JP2003517156A - Compositions and methods for performing biological reactions - Google Patents

Compositions and methods for performing biological reactions

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Abstract

(57)【要約】 本発明は生物学的反応を行う装置に関する。 (57) Abstract: The present invention relates to apparatus for performing biological reactions. 特に、本発明は、可撓カバーを備えた基板を使用して、多数のオリゴヌクレオチド結合部位を有する基板層上で核酸ハイブリダイゼーション反応を行う装置に関する。 In particular, the present invention uses a substrate with a flexible cover, an apparatus for performing a nucleic acid hybridization reaction on a substrate layer having a plurality of oligonucleotide binding sites.

Description

【発明の詳細な説明】 【0001】 この出願は、2000年6月28日に出願された米国特許出願第09/605 DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION [0001] This application, US Patent Application No., filed on June 28, 2000 09/605
766号と1999年12月15日に出願された米国特許出願第09/4644 It filed 766 Patent and December 15, 1999 U.S. Patent Application No. 09/4644
90号の継続出願である。 Which is a continuation application of 90 issue. 【0002】 発明の技術分野 本発明は、生物学的反応を行う組成物および方法に関する。 [0002] The present invention relates to compositions and methods for performing biological reactions. 特に、本発明は、 In particular, the present invention is,
複数のオリゴヌクレオチド結合部位が配設された基板層上で核酸ハイブリダイゼーション(hybridization)反応を行う方法に関する。 A plurality of oligonucleotide binding sites are arranged a substrate layer on to a method of performing nucleic acid hybridization (Hybridization) reaction. 【0003】 分子生物学における最近の発展により、所望目的に特有の遺伝子配列を使用して、病原体を識別し、病状を診断し、司法決定(forensic determination)を行う機会が提供されてきている。 [0003] Recent developments in molecular biology, using a specific gene sequence in the desired purpose, to identify the pathogen, to diagnose a medical condition, have been provided the opportunity to perform the judicial decision (forensic determination). 遺伝子情報の功績により、分子生物学アッセイ特に核酸ハイブリダイゼーションアッセイを行う高容量の分析機器が必要とされている。 The achievements of genetic information, molecular biology assays high capacity analytical instrument, in particular performing nucleic acid hybridization assays is required. 最も緊急のものは、このようなアッセイを小型化し、自動化し、標準化し、単純化することが必要になっている。 The most urgent ones, such assay miniaturization and automation and standardization, be simplified and become necessary. この必要性は、ハイブリダイゼーションアッセイがもともと精製品を用いて研究室で発展し、高度に熟練した人によって行われる一方、これらの手順を診断のような臨床分野、法科学、その他の分野に採用することにより、より大きな容量で厳格でないアッセイ条件で、熟練のないオペレータが有効にアッセイを行うことができる装置と方法の必要性が生じたという事実から生じている。 This need, while hybridization assay originally using purified product was developed in the laboratory is carried out by highly skilled people, adopting these steps clinical areas such as diagnostic, forensic, and other fields by that, under assay conditions not strictly in a larger volume, the need for devices and methods that can be experienced without operator to effectively assay stems from the fact that occurred. 【0004】 核酸ハイブリダイゼーションアッセイは、プローブアレイ技術を使用して有利に達成される。 [0004] Nucleic acid hybridization assays are advantageously accomplished using a probe array technology. このプローブアレイ技術は、目標単一鎖DNAを固定DNA(通常はオリゴヌクレオチド)プローブに結束することを利用している。 The probe array technology, the target single stranded DNA fixed DNA (usually oligonucleotides) are utilized to tie the probe. 核酸ハイブリダイゼーションアッセイの検出限界は、ハイブリダイゼーション中の検出デバイスの感度と、典型的にはオリゴヌクレオチドプローブであるプローブに結束するのに利用される目標核酸の量とにより決定される。 The detection limit of nucleic acid hybridization assays is determined by the sensitivity of the detection device in the hybridization, typically by the amount of the target nucleic acid is used to tie the probe is an oligonucleotide probe. 【0005】 核酸ハイブリダイゼーション室は、ハイブリダイゼーション室を開示するSmyc [0005] The nucleic acid hybridization chamber, discloses hybridization chamber Smyc
zekらの米国特許第5100755号で公知である。 It is known in zek et al., U.S. Patent No. 5,100,755. Ravaらの米国特許第554 Rava et al., US Pat. No. 554
5531号は、複数のオリゴヌクレオチドアレイからなるハイブリダイゼーション板を開示している。 No. 5531 discloses a hybridization plate comprising a plurality of oligonucleotide arrays. Hunnellの米国特許第5360741号は、ガス加熱ハイブリダイゼーション室を開示している。 U.S. Patent No. 5360741 of Hunnell discloses a gas heating hybridization chamber. Andersonらの米国特許第5922591 Anderson et al., US Patent No. 5922591
号は、オリゴヌクレオチドアレイを用いて使用する小型化されたハイブリダイゼーション室を開示している。 No. discloses a hybridization chamber miniaturized use with oligonucleotide arrays. Bsesemerの米国特許第5945334号は、オリゴヌクレオチドアレイパッケージングを開示している。 U.S. Patent No. 5945334 of Bsesemer discloses oligonucleotide array packaging. 【0006】 現在利用されているオリゴヌクレオチドアレイ技術は最大ハイブリダイゼーション効率を与えない。 [0006] The oligonucleotide array technology that is currently available does not give the maximum hybridization efficiency. 既存の核酸ハイブリダイゼーションアッセイ装置は多大な部材を有し、各部材は非能率と不正確の要因となっている。 Existing nucleic acid hybridization assay devices have great members, each member is a factor of inefficiency and inaccurate. 【0007】 オリゴヌクレオチドアレイを使用するハイブリダイゼーションは、少量の目標DNAまたは他の核酸を固定(immobilized)プローブに有効にアニール(annea [0007] Hybridization using oligonucleotide arrays, effectively anneal the small amount of target DNA or other nucleic acid in the fixed (Immobilized) Probe (Annea
l)することができる空間(volume)で達成しなければならない。 l) must be achieved in the space (volume) that can be. 診断アッセイでは、目標DNA分子は微量(ピコモル)得られる。 In diagnostic assays, the target DNA molecules are obtained trace (picomolar). 実際には、生物学的サンプルに有用な低核酸レベルでハイブリダイゼーションが実質的に完了するのに数時間(10時間)要する。 In fact, it takes several hours to hybridization with useful low nucleic acid levels in a biological sample is substantially complete (10 hours). 【0008】 さらに、アレイハイブリダイゼーションは、従来、活性混合(active mixing Furthermore, array hybridization, conventionally, the active mixture (active Mixing
)のない静止ハイブリダイゼーション室で行われる。 ) With no carried out in a stationary hybridization chamber. このような条件では、特定の目標分子が、表面に固定された相補オリゴヌクレオチドプローブにアレイハイブリダイゼーションされる可能性は、目標分子の濃度、拡散速度、目標分子と相補オリゴヌクレオチドとの間の相互作用の統計によって決定される。 In such conditions, the mutual during a particular target molecule, is likely to be an array hybridized to complementary oligonucleotide probes immobilized on a surface, the concentration of the target molecule, the diffusion rate, the target molecule and the complementary oligonucleotide It is determined by statistical effects. したがって、有用な情報を得るには多数のサンプルをテストしなければならないので、ハイブリダイゼーション時間と非能率性が増加する。 Therefore, in order to obtain useful information since they must be tested a number of samples, the hybridization time and inefficiency increases. 【0009】 さらに、ユーザ操作の量を最小に維持すると効率が増加する。 Furthermore, the efficiency increases when maintaining the amount of user operation to a minimum. 現在実行されているように、オリゴヌクレオチドアレイハイブリダイゼーションは、多大なオペレータの注意深さと操作が必要であり、分析を行う熟練度は高い。 As currently performed, oligonucleotide array hybridization, it is necessary attentiveness and operation of significant operator skill to perform analysis is high. 例えば、ハイブリダイゼーションは典型的にはアッセイ室で行われ、データの収集と分析は( For example, hybridization is typically carried out in the assay chamber, data collection and analysis (
レーザスキャナや蛍光顕微鏡のような)別個の装置で行われる。 Such as a laser scanner or fluorescence microscopy) carried out in a separate device. この装置は、ユーザによる相当な量の取り扱いが必要であり、アッセイの時間浪費とユーザエラーを生じる。 This device requires a substantial amount of handling by the user, resulting in time-consuming and user error of the assay. 【0010】 ハイブリダイゼーションを一時に1つのアレイで行うことが現在の方法の限界であるので、並行処理とデータ分析の経済性を無視している。 [0010] Since the temporary hybridization be performed in a single array are limitations of current methods, it ignores the economics of parallel processing and data analysis. 【0011】 他の限界や不効率、出費は、既存の装置の構造的特徴から生じている。 [0011] Other limitations and inefficiencies, expense arises from structural characteristics of existing devices. 多くの既存の装置は、収容できる基板のサイズが制限されている。 Many existing devices, the size of the housing can substrate is limited. 他の装置は、廃棄できないし、サンプル汚染を防止するために操作間で大規模な洗浄を行う必要がある。 Other devices, to not be disposed, it is necessary to perform extensive washing between operations in order to prevent sample contamination. さらに他の装置は、かさが大きく、有効なハイブリダイゼーションに必要な迅速加熱および冷却が不可能である。 Still other devices, bulky, it is impossible to rapidly heating and cooling required for effective hybridization. さらに他の装置は、反応生成物の分析に高価な光学機器を使用しなければならない。 Still other devices must use expensive optical instruments for the analysis of the reaction products. 【0012】 小さな反応空間(reaction volume)を有し、流体成分が活性混合され、並行処理が可能であり、ユーザ介入を最小化できる、特に拡散ハイブリダイゼーションのような生物学的反応を行う使用容易な装置が要求されている。 [0012] have a small reaction space (Reaction volume), the fluid component is active mixing, but may be parallel processing, thereby minimizing user intervention, particularly easy use for performing biological reactions such as diffusion hybridization device is required Do. さらに、種々の大きさに容易に製造でき、廃棄可能で、サンプル汚染を最小化し、低コストの光学分析機器を使用することができ、サンプル流体の迅速な加熱冷却が可能なように小空間である装置が要求されている。 Furthermore, can be easily manufactured in various sizes, can be discarded to minimize sample contamination, it can be used low-cost optical analysis instrument, so as to enable rapid heating and cooling of the sample fluid in a small space a device is required. またさらに、このような装置を利用して、特に当業者に理解されているバイオチップアレイに関してハイブリダイゼーション効率を増加することができる方法が要求されている。 Furthermore, by utilizing such devices, and it is particularly required method that can increase the hybridization efficiency with respect to the biochip array that is understood by those skilled in the art. バイオチップ技術における強大な興味や、バイオチップ技術への投資および研究により生じる財政的報酬、そのような研究により生じる広範な生成物に照らすと、この要求は特に著しい。 And mighty interest in bio-chip technology, financial compensation resulting from investment and research into biochip technology, in light of the wide range of products resulting from such studies, the request particularly pronounced. 【0013】 (発明の概要) 前記目的に従って、本発明は、生物学的反応を行う装置を提供する。 According [0013] SUMMARY OF THE INVENTION The object, the present invention provides a device for performing biological reactions. 該装置は、第1面と第2面(通常、平坦な基板の場合は互いに対向する)を有する基板からなる。 The device consists of a substrate having a first surface and a second surface (typically, opposing the case of a flat substrate). 生体分子のアレイは第1面に設置され、可撓層は接着層によって基板の第1面に付着される。 Array of biomolecules is placed on a first surface, the flexible layer is attached to the first surface of the substrate by an adhesive layer. ここで、接着層は第1面に配置され、反応空間を形成する。 Here, the adhesive layer is disposed on the first surface, to form a reaction space. 基板は、第1面から第2面に基板を通して延びる少なくとも第1ポートを有し、該ポートは第1開口と第2開口を有する。 Substrate has at least a first port extending through the substrate to the second surface from the first surface, said port having a first opening and the second opening. ポートの第1開口は接着層で境界づけられた領域内に設けられ、可撓層で被覆される(例えば反応空間)。 The first opening of the port is provided in a region bounded by an adhesive layer, it is coated with a flexible layer (e.g., reaction space). ポートの第2開口は、基板の第2面に設けられる。 Second opening port is provided on the second surface of the substrate. 代案として、ポートは反応空間の可撓層に設けられる。 Alternatively, the port is provided in the flexible layer of the reaction space. 【0014】 オプションとして、箔テープのようなポートの第2開口の上に配置された取り外し可能なカバーと、第1温度では個体で第2の高い温度では液体であって、基板の第1面と可撓層の間に配置された水溶性化合物層とがあってもよい。 [0014] Optionally, the arranged removable cover over the second opening of the port, such as foil tape, at a high temperature of the second in the individual first temperature a liquid, the first surface of the substrate and a water-soluble compound layer disposed between the flexible layer may be a. オプションとして、可撓層は半透明プラスチックまたはガス浸透性膜である。 Optionally, the flexible layer is a translucent plastic or gas permeable membrane. 【0015】 ポートは、小径端と大径端を有する円錐台とすることができ、ここで小径端は接着層で境界づけられた第1基板面上の領域に設けられ(反応空間)、大径端は第2基板面上に設けられる。 [0015] The port may be a truncated cone having a small diameter end and a large diameter end, wherein the small diameter end is provided in a region on the first substrate surface bounded by adhesive layers (reaction space), a large diameter end is provided on the second substrate surface. ある実施形態におけるポートの壁は、第2基板面とともに90℃以下の角度を形成する。 There the wall of the port in the embodiment form an angle of 90 ° C. or less with the second substrate surface. オプションとして、ポートはある接触角を有する試料流体を収容する。 Optionally, the port to accommodate the sample fluid having a contact angle with. 第2基板面とポート壁の間の角度は試料流体の接触角以下または同一である。 The angle between the second substrate surface and a port wall is less or the same contact angle of the sample fluid. 【0016】 第2ポートを含めることができる。 [0016] can be included in the second port. この実施形態では、第2ポートは第1面から第2面まで基板を貫通して延び、第1開口と第2開口を有する。 In this embodiment, the second port extends through the substrate from the first surface to the second surface, having a first opening and the second opening. ここで、出口ポートの第1開口は、接着層で境界づけられ可撓層で被覆された領域内の第1基板面に設けられている。 Here, the first opening of the outlet port is provided on the first substrate surface in bounded by adhesive layer covered with the flexible layer region. 出口ポートの第2開口は、第2基板面に設けられ、取り外し可能なカバーで被覆される。 The second opening of the outlet port is provided on the second substrate surface is covered with a removable cover. 代案として、第2ポートは可撓層に設ける。 Alternatively, the second port is provided in the flexible layer. 【0017】 オプションとして、本発明の装置は、アレイと第1基板面の間に配置された反射層、および/または抵抗ヒータを有する。 [0017] Optionally, the apparatus of the present invention comprises an array and arranged reflective layer between the first substrate surface, and / or resistance heaters. 後者は、アレイと第1基板面の間に配置された反射層とすることができる。 The latter may be a arranged reflective layer between the array and the first substrate surface. 【0018】 さらに、本装置は、パリレンのような不動態化層、またはスキャナーを有することができる。 Furthermore, the apparatus can have passivation layer such as parylene or a scanner. スキャナーは、アレイの上の位置で可撓層と接触する。 Scanner is in contact with the flexible layer at the position on the array. スキャナーは導波管(light pipe)とすることができ、反応空間の全体を被覆する。 The scanner may be a waveguide (light pipe), covering the entire reaction space. 【0019】 好ましい特徴では、装置はさらに第2基板面と接触する試料調製チップを有する。 [0019] In a preferred aspect, the device further comprises a sample preparation chip in contact with the second substrate surface. ここで、試料調製チップは装置の第1ポートと一致するポートを有する。 Here, sample preparation chip has a port that coincides with the first port of the device. 【0020】 さらなる特徴では、装置はさらにローラを有する。 [0020] In a further aspect, the apparatus further comprises a roller. ここで、ローラはアレイ上の位置で可撓層と接触する。 Here, the roller is in contact with the flexible layer at the position on the array. 例えば、このローラは、反応空間を横切って長手方向に移動することができる。 For example, the roller can be moved longitudinally across the reaction space. 【0021】 さらなる特徴では、装置は蓋を有するケースと、空間を備えた基台と、スキャナーとローラを備えたキャリッジとを含む。 [0021] In a further feature, the apparatus comprises a case having a lid, a base with a space, a carriage having a scanner and roller. ここで、キャリッジは空間に設けられ、基板は第1基板面がキャリッジと動作可能に接触するようにキャリッジの上に取り外し可能に設置される。 Here, the carriage is provided in the space, the substrate is detachably mounted on the carriage so that the first substrate surface is operative contact with the carriage. 【0022】 追加の特徴では、本発明は生物学的反応を行う装置を提供する。 [0022] In an additional feature, the present invention provides a device for performing biological reactions. 該装置は、 第1面と該第1面に対向する第2面を有するガラス製顕微鏡スライドと; スライドの第1面に配置された生体分子のアレイであって、該アレイ内の各生体分子はポリアクリルアミドのゲルパッドで第1面に固定されている生体分子アレイと; 両面接着層でスライドの第1面に付着された塩化ポリビニリデン層であって、接着層はスライドの第1面に設置され、その領域を包囲している塩化ポリビニリデン層と; 第1面から第2面にスライドを貫通して延びる第1と第2のポートであって、各ポートは第1開口と第2開口を有し、各ポートの第1開口は接着剤により境界づけられたスライドの第1面上の領域内に設けられて可撓層により被覆され、各ポートの第2開口はスライドの第2面上に設けられ、各ポートは小径端と大径端 The apparatus glass microscope slide and having a second surface facing the first surface and the first surface; an array arrangement biomolecules on the first surface of the slide, the biomolecules in the array installation a polyvinylidene chloride layer deposited on the first surface of the slide double-sided adhesive layer, the adhesive layer on the first surface of the slide; the gel pad in has been fixed with a biomolecule array on a first surface of the polyacrylamide It is a polyvinylidene chloride layer surrounds the area; a first and second port extending through the slide from the first surface to the second surface, each port first opening and the second opening has a first opening of the port is covered by a flexible layer provided in a region on the first surface of the slide bounded by an adhesive, the second opening of each port and the second side of the slide provided in the upper, each port and the small diameter end large diameter end を有する円錐台の形状を有し、小径端は第1開口で、大径端は第2開口である第1 Having a truncated cone shape having a first small diameter end in the first opening, the large diameter end is a second opening
と第2のポートと; 各ポートの第2開口の上に配置された箔テープの層と; スライドの第1面と塩化ポリビニリデンの層の間に配置されたポリエチレングリコールの層と; アレイと第1基板面の間の配置された反射層と; 反射層と塩化ポリビニリデンの層の間に配置されたパリレンの層と; 抵抗ヒータとからなる。 When the second port and; a layer arrangement polyethylene glycol between layers of the first surface and the polyvinylidene chloride slides; layer and foil tape disposed on the second opening of each port array and and arranged reflective layer between the first substrate surface; and a layer of reflective layer and parylene disposed between layers of polyvinylidene chloride; consisting of resistive heater. 【0023】 さらなる特徴では、本発明は、生物学的反応を行う装置を提供する。 [0023] In a further feature, the present invention provides a device for performing biological reactions. 該装置は、第1面と第2面を有する基板と、基板の第1面に配置された複数の生体分子と、基板の第1面に接着層により付着された可撓層とからなる。 The device consists of a substrate having a first surface and a second surface, a plurality of biological molecules arranged on the first surface of the substrate, a flexible layer deposited by an adhesive layer to the first surface of the substrate. ここで、接着層は、基板の第1面に配置されてその上の領域を包囲する。 Here, the adhesive layer is disposed on the first surface of the substrate surrounding the region thereon. 反応空間は、可撓層と接着層で規定された領域の第1基板面との間に包囲されている。 The reaction space is enclosed between the first substrate surface of the area defined by the adhesive layer and the flexible layer. 可撓層と接着層を貫通して、可撓層と接着層で規定された領域の第1基板面との間に包囲された空間に延びる第1と第2のポートがある。 Through the flexible layer and the adhesive layer, there is a first and second port extending enclosed space between the first substrate surface of the area defined by the adhesive layer and the flexible layer. 【0024】 追加の特徴では、複数の生体分子の各々は、別個の部位または連続層として、 [0024] In an additional feature, each of a plurality of biomolecules, as a separate part or continuous layer,
ポリアクリルアミドのような重合材料からなるゲルパッドのような固定構造に付着されている。 It is attached to a fixed structure such as a gel pad made of polymeric material such as polyacrylamide. 【0025】 さらなる特徴では、装置は、可撓層に付着された標識層を有する。 [0025] In further features, the device has a label layer which is attached to the flexible layer. ここで、第1と第2のポートは標識層と可撓層を貫通して延びている。 Here, the first and second ports extend through the label layer flexible layer. 標識層は、接着面と非接着面とを有し、ここで標識層は接着面を使用して可撓層に付着されている。 Label layer, and an adhesive surface and a non-adhesive surface, where label layer is attached to a flexible layer using an adhesive surface.
標識層は、サイズと位置が接着層で境界づけられた領域に対応する窓を有する。 Label layer has a window corresponding to the region size and position is bounded by the adhesive layer.
ここで、窓は可撓層と、該可撓層と接着層で規定される領域の第1基板面との間に包囲される空間の視覚的検査を許容する。 Here, the window permits a flexible layer, a visual inspection of the space enclosed between the movable Deflection layer and the first substrate surface of the area defined by the adhesive layer. オプションとして、アレイと第1基板面との間に配置された反射層、および/または抵抗ヒータが設けられる。 Optionally, the reflective layer disposed between the array and the first substrate surface, and / or resistance heater is provided. 【0026】 さらなる特徴では、本発明は、装置を使用して目標分析物を検出する方法を提供する。 [0026] In a further feature, the present invention provides a method of detecting a target analyte using the apparatus. 【0027】 (発明の実施形態の詳細な説明) 本発明の現在好ましい実施形態を添付図面を参照して説明する。 [0027] will be described with reference to the accompanying drawings embodiments which are presently preferred for (detailed description of embodiments of the invention) the present invention. 【0028】 本発明は、生物学的結合部位のアレイを有する基板からなるバイオチップ上で大容量の生物学的反応を行う方法および組成物に向けられている。 [0028] The present invention is directed to methods and compositions for performing biological reactions large capacity on a biochip comprising a substrate having an array of biological binding site. 本発明は、バイオチップが核酸からなる場合におけるハイブリダイゼーション室のような反応室を提供する。 The present invention provides a reaction chamber such as hybridization chamber in the case where the biochip is a nucleic acid. ハイブリダイゼーション室には、基板、接着層、可撓カバーが形成されている。 Hybridization chamber, the substrate, the adhesive layer, the flexible cover is formed. このシステムは、試料および/または試薬を供給するために、基板または可撓カバーのいずれかに設けたポートを利用する。 The system for supplying the sample and / or reagents utilized ports provided on either the substrate or the flexible cover. 【0029】 したがって、本発明は、試料中の目標分析物(target analyte)を検出するのに使用されるデバイスを提供する。 [0029] Accordingly, the present invention provides a device that is used to detect a target analyte in a sample (target analyte). 「目標分析物」または「分析物」あるいは文法的均等物(grammatical equivalents)は、検出される如何なる分子や化合物、粒子をも意味する。 "Target analyte" or "analyte" or grammatical equivalents (grammatical Equivalents) is any molecule or compound to be detected, also means the particle. 以下に概説するように、目標分析物は好ましくは結合リガンド(binding ligand)に結束(bind)している。 As outlined below, target analytes preferably are united (bind) to the binding ligand (binding ligand). 当業者に明らかなように、この方法を使用して多数の検出物を検出することができる。 As will be apparent to those skilled in the art can be used to detect multiple detected object using this method. 基本的には、ここに記載された結合リガンドが作られる如何なる検出物も本発明の方法を使用して検出することができる。 Basically, it can also be detected using the methods of the present invention any detectable product is bound ligand as described herein are made. 【0030】 適切な検出物は、有機または無機分子を含み、生体分子を含む。 [0030] Suitable detected object comprises an organic or inorganic molecules, including biomolecules. 好ましい実施形態では、検出物は、環境汚染物(農薬、殺虫剤、毒素等を含む)、化学薬品( In a preferred embodiment, the detection comprises, environmental contaminants (pesticides, insecticides, including toxins), chemicals (
溶剤、ポリマー、有機物質等を含む)、治療分子(治療および濫用薬物、抗生物質等を含む)、生体分子(ホルモン、シトキン、蛋白質、脂質、炭水化物、細胞膜抗原および受容体(神経、ホルモン、および細胞面の受容体)、またはこれらのリガンド等を含む)、完全細胞(原核生物(病原菌のような)、哺乳類腫瘍細胞を含む真核生物細胞等を含む)、ウィルス(レトロウィルス、ヘルペスウィルス、アデノウィルス、レンチウィルス等を含む)、胞子等であってもよい。 Including solvents, polymers, organic materials, etc.), therapeutic molecules (therapeutic and abused drugs, including antibiotics, etc.), biomolecules (hormones, cytokines, proteins, lipids, carbohydrates, cellular membrane antigens and receptors (neural, hormonal, and comprising receptors) or their ligands such cells surface), intact cells (such as prokaryotic (pathogens), including eukaryotic cells such as including mammalian tumor cells), virus (retrovirus, herpes virus, adenoviruses, lentiviruses, etc.), may be spores, or the like. 特に好ましい分析物は、環境汚染物、核酸、蛋白質(酵素、抗体、抗原、発育因子、 Particularly preferred analytes are environmental pollutants, nucleic acids, proteins (enzymes, antibodies, antigens, growth factors,
シトキン等を含む)、治療および濫用薬物、およびウィルスである。 Including cytokines, etc.), a treatment and drugs of abuse, and viruses. 【0031】 好ましい実施形態では、目標検出物は核酸である。 [0031] In a preferred embodiment, the target detection object is a nucleic acid. 「核酸」または「オリゴヌクレオチド」あるいは文法的均等物は、互いに共有連鎖(covalently linked) "Nucleic acid" or "oligonucleotide" or grammatical equivalents, shared chained together (covalently linked)
された少なくとも2つのヌクレオチドを意味する。 It means at least two nucleotides. 本発明の核酸は、一般にホスホジエステル結合を含むが、ある場合には以下に概説するように、核酸アナログを含む。 The nucleic acid of the present invention generally includes a phosphodiester bond, so is outlined below in some cases, including nucleic acid analogs. 互生主鎖(alternate bakbone)を有する。 Having and alternate main chain (alternate bakbone). 例えば、燐酸アミド(Beau For example, phosphoric acid amide (Beau
cageら,Tetrahedron49(10):1925(1923)およびその参照文献;Letsinger,J.Org.Chem.35:3800(1970);Sprinzlら,Eur. cage et, Tetrahedron49 (10): 1925 (1923) and references therein; Letsinger, J.Org.Chem.35: 3800 (1970); Sprinzl et al., Eur. J. J. B B
iochem. iochem. 81:579(1977);Letsingerら,Nucl. 81: 579 (1977); Letsinger et al, Nucl. Acids Res. Acids Res. 14: 14:
3487(1986);Sawalら,Chem. 3487 (1986); Sawal et al., Chem. Lett. Lett. 805(1984);Letsinger 805 (1984); Letsinger
ら,J. Et al., J. A. A. Chem. Chem. Soc. Soc. 110:4470(1988);Pauwelsら,Chemica S 110: 4470 (1988); Pauwels et al., Chemica S
cripta26:141(1986))、燐酸硫黄塩(Magら,Nucleic Acid Res. cripta26: 141 (1986)), phosphate sulfur salts (Mag et al., Nucleic Acid Res.
19:1437(1991);米国特許第5644048号)、燐酸二硫黄塩( 19: 1437 (1991); U.S. Pat. No. 5,644,048), dihydrogen phosphate sulfur salt (
Briuら,J.Am.Chem.Soc.111:2321(1989)参照)、O−メチルポポロアミド(Eckstein,Oligonucleotides and Analogues:A Practical Appr Briu et al., J.Am.Chem.Soc.111: 2321 (1989) refer), O- methyl Popolo amide (Eckstein, Oligonucleotides and Analogues: A Practical Appr
oach,Oxford University Press参照)、およびペプチド核酸主鎖および連鎖(Egholm, J.Am.Chem.Soc.114;1895(1992);Meierら,Chem.In oach, Oxford University Press reference), and peptide nucleic acid backbones and chain (Egholm, J.Am.Chem.Soc.114; 1895 (1992); Meier et al., Chem.In
t. t. Ed. Ed. Engl. Engl. 31:1008(1992);Nielsen,Nature,365:566 31: 1008 (1992); Nielsen, Nature, 365: 566
(1993);Carlssonら,Nature380:207(1996)参照、これらはここに組み入れる)。 (1993); Carlsson et al., Nature380: 207 (1996) see, which are incorporated herein). 他のアナログ核酸は、正主鎖をもつもの(Denpcyら,Proc Other analog nucleic acids include those with positive backbone (Denpcy et al., Proc
. Natl. Natl. Acad. Acad. Sci. Sci. USA92:6097(1995);非イオン主鎖(米国特許第5386023号、第5637684号、第5602240号、521614 USA92: 6097 (1995); non-ionic backbones (U.S. Pat. No. 5,386,023, No. 5,637,684, No. 5,602,240, 521,614
1号および第4469863号;Kiedrowshiら,Angew. No. 1 and No. 4469863; Kiedrowshi et al, Angew. Chem. Chem. Intl. Intl. Ed. Ed. Engli Engli
sh30:423(1991);Letsingerら,J. sh30: 423 (1991); Letsinger, et al., J. Am. Am. Chem. Chem. Soc. Soc. 110:44 110: 44
70(1988);Letsingerら,Nucleosides&Nucleotide13:1597(1 70 (1988); Letsinger et al., Nucleosides & Nucleotide13: 1597 (1
994);第2,3章,ASCシンポジウムシリーズ580,“Carbohydrate Mod 994); the second and third chapter, ASC Symposium Series 580, "Carbohydrate Mod
ification in Antisense Research”,Ed.YSSanghuiとP.Dan Cook;Mesm ification in Antisense Research ", Ed.YSSanghui and P.Dan Cook; Mesm
aekerら、Bioorganic&Medicinal Chem. aeker et al., Bioorganic & Medicinal Chem. Lett. Lett. 4:395(1994);Jeff 4: 395 (1994); Jeff
sら,J. s et al., J. Biomolecular NMR34:17(1994);Tetrahedron Lett. Biomolecular NMR34: 17 (1994); Tetrahedron Lett. 37 37
:743(1996))、および米国特許第5235033号、第503450 : 743 (1996)), and U.S. Patent No. 5235033, No. 503450
6号、第6および7章,ASCシンポジウムシリーズ580,“Carbohydrate Mod No. 6, the sixth and Chapter 7, ASC Symposium Series 580, "Carbohydrate Mod
ifications in Antisense Research”,Ed.YSSanghuiおよびP.Dan Cookに記載されたものを含む非リボース主鎖を含む。1または複数の炭素環式糖を含む核酸も核酸の定義に含まれる(Jenkinsら,Chem.Soc.Rev.(1995)16 ifications in Antisense Research ", Ed.YSSanghui and P.Dan Cook nucleic acid comprising a .1 or more carbocyclic sugars including non-ribose backbones, including those described are also included within the definition of nucleic acids (Jenkins et al, Chem.Soc.Rev. (1995) 16
9−176頁)。 Pp. 9-176). 幾つかの核酸アナログが、Rawls,C&E News1997年6月2 Some of the nucleic acid analog, Rawls, C & E News 1997 June 2
日第35頁に記載されている。 It is described in the day the first 35 pages. また、核酸アナログ(analog)は、「閉鎖(lock In addition, nucleic acid analog (analog) is, "closing (lock
ed)核酸」を含む。 Including the ed) nucleic acid ". これらの全ての参照文献は、参照することでここに組み入れる。 All of these references are incorporated herein by reference. リボース燐酸塩主鎖の修飾は、電子伝達部分(moieties)の添加を促進し、 Modification of the ribose phosphate backbone to promote the addition of electron transfer moieties (moieties),
生理学的環境におけるそのような分子の安定性および半減期を増加する。 To increase the stability and half-life of such molecules in physiological environments. 【0032】 当業者に明らかなように、全ての核酸アナログを本発明で使用してもよい。 As is apparent to those skilled in the art, it may be used in the present invention all nucleic acid analogs. さらに、核酸とアナログの混合は自然に生じる。 Furthermore, mixing of the nucleic acids and analogs may occur naturally. 例えば、導電性オリゴマーまたは電子移動部分(moiety)の取付部位で、アナログ構造を使用してもよい。 For example, the mounting site of conductive oligomer or electron transfer moiety (moiety), or using analog structure. 代案として、異なる核酸アナログの混合、自然に生じる核酸とアナログの混合を行ってもよい。 Alternatively, mixtures of different nucleic acid analogs, may be carried out mixing of the nucleic acids and analogs occur naturally. 【0033】 概説したように、核酸は単鎖または複鎖であってもよいし、複鎖配列または単鎖配列の両方の部分を含んでいてもよい。 [0033] As outlined, the nucleic acid may be a single or double chain, may contain portions of both double-chained sequence or single-chain sequence. 核酸は、DNAであってもよいし、ゲノムとcDNA、RNAまたは雑種(hybrid)との両方であってもよい。 The nucleic acid may be a DNA, genomic and cDNA, may be both an RNA or hybrids (hybrid). ここで、核酸は、デオキシリボヌクレオチドとリボヌクレオチドの組合せ、ウラシル、 Wherein the nucleic acid is a combination of deoxyribonucleotides and ribonucleotides, uracil,
アデニン、チミン、シトシン、グアニン、イノシン、キサニンヒポキサニン、イソシトシン、イソグアニン等を含む塩基の組合せを含む。 Including adenine, thymine, cytosine, guanine, inosine, hexa Nin hypoxanthine hexa Nin, isocytosine, combinations of bases including uracil, and the like. ここで使用する用語「 As used herein, the term "
ヌクレオシド」は、ヌクレオチドとヌクレオシド、ヌクレオチドアナログ、アミノ修飾ヌクレオシドのような修飾ヌクレオシドを含む。 Nucleoside "includes nucleotides and nucleoside, nucleotide analogs, modified nucleosides such as amino modified nucleosides. さらに、「ヌクレオシド」は、非自然的に生じるアナログ構造を含む。 Furthermore, "nucleoside" includes non-naturally occurring analog structures. 例えば、ペプチド核酸の個々のユニットは、塩基(base)を含むが、ここではヌクレオシドと言及する。 For example, the individual units of a peptide nucleic acid, which contains a base (base), here referred to as the nucleoside. 【0034】 好ましい実施形態において、本発明は目標核酸を検出する方法を提供する。 In a preferred embodiment, the present invention provides a method for detecting a target nucleic acid. "
目標核酸」、「目標配列」およぼその文法的均等物は、単鎖核酸上の核酸配列を意味する。 Target nucleic acid ", grammatical equivalents of Oyoboso" target sequence "refers to a nucleic acid sequences on single-stranded nucleic acid. 目標配列は、遺伝子の一部、調節配列、ゲノムDNA、cDNA、m Target sequence portion of a gene, a regulatory sequence, genomic DNA, cDNA, m
RNAおよびrRNAを含むRNAその他であってもよい。 RNA including RNA and rRNA may be in the other. 配列が長ければ特異(specific)であることを考えると、如何なる長さでもよい。 Given that the sequence is specific (specific) Longer be any length. 幾つかの実施形態では、試料核酸を裂いて(fragment、cleave)100から10000の塩基対の破片にすることが好ましく、ある実施形態では約500の塩基対の断片が好ましい。 In some embodiments, tore sample nucleic acid (fragment, cleave) is preferable to the debris bp from 100 10000, fragment of about 500 base pairs in certain embodiments are preferred. 当業者に明らかなように、相補目標配列は多くの形態をとることができる。 As will be apparent to those skilled in the art, the complementary target sequence may take many forms.
例えば、より大きな核酸配列内に含めてもよい。 For example, it may be included in a larger nucleic acid sequence. すなわち、遺伝子またはmRN In other words, the gene or mRN
Aの全てまたは一部、プラスミドまたはゲノムDNAの制限断片(restriction All or a portion of A, plasmid or genomic DNA restriction fragments (restriction
fragment)に含めてもよい。 It may be included in the fragment). 【0035】 以下に概説するように、プローブ(プライマーを含む)を作成して、目標配列にハイブリダイゼーションし、試料中に目標配列の有無を決定する。 [0035] As outlined below, to create a probe (including primers), hybridized to the target sequence, to determine the presence or absence of a target sequence in a sample. 概して言えば、この用語は当業者に理解されるであろう。 Generally speaking, this term will be understood by those skilled in the art. 【0036】 また、目標配列は、接近(すなわち連続)または離隔した異なる目標ドメインからなっていてもよい。 [0036] The target sequence may consist proximity (i.e. continuous) or spaced different target domains. 例えば、リゲーション(ligation)鎖反応(LCR)技術を使用するとき、第1プライマーは第1目標ドメインにハイブリダイゼーションし、第2プライマーは第2目標ドメインにハイブリダイゼーションする。 For example, when using a ligation (Ligation) chain reaction (LCR) techniques, the first primer hybridizes to the first target domain, the second primer hybridizes to the second target domain. ドメインは近接していてもよいし、以下に詳細に説明するようにポリメラーゼとdN It domains may be close, polymerase dN as described in detail below
TPの使用と合わせて1または複数のヌクレオチドにより離隔していてもよい。 Combined with the use of TP may be spaced apart by one or more nucleotides.
「第1」および「第2」の用語は、5´−3´方位の目標配列に対してある方位の配列を授与することを意味しない。 The term "first" and "second" are not meant to confer sequence orientation with respect to the target sequence 5'-3 'orientation. 例えば、5´−3´方位の相補目標配列を仮定すると、第1目標ドメインは第2ドメインまで5´、または第2ドメインまで3´に配置してもよい。 For example, assuming a complementary target sequence 5'-3 'orientation, a first target domain may be located 3' to 5 'or the second domain, to the second domain. 【0037】 好ましい実施形態では、目標検出物は蛋白質である。 [0037] In a preferred embodiment, the target detection object is a protein. 当業者に明らかなように、本発明を使用して検出される可能性のある多数の蛋白質目標検出物がある。 As will be apparent to those skilled in the art, there are a number of protein targets detected object that may be detected using the present invention. ここで、「蛋白質」またはその文法的均等物は、蛋白質、オリゴペプチドおよびペプチド、誘導体およびアナログ、非自然的に生じるアミノ酸およびアミノ酸アナログを含有する蛋白質、ペプチド様構造を意味する。 Here, "protein" or grammatical equivalents, proteins, oligopeptides and peptides, derivatives and analogs, non-naturally occurring amino acids and amino acid protein containing analog, means a peptide-like structures. 側鎖は(R)または(S) The side chains (R) or (S)
配置のいずれであってもよい。 It may be any arrangement. 好ましい実施形態では、アミノ酸は(S)またはL配置である。 In a preferred embodiment, the amino acid is (S) or L-configuration. 以下に説明するように、蛋白質が結合リガメントとして使用されるとき、試料汚染物による退化(degradation)を遅延させるのに蛋白質アナログを利用することが望ましい。 As described below, when the protein is used as a binding ligaments, it is desirable to utilize protein analogs to retard degeneration (degradation) by the sample contamination. 【0038】 適切な蛋白質目標検出物は、以下のものを含むが、これらに限定されるものではない。 [0038] Suitable protein target detection object may include but below, but the invention is not limited thereto. (1)免疫グロブリン、特にlgEs,lgGs,lgMs、特に治療または診断関連抗体、例えば限定されるものではないがヒトアルブミン抗体、アポリポ蛋白質(アポリポ蛋白質Eを含む)、ヒト絨毛膜刺激ホルモン、コルチゾール、α (1) immunoglobulins, particularly lgEs, lgGs, lgMs, especially therapeutic or diagnostic related antibodies, for example but are not limited to human albumin antibody, (including apolipoprotein E) apolipoprotein, human chorionic hormone, cortisol, α
−フェトプロテイン、チロキシン、甲状腺刺激ホルモン(TSH)、抗トロンビン、薬剤抗体(抗エプチレプチック薬(フェニトイン、プリミドン、カーバリエンゼピン、エトサクシミド、バルプロイック酸、フェノバルビトール)、心作用薬(ジゴキシン、リドカイン、プロカインアミドおよびジソピラミド)、気管支拡張薬(テオフィリン)、抗生物質(クロラムフェニコール、スルホンアミド) - fetoprotein, thyroxine, thyroid stimulating hormone (TSH), antithrombin, drug antibody (anti Epuchirepuchikku drugs (phenytoin, primidone, car burrs Enze pins, ethosuximide, Barupuroikku acid, phenobarbitol), cardiac agents (digoxin, lidocaine, procainamide and disopyramide), bronchodilators (theophylline), antibiotics (chloramphenicol, sulfonamides)
、抗鬱薬、免疫抑制薬、濫用薬(アンフェタミン、メタンフェタミン、カンナビノイド、コカインおよびアヘン)、任意数のウィルス抗体(オルソミクソウィルス、(例えば、インフルエンザウィルス)、パラミクソウィルス(例えば呼吸シンシチウムウィルス、耳下腺炎ウィルス、ミーシエスウィルス)、アデノウィルス、ライノウィルス、コロナウィルス、レオウィルス、トガウィルス(例えば風疹ウィルス)、パルボウィルス、ポックスウィルス(例えば痘瘡ウィルス、痘疹ウィルス)、腸内ウィルス(例えばポリウィルス、コクサッキーウィルス)、肝炎ウィルス(A、BおよびCを含む)、ヘルペスウィルス(例えば単純疱疹ウィルス、水痘帯状疱疹ウィルス、巨細胞ウィルス、エプスタイン−バーウィルス) , Antidepressants, immunosuppressants, abuse drugs (amphetamine, methamphetamine, cannabinoids, cocaine and opiates), any number of viral antibodies (Orthomyxoviridae viruses (e.g., influenza virus), paramyxovirus (e.g. respiratory syncytial virus, parotid glandular inflammation virus, Me sheet S. virus), adenovirus, rhinovirus, coronavirus, reovirus, togaviruses (e.g., rubella virus), parvoviruses, poxviruses (e.g. variola virus, vaccinia virus), enteroviruses (e.g. poly virus, Coxsackie viruses), including hepatitis viruses (a, B and C), herpes virus (e.g. herpes simplex virus, varicella zoster virus, giant cell virus, Epstein - Barr virus)
、ロータウィルス、ノーウォークウィルス、ハンタウィルス、アリーナウィルス、ラブドウィルス(例えば狂犬病ウィルス)、レトロウィルス(HIV,HTL , The rotor virus, Norwalk virus, hantavirus, Arena virus, rhabdovirus virus (eg, rabies virus), retroviruses (HIV, HTL
V−IおよびII)、パポーベウィルス(例えば乳頭腫ウィルス)、ポリオーマウィルス、およびピコルナウィルス等)、およびバクテリア(広範な病原性および非病原性原核生物を含む、バチルス菌;ビブリオ菌,例えばV.cholerae;エシェリヒア菌,例えば腸毒素原性E.coli;シゲラ菌,例えばS.dysenteriae V-I and II), Papobewirusu (e.g. papilloma virus), polyoma virus, and picornaviruses, etc.), and bacteria (broad pathogenic and non-pathogenic prokaryotes, Bacillus; Vibrio, e.g. V .Cholerae; Escherichia bacteria, for example, enterotoxigenic E. coli; Shigella, for example S.dysenteriae
;サルモネラ菌、例えばS.typhi;ミコバクテリウム,例えばM. ; Salmonella, e.g. S.Typhi; Mycobacterium, for example M. Tuberculosis Tuberculosis
,M. , M. leprae;クロストリディウム菌例えばC. leprae; Clostridium bacteria for example C. botulinum,C.tetani,CC.diff botulinum, C.tetani, CC.diff
icile,C.perfringens;穀物バクテリア,例えばC. icile, C.perfringens; grain bacteria, for example C. diphtheriae;連鎖球菌, diphtheriae; streptococci,
例えばS. For example, S. pyogenes,S. pyogenes, S. pneumoniae;ぶどう状球菌,例えばS. pneumoniae; Staphylococcus, e.g. S. aureus;ヘモフィラス菌,例えばH. aureus; Haemophilus bacteria such H. いinfluenzae;ナイセリア菌,例えばN. There influenzae; Neisseria, for example N. meningitidis meningitidis
,N. , N. gonorrhoeae;エルシニア菌,例えばG. gonorrhoeae; Yersinia bacteria, for example, G. lamblia,Y. lamblia, Y. pestis;シュードモナス菌,例えばP. pestis; Pseudomonas bacteria, for example P. aeruginosa,P. aeruginosa, P. putida;クラミジア菌,C. putida; Chlamydia bacteria, C. trachomati trachomati
s;ボルデテラ菌,例えばB. s; Bordetella bacteria, for example B. pertussis;トレポネマ菌,例えばT. pertussis; Toreponema bacteria, for example, T. palladium palladium
等)。 etc). (2)酵素(および他の蛋白質)。 (2) enzymes (and other proteins). 以下のものを含むがこれに限定されるものではない。 Including the following but not limited thereto. 心臓病の標識薬または治療薬として使用される酵素;クレアチンキナーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、アスパラギン酸塩アミノ基転移酵素、トロポニンT Enzyme used as a label or therapeutic agent for heart disease; creatine kinase, lactate dehydrogenase, aspartate aminotransferase, troponin T
、ミオグロビン、フィブリノゲン、コレステロール、トリグリセリド、トロンビン、組織プラスミノゲン活性剤(tPA);アミラーゼ、リパーゼ、キモトリプシンおよびトリプシンを含む膵臓病指示薬;コリンエステラーゼ、ビリルビン、 , Myoglobin, fibrinogen, cholesterol, triglycerides, thrombin, tissue plasminogen activator (tPA); amylase, lipase, pancreatic disease indicators including chymotrypsin and trypsin; cholinesterase, bilirubin,
アルカリホスファターゼを含む肝臓機能酵素および蛋白質;アルドラーゼ、前立腺酸ホスファターゼ、末期デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ、およびHIVプロテアーゼのようなバクテリアおよびウィルス性酵素。 Liver function enzymes and proteins including alkaline phosphatase; aldolase, prostatic acid phosphatase, end deoxynucleotidyl transferase and bacterial and viral enzymes such as HIV protease. (3)ホルモンおよびシトキン(これらの多くは細胞受容体用のリガンドとして役立つ)、例えばエリトロポイエチン(EPO)、血栓ポイエチン(TPO)、 (3) hormones and cytokines (many of these serve as ligands for cellular receptors), for example, erythropoietin (EPO), thrombus Poiechin (TPO),
インターロイキン(IL−1からIL−17を含む)、インシュリン、インシュリン様発育因子(IGF−1から−2を含む)、上皮細胞増殖因子(EGF)、 Interleukins (including from IL-1 to IL-17), (including the IGF-1 -2) insulin, insulin-like growth factor, epidermal growth factor (EGF),
変態発育因子(TGF−αおよびTGF−βを含む)、ヒト成長ホルモン、トランスフェリン、上皮細胞増殖因子(EGF)、低密度リポ蛋白、高密度リポ蛋白、レプチン、VEGF、PDGF、細毛神経組織栄養因子、プロラクチン、副腎皮質刺激性ホルモン(ACTH)、カルシトニン、ヒト絨毛膜刺激ホルモン、コトリソル(cotrisol)、エストラジオール、濾胞刺激ホルモン(FSH)、甲状腺刺激ホルモン(TSH)、レウチンジング(leutinzing)ホルモン(LH)、 Transformation growth factor (including TGF-alpha and TGF-beta), human growth hormone, transferrin, epidermal growth factor (EGF), low density lipoprotein, high density lipoprotein, leptin, VEGF, PDGF, capillitia neurotrophic factor , prolactin, adrenocorticotropic hormone (ACTH), calcitonin, human chorionic hormone, Kotorisoru (cotrisol), estradiol, follicle stimulating hormone (FSH), thyroid stimulating hormone (TSH), Reuchinjingu (leutinzing) hormone (LH),
プロゲテロン(progeterone)およびテストステロン。 Purogeteron (progeterone) and testosterone. (4)他の蛋白質(α−フェトプロテイン、癌肺抗原CEA、癌マーカー等)。 (4) other proteins (alpha-fetoprotein, Ganhai antigen CEA, cancer markers, etc.). 【0039】 さらに、抗体が検出される如何なる生体分子も直接検出することができる。 [0039] Further, it is possible to detect directly any biological molecule to which an antibody is detected. すなわち、ウィルスまたはバクテリア細胞、治療および濫用薬物等は直接検出することができる。 That is, virus or bacterial cells, therapeutic and abused drugs, etc. can be detected directly. 【0040】 適切な目標検出物は、炭水化物を含み、胸部癌用マーカー(CA15−3,C [0040] Suitable target detection object includes a carbohydrate, breast cancer markers (CA15-3, C
A549,CA27,29)、ムチン様癌腫関連抗原(MCA)、卵巣癌(CA A549, CA27,29), mucin-like carcinoma associated antigen (MCA), ovarian cancer (CA
125)、膵臓癌(DE−PAN−2)、前立腺癌(PSA)、CEA、および結腸直腸および膵臓癌(CA19,CA50,CA242)を含むが、これに限定されるものではない。 125), pancreatic cancer (DE-PAN-2), prostate cancer (PSA), CEA, and colorectal and pancreatic cancer (CA19, CA50, CA242) including, but not limited thereto. 【0041】 適切な目標検出物は、金属イオン、特に重金属および/または毒性金属であり、アルミニウム、砒素、カドミウム、セレニウム、コバルト、銅、クロム、鉛、 [0041] Suitable target detection object is a metal ion, in particular heavy metals and / or toxic metals, aluminum, arsenic, cadmium, selenium, cobalt, copper, chromium, lead,
銀およびニッケルを含むが、これらに限定されるものではない。 Including silver and nickel, it is not limited thereto. 【0042】 これらの目標検出物は、血液、リンパ液、唾液、膣および肛門分泌物、尿、糞、汗および涙を含む体液、肝臓、脾臓、骨髄、肺、筋肉、脳等を含む固形組織を含むがこれらに限定されるものではない、任意数の異なる試料タイプに存在していてもよい。 [0042] These target detection object is blood, lymph, saliva, vaginal and anal secretions, urine, feces, body fluids, including sweat and tears, liver, spleen, bone marrow, lung, muscle, solid tissues, including brain, etc. including but not limited to, may be present in the sample types with different arbitrary number. 【0043】 したがって、本発明は、固形基板を有する目標検出物を検出するためのデバイスを提供する。 [0043] Accordingly, the present invention provides a device for detecting a target detection substance with a solid substrate. 固形基板は、ここに記載し、また当業者に明らかなように、広範な材料で、多くの方法で形成することができる。 Solid substrate is described herein, and as will be apparent to those skilled in the art, a wide range of materials can be formed in many ways. さらに、単一のデバイスは1以上の基板からなっていてもよい。 Furthermore, a single device may comprise one or more substrates. 例えば、別個の「検出」カセットとインターフェースを介して連結する「試料処理」カセットがあってもよい。 For example, there may be a "sample treatment" cassette that connects via a separate "detection" cassette and interface. 生の試料を試料処理カセットに加え、当該試料を操作して検出の準備をする。 The raw sample is added to the sample treatment cassette and prepared for detection by operating the sample. 試料を試料処理カセットから取り出して検出カセットに加える。 Samples added to the detection cassette is taken out from the sample processing cassette. デバイスが適合する追加の機能カセット、例えば試料カセットと接触するように設置されてPCRのような反応を生じさせる加熱要素のようなものがあってもよい。 Device fits additional functionality cassettes, for example there may be something like installed in the heating element to cause reactions such as PCR to be in contact with the sample cassette. ある場合には、基板の一部を除去可能であり、例えば、試料カセットは、試料カセット全体が検出装置と接触しないように、着脱可能な検出カセットを有していてもよい。 In some cases, it can be removed a portion of the substrate, for example, the sample cassette, so that the entire sample cassette is not contacted with the detection device may have a detachable detection cassette. 例えば、米国特許第5603351号、PCTUS96/17116、および2000年12月1 For example, US Pat. No. 5603351, PCTUS96 / 17116, and December 1, 2000
1日に出願された「検出物反応のための多層微流体デバイス」(出願日未受領) "Multi-layer microfluidic device for the detection object reaction" filed on 1 day (filed unclaimed)
を参照。 See. これらは参照することで、ここに組み入れる。 These by reference incorporated herein. 【0044】 固形基板の組成は、デバイスを形成するのに使用される技術、デバイスの使用、試料の組成、検出すべき検出物、ウェルおよびマイクロチャンネルの大きさ、 The composition of the solid substrate, a technique used to form the devices, use of the device, the composition of the sample, the detection object to be detected, the wells and microchannels size,
電子部品の有無等を含む洋々な因子に依存する。 It depends on the Yoyo of factors, including the presence or absence of the electronic parts and the like. 一般に、本発明のデバイスは容易に滅菌可能でなければならない。 Generally, the device of the present invention must be readily sterilizable. 【0045】 好ましい実施形態では、固形基板は、シリコンウェハーのようなシリコン、二酸化シリコン、窒化シリコン、ガラスおよび融解シリカ、ガリウム砒素、燐火インジウム、アルミニウム、セラミック、ポリイミド、石英、プラスチック、樹脂および、ポリメチルメタクリレート、アクリル酸、ポリエチレン、ポリエチレンテレフタレート、ポリカーカーボネート、ポリスチレンおよび他のスチレン共重合体、ポリプロピレン、ポリテトラフルオロエチレン、超合金、ジルカロイ、鋼、金、銀、銅、タングステン、モリブデン、タンタル、コバール(KOVAR) [0045] In a preferred embodiment, the solid substrate is a silicon such as silicon wafers, silicon dioxide, silicon nitride, glass and fused silica, gallium arsenide, linker indium, aluminum, ceramics, polyimide, quartz, plastics, resins and poly methyl methacrylate, acrylic acid, polyethylene, polyethylene terephthalate, Porika carbonate, polystyrene and other styrene copolymers, polypropylene, polytetrafluoroethylene, superalloys, zircaloy, steel, gold, silver, copper, tungsten, molybdenum, tantalum, Kovar (KOVAR)
、ケブラー(LEVLAR)、カプトン(KAPTON)、マイラー(MYLA , Kevlar (LEVLAR), Kapton (KAPTON), Mylar (MYLA
R)、真鍮、サファイア等を含むがこれらに限定されない広範な材料から形成することができる。 R), brass, it may include sapphire or the like to form a wide variety of materials including but not limited to. 試料操作工程が光ベース技術を必要とするときには、光透過性のある高融解ホウ珪酸塩や融解シリカのような高品質ガラスが好ましい。 When the sample manipulation steps require light based technologies for high-quality glass such as optical transparency is high melting borosilicate or fused silica are preferred. さらに、ここに概説するように、デバイスの内面の一部は、非特異性結合を減少し、生体適合性や流体抵抗のための結合リガメントの取り付けを許容するために、必要に応じて様々なコーティングで被覆してもよい。 Moreover, as herein outlined, some of the inner surface of the device, to reduce non-specific binding, to allow the attachment of binding ligaments for biocompatibility and fluid resistance, various optionally coated with may be covered. 【0046】 好ましい実施形態では、固形サポートは、米国特許出願番号第09/2350 [0046] In a preferred embodiment, the solid support is U.S. Patent Application No. 09/2350
81号、第09/337086号、第09/464490号、第09/4920 81 Nos., No. 09/337086, No. 09/464490, the 09/4920
13号、第09/466325号、第09/460281号、第09/4602 No. 13, No. 09/466325, No. 09/460281, the 09/4602
83号、第09/387691号、第09/438600号、第09/5061 83 Nos., No. 09/387691, No. 09/438600, the 09/5061
78号、第09/458534号に概説されているようなセラミック材料からなり、これらの文献は参照することでその全体をここに組み入れる。 78 No., a ceramic material as outlined in No. 09/458534, these references are incorporated herein in its entirety by reference. この実施形態では、グリーンシートを積層し、互いに焼結して実質的にモノリシック(monoli In this embodiment, by laminating a green sheet, substantially monolithic and sintered together (monoli
thic)構造を形成したグリーンシート層から作られる。 THIC) made from the green sheet layers to form a structure. グリーンシートは、ガラス、ガラス−セラミック、セラミック、またはこれらの混合の無機粒子をポリマー結合剤中で分散した複合材料であり、可塑剤や分散剤のような添加剤を含めてもよい。 Green sheets, glass, glass - ceramic, a composite material obtained by dispersing a ceramic, or inorganic particles of mixtures thereof in a polymeric binder, may be included additives such as plasticizers and dispersing agents. グリーンシートは、50から250ミクロンの厚さのシートの形態であることが好ましい。 Green sheet is preferably a thickness in the form of a sheet from 50 250 microns. セラミック粒子は典型的には酸化アルミニウムや酸化ジルコニウムのような酸化金属である。 Ceramic particles are typically metal oxides such as aluminum oxide or zirconium oxide. ガラス−セラミック粒子を含むグリーンシートの例は、E. Glass - Examples of green sheet containing a ceramic particles, E. I. I. Du Pont de Nemours and Companyから販売されている「 Sold by Du Pont de Nemours and Company "
AX951」である。 AX951 "is. 酸化アルミニウム粒子を含むグリーンシートの例は、Ferr Examples of green sheet containing aluminum oxide particles, Ferr
o Corpから販売されている「フェロアルミナ」である。 Are sold from o Corp is the "ferro-alumina". グリーンシートの組成は特定に用途に合致するような注文仕様であってもよい。 The composition of the green sheet may be ordered specifications to meet the application in particular. グリーンシート層は互いに積層され、燃焼されて実質的にモノリシック多層構造を形成している。 Green sheet layers are laminated together to form a substantially monolithic multilayered structure is burned. セラミックグリーンシートの製造、処理および適用は、Richard E. Mistier,「テープキャスティング:電子工業の要求にかなう基本プロセス」,Ceramic Bulle Manufacture of ceramic green sheet, processing and applications, Richard E. Mistier, "tape casting: the basic process that meets the requirements of the electronics industry", Ceramic Bulle
tin,vol. tin, vol. 69、no. 69, no. 6,pp. 6, pp. 1022−26(1990)や、米国特許第39 1022-26 (1990), and US Pat. No. 39
91029号に記載され、これらは参照することでここに組み入れる。 It is described in JP 91 029, which are incorporated herein by reference. 【0047】 デバイス(図27−30にデバイス100と200で示す)を製作する方法は、好ましくは50から250ミクロン厚であるグリーンシートのシートを準備することから始める。 The method of fabricating a device (indicated by the device 100 and 200 in FIG. 27-30) preferably begins by preparing a green sheet of the sheet which is 250 microns thick and 50. グリーンシートのシートは、所望のサイズに切断され、従来の処理には典型的には6インチ×6インチであるが、より小さなまたはより大きなデバイスも必要に応じて使用してもよい。 Sheet of the green sheet is cut into a desired size, although the conventional process typically 6 inches × 6 inches, may be used if necessary smaller or larger devices. 各グリーンシート層は種々の技術を使用してテクスチャー(texture)し、最終多層構造の中に、バイアス(vias) Each green sheet layer is texture (texture) using a variety of techniques, in the final multilayer structure, bias (vias)
、溝または空洞のような所望の構造を形成する。 , To form the desired structure, such as a groove or cavity. 【0048】 グリーンシート層をテクスチャーするのに種々の技術を使用してもよい。 [0048] may be using a variety of techniques to texture the green sheet layer. 例えば、グリーンシート層の一部を穿孔してバイアスや溝を形成してもよい。 For example, it may be formed bias or grooves by puncturing a part of the green sheet layers. この操作は、Pacific Trinetics Corp.のモデルAPS−8718自動穿孔装置のような従来の多層セラミック穿孔器を使用して行うことができる。 This operation can be carried out using conventional multilayer ceramic punches, such as Model APS-8718 automatic perforating apparatus Pacific Trinetics Corp.. 材料の一部を穿孔する代わりに、溝やウェルのような特徴は、所望構造の負像(negative imag Instead of drilling a portion of the material, features such as grooves or wells, the negative image of the desired structure (negatives imag
e)を有するエンボスプレートに対してグリーンシートを押し付けることにより、グリーンシートの表面に打ち出し(emboss)してもよい。 By against embossing plates pressing a green sheet having a e), it may be embossed on the surface of the green sheet (emboss). また、織り込み(te Also, weaving (te
xturing)は、Pacific TrineticsのLVS−3012のようなレーザ媒介システムを有するレーザ工具によって行ってもよい。 Xturing) may be carried out by a laser tool with a laser-mediated system such as LVS-3012 of Pacific Trinetics. 【0049】 次に、各織グリーンシート層に、好ましくは厚膜ペーストの形態で、広範な材料を適用してもよい。 Next, each woven green sheet layer, preferably in the form of a thick film paste, may be applied to a wide range of materials. 例えば、金属含有厚膜ペーストをグリーンシート層に設置することで、電気的に導通した通路を設けてもよい。 For example, by installing a metal-containing thick-film paste on the green sheet layer, an electrically conductive passageway. 厚膜ペーストは典型的には所望の材料を含むが、それは有機媒体(vehicle)に分散されたパウダーの形態の金属や誘電体でもよい。 Although the thick film pastes typically include the desired material, which may be a metal or a dielectric in the form of dispersed powder in an organic medium (vehicle). またペーストは、スクリーン印刷のような所望のデポジション(deposition)技術に適した粘度を有するように設計される。 The paste is designed to have a viscosity suitable for the desired deposition (Deposition) techniques such as screen printing. 有機媒体は、焼結を促進するために、ガラスフリットのような少量のフラックスを含めてもよい。 The organic medium, in order to facilitate sintering may include small amounts of flux, such as glass frit. 厚膜技術は、J. Thick-film technology, J. D. D. Provance,「厚膜材料の性能レビュー」,「Insula Provance, "performance review of the thick film material", "Insula
tion/Circuits(1977年4月)」や、Morton L. tion / Circuits (4 May 1977) "and, Morton L. Topfer,厚膜マイクロエレクトロニクス、製作、設計および適用(1977),pp. Topfer, Thick Film Microelectronics, manufacture, design and application (1977), pp. 41−59に記載され、これらは参照することでここに組み入れる。 41-59 are described, which are incorporated herein by reference. 【0050】 得られた厚膜の有孔率(porosity)は、厚膜ペーストに存在する有機媒体の量を調整することで調整することができる。 The porosity of the resulting thick film (porosity) can be adjusted by adjusting the amount of organic medium present in the thick film paste. すなわち、厚膜の有孔率は、厚膜ペースト中の有機媒体のパーセンテージを増加することで、増加することができる。 In other words, porosity of the thick film, by increasing the percentage of organic medium in the thick film paste can be increased.
同様に、グリーンシート層の有孔率は、有機結合剤の比率を増加することで増加することができる。 Similarly, the porosity of the green sheet layer can be increased by increasing the proportion of organic binder. 厚膜およびグリーンシート層の有孔率を増加する他の方法は、有機媒体すなわち有機結合内で、有機媒体に溶解しない他の有機相を分散することである。 Another method of increasing the porosity of the thick film and the green sheet layer, an organic medium or in an organic bond, is to distribute the other organic phases not soluble in an organic medium. ポリマーミクロスフェアはこの目的のために有利に使用することができる。 Polymer microspheres can be used advantageously for this purpose. 【0051】 電気的に導通する通路を加えるために、厚膜ペーストは、典型的には銀、プラチナ、パラジウム、金、銅、タングステン、ニッケル、錫、またはこれらの合金のような金属粒子を含む。 [0051] To add a passage of electrically conductive thick film pastes typically include silver, platinum, palladium, gold, copper, tungsten, nickel, tin, or metal particles such as these alloys . 適切な銀ペーストの例は、E. Examples of suitable silver paste, E. I. I. Du Pont de Ne Du Pont de Ne
mours and Companyから販売されている銀導体組成番号7025および771 Silver conductor composition numbers are available from mours and Company 7025 and 771
3である。 3. 【0052】 厚膜ペーストは、スクリーン印刷によりグリーンシート層に付与することが好ましい。 [0052] thick film paste is preferably applied to the green sheet layer by screen printing. スクリーン印刷処理では、厚膜ペーストは、パターンシルクスクリーンに押しつけて、対応するパターン内のグリーンシート層に設置する。 In the screen printing process, the thick film pastes, against the pattern silk-screen, installed in the green sheet layer in a corresponding pattern. 典型的には、シルクスクリーンパターンは、マスクに露光することで写真的に形成する。 Typically, the silk screen pattern is photographically formed by exposing the mask. このようにして、導電性トレースをグリーンシート層の表面に付与する。 In this manner, it imparts the conductive traces on the surface of the green sheet layers. グリーンシート層に存在するバイアスは、厚膜ペーストで満たしてもよい。 Bias present in the green sheet layer may be filled with the thick film paste. 電気的に導通する材料を含む厚充填ペーストで満たされた場合、バイアスは層間に電気接続を与えるのに役立つ。 When filled with thick filling paste containing a material that electrically conductive, the bias serves to provide electrical connection between the layers. 【0053】 所望の構造をグリーンシートの各層に形成した後、接着層をグリーンシートのいずれかの表面に付与する。 [0053] After forming the layers of the green sheet the desired structure, to impart an adhesive layer to one surface of the green sheet. 好ましくは、接着剤は室温接着剤である。 Preferably, the adhesive is a room temperature adhesive. このような室温接着剤は、室温すなわち約20°Cのガラス遷移温度を有し、これにより室温で互いに基板を接合することができる。 Such room temperature bonding agent has a glass transition temperature of room temperature or about 20 ° C, thereby bonding the substrates together at room temperature. さらに、化学変化を受け、基板と化学的に反応し、あるいは基板の成分を溶解するというよりも、室温接着剤は基板の表面に浸透することで、基板を互いに結合する。 Furthermore, it undergoes chemical changes, and the substrate and chemically react, or rather than to dissolve the components of the substrate, room temperature adhesive that penetrate the surface of the substrate, couples the substrate to each other. 時々、このような室温接着剤は「感圧接着剤」と言及される。 Sometimes, such a room temperature adhesive is referred to as "pressure sensitive adhesive". 適切な室温接着剤は、典型的には、水性乳剤( Suitable room temperature adhesives are typically aqueous emulsions (
emulsion)として供給され、Rohm and Haas,Inc. Is supplied as an emulsion), Rohm and Haas, Inc. やAir Products,Inc.から入手可能である。 And Air Products, is available from Inc.. 例えば、Air Products,Inc.から「Flexcryl1653」として販売されている材料がよいことが分かった。 For example, Air Products, Inc. Material sold as "Flexcryl1653" was found to be good from. 【0054】 室温接着剤は、従来のコーティング技術によってグリーンシートに塗布してもよい。 [0054] room temperature adhesive may be applied to the green sheet by conventional coating techniques. コーティングを促進するために、使用されるコーティング技術や出発材料の装填時の粘性および固形度に依存して、塗布された感圧接着剤を水に希釈することが望ましい。 Coating in order to promote, depending on the loading time of the viscosity and solids of the coating techniques and starting materials used, it is desirable that the pressure sensitive adhesive applied diluted in water. コーティング後、室温接着剤は乾燥することができる。 After coating, it can be room temperature adhesive dries. 室温接着剤の膜の乾燥厚さは、1から10ミクロンの範囲であることが好ましく、厚さはグリーンシートの全表面にわたって均一でなければならない。 The dry thickness of the film at room temperature adhesive is preferably 1 from the range of 10 microns, the thickness should be uniform over the entire surface of the green sheet. 15ミクロンを越える膜厚は望ましくない。 Thickness exceeding 15 microns are undesirable. このような膜厚の接着剤を用いると、多量の有機材料を除去しなければならないために、焼成中に空隙や層間剥離が生じるおそれがある。 With such a thickness of the adhesive, in order not to be removed a large amount of an organic material, there is a possibility that voids or delamination may occur during firing. 乾燥時に約0.5ミクロン厚以下の膜は、層間の接着が不十分であるため、薄すぎる。 About 0.5 micron or less in thickness film during drying, because adhesion between the layers is insufficient, too thin. 【0055】 従来のコーティング技術のうち、スピンコーティングやスプレーが好ましい方法である。 [0055] Among the conventional coating techniques, spin coating or spraying is the preferred method. スピンコーティングを使用する場合、10グラムの「Flexcryl165 If you want to use the spin coating, 10 grams of "Flexcryl165
3」に対して1グラムの消イオン水を加えることが好ましい。 It is preferable to add 1 gram of deionized water for three ". スプレーを使用する場合は、スプレーを容易にするために、より高い希釈レベルが好ましい。 When using a spray, in order to facilitate spraying, higher dilution levels are preferred. さらに、室温接着剤をスプレーするとき、グリーンシートを約60から70°Cの温度に上昇させることが好ましい。 Further, when spraying the room temperature adhesive, it is preferable to increase the green sheet to a temperature of about 60 70 ° C. これにより、材料はグリーンシートに設置した際に殆ど瞬間的に乾燥する。 Thus, the material is almost instantaneously dry when installed in the green sheet. この瞬間的な乾燥により、接着剤はさらに均一で同質の膜となる。 The instantaneous drying, the adhesive becomes a homogeneous film more uniform. 【0056】 室温接着剤をグリーンシート層に塗布した後、当該層を互いに積み重ねて多層グリーンシート層を形成する。 [0056] After applying the room temperature adhesive on the green sheet layer to form a multilayered green sheet layer by stacking the layers to each other. 当該層を調整ダイ(alignment die)の中に積み重ねて、各層構造間の所望のレジストレーションを維持することが好ましい。 Stacking the layers in the adjustment die (alignment die), it is preferred to maintain the desired registration between the layers structure. 調整ダイを使用するとき、調整孔を各グリーンシート層に付加しなければならない。 When using adjusting die, the adjusting hole must be added to each green-sheet layer. 典型的には、室温接着剤を使用するときには、積み重ね工程だけでもグリーンシート層を互いに接合するのに十分である。 Typically, when using room temperature adhesive is sufficient to bond together the green sheet layer alone stacking process. 換言すれば、層を互いに接合するのに圧力は少しでよいし、無くてもよい。 In other words, to pressure may be a little to bonding the layers together, it may be omitted. しかしながら、層をより強固に接合するためには、層は積み重ねた後に互いに積層することが好ましい。 However, in order to bond the layers more firmly, the layer is preferably laminated together after stacking. 【0057】 積層工程は、積み重ねた層に圧力を加えることを含む。 [0057] laminating step comprises applying pressure to the layer stacked. 例えば、従来の積層プロセスでは、積み重ねたグリーンシート層に約1000から1500psiの一軸圧力を付与した後、例えば70°Cに昇温して約10から15分間、約300 For example, in a conventional lamination process, after applying a uniaxial pressure of 1500psi from about 1000 the green sheet layers stacked, for example, and heated to 70 ° C for about 10 to 15 minutes, about 300
0から5000psiの均衡圧を付与する。 From 0 to impart a balance pressure of 5000psi. 従来の積層工程を使用するときは、 When using conventional lamination step,
グリーンシート層を互いに接合するのに接着剤を使用する必要はない。 It is not necessary to use an adhesive green sheet layers to bond to one another. 【0058】 しかしながら、内部または外部の空洞や溝のような構造の範囲にわたって良好な制御を行うために、2500psi以下の圧力が好ましい。 [0058] However, in order to perform a better control over a range of structures such as internal or external cavities or grooves, a pressure below 2500psi are preferred. 空洞や溝のようなより長い構造の形成を許容するためには、より低い圧力が好ましい。 To allow the formation of a longer structure than such as cavities or grooves, a lower pressure is preferred. 例えば、2 For example, 2
500psiの積層圧力を使用する場合、正しく形成された内部空洞や溝の大きさは、典型的には、概略20ミクロン以下に限定される。 When using the laminated pressure 500 psi, the size of the internal cavity or groove formed correctly, is typically limited to schematic 20 microns. したがって、1000 Therefore, 1000
psi以下の圧力は、このような圧力により約100ミクロン以上のサイズを有する構造をある寸法制御手段を用いて形成することができるので、好ましい。 psi following pressure can be formed by using a dimension control means with a structure having a size of more than about 100 microns by such pressure, preferably. 3
00psi以下の圧力は、このような圧力により250ミクロン以上のサイズを有する構造をある程度の寸法制御を用いて形成することができるので、好ましい。 Pressures below 00psi, since the structure having a size of more than 250 microns by such pressure can be formed by using a degree of dimensional control, preferably. 100psi以下の圧力は、ここでは「近ゼロ圧力」と言及するが、多層構造に形成することができる内部および外部の空洞または溝のサイズに関していくつかの限界が存在するので、好ましい。 The following pressure 100psi, here will be referred to as "near-zero pressure", since several limitations with respect to internal and external cavity or groove size that can be formed in the multilayer structure is present, preferred. 【0059】 圧力は、積層工程で一軸プレスにより付与することが好ましい。 [0059] The pressure is preferably applied by uniaxial pressing in the laminating process. 【0060】 代案として、約100psi以下の圧力を手動で付与してもよい。 [0060] Alternatively, it may be imparted to a pressure of less than about 100psi manually. 【0061】 半導体デバイスの製作については、各シートに多くのデバイスを介在させてもよい。 [0061] For the fabrication of semiconductor devices, it may be interposed in too many devices each sheet. 【0062】 したがって、積層後、多層構造を従来のグリーンシートダイシングまたはソーイング装置を使用して切断し、個々のデバイスに分離してもよい。 [0062] Accordingly, after lamination, the multilayer structure was cut using a conventional green sheet dicing or sawing apparatus, it may be separated into individual devices. 室温接着剤によって与えられる剥離またはせん断抵抗のレベルが高いので、ダイシング工程中に非常に小さなエッジの層間剥離が発生する。 Due to the high peel or shear resistance levels provided by room temperature adhesive, delamination of very small edge during dicing process occurs. ダイシング後にエッジの回りでいくつかの層が分離しても、手動で当該エッジに圧力を付与することにより、デバイスの残部に害を与えることなく、当該層を容易に再積層することができる。 Be separated several layers at the edge around after the dicing, by manually applying pressure to the edge, without harm to the remainder of the device, the layer can be easily re-laminated. 【0063】 最終処理工程は、積層された多層グリーンシート構造を「グリーン」状態から最終の実質的にモノリシックな多層構造を形成するための焼成である。 [0063] The final processing step is firing to form a substantially monolithic multilayered structure of the final laminated multilayer green sheet structure from the "green" state. 焼成工程は温度が上昇するにつれて2つの重要な段階で生じる。 Firing process occurs in two important stages as the temperature increases. 最初の重要な段階は、約250から500°Cの温度範囲で生じる結合剤バムアウト(bumout)段階であり、その間に、グリーンシート層中の結合剤や塗布された厚膜ペースト中の有機要素のような他の有機材料が当該構造から除去される。 The first important step, a binding agent Bamuauto (bumout) step occurs at a temperature ranging from about 250 500 ° C, during which the organic components of the binder and the coating thick film paste of green sheet layer other organic materials, such as is removed from the structure. 【0064】 次の重要な段階は高温で起こる焼結段階であり、この段階では、無機粒子が互いに焼結し、これにより多層構造が緻密になり、実質的にモノリシックになる。 [0064] The next important step is the sintering step takes place at elevated temperatures, at this stage, the inorganic particles are sintered together, thereby become multilayer structure dense, it becomes substantially monolithic.
使用する焼結温度は、グリーンシート内に存在する無機粒子の性質に依存する。 The sintering temperature used depends on the nature of the inorganic particles present in the green sheet.
多くのタイプのセラミックに対して、適切な焼結温度は約950から約1600 For many types of ceramics, appropriate sintering temperatures range from about 950 to about 1600
℃の範囲であり、材料に依存する。 ℃ by weight, depending on the material. 例えば、酸化アルミニウムを含有するグリーンシートに対しては1400から1600℃の間の焼結温度が典型的である。 For example, sintering temperatures between 1400 from 1600 ° C. is typical for green sheet containing aluminum oxide. 窒化シリコン、窒化アルミニウムおよびシリコンカーバイドのような他のセラミック材料は、例えば1700から2200℃のようなより高い焼結温度を必要とする。 Silicon nitride, other ceramic materials such as aluminum nitride and silicon carbide, require higher sintering temperature than such as 1700 from 2200 ° C.. ガラス−セラミック粒子を有するグリーンシートに対しては、750から9 Glass - For green sheets having the ceramic particles, from 750 9
50℃の範囲の焼結温度が典型的である。 The sintering temperature in the range of 50 ° C. is typical. ガラス粒子は一般に約350から70 Glass particles generally from about 350 70
0℃の範囲の焼結温度を必要とする。 0 requires a sintering temperature in the range of ° C.. 最後に、金属粒子は、当該金属に依存するが、550から1700℃の焼結温度を必要とする。 Finally, metal particles, depending on the metal, which requires a sintering temperature of 550 from 1700 ° C.. 【0065】 典型的には、デバイスは使用する材料に応じて約4時間から約12時間またはそれ以上の間、焼成する。 [0065] Typically, the device between about 4 hours to about 12 hours or more, depending on the material used, firing. 一般に、焼成は、構造から有機材料を除去し、無機粒子を完全に焼結するために十分な持続時間を有していなければならない。 Generally, calcination, to remove organic materials from the structure must have a sufficient duration to fully sinter the inorganic particles. 特に、 In particular,
ポリマーがグリーンシートや室温接着剤に結合剤として存在する。 Polymer is present as the binder in the green sheet and room temperature adhesive. 焼成は、これらのポリマーを分解し、多層構造から除去するのに十分な温度と持続時間を有していなければならない。 Calcination to decompose these polymers must have a sufficient temperature and duration to remove the multi-layer structure. 【0066】 典型的には、多層構造は焼成工程中に空間の減少をこうむる。 [0066] Typically, the multilayer structure suffers a reduction in space during the firing process. 結合剤バムアウト段階では、約0.5から1.5%の小さな空間の減少が通常みられる。 The binder Bamuauto stage, decrease in small of about 0.5 to 1.5% space normally found. それより高温では、焼結段階で、約14から17%のさらなる空間の減少が典型的にみられる。 At higher temperatures than, the sintering stage, a further decrease in the space of about 14 17% it is typically found. 【0067】 一方、焼成による空間変化は制御することができる。 [0067] On the other hand, the space changes due to firing can be controlled. 特に、グリーンシートや厚膜ペーストのような2つの材料における空間変化を調和(match)させるために、(1)粒子サイズと、(2)焼成工程中に除去される結合剤のような有機成分のパーセンテージを調和するべきである。 In particular, in order to harmonize the spatial variation (match) in the two materials, such as green sheet or thick paste, (1) an organic component such as the particle size, binder is removed during (2) Firing Step It should harmonize the percentage. さらに、この空間変化は正確に調和させる必要がないが、不調和(mismatch)によりデバイスに内部応力が生じる。 Furthermore, this spatial variation is not required to be accurately matched, the internal stress in the device by disharmony (mismatch).
しかし、対称処理、すなわち、デバイスの対向位置に同一の材料または構造を配置することで、ある程度、収縮した不調和の材料に対する補償をすることができる。 However, symmetric processing, i.e., by disposing the same material or structure on opposite position of the device, it is possible to some extent, compensate for shrinkage and disharmony material. 焼結温度または空間変化における大きな不調和により、デバイスの部分あるいは全体に欠陥や破損を生じる。 The large disharmony in the sintering temperature or spatial variation, resulting in defects or damage to the part or the whole of the device. 例えば、デバイスは個々の層に分離し、またはそらせたり、ゆがめたりしてもよい。 For example, the device separated into individual layers or or deflect, may or distorted. 【0068】 前述したように、グリーンシート層に加えられる非類似の如何なる材料も同時焼成(co−fire)される。 [0068] As described above, dissimilar any material added to the green sheet layers are also co-fired (co-fire). このような非類似材料は厚膜ペーストとして、または他のグリーンシート層として加えることができ、あるいは製造工程の後に、すなわち焼結後に加えることができる。 Such dissimilar materials thick film pastes, or other can be added as a green sheet layer, or after the manufacturing process, i.e. it can be added after sintering. 同時焼成の利点は、加えた材料をグリーンシート層に焼結して、実質的にモノリシックな微流体デバイスに一体化されることである。 The advantage of co-firing, by sintering the added material in the green sheet layer, is to be integrated into a substantially monolithic microfluidic device. しかしながら、同時焼成可能であるためには、加えられた材料はグリーンシート層と調和する焼結温度と空間の変化を有していなければならない。 However, in order to be simultaneously possible firing, the added material should have a variation of sintering temperature and space in harmony with the green sheet layer. 焼結温度は材料に大いに依存するので、焼結温度を調和するには材料の適切な選択が必要である。 Since the sintering temperature is highly dependent on the material, to harmonize the sintering temperature is required proper selection of materials. 例えば、銀は電気的に導通する通路を適用するのに好ましい材料であるが、もしグリーンシート層が1400から1600℃の範囲の焼結温度を必要とするアルミニウム粒子を含んでいる場合、銀の融点(961℃)が比較的低いことにより、プラチナのような他の金属を使用しなければならない。 For example, silver is a preferred material for the application of passages electrically conductive, if the green sheet layer contains aluminum particles which requires the sintering temperature ranging from 1400 to 1600 ° C., silver by melting point (961 ° C.) is relatively low, it must be used other metals such as platinum. 【0069】 代案として、他の基板の追加または2つの燒結後部品の接合は、ここで概説したような広範な接着技術を使用して行うことができる。 [0069] Alternatively, the junction of the additional or two sintered parts after other substrate may be performed using a wide range of adhesive techniques as outlined herein. 例えば、デバイスの2つの「半分(half)」は互いに接着または融着することができる。 For example, two "halves (half)" of the device may be adhered or fused together. 例えば、特定の検出台(detection platform)や、ヒドロゲルのような試薬混合物、高温で安定しない生物学的成分を2つの半部間に挟むことができる。 For example, certain detection stage (detection platform) and the reagent mixtures such as hydrogels, can be sandwiched stable without biological component at high temperature between the two halves. 代案として、開口溝やウェルを有するセラミックデバイスを作製し、該デバイスに追加の基板や材料を設置し、他の材料でシールしてもよい。 Alternatively, to prepare a ceramic device having an open groove or well, installing additional substrate or material to the device may be sealed with other materials. 【0070】 特に好ましい基板は、顕微鏡スライドのようなガラスである。 [0070] Particularly preferred substrates are glass, such as a microscope slide. 【0071】 好ましい実施形態では、固体基板は、複数の目標検出物を含む単一試料を取り扱うように形成される。 [0071] In a preferred embodiment, the solid substrate is formed to handle a single sample containing a plurality of target detection object. すなわち、単一試料をデバイスに加え、該試料を等分して平行処理し検出物を検出してもよいし、あるいは連続的に処理し、個々の目標検出物を連続的に検出してもよい。 That is, addition of a single specimen to the device, and aliquoted sample may be detected in parallel processing detection object, or continuously treated, be continuously detect individual target detection object good. さらに、試料を周期的、またはインラインサンプリングのために異なる位置から除去してもよい。 Furthermore, the sample may be removed from different positions for periodic, or inline sampling. 【0072】 好ましい実施形態では、個体基板は1または複数の目標検出物を含む複数の試料を取り扱うように形成されている。 [0072] In a preferred embodiment, the individual substrate is formed to handle a plurality of samples comprising one or more target detection object. 一般に、この実施形態では、各試料は個別に取り扱う。 In general, in this embodiment, each sample handled individually. すなわち、操作と分析は並行して行い、それらの間に接触や汚染がないことが好ましい。 That is, the operation and analysis performed in parallel, it is preferred no contact or contamination between them. 代案として、共通のいくつかの工程があってもよい。 Alternatively, there may be common several steps. 例えば、異なる試料を別個に処理するが、単一の検出台上で目標検出物の全てを検出することが望ましい。 For example, although separately process different samples, it is desirable to detect all of the target detection object on a single detection platform. 【0073】 さらに、ここになされた全ての議論は微小溝とウェルを備えたほぼ平坦な基板を使用することに向けられているが、他の形状も使用することができる。 [0073] Further, all discussion has been made herein is directed to the use of substantially planar substrate having a fine groove and the well may be used other shapes. 例えば、2またはそれ以上の平坦な基板を積み重ねて3次元デバイスを製造することもでき、それは1つの平面内またはそれらの平面間に流れる微小溝を有する。 For example, it is also possible to prepare three-dimensional device by stacking two or more planar substrates, it has a small groove that flows between a single plane or their plane. 同様に、ウェルは2またはそれ以上の基板間にまたがってより大きな空間の試料を許容することができる。 Similarly, the well can allow a sample of more space split between two or more substrates. 例えば、基板の両側をエッチングして微小溝を形成することができる。 For example, it is possible to form fine grooves on both sides of the substrate by etching. 例えば、米国特許第5603351号および第5681484号を参照。 For example, see U.S. Pat. Nos. 5603351 and No. 5681484. これらは参照することでここに組み入れる。 Which are incorporated herein by reference. 【0074】 本発明のバイオチップ基板は、アレイ形式で取り付けられた捕獲結合リガンド(capture binding ligands)を有する。 Biochip substrate [0074] The present invention includes a capture binding ligand attached in an array format (capture binding ligands). ここで「アレイ」または「バイオチップ」は、複数の捕獲結合リガンド、好ましくはアレイ形式の核酸を意味し、アレイのサイズは組成およびアレイの最終使用に依存する。 Where "array" or "biochip" refers to a plurality of capture binding ligand, preferably refers to a nucleic acid array formats, the size of the array depends on the final use of the composition and the array. ここでなされる議論の大部分は、捕獲プローブを備えた核酸アレイの使用に向けられているが、本発明の範囲を限定することを意味しない。 Most of the discussion made herein is directed to the use of nucleic acid arrays with capture probes and are not meant to limit the scope of the present invention. 他のタイプの捕獲結合リガンド(蛋白質等)を使用することができる。 Other types of capture binding ligand (protein, etc.) can be used. 【0075】 核酸アレイは当業者に公知であり、多くの方法で分類することができ、整列( [0075] Nucleic acid arrays are well known to those skilled in the art, it can be classified in many ways, the alignment (
ordered)アレイ(例えば、別個の位置で化学作用(chemistries)を解明(reso ordered) array (e.g., chemistry (chemistries at discrete locations) elucidated (reso
lve)する能力)とランダムアレイとを含む。 lve) ability to) and including a random array. 整列アレイは、写真石版技術(登録商標Affymetrix GeneChip)、スポッティング技術(Synteiその他)、印刷技術(Hewlette Packard and Rosetta)、3次元「ゲルパッド」アレイ等を使用して行うものを含むが、これらに限定されるものではない。 Alignment array, photolithographic techniques (TM Affymetrix GeneChip), spotting techniques (Syntei other), printing techniques (Hewlette Packard and Rosetta), including those using the 3-dimensional "gel pad" arrays, etc., limited to not intended to be. アレイのサイズは変化させることができる。 The size of the array can be varied. 2から多数の異なる捕獲プローブを有するアレイが作られると、非常に大きなアレイが可能となる。 When the array having a number of different capture probes 2 is made, a very possible large arrays. 一般に、アレイは2から100, Generally, the array from 2 100,
000からなり、約400から約1000が最も好ましく、約1000が特に好ましい。 Made 000, and most preferably from about 400 to about 1000, about 1000 being particularly preferred. アレイは「アドレス可能」なものとして分類することができる。 Array can be classified as being "addressable". これは、アレイの個々の要素はxy座標を正確に規定し、これにより所定のアレイ要素をピンポイントすることができることを意味する。 This individual elements of the array define the xy coordinates accurately, thereby meaning that it is possible to pinpoint a certain array elements. 【0076】 本発明は、バイオチップ18を使用してアッセイを行うのに有利に使用される。 [0076] The present invention is advantageously used to perform assays using biochip 18. 当業者で使用されているバイオチップは、生物学的結合対の1つのメンバーからなる生体分子のアレイまたはマイクロアレイ、好ましくは整列アレイ、さらに好ましくは整列およびアドレス可能アレイを含む基板を包含する。 Biochip used in those skilled in the art include, array or microarray of biomolecules consisting of one member of a biological binding pair, preferably aligned array, the substrate further preferably comprising alignment and addressable array. 典型的には、 Typically,
このようなアレイは、生物学的試料に存在すると期待される少なくとも1つの配列に相補するヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドアレイである。 Such an array is an oligonucleotide array consisting of a nucleotide sequence complementary to at least one of the sequences expected to be present in a biological sample. 代案として、ペプチドまたは他の小さな分子をバイオチップに配列して、免疫分析( Alternatively, the sequence peptide or other small molecules to the biochip, immunoassay (
ここで整列分子は抗原である)を行い、あるいは生物学的受容体(ここで、整列分子は前記受容体のガンド、作用薬または拮抗薬である)を分析することができる。 Here aligned molecules do an antigen), or biological receptors (wherein the alignment molecules can analyze the receptor ligands are agonists or antagonists). 【0077】 バイオチップの1つの有益な特徴は、生体分子をバイオチップの表面に取り付ける方法である。 [0077] One advantageous feature of the biochip is a method for attaching a biomolecule to the surface of the biochip. 従来、このような方法は、複数の反応工程を有し、固体サポート(solid support)それ自身の化学的修飾(chemical modification)が必要であった。 Conventionally, such a method has a plurality of reaction steps, the solid support (solid support) itself chemical modifications (Chemical modification) was required. 固体サポート上に存在するヒドロゲルのような吸収マトリックス(ad Absorbing matrix such as a hydrogel which present on a solid support (ad
sorption)を有する実施形態では、生体分子で共有結合を形成することができる化学的機能を提供するために、ゲルポリマーの化学的修飾が必要である。 In embodiments having a sorption), in order to provide a chemical functionality capable of forming a covalent bond with a biological molecule, it is necessary to chemical modification of the gel polymer. 付着作用(attachment chemistry)の効率および形成された化学的結合の強度は、マイクロアレイの製造および最終的性能に不可欠(critical)である。 Strength efficiency and the formed chemical bonds adhering effect (attachment chemistry) is essential (critical) for the production and final performance of the microarray. 【0078】 重合ヒドロゲルおよびゲルパッドは、生体分子の表面に接着する結合層として使用される。 [0078] Polymerization hydrogels and gel pad is used as a bonding layer which adheres to the surface of biomolecules. 生体分子は、蛋白質、ペプチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチドおよび大きな核酸断片を含むが、これらに限定されるものではない。 Biomolecules, proteins, peptides, oligonucleotides, including polynucleotides and larger nucleic acid fragment, but not limited thereto. オリゴヌクレオチドプローブは、ヒドロゲルの連続層の表面またはゲルパッドのアレイに結合してもよい。 Oligonucleotide probes may be bound to the array surface or gel pad of the hydrogel of the continuous layer. 本発明の装置とともに使用するバイオチップからなるゲルパッドは、薄シートまたは平板(slab)として都合よく製造され、典型的には、 Gel pad consisting biochip for use with apparatus of the present invention may conveniently be well prepared as a thin sheet or flat plate (slab), typically
アクリルアミドモノマーの溶液、メチレンビスアクリアミドのような架橋剤、およびN,N,N´,N´−テトラメチルエチレンジアミド(TEMED)のような触媒の溶液と、化学重合用アンモニウム過硫酸塩、または光重合用2,2−ジメトキシ−2−フェニル−アセトフェノン(DMPAP)のような開始剤とを、 Solution of acrylamide monomer, cross-linking agents such as methylene bis-acryl amide, and N, N, N', a solution of a catalyst as N'- tetramethylethylene diamide (TEMED), chemical polymerization ammonium persulfate or, for photopolymerization 2,2-dimethoxy-2-phenyl - an initiator such as acetophenone (DMPAP),
スペーサを使用して2つのガラス面(例えば、ガラス板または顕微鏡スライド) Two glass surface using spacers (e.g., a glass plate or a microscope slide)
の間に設置し、所望の厚さの重合ゲルを得る。 Placed between the to obtain the desired thickness of the polymer gel. 一般に、アクリルアミドモノマーと架橋剤を、水/グリセロール中で約4−5%のアクリルアミド(19/1のアクリルアミド/ビスアクリルアミド比を有する)の溶液内で調製し、僅かな量の開始剤を加える。 Generally, the acrylamide monomer and the cross-linking agent, prepared in a solution of about 4-5% acrylamide in water / glycerol (having an acrylamide / bisacrylamide ratio of 19/1), is added a small amount of the initiator. この溶液を、紫外線(UV)放射(例えば、少なくとも約15 This solution, ultraviolet (UV) radiation (e.g., at least about 15
分、254nm、または他の適切なUV条件、集合的に「光重合」とよぶ)、または高温(例えば典型的には約40℃)での熱イニシエーションのいずれかにより、重合し架橋する。 Min, 254 nm, or other suitable UV conditions, by either thermal initiation at collectively referred to as "photopolymerization"), or high temperature (e.g., typically about 40 ° C.),, polymerized crosslinked. 重合および架橋の後、上のガラススライドを表面から除去し、ゲルを取り出す。 After polymerization and crosslinking, removing the glass slides above the surface, take out the gel. ゲルの孔のサイズ(すなわち「篩特性(sieving propert The size of the gel pore (i.e. "sieving characteristics (sieving Propert
y)」)は、架橋剤の量とモノマー溶液中の固形物パーセントを変更することで制御する。 y) ") is controlled by changing the solids percent of the amount and the monomer solution of the crosslinking agent. 孔のサイズは重合温度を変更することによっても制御することができる。 The pore size can be controlled by varying the polymerization temperature. 【0079】 生体分子用の結合層として使用される本発明の重合ヒドロゲルアレイ(すなわちパターンゲル(patterned gel))のポリアクリルアミドの実施形態の製造において、アクリルアミド溶液は、典型的には、UV重合/架橋工程中にマスクを介してイメージ(image)する。 [0079] In the manufacture of embodiments of the polyacrylamide polymer hydrogel arrays of the present invention used as a tie layer for biomolecules (i.e. pattern gel (Patterned gel)), acrylamide solution typically, UV polymerization / to image (image) through a mask during the cross-linking process. 上のガラススライドを重合後に取り除き、未重合モノマーを水で洗い流し(現像し)、ポリアクリルアミドヒドロゲルの細微な特徴パターンを残し、これを架橋ポリアクリルアミドヒドロゲルパッドを製造するのに使用する。 Remove the glass slide above after polymerization, the unpolymerized monomer rinse with water (developing), leaving Saibi feature patterns of polyacrylamide hydrogel, which is used to produce a crosslinked polyacrylamide hydrogel pad. さらに、半導体工業で知られている石版技術を適用する場合、 In addition, the case of applying the lithographic techniques known in the semiconductor industry,
ポリアクリルアミドヒドロゲルの表面上の個々の位置に光を照射し、これらの特定位置を活性化し、オリゴヌクレオチド、抗体、抗原、ホルモン、ホルモン受容体、リガンドまたは多糖類を固形サポート(例えば、国際出願公開第WO91/ Irradiating light to individual positions on the surface of a polyacrylamide hydrogel, to activate these specific positions, oligonucleotides, antibodies, antigens, hormones, hormone receptors, the solid support a ligand or polysaccharides (e.g., International Application Publication No. WO91 /
07087参照。 07087 reference. これは参照することでここに組み入れる。 This is incorporated herein by reference. )の表面(例えばポリアクリルアミドヒドロゲル表面)に付着させる。 ) Is deposited on the surface (e.g., polyacrylamide hydrogel surface) of the. 【0080】 ポリアクリルアミドを使用するヒドロゲル基アレイには、(オリゴヌクレオチドのような)生体分子は、生体分子と同属化学基からなる派生ポリマー(deriva [0080] The hydrogel based arrays using polyacrylamide (such as oligonucleotides) biomolecules derived polymer (Deriva consisting biomolecules and cognate chemical group
tized polymer)との間にアミド、エステル、または二硫化結合剤を形成することによって、電子対を共有して(covalently)付着させる。 Amides between tized polymer), an ester or by forming a disulfide bond include, by sharing a pair of electrons (covalently) is deposited. 生体分子のポリマーへの共有付着は、通常、ポリマーの重合化および化学架橋が完了した後に行う。 Covalent attachment to a polymer of biological molecules is usually carried out after the polymerization and chemical crosslinking of the polymer was complete. 【0081】 代案として、5´−最終アクリルアミド修飾を支持するオリゴヌクレオチドを使用することができる。 [0081] Alternatively, it is possible to use oligonucleotides which supports the 5'final acrylamide modification. それは、アクリルアミドモノマーと有効に共重合して、 It effectively copolymerized with acrylamide monomer,
DNA−含有ポリアクリルアミド共重合を形成する(Rehmanら、1999,Nucl Forming a DNA- containing polyacrylamide copolymer (Rehman et al., 1999, Nucl
eic Acids Research27:649−655)。 eic Acids Research27: 649-655). この試みを使用して、安定プローブ含有層を、露出したアクリル基を有するサポート(例えばマイクロチター( Using this attempt, support having a stable probe-containing layer, the exposed acrylic group (for example, a micro zither (
microtiter)プレートやシラナイズド(silanized)ガラス)上に製作することができる。 It can be fabricated on a microtiter) plate or Shiranaizudo (silanized) glass). この試みは、市販の「Acrydite(登録商標)」捕獲プローブ(メリーランド州ボストンにあるMosaic Technologiesから入手できる)を利用する。 This attempt to use the commercially available "Acrydite (registered trademark)" capture probe (available from Mosaic Technologies in Baltimore, MD Boston). Ac Ac
ryditeの部分(moiety)は、アクリルアミドと遊離基共重合が可能なエチレン基を有するフォスポルアミダイト(phosporamidite)であり、標準DNAシンセサイザーで、オリゴヌクレオチドプローブの5´ターミナル(terminus)で共重合基を導入するのに使用することができる。 Portion of rydite (moiety) is a phosphatidyl Pol amidites having an acrylamide with a free radical copolymerization ethylenic group (phosporamidite), a standard DNA synthesizer, the copolymerization group 5'terminal oligonucleotide probes (terminus) it can be used to introduce. 【0082】 図1を参照すると、バイオチップからなるハイブリダイゼーション室10を提供し、該ハイブリダイゼーション室10は、第1面12と該第1面12に対向する第2面13を有する基板11と、接着層15によって第1基板面12に取り付けられた可撓層16とからなっている。 [0082] Referring to FIG. 1, to provide a hybridization chamber 10 consisting of biochips, the hybridization chamber 10 includes a substrate 11 having a second surface 13 opposed to the first surface 12 and first surface 12 consists of the adhesive layer 15 attached to the first substrate surface 12 flexible layer 16.. 第1面12には、領域14が接着層15 The first surface 12, region 14 is adhesive layer 15
によって結合され、可撓層16によって被覆されている。 Bound by is covered by a flexible layer 16. 可撓層16、接着層1 Flexible layer 16, the adhesive layer 1
5および第1基板面12は、空間(volume)25を規定している。 5 and the first substrate surface 12 defines a space (volume) 25. 領域14に対する空間25の比は、好ましくは、約0.025mL/mm から約0.25m The ratio of the space 25 for the region 14 is preferably from about 0.025 mL / mm 2 to about 0.25m
L/mm 、好ましくは約0.1mL/mm から約0.25mL/mm 、さらに好ましくは約0.1mL/mm から約0.2mL/mm である。 L / mm 2, preferably about 0.1 mL / mm 2 to about 0.25 mL / mm 2, more preferably from about 0.1 mL / mm 2 to about 0.2 mL / mm 2. 【0083】 図3に示すように、領域14の可撓層16と第1基板面12の間には、複数の生体分子が配設されている。 [0083] As shown in FIG. 3, between the flexible layer 16 in the region 14 between the first substrate surface 12, a plurality of biomolecules are arranged. 好ましい実施形態では、複数の生体分子は、生体分子のアレイ17からなり、該アレイは好ましくは第1基板面12に付着している。 In a preferred embodiment, a plurality of biomolecules, consists of an array 17 of biomolecules, the array preferably is attached to the first substrate surface 12. アレイ17はさらにゲルパッド22を有するのが好ましい。 Array 17 further preferably has a gel pad 22. 代案の好ましい実施形態では、アレイ17はポリアクリルアミドの連続層に設置されている。 In a preferred embodiment alternative, the array 17 is installed in a continuous layer of polyacrylamide. 図2 Figure 2
は、アレイ17の一部の分解断面図であり、ゲルパッド22を示す。 Is an exploded sectional view of a portion of array 17, illustrating the gel pad 22. 各ゲル構造22は好ましくは円柱形で、さらに好ましくは約113ミクロンの径と、約25 In each gel structure 22 is preferably cylindrical, more preferably a diameter of about 113 microns, about 25
ミクロンの厚さを有する。 Having a thickness of microns. 各アレイ17内の各部位間の距離は、好ましくは約3 The distance between each site in each array 17, preferably about 3
00ミクロンである。 Is 00 microns. 【0084】 水溶性化合物層28は、約30から約60℃、好ましくは約35から約50℃ [0084] water-soluble compound layer 28 is from about 30 to about 60 ° C., preferably from about 35 to about 50 ° C.
、さらに好ましくは約35から約45℃の融点を有するが、第1基板面12、可撓層16および接着層15によって境界づけられた空間25に配置されている。 , More preferably has a melting point of from about 35 to about 45 ° C., the first substrate surface 12, is disposed in a space 25 bounded by the flexible layer 16 and the adhesive layer 15.
好ましくは、水溶性化合物は生物学的適合性であり、可撓層16に付着せず、ゲルパッド22への機械的損傷を防止するのに役立つ。 Preferably, the water-soluble compound is a biologically compatible, do not adhere to the flexible layer 16, it serves to prevent mechanical damage to the gel pad 22. この化合物は、任意数の材料からなるが、グリコールポリマーのようなポリマー、デキストラン、糖および他の炭水化物が好ましい。 This compound is comprised of any number of materials, polymers such as glycol polymers, dextran, sugars and other carbohydrates preferred. 好ましい実施形態では、化合物は、ポリエチレングリコール、好ましくはポリエチレングリコール600である。 In a preferred embodiment, the compound is polyethylene glycol, preferably polyethylene glycol 600. 化合物28は、全空間25がアレイ17によって占有されている部分を除き化合物28からなるように設置されている。 Compound 28, the entire space 25 is installed such that a compound 28 except for the portion that is occupied by the array 17. 【0085】 アレイ17は、マーキングを設けることによって面12に配置することができる。 [0085] Array 17 may be arranged on the surface 12 by providing a marking. マーキングは、好ましくは面12に設けたホールまたはピットであるが、アレイ17を正確に配置するための面12上の基準点または参照点として作用する。 Marking is preferably a hole or pit formed in the surface 12, which acts as a reference point or reference points on the surface 12 for accurately positioning the array 17. 前記基準点の存在は、面12上の1または複数の領域14に複数のアレイ17 Presence of the reference points, a plurality of the one or more regions 14 on the surface 12 arrays 17
を有する実施形態において特に有利である。 It is particularly advantageous in the embodiment with. ここで、前記アレイの正確な設置は、ハイブリダイゼーション室にアレイを適切に配置し方位するのに必要である。 Here, the precise placement of the array is needed to orientation and proper placement of the array hybridization chamber. 【0086】 好ましい実施形態では、第1ポート19と第2ポート20が、図7に示すように、可撓層16を貫通して延びている。 [0086] In a preferred embodiment, the first port 19 and the second port 20, as shown in FIG. 7, extends through the flexible layer 16. 第1ポート19は、入力ポートとして作用し、第1開口29が第1面12に接着層15によって境界づけられた領域14 The first port 19 acts as an input port, region 14 first opening 29 is bounded by the adhesive layer 15 to the first surface 12
に設けられるように、可撓層16に配置されている。 As provided, it is arranged on the flexible layer 16. 第2ポート20は、出口ポートとして作用し、第1開口31が第1面12上の接着層15によって境界づけられる領域14内で開口するように、可撓層16に設けられている。 The second port 20 acts as an outlet port, so that the first opening 31 is opened in the region 14 bounded by the adhesive layer 15 on the first surface 12 is provided on the flexible layer 16. ポート19 Port 19
と20の開口は、着脱可能なカバー21によって覆うようにしてもよい。 When 20 opening may be covered by a removable cover 21. 好ましい実施形態では、取り換え可能なカバー21は、ストッパー、ガスケット、テープであり、好ましくは箔テープである。 In a preferred embodiment, replaceable cover 21, a stopper, a gasket, a tape, preferably foil tape. これらの好ましい実施形態では、1または複数の第1ノッチ70は、該第1ノッチ70が第1接着層15によって境界づけられた第1基板面12上の領域14と直接連通するように、第1接着層15に切り込まれている。 In these preferred embodiments, the one or more first notch 70, as the first notch 70 is in direct communication with the area 14 on the first substrate surface 12 bounded by a first adhesive layer 15, the It is cut in first adhesive layer 15. 第2ノッチ72は、接着層15の第1ノッチ70のサイズと位置に対応する位置において、可撓層16に切り込まれ、これにより1または複数のポートを形成する。 The second notch 72 is at the position corresponding to the size and location of the first notch 70 of the adhesive layer 15, cut into the flexible layer 16, thereby forming one or more ports. 特に好ましい実施形態では、接着層74のリングは各第2ノッチ72の周囲に配置される。 In a particularly preferred embodiment, a ring of adhesive layer 74 is disposed around each second notch 72. これにより、接着リング74の内周は第2ノッチ72の外周と同一の広がり(coextensive)を有する。 Thus, the inner periphery of the adhesive ring 74 has a spreading identical to the outer periphery of the second notch 72 (coextensive). 好ましくは、第1ノッチ70と第2ノッチ72は、形状が円で、接着リング74の内径と等しい径を有する。 Preferably, the first notch 70 second notch 72 is shaped in a circle having a diameter equal to the inner diameter of the adhesive ring 74. 好ましくは、接着リング74の内径および外径は、ピペットの先端と密着シールを形成するように選択される。 Preferably, the inner and outer diameters of the adhesive ring 74 is selected to form a close contact seal with the tip of the pipette. 代案の好ましい実施形態では、第2接着層76は、第1基板面12上の涼気14を覆わずに、かつ、第1ポート19と第2ポート20を規定しないように、可撓層16の一部に配置されている。 In a preferred embodiment of the alternative, the second adhesive layer 76, without covering the first cool air 14 on the substrate surface 12, and so as not to define a first port 19 and the second port 20, the flexible layer 16 They are arranged in a part. この実施形態では、装置はさらに第1接着層15と同じ方法でダイカットされて窓58 In this embodiment, the apparatus is further die cut in the same manner as the first adhesive layer 15 a window 58
を形成するように、標識層57を有する。 To form, a label layer 57. 窓は、第1基板面12上の領域14に位置が対応し、第2接着層76に適用される。 Window is located in the first region 14 on the substrate surface 12 is correspondingly applied to the second adhesive layer 76. この実施形態では、1または複数の第3ノッチ78が第2接着層76に切り込まれ、これにより第3ノッチ78は形状、サイズおよび位置において第1ノッチ70と第2ノッチ72に対応する。 In this embodiment, the one or more third notch 78 is cut into the second adhesive layer 76, thereby the third notch 78 is shaped to correspond to the first notch 70 and second notch 72 in size and position.
第4ノッチ80は、第1ノッチ70、第2ノッチ72、第3ノッチ78に対応する形状と位置を有するが、標識層57に切り込まれている。 4th notch 80, first notch 70, a second notch 72 has a shape and position corresponding to the third notch 78 is cut in the label layer 57. 第4ノッチ80の径は、第1ノッチ70、第2ノッチ72、第3ノッチ78の径より大きいことが好ましく、これにより、装置が組み立てられた後に第2接着層76の一部が第4ノッチ80によって露光される。 Diameter of the fourth notch 80, first notch 70, a second notch 72 is preferably greater than the diameter of the third notch 78, thereby, a portion of the second adhesive layer 76 after the device is assembled 4th It is exposed by the notch 80. 好ましくは、第2接着層76の露光位置はピペットの形状とサイズに相当する。 Preferably, the exposure position of the second adhesive layer 76 corresponds to the shape of the pipette and size. 【0087】 本発明の代案の実施形態では、第1ポート19と第2ポート20は、可撓層1 [0087] In alternate embodiment of the present invention includes a first port 19 and the second port 20, the flexible layer 1
6よりもむしろ、基板11を貫通して延びている。 Extend rather, through the substrate 11 than 6. 図示した実施形態は、共有にかかる同時継続の特許出願第09/464490号に記載され、それは参照することでここに組み入れる。 Illustrated embodiment, is described in Patent Application No. 09/464490 copending according to shared, it is incorporated herein by reference. 本発明の好ましい実施形態では、第1基板面12上の領域14は、該領域14の対角方向に対向するコーナーに体格2つの丸いエッジを備えるとともに、領域14の残りの対角方向に対向するコーナーで2つの90 In a preferred embodiment of the present invention, the opposing region 14 on the first substrate surface 12 is provided with a physique two rounded edges in the corner facing diagonally of the region 14, the remaining diagonal direction of a region 14 two of 90 at the corner of
°の角度を備えている正方形または矩形である。 Square or rectangular and includes an angle of °. 好ましくは、第1ポート19または第2ポート20が可撓層16を貫通して延びるとき、第1接着層15の第1 Preferably, when the first port 19 or second port 20 extends through the flexible layer 16, the first adhesive layer 15 first
ノッチ70は、図7に示すように、領域14の先鋭なエッジで切り込まれている。 Notch 70, as shown in FIG. 7, are cut in a sharp edge area 14. これらの実施形態は、コーナーを排除した結合構造からなるので特に好まれ、 These embodiments are particularly preferred since a coupling structure which eliminated the corner,
領域14に気泡の形成を防止することで有益である。 It is beneficial in preventing the formation of air bubbles in the region 14. 【0088】 基板11は、任意の固形サポート物質から製作されるが、その物資は、金属、 [0088] substrate 11, but is fabricated from any of the solid support material, the goods are, metal,
セラミックおよびガラスを含むが、これらに限定されるものではない。 Including ceramics and glass, but are not limited thereto. 好ましくは、基板11は、シリコンまたはガラス(正確と剛性のため)、成形プラスチック(製造コストと熱慣性を減少する)、またはセラミック(一体加熱要素をフィ組む微小流体要素のため)から作製されている。 Preferably, the substrate 11 is (for accuracy and rigidity) silicon or glass, molded plastic (to reduce manufacturing costs and thermal inertia), or ceramic made from (for microfluidic elements Crossed Fi an integral heating element) there. 好ましくは、基板はガラスである。 Preferably, the substrate is glass. 【0089】 接着層15は、基板11と可撓層16の間に水密結合を行うのに適した接着剤を使用する。 [0089] The adhesive layer 15 using an adhesive suitable for performing watertight bond between the substrate 11 and the flexible layer 16. 該接着剤は、高温アクリル樹脂、ゴム基接着剤およびシリコン基接着剤を含むが、これに限定されるものではない。 The adhesive, high temperature acrylic resin, including rubber base adhesive and silicone based adhesives, but is not limited thereto. 接着層15の形状はアレイ17 The shape of the adhesive layer 15 is an array 17
を含むように形成する。 Formed to include a. 接着層15は、所望の形状に領域14を形成するパターンで第1基板面12に設置することができるが、好ましくは長円領域14である。 Adhesive layer 15, can be installed in the first substrate surface 12 in a pattern to form a region 14 into a desired shape, which is preferably oval region 14. 接着層15はインクジェット印刷やオフセット印刷法を使用して、あるいは接着剤のシートから所望の形状をダイカッティングして設置することができる。 Adhesive layer 15 can be placed using an ink-jet printing or offset printing method, or a desired shape from a sheet of adhesive is die cutting. さらに、第1基板面12のほぼ全体部分を接着剤で被覆し、接着剤を保持することを望まない基板の部分は例えば紫外線硬化により硬化させることができる。 Further, substantially the entire portion of the first substrate surface 12 is coated with an adhesive, portions of the substrate that does not wish to retain the adhesive can be cured by, for example, an ultraviolet curing. これらの実施形態では、接着特性を保有する部分はマスクを使用して規定し、可撓層16を面12に付着させるのに必要な接着特性を保持する。 In these embodiments, the portion carrying the adhesive properties are defined using a mask, to retain the adhesive properties needed to adhere the flexible layer 16 to the surface 12. ダイカット接着剤を使用する実施形態では、接着剤は両面接着テープ、好ましくはキャリアのない両面接着テープである。 In embodiments using a die cut adhesive, adhesive double-sided adhesive tape, preferably double-sided adhesive tape without carrier. 接着層15は、1から100mm厚、好ましくは25から50mm厚、さらに好ましくは約50mm厚の層に設置することが好ましい。 Adhesive layer 15, 100 mm thickness from 1, preferably be located in a layer of 50mm thick, more preferably about 50mm thick 25. 【0090】 可撓層16は可撓性のある任意の固体物質で形成する。 [0090] The flexible layer 16 is formed of any solid material having flexibility. 個体物質は、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリ塩化ビニリデン(サラン(商標)ラップとして販売されている)を含むプラスチック、シリコンゴムを含むゴム、高温ポリエステル、および多孔テフロン(商標)を含むが、これらに限定されるものではない。 Individual substances, polypropylene, polyethylene, plastic containing polyvinylidene chloride (sold as Saran (TM) wrap), rubber including silicon rubber, high temperature polyesters, and including a porous Teflon (trademark), are limited to not shall. 可撓層16は、好ましくは生物学的適合性を有し、可撓層と基板の間に含まれる基板から水が蒸発するのを防止するために、低透水性を有することが好ましい。 The flexible layer 16 preferably has a biocompatible, in order to water from the substrate comprised between the flexible layer and the substrate is prevented from evaporating, it is preferred to have a low permeability. 可撓層16はまた、光学的に透明(clear)であることが好ましく、8から12時間、収縮することなく50から95℃の温度に耐えることができなければならない。 The flexible layer 16 also is preferably optically transparent (clear), 8 to 12 hours, from 50 must be able to withstand temperatures of 95 ° C. without shrinkage. 好ましい実施形態では、可撓層はガス浸透膜である。 In a preferred embodiment, the flexible layer is a gas permeable membrane. 可撓層16は、約5m Flexible layer 16, about 5m
から約1400mm 、好ましくは約5mm から約600mm 、さらに好ましくは約100mm から約600mm の領域を被覆するのが好ましい。 m 2 to about 1400 mm 2, preferably from about 5 mm 2 to about 600 mm 2, still more preferably from about 100 mm 2 to cover an area of approximately 600 mm 2. 【0091】 好ましい実施形態では、図5に示すように、本発明は標識層57を有する。 [0091] In a preferred embodiment, as shown in FIG. 5, the present invention has a label layer 57. 標識層57は、接着剤と同様にダイカットして、第1基板面12上の領域14に対応する窓58を形成する。 Label layer 57 is die cut as with adhesive, to form a window 58 corresponding to the first region 14 on the substrate surface 12. 標識層は、接着層を有する厚膜、好ましくはAveryレーザラベルが好ましい。 Label layer, a thick film having an adhesive layer, preferably Avery laser labels are preferred. 標識層は好ましくは真空ラミネーションによって可撓層の外面に付与する。 Label layer are preferably applied to the outer surface of the flexible layer by vacuum lamination. 【0092】 第1基板面12上の領域に含まれるアレイ17は、水溶性化合物28で被覆される。 [0092] array 17 included in the region on the first substrate surface 12 is coated with a water-soluble compound 28. この水溶性化合物28は、使用する前にバイオチップを保護し封止するとともに、アレイの退化その他の損傷を防止する。 The water-soluble compound 28 is configured to seal and protect the biochip prior to use, to prevent other damage degeneration array. 約30℃から約60℃、好ましくは約35℃から約50℃、さらに好ましくは約35℃から約45℃の融点を有する水溶性化合物28は、アレイ17と可撓層16の間の空間25を満たすのに有利に使用される。 From about 30 ° C. to about 60 ° C., preferably about 35 ° C. to about 50 ° C., more preferably water-soluble compound 28 having a melting point of from about 35 ° C. to about 45 ° C., the space 25 between the array 17 and the flexible layer 16 It is advantageously used to fill. 好ましくは、この化合物は、ポリエチレングリコール、好ましくはポリエチレングリコール600である。 Preferably, the compound is polyethylene glycol, preferably polyethylene glycol 600. 本発明のハイブリダイゼーション室10の特に好ましい特徴は、水溶性化合物28が空間25の全体を満たし、好ましくは少なくとも入力ポート19の一部を満たすことである。 A particularly preferred feature of the hybridization chamber 10 of the present invention fulfills a water-soluble compound 28 is the entire space 25 is that preferably meet at least part of the input port 19. これにより、空間25に気泡が形成されるのが防止される。 This prevents air bubbles in the space 25 is formed. なぜなら、化合物28がまず溶融し、ローラ40を使用して、ハイブリダイゼーション流体26中に気泡を生じることなく、ハイブリダイゼーション流体26と混合するからである。 This is because compound 28 is first melted, using a roller 40, without causing air bubbles in the hybridization fluid 26 is mixed with hybridization fluid 26. 空間25に気泡がないことにより、スキャナー36または光パイプ37により検出される人為的信号が最小化される。 The absence of bubbles in the space 25, artificial signal detected by the scanner 36 or the light pipe 37 is minimized. 【0093】 ポートまたはホールは、ガラス基板の実施形態ではダイヤモンドドリルにより、プラスチック基板の実施形態では打ち抜きまたは成形により、あるいはここの概説するセラミック調製技術を使用して、基板11に形成することができる。 [0093] ports or holes, the diamond drill in the embodiment of the glass substrate, by stamping or molding in the embodiment of the plastic substrate, or using ceramic preparation technique outlined here can be formed on the substrate 11 . これは、例えば第1ポート19および第2ポート20が単一操作で形成される基板を形成することで、ハイブリダイゼーション室の寸法の標準化を促進する。 This, for example, that the first port 19 and second port 20 to form a substrate to be formed in a single operation, to promote the standardization of the dimensions of the hybridization chamber. 基板11と着脱可能なカバー21は、ストリップまたは大シートとして設置することができ、転がせて気泡の閉じ込みを防止することができる。 Substrate 11 and removable cover 21 may be installed as a strip or large sheets, it is possible to prevent the confinement of bubbles you roll. 可撓層16は、空気の閉じ込みを防止するために真空ラミネーションを適用することができ、あるいは接着層15と水溶性化合物28を処理した後に、基板11上に液体プラスチックをスピニングしたり流動させ、続いて可撓層を硬化させることで設置することができる。 The flexible layer 16 can be applied to vacuum lamination in order to prevent the confinement of the air, or after processing adhesive layer 15 and a water-soluble compound 28, is or flow spinning liquid plastic onto the substrate 11 it can subsequently be installed by curing the flexible layer. 個々のハイブリダイゼーション室10は、例えば図6に示すようなダイヤモンドソーを使用して積層して形成することができる。 Individual hybridization chamber 10 can be formed by laminating using a diamond saw, as shown in FIG. 6, for example. 【0094】 図6は、ハイブリダイゼーション室10を製作するための好ましい配置を示す。 [0094] Figure 6 shows a preferred arrangement for producing the hybridization chamber 10. ここで、可撓層16、接着層15、アンカット基板11および取り外し可能なカバー21からなる交互層が設置され、ハイブリダイゼーション室は例えばダイヤモンドソーや任意の製作工具を用いて積層層を切断することで製造される。 Here, the flexible layer 16, adhesive layer 15, alternating layers consisting of the uncut substrate 11 and removable cover 21 is installed, the hybridization chamber to cut the laminate layer using a diamond saw or any fabricating tool e.g. It is produced by. シール空間25は、切断工程中に生じるくずからアレイを保護する。 Seal space 25 protects the array from debris generated during the cutting process. 【0095】 本発明のハイブリダイゼーション室10の代案の実施形態は、可撓層16の下の複数の領域14に規定された複数のアレイ17を包含する。 [0095] alternate embodiment of the hybridization chamber 10 of the present invention includes a plurality of arrays 17 defined in a plurality of regions 14 below the flexible layer 16. 各領域はアレイ1 Each area array 1
7を有し、第1ポート19とオプションとして第2ポート20を供給されている。 Has a 7, is supplied to the second port 20 as the first port 19 option. これらの実施形態では、接着層15は各領域14を規定するパターンで第1基板面12上に設置され、可撓層16は前記面上の領域14を包含するように接着層15に当接されている。 In these embodiments, the adhesive layer 15 is disposed on the first substrate surface 12 in a pattern that defines a respective region 14, flexible layer 16 abuts on the adhesive layer 15 to cover the area 14 on the surface It is. 本発明のある実施形態では、アレイ17またはここに記載したような複数のアレイ17を含むハイブリダイゼーション室10が製造される。 In certain embodiments of the present invention, hybridization chamber 10 which includes a plurality of arrays 17 as described herein or array 17 is manufactured. ここで、1または複数の目標分子からなるハイブリダイゼーション流体2 Here, hybridization fluid 2 comprising one or more target molecules
6の添加により、使用の準備ができたハイブリダイゼーション室が提供される。 The addition of 6, hybridization chamber ready for use is provided.
代案の実施形態では、ハイブリダイゼーション室10は、アレイ17なしに製造され、ユーザがそのアレイ17を挿入できるようにする。 In alternative embodiments, the hybridization chamber 10 is produced without the array 17 to allow a user to insert the array 17. これらの実施形態では、可撓層16の少なくとも1つのエッジは第1基板面12に接着されていない。 In these embodiments, the at least one edge of the flexible layer 16 is not bonded to the first substrate surface 12. 【0096】 本発明のハイブリダイゼーション室10の使用においては、好ましくは目標核酸を含む生物学的試料からなるある量のハイブリダイゼーション流体26を第1 [0096] In use of the hybridization chamber 10 of the present invention, preferably the hybridization fluid 26 in the amount first in comprising from a biological sample containing the target nucleic acid
ポート19を介してハイブリダイゼーション室に添加する。 Through the port 19 is added to the hybridization chamber. ハイブリダイゼーション流体26をハイブリダイゼーション室に適用する前に、空間25を水溶性化合物28の融点より高いまたは等しい温度まで加熱するのが好ましい。 Before applying the hybridization fluid 26 in the hybridization chamber is preferably heated space 25 to a high or equal than the melting point of the water-soluble compound 28. 溶融すると、ハイブリダイゼーション流体26をハイブリダイゼーション室に添加し、図18に示すような水溶性化合物と混合することができる。 When melted, the addition of hybridization fluid 26 in the hybridization chamber can be mixed with water-soluble compounds such as shown in FIG. 18. 水溶性化合物28は室内のハイブリダイゼーションに影響を及ぼさないのが好ましい。 Water-soluble compound 28 preferably does not affect the indoor hybridization. さらにある量の化合物28は、該化合物28が試料流体26と混合したときにハイブリダイゼーション効率が改良されるように、選択する。 Further a quantity of the compound 28, the compound 28 is such that hybridization efficiency when mixed with the sample fluid 26 is improved, to select. 【0097】 第2ポート20ではなく第1ポート19を有するハイブリダイゼーション室の実施形態では、化合物28が溶融した後にハイブリダイゼーション流体をハイブリダイゼーション室に導入し、ハイブリダイゼーション流体を好ましくはピペットを使用してハイブリダイゼーション室の内外に循環させるのが好ましい。 [0097] In an embodiment of the hybridization chamber having a first port 19 rather than the second port 20, the hybridization fluid after compound 28 is melted and introduced into the hybridization chamber, the hybridization fluid preferably using a pipette to circulate in and out of the hybridization chamber Te is preferred. これにより、ハイブリダイゼーション流体26と化合物28が完全に混合してハイブリダイゼーション流体26がアレイ17の面上で均一に分布し、あるいは前記アレイのある実施形態からなるゲルパッド22に混合する。 Thus, hybridization fluid 26 is uniformly distributed on the surface of the array 17 hybridization fluid 26 and the compound 28 is thoroughly mixed, or mixed gel pad 22 made of an embodiment of the array. 代案として、以下に詳細に説明するように可撓層16を物理的に操作することによって、ハイブリダイゼーション流体26をアレイ17の面上に均一に分布させ、またはゲルパッド2 Alternatively, by physically manipulating the flexible layer 16 as described in detail below, uniformly distributed hybridization fluid 26 on the surface of the array 17, or gel pads 2
2に混合させる。 It is mixed in 2. これらの実施形態では、ハイブリダイゼーションが完了した後、図9に示すように、ハイブリダイゼーション流体26を除去し、好ましくはピペットを使用して十分な量の洗浄液27をハイブリダイゼーション室の内外に循環させることにより、アレイ17を洗浄する。 In these embodiments, after hybridization is complete, as shown in FIG. 9, to remove the hybridization fluid 26, thereby preferably circulate a sufficient amount of the cleaning liquid 27 using a pipette into and out of the hybridization chamber it allows cleaning the array 17. 第1ポート19と第2ポート20 A first port 19 and the second port 20
の両方からなるハイブリダイゼーション室の実施形態では、化合物28が溶融した後、ハイブリダイゼーション流体をハイブリダイゼーション室に導入し、好ましくは少なくとも1つのピペットを使用してハイブリダイゼーション流体をハイブリダイゼーション室の内外に循環させるのが好ましい。 In the embodiment of consisting both the hybridization chamber, after the compound 28 is melted, introduced hybridization fluid hybridization chamber, preferably the hybridization fluid using at least one pipette in and out of the hybridization chamber It is preferable to circulate. これにより、ハイブリダイゼーション流体26と化合物28が完全に混合してハイブリダイゼーション流体26がアレイ17の面上で均一に分布し、あるいは前記バイオチップのある実施形態からなるゲルパッド22に混合する。 Thus, hybridization fluid 26 hybridization fluid 26 and the compound 28 was mixed thoroughly is uniformly distributed on the surface of the array 17, or mixed into the gel pad 22 made of an embodiment of the biochip. 次に、ハイブリダイゼーションを達成するのに十分な時間と温度でハイブリダイゼーション室を培養(incubate) Then, culturing the hybridization chamber at a temperature and for a time sufficient to achieve hybridization (incubate)
することにより、ハイブリダイゼーションを行う。 By hybridization is carried out. ハイブリダイゼーションが完了すると、出口ポート20を介してハイブリダイゼーション流体26を除去し、 When hybridization is completed, remove hybridization fluid 26 through the outlet port 20,
十分な量の洗浄液を付与し好ましくはピペットを使用してハイブリダイゼーション室の内外に循環させることで、バイオチップを洗浄する。 Preferably impart a sufficient amount of cleaning liquid that is circulated in and out of the hybridization chamber using a pipette, washing the biochip. これらの実施形態では、洗浄液を入力ポートを介して付与し、出口ポートを介して除去することで、 In these embodiments, the cleaning liquid through the input port to grant, by removing through the outlet port,
洗浄液を連続的に供給することができる。 It can be continuously supplying a cleaning liquid. ある実施形態では、ハイブリダイゼーションされたアレイを含むバイオチップを、ハイブリダイゼーション室から除去して成長(development)させ,必要に応じてさらに操作する。 In certain embodiments, a biochip comprising the hybridized array was removed from the hybridization chamber is grown (development), further manipulated as needed. 好ましい実施形態では、ハイブリダイゼーションアレイを含むバイオチップを以下に説明するようにもとの場所(in situ)で分析する。 In a preferred embodiment, it analyzed in situ (in situ) to explain the biochip below containing hybridization arrays. 【0098】 図1Bは、さらに加熱要素33を有する本発明のハイブリダイゼーション室1 [0098] Figure 1B, the hybridization chamber 1 of the present invention further comprises a heating element 33
0の有利な実施形態を示す。 It shows an advantageous embodiment of the 0. 加熱要素33はさらに可撓層16の下の領域14をほぼ覆うようにハイブリダイゼーション室10の形状に適合した加熱面34を有する。 The heating element 33 further has a heating surface 34 adapted to the shape of the hybridization chamber 10 so as to substantially cover the area 14 below the flexible layer 16. 加熱要素33は、如何なる加熱手段でもよく、抵抗ヒータ、熱電気ヒータ、マイクロ波吸収ヒータを含むが、これらに限定されるものではない。 Heating element 33 may be any heating means, resistance heaters, thermoelectric heaters, including microwave absorbing heater, but is not limited thereto. 【0099】 本発明のハイブリダイゼーション室10は、該ハイブリダイゼーション室10 [0099] hybridization chamber 10 of the present invention, the hybridization chamber 10
のハイブリダイゼーション流体26の温度を測定する熱伝対35または他の温度検出または測定要素を有するのが有利である。 It is advantageous to have a thermocouple 35 or other temperature sensing or measuring element for measuring the temperature of the hybridization fluid 26. これらの温度検出要素は、ハイブリダイゼーション流体26と洗浄溶液27の温度を制御するように加熱要素33 These temperature sensing element, the heating element to control the temperature of the hybridization fluid 26 and the cleaning solution 27 33
と結合するのが有利であり、以下に説明する温度に敏感な走査デバイス36のような他の要素を更正するのに使用することができる。 From binding is advantageous, it can be used to rectify other factors such as sensitive scan device 36 to a temperature which will be described hereinafter with. 【0100】 本発明のある実施形態では、ハイブリダイゼーションが生じるバイオチップ1 [0100] In certain embodiments of the present invention, the biochip 1 hybridization to occur
8の部位で可視光を反射する染料や他の材料を生成することで、塩基性(positi 8 sites to produce a dye or other material that reflects visible light, basic (POSITI
ve)ハイブリダイゼーションを可視的に検出することができる。 ve) hybridization can be detected visually. これらの実施形態では、染料や他の材料は、染料の生成を引き起こす酵素に結合した抗体のような例えばハイブリダイゼーション特定免疫試薬を使用して、酵素により生成することが好ましい。 In these embodiments, dyes and other materials, using, for example, hybridization specific immunological reagents, such as antibodies bound to an enzyme that causes the production of dye, it is preferably generated by the enzyme. 可視的検査は、塩基性ハイブリダイゼーションの部位を検出するのに使用することができる。 Visual inspection can be used to detect sites of basic hybridization. さらに好ましくは、ハイブリダイゼーションアレイを含むバイオチップを以下に説明するスキャナ36を使用して走査することが好ましい。 More preferably, it is preferable to scan using the scanner 36 to explain the biochip below containing hybridization arrays. 【0101】 バイオチップ18上の塩基性ハイブリダイゼーションは、生物学的試料内の標識目標分子を使用する蛍光によって、またはハイブリダイゼーションされた二本鎖DNA分子により結合されて特定波長の光で照明されたときに蛍光を発する介入染料(intercalating dye)をハイブリダイゼーション液体中に含めることによって、検出することが好ましい。 [0102] Basic hybridization on the biochip 18 is illuminated with light labeled by fluorescence using a target molecule or hybridization are linked by a double-stranded DNA molecule specific wavelength, in a biological sample by including the intervention dye that fluoresces (intercalating dye) hybridization in the liquid when the it is preferable to detect. 適切な介入染料は、臭化エチジウム、ヘキストDAPI、アレクサフルオロ染料(Alexa Fluor dye)を含むが、これらに限定されるものはない。 Appropriate interventions dyes, ethidium bromide, Hoechst DAPI, including Alexa Fluor dyes (Alexa Fluor dye), not limited thereto. 適切な蛍光標識は、フルオレセイン、ローダミン、プロピディウムヨー化物、Cy3およびCy5(Amersham)を含むが、これらに限定されるものではない。 Suitable fluorescent labels include fluorescein, rhodamine, propidium iodide, including Cy3 and Cy5 (Amersham), but is not limited thereto. これらは、標識オリゴヌクレオチドプライマーを使用して、目標分子例えば生体外増殖断片に組み込むことができる。 These uses labeled oligonucleotide primers can be incorporated into target molecules, such as in vitro proliferation fragments. 【0102】 図10A−10Cは、スキャナー36を有する本発明の実施形態を示す。 [0102] Figure 10A-10C illustrate an embodiment of the present invention having a scanner 36. このスキャナー36は、可撓層16の上(または下)に配置され、連続的に領域14 The scanner 36 is disposed on the flexible layer 16 (or below), continuously region 14
とその上に配置されたアレイ17を照明しながら、領域14の一端から他端に移動する。 And while illuminating the array 17 disposed thereon, it is moved from one end to the other end of region 14. ハイブリダイゼーションされたアレイの分析前に、全ての流体を空間2 Before analysis of hybridization arrays, all of the fluid space 2
5から除去し、これにより可撓層16はアレイ17と接触する。 Was removed from the 5, thereby the flexible layer 16 is in contact with the array 17. スキャナー36 Scanner 36
は、好ましくは短波長光、さらに好ましくは250nmから600nmの波長を有する光で蛍光染料を励起する。 Is preferably short-wavelength light, more preferably excites a fluorescent dye with light having a wavelength of 600nm from 250 nm. スキャナー36は特定領域からの放射光を収集する。 Scanner 36 collects light emitted from a particular area. 放射光の量は、領域内に存在する蛍光染料の量、すなわち標識目標の量を決定するのに使用する。 The amount of the emitted light, the amount of fluorescent dye present in the area, that used to determine the amount of labeled target. 【0103】 スキャナーと走査デバイス36の特定の実施形態を図11Aから11Eに示す。 [0103] A specific embodiment of the scanner and the scanning device 36 from FIG. 11A to 11E. ハイブリダイゼーション室10の特に有利な特徴は、可撓層16がスペクトルの紫外および可視部の光を含む適切な波長光に対して半透明であることである。 Particularly advantageous features of the hybridization chamber 10 is that the flexible layer 16 is semi-transparent to the appropriate wavelength light including light in the ultraviolet and visible portion of the spectrum.
ハイブリダイゼーション室10のさらに有利な特徴は、ハイブリダイゼーション流体26または洗浄流体27がハイブリダイゼーション室10から除去された後に、非常に薄い可撓層16が直ちにバイオチップ18と近接し接触することである。 Further advantageous features of the hybridization chamber 10 is that the hybridization fluid 26 or the cleaning fluid 27 after it has been removed from the hybridization chamber 10, a very thin flexible layer 16 is immediately adjacent the biochip 18 contact . この特徴の組合せは、スキャナーからの照明の自由表面反射、内部反射、照明光の分散または散乱を減少し排除し、これによりアレイ17を照明する入射光を最適化される。 The combination of this feature, the free surface reflection of the illumination from the scanner, internal reflection, to reduce the dispersion or scattering of the illumination light to eliminate, is optimized incident light thereby illuminating the array 17. この配置は、高研磨でかつ低散乱の面や複雑で高価なレンズが不用であり、さらに複雑な光学検出器における焦点および深度に関する問題を排除することができるので、既存の装置より経済的である。 This arrangement is highly polished and low scattering surface and complex and expensive lens is unnecessary, it is possible to eliminate the problems with focus and depth of more complex optical detector, more economical than existing devices is there. 【0104】 他の実施形態では、導波管37は可撓層16の面と接触し、該可撓層16は直ちに、図11Bに示すように、アレイ17の面に近接し接触する。 [0104] In another embodiment, the waveguide 37 is in contact with the surface of the flexible layer 16, the movable Shiwaso 16 immediately, as shown in FIG. 11B, contacts close to the plane of the array 17. これらの実施形態では、照明光および放射光は導波管37によって伝播され収集される。 In these embodiments, the illumination light and the emitted light is collected is propagated by the waveguide 37. 導波管は、可撓層16の輪郭面に適合するように、わずかに可撓性を有するように設計されている。 Waveguide, to match the contoured surface of the flexible layer 16 is designed to have a slightly flexible. 導波管37は可撓層16と接触し、該可撓層16はアレイ17と接触し、これによりアレイ17および導波管37が種々の高さで配置されている状況においても表面反射なく接触する。 The waveguide 37 is in contact with the flexible layer 16, the movable Shiwaso 16 is in contact with the array 17, thereby no surface reflection in situations where the array 17 and waveguide 37 are arranged in different heights Contact. 導波管37はアレイ17より大きな表面積を有する。 The waveguide 37 has a larger surface area than the array 17. これにより、最大量の照明光がアレイ17に供給され、該アレイ1 Thus, the maximum amount of illumination light is supplied to the array 17, the array 1
7から放射される最大量の光が導波管37によって収集される。 7 maximum amount of light emitted is collected by the waveguide 37 from. 導波管37のさらなる利点は、ハイブリダイゼーション流体26または洗浄緩衝剤27の中に形成される気泡を検出することができ、その検出結果を、ローラ40が可撓層16 A further advantage of the waveguide 37 can detect the bubbles formed in the hybridization fluid 26 or wash buffer 27, the detection result, the roller 40 is flexible layer 16
をアドレスしてそのような気泡を除去する信号として使用することができる。 The by address can be used as a signal for removing such bubbles. ハイブリダイゼーション流体26または洗浄緩衝剤27中の気泡を除去することにより、非特定結合(non−specific binding)やスキャナー36によって検出される人為的信号の頻度を減少する。 By removing air bubbles in the hybridization fluid 26 or during the wash buffer 27, to reduce the frequency of artificial signal detected by non-specific binding (non-specific binding) or scanner 36. 【0105】 本発明の追加の実施形態では、接着層15によって規定される領域14は、反射層38をさらに有する。 [0105] In additional embodiments of the present invention, the region 14 defined by the adhesive layer 15 further has a reflective layer 38. この反射層は、領域14の全体をほぼ被覆し、アレイ17と第1基板面12の間に配置されている。 The reflective layer, the entire area 14 substantially covering is disposed between the array 17 of the first substrate surface 12. 好ましい実施形態では、反射層3 In a preferred embodiment, the reflective layer 3
8は、アルミニウム、金、銀、またはプラチナからなる。 8 is composed of aluminum, gold, silver or platinum,. これらの実施形態では、反射した光信号、またはスキャナー38の光検出部に移送した光信号は、4重(four−fold)まで増加する。 In these embodiments, the reflected light signal or an optical signal and transferred to the light detecting portion of the scanner 38, is increased to a quadruple (four-fold). 本発明のさらなる有利な実施形態では、反射層3 In a further advantageous embodiment of the present invention, the reflective layer 3
8は、金属膜抵抗またはRF誘導加熱である。 8 is a metal film resistor or RF induction heating. これらの実施形態では、反射層3 In these embodiments, the reflective layer 3
8は、追加の加熱要素33を必要とすることなくスライドを加熱することができる。 8, it is possible to heat the slide without requiring additional heating elements 33. これは本発明のハイブリダイゼーション室10の携帯型の実施形態において特に望ましい特徴である。 This is particularly desirable feature in embodiments of a portable hybridization chamber 10 of the present invention. 【0106】 もし必要なら、反射層38の上に不動態層39を設けることができる。 [0106] If necessary, it is possible to provide a passivation layer 39 on the reflective layer 38. 不動態層29は蒸着によって設けられる数ミクロン厚のパリレン層であることが好ましい。 It is preferred that passivation layer 29 is a parylene layer of a few microns thickness provided by vapor deposition. これらの実施形態では、必要な照明量、すなわち、スキャナー36を操作するのに必要な電力量は減少する。 In these embodiments, the illumination required amount, i.e., the amount of power required to operate the scanner 36 is reduced. これは、携帯型デバイスのようなバッテリー駆動型の実施形態にはバッテリー寿命を向上するのに特に適している。 It is particularly suitable for improving the battery life in battery-driven embodiments, such as a portable device. さらに、不動態層39は、異物(obscuring objects)による光放出データ中の人為的信号を減少する。 Furthermore, the passivation layer 39 reduces the artificial signal in the light emission data due to foreign matter (obscuring objects). 【0107】 ハイブリダイゼーション室10は、可撓層16と取り外し可能に接触するローラ40を設けることが好ましい。 [0107] Hybridization chamber 10 is preferably provided with rollers 40 that allow contact removal and flexible layer 16. このローラ40は、第1基板面12上の領域1 The roller 40, the region 1 on the first substrate surface 12
4を長手方向に横切って移動することができる。 4 can be moved across the longitudinal direction. 好ましい実施形態では、ローラ40の表面は、当該ローラが領域14とアレイ17を横切ってハイブリダイゼーション流体と洗浄液を有効に混合させることができる織地パターン41、好ましくは螺旋パターンからなる。 In a preferred embodiment, the surface of the roller 40, the fabric pattern 41 to which the rollers can be effectively mixed hybridization fluid and the cleaning liquid across the region 14 and array 17 preferably consists of a spiral pattern. ローラ40とハイブリダイゼーション室10の1つの有利な配置は、図11Eに示されている。 One advantageous arrangement of the rollers 40 and the hybridization chamber 10 is shown in Figure 11E. 図に示すように、ローラ40は可動アーム42に有利に接続することができる。 As shown, the roller 40 can be advantageously connected to the movable arm 42. 可動アーム42は、第1位置にある時にローラ40が可撓層16と接触するように配置することができ、また可撓層16と接触しない第2位置に移動することができる。 Movable arm 42 can be the roller 40 when in the first position can be placed in contact with the flexible layer 16, also moves to the second position not in contact with the flexible layer 16. 好ましくは、可動アーム4 Preferably, the movable arm 4
2は、回動点44を有し、該回動点44の回りの移動はソレノイドによって制御するのが好ましい。 2 has a pivot point 44, around the transfer 該回 moving point 44 is preferably controlled by a solenoid. ハイブリダイゼーション室10と接離するローラの移動に加えて、ローラ40若しくはハイブリダイゼーション室10、またはそれらの両方は、長手方向に移動可能である。 In addition the hybridization chamber 10 to move toward and away from the roller, the roller 40 or hybridization chamber 10, or both, is movable in the longitudinal direction. これにより、ローラ40は、アレイ17を含む領域14内で可撓層16、接着層15および第1基板面12によって境界づけられた空間25内のハイブリダイゼーション流体26または洗浄液27を混合させることができる。 Thus, the roller 40 may be mixed with the flexible layer 16, adhesive layer 15 and the first hybridization fluid 26 or the cleaning liquid 27 in the space 25 bounded by the substrate surface 12 in region 14 including an array 17 it can. 複数のアレイ17を有する複数の領域14からなる実施形態では、ローラ40は複数の各領域14を長手方向に横切るように配置され、アレイ17を含むいずれかの空間25内でハイブリダイゼーション流体26または洗浄液27を混合させることができる。 In embodiments including a plurality of areas 14 having a plurality of arrays 17, the roller 40 is arranged so as to cross each of the plurality of regions 14 in the longitudinal direction, the hybridization fluid 26 or any space within 25 including an array 17 it can be mixed cleaning liquid 27. 【0108】 追加の実施形態では、図12Aから図12Cに示すように、ポート46を有する試料調製チップ45をハイブリダイゼーション室10に取り付けることができる。 [0108] In additional embodiments, can be attached in FIG. As shown in 12C, the hybridization chamber 10 of the sample preparation chip 45 having a port 46 from Figure 12A. この試料調製チップ45のポート46は、ハイブリダイゼーション室10の第1ポート19と一致し、試料の空間25への有効な移動を許容する。 The port 46 of the sample preparation chip 45 is coincident with the first port 19 of the hybridization chamber 10, to permit effective transfer to the space 25 of the sample. ハイブリダイゼーション室10と試料調製チップ45を正確に一致させるために、追加の基準参照部(fiducial reference)を使用することができる。 To match the hybridization chamber 10 and the sample preparation chip 45 can be accurately used additional criteria reference portion (fiducial reference). 第1ポート19 The first port 19
へのアクセスは第2基板面13を通して行われるので、アレイは取り付けられた試料調製チップからの干渉なく走査される。 Since access to is made through the second substrate surface 13, the array is scanned without interference from sample preparation chip attached. 本発明の代案の実施形態では、試料調製チップ45は、第2基板面13に結合することができ(図12B)、あるいは基板11の一体部分として形成することができる(図12C)。 In alternate embodiment of the present invention, sample preparation chip 45, it is possible to bind to the second substrate surface 13 can be formed as an integral part of (FIG. 12B), or the substrate 11 (FIG. 12C). 【0109】 本発明のハイブリダイゼーション室10の好ましい実施形態は、さらにスキャナー36を有する図10A−10Cに示すような携帯型の実施形態である。 [0109] Preferred embodiments of the hybridization chamber 10 of the present invention is a further embodiment of a portable type as shown in FIG. 10A-10C having a scanner 36. これらの実施形態では、携帯型デバイス47は、基台48、蓋49、ローラ40を具体化したキャリッジ50、スキャナー36、加熱要素33および熱伝対35からなる。 In these embodiments, the portable device 47, base 48, lid 49, the carriage 50 embodying the rollers 40, the scanner 36, consisting of the heating element 33 and thermocouple 35. キャリッジ50は、図11Aに示されている。 The carriage 50 is shown in Figure 11A. デバイス47は、ハイブリダイゼーション室10をキャリッジ50の近傍に配置するための区画を有する。 Device 47 comprises a compartment for placing the hybridization chamber 10 in the vicinity of the carriage 50.
キャリッジ50は、前述したような操作に要求されるように、ローラ40、スキャナー36および加熱要素33をハイブリダイゼーション室10に対して移動させる可動手段を備えている。 The carriage 50, as required as described above operation, the roller 40, and a movable means for moving the scanner 36 and heating element 33 with respect to the hybridization chamber 10. キャリッジ50と蓋49は、ユーザが必要に応じてハイブリダイゼーション流体26と洗浄液27を第1ポート19と第2ポート2 The carriage 50 and the lid 49, the hybridization fluid 26 and the cleaning solution 27 to the first port 19 and the second port 2 as required by the user
0を介してハイブリダイゼーション室に導入し除去することができるように配置されている。 It is arranged so that it can be introduced into the hybridization chamber removed through 0. 代案として、デバイス47はさらに第1および第2ポートの各々への流体接続部52を有し、試料をハイブリダイゼーションした後の試料導入とアレイ洗浄に備える。 Alternatively, the device 47 further comprises a fluid connection 52 to each of the first and second ports includes a sample into the sample introduction and arrays washed after hybridization. デバイス47はバッテリーで駆動されることが好ましいが、 Although device 47 is preferably driven by a battery,
ACアダプターも本発明の範囲に含まれる。 AC adapter is also included in the scope of the present invention. さらなる好ましい実施形態では、蓋49は分析結果を表示するための表示装置56をさらに有する。 In a further preferred embodiment, the lid 49 further comprises a display device 56 for displaying the analysis results. 【0110】 デバイスを使用する方法に関しては、様々な方法がある。 [0110] For information on how to use the device, there are a variety of ways. 必要なら、目標配列を公知の技術を使用して調整する。 If necessary, to adjust the target sequence using known techniques. 例えば、当業者に明らかなように、公知の溶解緩衝(lysis buffer)、超音波処理(sonication)、電子穿孔(electropora For example, as will be apparent to those skilled in the art, known lysis buffer (lysis buffer), sonicated (sonication), electronic perforation (Electropora
tion)等を使用して、細胞を溶解(lyse)する処理を行ない、必要に応じて精製および増幅を行わせてもよい。 Use tion) or the like, the cells subjected to treatment to dissolve (lyse), may be carried out purification and amplification as required. さらに、ここに説明する反応は当業者に明らかなように様々な方法で行なうことができる。 Further, the reaction described herein can be performed in various ways as will be apparent to those skilled in the art. 反応の成分は、以下に説明する好ましい実施形態では、同時に付加してもよいし、任意の順番で連続的に行ってもよい。 Components of the reaction, in the preferred embodiment described below, may be added simultaneously, or may be carried out continuously in any order. さらに、反応は、アッセイに含まれる他の様々な試薬(reagent)を含む。 Further, the reaction may include various other reagents contained in the assay (reagent). これらには、塩、緩衝剤、中性蛋白質、例えばアルブミン、洗浄剤のような試薬を含み、これらは最適なハイブリダイゼーションと検出を促進し、および/または、非特異性または背景(background)の相互作用を減少する。 These include salts, buffers include neutral proteins, eg albumin, a reagent such as detergents, it will facilitate optimal hybridization and detection, and / or, the non-specific or background (background) to reduce the interaction. また、アッセイの効率を向上するプロテアーゼ抑制剤、ヌクレアーゼ抑制剤、抗菌剤等のような試薬を、試料調製法や目標の純度に依存して使用してもよい。 Moreover, protease inhibitors to improve the efficiency of the assay, nuclease inhibitors, reagents such as antimicrobial agents, may be used depending on the sample preparation methods and goals purity. 【0111】 さらに、たいていの実施形態では、二本鎖目標核酸を変性して単鎖にし、プライマーと本発明の他のプローブのハイブリダイゼーションを許容する。 [0111] Further, in most embodiments, by denaturing double-stranded target nucleic acid to single stranded, to allow hybridization of the other probe of the primer and the present invention. 好ましい実施形態は、一般に反応温度を約95℃に上昇させることで、加熱工程を利用するが、PH変更や他の技術を使用してもよい。 Preferred embodiments, generally the reaction temperature by raising to approximately 95 ° C., utilizes a heating step may be used PH changes and other techniques. 【0112】 ここで概説するように、本発明は、目標配列のある部分すなわちドメインにハイブリダイゼーションする多数の捕獲プローブを提供する。 [0112] As outlined herein, the present invention provides a number of capture probes that hybridize to part or domain of the target sequence. 本発明のプローブは、目標配列(試料の目標配列、または、例えば当業者に公知のサンドイッチアッセイで使用する他のプローブ配列)に相補的であるように設計される。 The probe of the present invention, the target sequence (the target sequence of the sample, or, for example, other probe sequences for use in the known sandwich assay to those skilled in the art) are designed to be complementary to. これにより、目標配列および本発明のプローブのハイブリダイゼーションが生じる。 Thus, hybridization of the probe target sequences and the invention is produced. 以下に概説するように、この相補性は完全である必要はない。 As outlined below, this complementarity need not be perfect. 目標配列と本発明の単鎖核酸との間のハイブリダイゼーションと干渉する多数の塩基対の不一致(mism Numerous base pair mismatch interfere with hybridization between the single stranded nucleic acid target sequence and the present invention (MISM
atch)があってもよい。 atch) there may be. しかしながら、突然変異の数が多くてハイブリダイゼーション条件が厳格(stringent)でなくてもハイブリダイゼーションが生じない場合、配列は相補目標配列ではない。 However, if the hybridization conditions are many number of mutations hybridization without strict (stringent) does not occur, the sequence is not a complementary target sequence. したがって、「実質的に相補的」は、プローブが通常反応条件でハイブリダイゼーションするのに十分に目標配列に対して相補的であることを意味する。 Thus, "substantially complementary" means that the probes are usually complementary to sufficiently target sequences for hybridization reaction conditions. 【0113】 本発明では、高、中、低の厳格条件(stringency condition)を含む様々なハイブリダイゼーション条件を使用してもよい。 [0113] In the present invention, high, medium, may be used various hybridization conditions comprising a low stringent conditions (stringency condition). 例えば、Maniatisら,分子クローニング:実験室マニュアル,第2版,1989、および分子生物学におけるショートプロトコル,ed. For example, Maniatis et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, 1989, and Short Protocols in Molecular Biology, ed. Ausubelら参照。 See Ausubel et al. これらは、参照することでここに組み入れる。 These are incorporated herein by reference. 厳格条件は配列に依存し、環境が異なると異なる。 Stringent conditions are sequence-dependent and are different and different environment. 核酸のハイブリダイゼーションに対する広範囲のガイドは、Tijssen,核酸プローブを用いた生物化学および分子生物学における技術,「ハイブリダイゼーションの原理と核酸アッセイの戦略の概観」(1993)にみられる。 Extensive guide to the hybridization of nucleic acids is, Tijssen, techniques in biochemistry and molecular biology using nucleic acid probes, seen in "Overview of Strategy of the principles of hybridization and nucleic acid assays" (1993). 一般に、厳格条件は、所定のイオン強度およびpHで、特定の配列に対して融点(Tm)より約5−10℃低く選択される。 Generally, stringent conditions are at a defined ionic strength and pH, are selected melting point (Tm) above about 5-10 ° C. lower than the specific sequence. Tmは、(所定のイオン強度、pHおよび核酸濃度で)目標に相補的な50%のプローブが平衡して目標配列にハイブリダイゼーションする温度である(Tmでは目標配列が過剰に存在するので、50%のプローブが平衡になる) Because Tm is (under defined ionic strength, pH and nucleic acid concentration) goal is complementary 50% of the probes is a temperature at which hybridization to the target sequence at equilibrium (Tm in target sequences are present in excess, 50 % probe is in equilibrium)
. 厳格条件は、塩濃度が約1.0Mナトリウムイオンより小さいことであり、典型的にはpH7.0から8.3で約0.01から1.0Mナトリウムイオン濃度(または他の塩)である。 Stringent condition is that the salt concentration is less than about 1.0M sodium ion, typically with 1.0M sodium ion concentration from about 0.01 to 8.3 pH 7.0 (or other salts) . 温度は、短いプローブ(例えば10から50ヌクレオチド)に対しては少なくとも約30℃であり、長いプローブ(例えば50以上のヌクレオチド)に対しては少なくとも約60℃である。 Temperature is at least about 30 ° C. for short probes (e.g. 10 to 50 nucleotides), is at least about 60 ° C. for long probes (e.g., 50 or more nucleotides). 厳格条件は、ホルムアミドのような螺旋不安定化剤の添加により達成してもよい。 Stringent conditions may also be achieved with the addition of helix destabilizing agents such as formamide. ハイブリダイゼーション条件は、非イオン主鎖(backbone)すなわちPNAが使用されるときは変化させてもよい。 Hybridization conditions may be alters when nonionic backbone (backbone) i.e. PNA is used. さらに、架橋剤を目標結合後に付加して、二本鎖のハイブリダイゼーション錯体を架橋すなわち電子対を共有して付着させてもよい。 Furthermore, by adding a crosslinking agent after target binding, it may be attached covalently crosslinked i.e. electron pair hybridization complex of double-stranded. 【0114】 このように、アッセイは一般に、目標が存在する場合のみにハイブリダイゼーション錯体の形成を許容する厳格条件で進行する。 [0114] Thus, the assay generally proceeds under stringent conditions allowing the formation of only the hybridization complex when the target is present. 厳格条件は、熱力学的変数である工程パラメータを変更することで制御することができる。 Stringent conditions can be controlled by changing the process parameters is thermodynamically variables. 熱力学的変数は、 Thermodynamic variables,
温度、ホルムアミド濃度、塩濃度、攪乱塩濃度、pH、有機溶剤濃度等を含むがこれらに限定されるものではない。 Temperature, formamide concentration, salt concentration, disrupting salt concentration, pH, does not include an organic solvent concentration, etc. is not limited thereto. 【0115】 これらのパラメータは、米国特許第5681697号に概説されているように、特異的結合を制御するのに使用してもよい。 [0115] These parameters, as outlined in U.S. Patent No. 5,681,697, may be used to control the specific binding. これにより、特異的結合を減少するために、より高い厳格条件で、工程を実行することが好ましい。 Thus, in order to reduce the specific binding, higher stringent conditions, it is preferable to perform the process. 【0116】 ここで記載するように、本発明で利用することができる多くの可能な検出技術がある。 [0116] As described herein, there are a number of possible detection technique that can be utilized in the present invention. 好ましい実施形態では、ここで概説するように、光標識技術を使用する。 In a preferred embodiment, as will now be outlined, the use of optical labeling techniques. 好ましい実施形態では、光学染料(例えば蛍光色素)のような標識を、目標検出物と捕獲結合リガンドからなるアッセイ錯体に加える。 In a preferred embodiment, addition of label, such as optical dyes (e.g., fluorescent dye), the assay complexes comprising a target detection object and the capture binding ligand. ある実施形態では、例えば核酸の場合、PCRのような増幅反応中に混合(incorporation)することによって、標識を目標に加えることができる。 In certain embodiments, for example in the case of nucleic acid, by mixing (incorporation) in such during the amplification reaction as PCR, may be added to label the target. 例えば、蛍光色素またはビオチンのような他の標識をPCRプライマーまたは酵素混合のためのdNTPに加えることができる。 For example, it is possible to add other labels such as fluorescent dyes or biotin dNTP for PCR primers or enzyme mixture. 代案として、前述したように、インターカレータ(intercalator Alternatively, as described above, intercalators (intercalators
)を使用することができる。 ) Can be used. 【0117】 代案として、好ましい実施形態では、米国出願第09/458553;09/ [0117] Alternatively, in a preferred embodiment, U.S. Application No. 09/458553; 09 /
458501;09/572187;09/495992;09/344217 458,501; 09/572187; 09/495992; 09/344217
;WO00/31148;09/439889;09/438209;09/3 ; WO00 / 31148; 09/439889; 09/438209; 09/3
44620;09/478727;PCTUS00/17422;WO98/2 44620; 09/478727; PCTUS00 / 17422; WO98 / 2
0162;WO98/12430;WO98/57158;WO99/5731 0162; WO98 / 12430; WO98 / 57158; WO99 / ​​5731
7;WO99/67425;PCT00/19889;WO99/57319に記載されたような電子検出法を使用することができる。 7; WO99 / ​​67425; PCT00 / 19889; WO99 / ​​57319 may be used electron detection method as described in. これらは全て参照することでここに組み入れる。 Which are incorporated herein by reference in its entirety. これらの実施形態は基板上でマイクロ電極のアレイを使用する。 These embodiments using an array of microelectrodes on a substrate. 【0118】 以下の実施例は、本発明の特定の実施形態およびその使用を示す。 [0118] The following examples illustrate specific embodiments and use of the present invention. これらは説明目的で記載され、本発明を限定するものではない。 These are described for illustrative purposes and are not intended to limit the present invention. ここで引用する文献は参照することでここに組み入れる。 Cited herein are incorporated herein by reference. 【0119】 実施例1 ハイブリダイゼーション室のアセンブリ本発明によりハイブリダイゼーション室を組み立てる方法は図13に示されている。 [0119] The method of assembling a hybridization chamber by assembly present invention of Example 1 Hybridization chamber is shown in Figure 13. 【0120】 ダイカッターを使用して、502FLウルトラ−クリーン積層接着フィルム( [0120] using a die cutter, 502FL Ultra - clean laminated adhesive film (
3M)の層に4つの楕円孔を形成した。 To form four oval holes in a layer of 3M). フレームおよび標識層として使用するエーベリーレーザラベル5663に同様のパターンを穿孔した。 It drilled a similar pattern to the er Berry laser labels 5663 to be used as a frame and a label layer. その間、塩化ポリビニリデンフィルムのシートをステンレス鋼フレーム上に引き伸ばし、100℃ Meanwhile, stretching the sheet of polyvinylidene chloride film on a stainless steel frame, 100 ° C.
で30分、アニールした。 In 30 minutes, and annealed. エーベリーラベルを真空積層プレス内に真空積層することで、当該エーベリーラベルを塩化ポリビニリデンフィルムの片面に付着した。 The Agent Berry label by vacuum lamination in a vacuum lamination in a press, adhering the Agent berries label on one surface of a polyvinylidene chloride film. 15psiの真空を30分間作用させ、該真空を除去した後、15psiの機械的圧力を1分間維持した。 A vacuum of 15psi to act for 30 minutes, after removing the vacuum, and maintaining the mechanical pressure of 15psi 1 minute. ラベルと同じ方法で、塩化ポリビニリデンフィルムの他方の面に接着剤を塗布した。 In the same way as the label, an adhesive is applied to the other surface of the polyvinylidene chloride film. 【0121】 次に、接着剤塗布フィルムを予め調製したガラススライドに付着した。 [0121] Next, adhered to glass slides previously prepared adhesive coating film. 核酸プローブとゲルパッドのアレイを標準の方法でガラススライドに設置した。 An array of nucleic acid probes and gel pad was placed in a glass slide in a standard way. ダイヤモンドドリルを使用してスライドにポートを穿孔した。 It was drilling a port on the slide using a diamond drill. 真空積層プレスを使用して塩化ポリビニリデンフィルムをスライドに付着した。 Adhering a polyvinylidene chloride film slides using a vacuum laminating press. 15psiの真空を1分間維持してから、15psiの機械的圧力を維持した。 The vacuum 15psi after maintained for 1 minute, maintaining the mechanical pressure of 15psi. 【0122】 各ハイブリダイゼーション室を10mLピペットを使用してポリエチレングリコール500で満たした。 [0122] was filled with polyethylene glycol 500 by using 10mL pipette each hybridization chamber. 3M7350ポリエステルテープの層をスライドに付着させてポートをシールした。 3M7350 depositing a layer of polyester tape to a slide sealing the port. 【0123】 実施例2 上方装入ハイブリダイゼーション室のアセンブリダイカッターを使用して、502FLウルトラ−クリーン積酢接着フィルム( [0123] Using an assembly die cutter in Example 2 above charged hybridization chamber, 502FL Ultra - Clean Sekisu adhesive film (
3M)に4つの楕円孔を形成した。 To form four oval holes 3M). フレームおよび標識層として使用するエーベリーレーザラベル5663に同様のパターンを穿孔した。 It drilled a similar pattern to the er Berry laser labels 5663 to be used as a frame and a label layer. その間、塩化ポリビニリデンフィルムのシートをステンレス鋼フレーム上に引き伸ばし、100℃で3 Meanwhile, stretching the sheet of polyvinylidene chloride film on a stainless steel frame, 3 at 100 ° C.
0分、アニールした。 0 minutes, and annealed. エーベリーラベルを真空積層プレス内に真空積層することで、当該エーベリーラベルを塩化ポリビニリデンフィルムの片面に付着した。 The Agent Berry label by vacuum lamination in a vacuum lamination in a press, adhering the Agent berries label on one surface of a polyvinylidene chloride film. 1
5psiの真空を30分間作用させ、該真空を除去した後、15psiの機械的圧力を1分間維持した。 A vacuum of 5psi to act for 30 minutes, after removing the vacuum, and maintaining the mechanical pressure of 15 psi 1 minute. ラベルと同じ方法で、塩化ポリビニリデンフィルムの他方の面に接着剤を塗布した。 In the same way as the label, an adhesive is applied to the other surface of the polyvinylidene chloride film. 【0124】 次に、接着剤塗布フィルムを予め調製したガラススライドに付着した。 [0124] Next, adhered to glass slides previously prepared adhesive coating film. 核酸プローブとゲルパッドのアレイを標準の方法でガラススライドに設置した。 An array of nucleic acid probes and gel pad was placed in a glass slide in a standard way. 真空積層プレスを使用して塩化ポリビニリデンフィルムをスライドに付着した。 Adhering a polyvinylidene chloride film slides using a vacuum laminating press. 15p 15p
siの真空を1分間維持してから、15psiの機械的圧力を維持した。 The vacuum si after maintained for 1 minute, maintaining the mechanical pressure of 15 psi. 【0125】 各ハイブリダイゼーション室を10mLピペットを使用してポリエチレングリコール500で満たした。 [0125] was filled with polyethylene glycol 500 by using 10mL pipette each hybridization chamber. 3M7350ポリエステルテープの層をスライドに付着させてポートをシールした。 3M7350 depositing a layer of polyester tape to a slide sealing the port. 【図面の簡単な説明】 【図1A−1D】 本発明の好ましい実施形態の図であり、反応室の準備を示す。 It is a diagram of a preferred embodiment BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS FIG. 1A-1D of the present invention, illustrating the preparation of the reaction chamber. 【図1A】 加熱要素と接触するように水溶性化合物で予め満たされたハイブリダイゼーション室を示す装置の断面図である。 1A is a cross-sectional view of the device showing the hybridization chamber filled previously with a water-soluble compound into contact with the heating element. 【図1B】 水溶性化合物と生物学的試料液体との混合を示す装置の断面図である。 1B is a cross-sectional view of the device showing the mixing of the water-soluble compound and the biological sample liquids. 【図1C】 試料液体/水溶性化合物の混合物で満たされた室を示す装置の断面図であり、第1と第2ポートはシールで蓋されている。 Figure 1C is a cross-sectional view of the device showing a chamber filled with a mixture of sample liquid / water-soluble compound, the first and second ports are capped with the seal. 【図1D】 オリゴヌクレオチドプローブのアレイを含む個々の領域を規定する接着パターンを示す装置の平面図である。 Figure 1D is a plan view of the device showing the bonding pattern defining the individual areas containing the array of oligonucleotide probes. 【図2】 本発明の好ましい実施形態のゲルパッドのアレイを示す室の分解断面図である。 2 is an exploded sectional view of the chamber showing an array of gel pads of the preferred embodiment of the present invention. 【図3】 本発明の好ましい実施形態の基板へのゲルパッドの位置決めを示す生体分子プローブのアレイを示す分解斜視図である。 3 is an exploded perspective view showing an array of biomolecules probe showing the positioning of the gel pad to the substrate of the preferred embodiment of the present invention. 【図4】 本発明の好ましい実施形態の円錐形状のポートを示すポートの分解断面図である。 4 is an exploded sectional view of the port showing the ports of the conical shape of the preferred embodiment of the present invention. 【図5】 本発明の好ましい実施形態の標識層、可撓層および接着層の斜視図である。 [5] label layer of the preferred embodiment of the present invention, is a perspective view of the flexible layer and the adhesive layer. 【図6】 好ましい実施形態による積層室の断面図である。 6 is a cross-sectional view of a laminated chamber according to a preferred embodiment. 【図7A−7E】 可撓層を貫通して延びる入口および出口ポートを有する本発明の他の好ましい実施形態の層の平面図である。 FIG. 7A-7E is a plan view of a layer of another preferred embodiment of the present invention having an inlet and an outlet port extending through the flexible layer. 【図7A】 第1接着層の平面図である。 7A is a plan view of the first adhesive layer. 【図7B】 可撓層の平面図である。 7B is a plan view of the flexible layer. 【図7C】 第2接着層の平面図である。 7C is a plan view of the second adhesive layer. 【図7D】 標識層の平面図である。 7D is a plan view of the label layer. 【図7E】 図7Aから図7Dの層を組み合わせた平面図である。 It is a plan view of a combination of layers of Figure 7D from Figure 7E] Figure 7A. 【図8A−8B】 可撓層を貫通して延びる入口および出口ポートを有する本発明の好ましい実施形態の第1接着層と標識層に切り込まれたノッチの詳細図である。 Figure 8A-8B is a preferred detailed view of a notch cut into the first adhesive layer and the label layer embodiment of the present invention having an inlet and an outlet port extending through the flexible layer. 【図9A−9C】 反応完了後にアレイを分析する過程を示す本発明の好ましい実施形態の断面図である。 FIG. 9A-9C is a cross-sectional view of a preferred embodiment of the present invention showing a process to analyze the array after completion of the reaction. 【図9A】 反応完了時の装置を示す図である。 9A is a diagram showing the apparatus during the reaction completion. 【図9B】 可撓層がアレイと接触するように室から試料流体を除去する状態を示す図である。 FIG. 9B flexible layer is a diagram showing a state of removing the sample fluid from the chamber into contact with the array. 【図9C】 レーザスキャナを使用してアレイを分析する状態を示す図である。 FIG. 9C using a laser scanner is a diagram showing a state in which to analyze the array. 【図10A−10C】 本発明の携帯型の実施形態を示す図である。 It is a diagram illustrating a portable embodiment of Figure 10A-10C present invention. 【図10A】 携帯型の走査システムの側面図である。 10A is a side view of a portable scanning system. 【図10B】 キャリッジと接触する可撓層を示す携帯型走査装置を有する好ましい実施形態の斜視図である。 10B is a perspective view of a preferred embodiment with a portable scanning device, showing a flexible layer in contact with the carriage. 【図10C】 ディスプレイ装置を有する蓋を示す携帯型システムの図である。 Figure 10C is a diagram of a portable system showing a lid with a display device. 【図11−11E】 図10に示す直接接触光ファイバスキャナの断面図である。 It is a cross-sectional view of a direct contact optical fiber scanner shown in FIG 11-11E Figure 10. 【図12A−12C】 試料調製チップに接続された装置を示す他の実施形態の図である。 Figure 12A-12C is a diagram of another embodiment showing a device connected to the sample preparation chip. 【図12A】 試料調製チップを基板の第2面に着脱可能に配置する実施形態を示す図である。 The 12A-sample preparation chip is a diagram showing an embodiment for removably disposed on the second surface of the substrate. 【図12B】 試料調製チップを基板の第2面に固定する実施形態を示す図である。 The FIG. 12B sample preparation chip is a diagram showing an embodiment of fixing to the second surface of the substrate. 【図12C】 試料調製チップを基板に組み込む実施形態を示す図である。 The Figure 12C] Sample preparation chip is a diagram showing embodiments incorporating the substrate. 【図13】 本発明の好ましい実施形態のアセンブリとその使用を示す図である。 13 is a diagram showing a preferred embodiment of the assembly and its use of the present invention.

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Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 【請求項1】 生物学的反応を行う装置において、 a)第1面と第2面を有する基板と、 b)前記第1面に配置された生体分子のアレイと、 c)接着層により前記第1面に付着されて反応空間を生成する可撓層と、 d)前記第2面から前記第1面の反応空間まで延びるポートとからなる生物学的反応装置。 An apparatus for performing the Patent Claims 1. A biological response, a) a substrate having a first surface and a second surface, b) an array of biological molecules arranged on the first surface, c) a flexible layer which is adhered to the first surface by the adhesive layer to produce a reaction space, d) biological reactor consisting of the extending from the second surface to the reaction space of the first surface port. 【請求項2】 生物学的反応を行う装置において、 a)第1面を有する基板と、 b)前記第1面に配置された生体分子のアレイと、 c)接着層により前記第1面に貼付されて反応空間を生成し、該反応空間への第1ポートを有する可撓層とからなる生物学的反応装置。 2. A device for performing biological reactions, a) a substrate having a first surface, b) an array of the first surface disposed biomolecule, c) to the first surface by an adhesive layer affixed to form a reaction space, biological reactor comprising a flexible layer having a first port to the reaction space. 【請求項3】 前記基板はガラス、シリコン、セラミックまたはプラスチックである請求項1または2に記載の装置。 Wherein the substrate is glass, silicon, according to claim 1 or 2, ceramic or plastic. 【請求項4】 前記生体分子は核酸である請求項1から3のいずれかに記載の装置。 4. A device according to any of claims 1-3 wherein the biomolecule is a nucleic acid. 【請求項5】 前記反応空間は水溶性化合物からなる請求項1から3のいずれかに記載の装置。 Wherein said reaction space apparatus according to any one of claims 1 comprising a water-soluble compound 3. 【請求項6】 前記生体分子はゲルパッドを使用して前記基板に取りつけられている請求項1から5のいずれかに記載の装置。 6. The apparatus according to any one of the biomolecule from claim 1 is attached to the substrate using a gel pad 5. 【請求項7】 さらにスキャナを有する請求項1から6のいずれかに記載の装置。 7. The further apparatus set forth in any one of claims 1 to 6, having a scanner.
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