JP2003299481A - 成熟肥満細胞の生産方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 簡単な操作かつ短期間に成熟肥満細胞を生産
する方法を提供することである。 【解決手段】 細胞接着シグナルを現わす最小アミノ酸
配列を１分子中に少なくとも１個含有してなるポリペプ
チド（Ｂ）を有する培養基材と、サイトカイン（Ｃ）を
有する培地とを用いて未成熟肥満細胞（Ｄ）を成熟肥満
細胞（Ａ）へ分化誘導することを特徴とする成熟肥満細
胞（Ａ）の生産方法を用いる。なお、成熟肥満細胞
（Ａ）としては、骨髄液中の未成熟肥満細胞（Ｄ）から
分化させた成熟肥満細胞であることが好ましい。また、
細胞接着シグナルを現わす最小アミノ酸配列の数は、ポ
リペプチド（Ｂ）１分子当たり３〜５０個であることが
好ましい。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、成熟肥満細胞の生
産方法に関する。さらに詳しくは未成熟肥満細胞を成熟
肥満細胞に分化誘導して成熟肥満細胞を生産する方法に
関する。

【０００２】

【従来の技術】未成熟肥満細胞を分化誘導する方法とし
て、臍帯（さいたい）血単核球中の未成熟肥満細胞を、
幹細胞因子（ＳＣＦ）及びインターロイキン−６を含有
する培地中で培養した後、初代皮膚線維芽細胞を単層培
養した面の上でＳＣＦ存在下に培養する方法が知られて
いる（特許文献１）。

【０００３】

【特許文献１】特開平１１−１９９６００号公報

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】しかし、この方法によ
ると、臍帯血単球細胞を６週間培養した後に初代皮膚線
維芽細胞との共生培養へ植え替えて、さらに２ヶ月間培
養が必要であり、臍帯血の採取から成熟細胞を得るまで
に最低でも３．５ヶ月間必要であり、このような煩雑な
操作と長い培養期間が大きな問題でであった。すなわ
ち、本発明の目的は、簡単な操作かつ短期間に成熟肥満
細胞を生産する方法を提供することである。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者は、鋭意研究を
重ねてきた結果、特定のポリペプチドを有する培養基材
と、サイトカインを有する培地を用いることにより上記
の目的を達成し得ることを見いだし本発明に到達した。
すなわち、本発明の成熟肥満細胞（Ａ）の生産方法の特
徴は、細胞接着シグナルを現わす最小アミノ酸配列を１
分子中に少なくとも１個含有してなるポリペプチド
（Ｂ）を有する培養基材と、サイトカイン（Ｃ）を有す
る培地とを用いて未成熟肥満細胞（Ｄ）を成熟肥満細胞
（Ａ）へ分化誘導する工程を含む点を要旨とする。

【０００６】

【発明の実施の形態】成熟肥満細胞（Ａ）とは、哺乳動
物の骨髄若しくは臍帯血等から得られる未成熟肥満細胞
（Ｄ）を、サイトカイン等によって分化させて得られる
細胞であり、細胞内にコンドロイチン硫酸、ヘパリン及
びヒスタミン等を含む顆粒を有し、刺激に応じてその内
容物を放出するものである。培養で得られる成熟肥満細
胞は種々の表現型（刺激に対する応答や顆粒成分の構成
等）において、哺乳動物の腹腔若しくは皮膚等の組織内
に分布する成熟肥満細胞と同様に扱われる。成熟肥満細
胞（Ａ）には分布する組織環境に応じて様々な亜群が存
在することが知られるが、大別して二つのグループに分
けられる。一つは皮膚や腹腔等に分布するものと同様の
表現型を有する組織結合型肥満細胞で、もう一つは腸管
膜等に分布するものと同様の表現型を有する粘膜型肥満
細胞である。一般的にアレルギーや炎症応答で重要な機
能を果たすのは組織結合型の方であることから、成熟肥
満細胞（Ａ）としては組織結合型肥満細胞が好ましい。
また哺乳動物としては、ヒト、マウス、ラット、ブタ、
ウシ、ウマ及びヤギ等が挙げられる。これらのうち、ヒ
ト及びマウスが好ましい。未成熟肥満細胞（Ｄ）とは、
成熟肥満細胞（Ａ）に分化する能力を有する細胞であ
り、一般に哺乳動物の骨髄又は臍帯血等に存在する。未
成熟肥満細胞（Ｄ）としては、骨髄中に含まれる造血幹
細胞、及び臍帯血中に含まれる造血幹細胞等が知られて
いる。

【０００７】次に、細胞接着シグナルを現わす最小アミ
ノ酸配列を１分子中に少なくとも１個含有してなるポリ
ペプチド（Ｂ）について説明する。細胞接着性とは、特
定の最小アミノ酸配列（Ｘ）が細胞のインテグリンレセ
プターに認識され細胞が基材に接着しやすくなる性質を
意味する（大阪府立母子医療センター雑誌、第８巻 第
１号、５８〜６６頁、１９９２年）。細胞接着シグナル
を現わす最小アミノ酸配列としては、接着シグナルとし
て働くものであればいずれも使用でき、例えば、株式会
社永井出版発行「病態生理」Ｖｏｌ．９、Ｎｏ．７（１
９９０）５２７頁に記載されているもの等が挙げられ
る。これらのうち、接着する細胞の種類が多いという点
で、Arg Gly Asp配列、LeuAsp Val配列、Arg Glu Asp V
al配列（１）、Tyr Ile Gly Ser Arg配列（２）、Pro A
sp Ser Gly Arg配列（３）、Arg Tyr Val Val Leu Pro
Arg配列（４）、Leu Gly Thr Ile Pro Gly配列（５）、
Arg Asn Ile Ala Glu Ile Ile Lys Asp Ile配列
（６）、Ile Lys Val Ala Val配列（７）、Leu Arg Glu
配列、Asp Gly GluAla配列（８）及びHis Ala Val配列
が好ましく、さらに好ましくはArg Gly Asp配列、Ile L
ys Val Ala Val配列（７）及びHis Ala Val配列、特に
好ましくはIle Lys Val Ala Val配列（７）である。な
お、アミノ酸配列はアミノ酸３文字表記で現わし、
（ ）内にアミノ酸配列表に対応する配列番号を付記し
た（以下同様である。）。

【０００８】ポリペプチド（Ｂ）中には前記最小アミノ
酸配列が１分子中に少なくとも１個含有される必要があ
る。前記最小アミノ酸配列があると、細胞接着活性が高
まり、未成熟肥満細胞（Ｄ）の成熟肥満細胞（Ａ）への
分化誘導を促進することが可能となる。一方、前記最小
アミノ酸配列が含有されない場合、細胞接着性が低下す
る結果、（Ｄ）の（Ａ）への分化誘導が不十分となりや
すい。

【０００９】この最小アミノ酸配列の含有量は、細胞接
着・増殖性の観点から、１分子中３〜５０個が好まし
く、さらに好ましくは５〜４０個、特に好ましくは１０
〜３０個である。含有量がこの範囲であると、細胞接着
活性がさらに高まり、未成熟肥満細胞（Ｄ）の成熟肥満
細胞（Ａ）への分化誘導がさらに促進されやすくなる。

【００１０】ポリペプチド（Ｂ）の数平均分子量は、細
胞に対する毒性が低く、接着性能が高いという点で、
５，０００以上が好ましく、さらに好ましくは１０，０
００以上、特に好ましくは５０，０００以上である。ま
た５，０００，０００以下が好ましく、さらに好ましく
は１，０００，０００以下、特に好ましくは５００，０
００以下である。なお、数平均分子量（Ｍｎ）は、ＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥ法（Ｎａドデシルスルフェイト−ポリアク
リルアミドゲル電気泳動法）で、測定試料をゲル中で展
開し、泳動距離を標準物質と比較することによって求め
られる。

【００１１】ポリペプチド（Ｂ）は、細胞接着シグナル
を現わす最小アミノ酸配列以外に、（Ｂ）の熱安定性が
高まるアミノ酸配列、例えばシルクフィブロイン由来の
GlyAla Gly Ala Gly Ser配列（９）を少なくとも２個有
することが好ましく、このアミノ酸配列を３個以上有す
ることがさらに好ましく、５〜３０個有することが特に
好ましい。

【００１２】ポリペプチド（Ｂ）としては、（Gly Ala
Gly Ala Gly Ser）₉配列（１０）とArg Gly Asp配列と
を有するポリペプチド、（Gly Ala Gly Ala Gly Ser）₉
配列（１０）とTyr Ile Gly Ser Arg配列（２）とを有
するポリペプチド、（Gly AlaPro (Gly Pro Pro)₄）₂配
列（１１）とArg Gly Asp配列とを有するポリペプチ
ド、（Gly Ala Pro (Gly Pro Pro)₄）₂配列（１１）とT
yr Ile Gly Ser Arg配列（２）とを有するポリペプチ
ド、及び（Gly Ala Gly Ala Gly Ser）₉配列（１０）と
Ile Lys Val Ala Val配列（７）とを有するポリペプチ
ド（特表平３−５０２９３５号公報）等が挙げられる。

【００１３】ポリペプチド（Ｂ）として市場から入手で
きるものとしては、例えば、三洋化成工業（株）製プロ
ネクチンＦ（遺伝子組替大腸菌により製造され、１分子
中にArg Gly Asp配列と（Gly Ala Gly Ala Gly Ser）₉
配列（１０）とを各々約１３個有する数平均分子量約１
１万のポリペプチド）、同プロネクチンＦプラス（プロ
ネクチンＦをジメルアミノエチルクロライドと反応させ
て水溶性にしたもの）、同プロネクチンＬ（遺伝子組替
大腸菌により製造され、１分子中にIle Lys Val Ala Va
l配列（７）と（Gly Ala Gly Ala Gly Ser）₉配列（１
０）とを各々約７個有する数平均分子量約９万のポリペ
プチド）等が挙げられる。

【００１４】また、宝酒造（株）製ＲｅｔｒｏＮｅｃｔ
ｉｎ（リコンビナントヒトフィブロネクチンＣＨ−２９
６）｛ヒトフィブロネクチン細胞接着シグナルであるＣ
Ｓ１シグナルと細胞接着ドメインＴｙｐｅＩＩＩ及びヘ
パリン結合ドメインＩＩを１つずつ有する数平均分子量
約6万のポリペプチド｝、同ＲＧＤＳ−Ｐｒｏｔｅｉｎ
Ａ｛Arg Gly Asp配列をＰｒｏｔｅｉｎ Ａ（ＩｇＧ結
合ドメイン）に挿入した数平均分子量約３万のポリペプ
チド｝もポリペプチド（Ｂ）として使用可能である。

【００１５】ポリペプチド（Ｂ）の製造方法は特に制限
されず、ペプチドを合成する従来既知の方法と同様にし
て製造することができ、例えば、有機合成法（固相合成
法、液相合成法等）及び生化学的合成法［遺伝子組換微
生物（酵母、細菌、大腸菌等）］等によって合成するこ
とができる。有機合成法に関しては、例えば、日本生化
学学会編「続生化学実験講座２、タンパク質の化学
（下）」第６４１〜６９４頁（昭和６２年５月２０日；
株式会社東京化学同人発行）に記載されている方法等が
用いられる。生化学的合成法に関しては、例えば、組換
えタンパク質生産法「塚越規弘 編著、株式会社学会出
版センター、２００１年版」や特表平３−５０２９３５
号公報に記載されている方法等が用いられる。高分子量
のポリペプチド（Ｂ）を容易に合成できる点で、遺伝子
組換微生物による生化学的合成法が好ましく、特に好ま
しくは遺伝子組換大腸菌を用いて合成する方法である。

【００１６】ポリペプチド（Ｂ）の含有量としては、培
養基材の培養表面積１００ｃｍ²あたり、０．０１μｇ
以上が好ましく、さらに好ましくは０．１μｇ以上、特
に好ましくは１μｇ以上、最も好ましくは１０μｇ以上
である。また１０００ｍｇ以下が好ましく、さらに好ま
しくは１００ｍｇ以下、特に好ましくは１０ｍｇ以下、
最も好ましくは１ｍｇ以下である。培養表面積あたりの
細胞接着性ペプチドの含有量の測定方法は特に限定され
ないが、例えば、免疫学的測定法が利用できる。例え
ば、培養基材に、ポリペプチド（Ｂ）と結合する抗体に
酵素を標識したもの（以下、酵素標識抗体）を反応さ
せ、この反応した酵素標識抗体の酵素量を測定すること
により、培養表面積あたりのポリペプチドの含有量を測
定できる。また、酵素の代わりにアイソトープ、色素、
蛍光物質又は発光物質等を用いて抗体に標識し、酵素量
の代わりに放射線量、色素量、蛍光強度又は発光強度等
を測定することにより、培養表面積あたりのポリペプチ
ドの含有量を測定することもできる。なお、培養表面積
は、培養容器の表面のうち、培養される細胞が接着し得
る表面の表面積を意味する。ここで、細胞が入り込まな
いような微小な凹凸（例えば、１μｍ以下）は平坦な表
面として取扱うが、培養面積を高める目的でリブ（畝）
等が設けてあるものについてはそのリブの表面積を培養
表面積に含める。また培養容器が市販品の場合、培養表
面積は容器メーカーがカタログ等に記載している培養容
器の培養表面積をそのまま適用できる。

【００１７】本発明で使用される培養基材は、培養容器
にポリペプチド（Ｂ）を有していればよく、培養容器内
部に練り込まれていてもよく、表面に付着していもよ
い。培養容器としては特に制限はなく細胞培養に一般に
用いられるものが使用でき、例えば、プレート、シャー
レ、Ｔ−フラスコ、ローラーボトル、マイクロキャリア
ビーズ及びホローファイバー等が用いられる。これらの
培養容器の材質としては、細胞培養に使用できるもので
あればいずれも使用でき、例えば、プラスチック、ガラ
ス等が挙げられる。

【００１８】本発明で使用される培養基材を得る方法と
しては、例えば、培養容器にポリペプチド（Ｂ）をコー
ティング処理する方法、及びポリペプチド（Ｂ）を培養
容器の原料に練り込んだ後、培養容器に成型する方法等
が挙げられる。これらの方法のうち、ポリペプチド
（Ｂ）の使用量が少なくて済むという観点から、培養容
器にポリペプチド（Ｂ）をコーティング処理する方法が
好ましい。

【００１９】培養容器へのポリペプチド（Ｂ）のコーテ
ィング方法としては、ポリペプチド（Ｂ）を溶媒に溶か
した溶液を予め作製し、培養容器に加え、所定のコーテ
ィング時間静置した後に余分の溶液を捨て乾燥させる
か、余分の溶液を捨てずに乾燥させる方法や、ポリペプ
チド（Ｂ）の溶液をローラーボトルに加え、所定のコー
ティング時間ローラーボトルを回転した後に余分の溶液
を捨て乾燥させるか、余分の溶液を捨てずに乾燥させる
方法、ポリペプチド（Ｂ）の溶液中にマイクロキャリア
ビーズを入れて所定のコーティング時間必要に応じて攪
拌した後に溶液から取り出し必要に応じて乾燥させる方
法、及びポリペプチド（Ｂ）の溶液をホローファイバー
中に所定のコーティング時間循環させ必要に応じて乾燥
させる方法等が挙げられる。

【００２０】ポリペプチド（Ｂ）の溶液を作製するため
に用いられる溶媒としては特に制限はないが、無機塩、
有機酸塩、アミノ酸、ビタミン、アルコール、脂質・
糖、酸及び／又は塩基を０．１重量％以上５０重量％以
下（好ましくは１重量％以上３０重量％以下）含有する
水溶液及び水等が使用できる。無機塩としては、ハロゲ
ン化金属塩、硫酸金属塩、リン酸金属塩、硝酸金属塩、
炭酸金属塩及び過ハロゲン酸金属等が使用でき、例え
ば、塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、リン酸ナトリウ
ム、塩化カルシウム、硝酸鉄、塩化カリウム、硫酸マグ
ネシウム、炭酸ナトリウム、リン酸水素ナトリウム、リ
ン酸カリウム、リン酸水素カリウム、硫酸銅、硫酸鉄、
塩化リチウム、臭化ナトリウム、臭化リチウム過塩素酸
ナトリウム及び過塩素酸リチウム等が挙げられる。

【００２１】有機酸塩としては、例えば、蟻酸ナトリウ
ム、酢酸ナトリウム、酢酸リチウム及び酒石酸ナトリウ
ム等が挙げられる。アミノ酸としては、例えば、アルギ
ニン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、メチオニ
ン、フェニルアラニン、スレオニン、トリプトファン、
チロシン、バリン、アラニン、アスパラギン、アスパラ
ギン酸、グルタミン酸、プロリン、セリン及びグリシン
等が挙げられる。ビタミンとしては、例えば、コリン、
イノシトール、ニコチンアミド、グルタミン、ビタミン
Ａ及びビタミンＢ１２等が挙げられる。アルコールとし
ては、炭素数１〜４の脂肪族アルコール等が使用でき、
例えば、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコ
ール及びブタノール等が挙げられる。

【００２２】脂質・糖としては、例えば、脂質、単糖、
２糖、オリゴ糖、アミノ糖及び酸性糖等が挙げられる。
酸としては、無機酸及び炭素数１〜６の有機酸等が使用
でき、例えば、塩酸、燐酸、酢酸、蟻酸、フェノール及
び硫酸等が挙げられる。塩基としては、無機塩基及び炭
素数２〜６の有機塩基等が使用でき、例えば、水酸化ナ
トリウム、水酸化カリウム、アンモニア及びトリエチル
アミン等が挙げられる。水としては、蒸留水、イオン交
換水、水道水及びイオン交換蒸留水等が挙げられる。こ
れらの溶媒の中で、無機塩、酸及び／又は塩基を含有す
る水溶液及び水が好ましく、さらに好ましくは無機塩を
含有する水溶液及び水、特に好ましくは無機塩を含有す
る水溶液である。

【００２３】ポリペプチド（Ｂ）の溶液の濃度は、溶媒
１ｍｌ当り、０．０１μｇ以上が好ましく、さらに好ま
しくは０．１μｇ以上、特に好ましくは１μｇ以上であ
る。また同様に１００ｍｇ以下が好ましく、さらに好ま
しくは１０ｍｇ以下、特に好ましくは１ｍｇ以下であ
る。コーティング時間としては、用いる培養基材によっ
ても異なるが、３０秒以上が好ましく、さらに好ましく
は１分以上、特に好ましくは３分以上である。また４８
時間以下が好ましく、さらに好ましくは２４時間以下、
特に好ましくは１２時間以下である。

【００２４】必要に応じて行われる乾燥の条件について
も特に制限はなく、通常の方法が適用でき、例えば、必
要に応じて順風乾燥機や減圧乾燥機などを用いて、０〜
２００℃、０．００１Ｐa〜大気圧の圧力下で、１〜１
００時間乾燥することで行える。また、必要に応じて行
われる乾燥の前又は後で、無機塩を含有する水溶液又は
水で通常の方法で洗浄することもできる。また、コーテ
ィングの後で、必要に応じて滅菌処理を施してもよい。
滅菌方法は特に制限は無く、例えば、放射線滅菌、エチ
レンオキサイドガス滅菌、オートクレーブ滅菌及び乾熱
滅菌等が挙げられる。

【００２５】ポリペプチド（Ｂ）を培養容器の原料に練
り込んだ後、成型する方法としては、原料樹脂等とポリ
ペプチド（Ｂ）とを混練・成形する方法等が挙げられ、
例えば、ポリペプチド（Ｂ）と熱可塑性樹脂（ポリエチ
レン、ポリスチレン及びポリアミド等）とを、この融点
温度以上で、押出成形や射出成形等する方法や、（Ｂ）
と熱硬化性樹脂（尿素樹脂、メラミン樹脂、フェノール
樹脂、エポキシ樹脂、不飽和ポリエステル、アルキド樹
脂、ウレタン樹脂、エボナイト及びシリコーン樹脂等）
とを混練・成形した後、加熱硬化する方法等が適用でき
る。

【００２６】ポリペプチド（Ｂ）を培養容器に練り込ま
せる場合、ポリペプチド（Ｂ）の含有量は、培養基材１
ｇ当たり、０．１μｇ以上が好ましく、さらに好ましく
は１μｇ以上、特に好ましくは１０μｇ以上である。ま
た同様に１０００ｍｇ以下が好ましく、さらに好ましく
は１００ｍｇ以下、特に好ましくは１０ｍｇ以下であ
る。

【００２７】サイトカイン（Ｃ）としては、インターロ
イキン（ＩＬ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、コロニー刺激
因子（ＣＳＦ）、インターフェロン（ＩＦＮ）、腫瘍壊
死因子（ＴＮＦ）、トランスフォーミング成長因子（Ｔ
ＧＦ）及びケモカイン等が挙げられる。ＩＬとしては、
ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−
４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−
９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１
３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７
及びＩＬ−１８等が挙げられる。

【００２８】ＳＣＦとしては、ＳＣＦが挙げられる。Ｃ
ＳＦとしては、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ及びＭ−ＣＳ
Ｆ等が挙げられる。ＩＦＮとしては、ＩＦＮ―α、ＩＦ
Ｎ―β及びＩＦＮ―γ等が挙げられる。ＴＮＦとして
は、ＴＮＦ−α及びＴＮＦ−β等が挙げられる。ＴＧＦ
としては、ＴＧＦ−α及びＴＧＦ−β等が挙げられる。
ケモカインとしては、エオタキシン、ＭＩＰ−１α、Ｍ
ＩＰ-１β、ＭＣＰ−１及びＲＡＮＴＥＳ等が挙げられ
る。

【００２９】サイトカイン（Ｃ）は、２種以上を組み合
わせて用いることもでき、これらのうち、ＩＬ及びＳＣ
Ｆが好ましく、さらに好ましくはＩＬの一種以上とＳＣ
Ｆとの組合せであり、特に好ましくはＩＬ−３、ＩＬ−
４、ＩＬ−６、ＩＬ−９及びＩＬ−１０からなる群より
選ばれる一種以上とＳＣＦとの組合せであり、最も好ま
しくはＩＬ−４とＳＣＦとの組合せである。

【００３０】本発明の成熟肥満細胞の生産方法に用いる
培地としては、ＲＰＭＩ培地、ＭＥＭ培地、ＢＭＥ培
地、ＤＭＥ培地、αＭＥＭ培地、ＩＭＥＭ培地、ＥＳ培
地、ＤＭ−１６０培地、Ｆｉｓｈｅｒ培地、Ｆ１２培地
及びＷＥ培地等（朝倉書店発行「日本組織培養学会編
組織培養の技術第三版」５８１頁に記載の基礎培地）、
これらの培地に血清成分（仔ウシ血清、ウシ胎児血清
等）等を添加したもの、並びに市販の無血清培地［味の
素（株）製無血清培地ＡＳＦ１０３，同ＡＳＦ１０４，
同ＡＳＦ３０１、ギブコ社製無血清培地ＣＨＯ−ＳＦ
Ｍ，同ＶＰ−ＳＦＭ等］等が用いられる。

【００３１】これらのうち、基礎培地に血清成分を加え
たものが好ましく、さらに好ましくはＲＰＭＩ−１６４
０培地に仔ウシ血清を加えたものである。血清成分の使
用量（重量％）は、基礎培地１００重量部に対して、１
以上が好ましく、さらに好ましくは２以上、特に好まし
くは５以上である。また５０以下が好ましく、さらに好
ましくは３０以下、特に好ましくは２０以下である。培
地の使用量（ｍＬ）は、用いる培養基材の種類や成熟肥
満細胞（Ａ）の種類等によって異なるが、培養基材表面
積１ｃｍ²当り、０．０１以上が好ましく、さらに好ま
しくは０．０５以上、特に好ましくは０．１以上であ
る。また５０以下が好ましく、さらに好ましくは５以
下、特に好ましくは０．５以下である。

【００３２】サイトカイン（Ｃ）の使用量（μｇ）は、
培地１０００ｍＬに対して、０．１以上が好ましく、さ
らに好ましくは１以上、特に好ましくは１０以上であ
る。また1０００以下が好ましく、さらに好ましくは１
００以下、特に好ましくは９０以下である。サイトカイ
ン（Ｃ）の含有量がこの範囲であると、細胞の分化誘導
が促進される。サイトカイン（Ｃ）を培地に添加する方
法としては、培地にサイトカイン（Ｃ）を直接加える方
法や、予めサイトカイン（Ｃ）を前記の溶媒に溶解又は
分散したものを培地に加える方法等が挙げられる。

【００３３】さらに必要に応じて、細胞増殖因子（Ｅ）
を培地中に含有させることにより、成熟肥満細胞（Ａ）
の増殖速度をさらに高めたり、細胞活性を高めたりする
ことができる。細胞増殖因子（Ｅ）は細胞を増殖させる
活性のある物質であり、例えば、ＦＧＦ、ＶＥＧＦ、Ｈ
ＧＦ、ＥＧＦ、ＰＤＧＦ、ＩＧＦ及びＢＭＰ等が挙げら
れ、この他に、ＫＧＦ、ＣＳＦ−１、ＳＣＦ、ＰＩＧ
Ｆ、ＮＧＦ、ＢＤＮＦ、ＮＴ−３、ＮＴ−４、ＴＧＦ、
ＮＤＦ及びインシュリン等｛例えば財団法人名古屋大学
出版会発行「上田実編ティッシュエンジニアリング（１
９９９年）」４３〜５１頁及び同文献に付記されている
参考文献に記載されているもの等｝も用いられる。細胞
増殖因子（Ｅ）を培地に添加する方法としては、培地に
（Ｅ）を直接加える方法や、予め（Ｅ）を前記の溶媒に
溶解又は分散したものを培地に加える方法等が挙げられ
る。

【００３４】さらに培地中には必要に応じて、他の成分
（Ｆ）として、アミノ酸類（グルタミン、アラニルグル
タミン、アルギニン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイ
シン、メチオニン、フェニルアラニン、スレオニン、ト
リプトファン、チロシン、バリン、アラニン、アスパラ
ギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、プロリン、セリ
ン及びグリシン等）、ビタミン類（コリン、塩化コリ
ン、パントテン酸カルシウム、葉酸、ピリドキサール、
リボフラビン、チアミン、イノシトール、ニコチンアミ
ド、グルタミン、ビタミンＡ及びビタミンＢ１２等）、
成長促進剤（アルブミン、ウシ脳下垂体抽出物、ニワト
リ胚抽出液、インスリン、トランスフェリン、亜セレン
酸ナトリウム、メルカプトエタノール、ピルビン酸ナト
リウム、ヒドロコルチゾン及びエタノールアミン等）、
抗生物質（ペニシリン、ストレプトマイシン、ネオマイ
シン及びアクチノマイシン等）、安定化剤（例えば、酸
化防止剤等）及びｐＨ調整剤（例えば、炭酸水素ナトリ
ウム、ＨＥＰＥＳ、炭酸ナトリウム及びリン酸ナトリウ
ム等）等を含有させることができる。

【００３５】未成熟肥満細胞を培養し、成熟肥満細胞に
分化誘導する工程における未成熟肥満細胞（Ｄ）の量と
しては、用いる培養基材の種類等によって異なるが、培
地１ｍＬ当り、５万〜５０００万個が好ましく、さらに
好ましくは５０万〜１０００万個、特に好ましくは５０
０万〜５００万個である。

【００３６】培養条件（分化誘導条件）としては特に制
限はなく、ＣＯ₂濃度１〜２０体積％、５〜４５℃で１
時間〜１００日間、必要に応じて１〜７日毎に培地交換
しなら培養（分化誘導）すること等が挙げられる。特に
好ましい例としては、例えば、ＣＯ₂濃度５体積％、３
７℃の条件で、２〜３日毎に培地交換しながら１〜３６
日間培養（分化誘導）することである。

【００３７】具体的な培養条件（分化誘導条件）や処理
の方法等は、朝倉書店発行日本組織培養学会編「組織培
養の技術」に記載されている方法等が適用できる。例え
ば、培養基材としてＴ−フラスコ（培養面積；１０〜５
００ｃｍ²等）、プレート（２〜３８４穴等）又はディ
ッシュ（培養面積；５〜５００ｃｍ²等）を用いる場
合、未成熟肥満細胞を５０〜５００万個／ｍＬの濃度で
分散した培地を、深さが１〜２０ｍｍになる量だけディ
ッシュ又はシャーレに加え、ＣＯ₂濃度５体積％、３７
℃の炭酸ガスインキュベーター中で静置培養（分化誘
導）する方法等が挙げられる。この際、１〜５日毎に、
１／３量〜全量の培地を交換することが好ましい。

【００３８】培養基材としてローラーボトル（容量；
０．１〜１０L等）を用いる場合、未成熟肥満細胞を５
０〜５００万個／ｍＬの濃度で分散した培地を、０．５
／１００〜３０／１００の容量になる量だけローラーボ
トルに加え、ＣＯ₂濃度５体積％、３７℃の炭酸ガスイ
ンキュベーター中で、０．１〜１０ｒｐｍの回転速度で
回転させながら培養（分化誘導）する方法等が挙げられ
る。この際、１２〜５日毎に、１／３量〜全量の培地を
交換することが好ましい。

【００３９】培養基材としてマイクロキャリアビーズ
（粒子径；２０〜５００μｍ、表面積；１００〜１００
００ｃｍ²等）を用いる場合、スピナーフラスコ（容
量；１０〜5００ｍL等）中に、未成熟肥満細胞を５０〜
５００万個／ｍＬの濃度で分散した培地を、１／１０〜
７／１０の容量になる量だけ加え、マイクロキャリアビ
ーズを、培地１Ｌ当り０．１〜５０ｇの割合で加え、Ｃ
Ｏ₂濃度５体積％、３７℃の炭酸ガスインキュベーター
中で、１〜１００ｒｐｍの回転速度で撹拌しながら培養
（分化誘導）する方法等が挙げられる。この際、１２〜
５日毎に、１／３量〜全量の培地を交換することが好ま
しい。さらにスピナーフラスコの代わりに流動層型バイ
オリアクターや充填型バイオリアクター（容量；１０ｍ
Ｌ〜１０ｋＬ等）を用いて、マイクロキャリアビーズを
バイオリアクター内にセットし未成熟肥満細胞を５０〜
５００万個／ｍＬの濃度で分散した１〜５倍容量の培地
を循環させた後、ＣＯ₂濃度５体積％、３７℃の炭酸ガ
スインキュベーター中で調整した培地を１〜１００ｃｍ
／分の線速度で循環しながら連続培養（連続分化誘導）
する方法等が挙げられる。

【００４０】培養基材としてホローファイバー（内径１
０〜５００μｍ等）を用いる場合、カートリッジ（容
量；１０〜１０００ｍL等）中に、未成熟肥満細胞を５
０〜５００万個／ｍＬの濃度で分散した培地をカートリ
ッジに加えたあと、ホローファイバー内に、ＣＯ₂濃度
５体積％、３７℃の炭酸ガスインキュベーター中で調整
した培地を１〜１００ｃｍ／分の線速度で循環し連続培
養（連続分化誘導）する方法等が挙げられる。

【００４１】培養後は、ＥＤＴＡ等のキレート剤若しく
はトリプシン等の蛋白質分解酵素で処理するか又はスク
レーパーで掻きとることによって、成熟肥満細胞が回収
される。これらのうち、ＥＤＴＡで処理する方法が好ま
しい。細胞の保存方法としては、細胞を、ジメチルスル
ホキシド等を１〜２０体積％（好ましくは５〜１５体積
％、さらに好ましくは１０体積％）含有させた培地に分
散させた後、−８０℃以下の温度の冷凍庫又は液体窒素
中で保存する方法等が挙げられる。

【００４２】以上の分化誘導させる方法は、成熟した肥
満細胞を簡単な操作で短期間に得られるものであり、生
産される成熟肥満細胞は、アレルギーの機構解明、並び
に花粉症、アトピー性疾患及び慢性アレルギーの予防・
治療薬の開発研究及び生産に有用であるとともに、各種
サイトカイン（ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５等）の大
量生産用にも非常に有用である。

【００４３】

【実施例】以下に実施例を掲げて本発明を更に詳しく説
明するが、本発明はこれら実施例のみに限定されるもの
ではない。 ＜実施例１＞ ＜細胞培養プレートの作製＞特表平３−５０２９３５号
公報中の実施例記載の方法に準じて、（Gly Ala Gly Al
a Gly Ser）₉配列（１０）とArg Gly Asp配列とを１２
個含むＭｎ約１１万の遺伝子組換え大腸菌の産生蛋白
質"ＳＬＰＦ"を作製した。次いで、ＳＬＰＦの４．５規
定の過塩素酸リチウム溶液（ＳＬＰＦの濃度；１ｍｇ／
ｍｌ）をリン酸バッファー液（ＰＢＳ）でＳＬＰＦの濃
度が１０μｇ／ｍｌとなるように希釈し、ＰｎＦ溶液を
作製した。旭テクノグラス製６０ｍｍφ細胞培養ディッ
シュにＰｎＦ溶液を1．５ｍｌ加え、室温で１週間放置
して乾燥した（ＳＬＰＦの塗布量＝１５μｇ／ディッシ
ュ）。さらにＰＢＳ５ｍｌで２回洗浄して、培養基材
（ディッシュ１）を得た。［ＳＬＰＦ含有量：約０．５
μｇ／ｃｍ²］

【００４４】＜細胞培養＞８週齢のＢａｌｂ／ｃ雌性マ
ウスから骨髄液（骨髄細胞）を採取した。この骨髄液
（骨髄細胞）を培地（シグマ社製ＲＰＭＩ−１６４０；
１０００ｍL、インビトロジェン社製ウシ胎仔血清；１
００ｍＬ、エンドゲン社製ＳＣＦ；１０μg、エンドゲ
ン社製ＩＬ−４；３０μｇ、インビトロジェン社製ペニ
シリン；１００ｋＵ、インビトロジェン社製ストレプト
マイシン；１００ｍｇ、インビトロジェン社製メルカプ
トエタノール；４．３ｍｇ（最終濃度50 μM）、インビ
トロジェン社製非必須アミノ酸溶液１０ｍＭ；１０ｍ
ｌ）に縣濁し、細胞濃度；２×１０⁶個／ｍｌの細胞縣
濁液を得た。この細胞懸濁液５ｍｌを培養基材（ディッ
シュ１）に加えて（細胞数：１×１０⁷個／ディッシ
ュ）、３７℃、５体積％ＣＯ₂で培養した。培地交換は
３日おきに行った。細胞播種後１８及び２１日目に、ア
ルシアンブルー・サフラニン染色で細胞を染色し、アル
シアンブルー、サフラニンともに陽性の細胞、即ち成熟
度の高い組織結合型肥満細胞様の細胞（成熟肥満細胞）
の、全細胞に対する比率を求め、この結果を表１に示し
た。

【００４５】＜実施例２＞ ＜細胞培養プレートの作製＞特表平３−５０２９３５号
公報中の実施例記載の方法に準じて、（Gly Ala Gly Al
a Gly Ser）₉配列（１０）とIle Lys Val Ala Val配列
（７）とを７個含むＭｎ約９万の遺伝子組換え大腸菌の
産生蛋白質"ＳＬＰＬ"を作製した。次いで、ＳＬＰＬの
４．５規定の過塩素酸リチウム溶液（ＳＬＰＬの濃度；
１ｍｇ／ｍｌ）をリン酸バッファー液（ＰＢＳ）でＳＬ
ＰＦの濃度が１０μｇ／ｍｌとなるように希釈し、Ｐｎ
Ｌ溶液を作製した。旭テクノグラス製６０ｍｍφ細胞培
養ディッシュにＰｎＬ溶液を１．５ｍｌ加え、室温で１
週間放置して乾燥した（ＳＬＰＬの塗布量＝１５μｇ／
ディッシュ）。さらにＰＢＳ５ｍｌで２回洗浄して、培
養基材（ディッシュ２）を得た。［ＳＬＰＬ含有量：約
０．５μｇ／ｃｍ²］

【００４６】＜細胞培養＞ディッシュ１の代わりにディ
ッシュ２を用いた以外は実施例１と同様に細胞培養を行
い、細胞播種後１８及び２１日目に、全細胞中の成熟肥
満細胞の割合を測定し、この結果を表１に示した。

【００４７】＜実施例３＞ ＜細胞培養プレートの作製＞実施例２の培養基材（ディ
ッシュ２）をそのまま使用した。 ＜細胞培養＞８週齢のＢａｌｂ／ｃ雌性マウスから骨髄
液（骨髄細胞）を採取した。この骨髄液（骨髄細胞）を
培地（シグマ社製ＲＰＭＩ−１６４０；１０００ｍL、
インビトロジェン社製ウシ胎仔血清；１００ｍＬ、エン
ドゲン社製ＳＣＦ；１０μg、エンドゲン社製ＩＬ−
４；３０μｇ、エンドゲン社製ＩＬ−３；１０μｇ、イ
ンビトロジェン社製ペニシリン；１００ｋＵ、インビト
ロジェン社製ストレプトマイシン；１００ｍｇ、インビ
トロジェン社製メルカプトエタノール；４．３ｍｇ（最
終濃度50 μM）、インビトロジェン社製非必須アミノ酸
溶液１０ｍＭ；１０ｍｌ）に縣濁し、細胞濃度；２×１
０⁶個／ｍｌの細胞縣濁液を得た。この細胞懸濁液５ｍ
ｌを培養基材（ディッシュ１）に加えて（細胞数：１×
１０⁷個／ディッシュ）、３７℃、５体積％ＣＯ₂で培養
した。培地交換は３日おきに行った。細胞播種後１８日
目に、アルシアンブルー・サフラニン染色で細胞を染色
し、アルシアンブルー、サフラニンともに陽性の細胞、
即ち成熟度の高い組織結合型肥満細胞様の細胞（成熟肥
満細胞）の、全細胞に対する比率を求め、この結果を表
２に示した。

【００４８】＜比較例１＞培養基材（ディッシュ１）の
替わりに、旭テクノグラス製３５ｍｍφ細胞培養ディッ
シュを比較用の培養基材（ディッシュ３）としてそのま
ま使用すること以外は実施例１と同様に細胞培養を行
い、細胞播種後１８及び２１日目に、全細胞中の成熟肥
満細胞の割合を測定し、この結果を表１に示した。

【００４９】＜比較例２＞旭テクノグラス製３５ｍｍφ
コラーゲンコート細胞培養ディッシュを培養基材（ディ
ッシュ４）として用いて、ヘパリン処理した臍帯血をフ
ィコール・ハイパック液（比重１．０７７、シグマ社）
に重層して３００×ｇで３０分間室温で遠心して単核球
を分離した後、これをＲＰＭＩ１６４０培地（日水製
薬）に懸濁した。なお、ＲＰＭＩ１６４０培地には、さ
らに、１０％のＦＢＳ｛ギブコ社（→インビトロジェン
社）｝、５０μＭの２−メルカプトエタノール、４ｍＭ
のＬ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン及び５
０μｇ／ｍｌのストレプトマイシンが加えられている。
次いで、懸濁液の単核球数濃度を２×１０⁶個／ｍｌに
調製したもの５ｍｌを、培養基材（ディッシュ４）に播
種し、実施例１と同様に細胞培養を行い、細胞播種後１
８及び２１日目に、全細胞中の成熟肥満細胞の割合を測
定し、この結果を表１に示した。また、６週間培養した
段階で、上記培養細胞を、別途定法によって作製した肺
由来の繊維芽細胞の単層培養の上に移し、５０ｎｇ／ｍ
ｌのＳＣＦの存在下で共培養した。２ヶ月後、全細胞中
の成熟肥満細胞の割合を測定した結果、成熟肥満細胞の
割合は２０．０％であった。

【００５０】＜比較例３＞培養基材（ディッシュ２）の
替わりに、旭テクノグラス製３５ｍｍφ細胞培養ディッ
シュを比較用の培養基材（ディッシュ３）としてそのま
ま使用すること以外は実施例３と同様に細胞培養を行
い、細胞播種後１８日目に、全細胞中の成熟肥満細胞の
割合を測定し、この結果を表２に示した。

【００５１】

【表１】

【００５２】表１に示すように、比較例１の培養１８日
目では成熟肥満細胞の割合が低く、さらに２１日目では
殆どの細胞が死滅してしまい、培養が維持できなかっ
た。これに対し、実施例１及び２の培養１８日目では成
熟肥満細胞の割合が極めて高く、さらに２１日目でも高
水準を維持していることが判る。また、従来知られてい
る方法によっては、２１日後の成熟肥満細胞の割合は非
常に低いものであり、また、その後、繊維芽細胞との共
培養を２ヶ月間行っても、つまり、３．５ヶ月間細胞培
養したにもかかわらず、成熟肥満細胞の割合は２０％に
到達したにすぎなかった。

【００５３】

【表２】 表２に示すように、比較例３では成熟肥満細胞が全く検
出されなかったが、実施例３では成熟肥満細胞が明らか
に検出されていることが分かる。

【００５４】

【発明の効果】本発明の成熟肥満細胞の生産方法を用い
ることによって、簡単な操作で短期間に成熟した肥満細
胞を得ることができ、また、長時間維持することができ
る。これによって、成熟肥満細胞を用いるアレルギーの
研究開発や医薬品の生産が容易になることの他、サイト
カイン等の生産も容易になるため、非常に有用である。

【００５５】

【配列表】 <110>三洋化成工業株式会社；SANYO CHEMICAL INDUSTRIES,LTD. <120>成熟肥満細胞の生産方法 <130>P5838 <150>特願2002-028246 <151>2002-2-5 <160>11 <210>1 <211>4 <212>PRT <213>Homo sapiens <400>1 Arg Glu Asp Val 1 <210>2 <211>5 <212>PRT <213>Homo sapiens <400>2 Tyr Ile Gly Ser Arg 1 5 <210>3 <211>5 <212>PRT <213>Homo sapiens <400>3 Pro Asp Ser Gly Arg 1 5 <210>4 <211>7 <212>PRT <213>Homo sapiens <400>4 Arg Tyr Val Val Leu Pro Arg 1 5 <210>5 <211>6 <212>PRT <213>Homo sapiens <400>5 Leu Gly Thr Ile Pro Gly 1 5 <210>6 <211>10 <212>PRT <213>Homo sapiens <400>6 Arg Asn Ile Ala Glu Ile Ile Lys Asp Ile 1 5 10 <210>7 <211>5 <212>PRT <213>Homo sapiens <400>7 Ile Lys Val Ala Val 1 5 <210>8 <211>4 <212>PRT <213>Homo sapiens <400>8 Asp Gly Glu Ala 1 <210>9 <211>6 <212>PRT <213>Bombyx mori <400>9 Gly Ala Gly Ala Gly Ser 1 5 <210>10 <211>54 <212>PRT <213>Bombyx mori <400>10 Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ala 1 5 10 15 Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala 20 25 30 Gly Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly Ser 35 40 45 Gly Ala Gly Ala Gly Ser 50 <210>11 <211>30 <212>PRT <213>Artificial Sequence <400>11 Gly Ala Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly 1 5 10 15 Ala Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro 20 25 30

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】細胞接着シグナルを現わす最小アミノ酸配
   列を１分子中に少なくとも１個含有してなるポリペプチ
   ド（Ｂ）を有する培養基材と、サイトカイン（Ｃ）を有
   する培地とを用いて未成熟肥満細胞（Ｄ）を成熟肥満細
   胞（Ａ）へ分化誘導する工程を含むことを特徴とする成
   熟肥満細胞（Ａ）の生産方法。
2. 【請求項２】成熟肥満細胞（Ａ）が、骨髄液中の未成熟
   肥満細胞（Ｄ）から分化させた成熟肥満細胞である請求
   項１に記載の生産方法。
3. 【請求項３】細胞接着シグナルを現わす最小アミノ酸配
   列の数がポリペプチド（Ｂ）１分子当たり３〜５０個で
   ある請求項１又は２に記載の生産方法。
4. 【請求項４】細胞接着シグナルを現わす最小アミノ酸配
   列が、Arg Gly Asp配列、Leu Asp Val配列、Arg Glu As
   p Val配列（１）、Tyr Ile Gly Ser Arg配列（２）、Pr
   o Asp Ser Gly Arg配列（３）、Arg Tyr Val Val Leu P
   ro Arg配列（４）、Leu Gly Thr Ile Pro Gly配列
   （５）、Arg Asn Ile Ala Glu Ile Ile Lys Asp Ile配
   列（６）、Ile Lys Val Ala Val配列（７）、Leu Arg G
   lu配列、Asp Gly Glu Ala配列（８）及びHis Ala Val配
   列からなる群より選ばれる少なくとも１種の配列である
   請求項１〜３のいずれかに記載の生産方法。
5. 【請求項５】ポリペプチド（Ｂ）が、さらにGly Ala Gl
   y Ala Gly Ser配列（９）を少なくとも２個有してなる
   請求項１〜４のいずれかに記載の生産方法。
6. 【請求項６】ポリペプチド（Ｂ）の含有割合が、培養基
   材の培養表面積１００ｃｍ²あたり、０．１μｇ以上１
   ００ｍｇ以下である請求項１〜５のいずれかに記載の生
   産方法。
7. 【請求項７】サイトカイン（Ｃ）がインターロイキン及
   び／又は幹細胞因子である請求項１〜６のいずれかに記
   載の生産方法。