state in adults 2,000 to about 3,000 it is a cell / mm 2. このことを考慮すれば、本発明の角膜内皮様シートを構成する細胞層における細胞密度は約2,000〜約4,000細胞/mm であることが好ましい。 Taking this into consideration, it is preferred cell density in the cell layer of the corneal endothelium-like sheet of the present invention is from about 2,000 to about 4,000 cells / mm 2. 特に、成人をレシピエント(移植者)とする場合には約2,000〜約3,000細胞/mm であることが好ましい。 It is particularly preferred when the adult recipient (recipient) is about 2,000 to about 3,000 cells / mm 2.
(3)細胞層を構成する細胞の平面視形状が略六角形である。 (3) it is a plan view shape is substantially hexagonal cells constituting the cell layer. これは生体における角膜内皮細胞層を構成する細胞が備える特徴の一つである。 This is one of the characteristics of the cells constituting the corneal endothelial cell layer in the body. この特徴が認められることにより、本発明の角膜内皮様シートは生体の角膜内皮細胞層に類似し、角膜内皮細胞層と同様の機能を発揮することが期待される。 By this feature is observed, the corneal endothelium-like sheet of the present invention is similar to the corneal endothelial cell layer of the living body, it is expected to exhibit the same function as the corneal endothelial cell layer.
(4)細胞層において細胞が規則正しく整列している。 (4) cells are regularly arranged in the cell layer. 生体の角膜内皮細胞層においてはそれを構成する細胞は規則正しく整列しており、これによって高い透明性が維持され、また角膜の水分調整機能が適切に発揮されると考えられている。 Cells constituting it in corneal endothelial cell layer of the living body are regularly aligned, it believed whereby high transparency is maintained and also moisture control capabilities of the cornea is properly exhibited. したがって、このような形態的な特徴を備えることにより、本発明の角膜内皮様シートは生体における角膜内皮細胞層と同様の機能を発揮することが期待される。 Thus, by providing such morphological characteristics, corneal endothelium-like sheet of the present invention is expected to exert the same function as the corneal endothelial cell layer in the body.
【0007】 [0007]
本発明の角膜内皮様シートは例えば以下の方法により作製することができる。 Corneal endothelium-like sheet of the present invention can be prepared by the following method for example.
<1>角膜内皮細胞の採取、及び増殖角膜内皮細胞はレシピエント自身又は適当なドナーの角膜から常法で採取される。 <1> Collection of corneal endothelial cells, and proliferation corneal endothelial cells are harvested in a conventional manner from the cornea of ​​the recipient himself or a suitable donor. 例えば、角膜組織のデスメ膜と内皮細胞層を角膜実質から剥離した後、培養皿に移し、ディスパーゼなどで処理する。 For example, Descemet's membrane and the endothelial cell layer of the corneal tissue after peeling from the corneal stroma, transferred to a culture dish and treated with a dispase. これによって角膜内皮細胞はデスメ膜より脱落する。 This corneal endothelial cells to fall off from the Descemet's membrane. デスメ膜に残存している角膜内皮細胞はピペッティングなどによって脱落させることができる。 Corneal endothelial cells remaining Descemet's membrane can be dropped, such as by pipetting. デスメ膜を除去した後、角膜内皮細胞が成育できる適当な培養液中で角膜内皮細胞を培養する。 After removal of the Descemet's membrane, culturing corneal endothelial cells in the corneal endothelial cells can grow a suitable culture medium. 培養液としては例えば市販のDMEM(Dullbecco's Modified Eagle's Medium)にFBS(ウシ胎仔血清)、b−FGF(basic−fibloblast growth factor)、EGF(epidermal growth factor)、insulin、及びペニシリン、ストレプトマイシンなどの抗生物質を適宜添加したものを使用することができる。 Examples of culture media for example a commercially available DMEM (Dullbecco's Modified Eagle's Medium) in FBS (fetal bovine serum), b-FGF (basic-fibloblast growth factor), EGF (epidermal growth factor), insulin, and penicillin, streptomycin it can be used those obtained by adding an antibiotic as appropriate. 培養容器(培養皿)にはその表面にI型コラーゲン、IV型コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン、又はウシ内皮細胞の細胞外マトリックスなどをコーティングしてあるものを使用することが好ましい。 Type I collagen on the surface of the culture vessel (culture dish), IV collagen, fibronectin, it is preferable to use a laminin, or bovine endothelial cells in the extracellular matrix and are coated. 角膜内皮細胞の培養容器表面への接着が促され、良好な増殖が行われるからである。 Adhesion to the culture vessel surface of the corneal endothelial cells is promoted, because good growth is made.
【0008】 [0008]
角膜内皮細胞を培養する際の温度条件は角膜内皮細胞が成育する限りにおいて特に限定されないが、例えば約25℃〜約45℃、増殖効率を考慮すれば好ましくは約30℃〜約40℃、更に好ましくは約37℃である。 The temperature conditions for culturing corneal endothelial cells are not particularly limited as long as the corneal endothelial cells grow, for example, about 25 ° C. ~ about 45 ° C., preferably about 30 ° C. ~ about 40 ° C. In view of the growth efficiency, and further preferably about 37 ° C.. 培養時間は使用する細胞の状態などによっても異なるが、例えば7〜14日間である。 It varies depending on the condition of cells to be used culture time, for example 7-14 days.
【0009】 [0009]
ここで、利用可能な場合にはレシピエント自身の角膜内皮細胞を用いることが好ましい。 Here, it is preferable to use a corneal endothelial cell of the recipient itself if available. 移植に供した際に免疫拒絶反応の惧れが無い角膜内皮様シートの作製が可能となり、即ち免疫拒絶反応を伴わない移植術が可能となるからである。 Preparation of fear Re there is no corneal endothelium-like sheet of immune rejection when it is subjected to transplantation becomes possible, that is, because the grafting is possible without immune rejection. レシピエント自身の角膜内皮細胞が入手できないか或は入手が困難な場合にはレシピエント以外の角膜内皮細胞を用いることもできるが、この場合には免疫適合性を考慮してドナーを選択することが好ましい。 Although if the corneal endothelial cells of the recipient's own is difficult or available not available can also be used corneal endothelial cells other than the recipient, in this case to select a donor in consideration of immunocompatibility that It is preferred.
【0010】 [0010]
<2>継代培養、細胞浮遊液の作製培養に供された角膜内皮細胞が増殖した後に継代培養を行うことができる。 <2> subculture, corneal endothelial cells subjected to producing culture of cell suspension can be subcultured after growth. 好ましくはサブコンフルエントないしコンフルエントになった時点で継代培養を行う。 Preferably performs subculture as it becomes subconfluent or confluent. 継代培養は次のように行うことができる。 Subculture can be carried out in the following manner. まずtrypsin−EDTA等で処理することによって細胞を培養容器表面から剥がし、次いで細胞を回収する。 Peeled off cells from the culture vessel surface by first treating with trypsin-EDTA and the like, then the cells are harvested. 回収した細胞に培養液を加えて細胞浮遊液とする。 The recovered cells by adding culture medium to the cell suspension. 細胞を回収する際、或は回収後に遠心処理を行うことが好ましい。 When recovering the cells, or it is preferable to perform centrifugation after collection. かかる遠心処理によって細胞密度の高い細胞浮遊液を調製することができる。 It can be prepared a high cell suspension cell density by such centrifugation. 尚、ここでの遠心処理の条件としては、例えば 500 rpm(30g)〜1000 rpm(70g)、1〜10分を挙げることができる。 As the conditions for the centrifugation treatment here, for example, 500 rpm (30g) ~1000 rpm (70g), mention may be made of 1 to 10 minutes.
細胞浮遊液は上記の初期培養と同様に培養容器に播種され、培養に供される。 Cell suspension are seeded in culture vessels as with the above-mentioned initial culture, and cultured. 継代培養は上記の初期培養と同様の培養条件で行うことができる。 Passage culture can be performed under the same culture conditions as the above-mentioned initial culture. 培養時間は使用する細胞の状態などによっても異なるが、例えば7〜21日間である。 It varies depending on the condition of cells to be used culturing time is, for example, 7 to 21 days. 以上の継代培養は必要に応じて複数回行うことができる。 It can be carried out several times if necessary or subculture. 継代培養を繰り返すことにより細胞数を増加でき、また細胞密度の高い細胞浮遊液を調製することができる。 Can increase the number of cells by repeating subculture, also can be prepared with a high cell density cell suspension. 最終的に約5×10 細胞/ml〜20×10 細胞/mlの細胞密度を有する細胞浮遊液を調製することが好ましい。 It is preferred to prepare a cell suspension having a cell density of the finally about 5 × 10 5 cells / ml to 20 × 10 5 cells / ml.
【0011】 [0011]
<3>細胞浮遊液の播種、培養細胞浮遊液はコラーゲン層上に播種され、培養に供される。 <3> seeding cell suspension, cultured cell suspension was seeded on a collagen layer, and cultured. この際、最終的に作製される角膜内皮様シートにおいて所望の細胞密度の細胞層が形成されるように播種する細胞数が調整される。 At this time, the number of cells inoculated at a cell layer having a desired cell density in the corneal endothelium-like sheet is formed to be finally produced is adjusted. 具体的には細胞密度が約2,000〜約4,000細胞/mm の細胞層が形成されるように、例えば1 mm あたり約3,000個〜約7,500個、好ましくは約5,000個〜 7,500個の細胞を播種する。 As specifically cell layer of the cell density of about 2,000 to about 4,000 cells / mm 2 is is formed, for example, from about 3,000 to about 7,500 per 1 mm 2, preferably about It is seeded with 5,000 ~ 7,500 cells. 培養は上記の初期培養などと同様の条件で行うことができる。 Culture can be performed under the same conditions and the like above the initial culture. 培養時間は使用する細胞の状態などによっても異なるが、例えば3〜21日間である。 It varies depending on the condition of cells to be used culture time, for example 3 to 21 days.
【0012】 [0012]
ここで、コラーゲン層の原材料となるコラーゲンの種類は特に限定されず、I型コラーゲン、III型コラーゲン、IV型コラーゲン、VIII型コラーゲンなどを用いることができる。 Here, the type of collagen as a raw material for the collagen layer is not particularly limited, and may be type I collagen, III collagen, IV collagen, and type VIII collagens. 複数の種類のコラーゲンが混在するものを用いることもできる。 A plurality of types of collagen may be used as the mixed. これらのコラーゲンはブタ、ウシ、ヒツジなどの動物の皮膚、軟骨などの結合組織から酸可溶化法、アルカリ可溶化法、酵素可溶化法などにより抽出、精製することができる。 These collagens are pigs, cattle, acid solubilization of connective tissue such as animal skin, cartilage, such as sheep, alkaline solubilization, extraction and the like enzymatic solubilization, it can be purified. 尚、抗原性を低下させる目的から、ペプシンやトリプシンなどの分解酵素で処理することによりテロペプチドを除去した、いわゆるアテロコラーゲンとしたものを用いることが好ましい。 Incidentally, the purpose of lowering the antigenicity were removed telopeptide by treatment with enzymes such as pepsin or trypsin, it is preferable to use a material obtained by a so-called atelocollagen.
【0013】 [0013]
コラーゲン層として羊膜由来、特にヒト羊膜由来のものを用いることが特に好ましい。 Amnion-derived as the collagen layer, in particular it is particularly preferred to use those derived from human amnion. ここで、「羊膜由来」とは広く羊膜を出発原料として得られたものであることを意味する。 Here, it means that the broad amnion as "amnion-derived" is obtained as a starting material. ヒト羊膜は子宮と胎盤の最表層を覆う膜であって、コラーゲンに富む実質組織上に基底膜及び上皮層が形成されて構成される。 Human amniotic membrane a membrane covering the outermost layer of the uterus and placenta, configured by basement membrane and epithelial layers on parenchyma rich in collagen formation. ヒト羊膜は例えば分娩時に後産として得られるヒト胎仔膜、胎盤などから採取することができる。 Human amniotic membrane can be collected such as human embryonic membrane obtained as afterbirth at delivery, such as the placenta. 具体的には、分娩直後に得られるヒト胎仔膜、胎盤及び臍帯からなる一体物を処理、精製することによりヒト羊膜を調製することができる。 Specifically, human embryonic membrane obtained immediately after delivery, processing an integrated composed of the placenta and umbilical cord, can be prepared human amniotic by purification. 処理、精製方法は特開平5−5698号に記載される方法などの公知の方法を採用できる。 Treatment, the purification method can be employed a known method such as the method described in JP-A-5-5698. 即ち、分娩時に得られる胎仔膜より羊膜を剥離し、超音波洗浄等の物理的処理及び酵素処理などにより残存組織を除去し、適宜洗浄工程を経てヒト羊膜を調製することができる。 That is, amnion was peeled off from the resulting fetal membranes during labor, the remaining tissue was removed by physical treatment and enzyme treatment of ultrasonic cleaning or the like, can be prepared human amniotic through appropriate washing process.
【0014】 [0014]
このように調製したヒト羊膜を使用時まで凍結して保存しておくことができる。 The thus prepared human amniotic may have been stored frozen until use. ヒト羊膜の凍結は例えば−80℃、DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium)とグリセロールとを体積比で等量混合した液中で行うことができる。 Human amniotic freezing example -80 ° C., can be carried out in equal amounts mixed solution in glycerol and DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium) at a volume ratio. 凍結保存することにより操作性が向上することは勿論のこと、抗原性が低下することも期待できる。 Frozen by storing it of course possible to improve the operability can also be expected that the antigenicity is lowered.
【0015】 [0015]
羊膜をそのままコラーゲン層として利用することもできるが、羊膜から掻爬処理などによって上皮を除去したものを利用することが好ましい。 Although amniotic membrane may directly be used as the collagen layer, it is preferable to use a material obtained by removing the epithelium, such as by scraping process from amniotic membrane. 例えば、上記のように凍結保存したヒト羊膜を解凍した後、EDTAやタンパク分解酵素で処理して細胞間の接着を緩め、そしてセルスクレイパーなどを用いて上皮を掻爬することにより、上皮が除去されたヒト羊膜を調製することができる。 For example, after thawing the cryopreserved human amniotic membrane, as described above, loosen the adhesion between cells treated with EDTA or proteolytic enzyme, and by scraping the epithelium using a cell scraper, the epithelium is removed the human amniotic membrane can be prepared.
コラーゲン層として上皮を除去したヒト羊膜を利用する場合には、上皮を除去して表出した面側(即ち、基底膜側)に角膜内皮細胞を播種することが好ましい。 When using the human amniotic membrane to remove the epithelial as collagen layer exposed to the surface side by removing the epithelium (i.e., basal side) it is preferred to seed the corneal endothelial cells. この面側にはIV型コラーゲンが多量に含まれており、播種された角膜内皮細胞の増殖、接着を良好に行うことができると考えられるからである。 This side is considered to have been contained in large amount of type IV collagen, proliferation of seeded corneal endothelial cells, can be well adhered.
【0016】 [0016]
コラーゲン層上での角膜内皮細胞の培養は例えば次のようにして行うことができる。 Culture of corneal endothelial cells on the collagen layer can be carried out, for example, as follows. まず、培養液を通過可能なポアサイズの膜からなる底面を有する容器(以下、「カルチャーインサート」ともいう)を底面を下にして培養容器内に留置する。 First, the container having a bottom made of a film that can be passed through a pore size of the medium (hereinafter, "Culture Insert" also referred to) is placed within the culture vessel to the bottom down. 続いて、カルチャーインサートの底面上(カルチャーインサート内側)にコラーゲン層を形成する。 Subsequently, a collagen layer on the bottom surface of the culture insert (culture insert inside). そして、コラーゲン層上に細胞浮遊液を播種し、培養する。 Then, cells were seeded suspension on the collagen layer and cultured. 尚、カルチャーインサートの底面に予めコラーゲン層を形成しておくこともできる。 It is also possible to previously formed collagen layer on the bottom surface of the culture insert. 即ち、例えばカルチャーインサートの底面に上皮を除去した羊膜をのせ(この状態で一旦乾燥処理を行ってもよい)、このカルチャーインサートを培養容器内に設置し、その後細胞浮遊液の播種、培養を行ってもよい。 Performed That is, for example placing the amniotic membrane was removed epithelium on the bottom surface of the culture insert (may be performed once dried in this state), set up the culture insert in a culture vessel, seeding of subsequent cell suspension, a culture it may be.
カルチャーインサートの底面に使用できる膜の例としてはポリカーボネート製、ポアサイズが約0.4μm〜3.0μmの膜を挙げることができる。 Examples of film that can be used on the bottom surface of the culture insert may be mentioned polycarbonate, membrane pore size of about 0.4Myuemu~3.0Myuemu. この他、ポリエステル製の膜などを使用することもできる。 In addition, it is also possible to use such a polyester film. このような膜は市販されており容易に入手することができる。 Such membranes are readily available are commercially available.
【0017】 [0017]
カルチャーインサート内に細胞浮遊液を播種した後に遠心処理を行うことができる。 Centrifugation after seeding cell suspension in culture in the insert can be performed. これによりコラーゲン層上の細胞密度を高めることができる。 Thereby increasing the cell density on the collagen layer. また、コラーゲン層表面への細胞の接着も良好なものとなる。 Also, adhesion of cells to the collagen layer surface becomes good. さらに、細胞密度の偏りが小さくなるといった効果も得られる。 Furthermore, there is also an effect such deviation of the cell density is lower. 尚、ここでの遠心処理の条件としては例えば500rpm(30g)〜1,000rpm(70g)、1〜10分を挙げることができる。 Here, for example, as a condition for centrifugation at 500rpm (30g) ~1,000rpm (70g), mention may be made of 1 to 10 minutes.
【0018】 [0018]
以上のようにして培養を行うことにより、コラーゲン層上に角膜内皮由来の細胞からなる細胞層が形成された角膜内皮様のシートが形成される。 By performing culture in the manner described above, the sheet of corneal endothelium-derived corneal endothelial-like cell layer was formed consisting of the cell is formed on a collagen layer. この角膜内皮様シートは角膜内皮の移植が必要な疾患、例えば水疱性角膜症、角膜浮腫、角膜白斑、円錐角膜の治療における移植材料(角膜内皮の代替)として用いることができる。 The corneal endothelium-like sheet can be used as a disease requiring transplantation of corneal endothelium, for example bullous keratopathy, corneal edema, corneal vitiligo, graft material in the treatment of keratoconus (corneal endothelium alternative). 尚、コラーゲン層の一部を除去したもの又は全部を除去したもの(即ち、細胞層のみ)を移植片として用いることもできる。 Incidentally, obtained by removing a part intended or all removing the collagen layer (i.e., the cell layer only) can be used as a graft. このコラーゲン層の除去はEDTA等による化学処理、タンパク分解酵素等による酵素処理、ピンセット等による掻爬などの物理的処理を適宜組み合わせて行うことができる。 Removal of the collagen layer is chemical treatment with EDTA, etc., enzymatic treatment with proteolytic enzymes and the like, can be appropriately combined physical treatment such as scraping by tweezers.
【0019】 [0019]
角膜内皮細胞の培養(初期培養、継代培養、及びコラーゲン層上での培養を含む)を支持細胞の共存下で行うことができる。 Corneal endothelial cell cultures (primary cultures, including culture in subculture, and collagen layer) can be carried out in the presence of feeder cells. 支持細胞とはfeeder細胞とも呼ばれ、培養液中に成長因子等などを供給する。 And feeder cells, also known as feeder cells, supplies such as growth factors and the like in the culture medium. 支持細胞との共存下で培養することにより、角膜内皮細胞の増殖効率の向上、分化促進などの効果が期待できる。 By culturing in the presence of the support cell, the improvement of growth efficiency of corneal endothelial cells, the effect of such differentiation promotion can be expected. 支持細胞には、例えば10T1/2線維芽細胞(Hyldahl L: Primary cell cultures from human embryonic corneas. J Cell Sci. 66: 343−351, 1984.)、3T3細胞(スイスマウス3T3細胞、マウスNIH3T3細胞、3T3J2細胞など)、角膜実質細胞などを用いることができる。 The feeder cells, for example, 10T1 / 2 fibroblast (Hyldahl L:. Primary cell cultures from human embryonic corneas J Cell Sci 66:.. 343-351, 1984), 3T3 cells (Swiss mice 3T3 cells, mouse NIH3T3 cells, 3T3J2 cells, etc.), etc. keratocytes can be used.
支持細胞の共存下で角膜内皮細胞の培養を行う場合には、角膜内皮細胞と支持細胞との間に支持細胞が通過できないポアサイズの隔離膜を介在させることが好ましい。 When performing culture of corneal endothelial cells in the presence of feeder cells, it is preferable to interpose a separator having a pore size of the support cells can not pass between the corneal endothelial cells and supporting cells. この隔離膜の利用によって培養時に角膜内皮細胞側に支持細胞が侵入することを防止できる。 Feeder cells corneal endothelium side in culture through the use of the isolation film can be prevented from entering. その結果、最終的に得られる角膜内皮様シート内に支持細胞が混在するおそれが無くなる。 As a result, the support cells finally obtained corneal endothelium-like in the sheet may have eliminated mixed. このことは、支持細胞による免疫拒絶の問題のない角膜内皮様シートの作製が可能になることを意味し、臨床上極めて有意義である。 This means that the production of the corneal endothelium-like sheet with no immunological rejection problems by supporting cells is possible, it is clinically very significant.
【0020】 [0020]
支持細胞を使用する場合には、支持細胞を予めマイトマイシンCなどを用いて不活性化しておくことが好ましい。 When using feeder cells, it is preferable to inactivated using previously mitomycin C and the feeder cells. 支持細胞自体が増殖することによって角膜内皮細胞の増殖が阻害されることを防止するためである。 This is to prevent the corneal endothelial cell growth is inhibited by the support cells themselves proliferate. このような不活性化は放射線処理などによっても行うことができる。 Such inactivation can be carried out by such as radiation treatment.
【0021】 [0021]
隔離膜としては上記のカルチャーインサートに使用される膜と同様のものを採用することができる。 The separator can be formed of the same as the film used in the above culture insert. 即ち、例えばポリカーボネート、ポリエステルなどからなりポアサイズが約0.4μm〜3.0μmの膜を用いることができる。 That is, for example, polycarbonate, pore size made of a polyester can be used a film of about 0.4Myuemu~3.0Myuemu.
【0022】 [0022]
支持細胞の細胞密度は、例えば約1×10 個/cm 以上、好ましくは約1×10 個/cm 〜約1×10 個/cm 、更に好ましくは約1×10 個/cm 〜約1×10 個/cm とすることができる。 Cell density of feeder cells, for example, about 1 × 10 2 / cm 2 or more, preferably about 1 × 10 2 / cm 2 or ~ about 1 × 10 7 cells / cm 2, more preferably about 1 × 10 3 cells / cm 2 may be about 1 × 10 5 cells / cm 2. 支持細胞数が少ないと角膜内皮細胞の増殖率が低下することが考えられ好ましくない。 Unfavorable believed that the number of support cells is small and the growth rate of the corneal endothelial cells is reduced. 一方、支持細胞数が多すぎる場合には、かえって角膜内皮細胞の増殖率を低下させることとなり好ましくない。 On the other hand, if the number of the support cells is too large, rather unfavorably reducing the growth rate of the corneal endothelial cells.
【0023】 [0023]
移植方法の例としては全層トレパネーション法及び深層角膜切除法を挙げることができる。 Examples of method of implantation can be cited all layers trepanned method and deep corneal resection. 前者の方法はトレパンを用いて一旦角膜全層を採取し、角膜内皮細胞層を本発明の角膜内皮様シートで置き換えた後にレシピエントに戻す方法であって、具体的には次のように行うことができる。 The former method is taken once corneal all layers using trepan, the corneal endothelial cell layer A method of returning to the recipient after replacing corneal endothelium-like sheet of the present invention is carried out as follows: Specifically, be able to. まず、レシピエント(ホスト)の角膜をトレパンにて全層切開し、角膜の一部(又は全部)をボタン状に採取する。 First, the cornea of ​​the recipient (host) and full thickness incision in trephine, collected portion of the cornea (or all) to the button-like. 次に採取された角膜片からデスメ膜、及び角膜内皮細胞層を剥離する。 Then harvested Descemet's membrane from the cornea pieces, and peeling the corneal endothelial cell layer. 露出された角膜実質上に本発明の角膜内皮様シートを接着させる。 Adhering a corneal endothelium-like sheet of the present invention the exposed corneal stroma on. この際、コラーゲン層が実質側となるようにする。 In this case, so that the collagen layer is substantially side. その後、角膜片をレシピエントに戻し、縫合糸を用いて固定する。 Thereafter, returning the corneal pieces recipient, fixed with sutures.
他方、深層角膜切除法は角膜全層を摘出するのではなく角膜深層部のみを切除するものであって、レシピエントへの負担がより少ない方法と考えられる。 On the other hand, deep corneal resection has been made to cut only the corneal deep layer rather than to remove the corneal all layers, the burden on the recipient is considered less methods. 具体的には次のように行うことができる。 More specifically, the CPU 11 can be performed as follows. まず、レシピエントの角膜実質の一部を剥離し、角膜実質深層の一部とデスメ膜及び内皮細胞層の一部を切除する。 First, separating the part of the corneal stroma of the recipient, to ablate a portion of the part of the corneal stroma deep and Descemet's membrane and the endothelial cell layer. 尚、内皮細胞層のみ、又は内皮細胞層及びデスメ膜のみを剥離切除してもよい。 Note that the endothelial cell layer only, or only the endothelial cell layer and Descemet's membrane may be peeled resection. 次に、本発明の角膜内皮様シートをスパーテルなどを用いて切除部に挿入する。 Next, a corneal endothelium-like sheet of the present invention is inserted into the cut portion by using a spatula. 必要に応じて前房内に空気を注入して移植片の固定を行う。 Performing fixed by injecting air implant into the anterior chamber as needed. さらに、コラーゲン層の無い角膜内皮層の場合には、傷害されたレシピエント角膜内皮細胞だけを剥離しても良い。 Furthermore, in the case of no corneal endothelial layer of the collagen layer may be peeled off only the injured recipient corneal endothelial cells.
尚、移植した角膜内皮様シートが生体における角膜内皮細胞層と同様にバリアー機能、ポンプ機能を発揮するか否かは、例えば移植後の角膜厚の変化、浮腫の発生を調べることによって確認することができる。 Incidentally, similarly barrier function and the corneal endothelial cell layer transplanted corneal endothelium-like sheet in the body, whether to exert pumping function, for example, changes in the corneal thickness after implantation, be confirmed by examining the occurrence of edema can.
【0024】 [0024]
【実施例】 【Example】
<実施例1> 羊膜の採取羊膜は、全身的合併症のない帝王切開予定の妊婦に対して事前に産婦人科医とともに十分なインフォームドコンセントを行った後、手術室で帝王切開時に採取した。 Collected amniotic membrane of <Example 1> amniotic membrane, after sufficient informed consent with obstetricians and gynecologists in advance for the pregnant women of cesarean section will no systemic complications, were taken at the time of cesarean section in the operating room . 操作は清潔に気をつけ、手術操作に準じて手洗いの後に専用ガウンを装用した。 Operation is clean and careful, was wearing a special gown after hand washing in accordance with the surgical operation. 分娩前に清潔な羊膜採取用のバットと洗浄用の生理食塩水を準備した。 We were prepared butt saline for washing for a clean amnion taken antepartum. 分娩後に胎盤組織をバットに移し、用手的に羊膜組織を胎盤より剥離した。 Transfer the placental tissue bat postpartum use hands to amniotic tissue was peeled off from the placenta. 羊膜と胎盤との癒着が強い部分はハサミで切除した。 Adhesions strong portion of the amnion and placenta was cut with scissors.
【0025】 [0025]
<実施例2> 羊膜の処理羊膜処理の過程は(1)洗浄、(2)トリミング、(3)保存の順で行った。 Process of processing the amnion processing <Example 2> amnion (1) wash was carried out (2) trimming, and (3) in the order of storage. すべての過程において、操作は清潔なドラフト内で行うのが望ましく、使用する容器や器具もすべて滅菌されたものを使用し、シャーレ等は滅菌された使い捨て(ディスポーザブル)タイプのものを使用した。 In all processes, the operation is desirably carried out in a clean draft, using those also all containers and instruments for use sterile, petri dish or the like were from sterile disposable (disposable) type. 採取した羊膜に付着した血液成分を生理食塩水にて洗浄しながら除去し、さらに十分量の生理食塩水(0.005% ofloxacin添加)にて洗浄した。 Blood components adhered to the collected amnion is removed while washing with physiological saline, and washed with more sufficient amount of saline (0.005% ofloxacin added). 次に羊膜をシャーレ内のリン酸緩衝液(PBS)に移し、ハサミを用いて約4×3cm程度のサイズに分割した。 Then amnion was transferred to a phosphate buffer solution (PBS) in a petri dish, it was divided into approximately 4 × 3 cm approximately size using scissors. 分割後さらに数個のシャーレに保存液を浸し、その中で状態のよい羊膜を選別した。 Moreover the preservative solution soaked into several Petri dish after division were sorted good amnion of state therein.
【0026】 [0026]
<実施例3> 羊膜の保存2ccの滅菌クライオチューブに1ccずつ保存液を入れ、そこに採取、洗浄して選別された羊膜を1枚ずついれラベルした後、−80℃の冷蔵庫に保存した。 <Example 3> placed amniotic preservative solution by 1cc to sterile cryotubes storage 2cc of, taken there, after the sorted and washed amnion labeled put one by one, and stored in a refrigerator at -80 ° C.. 保存液には50%滅菌済みグリセロール in DMEM (Dulbecco's Modofied Eagle's Medium: GIBCOBRL社製)を使用した。 The storage solution 50% sterile glycerol in DMEM: was used (Dulbecco's Modofied Eagle's Medium made GIBCOBRL Co., Ltd.). 保存された羊膜の使用期限は3ヶ月とし、期限が過ぎれば焼却処分した。 Expiration date of the stored amniotic membrane and three months, the deadline has been incinerated if Sugire.
【0027】 [0027]
<実施例4> 羊膜上皮の処理羊膜はその上皮を処理した後、培養に使用した。 Processing the amnion <Example 4> amniotic epithelium after handling the epithelium was used in the culture. まず、−80℃で保存していた羊膜を室温で解凍した後、シャーレ内の滅菌済みリン酸緩衝液(PBS)で十分に洗浄した。 First, after thawing the amniotic membrane was stored at -80 ° C. at room temperature, washed thoroughly with sterile phosphate buffer solution in the Petri dish (PBS). 洗浄後0.02%EDTA溶液 (Nacalai tesque社)に2時間37℃で保存した後、cell scraper (Nunc社 USA)を用いて機械的に上皮を掻爬し、培養の基質として使用した。 After storage for 2 hours 37 ° C. in 0.02% EDTA solution washed (Nacalai tesque Co.), mechanically scraping the epithelium using a cell scraper (Nunc, Inc. USA), was used as a substrate for culture. 尚、この処理方法によって、1層の羊膜上皮が完全に掻爬されたことを光学的及び電子顕微鏡的操作(走査型電子顕微鏡)において確認した。 Incidentally, this processing method, it was confirmed in the amniotic epithelium one layer completely scraped been possible optical and electron microscopic operation (scanning electron microscope).
【0028】 [0028]
<実施例5> ヒト角膜内皮細胞の採取、初期培養ヒト(47歳、男性)角膜組織からデスメ膜と内皮細胞層を実質より鑷子にて剥離した後、35mm培養皿に留置し、カルシウムを含まないPBSで2倍希釈したディスパーゼ(dispase) 1ml(最終濃度1.2 U/ml)にて37℃、5% CO の条件で60分間処理した。 Collection of <Example 5> Human corneal endothelial cells, primary cultures human (47 years old, male) after removing from the substantially at tweezers Descemet's membrane and the endothelial cell layer from the cornea tissue, and placed in 35mm culture dishes, free of calcium 37 ° C. at no dispase diluted 2-fold with PBS (dispase) 1ml (final concentration 1.2 U / ml), and treated for 60 minutes at 5% CO 2 conditions. この処理にて角膜内皮細胞の多くはデスメ膜より脱落する。 Many of the corneal endothelial cells in this process will be falling from the Descemet's membrane. デスメ膜に残存している角膜内皮細胞を脱落させるためにピペッティング処理を行った。 The pipetting process was carried out in order to shed corneal endothelial cells remaining Descemet's membrane. 次にデスメ膜を除去し、角膜内皮細胞を15 ccの遠心チューブへ移した。 Then removed Descemet's membrane was transferred corneal endothelial cells into 15 cc tube. 培養液を加えて全液量5 mlとした後、1,000rpm、70g、3分の条件で遠心した。 After a total liquid volume 5 ml was added to the culture solution, and centrifuged at 1,000 rpm, 70 g, 3 minutes. 培養液にはDMEM(GIBCOBRL社製)に10% FBS(大日本製薬株式会社製)、b−FGF(Invitrogen社製)2ng/ml、ペニシリン(50 U/ml)−ストレプトマイシン(50μg/ml)(ナカライ社製)を添加したものを使用した。 The culture medium DMEM 10% FBS (Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.) to (GIBCOBRL Co.), b-FGF (Invitrogen Corporation) 2 ng / ml, penicillin (50 U / ml) - streptomycin (50 [mu] g / ml) ( was used with the addition of Nacalai Inc.). 上澄み液を除去した後、培養液を加えて約1mlの細胞浮遊液とした。 After removing the supernatant, and a cell suspension of about 1ml by the addition of culture medium. この細胞浮遊液をIV型コラーゲンコートされた24穴培養皿に播種し、37℃、5% CO の条件で培養した。 The cell suspension was seeded in 24-well culture dish was type IV collagen-coated, 37 ° C., were cultured in a 5% CO 2 condition. 以後、48時間ごとに培養液を交換した。 Thereafter, replacing the culture solution every 48 hours.
【0029】 [0029]
<実施例6> 内皮細胞の継代培養培養された細胞がコンフルエント(confluent)となった時点で培養液を除去し、カルシウムを含まないPBS 1mlを用いて細胞を3回洗浄した。 <Example 6> subcultured cultured endothelial cells cells the medium was removed when it becomes confluent (confluent), the cells were washed 3 times with PBS 1 ml without calcium. 洗浄後、0.05%トリプシン(trypsin)−EDTAを200μl加え37℃、5% CO の条件で3分間静置した。 After washing, 200 [mu] l was added 37 ° C. with 0.05% trypsin (trypsin) -EDTA, allowed to stand for 3 minutes at a 5% CO 2 condition. この処理によって培養皿の底に接着した内皮細胞が浮遊する。 Endothelial cells attached to the bottom of the culture dish by this process is suspended. 培養液5mlを加えた後、15cc遠心チューブに細胞浮遊液を移し、1,000rpm、70g、3分の条件で遠心処理した。 After adding the culture solution 5 ml, transferred to a cell suspension in 15cc centrifuge tube, 1,000 rpm, and centrifuged under the conditions of 70 g, 3 min. 上澄み液を除去した後、培養液を加えて約2mlの細胞浮遊液とした。 After removing the supernatant, and a cell suspension of about 2ml by addition of culture medium. この細胞浮遊液をIV型コラーゲンコートされた35mm培養皿に播種し、37℃、5% CO の条件で培養した。 The cell suspension was seeded in 35mm culture dishes which are type IV collagen-coated, 37 ° C., were cultured in a 5% CO 2 condition. 以後、48時間ごとに培養液を交換した。 Thereafter, replacing the culture solution every 48 hours. 細胞がコンフルエントとなった時点で上記と同様の操作を行い、必要な細胞数が得られるまで継代を繰り返した。 Cells The same procedure as above as they become confluent, repeated passaging up of cells required can be obtained. 継代培養を5回繰り返した後の細胞密度を計測したところ500〜1,000個/mm であった。 The cell density after repeated passage 5 was measured 500-1,000 pieces was / mm 2. 尚、以上の操作で継代培養することにより、少なくとも10代まで継代培養することが可能であった。 Incidentally, by subculturing the above procedure, it was possible to subculture to at least 10 generations.
【0030】 [0030]
<実施例7> 高密度培養角膜内皮細胞層の作製継代培養された細胞を0.05% trypsin−EDTAにて処理した後、細胞数をカウントした。 After processing the cells produced were subcultured <Example 7> density cultured corneal endothelial cell layer in 0.05% trypsin-EDTA, the cells were counted number. 次いで遠心処理して上澄み液を除去した後、細胞密度が約2.0×10 個/mlとなるように培養液を添加した。 Then the supernatant was removed by centrifugation, it was added the culture at a cell density of about 2.0 × 10 6 cells / ml. 得られた細胞浮遊液を用いて角膜内皮細胞層を以下の手順で作製した。 The corneal endothelial cell layer using the resulting cell suspension was prepared by the following procedure. 培養器具としては6穴培養皿(Corning社製、 NY)とカルチャーインサート(culture insert:培養挿入容器、ポリカーボネート製、平均ポアサイズ3.0μm、Corning社製、 NY)を用いた。 6 well culture dishes (Corning Inc., NY) as culture instrument and culture insert (culture insert: culture insert vessel, polycarbonate, average pore size 3.0 [mu] m, Corning Inc., NY) was used. 培養液は上記で使用したものと同じものを用いた。 Culture were the same as those used above.
【0031】 [0031]
まず、培養皿内にカルチャーインサートを留置した。 First, the placement of a culture insert in a culture dish. 次に、カルチャーインサート内に約5,000個/mm となるように細胞浮遊液を播種した。 Next, cells were seeded suspension to approximately 5,000 / mm 2 in the culture insert. その後、培養皿を遠心器(kendro社製)を用いて1,000rpm、70g、3分の条件で遠心した。 Then centrifuged at 1,000 rpm, 70 g, 3 min conditions culture dishes using a centrifuge (Kendro, Inc.). 遠心後、37℃、5%CO の条件で培養した。 After centrifugation, 37 ° C., were cultured in a 5% CO 2 condition. その結果、14日間の培養で細胞密度が約3,000個/mm の細胞層が得られた。 As a result, cell layer of the cell density of about 3,000 / mm 2 was obtained in the 14 days of culture. また、2週間の培養にて細胞に形態的変化は認められなかった。 In addition, morphological changes in the cells in the two weeks of culture was observed.
尚、図5は培養中の状態を示した模式断面図である。 Incidentally, FIG. 5 is a schematic sectional view showing a state in culture. 培養皿1内にカルチャーインサート2が留置され、カルチャーインサート2内で角膜内皮細胞3が培養される状態が示される。 It is detained the culture insert 2 in the culture dish 1, the corneal endothelial cells. 3 is shown a state cultured in the culture insert 2. 符号5は培地である。 Reference numeral 5 is a medium.
【0032】 [0032]
<実施例8> 羊膜を基質とした角膜内皮様シートの作製実施例7で使用される細胞浮遊液(細胞密度約2.0×10 個/ml)を用いて角膜内皮様シートを以下の手順で作製した。 <Example 8> amniotic cell suspension for use in making Example 7 of the corneal endothelium-like sheet as a substrate (cell density of about 2.0 × 10 6 cells / ml) the following corneal endothelium-like sheet by using It was prepared by the procedure. 培養器具は実施例7と同様のものを用いた。 Culture instrument used was the same as in Example 7.
まず、培養皿内にカルチャーインサートを留置した。 First, the placement of a culture insert in a culture dish. 次に、カルチャーインサート内(底面上)に実施例4で得られた上皮を掻爬した羊膜を、掻爬した側を上にして伸展させ敷いた。 Then, the amniotic membrane was scraped epithelium obtained in Example 4 in the culture insert (on bottom), it was laid by stretching in the top scraped side. 続いて、羊膜上に約5,000個/mm となるように細胞浮遊液を播種した。 Subsequently, cells were seeded suspension to approximately 5,000 / mm 2 on the amniotic membrane. その後、培養皿を を用いて1,000rpm、70g、3分の条件で遠心した。 Then centrifuged at 1,000 rpm, 70 g, 3 min conditions using a culture dish. 遠心後、37℃、5%CO の条件で約14日間培養したところ羊膜上に生体と同様に連続的な単層の細胞層が構築された(図1A)。 After centrifugation, 37 ° C., cell layers similar to the biological continuous monolayer was built in the 5% CO 2 condition for about 14 days cultured at amnion on (Fig. 1A). 得られた細胞層の細胞密度を計測したところ3,340個/mm であり、実施例7で得られた細胞層と同様の密度であった(図1B)。 The cell density of the resultant cell layer were measured 3,340 pieces is / mm 2, a density similar to the cell layer obtained in Example 7 (FIG. 1B). また、走査型電子顕微鏡で形態観察を行ったところ、細胞層を構成する細胞は六角形の扁平な形態を有し、生体の内皮細胞に近似していた(図1C、D)。 When it was morphological observation with a scanning electron microscope, the cells constituting the cell layer has a flattened form of the hexagonal, were similar to the living body of endothelial cells (Figure 1C, D). また、この六角形状の細胞がほぼ均一に整列して細胞層が構成されていることが認められた。 Moreover, it was observed that cell layer in alignment this hexagonal cells substantially uniformly is formed.
尚、図6は培養中の状態を示した模式断面図である。 Incidentally, FIG. 6 is a schematic sectional view showing a state in culture. 培養皿1内にカルチャーインサート2が留置される。 Culture insert 2 is placed in the culture dish 1. また、カルチャーインサート2の底面上に羊膜4が伸展され、その上に角膜内皮細胞3が培養される状態が示される。 Also, the amniotic membrane 4 is extended on the bottom surface of the culture insert 2, the corneal endothelial cells. 3 is shown a state to be cultivated thereon. 符号5は培地である。 Reference numeral 5 is a medium.
【0033】 [0033]
<実施例9> 角膜内皮様シートの移植a. <Example 9> corneal endothelium-like sheet of porting a. 全層トレパネーションでの移植家兎(6週令、日本白色)の角膜(ホスト角膜)中央部を7〜8mm径のトレパンにて全層切開した。 Transplanting rabbit (6-week-old, Japanese white) in all the layers trepanned was full thickness incision in the trepanning of 7~8mm diameter of the cornea (the host cornea) the central part of. ボタン上に採取されホスト角膜片のデスメ膜を内皮細胞層ごと剥離した。 Descemet's membrane taken on the button host corneal pieces were peeled off each endothelial cell layer. 実施例8で得られた角膜内皮様シートを鑷子にて培養皿から取り出した後、6〜8mmのトレパンにて切開し、それをデスメ膜および内皮細胞層が剥離されたホスト角膜片の実質上に留置した。 After removal of the corneal endothelium-like sheet obtained in Example 8 from the culture dish by forceps, dissected at trephine of 6-8 mm, it Descemet's membrane and the endothelial cell layer on substantially the host cornea pieces peeled It was placed in. この際縫合糸は用いず、スポンジにて水分を吸収し軽度に乾燥させることにより角膜内皮様シートを角膜実質に接着させた。 At this time the suture is not used and the corneal endothelium-like sheet adhered to the corneal stroma by absorbing drying lightly water a sponge. 羊膜上角膜内皮シートが留置されたホスト角膜片を10−0ナイロン糸にてホスト角膜に縫合した。 Host corneal pieces amnion on corneal endothelium sheet is placed and sutured to the host cornea with 10-0 nylon thread. その後、術後7日目まで毎日移植部の角膜厚、浮腫の状態を観察した。 Then, corneal thickness of the daily transplant unit until postoperative day 7, to observe the state of edema. 尚、比較対照として、角膜内皮様シートの代わりに羊膜を用いる群(AM群)、及びデスメ膜を剥離して得られたホスト角膜片をそのまま移植する群(コントロール群)を用いた。 As a control, the group using the amnion instead of the corneal endothelium-like sheet (AM group), and was used as a group to transplantation (control group) the Descemet's membrane host cornea pieces obtained by peeling off the.
術後4日目の移植部の状態を図2に示す。 The state of the recipient site postoperative day 4 shown in FIG. 全層トレパネーション後、デスメ膜を剥離して移植した群(コントロール群)では著明な浮腫が生じていた(図2A)。 After all layers trepanned, the group implanted with stripping Descemet's membrane (control group) is significant swelling had occurred (FIG. 2A). また、羊膜を用いた群(AM群)もコントロール群と同様に著明な浮腫が認められた(図2B)。 Further, the group using amniotic membrane (AM group) was also observed significant edema as with the control group (Fig. 2B). 一方、角膜内皮様シートを移植した角膜ではコントロール群などに比較して顕著に浮腫が軽減されており、透明性が維持されていた。 On the other hand, the corneas were transplanted corneal endothelium-like sheet is remarkably edema is reduced as compared to such control group, transparency was maintained. 術後7日目の観察では、角膜内皮様シートを移植した角膜ではコントロール群(図3A)及びAM群(図3B)に比較した浮腫の軽減が認められ、また透明性が維持されていた(図3C)。 The postoperative day 7 observations, control group with corneas were transplanted corneal endothelium-like sheet (Figure 3A) and AM groups reduce edema compared (FIG. 3B) was observed, also transparency was maintained ( Fig. 3C). また、角膜内皮様シートを移植した角膜ではその角膜厚がコントロール群及びAM群に比較して有意に減少していることが認められた(図4)。 Further, the corneas were transplanted corneal endothelium-like sheet that has decreased significantly in comparison the corneal thickness is the control group and the AM group was observed (Figure 4). 以上の結果より、ヒト角膜内皮細胞由来の細胞が羊膜上で生体に極めて近似した形態を有することが示唆された。 These results have the form of cells derived from human corneal endothelial cells were very close to the living body on the amniotic membrane was suggested. また、遠心処理を用いることにより、3,000cells/mm 以上の細胞密度を得ることができた。 Further, by using the centrifugation, it was possible to obtain a 3,000cells / mm 2 or more cell density. さらには、この手法により作製された角膜内皮様シートは生体においてもその機能を発揮することが示された。 Furthermore, the corneal endothelium-like sheet produced by this method was shown to be perform its function in vivo.
【0034】 [0034]
b. b. 深層角膜切除法による移植家兎(6週令、日本白色)の角膜(ホスト角膜)実質を剥離し、中央部7〜8mm径の実質深層を内皮細胞層を含めて切除した。 Deep corneal resection transplant rabbit (6 weeks of age, Japan white) stripping the cornea (host cornea) real, the real deep central portion 7~8mm size was excised, including the endothelial cell layer. あるいは前房内から中央部7〜8mm径の内皮細胞およびデスメ膜のみを剥離除去した。 Or from the anterior chamber only endothelial cells and Descemet's membrane of the central portion 7~8mm diameter was peeled off. 実施例8で得られた角膜内皮様シートをスパーテルにて実質層間あるいは前房内より挿入し、切除範囲にあわせて留置した。 The corneal endothelium-like sheet obtained in Example 8 was inserted from substantially interlayer or the anterior chamber by a spatula, and placed in accordance with the extent of resection. その後、前房内に空気を注入して移植片を固定した。 Then, by injecting air to fix the implant into the anterior chamber. その後、術後7日目まで毎日移植部の角膜厚、浮腫の状態を観察した。 Then, corneal thickness of the daily transplant unit until postoperative day 7, to observe the state of edema. その結果、角膜内皮様シートを移植した群では、全層トレパネーション同様、羊膜のみを移植した群(AM群)、あるいは角膜内皮を除去したのみのコントロール群に比較して、角膜厚、角膜浮腫は有意に減少していた。 As a result, in the group transplanted corneal endothelium-like sheet, similar to full-thickness trepanned, only the transplanted group (AM group) amniotic membrane, or as compared to the control group of only removing the corneal endothelium, corneal thickness, corneal edema It was significantly reduced.
【0035】 [0035]
以上の実施例により、角膜内皮様シートが生体内でもその機能を有することが確認された。 With the above embodiments, that the corneal endothelium-like sheet has its function in vivo was confirmed. 即ち、上述の方法により作製される角膜内皮様シートは角膜内皮の代替として良好に機能するものであって、角膜内皮の損傷、欠損などの場合に角膜内皮を再建するための移植材料として好適に利用できるものであることが確認された。 That is, the corneal endothelium-like sheet made by the method described above has been made to function satisfactorily as a replacement for the corneal endothelium, corneal damage endothelium, preferably as an implant material to rebuild the corneal endothelium in the case of such defect it was confirmed that those available. また、このシートを用いることにより、前眼部の免疫抑制環境の破綻を最小限にとどめ、障害された角膜内皮細胞のみを健常な内皮細胞と置き換える理想的な術式が可能となることが示された。 Further, by using this sheet, it kept the collapse of immunosuppressive environment of the anterior segment to a minimum, that the ideal surgical procedure to replace only impaired corneal endothelial cells to healthy endothelial cells is possible shows It has been.
【0036】 [0036]
この発明は、上記発明の実施の形態及び実施例の説明に何ら限定されるものではない。 This invention is not intended to be limited to the description of embodiments and examples of the invention. 特許請求の範囲の記載を逸脱せず、当業者が容易に想到できる範囲で種々の変形態様もこの発明に含まれる。 Without departing from the description of the claims, various modifications within a range that a person skilled in the art can easily conceive also included in the present invention.
【0037】 [0037]
【発明の効果】 【Effect of the invention】
本発明により提供される角膜内皮様シートは生体の角膜内皮細胞層に類似した構造を有し、角膜内皮細胞の移植が必要とされる各種疾患における移植材料として用いることができる。 Corneal endothelium-like sheet provided by the present invention has a structure similar to the corneal endothelial cell layer of the living body, it can be used as graft material in various diseases transplantation of corneal endothelial cells is required. この角膜内皮様シートは移植後の生着が良好であって、かつ角膜内皮細胞層の機能、即ちバリア機能及びポンプ機能を発揮し、損傷した角膜内皮細胞層の再建に極めて有用なものである。 The corneal endothelium-like sheet is a good engraftment after transplantation, and functions of the corneal endothelial cell layer, i.e. exhibits a barrier function and the pump function, is extremely useful for the reconstruction of damaged corneal endothelial cell layer . 一方、この角膜内皮様シートは採取した角膜内皮細胞をin vitroで培養、増殖させることによって形成される。 On the other hand, the corneal endothelium-like sheet culturing corneal endothelial cells collected by in vitro, is formed by growing. したがって、僅かな角膜内皮細胞をもとに移植材料を作製することが可能であり、角膜内皮細胞数が減少した患者においても自己の角膜内皮細胞から移植材料を作製できる。 Therefore, it is possible to produce a slight corneal endothelial cells transplanted material based, can be prepared graft material from autologous corneal endothelial cells even in patients where the number of corneal endothelial cells is reduced. このことは拒絶反応を生じない角膜移植術を実現できることを意味する。 This means can be realized keratoplasty that does not cause rejection. また、障害された部位のみを置換する角膜内皮移植術が可能となり、これまでの全層角膜移植で問題となっていた術中、術後の合併症を生じない理想的な手術法の実現を期待できる。 Further, it is possible to corneal endothelium transplantation to replace only the part which is impaired, heretofore intraoperative has been a problem in penetrating keratoplasty transplant, expect to achieve ideal surgical technique that does not result in postoperative complications it can.
【図面の簡単な説明】 BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS
【図1】図1は上皮を除去した羊膜上に形成された角膜内皮様細胞層の形態を示す図であり、AはHE(ヘマトキシリン−エオシン)染色像、Bはアリザリン染色像、C及びDは走査型電子顕微鏡像である。 FIG. 1 is a diagram showing an embodiment of a corneal endothelium-like cell layer formed on the amniotic membrane to remove the epithelium, A is HE (hematoxylin - eosin) staining images, B is alizarin staining images, C and D is a scanning electron microscope image.
【図2】図2は全層トレパネーションでの移植術後4日目の前眼部スリット写真を表した図であり、Aはコントロール群(デスメ膜を剥離した群)、Bは羊膜を用いた群(AM群)、Cは実施例の角膜内皮様シートを用いた群である。 Figure 2 is a diagram showing the anterior segment slit photo transplant surgery day 4 in all layers trepanned, A is the control group (group peeling off the Descemet's membrane), B was used amnion group (AM group), C is a group with corneal endothelium-like sheet of example.
【図3】図3は全層トレパネーションでの移植術後7日目の前眼部スリット写真を表した図であり、Aはコントロール群(デスメ膜を剥離した群)、Bは羊膜を用いた群(AM群)、Cは実施例の角膜内皮様シートを用いた群である。 Figure 3 is a diagram showing the anterior segment slit photo transplant surgery day 7 in all layers trepanned, A is the control group (group peeling off the Descemet's membrane), B was used amnion group (AM group), C is a group with corneal endothelium-like sheet of example.
【図4】図4は全層トレパネーションでの移植前、移植後の角膜厚の変化を示したグラフである。 Figure 4 is a graph showing the pre-transplant, a change in the corneal thickness after implantation in all layers trepanned. グラフ中の※はp<0.05を表す。 In the graph ※ represents a p <0.05. 角膜内皮様シートを用いた群では、コントロール群、羊膜を用いた群(AM群)に比較して有意に(p<0.05)角膜厚の減少が認められる。 In the group with corneal endothelium-like sheet, the control group, the significant compared to group (AM group) using amniotic membrane (p <0.05) decrease in corneal thickness it is observed.
【図5】図5は角膜内皮細胞を培養する際の器具等の状態を模式的に示した断面図である。 Figure 5 is a cross-sectional view of the state of the instrument such as shown schematically for culturing corneal endothelial cells. 培養皿1内にカルチャーインサート2が留置される。 Culture insert 2 is placed in the culture dish 1. また、カルチャーインサート2の底面上に角膜内皮細胞3が培養される状態が示される。 Furthermore, the corneal endothelial cells. 3 is shown a state cultured on the bottom surface of the culture insert 2. 符号5は培地である。 Reference numeral 5 is a medium.
【図6】図6は羊膜上に角膜内皮細胞を培養する際の器具等の状態を模式的に示した断面図である。 Figure 6 is a cross-sectional view of the state of the instrument such as shown schematically for culturing corneal endothelial cells on amniotic membrane. 培養皿1内にカルチャーインサート2が留置される。 Culture insert 2 is placed in the culture dish 1. また、カルチャーインサート2の底面上に羊膜4が伸展され、その上に角膜内皮細胞由来の細胞3が培養される状態が示される。 Also, the amniotic membrane 4 is extended on the bottom surface of the culture insert 2, the cells 3 from corneal endothelial cells are shown to the condition to be cultured thereon. 符号5は培地である。 Reference numeral 5 is a medium.
【符号の説明】 DESCRIPTION OF SYMBOLS
1 培養皿2 カルチャーインサート(培養挿入容器) 1 dish 2 Culture Insert (culture insert container)
3 角膜内皮細胞由来の細胞4 羊膜5 培地 3 corneal endothelial cell-derived cell 4 amniotic 5 medium

Claims (14)

  1. コラーゲン層と、 And the collagen layer,
    該コラーゲン層上に形成された細胞層であって、角膜内皮由来の細胞からなる細胞層と、を備える角膜内皮様シート。 A cell layer formed on the collagen layer, a corneal endothelium-like sheet comprising a cell layer consisting of corneal endothelial cells from the.
  2. 前記コラーゲン層が羊膜由来である、請求項1に記載の角膜内皮様シート。 Wherein the collagen layer is derived from amniotic membrane, corneal endothelium-like sheet according to claim 1.
  3. 前記コラーゲン層が上皮を除去した羊膜からなる、請求項1に記載の角膜内皮様シート。 Consisting amniotic membrane wherein the collagen layer is removed epithelium, corneal endothelium-like sheet according to claim 1.
  4. 角膜内皮由来の細胞からなる細胞層を備える角膜内皮様シート。 Corneal endothelium-like sheet comprising a cell layer made from the corneal endothelium-derived cells.
  5. 前記細胞層が一層構造である、請求項1〜4のいずれかに記載の角膜内皮様シート。 Wherein the cell layer is a monolayer structure, the corneal endothelium-like sheet according to any one of claims 1 to 4.
  6. 前記細胞層の細胞密度が約2,000〜約4,000個/mm である、請求項1〜5のいずれかに記載の角膜内皮様シート。 Cell density of the cell layer is about 2,000 to about 4,000 / mm 2, corneal endothelium-like sheet according to claim 1.
  7. 前記角膜内皮由来の細胞の平面視形状が略六角形である、請求項1〜6のいずれかに記載の角膜内皮様シート。 The corneal endothelium plan view shape from the cells is substantially hexagonal, corneal endothelium-like sheet according to any one of claims 1 to 6.
  8. 前記細胞層において、前記角膜内皮由来の細胞が規則的に整列している、請求項1〜7のいずれかに記載の角膜内皮様シート。 In said cell layer, the corneal endothelium-derived cells are regularly aligned, corneal endothelium-like sheet according to any one of claims 1 to 7.
  9. 以下のステップを含んでなる、角膜内皮様シートの作製方法、 Comprising the following steps, a method for manufacturing a corneal endothelium-like sheet,
    a)採取した角膜内皮細胞を培養して増殖させるステップ、 a) step of growing by culturing a corneal endothelial cells collected,
    b)増殖した角膜内皮細胞を回収して細胞浮遊液を作製するステップ、及びc)前記細胞浮遊液をコラーゲン層上に播種し、培養するステップ。 b) the step of proliferating corneal endothelial cells were harvested to prepare a cell suspension, and c) the cell suspension was seeded on a collagen layer and culturing step.
  10. 前記ステップb)の後に、次のステップが行われる、請求項9に記載の角膜内皮様シートの作製方法、 After said step b), the following steps are performed, a method for manufacturing a corneal endothelium-like sheet according to claim 9,
    b−1)遠心処理によって前記細胞浮遊液の細胞密度を高めるステップ。 The step of increasing the cell density of the cell suspension by b-1) centrifugation.
  11. 前記ステップc)において、細胞浮遊液を播種した後に遠心処理する、ことを特徴とする請求項9又は10に記載の角膜内皮様シートの作製方法。 In step c), a method for manufacturing a corneal endothelium-like sheet according to claim 9 or 10, centrifuged after seeding cell suspension, it is characterized.
  12. 前記ステップc)が以下のステップを含んでなる、請求項9又は10に記載の角膜内皮様シートの作製方法。 Wherein step c) comprises the following steps, a method for manufacturing a corneal endothelium-like sheet according to claim 9 or 10.
    c−1)培養容器内に、培養液を通過可能なポアサイズの膜からなる底面を有する容器を留置するステップ、 To c-1) culture vessel, the step of placing a container having a bottom made of a film that can be passed through a pore size of the culture solution,
    c−2)前記容器の前記底面上にコラーゲン層を形成するステップ、 c-2) forming a collagen layer on the bottom surface of the container,
    c−3)前記細胞浮遊液をコラーゲン層上に播種するステップ、 c-3) the step of cell suspension is seeded on a collagen layer,
    c−4)遠心処理するステップ、及びc−5)培養するステップ。 c-4) Step centrifuging, and c-5) the step of culturing.
  13. 前記コラーゲン層が羊膜由来である、請求項9〜12のいずれかに記載の角膜内皮様シートの作製方法。 Wherein the collagen layer is derived from amniotic membrane, a method for manufacturing a corneal endothelium-like sheet according to any of claims 9-12.
  14. 前記コラーゲン層が上皮を除去した羊膜からなる、請求項9〜12のいずれかに記載の角膜内皮様シートの作製方法。 Wherein the collagen layer consists of amniotic membrane was removed epithelium, a method for manufacturing a corneal endothelium-like sheet according to any of claims 9-12.
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