JP2002540402A - 質量分析法におけるｌｎａの使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 本発明は、安定性と解像度を向上させるために完全にまたは部分的にＬＮＡ修飾されたＤＮＡプローブを用いた、質量分析法、たとえばマトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）質量分析法、エレクトロスプレー（ＥＳ）質量分析法、イオンサイクロトロン共鳴（ＩＣＲ）質量分析法、フーリエ変換質量分析法またはその組み合わせに基づくＤＮＡおよびＲＮＡ診断に関する。 【解決手段】 本発明は、核酸分子の標的核酸配列の検出する方法、または核酸分子の核酸配列における突然変異を検出する方法であって、前記標的核酸配列または突然変異に関する直接的または間接的な情報を得るために、核酸分子の配列または少なくとも部分配列に対して相補的な（ａ）核酸分子、または（ｂ）核酸分子の一部、または（ｃ）オリゴヌクレオチドを質量分析法によって分析し、ＬＮＡ修飾オリゴヌクレオチドの核酸分子へのハイブリダイゼーションを含む方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 （発明の属する技術分野） 本発明は、安定性と解像度を向上させるために完全にまたは部分的にＬＮＡ修
飾されたＤＮＡプローブを用いた、質量分析法に基づくＤＮＡ診断に関する。

【０００２】 （従来の技術） すべての生物（たとえば動物、植物および微生物）の遺伝情報は、デオキシリ
ボ核酸（ＤＮＡ）中にコード化されている。ヒトの場合、全ゲノムは２４本の染
色体に配置された約１００，０００個のゲノムより成る（「ヒトゲノム（Ｔｈｅ
Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ）」， Ｔ． Ｓｔｒａｃｈａｎ， ＢＩＯＳ Ｓ
ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， １９９２）。各遺伝子は、転写
または翻訳による発現後に生細胞内で特定の生化学機能を実現する特定のタンパ
ク質のコード化する。ＤＮＡ配列の変化は突然変異として知られ、変化した、あ
るいは場合によっては生化学活性さえ失ったタンパク質が生じることがある；こ
れは次に、遺伝病を引き起こす可能性がある。突然変異には、ヌクレオチド欠失
、挿入または変化（点突然変異）がある。点突然変異は、タンパク質配列のアミ
ノ酸に変化が生じる「ミスセンス」か、停止コドンをコード化し、それによって
切断タンパク質が生じる「ナンセンス」のどちらかになる。さらに、多形性の検
出も同様に興味深い。

【０００３】 現在、血友病、サラセミア、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）、ハ
ンチントン舞踏病（ＨＤ）、アルツハイマー病、嚢胞性線維症（ＣＦ）を含む、
３０００を超える遺伝病が知られている（「ヒトゲノム突然変異（Ｈｕｍａｎ
Ｇｅｎｏｍｅ Ｍｕｔａｔｉｏｎ）」、Ｄ． Ｎ． Ｃｏｏｐｅｒ ａｎｄ Ｍ
． Ｋｒａｗｃｚａｋ， ＢＩＯＳ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ， １９９３）。遺伝
病を引き起こす突然変異遺伝子に加えて、ある種の出生時欠陥も、トリソミー２
１（ダウン症候群）トリソミー１３（パトー症候群）、トリソミー１８（エドワ
ード症候群）、モノソミーＸ（ターナー症候群）およびクラインフェルター症候
群（ＸＸＹ）などの他の性染色体異数性などの遺伝子異常の原因である。さらに
あるＤＮＡ配列が個人に、糖尿病、動脈硬化、肥満、各種の自己免疫疾患および
癌（たとえば結腸直腸癌、乳癌、卵巣癌、肺癌）などの多くの病気のいずれかの
素因を与えるという証拠が増加しつつある。

【０００４】 ウィルス、細菌、真菌および他の感染性生物は、宿主細胞に含まれる配列とは
異なる、独特の核酸配列を含む。したがって、感染性生物もその特異的なＤＮＡ
配列に基づいて検出・同定できる。

【０００５】 ヌクレオチド約１６個の配列は、統計的根拠からヒトゲノムのサイズにとって
さえ特異的であるため、比較的短い核酸配列を用いて、高等生物の正常および欠
損遺伝子を検出し、感染性微生物（たとえば細菌、真菌、原生生物および酵母）
を検出することができる。ＤＮＡ配列は、同一種内で異なる個体を検出するため
の指紋としての役割を果たす。

【０００６】 したがって、質量分析法による核酸分子の分析は近年、ますます関心を集めて
いる。

【０００７】 一般に、質量分析法は、真空中で分子をイオン化し、気化してそれらを「飛ば
す」ことによって、個々の分子を「秤量する」手段を与える。電場と磁場を組み
合わせた影響下で、イオンはそれぞれの質量（ｍ）および電荷（ｚ）に応じて軌
道をたどる。低分子量分子の領域では、質量分析法は長い間、親分子イオンの質
量を決定して、有機分子の分析およびキャラクタリゼーションを行うための、決
まりきった物理有機的なレパートリーの一部となっている。さらにこの親分子イ
オンを他の粒子（たとえばアルゴン分子）と衝突させると、分子イオンは崩壊し
て、いわゆる衝突誘発解離（ＣＩＤ）により２次イオンを形成する。崩壊パター
ン／経路によって、詳細な構造情報を導出できることが非常に多い。質量分析法
の多くの応用は当業界、特に生化学で既知であり、酵素学の方法（Ｍｅｔｈｏｄ
ｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）、Ｖｏｌ． １９３、「質量分析法（Ｍａｓ
ｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）」（Ｊ． Ａ． ＭｃＣｌｏｓｋｅｙ編）、１
９９０、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋおよび「バイオテク
ノロジーのための質量分析法（Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ ｆｏｒ
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）」がＧ．Ｓｉｕｚｄａｋ、１９９６、Ａｃａｄｅ
ｍｉｃ Ｐｒｅｓｓにまとめられていることがわかる。

【０００８】 ２つのさらに新たなイオン化／脱離手法は、エレクトロスプレー／イオンスプ
レー（ＥＳ）およびマトリックス支援レーザー脱離／イオン化（ＭＡＬＤＩ）で
ある。ＥＳ質量分析法は、Ｆｅｎｎ ｅｔ ａｌ．によって紹介され（Ｊ． Ｐ
ｈｙｓ． Ｃｈｅｍ． ８８， ４４５１−５９（１９８４）；ＰＣＴ出願Ｎｏ
．ＷＯ／１４１４８）、現在の応用は最近の総説論文にまとめられている（Ｒ．
Ｄ． Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．， Ａｎａｌ． Ｃｈｅｍ．， ６２， ８
８２−８９（１９９０）； Ｂ． Ａｒｄｒｅｙ， 「エレクトロスプレー質量
分析法（Ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｔｒｏｍｅｔｒｙ）」，
Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ Ｅｕｒｏｐｅ， ４， １０−１８（１９９２）
）。質量分析装置として、四重極が最もよく使用される。フェムトモル量のサン
プルによる分子量の決定は、質量計算にすべて使用できる複数のイオンピークが
存在するため、非常に正確である。

【０００９】 これに対してＭＡＬＤＩ質量分析法は、質量分析装置として飛行時間（ＴＯＦ
）構成を使用する場合に特に魅力的である。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法は、
Ｈｉｌｌｅｎｋａｍｐ ｅｔ ａｌ．が紹介した（「マトリックス支援ＵＶレー
ザー脱離／イオン化：大型生分子の質量分析法への新たな手法（Ｍａｔｒｉｘ
Ａｓｓｉｓｔｅｄ ＵＶ−Ｌａｓｅｒ Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ／Ｉｏｎｉｓａｔ
ｉｏｎ： Ａ Ｎｅｗ Ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ
ｅｔｒｙ ｏｆ Ｌａｒｇｅ Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）」、生質量分析法Ｂ
ｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ（Ｂｕｒｌｉｎｇａ
ｍｅ ａｎｄ ＭｃＣｌｏｓｋｅｙ編）、Ｅｌｓｅｒｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ
Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， Ａｍｓｔｅｒｄａｍ， ｐｐ． ４９−６０， １
９９０）。多くの場合、この手法では複数の分子イオンピークは生成されないた
め、原則としてマススペクトルは、ＥＳ質量分析法と比べて単純に見える。

【００１０】 ＷＯ ９４／１６１０１（Ｋｏｓｔｅｒ）は、質量分析法を用いたＤＮＡ配列
決定について述べ、ＷＯ ９４／２１８２２（Ｋｏｓｔｅｒ）は、エクソヌクレ
アーゼ分解による質量分析法を用いたＤＮＡ配列決定について述べている。

【００１１】 ＷＯ ９６／２９４３１（Ｓｅｑｕｅｎｏｍ）は、質量分析法を用いた核酸の
配列および突然変異の決定の各種方法について述べている。質量区別マーカーの
導入によって、質量分析信号の分解能が向上するため、多重化が可能となること
が述べられている。

【００１２】 二環式ヌクレオチド類似体、すなわち二環式糖を含むヌクレオチド類似体が論
文で述べられている。しかし、オリゴヌクレオチド内の天然ヌクレオチドを二環
式類似体で置換することは、特異性または親和性を犠牲にしてよく行われる。し
かし最近、Ｗｅｎｇｅｌと共同研究者がロックヌクレオシド類似体（ＬＮＡ）に
ついて述べており（Ｎｉｅｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏ
ｃ． Ｐｅｒｋｉｎ Ｔｒａｎｓ． １， １９９７， ｐ．３４２３； Ｋｏ
ｓｈｋｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ５４（１９９８），
ｐ．３６０７−３６３０； Ｋｕｍａｒ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｏｒｇ． Ｍ
ｅｄ． Ｃｈｅｍ． Ｌｅｔｔ． ８（１９９８） ２２１９−２２２２； Ｏ
ｂｉｋａ ｅｔ ａｌ．， Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ． ３９（１９
９８）， ５４０１−５４０４）、新規の二環式類似体はオリゴヌクレオチドに
組み込んだ場合に、親和性と特異性の向上を示すことが述べられている。このよ
うな修飾ヌクレオチド類似体のクラス全体は、Ｗｅｎｇｅｌと共同研究者が述べ
ている特性を備えていると考えられる。

【００１３】 （課題を解決するための手段） 本出願者は、質量分析法によって核酸分子の標的核酸配列を検出する方法、ま
たは核酸分子の核酸配列における突然変異を検出する方法において、ＬＮＡ修飾
オリゴヌクレオチドを使用すると、３つの利点、すなわち（ａ）核酸分子の検出
方法に関与するオリゴヌクレオチドの特異性および／または親和性を調整する（
一般に向上させる）可能性、（ｂ）質量区別マーカーの直接包含、（ｃ）質量分
析法の条件下でのＬＮＡ修飾オリゴヌクレオチドの安定性の上昇がもたらされる
ことを発見した。

【００１４】 したがって、本発明は、核酸分子の標的核酸配列の検出する方法、または核酸
分子の核酸配列における突然変異を検出する方法であって、前記標的核酸配列ま
たは突然変異に関する直接的または間接的な情報を得るために、核酸分子の配列
または少なくとも部分配列に対して相補的な（ａ）核酸分子、または（ｂ）核酸
分子の一部、または（ｃ）オリゴヌクレオチドを質量分析法によって分析し、Ｌ
ＮＡ修飾オリゴヌクレオチドの核酸分子へのハイブリダイゼーションを含む方法
を提供する。

【００１５】 本発明はそれゆえ、ＤＮＡ分析の既知の診断方法に対して非常に有用で、価値
のある改良をもたらす。

【００１６】 （発明の実施の形態） 上述したように、本発明は、核酸分子の標的核酸配列を検出する方法、または
核酸分子の核酸配列内の突然変異を検出する方法であって、前記標的核酸配列ま
たは突然変異に関する直接的または間接的な情報を得るために、核酸分子の配列
または少なくとも部分配列に対して相補的な（ａ）核酸分子、または（ｂ）核酸
分子の一部、または（ｃ）オリゴヌクレオチドを質量分析法によって分析し、Ｌ
ＮＡ修飾オリゴヌクレオチドの核酸分子へのハイブリダイゼーションを含む方法
を提供する。

【００１７】 このような方法（しかし有利なＬＮＡ修飾オリゴヌクレオチドを利用していな
い）は、ＷＯ ９６／２９４３１およびＷＯ ９４／２１８２２に記載されてお
り、引用することで本明細書の一部となっている。

【００１８】 ＬＮＡ修飾オリゴヌクレオチドと核酸分子とのハイブリダイゼーションは、本
発明による方法で重要な役割を果たしているため、さらに信頼性の高い結果を得
る目的で特異性または親和性、あるいはその両方を調整するために、ハイブリダ
イゼーション特性を改良することが好ましいことが多い。本発明を用いると、特
異性および／または親和性を改良し、同時に、マススペクトルの分解能の向上に
使用できる質量区別マーカーを包含させることが可能となる。加えて、さらに信
頼性が高く、再現性のある結果を得るために、質量分析法によって分析するオリ
ゴヌクレオチドの安定性を向上させることが望ましい。

【００１９】 以下で明らかになるように、核酸分子にハイブリダイズされるＬＮＡ修飾オリ
ゴヌクレオチドは、もちろん検出分析の構成および種類によって、通常、検出オ
リゴヌクレオチド、捕獲オリゴヌクレオチド、プライマー、拡張プライマー、連
結抽出物および連結生成物から選択される。

【００２０】 ＬＮＡ修飾オリゴヌクレオチドの有利な特徴（特異性／親和性および質量区別
）を十分に利用する好ましい変形において、ＬＮＡ修飾オリゴヌクレオチドは、
標的核酸配列または突然変異に関する情報を得るために、質量分析法によって分
析される。しかし、向上した親和性および特異性のみでも、たとえば、次に質量
分析法によって直接分析される核酸分子の捕獲に非常に有用であることを理解す
る必要がある（以下を参照）。

【００２１】 ＬＮＡ修飾オリゴヌクレオチドは、質量分析法において捕獲プローブとして非
常に有用であるが、質量分析法におけるＬＮＡ修飾オリゴヌクレオチドの使用に
関するすべての利点を利用するために、ＬＮＡ修飾オリゴヌクレオチドが質量分
析法によって分析されるオリゴマーであることが好ましいことを理解する必要が
ある。それゆえ、核酸分子にハイブリダイズされるＬＮＡ修飾オリゴヌクレオチ
ドは、前記標的核酸の配列または突然変異に関する直接または間接情報を得るた
めに、質量分析法によって分析されるオリゴヌクレオチドであることが好ましい
。したがってＬＮＡ修飾オリゴヌクレオチドは、質量分析法方法における検出オ
リゴヌクレオチド、プライマー、拡張プライマー、連結抽出物および連結生成物
から選択することが好ましい。

【００２２】 質量分析を行いやすくするために、検出される核酸配列を含む核酸分子を担体
に固定化することができる。適切な担体の例としては、ビード（たとえばシリカ
ゲル、制御孔ガラス、磁石、セファデックス、セファロース、セルロース）、平
坦な面またはチップ（たとえばガラス繊維フィルタ、ガラス表面、金属表面（ス
チール、金、銀、アルミニウム、銅およびケイ素）、毛細管、プラスチック（た
とえばポリエチレン、ポリプロピレン、ポリアミド、二フッ化ポリビニルピロリ
ドン膜またはマイクロタイタープレート）、あるいはビードまたは平坦な表面、
またはウェファ（たとえばシリコンウェファ）などの平坦な表面の穴に配置され
たビーズより成る同様の材料から作成されたピンまたはコームが挙げられる。

【００２３】 固定化はたとえば、すでに担体に固定化されている捕獲オリゴヌクレオチドと
、検出される核酸配列を含む核酸分子内に含まれている相補性核酸配列とのハイ
ブリダイゼーションに基づいて実施できる。相補性核酸分子間のハイブリダイゼ
ーションが担体によって阻害されないために、捕獲核酸は、長さが少なくともヌ
クレオチド約５個以上のスペーサー領域を担体と捕捉核酸配列の間に含むことが
できる。形成される二重鎖はレーザーパルスの影響下で開裂し、脱離が開始でき
る。担体に結合した捕獲ヌクレオチドは、天然オリゴリボ−またはオリゴデオキ
シリボヌクレオチドはもちろん、類似体（たとえばチオ修飾ホスホジエステルま
たはホスホトリエステル主鎖）によって、あるいは、塩基配列が酵素分解を受け
にくくすることによって、担体に結合した捕獲塩基配列の全体的な安定性を向上
させる、ＰＮＡ類似体などの模倣オリゴヌクレオチドを利用して表すことができ
る。

【００２４】 本発明では、捕獲ヌクレオチドが好ましい固定化ＬＮＡ修飾オリゴヌクレオチ
ドである。

【００２５】 あるいは、標的検出部位は、標的核酸分子（Ｔ）上の適切な官能基（Ｌ’）と
担体に結合された捕獲分子上の適切な官能基（Ｌ）との可逆または非可逆結合に
よって担体に直接結合できる。可逆結合は、質量分析法の条件下で開裂するよう
にできる（すなわち、比較的安定な有機ラジカル間の電荷移動錯体または不安定
結合などの光開裂結合）。さらに、結合は四級アンモニウム基であるＬ’によっ
て形成可能であり、この場合、担体の表面には、負に荷電した核酸主鎖に反発す
るため、質量分析計による分析に必要な脱離が促進される。

【００２６】 脱離は、レーザーパルスによって生成された熱、および／またはＬ’に依存し
て、Ｌ’発色団と共鳴状態にあるレーザーエネルギーの特異性吸収のいずれかに
よって起きる。

【００２７】 一例として、Ｌ−Ｌ’化学的作用は、一種のジスルフィド結合（たとえばメル
カプトエタノールまたはジチオエリトロールによって化学的に開裂可能）、ビオ
チン／ストレプトアビジン系、弱い酸性条件下ではもちろん、質量分析法の条件
下でも開裂可能なトリチルエーテル基のヘテロ二機能性誘導体、ヒドラジニウム
／酢酸塩緩衝液によるほぼ中性条件下で開裂可能なレブリニル基、トリプシンな
どのエンドペプチダーゼ酵素によって開裂可能なアルギニン−アルギニンまたは
リジン−リジン結合、ピロホスファターゼによって開裂可能なピロリン酸結合、
またはたとえば、リボヌクレアーゼまたはアルカリによって開裂可能な、オリゴ
ヌクレオチド配列の間のリボヌクレオチド結合でもよい。

【００２８】 官能基ＬおよびＬ’は電荷移動錯体を形成可能であるため、一時的なＬ−Ｌ’
結合を形成する。多くの場合「電荷移動バンド」はＵＶ／可視分光測定法によっ
て決定できるため、レーザーエネルギーは電荷移動波長の該当するエネルギーに
合わせられ、それゆえ担体からの特異的脱離が開始可能である。当業熟練者は、
複数の組み合わせがこの目的を果たし、供与官能基は担体上にあっても、検出さ
れる核酸分子に結合していてもよく、またはその逆でもよいことを認識するであ
ろう。

【００２９】 また別の手法では、比較的安定なラジカルをホモリティックに形成することに
よって、可逆性Ｌ−Ｌ’結合が生成できる。レーザーパルスの影響下では、（上
述したように）脱離はイオン化と同様にラジカル位置で起こる。

【００３０】 当業熟練者は、他の有機ラジカルが選択可能であり、その間の結合をホモリテ
ィック開裂するのに必要な解離エネルギーに関連して、該当するレーザー波長を
選択できる（たとえば「反応生分子（Ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）
」ｂｙ Ｃ． Ｗｅｎｔｒｕｐ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ Ｂ： ｓｏｎｓ，
１９８４）ことを認識するであろう。

【００３１】 固着官能基Ｌ’は、ＰＣＲ、ＬＣＲまたは転写増幅などの増幅手順の間に、適
切なプライマーを用いて標的捕獲配列（ＴＣＳ）に包含させることもできる。

【００３２】 捕獲オリゴヌクレオチドまたは標的核酸も、たとえば、ＷＯ ９６／３１５７
７（Ｈａｖｓｔｅｅｎ Ｊａｋｏｂｓｅｎ ａｎｄ Ｋｏｃｈ）で述べられてい
るアントラキノン試薬などの光化学結合剤によって担体に直接固定化できる。

【００３３】 一般に本発明は、核酸分子の特定の核酸配列を検出するための質量分析方法を
提供する。このような核酸分子は、生体サンプルから得られることが多い。本明
細書で使用するように、「生体サンプル」という語は、生物から得た物質（たと
えばヒト、動物、植物、細菌、真菌、原生生物ウィルス）を指す。発明で使用す
る場合、生体サンプルは核酸分子を含む必要がある。本発明で使用するのに適し
た生体サンプルの例としては：固体物質（たとえば組織、細胞ペレット、生体組
織検査）および生体液（たとえば尿、血液、唾液、羊水）を含む。

【００３４】 核酸分子は、当業界で周知であり、特定の生体サンプルに適切に選択された特
定の単離手順である、多くの手順のいずれかを用いて特定の生体サンプルから単
離できる。たとえば、凍結／解凍、アルカリ溶解手順は、核酸分子を固体物質か
ら得るのに有用な手順であり、熱およびアルカリ溶解手順は、尿から核酸分子を
得るのに有用な手順であり、プロテイナーゼＫ抽出は血液から核酸を得るのに用
いることができる。

【００３５】 質量分析を実施するのに適量の核酸分子を得るには、増幅が必要である。本発
明で使用する適切な増幅手段の例としては：クローニング（Ｓａｍｂｒｏｏｋ
ｅｔ ａｌ．，「分子クローニング：実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」Ｃｏｌｄ Ｓｐ
ｒｉｎｇ Ｈａｒｂａｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ． １９８９）、
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（Ｃ． Ｒ． Ｎｅｗｔｏｎ ａｎｄ Ａ．
Ｇｒａｈａｍ． ＰＣＲ， ＢＩＯＳ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， １９９４）、
リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）（Ｗｉｅｄｍａｎｎ， Ｍ．， ｅｔ ａｌ．，（
１９９４）ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｐｐｌ．， Ｖｏｌ．３． ｐｐ．５７
−６４；Ｆ． Ｂａｒａｎｙ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ
ＵＳＡ ８８， １８９−９３（１９９１））、鎖置換増幅（ＳＤＡ）（Ｇ．
Ｔｅｒｒａｎｃｅ Ｗａｌｋｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉ
ｄｓ Ｒｅｓ ２２， ２６７０−７７（１９９４））、ＲＴ−ＰＣＲ（Ｈｉｇ
ｕｃｈｉ． ｅｔ ａｌ；，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １１， １０２６
−１０３０（１９９３））、対立遺伝子特異性増幅（ＡＳＡ）および転写ベース
方法などの変形が挙げられる。

【００３６】 核酸分子は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）およびリボ核酸（ＲＮＡ）を含む。

【００３７】 質量分析は一般に、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化飛行時間型（Ｍ
ＡＬＤＩ−ＴＯＦ）質量分析法、エレクトロスプレー（ＥＳ）質量分析法、イオ
ンサイクロトロン共鳴（ＩＣＲ）質量分析法、フーリエ変換質量分析法、または
その組み合わせを利用する。これらの技術は、当業技術者に周知である。

【００３８】 本発明で使用するのに好ましい分光計の形式は、マトリックス支援レーザー脱
離イオン化（ＭＡＬＤＩ）、エレクトロスプレー（ＥＳ）、イオンサイクロトロ
ン共鳴（ＩＣＲ）およびフーリエ変換である。ＥＳの場合、水または揮発性緩衝
液に溶解させたサンプルを、大気圧イオン化インタフェース（ＡＰＩ）に連続的
または不連続的に注入し、次に四重極で質量分析する。ＥＳ質量分析法を用いて
得られる多重イオンピークに生成によって、質量決定の精度が増す。特異構造に
関するさらに詳細な情報も、ＭＳ／ＭＳ四重極構成を用いて得ることができる。
ＴＯＦもＥＳとともに用いると、精度と分解能が上昇する。ＭＡＬＤＩ質量分析
法では、たとえば単一または三次元四重極モードの磁気セクタ／磁気偏向（ｍａ
ｇｎｅｔｉｃ ｓｅｃｔｏｒ／ｍａｇｎｅｔｉｃ ｄｅｆｌｅｃｔｉｏｎ ｉｎ
ｓｔｒｕｍｅｎｔｓ ｉｎ ｓｉｎｇｌｅ ｏｒ ｔｒｉｐｌｅ ｑｕａｄｒｕ
ｐｏｌｅ ｍｏｄｅ）（ＭＳ／ＭＳ）などの各種質量分析装置を使用できる。フ
ーリエ変換および飛行時間型（ＴＯＦ）構成は、質量分析法の技術として知られ
ている。脱離／イオン化方法の場合、多数のマトリックス／レーザーの組み合わ
せが使用できる。イオントラップおよびリフレクトロン構成も利用できる。

【００３９】 ＬＮＡ修飾オリゴマーは質量分析法によって分析されるオリゴマーの安定性を
改善すると考えられているが（以下参照）、ある例においては、たとえば、気化
に必要なレーザーエネルギーをを低下させ、および／または（さらに）断片化を
最小にするために、（さらに）核酸分子を「調節」するのは有利である。調整は
、標的検出部位が固定化される間に行うことが好ましい。調整の一例は、核酸分
子のホスホジエステル主鎖の修飾（たとえばカチオン交換）であり、これはヌク
レオチド単位当たりのカチオン結合の異質性によるピークの広がりをなくすのに
有用である。核酸分子にヨウ化アルキル、ヨードアセトアミド、β−ヨードエタ
ノールまたは２，３−エポキシ−１−プロパノールなどのアルキル化剤を接触さ
せると、核酸分子のモノチオホスホジエステル結合をホスホトリエステル結合に
変換できる。同様にホスホジエステル結合は、塩化トリアルキルシリルを用いた
非荷電誘導体に変換されることがある。さらに調整には、Ｎ７−またはＮ９−デ
アザプリンヌクレオチド、ＲＮＡ細胞構築物などの、脱プリン（質量分析時の断
片化）感受性を低下させる組み込まれたヌクレオチドを包含させること、オリゴ
ヌクレオチドトリエステルを使用すること、またはアルキル化される組み込まれ
たホスホロチオアート機能を包含させること、またはＰＮＡなどの擬似オリゴヌ
クレオチドを採用することがある。ＬＮＡ修飾オリゴヌクレオチドを使用する場
合にも、ＬＮＡ修飾オリゴヌクレオチド内のＬＮＡがたとえば、リン酸塩主鎖が
修飾されている場合にＬＮＡ修飾オリゴヌクレオチドを使用することによって、
調整が不要となるように構成されていても、調整は適切である（以下を参照）。

【００４０】 ある応用では、（配列の１地点において）特定の捕獲核酸断片上で２つ以上の
（突然変異）遺伝子座を同時に検出するのに有用であり、各種担体上のオリゴヌ
クレオチドまたは擬似オリゴヌクレオチド配列を用いて、並列処理を行うのに有
用である。複数の各種方法によって「多重化」も行える。たとえば、該当する検
出オリゴヌクレオチドを用いることによって、ある標的配列上で複数の突然変異
を同時に検出することができる。しかし、同時検出（多重化）を可能にするため
には、検出オリゴヌクレオチドＤ１、Ｄ２およびＤ３の分子量の違いが十分に大
きくなければならない。これは、配列自体によってか（組成または長さ）、質量
調節官能性Ｍ１〜Ｍ３を検出オリゴヌクレオチドに導入することによって行える
。ここで、検出オリゴヌクレオチドをＬＮＡ修飾すると、包含されたＬＮＡ自体
のブリッジが分子量を少なくとも修飾当たり１０Ｄ増加させることで（たとえば
、Ｒ^２＊およびＲ^４＊がともにＬＮＡ内で−Ｏ−ＣＨ_２−ブリッジを形成する場
合のように、−Ｏ−ＣＨ_２−ブリッジが−Ｈおよび−ＯＨ置換基を置換する場合
、１個の炭素が２個の水素を置換する。以下を参照。）、必要な分子量の違いが
生じる。同様に、−Ｓ−ＣＨ_２−または−ＮＲ−ＣＨ_２−ブリッジを導入すると
、質量の異なる他の組み合わせが導入される可能性が生じる。したがって一般に
、それ以上の質量調節官能基を導入する必要はない。

【００４１】 必要ならば、質量調節部分をたとえば、オリゴヌクレオチドの５’−末端、核
塩基（塩基）、リン酸塩主鎖、ヌクレオシド（複数のヌクレオシド）の２−位置
、および／または末端３’−位置に付加することができる。質量調節部分の例と
してはたとえば、ハロゲン、アジドまたはＸＲの形式（ここでＸは結合基であり
、Ｒは質量修飾機能である）が挙げられる。したがって質量調節官能基は、オリ
ゴヌクレオチド分子にさらに特定された質量増分を導入するのに使用できる。

【００４２】 ここで質量調節部分Ｍは、ヌクレオ塩基（Ｃ^７−デアザヌクレオシドの場合に
はＣ−７にも）、アルファリン酸塩の三リン酸基、またはヌクレオシド三リン酸
の糖環の３’−位置に付加できる。さらに質量調節官能基は、ヌクレオシド三リ
ン酸の糖環の３’−位置に付加することによって、鎖停止に影響を与えるように
付加することができる。当業熟練者には、多くの組み合わせが本発明の目的を同
様に果たすことが明白である。同様に当業熟練者は、鎖延長ヌクレオシド三リン
酸も、官能基および付加位置を多様に変更および組み合わせた同様の方法で、質
量修飾できることを認識するであろう。あるいは、質量調節は安定な同位体、た
とえば^３２Ｓ、^３３Ｓ、^３４Ｓ、^３６Ｓを包含させることによって導入すること
ができる。

【００４３】 本発明の範囲を制限せずに、オリゴ−／ポリエチレングリコール誘導体をＲに
使用するの同様に、ＭをＸＲのＸに導入することができる。この場合の質量調節
増分は４４であり、すなわちｍを０から４に変え、したがって質量単位４５（ｍ
＝０）、８９（ｍ＝１）、１３３（ｍ＝２）、１７７（ｍ＝３）および２２１（
ｍ＝４）を核酸分子に付加するだけで、５種類の質量調節種を生成することがで
きる。オリゴ／ポリエチレングリコールも、メチル、エチル、プロピル、イソプ
ロピル、ｔ−ブチルなどの低アルキル基によってモノアルキル化できる。結合官
能基Ｘの選択も説明する。たとえば、最近、「オリゴヌクレオチドと類似体、実
践的アプローチ（Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ａｎｄ Ａｎａｇｌｏｇｕ
ｅｓ． Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ）」， Ｆ． Ｅｃｋｓｔ
ｅｉｎ編， ＩＲＬプレス， Ｏｘｆｏｒｄ， １９９１で述べられているよう
に、他の化学的作用を質量調節化合物に使用できる。

【００４４】 また別の実施態様において、オリゴ／ポリエチレングリコール以外の各種の質
量調節官能基Ｒを、適切な結合作用Ｘによって選択および付加することができる
。ＨをＦ、Ｃｌ、Ｂｒおよび／またはＩなどのハロゲン、あるいはＳＣＮ、ＮＣ
Ｓなどの擬ハロゲンで置換することによって、あるいはメチル、エチル、プロピ
ル、イソプロピル、ｔ−ブチル、ヘキシル、フェニル、置換フェニル、ベンジル
などの各種アルキル、アリルまたはアラルキル部分、またはＣＨ_２Ｆ、ＣＨＦ_２ 、ＣＦ_３、Ｓｉ（ＣＨ_３）_３、Ｓｉ（ＣＨ_３）_２、（Ｃ_２Ｈ_５）、Ｓｉ（ＣＨ_３ ）（Ｃ_２Ｈ_５）_２、Ｓｉ（Ｃ_２Ｈ_５）_３などの官能基を用いることによって、簡
単な質量調節を行える。さらに別の質量調節は、核酸分子（たとえば検出（Ｄ）
）またはヌクレオシド三リン酸によって、ホモ−またはヘテロペプチドを付加さ
せることで行える。質量増分５７の質量調節種を生成するのに有用な例は、オリ
ゴグリシンの付加であり、たとえば７４（ｒ＝１， ｍ＝０）、１３１（ｔ＝１
， ｍ＝２）、１８８（ｒ＝１， ｍ＝３）、２４５（ｒ＝１， ｍ＝４）の質
量調節が行われる。簡単なオリゴアミドも使用可能であり、７４（ｒ＝１， ｍ
＝０）、８８（ｒ＝２， ｍ＝０）、１０２（ｒ＝３， ｍ＝０）、１１６（ｒ
＝４， ｍ＝０）などが得られる。当業熟練者には、上記に以外に多くの可能性
があることが明白である。

【００４５】 各種の質量調節検出オリゴヌクレオチドを用いて、考えられるすべての変形／
突然変異体を同時に検出することができる。あるいは、検出オリゴヌクレオチド
の設計および位置決定により、検出オリゴヌクレオチドがＤＮＡ／ＲＮＡポリメ
ラーゼのプライマーとして作用するため、突然変異部位における４つすべての塩
基順列を検出できる。増幅方法の間に、たとえば質量調節も組込むことができる
。

【００４６】 説明した質量調節はＬＮＡ修飾オリゴヌクレオチドのすでに不可欠な機能であ
るため（以下の定義を参照）、上述の質量調節は主として、オリゴヌクレオチド
またはＬＮＡ修飾オリゴヌクレオチド中の任意の未変性ヌクレオチドに適用され
ることを理解されたい。

【００４７】 さらに好ましい実施態様において、サンプルは、２種類以上の標的核酸配列を
同時に検出および識別するために、２種類以上の検出オリゴヌクレオチドまたは
擬似オリゴヌクレオチドで質量区別によって調整される。ここで１種類以上の検
出オリゴヌクレオチドは、ＬＮＡ修飾オリゴヌクレオチドである。この応用は、
多重化に関連して特に適切である。

【００４８】 本発明の方法の実施態様において、標的核酸配列はＤＮＡ指紋であるか、遺伝
子病、染色体異常、遺伝子素因、ウィルス感染、真菌感染、細菌感染および原生
生物感染より成る群から選択される疾病または状態に関与している。あるＤＮＡ
配列が人に糖尿病、動脈硬化、肥満、各種の自己免疫疾病および癌（たとえば直
腸結腸癌、乳癌、卵巣癌、肺癌）；染色体異常（先天性または後天性のいずれか
）；または疾病または状態への素因（たとえば肥満、動脈硬化、癌）などの多く
の疾病のいずれかにかかりやすくする証拠が増えてきているため、このことは特
に興味深い。また、「ＤＮＡ指紋」、たとえば「マイクロサテライト配列」など
の多形性の検出は、同一性または遺伝（父性または母性）の決定に有用である。

【００４９】 生体サンプルによって、遺伝病、染色体ｐｎｅｕｐｌｏｉｄｙまたは遺伝的素
因の診断を、出生前か後に実施できる。

【００５０】 ウィルス、細菌、菌類および他の感染性生物は、独自の核酸配列を含み、これ
らは宿主細胞に含まれる配列とは異なる。感染性生物に特有の核酸配列の検出と
定量化は、感染の診断または監視にとって重要である。

【００５１】 標的（Ｔ）核酸分子における野生種（Ｄ^ｗｔ）および／または突然変異体（Ｄ ^ｍｕｔ ）配列を検出する方法は以下のとおりである：特定の捕獲配列（Ｃ；ＬＮ
Ａ修飾オリゴヌクレオチドでもよい）をスペーサ（Ｓ）によって、担体（ｓｓ）
に結合させる。さらに、標的配列（Ｔ）の相補性配列と特異的に相互作用し、標
的捕獲部位（ＴＣＳ）がハイブリダイゼーションによって検出されるように、捕
獲配列を選択する。しかし標的検出部位（ＴＤＳ）が、分子量を増減させる突然
変異Ｘを含む場合、突然変異ＴＤＳは質量分析法によって野生種と区別すること
ができる。たとえば、アデニン塩基（ｄＡ）挿入の場合、Ｄ^ｗｔとＤ^ｍｕｔの分
子量の違いは約３１４ダルトンとなる。

【００５２】 検出核酸（Ｄ；ＬＮＡ修飾オリゴヌクレオチドでもよい）は、野生種検出オリ
ゴヌクレオチド（Ｄ^ｗｔ）が対照としての突然変異標的検出配列と接触しても安
定なハイブリッドが形成されないように、突然変異が分子の中央となり、フラン
キング領域が十分短くなるように設計することが好ましい。突然変異位置に一致
塩基を持つ突然変異検出オリゴヌクレオチド（Ｄ^ｍｕｔ）をハイブリダイゼーシ
ョンに使用する場合にも、突然変異を検出することができる。生体サンプルから
得た核酸が特定の配列に対してヘテロ接合性である（すなわちＤ^ｗｔとＤ^ｍｕｔ の両方を含む）場合、Ｄ^ｗｔとＤ^ｍｕｔはどちらも適切な鎖に結合し、質量の違
いによって、Ｄ^ｗｔとＤ^ｍｕｔはどちらも同時に検出することができる。

【００５３】 本発明の方法は、標的配列の既知の配列情報と既知の突然変異部位を利用する
。新しい突然変異も検出できる。たとえば、生体サンプルから得た核酸分子の転
写は、１種類以上のヌクレアーゼと該当する相補性核酸配列を持つ担体に捕獲さ
れた断片を用いて、特異的に消化できる。捕獲標的配列のハイブリダイゼーショ
ンおよび分子量の検出は、遺伝子内の突然変異の有無、その位置に関する情報を
与える。あるいは、ＤＮＡは１種類以上の特異性エンドヌクレアーゼによって開
裂され、断片の混合物を生成できる。野生種と突然変異断片混合物との分子量の
比較によって、突然変異が検出される。

【００５４】 本発明の方法は、核酸の性質と望ましい結果の種類によって、多くの方法で実
施できる。考えられる変形の一部を以下に述べる。

【００５５】 生体サンプル内に存在する標的核酸配列を検出する１つの変形は、以下の工程
より成る： ａ）生体サンプルから核酸分子を得る工程と； ｂ）固定化核酸分子を作成するために、核酸分子を担体に固定化する工程と； ｃ）検出オリゴヌクレオチドを固定化核酸分子とハイブリダイズし、ハイブリダ
イズしなかった検出オリゴヌクレオチドを除去する工程と； ｄ）工程ｃ）の生成物をイオン化および気化させる工程と； ｅ）質量分析法によって検出オリゴヌクレオチドを検出する工程であって、検出
オリゴヌクレオチドの検出によって生体サンプル内に標的核酸配列の存在が示さ
れる工程。

【００５６】 この変形において、ＬＮＡ修飾オリゴヌクレオチドは、検出オリゴヌクレオチ
ドであるか、核酸分子を固定化するために用いることができる。

【００５７】 この変形は、検出オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションが核酸配列内
の特異配列または特異突然変異の陽性マーカーである場合に、特に適切である。
もちろん検出オリゴヌクレオチドがＬＮＡ修飾オリゴヌクレオチドであることが
好ましい。

【００５８】 核酸分子は一般に、生体サンプルから得られる。この核酸分子は上述したよう
に、分析の前に精製・増幅できる。標的核酸配列は工程ｂ）の前に、たとえばク
ローニング、増幅に基づく転写、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連
鎖反応（ＬＣＲ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）より成る群から選択される増幅手順に
よって増幅することが好ましい。

【００５９】 固定化、工程ｂ）は、光化学結合試薬（たとえばアントラキノン）、またはビ
オチン／ストレプトアビジン系のどちらかによって、核酸分子を直接担体に結合
することによって行える。あるいは、事前に担体に固定化されている相補性捕獲
核酸分子と、標的核酸配列上の相補性特異配列とのハイブリダイゼーションによ
っても固定化できる。このような相補性捕獲核酸分子は、ＬＮＡ修飾オリゴヌク
レオチドであることが好ましい。

【００６０】 興味深い別の方法では、事前に担体に固定化されている相補性捕獲核酸分子の
配列と、標的核酸配列とは異なる核酸分子の一部とのハイブリダイゼーションに
よって固定化される。相補性捕獲核酸分子は通常、オリゴヌクレオチドまたは擬
似オリゴヌクレオチドであり、好ましくはＬＮＡ修飾オリゴヌクレオチドである
。

【００６１】 標的検出部位に相補性の検出核酸分子（たとえばオリゴヌクレオチドまたは擬
似オリゴヌクレオチド）を次に、標的検出部位に接触させると、質量分析法によ
って、標的検出部位の存在を示す二重鎖の形成が検出できる。好ましい実施態様
では、標的検出部位を検出前に増幅し、核酸分子を調整する。さらに好ましい実
施態様では、標的検出配列を、オリゴヌクレオチド配列を用いて並列処理するだ
けでなく、複数の同時検出（多重化）ができるような形式に調整する（「ＤＮＡ
チップ（ＤＮＡ ｃｈｉｐｓ）」たとえばＮａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ
ｏｇｙ， Ｖｏｌ． １６， Ｏｃｔｏｂｅｒ １９８８， ページ９８１−９
８３）。

【００６２】 工程ｂ）の固定化は、核酸分子が精製または分析目的で遊離できるように、可
逆的であることがさらに好ましい。

【００６３】 検出オリゴヌクレオチドを分析する変形にも適用可能な本発明の興味ある特徴
は、オリゴヌクレオチド配列の設計が可能であることである。ここで配列（また
はサブ配列）は、分子量の直接関数である。たとえば、核酸分子の３つの位置（
Ａ， Ｂ， Ｃ）にＣ−＞Ｇ突然変異が見られる場合、野生種以外に７種類の突
然変異（２^＊２^＊２−１）が存在することが考えられる。８種類の「未修飾」検
出オリゴヌクレオチドの構成によって、位置Ａ、ＢおよびＣの単一突然変異を区
別することはできない。しかし、Ａ、ＢまたはＣにおける単一突然変異に対応す
る３つのオリゴヌクレオチドが異なる数のＬＮＡを含み、ＡＢ、ＢＣまたはＡＣ
における二重突然変異に該当する３つのオリゴヌクレオチドが異なる数のＬＮＡ
を含んでいる場合、たとえば８種類のＬＮＡ修飾検出オリゴヌクレオチドを構成
することによって、それぞれのオリゴヌクレオチドの質量は弁別的となる。した
がって、オリゴヌクレオチドの混合物を添加することによって、唯一のＬＮＡ修
飾オリゴヌクレオチドがハイブリダイズし、続いて質量分光分析を行うと、突然
変異の数と位置が直接検出できる。

【００６４】 本原理は、核酸分子内の未知の短い配列の検出にも同様に適用できると考えら
れる。たとえば、特有の分子量の６４（４^＊４^＊４）ＬＮＡ修飾オリゴヌクレオ
チドの混合物を添加すると、ハイブリダイゼーションにより核酸中の未知の３つ
の位置を「スキャン」し、次の質量分析によって直接情報を得ることができる。
このことは、あるＬＮＡの優れた特異性および親和性特性に基づいて現実的であ
ると思われる。

【００６５】 生体サンプル中に存在する標的核酸配列を検出する別の変形は、以下の工程よ
り成る： ａ）生体サンプルから標的核酸配列を含む核酸分子を得る工程と； ｂ）適切な増幅手順を用いて標的核酸配列を増幅することによって、増幅標的核
酸配列を得る工程と； ｃ）検出オリゴヌクレオチドを核酸分子とハイブリダイズし、ハイブリダイズさ
れなかった検出オリゴヌクレオチドを除去する工程と； ｄ）工程ｃ）の生成物をイオン化・気化する工程と； ｅ）質量分析法によって検出オリゴヌクレオチドを検出する工程であって、検出
オリゴヌクレオチドの検出によって生体サンプル内に標的核酸配列の存在が示さ
れる工程。

【００６６】 この変形において、上の変形と等しいが、固定化は必須の工程ではない。上と
同様に、検出オリゴヌクレオチドはＬＮＡ修飾オリゴヌクレオチドであることが
好ましい。さらに上と同様に、標的核酸は、クローニング、増幅に基づく転写、
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、鎖置換増幅（
ＳＤＡ）より成る群から選択される増幅手順によって増幅することが好ましい。
また、増幅標的核酸配列は、固定化標的核酸配列を生成するために担体に固定化
することが好ましく、続いて、事前に担体に固定化された相補性捕獲核酸分子（
好ましくはＬＮＡ修飾オリゴヌクレオチド）と、標的核酸配列とのハイブリダイ
ゼーションを実施することが好ましい。

【００６７】 工程ｂ）の固定化は、核酸分子が精製または分析目的で遊離できるように、可
逆的であることがさらに好ましい。

【００６８】 生体サンプル中に存在する標的核酸配列を検出する別の変形は、以下の工程よ
り成る： ａ）生体サンプルから標的核酸配列を得る工程と； ｂ）標的核酸配列を複製することによって、複製核酸分子を生成する工程と； ｃ）複製核酸分子を、１つ以上の適切なヌクレアーゼを用いて特異的に消化し、
消化断片を生成する工程と； ｄ）固定化断片を生成するために、相補性捕獲核酸配列を含む担体に消化断片を
固定化する工程と； ｅ）固定化断片を質量分析によって分析する工程であって、ハイブリダイゼーシ
ョンと固定化断片の分子量決定によって、標的核酸配列の情報が得られる工程。

【００６９】 この変形では、ＬＮＡ修飾オリゴヌクレオチドを捕獲核酸として用いるか、Ｌ
ＮＡモノマーを核酸分子の複製で使用できる。

【００７０】 この変形では、生体サンプルから得られた核酸分子から複製された核酸分子を
、１つ以上のヌクレアーゼ（ＤＮＡにはデオキシリボヌクレアーゼ、ＲＮＡには
リボヌクレアーゼを用いる）および対応する相補性配列を持つ担体に捕獲された
断片を用いて、特異的に消化できる。ハイブリダイゼーションイベントと捕獲標
的配列の実際の分子量によって、遺伝子内の突然変異の有無とその位置に関する
情報が与えられる。配列は、質量分析法を用いてスポットごとに分析できる。Ｄ
ＮＡは同様に、制限エンドヌクレアーゼを含むヌクレアーゼのカクテルを用いて
、同様に消化される。好ましい実施態様において、核酸断片は質量分析検出前に
調整される。

【００７１】 工程ａ）の後、標的核酸配列は質量調節デオキシヌクレオシドおよび／または
ジデオキシヌクレオシド三リン酸およびＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを用い
て、ＤＮＡ内に複製してもよい。質量調節デオキシリボヌクレオシドおよび／ま
たはジデオキシヌクレオシド三リン酸は、モノマーＬＮＡでもよい。

【００７２】 あるいは、質量調節リボヌクレオシドおよび／または３’−デオキシヌクレオ
シド三リン酸およびＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを用いて、標的核酸配列を
ＲＮＡ内に複製してもよい。質量調節リボヌクレオシドおよび／または３’−デ
オキシヌクレオシド三リン酸は、モノマーＬＮＡでもよい。

【００７３】 さらには、質量調節デオキシヌクレオシドおよび／またはジデオキシヌクレオ
シド三リン酸、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを用いて、標的核酸をＤＮＡ何
複製してもよい。またここで、質量調節デオキシリボヌクレオシドおよび／また
はジデオキシヌクレオシド三リン酸はモノマーＬＮＡでもよい。

【００７４】 相補性捕獲核酸配列は通常、オリゴヌクレオチドまたは、ＬＮＡ修飾オリゴヌ
クレオチドなどの擬似オリゴヌクレオチドである。固定化は可逆性であることが
好ましい。

【００７５】 生体サンプル中に存在する標的核酸配列を検出する、さらに別の変形は、以下
の工程より成る： ａ）生体サンプルから標的核酸配列を含む核酸分子を得る工程と； ｂ）標的核酸配列を１つ以上のプライマーと接触させる工程であって、前記プラ
イマーが標的核酸配列に相補的な３’末端塩基を持つ工程と； ｃ）工程ｂ）の生成物を適切なポリメラーゼ酵素と接触させ、次に４つのヌクレ
オシド三リン酸のうち１つに接触させる工程と； ｄ）工程ｃ）の生成物をイオン化・気化させる工程と； ｅ）工程ｄ）の生成物を質量分析法によって検出する工程であって、生成物の分
子量によって、標的核酸配列のプライマーの３’−末端に隣接する突然変異の有
無をが示される工程。

【００７６】 この変形では、対立遺伝子（突然変異体または正常）に対して相補性の３’末
端塩基を持つ１つ以上のプライマーが、対立遺伝子を含む標的核酸分子によって
ハイブリダイズされる。プライマーを独自に延長をさせるために、適切なポリメ
ラーゼおよびヌクレオシド三リン酸の完全なセット、またはヌクレオシド三リン
酸１つのみを個別の反応で使用する。プライマーが適切にアニーリングされてい
て（すなわち３’のミスマッチがない）、正しい（すなわち相補性の）ヌクレオ
シドが付加されている場合に限り、プライマーが拡張される。質量分析法で決定
されたように、分子量シフトによって生成物を分解することができる。

【００７７】 この変形において、プライマーはＬＮＡ修飾オリゴヌクレオチドである。

【００７８】 生体サンプル中に存在する標的ヌクレオチドを検出する、また別の変形は、以
下の工程より成る： ａ）標的ヌクレオチドを含む核酸分子を得る工程と； ｂ）固定化核酸分子を生成するために、核酸分子を担体上に固定化する工程と；
ｃ）固定化核酸分子を、標的ヌクレオチドの５’に接している部位で核酸分子に
相補性であるプライマーオリゴヌクレオチドとハイブリダイズする工程と； ｄ）標的ヌクレオチドに相補性である唯一のデオキシヌクレオシドまたは３’−
デオキシヌクレオシド三リン酸がプライマーに拡張されるようにするために、工
程ｃ）の生成物に、完全なセットのジデオキシヌクレオシドまたは３’−デオキ
シヌクレオシド三リン酸およびＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを接触させる工
程と； ｅ）工程ｄ）の生成物をイオン化・気化する工程と； ｆ）標的ヌクレオチドの同一性を判定するために、質量分析法によって拡張プラ
イマーを検出する工程。

【００７９】 この変形において、検出される核酸配列（すなわち標的）を含む核酸分子は最
初に担体に固定化される。固定化はたとえば、標的検出部位とは異なる標的核酸
分子の一部と、事前に担体に固定化されている捕獲核酸分子とのハイブリダイゼ
ーションによって行える。あるいは固定化は、標的核酸分子と担体の直接結合に
よって行える。標的核酸分子と担体の間にスペーサ（たとえば核酸分子）がある
ことが好ましい。突然変異部位の５’に接する標的検出部位の一部に対して相補
性の核酸分子は次に、標的核酸分子とハイブリダイズする。ジデオキシヌクレオ
シドの完全なセットまたは３’−デオキシヌクレオシド三リン酸（たとえばｐｐ
ｐＡｄｄ、ｐｐｐＴｄｄ、ｐｐｐＣｄｄ、ｐｐｐＧｄｄ）およびＤＮＡ依存性Ｄ
ＮＡポリメラーゼを添加すると、Ｘに相補性であるジデオキシヌクレオシドまた
は３’デオキシヌクレオシド三リン酸の１つだけを添加することができる。次に
、質量分析法によって、ハイブリダイゼーション生成物を検出することができる
。

【００８０】 この変形において、捕獲核酸分子または拡張プライマーのいずれかがＬＮＡ修
飾オリゴヌクレオチドである。この後者が事例であることが好ましく、ＬＮＡ修
飾オリゴヌクレオチドをプライマーとして使用するか、ＬＮＡモノマーを核酸ポ
リメラーゼ基質として使用することのいずれかによって実施できる。

【００８１】 核酸分子中の突然変異を検出するための、さらに別の変形は、以下の工程より
成る： ａ）核酸分子を得る工程と； ｂ）核酸分子とオリゴヌクレオチドプローブをハイブリダイズすることによって
、突然変異部位でミスマッチを形成する工程と； ｃ）工程ｂ）の生成物を単鎖特異性エンドヌクレアーゼに接触させる工程と； ｄ）工程ｃ）の生成物をイオン化・気化する工程と； ｅ）質量分析法によって、得られた生成物を検出する工程であって、２つ以上の
断片の存在が、核酸分子に突然変異が含まれていることを示す工程。

【００８２】 ここで標的核酸を、突然変異Ｍを含む領域内の標的に対してハイブリダイズす
る相補性オリゴヌクレオチドとハイブリダイズする。次に、ヘテロ二重鎖をハイ
ブリダイズされていない部分で特異的に開裂できる薬剤（たとえば単鎖特異性エ
ンドヌクレアーゼ）と接触させると、突然変異の存在を示すミスマッチによって
、標的核酸の開裂が生じる。次いで、２つの開裂生成物は質量分析法によって検
出できる。オリゴヌクレオチドプローブは、ＬＮＡ修飾オリゴヌクレオチドであ
ることが好ましい。

【００８３】 生体サンプルに存在する標的核酸配列を検出するための、またさらなる変形は
、以下の工程より成る： ａ）生体サンプルから標的核酸配列を含む核酸を得る工程と； ｂ）標的核酸配列を連結抽出物のセットおよび熱安定性ＤＮＡリガーゼとの１種
類以上のハイブリダイゼーションを実施することによって、連結生成物を作成す
る工程と； ｃ）工程ｂ）の生成物をイオン化・気化する工程と； ｄ）質量分析法による連結生成物を検出し、標的核酸配列を決定するために、得
られた値を既知の値と比較する工程。

【００８４】 この変形は、標的核酸が連結抽出物のセットおよび熱安定性ＤＮＡリガーゼと
ハイブリダイズされるリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）に基づくため、リガーゼ抽出
物は相互に共有結合し、連結生成物が生成する。次に連結生成物は質量分析法に
よって検出し、既知の値と比較することができる。反応が循環式に行われる場合
、得られた連結生成物は増幅され、少量の標的核酸の検出をさらに促進すること
ができる。連結点での野生種プライマーと突然変異プライマーの選択によって、
点突然変異が検出できる。連結抽出物および／または連結生成物の１つがＬＮＡ
修飾オリゴヌクレオチドであることが好ましい。

【００８５】 本発明の方法によって、質量分析法による核酸検出の精度および信頼性が向上
する。さらに、本方法によって、偽陰性または陽性結果を防ぐために厳密な制御
が可能となる。本発明の方法は、電気泳動工程：標識化およびその後の標識の検
出を回避する。実際に、核酸単離、増幅および質量分析を含む手順全体は、約２
〜３時間しか要しないと見積もられている。したがって本発明の本開示の方法は
、既存のＤＮＡ検出システムよりも迅速に、安価に実施される。さらに本開示の
方法によって、核酸断片が固有分子量（明確な物理基準）によって同時に同定・
検出できるため、開示方法はまた、現在利用できる手順よりもはるかに正確で信
頼性が高い。ＬＮＡ修飾オリゴヌクレオチドを使用するとさらに、質量分析法に
よって分析されるオリゴヌクレオチドの安定性も向上させることができる。

【００８６】 上記について考えると、ＬＮＡ修飾オリゴヌクレオチドは実質的に、対応する
未修飾オリゴヌクレオチドに比べて、核酸配列に対して同等以上の親和性を備え
ていることが好ましい。したがって、ＬＮＡ修飾オリゴヌクレオチド（オリゴマ
ー）は、ヌクレオシド類似体を何ら含まない、対応する未修飾対照オリゴヌクレ
オチドのＴ_ｍよりも１．５℃以上または２．５℃以上など、０．５度以上高い、
好ましくは３．５℃以上高い、特に好ましくは４．０℃以上高い、特別好ましく
は５．０℃以上高いＴ_ｍを、相補性ＤＮＡオリゴヌクレオチドによってオリゴマ
ーに付与する１つ以上のヌクレオシド類似体より成ることが好ましい。特にオリ
ゴマーのＴ_ｍは、ＬＮＡを含まない、対応する未修飾対照オリゴヌクレオチドの
Ｔ_ｍよりも２．５×Ｎ℃以上高く、好ましくは３．５×Ｎ℃以上高く、特に好ま
しくは４．０×Ｎ℃以上高く、特別好ましくは５．０×Ｎ℃以上高い。ここでＮ
はＬＮＡの数である。

【００８７】 相補性ＲＮＡオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションの場合、１つ以
上のヌクレオシド類似体が、ヌクレオシド類似体を何ら含まない、対応する未修
飾対照オリゴヌクレオチドのＴ_ｍよりも１．５℃以上、２．５℃以上または４℃
以上など、０．５度以上高い、好ましくは５．０℃以上高い、特に好ましくは６
．０℃以上高い、特別好ましくは７．０℃以上高いＴ_ｍを、相補性ＤＮＡオリゴ
ヌクレオチドによってオリゴマーに付与することも好ましい。特にオリゴマーの
Ｔ_ｍは、ＬＮＡヌクレオシド類似体を含まない、対応する未修飾対照オリゴヌク
レオチドのＴ_ｍよりも４．０×Ｎ℃以上高く、好ましくは５．０×Ｎ℃以上高く
、特に好ましくは６．０×Ｎ℃以上高く、特別好ましくは７．０×Ｎ℃以上高い
。ここでＮはヌクレオシド類似体の数である。

【００８８】 「対応する未修飾対照オリゴヌクレオチド」という語は、同一絶対オーダ（お
よび同一方向）で同一核塩基を表現する天然型ヌクレオチドのみより成る、オリ
ゴヌクレオチドを意味するものである。

【００８９】 上記を決定するために、Ｔ_ｍを以下のいずれかの条件下で： ａ）１０ｍＭ Ｎａ_２ＨＰＯ_４、ｐＨ７．０、１００ｍＭ ＮａＣｌ、０．１ｍ
Ｍ ＥＤＴＡ； ｂ）１０ｍＭ Ｎａ_２ＨＰＯ_４、ｐＨ７．０、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ；または ｃ）３Ｍ テトラメチル塩化アンモニウム（ＴＭＡＣ）、１０ｍＭ Ｎａ_２ＨＰ
Ｏ_４、ｐＨ７．０、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ

【００９０】 好ましくは条件ａ）により、等モル量（通常は１．０μＭ）のオリゴマーと相
補性ＤＮＡオリゴヌクレオチドで、測定する。

【００９１】 ＬＮＡ修飾オリゴヌクレオチドも実質的に、対応する未修飾オリゴヌクレオチ
ドと比べて、核酸配列に対して同等以上の特異性を備えている必要がある。した
がって、特異性と親和性に関して、オリゴマーを、前記オリゴマーと１つ以上の
ミスマッチがある部分相補性ＤＮＡオリゴヌクレオチドまたは部分相補性ＲＮＡ
オリゴヌクレオチドとハイブリダイズする場合、前記ミスマッチの結果として、
ヌクレオシド類似体を含まない、対応する未修飾対照オリゴヌクレオチドによっ
て見られる低下と同等以上である、Ｔｍの低下をオリゴマーが示す必要がある。
また、オリゴマーは、ハイブリダイゼーション緩衝液のイオン強度に対して、対
応する未修飾対照オリゴヌクレオチドと実質的に同等の感度のＴｍを持つ必要が
ある。

【００９２】 ＬＮＡ修飾オリゴマーとＬＮＡ 本発明の方法に特有の特徴は、核酸分子の標的核酸配列の質量分析検出に、ま
たは核酸分子の核酸配列中の突然変異の質量分析検出にＬＮＡ修飾オリゴヌクレ
オチドを使用することである。本開示全体として明らかとなるように、検出され
る核酸分子とＬＮＡ修飾オリゴヌクレオチドとの特異性と親和性を変化させるこ
とが可能であると、既知技術を改良する多くの可能性が与えられる。

【００９３】 したがって本発明は、一般式Ｉの少なくとも１つのヌクレオシド類似体（以下
「ＬＮＡ」と呼ぶ）より成るオリゴマー（ＬＮＡ修飾オリゴヌクレオチド）を利
用する方法に関する。

【００９４】

【化１】

【００９５】 ここでＸは、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｎ（Ｒ^Ｎ＊）−、−Ｃ（Ｒ^６Ｒ^６＊）−、−
Ｏ−Ｃ（Ｒ^７Ｒ^７＊）−、−Ｃ（Ｒ^６Ｒ^６＊）−Ｏ−、−Ｓ−Ｃ（Ｒ^７Ｒ^７＊）
−、−Ｃ（Ｒ^６Ｒ^６＊）−Ｓ−、−Ｎ（Ｒ^Ｎ＊）−Ｃ（Ｒ^７Ｒ^７＊）−、−Ｃ（
Ｒ^６Ｒ^６＊）−Ｎ（Ｒ^Ｎ＊）−および−Ｃ（Ｒ^６Ｒ^６＊）−Ｃ（Ｒ^７Ｒ^７＊）−
より選択され； Ｂは、水素、ヒドロキシ、随意に置換されたＣ_１−４−アルコキシ、随意に置
換されたＣ_１−４−アルキル、随意に置換されたＣ_１−４−アシルオキシ、核塩
基、ＤＮＡインタカレータ、光化学活性基、熱化学活性基、キレート基、レポー
タ基、およびリガンドから選択され； Ｐは、次のモノマーへのヌクレオシド間結合のラジカル位置または５’−末端
基を示し、このようなヌクレオシド結合または５’−末端基は随意に置換基Ｒ^５ を含み； 置換基Ｒ^２、Ｒ^２＊、Ｒ^３およびＲ^３＊のうちの１つは、次のモノマーへのヌ
クレオシド間結合または３’−末端基を示す基Ｐ^＊であり； 非ジェミナル置換基の１つまたは２つの対は、Ｒ^１＊、Ｒ^４＊、Ｒ^５、Ｒ^５＊ 、Ｒ^６、Ｒ^６＊、Ｒ^７、Ｒ^７＊、Ｒ^Ｎ＊の本置換基から選択され、Ｐ^＊を示さな
いＲ^２、Ｒ^２＊、Ｒ^３およびＲ^３＊の置換基はそれぞれ、−Ｃ（Ｒ^ａＲ^ｂ）−、
−Ｃ（Ｒ^ａ）＝Ｃ（Ｒ^ａ）−、−Ｃ（Ｒ^ａ）＝Ｎ−、−Ｏ−、−Ｓｉ（Ｒ^ａ）_２ −、−Ｓ−、−ＳＯ_２−、−Ｎ（Ｒ^ａ）−および＞Ｃ＝Ｚから選択される１〜８
の基／原子から成るビラジカルを示し、 ここでＺは、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｎ（Ｒ^ａ）−、それぞれ水素、随意に置換さ
れたＣ_１−１２−アルキル、随意に置換されたＣ_２−１２−アルケニル、随意に
置換されたＣ_２−１２−アルキニル、ヒドロキシ、Ｃ_１−１２−アルコキシ、Ｃ _２−１２ −アルケニロキシ−、カルボキシ、Ｃ_１−１２−アルコキシカルボニル
、Ｃ_１−１２−アルキルカルボニル、ホルミル、アリル、アリロキシ−カルボニ
ル、アリロキシ、アリルカルボニル、ヘテロアリル、ヘテロアリロキシ−カルボ
ニル、ヘテロアリロキシ、ヘテロアリルカルボニル、アミノ、モノ−およびジ（
Ｃ_１−６−アルキル）アミノ、カルバモイル、モノ−およびジ（Ｃ_１−６−アル
キル）アミノ−カルボニル、アミノ−Ｃ_１−６−アルキル−アミノカルボニル、
モノ−およびジ（Ｃ_１−６−アルキル）アミノ−Ｃ_１−６−アルキル−アミノカ
ルボニル、Ｃ_１−６−アルキル−カルボニルアミノ、カルバミド、Ｃ_１−６−ア
ルカノイロキシ、スルホノ、Ｃ_１−６−アルキルスルホニロキシ、ニトロ、アジ
ド、スルファニル、Ｃ_１−６−アルキルチオ、ハロゲン、ＤＮＡインタカレータ
、光化学活性基、熱化学活性基、キレート基、レポータ基およびリガンドより個
別に選択されるＲ^ａおよびＲ^ｂより選択され、アリルおよびヘテロアリルは随意
に置換され、２つのジェミナル置換基Ｒ^ａおよびＲ^ｂはともに随意に置換された
メチレン（＝ＣＨ_２）を示し、ここでＲ^ａ、Ｒ^ｂ、およびＲ^１＊、Ｒ^２、Ｒ^２＊ 、Ｒ^３、Ｒ^３＊、Ｒ^４＊、Ｒ^５、Ｒ^５＊、Ｒ^６、およびＰ、Ｐ^＊またはビラジカ
ルに存在し、包含されていないＲ^６＊、Ｒ^７およびＲ^７＊のいずれかの置換基か
ら選択される２つの非ジェミナルまたはジェミナル置換基はともに、以前定義し
たのと同種のビラジカルから選択される関連ビラジカルを形成し； そのため非ジェミナル置換基の前記対は、（ｉ）前記置換基が結合される原子
および（ｉｉ）任意の介入原子とともに単環または二環式エンティティを形成し
、 Ｒ^１＊、Ｒ^２、Ｒ^２＊、Ｒ^３、Ｒ^４＊、Ｒ^５、Ｒ^５＊、Ｒ^６、およびＰ、Ｐ^＊ またはビラジカルに存在し、包含されていないＲ^６＊、Ｒ^７ならびにＲ^７＊の置
換基はそれぞれ、水素、随意に置換されたＣ_１−１２アルキル、随意に置換され
たＣ_２−１２アルケニル、随意に置換されたＣ_２−１２アルキニル、ヒドロキシ
、Ｃ_１−１２−アルコキシ、Ｃ_２−１２−アルケニロキシ、カルボキシ、Ｃ_{１− １２} −アルコキシカルボニル、Ｃ_１−１２−アルキルカルボニル、ホルミル、ア
リル、アリロキシ−カルボニル、アリロキシ、アリルカルボニル、ヘテロアリル
、ヘテロアリロキシ−カルボニル、ヘテロアリロキシ、ヘテロアリルカルボニル
、アミノ、モノ−およびジ（Ｃ_１−６−アルキル）アミノ、カルバモイル、モノ
−およびジ（Ｃ_１−６アルキル）−アミノ−カルボニル、アミノ−Ｃ_１−６−ア
ルキル−アミノカルボニル、モノ−およびジ（Ｃ_１−６−アルキル）アミノ−Ｃ _１−６ −アルキル−アミノカルボニル、Ｃ_１−６−アルキル−カルボニルアミノ
、カルバミド、Ｃ_１−６−アルカノイロキシ、スルホノ、Ｃ_１−６−アルキルス
ルホニロキシ、ニトロ、アジド、スルファニル、Ｃ_１−６アルキルチオ、ハロゲ
ン、ＤＮＡインタカレータ、光化学活性基、熱化学活性基、キレート基、レポー
タ基およびリガンドから個別に選択され、アリルおよびヘテロアリルは随意に置
換され、２つのジェミナル置換基はともにオキソ、チオキソ、イミノまたは随意
に置換されたメチレンを示すか、あるいはともに、−Ｏ−、−Ｓ−および−（Ｎ
Ｒ^Ｎ）−より成る１つ以上のヘテロ原子／基によって随意に中断または停止され
る１〜５の炭素原子アルキレン鎖より成る、スピロビラジカルを形成し、Ｒ^Ｎは
水素およびＣ_１−４アルキルから選択され、２つの隣接（非ジェミナル）置換基
は二重結合を生じる追加結合を示し、Ｒ^Ｎ＊はビラジカルに存在し、包含されて
いない場合に水素およびＣ_１−１４−アルキルから選択される、 塩基性塩およびその酸添加塩、および安定な同位体によって強化された類似体
。

【００９６】 本発明はさらに、一般式ＩＩのヌクレオシド類似体（以下、ＬＮＡ）を利用す
る。

【００９７】

【化２】

【００９８】 ここで置換基Ｂは、核塩基、ＤＮＡインタカレータ、光化学活性、熱化学活性
基、キレート基、レポータ基およびリガンドから選択され； Ｘは、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｎ（Ｒ^Ｎ＊）−および−Ｃ（Ｒ^６Ｒ^６＊）−から選
択され； 置換基Ｒ^２、Ｒ^２＊、Ｒ^３およびＲ^３＊のうち１つは、基Ｑ^＊であり； ＱおよびＱ^＊はそれぞれ、水素、アジド、ハロゲン、シアノ、ニトロ、ヒドロ
キシ、Ｐｒｏｔ−Ｏ−、Ａｃｔ−Ｏ−、メルカプト、Ｐｒｏｔ−Ｓ−、Ａｃｔ−
Ｓ−、Ｃ_１−６アルキルチオ、アミノ、Ｐｒｏｔ−Ｎ（Ｒ^Ｈ）−、Ａｃｔ−Ｎ（
Ｒ^Ｈ）−、モノ−またはジ（Ｃ_１−６−アルキル）アミノ、随意に置換されたＣ _１−６ −アルコキシ、随意に置換されたＣ_１−６−アルキル、随意に置換された
Ｃ_２−６−アルケニル、随意に置換されたＣ_２−６−アルケニロキシ、随意に置
換されたＣ_２−６−アルキニル、随意に置換されたＣ_２−６−アルキニロキシ、
一リン酸塩、二リン酸塩、三リン酸塩、ＤＮＡインタカレータ、光化学活性基、
熱化学活性基、キレート基、レポータ基、リガンド、カルボキシ、スルホノ、ヒ
ドロキシメチル、Ｐｒｏｔ−Ｏ−ＣＨ_２−、Ａｃｔ−Ｏ−ＣＨ_２−、アミノメチ
ル、Ｐｒｏｔ−Ｎ（Ｒ^Ｈ）−ＣＨ_２−、Ａｃｔ−Ｎ（Ｒ^Ｈ）−ＣＨ_２−、カルボ
キシメチル、スルホノメチルより選択され、Ｐｒｏｔは−ＯＨ、−ＳＨおよび−
ＮＨ（Ｒ^Ｈ）それぞれの保護基であり、Ａｃｔは−ＯＨ、−ＳＨおよび−ＮＨ（
Ｒ^Ｈ）それぞれの活性基であり、Ｒ^Ｈは水素およびＣ_１−６アルキルより選択さ
れ； （ｉ）Ｒ^２＊およびＲ^４＊はともに、−Ｏ−、−（ＣＲ^＊Ｒ^＊）_{ｒ＋ｓ＋１}−、
−（ＣＲ^＊Ｒ^＊）_ｒ−Ｏ−（ＣＲ^＊Ｒ^＊）_ｓ−、−（ＣＲ^＊Ｒ^＊）_ｒ−Ｓ−（Ｃ
Ｒ^＊Ｒ^＊）_ｓ−、−（ＣＲ^＊Ｒ^＊）_ｒ−Ｎ（Ｒ^＊）−（ＣＲ^＊Ｒ^＊）_ｓ−、−Ｏ
−（ＣＲ^＊Ｒ^＊）_ｒ＋ｓ−Ｏ−、−Ｓ−（ＣＲ^＊Ｒ^＊）_ｒ＋ｓ−Ｏ−、−Ｏ−（
ＣＲ^＊Ｒ^＊）_ｒ＋ｓ−Ｓ−、−Ｎ（Ｒ^＊）−（ＣＲ^＊Ｒ^＊）_ｒ＋ｓ−Ｏ−、−Ｏ
−（ＣＲ^＊Ｒ^＊）_ｒ＋ｓ−Ｎ（Ｒ^＊）−、−Ｓ−（ＣＲ^＊Ｒ^＊）_ｒ＋ｓ−Ｓ−、
−Ｎ（Ｒ^＊）−（ＣＲ^＊Ｒ^＊）_ｒ＋ｓ−Ｎ（Ｒ^＊）−、−Ｎ（Ｒ^＊）−（ＣＲ^＊ Ｒ^＊）_ｒ＋ｓ−Ｓ−および−Ｓ−（ＣＲ^＊Ｒ^＊）_ｒ＋ｓ−Ｎ（Ｒ^＊）−から選択
されるビラジカルを示し、 （ｉｉ）Ｒ^２およびＲ^３はともに、−Ｏ−、−（ＣＲ^＊Ｒ^＊）_ｒ＋ｓ−、−（Ｃ
Ｒ^＊Ｒ^＊）_ｒ−Ｏ−（ＣＲ^＊Ｒ^＊）_ｓ−、−（ＣＲ^＊Ｒ^＊）_ｒ−Ｓ−（ＣＲ^＊Ｒ ^＊ ）_ｓ−および−（ＣＲ^＊Ｒ^＊）_ｒ−Ｎ（Ｒ^＊）−（ＣＲ^＊Ｒ^＊）_ｓ−から選択
されるビラジカルを示し、 （ｉｉｉ）Ｒ^２＊およびＲ^３はともに、−Ｏ−、−（ＣＲ^＊Ｒ^＊）_ｒ＋ｓ−、−
（ＣＲ^＊Ｒ^＊）_ｒ−Ｏ−（ＣＲ^＊Ｒ^＊）_ｓ−、−（ＣＲ^＊Ｒ^＊）_ｒ−Ｓ−（ＣＲ ^＊ Ｒ^＊）_ｓ−および−（ＣＲ^＊Ｒ^＊）_ｒ−Ｎ（Ｒ^＊）−（ＣＲ^＊Ｒ^＊）_ｓ−から
選択されるビラジカルを示し、 （ｉｖ）Ｒ^３およびＲ^４＊はともに、−（ＣＲ^＊Ｒ^＊）_ｒ−Ｏ−（ＣＲ^＊Ｒ^＊） _ｓ −、−（ＣＲ^＊Ｒ^＊）_ｒ−Ｓ−（ＣＲ^＊Ｒ^＊）_ｓ−および−（ＣＲ^＊Ｒ^＊）_ｒ −Ｎ（Ｒ^＊）−（ＣＲ^＊Ｒ^＊）_ｓ−から選択されるビラジカルを示し、 （ｖ）Ｒ^３およびＲ^５はともに、−（ＣＲ^＊Ｒ^＊）_ｒ−Ｏ−（ＣＲ^＊Ｒ^＊）_ｓ−
、−（ＣＲ^＊Ｒ^＊）_ｒ−Ｓ−（ＣＲ^＊Ｒ^＊）_ｓ−および−（ＣＲ^＊Ｒ^＊）_ｒ−Ｎ
（Ｒ^＊）−（ＣＲ^＊Ｒ^＊）_ｓ−から選択されるビラジカルを示し、 （ｖｉ）Ｒ^１＊およびＲ^４＊はともに、−（ＣＲ^＊Ｒ^＊）_ｒ−Ｏ−（ＣＲ^＊Ｒ^＊ ）_ｓ−、−（ＣＲ^＊Ｒ^＊）_ｒ−Ｓ−（ＣＲ^＊Ｒ^＊）_ｓ−および−（ＣＲ^＊Ｒ^＊） _ｒ −Ｎ（Ｒ^＊）−（ＣＲ^＊Ｒ^＊）_ｓ−から選択されるビラジカルを示し、 （ｖｉｉ）Ｒ^１＊およびＲ^２＊はともに、−（ＣＲ^＊Ｒ^＊）_ｒ−Ｏ−（ＣＲ^＊Ｒ ^＊ ）_ｓ−、−（ＣＲ^＊Ｒ^＊）_ｒ−Ｓ−（ＣＲ^＊Ｒ^＊）_ｓ−および−（ＣＲ^＊Ｒ^＊ ）_ｒ−Ｎ（Ｒ^＊）−（ＣＲ^＊Ｒ^＊）_ｓ−から選択されるビラジカルを示し； ここで各Ｒ^＊は、水素、ハロゲン、アジド、シアノ、ニトロ、ヒドロキシ、メル
カプト、アミノ、モノ−またはジ（Ｃ_１−６−アルキル）アミノ、随意に置換さ
れたＣ_１−６−アルコキシ、随意に置換されたＣ_１−６−アルキル、ＤＮＡイン
タカレータ、光化学活性基、熱化学活性基、キレート基、レポータ基およびリガ
ンドより選択され、および／または２つの隣接（非ジェミニナル）Ｒ^＊はともに
二重結合を示し、ｒおよびｓはそれぞれ、合計ｒ＋ｓが１〜４であるならば、０
〜３であり； 置換基Ｒ^１＊、Ｒ^２、Ｒ^２＊、Ｒ^３、Ｒ^４＊、Ｒ^５およびＲ^５＊はそれぞれ、
Ｑ、Ｑ^＊またはビラジカルに包含されておらず、水素、随意に置換されたＣ_{１− １２} −アルキル、随意に置換されたＣ_２−１２−アルケニル、随意に置換された
Ｃ_２−１２アルキニル、ヒドロキシ、Ｃ_１−１２−アルコキシ、Ｃ_２−１２−ア
ルケニロキシ、カルボキシ、Ｃ_１−１２−アルコキシカルボニル、Ｃ_１−１２−
アルキルカルボニル、ホルミル、アリル、アリロキシ−カルボニル、アリロキシ
、アリルカルボニル、ヘテロアリル、ヘテロアリロキシ−カルボニル、ヘテロア
リロキシ−、ヘテロアリルカルボニル、アミノ、モノ−およびジ（Ｃ_１−６−ア
ルキル）アミノ、カルバモイル、モノ−およびジ（Ｃ_１−６−アルキル）−アミ
ノ−カルボニル、アミノ−Ｃ_１−６−アルキル−アミノカルボニル、モノ−およ
びジ（Ｃ_１−６−アルキル）−アミノ−Ｃ_１−６−アルキル−アミノカルボニル
、Ｃ_１−６−アルキル−カルボニルアミノ、カルバミド、Ｃ_１−６−アルカノイ
ロキシ、スルホノ、Ｃ_１−６−アルキルスルホニロキシ、ニトロ、アジド、スル
ファニル、Ｃ_１−６−アルキルチオ、ハロゲン、ＤＮＡインタカレータ、光化学
活性基、熱化学活性基、キレート基、レポータ基およびリガンドより個別に選択
され、アリルおよびヘテロアリルは随意に置換され、２つのジェミナル置換基は
ともにオキソ、チオキソ、イミノまたは随意に置換されたメチレンを示すか、あ
るいはともに、−Ｏ−、−Ｓ−および−（ＮＲ^Ｎ）−より成る１つ以上のヘテロ
原子／基によって随意に中断または停止される１〜５の炭素原子アルキレン鎖よ
り成る、スピロビラジカルを形成し、Ｒ^Ｎは水素およびＣ_１−４アルキルから選
択され、２つの隣接（非ジェミナル）置換基は二重結合を生じる追加結合を示し
、Ｒ^Ｎ＊はビラジカルに存在し、包含されていない場合に水素およびＣ_１−４−
アルキルから選択される； 塩基性塩およびその酸添加塩、および安定な同位体によって強化された類似体
。

【００９９】 本明細書で使用する場合、「ＬＮＡ」（ロックヌクレオシド類似体Ｌｏｃｋｅ
ｄ Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ）は、本明細書で定義されるよ
うに、オリゴマー（ＬＮＡ修飾オリゴヌクレオシド）（一般式Ｉ）または別個の
化学種（一般式ＩＩ）のどちらかに含まれる二環式および三環式ヌクレオシド類
似体を指す。「モノマーＬＮＡ」という語は特異的に後者の場合を指す。

【０１００】 上述したように、オリゴマー（ＬＮＡ修飾オリゴヌクレオチド）は、１つ以上
の二環式、三環式、または多環式ヌクレオシド類似体（以下「ＬＮＡ」と呼ぶ）
より成る。既知のヌクレオシドの代わりに、または既知のヌクレオシドに加えて
、このようなＬＮＡを包含することによって、オリゴヌクレオチドは興味深い、
高度に有用な特性を付与される。このようなＬＮＡを含む二環式ＬＮＡおよびオ
リゴヌクレオチドは、本発明の範囲内で特に興味深く思われる。

【０１０１】 オリゴマー（オリゴヌクレオチド）に含まれる考えられるＬＮＡはそれぞれ、
以下の一般式Ｉを持つ。

【０１０２】

【化３】

【０１０３】 ここでＸは、−Ｏ−（フラノースモチーフ）、−Ｓ−、−Ｎ（Ｒ^Ｎ＊）−、−
Ｃ（Ｒ^６Ｒ^６＊）−、−Ｏ−Ｃ（Ｒ^７Ｒ^７＊）−、−Ｃ（Ｒ^６Ｒ^６＊）−Ｏ−、
−Ｓ−Ｃ（Ｒ^７Ｒ^７＊）−、−Ｃ（Ｒ^６Ｒ^６＊）−Ｓ−、−Ｎ（Ｒ^Ｎ＊）−Ｃ（
Ｒ^７Ｒ^７＊）−、−Ｃ（Ｒ^６Ｒ^６＊）−Ｎ（Ｒ^Ｎ＊）−および−Ｃ（Ｒ^６Ｒ^６＊ ）−Ｃ（Ｒ^７Ｒ^７＊）−から選択され、Ｒ^６、Ｒ^６＊、Ｒ^７、Ｒ^７＊およびＲ^{Ｎ ＊} は以下でさらに定義するとおりである。したがって、オリゴマーに含まれるＬ
ＮＡは、二環式、三環式または多環式構造の重要部分として、五または六員環の
どちらかを含む。五員環（Ｘ＝−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｎ（Ｒ^Ｎ＊）−、−Ｃ（Ｒ^６ Ｒ^６＊）−）は、天然型ヌクレオシドの未変性フラノース環と実質的に同一の（
しかし、１つ以上のビラジカルの導入によってロックされた（以下を参照））配
座を占めることができるという点で、特に興味深い。考えられる五員環のうち、
Ｘが−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｎ（Ｒ^Ｎ＊）−を示す状況は特別興味深く、Ｘが−Ｏ−
である状況は特に興味深く見える。

【０１０４】 置換基Ｂは、オリゴマーがＤＮＡまたはＲＮＡと錯化している場合に、（たと
えば水素結合、共有結合または電子的相互作用によって）ＤＮＡまたはＲＮＡ、
特にＤＮＡまたはＲＮＡの核塩基と相互作用可能な基を示す。あるいは、置換基
Ｂは標識またはレポータとしてとして作用する基を示すか、置換基Ｂは、ＤＮＡ
またはＲＮＡとほとんどまたは全く相互作用がないと考えられる基（たとえば水
素）を示す。したがって、置換基Ｂは、水素、ヒドロキシ、随意に置換されたＣ _１−４ −アルコキシ、随意に置換されたＣ_１−４−アルキル、随意に置換された
Ｃ_１−４アシロキシ、核塩基、ＤＮＡインタカレータ、光化学活性基、熱化学活
性基、キレート基、レポータ基およびリガンドから選択されることが好ましい。

【０１０５】 ここでは、「核塩基」という用語は、非天然型核塩基と同様に、天然型核塩基
を対象としている。当業熟練者には、以前「非天然型」と見なされていた各種核
塩基がその後、自然界で発見されたことは明白である。したがって「核塩基」は
既知のプリンおよびピリミジンヘテロ環だけでなく、ヘテロ環類似体およびその
互変異性体も含む。各塩基の実例は、アデニン、グアニン、チミン、シトシン、
ウラシル、プリン、キサンチン、ジアミノプリン、８−オキソ−Ｎ^６−メチルア
デニン、７−デアザキサンチン、７−デアザグアニン、Ｎ^４，Ｎ^４−エタノシト
シン、Ｎ^６，Ｎ^６−エタノ−２，６−ジアミノプリン、５−メチルシトシン、５
−（Ｃ^３−Ｃ^６）−アルキニルシトシン、５−フルオロウラシル、５−ブロモウ
ラシル、偽イソシトシン、２−ヒドロキシ−５−メチル−４−トリアゾロピリジ
ン、イソシトシン、イソグアニン、イノシンおよび、Ｂｅｎｎｅｒ ｅｔ ａｌ
．， 米国特許第５，４３２，２７２号に記載されている「非天然型」核塩基で
ある。「核塩基」という語は、これらの例すべてはもちろんのこと、その類似体
および互変異性体を対象とする。特別に興味深い核塩基は、ヒトの治療および診
断応用に関連して天然型核塩基と見なされる、アデニン、グアニン、チミン、シ
トシンおよびウラシルである。

【０１０６】 ここで使用するように、「ＤＮＡインタカレータ」という語は、ＤＮＡまたは
ＲＮＡらせん、二重鎖または三重鎖にインタカレート（挿入）できるグループを
意味する。ＤＮＡインタカレータの機能部の例としては、アクリジン、アントラ
セン、アントラキノンなどのキノン、インドール、キノリン、イソキノリン、ジ
ヒドロキノン、アントラサイクリン、テトラサイクリン、メチレンブルー、アン
トラサイクリノン、ソラレン、クマリン、ハロゲン化エチジウム、ダインマイシ
ン、１，１０−フェナントロリン銅、ｔｒｉｓ（４，７−ジフェニル−１，１０
−フェナントロリン）ルテニウム−コバルトなどの金属錯体、ｃａｌｃｈｅａｍ
ｉｃｉｎ、ポルフィリン、ジスタマイシン、ネトロプシン、ビオロゲン、ダウノ
マイシンなどのｅｎｅｄｉｙｎｅが挙げられる。特に興味深い例は、アクリジン
、アントラキノンなどのキノン、メチレンブルー、ソラレン、クマリンおよびハ
ロゲン化エチジウムである。

【０１０７】 ここでは、「光化学活性基」は、光照射時の化学反応を受けることのできる化
合物を含む。この官能基の実例はキノン、特に６−メチル−１，４−ナフトキノ
ン、アントラキノン、ナフトキノン、１，４−ジメチル−アントラキノン、ジア
ジリン、芳香性アジド、ベンゾフェノン、ソラレン、ジアゾ化合物、ジアジリノ
化合物である。

【０１０８】 ここでは「熱化学反応基」は、他の基との熱化学誘起共有結合形成を受けるこ
とのできる官能基として定義される。熱化学反応基の機能部の実例は、カルボン
酸、活性化エステルなどのカルボン酸エステル、酸フッ化物、酸塩化物、酸臭化
物、酸ヨウ化物などの酸ハロゲン化物、カルボン酸アジド、カルボン酸ヒドラジ
ド、スルホン酸、スルホン酸エステル、スルホン酸ハロゲン化物、セミカルバジ
ド、チオセミカルバジド、アルデヒド、ケトン、１級アルコール、２級アルコー
ル、３級アルコール、フェノール、ハロゲン化アルキル、チオール、ジスルフィ
ド、１級アミン、２級アミン、３級アミン、ヒドラジン、エポキシド、マレイミ
ド、ボロン酸誘導体である。

【０１０９】 ここでは、「キレート基」という語は、２個以上の結合部位を含み、頻繁に他
の分子、原子またはイオンに２個以上の結合部位で同時に結合する分子を意味す
る。キレート基の機能部の例は、イミノ二酢酸、ニトリロ三酢酸、エチレンジア
ミン三酢酸（ＥＤＴＡ）、アミノリン酸などである。

【０１１０】 ここでは、「レポータ基」という語は、それ自体によって、または検出シリー
ズの一部として検出可能である基を意味する。レポータ基の機能部の例は、ビオ
チン、ジゴキシゲニン、蛍光基（たとえばある波長の光またはＸ線など電磁放射
を吸収可能で、次にさらに長波長の放射として吸収したエネルギーを再放出する
基である；実例はダンシル（５−ジメチルアミノ）−１−ナフタレンスルホニル
）、ＤＯＸＹＬ（Ｎ−オキシル−４，４−ジメチロキサゾキジン）、ＰＲＯＸＹ
Ｌ（Ｎ−オキシル−２，２，５，５−テトラメチルピロリジン）、ＴＥＭＰＯ（
Ｎ−オキシル−２，２，６，６−テトラメチルピペリジン）、ジニトロフェニル
、アクリジン、クマリン、Ｃｙ３およびＣｙ５（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｄｅｔ
ｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｉｎｃ．の商標）、エリトロシン、クマリン
酸、ウンベリフェロン、テキサスレッド、ローダミン、テトラメチルローダミン
、Ｒｏｘ、７−ニロトベンゾ−２−オキサ−１−ジアゾール（ＮＢＤ）、ピレン
、フルオレセイン、ユーロピウム、ルテニウム、サマリウム、および他の他の稀
土金属）、放射等方性標識、化学発光標識（化学反応による光の放出によって検
出できる標識）、スピン標識（電子スピン共鳴分光法を使用して検出可能な生体
分子に結合された、フリーラジカル（たとえば置換有機窒素酸化物）または他の
常磁性プローブ（たとえばＣｕ^２＋、Ｍｇ^２＋））、酵素（ペルオキシダーゼ、
アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ）、
抗原、抗体、ハプテン（ペプチド、ステロイドホルモンなどの、抗体と結合可能
であるが、それ自体では免疫反応を開始できない基）、細胞膜浸透のための担体
システム：脂肪酸残基、ステロイド部分（コレステリル）、ビタミンＡ、ビタミ
ンＤ、ビタミンＥ、特異性レセプタの葉酸ペプチド、仲介エンドシトーゼ（ｅｎ
ｄｏｃｙｔｏｓｅ）の基、上皮成長因子（ＥＧＦ）、ブラジキニン、血小板由来
成長因子（ＰＤＧＦ）などである。特に興味深い例はビオチン、フルオレセン、
テキサスレッド、ローダミン、ジニトロフェニル、ジゴキシゲニン、ルテニウム
、ユーロピウム、Ｃｙ５、Ｃｙ３などである。

【０１１１】 ここでは、「リガンド」は結合するものを意味する。リガンドは、芳香基（ベ
ンゼン、ピリジン、ナフタレン、アントラセンおよびフェナントレンなど）、ヘ
テロ芳香基（チオフェン、フラン、テトラヒドロフラン、ピリジン、ジオキサン
およびピリミジンなど）、カルボン酸、カルボン酸エステル、ハロゲン化カルボ
ン酸、カルボン酸アジド、カルボン酸ヒドラジド、スルホン酸、スルホン酸エス
テル、ハロゲン化スルホン酸、セミカルバジド、チオセミカルバジド、アルデヒ
ド、ケトン、１級アルコール、２級アルコール、３級アルコール、フェノール、
ハロゲン化アルキル、チオール、ジスルフィド、１級アミン、二級アミン、３級
アミン、ヒドラジン、エポキシド、マレイミド、たとえば酸素原子、窒素原子お
よび／または硫黄原子などの１つ以上のヘテロ原子によって随意に中断または停
止されたＣ_１−Ｃ_２０アルキル基、随意に芳香またはモノ／ポリ不飽和炭化水素
、ポリエチレングリコールなどのポリオキシエチレン、ポリ−β−アラニン、ポ
リグリシン、ペプチドなどのオリゴ／ポリアミド、オリゴ／ポリサッカライド、
オリゴ／ポリリン酸、毒素、抗生物質、細胞毒、ステロイドを含むＣ_１−Ｃ_２０ アルキル基などの官能基と、および「親和性リガンド」すなわち、特定のタンパ
ク質、抗体、ポリおよびオリゴサッカライドおよび他の生体分子に特異的親和性
を持つ官能基または生体分子も含むことができる。

【０１１２】 当業者にとっては、ＤＮＡインカレータ、光化学活性基、熱化学活性基、キレ
ート基、レポータ基、リガンドに基づく、上述した具体例が問題の基の「活性／
官能」部に対応することは明らかである。当業熟練者にとっては、ＤＮＡインカ
レータ、光化学活性基、熱化学活性基、キレート基、レポータ基、リガンドが一
般にＭ−Ｋ−の形で表されることはさらに明らかである。ここでＭは問題の基の
「活性／官能」部であり、Ｋは「活性／官能」部が五員環または六員環に結合す
るためのスペーサである。したがって、基Ｂは、ＤＮＡインカレータ、光化学活
性基、熱化学活性基、キレート基、レポータ基、リガンドから選択される場合、
Ｍ−Ｋ−という形になることを理解されたい。ここでＭは、ＤＮＡインカレータ
、光化学活性基、熱化学活性基、キレート基、レポータ基、リガンドそれぞれの
「活性／官能」部であり、Ｋは、五員環または六員環と「活性／官能」部にある
、１〜５０個の原子、好ましくは１〜３０個の原子、特に好ましくは１〜１５個
の原子より成る随意のスペーサである。

【０１１３】 ここでは、「スペーサ」という語は熱化学的および光化学的に不活性の距離作
成基であり、上で定義した種類の２個以上の異なる部分を結合するのに用いる。
スペーサは、疎水性、親水性、分子の柔軟性および長さを含む各種の特性に基づ
いて選択される（たとえばＨｅｒｍａｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， 「固定化親和
性リガンド技術（Ｉｍｍｏｂｉｌｉｓｅｄ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｌｉｇａｎｄ
Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）」， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉ
ｅｇｏ， Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ（１９９２）， ｐ．１３７−ｆｆを参照）。
一般にスペーサの長さは約４００Å以下であり、一部の応用では１００Å未満で
あることが好ましい。したがってスペーサは、酸素原子、窒素原子および／また
は硫黄原子などの、１個以上のヘテロ原子によって随意に中断または停止された
炭素原子鎖より成る。したがって、スペーサＫは１個以上のアミド、エステル、
アミノ、エーテルおよび／またはチオール官能基と、随意に芳香またはモノ／ポ
リ不飽和炭化水素、ポリエチレングリコールなどのポリオキシエチレン、一般に
ポリ−β−アラニン、ポリグリシン、ポリリジン、ペプチドなどのオリゴ／ポリ
アミド、オリゴサッカライド、オリゴ／ポリリン酸を含むことがある。スペーサ
はさらに、その組み合わせ単位より構成されることがある。スペーサの長さは、
五員環または六員環に関連して、問題の基の「活性／機能」部の望ましいまたは
必要な位置調整および空間方向を考慮して、変化することがある。特に興味深い
実施態様において、スペーサは化学的に開裂可能な基を含む。そのような化学開
裂可能な基の例としては、還元条件下で開裂可能なペプチダーゼによって開裂可
能なペプチド断片などがある。

【０１１４】 本発明のある実施態様において、Ｋは、問題の基の「活性／官能」部が五員環
または六員環に直接結合できるように、単結合を示す。

【０１１５】 基Ｂ内の変形によって、同一ヌクレオチドで構成されるが、配列が異なるオリ
ゴマー間に質量区別の導入が可能になることも理解されたい。本明細書で述べる
ように、これにより、質量に依存して正確な配列を明らかにする検出分子の配列
の構築が可能となる。

【０１１６】 しかし、好ましい実施態様において、一般式ＩおよびＩＩの置換基Ｂは核塩基
、特にアデニン、グアニン、チミン、シトシンおよびウラシルから選択すること
が好ましい。

【０１１７】 オリゴマー（式Ｉ）において、Ｐは次のモノマーまたは５’−末端基へのヌク
レオシド間結合のラジカル位置を示す。最初の可能性は、問題のＬＮＡが５’−
末端「モノマー」でない場合に適用されるが、後者は、問題のＬＮＡが５’−末
端「モノマー」である場合に適用される。（さらに下のヌクレオシド間結合また
は５’−末端基の定義からも明らかとなるが）このようなヌクレオシド間結合ま
たは５’−末端基は置換基Ｒ^５（または等しく適用できる：置換基Ｒ^５＊）を含
むことがあり、これによって基Ｐとの二重結合を形成する（５’−末端はヌクレ
オシド内のリボース部分の５’炭素原子に該当する位置を指す）ことを理解され
たい。

【０１１８】 これに対して、前のモノマーまたは３’−末端基（Ｐ^＊）へのヌクレオシド間
結合は、置換基Ｒ^２、Ｒ^２＊、Ｒ^３、Ｒ^３＊のうちの１個によって定義される位
置、好ましくは置換基Ｒ^３およびＲ^３＊の１個によって定義される位置から生じ
る。同じように、最初の可能性は、問題のＬＮＡが３’−末端「モノマー」でな
い場合に適用されるが、後者は、問題のＬＮＡが３’−末端「モノマー」である
場合に適用される（３’−末端は、ヌクレオシド内のリボース部分の３’炭素原
子に該当する位置を指す）。

【０１１９】 ここでは、「モノマー」という語は、ＬＮＡと同様に、天然型ヌクレオシド、
非天然型ヌクレオシド、ＰＮＡモノマーなどに関連する。したがって、「次のモ
ノマー」という語は５’−末端方向に隣接するモノマーに関連し、「前のモノマ
ー」という語は３’−末端方向に隣接するモノマーに関連する。このような前後
のモノマーは、ＬＮＡモノマーの位置から見ると、天然型ヌクレオシドまたは非
天然型ヌクレオシド、あるいはＬＮＡモノマーでもよい。

【０１２０】 結果として、ここでは（上の定義より導けるように）、「オリゴマー」という
語は、１個以上のＬＮＡを含むことによって修飾されるオリゴヌクレオチドを意
味する。

【０１２１】 本発明の重要部分は、一般式Ｉで示される五員環または六員環に融着された１
個以上の環の存在である。それゆえ、Ｒ^１＊、Ｒ^４＊、Ｒ^５、Ｒ^５＊、Ｒ^６、Ｒ ^６＊ 、Ｒ^７、Ｒ^７＊、Ｒ^Ｎ＊の本置換基から選択される非ジェミナル置換基とＰ ^＊ を示さないＲ^２、Ｒ^２＊、Ｒ^３およびＲ^３＊の置換基の１〜２個の対はそれぞ
れ、−Ｃ（Ｒ^ａＲ^ｂ）−、−Ｃ（Ｒ^ａ）＝Ｃ（Ｒ^ａ）−、−Ｃ（Ｒ^ａ）＝Ｎ−、
−Ｏ−、−Ｓｉ（Ｒ^ａ）_２−、−Ｓ−、ＳＯ_２−、−Ｎ（Ｒ^ａ）−および＞Ｃ＝
Ｚから個別に選択される１〜８個の、好ましくは１〜４個の基／原子より成るビ
ラジカルを示す（「本」という語は、一部の置換基、すなわちＲ^６、Ｒ^６＊、Ｒ ^７ 、Ｒ^７＊、Ｒ^Ｎ＊の存在が、Ｘがこのような置換基を含むかどうかによって変
わることを示す）。

【０１２２】 ビラジカルを構成する基において、Ｚは−Ｏ−、−Ｓ−および−Ｎ（Ｒ^ａ）−
から選択され、Ｒ^ａおよびＲ^ｂはそれぞれ、水素、随意に置換されたＣ_１−１２ −アルキル、随意に置換されたＣ_２−１２−アルケニル、随意に置換されたＣ_{２ −１２} −アルキニル、ヒドロキシ、Ｃ_１−１２−アルコキシ、Ｃ_２−１２−アル
ケニロキシ、カルボキシ、Ｃ_１−１２−アルコキシカルボニル、Ｃ_１−１２−ア
ルキルカルボニル、ホルミル、アリル、アリロキシ−カルボニル、アリロキシ、
アリルカルボニル、ヘテロアリル、ヘテロアリロキシ−カルボニル、ヘテロアリ
ロキシ、ヘテロアリルカルボニル、アミノ、モノ−およびジ（Ｃ_１−６−アルキ
ル）アミノ、カルバモイル、モノ−およびジ（Ｃ_１−６−アルキル）−アミノ−
カルボニル、アミノ−Ｃ_１−６−アルキル−アミノカルボニル、モノ−およびジ
（Ｃ_１−６−アルキル）アミノ−Ｃ_１−６−アルキル−アミノカルボニル、Ｃ_{１ −６} −アルキル−カルボニルアミノ、カルバミド、Ｃ_１−６−アルカノイロキシ
、スルホノ、Ｃ_１−６−アルキルスルホニロキシ、ニトロ、アジド、スルファニ
ル、Ｃ_１−６−アルキルチオ、ハロゲン、ＤＮＡインタカレータ、光化学活性基
、熱化学活性基、キレート基、レポータ基、およびリガンド（後者の基が置換基
Ｂについて定義されたように、スペーサを含む場合）から個別に選択され、アリ
ルおよびヘテロアリルは随意に置換される。さらに２個のジェミナル置換基Ｒ^ａ およびＲ^ｂはともに、随意に置換されたメチレン（＝アリルに対して置換基とし
て定義された置換基によって、１〜２回随意に置換されたＣＨ_２）を示し、Ｒ^ａ 、Ｒ^ｂ、およびＰ、Ｐ^＊またはビラジカルに存在するが含まれていない置換基Ｒ ^１＊ 、Ｒ^２、Ｒ^２＊、Ｒ^３、Ｒ^３＊、Ｒ^４＊、Ｒ^５、Ｒ^５＊、Ｒ^６、Ｒ^６＊、Ｒ ^７ およびＲ^７＊より選択される、２個の非ジェミナルまたはジェミナル置換基は
、以前定義したのと同種のビラジカルから選択される関連ビラジカルをともに形
成する。非ジェミナル置換基の各対はそれによって、（ｉ）非ジェミナル置換基
が結合する原子および（ｉｉ）任意の介入原子とともに、一環式または二環式エ
ンティティを形成することが明らかになる。

【０１２３】 五員環または六員環の環原子に結合するビラジカルは、置換基Ｒ^５およびＲ^{５ ＊} の包含によってヌクレオシド間結合との好ましくない立体相互作用が生じると
いう点で好ましいと考えらている。したがって、１〜２個のビラジカルを構成す
る、非ジェミナル置換基の１〜２個の対がそれぞれ、Ｒ^１＊、Ｒ^４＊、Ｒ^６、Ｒ ^６＊ 、Ｒ^７、Ｒ^７＊、Ｒ^Ｎ＊の本置換基と、Ｐ^＊を示さないＲ^２、Ｒ^２＊、Ｒ^３ およびＲ^３＊の置換基から選択されることが好ましい。

【０１２４】 オリゴマーに含まれるＬＮＡが、（２個の）非ジェミナル置換基の対から構成
されたビラジカルを１個だけ含むことが好ましい。特に、Ｒ^３＊がＰ^＊を示し、
ビラジカルがＲ^２＊およびＲ^４＊、またはＲ^２およびＲ^３で形成されることが好
ましい。

【０１２５】 ここでは、すなわち本説明および請求項において、ビラジカルの方向は左側が
小さい番号の置換基を表し、右側が大きい番号の置換基を示すようになっている
ため、Ｒ^３およびＲ^５がともにビラジカル“−Ｏ−ＣＨ_２−”を示す場合、酸素
原子がＲ^３を示すため、酸素原子はたとえばＲ^３の位置に結合し、メチレン基は
Ｒ^５を表すことを理解されたい。

【０１２６】 オリゴマーに含まれるＬＮＡ中のビラジカルの構造について、多数の興味深い
可能性を考慮すると、非ジェミナル置換基の対によって構成されたビラジカルは
、−（ＣＲ^＊Ｒ^＊）_ｒ−Ｙ−（ＣＲ^＊Ｒ^＊）_ｓ−、−（ＣＲ^＊Ｒ^＊）_ｒ−Ｙ−（
ＣＲ^＊Ｒ^＊）_ｓ−Ｙ−、−Ｙ−（ＣＲ^＊Ｒ^＊）_ｒ＋ｓ−Ｙ−、−Ｙ−（ＣＲ^＊Ｒ ^＊ ）_ｒ−Ｙ−（ＣＲ^＊Ｒ^＊）_ｓ−、−（ＣＲ^＊Ｒ^＊）_ｒ＋ｓ−、−Ｙ−、−Ｙ−
Ｙ−より選択されて、ここでＹはそれぞれ、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｓｉ（Ｒ^＊）_２ −、−Ｎ（Ｒ^＊）−、＞Ｃ＝Ｏ、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｎ（Ｒ^＊）−および−Ｎ（Ｒ^＊ ）−Ｃ（＝Ｏ）−より個別に選択され、Ｒ^＊はそれぞれ水素、ハロゲン、アジド
、シアノ、ニトロ、ヒドロキシ、メルカプト、アミノ、モノまたはジ（Ｃ_１−６ −アルキル）アミノ、随意に置換されたＣ_１−６−アルコキシ、随意に置換され
たＣ_１−６−アルキル、ＤＮＡインタカレータ、光化学活性基、熱化学活性基、
キレート基、レポータ基、リガンドより選択され、および／または２個の隣接（
非ジェミナル）Ｒ^＊はともに二重結合を示す；ｒおよびｓはそれぞれ、合計ｒ＋
ｓが１〜５であるという条件で、０〜４である。特に興味深い状況は、各ビラジ
カルが−Ｙ−、−（ＣＲ^＊Ｒ^＊）_ｒ＋ｓ−、−（ＣＲ^＊Ｒ^＊）_ｒ−Ｙ−（ＣＲ^＊ Ｒ^＊）_ｓ−および−Ｙ−（ＣＲ^＊Ｒ^＊）_ｒ＋ｓ−Ｙ−から個別に選択され、ｒお
よびｓはそれぞれ、合計ｒ＋ｓが１〜４であるという条件で、０〜３であるとい
う状況である。

【０１２７】 ＬＮＡ内のビラジカルの位置決定を考慮すると、以下の状況が特に興味深いと
思われる。すなわち；Ｒ^２＊およびＲ^４＊はともに、−Ｙ−、−（ＣＲ^＊Ｒ^＊） _{ｒ＋ｓ＋１} −、−（ＣＲ^＊Ｒ^＊）_ｒ−Ｙ−（ＣＲ^＊Ｒ^＊）_ｓ−および−Ｙ−（Ｃ
Ｒ^＊Ｒ^＊）_ｒ＋ｓ−Ｙ−から選択されるビラジカルを示し；Ｒ^２およびＲ^３はと
もに、−Ｙ−、−（ＣＲ^＊Ｒ^＊）_ｒ＋ｓ−、−（ＣＲ^＊Ｒ^＊）_ｒ−Ｙ−（ＣＲ^＊ Ｒ^＊）_ｓ−および−Ｙ−（ＣＲ^＊Ｒ^＊）_ｒ＋ｓ−Ｙ−から選択されるビラジカル
を示し；Ｒ^２＊およびＲ^３はともに、−Ｙ−、−（ＣＲ^＊Ｒ^＊）_ｒ＋ｓ−、−（
ＣＲ^＊Ｒ^＊）_ｒ−Ｙ−（ＣＲ^＊Ｒ^＊）_ｓ−および−Ｙ−（ＣＲ^＊Ｒ^＊）_ｒ＋ｓ−
Ｙ−から選択されるビラジカルを示し；Ｒ^３およびＲ^４はともに−Ｙ−、−（Ｃ
Ｒ^＊Ｒ^＊）_ｒ＋ｓ−、−（ＣＲ^＊Ｒ^＊）_ｒ−Ｙ−（ＣＲ^＊Ｒ^＊）_ｓ−および−Ｙ
−（ＣＲ^＊Ｒ^＊）_ｒ＋ｓ−Ｙ−から選択されるビラジカルを示し；Ｒ^３およびＲ ^５ はともに、−Ｙ’−、−（ＣＲ^＊Ｒ^＊）_{ｒ＋ｓ＋１}−、−（ＣＲ^＊Ｒ^＊）_ｒ−
Ｙ−（ＣＲ^＊Ｒ^＊）_ｓ−および−Ｙ−（ＣＲ^＊Ｒ^＊）_ｒ＋ｓ−Ｙ−から選択され
るビラジカルを示し；Ｒ^１＊およびＲ^４＊はともに、−Ｙ’−、−（ＣＲ^＊Ｒ^＊ ）_{ｒ＋ｓ＋１}−、−（ＣＲ^＊Ｒ^＊）_ｒ−Ｙ−（ＣＲ^＊Ｒ^＊）_ｓ−および−Ｙ−（
ＣＲ^＊Ｒ^＊）_ｒ＋ｓ−ＮＲ^＊−から選択されるビラジカルを示し；またはＲ^１＊ およびＲ^２＊はともに、−Ｙ−、−（ＣＲ^＊Ｒ^＊）_ｒ＋ｓ−、−（ＣＲ^＊Ｒ^＊） _ｒ −Ｙ−（ＣＲ^＊Ｒ^＊）_ｓ−および−Ｙ−（ＣＲ^＊Ｒ^＊）_ｒ＋ｓ−Ｙ−から選択
されるビラジカルを示し；ｒおよびｓはそれぞれ、合計ｒ＋ｓが１〜４であると
いう条件で、０〜３であり、Ｙは上で定義したとおりであり、Ｙ’は−ＮＲ^＊−
Ｃ（＝Ｏ）−および−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＲ^＊−より選択される。この例において、
Ｒ^３＊はＰ^＊であることが好ましい。

【０１２８】 特に興味深いオリゴマーは、以下の条件の１個がオリゴマー内の１個以上のＬ
ＮＡに適用されるオリゴマーである：Ｒ^２＊およびＲ^４＊がともに、−Ｏ−、−
Ｓ−、−Ｎ（Ｒ^＊）−、−（ＣＲ^＊Ｒ^＊）_{ｒ＋ｓ＋１}−、−（ＣＲ^＊Ｒ^＊）_ｒ−
Ｏ−（ＣＲ^＊Ｒ^＊）_ｓ−、−（ＣＲ^＊Ｒ^＊）_ｒ−Ｓ−（ＣＲ^＊Ｒ^＊）_ｓ−、−（
ＣＲ^＊Ｒ^＊）_ｒ−Ｎ（Ｒ^＊）−（ＣＲ^＊Ｒ^＊）_ｓ−、−Ｏ−（ＣＲ^＊Ｒ^＊）_{ｒ＋ ｓ} −Ｏ−、−Ｓ−（ＣＲ^＊Ｒ^＊）_ｒ＋ｓ−Ｏ−、−Ｏ−（ＣＲ^＊Ｒ^＊）_ｒ＋ｓ−
Ｓ−、−Ｎ（Ｒ^＊）−（ＣＲ^＊Ｒ^＊）_ｒ＋ｓ−Ｏ−、−Ｏ−（ＣＲ^＊Ｒ^＊）_{ｒ＋ ｓ} −Ｎ（Ｒ^＊）−、−Ｓ−（ＣＲ^＊Ｒ^＊）_ｒ＋ｓ−Ｓ−、−Ｎ（Ｒ^＊）−（ＣＲ ^＊ Ｒ^＊）_ｒ＋ｓ−Ｎ（Ｒ^＊）−、−Ｎ（Ｒ^＊）−（ＣＲ^＊Ｒ^＊）_ｒ＋ｓ−Ｓ−お
よび−Ｓ−（ＣＲ^＊Ｒ^＊）_ｒ＋ｓ−Ｎ（Ｒ^＊）から選択されるビラジカルを示す
；Ｒ^２およびＲ^３はともに、−Ｏ−、−（ＣＲ^＊Ｒ^＊）_ｒ＋ｓ−、−（ＣＲ^＊Ｒ ^＊ ）_ｒ−Ｏ−（ＣＲ^＊Ｒ^＊）_ｓ−、−（ＣＲ^＊Ｒ^＊）_ｒ−Ｓ−（ＣＲ^＊Ｒ^＊）_ｓ −および−（ＣＲ^＊Ｒ^＊）_ｒ−Ｎ（Ｒ^＊）−（ＣＲ^＊Ｒ^＊）_ｓ−から選択される
ビラジカルを示す；Ｒ^２＊およびＲ^３はともに、−Ｏ−、−（ＣＲ^＊Ｒ^＊）_{ｒ＋ ｓ} −、−（ＣＲ^＊Ｒ^＊）_ｒ−Ｏ−（ＣＲ^＊Ｒ^＊）_ｓ−、−（ＣＲ^＊Ｒ^＊）_ｒ−Ｓ
−（ＣＲ^＊Ｒ^＊）_ｓ−および−（ＣＲ^＊Ｒ^＊）_ｒ−Ｎ（Ｒ^＊）−（ＣＲ^＊Ｒ^＊） _ｓ −から選択されるビラジカルを示す；Ｒ^３およびＲ^４＊｀はともに、−（ＣＲ ^＊ Ｒ^＊）_ｒ−Ｏ−（ＣＲ^＊Ｒ^＊）_ｓ−、−（ＣＲ^＊Ｒ^＊）_ｒ−Ｓ−（ＣＲ^＊Ｒ^＊ ）_ｓ−および−（ＣＲ^＊Ｒ^＊）_ｒ−Ｎ（Ｒ^＊）−（ＣＲ^＊Ｒ^＊）_ｓ−から選択さ
れるビラジカルを示す；Ｒ^３およびＲ^５はともに、−（ＣＲ^＊Ｒ^＊）_ｒ−Ｏ−（
ＣＲ^＊Ｒ^＊）_ｓ−、−（ＣＲ^＊Ｒ^＊）_ｒ−Ｓ−（ＣＲ^＊Ｒ^＊）_ｓ−、−（ＣＲ^＊ Ｒ^＊）_ｒ−Ｎ（Ｒ^＊）−（ＣＲ^＊Ｒ^＊）_ｓ−から選択されるビラジカルを示す；
Ｒ^１＊およびＲ^４＊はともに、−（ＣＲ^＊Ｒ^＊）_ｒ−Ｏ−（ＣＲ^＊Ｒ^＊）_ｓ−、
−（ＣＲ^＊Ｒ^＊）_ｒ−Ｓ−（ＣＲ^＊Ｒ^＊）_ｓ−および−（ＣＲ^＊Ｒ^＊）_ｒ−Ｎ（
Ｒ^＊）−（ＣＲ^＊Ｒ^＊）_ｓ−から選択されるビラジカルを示す；またはＲ^１＊お
よびＲ^２＊はともに、−（ＣＲ^＊Ｒ^＊）_ｒ−Ｏ−（ＣＲ^＊Ｒ^＊）_ｓ−、−（ＣＲ ^＊ Ｒ^＊）_ｒ−Ｓ−（ＣＲ^＊Ｒ^＊）_ｓ−、−（ＣＲ^＊Ｒ^＊）_ｒ−Ｎ（Ｒ^＊）−（Ｃ
Ｒ^＊Ｒ^＊）_ｓ−から選択されるビラジカルを示す；ここでｒおよびｓはそれぞれ
、合計ｒ＋ｓが１〜４であるという条件で、０〜３であり、Ｒ^Ｈは水素またはＣ _１−４ アルキルを示す。この例において、Ｒ^３＊はＰ^＊であることが好ましい。

【０１２９】 １個のＲ^＊が水素、ヒドロキシ、随意に置換されたＣ_１−６−アルコキシ、随
意に置換されたＣ_１−６−アルキル、ＤＮＡインタカレータ、光化学活性基、熱
化学活性基、キレート基、リポータ基およびリガンドから選択され、残りの置換
基Ｒ^＊は水素であることがさらに好ましい。

【０１３０】 ある好ましい実施態様において、１個以上のＬＮＡ内のビラジカルにおける基
Ｒ^＊は、ＤＮＡインタカレータ、光化学活性基、熱化学活性基、キレート基、レ
ポータ基、およびリガンドから選択される（後者の基が、置換基Ｂについて定義
されたとおりにスペーサを含む場合）

【０１３１】 Ｐ、Ｐ^＊またはビラジカルに存在し、含まれていない置換基Ｒ^１＊、Ｒ^２、Ｒ ^２＊ 、Ｒ^３、Ｒ^４＊、Ｒ^５、Ｒ^５＊、Ｒ^６およびＲ^６＊、Ｒ^７およびＲ^７＊に関
して、これらは、水素、随意に置換されたＣ_１−１２−アルキル、随意に置換さ
れたＣ_２−１２−アルケニル、随意に置換されたＣ_２−１２−アルキニル、ヒド
ロキシ、Ｃ_１−１２−アルコキシ、Ｃ_２−１２−アルケニロキシ、カルボキシ、
Ｃ_１−１２−アルコキシカルボニル、Ｃ_１−１２−アルキルカルボニル、ホルミ
ル、アリル、アリロキシ−カルボニル、アリロキシ、アリルカルボニル、ヘテロ
アリル、ヘテロアリロキシ−カルボニル、ヘテロアリロキシ、ヘテロアリルカル
ボニル、アミノ、モノ−およびジ（Ｃ_１−６−アルキル）アミノ、カルバモイル
、モノ−およびジ（Ｃ_１−６−アルキル）−アミノ−カルボニル、アミノ−Ｃ_{１ −６} −アルキル−アミノカルボニル、モノ−およびジ（Ｃ_１−６−アルキル）ア
ミノ−Ｃ_１−６−アルキル−アミノカルボニル、Ｃ_１−６−アルキル−カルボニ
ルアミノ、カルバミド、Ｃ_１−６−アルカノイロキシ、スルホノ、Ｃ_１−６−ア
ルキルスルホニロキシ、ニトロ、アジド、スルファニル、Ｃ_１−６−アルキルチ
オ、ハロゲン、ＤＮＡインタカレータ、光化学活性基、熱化学活性基、キレート
基、レポータ基およびリガンドから個別に選択され（後者の基が、置換基Ｂにつ
いて定義されたとおりにスペーサを含む場合）、アリルおよびヘテロアリルが随
意に置換され、２個のジェミナル置換基がともに、オキソ、チオキソ、イミノま
たは随意に置換されたメチレンを表すか、−Ｏ−、−Ｓ−および−（ＮＲ^Ｎ）−
から選択される１個以上のヘテロ原子／基によって随意に中断および／または停
止される１〜５個の炭素原子アルキレン鎖より成る、スピロビラジカルをともに
形成し、Ｒ^Ｎは水素およびＣ_１−４−アルキルから選択され、２個の隣接する（
非ジェミナル）置換基が二重結合を生じる追加結合を示し；Ｒ^Ｎ＊は、ビラジカ
ルに存在し、含まれていない場合に、水素およびＣ_１−４アルキルから選択され
る。

【０１３２】 Ｐ、Ｐ^＊またはビラジカルに存在するが含まれていない、ＬＮＡの置換基Ｒ^{１ ＊} 、Ｒ^２、Ｒ^２＊、Ｒ^３、Ｒ^３＊、Ｒ^４＊、Ｒ^５、Ｒ^５＊、Ｒ^６＊、Ｒ^７および
Ｒ^７＊はそれぞれ、水素、随意に置換されたＣ_１−６−アルキル、随意に置換さ
れたＣ_２−６−アルケニル、ヒドロキシ、Ｃ_１−６−アルコキシ、Ｃ_２−６−ア
ルケニロキシ、カルボキシ、Ｃ_１−６−アルコキシカルボニル、Ｃ_１−６−アル
キルカルボニル、ホルミル、アミノ、モノ−およびジ（Ｃ_１−６−アルキル）ア
ミノ、カルバモイル、モノ−およびジ（Ｃ_１−６−アルキル）−アミノ−カルボ
ニル、Ｃ_１−６−アルキル−カルボニルアミノ、カルバミド、アジド、Ｃ_１−６ −アルカノイロキシ、スルホノ、スルファニル、Ｃ_１−６−アルキルチオ、ＤＮ
Ａインタカレータ、光化学活性基、熱化学活性基、キレート基、レポータ基およ
びリガンドおよびハロゲンから個別に選択されることが好ましく、２個のジェミ
ナル置換基がともにオキソを示し、Ｒ^Ｎ＊は、ビラジカルに存在し、含まれてい
ない場合に、水素およびＣ_１−４アルキルから選択される。

【０１３３】 本発明の好ましい実施態様において、Ｘは−Ｏ−、−Ｓ−および−ＮＲ^Ｎ＊−
、特に−Ｏ−から選択され、Ｐ、Ｐ^＊またはビラジカルに存在するが含まれてい
ない、ＬＮＡの置換基Ｒ^１＊、Ｒ^２、Ｒ^２＊、Ｒ^３、Ｒ^３＊、Ｒ^４＊、Ｒ^５、Ｒ ^５＊ 、Ｒ^６＊、Ｒ^７およびＲ^７＊はそれぞれ、水素を示す。

【０１３４】 本発明のさらに好ましい実施態様において、オリゴマーに含まれるＬＮＡのＲ ^２＊ およびＲ^４＊はともにビラジカルを示す。ＸはＯであり、Ｒ^２は水素、ヒド
ロキシおよび随意に置換されたＣ_１−６−アルコキシから選択され、Ｒ^１＊、Ｒ ^３ 、Ｒ^５およびＲ^５＊は水素を表し、さらに詳細には、ビラジカルは−Ｏ−、−
（ＣＨ_２）_０−１−Ｏ−（ＣＨ_２）_１−３−、−（ＣＨ_２）_０−１−Ｓ−（ＣＨ _２ ）_１−３−、−（ＣＨ_２）_０−１−Ｎ（Ｒ^Ｎ）−（ＣＨ_２）_１−３−および−
（ＣＨ_２）_２−４−、特に−Ｏ−ＣＨ_２−、−Ｓ−ＣＨ_２−および−ＮＲ^Ｈ−Ｃ
Ｈ_２−から選択される。一般に、これまでに得られた結果に払うべき注意を払う
と、Ｒ^２＊およびＲ^４＊を構成するバイラジカルが２個の原子ブリッジを形成す
る、すなわちバイラジカルがフラノース環と五員環を形成する（Ｘ＝Ｏ）ことが
好ましい。

【０１３５】 特に興味深いＬＮＡ修飾オリゴヌクレオチドは、式Ｉａの含有ＬＮＡのＲ^２＊ およびＲ^４＊がともに、−Ｏ−ＣＨ_２−、−Ｓ−ＣＨ_２−および−ＮＲ^Ｈ−ＣＨ _２ −から選択されるビラジカルを示し；ＸがＯであり、Ｂがアデニン、グアニン
、チミン、シトシンおよびウラシルから選択される核塩基を示し；Ｒ^２が水素、
Ｒ^１＊、Ｒ^３、Ｒ^５およびＲ^５＊が水素を示す場合のオリゴヌクレオチドである
。

【０１３６】 本発明の別の実施態様において、オリゴマーに含まれるＬＮＡのＲ^２およびＲ ^３ はともにビラジカルを示す。好ましくは、ＸはＯであり、Ｒ^２＊は水素、ヒド
ロキシおよび随意に置換されたＣ_１−６−アルコキシより選択され、Ｒ^１＊、Ｒ ^３ 、Ｒ^５およびＲ^５＊は水素を示し、さらに詳細にはビラジカルは、−（ＣＨ_２ ）_０−１−Ｏ−（ＣＨ_２）_１−３−、−（ＣＨ_２）_０−１−Ｓ−（ＣＨ_２）_{１− ３} −、−（ＣＨ_２）_０−１−Ｎ（Ｒ^Ｎ）−（ＣＨ_２）_１−３−および−（ＣＨ_２ ）_１−４−、特に−Ｏ−ＣＨ_２−、−Ｓ−ＣＨ_２−および−Ｎ（Ｒ^Ｈ）−ＣＨ_２ −から選択される。後者の場合、アミノおよびチオの変形が特に興味深いと思わ
れる。

【０１３７】 本発明の別の実施態様において、オリゴマーに含まれるＬＮＡのＲ^２およびＲ ^３ はともにビラジカルを示す。好ましくは、ＸはＯであり、Ｒ^２＊は水素、ヒド
ロキシおよび随意に置換されたＣ_１−６−アルコキシより選択され、Ｒ^１＊、Ｒ ^４＊ 、Ｒ^５およびＲ^５＊は水素を示し、さらに詳細にはビラジカルは、−（ＣＨ _２ ）_０−１−Ｏ−（ＣＨ_２）_１−３−および−（ＣＨ_２）_２−４−から選択され
る。

【０１３８】 本発明の別の実施態様において、オリゴマーに含まれるＬＮＡのＲ^３およびＲ ^４＊ はともにビラジカルを示す。好ましくは、ＸはＯであり、Ｒ^２＊は水素、ヒ
ドロキシおよび随意に置換されたＣ_１−６−アルコキシより選択され、Ｒ^１＊、
Ｒ^２、Ｒ^５およびＲ^５＊は水素を示し、さらに詳細にはビラジカルは、−（ＣＨ _２ ）_０−２−Ｏ−（ＣＨ_２）_０−２−である。

【０１３９】 本発明の別の実施態様において、オリゴマーに含まれるＬＮＡのＲ^３およびＲ ^５＊ はともにビラジカルを示す。好ましくは、ＸはＯであり、Ｒ^２＊は水素、ヒ
ドロキシおよび随意に置換されたＣ_１−６−アルコキシより選択され、Ｒ^１＊、
Ｒ^２、Ｒ^４およびＲ^５は水素を示し、さらに詳細にはビラジカルは、−Ｏ−（Ｃ
ＨＲ^＊）_２−３−および−（ＣＨＲ^＊）_１−３−Ｏ−（ＣＨＲ^＊）_０−３−であ
る。

【０１４０】 本発明の別の実施態様において、オリゴマーに含まれるＬＮＡのＲ^１＊および
Ｒ^４＊はともにビラジカルを示す。好ましくは、ＸはＯであり、Ｒ^２＊は水素、
ヒドロキシおよび随意に置換されたＣ_１−６−アルコキシより選択され、Ｒ^２、
Ｒ^３、Ｒ^５およびＲ^５＊は水素を示し、さらに詳細にはビラジカルは、−（ＣＨ _２ ）_０−２−Ｏ−（ＣＨ_２）_０−２−である。

【０１４１】 これらの実施態様において、オリゴマーに含まれる１個以上のＬＮＡが、アデ
ニンおよびグアニンから選択される核塩基（置換基Ｂ）を含むことがさらに好ま
しい。特に、オリゴマーに含まれたＬＮＡが、チミン、ウラシルおよびシトシン
から選択された１個以上の核塩基と、アデニンおよびグアニンから選択された１
個以上の核塩基の両方を含むことが好ましい。ＬＮＡモノマーの場合、核塩基が
アデニンおよびグアニンから選択されることが特に好ましい。

【０１４２】 これらの興味深い実施態様では、ＬＮＡが一般式Ｉａを持つことも好ましい（
以下参照）。

【０１４３】 これらの興味深い実施態様の変形の範囲内で、オリゴヌクレオチドのモノマー
はすべて、ＬＮＡモノマーである。

【０１４４】 一般式Ｉ（オリゴマー内のＬＮＡ）（ならびに一般式ＩＩ（モノマーＬＮＡ−
以下参照））と、それに加えて関連する定義から明らかとなるように、置換基お
よび考えられるビラジカルの性質によって、オリゴマー（およびモノマーＬＮＡ
）内に１個または複数の非対称炭素原子が存在することがある（以下参照）。本
発明の方法に従って調製したオリゴマーは、本来のオリゴマーと同様に、各モノ
マー断片はもちろんのこと、ラセミ混合物を含むその混合物のあらゆる異性体の
存在から生じる、すべての立体異性体を含有させるものである。

【０１４５】 しかし、五員環または六員環を考慮すると、たとえば以下のような、ある立体
化学構造が特に興味深い。

【０１４６】

【化４】

【０１４７】 ここで波線は、問題の２個の置換基の交換から生じる両方のジアステレオマー
の可能性を示す。

【０１４８】 特に興味深い立体異性体形は、ＬＮＡが以下の式Ｉａを持つ場合である。

【０１４９】

【化５】

【０１５０】 本発明の別の態様としてまた興味深いのは、Ｂが「αー構造」にある式Ｉａの
変形である。

【０１５１】 この場合、一般と同様に、Ｒ^３＊はＰ^＊を示す。

【０１５２】 これによるオリゴマーは通常、一般式Ｉ（またはさらに詳細な一般式Ｉａ）の
ＬＮＡ１〜１００００個と、天然型ヌクレオシドおよびヌクレオシド類似体から
選択される０〜１００００個のヌクレオシドより成る。ヌクレオシド数とＬＮＡ
数の合計は、２〜１５０００の範囲、好ましくは３〜１００などの２〜１００の
範囲、特に好ましくは３〜５０、５〜５０、７〜５０などの２〜５０の範囲など
において、２以上、好ましくは３以上、特に好ましくは５以上、特別好ましくは
７以上である。

【０１５３】 １個以上のＬＮＡが、置換基Ｂとして核塩基を含むことが好ましい。

【０１５４】 ここでは、「核塩基」という語は、ヘテロ環塩基のグリコシドを意味する。「
ヌクレオシド」という語は、非天然型ヌクレオシド、天然型ヌクレオシドはもち
ろんのこと、他のヌクレオシド類似体を含めて幅広く使用されている。ヌクレオ
シドの実例は、デオキシリボース部分より成るデオキシリボヌクレオシドと同様
に、リボース部分より成るリボヌクレオシドである。このようなヌクレオシドの
塩基に関して、これは天然型塩基、たとえばアデニン、グアニン、シトシン、チ
ミンおよびウラシルはもちろんのこと、その修飾された変形あるいは考えられる
非天然型塩基のいずれでもよいことを理解する必要がある。

【０１５５】 定義および既知のヌクレオシド（天然型と非天然型）、ヌクレオシド類似体（
既知のニ環式および三環式類似体を含む）を考慮する場合、オリゴマーが１個以
上の（置換基の選択とビラジカルの選択の両方に関して同一または異なる）ＬＮ
Ａと、１個以上のヌクレオシドおよび／またはヌクレオシド類似体より成ること
は明らかである。本文脈において、「オリゴヌクレオシド」は、ヌクレオシド間
結合によって結合されたヌクレオシドの連続鎖を意味するが、オリゴマー（オリ
ゴヌクレオチド）内の１個以上のヌクレオチド単位（モノマー）内の核塩基が、
上で定義したように置換基Ｂによって修飾されていることを理解する必要がある
。

【０１５６】 オリゴマーは直鎖、分岐または環式でもよい。分岐オリゴマーの場合、分岐点
はヌクレオシド、ヌクレオシド間結合に位置し、興味深い実施態様ではＬＮＡ内
に位置する。後者の場合、置換基Ｒ^２、Ｒ^２＊、Ｒ^３およびＲ^３＊は、それぞれ
前のモノマーに対するヌクレオシド間結合を示す２個の基Ｐ^＊を示し、特にＲ^２ およびＲ^２＊の１個はＰ^＊および１を示し、Ｒ^３およびＲ^３＊はさらにＰ^＊を示
す。

【０１５７】 上述したように、オリゴマーのＬＮＡはヌクレオシド間結合によって他のモノ
マーに結合される。本文脈において、「ヌクレオシド間結合」という語は、−Ｃ
Ｈ_２−、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＲ^Ｈ−、＞Ｃ＝Ｏ、＞Ｃ＝ＮＲ^Ｈ、＞Ｃ＝Ｓ、−
Ｓｉ（Ｒ”）_２−、−ＳＯ−、−Ｓ（Ｏ）_２−、−Ｐ（Ｏ）_２−、−ＰＯ（ＢＨ _３ ）−、−Ｐ（Ｏ，Ｓ）−、−Ｐ（Ｓ）_２−、−ＰＯ（Ｒ”）−、−ＰＯ（ＯＣ
Ｈ_３）−および−ＰＯ（ＮＨＲ^Ｈ）−から選択される２〜４個、好ましくは３個
の基／原子より成る結合を意味し、ここでＲ^Ｈは水素およびＣ_１−４−アルキル
より選択され、Ｒ”はＣ_１−６−アルキルおよびフェニルから選択される。この
ようなヌクレオシド間結合の実例は、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＣＨ_２−、−ＣＨ_２−
ＣＯ−ＣＨ_２−、−ＣＨ_２−ＣＨＯＨ−ＣＨ_２−、−Ｏ−ＣＨ_２−Ｏ−、−Ｏ−
ＣＨ_２−ＣＨ_２−、−Ｏ−ＣＨ_２−ＣＨ＝（次のモノマーへの結合として使用す
る場合Ｒ^５を含む）、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｏ−、−ＮＲ^Ｈ−ＣＨ_２−ＣＨ_２−、
−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＮＲ^Ｈ−、−ＣＨ_２−ＮＲ^Ｈ−ＣＨ_２−、−Ｏ−ＣＨ_２−Ｃ
Ｈ_２−ＮＲ^Ｈ−、−ＮＲ^Ｈ−ＣＯ−Ｏ−、−ＮＲ^Ｈ−ＣＯ−ＮＲ^Ｈ−、−ＮＲ^Ｈ −ＣＳ−ＮＲ^Ｈ−、−ＮＲ^Ｈ−Ｃ（＝ＮＲ^Ｈ）−ＮＲ^Ｈ−、−ＮＲ^Ｈ−ＣＯ−Ｃ
Ｈ_２−ＮＲ^Ｈ−、−Ｏ−ＣＯ−Ｏ−、−Ｏ−ＣＯ−ＣＨ_２−Ｏ−、−Ｏ−ＣＨ_２ −ＣＯ−Ｏ−、−ＣＨ_２−ＣＯ−ＮＲ^Ｈ−、−Ｏ−ＣＯ−ＮＲ^Ｈ−、−ＮＲ^Ｈ−
ＣＯ−ＣＨ_２−、−Ｏ−ＣＨ_２−ＣＯ−ＮＲ^Ｈ−、−Ｏ−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＮＲ ^Ｈ −、−ＣＨ＝Ｎ−Ｏ−、−ＣＨ_２−ＮＲ^Ｈ−Ｏ−、−ＣＨ_２−Ｏ−Ｎ＝（次の
モノマーへの結合として使用する場合Ｒ^５を含む）、−ＣＨ_２−Ｏ−ＮＲ^Ｈ−、
−ＣＯ−ＮＲ^Ｈ−ＣＨ_２−、−ＣＨ_２−ＮＲ^Ｈ−Ｏ−、−ＣＨ_２−ＮＲ^Ｈ−ＣＯ
−、−Ｏ−ＮＲ^Ｈ−ＣＨ_２−、−Ｏ−ＮＲ^Ｈ−、−Ｏ−ＣＨ_２−Ｓ−、−Ｓ−Ｃ
Ｈ_２−Ｏ−、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｓ−、−Ｏ−ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｓ−、−Ｓ−Ｃ
Ｈ_２−ＣＨ＝（次のモノマーへの結合として使用する場合Ｒ^５を含む）、−Ｓ−
ＣＨ_２−ＣＨ_２−、−Ｓ−ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｏ−、−Ｓ−ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｓ−
、−ＣＨ_２−Ｓ−ＣＨ_２−、−ＣＨ_２−ＳＯ−ＣＨ_２−、−ＣＨ_２−ＳＯ_２−Ｃ
Ｈ_２−、−Ｏ−ＳＯ−Ｏ−、−Ｏ−Ｓ（Ｏ）_２−Ｏ−、−Ｏ−Ｓ（Ｏ）_２−ＣＨ _２ −、−Ｏ−Ｓ（Ｏ）_２−ＮＲ^Ｈ−、−ＮＲ^Ｈ−−Ｓ（Ｏ）_２−ＣＨ_２−、−Ｏ
−Ｓ（Ｏ）_２−ＣＨ_２−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）_２−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ，Ｓ）−Ｏ−
、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）_２−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）_２−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ，Ｓ）−Ｏ
−、−Ｓ−Ｐ（Ｓ）_２−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）_２−Ｓ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ，Ｓ）−
Ｓ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）_２−Ｓ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）_２−Ｓ−、−Ｓ−Ｐ−（Ｏ，Ｓ
）−Ｓ−、−Ｓ−Ｐ（Ｓ）_２−Ｓ−、−Ｏ−ＰＯ（Ｒ”）−Ｏ−、−Ｏ−ＰＯ（
ＯＣＨ_３）−Ｏ−、−Ｏ−ＰＯ（ＯＣＨ_２ＣＨ_３）−Ｏ−、−Ｏ−ＰＯ（ＯＣＨ _２ ＣＨ_２Ｓ−Ｒ）−Ｏ−、−Ｏ−ＰＯ（ＢＨ_３）−Ｏ−、−Ｏ−ＰＯ（ＮＨＲ^Ｎ ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）_２−ＮＲ^Ｈ−、−ＮＲ^Ｈ−Ｐ（Ｏ）_２−Ｏ−、−Ｏ−
Ｐ（Ｏ，ＮＲ^Ｈ）−Ｏ−、−ＣＨ_２−Ｐ（Ｏ）_２−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）_２−Ｃ
Ｈ_２−、および−Ｏ−Ｓｉ（Ｒ”）_２−Ｏ−から選択される２〜４個、好ましく
は３個の基／原子より成る結合を意味し；そのうち−ＣＨ_２−ＣＯ−ＮＲ^Ｈ−、
−ＣＨ_２−ＮＲ^Ｈ−Ｏ−、−Ｓ−ＣＨ_２−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）_２−Ｏ−、−Ｏ
−Ｐ（Ｏ，Ｓ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）_２−Ｏ−、−ＮＲ^Ｈ−Ｐ（Ｏ）_２−Ｏ−
、−Ｏ−Ｐ（Ｏ，ＮＲ^Ｈ）−Ｏ−、−Ｏ−ＰＯ（Ｒ”）−Ｏ−、−Ｏ−ＰＯ（Ｃ
Ｈ_３）−Ｏ−、−Ｏ−ＰＯ（ＮＨＲ^Ｎ）−Ｏ−（ここでＲ^Ｈは水素およびＣ_{１− ４} −アルキルより選択され、Ｒ”はＣ_１−６−アルキルおよびフェニルから選択
される）が特に好ましい。さらなる実例は、Ｍｅｓｍａｅｋｅｒ ｅｔ ａｌ．
， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌ
ｏｇｙ １９９５， ５， ３４３−３５５に与えられている。ヌクレオチド間
結合の左側は置換基Ｐ^＊として五員環または六員環に結合しているが、右側は前
のモノマーの５’−位置に結合している。

【０１５８】 上記より、問題のＬＮＡが５’−末端モノマーである場合に、基Ｐは５’−末
端基を示すことも明白である。このような５’−末端基の例は、水素、ヒドロキ
シ、随意に置換されたＣ_１−６−アルキル、随意に置換されたＣ_１−６−アルコ
キシ、随意に置換されたＣ_１−６−アルキルカルボニロキシ、随意に置換された
アリロキシ、一リン酸塩、二リン酸塩、三リン酸塩および−Ｗ−Ａ’であり、こ
こでＷは−Ｏ−、−Ｓ−および−Ｎ（Ｒ^Ｈ）−から選択され、Ｒ^Ｈは水素および
Ｃ_１−６−アルキルより選択され、Ａ’はＤＮＡインタカレータ、光化学活性基
、熱化学活性基、キレート基、レポータ基およびリガンド（後者の基が、置換基
Ｂについて定義されたとおりにスペーサを含む場合）から選択される。

【０１５９】 ここで、および、請求項において、「一リン酸塩」、「二リン酸塩」、「三リ
ン酸塩」という語はそれぞれ式：−Ｏ−Ｐ（Ｏ）_２−Ｏ⁻、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）_２−
Ｏ−Ｐ（Ｏ）_２−Ｏ⁻、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）_２−Ｏ−Ｐ（Ｏ）_２−Ｏ−Ｐ（Ｏ）_２−
Ｏ⁻の基を意味する。

【０１６０】 特に興味深い実施態様において、基Ｐは一リン酸塩、二リン酸塩、三リン酸塩
から選択される５’−末端基を示す。特に三リン酸塩の変形は、核酸ポリメラー
ゼの基質として興味深い。

【０１６１】 同様に基Ｐ^＊は、問題のＬＮＡが３’−末端モノマーである場合の３’−末端
基を示す。このような３’−末端基の例としては、水素、ヒドロキシ、随意に置
換されたＣ_１−６−アルコキシ、随意に置換されたＣ_１−６−アルキルカルボニ
ロキシ、随意に置換されたアリロキシおよび−Ｗ−Ａ’があり、ここでＷは−Ｏ
−、−Ｓ−および−Ｎ（Ｒ^Ｈ）−より選択され、Ｒ^Ｈは水素およびＣ_１−６−ア
ルキルから選択され、Ａ’はＤＮＡインタカレータ、光化学活性基、熱化学活性
基、キレート基、レポータ基およびリガンド（後者の基が、置換基Ｂについて定
義されたとおりにスペーサを含む場合）から選択される。

【０１６２】 本発明の好ましい実施態様において、オリゴマーは以下の式Ｖを持つ： Ｇ−［Ｎｕ−Ｌ］_ｎ（０）−｛［ＬＮＡ−Ｌ］_ｍ（ｑ）−［Ｎｕ−Ｌ］_ｎ（ｑ） ｝_ｑ−Ｇ^＊ Ｖ ここで、 ｑは１〜５０であり； ｎ（０），．．．ｎ（ｑ）とｍ（０），．．．ｍ（ｑ）の和が２〜１５０００
という条件で、 ｎ（０），．．．ｎ（ｑ）はそれぞれ独立に０〜１００００であり； ｍ（０），．．．ｍ（ｑ）はそれぞれ独立に０〜１００００であり； Ｇは５’−末端基を示し； Ｎｕはそれぞれ、天然型ヌクレオシドおよびヌクレオシド類似体から選択され
たヌクレオシドを示し； 各ＬＮＡは独立にヌクレオシド類似体を示し； 各Ｌは独立に、ＮｕおよびＬＮＡから選択される２個の基の間のヌクレオシド
間結合を示すか、ＬはＧ^＊とともに３’−末端基を示し；各ＬＮＡ−Ｌは上で定
義した一般式Ｉのヌクレオシド類似体を示すか、好ましくは上で定義した一般式
Ｉａを示す。

【０１６３】 本発明で使用されるＬＮＡ修飾オリゴマーの構造は機能、すなわちＬＮＡ修飾
オリゴヌクレオチドが、たとえば質量分析法によって分析されない捕獲プローブ
として使用されるかどうか、またはＬＮＡ修飾オリゴヌクレオチドが質量分析法
によって分析されるオリゴマーとして使用されるかどうかによって変わる。

【０１６４】 第１の例において（捕獲プローブ）、ＬＮＡ修飾の程度は、ＬＮＡ修飾オリゴ
ヌクレオチド中のＬＮＡの数によって、標的核酸とＬＮＡ修飾オリゴヌクレオチ
ドとのハイブリダイゼーションが十分安定である、すなわち未修飾オリゴヌクレ
オチドを使用した場合よりもより安定であるという点で、低いことがある。した
がって、このようなＬＮＡ修飾オリゴヌクレオチドは、たとえば１０〜２００個
のオリゴヌクレオチド長のように比較的長く、この例では、ＬＮＡ修飾オリゴヌ
クレオチドは、標的核酸へのハイブリダイゼーションのための、たとえば２〜１
５個のＬＮＡ／ヌクレオチドのドメインと、担体への間隔と固定化のための、主
としてヌクレオチド（たとえば２〜２００塩基のＤＮＡ）より成る別のドメイン
を含むことがある。それゆえ式Ｖを参照すると、例は次のようになる：ｑは１で
あり、ｎ（０）またはｎ（１）は１〜２００、好ましくは２〜２０などの２〜５
０であり、残りのｎ（０）およびｎ（１）は０、ｍ（１）は２〜２０または３〜
１５などの１〜５０である。本例において、「長い」オリゴヌクレオチドは通常
、オリゴヌクレオチドにおけるＬＮＡのヌクレオチドに対する、１：２０〜１：
１の比（１：１０〜１：２など、たとえば１：８〜１：４）より成る。

【０１６５】 第２の例において（質量分析可能なプローブ）、ＬＮＡ修飾の程度は通常、比
較的高く（以下参照）、ＬＮＡ修飾オリゴヌクレオチドは、質量分析信号の分解
能は長さ（分子質量）が増すと低下するため、ＬＮＡ／ヌクレオチド２〜３０個
の長さというように、比較的短い。本例において、「短い」オリゴヌクレオチド
は通常、オリゴヌクレオチドにおけるＬＮＡのヌクレオチドに対する、１：２以
上（１：１以上など、好ましくは２：１以上）の比より成る。

【０１６６】 一般と同様に、上記の実施態様の範囲内で、本発明は、各種の核塩基、特にチ
ミン、シトシンおよびウラシルから選択された核塩基と、アデニンおよびグアニ
ンから選択された各塩基の両者を含む（それにより各種分子質量である）オリゴ
ヌクレオチドにＬＮＡが含まれる興味深い可能性をもたらす。

【０１６７】 オリゴマーはさらに、次の式のＰＮＡモノ−またはオリゴマーセグメントより
成る：

【０１６８】

【化６】

【０１６９】 ここでＢは式Ｉについて定義されており、ＡＡＳＣは水素またはアミノ酸側鎖
を示し、ｔは１〜５であり、ｗは１〜５０である。

【０１７０】 本文脈において、「アミノ酸側鎖」は、α−アミノ酸のα−原子に結合した基
を意味する。すなわち、グリセリン部分を含まないα−アミノ酸、好ましくは天
然型またはただちに入手可能なα−アミノ酸に相当する。実例は、水素（グリセ
リン自体）、重水素（重水素化グリシン）、メチル（アラニン）、シアノメチル
（β−シアノ−アラニン）、エチル、１−プロピル（ノルバリン）、２−プロピ
ル（バリン）、２−メチル−１−プロピル（ロイシン）、２−ヒドロキシ−２−
メチル−１−プロピル（β−ヒドロキシ−ロイシン）、１−ブチル（ノルロイシ
ン）、２−ブチル（イソロイシン）、メチルチオエチル（メチオニン）、ベンジ
ル（フェニルアラニン）、ｐ−アミノ−ベンジル（ｐ−アミノ−フェニルアラニ
ン）、ｐ−ヨード−ベンジル（ｐ−ヨード−フェニルアラニン）、ｐ−フルオロ
−ベンジル（ｐ−フルオロ−フェニルアラニン）、ｐ−ブロモ−ベンジル（ｐ−
ブロモ−フェニルアラニン）、ｐ−クロロ−ベンジル（ｐ−クロロ−フェニルア
ラニン）、ｐ−ニトロ−ベンジル（ｐ−ニトロ−フェニルアラニン）、３−ピリ
ジルメチル（β−（３−ピリジル）−アラニン）、３，５−ジヨード−４−ヒド
ロキシ−ベンジル（３，５−ジヨード−チロシン）、３，５−ジブロモ−４−ヒ
ドロキシ−ベンジル（３，５−ジブロモ−チロシン）、３，５−ジクロロ−４−
ヒドロキシ−ベンジル（３，５−ジクロロ−チロシン）、３，５−ジフルオロ−
４−ヒドロキシ−ベンジル（３，５−ジフルオロ−チロシン）、４−メトキシ−
ベンジル（Ｏ−メチル−チロシン）、２−ナフチルメチル（β−（２−ナフチル
）−アラニン）、１−ナフチルメチル（β−（１−ナフチル）−アラニン）、３
−インドリルメチル（トリプトファン）、ヒドロキシメチル（セリン）、１−ヒ
ドロキシエチル（トレオニン）、メルカプトメチル（システイン）、２−メルカ
プト−２−プロピル（ペニシルアミン）、４−ヒドロキシ−ベンジル（チロシン
）、アミノカルボニルメチル（アスパラギン）、２−アミノカルボニルエチル（
グルタミン）、カルボキシメチル（アスパラギン酸）、２−カルボキシエチル（
グルタミン酸）、アミノメチル（α，β−ジアミノ−プロピオン酸）、２−アミ
ノエチル（α，γ−ジアミノ酪酸）、３−アミノ−プロピル（オルニチン）、４
−アミノ−１−ブチル（リジン）、３−グアニジノ−１−プロピル（アルギニン
）、および４−イミダゾリルメチル（ヒスチジン）である。

【０１７１】 ＰＮＡモノ−またはオリゴマーセグメントは、ＥＰ ０６７２６７７ Ａ２に
示すようにオリゴマーに含めてもよい。

【０１７２】 オリゴマーはキメラオリゴマーも対象とするものである。「キメラオリゴマー
」は、直接、またはスペーサによって結合された、異なる起源のモノマーを含む
２個以上のオリゴマーを意味する。結合可能なこのようなオリゴマーの実例は、
ペプチド、ＰＮＡ−オリゴマー、ＬＮＡを含むオリゴマーおよびオリゴヌクレオ
チドオリゴマーである。

【０１７３】 上で定義したオリゴマーとは別に、本発明は、核酸ポリメラーゼ、ポリヌクレ
オチドキナーゼの基質として、そして末端トランスフェラーゼとして、モノマー
ＬＮＡ（好ましくは三リン酸塩）も利用する。構造全体において、モノマーＬＮ
Ａはオリゴマーの構成要素として定義されたＬＮＡに相当するが（特に考えられ
るビラジカルについて）、基ＰおよびＰ^＊に関して、モノマーＬＮＡは以下で説
明するように、少し異なる。さらに、モノマーＬＮＡは、特にモノマーＬＮＡが
化学合成によってオリゴマーに含有される場合には、官能基保護基より成る場合
がある。

【０１７４】 考えられるモノマーＬＮＡの興味深いサブグループは、一般式ＩＩの二環式ヌ
クレオシド類似体（ＬＮＡ）より成る：

【０１７５】

【化７】

【０１７６】 ここで置換基Ｂは核塩基、ＤＮＡインタカレータ、光化学活性基、熱化学活性
基、キレート基、レポータ基およびリガンドより選択され；Ｘは−Ｏ−、−Ｓ−
、−Ｎ（Ｒ^Ｎ＊）−および−Ｃ（Ｒ^６Ｒ^６＊）−、好ましくは−Ｏ−、−Ｓ−、
−Ｎ（Ｒ^Ｎ＊）−より選択され；置換基Ｒ^２、Ｒ^２＊、Ｒ^３およびＲ^３＊のうち
１個はグループＱ^＊であり、 ＱおよびＱ^＊はそれぞれ、水素、アジド、ハロゲン、シアノ、ニトロ、ヒドロ
キシ、Ｐｒｏｔ−Ｏ−、Ａｃｔ−Ｏ−、メルカプト、Ｐｒｏｔ−Ｓ−、Ａｃｔ−
Ｓ−、Ｃ_１−６−アルキルチオ、アミノ、Ｐｒｏｔ−Ｎ（Ｒ^Ｈ）−、Ａｃｔ−Ｎ
（Ｒ^Ｈ）−、モノ−またはジ（Ｃ_１−６−アルキル）アミノ、随意に置換された
基Ｃ_１−６−アルコキシ、随意に置換されたＣ_１−６−アルキル、随意に置換さ
れたＣ_２−６−アルケニル、随意に置換されたＣ_２−６−アルケニロキシ、随意
に置換されたＣ_２−６−アルキニル、随意に置換されたＣ_２−６−アルキニロキ
シ、一リン酸塩、二リン酸塩、三リン酸塩、ＤＮＡインタカレータ、光化学活性
基、熱化学活性基、キレート基、レポータ基、リガンド、カルボキシ、スルホノ
、ヒドロキシメチル、Ｐｒｏｔ−Ｏ−ＣＨ_２−、Ａｃｔ−Ｏ−ＣＨ_２−、アミノ
メチル、Ｐｒｏｔ−Ｎ（Ｒ^Ｈ）−ＣＨ_２−、Ａｃｔ−Ｎ（Ｒ^Ｈ）−ＣＨ_２−、カ
ルボキシメチル、スルホノメチルから個別に選択され、Ｐｒｏｔは−ＯＨ、−Ｓ
Ｈおよび−ＮＨ（Ｒ^Ｈ）それぞれの保護基であり、Ａｃｔは−ＯＨ、−ＳＨおよ
び−ＮＨ（Ｒ^Ｈ）それぞれの活性基であり、Ｒ^Ｈは水素およびＣ_１−６−アルキ
ルより選択され； Ｒ^２＊およびＲ^４＊はともに、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｎ（Ｒ^＊）−、−（ＣＲ^＊ Ｒ^＊）_{ｒ＋ｓ＋１}−、−（ＣＲ^＊Ｒ^＊）_ｒ−Ｏ−（ＣＲ^＊Ｒ^＊）_ｓ−、−（ＣＲ ^＊ Ｒ^＊）_ｒ−Ｓ−（ＣＲ^＊Ｒ^＊）_ｓ−、−（ＣＲ^＊Ｒ^＊）_ｒ−Ｎ（Ｒ^＊）−（Ｃ
Ｒ^＊Ｒ^＊）_ｓ−、−Ｏ−（ＣＲ^＊Ｒ^＊）_ｒ＋ｓ−Ｏ−、−Ｓ−（ＣＲ^＊Ｒ^＊）_{ｒ ＋ｓ} −Ｏ−、−Ｏ−（ＣＲ^＊Ｒ^＊）_ｒ＋ｓ−Ｓ−、−Ｎ（Ｒ^＊）−（ＣＲ^＊Ｒ^＊ ）_ｒ＋ｓ−Ｏ−、−Ｏ−（ＣＲ^＊Ｒ^＊）_ｒ＋ｓ−Ｎ（Ｒ^＊）−、−Ｓ−（ＣＲ^＊ Ｒ^＊）_ｒ＋ｓ−Ｓ−、−Ｎ（Ｒ^＊）−（ＣＲ^＊Ｒ^＊）_ｒ＋ｓ−Ｎ（Ｒ^＊）−、−
Ｎ（Ｒ^＊）−（ＣＲ^＊Ｒ^＊）_ｒ＋ｓ−Ｓ−および−Ｓ−（ＣＲ^＊Ｒ^＊）_ｒ＋ｓ−
Ｎ（Ｒ^＊）−から選択されるビラジカルを示し；Ｒ^２およびＲ^３はともに、−Ｏ
−、−（ＣＲ^＊Ｒ^＊）_ｒ＋ｓ−、−（ＣＲ^＊Ｒ^＊）_ｒ−Ｏ−（ＣＲ^＊Ｒ^＊）_ｓ−
、−（ＣＲ^＊Ｒ^＊）_ｒ−Ｓ−（ＣＲ^＊Ｒ^＊）_ｓ−および−（ＣＲ^＊Ｒ^＊）_ｒ−Ｎ
（Ｒ^＊）−（ＣＲ^＊Ｒ^＊）_ｓ−から選択されるビラジカルを示し；Ｒ^２＊および
Ｒ^３はともに、−Ｏ−、−（ＣＲ^＊Ｒ^＊）_ｒ＋ｓ−、−（ＣＲ^＊Ｒ^＊）_ｒ−Ｏ−
（ＣＲ^＊Ｒ^＊）_ｓ−、−（ＣＲ^＊Ｒ^＊）_ｒ−Ｓ−（ＣＲ^＊Ｒ^＊）_ｓ−および−（
ＣＲ^＊Ｒ^＊）_ｒ−Ｎ（Ｒ^＊）−（ＣＲ^＊Ｒ^＊）_ｓ−から選択されるビラジカルを
示し；Ｒ^３およびＲ^４はともに、−（ＣＲ^＊Ｒ^＊）_ｒ−Ｏ−（ＣＲ^＊Ｒ^＊）_ｓ−
、−（ＣＲ^＊Ｒ^＊）_ｒ−Ｓ−（ＣＲ^＊Ｒ^＊）_ｓ−および−（ＣＲ^＊Ｒ^＊）_ｒ−Ｎ
（Ｒ^＊）−（ＣＲ^＊Ｒ^＊）_ｓ−から選択されるビラジカルを示し；Ｒ^３およびＲ ^５ はともに、−（ＣＲ^＊Ｒ^＊）_ｒ−Ｏ−（ＣＲ^＊Ｒ^＊）_ｓ−、−（ＣＲ^＊Ｒ^＊） _ｒ −Ｓ−（ＣＲ^＊Ｒ^＊）_ｓ−および−（ＣＲ^＊Ｒ^＊）_ｒ−Ｎ（Ｒ^＊）−（ＣＲ^＊ Ｒ^＊）_ｓ−から選択されるビラジカルを示し；Ｒ^１＊およびＲ^４＊はともに、−
（ＣＲ^＊Ｒ^＊）_ｒ−Ｏ−（ＣＲ^＊Ｒ^＊）_ｓ−、−（ＣＲ^＊Ｒ^＊）_ｒ−Ｓ−（ＣＲ ^＊ Ｒ^＊）_ｓ−および−（ＣＲ^＊Ｒ^＊）_ｒ−Ｎ（Ｒ^＊）−（ＣＲ^＊Ｒ^＊）_ｓ−から
選択されるビラジカルを示し；またはＲ^１＊およびＲ^２＊はともに、−（ＣＲ^＊ Ｒ^＊）_ｒ−Ｏ−（ＣＲ^＊Ｒ^＊）_ｓ−、−（ＣＲ^＊Ｒ^＊）_ｒ−Ｓ−（ＣＲ^＊Ｒ^＊） _ｓ −および−（ＣＲ^＊Ｒ^＊）_ｒ−Ｎ（Ｒ^＊）−（ＣＲ^＊Ｒ^＊）_ｓ−から選択され
るビラジカルを示し；ここでＲ^＊はオリゴマーについて上で定義したとおりであ
り；Ｑ、Ｑ^＊またはビラジカルに含まれていない置換基Ｒ^１＊、Ｒ^２、Ｒ^２＊、
Ｒ^３、Ｒ^４＊、Ｒ^５およびＲ^５＊はそれぞれ、オリゴマーについて上で定義した
とおりである。

【０１７７】 モノマーＬＮＡも、塩基性塩とその酸添加塩より成る。さらに、オリゴヌクレ
オチドの化学合成において有効な条件下で活性である化学基（核塩基を含む）は
、当業界で知られているように随意に保護された官能基である。このことは、モ
ノマーＬＮＡのヒドロキシ、アミノ、カルボキシ、スルホノおよびメルカプト基
などの基は、核塩基と同様に、随意に保護された官能基であることを意味する。
保護（および脱保護）は、当業熟練者に既知の方法で実施する（たとえばＧｒｅ
ｅｎｅ， Ｔ． Ｗ． ａｎｄ Ｗｕｔｓ， Ｐ． Ｇ． Ｍ．，「有機合成に
おける保護基（Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ
Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）」、第２版、Ｊｏｈｎ Ｗｉｅｌｙ， Ｎ．Ｙ．（１９９
１）およびＭ． Ｊ． Ｇａｉｔ， 「オリゴヌクレオチド合成（Ｏｌｉｇｏｎ
ｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）」， ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ， １９
８４を参照）。

【０１７８】 好ましい実施態様において、モノマーＬＮＡの基Ｂは好ましくは核塩基および
保護核塩基から、好ましくはアデニン、グアニン、シトシン、チミンおよびウラ
シルから選択された核塩基から選択される。

【０１７９】 モノマーＬＮＡにおいて、ＱおよびＱ^＊のうちの１個、好ましくはＱ^＊は、Ａ
ｃｔ−Ｏ−、Ａｃｔ−Ｓ−、Ａｃｔ−Ｎ（Ｒ^Ｈ）−、Ａｃｔ−Ｏ−ＣＨ_２−、Ａ
ｃｔ−Ｓ−ＣＨ_２−、Ａｃｔ−Ｎ（Ｒ^Ｈ）−ＣＨ_２−を表し、もう一方のＱおよ
びＱ^＊、好ましくはＱは、水素、アジド、ハロゲン、シアノ、ニトロ、ヒドロキ
シ、Ｐｒｏｔ−Ｏ−、メルカプト、Ｐｒｏｔ−Ｓ−、Ｃ_１−６−アルキルチオ、
アミノ、Ｐｒｏｔ−Ｎ（Ｒ^Ｈ）−、モノ−またはジ（Ｃ_１−６−アルキル）アミ
ノ、随意に置換されたＣ_１−６−アルコキシ、随意に置換されたＣ_１−６−アル
キル、随意に置換されたＣ_２−６−アルケニル、随意に置換されたＣ_２−６−ア
ルケニロキシ、随意に置換されたＣ_２−６−アルキニル、随意に置換されたアル
キニロキシ、一リン酸塩、二リン酸塩、三リン酸塩、ＤＮＡインタカレータ、光
化学活性基、熱化学活性基、キレート基、レポータ基、リガンド、カルボキシ、
スルホノ、ヒドロキシメチル、Ｐｒｏｔ−Ｏ−ＣＨ_２−、アミノメチル、Ｐｒｏ
ｔ−Ｎ（Ｒ^Ｈ）−ＣＨ_２−、カルボキシメチル、スルホノメチルを示し、Ｒ^Ｈは
水素およびＣ_１−６−アルキルから選択される。

【０１８０】 上述した場合には、基Ｐｒｏｔは−ＯＨ、−ＳＨおよび−ＮＨ（Ｒ^Ｈ）それぞ
れの保護基を示す。しかし、安定した可逆性の保護基の必要性を考慮して、この
ような保護基は、ヒドロキシ保護基、メルカプト保護基およびアミノ保護基につ
いてそれぞれ上で定義した保護基から選択される。だが、−ＯＨの保護基は、ジ
メトキシトリチル（ＤＭＴ）、モノメトキシトリチル（ＭＭＴ）など随意に置換
されたトリチル、トリチル、９−（９−フェニル）キサンテニル（ピキシル）、
随意に置換されたテトラヒドロピラニル（ｔｈｐ）（ホスホラミダイトオリゴヌ
クレオチド合成にさらに適したヒドロキシ保護基は、Ａｇｒａｗａｌ編「オリゴ
ヌクレオチド接合体の手順（Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｆｏｒ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌ
ｅｏｔｉｄｅ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ）」；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ｖｏｌ．２６， Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，
Ｔｏｔａｗａ， ＮＪ（１９９４）ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｆｏｒ Ｏｌ
ｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ａｎａｌｏｇｓ， ｖｏｌ．２０，
（Ｓｕｄｈｉｒ Ａｇｒａｗａｌ編）， Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， １９９
３， Ｔｏｔａｗａ， ＮＪに記載されている）から選択されるか、アセタール
として保護されること；−ＳＨの保護基は、ジメトキシトリチル（ＤＭＴ）、モ
ノメトキシトリチル（ＭＭＴ）などのトリチルおよびトリチル、９−（９−フェ
ニル）キサンテニル（ピキシル）、随意に置換されたテトラヒドロピラニル（ｔ
ｈｐ）から選択されること（ホスホラミダイトオリゴヌクレオチド合成にさらに
適したメルカプト保護基は、Ａｇｒａｗａｌにも述べられている（上記参照））
；および−ＮＨ（Ｒ^Ｈ）の保護基は、ジメトキシトリチル（ＤＭＴ）、モノメト
キシトリチル（ＭＭＴ）などのトリチルおよびトリチル、９−（９−フェニル）
キサンテニル（ピキシル）、随意に置換されたテトラヒドロピラニル（ｔｈｐ）
から選択されること（ホスホラミダイトオリゴヌクレオチド合成にさらに適した
アミノ保護基は、Ａｇｒａｗａｌにも述べられている（上記参照））が好ましい
。

【０１８１】 上記において、ここで定義したモノマーＬＮＡについてと同様に、Ａｃｔは−
ＯＨ、−ＳＨ、および−ＮＨ（Ｒ^Ｈ）それぞれの活性基を示す。このような活性
基はたとえば、随意に置換されたＯ−ホスホラミダイト、随意に置換されたＯ−
ホスホトリエステル、随意に置換されたＯ−ホスホジエステル、随意に置換され
たＨ−リン酸塩、随意に置換されたＯ−リン酸塩から選択される。

【０１８２】 ここで、「ホスホラミダイト」という語は、式−Ｐ−（ＯＲ^Ｘ）Ｎ（Ｒ^ｙ）_２ の基を意味し、ここでＲ^Ｘは、たとえばメチル、２−シアノエチル、またはベン
ジルなどの随意に置換されたアルキル基を示し、Ｒ^ｙはそれぞれ、たとえばエチ
ルまたはイソプロピルなどの随意に置換されたアルキル基を示すか、基−Ｎ（Ｒ ^ｙ ）_２はモルホリン基（−Ｎ（ＣＨ_２ＣＨ_２）_２Ｏ）を形成する。Ｒ^Ｘは好まし
くは２−シアノエチルを示し、２個のＲ^ｙは好ましくは同一であり、イソプロピ
ルを示す。したがって、特に適切なホスホラミダイトは、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピ
ル−Ｏ−（２−シアノエチル）ホスホラミダイトである。

【０１８３】 １個のモノマーＬＮＡまたは複数のモノマーＬＮＡについて本明細書で使用す
る保護基は、このＬＮＡがオリゴマーに含まれる場合、官能基が同時に、または
連続的に脱保護されるように選択できる。後者の状況は、ＤＮＡインタカレータ
、光化学活性基、熱化学活性基、キレート基、レポータ基およびリガンドなどの
、１個または複数の「活性／官能」基を、このような基が上述したようにスペー
サによって結合できる場合に、位置選択的に導入される可能性を広げる。

【０１８４】 好ましい実施態様において、Ｑは水素、アジド、ハロゲン、シアノ、ニトロ、
ヒドロキシ、Ｐｒｏｔ−Ｏ−、メルカプト、Ｐｒｏｔ−Ｓ−、Ｃ_１−６−アルキ
ルチオ、アミノ、Ｐｒｏｔ−Ｎ（Ｒ^Ｈ）−、モノ−またはジ（Ｃ_１−６−アルキ
ル）アミノ、随意に置換されたＣ_１−６−アルコキシ、随意に置換されたＣ_{１− ６} −アルキル、随意に置換されたＣ_２−６−アルケニル、随意に置換されたＣ_{２ −６} −アルケニロキシ、随意に置換されたＣ_２−６−アルキニル、随意に置換さ
れたＣ_２−６−アルキニロキシ、一リン酸塩、二リン酸塩、三リン酸塩、ＤＮＡ
インタカレータ、光化学活性基、熱化学活性基、キレート基、レポータ基、リガ
ンド、カルボキシ、スルホノ、ヒドロキシメチル、Ｐｒｏｔ−Ｏ−ＣＨ_２−、ア
ミノメチル、Ｐｒｏｔ−Ｎ（Ｒ^Ｈ）−ＣＨ_２−、カルボキシメチル、スルホノメ
チルから選択され、Ｐｒｏｔは−ＯＨ、−ＳＨおよび−ＮＨ（Ｒ^Ｈ）それぞれの
保護基であり、Ｒ^Ｈは水素およびＣ_１−６−アルキルから選択される；そしてＱ ^＊ は、水素、アジド、ハロゲン、シアノ、ニトロ、ヒドロキシ、Ａｃｔ−Ｏ−、
メルカプト、Ａｃｔ−Ｓ−、Ｃ_１−６−アルキルチオ、アミノ、Ａｃｔ−Ｎ（Ｒ ^Ｈ ）−、モノ−またはジ（Ｃ_１−６−アルキル）アミノ、随意に置換されたＣ_{１ −６} −アルコキシ、随意に置換されたＣ_１−６−アルキル、随意に置換されたＣ _２−６ −アルケニル、随意に置換されたＣ_２−６−アルケニロキシ、随意に置換
されたＣ_２−６−アルキニル、随意に置換されたＣ_２−６−アルキニロキシ、Ｄ
ＮＡインタカレータ、光化学活性基、熱化学活性基、キレート基、レポータ基、
リガンド、カルボキシ、スルホノ、ヒドロキシメチル、Ａｃｔ−Ｏ−ＣＨ_２−、
アミノメチル、Ａｃｔ−Ｎ（Ｒ^Ｈ）−ＣＨ_２−から選択され、Ａｃｔは−ＯＨ、
−ＳＨおよび−ＮＨ（Ｒ^Ｈ）それぞれの保護基であり、Ｒ^Ｈは水素およびＣ_{１− ６} −アルキルから選択される。

【０１８５】 一般式ＩＩのモノマーＬＮＡは、オリゴマーに含まれるＬＮＡと同様に、各種
の立体異性体を表す。したがって、オリゴマーに含まれるＬＮＡについて上で述
べた立体化学変形は、モノマーＬＮＡの場合にも等しく適用できると考えられる
（しかし、そのときＰをＱに代えることに注意する必要がある）。

【０１８６】 好ましい実施態様において、モノマーＬＮＡの一般式はＩＩａである：

【０１８７】

【化８】

【０１８８】 ここで置換基は、上のように定義される。

【０１８９】 さらにビラジカルＲ^＊などの置換基の定義に関して、本発明に関するオリゴマ
ーについて上で定義されたのと同じ好ましい実施態様が、モノマーＬＮＡの場合
にも適用される。

【０１９０】 モノマーＬＮＡの特に興味深い実施態様において、Ｂは核塩基、好ましくはチ
ミン、シトシン、ウラシル、アデニンおよびグアニン（特にアデニンおよびグア
ニン）から選択される核塩基を示し、Ｘは−Ｏ−、Ｒ^２＊およびＲ^４＊はともに
、−（ＣＨ_２）_０−１−Ｏ−（ＣＨ_２）_１−３−、−（ＣＨ_２）_０−１−Ｓ−（
ＣＨ_２）_１−３−および−（ＣＨ_２）_０−１−Ｎ（Ｒ^Ｎ）−（ＣＨ_２）_１−３−
、特に−Ｏ−ＣＨ_２−、−Ｓ−ＣＨ_２−および−Ｒ^Ｎ−ＣＨ_２−から選択される
ビラジカルを示し、Ｒ^Ｎは水素およびＣ_１−４アルキルから選択され、ＱはＰｒ
ｏｔ−Ｏ−を示し、Ｒ^３＊はＡｃｔ−ＯＨを示すＱ^＊であり、Ｒ^１＊、Ｒ^２、Ｒ ^３ 、Ｒ^５およびＲ^５＊はそれぞれ水素を示す。本実施態様において、Ｒ^ＮはＤＮ
Ａインタカレータ、光化学活性基、熱化学活性基、キレート基、レポータ基およ
びリガンドから選択してもよい。

【０１９１】 モノマーＬＮＡのさらに特に興味深い実施態様において、Ｂは核塩基、好まし
くはチミン、シトシン、ウラシル、アデニンおよびグアニン（特にアデニンおよ
びグアニン）から選択される核塩基を示し、Ｘは−Ｏ−、Ｒ^２＊およびＲ^４＊は
ともに、−（ＣＨ_２）_０−１−Ｏ−（ＣＨ_２）_１−３−、−（ＣＨ_２）_０−１−
Ｓ−（ＣＨ_２）_１−３−および−（ＣＨ_２）_０−１−Ｎ（Ｒ^Ｎ）−（ＣＨ_２）_{１ −３} −、特に−Ｏ−ＣＨ_２−、−Ｓ−ＣＨ_２−および−Ｒ^Ｎ−ＣＨ_２−から選択
されるビラジカルを示し、Ｒ^Ｎは水素およびＣ_１−４アルキルから選択され、Ｑ
はヒドロキシ、メルカプト、Ｃ_１−６−アルキルチオ、アミノ、モノ−またはジ
（Ｃ_１−６−アルキル）アミノ、随意に置換されたＣ_１−６−アルコキシ、随意
に置換されたＣ_２−６−アルケニロキシ、随意に置換されたＣ_２−６−アルキニ
ロキシ、一リン酸塩、二リン酸塩および三リン酸塩より選択され、Ｒ^３＊は水素
、アジド、ハロゲン、シアノ、ニトロ、ヒドロキシ、メルカプト、Ｃ_１−６−ア
ルキルチオ、アミノ、モノ−またはジ（Ｃ_１−６−アルキル）アミノ、随意に置
換されたＣ_１−６−アルコキシ、随意に置換されたＣ_１−６−アルキル、随意に
置換されたＣ_２−６−アルケニル、随意に置換されたＣ_２−６−アルケニロキシ
、随意に置換されたＣ_２−６−アルキニル、および随意に置換されたＣ_２−６−
アルキニロキシより選択されるＱ^＊であり、Ｒ^３は水素、随意に置換されたＣ_{１ −６} −アルキル、随意に置換されたＣ_２−６−アルケニルおよび随意に置換され
たＣ_２−６−アルキニルより選択され、Ｒ^１＊、Ｒ^２、Ｒ^５およびＲ^５＊はそれ
ぞれ水素を示す。またここで、Ｒ^ＮもＤＮＡインタカレータ、光化学活性基、熱
化学活性基、キレート基、レポータ基およびリガンドから選択してもよい。

【０１９２】 本発明のモノマーＬＮＡのさらに特に興味深い実施態様において、Ｂは核塩基
を示し、Ｘは−Ｏ−であり、Ｒ^２およびＲ^３はともに、−（ＣＨ_２）_０−１−Ｏ
−ＣＨ＝ＣＨ−、−（ＣＨ_２）_０−１−Ｓ−ＣＨ＝ＣＨ−および−（ＣＨ_２）_{０ −１} −Ｎ（Ｒ^Ｎ）−ＣＨ＝ＣＨ−から選択されるビラジカルを示し、Ｒ^Ｎは水素
およびＣ_１−４アルキルから選択され、Ｑはヒドロキシ、メルカプト、Ｃ_１−６ −アルキルチオ、アミノ、モノ−またはジ（Ｃ_１−６−アルキル）アミノ、随意
に置換されたＣ_１−６−アルコキシ、随意に置換されたＣ_２−６−アルケニロキ
シ、随意に置換されたＣ_２−６−アルキニロキシ、一リン酸塩、二リン酸塩およ
び三リン酸塩より選択され、Ｒ^３＊は水素、アジド、ハロゲン、シアノ、ニトロ
、ヒドロキシ、メルカプト、Ｃ_１−６−アルキルチオ、アミノ、モノ−またはジ
（Ｃ_１−６−アルキル）アミノ、随意に置換されたＣ_１−６−アルコキシ、随意
に置換されたＣ_１−６−アルキル、随意に置換されたＣ_２−６−アルケニル、随
意に置換されたＣ_２−６−アルケニロキシ、随意に置換されたＣ_２−６−アルキ
ニル、および随意に置換されたＣ_２−６−アルキニロキシより選択されるＱ^＊で
あり、Ｒ^１＊、Ｒ^２＊、Ｒ^４＊、Ｒ^５およびＲ^５＊はそれぞれ水素を示す。

【０１９３】 特に興味深い実施態様において、一般式Ｉａの１個以上のＬＮＡより成るオリ
ゴマー

【０１９４】

【化９】

【０１９５】 ここでＸは−Ｏ−であり、Ｂは核塩基、ＤＮＡインタカレータ、光化学活性基
、熱化学活性基、キレート基、レポータ基およびリガンドから選択され；Ｐは、
随意に置換基Ｒ^５を含むヌクレオシド間結合または５’−末端基などの、次のモ
ノマーへのヌクレオシド間結合または５’−末端基のラジカル位置を示し；Ｒ^{３ ＊} は、前のモノマーへのヌクレオシド間結合または３’−末端基を示す基Ｐ^＊で
あり；Ｒ^２＊およびＲ^４＊はともに、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｎ（Ｒ^＊）−、−（Ｃ
Ｒ^＊Ｒ^＊）_{ｒ＋ｓ＋１}−、−（ＣＲ^＊Ｒ^＊）_ｒ−Ｏ−（ＣＲ^＊Ｒ^＊）_ｓ−、−（
ＣＲ^＊Ｒ^＊）_ｒ−Ｓ−（ＣＲ^＊Ｒ^＊）_ｓ−、−（ＣＲ^＊Ｒ^＊）_ｒ−Ｎ（Ｒ^＊）−
（ＣＲ^＊Ｒ^＊）_ｓ−、−Ｏ−（ＣＲ^＊Ｒ^＊）_ｒ＋ｓ−Ｏ−、−Ｓ−（ＣＲ^＊Ｒ^＊ ）_ｒ＋ｓ−Ｏ−、−Ｏ−（ＣＲ^＊Ｒ^＊）_ｒ＋ｓ−Ｓ−、−Ｎ（Ｒ^＊）−（ＣＲ^＊ Ｒ^＊）_ｒ＋ｓ−Ｏ−、−Ｏ−（ＣＲ^＊Ｒ^＊）_ｒ＋ｓ−Ｎ（Ｒ^＊）−、−Ｓ−（Ｃ
Ｒ^＊Ｒ^＊）_ｒ＋ｓ−Ｓ−、−Ｎ（Ｒ^＊）−（ＣＲ^＊Ｒ^＊）_ｒ＋ｓ−Ｎ（Ｒ^＊）−
、−Ｎ（Ｒ^＊）−（ＣＲ^＊Ｒ^＊）_ｒ＋ｓ−Ｓ−および−Ｓ−（ＣＲ^＊Ｒ^＊）_{ｒ＋ ｓ} −Ｎ（Ｒ^＊）−から選択されるビラジカルを示し；ここでＲ^＊はそれぞれ、水
素、ハロゲン、アジド、シアノ、ニトロ、ヒドロキシ、メルカプト、アミノ、モ
ノ−またはジ（Ｃ_１−６−アルキル）アミノ、随意に置換されたＣ_１−６−アル
コキシ、随意に置換されたＣ_１−６−アルキル、ＤＮＡインタカレータ、光化学
活性基、熱化学活性基、キレート基、レポータ基、リガンドより個別に選択され
、および／または、２個の隣接（非ジェミナル）Ｒ^＊はともに二重結合を示すこ
とがあり、ｒおよびｓはそれぞれ、合計ｒ＋ｓが１〜４という条件で、それぞれ
０〜３であり；置換基Ｒ^１＊、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^５およびＲ^５＊はそれぞれ、水素
、随意に置換されたＣ_１−６−アルキル、随意に置換されたＣ_２−６−アルケニ
ル、ヒドロキシ、Ｃ_１−６−アルコキシ、Ｃ_２−６−アルケニロキシ、カルボキ
シ、Ｃ_１−６−アルコキシカルボニル、Ｃ_１−６−アルキルカルボニル、ホルミ
ル、アミノ、モノ−およびジ（Ｃ_１−６−アルキル）アミノ、カルバモイル、モ
ノ−およびジ（Ｃ_１−６−アルキル）−アミノ−カルボニル、Ｃ_１−６−アルキ
ル−カルボニルアミノ、カルバミド、アジド、Ｃ_１−６−アルカノイロキシ、ス
ルホノ、スルファニル、Ｃ_１−６−アルキルチオ、ＤＮＡインタカレータ、光化
学活性基、熱化学活性基、キレート基、レポータ基およびリガンド、およびハロ
ゲンから個別に選択され、ここで２個のジェミナル置換基はともにオキソ；塩基
性塩およびその酸添加塩を示す。特に１個のＲ^＊は、水素、ヒドロキシ、随意に
選択されたＣ_１−６−アルコキシ、随意に置換されたＣ_１−６−アルキル、ＤＮ
Ａインタカレータ、光化学活性基、熱化学活性基、キレート基、レポータ基およ
びリガンドから選択され、残りの置換基Ｒ^＊は水素である。特に、ビラジカルは
−Ｏ−、−（ＣＨ_２）_０−１−Ｏ−（ＣＨ_２）_１−３−、−（ＣＨ_２）_０−１−
Ｓ−（ＣＨ_２）_１−３−、−（ＣＨ_２）_０−１−Ｎ（Ｒ^Ｎ）−（ＣＨ_２）_１−３ −および−（ＣＨ_２）_２−４−より選択される。

【０１９６】 さらに特に興味深い実施態様において、本発明は一般式ＩＩａの
ＬＮＡに関連する：

【０１９７】

【化１０】

【０１９８】 Ｘは−Ｏ−であり、Ｂは核塩基、ＤＮＡインタカレータ、光化学活性基、熱化
学活性基、キレート基、レポータ基およびリガンドから選択され；Ｒ^３＊はＱ^＊ であり；ＱおよびＱ^＊はそれぞれ、水素、アジド、ハロゲン、シアノ、ニトロ、
ヒドロキシ、Ｐｒｏｔ−Ｏ−、Ａｃｔ−Ｏ−、メルカプト、Ｐｒｏｔ−Ｓ−、Ａ
ｃｔ−Ｓ−、Ｃ_１−６−アルキルチオ、アミノ、Ｐｒｏｔ−Ｎ（Ｒ^Ｈ）−、Ａｃ
ｔ−Ｎ（Ｒ^Ｈ）−、モノ−またはジ（Ｃ_１−６−アルキル）アミノ、随意に置換
されたＣ_１−６−アルコキシ、随意に置換されたＣ_１−６−アルキル、随意に置
換されたＣ_２−６−アルケニル、随意に置換されたＣ_２−６−アルケニロキシ、
随意に置換されたＣ_２−６−アルキニル、随意に置換されたＣ_２−６−アルキニ
ロキシ、一リン酸塩、ニリン酸塩、三リン酸塩、ＤＮＡインタカレータ、光化学
活性基、熱化学活性基、キレート基、レポータ基、リガンド、カルボキシ、スル
ホノ、ヒドロキシメチル、Ｐｒｏｔ−Ｏ−ＣＨ_２−、Ａｃｔ−Ｏ−ＣＨ_２−、ア
ミノメチル、Ｐｒｏｔ−Ｎ（Ｒ^Ｈ）−ＣＨ_２−、Ａｃｔ−Ｎ（Ｒ^Ｈ）−ＣＨ_２−
、カルボキシメチル、スルホノメチルから個別に選択され、ここでＰｒｏｔは−
ＯＨ、−ＳＨおよび−ＮＨ（Ｒ^Ｈ）それぞれの保護基であり、Ａｃｔは−ＯＨ、
−ＳＨおよび−ＮＨ（Ｒ^Ｈ）それぞれの活性基であり、Ｒ^Ｈは水素およびＣ_{１− ６} −アルキルより選択され；Ｒ^２＊およびＲ^４＊はともに、−Ｏ−、−Ｓ−、−
Ｎ（Ｒ^＊）−、−（ＣＲ^＊Ｒ^＊）_{ｒ＋ｓ＋１}−、−（ＣＲ^＊Ｒ^＊）_ｒ−Ｏ−（Ｃ
Ｒ^＊Ｒ^＊）_ｓ−、−（ＣＲ^＊Ｒ^＊）_ｒ−Ｓ−（ＣＲ^＊Ｒ^＊）_ｓ−、−（ＣＲ^＊Ｒ ^＊ ）_ｒ−Ｎ（Ｒ^＊）−（ＣＲ^＊Ｒ^＊）_ｓ−、−Ｏ−（ＣＲ^＊Ｒ^＊）_ｒ＋ｓ−Ｏ−
、−Ｓ−（ＣＲ^＊Ｒ^＊）_ｒ＋ｓ−Ｏ−、−Ｏ−（ＣＲ^＊Ｒ^＊）_ｒ＋ｓ−Ｓ−、−
Ｎ（Ｒ^＊）−（ＣＲ^＊Ｒ^＊）_ｒ＋ｓ−Ｏ−、−Ｏ−（ＣＲ^＊Ｒ^＊）_ｒ＋ｓ−Ｎ（
Ｒ^＊）−、−Ｓ−（ＣＲ^＊Ｒ^＊）_ｒ＋ｓ−Ｓ−、−Ｎ（Ｒ^＊）−（ＣＲ^＊Ｒ^＊） _ｒ＋ｓ −Ｎ（Ｒ^＊）−、−Ｎ（Ｒ^＊）−（ＣＲ^＊Ｒ^＊）_ｒ＋ｓ−Ｓ−および−Ｓ
−（ＣＲ^＊Ｒ^＊）_ｒ＋ｓ−Ｎ（Ｒ^＊）−から選択されるビラジカルを示し；ここ
でＲ^＊はそれぞれ、水素、ハロゲン、アジド、シアノ、ニトロ、ヒドロキシ、メ
ルカプト、アミノ、モノ−またはジ（Ｃ_１−６−アルキル）アミノ、随意に置換
されたＣ_１−６−アルコキシ、随意に置換されたＣ_１−６−アルキル、ＤＮＡイ
ンタカレータ、光化学活性基、熱化学活性基、キレート基、レポータ基、リガン
ドより個別に選択され、２個の隣接（非ジェミナル）Ｒ^＊はともに二重結合を示
すことがあり、ｒおよびｓはそれぞれ、合計ｒ＋ｓが１〜４という条件で、それ
ぞれ０〜３であり；置換基Ｒ^１＊、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^５およびＲ^５＊はそれぞれ、
水素、随意に置換されたＣ_１−６−アルキル、随意に置換されたＣ_２−６−アル
ケニル、ヒドロキシ、Ｃ_１−６−アルコキシ、Ｃ_２−６−アルケニロキシ、カル
ボキシ、Ｃ_１−６−アルコキシカルボニル、Ｃ_１−６−アルキルカルボニル、ホ
ルミル、アミノ、モノ−およびジ（Ｃ_１−６−アルキル）アミノ、カルバモイル
、モノ−およびジ（Ｃ_１−６−アルキル）−アミノ−カルボニル、Ｃ_１−６−ア
ルキル−カルボニルアミノ、カルバミド、アジド、Ｃ_１−６−アルカノイロキシ
、スルホノ、スルファニル、Ｃ_１−６−アルキルチオ、ＤＮＡインタカレータ、
光化学活性基、熱化学活性基、キレート基、レポータ基およびリガンド、および
ハロゲンから個別に選択され、ここで２個のジェミナル置換基はともにオキソ；
塩基性塩およびその酸添加塩を示し；そして、オリゴヌクレオチド合成において
有効な条件下で反応性である化学基（各塩基を含む）が、随意に保護された官能
基であるという条件である。１個のＲ^＊は、水素、ヒドロキシ、随意に選択され
たＣ_１−６−アルコキシ、随意に置換されたＣ_１−６−アルキル、ＤＮＡインタ
カレータ、光化学活性基、熱化学活性基、キレート基、レポータ基およびリガン
ドから選択され、残りの置換基Ｒ^＊は水素であることが好ましい。特に、ビラジ
カルは−Ｏ−、−（ＣＨ_２）_０−１−Ｏ−（ＣＨ_２）_１−３−、−（ＣＨ_２）_{０ −１} −Ｓ−（ＣＨ_２）_１−３−、−（ＣＨ_２）_０−１−Ｎ（Ｒ^Ｎ）−（ＣＨ_２） _１−３ −および−（ＣＨ_２）_２−４−より選択される。

【０１９９】 定義 ここで、「Ｃ_１−１２−アルキル」という語は、メチル、エチル、プロピル、
イソプロピル、シクロプロピル、ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、イソブチル、シク
ロブチル、ペンチル、シクロペンチル、ヘキシル、シクロヘキシルおよびドデシ
ルなどの、１〜１２個の炭素原子を持つ直鎖、環式または分岐炭化水素基を意味
する。同様に「Ｃ_１−６−アルキル」という語は、メチル、エチル、プロピル、
イソプロピル、ペンチル、シクロペンチル、ヘキシル、シクロヘキシルなどの、
１〜６個の炭素原子を持つ直鎖、環式または分岐炭化水素基を意味し、「Ｃ_{１− ４} アルキル」という語は、たとえばメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、
シクロプロピル、ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、シクロブチルなどの
、１〜４個の炭素原子を持つ直鎖、環式または分岐炭化水素基を対象とするもの
である。

【０２００】 「Ｃ_１−６−アルキル」の好ましい例は、メチル、エチル、プロピル、イソプ
ロピル、ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、イソブチル、ペンチル、シクロペンチル、
ヘキシル、シクロヘキシル、特にメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ｔ
ｅｒｔ−ブチル、イソブチルおよびシクロヘキシルである。「Ｃ_１−４アルキル
」の好ましい例は、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、ｔｅｒ
ｔ−ブチルおよびイソブチルである。

【０２０１】 同様に、「Ｃ_２−１２−アルケニル」という語は、２〜１２個の炭素原子を持
ち、１個の不飽和結合を含む直鎖、環式または分岐炭化水素基を意味する。アル
ケニル基の例は、ビニル、アリル、ブテニル、ペンテニル、へキセニル、ヘプテ
ニル、オクテニル、ドデカエニルである。同様に、「Ｃ_２−６−アルケニル」と
いう語は、２〜６個の炭素原子を持ち、１個の不飽和結合を含む直鎖、環式また
は分岐炭化水素基を意味する。アルケニルの好ましい例はビニル、アリル、ブテ
ニル、特にアリルである。

【０２０２】 同様に、「Ｃ_２−１２−アルキニル」という語は、２〜１２個の炭素原子を持
ち、１個の三重結合を含む直鎖、環式または分岐炭化水素基を意味する。その例
はエチニル、プロピニル、ブチニル、オクチニルおよびドデカニルである。

【０２０３】 ここで、すなわち「アルキル」、「アルケニル」および「アルキニル」という
語に関連して、「随意に置換された」という語は、問題の基が１回または数回、
好ましくは１〜３回、ヒドロキシ（不飽和炭素原子に結合した場合、互変異性ケ
ト型で存在する）、Ｃ_１−６−アルコキシ（すなわちＣ_１−６−アルキル−オキ
シ）、Ｃ_２−６−アルケニロキシ、カルボキシ、オキソ（ケトまたはアルデヒド
官能基を形成）、Ｃ_１−６−アルコキシカルボニル、Ｃ_１−６−アルキルカルボ
ニル、ホルミル、アリル、アリロキシカルボニル、アリロキシ、アリルカルボニ
ル、ヘテロアリル、ヘテロアリロキシカルボニル、ヘテロアリロキシ、ヘテロア
リルカルボニル、アミノ、モノ−およびジ（Ｃ_１−６−アルキル）アミノ；カル
バモイル、モノ−およびジ（Ｃ_１−６−アルキル）アミノカルボニル、アミノ−
Ｃ_１−６−アルキル−アミノカルボニル、モノ−およびジ（Ｃ_１−６−アルキル
）アミノ−Ｃ_１−６−アルキル−アミノカルボニル、Ｃ_１−６−アルキルカルボ
ニルアミノ、シアノ、グアニジノ、カルバミド、Ｃ_１−６−アルカノイロキシ、
スルホノ、Ｃ_１−６−アルキルスルホニロキシ、ニトロ、スルファニル、Ｃ_{１− ６} −アルキルチオ、ハロゲンから選択される基と置換され、アリルおよびヘテロ
アリルは、「随意に置換されたアリルおよびヘテロアリル」について以下で詳細
に述べるように置換される場合もある。

【０２０４】 好ましくは、置換基はヒドロキシ、Ｃ_１−６−アルコキシ、カルボキシ、Ｃ_{１ −６} −アルコキシカルボニル、Ｃ_１−６−アルキルカルボニル、ホルミル、アリ
ル、アリロキシカルボニル、アリルカルボニル、ヘテロアリル、アミノ、モノ−
およびジ（Ｃ_１−６−アルキル）アミノ、カルバモイル、モノ−およびジ（Ｃ_{１ −６} −アルキル）アミノカルボニル、アミノ−Ｃ_１−６−アルキル−アミノカル
ボニル、モノ−およびジ（Ｃ_１−６−アルキル）アミノ−Ｃ_１−６−アルキル−
アミノカルボニル、Ｃ_１−６−アルキルカルボニルアミノ、シアノ、カルバミド
、ハロゲンより選択され、アリルおよびヘテロアリルは１〜５回、好ましくは１
〜３回、Ｃ_１−４−アルキル、Ｃ_１−４−アルコキシ、ニトロ、シアノ、アミノ
またはハロゲンに置換される。特に好ましい例は、ヒドロキシ、Ｃ_１−６−アル
コキシ、カルボキシ、アリル、ヘテロアリル、アミノ、モノ−およびジ（Ｃ_{１− ６} −アルキル）アミノおよびハロゲンであり、ここでアリルおよびヘテロアリル
は１〜３回、Ｃ_１−４アルキル、Ｃ_１−４−アルコキシ、ニトロ、シアノ、アミ
ノまたはハロゲンによって置換される。

【０２０５】 ここで、「アリル」という語は、フェニル、ナフチル、１，２，３，４−テト
ラヒドロナフチル、アントラシル、フェナントラシル、ピレニル、ベンゾピレニ
ル、フルオレニル、およびキサンテニルなどの完全または部分的な芳香炭素環ま
たは環系を意味し、そのうちフェニルが好ましい実施例である。

【０２０６】 「ヘテロアリル」という語は、１個以上の炭素原子が、たとえば窒素（＝Ｎ−
または−ＮＨ）、硫黄および／または酸素原子などのヘテロ原子と置換されてい
る完全または部分的な芳香炭素環または環系を意味する。このようなヘテロアリ
ル基の例は、オキサゾリル、イソキサゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル、ピ
ロリル、イミダゾリル、ピラゾリル、ピリジニル、ピラジニル、ピリダジニル、
ピペリジニル、クマリル、フリル、キノリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾトリア
ゾリル、ベンゾジアゾリル、ベンゾオキゾリル、フタラジニル、フタラニル、ト
リアゾリル、テトラゾリル、イソキノリル、アクリジニル、カルバゾリル、ジベ
ンザゼピニル、インドリル、ベンゾピラゾイル、フェノキザゾニルである。

【０２０７】 ここで、すなわち「アリル」および「ヘテロアリル」という語に関連して、「
随意に置換された」という語は、問題の基が１回または数回、好ましくは１〜５
回、特に１〜３回、ヒドロキシ（エノール系に存在する場合、互変異性ケト型で
存在する）、Ｃ_１−６−アルキル、Ｃ_１−６−アルコキシ、オキソ（互変異性エ
ノール型で表される）、カルボキシ、Ｃ_１−６−アルコキシカルボニル、Ｃ_{１− ６} −アルキルカルボニル、ホルミル、アリル、アリロキシ、アリロキシカルボニ
ル、アリルカルボニル、ヘテロアリル、アミノ、モノ−およびジ（Ｃ_１−６−ア
ルキル）アミノ；カルバモイル、モノ−およびジ（Ｃ_１−６−アルキル）アミノ
カルボニル、アミノ−Ｃ_１−６−アルキル−アミノカルボニル、モノ−およびジ
（Ｃ_１−６−アルキル）アミノ−Ｃ_１−６−アルキル−アミノカルボニル、Ｃ_{１ −６} −アルキルカルボニルアミノ、シアノ、グアニジノ、カルバミド、Ｃ_１−６ −アルカノイロキシ、スルホノ、Ｃ_１−６−アルキルスルホニロキシ、ニトロ、
スルファニル、ジハロゲン−Ｃ_１−４−アルキル、トリハロゲン−Ｃ_１−４−ア
ルキル、ハロゲンから選択される基と置換され、置換基を示すアリルおよびヘテ
ロアリルは、Ｃ_１−４−アルキル、Ｃ_１−４−アルコキシ、ニトロ、シアノ、ア
ミノまたはハロゲンによって１〜３回置換される。好ましい例は、ヒドロキシ、
Ｃ_１−６−アルキル、Ｃ_１−６−アルコキシ、カルボキシ、Ｃ_１−６−アルコキ
シ−カルボニル、Ｃ_１−６−アルキルカルボニル、アリル、アミノ、モノ−およ
びジ（Ｃ_１−６−アルキル）アミノ、ハロゲンであり、アリルはＣ_１−４−アル
キル、Ｃ_１−４−アルコキシ、ニトロ、シアノ、アミノまたはハロゲンによって
１〜３回置換される。

【０２０８】 「ハロゲン」は、フルオロ、クロロ、ブロモおよびヨードを含む。

【０２０９】 オリゴマー（ＬＮＡ修飾オリゴヌクレオチド）と、製薬的に許容可能な塩の、
その考えられる塩を含むＬＮＡは、特に適切であることを理解する必要がある。
塩は酸添加塩および塩基性塩を含む。酸添加塩の例は、塩酸塩、ナトリウム塩、
カルシウム塩、カリウム塩などである。塩基性塩の例は、（残りの）対イオンが
ナトリウムおよびカリウムなどのアルカリ金属、カルシウムなどのアルカリ土類
金属、アンモニウムイオン（^＋Ｎ（Ｒ^ｇ）_３Ｒ^ｈ、ここでＲ^ｇおよびＲ^ｈはそれ
ぞれ、随意に置換されたＣ_１−６−アルキル、随意に置換されたＣ_２−６−アル
ケニル、随意に置換されたアリル、または随意に置換されたヘテロアリル）から
選択される場合の塩である。製薬的に許容可能な塩はたとえば、レミントン製薬
科学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃ
ｅｓ）、１７版、Ａｌｆｏｎｓｏ Ｒ． Ｇｅｎｎａｒｏ（編）、Ｍａｃｋ Ｐ
ｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ、Ｕ．Ｓ．Ａ．、１
９８５、およびそれ以降の版、そして製薬技術事典（Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ
ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）に記載されて
いるものである。したがって、本明細書で使用する「酸添加塩またはその塩基性
塩」という語は、このような塩より成るものとする。さらにオリゴマーおよびＬ
ＮＡと同様に、その中間体または開始物質も水和物形で存在してもよい。

【０２１０】 実施例 本出願には具体的な実際の実施例は含まれていないが、適切な実施例は、ＷＯ ９６／２９４３１に詳細に記載された実施例であり、そこではＬＮＡ修飾オリ
ゴヌクレオチドを使用して得られた利点をさらに説明することができる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/566 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ Ｆ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ， ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，Ｋ Ｒ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ， ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，Ｓ Ｉ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 クリフォード・スミス イギリス国 エッチ・ピー23 ５ピー・ジ ー ハートフォードシャー トリング ハ ンターズ・クローズ 27 Ｆターム(参考） 4B024 AA11 CA04 CA11 HA12 HA14 4B063 QA17 QA19 QQ03 QQ08 QQ42 QQ52 QQ58 QR40 QR55 QR62 QS15 QS25 QS32 QS34 QX04

Claims (47)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 核酸分子の標的核酸配列または核酸分子の核酸配列中の突然変異
   を検出する方法であって、前記核酸配列または突然変異に関する直接的または間
   接的情報を得るために、 （ａ）核酸分子または、 （ｂ）核酸分子の一部または、 （ｃ）核酸分子の配列または１個以上の部分配列に対して相補性のオリゴヌクレ
   オチド、 を質量分析法によって分析し、ＬＮＡ修飾オリゴヌクレオチドを核酸分子にハイ
   ブリダイゼーションすることを含む方法。
2. 【請求項２】 ＬＮＡ修飾オリゴヌクレオチドが、対応する未修飾オリゴヌクレ
   オチドと比較して、核酸配列に対する実質的に同等かまたは高い特異性を備えて
   いる、請求項１に記載の方法。
3. 【請求項３】 ＬＮＡ修飾オリゴヌクレオチドが、対応する未修飾オリゴヌクレ
   オチドと比較して、核酸配列に対する実質的に同等または高い親和性を備えてい
   る、請求項１に記載の方法。
4. 【請求項４】 核酸分子がＤＮＡである、請求項１に記載の方法。
5. 【請求項５】 核酸分子がＲＮＡである、請求項１に記載の方法。
6. 【請求項６】 質量分析がマトリックス支援レーザー脱離／イオン化飛行時間型
   （ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）質量分析法、エレクトロスプレー（ＥＳ）質量分析法、
   イオンサイクロトロン共鳴（ＩＣＲ）質量分析法、フーリエ変換質量分析法、ま
   たはその組合せを利用する、先行する請求項のいずれかに記載の方法。
7. 【請求項７】 核酸分子にハイブリダイズされるＬＮＡ修飾オリゴヌクレオチド
   が、検出オリゴヌクレオチド、捕獲オリゴヌクレオチド、プライマー、拡張プラ
   イマー、連結抽出物および連結生成物から選択される、先行する請求項のいずれ
   かに記載の方法。
8. 【請求項８】 標的核酸配列または突然変異に関する情報を得るためにＬＮＡ修
   飾オリゴヌクレオチドを分析する、先行する請求項のいずれかに記載の方法。
9. 【請求項９】 質量分析法によって分析する核酸分子またはオリゴヌクレオチド
   を分析前に調整する、先行する請求項のいずれかに記載の方法。
10. 【請求項１０】 少なくとも１個の検出オリゴヌクレオチドがＬＮＡ修飾オリゴ
    ヌクレオチドである場合に、少なくとも２個の標的核酸配列を同時に検出および
    識別するために、少なくとも２個の検出ヌクレオチドまたは擬似オリゴヌクレオ
    チドを質量区別によってサンプル調整する、先行する請求項のいずれかに記載の
    方法。
11. 【請求項１１】 標的核酸配列がＤＮＡ指紋であるか、遺伝子病、染色体異常、
    遺伝子素因、ウィルス感染、真菌感染、細菌感染および原生生物感染より成る群
    より選択される疾病または症状で示される、請求項１に記載の方法。
12. 【請求項１２】 ａ）生体サンプルから核酸分子を得る工程と、 ｂ）核酸分子を担体に固定化し、固定化核酸分子を生成する工程と、 ｃ）固定化核酸分子を用いて検出オリゴヌクレオチドをハイブリダイズし、未ハ
    イブリダイズ検出オリゴヌクレオチドを除去する工程と、 ｄ）工程ｃ）の生成物をイオン化・気化する工程と、 ｅ）質量分析法によって検出オリゴヌクレオチドを検出する工程であって、検出
    オリゴヌクレオチドの検出が生体サンプル内の標的核酸配列の存在を示す工程、
    を含む生体サンプル内に存在する標的核酸配列を検出する、先行する請求項のい
    ずれかに記載の方法。
13. 【請求項１３】 検出オリゴヌクレオチドがＬＮＡ修飾オリゴヌクレオチドであ
    る、請求項１２に記載の方法。
14. 【請求項１４】 前記工程ｂ）において事前に担体に固定化された相補性捕獲核
    酸分子と、標的核酸配列上の相補性特異配列とのハイブリダイゼーションによっ
    て固定化を行う、請求項１２に記載の方法。
15. 【請求項１５】 相補性捕獲核酸分子がＬＮＡ修飾オリゴヌクレオチドであり、
    請求項１４に記載の方法。
16. 【請求項１６】 前記工程ｂ）において標的核酸配列を担体に直接結合して固定
    化を行う、請求項１２に記載の方法。
17. 【請求項１７】 前記工程ｂ）の前に標的核酸配列を増幅する、請求項１２に記
    載の方法。
18. 【請求項１８】 標的核酸配列を、クローニング、増幅に基づく転写、ポリメラ
    ーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＲＣ）および鎖置換増幅（ＳＤ
    Ａ）より成る群から選択される増幅手順によって増幅する、請求項１７に記載の
    方法。
19. 【請求項１９】 前記工程ｂ）において事前に担体に固定化され、一部が標的核
    酸配列とは異なる相補性捕獲核酸分子の配列群（アレイ）と、標的核酸分子との
    ハイブリダイゼーションによって固定化を行う、請求項１２に記載の方法。
20. 【請求項２０】 相補性捕獲核酸分子がオリゴヌクレオチドまたは擬似オリゴヌ
    クレオチドである、請求項１９に記載の方法。
21. 【請求項２１】 相補性捕獲核酸分子がＬＮＡ修飾オリゴヌクレオチドである、
    請求項２０に記載の方法。
22. 【請求項２２】 固定化が可逆的である、請求項１２に記載の方法。
23. 【請求項２３】 ａ）生体サンプルから標的核酸配列を含む核酸分子を得る工程
    と、 ｂ）適切な増幅手順を用いて標的核酸配列を増幅することによって、増幅標的核
    酸配列を得る工程と、 ｃ）検出オリゴヌクレオチドを核酸分子とハイブリダイズして、ハイブリダイズ
    されていない検出オリゴヌクレオチドを除去する工程と、 ｄ）工程ｃ）の生成物をイオン化・気化させる工程と、 ｅ）質量分析法によって検出オリゴヌクレオチドを検出する工程であって、検出
    オリゴヌクレオチドの検出が、生体サンプルに標的核酸配列の存在を示す工程 より成る、生体サンプル中に存在する標的核酸配列を検出する方法。
24. 【請求項２４】 検出オリゴヌクレオチドがＬＮＡ修飾オリゴヌクレオチドであ
    る、請求項２３に記載の方法。
25. 【請求項２５】 標的核酸をクローニング、増幅に基づく転写、ポリメラーゼ連
    鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＲＣ）および鎖置換増幅（ＳＤＡ）よ
    り成る群より選択される増幅手段によって増幅する、請求項２３に記載の方法。
26. 【請求項２６】 固定化標的核酸配列を作成するために、工程ｃ）の前に、増幅
    された標的核酸配列を担体に固定化する、請求項２３に記載の方法。
27. 【請求項２７】 事前に担体に固定化された相補性捕獲核酸分子と、標的核酸配
    列とのハイブリダイゼーションによって固定化を行う、請求項２６に記載の方法
    。
28. 【請求項２８】 相補性捕獲核酸分子がＬＮＡ修飾オリゴヌクレオチドである、
    請求項２７に記載の方法。
29. 【請求項２９】 固定化が可逆的である、請求項２６に記載の方法。
30. 【請求項３０】 ａ）生体サンプルから標的核酸配列を得る工程と、 ｂ）標的核酸配列を複製することによって、複製核酸分子を作成する工程と、 ｃ）１個以上の適切なヌクレアーゼを用いて複製核酸分子を特異的に消化するこ
    とによって、消化された断片を作成する工程と、 ｄ）固定化断片を作成するために、消化された断片を、相補性捕獲核酸配列を含
    む担体に固定化する工程と、 ｅ）質量分析法によって固定化断片を分析する工程であって、ハイブリダイゼー
    ションと固定化断片の分子量決定によって、標的核酸配列に関する情報が与えら
    れる工程、 を含む生体サンプル中に存在する標的核酸配列を検出する方法。
31. 【請求項３１】 相補性捕獲核酸配列がオリゴヌクレオチドまたは擬似オリゴヌ
    クレオチドである、請求項３０に記載の方法。
32. 【請求項３２】 相補性捕獲核酸分子がＬＮＡ修飾オリゴヌクレオチドであり、
    請求項３１に記載の方法。
33. 【請求項３３】 固定化が可逆的である、請求項３０に記載の方法。
34. 【請求項３４】 前記工程ａ）の後、質量変更デオキシヌクレオシドおよび／ま
    たはジデオキシヌクレオシド三リン酸およびＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを
    用いて、標的核酸配列をＤＮＡに複製する、請求項３０に記載の方法。
35. 【請求項３５】 質量変更デオキシリボヌクレオシドおよび／またはジデオキシ
    ヌクレオシド三リン酸がモノマーＬＮＡである、請求項３４に記載の方法。
36. 【請求項３６】 工程ａ）の後、質量変更リボヌクレオシドおよび／または３’
    −ジデオキシヌクレオシド三リン酸およびＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを用
    いて、標的核酸配列をＲＮＡに複製する、請求項３０に記載の方法。
37. 【請求項３７】 質量変更リボヌクレオシドおよび／または３’−デオキシヌク
    レオシド三リン酸がモノマーＬＮＡである、請求項３６に記載の方法。
38. 【請求項３８】 前記工程ａ）の後、質量変更デオキシヌクレオシドおよび／ま
    たはジデオキシヌクレオシド三リン酸およびＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを
    用いて、標的核酸をＤＮＡに複製する、請求項３０に記載の方法。
39. 【請求項３９】 質量変更デオキシリボヌクレオシドおよび／またはジデオキシ
    ヌクレオシド三リン酸がモノマーＬＮＡである、請求項３８に記載の方法。
40. 【請求項４０】 ａ）生体サンプルから標的核酸配列を含む核酸分子を得る工程
    と、 ｂ）標的核酸配列を１個以上のプライマーに接触させる工程であって、前記プラ
    イマーが標的核酸配列に対して３’末端塩基相補性を持つ工程と、 ｃ）工程ｂ）の生成物を適切なポリメラーゼ酵素と４個のヌクレオシド三リン酸
    のうち１つに連続して接触させる工程と、 ｄ）工程ｃ）の生成物をイオン化・気化する工程と、 ｅ）質量分析法によって工程ｄ）の生成物を検出する工程であって、生成物の分
    子量が、標的核酸配列内のプライマーの３’末端に隣接する突然変異の有無を示
    す工程、 を含む生体サンプル内に存在する標的核酸配列を検出する方法。
41. 【請求項４１】 プライマーがＬＮＡ修飾オリゴヌクレオチドである、請求項４
    ０に記載の方法。
42. 【請求項４２】 ａ）標的ヌクレオチドを含む核酸分子を得る工程と、 ｂ）固定化核酸分子を作成するために、核酸分子を担体に固定化する工程と、 ｃ）核酸分子に相補性のプライマーオリゴヌクレオチドを用いて、固定化核酸分
    子を標的ヌクレオチドの５’に接する部位でハイブリダイズする工程と、 ｄ）標的ヌクレオシドに対して相補性のジデオキシヌクレオシドまたは３’−デ
    オキシヌクレオシド三リン酸のみがプライマーに拡張されるように、工程ｃ）の
    生成物を、完全なセットのジデオキシヌクレオシドまたは３’−デオキシヌクレ
    オシド三リン酸およびＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼに接触させる工程と、 ｅ）工程ｄ）の生成物をイオン化・気化する工程と、 ｆ）標的ヌクレオチドの同一性を決定するために、質量分析法によって拡張プラ
    イマーを検出する工程より成る、生体サンプル内に存在する標的ヌクレオチドを
    検出する方法。
43. 【請求項４３】 拡張プライマーがＬＮＡ修飾オリゴヌクレオチドである、請求
    項４２に記載の方法。
44. 【請求項４４】 ａ）核酸分子を得る工程と、 ｂ）核酸分子をオリゴヌクレオチドプローブによってハイブリダイズすることに
    よって、突然変異部位のミスマッチを作成する工程と、 ｃ）工程ｂ）の生成物を単鎖特異性エンドヌクレアーゼに接触させる工程と； ｄ）工程ｃ）の生成物をイオン化・気化する工程と、 ｅ）質量分析法によって得られた生成物を検出する工程であって、２個以上の断
    片の存在によって、核酸分子が突然変異を含むことを示す工程、 を含む核酸分子内の突然変異を検出する方法。
45. 【請求項４５】 オリゴヌクレオチドプローブがＬＮＡ修飾オリゴヌクレオチド
    である、請求項４４に記載の方法。
46. 【請求項４６】 ａ）生体サンプルから標的核酸配列を含む核酸を得る工程と、
    ｂ）結合抽出物のセットおよび熱安定性ＤＮＡリガーゼを用いた標的核酸配列の
    １個以上のハイブリダイゼーションを実施することにより、結合生成物を作成す
    る工程と、 ｃ）工程ｂ）の生成物をイオン化・気化する工程と、 ｄ）質量分析法によって結合生成物を検出し、標的核酸配列を決定するために、
    得られた値を既知の値と比較する工程、 を含む生体サンプル内に存在する標的核酸配列を検出する方法。
47. 【請求項４７】 １個以上の結合抽出物がＬＮＡ修飾オリゴヌクレオチドである
    、請求項４６に記載の方法。