JP2002543092A - Pulmonary administration for insulin crystals - Google Patents

Pulmonary administration for insulin crystals

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JP2002543092A JP2000614289A JP2000614289A JP2002543092A JP 2002543092 A JP2002543092 A JP 2002543092A JP 2000614289 A JP2000614289 A JP 2000614289A JP 2000614289 A JP2000614289 A JP 2000614289A JP 2002543092 A JP2002543092 A JP 2002543092A
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シュン・リ
ベンジャミン・リー・ヒューズ
マーク・ローレンス・ブレイダー
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ロナルド・キース・ウルフ
ン・キンマン
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イーライ・リリー・アンド・カンパニー
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Abstract

(57)【要約】 本発明は、誘導体化インスリンまたは誘導体化インスリン類似体を含む結晶、そのような結晶の製造方法、および糖尿病の治療を要する患者に該結晶を投与して血糖を調節することを含む糖尿病の治療方法に関する。 (57) Abstract: The present invention, crystals containing derivatized insulin or derivatized insulin analog, modulating such a method of manufacturing a crystal, and blood glucose was administered patients requiring in the crystal treatment of diabetes a method for treating diabetes comprising. 望ましい平均サイズを有する結晶を得る。 Obtain crystals having a desired average size. 平均結晶サイズを調節し、該結晶を口から吸入により好都合に投与し、深部肺に蓄積させ、そこで長時間にわたり吸収させることにより、食事間および通夜の血糖を調節することができる。 Mean adjust the crystal size, it was administered advantageously by inhalation the crystals from the mouth, is accumulated in the deep lung, where by absorbing over time, it is possible to adjust the glucose meals and between wake.

Description

【発明の詳細な説明】 DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

【0001】 クロスリファレンス 本願は米国仮出願第60/131,170(出願日、1999年4月27日)の恩恵を受ける権利を主張する(この内容は本明細書の一部を構成する)。 [0001] CROSS REFERENCE US Provisional Application No. 60 / 131,170 (filed April 27, 1999) claims the benefit rights of (the contents of which is incorporated herein by reference).

【0002】 発明の背景 1. [0002] Background of the Invention 1. 発明の分野。 Field of the Invention. 本発明はヒトの医薬の分野に属する。 The present invention is in the field of human medicine. より詳細には、本発明は糖尿病および高血糖症の治療分野に属する。 More particularly, the present invention belongs to the therapeutic field of diabetes and hyperglycemia. 2. 2. 関連技術の説明。 Description of the related art. 正常な個体における内因性インスリンの分泌パターンをまねることがインスリン療法の長い間の目標となってきた。 It has become the target of a long time of insulin therapy to mimic the secretion pattern of endogenous insulin in normal individuals. インスリンの1日の生理学的な要求は変動し、(a)食事に関連した血液グルコース(血糖)の急激な変動をなくすためのインスリンの適用(pulse)を必要とする吸収相(absorptive Physiological requirements of daily insulin fluctuates, (a) the absorption phase which requires the application of insulin to eliminate abrupt variation of the meal-related blood glucose (sugar) (pulse) (absorptive
phase)と、(b)最適な空腹時血糖を維持するための肝臓グルコースの放出を調節するためにインスリンの持続的供給を必要とする後吸収相(post-absorptive ph And phase), (b) optimal absorption phase after that it requires sustained supply of insulin to regulate the release of hepatic glucose to maintain fasting blood glucose (post-absorptive ph
ase)の二相に分けることができる。 It can be divided into two phases of ase). したがって、一般的に、糖尿病の人々に対する効果的治療には、ボーラス注射で投与する食事時間の即効性インスリンと、 Thus, in general, the effective treatment for people with diabetes, a fast acting insulin mealtime administered by bolus injection,
食事間の血糖レベルを調節するのに1日1〜2回注射により投与する長く作用する、いわゆる基礎インスリンの2種類の外因性インスリン製剤の併用が必要である。 Long acting administered by daily or twice injections to regulate blood glucose levels between meals, it is necessary combination of two types of exogenous insulin formulations of the so-called basal insulin.

【0003】 常套的なインスリン療法では1日に2回注射するだけである。 [0003] In the conventional insulin therapy is only injected twice a day. 1日に3回またはそれ以上インスリンを注射するより集中的なインスリン療法は、Diabetes Con Intensive insulin therapy than injected 3 times or more insulin per day, Diabetes Con
trol and Complications Trial(DCCT)試験が示す通り、合併症の減少をもたらす。 trol and Complications Trial (DCCT) as indicated by the test results in a reduction of complications. 残念ながら、多くの糖尿病患者は、グルコースレベルの厳密な調節を維持するのに必要な多くの注射が不快であるため集中的療法を受けることを嫌がる。 Unfortunately, many diabetics are unwilling to undergo intensive therapy for many injections are uncomfortable required to maintain a strict regulation of glucose levels. 集中的インスリン療法に対する患者のコンプライアンスを高め、合併症のリスクを低下させるには非注射型のインスリンが望ましい。 Increasing patient compliance with intensive insulin therapy, the reduce the risk of complications of non-injected insulin is desirable.

【0004】 多くの研究者が、非注射型のインスリン、例えば経口、経直腸、経皮、および経鼻経路について研究してきた。 [0004] Many of the researchers, non-injection type of insulin, such as oral, rectal, transdermal, and have been studied for the nasal route. 今までのところ、これらの型の投与は、インスリンの吸収が悪く、血清インスリン濃度が低く、供給部位を刺激し、または血清グルコースレベルの有意な低下を生じないことにより有効ではなかった。 So far, administration of these types, poor absorption of insulin, low serum insulin levels, and stimulate the supply site, or was ineffective by not caused a significant decrease in serum glucose levels.

【0005】 非注射用インスリンを投与するための別のよく研究された経路は肺からである。 [0005] Another well-studied route for administering non-injectable insulin is from lung. 比較的低分子量(5,800ダルトン)であることからインスリンは、肺から投与するのに理想的な候補であるようである。 Insulin because of its relatively low molecular weight (5,800 daltons) appears to be ideal candidates for administration from the lungs. 吸入によるインスリンの投与とその肺からの吸収は1925年に最初に報告された。 With the administration of insulin by inhalation absorption from the lung it was first reported in 1925. しかしながら、吸入により投与した後、インスリンのようなサイズの小さなタンパク質は、肺の表面積が非常に大きく、比較的多孔膜であることから肺から急速に吸収される。 However, after administration by inhalation, the small proteins sized insulin, the surface area of ​​the lungs is very large, it is rapidly absorbed from the lung because it is relatively porous membrane. 血漿中濃度は急速に最高値となり、急速に低下する。 Plasma concentration rapidly becomes the highest value, it decreases rapidly. これらの薬物動態は、吸収相における血糖を調節するのに適しているかも知れないが、後吸収相では全く不適当である。 These pharmacokinetics, but might be suitable to modulate the blood glucose in the absorption phase, is quite unsuitable in the post absorption phase. したがって、吸入による長期作用性インスリンの投与方法は依然として課題である。 Thus, the method of administration long acting insulin by inhalation is still problem.

【0006】 下記はインスリンおよび他のタンパク質の吸入に関する総論である:「Aeroso [0006] The following is a review article on the inhalation of insulin and other proteins: "Aeroso
l Insulin-A Brief Review」, Patton, JSおよびPlatz, RM, Respiratory l Insulin-A Brief Review ", Patton, JS and Platz, RM, Respiratory
Drug Delivery IV中, P. Byron編, Interpharm Press(1994); 「Delivery of B In Drug Delivery IV, P. Byron ed., Interpharm Press (1994); "Delivery of B
iotherapeutics by Inhalation Aerosol」, Niven, R., Crit. Rev. in Therape iotherapeutics by Inhalation Aerosol, ", Niven, R., Crit. Rev. in Therape
utic Drug Carrier Systems 12: 151 231(1995);および「Drug Delivery via th utic Drug Carrier Systems 12: 151 231 (1995); and "Drug Delivery Via th
e Respiratory Tract」, Byron, PRおよびPatton, JS, J. Aerosol Medic e Respiratory Tract ", Byron, PR and Patton, JS, J. Aerosol Medic
ine 7: 49-75(1994)。 ine 7: 49-75 (1994).

【0007】 深部肺、すなわち肺胞の表面上への粒子の供給および蓄積効率は、粒子の空力 [0007] Deep lung, i.e. the supply and storage efficiency of the particles onto the surface of the alveoli, the aerodynamic particle
(的)質量中央径(MMAD)と強い関連がある。 (Target) is strongly associated with the mass median diameter (MMAD). 最適MMADは約2-3ミクロンである。 Optimum MMAD is about 2-3 microns. この範囲以上でもそれ以下でも、物質は肺胞表面にあまり蓄積しないであろう。 The range of any even less, the material will not significantly accumulate in alveolar surface.

【0008】 不溶性または徐々に溶解する粒子の食作用(ファゴサイトーシス)は、深部肺における最も重要なクリアランスメカニズムである [Rudt, SH, et al., J. [0008] phagocytosis of insoluble or slowly dissolving particles (phagocytosis) is the most important clearance mechanism in the deep lung [Rudt, SH, et al., J.
Controlled Release 25: 123-138(1993); Tabata, Y., et al., J. Biomedical Controlled Release 25:. 123-138 (1993); Tabata, Y., et al, J. Biomedical
Material Res. 22: 837-842(1988); Wang, JA, et al., In : Respiratory D Material Res 22:.. 837-842 (1988); Wang, JA, et al, In: Respiratory D
rug Delivery. Buffalo Grove, IL; Interpharm 1997, vol. VI, pp. 187-192; . Rug Delivery Buffalo Grove, IL;.. Interpharm 1997, vol VI, pp 187-192;
Edwards, DA, et al., Science 276: 1868-1871(1997); Gehr, PM, Micro . Edwards, DA, et al, Science 276: 1868-1871 (1997); Gehr, PM, Micro
sc. Res. Tech. 26: 423-436(1993)]。 ... Sc Res Tech 26: 423-436 (1993)]. 肺胞表面に蓄積したら、実際の大きさが約1〜約10ミクロンの範囲の粒子は肺マクロファージにより貪食される(phagocy After accumulating the alveolar surface, particles of the actual size in the range of from about 1 to about 10 microns are phagocytosed by pulmonary macrophages (Phagocy
tose)。 tose). 非常に大きな粒子、例えば実際の直径が約10ミクロン以上の粒子は、肺マクロファージによって効率的に貪食されないことが知られている。 Very large particles, for example, the actual diameter is greater than or equal to about 10 microns particles are known not to be efficiently phagocytosed by lung macrophages. 実際の大きさがナノメーターのサイズ範囲である小粒子はマクロファージの摂取を逃れるようである。 Small particles actual size is in the size range of nanometers seem evade uptake of macrophages. 残念なことに、供給と蓄積のために最適な特性を有する粒子は実際の粒子の大きさがマクロファージの攻撃が予期される範囲にあることが多い。 Unfortunately, the particles having the optimum properties for the supply and storage are often in the range of size of the actual particles are expected macrophage attack.

【0009】 Edwardsらは、吸入により深部肺に投与された大多孔性粒子からのインスリンの長期の放出について記載している[J. Appl. Physiol. 85: 379-385(1998); Sc [0009] Edwards et al., [J. Appl describes prolonged release of insulin from the large porous particles administered to the deep lung by inhalation Physiol 85:.. 379-385 (1998); Sc
ience 276: 1868-1871(1997)]。 ience 276: 1868-1871 (1997)]. 投与された粒子の持続性は、粒子の実サイズが大きいことによるが(10ミクロン以上)、深部肺への蓄積速度の速さは、その物理的サイズが大きいにも関わらず比較的小さな空力的サイズ(約3-4マイクロメーターMMAD)を生じる粒子の密度の低さによる。 Persistence of the administered particles is due to a large actual size of the particles (10 microns or more), the speed of the accumulation rate to the deep lung is relatively small aerodynamic Despite the large its physical size According to low density of the particles resulting in size (about 3-4 micrometers MMAD). これら粒子は、生分解性共重合体(ポリ−乳酸−共グリコール酸)に封入されたインスリンを含む。 These particles are biodegradable copolymer comprising insulin encapsulated in (poly - co-glycolic acid - lactic acid). 共重合体の遅い分解によりインスリンは少なくとも4日間の期間にわたり放出される。 Insulin by the slow decomposition of the copolymer is released over a period of at least 4 days.

【0010】 例えばNPH-インスリンおよび種々のLente製品を用いるインスリンの結晶化は、糖尿病の人々に長期の血糖調節をもたらすよく知られた手段である。 [0010] For example NPH- insulin and crystallization of insulin using various Lente products is a well-known means of providing long-term glycemic control in people with diabetes. インスリン結晶は一様に非経口投与経路、通常、皮下経路で投与される。 Insulin crystals uniformly parenteral administration routes, typically administered by subcutaneous route. 吸入により深部肺に供給するとインスリン含有結晶の許容される高い生分解性は達成されなかった。 Acceptable high biodegradability of the supply to the deep lung insulin-containing crystals by inhalation was not achieved. これは、上部気道の捕捉(entrapment)メカニズムを回避させる粒子特性を有する空気中の粒子、特に微生物および微生物を含むエアロゾルの除去に関する肺表面の生物学、免疫学および化学が関与する複雑な防御メカニズムによるようである。 This airborne particles having a particle properties to avoid trapping (entrapment) mechanism of the upper respiratory tract, the biology of lung surface and particularly to the removal of aerosols containing microorganisms and microorganisms, immunology and complex defense mechanism chemistry involved it seems due to.

【0011】 Hughes, BLら [PCT/US98/23040, 出願日、1998年10月29日]は、糖尿病を治療するために吸入により脂肪酸アシル化インスリンおよびインスリン類似体を投与する方法および医薬組成物について記載した。 [0011] Hughes, BL et al. [PCT / US98 / 23040, filed October 29, 1998], the methods and pharmaceutical compositions for administering the fatty acylated insulin and insulin analogs by inhalation for the treatment of diabetes It described for. 該組成物は溶液もしくは非晶質物質の粉末であり結晶ではない。 The composition is not an a powder solution or amorphous material crystals. Hughesらは、誘導体化インスリンB28-Nε-ミリストイル-LysB28、ProB29ヒトインスリン類似体、およびB29-Nε-パルミトイル- Hughes et al., Derivatized insulin B28-Nε- myristoyl -LysB28, ProB29 human insulin analog, and B29-Nε- palmitoyl -
ヒトインスリンがグルコースレベルを低下させるのに有効な量で吸着したことを証明した。 Human insulin was demonstrated that adsorbed in an amount effective to reduce the glucose level. 肺を介して投与した脂肪酸アシル化インスリンの薬物動態は非アシル化インスリンに比べて遅延したが、遅延の長さは皮下的に供給したNPH-インスリンのそれより短かった。 Pharmacokinetics of fatty acylated insulin administered via the lungs was delayed as compared to the non-acylated insulin, but the length of the delay is shorter than that of NPH- insulin subcutaneously supplied.

【0012】 Havelund, S. [W098/42749, 1998年10月1日公開]は、吸入により投与するのに適しているとされる、凝集(aggregation)およびクランピング(clumping)に抵抗性であるとクレームしているインスリン、インスリン類似体、およびインスリン誘導体の亜鉛非含有結晶粉末について記載している。 [0012] Havelund, S. [W098 / 42749, 1998 October 1 Public] is to be suitable for administration by inhalation, are resistant to aggregation (aggregation) and clamping (clumping) It describes claims to have insulin, insulin analogues and zinc-free crystal powder of the insulin derivative and.

【0013】 Whittingham, JLら[Biochemistry 36: 2826-2831(1997)]は、X-線結晶学による構造試験のためにB29-Nε-テトラデカノイル-デス(B30)-ヒトインスリン類似体および亜鉛からなる非常に大きな結晶を製造した。 [0013] Whittingham, JL et al [Biochemistry 36: 2826-2831 (1997)] is, B29-Nε- tetradecanoyl for structural testing by X- ray crystallography - des (B30) - human insulin analog and zinc to produce a very large crystal composed of. これらの結晶は大きすぎて、吸入により投与したときに深部肺への効率的な蓄積を期待できなかった。 These crystals are too large, not be expected an efficient accumulation in the deep lung when administered by inhalation. これら結晶は、吸入により投与したときに効率的な蓄積を達成するのに適した粒子サイズの物質を生成するため粉砕する必要があったであろう。 These crystals would have been necessary to mill to produce a material of particle size suitable for achieving efficient accumulation when administered by inhalation.

【0014】 Brader, M. [米国特許出願第09/177685号、1998年10月22日出願; PCT/US98/22 [0014] Brader, M. [US Patent Application No. 09/177685, October 22, 1998, filed; PCT / US98 / 22
434; 欧州特許公開公報第0911035号、1999年4月28日公開、本明細書ではBrader 434; European Patent Publication No. 0911035, 1999 April 28 published herein Brader
Iという]、およびBrader, M. [米国特許出願第09/217275号、1998年12月21日出願;PCT/US98/27299、本明細書ではBrader IIという]は、二価金属カチオンを、 ] That I, and Brader, M. [U.S. Patent Application No. 09/217275, 1998 December 21 filed; PCT / US98 / 27299,] that Brader II as used herein, a divalent metal cation,
誘導体化インスリンおよび誘導体化インスリン類似体を含有する誘導体化タンパク質と共に含む微結晶、該結晶の製造方法、および糖尿病を治療(処置)するためのそれらの投与方法について記載している。 It describes microcrystals, method for producing the crystals, and their method of administration for treating diabetes (treatment) in association with a derivatized protein containing the derivatized insulin and derivatized insulin analogs. 該結晶は棒状であり、市販の棒状 The crystals are rod-like, commercially available rod-like
NPHインスリン結晶の大きさを有し、長さ約5ミクロンである。 Have a size of NPH insulin crystals, it is about 5 microns in length. そのような結晶は、口から吸入により投与したときに深部肺への最適蓄積を得るには大きすぎると考えられる。 Such crystals are believed to be too large for optimum accumulation in the deep lung when administered by inhalation through the mouth.

【0015】 Brader IIは、結晶速度およびサイズに影響すると考えられるパラメーターの長いリスト示しており、その中で温度と競合化合物、例えばクエン酸塩の濃度に言及した。 [0015] Brader II shows a long list of parameters that would influence the crystallization rate and the size, temperature and competing compounds in which, referred to the concentration of, for example citrate. しかしながら、Brader IIは、結晶サイズと温度の関係を特定しておらず、サイズに対する競合化合物の影響は結晶速度を遅くすると思われる影響を推論しているだけである。 However, Brader II is not to identify the relationship of crystal size and temperature, the influence of competing compounds for size is only infer the effect that appears to slow down the rate of crystallization. さらに、Brader IIは、誘導体化タンパク質の結晶サイズに影響すると考えられる多くのパラメーターの中の塩素アニオンには言及していない。 Furthermore, Brader II is the chloride anion in the many parameters that are believed to affect the crystal size of the derivatized protein does not mention.

【0016】 発明の要約 本発明は、誘導体化インスリンまたは誘導体化インスリン類似体および二価金属カチオンからなる、平均直径が1-3ミクロンの範囲であることを特徴とする結晶の安定したポピュレーションを含む。 [0016] SUMMARY OF THE INVENTION The invention consists of derivatized insulin or derivatized insulin analog, and a divalent metal cation, a stable population of crystals, wherein the average diameter is in the range of 1-3 microns including. より具体的には、本発明は、単一モード(uni-modal)対称粒子分布を有する結晶であって、 a)式:B29-Nε-X-ヒトインスリン(ここで、Xはブチリル、ペンタノイル、ヘキサノイル、ヘプタノイル、オクタノイル、ノナニル、およびデカノイルからなる群から選ばれる)で示される誘導体化インスリン、 b)亜鉛、 c)フェノール性保存剤、および d)プロタミンを含む、容積平均球形等価直径(volume mean spherical equiva More particularly, the present invention relates to a crystal having a single-mode (uni-modal) symmetrical particle distribution, a) Formula: B29-Nε-X- human insulin (where, X is butyryl, pentanoyl, hexanoyl, heptanoyl, octanoyl, nonanyl, and derivatized insulin represented by chosen) from the group consisting of decanoyl, b) zinc, c) a phenolic preservative, and d) a protamine, volume average spherical equivalent diameter (volume mean spherical equiva
lent diameter)が1ミクロン〜3ミクロンであることを特徴とする結晶である。 lent For diameter) is crystalline, which is a 1 micron to 3 microns.

【0017】 本発明は、インスリンもしくはインスリン類似体、および誘導体化インスリンもしくは誘導体化インスリン類似体および二価金属カチオンからなる、平均直径が1-3ミクロンの範囲であることを特徴とする共結晶の安定したポピュレーションを含む。 The present invention, insulin or insulin analogues, and a derivatized insulin or derivatized insulin analog, and a divalent metal cation, an average diameter of the co-crystal, which is a range of 1-3 microns including a stable population. すなわち、より詳細には、本発明は、単一モード(uni-modal)対称粒子分布を有する共結晶であって、インスリン、ならびに a)式:B29-Nε-X-ヒトインスリン(ここで、Xはブチリル、ペンタノイル、ヘキサノイル、ヘプタノイル、オクタノイル、ノナニル、およびデカノイルからなる群から選ばれる)で示される誘導体化インスリン、 b)亜鉛、 c)フェノール性保存剤、および d)プロタミンを含む、容積平均球形等価直径が1ミクロン〜3ミクロンであることを特徴とする共結晶も含む(ここで、総タンパク質に対する誘導体化インスリンの割合は少なくとも50%である)。 That is, more specifically, the present invention provides a co-crystal with a single mode (uni-modal) symmetrical particle distribution, insulin, and a) Formula: B29-Nε-X- human insulin (wherein, X comprises butyryl, pentanoyl, hexanoyl, heptanoyl, octanoyl, nonanyl, and derivatized insulin represented by chosen) from the group consisting of decanoyl, b) zinc, c) a phenolic preservative, a and d) protamine, volume average sphericity equivalent diameter also include co-crystal, which is a 1 micron to 3 microns (wherein the proportion of the derivatized insulin on total protein is at least 50%).

【0018】 本発明は、結晶もしくは共結晶を、1またはそれ以上の医薬的に許容される賦形剤、担体、もしくは結晶が安定な水性溶媒とともに含む医薬組成物も含む。 [0018] The present invention includes a crystal or co-crystal, one or more pharmaceutically acceptable excipients, carriers, or even crystal pharmaceutical composition comprising together with a stable aqueous solvents. 該医薬組成物は非経口投与するための、より好ましくは深部肺(肺胞)に蓄積させるために患者の口から吸入により投与するためのものであってよい。 The pharmaceutical composition for parenteral administration may be for more preferably administered by inhalation from the patient's mouth in order to accumulate the deep lung (alveolar).

【0019】 非経口用医薬組成物では、結晶を、所望により等張性物質、緩衝剤、保存剤、 [0019] In non-oral pharmaceutical composition, crystals, optionally isotonicity agents, buffering agents, preservatives,
およびインスリンもしくはインスリン類似体医薬的に許容される水性溶媒に懸濁させる。 And it is suspended in insulin or insulin analogues a pharmaceutically acceptable aqueous solvent. 肺投与用の医薬組成物では、結晶は、所望により他の乾燥賦形剤、インスリンもしくはインスリン類似体の乾燥粉末、および担体粒子を一緒に含む、乾燥粉末(例えば乾燥粉末吸入器により供給するための)の形であってよい。 The pharmaceutical composition for pulmonary administration, crystal, optionally other dry excipients, dry powder insulin or insulin analogues, and including carrier particles together, the dry powder (e.g. for supplying the dry powder inhaler it may be in the form of). 該結晶は、所望によりインスリンおよびインスリン類似体を含む医薬的に許容される水性溶媒に該結晶を懸濁させることにより液体の形で患者に口から吸入させることにより投与するために製剤化してもよい。 The crystals can also be formulated for administration by inhalation through the mouth into the patient in liquid form by suspending the crystals in a pharmaceutically acceptable aqueous solvent optionally containing insulin and insulin analogs good.

【0020】 本発明は、口から吸入により投与したときの深部肺における吸収効率が増加するサイズの結晶および共結晶の製造方法を提供する。 [0020] The present invention provides a method for producing crystals and co-crystals of a size that the absorption efficiency increases in the deep lung when administered by inhalation through the mouth. 該方法は、クエン酸塩の非存在下で下記工程a)-f)をあらゆる順序で行うことにより中性pHを有する懸濁剤を製造することを含む(ただし、工程f)が工程a)に続き、工程f)が工程e)に先立つときは工程b)およびc)は工程f)に先立つ): a)酸性pHの水性溶媒に誘導体化インスリンを溶解し、 b)フェノール性保存剤を加え、 c)亜鉛を加え、 d) 塩素アニオンを、pH調整により導入される以上の最終濃度約100mM〜約150mM The method includes preparing a suspension having a neutral pH by performing the following steps a) -f) in the absence of citrate in any order (although, step f) a step a) the continued, prior to step b) and c) the step f) when step f) precedes step e)): a) dissolving the derivatized insulin in aqueous acidic pH, b) a phenolic preservative in addition, c) zinc was added, d) a chloride anion, beyond that introduced by pH adjustment final concentration of about 100mM~ about 150mM
塩素イオンとなるように加え、 e)プロタミンを加え、 f)中性pHに調整し、次いで12時間〜約96時間、中性pH懸濁液の温度を約25℃〜 Added to a chloride ion, e) protamine was added, f) was adjusted to neutral pH, then 12 hours to about 96 hours, a temperature of about 25 ° C.-neutral pH suspension
約37℃に保つ。 Keep at about 37 ℃.

【0021】 本発明は、吸入により糖尿病または高血糖を治療するための医薬の製造における結晶の使用も含む(ここで、治療は、医薬が患者の肺に蓄積されるように吸入用具を用いて有効量の医薬をそれを必要とする患者に投与することを含む)。 [0021] The present invention is inhalation diabetes or crystals containing (where use of in the manufacture of a medicament for treating hyperglycemia, the treatment medicament using suction devices to be accumulated in the lungs of the patient comprising administering an effective amount of a pharmaceutical to a patient in need thereof). 本発明は、吸入により糖尿病または高血糖を治療するための医薬の製造における共結晶の使用も含む(ここで、治療は医薬が患者の肺に蓄積されるように吸入用具を用いて有効量の医薬をそれを必要とする患者に投与することを含む)。 The present invention is inhaled by the use of co-crystal in the manufacture of a medicament for treating diabetes or hyperglycemia including (where treatment medicament effective amount using the suction tool so accumulated in the lungs of the patient pharmaceutical comprising administering to a patient in need thereof a).

【0022】 本発明は吸入により結晶または共結晶を投与する方法も提供する。 [0022] The present invention also provides methods of administering crystals or co-crystals by inhalation. 本発明は、Brader IおよびBrader IIに記載の方法により製造された結晶および共結晶より好都合に物理的に安定で再懸濁しやすい結晶および共結晶も提供する。 The present invention also provides advantageously physically stable and resuspended easily crystals and co-crystals than crystals and co-crystals produced by the method according to Brader I and Brader II. 改良された特性を有する結晶および共結晶の製造方法には、クエン酸塩の非存在下で下記工程a)-g)を実施することにより中性pHを有する懸濁液を製造することが含まれる(ただし、工程g)が工程a)に続き、工程g)が工程f)に先立つときは工程b)およびc)は工程g)に先立つ): a)誘導体化インスリンを酸性pHの水性溶媒に溶解し、 b)フェノール性保存剤を加え、 c)亜鉛を加え、 d)塩素アニオンを、pH調整により導入される以上の最終濃度約15mM〜150mM塩素イオンとなるように加え、 e)クエン酸塩を濃度1mM〜10mMに加え、 f)プロタミンを加え、 g)中性pHに調整し、次いで12時間〜約96時間、中性pH懸濁液の温度を約20℃〜約 The method for producing crystals and co-crystals with improved properties, involves the production of suspensions having a neutral pH by carrying out the following steps a) -g) in the absence of citrate is (provided that step g) is followed by step a), step b) and c when step g) is prior to step f)) is prior to step g)): a) the derivatized insulin acidic pH aqueous solvent dissolved in, b) a phenolic preservative was added, c) zinc was added, d) a chloride anion, added to a more final concentration of about 15mM~150mM chloride ions introduced by pH adjustment, e) citric salt was added to the concentration 1 mm to 10 mm, f) protamine was added, g) and adjusted to neutral pH, then 12 hours to about 96 hours, about 20 ° C. to about the temperature of the neutral pH suspension
37℃に保つ。 Keep to 37 ℃. 共結晶では、インスリンも上記方法を用いて溶解し、総タンパク質に対する誘導体化インスリンの割合は少なくとも50%である。 In co-crystals, insulin also dissolved using the above method, the ratio of derivatized insulin on total protein is at least 50%. この方法により製造される結晶は、Brader IおよびBrader IIの開示に従って製造される結晶より物理的に安定であり、より容易に再懸濁される。 Crystals produced by this method is physically stable than crystals produced in accordance with the disclosure of Brader I and Brader II, it is more easily resuspended. これらは患者に好都合である。 These are convenient to the patient.

【0023】 本発明は、結晶および共結晶の粒子サイズ、および物理的安定性および再懸濁性に対する塩素イオンの劇的で予期しない効果の発見である。 [0023] The present invention is the discovery of the dramatic unexpected effect of chloride ion particle size of crystals and co-crystals, and on the physical stability and resuspension properties. さらに粒子を分類もしくはサイズを小さくすることなく高効率に肺に蓄積させるのに理想的に適合した、容積平均球体等価直径が約1ミクロン〜約3ミクロンの範囲の結晶および共結晶を製造する能力は、塩素イオン、より高い温度、およびクエン酸塩が存在しないか低レベルであることの組合せ効果をさらに発見したことから生まれたものである。 Ability high efficiency ideally suited to be accumulated in the lungs, where the volume average sphere equivalent diameter to produce crystals and co-crystals in the range of from about 1 micron to about 3 microns without further smaller classification or size of particles are those born from the chlorine ions, it was further discovered a combination effect of a higher temperature, and a low level or citrate is not present.

【0024】 本発明は、当該分野で現在取り組まれていない2つの問題を解決する。 The present invention solves two problems that are not addressed currently in the art. 第一に、インスリンを供給するための以前の肺の方法は、食事間と通夜(一夜)の血糖を調節するための適切な時間作用をもたらさなかった。 First, the method of the previous lungs for supplying insulin did not result appropriate time action for adjusting the blood sugar of vigil and between meals (overnight). 第二に、現在知られた可溶性、長時間作用性インスリンおよびインスリン類似体は、注射用試料を製造するのに不便で、注射針を刺す痛みを伴う皮下注射により供給される。 Secondly, currently known soluble, the long-acting insulin and insulin analogues, inconvenient to manufacture injectable sample, supplied by subcutaneous injection painful pricking needle. 本発明によれば、血糖レベルを調節するためにインスリンが必要な患者は、非誘導体化インスリンの吸入に比べてインスリンの好都合な緩やかな取り込みと持続性の延長、および皮下投与に比べて不便さと痛みも減るという利益を受けるであろう。 According to the present invention, the patient insulin needed to regulate blood sugar levels, as compared to the inhalation of underivatized insulin advantageous gradual uptake and persistence of the extension of the insulin, and the inconvenience compared to subcutaneous administration It will receive the benefit of also reduce pain. 結晶および共結晶は、吸入により投与するのに適したあらゆる種々の用具を用い、担体中の例えば溶液剤もしくはサスペンジョン(懸濁)剤としてか、 Crystals and co-crystals using any of a variety of devices suitable for administration by inhalation, or for example as solutions or suspensions (suspension) agent in the carrier,
または乾燥粉末剤として供給することができる。 Or it can be supplied as a dry powder. アシル化インスリンは、吸入用具、例えば、ネブライザー、定量吸入器、乾燥粉末吸入器、吸入器(sprayer)などを用いて投与することができる。 Acylated insulin inhalation devices, for example, nebulizers, metered dose inhalers, dry powder inhalers, can be administered using a inhaler (sprayer).

【0025】 本発明は、結晶または共結晶およびインスリンまたはインスリン類似体のいずれかを含む医薬組成物を吸入によりそれを必要とする患者に投与する方法も提供する。 The present invention also provides a method of administering a pharmaceutical composition comprising any of the crystalline or co-crystal and insulin or an insulin analogue to a patient in need thereof by inhalation. そのような合剤を投与することにより血糖値の食事後の調節と基礎調節の両方がもたらされる。 Both regulatory and basic adjustment of the post-meal blood glucose level caused by the administration of such a mixture. 該方法は注射を回避するため、患者の快適さが改善され、 The method for avoiding injections, improves patient comfort,
患者のコンプライアンスが通常のインスリン供給法に比べて増大した。 Patient compliance is increased as compared to the normal insulin supply method.

【0026】 図面の簡単な説明 図1はF344ラットに結晶および共結晶を投与した後の血糖値を示す:100% C8- [0026] BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS Figure 1 shows the blood glucose level after administration of crystals and co-crystals in F344 rats: 100% C8-
BHI 1mg/kgの気管内注入(黒四角、実線);75% C8-BHI: 25% BHI 1mg/kgの気管内注入(白四角、実線); 75% C8-BHI: 25% BHI 1mg/kgの皮下投与(黒丸、破線); Intratracheal injection of BHI 1 mg / kg (closed squares, solid line); 75% C8-BHI: intratracheal instillation of 25% BHI 1mg / kg (open squares, solid line); 75% C8-BHI: 25% BHI 1mg / kg subcutaneous administration (closed circles, dashed line);
およびコントロールとしてNPHインスリン1mg/kgの皮下投与(黒三角、実線)。 And subcutaneous administration of NPH insulin 1 mg / kg as a control (filled triangle, solid line).

【0027】 発明の詳細な説明 本明細書で用いている用語「結晶」は、誘導体化インスリンもしくは誘導体化インスリン類似体、二価金属カチオン、錯化化合物、および六量体安定化化合物を含む微結晶を意味する。 The term as used Detailed Description of the Invention "crystal", derivatized insulin or derivatized insulin analog, divalent metal cation, complexing compound, and hexamer stabilizing compound fine It means crystal. この種の結晶はBrader, M. [米国特許出願第09/17768 This kind of crystal Brader, M. [USSN 09/17768
5号、1998年10月22日出願、PCT/US98/22434、欧州特許公開公報第0911035号、19 No. 5, October 22, 1998 application, PCT / US98 / 22434, European Patent Publication No. 0911035, 19
99年4月28日公開]に最初に記載された。 Was first described in 1999, April 28, the public]. 本明細書で用いている用語「共結晶」は、インスリンもしくはインスリン類似体、誘導体化インスリンもしくは誘導体化インスリン類似体、二価金属カチオン、コンプレックス形成化合物、および六量体安定化化合物を含む微結晶を意味する。 The term "co-crystal" as used herein, insulin or insulin analogue, derivatized insulin or derivatized insulin analog, divalent metal cation, complexing compound, and microcrystalline containing hexamer stabilizing compound It means. この種の共結晶はBrader, M. [米国特許出願第09/217275号、1998年12月21 This kind of co-crystals Brader, M. [U.S. Patent Application No. 09/217275, December 1998 21
日出願、PCT/US98/27299]に最初に記載された。 Day application was first described in PCT / US98 / 27299].

【0028】 用語「微結晶」は、結晶状態の物質を主として含む、顕微鏡サイズ、典型的には最長寸法が1ミクロン〜100ミクロンの範囲内の固体を意味する。 The term "microcrystalline" means a substance in a crystalline state mainly including, microscopic size, typically the longest dimension means the solids in the range of 1 micron to 100 microns. 用語「微結晶の」とは微結晶である状態をいう。 The term "microcrystalline" refers to the state is microcrystalline.

【0029】 用語「棒状」は、先端がピラミッド状の正方晶棒状物としても記載されている独特な微結晶形態を意味する。 The term "rod-like" means the distinctive microcrystal forms the tip is described as pyramidal tetragonal sticks. 本発明の微結晶の形態は顕微鏡検査により簡単に決定される。 Form of fine crystals of the invention are easily determined by microscopic examination.

【0030】 用語「タンパク質」は、その通常の意味(すなわち、アミノ酸のポリマー)を持っていてよい。 [0030] The term "protein", the ordinary meaning (ie, polymers of amino acids) may have a. 本明細書で用いている用語「タンパク質」は、より狭い意味( The term "protein" as used herein, the narrower sense (
すなわち、インスリン、インスリン類似体、およびプロインスリンからなる群から選ばれるタンパク質)も持つ。 In other words, insulin, insulin analogs, and proteins selected from the group consisting of proinsulin) also has. 用語「非誘導体化タンパク質」もインスリン、 The term "non-derivatized protein" also insulin,
インスリン類似体、およびプロインスリンからなる群から選ばれるタンパク質を表す。 Insulin analogues, and represents a protein selected from the group consisting of proinsulin.

【0031】 クレームおよびその他で文脈として用いている用語「総タンパク質」は、タンパク質(インスリン、インスリン類似体、またはプロインスリン)、および誘導体化タンパク質(誘導体化インスリン、誘導体化インスリン類似体、または誘導体化プロインスリン)を混合した量を表す。 The claims and terms used other in a context "total protein" protein (insulin, insulin analog or proinsulin) and derivatized protein (derivatized insulin, derivatized insulin analogs or derivatized, It represents an amount of a mixture of pro-insulin). プロタミンおよび他の知られた錯化化合物も該用語の最も広い意味ではタンパク質であるが、用語「総タンパク質」 Protamine and other known complexing compounds are also proteins in the broadest sense of the term, but the term "total protein"
はそれらを含まない。 It does not include them.

【0032】 用語「誘導体化タンパク質」は、誘導体化タンパク質が非誘導体化タンパク質より水性溶媒中で溶解性が低いか、非誘導体化インスリンより脂溶性が高いようにか、または非誘導体化タンパク質の対応する錯体より溶解性が低い亜鉛およびプロタミンとの錯体を生成するように官能基により誘導体化される誘導体化インスリンおよび誘導体化インスリン類似体からなる群から選ばれるタンパク質を表す。 The term "derivatized protein", or derivatized protein is less soluble in aqueous solvents than the non-derivatized protein, either as lipophilic higher than underivatized insulin, or the corresponding non-derivatized proteins soluble than complexes that represents a protein selected from a low zinc and the group consisting of derivatized insulin and derivatized insulin analogs derivatized with functional groups so as to produce a complex with protamine. タンパク質および誘導体化タンパク質が溶解性であるか、親油性であるかの決定は当業者によく知られている。 Or protein and derivatized protein is soluble, determination of a lipophilic are well known to those skilled in the art. 亜鉛およびプロタミンとの錯体中の誘導体化タンパク質およびタンパク質の溶解性はよく知られた方法[GrahamおよびPomeroy Methods well known solubility of derivatized proteins and protein in complexes with zinc and protamine [Graham and Pomeroy
, J. Pharm. Pharmacol. 36: 427-430(1983)、DeFelippis, MRおよびFrank, , J. Pharm Pharmacol 36:.. 427-430 (1983), DeFelippis, MR and Frank,
B., EP735,048にて改変]、または本明細書で用いている方法により容易に決定することができる。 B., can be readily determined by methods used in the modification, or the specification in EP735,048.

【0033】 インスリンおよびインスリン類似体のベンゾイル、p-トルイル-スルホンアミドカルボニル、およびインドリル誘導体[Havelund, S.ら、W095/07931、1995年3 [0033] Benzoyl of insulin and insulin analogues, p- toluyl - sulfonamide carbonyl, and indolyl derivatives, [Havelund, S., et al., W095 / 07931, 1995 March
月23日公開]、インスリンのアルキルオキシカルボニル誘導体[Geiger, R.ら、米国特許第3,684,791号、1972年8月15日発行、Brandenberg, D.ら、米国特許第3,9 Month 23 Publishing, alkyloxycarbonyl derivatives of insulin [Geiger, R., et al., U.S. Patent No. 3,684,791, issued Aug. 15, 1972, Brandenberg, D., et al., U.S. Patent No. 3,9
07,763号、1975年9月23日発行]、インスリンのアリールオキシカルボニル誘導体 No. 07,763, issued Sep. 23, 1975], aryloxycarbonyl derivatives of insulin
[Brandenberg, D.ら、US3,907,763、1975年9月23日発行]、アルキルカルバミル誘導体[Smyth, DG、米国特許第3,864,325号、1975年2月4日発行、Lindsay, [Brandenberg, D., et al., US3,907,763, issued Sep. 23, 1975], alkyl carbamyl derivatives [Smyth, DG, U.S. Patent No. 3,864,325, issued Feb. 4, 1975, Lindsay,
DGら、米国特許第3,950,517号、1976年4月13日発行]、インスリンのカルバミル、O-アセチル誘導体[Smyth, DG、米国特許第3,864,325号、1975年2月4日発行]、架橋アルキルジカルボキシル誘導体[Brandenberg, D.ら、米国特許第3,9 DG et al., U.S. Patent No. 3,950,517, issued Apr. 13, 1976], insulin carbamyl, O- acetyl derivative [Smyth, DG, U.S. Patent No. 3,864,325, issued Feb. 4, 1975], crosslinked alkyl dicarboxylic derivatives [Brandenberg, D., et al., U.S. Patent No. 3,9
07,763号、1975年9月23日発行]、N-カルバミル、O-アセチル化インスリン誘導体 No. 07,763, issued Sep. 23, 1975], N-carbamyl, O- acetylated insulin derivatives
[Smyth, DG、米国特許第3,868,356号、1975年2月25日発行]、種々のO-アルキルエステル[Markussen, J.、米国特許第4,343,898号、1982年8月10日発行、Mori [Smyth, DG, U.S. Patent No. 3,868,356, issued Feb. 25, 1975], various O- alkyl ester [Markussen, J., U.S. Patent No. 4,343,898, issued Aug. 10, 1982, Mori
hara, K.ら、米国特許第4,400,465号、1983年8月23日発行、Morihara, K.ら、米国特許第4,401,757号、1983年8月30日発行、Markussen, J.、米国特許第4,489,1 hara, K. et al., US Pat. No. 4,400,465, issued Aug. 23, 1983, Morihara, K. et al., US Pat. No. 4,401,757, issued Aug. 30, 1983, Markussen, J., US Patent No. 4,489, 1
59号、1984年12月18日発行、Obermeier, R.ら、米国特許第4,601,852号、1986年 No. 59, issued Dec. 18, 1984, Obermeier, R. et al., US Pat. No. 4,601,852, 1986
7月22日発行、およびAndresen, FHら、米国特許第4,601,979号、1986年7月22 July 22 issue, and Andresen, FH, et al., US Pat. No. 4,601,979, July 1986 22
日発行]、インスリンのアルキルアミド誘導体[Balschmidt, P.ら、米国特許第5, Day Issue, alkylamide derivatives of insulin [Balschmidt, P., et al., U.S. Patent No. 5,
430,016号、1995年7月4日発行]、他の種々のインスリン誘導体[Lindsay, DG No. 430,016, issued Jul. 4, 1995], a variety of other insulin derivatives [Lindsay, DG
、米国特許第3,869,437号、1975年3月4日発行]、および本明細書に記載の脂肪酸アシル化タンパク質を含む、そのような誘導体化タンパク質の多くの例が当該分野で知られている。 , U.S. Patent No. 3,869,437, issued March 4, 1975, and herein includes a fatty acid-acylated protein according, many examples of such derivatized proteins are known in the art.

【0034】 本明細書で用いている用語「アシル化タンパク質」は、有機酸化合物の酸基と該タンパク質のアミノ基の間に形成されるアミド結合を介して該タンパク質と結合している有機酸部分でアシル化されているインスリンおよびインスリン類似体からなる群から選ばれる誘導体化タンパク質を表す。 [0034] herein by reference in the term "acylation protein" organic acid via an amide bond formed between the amino group of the acid group and the protein of the organic acid compound is bound to said protein It represents the derivatized protein selected from the group consisting of insulin and insulin analogues that are acylated at the portion. 一般的には、該アミノ基は該タンパク質のN-末端アミノ酸のα-アミノ基であるか、または該タンパク質のL In general, the amino groups are either α- amino group of N- terminal amino acid of the protein, or the protein L
ys残基のε-アミノ基であってよい。 It may be the ε- amino group ys residues. アシル化タンパク質は、インスリンおよびほとんどのインスリン類似体に存在する3個のアミノ基の1またはそれ以上がアシル化されていてよい。 Acylation protein is 1 or more of the three amino groups that are present in insulin and in most insulin analogs may be acylated. モノ-アシル化タンパク質は、1個のアミノ基がアシル化されている。 Mono - acylated protein is one amino group is acylated. ジ-アシル化タンパク質は2個のアミノ基がアシル化されている。 Di - acylated proteins two amino groups is acylated. トリ-アシル化タンパク質は3個のアミノ基がアシル化されている。 Tri - acylated protein three amino groups are acylated. 有機酸化合物は、例えば、脂肪酸、芳香族酸、タンパク質のアミノ基とアミド結合を形成し、非誘導体化タンパク質と比べて誘導体化タンパク質の亜鉛/プロタミン錯体の溶解性が低下するか、水溶性が低下するか、もしくは親油性が上昇するカルボン酸基を有する他の有機化合物であってよい。 Organic acid compounds, for example, fatty acids, aromatic acids, to form an amide bond with an amino group of the protein, or soluble zinc / protamine complexes of the derivatized protein compared with the underivatized protein is reduced, water solubility or decreased, or may be another organic compound having a carboxylic acid group lipophilicity is increased.

【0035】 用語「脂肪酸-アシル化タンパク質」は、脂肪酸の酸基とタンパク質のアミノ酸の間に形成されるアミド結合を介してタンパク質と結合する脂肪酸でアシル化されているインスリンおよびインスリン類似体からなる群から選ばれるアシル化タンパク質を表す。 The term "fatty acid - acylated protein" consists of insulin and insulin analogs is acylated with a fatty acid that binds to the protein via an amide bond formed between the amino acid group of the fatty acid and protein It represents an acylated protein selected from the group. 一般に、該アミノ酸は、該タンパク質のN-末端アミノ酸のα In general, the amino acid is the N- terminal amino acid of the protein α
-アミノ基であるか、または該タンパク質のLys残基のε-アミノ酸であってよい。 - or an amino group, or a ε- amino acid Lys residue of the protein. 脂肪酸-アシル化タンパク質は、インスリンおよびほとんどのインスリン類似体に存在する3個のアミノ酸の1またはそれ以上がアシル化されていてよい。 Fatty - acylated protein is one or more of the three amino acids present in insulin and in most insulin analogs may be acylated. モノ-アシル化タンパク質は1個のアミノ基がアシル化されている。 Mono - acylated protein one amino group is acylated. ジ-アシル化タンパク質は2個のアミノ基がアシル化されている。 Di - acylated proteins two amino groups is acylated. トリ-アシル化タンパク質は3個のアミノ基がアシル化されている。 Tri - acylated protein three amino groups are acylated. 脂肪酸-アシル化インスリンは日本特許出願第1-254,699号に開示されている。 Fatty - acylated insulin is disclosed in Japanese Patent Application No. 1-254,699. Hashimoto, M.ら、Pharmaceutical Resea Hashimoto, M., et al., Pharmaceutical Resea
rch, 6: 171-176(1989)、およびLindsay, DGら、Biochemical J. 121: 737-7 rch, 6: 171-176 (1989), and Lindsay, DG et al., Biochemical J. 121: 737-7
45(1971)も参照のこと。 45 (1971) See also. 脂肪酸アシル化インスリンおよび脂肪酸アシル化インスリン類似体、ならびにそれらの合成方法のさらなる開示は、Baker, JCら、U. Fatty acylated insulin and fatty acylated insulin analogs, and further disclosure of methods for their synthesis, Baker, JC, et al., U.
S.08/342,931(1994年11月17日出願、1997年12月2日に米国特許第5,693,609号として発行)、Havelund, S.ら、W095/07931(1995年3月23日公開)、および対応米国特許第5,750,497号(1998年5月12日発行)、およびJonassen, I.ら、W096/2 S.08 / 342,931 (11 October 17, 1994 filed, issued as U.S. Patent No. 5,693,609 on December 2, 1997), Havelund, S., et al., W095 / 07931 (published March 23, 1995), and corresponding to US Patent No. 5,750,497 (issued May 12, 1998), and Jonassen, I., et al., W096 / 2
9342(1996年9月26日公開)に見られる。 Seen in 9342 (published on September 26, 1996).

【0036】 用語「脂肪酸-アシル化タンパク質」は、脂肪酸-アシル化タンパク質の医薬的に許容される塩および錯体(コンプレックス)を含む。 The term "fatty acid - acylated protein" fatty - including pharmaceutically acceptable salts and complexes of an acylated protein (complex). 用語「脂肪酸-アシル化タンパク質」は、アシル化タンパク質分子のポピュレーションがアシル化部位もしくは部位(複数)に関して均一であるアシル化タンパク質の調製物も含む。 The term "fatty acid - acylated protein" population of acylated protein molecules including preparations of acylated proteins is uniform in the acylation site or sites (s). 例えば、Nε-モノ-アシル化タンパク質、B1-Nα-モノ-アシル化タンパク質、A1-N For example, Enuipushiron- mono - acylated protein, B1-N @ .alpha mono - acylated protein, A1-N
α-モノ-アシル化タンパク質、A1,B1-Nα-ジ-アシル化タンパク質、Ne,A1-Nα, α- mono - acylated protein, A1, B1-Nα- di - acylated protein, Ne, A1-Nα,
ジ-アシル化タンパク質、Nε,B1-Nα,ジ-アシル化タンパク質、およびNε,A1,B1 Di - acylated protein, Nε, B1-Nα, di - acylated proteins, and Nε, A1, B1
-Nα,トリ-アシル化タンパク質はすべて、本発明の目的において用語「脂肪酸- -Enuarufa, tri - All acylation protein, the term for the purposes of the present invention, "fatty acid -
アシル化タンパク質」内に含まれる。 It included in the acylated protein "within. 該用語はアシル化タンパク質分子ポピュレーションが異種アシル化を有する調製物も表す。 The term also represents the preparation acylated protein molecules populations have different acylation. 後者の場合には、用語「脂肪酸アシル化タンパク質」にはモノアシル化タンパク質とジアシル化タンパク質の混合物、モノアシル化タンパク質とトリアシル化タンパク質の混合物、およびモノアシル化タンパク質と、ジアシル化タンパク質、トリアシル化タンパク質の混合物が含まれる。 In the latter case, the term mixture of monoacylated protein and diacylated proteins in the "fatty acid-acylated protein", a mixture of mono-acylated protein and tri-acylated proteins, and a monoacylated protein, diacylated proteins, mixtures of tri-acylated proteins It is included.

【0037】 本明細書で用いている用語「インスリン」は、アミノ酸配列と特有の構造がよく知られているヒトインスリンを表す。 The term as used herein, "insulin" refers to a human insulin amino acid sequence and the unique structure is well known. ヒトインスリンは、ジスルフィド結合で架橋している21アミノ酸のA鎖と30アミノ酸のB鎖からなる。 Human insulin consists of B-chain of the A-chain and 30 amino acids of the 21 amino acids that are crosslinked by disulfide bonds. 適切に架橋したインスリンは3つのジスルフィド橋を含み、1つ目はA鎖の7位とB鎖の7位間、 Properly crosslinked insulin contains three disulfide bridges, between one eye 7-position of the 7-position and B chains of the A-chain,
2つ目はA鎖の20位とB鎖の19位間、そして3つ目はA鎖の6位と11位間にある。 Between the two eyes 19 of 20 of the B chain of the A-chain, and the third is between the 6- and 11-position of the A-chain.

【0038】 用語「インスリン類似体」は、それぞれヒトインスリンのA鎖およびB鎖と実質的に同じA鎖およびB鎖を有するが、インスリン類似体のインスリン活性を破壊しない1またはそれ以上のアミノ酸の欠失、1またはそれ以上のアミノ酸置換、および/または1またはそれ以上のアミノ酸の付加を有することがヒトインスリンのA鎖およびB鎖とは異なるタンパク質を意味する。 The term "insulin analog" is respectively an A-chain and B-chain is substantially the same as A and B chains of human insulin, do not destroy the insulin activity of the insulin analogue 1 or more amino acids deletions, have one or more amino acid substitutions, and / or adding one or more amino acids refers to protein that differs a and B chains of human insulin.

【0039】 「動物インスリン」は、ヒトインスリンの類似体であるから、本明細書に定義したインスリン類似体である。 [0039] "animal insulin", because an analogue of human insulin, an insulin analogue as defined herein. 4つのそのような動物インスリンは、ウサギ、ブタ、ウシ、およびヒツジインスリンである。 Four such animal insulins, rabbits, pigs, cattle, and sheep insulin. これら動物インスリンをヒトインスリンと区別するアミノ酸置換を読者に便利なように以下に示す。 These animals insulin below for convenience to the reader to distinguish amino acid substitutions with human insulin.

【0040】 [0040]

【0041】 別のタイプのインスリン類似体である「単量体インスリン類似体」は当該分野でよく知られている。 [0041] is a different type of insulin analogues "monomeric insulin analog" are well known in the art. 単量体インスリン類似体は、ヒトインスリンと構造的に非常に似ており、ヒトインスリンと同様または同じ活性を有するが、より高い凝集状態に結びつく傾向が低くなる二量体化および六量体化に必要な接触を妨げる傾向がある1またはそれ以上のアミノ酸の欠失、置換もしくは付加を有する。 Monomeric insulin analogues are very similar to human insulin structurally, has a similar or the same activity as human insulin, dimerization and hexamer conjugated tend to lead to higher state of aggregation becomes lower 1 or more amino acid deletion that tend to interfere with the necessary contact has a substitution or addition. 単量体インスリン類似体は急速に作用するヒトインスリン類似体であり、例えばChan Monomeric insulin analog is human insulin analogue that acts quickly, for example, Chan
ce, REら、米国特許第5,514,646号(1996年5月7日);Brems, DNら、Protein ce, RE et al., US Pat. No. 5,514,646 (May 7, 1996); Brems, DN et al., Protein
Engineering, 5: 527-533(1992); Brange, JJVら、EPO公開公報第214,826( Engineering, 5: 527-533 (1992); Brange, JJV et, EPO Publication No. 214,826 (
1987年3月18日公開);Brange, JJVら、米国特許第5,618,913号(1997年4月8 Published March 18, 1987); Brange, JJV, et al., US Pat. No. 5,618,913 (April 1997 8
日);およびBrange, J.ら、Current Opinion in Structural Biology 1: 934-94 Day); and Brange, J., et al., Current Opinion in Structural Biology 1: 934-94
0(1991)に開示されている。 It has been disclosed to 0 (1991). 単量体インスリン類似体の例は、B28位のProがAsp、 Examples of the monomeric insulin analogues, B28 Pro at position is Asp,
Lys、Leu、Val、またはAlaで置換され、B29位のLysがLysであるかまたはProで置換されているヒトインスリン、ならびにAlaB26-ヒトインスリン、デス(B28-B30) Lys, Leu, substituted Val or Ala,, human insulin Lys at position B29 is substituted with or Pro is Lys, and AlaB26- human insulin, des (B28-B30)
-ヒトインスリン、およびデス(B27)-ヒトインスリンとして記載されている。 - human insulin, and des (B27) - have been described as human insulin. 本結晶において誘導体として用いるか、または懸濁化製剤の溶液相で誘導体化されずに用いられる単量体インスリン類似体は、ヒトインスリンと同じ位置で適切に架橋している。 Monomeric insulin analogs for use without being derivatized in the solution phase of use or suspending formulation as derivatives in the present crystals are properly cross-linked at the same position as human insulin.

【0042】 本発明に用いるインスリン類似体の別の群は、等電点が約7.0〜約8.0であるインスリン類似体である。 [0042] Another group of insulin analogs for use in the present invention, isoelectric point of the insulin analog is between about 7.0 to about 8.0. これら類似体は、「pIシフトしたインスリン類似体と呼ばれる。そのようなインスリン類似体の例には、ArgB31,ArgB32-ヒトインスリン、GlyA21,ArgB31,ArgB32-ヒトインスリン、ArgAO, ArgB31, ArgB32-ヒトインスリン、およびArgAO,GlyA21,ArgB31,ArgB32-ヒトインスリンが含まれる。 These analogs are referred to as insulin analogues and "pI shift. Examples of such insulin analogues, ArgB31, ArgB32- human insulin, GlyA21, ArgB31, ArgB32- human insulin, ArgAO, ArgB31, ArgB32- human insulin and ArgAO, GlyA21, ArgB31, include ArgB32- human insulin.

【0043】 インスリン類似体の別の群は、該分子の活性を有意に妨げない1またはそれ以上のアミノ酸の欠失を有するインスリン類似体からなる。 [0043] Another group of insulin analogs consists of insulin analogs with deletion of one or more amino acids do not interfere significantly molecule activity. この群のインスリン類似体は、本明細書では「欠失類似体」として示している。 Insulin analogues of this group is shown as "deletion analogs" herein. 例えば、B1-B3位の1 For example, 1 at position B1-B3
またはそれ以上のアミノ酸の欠失を有するインスリン類似体は活性である。 Or insulin analogues having a deletion of more amino acids are active. 同様に、B28-B30位の1またはそれ以上のアミノ酸の欠失を有するインスリン類似体は活性である。 Similarly, insulin analogs with deletion of one or more amino acids of B28-B30 position is active. 「欠失類似体」の例にはデス(B30)-ヒトインスリン、デスPhe(B1 Des (B30) is an example of "deletion analogs" - human insulin, death Phe (B1
)-ヒトインスリン、デス(B27)-ヒトインスリン、デス(B28-B30)-ヒトインスリン、およびデス(B1-B3)-ヒトインスリンが含まれる。 ) - human insulin, des (B27) - human insulin, des (B28-B30) - human insulin, and des (B1-B3) - include human insulin. 本結晶において誘導体として用いるか、または懸濁製剤の溶液相中で誘導体化されずに用いる欠失類似体は、 Deletion analogs employed without being derivatized in the solution phase of use, or suspension formulation as derivatives in the present crystals,
ヒトインスリンと同じ位置で適切に架橋している。 They are properly cross-linked at the same position as human insulin.

【0044】 インスリン中のアミド化アミノ酸、特にアスパラギン残基は、化学的に不安定であることが知られている [Jorgensen, KHら、米国特許第5,008,241号(1991 The amidation amino acid in insulin, particularly asparagine residues, known to be chemically unstable [Jorgensen, KH et al., U.S. Pat. No. 5,008,241 (1991
年4月16日発行);Dorschug, M.、米国特許第5,656,722号(1997年8月12日]。詳細には、それらは、よく知られたある種の条件下で脱アミド化および種々の再配列反応を生じる傾向がある。したがって、所望によりインスリン類似体は、化学安定性を得るために1またはそれ以上のアミド化残基が他のアミノ酸で置換されたインスリンまたはインスリン類似体であってよい。例えば、AsnまたはGlnは非アミド化アミノ酸で置換されていてもよい。AsnまたはGlnの好ましいアミノ酸置換は、Gly、Ser、Thr、Asp、またはGluである。1またはそれ以上のAsn残基を置換することが好ましい。詳細には、AsnAl8、AsnA21、もしくはAsnB3、またはそれら残基のあらゆる組合せを、例えば、Gly、Asp、またはGluで置換してよい。 April 16th issue);. Dorschug, M., U.S. Pat. No. 5,656,722 (Aug. 12, 1997] Specifically, they are a well-known certain conditions deamidation and various tend to produce a rearrangement reaction. Thus, if desired insulin analogue is an insulin or insulin analogue is substituted one or more amidation residues with other amino acids in order to obtain chemical stability good. for example, Asn or Gln is preferred amino acid substitutions of non-amidated amino acid may be substituted with .Asn or Gln is, Gly, Ser, Thr, Asp or .1 or more Asn residues are Glu, it is preferable to replace. in particular, AsnAl8, AsnA21, or AsnB3, or any combination thereof residues, for example, may be substituted Gly, Asp, or Glu,.
また、GlnA15もしくはGlnB4、またはその両方をAspまたはGluのいずれかで置換してよい。 Also, GlnA15 or GlnB4, or both may be substituted by either Asp or Glu. 好ましい置換は、B21位のAspおよびB3のAspである。 Preferred substitutions are Asp at B21 position Asp and B3. タンパク質分子の荷電を変化させない置換も好ましく、AsnまたはGlnの中性アミノ酸による置換も好ましい。 Also preferred substitutions that do not change the charge of the protein molecules, preferably also substituted by a neutral amino acid Asn or Gln.

【0045】 用語「プロインスリン」は、インスリンの前駆体である1本鎖ペプチド分子を表す。 The term "proinsulin" refers to a single-chain peptide molecule that is a precursor of insulin. プロインスリンを、化学反応、もしくは好ましくは酵素触媒反応によりインスリンまたはインスリン類似体に変換してよい。 Proinsulin, chemical reaction, or preferably may be converted to insulin or an insulin analogue by enzymatic catalysis. プロインスリンでは、下記のごとく適切なジスルフィド結合が形成される。 In proinsulin, proper disulfide bonds are formed as described below. プロインスリンは、インスリンもしくはインスリン類似体、および連結用の結合もしくは連結用ペプチドを含む。 Proinsulin, insulin or insulin analogues, and a coupling or linking peptide for linking.
連結用ペプチドは1〜約35アミノ酸を有する。 Connecting peptide has from 1 to about 35 amino acids. 連結用の結合もしくは連結用ペプチドは、α-アミド結合および2つのα-アミド結合によりそれぞれA鎖の末端アミノ酸およびB鎖末端アミノ酸と結合する。 Coupling or linking peptide for coupling, respectively binding to a terminal amino acid and B-chain terminal amino acid of the A chain by α- amide bond and two α- amide bond. 好ましくは、連結用ペプチド中のアミノ酸はシステインではない。 Preferably, the amino acids in the connecting peptide is not a cysteine. 好ましくは、連結用ペプチドのC末端アミノ酸はL Preferably, C-terminal, the amino acid of the connecting peptide L
ysまたはArgである。 It is a ys or Arg. プロインスリンは、式:XBCAYまたは式:XACBYを有していてよい(ここで、Xは水素であるか、C末端アミノ酸がLysもしくはArgのいずれかである1〜約100アミノ酸のペプチドである。Yはヒドロキシであるか、N Proinsulin, the formula: XBCAY or formula: XACBY have it (here have, X represents either a hydrogen, C-terminal amino acid is a peptide of from 1 to about 100 amino acids is either Lys or Arg. or Y is hydroxy, N
-末端アミノ酸がLysまたはArgのいずれかである1〜約100アミノ酸のペプチドである。 - terminal amino acid is a peptide of from 1 to about 100 amino acids is either Lys or Arg. AはインスリンのA鎖またはインスリン類似体のA鎖であり、Cは、1〜約3 A is the A chain of A chain or insulin analogue insulin, C is 1 to about 3
5アミノ酸(そのいずれもシステインではない)のペプチドであり、C末端アミノ酸がLysまたはArgであり、BはインスリンのB鎖またはインスリン類似体のB鎖である。 5 amino acids and peptides of (the one not cysteine ​​also), a C-terminal amino acid is Lys or Arg, B is the B chain of insulin B chain or insulin analogue. )。 ).

【0046】 「医薬的に許容される塩」は、タンパク質中の1またはそれ以上の荷電基と、 [0046] "Pharmaceutically acceptable salt" includes one or more charged groups in the protein,
あらゆる1またはそれ以上の医薬的に許容される無毒性カチオンもしくはアニオンの間に形成される塩を意味する。 It means a salt formed between any one or more pharmaceutically acceptable non-toxic cations or anions. 有機塩および無機塩には、例えば酸、例えば、塩酸、硫酸、スルホン酸、酒石酸、フマル酸、臭化水素酸、グリコール酸、クエン酸、マレイン酸、リン酸、コハク酸、酢酸、硝酸、安息香酸、アスコルビン酸、p-トルエンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ナフタレンスルホン酸、プロピオン酸、カルボン酸など、または例えばアンモニウム、ナトリウム、カリウム、カルシウム、もしくはマグネシウムから製造される塩が含まれる。 The organic and inorganic salts, such as acid, e.g., hydrochloric, sulfuric, sulfonic, tartaric, fumaric, hydrobromic, glycolic, citric acid, maleic acid, phosphoric acid, succinic acid, acetic acid, nitric acid, benzoic acid, ascorbic acid, p- toluenesulfonic acid, benzenesulfonic acid, naphthalenesulfonic acid, propionic acid, such as carboxylic acid, or for example, ammonium, sodium, potassium, salts prepared from calcium or magnesium.

【0047】 用語「アシル化する」は、タンパク質のアミノ基と脂肪酸の間にアミド結合を形成することを意味する。 [0047] "acylated" term is meant to form an amide bond between the amino groups and fatty acids of the protein. タンパク質は、その1またはそれ以上のアミノ基が脂肪酸の酸基とアミド結合で結合する時「アシル化」される。 Protein, the one or more amino groups is "acylated" when bonded with an acid group and an amide bond of a fatty acid. 用語「脂肪酸」は、炭素数1〜18の飽和もしくは不飽和の、直鎖もしくは分岐鎖脂肪酸を意味する。 The term "fatty acid" is a saturated or unsaturated C1-18, means a straight-chain or branched-chain fatty acids. 用語「C1-C18脂肪酸」は、炭素数1〜18の飽和直鎖もしくは分岐鎖脂肪酸を表す。 The term "C1-C18 fatty acid" refers to a saturated straight or branched chain fatty acid having 1 to 18 carbon atoms.

【0048】 用語「二価金属カチオン」は、種々のタンパク質分子と錯体を形成するのに参加するイオンまたはイオン(複数)を表す。 The term "divalent metal cation" refers to a ion or ions (s) to participate in forming a variety of protein molecules and complexes. 遷移金属、アルカリ金属、およびアルカリ土類金属は、インスリンと錯体を形成することが知られている金属の例である。 Transition metals, alkali metals, and alkaline earth metals are examples of metals that are known to form an insulin complex. 遷移金属が好ましい。 Transition metals are preferred. 亜鉛が特に好ましい。 Zinc is particularly preferred. インスリンタンパク質と錯体を形成するのに医薬的に許容される他の遷移金属は銅、コバルト、および鉄である。 Other transition metal pharmaceutically acceptable to form the insulin protein complexes are copper, cobalt, and iron.

【0049】 用語「コンプレックス」は本発明では2つの意味を有する。 [0049] The term "complex" is in the present invention has the meaning of the two. 1つ目は、該用語は、錯体を形成するタンパク質の1またはそれ以上の原子と1またはそれ以上の二価の金属カチオンとの間に形成される錯体を表す。 First, the term represents a complex formed between one or more atoms and one or more divalent metal cations of proteins that form a complex. 該タンパク質中の原子は電子提供リガンドとして働く。 Atoms of the protein acts as an electron providing ligands. 該タンパク質は典型的には二価遷移金属カチオンと六量体の錯体を形成する。 The protein typically form a complex of a divalent transition metal cation and hexamer. 本発明における「コンプレックス」の2つ目の意味は、コンプレックス形成化合物と六量体の間の結合である。 The second meaning of "complex" in the present invention is a bond between the complex-forming compound and hexamer. 「コンプレックス形成(complexing)化合物」は、典型的には、不溶性組成物中の六量体と結合するか、またはコンプレックスを形成する種々の正の荷電を持つことにより溶解に対して安定化させる有機分子である。 "Complex formation (complexing) compounds" are typically organic stabilized against dissolution by having various positive charge to form either binds hexameric insoluble composition, or a complex it is a molecule. 本発明において安定なコンプレックス形成化合物の例には、プロタミン、スルフェン、種々のグロビンタンパク質[Brange, J., Examples of stable complex forming compound in the present invention, protamine, sulfenic, various globin proteins [Brange, J.,
Galenics of Insulin, Springer-Verlag, Berlin Heidelberg(1987)]、およびインスリンとコンプレックスを形成することが知られている種々の多カチオン性ポリマー化合物が含まれる。 Galenics of Insulin, Springer-Verlag, Berlin Heidelberg (1987)], and to complex with the insulin is includes various polycationic polymer compounds known.

【0050】 用語「プロタミン」は、魚精子由来の強塩基性タンパク質の混合物を表す。 [0050] The term "protamine" refers to a mixture of strongly basic proteins from fish sperm. プロタミン中の該タンパク質の平均分子量は約4,200である [Hoffmann, JAら、P Average molecular weight of the proteins in protamine is about 4,200 [Hoffmann, JA, et al., P
rotein Expression and Purification, 1:127-133(1990)]。 rotein Expression and Purification, 1: 127-133 (1990)]. 「プロタミン」は、 "Protamine" is,
しばしば「プロタミン塩基」と呼ばれる該タンパク質の比較的塩を含まない調製物を表すことができる。 Often it is possible to represent the preparation that is relatively free of salts of the proteins, called "protamine base." プロタミンは、該タンパク質の塩からなる調製物も表す。 Protamine also refers preparation consisting of a salt of the protein. 市販の調製物は塩含有量が大きく異なる。 Commercial preparations vary greatly salt content.

【0051】 プロタミンはインスリンの技術分野の当業者によく知られており、現在NPHインスリン生成物に含まれている。 [0051] protamine are well known to those skilled in the art of insulin, it has been included in the current NPH insulin products. プロタミン混合物のみならずプロタミンの純粋な分画を本発明に使用できる。 The pure fractions protamine not protamine mixture can only be used in the present invention. しかしながら、市販のプロタミン調製物は典型的には存在するタンパク質に関して均質でない。 However, not homogeneous with respect to protein commercial protamine preparations that would typically exist. それにも関わらず、これらは本発明において有効である。 Nevertheless, it is effective in the present invention. プロタミン塩基からなるプロタミンは、プロタミンの塩からなるプロタミン調製物、およびプロタミン塩基とプロタミン塩の混合物であるプロタミン調製物同様に本発明において有効である。 Protamine comprised of protamine base is protamine preparations a salt of protamine, and is effective in protamine preparations likewise present invention is a mixture of protamine base and protamine salts. プロタミンサルフェートは頻繁に用いられるプロタミン塩である。 Protamine sulfate is frequently protamine salts used. プロタミンに関する全ての質量比はプロタミン遊離塩基について得られる。 All mass ratio for protamine obtained for protamine free base. 当業者は、プロタミンに関する特定の質量比を満たす他のプロタミン調製物の量を決定することができる。 Those skilled in the art can determine the amount of other protamine preparations that meet a specific mass ratio for protamine.

【0052】 用語「サスペンジョン(懸濁液)」は、コロイドサイズより大きい不溶性もしくはやや溶けにくい粒子からなる固相と液相の混合物を表す。 The term "suspension (suspension)" refers to a mixture of solid and liquid phases consisting of a large insoluble or sparingly soluble particles from the colloidal size. NPH微結晶と水性溶媒の混合物はサスペンジョンを形成する。 NPH microcrystals and an aqueous mixture solvent to form a suspension. 用語「サスペンジョン(懸濁)製剤」は、活性物質が水性溶媒に微細に分散している固相、例えば微結晶固体、非晶質沈殿物、またはその両方に存在している医薬組成物を表す。 The term "suspension (suspension) formulation" denotes a solid phase in which the active substance is dispersed finely in an aqueous solvent, such as microcrystalline solid, an amorphous precipitate, or a pharmaceutical composition present in both . 微細に分散した固体は、混合物を静かに攪拌する動作により水性溶媒全体に完全に均一になるように懸濁させ、投与容量を抽出するのに適切な均一さを持つサスペンジョンを提供する。 The solid was finely dispersed, the mixture gently suspended at completely uniform throughout the aqueous solvent by the action of stirring and provides a suspension with appropriate uniformity to extract the dose volume. 市販されているインスリンサスペンジョン製剤の例には、例えばNPH、PZI Examples of insulin suspension formulations are commercially available, for example NPH, PZI
、およびUltralente(ウルトラレンテ)が含まれる。 , And it included Ultralente (Ultra Lente) is. 微結晶サスペンジョン製剤中の低比率の固体物質は非晶質であってよい。 Low proportion of solid material in microcrystalline suspension formulation may be amorphous. 好ましくは、非晶質物質の割合は、微結晶サスペンジョン中の固体物質の10%以下、最も好ましくは1%以下である。 Preferably, the proportion of amorphous material, 10% of the solid material in microcrystalline suspension, and most preferably no more than 1%. 同様に、非晶質沈殿物サスペンジョン中の低比率の固体物質が微結晶であってよい。 Similarly, low proportion of solid material in the amorphous precipitate suspension may be microcrystalline.

【0053】 「NPHインスリン」は、インスリンの「Neutral Protamine Hagedorn(中性プロタミンハーゲドルン)」製剤を表す。 [0053] "NPH insulin", represents a "Neutral Protamine Hagedorn (neutral protamine Hage dollar down)" formulations of insulin. 同意語には、他にも多々あるがヒトインスリンNPHおよびインスリンNPHが含まれる。 The synonym, other there are many also include but are human insulin NPH and insulin NPH. Humulins(ヒュームリン)(登録商標)NはNPHインスリンの市販製剤である。 Humulins (Hume phosphorus ®) N is a commercial preparation of NPH insulin. 関連用語は、LysB28, ProB29-ヒトインスリン類似体を表す「NPL」である。 Related terms, LysB28, is "NPL" representing ProB29- human insulin analogue. これら用語の意味、およびそれらの製造方法はインスリン製剤の技術分野の当業者によく知られているだろう。 The meaning of these terms, and methods for their preparation will be familiar to those skilled in the art of insulin preparations.

【0054】 用語「水性溶媒」は、水を含む水性溶媒を表す。 [0054] The term "aqueous solvent" refers to the aqueous solvent containing water. 水性溶媒系は、水のみからなっていてもよく、水と1またはそれ以上の混和性溶媒からなっていてもよく、また溶質を含んでいてよい。 Aqueous solvent systems may consist of water alone, water and may be composed of one or more miscible solvents, and may contain solutes. より普通に用いられる混和性溶媒は短鎖有機アルコール、例えばメタノール、エタノール、プロパノール、短鎖ケトン、例えばアセトン、およびポリアルコール、例えばグリセロールである。 More usually miscible solvent used is a short-chain organic alcohols, such as methanol, ethanol, propanol, short-chain ketones, such as acetone, and poly alcohols, such as glycerol.

【0055】 「等張性物質」とは、生理学的に許容され、投与した製剤と接触している細胞膜を通過する正味の水の流れを防ぐように製剤に適切な張性を与える化合物である。 [0055] The term "isotonic agent" physiologically acceptable is the compound giving suitable tonicity to the formulation to prevent the flow of water net across cell membranes that are in contact with the administered formulation . グリセリンとしても知られるグリセロールが等張性物質として普通に用いられる。 Glycerol also known as glycerol is commonly used as the isotonic agent. 他の等張性物質には、塩、例えば塩化ナトリウム、および単糖類、例えばデキストロースおよびラクトースが含まれる。 Other isotonic agents, salts, such as sodium chloride, and monosaccharides, e.g., dextrose and lactose.

【0056】 本発明の結晶および共結晶は、六量体安定化化合物を含む。 [0056] crystals and co-crystals of the present invention comprises a hexameric stabilizing compound. 用語「六量体安定化化合物」は、六量体に結合した状態のタンパク質または誘導体化タンパク質を安定化する非タンパク質性の低分子化合物を表す。 The term "hexamer stabilizing compound" refers to a low molecular compound of a non-proteinaceous stabilizing the protein or derivatized protein in a state bound to the hexamer. フェノール性化合物、特にフェノール性保存剤がインスリンおよびインスリン誘導体用の最もよく知られた安定化化合物である。 Phenolic compounds, in particular the best known stabilizing compounds of a phenolic preservative for insulin and insulin derivatives. 六量体安定化化合物は、特異的な分子間接触により六量体と結合することにより六量体を安定化する。 Hexamer stabilizing compounds stabilize the hexamer by binding to hexameric by contact between specific molecules. 六量体安定化剤の例には、種々のフェノール性化合物、フェノール性保存剤、レゾルシノール(resorcinol)、4'-ヒドロキシアセトアニリド、4-ヒドロキシベンザミド、および2,7-ジヒドロキシナフタレンが含まれる。 Examples of hexamer stabilizing agent, various phenolic compounds, phenolic preservatives, resorcinol (resorcinol), 4'-hydroxyacetanilide, 4-hydroxy benzylalkonium bromide, and 2,7-dihydroxynaphthalene. 本発明の不溶性組成物の多使用製剤は、六量体安定化化合物に加えて保存剤を含むであろう。 Multi-use preparations insoluble compositions of the present invention will contain a preservative, in addition to a hexamer stabilizing compound. 本発明製剤に用いる保存剤は、フェノール性保存剤であってよく、また六量体安定化化合物と同じかもしくは異なっていてよい。 Preservatives for use in the present invention the formulation may be a phenolic preservative, and may be the same or different and hexamer stabilizing compound.

【0057】 用語「保存剤」は、医薬製剤に抗菌剤として作用するように加える化合物を表す。 The term "preservative" refers to a compound added to act as an antimicrobial agent in the pharmaceutical formulation. 非経口用製剤は、市販の多使用生成物であるための保存剤の有効性に関する指針に適合しなければならない。 Parenteral formulations must be compatible with the guidelines on the efficacy of the preservative is a commercial multi-use product. 非経口用製剤において有効で許容される当該分野で知られる保存剤には、塩化ベンザルコニウム、ベンゼトニウム、クロロヘキシジン、フェノール、m-クレゾール、ベンジルアルコール、メチルパラベン、クロロブタノール、o-クレゾール、p-クレゾール、クロロクレゾール、硝酸フェニル水銀、チメロサール、安息香酸、およびその種々の混合物がある。 Preservatives known in the art to be effective acceptable in parenteral formulations, benzalkonium chloride, benzethonium, chlorohexidine, phenol, m- cresol, benzyl alcohol, methyl paraben, chlorobutanol, o- cresol, p- cresol , chlorocresol, phenylmercuric nitrate, thimerosal, benzoic acid, and various mixtures thereof. 例えば、Wa For example, Wa
llhaeusser, K.-H., Develop. Biol. Standard, 24: 9-28(1974)(S. Krager, Ba llhaeusser, K.-H., Develop Biol Standard, 24:... 9-28 (1974) (S Krager, Ba
sel)参照。 sel) reference.

【0058】 用語「フェノール性保存剤」には、化合物フェノール、m-クレゾール、o-クレゾール、p-クレゾール、クロロクレゾール、メチルパラベン、およびその混合物が含まれる。 [0058] The term "phenolic preservative" is a compound phenol, m- cresol, include o- cresol, p- cresol, chlorocresol, methylparaben, and mixtures thereof. ある種のフェノール性保存剤、例えば、フェノールおよびm-クレゾールは、インスリン様分子と結合して物理安定性もしくは化学安定性またはその両方を増大させる構造的変化を誘導することが知られている [Birnbaum, DT, Certain phenolic preservatives, such as phenol and m- cresol, to induce structural changes that binds to insulin-like molecules increase the physical stability or chemical stability, or both are known [ Birnbaum, DT,
et al., Pharmaceutical. Res. 14: 25-36(1997); Rahuel-Clermont, S., et a et al, Pharmaceutical Res 14:... 25-36 (1997); Rahuel-Clermont, S., et a
l., Biochemistry 36: 5837-5845(1997)]。 . L, Biochemistry 36: 5837-5845 (1997)].

【0059】 用語「緩衝剤」または「医薬的に許容される緩衝剤」は、インスリン製剤に用いるのに安全なことが知られており、該製剤に望ましいpHに製剤のpHを調節する効果を有する化合物を表す。 The term "buffer" or "pharmaceutically acceptable buffer", for use in insulin formulations is known to be safe, the effect of adjusting the pH of the formulation to pH desired for the formulation It represents a compound having. 本発明製剤のpHは約6.0〜約8.0である。 pH of the present invention the formulation is from about 6.0 to about 8.0. 本発明製剤はpH約6.8〜約7.8であることが好ましい。 It is preferred inventive formulation is about pH 6.8 to about 7.8. pHを穏やかな酸性pH〜穏やかな塩基性 Mildly acidic pH~ mildly basic to pH
pHに調節するための医薬的に許容される緩衝剤には、ホスフェート、アセテート、シトレート、アルギニン、トリス、およびヒスチジンといった化合物が含まれる。 Pharmaceutically acceptable buffers for regulating the pH, phosphate, acetate, citrate, arginine, TRIS, and compounds such as histidine. 「トリス」は、2-アミノ-2-ヒドロキシメチル-1,3,-プロパンジオール、およびそのあらゆる医薬的に許容される塩を表す。 "Tris" is 2-amino-2-hydroxymethyl-1,3, - represents propanediol, and all its pharmaceutically acceptable salts. 遊離塩基および塩酸形がトリスの普通の2つの形である。 Free base and hydrochloride forms are usually two forms of Tris. トリスは、当該分野ではトリメチルオールアミノメタン、トロメタミン、およびトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタンとしても知られている。 Tris is in the art also known as tri methylol aminomethane, tromethamine, and tris (hydroxymethyl) aminomethane. 医薬的に許容される、pHを所望のレベルに調節するのに適した他の緩衝剤は通常の技術を有する化学者に知られている。 Pharmaceutically acceptable, other buffers suitable for adjusting the pH to the desired level are known to chemists of ordinary skill.

【0060】 用語「投与する」は、病気または病状を処置するために、本発明製剤を、それを必要とする患者の体内に導入することを意味する。 The term "administering" to treat a disease or condition, the present invention formulation, means introducing into the body of a patient in need thereof. 用語「治療(処置)すること(treating)」は、糖尿病もしくは高血糖の患者、または病状の症状もしくは合併症に対処し、軽減するためにインスリン投与が必要な他の病状を有する患者の処置(management)および管理(care)を表す。 The term "treatment to (Treating)" is diabetes or hyperglycemia patient or to deal with the symptoms or complications of the condition, the treatment of patients with other conditions requiring insulin administration to alleviate ( management) and management representing the (care).
治療することには、症状または合併症の発症を予防し、症状もしくは合併症を軽減するか、病気、病状、もしくは障害を除去するために本発明製剤を投与することが含まれる。 To treatment to prevent the onset of the symptoms or complications, or alleviating the symptoms or complications, it includes administering disease, condition, or the present invention formulated to remove the fault.

【0061】 用語「MMAD」および「MMEAD」は当該分野でよく知られており、それぞれ「質量中央空力的直径(mass median aerodynamic diameter)」および質量中央等価空力的直径(mass median equivalent aerodynamic diameter)」を表す。 The term "MMAD" and "MMEAD" are well known in the art, are "mass median aerodynamic diameter (mass median aerodynamic diameter)" and mass median equivalent aerodynamic diameter (mass median equivalent aerodynamic diameter) " a representative. 該用語は実質的に等価である。 The term is substantially equivalent. 粒子の「空力的等価」サイズは、実際の密度や形に関わらず、該粒子と同じ空力(空気力学)的挙動を示す単位密度球状物の直径である。 "Aerodynamic equivalent" size of the particles, regardless of the actual density or shape, the diameter of a unit density sphere which exhibits the same aerodynamic (aerodynamic) behavior and particles. MMADをカスケードインパクターを用いて測定し、高速気流中の粒子の空力的挙動の作用として粒子サイズを求める。 MMAD was determined using a cascade impactor, determine the particle size as a function of the aerodynamic behavior of the particles of the high-speed air stream. 中央(50%)粒子サイズを、累積分布データの線形回帰分析から得る。 A central (50%) particle size, obtained from linear regression analysis of the cumulative distribution data. 用語「VMSED」は、「容積平均球形等価直径」を表す。 The term "VMSED" represents "volume mean spherical equivalent diameter". この用語は粒子サイジングの分野でよく知られている。 This term is well known in the field of particle sizing.

【0062】 本発明の結晶および共結晶は、棒状形態かまたは不規則な形態を持つ。 [0062] crystals and co-crystals of the present invention has a rod-like form or irregular form. 好ましくは、該結晶および共結晶は、アシル化インスリンまたはアシル化インスリン類似体、亜鉛イオン(総タンパク質1モルあたり約0.3〜約0.7モルで存在する)、 Preferably, the crystals and co-crystals, acylated insulin or acylated insulin analog, (present at about 0.3 to about 0.7 moles per mole of total protein) of zinc ions,
およびフェノール、m-クレゾール、o-クレゾール、p-クレゾール、クロロクレゾール、およびそれらの混合物からなる群から選ばれる、総タンパク質T3R3もしくはR6六量体構造を安定化するために総タンパク質に対して充分な割合で存在するフェノール性保存剤、およびプロタミン(約0.15〜約0.7mg/3.5mg 総タンパク質で存在する)からなる。 And phenol, m- cresol, o- cresol, p- cresol, chlorocresol, and is selected from the group consisting of a mixture thereof, sufficient for total protein to stabilize the total protein T3R3 or R6 hexamer structure phenolic preservative present in such proportions, and protamine (present in from about 0.15 to about 0.7 mg / 3.5 mg total protein).

【0063】 結晶および共結晶を形成するのに用いる誘導体化インスリン類似体を製造するためのインスリン類似体の好ましい群は、動物インスリン、欠失類似体、および [0063] A preferred group of insulin analogs for preparing derivatized insulin analogs used to form the crystals and co-crystals, animal insulin, deletion analogs, and
pI-シフト(shifted)類似体からなる。 pI- a shift (shifted) analogues. より好ましい群は、動物インスリン、および欠失類似体からなる。 More preferred group consists of animal insulin, and deletion analogs. 欠失類似体がさらに好ましい。 Deletion analogues are more preferred.

【0064】 本発明の結晶および共結晶に用いるインスリン類似体の別の好ましい群は、単量体インスリン類似体からなる。 [0064] Another preferred group of insulin analogs for use in the crystals and co-crystals of the present invention consists of monomeric insulin analogs. B28位のアミノ酸残基がAsp、Lys、Leu、Val、 Wherein the amino acid residue in position B28 is Asp, Lys, Leu, Val,
またはAlaであり、B29位のアミノ酸残基がLysまたはProであり、B10位のアミノ酸残基がHisまたはAspであり、B1位のアミノ酸残基がPhe、Aspであるか、または欠失しており(単独にかもしくはB2位の該残基の欠失と一緒になっている)、B3 Or is Ala, B29 of the amino acid residue is Lys or Pro, the amino acid residue of the B10 position is is His or Asp, B1 of the amino acid residues Phe, whether it is Asp, or deleted in cage (the deletion of the residues of alone on whether or B2 place are together), B3
0位のアミノ酸残基がThr、Ala、Serであるか、または欠失しており、B9位のアミノ酸残基がSerまたはAspである(ただし、B28またはB29位のいずれかがLysである)単量体インスリン類似体が特に好ましい。 0 of the amino acid residue is Thr, Ala, or is Ser, or is deleted, the amino acid residues of the B9-position is Ser or Asp (However, one of the B28 or B29-position is a Lys) monomeric insulin analogues are particularly preferred.

【0065】 本発明に用いるインスリン類似体の別の好ましい群は、インスリン類似体の等電点が約7.0〜約8.0であるものである。 [0065] Another preferred group of insulin analogs for use in the present invention are those isoelectric point of the insulin analog is between about 7.0 to about 8.0. これら類似体は、「pI-シフトしたインスリン類似体」という。 These analogs are referred to as "pI- shifted insulin analogs." pI-シフトしたインスリン類似体には、例えばArgB31,Ar pI- shifted insulin analogs, for example ArgB31, Ar
gB32-ヒトインスリン、GlyA21,ArgB31,ArgB32-ヒトインスリン、ArgAO,ArgB31,A gB32- human insulin, GlyA21, ArgB31, ArgB32- human insulin, ArgAO, ArgB31, A
rgB32-ヒトインスリン、およびArgAO,GlyA21,ArgB31,ArgB32-ヒトインスリンが含まれる。 rgB32- human insulin, and ArgAO, GlyA21, ArgB31, include ArgB32- human insulin.

【0066】 インスリン類似体の別の好ましい群は、LysB28,ProB29-ヒトインスリン(B28は [0066] Another preferred group of insulin analogues, LysB28, ProB29- human insulin (B28 is
Lysである、B29はProである)、AspB28-ヒトインスリン(B28はAspである)、AspB1 Is Lys, B29 is Pro), AspB28- human insulin (B28 is Asp), AspB1
-ヒトインスリン、ArgB31,ArgB32-ヒトインスリン、ArgAO-ヒトインスリン、Asp - human insulin, ArgB31, ArgB32- human insulin, ArgAO- human insulin, Asp
B1,GluB13-ヒトインスリン、AlaB26-ヒトインスリン、GlyA21-ヒトインスリン、 B1, GluB13- human insulin, AlaB26- human insulin, GlyA21- human insulin,
デス(ThrB30)-ヒトインスリン、およびGlyA21,ArgB31,ArgB32-ヒトインスリンからなる。 Des (ThrB30) - human insulin, and GlyA21, ArgB31, consisting ArgB32- human insulin.

【0067】 特に好ましいインスリン類似体には、LysB28,ProB29-ヒトインスリン、デス(T [0067] Particularly preferred insulin analog, LysB28, ProB29- human insulin, des (T
hrB30)-ヒトインスリン、AspB28-ヒトインスリン、およびAlaB26-ヒトインスリンが含まれる。 hrB30) - include human insulin, AspB28- human insulin, and AlaB26- human insulin. 別の特に好ましいインスリン類似体は、GlyA21,ArgB31,ArgB32- Another particularly preferred insulin analogues, GlyA21, ArgB31, ArgB32-
ヒトインスリンである[Doerschug、M.、米国特許第5,656,722号、1997年、8月12 Human insulin [Doerschug, M., U.S. Pat. No. 5,656,722, 1997, August 12
日]。 Day]. 最も好ましいインスリン類似体はLysB28,ProB29-ヒトインスリンである。 The most preferred insulin analog is LysB28, a ProB29- human insulin. 好ましい誘導体化タンパク質はアシル化タンパク質であり、本発明の製剤および微結晶のための好ましいアシル化タンパク質は、脂肪酸アシル化インスリンおよび脂肪酸アシル化インスリン類似体である。 Preferred derivatized proteins are acylated proteins, preferably acylated proteins for the formulation and fine crystals of the present invention is a fatty acylated insulin and fatty acid-acylated insulin analog. 脂肪酸-アシル化ヒトインスリンも極めて好ましい。 Fatty - acylated human insulin is also highly preferred. 脂肪酸-アシル化インスリン類似体も極めて好ましい。 Fatty - acylated insulin analogs are also highly preferred.

【0068】 インスリンまたはインスリン類似体(ひとまとめにしてタンパク質)を誘導体化するのに用いる特定の基は、該タンパク質の生物活性を有意に低下させず、該タンパク質と結合したときに毒性がなく、そして最も重要なことは誘導体化タンパク質の亜鉛/プロタミン複合体の溶解性を低下させるか、水性溶解性を低下させるか、脂肪親和性を増大させるあらゆる化学的部分であってよい。 [0068] insulin or insulin analogue particular group used to derivatize (collectively protein) does not significantly reduce the biological activity of the protein, not toxic when combined with the protein, and or most importantly reduces the solubility of zinc / protamine complexes of the derivatized protein, it decreases the aqueous solubility may be any chemical moiety increases the lipophilicity.

【0069】 アシル化(acylating)部分のある好ましい群は直鎖の飽和脂肪酸からなる。 [0069] Acylation (acylating) preferred group of moieties consisting of saturated fatty acids linear.
この群は、メタン酸(C1)、エタン酸(C2)、プロパン酸(C3)、n-ブタン酸(C4)、n- This group, methanesulfonic acid (C1), ethanoic acid (C2), propanoic acid (C3), n-butanoic acid (C4), n-
ペンタン酸(C5)、n-ヘキサン酸(C6)、n-ヘプタン酸(C7)、n-オクタン酸(C8)、n- Pentanoic acid (C5), n-hexanoic acid (C6), n-heptanoic acid (C7), n-octanoic acid (C8), n-
ノナン酸(C9)、n-デカン酸(C10)、n-ウンデカン酸(Cll)、n-ドデカン酸(C12)、n Nonanoic acid (C9), n-decanoic acid (C10), n-undecanoic acid (Cll), n-dodecanoic acid (C12), n
-トリデカン酸(C13)、n-テトラデカン酸(C14)、n-ペンタデカン酸(C15)、n-ヘキサデカン酸(C16)、n-ヘプタデカン酸(C17)、およびn-オクタデカン酸(C18)からなる。 - tridecanoic acid (C13), n- tetradecanoate (C14), n- pentadecane acid (C15), n- hexadecanoic acid (C16), n- heptadecanoic acid (C17), and consists of n- octadecanoic acid (C18). 形容詞型は、ホルミル(C1)、アセチル(C2)、プロピオニル(C3)、ブチリル Adjective type, formyl (C1), acetyl (C2), propionyl (C3), butyryl
(C4)、ペンタノイル(C5)、ヘキサノイル(C6)、ヘプタノイル(C7)、オクタノイル (C4), pentanoyl (C5), hexanoyl (C6), heptanoyl (C7), octanoyl
(C8)、ノナノイル(C9)、デカノイル(C10)、ウンデカノイル(Cll)、ドデカノイル (C8), nonanoyl (C9), decanoyl (C10), undecanoyl (Cll), dodecanoyl
(C12)、トリデカノイル(C13)、テトラデカノイル(C14)またはミリストイル、ペンタデカノイル(C15)、ヘキサデカノイル(C16)またはパルミチック、ヘプタデカノイル(C17)、およびオクタデカノイル(C18)またはステアリックである。 (C12), tridecanoyl (C13), tetradecanoyl (C14) or myristoyl, pentadecanoyl (C15), hexadecanoyl (C16) or Parumichikku, heptadecanoyl (C17), and octadecanoyl (C18) or stearic is there.

【0070】 本発明の微結晶に用いる脂肪酸-アシル化タンパク質を形成するための脂肪酸の好ましい群は、炭素数が偶数の脂肪酸、すなわち、C2、C4、C6、C8、C10、C12 [0070] fatty acid used in the microcrystals of the present invention - preferred group of fatty acids for forming the acylated proteins, fatty acids of even carbon number, i.e., C2, C4, C6, C8, C10, C12
、C14、C16、およびC18飽和脂肪酸からなる。 Consists C14, C16, and C18 saturated fatty acids. 本発明の微結晶に用いる脂肪酸-アシル化タンパク質を形成するための脂肪酸の別の好ましい群は、炭素数が奇数の脂肪酸、すなわち、C1、C3、C5、C7、C9、 Fatty acid used in the microcrystals of the present invention - Another preferred group of fatty acids for forming the acylated protein is odd fatty carbon atoms, i.e., C1, C3, C5, C7, C9,
C11、C13、C15、およびC17飽和脂肪酸からなる。 C11, C13, C15, and consists of C17 saturated fatty acids.

【0071】 本発明の微結晶に用いる脂肪酸-アシル化タンパク質を形成するための脂肪酸の別の好ましい群は、炭素数が5より大きい脂肪酸、すなわち、C6、C7、C8、C9 [0071] fatty acid used in the microcrystals of the present invention - Another preferred group of fatty acids for forming the acylated protein is greater than 5 fatty acid carbon number, i.e., C6, C7, C8, C9
、C10、C11、C12、C13、C14、C15、C16、C17、およびC18飽和脂肪酸からなる。 Consists C10, C11, C12, C13, C14, C15, C16, C17, and C18 saturated fatty acids. 本発明の微結晶に用いる脂肪酸-アシル化タンパク質を形成するための脂肪酸の別の好ましい群は、炭素数が9より小さい脂肪酸、すなわち、C1、C2、C3、C4 Fatty acid used in the microcrystals of the present invention - Another preferred group of fatty acids for forming the acylated protein is less than 9 fatty acid carbon number, i.e., C1, C2, C3, C4
、C5、C6、C7、およびC8飽和脂肪酸からなる。 , C5, C6, C7, and consists C8 saturated fatty acids. 本発明の微結晶に用いる脂肪酸-アシル化タンパク質を形成するための脂肪酸の別の好ましい群は、炭素数6〜8の脂肪酸、すなわち、C6、C7、およびC8飽和脂肪酸からなる。 Fatty acid used in the microcrystals of the present invention - Another preferred group of fatty acids for forming the acylated protein is fatty acid having 6 to 8 carbon atoms, i.e., consisting of C6, C7, and C8 saturated fatty acids.

【0072】 本発明の微結晶に用いる脂肪酸-アシル化タンパク質を形成するための脂肪酸の別の好ましい群は、炭素数4〜6の脂肪酸、すなわち、C4、C5、およびC6飽和脂肪酸からなる。 [0072] fatty acid used in the microcrystals of the present invention - Another preferred group of fatty acids for forming the acylated protein is fatty acid having 4 to 6 carbon atoms, i.e., consisting of C4, C5, and C6 saturated fatty acid. 本発明の微結晶に用いる脂肪酸-アシル化タンパク質を形成するための脂肪酸の別の好ましい群は、炭素数2〜4の脂肪酸、すなわち、C2、C3,およびC4飽和脂肪酸からなる。 Fatty acid used in the microcrystals of the present invention - Another preferred group of fatty acids for forming the acylated protein is fatty acid having 2 to 4 carbon atoms, i.e., consisting of C2, C3, and C4 saturated fatty acids. 本発明の微結晶に用いる脂肪酸-アシル化タンパク質を形成するための脂肪酸の別の好ましい群は、炭素数が6より小さい脂肪酸、すなわち、C1、C2、C3、C4 Fatty acid used in the microcrystals of the present invention - Another preferred group of fatty acids for forming the acylated protein has a carbon number less than 6 fatty acids, i.e., C1, C2, C3, C4
、およびC5飽和脂肪酸からなる。 , And a C5 saturated fatty acids.

【0073】 本発明の微結晶に用いる脂肪酸-アシル化タンパク質を形成するための脂肪酸の別の好ましい群は、炭素数が4より小さい脂肪酸、すなわち、C1、C2、および [0073] fatty acid used in the microcrystals of the present invention - Another preferred group of fatty acids for forming the acylated protein is less than 4 fatty acid carbon number, i.e., C1, C2, and
C3飽和脂肪酸からなる。 Consisting of C3 saturated fatty acids. 本発明の微結晶に用いる脂肪酸-アシル化タンパク質を形成するための脂肪酸の別の好ましい群は、炭素数が9より大きい脂肪酸、すなわち、C10、Cll、C12 Fatty acid used in the microcrystals of the present invention - Another preferred group of fatty acids for forming the acylated protein is greater than the fatty acid carbon number of 9, i.e., C10, Cll, C12
、C13、C14、C15、C16、C17、およびC18飽和脂肪酸からなる。 , C13, C14, C15, C16, C17, and consists of C18 saturated fatty acids. 本発明の微結晶に用いる脂肪酸-アシル化タンパク質を形成するための脂肪酸の別の好ましい群は、炭素数が9より大きい偶数の脂肪酸、すなわち、C10、C12 Fatty acid used in the microcrystals of the present invention - Another preferred group of fatty acids for forming the acylated protein is fatty acid number is greater than 9 even number of carbon, i.e., C10, C12
、C14、C16、およびC18飽和脂肪酸からなる。 Consists C14, C16, and C18 saturated fatty acids.

【0074】 本発明の微結晶に用いる脂肪酸-アシル化タンパク質を形成するための脂肪酸の別の好ましい群は、炭素数12、14、または16の脂肪酸、すなわち、C12、C14、 [0074] fatty acid used in the microcrystals of the present invention - Another preferred group of fatty acids for forming the acylated protein is fatty acid having a carbon 12, 14 or 16, i.e., C12, C14,
およびC16飽和脂肪酸からなる。 And consisting of C16 saturated fatty acids. 本発明の微結晶に用いる脂肪酸-アシル化タンパク質を形成するための脂肪酸の別の好ましい群は、炭素数14または16の脂肪酸、すなわち、C14およびC16飽和脂肪酸からなる。 Fatty acid used in the microcrystals of the present invention - Another preferred group of fatty acids for forming the acylated proteins, fatty acids having 14 or 16 carbon atoms, i.e., consisting of C14 and C16 saturated fatty acids. 炭素数14の脂肪酸が特に好ましい。 Fatty acid having 14 carbon atoms are particularly preferred. 炭素数16の脂肪酸も特に好ましい。 Fatty acid having 16 carbon atoms is also preferred.

【0075】 本発明の微結晶に用いる脂肪酸-アシル化タンパク質を形成するための脂肪酸の別の好ましい群は、炭素数4〜10の脂肪酸、すなわち、C4、C5、C6、C7、C8、C [0075] fatty acid used in the microcrystals of the present invention - Another preferred group of fatty acids for forming the acylated protein is fatty acid having 4 to 10 carbon atoms, i.e., C4, C5, C6, C7, C8, C
9、およびC10飽和脂肪酸からなる。 9, and a C10 saturated fatty acids. 本発明の微結晶に用いる脂肪酸-アシル化タンパク質を形成するための脂肪酸の別の好ましい群は、炭素数4〜10の偶数の脂肪酸、すなわち、C4、C6、C8、およびC10飽和脂肪酸からなる。 Fatty acid used in the microcrystals of the present invention - Another preferred group of fatty acids for forming the acylated protein is an even number fatty acids having 4 to 10 carbon atoms, i.e., consisting of C4, C6, C8, and C10 saturated fatty acids. 本発明の微結晶に用いる脂肪酸-アシル化タンパク質を形成するための脂肪酸の別の好ましい群は、炭素数6、8、または10の脂肪酸からなる。 Fatty acid used in the microcrystals of the present invention - Another preferred group of fatty acids for forming the acylated protein consists fatty acid having 6, 8 or 10, carbon atoms. 炭素数6の脂肪酸が特に好ましい。 Fatty acid having 6 carbon atoms is particularly preferred. 炭素数8の脂肪酸も特に好ましい。 Fatty acid having 8 carbon atoms is also particularly preferred. 炭素数10の脂肪酸が特に好ましい。 Fatty having 10 carbon atoms are particularly preferred. 当業者は、より狭い好ましい群は上記脂肪酸の好ましい群の組み合わせにより構成されることを十分理解するであろう。 Those skilled in the art, a narrower preferred group will appreciated that it is constituted by a combination of preferred groups of the fatty acid.

【0076】 アシル化部分の別の好ましい群は、分枝している飽和脂肪酸からなる。 [0076] Another preferred group of acylating moieties consists of saturated fatty acids that are branched. 分枝脂肪酸は少なくとも2つの分枝を有する。 Branched fatty acids having at least two branches. 分枝脂肪酸の「分枝」の長さは、酸の炭素で始まる分枝の炭素数で表すことができよう。 The length of the "branch" of a branched fatty acid, could be expressed by the number of carbon atoms in the branches starting with carbon acid. 例えば、分枝脂肪酸 3-エチル- For example, branched fatty acid 3-ethyl -
5-メチルヘキサン酸は炭素数5、6、および6の長さの3つの分枝を有する。 5-methylhexanoic acid has three branches numbers 5,6, and 6 the length of the carbon. この場合には、「最長」分枝は炭素数6である。 In this case, the "longest" branch is six carbon atoms. 別の例として、2,3,4,5-テトラエチルオクタン酸は、炭素数4、5、6、7、および8の長さの5つの分枝を有する。 As another example, 2,3,4,5-tetraethyl-octanoic acid has five branches of the length of the carbon atoms 4,5,6,7 and 8. 分枝脂肪酸の好ましい群は、最長分枝が炭素数3〜10のものである。 A preferred group of branched fatty acids, longest branch is of 3 to 10 carbon atoms.

【0077】 そのような分枝飽和脂肪酸の代表的な数を、本発明タンパク質のアシル化部分として用いてよいそのような脂肪酸の範囲を読者が確実に理解するように示す: [0077] shown as such branched saturated fatty representative number may readers the scope of such fatty acids will certainly appreciate that using as acylating moieties of the present invention the protein:
2-メチル-プロピオン酸(propioinic acid)、2-メチル酪酸、3-メチル-酪酸、2 2-methyl - propionic acid (propioinic acid), 2- methylbutyric acid, 3-methyl - butyric acid, 2
,2-ジメチル-プロピオン酸、2-メチル-ペンタン酸、3-メチル-ペンタン酸、4-メチル-ペンタン酸、2,2-ジメチル-酪酸、2,3-ジメチル-酪酸、3,3-ジメチル-酪酸、2-エチル酪酸、2-メチル-ヘキサン酸、5-メチル-ヘキサン酸、2,2-ジメチル- , 2-dimethyl - propionic acid, 2-methyl - pentanoic acid, 3-methyl - pentanoic acid, 4-methyl - pentanoic acid, 2,2-dimethyl - butyric acid, 2,3-dimethyl - butyric acid, 3,3-dimethyl - butyric acid, 2-ethyl butyric acid, 2-methyl - hexanoic acid, 5-methyl - hexanoic acid, 2,2-dimethyl -
ペンタン酸、2,4-ジメチル-ペンタン酸、2-エチル-3-メチル-酪酸、2-エチル-ペンタン酸、3-エチル-ペンタン酸、2,2-ジメチル-3-メチル-酪酸、2-メチル-ヘプタン酸、3-メチル-ヘプタン酸、4-メチル-ヘプタン酸、5-メチル-ヘプタン酸、6 Pentanoic acid, 2,4-dimethyl - pentanoic acid, 2-ethyl-3-methyl - butyric acid, 2-ethyl - pentanoic acid, 3-ethyl - pentanoic acid, 2,2-dimethyl-3-methyl - butyric acid, 2- methyl - heptanoic acid, 3-methyl - heptanoic acid, 4-methyl - heptanoic acid, 5-methyl - heptanoic acid, 6
-メチルヘプタン酸、2,2-ジメチル-ヘキサン酸、2,3-ジメチルヘキサン酸、2,4- - heptanoate, 2,2-dimethyl - hexanoic acid, 2,3-dimethyl hexanoic acid, 2,4
ジメチル-ヘキサン酸、2,5-ジメチルヘキサン酸、3,3,-ジメチル-ヘキサン酸、3 Dimethyl - hexanoic acid, 2,5-dimethyl hexanoic acid, 3,3, - dimethyl - hexanoic acid, 3
,4-ジメチルヘキサン酸、3,5-ジメチル-ヘキサン酸、4,4-ジメチル-ヘキサン酸、2-エチル-ヘキサン酸、3-エチル-ヘキサン酸、4-エチル-ヘキサン酸、2-プロピル-ペンタン酸、2-エチル-ヘキサン酸、3-エチル-ヘキサン酸、4-エチル-ヘキサン酸、2-(1-プロピル)ペンタン酸、2-(2-プロピル)ペンタン酸、2,2-ジエチル , 4-dimethyl hexanoic acid, 3,5-dimethyl - hexanoic acid, 4,4-dimethyl - hexanoic acid, 2-ethyl - hexanoate, 3-ethyl - hexanoate, 4-ethyl - hexanoate, 2-propyl - pentanoic acid, 2-ethyl - hexanoate, 3-ethyl - hexanoate, 4-ethyl - hexanoate, 2- (1-propyl) pentanoic acid, 2- (2-propyl) pentanoic acid, 2,2-diethyl
-酪酸、2,3,4-トリメチル-ペンタン酸、2-メチル-オクタン酸、4-メチル-オクタン酸、7-メチルオクタン酸、2,2-ジメチル-ヘプタン酸、2,6-ジメチル-ヘプタン酸、2-エチル-2-メチル-ヘキサン酸、3-エチル-5-メチル-ヘキサン酸、3-(1-プロピル)-ヘキサン酸、2-(2-ブチル)-ペンタン酸、2-(2-(2-メチルプロピル))ペンタン酸、2-メチル-ノナン酸、8-メチル-ノナン酸、6-エチル-オクタン酸、4-( - butyric acid, 2,3,4-trimethyl - pentanoic acid, 2-methyl - octanoic acid, 4-methyl - octanoic acid, 7-methyl-octanoic acid, 2,2-dimethyl - heptanoic acid, 2,6-dimethyl - heptane acid, 2-ethyl-2-methyl - hexanoic acid, 3-ethyl-5-methyl - hexanoic acid, 3- (1-propyl) - hexanoic acid, 2- (2-butyl) - pentanoic acid, 2- (2 - (2-methylpropyl)) pentanoic acid, 2-methyl - nonanoic acid, 8-methyl - nonanoic acid, 6-ethyl - octanoic acid, 4- (
1-プロピル)-ヘプタン酸、5-(2-プロピル)-ヘプタン酸、3-メチル-ウンデカン酸、2-ペンチル-ヘプタン酸、2,3,4,5,6-ペンタメチル-ヘプタン酸、2,6-ジエチル 1-propyl) - heptanoic acid, 5- (2-propyl) - heptanoic acid, 3-methyl - undecanoic acid, 2-pentyl - heptanoic acid, 2,3,4,5,6-pentamethyl - heptanoic acid, 2, 6-diethyl
-オクタン酸、2-ヘキシル-オクタン酸、2,3,4,5,6,7-ヘキサメチル-オクタン酸、3,3-ジエチル-4,4-ジエチル-ヘキサン酸、2-ヘプチル-ノナン酸、2,3,4,5-テトラエチル-オクタン酸、2-オクチル-デカン酸、および2-(1-プロピル)-3-(1-プロピル)-4,5-ジエチル-6-メチル-ヘプタン酸。 - octanoic acid, 2-hexyl - octanoic acid, 2,3,4,5,6,7-hexamethyl - octanoic acid, 3,3-diethyl-4,4-diethyl - hexanoic acid, 2-heptyl - nonanoic acid, 2,3,4,5-tetraethyl - octanoic acid, 2-octyl - decanoic acid, and 2- (1-propyl) -3- (1-propyl) -4,5-diethyl-6-methyl - heptanoic acid.

【0078】 アシル化部分のさらに別の好ましい群は、サイクリックアルキル部分または部分(複数)が炭素数5〜7である、炭素数5〜24のサイクリックアルキル酸からなる。 [0078] Yet another preferred group of acylating moieties, cyclic alkyl moiety or moieties (s) is 5 to 7 carbon atoms, consisting of cyclic alkyl acids 5-24 carbon atoms. そのようなサイクリックアルキル酸の代表的数を、本発明タンパク質のアシル化部分として用いてよいそのような酸の範囲を読者が確実に理解するように示す:シクロペンチル-ギ酸、シクロヘキシル-ギ酸、1-シクロペンチル-酢酸、2- Such representative number of cyclic alkyl acids, as may the reader the scope of such acid will certainly appreciate that using as acylating moieties of the present invention proteins are shown: cyclopentyl - formic acid, cyclohexyl - formic acid, 1 - cyclopentyl - acetic acid, 2-
シクロヘキシル-酢酸、1,2-ジシクロペンチル-酢酸など。 Cyclohexyl - acetate, 1,2-dicyclopentyl - such as acetic acid.

【0079】 誘導体化タンパク質の好ましい群はモノアシル化タンパク質からなる。 [0079] A preferred group of derivatized proteins consists monoacylated protein. ε-アミノ基のモノアシル化が最も好ましい。 Monoacylated of ε- amino group is most preferred. インスリンでは、LysB29のモノアシル化が好ましい。 The insulin preferably monoacylated of LysB29. 同様に、ある種のインスリン類似体、例えばLysB28、ProB29-ヒトインスリン類似体では、LysB28のε-アミノ基のモノアシル化が最も好ましい。 Similarly, certain insulin analogs, such LysB28, in ProB29- human insulin analogue, and most preferably monoacylated the ε- amino group of LysB28. B B
鎖(B1)のα-アミノ基のモノアシル化も好ましい。 Monoacylated of α- amino groups of the chain (B1) is also preferred. A鎖(A1)のα-アミノ基のモノアシル化も好ましい。 Monoacylated of α- amino groups of the A-chain (A1) is also preferred.

【0080】 アシル化タンパク質の別の群はジアシル化タンパク質からなる。 [0080] Another group of acylated proteins consists of di-acylated protein. ジアシル化は、例えばLysのε-アミノ基およびB鎖のα-アミノ基であるか、またはA鎖のα-アミノ基およびB鎖のα-アミノ基であってよい。 Diacylated, for example whether the ε- amino group and B chains of α- amino groups of Lys, or an α- amino group and B chains of α- amino groups of the A-chain. アシル化タンパク質の別の群はトリアシル化タンパク質からなる。 Another group of acylated proteins consists of tri-acylated protein. トリアシル化タンパク質は、Lysのε-アミノ基、B鎖のα-アミノ基、およびA鎖のα-アミノ基がアシル化されているものである。 Tri-acylated proteins are those Lys of ε- amino group, B chain of α- amino group, and α- amino groups of the A-chain is acylated. 主要な溶媒として水を含む水性組成物が好ましい。 Aqueous composition comprising water as the major solvent are preferred. 水が溶媒である水性懸濁液が極めて好ましい。 Aqueous suspensions of water is the solvent are highly preferred.

【0081】 本発明組成物は糖尿病または高血糖の患者を治療するのに用いられる。 [0081] The present invention compositions are used to treat patients with diabetes or hyperglycemia. 本発明製剤は、典型的には濃度約1mg/mL〜約10mg/mLの誘導体化タンパク質を提供するであろう。 The present invention preparations typically will provide derivatized protein at a concentration of about 1 mg / mL to about 10 mg / mL. 本発明のインスリン生成物製剤は、典型的にはインスリン活性の単位の濃度(units/mL)、例えば、U40、U50、U100(それぞれおおよそ、約1.4、1.75 Insulin product formulations of the present invention, typically the concentration of units of insulin activity (units / mL), for example, U40, U50, U100 (roughly respectively, about 1.4,1.75
、および3.5mg/mL調製物に対応する)などで特徴付けられる。 , And corresponds to 3.5 mg / mL preparation) characterized the like. 用量、投与経路、 Dose, route of administration,
および1日あたりの投与回数は、治療目的、患者の疾患の性質と原因、患者の性別と体重、運動レベル、食習慣、投与方法などの要因、および熟練した医師に知られた他の要因を医師が考慮して決定するであろう。 And number of administrations per day, therapeutic purposes, the nature and cause of the patient's disease, the patient's gender and weight, exercise level, diet, factors such as administration methods, and the skilled other factors known to physicians will the doctor be determined in consideration. 広範囲には、1日用量は約 The wide range, the daily dose is about
1nmol/kg体重〜約6nmol/kg体重(6nmolは約1インスリン活性単位に等しいと考えられる)。 1 nmol / kg body weight to about 6 nmol / kg body weight (6 nmol is considered equivalent to about 1 insulin activity units). 約2〜約3nmol/kgの用量が本インスリン療法では典型的である。 A dose of about 2 to about 3 nmol / kg is typical in this insulin therapy.

【0082】 糖尿病を治療している通常の医師は、本発明製剤を投与するための治療的に最も有利な方法を選択することができよう。 [0082] ordinary practitioner who is treating diabetes will be able to select the therapeutically most advantageous method for administering the present formulation. 非経口投与経路が好ましい。 Parenteral routes of administration are preferred. インスリンの懸濁製剤の典型的な非経口投与経路は皮下および筋肉内経路である。 Typical parenteral routes of administration of a suspension formulation of insulin is subcutaneous and intramuscular routes. 本発明組成物および製剤は、経鼻、バッカル、肺、または眼経路で投与することもできよう。 The present invention compositions and preparations, nasal, buccal, may also be administered by the pulmonary or ocular routes. 痛みや不都合を減らす点で肺経路が特に好都合である。 Pulmonary route in that reduce the pain and inconvenience is particularly convenient. 本発明の結晶および共結晶は肺投与に特によく適合する。 Crystals and co-crystals of the present invention is particularly well suited for pulmonary administration.

【0083】 濃度12mg/mL〜25mg/mLのグリセロールが等張性物質として好ましい。 [0083] Glycerol at a concentration 12 mg / 25 mg / mL is preferred as isotonic agent. 等張性にはグリセロールを濃度約15mg/mL〜約17mg/mLで用いるのがさらにより極めて好ましい。 The isotonic more highly preferred than the use of about 15 mg / mL to about 17 mg / mL concentrations of glycerol. M-クレゾールおよびフェノール、またはその混合物が本発明製剤において好ましい保存剤である。 M- cresol and phenol, or mixtures thereof, are preferred preservatives in the present invention formulation.

【0084】 誘導体化タンパク質を製造するのに用いるインスリンまたはインスリン類似体は、伝統的(溶液)法、固相法、半合成法、およびより最近の組換えDNA法を含むあらゆる種々の知られたペプチド合成技術により製造することができる。 [0084] insulin or insulin analogue used to prepare the derivatized protein is traditional (solution) methods, solid phase methods, semi synthetic methods, and more were all various known including recent recombinant DNA methods it can be produced by peptide synthesis techniques. 例えば、種々のプロインスリンおよびインスリン類似体の製造法を開示している、Ch For example, it discloses the preparation of various proinsulin and insulin analogs, Ch
ance、REら、米国特許第5,514,646号(1996年5月7日); EPO公開公報第383,47 ance, RE et al., US Pat. No. 5,514,646 (May 7, 1996); EPO Publication No. 383,47
2号(1996年2月7日); Brange, JJVら、EPO公開公報第214,826号(1987年3月 No. 2 (February 7, 1996); Brange, JJV, et al., EPO Publication No. 214,826 (March 1987
18日);およびBelagaje, RMら、米国特許第5,304,473号(1994年4月19日)を参照。 18); and Belagaje, RM et al., See U.S. Pat. No. 5,304,473 (Apr. 19, 1994). これら参考文献は本明細書の一部を構成する。 These references constitute a part of this specification.

【0085】 一般的に、誘導体化タンパク質は、当該分野で知られた方法を用いて製造される。 [0085] Generally, derivatized proteins are prepared using methods known in the art. 誘導体化タンパク質を説明するための上記刊行物は誘導体化タンパク質を製造するのに適した方法を含む。 The above publications for explaining the derivatized protein includes a method suitable for producing a derivatized protein. それら刊行物は誘導体化タンパク質の製造方法として本明細書の一部を構成する。 They Publications constitute a part of this specification As a method for producing derivatized protein. アシル化タンパク質を製造するには、該タンパク質を活性化有機酸、例えば、アシル化脂肪酸と反応させる。 To produce the acylated protein is activated organic acid the protein, for example, it is reacted with an acylating fatty acid. 活性化脂肪酸は普通に用いられるアシル化物質の誘導体であり、これには脂肪酸の活性化エステル、脂肪酸ハロゲン化物、脂肪酸の活性化アミド、例えば活性化アゾリド誘導体[H Activating fatty acid is a derivative of acylated substances commonly employed, an activated ester of this fatty acid, fatty acid halides, activated amides of fatty acids, such as activated azolide derivatives [H
ansen, LB, WIPO公開公報第98/02460号(1998年1月22日)]、および脂肪酸無水物が含まれる。 Ansen, LB, WIPO Publication No. 98/02460 (January 22, 1998)], and a fatty acid anhydride. 活性化エステル、特に脂肪酸のN-ヒドロキシスクシンイミドエステルは、遊離アミノ酸を脂肪酸でアシル化するための特に好都合な方法である。 Activated esters, in particular N- hydroxysuccinimide esters of fatty acids are particularly advantageous method for acylating the free amino acid with a fatty acid. Lapidotらは、N-ヒドロキシスクシンイミドエステルの製造と、N-ラウロイル- Lapidot et al., The preparation of N- hydroxysuccinimide esters, N- lauroyl -
グリシン、N-ラウロイル-L-セリン、およびN-ラウロイル-L-グルタミン酸の製造におけるその使用を記載している。 Glycine, describe its use in N- lauroyl -L- serine, and N- lauroyl -L- glutamic acid production. 用語「活性化脂肪酸エステル」は、当該分野で知られた一般的技術を用いて活性化された脂肪酸を意味する[Riordan, JF The term "activated fatty acid ester" means an activated fatty acid using the general techniques known in the art [Riordan, JF
およびVallee, BL, Methods in Enzymology, XXV: 494-499(1972); Lapidot, And Vallee, BL, Methods in Enzymology, XXV: 494-499 (1972); Lapidot,
Y.ら、J. Lipid Res. 8: 142-145(1967)]。 Y., et al., J Lipid Res 8:.. 142-145 (1967)]. ヒドロキシベンゾトリアジド(HOBT) Hydroxybenzotriazole azide (HOBT)
、N-ヒドロキシスクシンイミドおよびその誘導体は、ペプチド合成用の活性化酸を形成するために特によく知られている。 , N- hydroxysuccinimide and derivatives thereof are particularly well known for forming activated acids for peptide synthesis.

【0086】 ε-アミノ基を選択的にアシル化するには、カップリング時に種々の保護基を用いてα-アミノ基をブロックすることができよう。 [0086] To selectively acylate the ε- amino groups will be able to block α- amino groups using a variety of protecting groups during the coupling. 適切な保護基の選択は当業者に知られており、p-メトキシベンゾキシカルボニル(pmz)が含まれる。 Selection of suitable protecting groups are known to those skilled in the art and include p- methoxybenzoyl alkoxycarbonyl (PMZ) it is. 好ましくは、ε-アミノ酸はアミノ保護基を用いることなく一段階合成法によりアシル化される。 Preferably, .epsilon. amino acids are acylated by one-step synthesis without the use of amino-protecting group. LysのNε-アミノ基の選択的アシル化法は、Baker, JCら、米国特許第5,646,242号(1997年7月8日)に開示され、クレームされている(この内容は本明細書の一部を構成する)。 Nε- selective acylation method for the amino group of Lys may, Baker, JC et al., Is disclosed in U.S. Patent No. 5,646,242 (Jul. 8, 1997), are claimed (the contents of which are incorporated herein constitute a). アシル化タンパク質の乾燥粉末の製造方法は Method for producing a dry powder of an acylated protein
Baker, JCら、米国特許第5,700,904号(1997年12月23日)に開示され、クレームされている(この内容は本明細書の一部を構成する)。 Baker, JC et al., Is disclosed in U.S. Patent No. 5,700,904 (Dec. 23, 1997), claimed in that (the content of which is incorporated herein by reference).

【0087】 本発明の亜鉛の主な役割は、該タンパク質および誘導体化タンパク質のZn(II) [0087] The primary role of zinc in the present invention, Zn of the protein and derivatized protein (II)
六量体を、混合六量体として別個にか、またはハイブリッド六量体として一緒に形成するのを促進することである。 The hexamer, separately or as a mixed hexamer, or to facilitate shaping together as hybrid hexamers. 亜鉛は、インスリンおよびインスリン類似体の六量体の形成を促進する。 Zinc facilitates the hexamer formation of insulin and insulin analogues. 同様に、亜鉛は誘導体化インスリンおよびインスリン類似体の六量体の形成を促進する。 Similarly, zinc promote hexamer formation of derivatized insulin and insulin analogs. 六量体形成は、タンパク質もしくは誘導体化タンパク質、またはその両方を含む溶液のpHをZn(II)イオンの存在下で中性領域にするか、またはpHを中性領域に調整した後にZn(II)を加えることにより、好都合に達成される。 Hexamer formation, protein or derivatized protein, or the pH of a solution containing both after adjusting either the neutral region in the presence of Zn (II) ions, or a pH in the neutral region Zn (II ) by adding, it is conveniently achieved.

【0088】 結晶および共結晶を効率的に回収するには、総タンパク質に対する亜鉛のモル比を約0.33の下限まで制限する(すなわち、効率的な六量体化に必要な亜鉛約2 [0088] crystals and co-crystals to efficiently recovered limits the molar ratio of zinc to total protein to a lower limit of about 0.33 (i.e., zinc required for efficient hexameric of about 2
原子/六量体)。 Atoms / hexamer). 亜鉛と結合する際にインスリンと競合する化合物が存在しない場合は、結晶および共結晶は約2〜約4-6個の亜鉛原子が存在すると適切に形成される。 When a compound that competes with insulin in binding zinc is not present, crystals and co-crystals are suitably formed when about 2 to about 4-6 zinc atoms present. 亜鉛と結合する際にインスリンと競合する化合物、例えばクエン酸やリン酸を含む化合物が存在する場合は、処理時にさらにより多くの亜鉛を用いてよい。 Compounds that compete with insulin in binding zinc, for example, when a compound containing citric acid or phosphoric acid is present, may be used further more zinc during processing. より強力に六量体化を行うには、効率的な六量体化に必要な最小量以上の過剰の亜鉛が望ましいかも知れない。 More strongly performed six dimerization, efficient minimum amount or an excess of zinc required hexameric reduction may be desired. また、最小量以上の過剰の亜鉛は、本発明製剤に存在することができ、そして化学および物理的安定性を改善し、懸濁性を改善し、おそらくさらに時間-作用を延長するのに望ましいかも知れない。 Zinc minimal amount or more of excess may be present in the present preparation, and to improve the chemical and physical stability, to improve suspension properties, probably more time - desirable to prolong the effect May. したがって、本発明の不溶性組成物、方法、および製剤において許容される亜鉛:タンパク質比の範囲はかなり広い。 Therefore, the insoluble compositions of the present invention, a method, and zinc are acceptable in the formulation: protein ratio range is quite broad.

【0089】 本発明によれば、亜鉛は製剤中に約0.3モル〜約7モル/モル総タンパク質、より好ましくは約0.3モル〜約1.0モル/モル総タンパク質存在する。 According to [0089] the present invention, zinc is from about 0.3 mole to about 7 moles / mole of total protein in the formulation, more preferably in from about 0.3 mole to about 1.0 moles / mole of total protein. さらにより好ましくは、亜鉛/誘導体化タンパク質比は、亜鉛原子約0.3〜約0.7モル/モル総タンパク質である。 Even more preferably, the zinc / derivatized protein ratio is about zinc atoms 0.3 to about 0.7 moles / mole of total protein. 最も好ましくは、亜鉛/誘導体化タンパク質比は、亜鉛原子約0.30〜約0.55モル/モル総タンパク質である。 Most preferably, the zinc / derivatized protein ratio is zinc atoms about 0.30 to about 0.55 moles / mole of total protein. PZI調製物と同じ高亜鉛製剤では、亜鉛比は亜鉛約5〜約7モル/モル総タンパク質である。 The same high zinc formulations and PZI preparations, the zinc ratio is zinc from about 5 to about 7 moles / mole of total protein.

【0090】 本発明に亜鉛を提供する亜鉛化合物は、医薬的に許容されるあらゆる亜鉛化合物であってよい。 [0090] zinc compound that provides zinc to the present invention may be a pharmaceutically acceptable any zinc compound. インスリン調製物に亜鉛を加えることは、医薬的に許容される亜鉛の供給源同様、当該分野で知られている。 The addition of zinc to insulin preparations, pharmaceutically source of acceptable zinc Similarly, known in the art. 本発明のために亜鉛を供給する好ましい亜鉛化合物には、塩化亜鉛、酢酸亜鉛、クエン酸亜鉛、酸化亜鉛、および硝酸亜鉛が含まれる。 Preferred zinc compounds to supply zinc for the present invention, zinc chloride, zinc acetate, zinc citrate, include zinc oxide and zinc nitrate, is.

【0091】 本発明の微結晶および沈殿物にはコンプレックス形成化合物が必要である。 [0091] it is necessary complex forming compound in microcrystalline and precipitation of the present invention. コンプレックス形成化合物は、六量体の実質的な沈殿と結晶化を生じるのに充分な量で存在しなければならない。 Complex forming compound should be present in an amount sufficient to produce a substantial precipitation and crystallization of the hexamers. 特定の製造について特定のコンプレックス形成化合物のそのような量は、簡単な滴定実験により容易に決定することができる。 Such amounts of a particular complexing compound for a particular preparation can be readily determined by simple titration experiments. 理想的には、コンプレックス形成化合物の濃度は、沈殿および結晶化が完結した後に可溶相に残っているコンプレックス形成剤がごくわずかであるように調整される。 Ideally, the concentration of the complex forming compound, complex forming agents remaining in the soluble phase after precipitation and crystallization is completed is adjusted to be negligible. これには、実験的に決定した「イソフェン」比に基づいてコンプレックス形成剤を混合する必要がある。 This requires to mix the complex-forming agent based on the experimentally determined "Isofen" ratio. この比はNPHおよびNPLのそれと非常に類似していると予想される。 This ratio is expected to be very similar to those of NPH and NPL. しかしながら、誘導体化はタンパク質-プロタミン相互作用の性質に影響を与えるのでわずかに異なるかも知れない。 However, derivatization protein - might vary slightly because affect the properties of protamine interaction.

【0092】 プロタミンがコンプレックス形成化合物である場合は、プロタミンは結晶および共結晶中に約0.15mg〜約0.5mg/3.5mg総タンパク質の量で存在する。 [0092] When protamine is complex forming compound is protamine is present in an amount of from about 0.15mg~ about 0.5 mg / 3.5 mg total protein in crystals and co-crystals. プロタミン/総タンパク質比は、好ましくは約0.25〜約0.40(mg/3.5mg)である。 Protamine / total protein ratio is preferably from about 0.25 to about 0.40 (mg / 3.5mg). より好ましくは該比は約0.25〜約0.38(mg/3.5mg)である。 More preferably the ratio is from about 0.25 to about 0.38 (mg / 3.5mg). 好ましくは、プロタミンの量は Preferably, the amount of protamine
0.05mg〜約0.2mg/mg総タンパク質、より好ましくは約0.05〜約0.15mg/mg総タンパク質である。 0.05mg~ about 0.2 mg / mg total protein, and more preferably from about 0.05 to about 0.15 mg / mg total protein. 硫酸プロタミンは、本発明に用いるより好ましいプロタミンの塩である。 Protamine sulfate is the preferred protamine salt than using the present invention. 硫酸プロタミンまたは他のプロタミン塩を用いる場合は、用いるその量をプロタミン遊離塩基の量について調整し、該塩とプロタミンの分子量の比に等しい率で同じ適用に用いる必要があろう。 When using protamine sulfate or other protamine salts, the amount was adjusted for the amount of protamine free base, it may be necessary to use the same application at the same rate to the ratio of the molecular weight of the salt and protamine used.

【0093】 本発明組成物の時間作用をさらに延長するか、またはその懸濁性を改善するために、結晶後にさらにプロタミンおよび亜鉛を加えてよい。 [0093] The present invention further or to extend the time action of the compositions, or to improve their suspension, yet may be added protamine and zinc after crystallization. すなわち、イソファン比より高いプロタミンを有する製剤も本発明の範囲内である。 Ie, a formulation having greater than isophane ratios protamine also within the scope of the present invention. これら製剤において、プロタミン比はプロタミン0.25mg〜約0.5mg/mg総タンパク質である。 In these formulations, the protamine ratio is protamine 0.25mg~ about 0.5 mg / mg total protein.

【0094】 本発明の結晶および共結晶の必要成分は六量体安定化化合物である。 [0094] required components of crystals and co-crystals of the present invention is a hexamer stabilizing compound. 3種の六量体コンフォメーションの構造は文献に特徴づけられており、T6、T3R3、および Structure of three hexameric conformations have been characterized in the literature, T6, T3R3, and
R6で表される。 Represented by R6. 六量体安定化化合物、例えば種々のフェノール性化合物の存在下で、R6コンフォメーションは安定化する。 Hexamer stabilizing compound, for example in the presence of various phenolic compounds, R6 conformation is stabilized. したがって、六量体は、六量体安定化化合物、例えばフェノールまたはm-クレゾールの存在下で生成される結晶および共結晶中でR6コンフォメーションまたはT3R3コンフォメーションである可能性が高い。 Therefore, hexamer, hexamer stabilizing compound, such as phenol or m- cresol present in crystalline and co-crystal is produced under the likely a R6 conformation, or T3R3 conformation. 広範囲の六量体安定化化合物が適切である。 Hexamer stabilizing compound extensive is appropriate. 該化合物はR6六量体コンフォメーションを安定化するために総タンパク質に対して充分な割合で存在しなければならない。 The compound must be present in sufficient proportions with respect to total protein to stabilize the R6 hexamer conformation. これを達成するために、効果的に六量体を安定化するには六量体あたり少なくとも3モルの六量体安定化化合物が必要である。 To achieve this, to stabilize the effective hexamer are required hexamer stabilizing compound, at least 3 mol per hexamer. 本発明の結晶および共結晶には六量体あたり3モル以上の六量体安定化化合物が存在することが好ましい。 The crystals and co-crystals of the present invention preferably exist hexamer stabilizing compound 3 moles or more per hexamer. 微結晶および沈殿物を製造する溶液中に少なくとも25〜50倍までのより高い比の六量体安定化化合が存在しても、六量体の安定化に悪影響を及ぼさないであろう。 Even hexamer stabilizing compound of higher ratios of up to at least 25-50 times in the solution to produce fine crystals and precipitate are present, it will not adversely affect the stabilization of the hexamer.

【0095】 本発明製剤には、特に該製剤が複数回サンプリングすることを意図している場合は保存剤が存在していてよい。 [0095] The present invention formulation may preservative is present especially when the formulation is intended to be sampled multiple times. 上記のごとく、広範囲の適切な保存剤が知られている。 As indicated above, a wide range of suitable preservatives are known. 好ましくは、保存剤は薬局方の要求を満たすのに充分な抗菌効果をもたらす適切な量で溶液中に存在する。 Preferably, preservative is present in the solution in an amount suitable to provide a sufficient antimicrobial effect to satisfy the pharmacopoeia requirements.

【0096】 好ましい保存剤は、先に列挙したフェノール性保存剤である。 [0096] Preferred preservatives are the phenolic preservatives listed above. フェノール性保存剤の好ましい濃度は、水性懸濁製剤1mlあたり約2mg〜約5mgである。 A preferred concentration of phenolic preservative are from about 2mg~ about 5mg per aqueous suspension formulation 1 ml. これら濃度は、個々のフェノール性保存剤の混合物が予期されるので、フェノール性保存剤の総量を表す。 These concentrations are so mixtures of individual phenolic preservatives are contemplated, it represents the total amount of phenolic preservatives. 適切なフェノール性保存剤には、例えばフェノール、m-クレゾール、およびメチルパラベンが含まれる。 Suitable phenolic preservatives include, for example, phenols, m- cresol, and methylparaben. 好ましいフェノール性保存剤は、フェノールおよびm-クレゾールである。 Preferred phenolic preservative is phenol and m- cresol. フェノールおよびm-クレゾールのようなフェノール性化合物の混合物も予期され、極めて好ましい。 Mixtures of phenolic compounds such as phenol and m- cresol also be expected, highly preferred. フェノール性化合物の混合物の例は、0.6mg/mL フェノールおよび1.6mg/mL m-クレゾール、ならびに0.7m Examples of mixtures of phenolic compounds, 0.6 mg / mL phenol and 1.6 mg / mL m-cresol, and 0.7m
g/mL フェノールおよび1.8mg/mL m-クレゾールである。 g / mL phenol and 1.8 mg / mL is m- cresol.

【0097】 本発明の結晶および共結晶は、誘導体化タンパク質、二価金属カチオンからなる、コンプレックス形成化合物および六量体安定化化合物を含む、「棒状」としても知られる長楕円形(oblong)の単結晶であることが好ましい。 [0097] crystals and co-crystals of the present invention, derivatized protein, consisting of a divalent metal cation, complexing compound and containing hexamer stabilizing compound, oblong, also known as "rod-like" in (oblong) it is preferable that a single crystal. 好ましい組成物は、硫酸プロタミン約3mg〜約6mg/35mg総タンパク質、および亜鉛約0.1〜約0.4mg/35mg総タンパク質を含む。 Preferred compositions comprise protamine sulfate about 3mg~ about 6 mg / 35 mg total protein, and zinc about 0.1 to about 0.4 mg / 35 mg total protein. 別の好ましい組成物は、硫酸プロタミン約10mg〜約17mg/35mg総タンパク質、および亜鉛約2.0〜約2.5mg/35mg Another preferred composition, protamine sulfate about 10mg~ about 17 mg / 35 mg total protein, and zinc from about 2.0 to about 2.5 mg / 35 mg
総タンパク質を含む。 Including the total protein. 別の好ましい組成物は1mLあたり硫酸プロタミン0.34〜0.3 Another preferred composition of protamine sulfate per 1 mL 0.34-.3
8mg、亜鉛0.01〜0.04mg、および総タンパク質3.2〜3.8mgを含む。 8mg, including zinc 0.01~0.04mg, and total protein 3.2~3.8mg.

【0098】 非誘導体化タンパク質および誘導体化タンパク質はいずれも本発明の共結晶に必要である。 [0098] underivatized protein and derivatized protein are both required to co-crystals of the present invention. これらタンパク質の総量間の比は調製物の時間延長の程度を決定する。 The ratio between the total amount of these proteins determines the degree of time extension of the preparations. 誘導体化タンパク質のモル数に対する該タンパク質のモル数の好ましい比( Number of moles of the preferred ratio of the protein to the number of moles of derivatized protein (
該タンパク質のモル数/誘導体化タンパク質のモル数比)は、約1:100および約1 Molar ratio of moles / derivatized protein of the protein) is from about 1: 100 and about 1
00:1である。 00: 1. 誘導体化タンパク質のモル数に対する該タンパク質のモル数のさらに好ましい比は、約1:1〜約100:1である。 A further preferred ratio of the molar number of the protein to the number of moles of derivatized protein is from about 1: 1 to about 100. 誘導体化タンパク質のモル数に対する該タンパク質のモル数の別の好ましい比は、約1:1〜約20:1である。 Another preferred ratio of the number of moles of the protein to the number of moles of derivatized protein is from about 1: 1 to about 20: 1. 誘導体化タンパク質のモル数に対する該タンパク質のモル数のさらに別の好ましい比は、約 Yet another preferred ratio of moles of the protein to the number of moles of derivatized protein, from about
2:1〜約20:1、約2:1〜約10:1、約2:1〜約5:1、約3:1〜約5:1、約1:1〜約1:20、 2: 1 to about 20: 1, about 2: 1 to about 10: 1, about 2: 1 to about 5: 1, about 3: 1 to about 5: 1, about 1: 1 to about 1:20,
約1:1〜約1:10、約1:2〜約1:20、約1:2〜約1:10、約1:2〜約1:5、約1:3〜約1:5 About 1: 1 to about 1:10, about 1: 2 to about 1:20, about 1: 2 to about 1:10, about 1: 2 to about 1: 5, about 1: 3 to about 1: 5
、約10:1〜約1:10、約9:1〜約1:9、約5:1〜約1:5、約3:1〜約1:3である。 , From about 10: 1 to about 1:10, about 9: 1 to about 1: 9, from about 5: 1 to about 1: 5, from about 3: 1 to about 1: 3.

【0099】 本発明は結晶および共結晶の製造方法を提供する。 [0099] The present invention provides a method for producing crystals and co-crystals. 簡単には、適切な方法は一般に以下の手順の1工程を含む:可溶化(乾燥物質を用いて出発する場合)、六量体化、ホモゲナイゼーション、コンプレックス形成、沈殿、結晶(化)、所望により製剤化;または可溶化(乾燥物質を用いて出発する場合)、ホモゲナイゼーション、六量体化、コンプレックス形成、沈殿、結晶化、および所望により製剤化。 Briefly, including step 1 of suitable methods are generally the following steps: (if starting with dry material) solubilizing, hexameric reduction, homogenization, complex formation, precipitation, crystallization (of), optionally formulated by; (if starting with dry material), or solubilizing, homogenization, hexameric reduction, complex formation, precipitation, crystallization, and optionally formulation.

【0100】 可溶化は、誘導体化タンパク質およびタンパク質が六量体を形成するのに十分なようにそれらを溶解することを意味する。 [0100] Solubilization is derivatized protein and protein is meant to dissolve them enough so to form a hexamer. 六量体化は、タンパク質および誘導体化タンパク質の分子が亜鉛(II)原子と結合して六量体を形成する工程を表す。 Hexamer conjugated represents the step of molecules of protein and derivatized protein to form a hexamer bound with zinc (II) atoms.
コンプレックス形成は、六量体とプロタミンの間に不溶性のコンプレックスを形成することを意味する。 Complex formation means to form insoluble complexes between the hexamers and protamine. 結晶化には、沈殿した六量体/プロタミンコンの結晶、 The crystallization, crystals precipitated hexamer / protamine Con,
典型的には棒状結晶への変換を含む。 Typically it involves conversion of rod-shaped crystals.

【0101】 可溶化は、誘導体化タンパク質およびタンパク質を水性溶媒に溶解することにより達成される。 [0102] solubilization, derivatized proteins and protein is accomplished by dissolving in an aqueous solvent. 水性タンパク質は、例えば酸性溶液、中性溶液、または塩基性溶液であってよい。 Aqueous protein, for example an acidic solution may be a neutral or basic solution. 水性溶媒は、一部、混和性有機溶媒、例えばエタノール、アセトニトリル、ジメチルスルホキシドなどを含んでいてよい。 Aqueous solvent, partially miscible organic solvents, such as ethanol, acetonitrile, may include such as dimethylsulfoxide. 酸性溶媒は、例えばHCl溶液、好都合には約0.01N HCl〜約1.0N HClであってよい。 Acidic solvents, for example HCl solution, conveniently may be from about 0.01 N HCl~ about 1.0 N HCl. 医薬的に許容される他の酸も用いてよい。 It may be used other acids which are pharmaceutically acceptable. 塩基性溶液は、例えばNaOH溶液、好都合には約0.01N The basic solution such as NaOH solution, conveniently about 0.01N
NaOH〜約1.0N NaOHまたはそれ以上であってよい。 NaOH~ about may be at 1.0 N NaOH or more. 医薬的に許容される他の塩基も用いてよい。 Pharmaceutically acceptable other base may also be used. タンパク質の安定性のためには、酸または塩基の濃度は、タンパク質および誘導体化タンパク質を適切に溶解するのに有効なままでできるだけ低いことが好ましい。 For protein stability, the concentration of acid or base, as low as possible while effective to adequately dissolve the protein and derivatized protein is preferred.

【0102】 ほとんどのタンパク質(インスリンおよびインスリン類似体)および多くの誘導体化タンパク質は、中性pHで適切な濃度に溶解してよい。 [0102] Most proteins (insulin and insulin analogues) and many derivatized proteins may be dissolved to the appropriate concentration at neutral pH. 中性pHで誘導体化タンパク質を溶解するための溶液は、緩衝剤、および所望により1またはそれ以上のさらなる溶質、例えば塩、フェノール性化合物、亜鉛、および等張性物質を含んでいてよい。 The solution for dissolving the derivatized protein at neutral pH, the buffer, and optionally one or more additional solutes such as salts, phenolic compounds, may contain zinc, and isotonicity agents.

【0103】 ホモゲナイゼーション前に六量体化が生じる場合は、均質な六量体の2つのポピュレーションを最初に形成し、次いで該ポピュレーションを混合して混合六量体を形成させる。 [0103] If the hexameric of prior homogenization occurs by first forming two populations of homogenous hexamers, followed by forming a mixed hexamer by mixing the population. 最初にホモゲナイゼーションが生じる場合、六量体はハイブリッド六量体を生じる。 If the first to homogenization occurs, hexamer produces a hybrid hexamer. 上記のごとくハイブリッド六量体からなる不溶性組成物を製造するには、タンパク質および誘導体化タンパク質を二価金属カチオンで六量体化する前に単量体または二量体凝集段階に分離するのに好ましい条件下でホモゲナイズする。 To produce the insoluble compositions comprised of hybrid hexamers as described is to separate the monomer or dimer aggregation step before hexameric the protein and derivatized protein divalent metal cation homogenized under preferred conditions. 必要な分離を達成するには、タンパク質および誘導体化タンパク質を強酸性または強アルカリ性条件下で混合してよい。 To achieve the necessary separation, the protein and derivatized protein may be mixed under strongly acidic or strongly alkaline conditions. 分離、したがってホモゲナイゼーションの程度はこの工程のために選んだ溶液条件の影響を受ける。 Separation, and therefore the degree of homogenization is influenced by the chosen solution conditions for this process. インスリンおよび関連タンパク質は、二量体、六量体、および他の結合型を生成する一連の反応中で容易に自己結合する。 Insulin and related proteins readily self-binding in a series of reactions producing dimers, hexamers, and other bound. 平衡でのこれら結合形の分布はpHを含む多くのパラメーターに依存する。 Distribution of these bonds form at equilibrium is dependent on many parameters including pH. これら結合反応は通常、主として単量体-二量体- These coupling reactions are usually predominantly monomer - dimer -
六量体のアッセンブリーを含むと考えられる。 It believed to contain the assembly of the hexamer. したがって、選んだ溶液条件に依存して、ホモゲナイゼーションにより単量体、二量体、またはその混合物の混合を達成すべきである。 Thus, depending on the chosen solution conditions, monomer by homogenization, dimers, or should accomplish the mixing of the mixture. 例えば、1N NCl中でのホモゲナイゼーションは、0.1N HCl For example, homogenization in a 1N NCl is, 0.1 N HCl
中(おそらくより多くの二量体混和物を含む)でよりも単量体混和物の分画がより高くなることがある。 During fractionation of the monomer blend than with (possibly from including many dimer blends) may become higher. ハイブリッド六量体を含む組成物を製造するにはホモゲナイゼーション工程が有効であるが、ただし、用いるホモゲナイゼーション条件下ではタンパク質または誘導体化タンパク質の均質な六量体の分画が非常に少しまたはごくわずかしか存在しない。 Although in preparing a composition comprising a hybrid hexamer is effective homogenization step, however, homogenization conditions slightly fractionation is very homogeneous hexamers of the protein or derivatized protein is used or only very little exists.

【0104】 混合六量体からなる組成物は主として2種類の六量体、すなわちタンパク質の六量体および誘導体化タンパク質の六量体を含む。 [0104] composition comprising a mixture hexameric comprises mainly two hexamers, namely hexamers of the hexameric and derivatized protein protein. この場合、ホモゲナイゼーション工程は、六量体化工程後に生じ、コンプレックス形成化合物とコンプレックス形成する前に六量体のホモゲナイゼーションが達成される。 In this case, homogenization step occurs after hexameric step, homogenization of the hexamers is achieved prior to the complex formation complexing compound. したがって、ホモゲナイゼーション工程は、Zn(II)-インスリン六量体を安定化させる溶液条件下で行われる。 Therefore, homogenization step, Zn (II) - it is carried out in solution under conditions which stabilize the insulin hexamer. インスリン六量体を安定化する溶液条件は文献中によく知られている。 Solution conditions that stabilize insulin hexamers are well known in the literature.

【0105】 六量体化に必要な溶液条件は、溶液中でハイブリッド六量体または混合六量体を形成させる条件である。 [0105] The solution conditions required for hexamer of is a condition for forming the hybrid hexamers or mixed hexamers in solution. この条件はインスリンまたはインスリン類似体を六量体化させる条件と同じかまたは非常に同様であろう。 This condition will be the same or very similar to the conditions for hexameric conjugated insulin or insulin analogue. 典型的には、六量体化には亜鉛と中性〜わずかに塩基性のpH(約pH6.8〜約8.4)が必要である。 Typically, hexameric into zinc and neutral to slightly basic pH (about pH6.8~ about 8.4) are needed. 六量体安定化剤の存在は、誘導体化タンパク質(およびある場合にはタンパク質も)R6またはT3R3コンフォメーションを促すことにより六量体に好都合な影響を及ぼす。 The presence of a hexamer stabilizing agent is derivatized proteins (and proteins in some cases also) R6 or T3R3 con convenient to hexamer by prompting the conformation affects. ある種の単量体インスリン類似体については、六量体の形成に六量体安定化化合物が必要である。 For certain monomeric insulin analogs, it is required hexamer stabilizing compound in the formation of hexamer.

【0106】 ハイブリッド六量体からなる組成物については、7種の六量体:P 6 、P 5 D 1 、P 4 D 2 、P 3 D 3 、P 2 D 4 、P 1 D 5 、およびD 6が予期される(ここで、Pはタンパク質単量体を、Dは誘導体化タンパク質単量体を表す)。 [0106] For compositions comprised of hybrid hexamers, the seven hexameric: P 6, P 5 D 1 , P 4 D 2, P 3 D 3, P 2 D 4, P 1 D 5, and D 6 is expected (wherein, P is a protein monomer, D is represents the derivatized protein monomer). 六量体の統計的分布はポアソン分布に適合すると予想され、タンパク質および誘導体化タンパク質の相対比、および六量体化前の分離(解離)の程度に影響されよう。 Statistical distribution of hexamers is expected to conform to the Poisson distribution, the relative ratios of proteins and derivatized proteins, and hexamers will be affected to the extent of conjugated prior to separation (dissociation). 例えば、主に二量体で構成されるホモゲナイズされた溶液からの4つの主要なハイブリッド六量体は:P 6 For example, mainly the four major hybrid hexamer from homogenized by solution comprised of dimer: P 6,
P 4 D 2 、P 2 D 4 、およびD 6と予想される。 P 4 D 2, P 2 D 4, and is expected to D 6. 混合六量体からなる組成物については2つの六量体P6およびD6のみが優勢であると予想される。 For mixed hexamer consists composition only two hexameric P6 and D6 are expected to predominate.

【0107】 コンプレックス形成工程は、コンプレックス形成化合物と六量体を、それぞれが最初に可溶性である溶液条件下で混合することを含まなくてはならない。 [0107] Complex formation step, the complex forming compound with hexamer must include mixing in solution conditions is initially soluble respectively. これは六量体とプロタミンの別個の溶液を混合するか、最初に酸性もしくは塩基性pH This mixing separate solutions of hexamers and protamine or, initially acidic or basic pH
でタンパク質、誘導体化タンパク質、およびプロタミンの溶液を形成し、次いで In forming protein, derivatized protein, and a solution of protamine, then
pHを中性範囲に変化させることにより達成できよう。 It could achieved by changing the pH to the neutral range.

【0108】 結晶化中の溶液条件は、結晶するものを安定化し、沈殿物を溶質に変換し結晶するのを促進しなければならない。 [0108] The solution conditions during crystallization stabilizes those that crystals precipitate should facilitate to convert the solute crystals. すなわち、溶液条件は結晶化の速度と結果を決定するであろう。 That is, the solution conditions will determine the speed and results of the crystallization. 結晶化は、非結晶沈殿物、溶解した六量体−プロタミンコンプレックス、および結晶を含む複雑な平衡を伴うようである。 Crystallization amorphous precipitate, dissolved hexamer - to involve protamine complexes, and the complex equilibrium including crystals. 微結晶を得るには、結晶化のために選んだ条件は平衡を結晶形成に向かわせなければならない。 To obtain microcrystals, the conditions chosen for crystallization must directed to crystal formation equilibrium. また、仮定した平衡からみて、溶解性が低いと沈殿物の溶質、結晶への正味の変換が遅くなるようであるから、誘導体化タンパク質の溶解性は、結晶化の速度と大きさに大いに影響するものと予想される。 Further, when viewed from the assumed equilibrium solute solubility is low, precipitate, because the conversion of the net on the crystal is such that the slower dissolution of derivatized protein, greatly affect the rate and magnitude of the crystallization It is expected to. さらに、結晶化速度が遅くなると結晶が大きくなることが多い。 Further, the crystallization speed and slows down is often larger crystals. すなわち、結晶化速度と結晶の大きさは誘導体化タンパク質の誘導体化部分の大きさと性質に依存すると考えられる。 That is, the size of the crystallization rate and the crystal is believed to depend on the size and nature of the derivatizing moiety of derivatized protein.

【0109】 本発明の結晶化速度と結晶の大きさに影響すると以前は考えられていた結晶化パラメーターは(Brader IおよびBrader II参照)、アシル基の大きさと性質、 [0109] Crystallization parameters that previously crystallization rate and to affect the crystal size was considered of the present invention (see Brader I and Brader II), the size and nature of the acyl group,
温度、亜鉛についてタンパク質および誘導体化タンパク質と競合する「競合化合物」、例えばクエン酸塩、リン酸塩などの存在と濃度、フェノール性化合物の性質と濃度、亜鉛濃度、混和性有機溶媒の存在と濃度、結晶化に許された時間、pH Temperature, competes with the protein and derivatized protein for zinc, "competing compounds", such as citrate, presence and concentration of such phosphate, nature and concentration of phenolic compounds, zinc concentration, the presence and concentration of miscible organic solvents , the time allowed for crystallization, pH
とイオン強度、緩衝剤の同一性と濃度、沈殿剤の濃度、種物質の存在、容器の形と材料、攪拌速度、および総タンパク質濃度である。 And ionic strength, identity and concentration of the buffering agent, the concentration of the precipitating agent, the presence of a seed material, the shape of the container and the material, a stirring rate, and the total protein concentration. 競合化合物の濃度と温度は特に重要と考えられた。 Concentration and temperature of the competing compounds were considered particularly important.

【0110】 非常に驚くべきことに、今回、塩素イオンは、そのイオン強度に対する影響以外に、結晶および共結晶のサイズを決定するのに重要な役割を果たすことがわかった。 [0110] Very surprisingly, this chlorine ions, in addition to its effects on ionic strength was found play an important role in determining the size of the crystals and co-crystals. 結晶および共結晶に対する塩素の影響の正確な性質は知られていない。 The exact nature of the effect of chlorine on crystalline and co-crystals are not known. 塩素イオン濃度と結晶化速度の具体的な結びつきについては、これら結晶および共結晶について以前には記載されていなかった。 For chloride ion concentration and specific ties crystallization rate, it has not been described previously for these crystals and co-crystals.

【0111】 競合化合物、例えばクエン酸塩は、結晶の形成速度、および間接的に結晶の大きさと品質に影響を及ぼすことができよう。 [0111] competing compounds, such as citrate in the art could influence the size and quality of the formation rate of the crystal, and indirectly crystals. これら化合物は、溶液中で亜鉛と錯体(coordination complex)を形成し、亜鉛について六量体表面上の比較的弱い亜鉛結合部位と競合することにより影響を及ぼすことができよう。 These compounds form zinc complexes (coordination complex) in solution, it could be affected by competing with the relatively weak zinc binding sites on the hexameric surface for zinc. この弱い表面結合部位を占拠することでおそらく結晶化が妨げられる。 Perhaps crystallization is prevented by occupying this weak surface binding sites. さらに、多くの誘導体化タンパク質はわずか亜鉛0.333/モル誘導体化タンパク質の存在下で一部不溶性であり、競合化合物の存在は可溶性を回復させ、結晶化をもたらす。 Further, a part insoluble in the presence of many derivatized proteins only zinc 0.333 / mol derivatized protein, the presence of competing compounds restored the soluble, resulting in crystallization. 競合化合物の最適濃度は、タンパク質および誘導体化タンパク質のあらゆる組合せのための常套的技術を用いて決定することができる。 The optimum concentration of competing compound can be determined using routine techniques for any combination of protein and derivatized protein. もちろん、上限は、競合化合物により亜鉛が沈殿する濃度、または残留する競合化合物が、投与部位に痛みや刺激をもたらすような医薬的に許容されない濃度である。 Of course, the upper limit is the concentration of zinc by competing compounds precipitates or residual competing compound is a pharmaceutically unacceptable concentrations that result in pain and irritation at the site of administration.

【0112】 本発明の沈殿物および結晶の製造方法の例を以下に示す。 [0112] Examples of precipitates and production method of the crystal of the present invention are shown below. 測定した量の誘導体化タンパク質および測定した量のタンパク質を、六量体安定化化合物、例えばフェノール性化合物を含む適切な溶媒に溶解するか、または該溶媒中で溶液を形成するよう混合する。 Of protein measured amount of derivatized protein and the determined amount hexamer stabilizing compound, for example, either dissolved in a suitable solvent containing the phenolic compound, or mixed to form a solution in the solvent. この溶液に、可溶性塩の1つ(例えばZn(II)Cl 2 )として亜鉛の溶液を加え、亜鉛約0.3モル/モル誘導体化インスリン〜亜鉛約0.7モルもしくはほぼ1.0モル/モル総タンパク質(タンパク質+誘導体化タンパク質)とする。 To this solution, one of the soluble salt (e.g. Zn (II) Cl 2) zinc solution as added, zinc about 0.3 mol / mol derivatized insulin-zinc about 0.7 mole or about 1.0 mole / mole of total protein (protein + and derivatized protein). 所望により、無水エタノールまたは別の混和性有機溶媒を、約5%〜約10%(容量)有機溶媒の溶液となる量にこの溶液に加えてよい。 If desired, absolute ethanol or another miscible organic solvent, may be added to the solution in an amount which is a solution of about 5% to about 10% (volume) organic solvent. 次に、この溶液を0.22ミクロンのタンパク質低結合フィルターでろ過してよい。 Next, this solution may be filtered through a low protein-binding filter 0.22 micron. プロタミン溶液は測定した量のプロタミンを水性溶媒に溶解して製造する。 Protamine solution protamine measured amount prepared by dissolving in an aqueous solvent. この溶液を0.22ミクロンのタンパク質低結合フィルターでろ過してよい。 The solution may be filtered through a low protein-binding filter 0.22 micron. タンパク質および誘導体化タンパク質の溶液とプロタミン溶液を混合し、そこで最初に沈殿物が形成される。 Solution and the protamine solution of the protein and derivatized protein were mixed, where first precipitate forms. 得られた懸濁液を室温(典型的には約20〜25℃)で徐々に攪拌し、次いで、約4時間〜約 The resulting suspension was stirred slowly at room temperature (typically about 20-25 ° C.), then about 4 hours to about
10日間の期間内に微結晶が形成される。 Microcrystals are formed within a period of 10 days.

【0113】 次に、微結晶を母溶液から分離し、保存および患者に投与するために異なる溶媒に入れる。 [0113] Next, fine crystals were separated from the mother solution, placed in different solvents for administration saved and the patient. 適切な水性溶媒の例は以下の通りである: 25mMトリス、5mg/mLフェノール、および16mg/mLグリセロールを含む注射用水、2mg/mL第二リン酸ナトリウム、1.6mg/mL m-クレゾール、0.65mg/mL フェノール、および16mg/mLグリセロールを含む注射用水、および25mMトリス、5mg/mLフェノール、0.1Mクエン酸3 Examples of suitable aqueous solvents are as follows: 25 mM Tris, 5 mg / mL phenol, and 16 mg / mL water for injection containing glycerol, 2 mg / mL dibasic sodium phosphate, 1.6 mg / mL m-cresol, 0.65 mg / mL phenol, and 16 mg / mL water for injection containing glycerol, and 25mM tris, 5 mg / mL phenol, 0.1 M trisodium citrate
ナトリウム、および16mg/mLグリセロールを含む注射用水。 Sodium and 16 mg / mL water for injection containing glycerol.

【0114】 本発明の不溶性組成物の別の製造方法では、例えば、測定した量の乾燥誘導体化タンパク質および測定した量の乾燥タンパク質を一緒に酸性水性溶媒、例えば [0114] In another method of manufacturing the insoluble compositions of the present invention, for example, an acidic aqueous solvent dry protein dry derivatized protein and measured the amount of measured amount together, e.g.
0.1N〜1.0N HClに溶解する。 Dissolved in 0.1N~1.0N HCl. この溶液を攪拌して誘導体化タンパク質とタンパク質を確実に完全に混合する。 The solution ensure complete mixing derivatized protein and protein by stirring. この混合物中の、タンパク質粉末に対する誘導体化タンパク質粉末の比を予め定義することにより生成すべき不溶性組成物中のタンパク質に対する誘導体化タンパク質が同様の比となるようにする。 The in the mixture, so as derivatized protein to protein in the insoluble composition to be produced by pre-defining the ratio of derivatized protein powder to protein powder is the same ratio. フェノール性保存剤、および所望により医薬的に許容される緩衝剤からなる別個に製造した水性溶液を該タンパク質の酸性溶液と混合する。 Phenolic preservative, and optionally a pharmaceutically acceptable separately prepared aqueous solution comprising a buffer which is mixed with the acidic solution of the protein. 次に、得られた溶液のpHを約6.8 The pH of the resulting solution to about 6.8
〜約8.4、好ましくは約6.8〜約8.0、またはpH約7.2〜約7.8、および最も好ましくは約7.4〜約7.8に調整する。 To about 8.4, preferably from about 6.8 to about 8.0, or about pH 7.2 to about 7.8, and most preferably adjusted to about 7.4 to about 7.8. この溶液に、その可溶性塩(例えばZn(II)Cl 2 To this solution, a soluble salt (e.g. Zn (II) Cl 2)
の1つである亜鉛の溶液を加えて、亜鉛約0.3モル/モル総インスリン〜亜鉛約4 Is one solution of zinc added, and zinc about 0.3 mol / mol total insulin-zinc about 4
モル/モル総インスリンとする。 The mol / mol total insulin. この溶液を上記のpH、好ましくは約7.4〜7.6に調整し、次いで0.22ミクロンのタンパク質低結合フィルターでろ過してよい。 pH of this solution above, preferably adjusted to about 7.4 to 7.6, then it was filtered through a 0.22 micron low protein binding filter. 測定した量のプロタミンを水性溶媒に溶解してプロタミン溶液を調整する。 Protamine measured amount to adjust the protamine solution is dissolved in an aqueous solvent. プロタミン溶液は0.22ミクロンのタンパク質低結合フィルターでろ過してよい。 Protamine solution may be filtered through a low protein-binding filter 0.22 micron. タンパク質および誘導体化タンパク質の溶液を混合し、そこで最初に沈殿物が形成される。 The solution of protein and derivatized protein were mixed, where first precipitate forms. 得られた懸濁液を室温(典型的には約20〜25℃)で徐々に攪拌し、次いで、 The resulting suspension was stirred slowly at room temperature (typically about 20-25 ° C.), then
約4時間〜約10日間の期間内に微結晶が形成される。 Microcrystals are formed in about 4 hours to a period of about 10 days.

【0115】 本発明の不溶性組成物の別の製造方法では、最初に測定した量の誘導体化タンパク質をフェノール性保存剤を含む水性溶媒に溶解する。 [0115] In another method for manufacturing an insoluble composition of the present invention is to dissolve the first measured quantity of derivatized protein in an aqueous solvent containing a phenolic preservative. この溶液に、その可溶性塩(例えばZn(II)Cl 2 )の1つである亜鉛の溶液を加えて、亜鉛約0.3モル/モル誘導体化タンパク質〜亜鉛約4モル/モル誘導体化タンパク質とする。 To this solution was added which is one zinc solution of the soluble salts (for example Zn (II) Cl 2), and zinc about 0.3 mol / mol derivatized protein-zinc about 4 mol / mol-derivatized protein. 得られた溶液のpHを約6.8〜約8.4、好ましくは約6.8〜約8.0、またはpH約7.2〜約7.8、 The resulting solution pH to about 6.8 to about 8.4, preferably from about 6.8 to about 8.0, or about pH 7.2 to about 7.8,
および最も好ましくは約7.4〜約7.8に調整する。 And most preferably adjusted to about 7.4 to about 7.8. 測定した量の、インスリン、インスリン類似体、およびプロインスリンからなる群から選ばれるタンパク質をフェノール性保存剤を含む水性溶媒に溶解して第二溶液を別個に調製する。 The measured amount of insulin, insulin analogs, and separately preparing a second solution by dissolving in an aqueous solvent containing a phenolic preservative protein selected from the group consisting of proinsulin. この溶液に、その可溶性塩(例えばZn(II)Cl 2 )の1つである亜鉛の溶液を加えて、亜鉛約0.3モル/モルタンパク質〜亜鉛約4モル/モルタンパク質とする。 To this solution was added which is one solution of zinc soluble salts thereof (e.g., Zn (II) Cl 2), and zinc about 0.3 mol / mol protein-zinc about 4 mol / mol protein. 次いで、 Then,
得られた溶液のpHを約6.8〜約8.4、好ましくは約6.8〜約8.0、または好ましくは The resulting solution pH to about 6.8 to about 8.4, preferably from about 6.8 to about 8.0, or preferably
pH約7.2〜約7.8、および最も好ましくは約7.4〜約7.8もしくは7.4〜7.6に調整する。 pH about 7.2 to about 7.8, and most preferably adjusted to about 7.4 to about 7.8 or 7.4 to 7.6. 誘導体化タンパク質溶液およびタンパク質溶液の部分を、不溶性組成物と同様の誘導体化タンパク質/タンパク質比を達成するために予め定義した比で混合する。 The portion of the derivatized protein solution and protein solution are mixed in a predefined ratio to achieve the insoluble composition similar to derivatized protein / protein ratio. この溶液を攪拌して誘導体化タンパク質溶液とタンパク質を確実に完全に混合する。 The solution ensure complete mixing derivatized protein solution and the protein by stirring. 次に、この溶液をpH約7.6に調整し、次いで0.22ミクロンのタンパク質低結合フィルターでろ過してよい。 The solution was then adjusted to a pH of about 7.6, then it was filtered through a 0.22 micron low protein binding filter. 測定した量のプロタミンを水性溶媒に溶解してプロタミン溶液を調整してよい。 Protamine measured amount may adjust the protamine solution is dissolved in an aqueous solvent. このプロタミン溶液を0.22ミクロンのタンパク質低結合フィルターでろ過してよい。 The protamine solution may be filtered through a 0.22 micron low protein binding filter. タンパク質および誘導体化タンパク質の溶液を混合し、そこで最初に沈殿物が形成される。 The solution of protein and derivatized protein were mixed, where first precipitate forms. 得られた懸濁液を室温(典型的には約20〜25℃)で徐々に攪拌し、次いで、約4時間〜約10日間の期間内に微結晶が形成される。 The resulting suspension was stirred slowly at room temperature (typically about 20-25 ° C.), then fine crystals are formed within a time period of about 4 hours to about 10 days.

【0116】 本発明の不溶性組成物を生成する非常に多くの種類の方法をすべて説明している訳ではないが、以下に本発明のさらなる方法を示す: タンパク質、誘導体化タンパク質、六量体安定化化合物、および二価金属カチオンを、六量体の形成を許すpHを有する水性溶媒に溶解し、次いでコンプレックス形成化合物を加える、 タンパク質、誘導体化タンパク質、六量体安定化化合物、および二価金属カチオンを、六量体の形成を許さないpHを有する水性溶媒に溶解し、pHを約6.8〜約7 [0116] While not being all described numerous types of methods of producing an insoluble composition of the present invention, illustrating a further method of the present invention include the following: protein, derivatized protein, a hexamer stabilizing compounds, and divalent metal cations, dissolved in an aqueous solvent having a pH that allows formation of the hexamer, then added complex-forming compound, a protein, a derivatized protein, a hexamer stabilizing compound, and a divalent metal cations, dissolved in an aqueous solvent having a pH that does not allow the formation of hexamers, about 6.8 to about a pH 7
.8に調整し、次いでコンプレックス形成化合物を加える、 タンパク質、六量体安定化化合物、および二価金属カチオンを、六量体の形成を許すpHを有する水性溶媒に溶解し、誘導体化タンパク質、六量体安定化化合物、および二価金属カチオンを、六量体の形成を許すpHを有する水性溶媒に別個に溶解し、これら2つの溶液を完全に混合し、次いでコンプレックス形成化合物を加える、 タンパク質、六量体安定化化合物、二価金属カチオン、およびコンプレックス形成化合物を水性溶媒に溶解し(得られた溶液は沈殿を生じないpHである)、誘導体化タンパク質、六量体安定化化合物、二価金属カチオンおよびコンプレックス形成化合物を水性溶媒に別個に溶解し(得られた溶液は沈殿を生じないpHである)、これら2つの溶液を完全に混合し Adjusted to .8, then added complex-forming compound, a protein, a hexamer stabilizing compound, and a divalent metal cation, dissolved in an aqueous solvent having a pH that allows formation of the hexamer, derivatized protein, six mer stabilizing compound, and a divalent metal cation, separately dissolved in an aqueous solvent having a pH that allows the formation of hexamers, two solutions thoroughly mixed, then added complex-forming compound, a protein, hexamer stabilizing compound, a divalent metal cation, and the complex forming compound is dissolved in an aqueous solvent (the resulting solution is pH without precipitation), derivatized protein, a hexamer stabilizing compound, a divalent the metal cations and complexing compound are separately dissolved in an aqueous solvent (the resulting solution is pH without precipitation), two solutions were thoroughly mixed 溶液のpHを沈殿が生じる値に調整する、 タンパク質、誘導体化タンパク質、六量体安定化化合物、二価金属カチオン、 Adjusted to pH value occurs precipitation of the solution, protein, derivatized protein, a hexamer stabilizing compound, a divalent metal cation,
およびコンプレックス形成化合物を水性溶媒に溶解し(得られた溶液は沈殿を生じないpHである)、溶液のpHを沈殿が生じる値に調整する、 タンパク質、誘導体化タンパク質、六量体安定化化合物、および二価金属カチオンを水性溶媒に溶解し(得られた溶液はコンプレックス形成剤を加えたときに沈殿を生じないpHである)、コンプレックス形成化合物を加え、溶液のpHを沈殿が生じる値に調整する、 タンパク質、六量体安定化化合物、および二価金属カチオンを水性溶媒に溶解し(得られた溶液はコンプレックス形成化合物を加えたときに沈殿を生じないpH And complex forming compound is dissolved in an aqueous solvent (the resulting solution is pH without causing precipitation), adjusted to pH values ​​that occurs the precipitation of the solution, protein, derivatized protein, a hexamer stabilizing compound, and divalent metal cations dissolved in an aqueous solvent (the resulting solution is pH that does not cause a precipitate upon addition of complex forming agent), was added complex-forming compound, adjusted to a value of pH of the solution is precipitated occur to the protein, a hexamer stabilizing compound, and a divalent metal cation dissolved in an aqueous solvent (the resulting solution does not cause precipitation when adding complex forming compound pH
である)、別個に、誘導体化タンパク質、六量体安定化化合物、および二価金属カチオンを水性溶媒に溶解し(得られた溶液はコンプレックス形成化合物を加えたときに沈殿を生じないpHである)、溶液にコンプレックス形成化合物を加え、 In a), separately, derivatized protein, a hexamer stabilizing compound, and a divalent metal cation dissolved in an aqueous solvent (the resulting solution is at a pH that does not cause a precipitate upon addition of complex forming compound ), the complex forming compound added to the solution,
溶液のpHを沈殿が生じる値に調整する、 タンパク質、誘導体化タンパク質、六量体安定化化合物、および二価金属カチオンを水性溶媒に溶解し(得られた溶液はコンプレックス形成化合物を加えたときに沈殿を生じないpHである)、溶液のpHを、コンプレックス形成化合物を加えたときに沈殿が生じる値に調整し、次いで、溶液にコンプレックス形成化合物を加える、 タンパク質、六量体安定化化合物、および二価金属カチオンを水性溶媒に溶解し(得られた溶液はコンプレックス形成化合物を加えたときに沈殿を生じないpH Adjusted to a value pH is the precipitation occurs in the solution, the protein, derivatized protein, a hexamer stabilizing compound, and a divalent metal cation dissolved in an aqueous solvent (the resulting solution when the addition of complex forming compound a pH which does not cause precipitation), the pH of the solution was adjusted to a value that precipitation occurs when the addition of complex-forming compounds, followed by the addition of complex forming compound in the solution, the protein, a hexamer stabilizing compound, and pH divalent metal cations dissolved in an aqueous solvent (the resulting solution is not causing a precipitate upon addition of complex forming compound
である)、別個に、誘導体化タンパク質、六量体安定化化合物、および二価金属カチオンを水性溶媒に溶解し(得られた溶液はコンプレックス形成化合物を加えたときに沈殿を生じないpHである)、これら2つの溶液を完全に混合し、溶液の In a), separately, derivatized protein, a hexamer stabilizing compound, and a divalent metal cation dissolved in an aqueous solvent (the resulting solution is at a pH that does not cause a precipitate upon addition of complex forming compound ), the two solutions thoroughly mixed, the solution
pHを、コンプレックス形成化合物を加えたときに沈殿が生じる値に調整し、次いで、溶液にコンプレックス形成化合物を加える。 The pH, adjusted to a value that precipitation occurs when the addition of complex-forming compounds, followed by the addition of complex forming compound in the solution.

【0117】 好ましい態様では、予め、母液から微結晶を分離する必要がない方法で微結晶を製造する。 [0117] In a preferred embodiment, in advance, to produce fine crystals in a way that do not need to separate the microcrystals from the mother liquor. すなわち、母液はそれ自身で患者に投与するのに適しているか、または母液を適切な希釈剤を用いて希釈することにより投与に適するようにすることができることが好ましい。 That is, the mother liquid preferably can be made suitable for administration by dilution with it or are suitable for administration to the patient himself, or the mother liquor a suitable diluent. 用語希釈剤は、限定されるものではないが、緩衝剤、等張性物質、亜鉛、保存剤、プロタミンなどを含む種々の医薬的に許容される賦形剤が溶解する水性溶液からなる溶液を意味する。 The term diluents include, but are not limited to, buffering agents, isotonicity agent, zinc, a preservative, a solution consisting of a variety of pharmaceutically acceptable aqueous solution the excipient lysis, including protamine means.

【0118】 タンパク質、誘導体化タンパク質、二価イオン、コンプレックス形成化合物、 [0118] Proteins, derivatized protein, divalent ions, complex forming compounds,
および六量体安定化化合物に加えて、本発明に従って非経口投与に適した医薬的組成物には、さらに賦形剤、担体、例えば水混和性有機溶媒、例えばグリセロール、ゴマ油、水性プロピレングリコールなどを用いてよい。 And in addition to the hexamer stabilizing compound, a pharmaceutical composition suitable for parenteral administration according to the present invention, further excipients, carriers, such as water miscible organic solvents, such as glycerol, sesame oil, aqueous propylene glycol, etc. it may be used. 存在する場合、そのような物質は通常、最終製剤の約2.0重量%以下の量で用いられる。 If present, such materials are typically used in an amount of about 2.0% by weight of the final formulation. 非経口用生成物のための常套的賦形剤もしくは担体を用いる種々の技術に関するさらなる情報については、Remington's Pharmaceutical Sciences, 第17版, Mack Publishing For further information regarding various techniques using conventional excipients or carriers for parenteral products, Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed., Mack Publishing
Company, Easton, PA, USA(1985)参照のこと(この内容は本明細書の一部を構成する)。 Company, Easton, PA, USA (1985) see (the contents of which is incorporated herein by reference).

【0119】 本発明の一般的な実施において、製剤がインスリン、誘導体化インスリン、インスリン誘導体、および誘導体化インスリン類似体から選ばれるタンパク質の可溶性分画および微結晶の混合物を含んでいてよいことも予期される。 [0119] In general practice of the present invention, the formulation is insulin, derivatized insulin, insulin derivatives, and also may comprise a mixture of soluble fraction and fine crystals of a protein selected from the derivatized insulin analog expected It is. そのような医薬的組成物の例には、医薬的に許容される緩衝剤で緩衝された、発熱物質を含まない、インスリン、インスリン類似体、誘導体化インスリン、または誘導体化インスリン類似体の無菌の等張水性生理食塩水溶液が含まれる。 Examples of such pharmaceutical compositions, buffered with a pharmaceutically acceptable buffer, pyrogen-free insulin, insulin analogues, derivatized insulin or sterile derivatized insulin analog, isotonic aqueous saline solution. 可溶相には、インスリンまたは急性に作用するインスリン類似体、例えばLysB28,ProB29-ヒトインスリン、またはAspB28-ヒトインスリンが好ましい。 The soluble phase, insulin analogues acting insulin or acute, for example LysB28, preferably ProB29- human insulin or AspB28- human insulin. そのような混合物は、可溶性インスリンにより提供される血糖値の食事時の調節と、不溶性インスリンによりもたらされる血糖値の基礎調節の組合せを提供するよう設計される。 Such mixtures, and adjusted prandial of blood glucose levels provided by the soluble insulin, is designed to provide a combination of the basic regulation of blood sugar caused by the insoluble insulin. 不溶相中の総タンパク質(タンパク質+誘導体化タンパク質)、および可溶相中の総タンパク質の比は、約9:1〜約1:9の範囲である。 Total protein insoluble phase (protein + derivatized protein), and the ratio of the total protein in the soluble phase is from about 9: in the range of 9: 1 to about 1. この比の好ましい範囲は約9:1〜 A preferred range for this ratio is from about 9: 1
約1:1、より好ましくは約7:3である。 About 1: 1, more preferably from about 7: 3. 他の比は1:1および3:7である。 Other ratios 1: 1 and 3: 7.

【0120】 吸入のための結晶または共結晶の有効量は、約0.5μg/kg〜約200μg/kg総タンパク質が必要である。 [0120] An effective amount of the crystal or co-crystal for inhalation, it is necessary about 0.5 [mu] g / kg to about 200 [mu] g / kg total protein. 好ましい用量は、約5μg/kg〜約100μg/kg、約10μg/kg〜 A preferred dose is from about 5 [mu] g / kg to about 100 [mu] g / kg, about 10 [mu] g / kg to
約100μg/kg、約20μg/kg〜約100μg/kg、または約30μg/kg〜約100μg/kgである。 About 100 [mu] g / kg, about 20 [mu] g / kg to about 100 [mu] g / kg, or about 30 [mu] g / kg to about 100 [mu] g / kg,. より好ましくは、該用量は約10μg/kg〜約60μg/kg、20μg/kg〜約60μg/kg More preferably, the dose of about 10 [mu] g / kg to about 60μg / kg, 20μg / kg~ about 60 [mu] g / kg
、または30μg/kg〜約60μg/kgである。 , Or 30 [mu] g / kg to about 60 [mu] g / kg. 治療的有効量は、インスリンタンパク質レベル、患者の体調、患者の肺の状態、該タンパク質の有効性とバイオアベイラビリティ、総タンパク質を別のインスリン、例えば速作用もしくは食事時インスリンまたは他の治療剤とともに投与するか否か、または医師に知られた他の因子を含む因子を考慮して、博識な医師が決定することができる。 Administering a therapeutically effective amount of an insulin protein levels, the patient's physical condition, the patient's lung condition, the effectiveness of the protein and bioavailability, total protein another insulin, for example, with fast acting or prandial insulin or other therapeutic agent whether or taking into account the factors including other factors known to the physician, it is possible to knowledgeable physician to determine. 有効な開始療法には、患者の「タイトレーション」、すなわち、低用量で開始し、血糖値をモニターし、所望の血糖値を達成するのに必要な用量を増加することが含まれる。 The valid starting therapy, "titration" of a patient, i.e., starting with a low dose, to monitor blood glucose levels, which involves increasing the dose necessary to achieve the desired blood glucose level.

【0121】 本発明によれば、結晶および共結晶は、非誘導体化インスリンタンパク質の吸入および可溶性の誘導体化タンパク質の吸入の両方に比べてインスリンタンパク質の好都合な遅い取り込みを達成するために吸入により供給される。 According to [0121] the present invention, crystals and co-crystals supplied by inhalation to achieve the advantageous slow uptake of insulin protein in comparison to both the inhalation suction and soluble derivatized proteins underivatized insulin protein It is. 吸入投与は、結晶インスリンの皮下投与に匹敵する薬物動態をもたらす。 Inhalation administration can result in pharmacokinetics comparable to subcutaneous administration of crystalline insulin.

【0122】 本発明によれば、結晶および共結晶は、あらゆる種々の吸入用具、およびインスリンもしくは他のタンパク質を吸入により投与するための当該分野で知られた方法により供給される[Rubsamen, 米国特許第5,364,838号(1994年11月15日発行); Rubsamen, 米国特許第5,672,581号(1997年9月30日発行); Platzら、WIPO According to [0122] the present invention, crystals and co-crystals, any of a variety of inhalation devices, and is supplied by methods known in the art for administration by inhalation of insulin or other proteins [Rubsamen, U.S. Pat. No. 5,364,838 (issued Nov. 15, 1994); Rubsamen, U.S. Pat. No. 5,672,581 (Sep. 30, 1997 issue); Platz et al, WIPO
公開公報第W096/32149号(1996年10月17日公開); Pattonら、WIPO公開公報第W0 Publication No. W096 / 32149 (published Oct. 17, 1996); Patton et al., WIPO Publication No. W0
95/24183号(1995年9月14日公開); Johnsonら、米国特許第5,654,007号(1997 No. 95/24183 (published on September 14, 1995); Johnson et al., US Pat. No. 5,654,007 (1997
年8月5日発行); Goodmanら、米国特許第5,404,871号(1995年4月11日発行); R Year 5 August issue); Goodman et al., U.S. Patent No. 5,404,871 (issued Apr. 11, 1995); R
ubsamenら、米国特許第5,672,581号(1997年9月30日発行); Gondaら、米国特許第5,743,250号(1998年4月28日発行); Rubsamen, 米国特許第5,419,315号(199 ubsamen et al, U.S. Patent No. 5,672,581 (issued Sep. 30, 1997); Gonda et al., U.S. Patent No. 5,743,250 (issued Apr. 28, 1998); Rubsamen, U.S. Pat. No. 5,419,315 (199
5年5月30日発行); Rubsamenら、米国特許第5,558,085号(1996年9月24日発行) Issue 5 years May 30); Rubsamen et al., US Pat. No. 5,558,085 (issued Sep. 24, 1996)
; Gondaら、WIPO公開公報第W098/33480号(1998年8月6日公開); Rubsamen、米国特許第5,364,838号(1994年11月15日発行); Laubeら、米国特許第5,320,094号(1994年6月14日発行; Eljamalら、米国特許第5,780,014号(1998年7月14日発行); Backstromら、米国特許第5,658,878号(1997年8月19日発行); Backstromら、米国特許第5,518,998号(1996年5月21日発行); Backstromら、5,506,203(19 ; Gonda et al., WIPO Publication No. W098 / 33480 (8 June 1998 publication); Rubsamen, U.S. Pat. No. 5,364,838 (issued Nov. 15, 1994); Laube et al, U.S. Pat. No. 5,320,094 (1994 issued June 14; Eljamal et al., U.S. Patent No. 5,780,014 (issued Jul. 14, 1998); Backstrom et al, U.S. Patent No. 5,658,878 (issued Aug. 19, 1997); Backstrom et al, U.S. Patent No. 5,518,998 (issued May 21, 1996); Backstrom et al., 5,506,203 (19
96年4月9日発行); Meezanら、米国特許第5,661,130号(1997年8月26日発行); Issued April 9, 1996); Meezan et al, U.S. Patent No. 5,661,130 (issued Aug. 26, 1997);
Hodsonら、米国特許第5,655,523号(1997年8月12日発行); Schultzら、米国特許第5,645,051(1997年7月8日発行); Eiseleら、米国特許第5,622,166号(1997 Hodson et al., US Pat. No. 5,655,523 (issued Aug. 12, 1997); Schultz et al., US Patent No. 5,645,051 (issued Jul. 8, 1997); Eisele et al., US Pat. No. 5,622,166 (1997
年4月22日発行); Mecikalskiら、米国特許第5,577,497号(1996年11月26日); M April 22 issued); Mecikalski et al, U.S. Pat. No. 5,577,497 (Nov. 26, 1996); M
ecikalskiら、米国特許第5,492,112号(1996年2月20日発行); Williamsら、米国特許第5,327,883号(1994年7月12日発行); Williams, 米国特許第5,277,195 ecikalski et al, U.S. Patent No. 5,492,112 (issued Feb. 20, 1996); Williams et al., (issued Jul. 12, 1994) U.S. Pat. No. 5,327,883; Williams, U.S. Patent No. 5,277,195
号(1994年1月11日発行)]。 No. (issued Jan. 11, 1994)].

【0123】 本発明にしたがって結晶および共結晶を投与するのに用いる用具には当該分野でよく知られたもの、例えば、定用量吸入器、液体ネブライザー、乾燥粉末吸入器、噴霧器、熱気化器など、ならびにAradigm Corporationが開発したAERx(登録商標)肺薬剤供給システム、Inhale Therapeutic Systems, Inc.が開発した乾燥粉末製剤および供給用具、ならびにDura Pharmaceuticals, Inc.が開発したSp [0123] What the tool used to administer the crystals and co-crystals according to the present invention has been well known in the art, for example, metered dose inhalers, liquid nebulizers, dry powder inhalers, nebulizers, thermal evaporation device, etc. and AERx the Aradigm Corporation developed (TM) pulmonary drug delivery system, Inhale Therapeutic systems, dry powder formulations Inc. has developed and supplied tools, and Dura Pharmaceuticals, Inc. developed Sp
iros(登録商標)乾燥粉末吸入器システムを含む開発された技術により提供される用具が含まれる。 IROS (TM) tool provided by the developed technique comprises a dry powder inhaler system contains. 他の適切な技術には電気流体力学的エアロゾライザーが含まれる。 Other suitable techniques include electrohydrodynamic aerosolizer. 吸入用具は、良好な呼吸性を得るために、例えば、約10μm MMAD以下、好ましくは約1〜5μm MMAD、より好ましくは約1〜約3μm MMAD、最も好ましくは約 Inhalation devices, in order to obtain good breathability, e.g., about 10 [mu] m MMAD less, preferably about 1 to 5 [mu] m MMAD, more preferably from about 1 to about 3 [mu] m MMAD, and most preferably about
2〜約3μm MMADの範囲の小粒子を供給すべきである。 2 should provide the small particles in the range of about 3 [mu] m MMAD. さらに、吸入用具は、使用しやすく、持ち運びに好都合なように十分小さく、 Furthermore, inhalation devices are easy to use, convenient manner sufficiently small to carry,
多用量を提供でき、耐久性があるという点で実用的でなければならない。 It can provide multi-dose must be practical in that it is durable. 本発明の実施に適した市販の吸入用具の具体例としては、Turbohaler(Astra)、Rotahal Specific examples of commercially available inhalation devices suitable for the practice of the present invention, Turbohaler (Astra), Rotahal
er(Glaxo)、Diskus(Glaxo)、Ultraventネブライザー(Mallinckrodt)、Acorn II er (Glaxo), Diskus (Glaxo), Ultravent nebulizer (Mallinckrodt), Acorn II
ネブライザー(Marquest Medical Products)、Ventolin定用量吸入器(Glaxo)、Sp Nebulizer (Marquest Medical Products), Ventolin metered dose inhaler (Glaxo), Sp
inhaler粉末吸入器(Fisons)などが挙げられる。 inhaler powder inhaler (Fisons), and the like. インスリンおよび脂肪酸-アシル化インスリンは、乾燥粉末吸入器や噴霧器により好都合に供給することができる。 Insulin and a fatty acid - acylated insulin can be conveniently supplied by a dry powder inhaler or nebulizer. 結晶および共結晶を投与するための乾燥粉末吸入用具にはいくつかの望ましい特徴がある。 The dry powder inhalation devices for administering the crystals and co-crystals has several desirable features. 例えば、そのような吸入用具による供給は好都合に信頼でき、再生でき、そして正確である。 For example, supply by such inhalation devices can advantageously reliable, can play, and is accurate.

【0124】 当業者が認識するであろうように、医薬組成物の性質と量、および単回用量投与の持続時間は用いる吸入用具の種類に依存する。 [0124] As will be appreciated by those skilled in the art, the nature and amount of the pharmaceutical composition, and single dose duration of dosing will depend on the type of inhalation devices used. ネブライザーのようないくつかのエアロゾル供給システムについては、投与頻度と該システムが作動する時間の長さは、主としてエアロゾル中の結晶および共結晶の濃度に依存するだろう。 For some aerosol delivery systems, such as nebulizers, the length of time the frequency of administration and the system is activated will largely depend on the concentration of crystals and co-crystals in the aerosol.
例えば、投与時間が短いものはネブライザー溶液の結晶および共結晶濃度を高くして用いることができる。 For example, those shorter administration time can be used by increasing the crystals and co-crystals concentration of the nebulizer solution. 定用量吸入器のような用具は、高濃度のエアロゾルを生じることができ、短時間に所望の量の結晶または共結晶を供給するよう操作することができる。 Device such as a metered dose inhalers can produce higher aerosol concentrations, and can be operated to supply crystals or co-crystals of the desired amount in a short time. 乾燥粉末吸入器のような用具は、所定の薬効の物質が用具から放出されるまで活性物質を供給する。 Device such as a dry powder inhaler, supplies the active substance to a substance having a predetermined efficacy is released from the tool. この種の吸入器では、所定量の粉末中の結晶および共結晶の量が単回投与で供給される用量を決定する。 In this type of inhaler, it determines the dose amount of crystals and co-crystals in the powder of a given amount is supplied in a single dose.

【0125】 吸入用具により供給される結晶および共結晶の粒子サイズは、粒子が下部気道もしくは肺胞(表面積が大きいために蓄積に最も好都合である)に運ばれる程度を決定する。 [0125] The particle size of the crystals and co-crystals supplied by inhalation tool determines the extent particles carried to the lower respiratory tract or alveolar (most conveniently in storage due to the large surface area). 好ましくは結晶および共結晶の少なくとも約10%、好ましくは約10% Preferably at least about 10% of the crystals and co-crystals, preferably about 10%
〜約20%もしくはそれ以上が下部肺に蓄積する。 About 20% or more - is accumulated in the lower lung. 口で呼吸するヒトでの肺蓄積の最大効率は約2μm〜約3μm MMADで得られることが知られている。 Maximum efficiency of pulmonary accumulation in human breathing mouth are known to be obtained at about 2μm~ about 3 [mu] m MMAD. 約5μm MMADより大きいと肺蓄積は実質的に低下する。 About 5 [mu] m MMAD larger than the lung accumulation is substantially reduced. 約1μm MMADより小さいと肺蓄積は低下し、治療的に有効な充分量の粒子を供給するのが難しくなる。 About 1 [mu] m MMAD smaller than lung accumulation is reduced, to feed difficult a therapeutically effective sufficient amount of particles. 好ましくは、結晶および共結晶の粒子サイズは、約10μm以下、好ましくは約1μm〜約5μm MMADの範囲、より好ましくは約1〜約3μm MMADの範囲、最も好ましくは約2〜約3μm MM Preferably, the particle size of the crystals and co-crystals of about 10μm or less, preferably in the range of about 1μm~ about 5 [mu] m MMAD, more preferably from about 1 to about 3 [mu] m MMAD, and most preferably from about 2 to about 3 [mu] m MM
ADである。 It is AD.

【0126】 乾燥粉末の生成には、典型的には脂肪酸アシル化インスリンタンパク質の固体製剤から粒子を生成するのにスクレイパーブレードまたは空気ブラストのような方法を用いる。 [0126] The generation of the dry powder, typically using a method such as a scraper blade or an air blast to generate particles from a solid formulation of a fatty acid acylated insulin protein. 一般的には、粒子を容器内に生成し、次いで担体の気流を介して患者の肺内に粒子を輸送する。 In general, to produce particles in a container and then transported the particles to the lungs of a patient via a stream of carrier. 典型的には、現在の乾燥粉末吸入器では、固体および気流を終わらせる力は患者の吸入によってのみもたらされる。 Typically, in current dry powder inhalers, the force to end the solid and air flow is effected only by the patient's inhalation. ある適切な乾燥粉末吸入器はAstra製造のTurbohalerである。 One suitable dry powder inhaler is the Turbohaler of Astra production.

【0127】 本発明の結晶および共結晶の吸入による供給は、吸入用具、例えば、限定されるものではないが、ジェットネブライザー、乾燥粉末吸入器、超音波ネブライザー、ピストンポンプ、または電圧ネブライザーを用いることにより達成される。 [0127] supplied by crystallization and inhalation of co-crystals of the present invention, the suction devices, for example, but not limited to, jet nebulizers, dry powder inhalers, ultrasonic nebulizer, a piston pump or the use of a voltage nebulizer, It is achieved by.
ネブライザー用の液体溶液には、限定されるものではないが緩衝剤、保存剤、または界面活性剤のような物質を含んでいてもよい。 The liquid solution for a nebulizer, but are not limited to buffering agents, substances may include such as preservatives, or surfactants. 乾燥粉末製剤は、緩衝剤、および限定されるものではないがショ糖、乳糖、デキストロース、マンニトール、 Dry powder formulations include buffers, and without limitation sucrose, lactose, dextrose, mannitol,
トレハロース、デンプンといった糖もしくはポリオールの溶液からのスプレー乾燥粉末が含まれる。 Trehalose, spray-dried powder from a solution of sugar or a polyol such as starch.

【0128】 典型的には、乾燥粉末吸入器から投与するための結晶および共結晶の製剤は、 [0128] Typically, formulations of crystals and co-crystals for administration from a dry powder inhaler,
好ましくは粉砕や他の機械的操作を用いることなく生成される結晶および共結晶の微細乾燥粉末を含む。 Preferably includes a fine dry powder crystals and co-crystals are produced without the use of grinding or other mechanical operations. 該粉末には作用の比較的急速な発現(onset)と短い持続時間をもたらす非誘導体化インスリンまたはインスリン類似体、充填剤、緩衝剤、担体、賦形剤、別の添加物などを含むこともできる。 Relatively rapid expression (onset) and bring short duration underivatized insulin or insulin analogues act on the powders, fillers, buffers, carriers, excipients, also including further additives it can. 結晶および共結晶の乾燥粉末製剤は、特定の粉末吸入器から供給するのに必要な粉末の希釈を行い、製剤の加工を容易にし、製剤に好都合な粉末特性をもたらし、吸入用具からの粉末の分散を促し、製剤を安定化し(例えば、抗酸化剤または緩衝剤)、または製剤の風味付けなどのために添加剤を含むことができる。 Crystals and co-crystals of a dry powder formulation, performs dilution of powder required to supply the particular powder inhaler, to facilitate processing of the formulation, result in a favorable powder properties to the formulation, the powder from the suction tool dispersing urged, it can contain additives such as for stabilizing the formulation (e.g., antioxidants or buffers), or the formulation flavoring.

【0129】 好都合には、添加剤は患者の気道に有害作用を及ぼさない。 [0129] Advantageously, the additive does not have an adverse effect on the patient's airway. 該結晶および共結晶を添加剤と混合し、固体製剤が添加剤の粒子でコートされるかまたは該粒子と混合した結晶および共結晶の粒子を含むことができる。 Mixed with additives The crystals and co-crystals can include crystalline and co-crystals of particle solid formulation has mixed with or particles are coated with particles of the additive. 典型的な添加剤には、単糖類、二糖類、および多糖類、糖アルコール、および他のポリオール、例えば乳糖、グルコース、ラフィノース、メレジトース(melezitose)、ラクチトール、 Typical additives include monosaccharides, disaccharides, and polysaccharides, sugar alcohols, and other polyols, such as lactose, glucose, raffinose, melezitose (melezitose), lactitol,
マルチトール、トレハロース、ショ糖、マンニトール、デンプン、またはそれらの組合せ、界面活性剤、例えば、ソルビトール、ジホスファチジルコリン、またはレシチンなどが含まれる。 Maltitol, trehalose, sucrose, mannitol, starch, or combinations thereof, a surfactant, for example, sorbitol, and di-phosphatidylcholine or lecithin. 典型的な添加剤、例えば充填剤は、上記目的に有効な量(しばしば、製剤の約50重量%〜約90重量%)で存在する。 Typical additives such as fillers are present in an amount effective to the object (often about 50% to about 90% by weight of the formulation). タンパク質製剤用の当該分野で知られた添加剤を該製剤に含むこともできる。 The additives known in the art of protein formulations can also be included in the formulation. 例えば、日本特許出願第J04041421号(1992年2月12日公開、Taisho Pharmaceutical)参照。 For example, Japanese Patent Application No. J04041421 (published Feb. 12, 1992, Taisho Pharmaceutical) reference.

【0130】 好都合には、乾燥粉末として投与するには、該結晶または共結晶は約10μm以下のNMAD、好ましくは約1μm〜約5μmのMMAD、より好ましくは約1〜約3μm MMAD [0130] Conveniently, the administration as a dry powder, the crystals or co-crystals of about 10μm following NMAD, preferably MMAD of about 1μm~ about 5 [mu] m, more preferably from about 1 to about 3 [mu] m MMAD
の範囲、最も好ましくは約2〜約3μm MMADを持つ。 Range, and most preferably having from about 2 to about 3 [mu] m MMAD. 好ましい粒子サイズは患者肺の肺胞に効率的に供給され、そこに蓄積するのに有効である。 The preferred particle size is efficiently supplied to the alveoli of the patient lung, it is effective to accumulate there. 好ましくは、乾燥粉末は大部分、大多数の粒子が所望の範囲のサイズを持つように製造された粒子からなる。 Preferably, the dry powder consists mostly particles the majority of particles are prepared to have a size in the desired range.

【0131】 結晶または共結晶を含むスプレーは、結晶または共結晶を圧をかけて強制的にノズルを通すことにより生成することができる。 [0131] Spray comprising crystals or co-crystals can be produced by passing forcibly nozzle over pressure the crystal or co-crystal. ノズルのサイズと構成、かける圧力、および液体の供給速度を、所望の出力および粒子サイズを達成するために選ぶことができる。 Size and configuration of the nozzle, applying pressure, and the feed rate of the liquid can be chosen to achieve the desired output and particle size. 電気スプレーは、毛細管またはノズル供給口を接続した電場により生成することができる。 Electrospray can be produced by an electric field which is connected to a capillary or nozzle feed opening. 好都合にはスプレー器により供給される粒子の粒子サイズは、約10μm以下、好ましくは約1μm〜約5μm MMADの範囲、より好ましくは約1〜約3μm MMADの範囲、最も好ましくは約2〜約3μm MMADである。 Particle size conveniently particles fed by sprayer, about 10μm or less, preferably in the range of about 1μm~ about 5 [mu] m MMAD, more preferably from about 1 to about 3 [mu] m MMAD, and most preferably from about 2 to about 3 [mu] m is a MMAD. スプレーとして投与するのが結晶および共結晶には好ましい方法である。 The crystal and co-crystals for administration as a spray is a preferred method. 典型的には、スプレー器と共に用いるのに適した結晶および共結晶の製剤は、 Typically, the formulations of crystals and co-crystals suitable for use with sprayers,
水性溶液中に、溶液1mLあたり総タンパク質約1mg〜約20mgの濃度の結晶または共結晶を含む。 In an aqueous solution, including the concentration of the solution 1mL per total protein about 1mg~ about 20mg crystal or co-crystal. 該製剤は賦形剤、緩衝剤、等張性物質、保存剤、界面活性剤、および亜鉛といった物質を含むことができる。 Formulation may contain an excipient, buffer, isotonic agent, preservative, surfactant, and a material such as zinc. 該製剤は、緩衝剤、還元剤、バルクタンパク質もしくは炭水化物といったタンパク質を安定化するための物質または賦形剤も含むことができる。 The formulation buffer, a reducing agent may also comprise substances or excipients to stabilize proteins such bulk protein or carbohydrate. 結晶または共結晶を製剤化するのに有用なバルクタンパク質にはアルブミンやプロタミンなどが含まれる。 The crystals or co-crystals Bulk proteins useful in formulating the like albumin and protamine. スプレー製剤に有用な典型的な炭水化物には、ショ糖、マンニトール、乳糖、トレハロース、グルコースなどが含まれる。 Typical carbohydrates useful in spray formulations, sucrose, mannitol, lactose, trehalose, glucose and the like are included. スプレー製剤は、エアロゾルの形成において溶液の噴霧により生じる結晶または共結晶の表面に生じる凝集を減らすかもしくは防ぐことができる界面活性剤を含むこともできる。 Spray formulations may also contain a surface active agent that can prevent or reduce or aggregation occurring on the surface of the crystal or co-crystal caused by atomization of the solution in forming the aerosol. 種々の常套的表面活性剤、例えばポリオキシエチレン脂肪酸エステルおよびアルコール、ならびにポリオキシエチレンソルビトール脂肪酸エステルを用いることができる。 Various conventionally surface active agents can be used such as polyoxyethylene fatty acid esters and alcohols, and polyoxyethylene sorbitol fatty acid esters. 一般的に、量は製剤の0.001重量%〜 In general, the amount is 0.001% by weight of the formulation ~
4重量%である。 4 percent by weight. 本発明の目的に特に好ましい界面活性剤は、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート、ポリソルベート80、ポリソルベート20などである。 Especially preferred surfactants for purposes of this invention are polyoxyethylene sorbitan monooleate, polysorbate 80, polysorbate 20, or the like.
タンパク質製剤用に当該分野で知られたさらなる物質も該製剤に含まれる。 Additional materials known in the art for protein formulations are also included in the formulation.

【0132】 結晶または共結晶は、ジェットネブライザーや超音波ネブライザーのようなネブライザーにより投与することができる。 [0132] crystal or co-crystal can be administered by a nebulizer, such as jet nebulizer or an ultrasonic nebulizer. 典型的には、ジェットネブライザーでは、圧縮空気の供給源を用いて開口部を介し高速の空気ジェットを作り出す。 Typically, in a jet nebulizer, it produces a high velocity air jet through an opening with a source of compressed air. ガスがノズルから広がるので、低圧領域が生じ、液体リザーバーに接続した毛細管を介して結晶または共結晶の懸濁液が汲み上げられる。 The gas spreads from the nozzle, resulting a low-pressure region, a suspension of crystals or co-crystals is pumped through a capillary tube connected to a liquid reservoir. 毛細管から吹き出す懸濁液は毛細管を出ると矢のように飛んで不安定な糸状物および小滴となり、エアロゾルができる。 The suspension discharged from the capillary flew like an arrow exiting the capillary becomes unstable filamentous material and Shoshizuku can aerosol. ある範囲の構成、流速、および調節板を用いてジェットネブライザーから所望の性能特性を得ることができる。 A range of configurations, it is possible to flow rates, and baffle from the jet nebulizer with obtaining the desired performance characteristics. 超音波ネブライザーでは、高周波電気エネルギー、典型的には、圧電変換器を用いて振動機械エネルギーを得る。 In an ultrasonic nebulizer, high-frequency electrical energy, typically obtained vibration mechanical energy using a piezoelectric transducer.
このエネルギーを、直接にかまたはカップリング溶液を介して結晶または共結晶の懸濁液に伝達し、エアロゾルを生じさせる。 The energy transmitted to the suspension of crystalline or co-crystal via directly or coupling solution, causing an aerosol. 好都合には、ネブライザーにより供給された結晶または共結晶を含む粒子の粒子サイズは、約10μm以下、好ましくは約1μm〜約5μm MMADの範囲、より好ましくは約1〜約3μm MMADの範囲、最も好ましくは約2〜約3μm MMADである。 Advantageously, the particle size of the particles comprising the supplied crystal or co-crystal by a nebulizer is about 10μm or less, preferably in the range of about 1μm~ about 5 [mu] m MMAD, more preferably from about 1 to about 3μm range of MMAD, and most preferably is from about 2 to about 3 [mu] m MMAD.

【0133】 ジェットまたは超音波のネブライザーと共に用いるのに適した結晶の製剤は、 [0133] crystal formulations suitable for use with a jet or ultrasonic nebulizer,
典型的には、水性溶液中に溶液1mLあたり総タンパク質約1mg〜約20mgの濃度の結晶または共結晶を含む。 Typically includes a crystal or co-crystal concentration of total protein from about 1mg~ about 20mg per solution 1mL in an aqueous solution. 該製剤は、賦形剤、緩衝剤、等張性物質、保存剤、界面活性剤、および好ましくは亜鉛といった物質を含むことができる。 The formulation excipients, buffering agents, isotonicity agents, preservatives, surfactants, and preferably may include a material such as zinc. 該製剤は、緩衝剤、還元剤、バルクタンパク質もしくは炭水化物といったタンパク質を安定化するための物質または賦形剤も含むことができる。 The formulation buffer, a reducing agent may also comprise substances or excipients to stabilize proteins such bulk protein or carbohydrate. 製剤化に有用なバルクタンパク質にはアルブミンやプロタミンなどが含まれる。 The Bulk proteins useful in formulating the like albumin and protamine. 製剤化に有用な典型的な炭水化物には、ショ糖、マンニトール、乳糖、トレハロース、グルコースなどが含まれる。 Typical carbohydrates useful in formulating, sucrose, mannitol, lactose, trehalose, glucose and the like are included. 該製剤は、エアロゾルの形成において溶液の噴霧により生じる脂肪酸アシル化インスリンタンパク質の表面に生じる凝集を減らすかもしくは防ぐことができる界面活性剤を含むこともできる。 The formulation can also include a surfactant that can be prevented reduce or aggregation occurring on the surface of the fatty acylated insulin protein caused by atomization of the solution in forming the aerosol. 種々の常套的表面活性剤、例えばポリオキシエチレン脂肪酸エステルおよびアルコール、ならびにポリオキシエチレンソルビタール脂肪酸エステルを用いることができる。 Various conventionally surface active agents can be used such as polyoxyethylene fatty acid esters and alcohols, and polyoxyethylene sorbital fatty acid esters. 一般的に、量は製剤の0.001重量%〜4重量%である。 Generally, the amount is 0.001% to 4% by weight of the formulation. 本発明の目的に特に好ましい界面活性剤は、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート、ポリソルベート80、ポリソルベート20などである。 Especially preferred surfactants for purposes of this invention are polyoxyethylene sorbitan monooleate, polysorbate 80, polysorbate 20, or the like.

【0134】 定用量吸入器(MDI)では、プロペラント、結晶または共結晶の懸濁液、およびあらゆる賦形剤もしくは他の添加物が液化圧縮ガスを含む混合物として缶に含まれる。 [0134] In metered dose inhalers (MDI), a propellant, suspension of crystalline or co-crystal, and any excipients or other additives are contained in the can as a mixture including a liquefied compressed gas. 定量バルブが作動し、好ましくは約10μm以下の範囲の、好ましくは約1 Metering valve is actuated, preferably in the range of about 10μm or less, preferably about 1
μm〜約5μm MMADの範囲、より好ましくは約1〜約3μm MMADの範囲、最も好ましくは約2〜約3μm MMADのエアロゾルとして混合物を放出する。 Range of μm~ about 5 [mu] m MMAD, more preferably from about 1 to about 3 [mu] m MMAD, releasing the mixture and most preferably as an aerosol for about 2 to about 3 [mu] m MMAD. 所望のエアロゾル粒子サイズは、ジェット粉砕、スプレー乾燥、臨界点凝縮(critical point cond Desired aerosol particle size, jet milling, spray drying, critical point condensation (critical point cond
ensation)などを含む当業者に知られた種々の方法により製造された結晶または共結晶の製剤を用いて得ることができる。 It can be obtained using crystal or co-crystal formulation produced by a variety of methods known to those skilled in the art, including ensation). 本発明の方法に従って結晶化を調節することにより機械的方法を避けることが好ましい。 It is preferable to avoid mechanical method by adjusting the crystallization according to the method of the present invention. 好ましい定用量吸入器には3M Preferred metered dose inhalers 3M
またはGlaxoが製造するヒドロフルオロカーボンプロペラントを用いるものが含まれる。 Or Glaxo are included those using hydrofluorocarbon propellant to produce.

【0135】 定量吸入用具と共に用いる結晶または共結晶の製剤は、例えば界面活性剤の助けによりプロペラントに懸濁した、非水性媒質中の懸濁液中の微細粉末として結晶または共結晶を含むであろう。 [0135] Formulations of a metered-dose inhaler devices use with crystal or co-crystal, for example, it was suspended with the aid of a surfactant to propellant, comprise a crystal or co-crystal as a fine powder in suspension in a non-aqueous medium It will allo. プロペラントは、本目的に用いるあらゆる常套的物質、例えばクロロフルオロカーボン、ヒドロクロロフルオロカーボン、ヒドロフルオロカーボン、またはトリクロロフルオロメタン、ジクロロジフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタノール、および1,1,1,2-テトラフルオロエタン、HFA-134a(ヒドロフルオロアルカン-134a)、HFA-227(ヒドロフルオロアルカン-227)を含む炭化水素であってよい。 Propellants, any conventional substance used for this purpose, for example chlorofluorocarbons, hydrochlorofluorocarbons, hydrofluorocarbons or trichlorofluoromethane, dichlorodifluoromethane, dichlorotetrafluoroethane, and 1,1,1,2-tetrafluoroethane, , HFA-134a (hydrofluoroalkane 134a), it may be a hydrocarbon containing HFA-227 (hydrofluoroalkane -227). 好ましくはプロペラントはヒドロフルオロカーボンである。 Preferably the propellant is a hydrofluorocarbon. プロペラント中の懸濁液として結晶または共結晶を安定化させ、化学分解に対して活性物質を保護するなどのために界面活性剤を選ぶことができる。 To stabilize the crystal or co-crystal as a suspension in the propellant, it is possible to choose a surfactant, such as to protect the active agent against chemical degradation. 適切な界面活性剤には、ソルビタントリオレエート、ソーヤレシチン、オレイン酸などが含まれる。 Suitable surfactants include sorbitan trioleate, soya lecithin, and the like oleic acid. 該製剤は、さらなる物質や賦形剤も含むことができる。 The formulation can also contain additional substances and excipients. 本発明は、以下の実施例によりよりよく理解されよう。 The invention will be better understood by the following examples. これら実施例は本発明の具体的な態様を代表するものであって、本発明の範囲を限定するものではない。 These examples are representative of specific embodiments of the present invention and are not intended to limit the scope of the present invention.

【0136】 粒子サイズは以下のごとく測定する。 [0136] particle size is measured as follows. 下記の装置を用いて結晶および共結晶の粒子直径を測定してよい:Coulter(登録商標) Multisizer 646または同等物 ( The particle diameter of the crystals and co-crystals using the following equipment may be measured: Coulter (TM) Multisizer 646 or equivalent (
Coulter Corporation, Hialeah, FL)、Sampling Stand II, Model 999または同等物 (Coulter Corporation, Hialeah, FL)、50μm Coulter(登録商標)アパーチャチューブ、所望のPh値を挟むpH緩衝剤で較正したpHメーター。 Coulter Corporation, Hialeah, FL), Sampling Stand II, Model 999 or equivalent (Coulter Corporation, Hialeah, FL), 50μm Coulter (R) aperture tube, pH meter calibrated with pH buffer sandwiching the desired Ph value. 水1Lに第二リン酸ナトリウム結晶7.56g、m-クレゾール3.2g、グリセリン32g、 Second sodium phosphate crystals 7.56g of water 1L, m-cresol 3.2 g, glycerine 32g,
およびフェノール1.46gを含む保存希釈液(2X濃度)を調製する。 And preparing storage diluent containing phenol 1.46g of (2X concentration). 5N HClまたは5 5N HCl or 5
N NaOHでpHを7.35-7.45に調整し、0.22μmまたはそれ以下のポアサイズのフィルターでろ過する。 The pH was adjusted to 7.35-7.45 with N NaOH, filtered through a filter of 0.22μm or less pore size. 室温で保存。 Stored at room temperature. 保存希釈液1容量と水1容量を混合し、再度ろ過してワーキング希釈液(1X濃度)を作製する。 Save dilution 1 volume of water 1 volume mixture, to prepare a working dilution (1X concentration) and filtered again.

【0137】 被検試料を再懸濁する。 [0137] to re-suspending the test sample. バイアルに入っている場合は、手のひらで10回転させ、10回反転させて再懸濁する。 If contained in a vial, palm is 10 rotate, invert and re-suspended in 10 times. カートリッジに入っている場合は、手のひらで10 If you are in the cartridge, 10 in the palm of your hand
回転させ、10回反転させるのを3回行って再懸濁する。 Rotate and resuspended three times from inverting 10 times. 試料0.25 mLをピペットでワーキング希釈液100mLに入れる。 Samples 0.25 mL Add to the working dilutions 100mL Pipet. 一般的には、これを50秒のサンプリング時間で90,000〜300,000カウントの範囲の粒子カウントを得る。 In general, this obtain particles count ranging 90,000~300,000 counted in 50 seconds sampling time. 粒子カウントがこの範囲以下であるときは、試料を希釈し過ぎかも知れないので、0.25mL以上の容量の試料を用いて適切なカウント数を得る必要がある。 When particles count is less than this range, since it may excessively diluting the sample, it is necessary to obtain an appropriate number of counts using a sample of the above volume 0.25 mL. 適切な容量の懸濁液を加えて100,000〜300,000の範囲の粒子カウントを得る。 Obtain particles counts ranging from 100,000 to 300,000 by adding a suspension of appropriate capacity. 同時補正は15%を越えるべきではない。 Simultaneous correction should not exceed 15 percent. より濃いサンプルについては、0.25mL以下の容量を用いる必要があろう。 For darker samples would need to use a less capacity 0.25 mL. この希釈試料を含むビーカーを、外部電極が水中に確実に沈むようしてサンプリングスタンドに置く。 The beaker containing this diluted sample, placed in the sampling stand by so that external electrodes are submerged reliably in water. 1試料あたり1回測定する。 It is measured once per sample. 測定は50秒のサンプリング時間にわたり連続的に、徐々に攪拌しながら測定を行う。 Measurements continuously for 50 seconds sampling time, performing a gradual stirring measurements.

【0138】 機器については以下のパラメーターが典型的である。 [0138] The following parameters are typical for the equipment. ページ1開口部直径: 50μm 開口部長: 53μm セットアップ: マニュアル 分析: 試料 較正: リコール Kd: 505.00(既定値は各較正により異なる) サイズ: 5 単位: μm ページ2電流およびゲイン(gain): マニュアル アパーチャー電流: 400μA ゲイン: 4 極性: + 機器制御: 時間 時間: 50s チャンネルカウント: 0 総カウント: 0t Page 1 opening diameter: 50 [mu] m aperture Director: 53 .mu.m Setup: Manual Analysis: Sample Calibration: Recall Kd: 505.00 (default is different for each calibration) Size: 5 units: [mu] m Page 2 current and gain (gain): Manual aperture current : 400 .mu.A gain: 4 polarity: + device control: time time: 50s channel count: 0 total count: 0t

【0139】 ページ3チャンネル: 256 オートスケーリング: オン エディット: オフ 同時補正: オン 分析容量: 粒子相対密度: 1 Diff値: % エンドトーン: オンページ4コミュニケーション セットアップRS232C シリアル アウトプットボーレート(Baud rate): 9600 装置: コンピューター オートプロット: なしプリント/プロットオプションチャンネルデータ: なし アナログプロット: なし スクリーンダンプ: あり オーバーレイモード: なし フォーマット: 増強コンピューターオプションセンド(send)STX/ETX: なし エンドフィールドChar: 59 エンドラインChar: CR ローディングゼロ: なし [0139] Page 3 Channel: 256 autoscaling: On edit: Off Simultaneous Correction: On Analysis Capacity: particle relative density: 1 Diff value:% end tone: On page 4 Communication Setup RS232C serial output baud (Baud rate): 9600 equipment: computer auto plot: No print / plot options channel data: None analog plot: None screen dump: Yes overlay mode: None format: enhancing computer option send (send) STX / ETX: No end field Char: 59 end line Char: CR loading zero: None

【0140】 Coulter(登録商標)Multisizerを、粒子の特徴付け、すなわち、粒子の数とサイズの測定に用いる。 [0140] The Coulter (TM) Multisizer, characterization of particles, i.e., used to measure the number of particles and sizes. この機器は、導電性の液体に懸濁した粒子がいずれかの側に電極を有する小開口部を通過する時に電気抵抗の変化が生じる原理により作動する。 The device operates by the principle change in electrical resistance occurs when particles suspended in a conductive liquid is passed through the small opening having electrodes on either side. 抵抗の変化は粒子容積に関連し、本質的に粒子容積に比例した短い電気パルスを生じる。 The change in resistance associated with the particle volume, resulting in a short electrical pulses proportional essentially grain volume. 粒子容積の測定により等価容積直径を計算することができる。 It can be calculated equivalent capacity diameter by measurement of the grain volume.
一連のパルスを電子的にソートすることによりサイズ分布曲線を得る。 A series of pulses to obtain a size distribution curve by sorting electronically. 機器と一体になったソフトウエアにより数と容積の統計とその分布を得る。 Obtain statistically and distribution of the number and volume of the equipment and software that is integral.

【0141】 下記製造例および実施例に用いる略号は以下の通りである: BHI:組み換えDNAで形質転換した生物体中で生合成された生合成ヒトインスリン [0141] Abbreviations used in the following Preparations and Examples are as follows: BHI: Recombinant DNA biosynthesis human insulin biosynthesized by organisms which had been transformed with
Zn-BHI:ヒトインスリン1分子あたり亜鉛原子0.33個を含む生合成ヒトインスリンの亜鉛結晶 C6-BHI:B29-N ε -ヘキサノイル-ヒトインスリン C8-BHI:B29-N ε -デカノイル-ヒトインスリン VMSED:結晶または共結晶の粒度分布の容積平均球形等価直径;単位はミクロン SD:結晶または共結晶の粒子サイズ分布の標準偏差;単位はミクロン Zn-BHI: biosynthetic human insulin containing 0.33 or human insulin per molecule zinc atom zinc crystal C6-BHI: B29-N ε - hexanoyl - human insulin C8-BHI: B29-N ε - decanoyl - human insulin VMSED: volume average spherical equivalent diameter of the particle size distribution of crystal or co-crystal; unit microns SD: standard deviation of the grain size distribution of crystal or co-crystal; unit microns

【0142】 製造例1 40mg/mL C8-BHIのストック溶液を凍結乾燥C8-BHI粉末をpH 1.2で溶解することにより製造する。 [0142] The lyophilized C8-BHI powder stock solution of Preparation 1 40mg / mL C8-BHI prepared by dissolving at pH 1.2. 40mg/mL C8-BHI 1mLに12.44mg/mL 酸化亜鉛25μLを加えた。 It was added 12.44mg / mL zinc oxide 25μL to 40mg / mL C8-BHI 1mL. この溶液1mLに、40mg/mLグリセリン、4.4mg/mL m-クレゾール、1.8mg/mL フェノール、9.375mg/mL第二ホスフェート、および7.35mg/mLクエン酸3ナトリウムを含む結晶化緩衝液4mLを加えた。 To this solution 1 mL, 40 mg / mL glycerin, 4.4 mg / mL m-cresol, 1.8 mg / mL phenol, 9.375mg / mL Second phosphate, and 7.35 mg / mL crystallization buffer 4mL containing trisodium citrate added It was. 得られた溶液のpHを5N NaOHで7.6に調整した。 The pH of the resulting solution was adjusted to 7.6 with 5N NaOH. 該溶液をMillipore Millex-GVフィルターでろ過し、等量の0.64mg/mL 硫酸プロタミンと混合した。 The solution was filtered through a Millipore Millex-GV filter and was mixed with an equal volume of 0.64 mg / mL protamine sulfate. 沈殿物が速やかに形成された。 Precipitate formed rapidly. 25℃に調節した温度で試料を静かに保存した。 It was gently store the sample at a temperature adjusted to 25 ° C.. 24時間後、いくらかの非晶質物質を含む棒状結晶が観察された。 After 24 hours, rod-shaped crystals containing some amorphous material was observed. 粒子サイズ(粒度)分布は幅広く、容積平均球形等価直径(VMSED)は9.7ミクロンであった。 Particle size (particle size) distribution is broad, the volume mean spherical equivalent diameter (VMSED) was 9.7 microns.

【0143】 製造例2 結晶化緩衝液が7.3mg/mL 塩化ナトリウムを含む以外は製造例1の方法を実施した。 [0143] Production Example 2 Crystallization buffer except containing 7.3 mg / mL sodium chloride was carried out in Preparation Example 1. 硫酸プロタミン添加後に速やかに沈殿物が形成された。 Immediately precipitate after addition of protamine sulfate are formed. 25℃に調節した温度で試料を静かに保存した。 It was gently store the sample at a temperature adjusted to 25 ° C.. 24時間後、非晶質沈殿物が棒状結晶物質に変化した。 After 24 hours, the amorphous precipitate is changed into a rod crystalline material. 粒度分布は塩化ナトリウムを加えていないときよりはるかに狭く、VMSED 5.8ミクロンであった。 The particle size distribution is much narrower than when no added sodium chloride was VMSED 5.8 microns. これは100% C8-BHI/プロタミン結晶の製造手段も提供する。 It also provides means for producing 100% C8-BHI / protamine crystals.

【0144】 製造例3 ともに40mg/mLのC8-BHIおよびZn-BHIストック溶液をpH1.2で調製した。 [0144] was prepared C8-BHI and Zn-BHI stock solution of Preparation 3 in both 40 mg / mL at pH 1.2. 40mg/m 40mg / m
L C8-BHI 0.85mLを40mg/mL Zn-BHI 0.15mLと混合した。 The L C8-BHI 0.85 mL was mixed with 40mg / mL Zn-BHI 0.15mL. このインスリン溶液に12 To this insulin solution 12
.44mg/mL 酸化亜鉛 21.25μLを加えた。 It was added .44mg / mL zinc oxide 21.25MyuL. この溶液1mLに、40mg/mL グリセリン、4 To this solution 1 mL, 40 mg / mL glycerin, 4
.4mg/mL m-クレゾール、1.8mg/mL フェノール、9.375mg/mL 第二ホスフェート、 .4mg / mL m- cresol, 1.8 mg / mL phenol, 9.375mg / mL Second phosphate,
および7.35mg/mL クエン酸3ナトリウムを含む結晶化緩衝液4mLを加えた。 And it was added 7.35 mg / mL crystallization buffer 4mL containing trisodium citrate. 得られた溶液のpHを5N NaOHで7.6に調整した。 The pH of the resulting solution was adjusted to 7.6 with 5N NaOH. 該溶液をMillipore Millex-GVフィルターでろ過し、等量の0.64mg/mL 硫酸プロタミンと混合した。 The solution was filtered through a Millipore Millex-GV filter and was mixed with an equal volume of 0.64 mg / mL protamine sulfate. 沈殿物が速やかに形成された。 Precipitate formed rapidly. 25℃に調節した温度で試料を静かに保存した。 It was gently store the sample at a temperature adjusted to 25 ° C.. 24時間後、非晶質沈殿物が棒状結晶物質に変化した。 After 24 hours, the amorphous precipitate is changed into a rod crystalline material. VMSEDは7.7ミクロンであった。 VMSED was 7.7 micron.

【0145】 製造例4 結晶化緩衝液が7.3mg/mL 塩化ナトリウムを含む以外は製造例3の方法を実施した。 [0145] Production Example 4 Crystallization buffer except containing 7.3 mg / mL sodium chloride was carried out the method of Preparation 3. 硫酸プロタミン添加後に速やかに沈殿物が形成された。 Immediately precipitate after addition of protamine sulfate are formed. 25℃に調節した温度で試料を静かに保存した。 It was gently store the sample at a temperature adjusted to 25 ° C.. 24時間後、非晶質沈殿物が棒状結晶物質に変化した。 After 24 hours, the amorphous precipitate is changed into a rod crystalline material.
塩化ナトリウムを加える効果は明らかで顕著であった。 Effect of adding sodium chloride was evident pronounced. この場合も粒度分布はかなり狭く、VMSEDは4.8ミクロンに減少した。 Again the particle size distribution is quite narrow, VMSED was reduced to 4.8 microns.

【0146】 製造例5 ともに40mg/mLのC8-BHIおよびZn-BHIストック溶液をpH1.2で調製した。 [0146] was prepared C8-BHI and Zn-BHI stock solution of preparation 5 both 40 mg / mL at pH 1.2. 40mg/m 40mg / m
L C8-BHI 0.75mLを40mg/mL Zn-BHI 0.25mLと混合した。 The L C8-BHI 0.75 mL was mixed with 40mg / mL Zn-BHI 0.25mL. このインスリン溶液に12 To this insulin solution 12
.44mg/mL 酸化亜鉛18.75μLを加えた。 It was added .44mg / mL zinc oxide 18.75MyuL. この溶液1mLに、40mg/mL グリセリン、4. To this solution 1 mL, 40 mg / mL glycerin, 4.
4mg/mL m-クレゾール、1.8mg/mL フェノール、9.375mg/mL 第二ホスフェート、 4 mg / mL m-cresol, 1.8 mg / mL phenol, 9.375mg / mL Second phosphate,
および7.35mg/mL クエン酸3ナトリウムを含む結晶化緩衝液4mLを加えた。 And it was added 7.35 mg / mL crystallization buffer 4mL containing trisodium citrate. 得られた溶液のpHを5N NaOHで7.6に調整した。 The pH of the resulting solution was adjusted to 7.6 with 5N NaOH. 該溶液をMillipore Millex-GVフィルターでろ過し、等量の0.64mg/mL 硫酸プロタミンと混合した。 The solution was filtered through a Millipore Millex-GV filter and was mixed with an equal volume of 0.64 mg / mL protamine sulfate. 沈殿物が速やかに形成された。 Precipitate formed rapidly. 25℃に調節した温度で試料を静かに保存した。 It was gently store the sample at a temperature adjusted to 25 ° C.. 24時間後、非晶質沈殿物が棒状結晶物質に変化した。 After 24 hours, the amorphous precipitate is changed into a rod crystalline material. VMSEDは6.2ミクロンであった。 VMSED was 6.2 micron.

【0147】 製造例6 結晶化緩衝液が7.3mg/mL 塩化ナトリウムを含む以外は製造例5の方法を実施した。 [0147] Production Example 6 Crystallization buffer except containing 7.3 mg / mL sodium chloride was carried out the method of Preparation 5. 硫酸プロタミン添加後に速やかに沈殿物が形成された。 Immediately precipitate after addition of protamine sulfate are formed. 25℃に調節した温度で試料を静かに保存した。 It was gently store the sample at a temperature adjusted to 25 ° C.. 24時間後、非晶質沈殿物が棒状結晶物質に変化した。 After 24 hours, the amorphous precipitate is changed into a rod crystalline material.
塩化ナトリウムを加える効果は明らかで顕著であった。 Effect of adding sodium chloride was evident pronounced. この場合も粒度分布はかなり狭く、VMSEDは4.2ミクロンに減少した。 Again the particle size distribution is quite narrow, VMSED was reduced to 4.2 microns.

【0148】 製造例7 ともに40mg/mLのC8-BHIおよびZn-BHIストック溶液をpH1.2で調製した。 [0148] was prepared C8-BHI and Zn-BHI stock solution of Production Example 7 in both 40 mg / mL at pH 1.2. 40mg/m 40mg / m
L C8-BHI 0.65mLを40mg/mL Zn-BHI 0.35mLと混合した。 The L C8-BHI 0.65 mL was mixed with 40mg / mL Zn-BHI 0.35mL. このインスリン溶液に12 To this insulin solution 12
.44mg/mL 酸化亜鉛16.25μLを加えた。 It was added .44mg / mL zinc oxide 16.25MyuL. この溶液1mLに、40mg/mL グリセリン、4. To this solution 1 mL, 40 mg / mL glycerin, 4.
4mg/mL m-クレゾール、1.8mg/mL フェノール、9.375mg/mL 第二ホスフェート、 4 mg / mL m-cresol, 1.8 mg / mL phenol, 9.375mg / mL Second phosphate,
および7.35mg/mL クエン酸3ナトリウムを含む結晶化緩衝液4mLを加えた。 And it was added 7.35 mg / mL crystallization buffer 4mL containing trisodium citrate. 得られた溶液のpHを5N NaOHで7.6に調整した。 The pH of the resulting solution was adjusted to 7.6 with 5N NaOH. 該溶液をMillipore Millex-GVフィルターでろ過し、等量の0.64mg/mL 硫酸プロタミンと混合した。 The solution was filtered through a Millipore Millex-GV filter and was mixed with an equal volume of 0.64 mg / mL protamine sulfate. 沈殿物が速やかに形成された。 Precipitate formed rapidly. 25℃に調節した温度で試料を静かに保存した。 It was gently store the sample at a temperature adjusted to 25 ° C.. 24時間後、非晶質沈殿物が棒状結晶物質に変化した。 After 24 hours, the amorphous precipitate is changed into a rod crystalline material. VMSEDは5.0ミクロンであった。 VMSED was 5.0 micron.

【0149】 製造例8 結晶化緩衝液が7.3mg/mL 塩化ナトリウムを含む以外は製造例7の方法を実施した。 [0149] Production Example 8 Crystallization buffer except containing 7.3 mg / mL sodium chloride was carried out the method of Preparation 7. 硫酸プロタミン添加後に速やかに沈殿物が形成された。 Immediately precipitate after addition of protamine sulfate are formed. 25℃に調節した温度で試料を静かに保存した。 It was gently store the sample at a temperature adjusted to 25 ° C.. 24時間後、非晶質沈殿物が棒状結晶物質に変化した。 After 24 hours, the amorphous precipitate is changed into a rod crystalline material.
塩化ナトリウムを加える効果は明らかで顕著であった。 Effect of adding sodium chloride was evident pronounced. この場合も粒度分布はかなり狭く、VMSEDは3.8ミクロンに減少した。 Again the particle size distribution is quite narrow, VMSED was reduced to 3.8 microns.

【0150】 製造例9 C8-BHIを最初にpH1.2のかわりにpH2.4で溶解する以外は製造例1の手順を実施した。 [0150] Except for dissolving the Production Example 9 C8-BHI first with pH2.4 instead of pH1.2 was conducted in Preparation Example 1 procedure. 24時間後、該物質はまだ大部分が非晶質で、棒状結晶が少しみられた。 After 24 hours, the material is still largely amorphous, rod-like crystals were a little seen. 粒度分布は多様(multi-modal)であった。 Particle size distribution was varied (multi-modal).

【0151】 製造例10 結晶化緩衝液が7.3mg/mL 塩化ナトリウムを含む以外は製造例9の方法を実施した。 [0151] Production Example 10 Crystallization buffer except containing 7.3 mg / mL sodium chloride was carried out the method of Preparation 9. 硫酸プロタミン添加後に速やかに沈殿物が形成された。 Immediately precipitate after addition of protamine sulfate are formed. 25℃に調節した温度で試料を静かに保存した。 It was gently store the sample at a temperature adjusted to 25 ° C.. 24時間後、塩化ナトリウムを加えない製造法と異なり、非晶質沈殿物が棒状結晶物質に変化した。 After 24 hours, unlike the manufacturing process without the addition of sodium chloride, amorphous precipitate changed into a rod crystalline material. VMSEDは8.4ミクロンであった。 VMSED was 8.4 micron. これは100% C8-BHI プロタミン結晶の製造の調節例を示し、低平均の、粒度分布が狭低いGaussian分布が達成された。 This indicates an adjustment example of a production of 100% C8-BHI protamine crystals, the low mean particle size distribution is narrow lower Gaussian distribution has been achieved.

【0152】 製造例11 C8-BHIを最初にpH1.2のかわりにpH2.4で溶解する以外は製造例3の手順を実施した。 [0152] Except for dissolving the Production Example 11 C8-BHI first with pH2.4 instead of pH1.2 was performed procedure of Preparation 3. 24時間後、非晶質沈殿物は棒状結晶物質に変化した。 After 24 hours, the amorphous precipitate turned into a rod-like crystal substance. VMSEDは11.0ミクロンであった。 VMSED was 11.0 microns.

【0153】 製造例12 結晶化緩衝液が7.3mg/mL 塩化ナトリウムを含む以外は製造例11の方法を実施した。 [0153] Production Example 12 Crystallization buffer except containing 7.3 mg / mL sodium chloride was carried out the method of Preparation 11. 硫酸プロタミン添加後に速やかに沈殿物が形成された。 Immediately precipitate after addition of protamine sulfate are formed. 25℃に調節した温度で試料を静かに保存した。 It was gently store the sample at a temperature adjusted to 25 ° C.. 24時間後、非晶質沈殿物が棒状結晶物質に変化した。 After 24 hours, the amorphous precipitate is changed into a rod crystalline material. 塩化ナトリウムを加える効果は明らかで顕著であった。 Effect of adding sodium chloride was evident pronounced. この場合も粒度分布はかなり狭く、VMSEDは6.5ミクロンに減少した。 Again the particle size distribution is quite narrow, VMSED was reduced to 6.5 microns.

【0154】 製造例13 C8-BHIを最初にpH1.2のかわりにpH2.4で溶解する以外は製造例5の手順を実施した。 [0154] Except for dissolving the Production Example 13 C8-BHI first with pH2.4 instead of pH1.2 was performed procedure of Preparation 5. 24時間後、非晶質沈殿物は棒状結晶物質に変化した。 After 24 hours, the amorphous precipitate turned into a rod-like crystal substance. VMSEDは8.7ミクロンであった。 VMSED was 8.7 micron.

【0155】 製造例14 結晶化緩衝液が7.3mg/mL 塩化ナトリウムを含む以外は製造例13の方法を実施した。 [0155] Production Example 14 Crystallization buffer except containing 7.3 mg / mL sodium chloride was carried out the method of Preparation 13. 硫酸プロタミン添加後に速やかに沈殿物が形成された。 Immediately precipitate after addition of protamine sulfate are formed. 25℃に調節した温度で試料を静かに保存した。 It was gently store the sample at a temperature adjusted to 25 ° C.. 24時間後、非晶質沈殿物が棒状結晶物質に変化した。 After 24 hours, the amorphous precipitate is changed into a rod crystalline material. 塩化ナトリウムを加える効果は明らかで顕著であった。 Effect of adding sodium chloride was evident pronounced. この場合も粒度分布はかなり狭く、VMSEDは6.0ミクロンに減少した。 Again the particle size distribution is quite narrow, VMSED was reduced to 6.0 microns.

【0156】 製造例15 C8-BHIを最初にpH1.2のかわりにpH2.4で溶解する以外は製造例7の手順を実施した。 [0156] Except for dissolving the Production Example 15 C8-BHI first with pH2.4 instead of pH1.2 was performed procedure of Preparation 7. 24時間後、非晶質沈殿物は棒状結晶物質に変化した。 After 24 hours, the amorphous precipitate turned into a rod-like crystal substance. VMSEDは7.0ミクロンであった。 VMSED was 7.0 micron.

【0157】 製造例16 結晶化緩衝液が7.3mg/mL 塩化ナトリウムを含む以外は製造例15の方法を実施した。 [0157] Production Example 16 Crystallization buffer except containing 7.3 mg / mL sodium chloride was carried out the method of Preparation 15. 硫酸プロタミン添加後に速やかに沈殿物が形成された。 Immediately precipitate after addition of protamine sulfate are formed. 25℃に調節した温度で試料を静かに保存した。 It was gently store the sample at a temperature adjusted to 25 ° C.. 24時間後、非晶質沈殿物が棒状結晶物質に変化した。 After 24 hours, the amorphous precipitate is changed into a rod crystalline material. 塩化ナトリウムを加える効果は明らかで顕著であった。 Effect of adding sodium chloride was evident pronounced. この場合も粒度分布はかなり狭く、VMSEDは4.7ミクロンに減少した。 Again the particle size distribution is quite narrow, VMSED was reduced to 4.7 microns.

【0158】 製造例17 凍結乾燥C8-BHI粉末61.4mgを0.1N HCl 1.54mLに溶解してC8-BHI溶液を調製した。 [0158] was prepared C8-BHI solution was dissolved Production Example 17 lyophilized C8-BHI powder 61.4mg into 0.1 N HCl 1.54 mL. 0.51mLの0.1N HClにZn-BHI結晶20.5mgを溶解してZn-BHI溶液調製した。 And Zn-BHI solution prepared by dissolving Zn-BHI crystals 20.5mg in 0.1N HCl of 0.51 mL. Zn-B Zn-B
HI溶液にC8-BHI溶液1.5 mLを加えた。 It was added C8-BHI solution 1.5 mL to HI solution. Zn-BHIおよびC8-BHI溶液に、12.44mg/mL酸化亜鉛ストック溶液49μLを加えた。 The Zn-BHI and C8-BHI solution was added 12.44mg / mL zinc oxide stock solution 49MyuL. この溶液に、40mg/mL グリセリン、4.4mg/m To this solution, 40 mg / mL glycerin, 4.4 mg / m
L m-クレゾール、1.8mg/mL フェノール、9.375mg/mL 第二ホスフェート、および L m-cresol, 1.8 mg / mL phenol, 9.375mg / mL Second phosphates, and
7.35mg/mL クエン酸3ナトリウムを含む結晶化緩衝液8mLを加えた。 It was added crystallization buffer 8mL containing 7.35 mg / mL trisodium citrate. 得られた溶液のpHを5N NaOHで7.6に調整した。 The pH of the resulting solution was adjusted to 7.6 with 5N NaOH. 該溶液をMillipore Millex-GVフィルターでろ過し、等量の0.64mg/mL 硫酸プロタミンと混合した。 The solution was filtered through a Millipore Millex-GV filter and was mixed with an equal volume of 0.64 mg / mL protamine sulfate. 沈殿物が速やかに形成された。 Precipitate formed rapidly. 懸濁液を等分し、20、25および30℃に調節した温度で静かに保存した。 The suspension was aliquoted and gently stored at a temperature adjusted to 20, 25 and 30 ° C.. 24 twenty four
時間後、非晶質沈殿物が棒状結晶物質に変化した。 After time, the amorphous precipitate is changed into a rod crystalline material. 温度の効果は明らかで顕著であった。 The effect of temperature was clearly noticeable. VMSEDは20、25および30℃でそれぞれ7.8、6.9、および5.5ミクロンであった。 VMSED were respectively 7.8,6.9 and 5.5 microns 20,25 and 30 ° C..

【0159】 製造例1-17の要約 [0159] Summary of Production Example 1-17

【0160】 上記製造例1〜17に基づいて以下の結論が得られる。 [0160] Conclusion follows based on the above Production Examples 1 to 17 are obtained. 第一に、C8-BHIの割合が同じ場合は、pH1.2で溶解するとpH2.4で溶解するよりより小さくタイトな粒度分布をもたらす。 First, when the ratio of the C8-BHI are the same, results in a small tight particle size distribution than from dissolved at pH2.4 when dissolved at pH 1.2. 第二に、C8-BHIの割合が低いと、結晶はより小さく、標準偏差もより小さくなる。 Second, the proportion of C8-BHI is low, crystals are smaller, the standard deviation is also smaller. 第三に、塩化ナトリウムを加えても結晶はより小さく、標準偏差もより小さくなる。 Third, the addition of sodium chloride also crystals smaller, standard deviation smaller. これは、明らかに、製剤化および製造工程で考えられる種々の改変により粒子サイズを調節する手段を提供する。 This clearly provides a means for adjusting the particle size by a variety of modifications contemplated formulation and manufacturing process. 最後に、塩化ナトリウムの添加も明らかに100% C8-BHI結晶の製造手段を提供する。 Finally, the addition of sodium chloride to provide a production means apparently 100% C8-BHI crystals.

【0161】 製造例18 約26.5mg/mLのC8-BHIおよび8.9mg/mLのZn-BHIのストック溶液50mLをpH1.2で調製した。 [0161] The stock solution 50mL of Zn-BHI of preparation 18 to about 26.5 mg / mL of C8-BHI and 8.9 mg / mL were prepared in pH 1.2. このインスリン溶液に12.44mg/mL 酸化亜鉛1mLを加えた。 It was added 12.44mg / mL zinc oxide 1mL this insulin solution. この溶液に、 To this solution,
40mg/mL グリセリン、4.4mg/mL m-クレゾール、1.8mg/mL フェノール、9.375mg/ 40 mg / mL glycerin, 4.4 mg / mL m-cresol, 1.8 mg / mL phenol, 9.375mg /
mL 第二ホスフェート、および7.35mg/mL クエン酸3ナトリウムを含む結晶化緩衝液200mLを加えた。 mL Second phosphate, and 7.35 mg / mL crystallization buffer 200mL containing trisodium citrate were added. 得られた溶液のpHを5N NaOHで7.6に調整した。 The pH of the resulting solution was adjusted to 7.6 with 5N NaOH. 該溶液をMil Mil The solution
lipore Millex-GVフィルターでろ過し、等量の0.64mg/mL 硫酸プロタミンと混合した。 Filtered through a lipore Millex-GV filter and was mixed with an equal volume of 0.64 mg / mL protamine sulfate. 沈殿物が速やかに形成された。 Precipitate formed rapidly. 25℃に調節した温度で試料を静かに保存した。 It was gently store the sample at a temperature adjusted to 25 ° C.. 24時間後、非晶質沈殿物が棒状結晶物質に変化した。 After 24 hours, the amorphous precipitate is changed into a rod crystalline material. VMSEDは7.8ミクロンであった。 VMSED was 7.8 micron.

【0162】 製造例19 約10.5mg/mLのC8-BHIおよび約3.5mg/mLのZn-BHIのストック溶液約120mLをpH2. [0162] A stock solution of about 120mL of Zn-BHI of C8-BHI of Preparation 19 to about 10.5 mg / mL and about 3.5 mg / mL pH 2.
4で調製した。 It was prepared by four. このインスリン溶液に12.44mg/mL 酸化亜鉛1mLを加えた。 It was added 12.44mg / mL zinc oxide 1mL this insulin solution. この溶液に、64mg/mL グリセリン、7.0mg/mL m-クレゾール、2.9mg/mL フェノール、15 To this solution, 64 mg / mL glycerin, 7.0 mg / mL m-cresol, 2.9 mg / mL phenol, 15
mg/mL 第二ホスフェート、および11.76mg/mL クエン酸3ナトリウムを含む結晶化緩衝液約125mLを加えた。 mg / mL Second phosphates, and 11.76mg / mL crystallization buffer about 125mL containing trisodium citrate were added. 得られた溶液のpHを5N NaOHで7.6に調整した。 The pH of the resulting solution was adjusted to 7.6 with 5N NaOH. 水を加えて容量を250mLとした。 The capacity and mixed with water to prepare 250mL. 該溶液をMillipore Millex-GVフィルターでろ過し、 The solution was filtered through a Millipore Millex-GV filter,
等量の0.64mg/mL 硫酸プロタミンと混合した。 It was mixed with an equal volume of 0.64 mg / mL protamine sulfate. 沈殿物が速やかに形成された。 Precipitate formed rapidly. 25 twenty five
℃に調節した温度で試料を静かに保存した。 The samples were quietly stored at ℃ temperature was adjusted to. 24時間後、非晶質沈殿物が棒状結晶物質に変化した。 After 24 hours, the amorphous precipitate is changed into a rod crystalline material. VMSEDは9.2ミクロンであった。 VMSED was 9.2 micron.

【0163】 製造例20 結晶化緩衝液が11.69mg/mL 塩化ナトリウムも含む以外は製造例19の手順に従った。 [0163] except that the Preparation Example 20 crystallization buffer also contains 11.69mg / mL sodium chloride according to the procedure of Preparation 19. 24時間後、非晶質沈殿物が棒状結晶物質に変化した。 After 24 hours, the amorphous precipitate is changed into a rod crystalline material. VMSEDは5.3ミクロンであった。 VMSED was 5.3 micron.

【0164】 製造例21 約10.5mg/mLのC8-BHIおよび3.5mg/mLのZn-BHIのストック溶液25mLをpH2.5で調製した。 [0164] The stock solution 25mL of Zn-BHI of preparation 21 to about 10.5 mg / mL of C8-BHI and 3.5 mg / mL were prepared in pH 2.5. このインスリン溶液2.5mLに12.44mg/mL 酸化亜鉛0.24μLを加えた。 It was added 12.44mg / mL zinc oxide 0.24μL to the insulin solution 2.5 mL. この溶液に、64mg/mL グリセリン、7.0mg/mL m-クレゾール、2.9mg/mL フェノール、15mg/mL 第二ホスフェート、および11.76mg/mL クエン酸3ナトリウムを含む結晶化緩衝液2.5mLを加えた。 To this solution was added 64 mg / mL glycerin, 7.0 mg / mL m-cresol, 2.9 mg / mL phenol, 15 mg / mL Second phosphates, and 11.76mg / mL crystallization buffer 2.5mL containing trisodium citrate . 得られた溶液のpHを5N NaOHで7.6に調整した。 The pH of the resulting solution was adjusted to 7.6 with 5N NaOH. 該溶液をMillipore Millex-GVフィルターでろ過し、等量の0.64mg/mL 硫酸プロタミンと混合した。 The solution was filtered through a Millipore Millex-GV filter and was mixed with an equal volume of 0.64 mg / mL protamine sulfate. 沈殿物が速やかに形成された。 Precipitate formed rapidly. 25℃に調節した温度で試料を静かに保存した。 It was gently store the sample at a temperature adjusted to 25 ° C.. 24時間後、非晶質沈殿物が棒状結晶物質に変化した。 After 24 hours, the amorphous precipitate is changed into a rod crystalline material. VMSEDは7.0 VMSED 7.0
9ミクロンであった。 It was 9 microns.

【0165】 製造例22 結晶化緩衝液が11.69mg/mL 塩化ナトリウムも含む以外は製造例21の手順に従った。 [0165] except that the Preparation Example 22 crystallization buffer also contains 11.69mg / mL sodium chloride according to the procedure of Preparation 21. 24時間後、非晶質沈殿物が棒状結晶物質に変化した。 After 24 hours, the amorphous precipitate is changed into a rod crystalline material. VMSEDは5.72ミクロンであった。 VMSED was 5.72 micron.

【0166】 製造例23 結晶化緩衝液が14.91mg/mL 塩化カリウムも含む以外は製造例21の手順に従った。 [0166] except that the Preparation Example 23 crystallization buffer also contains 14.91mg / mL potassium chloride according to the procedure of Preparation 21. 24時間後、非晶質沈殿物が棒状結晶物質に変化した。 After 24 hours, the amorphous precipitate is changed into a rod crystalline material. VMSEDは5.39ミクロンであった。 VMSED was 5.39 micron.

【0167】 製造例24 結晶化緩衝液が16.41mg/mL 酢酸ナトリウムも含む以外は製造例21の手順に従った。 [0167] except that the Preparation Example 24 crystallization buffer also contains 16.41mg / mL sodium acetate according to the procedure of Preparation 21. 24時間後、非晶質沈殿物が棒状結晶物質に変化した。 After 24 hours, the amorphous precipitate is changed into a rod crystalline material. VMSEDは7.39ミクロンであった。 VMSED was 7.39 micron.

【0168】 製造例25 結晶化緩衝液が46.02mg/mL 酒石酸ナトリウムも含む以外は製造例21の手順に従った。 [0168] except that the Preparation Example 25 crystallization buffer also contains 46.02mg / mL sodium tartrate according to the procedure of Preparation 21. 24時間後、非晶質沈殿物が棒状結晶物質に変化した。 After 24 hours, the amorphous precipitate is changed into a rod crystalline material. VMSEDは8.07ミクロンであった。 VMSED was 8.07 micron.

【0169】 製造例26 結晶化緩衝液が28.41mg/mL 硫酸ナトリウムも含む以外は製造例21の手順に従った。 [0169] except that the Preparation Example 26 crystallization buffer also contains 28.41mg / mL sodium sulfate according to the procedure of Preparation 21. 24時間後、非晶質沈殿物が棒状結晶物質に変化した。 After 24 hours, the amorphous precipitate is changed into a rod crystalline material. VMSEDは7.07ミクロンであった。 VMSED was 7.07 micron.

【0170】 製造例27 結晶化緩衝液が13.6mg/mL ギ酸ナトリウムも含む以外は製造例21の手順に従った。 [0170] except that the Preparation Example 27 crystallization buffer also contains 13.6 mg / mL sodium formate according to the procedure of Preparation 21. 24時間後、非晶質沈殿物が棒状結晶物質に変化した。 After 24 hours, the amorphous precipitate is changed into a rod crystalline material. VMSEDは6.90ミクロンであった。 VMSED was 6.90 micron.

【0171】 製造例18〜27の要約 [0171] Summary of Production Example 18-27

【0172】 製造例18〜27から以下の結論が得られる。 [0172] The following conclusions can be obtained from preparation 18-27. 第一に、結晶化を行うスケールは、 First, the scale of performing the crystallization,
塩化ナトリウムを添加しないと平均粒子サイズのみに影響を及ぼす。 Only affects the average particle size and without addition of sodium chloride. 塩化ナトリウム(すなわち、塩素アニオン)の添加は、製造化可能な方法を用いる大スケールでより再現性のある結果をもたらすであろう。 Sodium chloride (i.e., chloride anion) adding will result in a more reproducible results in large-scale use of available manufacturing methods. 塩化ナトリウムの効果は塩素によるものであり、ナトリウムによるものではない。 The effect of sodium chloride is by chlorine, not with sodium. 試験した他のアニオンは全くもしくはほとんど効果がなかった。 Other anions tested had no or little effect. これらの結果も、塩化ナトリウムの効果はイオン強度の増加によるものではなく、塩素アニオンの特異的効果によることを示している。 These results, the effect of sodium chloride is not due to an increase in ionic strength, indicating that due to specific effect of the chloride anions.

【0173】 製造例28 ラットの気管内点滴注入試験用の100% C8-BHI結晶製剤 C8-BHI(471mg)の乾燥凍結乾燥粉末を0.1N HCl 11.77mLに溶解した。 [0173] was dissolved dry lyophilized powder 100% C8-BHI crystal formulations C8-BHI for intratracheal instillation test of preparation 28 rats (471 mg) in 0.1N HCl 11.77mL. この溶液に1000ppm硝酸亜鉛溶液3.532mLを加え、攪拌した。 The 1000ppm zinc nitrate solution 3.532mL was added to this solution and stirred. この溶液に、9.5mg/mLリン酸2ナトリウム・7水和物、0.375M NaCl、4mg/mL m-クレゾール、1.65mg/mL フェノール、および16mg/mLグリセロールを含む水性溶液(pH7.63)47.08mLを加えた。 To this solution, an aqueous solution (pH7.63) containing 9.5 mg / mL sodium phosphate dibasic heptahydrate, 0.375M NaCl, 4mg / mL m- cresol, 1.65 mg / mL phenol, and 16 mg / mL glycerol 47.08 mL was added. pHを少量の1N HClおよび1N NaOHで7.6に調整した。 pH was adjusted to 7.6 with a small amount of 1N HCl and 1N NaOH to. 次に、この溶液を0.2ミクロンのタンパク質低結合フィルターでろ過した。 Then, the solution was filtered through a low protein-binding filter 0.2 micron. 硫酸プロタミンの乾燥粉末86.8 Dry powder protamine sulfate 86.8
mgを水115.73mLに溶解し、次いで0.2ミクロンのタンパク質低結合フィルターでろ過した。 The mg was dissolved in water 115.73ML, then filtered through a 0.2 micron low protein binding filter. C8-BHI溶液55.95mLを硫酸プロタミン溶液55.95mLと混合した。 The C8-BHI solution 55.95ML was mixed with protamine sulfate solution 55.95ML. 白色沈殿物が形成された。 White precipitate formed. この懸濁液を静かに攪拌して完全に混合した。 The suspension was thoroughly mixed gently stirring. この調製物を The preparation
30℃の水浴に24時間静置した。 It was allowed to stand for 24 hours in a water bath at 30 ℃. 光学顕微鏡下で検査すると、棒状結晶を含む微結晶固体が存在することがわかった。 When examined under an optical microscope, it was found that microcrystalline solid comprising rod-like crystals are present. Coulter技術による粒度分布の測定によりVMS VMS by the measurement of particle size distribution by Coulter technology
EDが4.7ミクロンであることがわかった。 ED was found to be 4.7 microns.

【0174】 この調製物の母液を以下の手順により0.7mg/mL フェノール、1.6mg/mL m-クレゾール、および0.3mg/mLリン酸2ナトリウム・7水和物を含む水性溶液で置換した。 [0174] was replaced by the procedure of the mother liquor of the preparation below 0.7 mg / mL phenol, an aqueous solution containing 1.6 mg / mL m-cresol, and 0.3 mg / mL sodium phosphate dibasic heptahydrate. 懸濁液50mLを23℃で3000rpmにて12分間遠心し、母液40mLを固相をかき乱すことなく除去し、0.7mg/mL フェノール、1.6mg/mL m-クレゾール、および0.3mg/mL The suspension 50mL was centrifuged 12 minutes at 3000rpm at 23 ° C., the mother liquor 40mL was removed without disturbing the solid phase, 0.7 mg / mL phenol, 1.6 mg / mL m-cresol, and 0.3 mg / mL
リン酸2ナトリウム・7水和物を含む水性溶液で置換した。 It was replaced with an aqueous solution containing sodium phosphate dibasic heptahydrate. この方法を2回以上反復した。 The method was repeated twice more. 母液をこのように置換後、Coulterカウンターを用いて再度微結晶を分析し、VMSEDが3.5ミクロンであることがわかった。 After replacing the mother liquor in this manner, was analyzed microcrystalline again using a Coulter counter, it was found that VMSED is 3.5 microns.

【0175】 HPLCによる分析的特徴付けによりほとんど全てのインスリンおよび硫酸プロタミンが固相に存在することがわかった。 [0175] it was found that almost all of insulin and protamine sulfate by analytical characterization by HPLC is present in the solid phase. ラットの気管内点滴注入(instillation Intratracheal instillation of a rat (instillation
)試験用に、これら製剤を0.7mg/mL フェノール、1.6mg/mL m-クレゾール、および0.3mg/mLリン酸2ナトリウム・7水和物を含む水性溶液で適切に希釈することにより必要な濃度に希釈した。 ) For testing, the concentration required by appropriate dilution of these formulations 0.7 mg / mL phenol, an aqueous solution containing 1.6 mg / mL m-cresol, and 0.3 mg / mL sodium phosphate dibasic heptahydrate It was diluted to.

【0176】 製造例29 ラットの気管内点滴注入試験用の75% C8-BHI結晶製剤 C8-BHI(330mg)の乾燥凍結乾燥粉末を0.1N HCl 8.25mLに溶解した。 [0176] was dissolved dry lyophilized powder 75% C8-BHI crystal formulations C8-BHI for intratracheal instillation test of preparation 29 rats (330 mg) in 0.1 N HCl 8.25 mL. ヒトインスリン-Zn結晶の乾燥粉末(116mg)を0.1 HCl 2.9mLに溶解した。 It was dissolved dry powder of human insulin -Zn crystals (116 mg) in 0.1 HCl 2.9 mL. 後者の溶液2.75m The latter solution 2.75m
LをC8-BHI溶液と混合してC8-BHIとヒトインスリンの適切な重量比75:25の混合物を得た。 The L was mixed with C8-BHI solution to obtain a mixture of suitable weight ratios 75:25 C8-BHI and human insulin. この溶液を攪拌して混合した。 The solution was mixed by stirring. この溶液に1000ppm硝酸亜鉛溶液2.866mL 1000ppm zinc nitrate solution 2.866mL to this solution
を加え、攪拌した。 It was added, and the mixture was stirred. この溶液に、9.5mg/mLリン酸2ナトリウム・7水和物、0.375 To this solution, 9.5 mg / mL sodium phosphate dibasic heptahydrate, 0.375
M NaCl、4mg/mL m-クレゾール、1.65mg/mL フェノール、および16mg/mLグリセロールを含む水性溶液(pH7.63)47mLを加えた。 M NaCl, 4mg / mL m- cresol, 1.65 mg / mL phenol, and 16 mg / mL glycerol aqueous containing solution (pH7.63) 47mL was added. pHを少量の1N HClおよび1N NaOH A small amount of 1N HCl and 1N NaOH to pH
で7.6に調整した。 In was adjusted to 7.6. 次に、この溶液を0.2ミクロンのタンパク質低結合フィルターでろ過した。 Then, the solution was filtered through a low protein-binding filter 0.2 micron. 硫酸プロタミンの乾燥粉末86.8mgを水115.73mLに溶解し、次いで0. The dry powder 86.8mg of protamine sulfate was dissolved in water 115.73ML, then 0.
2ミクロンのタンパク質低結合フィルターでろ過した。 And filtered through a 2 micron low protein binding filter. C8-BHIおよびヒトインスリンの混合溶液50mLを硫酸プロタミン溶液50mLと混合した。 C8-BHI and mixed solution 50mL of human insulin was mixed with protamine sulfate solution 50mL. 白色沈殿物が形成された。 White precipitate formed. この懸濁液を静かに攪拌して完全に混合した。 The suspension was thoroughly mixed gently stirring. この調製物を30℃の水浴に This preparation in a water bath at 30 ° C.
24時間静置した。 It was allowed to stand for 24 hours. 光学顕微鏡下で検査すると、棒状結晶を含む微結晶固体が存在することがわかった。 When examined under an optical microscope, it was found that microcrystalline solid comprising rod-like crystals are present. Coulter技術による粒度分布の測定によりVMSEDが4.4ミクロンであることがわかった。 VMSED by measurement of particle size distribution by Coulter technique has been found to be 4.4 microns.

【0177】 この調製物の母液を、実施例28に記載のごとく0.7mg/mL フェノール、1.6mg/m [0177] The mother liquors of the preparation, as described in Example 28 0.7 mg / mL phenol, 1.6 mg / m
L m-クレゾール、および0.3mg/mLリン酸2ナトリウム・7水和物を含む水性溶液で置換した。 L m-cresol, and was replaced with an aqueous solution containing 0.3 mg / mL sodium phosphate dibasic heptahydrate. 母液をこのように置換後、Coulterカウンターを用いて再度微結晶を分析し、VMSEDが3.9ミクロンであることがわかった。 After replacing the mother liquor in this manner, was analyzed microcrystalline again using a Coulter counter, it was found that VMSED is 3.9 microns.

【0178】 HPLCによる分析的特徴付けによりほとんど全てのインスリンおよび硫酸プロタミンが固相に存在することがわかった。 [0178] it was found that almost all of insulin and protamine sulfate by analytical characterization by HPLC is present in the solid phase. ラットの気管内点滴注入試験用に、これら製剤を0.7mg/mL フェノール、1.6mg/mL m-クレゾール、および0.3mg/mLリン酸2ナトリウム・7水和物を含む水性溶液で適切に希釈することにより必要な濃度に希釈した。 For intratracheal instillation studies in rats, appropriately diluted these formulations 0.7 mg / mL phenol, an aqueous solution containing 1.6 mg / mL m-cresol, and 0.3 mg / mL sodium phosphate dibasic heptahydrate diluted to the required concentration by.

【0179】 製造例28および29に記載の手順は、結晶化条件を適切に調節すると、誘導体化インスリンを亜鉛およびプロタミンと共に含む結晶を深部肺への蓄積を最適化するための好ましいサイズ(好ましくは<5ミクロン、より好ましくは<3ミクロン) [0179] the procedure described in Preparation 28 and 29, when properly adjusting the crystallization conditions, the preferred size for optimizing the accumulation into the deep lung the crystals containing derivatized insulin with zinc and protamine (preferably <5 microns, more preferably <3 microns)
に調製することができることを示している。 Shows that can be prepared. これら製造例の重要なパラメーターは結晶化時のNaCl濃度(150mM)と、結晶化時の温度(30℃)であった。 Important parameters of these production examples and NaCl concentration during crystallization (150 mM), and the temperature was during the crystallization (30 ° C.).

【0180】 製造例30 製造例28および製造例30の母液を下記手順により水で置換した。 [0180] was replaced mother liquor of Preparation 30 Preparation 28 and Preparation 30 with water by the following procedure. 懸濁液5mLを2 The suspension 5 mL 2
3℃、3000rpmで12分間遠心した。 3 ° C., and centrifuged 12 minutes at 3000 rpm. 母液4mLを固相をかき乱すことなく除去し、水で置換した。 The mother liquor 4mL was removed without disturbing the solid phase and replaced with water. この手順を2回以上反復した。 This procedure was repeated two or more times. 得られた懸濁液を凍結乾燥した。 The resulting suspension is frozen and lyophilized. 凍結乾燥後に得られた固体を水5mLで再構成した。 The solid obtained after lyophilization and reconstituted with water 5 mL. 光学顕微鏡下で観察すると、得られた懸濁液は小微結晶を含んでいた。 When observed under an optical microscope, the resulting suspension contained small crystallites.

【0181】 製造例31 NaCl 0.9g/100mLの溶液を用いて結晶を洗浄した以外は製造例30の記載に従って、製造例28および製造例29の母液を置換した。 [0181] except that the crystals were washed with a solution of preparation 31 NaCl 0.9 g / 100 mL as described in Preparation 30, replacing the mother liquor of Preparation 28 and Preparation 29. 3回洗浄した後、得られた懸濁液を凍結乾燥した。 After washing three times, the resulting suspension is frozen and lyophilized. 凍結乾燥した後に得られた固体を水5mLで再構成した。 The solid obtained after lyophilization and reconstituted with water 5 mL. 光学顕微鏡下で観察すると、得られた懸濁液は小微結晶を含んでいた。 When observed under an optical microscope, the resulting suspension contained small crystallites.

【0182】 製造例30および31に記載の手順は、本発明の方法(すなわち、例えば製造例28 [0182] Procedure described for preparation 30 and 31, the method of the present invention (i.e., for example Preparation 28
および29)により得られた微結晶をその結晶の性質を損なうことなく凍結乾燥することができることを示す。 And indicating that the microcrystals obtained by 29) can be lyophilized without compromising the properties of the crystal. そのような微結晶粉末は肺供給用の乾燥粉末吸入器に入れて用いることができる。 Such fine crystal powder can be used to put in a dry powder inhaler for pulmonary supply. これらの結果は、これら微結晶を水と混合し、最小限の賦形剤を含む安定な水性懸濁液を形成することができることも示す。 These results, these microcrystals were mixed with water, it is also shown that it is possible to form a stable aqueous suspension containing minimal excipients. そのような水性懸濁液は肺供給用のネブライザーに入れて用いることができる。 Such aqueous suspensions can be used to put the nebulizer for pulmonary supply.

【0183】 製造例32 製造例28または29のいずれかに記載の手順に従って結晶化した後(光学顕微鏡で確定)、常套的固体/液体分離法により微結晶を母液から分離し、回収する。 [0183] After crystallization according to the procedure described in any one of Production Example 32 Production Example 28 or 29 (confirmed by optical microscopy), fine crystals were separated from the mother liquor by conventional solid / liquid separation methods, recovered.
次に、回収した微結晶を、緩衝剤(例えば、0.3mg/mLリン酸2ナトリウム・7水和物)、抗菌保存剤(例えば、0.65mg/mL フェノールおよび/または1.6mg/mL m-クレゾール)、および等張性物質(例えば、16mg/mLグリセロールまたは9mg/mL NaCl Then, the recovered microcrystals, buffering agents (e.g., 0.3 mg / mL sodium phosphate dibasic heptahydrate), antimicrobial preservatives (e.g., 0.65 mg / mL phenol and / or 1.6 mg / mL m-cresol ), and isotonic agents (e.g., 16 mg / mL glycerol or 9 mg / mL NaCl
)を含む溶液に再懸濁し、pHを6.8に調整する。 ) Was resuspended in a solution containing the pH is adjusted to 6.8.

【0184】 製造例33 製造例28または29のいずれかに記載の手順に従って結晶化した後(光学顕微鏡で確定)、常套的固体/液体分離法により微結晶を母液から分離し、回収する。 [0184] After crystallization according to the procedure described in any one of Production Example 33 Production Example 28 or 29 (confirmed by optical microscopy), fine crystals were separated from the mother liquor by conventional solid / liquid separation methods, recovered.
次に、回収した微結晶を、再懸濁溶液が抗菌保存剤を含まない以外は製造例32に従って再懸濁する。 Then, the recovered microcrystals, except that resuspension solution does not contain an antimicrobial preservative resuspended accordance Preparation 32. 刺激物や不要な賦形剤を含まないことが望ましいときにはそのような調製物はより適切であろう。 Such preparations when it is desired free of irritants and unwanted excipients would be more appropriate.

【0185】 製造例34 VMSED 2.1ミクロンの75% C8-BHI 共結晶の溶解 75% C8-BHI共結晶を、製造例29と同様の手順により10mLスケールで製造した。 [0185] Production Example 34 VMSED 2.1 microns 75% C8-BHI co-crystal of dissolving 75% C8-BHI co-crystal was prepared in 10mL scaled by the same procedure as in Production Example 29.
この手順により製造した結晶のVMSEDは2.1ミクロンであった。 VMSED of crystals prepared by this procedure was 2.1 microns. この結晶のin vitroでの溶解速度を分光測光溶解(dissolution)アッセイを用いて試験した。 The rate of dissolution in vitro of the crystals was tested using spectrophotometric dissolution (Dissolution) assay. リン酸緩衝生理食塩水3mLを小さな攪拌棒を入れた水晶キュベットに入れた。 Was placed in phosphate buffered saline 3mL a quartz cuvette containing the small stir bar. 溶液を一定速度で攪拌した。 The solution was stirred at a constant speed. 吸光度をゼロに合わせた。 The absorbance was zeroed. 一様に懸濁した製剤5μLをキュベットの底で急速に懸濁させた。 The formulation 5μL were uniformly suspended was quickly suspended was at the bottom of the cuvette. 製剤を加えて1分間後、 After 1 minute was added the formulation,
305nmの吸光度データを時間の作用として得た。 The absorbance data of 305nm was obtained as a function of time. 吸光度の変化を時間の作用として追跡した。 The change in absorbance was monitored as a function of time.

【0186】 吸光度はスキャッタリング粒子が溶解するにつれて低下する。 [0186] The absorbance decreases as scattering particles dissolve. 吸光度の完全な低下の半分だけ吸光度が低下するまでの時間をパラメーターt 1/2で示す。 The time until only the absorbance decreases half the full reduction in absorbance indicated by parameter t 1/2. このパラメーターは、異なる結晶調製物の溶解速度を比較するのに有用である。 This parameter is useful for comparing the dissolution rates of the different crystalline preparations. t 1/2が大きくなると、溶解速度は遅くなる。 When the t 1/2 increases, the dissolution rate becomes slow. 上記溶解試験において、製造例34に従って製造した共結晶のt 1/2は50分であった。 In the dissolution test, t 1/2 co-crystal prepared according to Preparation Example 34 was 50 minutes. 同じ溶解条件下でNPH-ヒトインスリン結晶のt 1/2は典型的には約10分またはそれ以下であった。 T 1/2 of NPH- human insulin crystals in the same dissolution conditions were typically about 10 minutes or less. すなわち、VMSEDがより小さく、表面積の付随する増加が予測されるにも関わらず、製造例34の共結晶の溶解はNPHより有意に遅かった。 That, VMSED is smaller, despite the concomitant increase of the surface area is expected, the dissolution of co-crystals of preparation 34 was significantly slower than NPH. この結果は、本発明のより小さい微結晶がNPH-ヒトインスリン結晶に比べてより持続する放出をもたらすという結論を支持する。 This result supports the conclusion that results in the release of smaller crystallites of the present invention is more persistent than the NPH- human insulin crystals.

【0187】 製造例35-40 3試料用の結晶化緩衝液が、塩化ナトリウム不含、もしくは75mM塩化ナトリウム、150mM塩化ナトリウムを含み、温度を30℃に調節する以外は上記製造例28および29の手順に従って、10mLスケールで3種類の各結晶試料を調製した。 [0187] Crystallization buffer for Production Example 35 to 40 3 samples, sodium-free, or 75mM sodium chloride, comprises 150mM sodium chloride, except for adjusting the temperature to 30 ° C. The above Production Examples 28 and 29 following the procedure to prepare three kinds of the crystal sample in 10mL scale. 結晶化時に150mM NaClが存在するときは、75%および100% C8-BHI組成物両方で平均粒子直径が約2ミクロンでサイズ分布が狭い非常に小さな粒子が得られた。 When 150 mM NaCl is present during crystallization, the mean particle diameter of both 75% and 100% C8-BHI composition the size distribution is obtained is narrow very small particles of about 2 microns.

【0188】 [0188]

【0189】 製造例41-44 C8-BHIの乾燥粉末(24.0mg)を0.1N HCl 1.20mLに溶解した。 [0189] was dissolved dry powder of Preparation 41-44 C8-BHI the (24.0 mg) in 0.1 N HCl 1.20 mL. ヒトインスリン亜鉛結晶の乾燥粉末(8.0mg)を0.1N HCl 0.400mLに溶解して別の溶液を調製した。 It was prepared another solution by dissolving a dry powder of human insulin zinc crystals (8.0 mg) in 0.1 N HCl 0.400 mL.
これら2つの溶液を混合してヒトインスリンおよびC8-BHIの混合溶液1.60mLを得た。 By mixing these two solutions to give a mixed solution 1.60mL of human insulin and C8-BHI. この溶液に、攪拌しながら15.3mM塩化亜鉛溶液448μLを加えた。 To this solution was added with stirring 15.3mM zinc chloride solution 448MyuL. この溶液に、10mg/mLリン酸2ナトリウム・7水和物、7.5mg/mL クエン酸3ナトリウム・2 To this solution, 10 mg / mL sodium phosphate dibasic heptahydrate, 7.5 mg / mL trisodium citrate
水和物、4mg/mL m-クレゾール、2mg/mLフェノール、および40mg/mLグリセロールからなる水性溶媒(pH7.59)6.4mLを加えた。 Hydrates, 4 mg / mL m-cresol, 2 mg / mL phenol, and 40 mg / mL aqueous solvent consisting of glycerol (pH7.59) and 6.4mL was added. pHを少量の1N HClおよび1N NaOHで A small amount of 1N HCl and 1N NaOH to pH
7.61に調整した。 It was adjusted to 7.61. 次に、この溶液を0.22ミクロンのタンパク質低結合性フィルターでろ過した。 Next, this solution was filtered through a low protein-binding filter 0.22 micron. 第二溶液を、硫酸プロタミン72.1mgを水96mLに溶解し、次いで0. The second solution, protamine sulfate 72.1mg dissolved in water 96 mL, and then 0.
22ミクロンのタンパク質低結合性フィルターでろ過して調製した。 It was prepared by filtration through low protein binding filter 22 microns. インスリン混合溶液8mL量を硫酸プロタミン溶液8mLと混合した。 Insulin mixed solution 8mL volume was mixed with protamine sulfate solution 8mL. 非晶質沈殿物が形成された。 Amorphous precipitate formed.
この懸濁液を静かに攪拌して混合を完結させた。 The suspension was gently to complete mixing by stirring. 調製物を4mLの4容量に分け、それぞれ15℃、25℃、30℃、および35℃の温度で90時間静置した。 Divided preparations 4 volume of 4 mL, 15 ° C., respectively, 25 ℃, 30 ℃, and allowed to stand 90 hours at a temperature of 35 ° C.. 光学顕微鏡(100 Optical microscope (100
0x)下で観察すると、どの場合も非晶質沈殿物が単一の棒状結晶を含む均一な外観の微結晶固体に変化したことがわかった。 When viewed 0x) under each case the amorphous precipitate was found to have changed to a fine crystalline solid uniform appearance comprising a single rod-shaped crystals. 15℃、25℃、30℃、および35℃の温度に対応する沈殿物をそれぞれ製造例41、42、43、および44に示した。 15 ° C., 25 ° C., 30 ° C., and showed 35 ° C. of the temperature in the corresponding precipitate in each preparation example 41, 42, 43 and 44,.

【0190】 各試料を3000rpmで12分間遠心し、結晶を沈殿させた。 [0190] centrifuged for 12 minutes each sample at 3000 rpm, to precipitate a crystal. 各製造例で、上清3.2mL In each Production Example, the supernatant 3.2mL
をデカントして除き、4mg/mLリン酸2ナトリウム・7水和物、3mg/mL クエン酸3 The decanted off, 4 mg / mL sodium phosphate dibasic heptahydrate, 3 mg / mL Citric acid 3
ナトリウム・2水和物、0.8mg/mL フェノール、および16mg/mLグリセロールを含む水性希釈液(pH 7.61)3.2mLで置換した。 Sodium dihydrate was replaced with 0.8 mg / mL phenol, and 16 mg / mL aqueous dilution containing glycerol (pH 7.61) 3.2mL. この希釈液による交換工程を2回目および3回目も反復した(ただし、3回目は、3.2mLを前記水性希釈液2.8mLで置換した)。 Second and third replacement step with this dilution was also repeated (provided that the third time, was replaced 3.2mL with the aqueous dilution 2.8 mL). この調製物のVMSEDを下記表に示す。 Shows the VMSED of the preparation in the following Table.

【0191】 [0191]

【0192】 製造例45-48 C8-BHIの乾燥粉末(24.0mg)を0.1N HCl 0.60mLに溶解した。 [0192] was dissolved dry powder of Preparation 45-48 C8-BHI the (24.0 mg) in 0.1 N HCl 0.60 mL. 別の溶液を、ヒトインスリン亜鉛結晶の乾燥粉末(8.2mg)を0.1N HCl 0.20mLに溶解して調製した。 Another solution was prepared by dissolving dry powder of human insulin zinc crystals (8.2 mg) in 0.1 N HCl 0.20 mL.
これら2溶液を混合してヒトインスリンおよびC8-BHIの混合溶液0.80mLを得た。 These two solutions were mixed to obtain a mixed solution 0.80mL of human insulin and C8-BHI.
この溶液に、攪拌しながら15.3mM塩化亜鉛溶液300μLを加えた。 To this solution was added with stirring 15.3mM zinc chloride solution 300 [mu] L. この溶液を0.27 This solution 0.27
5mLの4容量に分けた。 They were divided into 4 capacity of 5mL. 35mMリン酸2ナトリウム・7水和物、4mg/mL m-クレゾール、1.6mg/mL フェノール、および40mg/mLグリセロール(pH7.6)を含み、それぞれクエン酸ナトリウム濃度が異なる(それぞれ、0mM、12.5mM、37.5mM、および8 35mM sodium phosphate dibasic heptahydrate, 4 mg / mL m-cresol, 1.6 mg / mL comprises phenol, and 40 mg / mL glycerol (pH 7.6), sodium citrate concentrations are different (respectively, 0 mM, 12.5 mM, 37.5mM, and 8
7.5mM)4種の異なる結晶化緩衝液を調製した(製造例45、46、47、および48)。 7.5 mM) was Four different crystallization buffer was prepared (preparation 45, 46, 47, and 48).
タンパク質溶液の4試料0.275mLのぞれぞれに結晶化緩衝液1.1mLを加えた。 To, respectively, respectively of 4 samples 0.275mL of the protein solution was added crystallization buffer 1.1 mL. 各溶液のpHを少量の1N HClおよび1N NaOHで7.6に調製した。 The pH of each solution was adjusted to 7.6 with a small amount of 1N HCl and 1N NaOH. 次に、各溶液を0.22ミクロンのタンパク質低結合性フィルターでろ過した。 Then, each solution was filtered through a low protein-binding filter 0.22 micron. 各溶液1mLに、硫酸プロタミン37.6mgを水50mLに溶解し、次いで0.22ミクロンのタンパク質低結合フィルターでろ過して調製した硫酸プロタミン溶液1mLを加えた。 Each solution 1mL, protamine sulfate 37.6mg dissolved in water 50 mL, was added to the protamine sulfate solution 1mL prepared and then filtered through a 0.22 micron low protein binding filter. それぞれの例で非晶質が形成された。 Amorphous are formed in each example. 各調製を静かに攪拌して混合を完結させた。 Each preparation was gently to complete mixing by stirring. 4調製物を25℃で23時間静置した。 4 preparation was allowed to stand for 23 hours at 25 ° C.. 光学顕微鏡(1000x)下で観察すると、どの場合も非晶質沈殿物が単一の棒状結晶を含む均一な外観の微結晶固体に変化し、各調製物の平均結晶サイズは表に示すように異なることがわかった。 When observed under an optical microscope (at 1000x), each case an amorphous precipitate changed to a fine crystalline solid uniform appearance comprising a single rod-shaped crystals, the average crystal size of each preparation as shown in Table different it was found.

【0193】 [0193]

【0194】 製造例49 C8-BHIの乾燥粉末(60.7mg)を0.1N HCl 1.50mLに溶解した。 [0194] was dissolved dry powder of Preparation 49 C8-BHI the (60.7 mg) in 0.1 N HCl 1.50 mL. この溶液に、攪拌しながら15.3mM塩化亜鉛溶液600μLを加えた。 To this solution was added with stirring 15.3mM zinc chloride solution 600 [mu] L. この溶液0.70mLに、50mMトリス、 To this solution 0.70mL, 50mM Tris,
10mg/mLフェノール、30mg/mL クエン酸3ナトリウム・2水和物、および31mg/mL 10 mg / mL phenol, 30 mg / mL trisodium citrate dihydrate, and 31 mg / mL
グリセロールからなる水性溶媒(pH7.60)2mLを加えた。 Aqueous solvent (pH7.60) consisting of glycerol was added 2 mL. pHを少量の1N HClおよび1N NaOHで7.61に調整した。 pH was adjusted to 7.61 with a small amount of 1N HCl and 1N NaOH to. 次に、この溶液を0.22ミクロンのタンパク質低結合性フィルターでろ過した。 Next, this solution was filtered through a low protein-binding filter 0.22 micron. 第二溶液を、硫酸プロタミン37.8mgを水50mLに溶解し、次いで0.22ミクロンのタンパク質低結合性フィルターでろ過して調製した。 The second solution, protamine sulfate 37.8mg dissolved in water 50 mL, and then was prepared by filtration through 0.22 micron low protein binding filter.
C8-BHI混合溶液2.5mL量を硫酸プロタミン溶液2.5mLと混合した。 The C8-BHI mixed solution 2.5mL weight was mixed with protamine sulfate solution 2.5mL. 非晶質沈殿物が形成された。 Amorphous precipitate formed. この懸濁液を静かに攪拌して混合を完結させた。 The suspension was gently to complete mixing by stirring. 調製物を25℃で60 The preparation at 25 ° C. 60
時間静置した。 Time was allowed to stand. 光学顕微鏡(1000x)下で観察すると、非晶質沈殿物は推定近似平均粒子サイズ2ミクロンの小棒状結晶を含む均一な外観の微結晶固体に変化したことがわかった。 When observed under an optical microscope (at 1000x), amorphous precipitate was found to have changed to a microcrystalline solid uniform appearance including small rod-shaped crystals of the estimated approximate average particle size of 2 microns.

【0195】 製造例50 C8-BHIの乾燥粉末(39.2mg)を0.1N HCl 1000部に溶解した。 [0195] was dissolved dry powder of Preparation 50 C8-BHI the (39.2 mg) in 0.1 N HCl 1000 parts. この溶液に、攪拌しながら15.3mM塩化亜鉛溶液400μLを加えた。 To this solution was added with stirring 15.3mM zinc chloride solution 400 [mu] L. この溶液に、5mg/mLリン酸2ナトリウム・無水物、25mMクエン酸3ナトリウム、1.6mg/mL フェノール、4mg/mL m- To this solution, 5 mg / mL sodium phosphate dibasic anhydrous, sodium 25mM citrate 3, 1.6 mg / mL phenol, 4 mg / mL m-
クレゾール、および40mg/mLグリセロールからなる水性溶媒(pH7.6)4mLを加えた。 Cresol, and 40 mg / mL aqueous solvent consisting of glycerol (pH 7.6) 4 mL was added. pHを少量の1N HClおよび1N NaOHで7.60に調整した。 pH was adjusted to 7.60 with a small amount of 1N HCl and 1N NaOH to. 次に、この溶液を0.22 Next, this solution 0.22
ミクロンのタンパク質低結合性フィルターでろ過した。 And filtered through a micron low protein binding filter. 第二溶液を、硫酸プロタミン37.3mgを水50mLに溶解し、次いで0.22ミクロンのタンパク質低結合性フィルターでろ過して調製した。 The second solution, protamine sulfate 37.3mg dissolved in water 50 mL, and then was prepared by filtration through 0.22 micron low protein binding filter. C8-BHI混合溶液5mL量を硫酸プロタミン溶液5mLと混合した。 The C8-BHI mixture 5mL weight was mixed with protamine sulfate solution 5mL. 非晶質沈殿物が形成された。 Amorphous precipitate formed. この懸濁液を静かに攪拌して混合を完結させた。 The suspension was gently to complete mixing by stirring. 調製物を25℃で47時間静置した。 Preparation was allowed to stand for 47 hours at 25 ° C.. 光学顕微鏡(1000x)下で観察すると、非晶質沈殿物は近似平均長2ミクロンの単一の棒状結晶を含む均一な外観の微結晶固体に変化したことがわかった。 When observed under an optical microscope (at 1000x), amorphous precipitate was found to have changed to a microcrystalline solid uniform appearance comprising a single rod-shaped crystals of the approximate average length of 2 microns.

【0196】 製造例51-54 下記表に示すごとく、4試料中の最終クエン酸塩および塩化ナトリウム濃度を以下のようにする以外は実施例1または実施例19の手順に従って75% C8-BHI共結晶を製造した。 [0196] As shown in Production Examples 51-54 Table, 75% C8-BHI co a final citrate and sodium chloride concentration of 4 samples according to the procedure of Example 1 or Example 19, except that the following to produce a crystal. 24時間後、各例で非晶質沈殿物は棒状結晶物質に変化した。 After 24 hours, the amorphous precipitate in each example was changed into a rod crystalline material. 各調製物のVMESD VMESD of each preparation
およびSDを上記表に示す。 And shows the SD in the above table.

【0197】 製造例55 微結晶製剤 製造例1〜51のいずれかに従って調製した微結晶を、常套的固体/液体分離法により母液から分離し、回収する。 [0197] The microcrystals prepared according to any of Preparation 55 microcrystalline Formulation Preparation 1 - 51, separated from the mother liquor by conventional solid / liquid separation methods, recovered. 次に、回収した微結晶を2mg/mLリン酸2ナトリウム、1.6mg/mL m-クレゾール、0.65mg/ml フェノール、および16mg/mlグリセロールからなる溶液(pH 6.8)に懸濁し、インスリン活性の最終濃度を約100U/m Next, recovery 2 mg / mL disodium phosphate fine crystals were suspended in 1.6 mg / mL m-cresol, 0.65 mg / ml phenol, and 16 mg / ml made of glycerol solution (pH 6.8), the final insulin activity about 100U / m the concentration
Lとする。 And L.

【0198】 製造例56 微結晶製剤 製造例1〜51のいずれかに従って調製した微結晶を、常套的固体/液体分離法により母液から分離し、回収する。 [0198] The microcrystals prepared according to any of the Production Example 56 microcrystalline Formulation Preparation 1 - 51, separated from the mother liquor by conventional solid / liquid separation methods, recovered. 次に、回収した微結晶を水中の0.65mg/ml フェノールからなる溶液に懸濁し、インスリン活性の最終濃度を約100U/mLとする。 Then suspended in a solution consisting of recovered microcrystals from water 0.65 mg / ml phenol, the final concentration of insulin activity about 100 U / mL. 1N HClおよび1N NaOHでpHを約6.8に調整する。 Adjusting the pH to about 6.8 with 1N HCl and 1N NaOH.

【0199】 製造例57-83 すべての製造例で75% C8-BHI共結晶が生じた。 [0199] 75% C8-BHI cocrystal occurs in Preparation Example 57-83 All of Preparation. 3製造例(57、62、および63)を除くすべてで、結晶化緩衝液を、示した最終クエン酸塩および塩酸ナトリウム濃度を達成するのに必要なように調整する以外は実質的に製造例19の手順に従った。 3 in all but the Production Example (57 and 62, and 63), substantially Preparation except that adjusted as necessary to achieve the crystallization buffer, the final citrate and hydrochloric acid sodium concentrations shown 19 in accordance with the procedure. スケールは32〜50mLであった。 Scale was 32~50mL. タンパク質の溶解を実施したpHを表に示す。 The pH was carried lysis protein shown in Table. これら製造例は上記結論をさらに支持するとともに、VMSEDは少なくとも0〜10mMの範囲のクエン酸塩濃度に反比例することを示す。 These preparation examples with further supporting the conclusion, VMSED indicates that is inversely proportional to the citrate concentration in the range of at least 0 to 10 mm.

【0200】 [0200]

【0201】 製造例84-89 亜鉛の効果 すべての製造例で75% C8-BHI共結晶が生じた。 [0201] 75% C8-BHI cocrystal occurs in effect all Preparation of Preparation 84-89 zinc. すべての製造例で、結晶化緩衝液を、最終クエン酸塩を10mMおよび塩酸ナトリウム濃度を50mMとして実質的に製造例19の手順に従った。 In all Production Examples, the crystallization buffer, the final citrate The procedure was substantially Preparation 19 10mM and hydrochloric acid sodium concentration as 50 mM. スケールは20mLであった。 Scale was 20mL. タンパク質の溶解を実施する To implement the dissolution of the protein
pHは2.5であった。 pH was 2.5. 亜鉛を表に示すように加えた。 Zinc was added as shown in Table. 亜鉛濃度は総タンパク質(インスリン+インスリン誘導体)の重量比で示す。 Zinc concentrations are indicated by weight ratio of total protein (insulin + insulin derivative). 0.1%以上の亜鉛が必要であり、 0.1% or more of zinc is required,
0.5%〜5.8%の亜鉛濃度ではVMSEDに対する一貫した効果はなかった。 The zinc concentration of 0.5% ~5.8% had no consistent effect on VMSED.

【0202】 [0202]

【0203】 製造例90 プロタミンおよびZnを含む85% Nε-オクタノイル-LysB29ヒトインスリンおよびヒトインスリンの共結晶の製造 Nε-オクタノイル-LysB29ヒトインスリン(1678.5mg)の乾燥凍結乾燥粉末を0.1 [0203] Dry lyophilized powder 85% Nε- octanoyl -LysB29 human insulin and human insulin co-crystals of manufacturing Enuipushiron- octanoyl -LysB29 human insulin including the preparation examples 90 protamine and Zn (1678.5mg) 0.1
N HCl 42.5mLに溶解した。 It was dissolved in N HCl 42.5 mL. ヒトインスリン-Zn結晶乾燥粉末(286mg)を0.1N HCl 7 Human insulin -Zn crystalline dry powder (286 mg) with 0.1 N HCl 7
.5mLに溶解した。 It was dissolved in .5mL. 後者の溶液7.5mLをNε-オクタノイル-LysB29ヒトインスリンと混合し、適切な重量比75:25のNε-オクタノイル-LysB29ヒトインスリンとヒトインスリンの混合物を得た。 The latter solution 7.5mL was mixed with Enuipushiron- octanoyl -LysB29 human insulin, to obtain a mixture of suitable weight ratio 75:25 Enuipushiron- octanoyl -LysB29 human insulin and human insulin. この溶液を攪拌して混合した。 The solution was mixed by stirring. この溶液に10mg/mL Zn To this solution 10 mg / mL Zn
溶液1.38gを加えた。 The solution 1.38g were added. この溶液に9.5mg/mL リン酸2ナトリウム・7水和物、0.375 9.5 mg / mL sodium phosphate dibasic heptahydrate in this solution, 0.375
M NaCl、4mg/mL m-クレゾール、1.65mg/mL フェノール、および16mg/mL グリセロールからなる水性溶液(pH7.63)200mLを加えた。 M NaCl, 4mg / mL m- cresol, 1.65 mg / mL phenol, and 16 mg / mL made of glycerol aqueous solution (pH7.63) 200mL was added. pHを少量の5N HClおよび5N A small amount of 5N HCl and 5N to pH
NaOHで7.6に調整した。 It was adjusted to 7.6 with NaOH. 次に、この溶液を0.2ミクロンのタンパク質低結合性フィルターでろ過した。 Then, the solution was filtered through a low protein-binding filter 0.2 micron. 第二溶液を、硫酸プロタミン乾燥粉末262.9mgを水305.69gに溶解し、次いで、0.2ミクロンのタンパク質低結合性フィルターでろ過して調製した。 The second solution, protamine sulfate dry powder 262.9mg dissolved in water 305.69G, were then prepared and filtered through a low protein-binding filter 0.2 micron. Nε-オクタノイル-LysB29ヒトインスリンとヒトインスリンの混合物溶液2 Mixtures of Nε- octanoyl -LysB29 human insulin and human insulin solution 2
62.84gを硫酸プロタミン溶液259.6gと混合した。 The 62.84g was mixed with protamine sulfate solution 259.6G. 白色沈殿物が形成された。 White precipitate formed. この懸濁液を静かに攪拌して混合を完結させた。 The suspension was gently to complete mixing by stirring. 調製物を32℃で24時間静置した。 Preparation was allowed to stand for 24 hours at 32 ° C.. 光学顕微鏡下で観察すると、微結晶固体が存在することがわかった。 When observed under an optical microscope, it was found that microcrystalline solid are present. Coulter技術による粒度分布測定により平均粒子直径が2.5ミクロンであることがわかった。 The average particle diameter of the particle size distribution measurement by Coulter technique has been found to be 2.5 microns.
この調製物の母液を、以下の手順により0.04mg/mL フェノール、0.11mg/mL m-クレゾール、および0.3mg/mLリン酸2ナトリウム・7水和物、および24mg/mL グリセリンからなる液体溶液で置換した。 The mother liquor of the preparation, by the following procedure 0.04 mg / mL phenol, 0.11 mg / mL m-cresol, and 0.3 mg / mL sodium phosphate dibasic heptahydrate, and 24 mg / mL made of glycerol in liquid solution It was replaced. 固相をかき乱すことなく、上清450mLを十分沈んだ沈殿物から除去し、上記水性溶液で置換した。 Without disturbing the solid phase, the supernatant 450mL removed from well sunken precipitate, was replaced with the aqueous solution. HPLCによる分析的特徴付けにより85.2% C8-BHIおよび14.8% BHIの組成物であることがわかった。 It was found that the analytical characterization by HPLC is a composition of 85.2% C8-BHI and 14.8% BHI. イヌの気管内点滴注入実験では、これら製剤を、上記置換に用いる水性溶液で適切に希釈することにより所要濃度に希釈した。 The intratracheal instillation experiments dogs, these preparations were diluted to the required concentration by appropriate dilution with an aqueous solution used in the above-mentioned substituent. 本製造例の微結晶は、Coulterマルチサイジングにより平均粒子直径が2.5ミクロンであった。 Microcrystals of this preparation, the average particle diameter by Coulter multi sizing was 2.5 microns. この調製物をイヌの気管内点滴注入法に用いた。 This preparation was used for intratracheal instillation of dogs.

【0204】 製造例91 粉末形の85%共結晶製剤(上記製造例90から)の単離(約1gスケール) 製造例90から得られる結晶懸濁液約400mLを0.22ミクロンろ過装置に真空を適用してろ過した。 [0204] applying a vacuum to isolate (approximately 1g scale) 0.22 micron filtration device crystalline suspension of about 400mL obtained from preparation 90 of Production Example 91 in powder form 85% co-crystal formulation (from the above-mentioned Production Example 90) It was then filtered. 固体を純アルコール約5mLで洗浄し、ろ過装置に真空を適用して風乾する。 The solid was washed with pure alcohol to about 5 mL, and air dried by applying a vacuum to the filtration apparatus. 凝集粉末を清浄なスパーテルを用いて回収した。 The agglomerated powder was collected using a clean spatula.

【0205】 製造例92 85%共結晶製剤(上記製造例90および製造例91からの)のin vitro溶解特性 製造例90から得られる微結晶懸濁液のin vitro溶解速度をpH7.4のリン酸緩衝生理食塩水(PBS)を用いて25℃で測定した。 [0205] Phosphorus Production Example 92 85% co-crystal formulations The in vitro dissolution rate of a microcrystalline suspension obtained from in vitro dissolution characteristics Production Example 90 (from Preparation Example 90 and Production Example 91) pH 7.4 phosphate buffered saline (PBS) was measured at 25 ° C. using. PBS緩衝液はインスリンの吸着による損失を最小にするため1mg/mLウシ血清アルブミンを含んでいた。 PBS buffer contained 1 mg / mL bovine serum albumin to minimize losses due to adsorption of insulin. 総インスリン Total insulin
1.8mgを含む懸濁液の1容量を緩衝液溶液200mLに懸濁し、180rpmの一定速度で攪拌した。 Suspended one volume of a suspension containing 1.8mg in buffer solution 200 mL, and stirred at a constant speed of 180 rpm. 一定間隔で該溶液の部分標本を0.2ミクロンのタンパク質低結合性フィルターでろ過し、アッセイにより総溶解インスリンを測定した。 Aliquots of the solution was filtered through a low protein-binding filter 0.2 micron at regular intervals to determine the total dissolved insulin by the assay. 無ろ過コントロール試料も分析して総有効インスリンを測定した。 Unfiltered control samples were also measured total effective insulin and analyzed. このアッセイに基づくと、製造例90は完全に溶解するのに約6時間かかった。 Based on this assay, Preparation 90 took about 6 hours to completely dissolve. これに対してNPH結晶は約2分で溶解した。 NPH crystals whereas dissolved in about 2 minutes. さらに、製造例90は、溶解するにつれて、BHIに対して一定比のC8-BH Further, Production Examples 90, as it dissolves, C8-BH constant ratio to BHI
Iを放出し、製造例90の共結晶性が確認された。 Releasing I, co-crystal of Preparation Example 90 was confirmed. 単離粉末(製造例91)は、製造例9 Isolation powder (Production Example 91) Production Example 9
0の遅い溶解特性を保持し、粉末の単離および乾燥方法は溶解特性に影響しないことを示唆した。 Holding the slow dissolution characteristics 0, isolation and drying method of the powder suggesting that does not affect the dissolution properties. 該粉末では約3時間で約50%が溶解した。 The powder about 50% in about 3 hours to dissolve. この期間において、粉末は、溶解するにつれて、約85% C8-BHIおよび15% BHIの一定比で放出された。 In this period, the powder as it dissolves, was released at a constant ratio of about 85% C8-BHI and 15% BHI.
さらにこの均質に溶解する特性により、ろ過および風乾方法は微結晶の基本的性質を変化させないことを確認する。 Furthermore the characteristics of the homogeneously dissolved, filtering and air drying method to make sure that does not change the basic properties of the crystallites.

【0206】 これらin vitro溶解データは、粒子直径約2.5ミクロンのこの微結晶は、表面積が増加するにも関わらず、NPHに比べて非常に徐々に溶解することを示唆する。 [0206] These in vitro dissolution data, microcrystalline particles having a diameter of about 2.5 microns, despite the surface area is increased, suggesting that very gradually dissolve as compared with NPH. これらデータは、製造例90が持続放出製剤として役立つ可能性を支持する。 These data support the possibility that in Production Example 90 serves as a sustained-release formulation. これらデータはさらに、単離および乾燥方法は該懸濁液の独特な溶解特性を変化させないことを示唆する。 These data further isolation and drying methods suggest that do not alter the unique solubility characteristics of the suspension.

【0207】 実施例1 2種類の結晶インスリン、100% C8-BHI結晶および75% C8-BHI:25% BHI共結晶 [0207] Example 1 Two crystalline insulin, 100% C8-BHI crystals and 75% C8-BHI: 25% BHI co-crystal
について試験した。 It was tested for. これら両者について、気管内に点滴注入した化合物は、通常のインスリンを用いてラットで行った以前の試験よりより長い持続期間について高く、皮下に供給したSPHヒトインスリンの結果に匹敵する免疫応答性インスリンの血中レベルをもたらした。 These both compounds instillation into the trachea, high for a longer duration than the previous studies conducted in rats with normal insulin, immunoreactive insulin, comparable to the result of the SPH human insulin supplied to the subcutaneous It resulted in blood levels. 興味深いことに、肺洗浄液を肺点滴注入の4および8時間後に試験すると、インスリン結晶は、肺洗浄液中では主として遊離および完全で観察され、比較的わずかの結晶が肺胞マクロファージ内に見られるのみであった。 Interestingly, the lung lavage fluid when tested after 4 and 8 hours of lung instillation, the insulin crystals is primarily free and complete observed in lung lavage fluid in only a relatively few crystal is observed in alveolar macrophages there were. 文献は、肺内のマクロファージによる粒子の消化が大部分数時間内に完結することを示しているので、ほとんどの結晶物質は肺胞マクロファージに取り込まれ消化されたものと予想された。 Literature, since the particles by macrophages in the lung digestion indicates that complete most within a few hours, most of the crystalline material was expected to have been incorporated into the alveolar macrophages digestion. この驚くべき所見は、結晶インスリンが肺液に急速過ぎる溶解がおきないほど充分に不溶性である場合、該結晶インスリンは血中に徐々に溶解し吸収されるのに利用可能なままであることを示唆する。 That this surprising finding, when crystal insulin is more sufficiently insoluble does not occur dissolve too rapidly lung fluid, the crystalline insulin remains available to be absorbed slowly dissolved into the blood It suggests.
したがって、これら2種類の結晶インスリンの肺への供給は、グルコースの基礎的調節をもたらすインスリンの持続放出のための非侵襲的アプローチであるかも知れない。 Thus, the supply to the lungs of these two crystalline insulin, may be a non-invasive approach for sustained release of insulin resulting in basic regulation of glucose.

【0208】 血糖値をこれらラットの実験で測定したところ、血糖値は血中のインスリンの吸収レベルに比例して低下した。 [0208] The blood glucose level was measured in these rats experiments, blood glucose was decreased in proportion to the absorption level of blood insulin. これら実験は、血中にインスリンを持続放出させるには、肺への供給が不溶性インスリン結晶を肺に供給するのに適した方法であることを示す。 These experiments show that in sustaining release insulin in the blood is a method suitable for supply to the lungs to supply insoluble insulin crystals into the lungs. エアロゾル吸入は、注射の必要性を避け、患者のコンプライアンスを改善するために患者の肺に結晶インスリンを供給するための臨床使用に用いられる方法となろう。 Aerosol inhalation, avoiding the need for injections, would be a method for use in clinical use for supplying crystalline insulin to the patient's lungs to improve patient compliance.

【0209】 実施例2 雄F344ラット12匹/群をこの試験に用いた。 [0209] Using Example 2 Male F344 rats 12 mice / group in this study. 投与群は以下の通りである。 Administration group are as follows. 01群: 上記製造例28に従って製造した100% C8-BHI 1mg/kgの気管内点滴注入。 01 group: intratracheal instillation of 100% C8-BHI 1mg / kg prepared according to Preparation Example 28. 02群: 上記製造例29に従って製造した75% C8-BHI: 25% BHI 1mg/kgの気管内点滴注入。 02 groups: 75% C8-BHI was prepared according to the above Preparation Example 29: Intratracheal instillation of 25% BHI 1mg / kg. 03群: 上記製造例29に従って製造した75% C8-BHI: 25% BHI 1mg/kgの皮下投与。 03 groups: 75% C8-BHI was prepared according to the above Preparation Example 29: subcutaneous administration of 25% BHI 1mg / kg. 04群: 1mg/kg NPHインスリンの皮下投与。 04 group: Subcutaneous administration of 1 mg / kg NPH insulin. 血液試料を投与して、0(プレ)、0.5、1、4、8、16、および24時間後に採取した。 Blood samples were administered, 0 (pre), 0.5,1,4,8,16, and was taken after 24 hours. これら血液試料を遠心して血清を回収し、試験物質の血液レベルとグルコース濃度を測定した。 These blood samples were centrifuged and serum was collected and measured blood levels and glucose concentration of the test substance. グルコース測定の結果を図1に示す。 The results of the glucose measurements shown in FIG. ラット気管内に点滴注入したこれら調製物は血糖を低下させ、NPH-ヒトインスリンの皮下投与に匹敵する持続放出、および驚くほど高い活性をもたらした。 These preparations instilled in rat trachea reduces blood glucose, sustained comparable to subcutaneous administration of NPH- human insulin release, and resulted in a surprisingly high activity. これらのデータは、これら結晶および共結晶が吸入により投与でき、患者の肺にそれらを蓄積させることが知られている特性を有する粒子が、血糖を調節するのにインスリンが必要なヒト患者の肺に蓄積し、これら結晶または共結晶が肺内で溶解し、インスリン活性が蓄積した粒子から患者の血液中に吸収されるであろうことを予測するのを妥当なものにする。 These data may be administered these crystals and co-crystals by inhalation, particles having a characteristic that is known to accumulate them into the patient's lungs, a human patient in need of insulin to regulate blood sugar lung accumulated, these crystals or co-crystals are dissolved in the lungs, to the particles of insulin activity was accumulated in the reasonable to predict that it will be absorbed into the patient's blood.

【0210】 実施例3 物理安定性および再懸濁性試験 この試験では物理的ストレス条件下で、3.0-mLカートリッジ中の4種類の異なる75% C8-BHI共結晶製剤の物理安定性を評価した。 [0210] physical stress conditions in Example 3 Physical stability and resuspended test This test was evaluated physical stability of four different 75% C8-BHI co-crystal formulation in 3.0-mL cartridge . 製造例51-54を3.0mLカートリッジに充填し、加速物理安定性試験に供した。 Filling the Production Example 51-54 in 3.0mL cartridge were subjected to accelerated physical stability test. 各製造例につき44本のカートリッジを充填した。 It was filled with 44 pieces of cartridges for each Preparation Example. 各製造例の38本のカートリッジを37℃の一定温度で14日間インスリン振盪システムに入れた。 It was placed in a 14-day insulin shaking system at a constant temperature of 37 ° C. to 38 cartridges for each Preparation Example. この期間中に、物質を1日に4時間、30rpmで回転させて攪拌した。 During this period, 4 hours substance per day, and stirred by rotating at 30 rpm. カートリッジの線維形成(凝集(aggregation)または凝集(agglomeration))を調べ、第0、2、5、7、9、11、および14日の物理的変化を示した。 Examine the fibrosis of the cartridge (aggregation (aggregation) or aggregation (agglomeration)), it showed a physical change of the 0,2,5,7,9,11, and 14 days. コントロールカートリッジのセット(各製造例につき6個)を攪拌せず(再懸濁を除く)に5℃ Without stirring set of controls cartridge (six per Preparation) (excluding resuspended) to 5 ° C.
で保存し(縦キャップの側面を上げて)、7日間毎に調べた。 In saved (by raising the sides of the vertical cap), it was examined every seven days.

【0211】 カートリッジには、訓練した作業員による目視試験で確認したところ下記状態のいずれも出現しなかった:沈殿の遅い乳白色の均質な懸濁液からの、より急速に沈殿する分離した粒子を示す懸濁液への変化、カートリッジ壁上のフィルム、 [0211] the cartridge, none of the following conditions was visually observed test by worker trained did not appear: from milky homogeneous suspension slow sedimentation, and the separated particles more rapidly precipitate changes to the suspension showing the film on the cartridge wall,
フロスト、クランピング(大きな凝集物)、再懸濁の失敗、または上記理由のあらゆる組合せ。 Frost, clamping (large aggregates), failure of re-suspended or any combination of the above reasons. 14日間の加速物理安定性試験後の期待に反した(失敗した)カートリッジの数は、製造例51および54でほぼ同数であった。 The number of acceleration physical contrary to stability expected after test (failed) cartridges 14 days was approximately equal in Production Example 51 and 54. 製造例53は最小数を示し、製造例52 Production Example 53 shows the minimal number of preparation examples 52
では製造例53より失敗がわずかに多いだけであったが、製造例52または55より少なかった。 In failure from Preparative Example 53 was only slightly more, but was less than Production Example 52 or 55.

【0212】 実施例4 F344ラットの肺に吸入した85% C8インスリン:15% BHI共結晶粉末に対するグルコース反応 肺に供給した空気中の粉末の効果を検討するために、吸入法を用いてラット肺に85% C8インスリン粉末(製造例90-92)を吹き込む実験を行った。 [0212] 85% C8 insulin inhaled into the lungs of Example 4 F344 Rat: 15% In order to study the effect of powder in air supplied to the glucose response lungs to BHI co-crystal powder, rat lung with inhalation the blown 85% C8 insulin powder (preparation 90-92) in experiments were performed. 用量は2mg/kg Dose is 2mg / kg
とした。 And the. 絶食雄Fischer 344ラット(200-250g)をイソフルランで短時間麻酔し、気管内に挿管した。 Fasted male Fischer 344 rats (200-250g) were anesthetized with isoflurane a short period of time, it was intubated into the trachea. 予め計量した粉末の部分標本を、吸入グレードの乳糖を用い、インスリン結晶が担体乳糖と5重量%の濃度で確実に均質に混合されるように幾何学的希釈法を用いて調製した。 Aliquots of the pre-weighed powder using lactose inhalation-grade, insulin crystals prepared using geometric dilution method as ensure a homogeneous mix at a concentration of carrier lactose and 5 wt%. 粉末10mgをサイズ00のカプセルに充填し、次いでこれをPenn Century吸入用具に取り付けた。 The powder 10mg and filled into capsules of size 00, then attaching it to Penn Century inhalation devices. Penn Century用具を気管内カニューレ中に導入し、手動シリンジから空気3mLを急速に放出して肺に該粉末を吹き込んだ。 The Penn Century tool was introduced into the trachea within the cannula, it was blown into the powder into the lungs rapidly release the air 3mL from manual syringe. 投薬は動物の吸気に同調させた。 Dosing is tuned to the intake of the animals. グルコース測定用に投与後0(投薬前)および0 After administration for glucose measurement 0 (pre-dose) and 0
.25、0.5、1、3、4、6、8、および12時間に血液試料を採取した。 .25,0.5,1,3,4,6,8, and blood samples were collected in 12 hours.

【0213】 下記図は、ラット肺に85% C8インスリン:15% BHI結晶粉末を吸入後のグルコース反応(平均SE)を示す。 [0213] The following figures, 85% C8 insulin rat lung: the 15% BHI crystalline powder showing the glucose response after inhalation (average SE). 理由はわからないが、この群にはベースラインレベルの50%以上のグルコースレベルを有するラットが2匹いたため、8時間のデータポイントは通常の分布から大きくはずれたものと考えられる。 I do not know why, in this group for rats with glucose levels of more than 50% of baseline levels had 2 mice, it is considered that deviates significantly from the data points are normal distribution of 8 hours. このデータポイントを無視すると、グルコース反応は、上記の先の実験で得られた75% C8インスリン Ignoring the data points, 75% C8 insulin glucose reaction obtained in the above previous experiments
:25% BHI結晶懸濁液の吸入後に得られたデータと全く同様の長期(extended)時間 : Exactly the same long-term with the data obtained after inhalation of 25% BHI crystal suspension (extended) time
-作用プロフィールを示す。 - shows the effect profile. これらデータは肺内に導入した空気中の粉末、および液体懸濁液がいずれも同様の反応を生じることを示す。 These data indicate that the powder in the air introduced into the lungs, and the liquid suspension cause any similar reaction. 先のラット実験は、種々のタイプの結晶インスリンを吸入後に定性的に同様のグルコース反応を示した。 Previous rat experiments showed qualitatively similar glucose response after inhalation of various types of crystal insulin. これらの結果をまとめると、点滴注入試験の結果は、肺に導入した空気中の粉末から得られる結果の優れた予測指標であることを示唆する。 Taken together these results suggest that instillation test results are good predictors of the results obtained from the powder in the air introduced into the lungs. 本実験が示すように、ある結晶インスリンは肺に空気中の粉末を導入後にグルコース反応に長期作用を示し、他の結晶インスリンについても空気中の粉末として肺に導入すると同様の挙動が期待される。 As shown in this experiment, there shows a long-term effect on the glucose-responsive crystal insulin after introduction of powder in the air in the lungs is expected similar behavior when introduced into the lungs as a powder in the air for other crystalline insulin .

【0214】 F344ラットにおける85% C8-インスリン共結晶の気管内吸入および75% CS-インスリン共結晶の気管内点滴注入後のグルコースの変化 [0214] change in glucose 85% C8-insulin co endotracheal suction and 75% crystallinity CS- after intratracheal instillation of Insulin cocrystal in F344 rats

【0215】 実施例5 ビーグル犬に対する気管内に供給した3種類のインスリン結晶製剤の比較 本試験は、NPH結晶の皮下(sc)投与後の動態をNPH結晶、MicroUltralente(ウルトラレンテ)結晶、および85% C8インスリン共結晶の気管内(IB)投与後の動態と比較するために計画した。 [0215] Comparison this test three insulin crystals formulations supplied into the trachea for Example 5 Beagle dogs, subcutaneous NPH crystals (sc) kinetics after administration NPH crystals, MicroUltralente (ultralente) crystal, and 85 It was designed to compare% C8 intratracheal insulin co-crystal and (IB) after administration kinetics. LillyのToxicology Research Laboratoriesにて生存状態の試験を行った。 It was tested for survival state by Lilly of Toxicology Research Laboratories. 2頭の雄および3頭の雌成ビーグル犬をこの試験に用いた。 The MesuNaru beagle dogs of male and three animals of the two horses were used in this test. 試験開始時の体重は7.1〜 Body weight at the start of the test is 7.1
14.6kgの範囲であった。 14.6kg was in the range of. 用いた試験物質は85% C8-インスリン共結晶、MicroUltralente結晶、およびNP Test substances used 85% C8- insulin co-crystals, MicroUltralente crystal, and NP
H結晶であった。 It was H crystal. 2〜3μmの粒子を得るための一部変更した結晶化条件を用い、各試験物質を肺投与用に特別に製剤化した。 Using some modified crystallization conditions for obtaining the particle of 2 to 3 [mu] m, each test material was specially formulated for pulmonary administration. 表1に示すように各結晶インスリン製剤には特定のビークルを用いた。 We used specific vehicle in each crystal insulin formulations as shown in Table 1.

【0216】 表1. 結晶インスリン製剤とその関連ビークル [0216] Table 1. crystal insulin formulations and related vehicle that

【0217】 麻酔した絶食動物に、肺もしくは皮下投与経路で85% C8インスリン共結晶、Mi [0217] The anesthetized fasted animals, 85% C8 insulin co-crystals with pulmonary or subcutaneous administration routes, Mi
croUltralente結晶、およびNPH結晶を投与した。 croUltralente crystal, and NPH was administered crystal. 表2に示すように肺への用量として、点滴注入用量0.25mL/kgを気管支ファイバースコープで気管内に供給した。 As the dose to the lungs as shown in Table 2, the drip infusion dose 0.25 mL / kg was fed into the trachea bronchial fiberscope. 比較目的で、各イヌにNPH結晶0.75U/kgを皮下投与した。 For comparison purposes, it was subcutaneously administered NPH crystals 0.75 U / kg to each dog. 各処置の間隔を少なくとも7日間あけた。 The interval of each treatment was opened at least 7 days. 血液試料を処置前と投与後0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、 After administration to pretreatment blood sample 0.5,1,2,3,4,5,6,7,8,
9、10、12、16、および24時間に採取した。 9,10,12,16, and were taken in 24 hours. NPHの皮下および肺投与では、血液試料を処置前と投与後0.5、1、2、4、6、8、10、12、16、および24時間に採取した。 The subcutaneous and pulmonary administration of NPH, after administration to pretreatment blood samples 0.5,1,2,4,6,8,10,12,16, and were harvested 24 hours. これら試料から得た血清のグルコース濃度を分析した。 It was analyzed for glucose concentrations of serum obtained from these samples.

【0218】 表2.供給用量 [0218] Table 2. supply dose

【0219】 結果および考察 全ての結晶インスリン製剤の気管内点滴注入は血清グルコースレベルの有意な抑制をもたらした(表3、図1)。 [0219] Results and Discussion intratracheal instillation of all crystal insulin formulations resulted in a significant inhibition of serum glucose levels (Table 3, Figure 1). 平均血糖値は全ての製剤について2時間で初期の低いポイントに達した。 Mean blood glucose reached initial low points in 2 hours for all formulations.

【0220】 表3. ビーグル犬における結晶インスリン製剤の気管内または皮下投与後の血糖(%ベースライン) [0220] Table 3. glucose after intratracheal or subcutaneous administration of crystalline insulin preparation in beagle dogs (% baseline)

【0221】 すべての製剤において気管内または皮下投与後約10時間までグルコースレベルは顕著に抑制されたままであった。 [0221] Glucose levels up to about 10 hours after intratracheal or subcutaneous administration in all formulations remained significantly suppressed. 持続放出の時間-作用は、全製剤の気管内点滴注入、ならびに少なくともNPHの皮下投与に関する限り全例で同様であった。 Sustained release of the time - action, intratracheal instillation of the total formulation, and was similar in all cases far as the subcutaneous administration of at least NPH. N N
PHおよび85% C8インスリン共結晶の気管内投与後のイヌ2頭が投与後7〜10時間に重大な低グルコースレベルを示したが、50%デキストロースの経口もしくは静脈内投与により助かった。 2 dogs after intratracheal administration of PH and 85% C8 insulin co-crystals showed severe low glucose levels 7-10 hours after administration, but was saved by oral or intravenous administration of 50% dextrose. この出来事により助かった動物の血清グルコースレベルが人為的に増加したため、群の潜在持続放出作用および全体の平均は短縮した。 Since the serum glucose levels of survived animals The event is artificially increased, potentially sustained release effect and overall average of the group was shortened.

【0222】 NPHの皮下投与、またはNPH、MicroUltralente、および85% C8-インスリン共結晶の気管内投与後の血清グルコースレベルの変化(平均±SE) [0222] Subcutaneous administration of NPH, or NPH, MicroUltralente, and 85% C8-insulin both changes in serum glucose levels following intratracheal administration of crystals (mean ± SE)

【0223】 実施例6 3種類のインスリン結晶製剤のエアロゾルの特徴付け 3種類の結晶インスリンの乾燥粉末製剤を、Wright Dust Feed(WDF)ジェネレーター(10LPMで操作)を用いてエアロゾル化した。 [0223] The dry powder formulations of the characterization three crystalline insulin aerosol of Example 6 three insulin crystals formulation was aerosolized using a Wright Dust Feed (WDF) Generator (Operation in 10LPM). 12-L ヘッド-ドーム曝露システムに入れる前に大きな粒子を除くために設計されたサイクロンを通すか、WDF 12-L head - either through a cyclone designed to remove large particles before entering the dome exposure system, WDF
から直接ヘッド-ドーム中を通し、WDFによりエアロゾルを生成した。 Directly from the head - through in domes, generating aerosol by WDF. Gelman Typ Gelman Typ
e A/E ガラスファイバーフィルターを取り付けたSierra Model 218K Cascade Im Sierra was attached to the e A / E glass fiber filter Model 218K Cascade Im
pactor(カスケードインパクター)を用いて質量中央空力直径(MMAD)を測定した。 pactor mass using (cascade impactor) Central aerodynamic diameter (MMAD) was measured. Cascade Impactorを通す気流は3L/分で、試料採取時間は5〜50分の範囲であった。 Airflow through the Cascade Impactor in 3L / min, sampling time was in the range of 5 to 50 minutes. エアロゾル濃度は曝露中に重量測定試料を得ることにより決定した。 Aerosol concentration was determined by obtaining a weight measurement sample during exposure.

【0224】 結果 3種類の結晶インスリンの粒子サイズと重量測定データを表1に示す。 [0224] Results 3 kinds of particle sizes and weight measurement data of the crystalline insulin in Table 1. 表1.エアロゾルの特徴付け 平均(±SE) 試験物質 MMEAD GSD エアロソ゛ル濃度(mg/L) 85%C8-インスリン w/サイクロン 1.15 3.98 NA w/oサイクロン 1.30 4.03 0.069 10% MicroUltralente/90%乳糖 w/サイクロン 2.74 1.61 0.280 w/oサイクロン 4.07 1.97 0.104 スプレー乾燥MicroUltralente w/サイクロン 1.79 2.90 0.088 w/oサイクロン 2.31 3.04 0.040 Table 1. Characterization average aerosol (± SE) Test substance MMEAD GSD Earoso Bu Le Concentration (mg / L) 85% C8- insulin w / cyclone 1.15 3.98 NA w / o cyclone 1.30 4.03 0.069 10% MicroUltralente / 90 % lactose w / cyclone 2.74 1.61 0.280 w / o cyclone 4.07 1.97 0.104 spray-drying MicroUltralente w / cyclone 1.79 2.90 0.088 w / o cyclone 2.31 3.04 0.040

【0225】 これらデータは、これら結晶インスリンのエアロゾルの発生により極めて呼吸に適した粒度分布が得られることを示す。 [0225] These data show that particle size distribution suitable for very breathing by generating aerosol of these crystals insulin is obtained. 実施例1〜5から得られるデータは、点滴注入試験が吸入乾燥粉末の効果を予測させることを確信させる。 The data obtained from Examples 1-5, instillation test convince be predictive of effects of inhaled dry powder. a)通常のインスリン溶液のエアロゾルの吸入、b)通常のインスリン粉末の吸入、およびC)通常のインスリン溶液の点滴注入後のグルコース反応を比較するためビーグル犬で試験を行った。 a) inhalation of aerosols normal insulin solution, b) by usual inhalation of insulin powder, and C) tested in beagle dogs to compare the glucose response after instillation of normal insulin solution. 添付した図は、グルコース反応の時間-作用プロフィールが全例で急であり、3タイプすべての用量投与について同様の結果であることを示す。 Accompanying figure, time glucose response - a steep by the action profile all cases, indicating that the same results for all three types of dose administration. グルコースレベルが最小になるまでの時間は、全例で2時間以下であり、反応は4〜5時間以内にほぼベースラインにもどる。 Time to glucose levels is minimized, not more than 2 hours in all cases, the reaction is returned to nearly baseline within 4-5 hours. (Laube BL, Georgopoulus, Adams GK. 1992。肺から供給されたエアロゾル化インスリンは、インスリン非依存性糖尿病において血漿グルコースレベルを正常化するのに有効である。J. Biopharm. Sci 3(1992)163-169)。 (Laube BL, Georgopoulus, Adams GK. Aerosolized insulin supplied from 1992. lungs is effective to normalize plasma glucose levels in non-insulin dependent diabetes mellitus .J. Biopharm. Sci 3 (1992) 163 -169). または粉末(Patto Or powder (Patto
n J, Bukar J.,およびNajarajan S. 1999。 n J, Bukar J., and Najarajan S. 1999. Inhaled insulin. Adv. Drug Delive Inhaled insulin. Adv. Drug Delive
ry Rev. 35: 235-247)。 ry Rev. 35: 235-247). これら結果は、点滴注入試験で達成されたものと同じ結果を吸入試験で予測することを確信させる。 These results are convincing to predict inhalation tests the same results as those achieved by instillation test. C8共結晶の粉末の吸入と比較した同じC8共結晶の気管内点滴注入懸濁液を投与した後のラットにおける同様のグルコース反応もこの考察を直接指示する。 Similar glucose response in rats after administration of intratracheal instillation suspension of the same C8 co-crystal in comparison to the inhalation of powders C8 co-crystal is also instructs the discussion directly.

【0226】 種々の特定の好ましい態様や技術を参照して本発明を説明してきた。 [0226] The invention has been described with reference to various specific and preferred embodiments and techniques. しかしながら、本発明の精神や範囲内で多くの改変や変更を行って良いことを理解すべきである。 However, it should be understood that many modifications may be made and modified within the spirit and scope of the invention. 本明細書中のすべての刊行物と特許出願は本発明の属する技術分野の当業者の水準を示すものである。 All publications in this specification and patent applications illustrates the levels of those skilled in the art to which this invention belongs.

【図面の簡単な説明】 BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS

【図1】 F344ラットに結晶および共結晶を投与した後の血糖値を示すグラフである。 1 is a graph showing the blood glucose level after administration of crystals and co-crystals F344 rats.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl. 7識別記号 FI テーマコート゛(参考) A61P 3/10 A61K 37/26 (81)指定国 EP(AT,BE,CH,CY, DE,DK,ES,FI,FR,GB,GR,IE,I T,LU,MC,NL,PT,SE),OA(BF,BJ ,CF,CG,CI,CM,GA,GN,GW,ML, MR,NE,SN,TD,TG),AP(GH,GM,K E,LS,MW,SD,SL,SZ,TZ,UG,ZW ),EA(AM,AZ,BY,KG,KZ,MD,RU, TJ,TM),AE,AG,AL,AM,AT,AU, AZ,BA,BB,BG,BR,BY,CA,CH,C N,CR,CU,CZ,DE,D ────────────────────────────────────────────────── ─── of the front page continued (51) Int.Cl. 7 identification mark FI theme Court Bu (reference) A61P 3/10 A61K 37/26 (81) designated States EP (AT, BE, CH, CY, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, I T, LU, MC, NL, PT, SE), OA (BF, BJ, CF, CG, CI, CM, GA, GN, GW, ML, MR, NE, SN, TD, TG), AP (GH, GM, K E, LS, MW, SD, SL, SZ, TZ, UG, ZW), EA (AM, AZ, BY, KG, KZ, MD, RU , TJ, TM), AE, AG, AL, AM, AT, AU, AZ, BA, BB, BG, BR, BY, CA, CH, C N, CR, CU, CZ, DE, D ,DM,DZ,EE ,ES,FI,GB,GD,GE,GH,GM,HR, HU,ID,IL,IN,IS,JP,KE,KG,K P,KR,KZ,LC,LK,LR,LS,LT,LU ,LV,MA,MD,MG,MK,MN,MW,MX, NO,NZ,PL,PT,RO,RU,SD,SE,S G,SI,SK,SL,TJ,TM,TR,TT,TZ ,UA,UG,US,UZ,VN,YU,ZA,ZW (72)発明者 ベンジャミン・リー・ヒューズ アメリカ合衆国46208インディアナ州イン ディアナポリス、ブルー・リッジ・ロード 402番 (72)発明者 シュン・リ アメリカ合衆国46268インディアナ州イン ディアナポリス、バンカスター・ドライブ 7620番 (72)発明者 ン・キンマン アメリカ合衆国46032インディアナ州カー メル、パットナム・ , DM, DZ, EE, ES, FI, GB, GD, GE, GH, GM, HR, HU, ID, IL, IN, IS, JP, KE, KG, K P, KR, KZ, LC, LK, LR, LS, LT, LU, LV, MA, MD, MG, MK, MN, MW, MX, NO, NZ, PL, PT, RO, RU, SD, SE, S G, SI, SK, SL, TJ , TM, TR, TT, TZ, UA, UG, US, UZ, VN, YU, ZA, ZW (72) inventor Benjamin Lee Hughes United States 46,208 Indiana Indiana Police, Blue ridge Road 402 number ( 72) inventor Shun Lee United States 46268 Indiana Indiana Police, van Custer drive No. 7620 (72) inventor emissions, Kinman United States 46032 Indiana car Mel, Putnam レイス10745番 (72)発明者 ムッパラ・スクマール アメリカ合衆国46236インディアナ州イン ディアナポリス、ベント・オーク・レイン 12604番 (72)発明者 ロナルド・キース・ウルフ アメリカ合衆国46033インディアナ州カー メル、ブルックシャー・パークウェイ 12329番 Fターム(参考) 4C076 AA29 BB01 BB27 CC21 DD21 DD37 EE41 FF68 GG02 GG11 4C084 AA03 BA44 CA62 DB34 MA43 MA52 MA55 MA56 NA10 ZC35 4H045 AA30 DA37 EA27 Reis No. 10745 (72) inventor Muppara-Sukumaru United States 46,236 Indiana Indiana Police, Bent Oak Lane No. 12604 (72) inventor Ronald Keith Wolf United States 46,033 Indiana car Mel, Brookshire Parkway 12329 No. F-term (reference) 4C076 AA29 BB01 BB27 CC21 DD21 DD37 EE41 FF68 GG02 GG11 4C084 AA03 BA44 CA62 DB34 MA43 MA52 MA55 MA56 NA10 ZC35 4H045 AA30 DA37 EA27

Claims (26)

    【特許請求の範囲】 [The claims]
  1. 【請求項1】 単一モード(uni-modal)の対称粒子分布を有する結晶であって、 a)式:B29-Nε-X-ヒトインスリン(ここで、Xはブチリル、ペンタノイル、ヘキサノイル、ヘプタノイル、オクタノイル、ノナニル、およびデカノイルからなる群から選ばれる)で示される誘導体化(derivatized)インスリン、 b)亜鉛、 c)フェノール性保存剤、および d)プロタミンを含む、容積平均球形等価直径(volume mean spherical equiva 1. A crystal having a symmetrical particle distribution of a single-mode (uni-modal), a) Formula: B29-Nε-X- human insulin (where, X is butyryl, pentanoyl, hexanoyl, heptanoyl, octanoyl, nonanyl, and derivatized represented by chosen) from the group consisting of decanoyl (derivatized) insulin, b) zinc, c) a phenolic preservative, and d) a protamine, volume average spherical equivalent diameter (volume mean spherical equiva
    lent diameter)が1ミクロン〜3ミクロンであることを特徴とする結晶。 lent For diameter) crystals, characterized in that it is 1 micron to 3 microns.
  2. 【請求項2】 総タンパク質に対する誘導体化インスリンの割合が少なくとも約50%である請求項1記載の結晶。 2. A crystal of claim 1 wherein the amount of derivatized insulin on total protein is at least about 50%.
  3. 【請求項3】 誘導体化タンパク質がB29-Nε-オクタノイル-ヒトインスリンである請求項1または2記載の結晶。 3. A derivatized protein is B29-Nε- octanoyl - crystal according to claim 1 or 2 wherein the human insulin.
  4. 【請求項4】 誘導体化インスリンの割合が75%である請求項2または3記載の結晶。 4. The proportion of derivatized insulin according to claim 2 or 3, wherein 75% crystalline.
  5. 【請求項5】 亜鉛が総タンパク質1モル当たり約0.3モル〜約0.7モル存在する請求項1〜4のいずれかに記載の結晶。 5. A zinc according to claim 1 which is present from about 0.3 mole to about 0.7 mole per total protein 1 mole crystal.
  6. 【請求項6】 フェノール性保存剤がフェノール、m-クレゾール、およびフェノールとm-クレゾールの混合物からなる群から選ばれ、かつ、総タンパク質1 6. A phenolic preservative phenol is selected m- cresol and phenol and the group consisting of m- mixture of cresols, and total protein 1
    モル当たり少なくとも0.5モルの比で存在する請求項1〜5のいずれかに記載の結晶。 Crystal according to any one of claims 1 to 5 present at least 0.5 mole ratio per mole.
  7. 【請求項7】 プロタミンが総タンパク質3.5mgあたり約0.15mg〜約0.5mg存在する請求項1〜6のいずれかに記載の結晶。 7. The crystal according to claim 1, protamine is present from about 0.15mg~ about 0.5mg per total protein 3.5 mg.
  8. 【請求項8】 請求項1〜7のいずれかに記載の結晶、およびさらに担体、 8. The crystal according to claim 1, and further support,
    吸収増強化合物、賦形剤、または溶媒を含む口で吸入することにより投与するための医薬組成物。 Absorption enhancing compounds, pharmaceutical compositions for administration by inhalation in the mouth, including excipients or solvents.
  9. 【請求項9】 さらにインスリン、インスリン類似体、もしくは誘導体、またはその医薬的に許容される塩を含む請求項8記載の医薬組成物。 9. Further insulin, insulin analog, or derivative or pharmaceutical composition as recited in claim 8, including the pharmaceutically acceptable salts thereof.
  10. 【請求項10】 糖尿病を治療するための医薬を製造するための請求項1〜 10. The method of claim for the manufacture of a medicament for the treatment of diabetes 1
    7のいずれかに記載の結晶の使用。 Use of the crystal according to 7 any of the.
  11. 【請求項11】 クエン酸塩の非存在下で下記工程a)-f)をあらゆる順序で行うことにより中性pHの懸濁液を製造することを含む請求項1〜7のいずれかに記載の結晶の製造方法(ただし、工程f)は工程a)に続き、また、工程f)が工程e) 11. according to any one of claims 1 to 7, comprising preparing a suspension of neutral pH by the absence of citrate performing the steps of a) -f) in any order the method for producing the crystal (provided that step f) is followed step a), also step f) a step e)
    に先立つときは工程b)およびc)は工程f)に先立つ): a)酸性pHの水性溶媒に誘導体化インスリンを溶解し、 b)フェノール性保存剤を加え、 c)亜鉛を加え、 d)塩素アニオンを、pH調整により導入される以上の最終濃度約100mM〜約150mM塩素アニオンとなるように加え、 e)プロタミンを加え、 f)中性pHに調整し、次いで12時間〜約96時間、中性pH懸濁液の温度を約25℃〜 Steps b) and c) when prior to the preceding step f)): a) dissolving the derivatized insulin in aqueous acidic pH, b) a phenolic preservative was added, c) zinc was added, d) chlorine anion, added to a more final concentration of about 100mM~ about 150mM chloride anion introduced by pH adjustment, e) protamine was added, f) was adjusted to neutral pH, then 12 hours to about 96 hours, the temperature of the neutral pH the suspension about 25 ° C. ~
    約37℃に保つ。 Keep at about 37 ℃.
  12. 【請求項12】 インスリンも溶解し、総タンパク質に対する誘導体化インスリンの割合が少なくとも50%である請求項11記載の方法。 12. Insulin also dissolved method of claim 11 wherein the amount of derivatized insulin on total protein is at least 50%.
  13. 【請求項13】 該誘導体化インスリンがB29-Nε-オクタノイル-ヒトインスリンであり、塩素アニオンを、pH調整により導入される以上の最終濃度約120 13. The derivatized insulin B29-Nε- octanoyl - a human insulin, a chloride anion, approximately a final concentration of more than introduced by pH adjustment 120
    〜150mMに加え、温度が約30℃である請求項11または12記載の方法。 In addition to ~150MM, claim 11 or 12 method described temperature is about 30 ° C..
  14. 【請求項14】 該誘導体化インスリンがB29-Nε-オクタノイル-ヒトインスリンであり、誘導体化インスリンの割合が総タンパク質の少なくとも75%であり、塩素アニオンを、pH調整により導入される以上の最終濃度約120〜150mMに加え、温度が約30℃である請求項11または12記載の方法。 14. The derivatized insulin B29-Nε- octanoyl - a human insulin, the ratio of derivatized insulin is at least 75% of the total protein, the final concentration of more than a chloride anion, is introduced by pH adjustment in addition to about 120~150MM, claim 11 or 12 method described temperature is about 30 ° C..
  15. 【請求項15】 請求項1〜7のいずれかに記載の結晶を非経口的に投与することを含む糖尿病の治療方法。 15. A method of treating diabetes mellitus comprising administering the crystal according parenterally to any one of claims 1 to 7.
  16. 【請求項16】 請求項1〜7のいずれかに記載の結晶を口から吸入により投与することを含む糖尿病の治療方法。 16. A therapeutic method for diabetes mellitus comprising administering by inhalation the crystal according mouth to claim 1.
  17. 【請求項17】 クエン酸塩の非存在下で下記工程a)-g)をあらゆる順序で実施することにより中性pHを有する懸濁液を製造することを含む結晶の製造方法(ただし、工程g)は工程a)に先立ち、工程g)が工程f)に先立つときは工程b)およびc)は工程g)に先立つ): a)誘導体化インスリンを酸性pHの水性溶媒に溶解し、 b)フェノール性保存剤を加え、 c)亜鉛を加え、 d)塩素アニオンを、pH調整により導入される以上の最終濃度約15mM〜150mM塩素イオンとなるように加え、 e)クエン酸塩を濃度1mM〜10mMに加え、 f)プロタミンを加え、 g)中性pHに調整し、次いで12時間〜約96時間、中性pH懸濁液の温度を約20℃〜約 17. The method of crystals comprising the following steps a) -g) in the absence of citrate to produce a suspension having a neutral pH by performed in any order (although, step g) prior to the step a), step b) and c when step g) is prior to step f)) is prior to step g)): a) dissolving the derivatized insulin in aqueous acidic pH, b ) phenolic preservative was added, c) zinc was added, d) a chloride anion, added to a more final concentration of about 15mM~150mM chloride ions introduced by pH adjustment, e) citrate concentration 1mM in addition to to 10 mm, f) protamine was added, g) and adjusted to neutral pH, then 12 hours to about 96 hours, about 20 ° C. to about the temperature of the neutral pH suspension
    37℃に保つ。 Keep to 37 ℃.
  18. 【請求項18】 インスリンも溶解し、総タンパク質に対する誘導体化インスリンの割合が少なくとも50%である請求項17記載の方法。 18. Insulin also dissolved method of claim 17 wherein the amount of derivatized insulin on total protein is at least 50%.
  19. 【請求項19】 誘導体化インスリンの割合が75%である請求項18記載の方法。 19. The method of claim 18 wherein the amount of derivatized insulin is 75%.
  20. 【請求項20】 誘導体化インスリンがB29-Nε-オクタノイル-ヒトインスリンである請求項19記載の方法。 20. derivatized insulin B29-Nε- octanoyl - The method of claim 19 wherein the human insulin.
  21. 【請求項21】 亜鉛を総タンパク質1モルあたり濃度0.3モル〜0.7モルに加え、フェノール性保存剤がフェノール、m-クレゾール、およびフェノールとm- 21. Zinc was added to the total protein per mole concentration of 0.3 mol to 0.7 mol, phenolic preservatives phenol, m- cresol, and phenol and m-
    クレゾールの混合物からなる群から選ばれ、総タンパク質1モルあたりのフェノール性保存剤の比が少なくとも0.5モルとなるような濃度に加えられる請求項1 Selected from the group consisting of cresol, claim 1, the ratio of total protein per mole phenolic preservative is added to a concentration such that at least 0.5 mole
    7〜20のいずれかに記載の方法。 The method according to any one of 7 to 20.
  22. 【請求項22】 請求項17〜20のいずれかにより製造される結晶。 22. A crystal produced by any one of claims 17 to 20.
  23. 【請求項23】 請求項22記載の結晶およびさらに担体、吸収増強化合物、賦形剤もしくは溶媒を含む医薬組成物。 23. The crystal and further a carrier according to claim 22, absorption enhancing compounds, excipients or pharmaceutical compositions comprising a solvent.
  24. 【請求項24】 さらにインスリン、インスリン類似体、もしくは誘導体、 24. Furthermore insulin, insulin analogue or derivative,
    またはその医薬的に許容される塩を含む請求項23記載の医薬組成物。 Or a pharmaceutical composition of claim 23 comprising a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  25. 【請求項25】 糖尿病を治療するための医薬を製造するための請求項22 25. Claim 22 for the manufacture of a medicament for the treatment of diabetes
    記載の結晶の使用。 Use of the crystal according.
  26. 【請求項26】 請求項22記載の結晶を非経口的に投与することを含む糖尿病の治療方法。 26. A therapeutic method for diabetes mellitus comprising administering the crystals according to claim 22, wherein parenterally.
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Cited By (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2006519881A (en) * 2003-03-06 2006-08-31 エミスフィアー テクノロジーズ インコーポレイテッド Oral insulin treatment and protocol
JP2009544716A (en) * 2006-07-27 2009-12-17 ノバルティス アクチエンゲゼルシャフト Insulin containing aerosolizable formulations for pulmonary delivery
JP2011162560A (en) * 2003-03-06 2011-08-25 Emisphere Technologies Inc Oral insulin therapy and protocol
US8710001B2 (en) 2006-07-31 2014-04-29 Novo Nordisk A/S PEGylated, extended insulins
US8828923B2 (en) 2003-08-05 2014-09-09 Novo Nordisk A/S Insulin derivatives
US9018161B2 (en) 2006-09-22 2015-04-28 Novo Nordisk A/S Protease resistant insulin analogues
US9034818B2 (en) 2007-06-13 2015-05-19 Novo Nordisk A/S Pharmaceutical formulations comprising an insulin derivative
US9260502B2 (en) 2008-03-14 2016-02-16 Novo Nordisk A/S Protease-stabilized insulin analogues
US9387176B2 (en) 2007-04-30 2016-07-12 Novo Nordisk A/S Method for drying a protein composition, a dried protein composition and a pharmaceutical composition comprising the dried protein
US9481721B2 (en) 2012-04-11 2016-11-01 Novo Nordisk A/S Insulin formulations
US9603904B2 (en) 2008-10-30 2017-03-28 Novo Nordisk A/S Treating diabetes melitus using insulin injections with less than daily injection frequency
US9688737B2 (en) 2008-03-18 2017-06-27 Novo Nordisk A/S Protease stabilized acylated insulin analogues
US9896496B2 (en) 2013-10-07 2018-02-20 Novo Nordisk A/S Derivative of an insulin analogue
US10137172B2 (en) 2013-04-30 2018-11-27 Novo Nordisk A/S Administration regime

Families Citing this family (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1392262A1 (en) 2001-05-24 2004-03-03 Alexza Molecular Delivery Corporation Delivery of drug esters through an inhalation route
US20070122353A1 (en) 2001-05-24 2007-05-31 Hale Ron L Drug condensation aerosols and kits
CA2447519C (en) 2001-05-24 2008-09-16 Alexza Molecular Delivery Corporation Delivery of alprazolam, estazolam, midazolam or triazolam through an inhalation route
US6759029B2 (en) 2001-05-24 2004-07-06 Alexza Molecular Delivery Corporation Delivery of rizatriptan and zolmitriptan through an inhalation route
US20030051728A1 (en) 2001-06-05 2003-03-20 Lloyd Peter M. Method and device for delivering a physiologically active compound
NZ519403A (en) * 2001-06-21 2005-03-24 Pfizer Prod Inc Use of insulin in a medicament to reduce weight gain in a diabetic patient who is using exogenous insulin to control blood sugar levels
WO2003041693A1 (en) 2001-11-09 2003-05-22 Alexza Molecular Delivery Corporation Delivery of diazepam through an inhalation route
US7078016B2 (en) 2001-11-21 2006-07-18 Alexza Pharmaceuticals, Inc. Delivery of caffeine through an inhalation route
WO2003048195A2 (en) * 2001-12-02 2003-06-12 Novo Nordisk A/S Glucose dependant release of insulin from glucose sensing insulin derivatives
US7317000B2 (en) 2001-12-02 2008-01-08 Novo Nordisk A/S Glucose-dependent insulins
US20050203001A1 (en) 2004-03-05 2005-09-15 Emisphere Technologies, Inc. Oral insulin therapies and protocol
EP1625333A1 (en) 2003-05-21 2006-02-15 Alexza Pharmaceuticals, Inc. Self-contained heating unit and drug-supply unit employing same
EP1768694A1 (en) * 2004-07-09 2007-04-04 Novo Nordisk A/S Phamaceutical preparations comprising insulin
WO2008057248A2 (en) * 2006-10-26 2008-05-15 Next Breath Llc Phospholipid-based inhalation system
EP3043174B1 (en) 2008-11-04 2017-12-06 Panasonic Healthcare Holdings Co., Ltd. Measurement device
US9006176B2 (en) * 2011-10-18 2015-04-14 AmideBio LLC Chemically and thermodynamically stable insulin analogues and improved methods for their production
US9897565B1 (en) 2012-09-11 2018-02-20 Aseko, Inc. System and method for optimizing insulin dosages for diabetic subjects
US9171343B1 (en) 2012-09-11 2015-10-27 Aseko, Inc. Means and method for improved glycemic control for diabetic patients
WO2014172488A2 (en) 2013-04-17 2014-10-23 AmideBio LLC Chemically and thermodynamically stable insulin analogues and improved methods for their production
US9486580B2 (en) 2014-01-31 2016-11-08 Aseko, Inc. Insulin management
US9233204B2 (en) 2014-01-31 2016-01-12 Aseko, Inc. Insulin management
US9892234B2 (en) 2014-10-27 2018-02-13 Aseko, Inc. Subcutaneous outpatient management
US9886556B2 (en) 2015-08-20 2018-02-06 Aseko, Inc. Diabetes management therapy advisor

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0954282B1 (en) * 1997-01-16 2005-01-19 Massachusetts Institute Of Technology Preparation of particles for inhalation
RU2198181C2 (en) * 1997-03-20 2003-02-10 Ново Нордиск А/С Zinc-free insulin crystal for application in pulmonary compositions
WO1998042368A1 (en) * 1997-03-20 1998-10-01 Novo Nordisk A/S Therapeutic powder formulation for pulmonary administration, containing crystalline insulin
ZA9809644B (en) * 1997-10-24 2000-04-25 Lilly Co Eli Insoluble insulen compositions.

Cited By (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2006519881A (en) * 2003-03-06 2006-08-31 エミスフィアー テクノロジーズ インコーポレイテッド Oral insulin treatment and protocol
JP2011162560A (en) * 2003-03-06 2011-08-25 Emisphere Technologies Inc Oral insulin therapy and protocol
US8828923B2 (en) 2003-08-05 2014-09-09 Novo Nordisk A/S Insulin derivatives
JP2009544716A (en) * 2006-07-27 2009-12-17 ノバルティス アクチエンゲゼルシャフト Insulin containing aerosolizable formulations for pulmonary delivery
US8710001B2 (en) 2006-07-31 2014-04-29 Novo Nordisk A/S PEGylated, extended insulins
US9018161B2 (en) 2006-09-22 2015-04-28 Novo Nordisk A/S Protease resistant insulin analogues
US9387176B2 (en) 2007-04-30 2016-07-12 Novo Nordisk A/S Method for drying a protein composition, a dried protein composition and a pharmaceutical composition comprising the dried protein
US9034818B2 (en) 2007-06-13 2015-05-19 Novo Nordisk A/S Pharmaceutical formulations comprising an insulin derivative
US9260502B2 (en) 2008-03-14 2016-02-16 Novo Nordisk A/S Protease-stabilized insulin analogues
US9688737B2 (en) 2008-03-18 2017-06-27 Novo Nordisk A/S Protease stabilized acylated insulin analogues
US9603904B2 (en) 2008-10-30 2017-03-28 Novo Nordisk A/S Treating diabetes melitus using insulin injections with less than daily injection frequency
US9481721B2 (en) 2012-04-11 2016-11-01 Novo Nordisk A/S Insulin formulations
US10137172B2 (en) 2013-04-30 2018-11-27 Novo Nordisk A/S Administration regime
US9896496B2 (en) 2013-10-07 2018-02-20 Novo Nordisk A/S Derivative of an insulin analogue

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EP1173482A1 (en) 2002-01-23
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WO2000064940A1 (en) 2000-11-02

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