JP2002527059A - Modified polypeptides with reduced immune response - Google Patents

Modified polypeptides with reduced immune response

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Abstract

(57)【要約】 本発明は、他のアミノ酸残基により置換されている1又は複数のアミノ酸残基を有し、そして/又はポリペプチド金属結合部位近くに1又は複数のポリマー分子を結合している、低められたアレルゲン性を包含する低められた免疫応答を有するポリペプチド、本発明の修飾されたポリペプチドを調製するための方法、免疫原性及びアレルゲン性を低めるたへの前記ポリペプチドの使用、及び前記ポリペプチドを含んで成る組成物に関する。 (57) Abstract: The present invention has one or more amino acid residues have been substituted by another amino acid residue, and / or polypeptide binds one or more polymer molecules near the metal binding site and has, polypeptides with reduced immune response encompasses the lowered allergenicity, the polypeptide of the modified polypeptides of the present invention a method for preparing, the other to lower the immunogenicity and allergenicity the use of, and to compositions comprising said polypeptides.

Description

【発明の詳細な説明】 DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

【0001】 発明の分野: 本発明は、置換された1又は複数のアミノ酸残基を有し、そして/又はそのポリペプチドの三次元構造の表面上にカップリングされたポリマー分子を有するポリペプチド、本発明の修飾されたポリペプチドを調製するための方法、免疫原性及びアレルゲン性を低めるためへの前記修飾されたポリペプチドの使用、及び前記ポリペプチドを含んで成る組成物に関する。 [0001] Field of the Invention: The present invention has one or more amino acid residues are substituted, and / or polypeptide having the coupled polymer molecules on the surface of the three-dimensional structure of the polypeptide, methods for preparing modified polypeptides of the present invention, use of the modified polypeptide to for reducing the immunogenicity and allergenicity, and compositions comprising said polypeptide.

【0002】 発明の背景: 特定の生理学的効果を得るために、循環系へのポリペプチド、例えば酵素の使用は、医学業界においては良く知られている。 [0002] Background of the Invention: In order to obtain a particular physiological effect, polypeptide into the circulatory system, for example the use of enzymes are well known in the medical industry. さらに、産業用途、例えば洗濯洗浄、繊維漂白、パーソナルケアー、コンタクトレンズ洗浄、及び食品及び飼料調製の技術において、酵素は機能的成分として使用される。 Furthermore, industrial applications such laundry washing, textile bleaching, personal care, contact lens cleaning, and in food and feed preparation techniques, the enzyme is used as a functional component. 医薬用途と産業用途との間の重要な差異の1つは、後者のタイプの用途(すなわち、産業用途)に関しては、ポリペプチド(しばしば、酵素)は、身体の循環系中に侵入しないことである。 One of the key differences between pharmaceutical applications and industrial applications, the latter type of applications (i.e., industrial applications) with respect to the polypeptide (often enzymes), by not penetrate into the body's circulatory system is there.

【0003】 一定のポリペプチド及び酵素は、不満足な安定性を有し、そして一定の循環下で(すなわち、攻撃に依存して)、免疫応答、典型的には、IgG及び/又はIgE応答を引き起こすことができる。 [0003] Certain polypeptides and enzymes have an unsatisfactory stability, and under constant circulating (i.e., depending on the attack), immune response, typically an IgG and / or IgE response it can cause. ポリペプチドの安定性が改良され、そして免疫応答が、ポリペプチド、例えば酵素がポリマー分子に結合される場合、低められることが、今日、一般的に認識されている。 Improved stability of the polypeptide, and immune response, if a polypeptide, for example, an enzyme is bound to the polymer molecules, that is reduced is now commonly recognized. 低められた免疫応答は、結合されるポリマー分子による抗体形成を導く免疫応答を担当するポリペプチドの表面上のエピトープの防護の結果であると思われる。 The lowered immune response is believed to be a result of the protective epitope on the surface of the polypeptide responsible for the immune response leading to antibody formation by the polymer molecule to be coupled.

【0004】 ポリペプチドにポリマー分子を接合するための技法は、当業界において良く知られている。 [0004] Techniques for bonding polymer molecules to the polypeptide are well known in the art. 最初の適切な商業的技法の1つは、1970年代初期に記載されており、そして例えばアメリカ特許第4,179,337号に開示されている。 One of the first suitable commercially techniques are disclosed in EP are described early 1970's, and for example, US Patent 4,179,337. 前記特許は、非−免疫原生ポリペプチド、例えばポリエチレングリコール(PEG)又はポリプロピレングリコール(PPG)に結合される酵素及びペプチドホルモンに関する。 It said patent, non - immunogenic polypeptides, for example, to enzymes and peptide hormones coupled to polyethylene glycol (PEG) or polypropylene glycol (PPG). 少なくとも15 At least 15
%のポリペプチドの生理学的活性が維持される。 % Physiological activity of the polypeptide is maintained in the.

【0005】 イギリス特許第1,183,257号(Crookなど.)は、トリアジン環を通して多糖類への酵素の接合のための化学を記載する。 [0005] British Patent No. 1,183,257 (such as Crook.) Describes chemistry for conjugation of enzymes to polysaccharides via a triazine ring. さらに、酵素−ポリマー接合体の酵素活性の維持のための技法はまた、当業界において知られている。 Moreover, the enzyme - techniques for maintaining the enzymatic activity of the polymeric conjugate is also known in the art. WO93/15189号(Veroneseなど.)は、高分子化されたインヒビターにタンパク質分解酵素を連結することによって、ポリエチレングリコール−修飾されたタンパク質分解酵素における活性の維持方法を言及する。 WO93 / No. 15189 (. Etc. Veronese) by linking the proteolytic enzyme to polymerize been inhibitor, polyethylene glycol - refers to how to maintain activity in the modified proteolytic enzymes. 前記接合体は、医学的用途のために意図される。 The conjugates are intended for medical applications.

【0006】 ポリペプチドへのポリマー分子の結合がしばしば、前記ポリペプチドとその基質との間の相互作用を妨げることによって、そのポリペプチドの活性を低める効果を有することが見出された。 [0006] Binding of the polymer molecules to the polypeptide is often by interfering with the interaction between the said polypeptide and its substrate, was found to have the effect of lowering the activity of the polypeptide. ヨーロッパ特許第183503号(Beecham Group PLC European Patent No. 183503 (Beecham Group PLC
)は、可逆性結合基により少なくとも1つの水溶性ポリマーに連結される医薬的に有用なタンパク質を含んで成る接合体を提供することによる上記概念の開発を開示する。 ) Discloses a development of the concept by providing conjugates comprising pharmaceutically useful proteins linked to at least one water-soluble polymer by reversible linking group.

【0007】 ヨーロッパ特許第471,125号(Kanebo)は、熱及び保存安定性を改良するために、トリアジン環を通して多糖類に結合される親プロテアーゼ(商品名Esperase [0007] European Patent No. 471,125 (Kanebo), in order to improve the heat and storage stability, the parent protease (trade name Esperase coupled to the polysaccharide through a triazine ring
(商標)のバチルスプロテアーゼ)を含んで成るスキンケアー製品を開示する。 It discloses a skin care product comprising a Bacillus protease) (TM).
使用されるカップリング技法は、上記イギリス特許第1,183,257号(Crookなど. Coupling technique used is the British Patent No. 1,183,257 (such as Crook.
)にも記載される。 ) It is also described.

【0008】 日本特許第3083908号は、1又は複数の水溶性物質、例えばPEG、澱粉、セルロース、等により変性された、テンジクネズミ肝臓からのトランスグルタミナーゼを含む皮膚化粧用材料を記載する。 [0008] Japanese Patent No. 3083908 describes one or more water-soluble substances, for example PEG, starch, cellulose, modified with such a skin cosmetic material contains a transglutaminase from guinea pig liver. 前記変性は、ポリマー分子を活性化し、そしてそれらを酵素に結合することによって行われる。 The modification is carried out by a polymer molecule activate, and they bind to the enzyme. その組成物は、皮膚に対してマイルドであることが言及されている。 Its composition is mentioned to be mild to the skin.

【0009】 WO98/35026号(Novo Nordisk A/S)は、ポリペプチド構造体の表面上にポリマー分子を結合するための付加されそして/又は除去される1又は複数の結合基を有するポリペプチド−ポリマー接合体を記載する。 [0009] No. WO98 / 35026 (Novo Nordisk A / S), the polypeptide structure is added to bind the polymer molecules on the surface of and / or polypeptide having one or more binding groups are removed - It describes polymer conjugate. その接合体は、低められた免疫原性及びアレルゲン性を有する。 Its conjugate with reduced immunogenicity and allergenicity.

【0010】 発明の要約: 産業及び医薬用途のために適切な改良されたポリペプチドを提供することが、 [0010] SUMMARY OF THE INVENTION: to provide an appropriate improved polypeptides for industrial and pharmaceutical applications,
本発明の目的である。 It is an object of the present invention. 用語“改良されたポリペプチド”とは、ヒト及び動物において低められた免疫応答を有するポリペプチドを、本発明においては意味する。 The term "improved polypeptide", a polypeptide having an immune response which is reduced in humans and animals, which means in the present invention. さらに下記に記載されるように、免疫応答は攻撃の手段に依存する。 As described further below, the immune response depends on the means of attack.

【0011】 本発明者は、ポリペプチド、例えば酵素が、ポリペプチドの表面上の1又は複数のアミノ酸残基を、他のアミノ酸残基により置換することによって、及び/又は酵素活性に対して実質的に影響を及ぼさないで、酵素の結合されたリガンド、 [0011] The present inventors have polypeptide, for example enzymes, substantially one or more amino acid residues on the surface of the polypeptide, by replacing another amino acid residue, and / or for enzymatic activity to not affect the enzyme of the bound ligand,
例えば金属イオンの付近の酵素の表面上にポリマー分子をカップリングすることによって、免疫原性及び/又はアレルゲン性を低くされ得る。 For example by coupling polymeric molecules on the surface of the enzyme in the vicinity of the metal ions may be less immunogenic and / or allergenic.

【0012】 医薬用ポリペプチドを、循環系(すなわち、血流)中に直接的に導入する場合、可能性ある危険性は、主にIgG, IgA及び/又はIgM抗体の形での免疫原生応答である。 [0012] The pharmaceutical polypeptide, circulatory system (i.e., blood flow) When directly introduced into, the risk of a possible, mainly IgG, immunogenic response in the form of IgA and / or IgM antibodies it is. それとは対照的に、産業用ポリペプチド、例えば洗剤において機能的成分として使用される酵素は、循環系に侵入しない。 In contrast, industrial polypeptides, enzymes used as functional ingredients in example detergents, do not enter the circulation. 産業用ポリペプチドに関する可能性ある危険性は、主にIgE抗体形成の形でアレルギー応答を引き起こす吸入である。 Risk that potential for industrial polypeptides are mainly inhaled cause allergic responses in the form of IgE antibody formation. 従って、産業用ポリペプチドに関しては、可能性ある危険性は、ポリペプチドの吸入、気管内及び鼻腔内提供により引き起こされる呼吸アレルゲン性である。 Thus, for industrial polypeptides, the risk that potential, inhalation of the polypeptide, a respiratory allergenicity caused by providing intratracheal and intranasal.

【0013】 医薬用ポリペプチドの主な可能性ある危険性は、ポリペプチドの経皮内、静脈内又は皮下提供により引き起こされる免疫原性である。 [0013] risk of certain major potential pharmaceutical polypeptide in transdermal polypeptide is an immunogenic caused by intravenous or subcutaneous provided. 本発明において使用される用語“免疫原性”とは、臨床学的設定においてアレルゲン性接触性皮膚炎として言及され、そして皮膚と接触し、そして侵入する化学物質に対しての細胞介在性の遅延された免疫応答である。 The term "immunogenic" as used in the present invention, it referred to in the clinical setting as allergenic contact dermatitis, and contact with the skin, and cell-mediated delayed against chemicals entering It has been an immune response. この細胞介在性反応はまた、遅延された接触過敏性とも呼ばれる(組織損傷における免疫機構のGell The cell-mediated reaction may also, Gell immune mechanisms in which also called (tissue damage and contact hypersensitivity, delayed
and Combs 分類によれば、タイプIV反応)。 According to the classification and Combs, type IV reaction).

【0014】 用語“アレルゲン性”又は“呼吸アレルゲン性”とは、最初、例えばポリペプチドの吸入に続いて、即座の過敏性反応である(Gell and Combs によれば、タイプI抗体−介在性反応)。 [0014] The term "allergenic" or "respiratory allergenicity", first, for example, following the inhalation of the polypeptide, which is immediate hypersensitivity reactions (according to Gell and Combs, Type I antibody - mediated reaction ). 本発明によれば、実質的に保持された残留活性を有する、低められた免疫応答を有するポリペプチドを提供することが可能である。 According to the present invention, it is possible to provide a polypeptide having having substantially retained residual activity, the lowered immune response. アレルゲン性及び免疫性応答は、1つの用語においては、少なくとも本発明においては、“免疫応答”と呼ばれる。 Allergenic and immune response, in one term, at least in the present invention, called the "immune response".

【0015】 第1の観点においては、本発明は、1又は複数のアミノ酸残基を修飾されている、低められた免疫応答を有するポリペプチドに関し、ここで前記アミノ酸残基のCα−原子は前記ポリペプチドに結合されるリガントから15Åよりも短い位置に位置する。 [0015] In a first aspect, the present invention is modified with one or more amino acid residues relates to polypeptides with reduced immune response, wherein Cα- atoms of said amino acid residue is the Situated from Riganto attached to the polypeptide at a position shorter than 15 Å. 低められた免疫応答は好ましくは、低められたアレルゲン性である。 It is the lowered immune response preferably, the lowered allergenicity. ポリペプチドの修飾は、親ポリペプチドにおける1又は複数のアミノ酸残基を、他のアミノ酸残基により置換することによって、及び/又は親ポリペプチドの変異体の種々のライブラリーから変異体を選択することによって、及び/又は親ポリペプチドの表面にポリマー分子をカップリングすることによって行われる。 Modification of polypeptides, one or more amino acid residues in the parent polypeptide, selecting mutants from a variety of libraries by replacing another amino acid residue, and / or variant of a parent polypeptide carried out by coupling by, and / or the polymer molecules on the surface of the parent polypeptide it.

【0016】 用語“親ポリペプチド”とは、ポリマー分子にカップリングすることによって、又はアミノ酸残基を置換することによって修飾されるポリペプチドを言及する。 [0016] The term "parent polypeptide", by coupling to a polymer molecule, or refers to a polypeptide that is modified by replacing the amino acid residues. 親ポリペプチドは、天然に存在する(又は野生型)ポリペプチドであり得、又はいずれかの適切な手段により調製されるその変異体であり得る。 Parent polypeptide may be a naturally occurring (or wild-type) can be a polypeptide, or a variant thereof prepared by any suitable means. 例えば、親ポリペプチドは、1又は複数のアミノ酸残基の置換、欠失又は切断により、又は天然に存在するポリペプチドのアミノ酸配列への1又は複数のアミノ酸残基の付加又は挿入により修飾されている、天然に存在するポリペプチドの変異体であり得る。 For example, the parent polypeptide comprises a substitution of one or more amino acid residues, by deletion or cutting, or naturally modified by addition or insertion of one or more amino acid residues to the polypeptide of amino acid sequence present are may be a variant of a naturally occurring polypeptide.

【0017】 “適切な結合基”とは、本発明においては、問題のポリマー分子にカップリングすることができるポリペプチドの表面上のいずれかのアミノ酸残基を意味する。 [0017] and "appropriate coupling group" in the present invention, means any amino acid residue on the surface of the polypeptide capable of coupling to a polymer molecule in question. 好ましい結合基は、リシン残基のアミノ酸及びN−末端アミノ基である。 Preferred linking groups are amino acids and N- terminal amino group of a lysine residue. ポリマー分子はまた、表面上に位置するポリペプチド鎖におけるアミノ酸残基のカルボン酸基(−COOH)にも結合され得る。 Polymer molecules can also be coupled to the carboxylic acid group of the amino acid residues in the polypeptide chain located on the surface (-COOH). カルボン酸結合基は、アスパラギン又はグルタミンのカルボン酸基、及びC−末端COOH−基であり得る。 Carboxylic acid binding group can be asparagine or glutamine carboxylic acid groups, and C- terminal COOH- groups. もう1つの結合基は、システインにおけるSH−基である。 Another linking group is the SH- group at the cysteine.

【0018】 “活性部位”とは、ポリペプチドの性能、例えば触媒活性のために必須であることが知られているいずれかのアミノ酸残基及び/又は分子、例えば、触媒三組残基、すなわちセリンプロテアーゼにおけるヒスチジン、アスパラギン及びセリン、又は例えばペルオキシダーゼ、例えばアルスロミセス・ラモスス(Arthromy [0018] By "active site", the performance of the polypeptide, such as any amino acid residue and / or molecules that are known to be essential for catalytic activity, for example, catalytic triad residues, i.e. histidine at serine proteases, aspartic and serine, or for example peroxidases, e.g. Arusuromisesu-Ramosusu (Arthromy
ces ramosus)ペルオキシダーゼにおけるヘム基、及び遠位及び近位ヒスチジンを意味する。 ces ramosus) heme in peroxidase group, and means a distal and proximal histidine. “リガンド”とは、本発明においては、金属又は金属イオン、又は補因子を意味する。 The term "ligand", in the present invention, a metal or a metal ion, or means a cofactor.

【0019】 本発明において、“アミノ酸残基の修飾”とは、アミノ酸残基が他のアミノ酸残基により置換され、そして/又はポリマー分子がアミノ酸残基に結合されることを意味する。 [0019] In the present invention, the "modified amino acid residue", the amino acid residue is replaced by another amino acid residue, and / or the polymer molecules is meant to be attached to an amino acid residue. 本発明のポリペプチドは、本発明によれば、置換のみにより、ポリマー分子のみの結合により、又は置換及び結合の組み合わせにより修飾され得る。 Polypeptides of the present invention, according to the present invention, the only substituted by binding of only the polymer molecule, or may be modified by a combination of substitution and coupling.

【0020】 本発明においては、“位置する”とは、リガンドにおけるいずれかの原子から、アミノ酸残基における適切なC−原子までの最短の距離を意味する。 [0020] In the present invention, the "position", from one of the atoms in the ligands, means the distance shortest to a suitable C- atoms in amino acid residues. さらに、本発明においては、例えば“R250K”とは、ポリペプチドの位置250でのアミノ酸アルギニンが1文字コードのアミノ酸に従って、アミノ酸リシンにより置換されていることを意味する。 Further, in the present invention, for example the "R250K", according to the amino acid of the amino acid arginine 1 letter code at position 250 of the polypeptide, meaning that it is substituted by the amino acid lysine.

【0021】 第2の観点においては、本発明は、 a)問題の親ポリペプチドの三次元構造の表面上に位置するアミノ酸を同定し、 b)修飾されるべき、前記親ポリペプチドの前記三次元構造の表面上の標的アミノ酸残基を選択し、 c)段階b)において選択された1又は複数のアミノ酸残基を、他のアミノ酸残基により置換し、そして/又は d)段階b)及び/又は段階c)におけるアミノ酸残基にポリマー分子をカップリングする、 段階を含んで成る、低められた免疫応答を有するポリペプチドの調製方法に関する。 [0021] In a second aspect, the present invention is to identify the amino acids located on the surface of the three-dimensional structure of the parent polypeptide in a) problems, b) to be modified, the tertiary of the parent polypeptide select targeted amino acid residues on the surface of the source structure, c) one or more amino acid residues selected in step b), was replaced by another amino acid residue, and / or d) steps b) and / or coupling the polymer molecule to an amino acid residue in step c), comprising the steps relates to a process for the preparation of polypeptides with reduced immune response.

【0022】 本発明はまた、医薬の免疫原性を低め、そして産業製品のアレルゲン性を低めるためへの本発明の修飾されたポリペプチド及び本発明の方法の使用にも関する。 The invention also lowered medicament immunogenicity, and also relates to the use of modified polypeptides and methods of the present invention of the present invention for lowering the allergenicity of industrial products. 最終的に、本発明は、本発明の修飾されたポリペプチド、及び産業製品又は医薬に使用される追加の成分を含んで成る組成物に関する。 Finally, the present invention relates to modified polypeptides, and industrial use in the product or a pharmaceutical comprising the additional component compositions of the present invention.

【0023】 発明の特定の記載: 産業及び医薬用途のために適切な改良されたポリペプチドを提供することが、 To provide adequate improved polypeptides for industrial and pharmaceutical applications,: [0023] DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
本発明の目的である。 It is an object of the present invention. 医薬用途及び産業用途のために使用されるポリペプチドが相当に異なることができる場合でも、本発明の原理は、特定タイプの親ポリペプチド(すなわち、酵素、ホルモンペプチド、等)に調整され得る。 Even if the polypeptide used for pharmaceutical applications and industrial applications can vary considerably, the principles of the present invention can be adjusted to the specific type of parent polypeptide (i.e., an enzyme, a hormone peptide, etc.).

【0024】 本発明者は、ポリペプチド、例えば酵素が、金属イオン結合部位でのリガンド、例えば金属イオンの付近のアミノ酸残基を置換することによって、及び/又は親ポリペプチドの表面上に1又は複数のポリマー分子をカップリングすることによって、低い免疫原性及び/又は低いアレルゲン性にされ得ることを見出した。 [0024] The present inventors have polypeptide, for example enzymes, by substituting a ligand, for example, the amino acid residues in the vicinity of the metal ions in the metal ion binding site, and / or 1 or on the surface of the parent polypeptide by coupling a plurality of polymer molecules, it found that may be a low immunogenicity and / or low allergenicity.
さらに本発明者は、維持される残留触媒活性の高い百分率がそれらの修飾されたポリペプチドに維持され得ることも見出した。 The present inventors have also found that a high percentage of residual catalyst activity to be maintained can be maintained at their modified polypeptide.

【0025】 第1観点においては、本発明は、1又は複数のアミノ酸基を修飾されている改良されたポリペプチドに関し、ここで前記アミノ酸残基のCα−原子は前記ポリペプチドに結合されるリガンドから15Åよりも短い位置に位置する。 [0025] In a first aspect, the present invention is one or relates more improved polypeptide is modified with amino groups, wherein Cα- atoms of said amino acid residue ligand is bound to said polypeptide located at the position shorter than 15Å from. アミノ酸残基の置換、及びポリマー分子のカップリングは、下記の従来の態様に従って行われ得る。 Substitutions of amino acid residues, and coupling of the polymer molecules can be performed according to a conventional manner described below.

【0026】 低められた免疫応答vs. 維持される残留酵素活性 : 酵素に関しては、免疫応答の低下と実質的な残留酵素活性との間に矛盾が存在する。 [0026] the lowered immune response vs. maintained the residual enzymatic activity: For enzyme, there is a conflict between the lowering substantial residual enzymatic activity of the immune response. いずれの理論にも限定されないが、酵素−ポリマー複合体の酵素活性の損失は、特に巨大及び/又は重質ポリマー分子による基質の空間的妨害の形での活性部位への基質の妨げられた接近性の結果であると思われる。 Approaching the loss of enzymatic activity of the polymer composite was especially hindered the substrate to the active site in the form of huge and / or heavy polymeric molecules spatially interference of the substrate by - but not limited to any theory, the enzyme It seems to be the result of sex. それはまた、ポリマー分子のカップリングにより製造される応力による酵素の三次元構造の不都合なマイナーな構造変化により、少なくとも一部引き起こされ得る。 It also by undesirable minor structural changes of the three-dimensional structure of the enzyme due to the stress produced by the coupling of the polymer molecules, may be caused at least in part. また、1又は複数のアミノ酸残基を置換することによって修飾されたポリペプチドは、低められた酵素活性を有する。 Also, it modified polypeptides by substituting one or more amino acid residues, with reduced enzymatic activity.

【0027】 維持される残留活性 : 本発明の修飾されたポリペプチドは、実質的に維持された触媒活性を有する。 [0027] which is maintained residual activity: The modified polypeptide of the present invention have a substantially maintain catalytic activity. “実質的に”維持された触媒活性とは、本発明においては、対応する親ポリペプチドに基づいて調製された、修飾されたポリペプチドの活性に比較して、20% The "substantially" maintain catalyst activity, in the present invention were prepared on the basis of the corresponding parent polypeptide, as compared to the modified polypeptide activity, 20%
以上、少なくとも20%〜30%、好ましくは30%〜40%、より好ましくは40%〜60 Above, at least 20% to 30%, preferably 30% to 40%, more preferably from 40% to 60
%、良好には60%〜80%、さらに良好には80%〜100%である活性として定義される。 %, Good in 60% to 80% is the better defined as activity which is 80% to 100%.

【0028】 ポリマー分子が活性部位で又はその近くで結合されない本発明のポリペプチド−ポリマー接合体の場合、残留活性は100%までか又はそれに非常に近い。 The polypeptides of the polymer molecules present invention not bound at or near the active site - the case of a polymer conjugate, the residual activity is very close to 100% Madeka or therewith. 新ポリペプチドの結合基が活性部位から除去される場合、活性は、修飾された(すなわち、結合されたポリマー)親ポリペプチド接合体に比較して、100%以上である。 If attachment group of the new polypeptide is removed from the active site, activity is modified (i.e., binding polymer) as compared to the parent polypeptide conjugate, is 100% or more.

【0029】 結合基 : 実質的にすべてのイオン化された基、例えばリシン残基のアミノ基は、ポリペプチド分子の表面上に位置する(例えば、Thomas E. Creighton, (1993), “Pro The linking group: substantially all ionized groups, such as amino group of lysine residues are located on the surface of the polypeptide molecule (e.g., Thomas E. Creighton, (1993) , "Pro
teins”, WH Freeman and Company, Now Yorkを参照のこと)。 従って、修飾されているか又は親ポリペプチド上の容易に接近できる結合基( teins ", WH Freeman and Company, see Now York). Accordingly, easily accessible can bind groups on either or parent polypeptide is modified (
例えば、アミノ基)の数は、ポリペプチドの一次構造におけるリシン残基及びN For example, the number of amino groups), a lysine residue in the primary structure of the polypeptide and N
−末端アミノ基の数に一般的に等しい。 - In general the number of terminal amino groups equal.

【0030】 アミノ基へのポリマー分子のカップリングの化学は、非常に単純であり、そして当業界においては十分に確立している。 The chemistry of coupling polymeric molecules to amino groups are quite simple and well established in the art. 従って、低められた免疫原性及び/又はアレルゲン性、及び/又は改良された安定性及び/又は高い百分率で維持される触媒活性を有する改良された接合体を得るためには、問題の親ポリペプチドにリシン残基(すなわち、結合基)を付加することが好ましい。 Thus, the lowered immunogenicity and / or allergenicity, and / or in order to obtain improved stability and / or high improved conjugates having catalytic activity to be maintained in percentages, problems parent polypeptide peptide with a lysine residue (i.e., binding group) it is preferable to add.

【0031】 ポリマー分子はまた、ポリペプチドの表面上のアミノ酸残基のカルボキシル基(−COOH)にも結合され得る。 The polymer molecules can also be coupled to the carboxyl group of the amino acid residues on the surface of the polypeptide (-COOH). 従って、結合基としてカルボキシル基(C−末端基を包含する)を使用する場合、アスパラギン及びグルタミン残基の付加及び/ Therefore, when using a carboxyl group (including a C- terminal groups) as a binding group, the addition of asparagine and glutamine residues and /
又は除去はまた、本発明によれば適切である。 Or removal are also suitable according to the present invention. 他の結合基、例えば−SH基を用いる場合、それらは同様に付加され、そして/ Other linking groups, if used, for example -SH groups, they are added as well, and /
又は除去され得る。 Or it may be removed. アミノ酸残基の置換は、ポリペプチドの三次元構造に対する衝撃がほとんど明白でない場合、挿入よりも好ましい。 Substitution of amino acid residues, when impact on the three-dimensional structure of a polypeptide is not nearly clear, preferred over insertion.

【0032】 親ポリペプチド : 本発明においては、用語“ポリペプチド”とは、医薬又は産業用途のためのタンパク質、ペプチド及び/又は酵素を包含する。 The parent polypeptide: In the present invention encompasses the term "polypeptide", proteins for pharmaceutical or industrial applications, peptide and / or an enzyme. 典型的には、問題のポリペプチドは、約1〜1000kDa, 好ましくは4〜100kDa, より好ましくは2〜60kDaの範囲の分子量を有する。 Typically, the polypeptide in question is about 1~1000KDa, preferably 4~100KDa, more preferably has a molecular weight in the range of 2~60KDa. 医薬用ポリペプチド: Pharmaceutical polypeptide:

【0033】 用語“医薬用ポリペプチド”とは、ヒト及び/又は動物の身体の循環系中に導入される場合、生理学的に活性なポリペプチド、例えばペプチド、例えばペプチドホルモン、タンパク質、及び/又は酵素として定義される。 [0033] The term "pharmaceutical polypeptides", when introduced into the circulatory system of humans and / or animal body, physiologically active polypeptides such as peptides, such as peptide hormones, proteins, and / or It is defined as an enzyme. 医薬用ポリペプチドは、それらが循環系中に導入される場合、潜在的に免疫原性である。 Pharmaceutical polypeptides, when they are introduced into the circulatory system, are potentially immunogenic. 本発明に従って企画される“医薬用ポリペプチド”の例は、インスリン、ACTH Examples of the the "pharmaceutical polypeptides" planning in accordance with the present invention include insulin, ACTH
、グルカゴン、ソマトスタチン、ソマトトロピン、サイモシン、副甲状腺ホルモン、色素ホルモン、ソマトメジン、エリトロポイエチン、黄体化ホルモン、絨毛性ゴナドトロピン、視床下部開放因子、抗利尿ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、 , Glucagon, somatostatin, somatotropin, thymosin, parathyroid hormone, pigmentary hormones, somatomedin, erythropoietin, luteinizing hormone, chorionic gonadotropin, hypothalamic releasing factors, antidiuretic hormones, thyroid stimulating hormone,
レラキシン、インターフェロン、トロンボポイエチン(TPO)及びプロラクチンを包含する。 Encompasses relaxin, interferon, a thrombopoietin (TPO) and prolactin.

【0034】 産業用ポリペプチド: 産業用途のために使用されるポリペプチドはしばしば、酵素活性を有する。 [0034] Industrial polypeptides: a polypeptide to be used for industrial applications often have an enzymatic activity. 産業用ポリペプチド(例えば、酵素)は、(医薬用ポリペプチドに比較して)、身体の循環系中に導入されない。 Industrial polypeptides (e.g., enzymes) are (in comparison to pharmaceutical polypeptides) not introduced into the body's circulatory system.

【0035】 産業用ポリペプチド、例えば産業用組成物及び/又は製品における成分として使用される酵素、例えば洗剤及びパーソナルケア製品、例えば化粧品は、そのような酵素(又はそのような酵素を含んで成る製品)は血流中に注入されない(又は同様である)ので、ヒト又は動物の身体の循環系とは直接的に接触することはほとんどない。 [0035] Industrial polypeptides, such as enzymes used as ingredients in industrial compositions and / or products, for example, detergents and personal care products such as cosmetics, comprising such enzyme (or such enzymes since products) are not injected into the blood stream (or similar), it is hardly in direct contact to the circulatory system of the human or animal body. (従って、産業用ポリペプチドの場合、可能性ある危険性は、呼吸経路を通してのポリペプチドの吸入の結果としての呼吸アレルギー(すなわち、IgE応答)である。 (Thus, if the industrial polypeptide the risk that possibility is respiratory allergy as a result of inhalation of polypeptides through the respiratory route (i.e., IgE response).

【0036】 本発明においては、“産業用ポリペプチド”は、ヒト及び/又は動物に投与されないポリペプチド、例えばペプチド、タンパク質及び/又は酵素として定義される。 [0036] In the present invention, "industrial polypeptides" are polypeptides which are not administered to humans and / or animals, it is defined for example a peptide, a protein and / or enzyme. そのようなポリペプチドの例は、製品、例えば洗剤、家庭用品、農業用化学物質、パーソナルケアー製品、例えばスキンケアー製品、例えば化粧品及び洗面用化粧品、経口及び皮膚用医薬、繊維を加工するための組成物、硬質表面清浄のための組成物、及び食品及び飼料の製造のために使用される組成物、等に使用されるポリペプチド、特に酵素である。 Examples of such polypeptides, products, for example detergents, household products, agricultural chemicals, personal care products, for example skin care products such as cosmetics and toiletry products, oral and dermal pharmaceuticals, for processing the fibers compositions, compositions for hard surface cleaning, and compositions used for the manufacture of food and feed, polypeptides used etc, in particular enzymes.

【0037】 酵素活性: 酵素活性を示す医薬又は産業用ポリペプチドはしばしば、次の酵素グループの [0037] Enzyme activity: pharmaceutical or industrial polypeptides exhibit enzymatic activity is often in the following group of enzymes
1つに属するであろう:オキシドレダクターゼ(EC1, “Enzyme Nomenclature, Will belong to one: oxidoreductase (EC1, "Enzyme Nomenclature,
(1992), Academic Press Inc.)、例えばラッカーゼ及びスーパーオキシドジスムターゼ(SOD);トランスフェラーゼ(EC2)、例えばトランスグルタミナーゼ(TGアーゼ);ヒドロラーゼ(EC3)、例えばプロテアーゼ、特にスブチリシン及び脂質分解酵素;イソメラーゼ(EC5)、例えばタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ(PDI)。 (1992), Academic Press Inc.), for example, laccases and Superoxide dismutase (SOD); transferases (EC2), for example, transglutaminase (TG-ase); hydrolases (EC3), such as proteases, especially subtilisin and lipolytic enzymes; isomerase ( EC5), for example, protein disulfide isomerase (PDI).

【0038】 ヒドロラーゼタンパク質分解酵素: 企画されるタンパク質分解酵素は、アスパラギン酸プロテアーゼ、例えばペプシン、システインプロテアーゼ、例えばパパイン、セリンプロテアーゼ、例えばスブチリシン、又はメタロプロテアーゼ、例えばNeutrase(商標)の群から選択されたプロテアーゼを包含する。 The hydrolase proteolytic enzymes: Proteolytic enzymes are contemplated are, aspartic proteases, for example pepsin, cysteine proteases such as papain, serine proteases, such as subtilisin, or metalloprotease selected from the group of for example Neutrase (TM) It encompasses the protease.

【0039】 親プロテアーゼの特定の例は、PD498(WO93/24623号及び配列番号2)、Savin Specific examples of [0039] the parent protease, PD498 (WO93 / 24623 Patent and SEQ ID NO: 2), Savin
ase(商標)(von der Osten など., (1993), Journal of Biotechnology, 28, p ase (trademark) (von der Osten, such as., (1993), Journal of Biotechnology, 28, p
.55+, 配列番号3)、プロテイナーゼK(Gunkel など., (1989), Eur. J. Bioche .55Tasu, SEQ ID NO: 3), Proteinase K (such as Gunkel., (1989), Eur. J. Bioche
m, 179, P.185-194)、プロテイナーゼR(Samalなど., (1990), Mol. Microbiol m, 179, P.185-194), proteinase R (such as Samal., (1990), Mol. Microbiol
. 4, p.1789-1792)、プロテイナーゼT(Samalなど., (1989), Gene, 85, p.329 . 4, p.1789-1792), proteinase T (such as Samal., (1989), Gene, 85, p.329
-333)、スブチリシンDY(Betzelなど., (1993), Arch. Biophys, 302, no. 2, -333), subtilisin DY (such Betzel., (1993), Arch. Biophys, 302, no. 2,
p.499-502), Lion Y (JP 04197182-A), Rennilase(商標)(Novo Nordisk A/S p.499-502), Lion Y (JP 04197182-A), Rennilase (TM) (Novo Nordisk A / S
から入手できる)、JA16 (WO92/17576号), Alcalase(商標)(天然のスブチリシンCarlberg変異体) (von der Osten など., (1993), Journal of Biotechnology Available from), JA16 (No. WO92 / 17576), Alcalase (TM) (natural subtilisin Carlberg mutant) (von der Osten, such as., (1993), Journal of Biotechnology
, 28, p.55+)、スブチリシンBPN - (J. Mol. Biol. 178: 389-413 (1984); Hiron , 28, p.55 +), subtilisin BPN - (J. Mol Biol 178: .. 389-413 (1984); Hiron
o S., Akagawa H., Mitsui Y., Iitake Y.)(Novo Nordisk A/Sから入手できる) o S., Akagawa H., Mitsui Y., Iitake Y.) (available from Novo Nordisk A / S)
を包含する。 It encompasses.

【0040】 カルボヒドラーゼ: 親カルボヒドラーゼは、特に5及び6員環構造の炭化水素鎖(例えば、澱粉) The carbohydrases: Parent carbohydrases, especially 5 and 6-membered hydrocarbon chain ring structure (e.g., starch)
を加水分解できるすべての酵素(すなわち、Recommendations (1992) of the In All of the enzyme capable of hydrolyzing (ie, Recommendations (1992) of the In
ternational Union of Biochemistry and Molecular Biology (IUBMB) に従って、酵素分類番号EC3.2. (グリコシダーゼ) 下で分類される酵素)として定義される。 According ternational Union of Biochemistry and Molecular Biology (IUBMB), is defined as the enzyme classification number EC 3.2. (Glycosidase) enzymes classified under).

【0041】 例としては、酵素分類(EC)番号下で分類されるそれらのものから選択されるカルボヒドラーゼを包含する:α−アミラーゼ(3. 2. 1. 1)、β−アミラーゼ(3.2. 1. 2)、グルカン1,4−α−グルコシダーゼ(3. 2. 1. [0041] Examples include carbohydrases selected from those things that are classified under enzyme classification (EC) Number: alpha-amylase (3. 2. 1. 1), β- amylase (3.2 . 1.2), glucan l, 4-alpha-glucosidase (3.2.1.
3)、セルラーゼ(3. 2. 1. 4)、エンド−1,3(4)−β−グルカナーゼ(3.2.1.6)、エンド−1,4−β−キシラナーゼ(3.2.1.8 3), cellulase (3.2.1 1.4), End-1,3 (4)-.beta.-glucanase (3.2.1.6), End-1,4-beta-xylanase (3.2. 1.8
)、デキストラナーゼ(3.2.1.11)、キチナーゼ(3.2.1.14) ), Dextranase (3.2.1.11), chitinase (3.2.1.14)
、ポリガラクツロナーゼ(3.2.1.15)、リゾチーム(3.2.1.17 , Polygalacturonase (3.2.1.15), lysozyme (3.2.1.17
)、β−グルコシダーゼ(3.2.1.21)、α−ガラクトシダーゼ(3.2 ), Β- glucosidase (3.2.1.21), α- galactosidase (3.2
. 1.22)、β−ガラクトシダーゼ(3.2.1.23)、 1.22), β- galactosidase (3.2.1.23),

【0042】 アミロ−1,6−グルコシダーゼ(3.2.1.33)、キシラン1,4−β The amylose-1,6-glucosidase (3.2.1.33), xylan 1,4-β
−キシロシダーゼ(3.2.1.37)、グルカンエンド−1,3−β−D−グルコシダーゼ(3.2.1.39)、α−デキストリンエンド−1,6−グルコシダーゼ(3.2.1.41)、スクロースα−グルコシダーゼ(3.2.1. - xylosidase (3.2.1.37), glucan end-1,3-beta-D-glucosidase (3.2.1.39), α- dextrin end 1,6 glucosidase (3.2.1 .41), sucrose α- glucosidase (3.2.1.
48)、グルカンエンド−1,3−α−グルコシダーゼ(3.2.1.59)、 48), glucan end -1,3-α- glucosidase (3.2.1.59),
グルカン1,4−β−グルコシダーゼ(3.2.1.74)、グルカンエンド− Glucan 1,4-β- glucosidase (3.2.1.74), glucan end -
1,6−β−グルコシダーゼ(3.2.1.75)、アラビナンエンド−1,5 1,6-β- glucosidase (3.2.1.75), Arabi Nan end 1,5
−α−アラビノシダーゼ(3.2.1.99)、ラクターゼ(3.2.1.10 -α- arabinosidase (3.2.1.99), lactase (3.2.1.10
8)、キトナナーゼ(3.2.1.132)。 8), Kitonanaze (3.2.1.132).

【0043】 適切なカルボヒドラーゼの例は次のものも包含する:トリコダーマ・ハルジアナム(Trichoderma hazianum)に由来するα−1,3−グルカナーゼ;パエシロミセス(Paecilomyces)株に由来するα−1,6−グルカナーゼ;バチルス・スブチリス(Bacillus subtilis)に由来するβ−グルカナーゼ;ヒューミコラ・ [0043] Examples of suitable carbohydrase also include the following: Trichoderma harzianum alpha-1,3-glucanase derived from (Trichoderma hazianum); Paeshiromisesu (Paecilomyces) α-1,6- glucanase derived from a strain; Bacillus subtilis (Bacillus subtilis) derived from the β- glucanase; Humicola
インソレンス(Humicola insolens)に由来するβ−グルカナーゼ;アスペルギラス・ニガー(Aspergillus niger)に由来するβ−グルカナーゼ;トリコダーマ(Trichoderma)株に由来するβ−グルカナーゼ;オエルスコビア・キサンチネオリチカ(Oerskovia xanthinoeolytica)に由来するβ−グルカナーゼ; From Oerusukobia-hexane Chine Ori Chika (Oerskovia xanthinoeolytica); insolens (Humicola insolens) from To β- glucanases; Aspergillus niger (Aspergillus niger) from To β- glucanases; Trichoderma (Trichoderma) derived from a strain β- glucanase to β- glucanase;

【0044】 アスペルギラス・ニガーに由来するエキソ−1,4−α−D−グルコシダーゼ(グルコアミラーゼ);バチルス・スブチリスに由来するα−アミラーゼ;バチルス・アミロリケファシエンス(Bacillus amyloliquefaciens)に由来するα− [0044] derived from Aspergillus niger exo -1,4-α-D- glucosidase (glucoamylase); derived from Bacillus amyloliquefaciens (Bacillus amyloliquefaciens) α-; derived from Bacillus subtilis α- amylase
アミラーゼ;バチルス・ステアロサーモフィラス(Bacillus stearothermophilu Amylase; Bacillus stearothermophilus (Bacillus stearothermophilu
s)に由来するα−アミラーゼ;アスペルギラス・オリザエ(Aspergillus oriyz Derived from s) α- amylase; Aspergillus oryzae (Aspergillus oriyz
ae)に由来するα−アミラーゼ;非病原性微生物に由来するα−アミラーゼ;アスペルギラス・ニガーに由来するα−ガラクトシダーゼ;ヒューミコラ・インソレンスに由来するペントサーゼ、キシラナーゼ、セロビナーゼ、セルラーゼ、ヘミ−セルラーゼ; From ae) alpha-amylase; from a non-pathogenic microorganism alpha-amylase; Aspergillus derived niger to alpha-galactosidase; from Humicola insolens Pentosaze, xylanase, Serobinaze, cellulases, hemi - cellulase;

【0045】 トリコダーマ・レセイ(Trichoderma reesei)に由来するセルラーゼ;非病原性カビに由来するセルラーゼ;アスペルギラス・ニガーに由来するペクチナーゼ、セルラーゼ、アラビナーゼ、ヘミ−セルロース;ペニシリウム・リラシナム( [0045] Trichoderma reesei (Trichoderma reesei) cellulase derived; cellulase derived from a non-pathogenic fungi; from Aspergillus niger to pectinase, cellulase, arabinase, hemi - cellulose; Penicillium Rirashinamu (
Penicillium lilacinum)に由来するデキストラナーゼ;非病原性カビに由来するエンドグルカナーゼ;バチルス・アシドプリチカス(Bacillus acidopullytic Dextranase from Penicillium lilacinum); endoglucanase derived from the non-pathogenic fungi; Bacillus Ashidopurichikasu (Bacillus acidopullytic
us)に由来するプルラナーゼ;クルイベロミセス・フラジリス(Kluyveromyces Pullulanase derived from us); Kluyveromyces fragilis (Kluyveromyces
fragillis)に由来するβ−ガラクトシダーゼ;トリコダーマ・レセイに由来するキシラナーゼ。 Derived from the fragillis) β- galactosidase; Trichoderma reesei derived from the xylanase.

【0046】 容易に入手できる市販のカルボヒドラーゼの特定の例は、次のものを包含する:Alpha-GalO, Bio-feedO alpha, Bio-FeedO Beta, Bio-FeedO plus, Bio-FeedO [0046] Specific examples of commercially available carbohydrases readily available include the following:: Alpha-GalO, Bio-feedO alpha, Bio-FeedO Beta, Bio-FeedO plus, Bio-FeedO
plus, Novozyme(商標)188, Carezyme(商標), Celluclast(商標), Cellus plus, Novozyme (TM) 188, Carezyme (TM), Celluclast (TM), Cellus
oft(商標), Ceremyl(商標), CitrozymO, DenimaxO, DezymeO, DextrozymeO, oft (trademark), Ceremyl (trademark), CitrozymO, DenimaxO, DezymeO, DextrozymeO,
MaltogenaseO, PentopanO, PectinexO, Promozyme(商標), PulpzymeO, Novam MaltogenaseO, PentopanO, PectinexO, Promozyme (trademark), PulpzymeO, Novam
ylO, Termamyl(商標), AMG (Amyloglucosidase Novo), Maltogenase(商標), ylO, Termamyl (TM), AMG (Amyloglucosidase Novo), Maltogenase (TM),
Aquazym(商標), Natalase(商標)(すべての酵素は、Novo Nordisk A/Sから入手できる)。 AQUAZYM (TM), Natalase (TM) (all enzymes available from Novo Nordisk A / S). 他のカルボヒドラーゼは他の会社から入手できる。 Other carbohydrases are available from other companies.

【0047】 また、カルボヒドラーゼ変異体が親酵素として企画されることは、理解されるべきである。 [0047] In addition, it carbohydrase variants are planned as a parent enzyme is to be understood. カルボヒドラーゼの活性は、”Methods of Enzymatic Analysis”, third edi Activity of carbohydrase, "Methods of Enzymatic Analysis", third edi
tion, 1984, Verlag Chemie, Weinheim, vol.4に記載のようにして決定され得る。 tion, 1984, Verlag Chemie, Weinheim, may be determined as described in vol.4.

【0048】 オキシドレダクターゼラッカーゼ: 企画されるラッカーゼは、ポリポラス・ピニシタス(Polyporus ponisitus) [0048] oxidoreductase laccase: laccase to be planning is, Polyporus, Pinishitasu (Polyporus ponisitus)
ラッカーゼ(WO96/00290号)、マイセリオプソラ(Myceliophthora)ラッカーゼ(WO95/33836号)、シタリジウム(Schytalidium)ラッカーゼ(WO95/338337号)及びピリキュラリア・オリザエ(Pyricularia oryzae)ラッガーゼ(Sigmaから入手できる)を包含する。 Laccase (No. WO96 / 00290), including Maiseriopusora (Myceliophthora) laccase (No. WO95 / 33836), (available from Sigma) Shitarijiumu (Schytalidium) laccase (No. WO95 / 338337) and Pyricularia oryzae (Pyricularia oryzae) Raggaze.

【0049】 ペルオキシダーゼ: 企画されるペルオキシダーゼは、B.プミラス(B. pumilus)ペルオキシダーゼ(WO91/05858号)、ミクソコカセアエ(Myxococcaceae)ペルオキシダーゼ(WO9 [0049] peroxidase:. Peroxidase, which is planning is, B pumilus (B. pumilus) peroxidase (No. WO91 / 05858), Mikusokokaseae (Myxococcaceae) peroxidase (WO9
5/11964号)、コプリナス・シネレウス(Coprinus sinereus)(WO95/10602号)及びアルスロミセス・ラモサス(Arthromyces ramosus)ペルオキシダーゼ(kunis 5/11964 issue), Coprinus cinereus (Coprinus sinereus) (WO95 / 10602 issue) and Arusuromisesu-Ramosasu (Arthromyces ramosus) peroxidase (kunis
hima など. (1994), J. Mol. Biol. 235, p.331-344)を包含する。 Such as hima. (1994), J. Mol. Biol. 235, including the p.331-344).

【0050】 トランスフェラーゼトランスグルタミナーゼ: 適切なトランスフェラーゼは、WO96/06931号(Novo Nordisk A/S)及びWO96/2 [0050] Transferase Transglutaminase: Suitable transferases No. WO96 / 06931 (Novo Nordisk A / S) and WO96 / 2
2366号(Nove Nordisk A/S)に開示されるいずれかのトランスグルタミナーゼを包含する。 It includes any transglutaminase is disclosed in JP 2366 (Nove Nordisk A / S).

【0051】 イソメラーゼタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ: それらに限定されないが、適切なタンパク質ジスルフィドイソメラーゼは、WO [0051] isomerase protein disulfide isomerase: but are not limited to, the appropriate protein disulfide isomerase, WO
95/01425号(Novo Nordisk A/S)に記載されるPDIを包含する。 Encompasses PDI as described in WO 95/01425 (Novo Nordisk A / S). 企画されるイソメラーゼは、キシロース/グルコース イソメラーゼ(5.3 Isomerase, which is planning is, xylose / glucose isomerase (5.3
. 1.5)、例えばSweetzyme(商標)を包含する。 1.5) includes, for example, Sweetzyme (TM).

【0052】 リアーゼ適切なリアーゼは、多糖リアーゼ、すなわちペクチン酸リアーゼ(4.2.2 [0052] lyase appropriate lyase, polysaccharide lyase, ie pectate lyase (4.2.2
. 2)及びペクチンリアーゼ(4.2.2.10)、例えばWO99/27083号に開示されるバチルス・リケニホルミス(Bacillus licheniformis)からのそれらのリアーゼを包含する。 2) and including their lyase from pectin lyase (4.2.2.10), Bacillus licheniformis disclosed in example No. WO99 / ​​27083 (Bacillus licheniformis).

【0053】 ポリマー分子ポリペプチドに結合されるポリマー分子は、いずれかの適切なポリマー分子、 [0053] The polymer molecules attached to the polymer molecule polypeptide may be any suitable polymer molecule,
例えば天然及び合成ホモポリマー、例えばポリオール(すなわち、ポリ−OH)、 For example, natural and synthetic homopolymers, such as polyols (i.e., poly -OH),
ポリアミン(すなわち、ポリ−NH 2 )及びポリカルボン酸(すなわち、ポリ−COO Polyamines (i.e., poly -NH 2) and polycarboxylic acid (i.e., poly -COO
H)、及びさらに、ヘテロポリマー、すなわち1又は複数の異なったカップリング基、たとえばヒドロキシル及びアミン基を含んで成るポリマーであり得る。 H), and further heteropolymers, i.e. one or more different coupling group may be a polymer, for example comprising hydroxyl and amine groups.

【0054】 適切なポリマー分子の例は、酸化ポリアルキレン(PAO)、例えばポリアルキレングリコール(PAG)、例えばポリエチレングリコール(PEG)、メトキシポリエチレングリコール(mPEG)及びポリプロピレングリコール、PEG−グリシジルエーテル(Epox−PEG)、PEG−オキシカルボニルイミダゾール(CDI−PEG)、枝分かれPEG、ポリ−ビニルアルコール(PVA)、ポリ−カルボキシレート、ポリ− [0054] Examples of suitable polymer molecules, polyalkylene oxide (PAO), for example, polyalkylene glycol (PAG), such as polyethylene glycol (PEG), methoxypolyethylene glycol (mPEG) and polypropylene glycols, PEG-glycidyl ethers (Epox- PEG), PEG-oxycarbonylimidazole (CDI-PEG), branched PEG, poly - vinyl alcohol (PVA), poly - carboxylate, poly -
(ビニルピロリドン)、ポリ−D, L−アミノ酸、ポリエチレン−コ−無水マレイン酸、ポリスチレン−コ−無水マレイン酸、 (Vinylpyrrolidone), poly -D, L-amino acids, polyethylene - co - maleic anhydride, polystyrene - co - maleic anhydride,

【0055】 デキストラン、例えばカルボキシメチル−デキストラン、ヘパリン、相同アルブミン、セルロース、例えばメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、 [0055] Dextran, such as carboxymethyl - dextran, heparin, homologous albumin, celluloses, such as methylcellulose, carboxymethylcellulose,
エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシエチルセルロース及びヒドロキシプロピルセルロース、キトサンの加水分解物、澱粉、例えばヒドロキシエチル−澱粉及びプロピル−澱粉、グリコーゲン、アガロース及びそれらの誘導体、グアーガム、プルラン、イヌリン、キサンガム、カラゲニル、ペクチン、アルギン酸加水分解物及び生物ポリマーを含んで成る群から選択されたポリマー分子を包含する。 Ethyl cellulose, hydroxyethyl cellulose, carboxymethyl cellulose and hydroxypropyl cellulose, chitosan hydrolysates, starch, such as hydroxyethyl - starch and propyl - starch, glycogen, agarose and derivatives thereof, guar gum, pullulan, inulin, xanthan gum, Karageniru, pectin, alginic hydrolyzate and include polymer molecules selected from the group comprising biopolymers.

【0056】 好ましいポリマー分子は、酵素の表面上の結合基へのその共有結合のための比較的単純な化学を、さらに必要とする非毒性ポリマー分子、例えば(m)ポリエチレングリコール((m)PEG)である。 [0056] Preferred polymer molecules, a relatively simple chemistry for its covalent coupling to attachment groups on the surface of the enzyme, the non-toxic polymeric molecules requiring additional, eg (m) polyethylene glycol ((m) PEG ) it is. 一般的に、酸化ポリアルキレン(PAO)、例えば酸化ポリエチレン、例えばPEG Generally, polyalkylene oxide (PAO), such as polyethylene oxide, for example PEG
及び特にmPEGは、それらのポリマー分子は、多糖類、例えばデキストラン、プルラン及び同様のものに比較して、架橋できる反応性基をほとんど有さないので、 And especially mPEG are those polymer molecules, polysaccharides such as dextran, as compared to those of pullulan, and the like, since almost no reactive groups capable of crosslinking,
好ましいポリマー分子である。 The preferred polymer molecule.

【0057】 上記ポリマー分子のすべてが本発明に従って使用され得る場合でさえ、メトキシポリエチレングリコール(mPEG)が都合良く使用され得る。 [0057] All of the polymer molecules even when that may be used according to the invention, methoxy polyethylene glycol (mPEG) may be employed conveniently. これは、メトキシエチレングリコールが酵素と接合できるわずか1つの反応性末端を有する事実から発生する。 This arises from the fact that having only one reactive end capable of bonding methoxy ethylene glycol and enzymes. 従って、架橋の危険性は、ほとんど明白ではない。 Therefore, the risk of cross-linking is not a little obvious. さらに、それは生成物をより均質にし、そして酵素とポリマー分子との反応を、調節するのにより容易にする。 Furthermore, it will the product more homogeneous and the reaction of the enzyme with polymer molecules, facilitated by the adjusting. 枝分かれPEG接合体の例は、リシンの枝分かれPEG2−NHS−エステル(Shearwa Examples of branched PEG conjugates, branched PEG2-NHS-ester of lysine (Shearwa
terから入手できる)である。 It is available) from ter.

【0058】 ポリペプチドへのポリマーの活性化及びカップリング : 問題のポリペプチドにより接合されるポリマー分子が活性的でない場合、それらは適切な技法の使用により活性化されるべきである。 [0058] Activation and coupling of polymers to the polypeptide: If the polymer molecules are joined by the polypeptide in question are not active, they should be activated by the use of suitable techniques. リンカーを通してポリペプチドにポリマー分子を結合することが、本発明に従って企画される。 Coupling the polymer molecules to the polypeptide through a linker, it is organized in accordance with the present invention. 適切なリンカーは、当業者に良く知られている。 Suitable linkers are well known to those of ordinary skill in the art.

【0059】 ポリマー分子の活性化、及びポリペプチドの接合のための方法及び化学は、文献に広範囲に記載されている。 [0059] The methods and chemistry for activation and bonding of the polypeptides of the polymer molecules have been extensively described in the literature. 不溶性ポリマーの活性化のための通常使用される方法は、臭化シアン、過ヨウ化物、グルタルアルデヒド、ビエポキシド、エピクロロヒドリン、ジビニルスルホン、カルボジイミド、ハロゲン化スルホニル、トリクロロトリアジン、等により官能基の活性化を包含する(RF Taylor, (1991 Method usually used for activation of insoluble polymers include cyanogen bromide, periodate compound, glutaraldehyde, Biepokishido, epichlorohydrin, divinyl sulfone, a carbodiimide, sulfonyl halides, trichlorotriazine, etc. by functional group It encompasses activating (RF Taylor, (1991
), “Protein Immobilisation. Fundamental and Applications”, Mercel Dekk ), "Protein Immobilisation. Fundamental and Applications", Mercel Dekk
er, NY,; SS Wong, (1992), “Chemistry of Protein Conjugation and Cro er, NY ,; SS Wong, (1992), "Chemistry of Protein Conjugation and Cro
sslinking”, CRC Press, Boca Raton; GT Hermanson など., (1993), “Immo sslinking ", CRC Press, Boca Raton;. such as GT Hermanson, (1993)," Immo
bilized Affinity Ligand Techniques”, Academic Press, NY を参照のこと)。 bilized Affinity Ligand Techniques ", Academic Press, see NY).

【0060】 前記方法のいくつかは、不溶性ポリマーの活性化に関するが、しかしまた、可溶性ポリマーの例えば過ヨウ化物、トリクロロトリアジン、ハロゲン化スルホニル、ジビニルスルホン、カルボジイミド、等による活性化にも適用できる。 [0060] Some of the methods are directed to the activation of insoluble polymers but also, for example excessive iodide soluble polymer, trichlorotriazine, sulfonyl halide, divinyl sulfone, a carbodiimide, can be applied to activation by like. ポリマー上のアミノ、ヒドロキシル、トリオール、カルボキシル、アルデヒド又はスルフヒドリルの官能基、およびタンパク質上の選択された結合基は、i)ポリマーの活性化、ii)接合、及びiii)残留活性基のブロッキングから通常成る活性化及び接合化学の選択において考慮されるべきである。 Amino on the polymer include hydroxyl, triol, carboxyl, aldehyde or sulfhydryl functional groups, and selected binding groups on proteins, i) activation of polymer, ii) bonding, and iii) normal from the blocking of residual active groups in the selection of the activation and bonding chemical made it should be considered.

【0061】 次においては、多くの適切なポリマー活性化方法が短く記載されるであろう。 [0061] In the following will be a number of suitable polymer activation methods described shortened.
しかしながら、他の方法もまた使用され得ることが理解されるべきである。 However, it should be understood that other methods may also be used. ポリペプチドの遊離酸基へのポリマー分子のカップリングは、ジイミド及び例えばアミノ−PEG又はヒドラジノ−PEG(Pollakなど., (1996), J. Amr. Chem. S Coupling of the polymer molecules to the free acid groups of polypeptides may diimide and for example amino -PEG or hydrazino -PEG (such Pollak., (1996), J. Amr. Chem. S
oc., 98, 289-291)又はジアゾアセテート/アミド(Wong など., (1992), “Che oc., 98, 289-291) or diazoacetate / amide (Wong like., (1992), "Che
mistry of Protein Conjugation and Crosslinking”, CRC Press)の助けにより行われ得る。 mistry of Protein Conjugation and Crosslinking ", can be carried out with the aid of CRC Press).

【0062】 ヒドロキシ基へのポリマー分子のカップリングは、それが水において行われるべきであるので、一般的に非常に困難である。 [0062] Coupling of the polymer molecules to hydroxy groups, it therefore should be performed in water, it is generally very difficult. 通常、加水分解が、ヒドロキシル基との反応よりも卓越する。 Usually, hydrolysis, dominant than the reaction with the hydroxyl groups. 遊離スルフヒドリル基へのポリマー分子のカップリングは、マレイミド又はオルトピリジルジスルフィドのような特定の基と反応せしめられ得る。 Coupling of the polymer molecules to free sulfhydryl groups can be reacted with a specific group such as maleimide or ortho-pyridyl disulfide. また、ビニルスルホン(アメリカ特許第5,415,135号,(1995)、Snowなど.)は、スルフヒドリル基のために好ましいが、しかし言及される他のものほど選択的ではない。 Further, the vinyl sulfone (US Patent No. 5,415,135, (1995), etc. Snow.) Is preferred for sulfhydryl groups, but not selective as others mentioned. ポリペプチド鎖における接近できるアルギニン残基は、2つのビシナルカルボニル基を含んで成る基により標的化され得る。 Arginine residues accessible in the polypeptide chain may be targeted by groups comprising two vicinal carbonyl groups.

【0063】 リシンのアミノ基への求電子的に活性化されたPEGのカップリングを包含する技法がまた有用である。 [0063] Techniques include coupling electrophilically activated PEG to amino groups of lysine are also useful. マルコールのための通常の脱離基の多くは、アミン連鎖を生ぜしめる。 Many conventional leaving group for Marcol is causing a amine chain. 例えば、アルキルスルホネート、例えばトレシレート(Nilsson For example, alkyl sulfonates, e.g., tresylate (Nilsson
など., (1984), Methods in enzymology vol. 104, Jacoby, WB, Ed., Academ Etc.., (1984), Methods in enzymology vol. 104, Jacoby, WB, Ed., Academ
ic Press: Orlando, P.56-66; Nilsson など., (1987), Method in Enzymology ic Press:. Orlando, P.56-66; such as Nilsson, (1987), Method in Enzymology
vol. 135: Mosbach, K., Ed., Academic Press: Orlando, p.65-79; Scouten など., (1987), Methods in Enzymology vol. 135, Mosbach, K., Ed., Academic .. Vol 135: Mosbach, K., Ed, Academic Press:... Orlando, p.65-79; Scouten, etc., (1987), Methods in Enzymology vol 135, Mosbach, K., Ed, Academic
Press: Orlando, 1987, p.79-84; Crossland など., (1971), J. Amr. Chem. So Press:... Orlando, 1987, p.79-84; such as Crossland, (1971), J. Amr Chem So
c. 1971, 93, p.4217-4219)、メシレート(Harris, (1985), 前記; Harris など., (1984), J. Polym. Sci. Polym. Chem. Ed. 22, p.341-352)、トシレートのようなアリールスルホネート及びパラ−ニトロベンゼンスルホネートが使用され得る。 . C 1971, 93, p.4217-4219), mesylate (Harris, (1985), the;...... Harris, etc., (1984), J. Polym Sci Polym Chem Ed 22, p.341-352 ), aryl sulfonates and para, such as tosylate - nitrobenzene sulfonate may be used.

【0064】 有機塩化スルホニル、例えば塩化トレシルは、多くのポリマー、例えばPEGにおけるヒドロキシ基を、ポリペプチドにおけるアミノ基のような求核基と反応せしめられる場合、ポリマーとポリペプチドとの間に安定した連鎖の形成を可能にする良好な脱離基(スルホネート)に効果的に転換する。 [0064] Organic sulfonyl chlorides, e.g. tresyl chloride is many polymers, the hydroxy group for example in the PEG, if reacted with a nucleophilic group such as an amino group in a polypeptide, stable between the polymer and the polypeptide effectively converted into good leaving groups (sulfonates) that allow the formation of the chain. 高い接合収率の他に、 In addition to the high bonding yield,
反応条件は一般的に温和であり(変性を回避し、又は活性の破壊をほとんどか又は完全に回避するために、中性〜わずかなアルカリ性pH)、そしてポリペプチドに対する非破壊的な必要条件を満たす。 The reaction conditions are generally mild (avoiding degeneration, or to almost or completely avoid the destruction of active, neutral to slightly alkaline pH) nondestructive requirements for, and the polypeptide Fulfill.

【0065】 トシレートはメシレートよりも反応性であるが、しかしまた、より不安定性でもあり、PEG、ジオキサン及びスルホン酸分解する(Zalipsky, (1995), Bioconj [0065] tosylate but is more reactive than the mesylate but also is also a more labile, PEG, dioxane and decomposed sulfonic acid (Zalipsky, (1995), Bioconj
ugate Chem., 6, 150-165)。 ugate Chem., 6, 150-165). エポキシドはまた、アミン結合を創造するためにも使用されて来たが、しかし上記に言及された基よりも反応性ではない。 Epoxides Although it came also been used to create an amine linkage, but is not reactive than the stated groups above.

【0066】 ホスゲンによるPEGのクロロホルメートへの転換は、リシンへのカルバメート連鎖を生ぜしめる。 [0066] Conversion to PEG chloroformate by phosgene, causing a carbamate linkage to lysine. このテーマは、N−ヒドロキシスクシンイミド(アメリカ特許第5,122,614号(1992); Zalipskyなど., (1992), Biotechnol. Appl. Bioche This theme, N- hydroxysuccinimide (US Patent No. 5,122,614 (1992);... Zalipsky etc., (1992), Biotechnol Appl Bioche
m., 15, p.100-114; Monfardini など., (1995), Bioconjugate Chem., 6, 62-6 . M, 15, p.100-114;.. Etc. Monfardini, (1995), Bioconjugate Chem, 6, 62-6
9)、イミダゾール(Allenなど., (1991), Carbohydr. Res., 213, p.309-319) 9), imidazole (such as Allen., (1991), Carbohydr. Res., 213, p.309-319)
、パラ−ニトロフェノール、DMAP(ヨーロッパ特許第632082A1号、(1993)、Lo , Para - nitrophenol, DMAP (EP 632082A1, (1993), Lo
oze, Y.), 等により塩素を置換する多くの変異体において役割を果たされ得る。 oze, Y.), may play a role in many variants substituting the chlorine with like. 誘導体は通常、所望する脱離基とクロロホルメートとを反応せしめることによって製造される。 Derivatives are usually prepared by reacting the leaving group with a chloroformate desired. すべてのそれらの基は、ペプチドへのカルドメート連鎖を生ぜしめる。 All of these groups, give rise to Karudometo chain to the peptide.

【0067】 さらに、イソシアネート及びイソチオシアネートが使用され、それぞれウレア及びチオウレアが生成される。 [0067] Furthermore, isocyanates and isothiocyanates are used, the urea and thiourea, respectively are generated. アミドは、上記と同じ脱離基及び環状イミドトロンを用いて、PEG酸から得られる(アメリカ特許第5,349,001号、(1994)、Greenwaldなど.)。 Amides, using the same leaving group and cyclic Imidotoron as above, obtained from PEG acids (US Patent No. 5,349,001, (1994), etc. Greenwald.). それらの化合物の反応性は非常に高いが、しかし加水分解を早くする。 Reactivity of these compounds is very high, but faster hydrolysis. 無水琥珀酸との反応から製造されたPEGスクシネートがまた使用され得る。 PEG succinate made from reaction with succinic anhydride can also be used. それにより包含されるエステル基は、接合体を、加水分解に対してより敏感にする(アメリカ特許第5,122,614号、(1992)、Zalipsky)。 It ester groups encompassed by the bonding member, it is more sensitive to hydrolysis (US Patent No. 5,122,614, (1992), Zalipsky). この基は、N−ヒドロキシスクシンイミドにより活性化され得る。 This group may be activated by N- hydroxysuccinimide.

【0068】 さらに、特定のリンカーが導入され得る。 [0068] In addition, certain of the linker can be introduced. 塩化シアヌル酸が最も通常には、使用される(Abuchowskiなど., (1977), J. Biol. Chem., 252, 3578-3581; アメリカ特許第4,179,337号, (1979), Davis など.,; Shaferなど., (1986), J. Pol The cyanuric chloride is most typically such is used (Abuchowski, (1977), J. Biol Chem, 252, 3578-3581;... US Patent No. 4,179,337, (1979), Davis, etc.,;. Shafer such as., (1986), J. Pol
ym. Sci. Polym. Chem. Ed., 24, 375-378)。 ym. Sci. Polym. Chem. Ed., 24, 375-378). 芳香族アミンへのPEGのカップリングが、続くジアゾ化が、ペプチドと現場反応せしめられ得る、非常に反応性のジアゾニウム塩を生成する。 Coupling of PEG to an aromatic amine, followed by diazotization, may be allowed peptide situ reaction generates a highly reactive diazonium salt. アミド連鎖はまた、PEGのアズラクトン誘導体を反応することによって得られ(アメリカ特許第5 Amide linkage may also be obtained by reacting the azlactone derivative of PEG (US patent No. 5
,321,095号, (1994), Greenwald, RB)、従って追加のアミド連鎖が導入される。 , No. 321,095, (1994), Greenwald, RB), hence additional amide linkage is introduced.

【0069】 いくつかのペプチドは多くのリシンを含まないので、1よりも多くのPEGを同じリシンに結合することが好都合である。 [0069] Since some peptides do not comprise many lysine, it is advantageous to combine a number of PEG than 1 in the same lysine. これは、例えば1,3−ジアミノ−2 This, for example, 1,3-diamino -2
−プロパノールの使用により行われ得る。 - it may be performed by the use of propanol. PEGはまた、カルバメート連鎖により酵素のアミノ基に結合され得る(WO95/11 PEG may also be attached to the amino group of the enzyme by carbamate linkage (WO95 / 11
924号、Greenwaldなど.)。 924 No., such as Greenwald.). リシン残基はまた、主鎖として使用され得る。 Lysine residues may also be used as the main chain. 例に使用されるカップリング技法は、WO90/13590号(Enzon)に記載されるN− Coupling technique used in Examples are described in WO WO90 / 13590 (Enzon) N-
スクシンイミジルカルボネート接合技法である。 Is a succinimidyl carbonate bonding techniques.

【0070】 改良されたポリペプチドの調製方法 a)問題の親ポリペプチドの三次元構造の表面上に位置するアミノ酸を同定し、 b)修飾されるべき、前記親ポリペプチドの前記三次元構造の表面上の標的アミノ酸残基を選択し、 c)段階b)において選択された1又は複数のアミノ酸残基を、他のアミノ酸残基により置換し、そして/又は d)段階b)及び/又は段階c)におけるアミノ酸残基にポリマー分子をカップリングする段階を含んで成る、改良されたポリペプチドを調製するための方法を提供することがまた、本発明の目的である。 [0070] to identify amino acid located on the surface of the three-dimensional structure of the improved method a preparation of the polypeptide) problems of the parent polypeptide, b) to be modified, the three-dimensional structure of the parent polypeptide select targeted amino acid residues on the surface, c) one or more amino acid residues selected in step b), was replaced by another amino acid residue, and / or d) step b) and / or step polymer molecules in the amino acid residue at c) comprises the step of coupling, is possible to provide a method for preparing an improved polypeptide also an object of the present invention.

【0071】 段階a)親ポリペプチドの表面上に位置するアミノ酸残基の同定: 三次元構造:本発明の方法を行うためには、問題の親ポリペプチドの三次元構造が必要とされる。 [0071] Step a) Identification of amino acid residues located on the surface of the parent polypeptide: three-dimensional structure: To carry out the process of the present invention is required three-dimensional structure of the parent polypeptide in question. この構造は、例えば、X−線構造、NMR構造又はモデル−構築構造であり得る。 This structure, for example, X- ray structural, NMR structure or model - may be a building structure. Brookhaven Databankは、X−線及びNMR−構造の源である。 Brookhaven Databank is a source of X- lines and NMR- structure. モデル−構築構造は、問題のポリペプチドと少なくとも30%の配列同一性を共有する相同ポリペプチドの1又は複数の三次元構造が存在する場合、当業者により構造され得る。 Model - building structure, if one or more of the three dimensional structure of a polypeptide at least 30% sequence identity to homologous polypeptides which share the problems exist, can be structured by one skilled in the art. モデル構造を構成するために使用され得るいくつかのソフトウェアーパッケージが存在する。 Some software packages may be used to construct a model structure is present. 1つの例は、MSI Inc. からのHomology95.0パッケージである。 One example is Homology95.0 package from MSI Inc..

【0072】 モデル構造の構成のために必要とされる典型的な作用は次の通りである:三次元構造が存在する相同配列の整列、構造的に保存された領域(SCR)の定義、SCR [0072] Typical actions required for the construction of the model structure are: alignment of homologous sequences three-dimensional structure is present, the definition of the structurally conserved regions (SCR), SCR
に対する座標の割り当て、可変領域を置換するために構造データベースにおける構造フラグメント/ループについての調査、それらの領域に対する座標の割り当て、及びエネルギー最少化による構造改良。 Coordinates assignment of relative, investigation of structural fragment / loops in structure databases to replace the variable region, assignment of coordinates to these regions, and structural improvement by energy minimization. 既知の三次元構造に関する大きな挿入体(3個以上の残基)を含む領域は、モデルのためには非常に困難であることが知られており、そして構造予測は注意して考慮されるべきである。 Region containing large inserts (3 or more residues) on known three-dimensional structure are known for the model is very difficult, and structural predictions must be considered with care it is. 問題のポリペプチドの三次元構造、又は既知の構造に対する相同性に基づいての構造のモデルを得たなら、この構造は下記方法の実現のための必須の先行条件として作用する。 If obtain three-dimensional structure of the problem of the polypeptide, or known structural models of based on homology to structures, this structure serves as an essential prerequisite for the realization of the following methods.

【0073】 段階b)標的アミノ酸残基の選択:修飾されるべき標的アミノ酸残基は、Cα−原子がリガンドから15Åよりも短い位置に位置する、それらのアミノ酸残基から、本発明に従って選択される。 [0073] Step b) Selection of target amino acid residues: targeted amino acid residues to be modified are, Ca-atom is located at a position shorter than 15Å from the ligand from those amino acid residues are selected according to the invention that. 好ましい態様においては、可能性あるCβ−原子はCα−原子よりリガンドに接近して存在すべきである。 In a preferred embodiment, potential Cβ- atoms should be present close to the ligand than Cα- atoms. より好ましい態様においては、アミノ酸残基のCα−原子はリガンドから10Åよりも短い位置に位置し、そして前記アミノ酸残基は、少なくとも15%、好ましくは少なくとも20%及びより好ましくは少なくとも30%の接近性(accessibility)を有する。 In a more preferred embodiment, Ca-atoms of the amino acid residues are located at positions shorter than 10Å from the ligand, and the amino acid residues, at least 15%, preferably at least 20% and more preferably at least 30% of the approach having sex (accessibility).

【0074】 段階c)置換: 保存性置換:保存性置換は、ポリペプチド構造に対する置換の衝撃が制限されることを確保するので、ポリペプチドが接合されるべきである場合、ポリペプチドにおける保存性置換を行うことが好ましい。 [0074] Step c) substituted: conservative substitution: conservative substitutions, so to ensure that the impact of the substitution on the polypeptide structure is limited, when the polypeptide is to be bonded, storage stability in the polypeptide it is preferable to carry out the replacement. 追加のアミノ基を供給する場合、これはリシンに対するアルギニンの置換により行われ、両残基は陽性に荷電されているが、しかしリシンのみが結合基として適切な遊離アミノ基を有する。 When supplying additional amino group, this is done by substitution of Arginine against lysine, both residues may have been positively charged, but only the Lysine having a suitable free amino group as a bonding group.

【0075】 追加のカルボン酸基を供給する場合、例えば、保存性置換はアスパラギン酸に対するアスパラギン又はグルタミン酸に対するグルタミンであり得る。 [0075] When supplying additional carboxylic acid group, for example, conservative substitutions may be glutamine for asparagine or glutamic acid for aspartic acid. それらの残基は、サイズ及び形状においては、お互い類似しているが、但し、カルボン酸基は酸性残基上に存在する。 These residues are in the size and shape, although each other similar, provided that carboxylic acid groups present on the acidic residues. SH−基を供給する場合、保存性置換は、システインに対するトレオニン又はセリンの置換により行われ得る。 When supplying SH- groups, conservative substitutions may be made by substitution of threonine or serine to cysteine. 置換するアミノ酸は、主に、適用されるカップリング化学に依存する。 The substituting amino acid is mainly dependent on the coupling chemistry to be applied.

【0076】 カップリングが置換の後に行われない場合、一般的に、置換のためのアミノ酸の選択に対する制限は存在しない。 [0076] If the coupling is not performed after the replacement, in general, restrictions on the choice of amino acids for substitution not present. しかしながら、置換のための好ましいアミノ酸は、極性残基K, R, D, E, H, Q, N, S, T, Cである。 However, preferred amino acid for substitution are polar residues K, R, D, E, H, Q, N, S, T, C. さらに、カップリングが行われない場合、変化は、Cα原子が結合されるリガンドから15Å以内に位置する少なくとも1つのアミノ酸の付加又は欠失の形、好ましくは1つのアミノ酸を欠失する形で存在することができる。 Furthermore, if the coupling is not performed, change, at least one form of the addition or deletion of amino acids located from ligand Cα atoms is bonded within 15 Å, preferably present in a form lacking one amino acid can do. さらに、親タンパク質は、いくつかのアミノ酸を置換し、そして他を欠失し/付加することによって変更され得る。 Moreover, the parent protein may replace some amino acids, and can be modified by others deleted / added.

【0077】 動物モデルにおいて評価される場合、低められた免疫応答を有するポリペプチドを提供する置換のみが、本発明の概念内である。 [0077] When evaluated in an animal model, only substituted to provide a polypeptide with reduced immune response is within the concept of the present invention. 段階c)で行われる突然変異は、当業界において良く知られている標準の技法、 Mutations, standard techniques well known in the art which is performed in step c),
例えば特定部位の突然変異誘発に行われ得る。 For example it may be performed at specific sites of mutagenesis. (例えば、Sambrookなど. (1989) (See, for example, Sambrook, etc.. (1989)
, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NYを参照のこと)。 , Molecular Cloning, A Laboratory Manual, see Cold Spring Harbor, the NY). ヌクレオチド置換の一般的な記載は、例えばFordなど., 1991, Protein Expre General description of nucleotide substitution, for example, Ford like., 1991, Protein expre
ssion and Purification 2, p.95-107に見出され得る。 ssion and Purification 2, can be found in p.95-107.

【0078】 本発明の好ましい態様においては、1つよりも多くのアミノ酸残基が置換され、付加され、又は欠失され、それらのアミノ酸はたぶん、異なった供給されたリガンドに接近して位置する。 [0078] In a preferred embodiment of the present invention, than one even number of amino acid residues are substituted, added, or deleted, those amino acids are probably located close to the different supplied ligand . この場合、タンパク質の官能性が、抗原性、免疫原生、及び/又はアレルゲン性を低めながら、いかに十分に維持されるかを評価することは、困難である。 In this case, the functional protein, antigenic, while low immunogenicity, and / or allergenicity is to assess either maintained how well is difficult. これは、導入された1又は複数の変更されたアミノ酸をそれぞれ有する多様化された変異体のライブラリーを確立し、そして機能の良好な保持、及び同時に、抗原性の良好な低下を示すそれらの変異体を選択することによって達成され得る。 This establishes a library of diversified mutants having introduced one or more modified amino acids, respectively, and good retention of function and at the same time, their showing a good reduction in antigenicity It may be accomplished by selecting mutants.

【0079】 プロテアーゼの場合、これは、酵素活性(下記実験セクションにおいて記載されるように)、及び抗原結合性(例えば、当業界において知られている方法を用いての競争ELISAによる)についてその分泌された変異体をアッセイすることによって試験され得る(例えば、J. Clausen, Immunochemical Techniques For Th [0079] For the protease, which is (as described below in the experimental section) enzyme activity and antigen binding (e.g., by competition ELISA of using methods known in the art) for the secretion It may be tested by assaying the mutant (e.g., J. Clausen, Immunochemical Techniques for Th
e Identification and Estimation of Macromolecules, Elsevier, Amsterdam, e Identification and Estimation of Macromolecules, Elsevier, Amsterdam,
1988 p.187-188を参照のこと)。 See 1988 p.187-188). 特に、競争ELISAは、ELISAプレート上に披露された野生型プロテアーゼにより行われ、そしてプロテアーゼ変異体の存在下でウサギからの特異的ポリクローナル抗−プロテアーゼ抗血清と共にインキュベートされ得る。 In particular, competition ELISA is performed by the wild-type protease shown off to ELISA plates and specific polyclonal anti from rabbit in the presence of protease variants - may be incubated with the protease antiserum.

【0080】 本発明のそれらの態様の範囲は、単なる例示であって、プロテアーゼに制限されない。 [0080] scope of those aspects of the present invention are merely illustrative and are not limited to proteases. 多様化されたライブラリーは、当業者に知られている広範囲の技法により確立され得る(Reetz MT; Jaeger KE, in Biocatalysis-from Discovery to A Diversified library can be established by a wide range of techniques known to those skilled in the art (Reetz MT; Jaeger KE, in Biocatalysis-from Discovery to A
pplication edited by Fessner WD, vol. 200, pp. 31-57 (1999); Stemmer, Na . Pplication edited by Fessner WD, vol 200, pp 31-57 (1999);. Stemmer, Na
ture, Vol. 370, p.389-391, 1994, Zhao and Arnold, Proc. Natl. Acad. Sci. ture, Vol. 370, p.389-391, 1994, Zhao and Arnold, Proc. Natl. Acad. Sci.
, USA, Vol. 94, pp. 7997-8000, 1997; 又はYano など., Proc. Natl. Acad. S , USA, Vol 94, pp 7997-8000, 1997;...... Etc. or Yano, Proc Natl Acad S
ci., USA, vol. 95, pp 5511-5515, 1998)。 ci., USA, vol. 95, pp 5511-5515, 1998).

【0081】 より好ましい態様においては、置換は、次の段階を含んで成る方法により見出される:1)置換、付加及び/又は欠失の範囲が列挙され、2)アミノ酸配列におけるランダム化されたそれらの変化のサブセットを、例えばランダム突然変異誘発により標的遺伝子中に導入するライブラリーを企画し、3)ライブラリーが発現され、そして好ましい変異体が選択される。 [0081] In a more preferred embodiment, substitutions are found by a process comprising the following steps: 1) substitution, addition and / or scope of the deletions are listed, 2) randomized thereof in the amino acid sequence a subset of changes, organized a library to be introduced into the target gene, for example, by random mutagenesis, 3) the library is expressed, and preferred variants are selected. 最も好ましい態様においては、 In a most preferred embodiment,
この方法は、追加のスクリーニング段階及び/又は最初の段階のスクリーニングから的中のファミリー混合(shuffling)(jR Ness, など, Nature Biotechnol The method may include additional screening steps and / or the first stage family mixing center from screening (shuffling) (jR Ness, etc., Nature Biotechnol
ogy, vol. 17, p.893-896, 1999), 及び/又は遺伝学的手段によりアレルゲン性を低める他の方法との組み合わせ(例えば、WO92/10755号に開示される)により補充される。 ogy, vol. 17, p.893-896, 1999), and / or combination with other methods to lower allergenic by genetic means (e.g., is replenished by to) disclosed in Patent WO92 / 10755.

【0082】 部位特定突然変異誘発性生成:突然変異誘発の前、興味あるポリペプチドをコードする遺伝子が適切なベクターによりクローン化されるべきである。 [0082] Site-directed mutagenesis of product: before mutagenesis, the gene encoding the polypeptide of interest should be cloned by a suitable vector. 特定部位のおいて突然変異を誘発するための方法は、下記に記載される。 Methods for inducing mutations have up for specific sites are described below.

【0083】 ポリペプチドコードの遺伝子がクローン化され、突然変異のための所望する部位が同定され、そして元の残基を置換するための残基が決定されると、それらの突然変異は、合成オリゴヌクレオチドを用いて導入され得る。 [0083] Gene polypeptide coding was cloned, desired sites for mutation are identified, and the residues to replace the original residue is determined, those mutations, synthetic It can be introduced using oligonucleotide. それらのオリゴヌクレオチドは、所望する突然変異部位を端に有するヌクレオチド配列を含み;変異体ヌクレオチドがオリゴヌクレオチド合成の間、導入される。 These oligonucleotides contain nucleotide sequences having at an end a desired mutation sites; mutant nucleotides during oligonucleotide synthesis, it is introduced. 好ましい方法においては、特定部位の突然変異誘発が、Kammann など. (1989) Nucleic Acids R In a preferred method, the site-directed mutagenesis, such as Kammann. (1989) Nucleic Acids R
esearch 17(13), 5404, 及びSarker G. and Sommer, SS (1990) Biotechnique esearch 17 (13), 5404, and Sarker G. and Sommer, SS (1990) Biotechnique
s 8, 404-407 により記載されるSOE−PCR突然変異誘発技法により行われる。 s 8, is carried out by SOE-PCR mutagenesis technique described by 404-407.

【0084】 段階d)任意に修飾された親酵素へのポリマー分子のカップリング:本発明のポリヌクレオチド−ポリマー接合体は、上記技法を包含する、当業界において知られているいずれかのカップリング方法により調製され得る。 [0084] Step d) coupling of the polymer molecules to the parent enzyme is optionally modified: the polynucleotides of the present invention - polymer conjugates include the techniques, either coupling known in the art It can be prepared by methods.

【0085】 酵素変異体の調製: 接合されるべき酵素変異体は、いずれかの適切な方法により構成され得る。 [0085] Preparation of Enzyme Variants enzyme variant to be joined can be constituted by any suitable method. 多くの方法が当業界において十分に確立されている。 A number of methods have been well established in the art. 例えば、本発明の酵素変異体は、例えば、WO89/06279号(Novo Nordisk A/S), EP 130,756号 (Genentech), EP For example, enzyme variants of the present invention, for example, No. WO89 / 06279 (Novo Nordisk A / S), EP No. 130,756 (Genentech), EP
479,870号 (Novo Nordisk A/S), EP 214,435号 (Henkel), WO87/04461号 (Amge No. 479,870 (Novo Nordisk A / S), EP No. 214,435 (Henkel), No. WO87 / 04461 (Amge
n), WO87/05050号 (Genex), EP 特許出願番号第87303761号 (Genentech), EP 26 n), No. WO87 / 05050 (Genex), EP Patent Application No. 87303761 (Genentech), EP 26
0,105号 (Genencor), WO88/08028号 (Genex), WO88/08033号 (Amgen), WO88/081 No. 0,105 (Genencor), No. WO88 / 08028 (Genex), No. WO88 / 08033 (Amgen), WO88 / 081
64号 (Genex), Thomas など. (1985) Nature, 318 375-376, Thomas など. (198 64 No. (Genex), Thomas, etc.. (1985) Nature, 318 375-376, Thomas and so on. (198
7) J. Mol. Biol., 193, 803-813; Russel and Fersht (1987) Nature 328 496- .. 7) J. Mol Biol, 193, 803-813; Russel and Fersht (1987) Nature 328 496-
500に記載される同じ材料及び方法を用いて生成され得る。 It can be produced using the same materials and methods described in 500.

【0086】 注目のポリペプチドへのポリマー分子のカップリング:前記段落を参照のこと。 [0086] Coupling of the polymer molecules to the polypeptide of interest: see the paragraph. 免疫原性及びアレルゲン性: “免疫原性”は、“抗原性”及び“アレルゲン性”よりも広い用語であり、そして外因性物質の存在に対して免疫系の応答を表す。 Immunogenicity and allergenicity: "immunogenic" is a broad term than "antigenic" and "allergenicity", and represents the response of the immune system to the presence of exogenous material. 前記外因性物質は、誘発される免疫応答のタイプに依存して、免疫原、抗原及びアレルゲンと呼ばれる。 The exogenous material, depending on the type of immune response elicited, called immunogens, antigens and allergens. “免疫原”は、動物及びヒトの循環系中に導入される場合、免疫グロブリンの形成をもたらす免疫応答を刺激することができる物質として定義され得る。 "Immunogen", as introduced into an animal and the circulatory system of a human, may be defined as a substance capable of stimulating an immune response that results in the formation of immunoglobulin.

【0087】 用語“抗原”とは、非自己分子として認識される場合、抗体を単独で生成することができる物質を言及する。 [0087] The term "antigen", as recognized as non-self molecules, refers to substances which can generate antibodies alone. さらに、“アレルゲン”とは、IgE抗体(ヒトにおいて、及び動物において相当の効果を有する分子)によるアレルギー性感作又はアレルギー性応答を引き起こすことができる抗原として定義され得る。 Furthermore, "allergen" refers to (in humans, and molecules with considerable effects in animals) IgE antibodies may be defined as an antigen that can cause allergic sensitization or allergic response by.

【0088】 免疫原性の評価:免疫原性の評価は、循環系中に免疫原を入れるために動物に皮下注射し、そしてその対応する親ポリペプチドの応答と前記応答とを比較することによって行われる。 [0088] Immunogenicity Evaluation: Evaluation of immunogenicity, animals were injected subcutaneously to add immunogen into the circulation system, and by comparing the response and the response of a parent polypeptide the corresponding It takes place. ヒト及び動物の身体の“循環系”とは、本発明においては、主に心臓及び血管から成るシステムを意味する。 The "circulation" of the human and animal body, in the present invention mainly means a system consisting of the heart and blood vessels. 心臓は、血管系における血液循環を維持するための必要なエネルギーを供給する。 Heart supplies the necessary energy for maintaining blood circulation in the vascular system. 循環系は、血液が酵素、栄養物、ホルモン、及び細胞調節のための重要な他の物質を組織中に輸送する場合、生物の輸送システムとして機能する。 Circulatory system, blood enzymes, nutrients, hormones, and if a key other substances for cellular regulation is transported into tissues, functions as a biological delivery system. さらに、血液は、組織からの二酸化炭素を肺に、及び残留物質を、例えば腎臓に運ぶ。 Furthermore, blood, the carbon dioxide from the tissue into the lungs, and the residual material, e.g., carry the kidney. さらに、血液は、温度調節、及び免疫系を包含する、 Further, the blood includes, temperature regulation, and the immune system,
身体の防御機構のために重要なものである。 It is important for the body's defense mechanism.

【0089】 多くのインビボ動物モデルが、ポリペプチドの免疫原可能性の評価のために存在する。 [0089] A number of in vivo animal models exist for the evaluation of the immunogenic potential of the polypeptide. それらのモデルのいくつかは、ヒトにおける危険な評価のための適切な基礎を付与する。 Some of these models, to impart the appropriate basis for a risk assessment in humans. 適切なモデルは、マウスモデルを包含する。 Appropriate model includes a mouse model. このモデルは、修飾された及び修飾されていないポリペプチドを皮下注射されたBalb/CマウスにおけるIgG応答の形での免疫原性応答の同定を可能にする。 This model allows for the identification of immunogenic response in the form of IgG response in Balb / C mice the modified and unmodified polypeptide were injected subcutaneously. また他の動物モデルも、免疫原生の可能性の評価のために使用され得る。 Also other animal models can be used for evaluation of potential immunogenicity.

【0090】 本発明の“低められた免疫原性”を有するポリペプチドは、生成される抗体、 [0090] polypeptide having "the lowered immunogenicity" of the present invention, antibodies produced,
例えばヒトにおける免疫グロブリン、及び免疫応答を導くことができる特定動物において相当の効果を有する分子の量が、循環系中に導入される場合、その対応する親ポリペプチドに比較して、有意に低められることを示す。 Such as an immunoglobulin in humans, and the amount of molecules having a considerable effect in certain animal capable of directing the immune response when introduced into the circulatory system, as compared to the parent polypeptide its corresponding significantly lower indicating that be. Balb/Cマウスに関しては、IgG応答は、ポリペプチドの免疫原性可能性の良好な表示を付与する。 For the Balb / C mice, IgG response confers good display immunogenic potential of polypeptides.

【0091】 アレルゲン性の評価:アレルゲン性の評価を、気管内(気管中への)投与される親酵素の効果と、その対応する本発明の修飾された酵素の効果とを比較する吸収試験により行われ得る。 [0091] Allergenicity Evaluation: The evaluation of allergenicity, (into the trachea) intratracheally and effectiveness of the parent enzyme to be administered, the absorption test to compare the effect of the modified enzyme of the corresponding present invention It can be carried out. 多くのインビボ動物モデルが、酵素のアレルゲン性の評価のために存在する。 Many in vivo animal models exist for assessment of the allergenicity of the enzyme.
それらのモデルのいくつかは、ヒトにおける危険な評価のための適切な基礎を付与する。 Some of these models, to impart the appropriate basis for a risk assessment in humans. 適切なモデルは、テンジクネズミモデル及びマウスモデルを包含する。 Suitable models include a guinea pig model and a mouse model.
それらのモデルは、前もって感作された動物において誘発される誘発反応の機能として呼吸アレルゲンの同定を可能にする。 These models allow the identification of respiratory allergens as a function of the induced by an evoked response in previously sensitized animals. それらのモデルによれば、強張されたアレルゲンは、動物の気管内に導入される。 According to these models, TsuyoCho allergen is introduced into the animal's trachea.

【0092】 テンジクネズミの適切な株、すなわちDunkin Hartley株は、ヒトのように、アレルギー応答に関連してIgE抗体を生成しない。 [0092] Suitable strains of the guinea pig, i.e. Dunkin Hartley strain, as human, do not produce IgE antibodies in connection with the allergic response. しかしながら、それらは、吸入されたポリペプチド、例えば酵素に対するそれらのアレルゲン応答を担当するもう1つのタイプの抗体、すなわちIgG1A及びIgG1B(例えば、Prento, ATLA, 19, However, they are inhaled polypeptides, for example another type of antibody that is responsible for their allergenic response to the enzyme, i.e. IgG1A and IgG1B (e.g., Prento, ATLA, 19,
p.8-14, 1991を参照のこと)を生成する。 p.8-14, to generate a see 1991). 従って、Dunkin Hartley 動物モデルを用いる場合、IgG1A及びIgG1Bの相対的量が、アレルゲン性レベルの尺度である。 Therefore, when using the Dunkin Hartley animal model, the relative amount of IgG1A and IgG1B is a measure of the allergenicity level.

【0093】 Balb/Cマウス株は、気管内、経皮内又は皮下暴露のために適切である。 [0093] Balb / C mice strain, intratracheal, are suitable for transdermal or subcutaneous exposure. Balb/C Balb / C
マウスは、アレルギー応答としてIgEを生成する。 Mice produces IgE as the allergic response. テンジクネズミ及びマウスにおける呼吸アレルゲンの評価についての詳細は、 Details of the evaluation of the respiratory allergens in guinea pigs and mice,
Kimber など., (1996), Fundamental and Applied Toxicology, 33, p.1-10により記載されている。 Etc. Kimber., (1996), Fundamental and Applied Toxicology, 33, it has been described by p.1-10. 他の動物、例えばラット、ウサギ、等はまた、比較研究のためにも使用され得る。 Other animals, such as rats, rabbits, etc. also can be used for comparative studies.

【0094】 組成物:本発明は、本発明の修飾されたポリペプチドを含んで成る組成物に関する。 [0094] Compositions: The present invention relates to a composition comprising a modified polypeptide of the present invention. 前記組成物は、医薬又は産業用組成物であり得る。 The composition may be a pharmaceutical or industrial composition. 前記組成物はさらに、他のポリペプチド、タンパク質又は酵素、及び/又は例えば、洗剤、例えば石鹸棒、家庭用品、農業用化学物質、パーソナルケアー製品、例えばスキンケアー組成物、コンタクトレンズ、経口及び経皮用医薬のための清浄組成物、繊維を処理するため組成物、食品/飼料の製造のために使用される組成物、等に通常使用される成分を含んで成る。 The composition further, other polypeptides, proteins or enzymes, and / or, for example, detergents, such as soaps bars, household articles, agrochemicals, personal care products, for example skin care composition, contact lenses, oral and cleaning composition for skin pharmaceutical composition for treating fibers, the composition used for the preparation of food / feed, usually contain ingredients used in equal made.

【0095】 ポリペプチドの使用:本発明はまた、ポリペプチドの免疫応答を低めるためへの本発明の方法の使用にも関する。 [0095] Use of a polypeptide: The present invention also relates to the use of the method of the present invention for lowering the immune response of polypeptides. 産業用製品、例えば洗剤、例えば洗濯、皿洗い及び硬質表面用洗剤、食品分は飼料製品、パーソナルケアー製品及び繊維製品のアレルゲン性を低めるために、 Industrial products, for example detergents, e.g. laundry, detergent dishwashing and hard surface, the food component may feed products, in order to reduce the allergenicity of personal care products and textile products,
本発明に従って修飾されたポリペプチド−ポリマー接合体又はポリマーを使用することがまた、本発明の目的である。 Modified polypeptides according to the invention - also be used a polymer conjugate or polymer, an object of the present invention.

【0096】 材料及び方法:材料: 酵素: PD498:WO93/24623号に示されるスブチリシン型のプロテアーゼ。 [0096] Materials and Methods: Materials: Enzyme: PD498: WO93 / 24623 Patent in subtilisin-type protease are shown. PD498の配列は、配列番号1及び2に示される。 Sequence of PD498 is shown in SEQ ID NO: 1 and 2. Savinase(商標): この配列は配列番号3に示される(Novo Nordisk A/Sから入手できる)。 Savinase (TM): This sequence is shown in SEQ ID NO: 3 (available from Novo Nordisk A / S).

【0097】 スブチリシンBPN - :この配列は、SWISS−PROTデータベースに見出され得る。 [0097] subtilisin BPN -: This sequence can be found in SWISS-PROT database.
この配列はまた、GALLAGHER T., OLIVER J., BOTT R., BETZEL C., GILLILAND G This arrangement also, GALLAGHER T., OLIVER J., BOTT R., BETZEL C., GILLILAND G
.L.; “Subtilisin BPN' at 1.6-A resolution: Analysis for Discrete Disor .L .; "Subtilisin BPN 'at 1.6-A resolution: Analysis for Discrete Disor
der and Comparison of Crystal Forms”; Acta Crystallogr. D 52: 1125-1135 . Der and Comparison of Crystal Forms "; Acta Crystallogr D 52: 1125-1135
(1996) にも開示される。 (1996) are also disclosed in. 酵素は、Novo Nordisk A/Sから入手できる。 Enzyme is available from Novo Nordisk A / S.

【0098】 アミラーゼAA560:アルカリα−アミラーゼは、バチルスsp. DSM 12649の株から誘導され得る。 [0098] amylase AA560: alkaline α- amylase may be derived from a strain of Bacillus sp DSM 12649.. この株は、Deutshe Sammlung von Microorganismen und Zellk This strain, Deutshe Sammlung von Microorganismen und Zellk
ulturen GmbH (DSMZ)、Mascheroder Weg lb, D-38124 Braunschweig DEに、特許手続きの目的のために微生物の寄託の国際認識に基づいて、ブダペスト条件下で、本発明者により、1999年1月25日に寄託された。 ulturen GmbH (DSMZ), Mascheroder Weg lb, in D-38124 Braunschweig DE, based on the international recognition of the Deposit of Microorganisms for the purposes of Patent Procedure, in Budapest under the conditions, by the present inventors, January 25, 1999 It was deposited in. その配列は、配列番号4に示される。 Its sequence is shown in SEQ ID NO: 4.

【0099】 菌株: B.スブチリス309及び147は、バチルス・レンタス(Bacillus lentus)の変異体であり、NCIBに、寄託番号NCIB10309及び10147として寄託され、そして本明細書に引用により組み込まれているアメリカ特許第3,723,250号に記載されている。 [0099] Strains: B. subtilis 309 and 147 are variants of Bacillus lentus (Bacillus lentus), to the NCIB, which is incorporated by reference been deposited as accession number NCIB10309 and 10147, and herein the United States It is described in Japanese Patent No. 3,723,250. E.コリMC1000 (MJ Casadaban and SN Cohen (1980): J. Mol. Biol. 138: E. coli MC1000 (MJ Casadaban and SN Cohen (1980):.. J. Mol Biol 138:
179-207) が、従来の方法により、r-, m+ にされ、そしてまた、アメリカ特許番号039,298号にも記載さえる。 179-207) it is, by conventional methods, r-, is to m +, and also feel more alert also described in US Patent No. 039,298.

【0100】 ベクター: pPD498: PD498プロテアーゼ(配列番号2)をコードする野生型遺伝子を含むE [0100] Vector: pPD498: PD498 protease (SEQ ID NO: 2) encoding the E containing the wild-type gene
.コリ−B.スブチリスシャトルベクター(セクション6.2.1.6下でアメリカ特許第5,621,089号に記載される)。 . Coli -B. Subtilis shuttle vector (described in US Patent No. 5,621,089 under section 6.2.1.6). 同じベクターが、E.コリにおける突然変異誘発及びB.スブチリスにおける発現のために使用される。 The same vector is used for expression in mutagenesis and B. subtilis in E. Coli. 材料、化学物質及び溶液:ホースラディシュペルオキシダーゼによりラベルされた抗−ラット−Ig(Dako Materials, chemicals and solutions: labeled anti horseradish peroxidase - rats -Ig (Dako
, DK, P162, #031; 希釈度1:1000)。 , DK, P162, # 031; dilution of 1: 1000). マウス抗−ラットIgE(Serotec MCA193; 希釈度1:200)。 Mouse anti - rat IgE (Serotec MCA193; dilution 1: 200). ラット抗−マウスIgE(Serotec MCA419; 希釈度1:100)。 Rat anti - mouse IgE (Serotec MCA419; dilution 1: 100). ビオチンによりラベルされたマウス抗−ラットIgG1モノクローナル抗体(Zyme Mice were labeled with biotin anti - rat IgG1 monoclonal antibody (Zyme
d03-9140; 希釈度1:1000)。 d03-9140; dilution of 1: 1000). ビオチンによりラベルされたラット抗−マウスIgG1モノクローナル抗体(Sero Rats were labeled with biotin anti - mouse IgG1 monoclonal antibody (Sero
tec MCA 336 B; 希釈度1:1000)。 tec MCA 336 B; dilution 1: 1000).

【0101】 ストレプタビジン−ホースラディシュペルオキシダーゼ(Kirkegard & Perry [0101] streptavidin - horseradish peroxidase (Kirkegard & Perry
14-30-00, 希釈度1:1000)。 14-30-00, dilution 1: 1000). CovaLink NH 2プレート(Nunc. カタログ番号459439);塩化シアヌル(Aldri CovaLink NH 2 plates (Nunc Cat # 459439.); Cyanuric chloride (Aldri
ch);アセトン(Merck);ラット抗−マウスIgG1、ビオチン(Serotec, カタログ番号MCA336B);ストレプタビジン、ペルオキシダーゼ(KPL);オルト−フェニレン−ジアミン(OPD)(Kem−en−Tec、カタログ番号4260);H 2 O 2 , 30%(M ch); acetone (Merck); rat anti - mouse IgG1, biotin (Serotec, Cat. No. MCA336B); streptavidin, peroxidase (KPL); ortho - phenylene - diamine (OPD) (Kem-en-Tec, Catalog No. 4260); H 2 O 2, 30% ( M
erck);Tween 20 (Merck); 脱脂乳粉末(Difco);H 2 SO 4 (Merck)。 erck); Tween 20 (Merck) ; skimmed milk powder (Difco); H 2 SO 4 (Merck).

【0102】 緩衝液及び溶液: 炭酸緩衝液(0.1M, pH10 (1L)): Na 2 CO 3 10.60g PBS (pH7.2 (1L)): NaCl 8.00g KCl 0.20g K 2 HPO 4 1.04g KH 2 PO 4 0.32g [0102] Buffers and solutions: carbonate buffer (0.1M, pH10 (1L)) : Na 2 CO 3 10.60g PBS (pH7.2 (1L)): NaCl 8.00g KCl 0.20g K 2 HPO 4 1.04g KH 2 PO 4 0.32g

【0103】 洗浄緩衝液PBS, 0.05% (v/v) Tween 20; 阻止緩衝液PBS, 2% (wt/v) 脱脂乳粉末; 希釈緩衝液PBS, 0.05% (v/v) Tween 20, 0.5% (Wt/v) 脱脂乳粉末; クエン酸緩衝液(0.1M, pH5.0-5.2 (1L)): クエン酸ナトリウム 20.60g クエン酸 6.30g [0103] Wash buffer PBS, 0.05% (v / v) Tween 20; blocking buffer PBS, 2% (wt / v) skimmed milk powder; dilution buffer PBS, 0.05% (v / v) Tween 20, 0.5 % (Wt / v) skimmed milk powder; citrate buffer (0.1M, pH5.0-5.2 (1L)): sodium citrate 20.60g citric acid 6.30g

【0104】 硼酸ナトリウム、borax (Sigma); 3,3−ジメチルグルタル酸(Sigma); CaCl 2 (Sigma); トレシスクロライド(2,2,2−トリフルオロエタンスルホニルクロライド)(Fluka); 1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド(EDC)(F [0104] Sodium borate, borax (Sigma); 3,3- dimethyl glutaric acid (Sigma); CaCl 2 (Sigma ); Torre cis chloride (2,2,2-trifluoroethane sulphonyl chloride) (Fluka); 1- ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) (F
luka); luka);

【0105】 N−ヒドロキシスクシンイミド(Fluka art. 56480); ホスゲン(Fluka art. 79280); ラクトース(Merck 7656); Sigma からのPMSF(フェニルメチルスルホニルフルオリド); スクシニル−アラニン−アラニン−プロリン−フェニルアラニン−パラ−ニトロアニリド(Suc−AAPF−pNP)Sigma no. S-7388, Mw 624.6g/モル。 [0105] N- hydroxysuccinimide (. Fluka art 56480); phosgene (. Fluka art 79280); Lactose (Merck 7656); PMSF from Sigma (phenylmethylsulfonylfluoride); succinyl - alanine - alanine - proline - phenylalanine - para -. nitroanilide (Suc-AAPF-pNP) Sigma no S-7388, Mw 624.6g / mol.

【0106】 Covalinkプレートの活性化:・アセトン1ml当たり10mgの塩化シアヌルの新鮮な原液。 [0106] Covalink plate activation of: - fresh stock solution of cyanuric chloride of acetone 1ml per 10mg. ・使用の直前、撹拌しながら、PBS中に前記塩化シアヌル原液を希釈し、1mg/m · Immediately prior to use, with stirring, by diluting the cyanuric chloride stock solution into PBS, 1 mg / m
lの最終濃度にする。 To a final concentration of l. ・CovaLink NH 2プレートの個々のウェルに前記希釈溶液100mlを添加し、そして室温で5分間インキュベートする。 · CovaLink NH 2 plates adding the diluted solution 100ml to each well and incubated at room temperature for 5 minutes. ・PBSにより3度洗浄する。 · Wash 3 times with PBS. ・新しく調製された、活性化されたプレートを50℃で30分間乾燥せしめる。 · Newly prepared, the activated plates allowed to dry at 50 ° C. 30 min. ・すぐに、シールテープにより個々のプレートを密封する。 - immediately, to seal the individual plates by a seal tape. ・予備活性化されたプレートを、プラスチックバッグに維持される場合、3週間、室温で貯蔵する。 The replacement activated plates, when kept in a plastic bag, 3 weeks and stored at room temperature.

【0107】 試験動物:雌のBalb/Cマウス(約20g)は、Bomholdtgaard, Ry, Denmarkから購入された。 [0107] Test Animals: Female Balb / C mice (about 20g) were purchased Bomholdtgaard, Ry, from Denmark. 雌のBrown-Norway ラットは、平均180gの重量である。 Female Brown-Norway rats, is the weight of the average 180g.

【0108】 装置: XCELII(Novex); ELISA リーダー(Uvmax, Molecular Devices); HPLC (Waters); PFLC(Pharmacia); Superdex−75カラム、Pharmacia, SWからのMono-Q, Mono S; SLT:SLT LabInstrument からのFotometer; サイズ排除クロマトグラフィー(Sepherogel TSK-G2000 SW); サイズ排除クロマトグラフィー(Superdex 200, Pharmacia, SW); Amicon Cell。 [0108] apparatus: XCELII (Novex); ELISA reader (Uvmax, Molecular Devices); HPLC (Waters); PFLC (Pharmacia); Superdex-75 column, Pharmacia, Mono-Q from SW, Mono S; SLT: SLT LabInstrument Fotometer from; size exclusion chromatography (Sepherogel TSK-G2000 SW); size exclusion chromatography (Superdex 200, Pharmacia, SW); Amicon Cell.

【0109】 DNA操作のための酵素:特にことわらない限り、DNA操作のためのすべての酵素、例えばエンドヌクレアーゼ、リバーゼ、等は、New England Biolabs. Inc. から得られる。 [0109] enzymes for DNA manipulation: unless otherwise indicated, all enzymes for DNA manipulations, for example endonuclease, lipase, etc., obtained from New England Biolabs Inc... 培地: BPX : 組織(1L当たり) ジャガイモ澱粉 100g 粉砕された大麦 50g 大豆粉 20g Na 2 HPO 4・12H 2 O 9g プルロニック 0.1g カゼイン酸ナトリウム 10g 培地における澱粉がα−アミラーゼにより液化され、そしてその培地が、120 Medium: BPX: tissue (1L per) Potato starch 100g milled barley 50g Soybean flour 20g Na 2 HPO 4 · 12H 2 O 9g Pluronic 0.1g starch in sodium caseinate 10g medium is liquefied by α- amylase and the medium There, 120
℃で45分間、加熱することによって減菌される。 ℃ for 45 minutes, it is sterilized by heating. 減菌の後、培地のpHが、炭酸水素ナトリウムの添加により0.1Mの濃度にすることにより、9に調節される。 After sterilization, pH of the medium, by a concentration of 0.1M by the addition of sodium bicarbonate, is adjusted to 9.

【0110】 方法: 一般的な分子生物学方法:特にことわらない限り、DNA操作及び形質転換が、分子生物学の標準の方法を用いて行われた(Sambrook など. (1989) Molecular cloning: A laboratory ma [0110] Method: General molecular biology methods: Unless otherwise stated, DNA manipulations and transformation was performed using a molecular biology standard methods (Sambrook, etc. (1989) Molecular cloning:. A laboratory ma
nual, Cold Spring Harbor lab., Cold Spring Harbor, NY; Ausubel, FM など. (eds.) “Current protocols in Molecular Biology”. John Wiley and So . Nual, Cold Spring Harbor lab, Cold Spring Harbor, NY;. (. Eds). Ausubel, FM, such as "Current protocols in Molecular Biology" John Wiley and So
ns, 1995; Harwood, CR, and Cutting, s. M. (eds.) “Molecular Biologic ns, 1995;. (. eds) Harwood, CR, and Cutting, s M. "Molecular Biologic
al Methods for Bacillus”. John Wiley and Sons, 1990)。DNA操作のための酵素は、その供給者の規定に従って使用された。 al Methods for Bacillus ". John Wiley and Sons, 1990) .DNA enzyme for the operation were used in accordance with the provisions of its suppliers.

【0111】 PD498変異体の発酵: B.スブチリスにおけるPD498変異体の発酵を、100mlのBPXの培地を含む500mlのそらせ板付きの三角フラスコにおいて、回転振盪テーブル(300 rpm)上で30 [0111] PD498 fermentation variants: the fermentation of PD498 variants in B. subtilis, the baffle with a conical flask of 500ml containing BPX medium of 100 ml, on a rotary shaker table (300 rpm) 30
℃で5日間、行う。 ℃ in 5 days, it does. 例えば2Lのブイヨンを製造するために、20の三角フラスコを同時に発酵する。 For example in order to produce a broth of 2L, simultaneously fermenting 20 Erlenmeyer flask.

【0112】 PD498変異体の精製:約1.6L のPD498変異体発酵ブイヨンを、1Lのビーカーにおいて、5000rpmで35 [0112] of PD498 variants Purification: The PD498 variant fermentation broth of about 1.6 L, the beaker 1L, 35 at 5000rpm
分間、遠心分離する。 Min, centrifuged. 上清液を、10%の酢酸を用いて、pH10に調節し、そしてSe The supernatant using 10% acetic acid, adjusted to pH 10, and Se
itz Supra S100 フィルタープレート上で濾過する。 itz Supra S100 is filtered through a filter plate. 濾液を、Amicon S1Y10 UFカートリッジを備えつけられたAmicon CH2A UF ユニットを用いて、約400mlに濃縮する。 The filtrate using Amicon CH2A UF unit equipped with Amicon S1Y10 UF cartridge, concentrated to approximately 400 ml. UF濃縮物を遠心分離し、そしてpH7でのBacitracin 親和性カラム上で室温で、吸収の前、濾過した。 The UF concentrate was centrifuged and at room temperature on Bacitracin affinity column at pH 7, prior to absorption, and filtered. PD498変異体を、pH7に調節された、0.01Mのジメチル−グルタル酸、0.1Mの硼酸及び0.002Mの塩化カルシウムを含む緩衝溶液において、25%の2−プロパノール及び1Mの塩酸ナトリウムを用いて、室温でバシトラシンカラムから溶出する。 The PD498 variant was adjusted to pH 7, 0.01 M dimethyl - glutaric acid, in a buffer solution containing boric acid and calcium chloride 0.002M of 0.1 M, using sodium hydrochloric acid 25% 2-propanol and 1M, eluted from Basi tiger thin column at room temperature.

【0113】 バシトラシン 精製段階からのプロテアーゼ活性を有する画分を組合し、そしてpH6.0に調節された、0.01Mのジメチルグルタル酸、0.1Mの硼酸及び0.002Mの塩化カルシウムを含む緩衝液により平衡化された750mlのSephadex G25 カラム(5c [0113] Equilibrium were combined fractions with protease activity from the Bacitracin purification step, and adjusted to pH 6.0, dimethyl glutaric acid 0.01 M, with a buffer containing boric acid and calcium chloride 0.002M in 0.1M Sephadex G25 column of been 750 ml (5c
mの直径)に適用する。 To apply to the diameter) of m.

【0114】 Sephadex G25カラムのタンパク質分解活性を有する画分を組合し、そしてpH6. [0114] were combined Fractions with proteolytic activity of Sephadex G25 column and pH 6.
0に調節された、0.01Mのジメチルグルタル酸、0.1Mの硼酸及び0.002Mの塩化カルシウムを含む緩衝液により平衡化された150mlのCM Sepharose CL 6B カチオン交換カラム(5cmの直径)に適用する。 0 is adjusted to apply to dimethyl glutaric acid 0.01 M, CM Sepharose CL 6B cation exchange column equilibrated 150ml with a buffer containing boric acid and calcium chloride 0.002M of 0.1 M (diameter 5 cm). プロテアーゼを、1Lの同じ緩衝液中、0〜 Protease, in the same buffer 1L, 0 to
0.5Mの塩化ナトリウムの線状グラジエントを用いて溶出する。 Eluting with a linear gradient of 0.5M sodium chloride. CM Sephasose カラムからのプロテアーゼ含有画分を組合し、そして2μのフィルターを通して濾過する。 It was combined protease containing fractions from the CM Sephasose column, and filtered through a 2μ filter.

【0115】 分子量の決定:タンパク質の電気泳動分離を、4〜20%のグラジエントのSDSポリアクリルアミドゲル(Novex)を用いて、標準の方法により行った。 [0115] Molecular weight determination: the electrophoretic separation of proteins, using a 4-20% gradient of SDS-polyacrylamide gels (Novex), were performed by standard methods. タンパク質を銀染色により検出した。 The proteins were detected by silver staining. 分子量を、NovexからのMark−12(商標)広範囲分子量標準の移動度に関連して測定した。 The molecular weight was measured in relation to the Mark-12 (TM) broad molecular weight standards mobility from Novex.

【0116】 プロテアーゼ活性: Suc−Ala−Ala−Pro−Phe−pNaによる分析: プロテアーゼは、ペプチドとp−ニトロアニリンとの間の結合を分解し、405nm [0116] Protease activity: Suc-Ala-Ala-Pro -Phe-pNa Analysis: protease decomposes the bonds between the peptide and p- nitroaniline, 405 nm
で吸収する可視の黄色の色を付与する。 In to give the color of the visible yellow to absorb. 緩衝液:例えばBritton and Robinson 緩衝液(pH8.3)。 Buffer: e.g. Britton and Robinson buffer (pH 8.3). 基質:100mg のsuc−AAPF−pNaを、1mlのジメチルスルホキシド(DMSO)に溶解し、この100mlを、Britton and Robinson 緩衝液10mlに希釈する。 Substrate: The suc-AAPF-pNa of 100mg, was dissolved in dimethyl sulfoxide 1 ml (DMSO), the 100 ml, diluted to Britton and Robinson buffer 10 ml. 基質及びプロテアーゼ溶液を混合し、そして吸光度を、時間の関数として405n Substrate and protease solution is mixed and the absorbance, 405n as a function of time
mで及びABS 405 nm/分でモニターする。 m a and monitored by ABS 405 nm / min. 温度は調節されるべきである(プロテアーゼに依存して、20〜50℃)。 The temperature should be adjusted (depending on the protease, 20 to 50 ° C.). これは、サンプルにおけるプロテアーゼ活性の目安である。 This is a measure of the protease activity in the sample.

【0117】 タンパク質分解活性:本発明においては、タンパク質分解活性は、Kilo NOVO プロテアーゼ単位(KN [0117] Proteolytic Activity In the present invention, proteolytic activity, Kilo NOVO Protease Units (KN
PU)で表される。 Represented by PU). 活性は酵素標準(SAVINASE)に対して相対的に決定され、そしてその決定は、標準条件、すなわち50℃、pH8.3、9分の反応時間、3分の測定時間で、タンパク質分解酵素によるジメチルカゼイン(DMC)溶液の消化に基づかれる。 Activity is determined relative to an enzyme standard (SAVINASE), and the decision, the standard conditions, i.e. 50 ° C., a reaction time of pH8.3,9 minutes, 3 minutes of measuring time, dimethyl proteolytic enzymes It is based on the digestion of casein (DMC) solution. フォルダーAF220/1は、Novo Nordisk A/S, Denmarkから要求に基づいて入手できる。 Folder AF220 / 1 are available on the basis of Novo Nordisk A / S, from Denmark to the request.

【0118】 GUは、標準条件下で、基質としてのN−アセチルカゼインと共に40℃での15分間のインキュベーションの間、1mモルのグリシンに等しいNH 2 −基の量を生成するタンパク質分解酵素活性として定義される。 [0118] GU is under standard conditions, during a 15 min incubation at 40 ° C. with N- acetyl casein as substrate, is equal NH 2 to 1m mole of glycine - as proteolytic enzyme activity to produce the amount of group It is defined. 酵素活性はまた、Journal of American Oil Chemists Society, Rothgeb, TM Enzyme activity also, Journal of American Oil Chemists Society, Rothgeb, TM
., Goodlander, BD, Garrison, PH, and Smith, LA, (1988) に記載される、可溶性基質スクシニル−アラニン−アラニン−プロリン−フェニル−アラニン−パラ−ニトロフェノールとの反応に従って、PNAアッセイを用いても測定され得る。 ., Goodlander, BD, Garrison, PH, and Smith, LA, are described in (1988), soluble substrate succinyl - alanine - alanine - proline - phenyl - alanine - para - according to the reaction of the nitrophenol, using PNA assay also it can be measured.

【0119】 ELISA IgE 試験システム(Brown Norway ラットについての):三層サンドイッチELISAを用いて、特定の抗体の相対的濃度を決定する。 [0119] ELISA IgE test system (for Brown Norway rats): using a three layer sandwich ELISA, to determine the relative concentrations of specific antibodies. 免疫化された分子は、中性リン酸緩衝液においてウェル当たり10mg及び50mlの被覆抗原として使用され、4℃で一晩インキュベートされた。 Immunized molecule, in a neutral phosphate buffer is used as a coating antigen per well 10mg and 50 ml, were incubated overnight at 4 ° C.. ウェル表面上のすべての残る結合スポットは、室温で少なくとも30分間、リン酸緩衝液においてウェル当たり200mlの2%脱脂乳において阻止される。 All the remaining binding spots on the well surface is at least 30 minutes at room temperature, is blocked in 2% skim milk per well 200ml in phosphate buffer. この抗原により試験されるすべての血清を、10倍希釈からの希釈シリーズ、続く3倍希釈のシリーズにおいて、8−チャネルピペットを用いて、このプレートに50ml/ウェルで添加する。 All sera are tested by this antigen, 10-fold dilution series from dilution, in a series of subsequent 3-fold dilutions, using a 8-channel pipette, added with 50ml / well to the plate.

【0120】 希釈は、0.5%の脱脂乳及び0.05%のTween20と共にリン酸緩衝液において行われ、RTで撹拌プラットフォーム上で2時間インキュベートされる。 [0120] dilution is carried out in phosphate buffer with 0.5% skim milk and 0.05% Tween20, incubated 2 hours on agitation platform at RT. “微量”分子は、ウェル当たり50mlのビオチニル化されたマウス抗ラットIgEであり、0.5%の脱脂及び0.05%のTween20と共にリン酸緩衝液において2000倍に希釈され、RTで撹拌プラットフォーム上で2時間インキュベートされる。 "Trace" molecules are biotinylated mouse anti-rat IgE in 50ml per well, diluted 2000-fold in phosphate buffer with Tween20 0.5% nonfat and 0.05%, 2 hours on agitation platform at RT It is incubated. 対照(ブランク)は、 Control (blank) is,
同一の順序であるが、しかしラット血清を伴わない。 The same order, but without the rat serum.

【0121】 2000倍に希釈された、ウェル当たり50mlのストレプタビジンホースラディシュペルオキシダーゼを、撹拌プラットフォーム上で1時間インキュベートした。 [0121] were diluted 2000-fold, the streptavidin horseradish peroxidase 50ml per well and incubated for 1 h on stirring platform. ウェル当たり50mlでの着色する基質は、pH5.2のクエン酸緩衝液10ml当たりOPD(6 Coloring to substrate in the wells per 50 ml, OPD citrate buffer per 10ml of pH 5.2 (6
mg)及びH 2 O 2 (30%溶液4ml)である。 mg) is and H 2 O 2 (30% solution 4 ml). 反応は、ウェル当たり100mlの2NのH 2 SO 4を用いて停止される。 The reaction is stopped with 2N H 2 SO 4 in 100ml per well. すべての読み取りは、486nm及び620nm(対照として)でSL All of the reading, SL at 486nm and 620nm (as a control)
T上で行われる。 It is performed on T. データは、計算され、そしてLotusにおいて示される。 Data is calculated and shown in Lotus.

【0122】 Balb/CマウスにおけるIgE抗体の相対的濃度を決定するためのELISA方法:三層サンドイッチELISAを用いて、特異的IgE血清抗体の相対濃度を決定する。 [0122] Balb / C mice of IgE antibodies in the relative concentration ELISA method for determining: using a three-layer sandwich ELISA, to determine the relative concentrations of specific IgE serum antibodies. 1)10mgのラット抗−マウスIgE又はマウス抗−ラットIgE/ml緩衝液1によりE 1) 10 mg of rat anti - mouse IgE or mouse anti - E by rat IgE / ml buffer 1
LISA−プレートを被覆する。 LISA- plate to cover the. 50ml/ウェル。 50ml / well. 4℃で一晩インキュベートする。 Incubate overnight at 4 ° C.. 2)プレートを空にし、そして室温で少なくとも30分間、阻止緩衝液により阻止する。 2) Empty the plate, and at least 30 minutes at room temperature, to prevent the blocking buffer. 200ml/ウェル。 200ml / well. 軽く振盪する。 Lightly shaken. 洗浄緩衝液により3度プレートを洗浄する。 3 times the plate with washing buffer to wash.

【0123】 3)マウス/ラット血清と共にインキュベートし、これは希釈されていない状態で開始し、そして2倍希釈で続ける。 [0123] 3) were incubated with mouse / rat sera, starting in a state in which undiluted and continue with 2-fold dilutions. いくつかのウェルを、緩衝液4のみを含まないように維持する(ブランク)。 Some wells, to maintain so as not to include only buffer 4 (blank). 50ml/ウェル。 50ml / well. 室温で30分間インキュベートする。 Incubate at room temperature for 30 minutes. 軽く振盪する。 Lightly shaken. プレートを3度、洗浄緩衝液により洗濯する。 Plates 3 times, washing with wash buffer. 4)希釈緩衝液において酵素を、適切なタンパク質濃度に希釈する。 4) The enzyme in dilution buffer, diluted to the appropriate protein concentration. 50ml/ウェル。 50ml / well. 室温で30分間インキュベートする。 Incubate at room temperature for 30 minutes. 軽く振盪する。 Lightly shaken. プレートを洗浄緩衝液3度、洗浄する。 Plates wash buffer three times and washed. 5)希釈緩衝液における結合された抗体を検出するために特異的ポリクローナル抗−酵素抗血清(pIg)を希釈する。 Dilute enzyme antiserum (pIg) - 5) specific polyclonal anti to detect bound in dilution buffer antibodies. 室温で30分間インキュベートする。 Incubate at room temperature for 30 minutes. 軽く振盪する。 Lightly shaken. プレートを洗浄緩衝液により3度、洗浄する。 3 times Plates with wash buffer and washed.

【0124】 6)希釈緩衝液においてホースラディシュペルオキシダーゼ−接合抗−pIg− [0124] 6) horseradish peroxidase at a dilution buffer - conjugated anti -pIg-
抗体を希釈する。 To dilute the antibody. 50ml/ウェル。 50ml / well. 室温で30分間インキュベートする。 Incubate at room temperature for 30 minutes. 軽く振盪する。 Lightly shaken. プレートを洗浄緩衝液により3度洗浄する。 Wash plate 3 times with wash buffer. 7)基質緩衝液において、0.6mgのODP/ml+0.4μlのH 2 O 2 /mlを混合する。 7) in substrate buffer, mixing H 2 O 2 / ml of ODP / ml + 0.4 [mu] l of 0.6 mg. 使用の直前、溶液にする。 Shortly before use, to the solution. 10分間インキュベートする。 Incubated for 10 minutes. 50μl/ウェル。 50μl / well. 8)反応を停止するために、停止溶液を添加する。 8) To stop the reaction, adding a stop solution. 50μl/ウェル。 50μl / well. 9)プレートを、492nmで及び対照として620nmで読み取る。 9) The plates are read at 620nm as 492nm and in control. データが計算され、そしてLotus で示される。 Data is calculated and shown in Lotus.

【0125】 実施例例1. [0125] Example Example 1. スブチリシンBPN'修飾されるべき残基を同定するために、距離及び方向基準を適用する。 To identify subtilisin BPN 'residue to be modified, applying the distance and direction reference. 前記に開示されるように、リガンドに対して15Åよりも近いそれらのCα−原子を有する残基は、修飾のための標的物である。 As disclosed above, residue having their Cα- atoms closer than 15Å for the ligand is a target for modification. 好ましくは、Cα−原子よりも、結合されるリガンドに対して近くにそれらのCβ−原子を有する(それにより、リガンドの方向への可能性ある側鎖の方向づけを可能にする)は、修飾のための標的物である。 Preferably, than Cα- atoms, near a (thereby allowing the orientation of side chains that possible in the direction of the ligand) thereof Cβ- atoms for a ligand to be joined, the modified it is a target for.

【0126】 適切な距離は、例えばMolecular Simulations Inc. からの分子グラフィックプログラム様Insight IIを用いて、容易に測定され得る。 [0126] Suitable distances, for example, using a molecular graphics program like Insight II from Molecular Simulations Inc., may be readily determined. 特に、構造体の適切なタンパク質部分にDSSPプログラムを適用する場合、ACC In particular, when applying the DSSP program to the appropriate protein moiety of the structure, ACC
>0を有するものとして定義される、表面に暴露された残基が修飾のための標的物である。 > Is defined as having a 0, the exposed residues in the surface is a target for modification. DSSPプログラムは、W. Kabsch and C. Sander, BIOPOLYMERS 22 (198 DSSP program, W. Kabsch and C. Sander, BIOPOLYMERS 22 (198
3) P.2577-2637に開示される。 3) is disclosed in P.2577-2637. Thomas E. Creighton, PROTEINS; Structure and Molecular Principles, WH Thomas E. Creighton, PROTEINS; Structure and Molecular Principles, WH
Freeman and Company, NY, ISBN: 0-7167-1566-X (1984) においては、個々のアミノ酸残基の接近できる表面積を列挙する表が開示される。 Freeman and Company, NY, ISBN: in 0-7167-1566-X (1984), a table listing the approach can surface area of ​​individual amino acid residues are disclosed. 下記表においては、 In the table below,
15%及び20%の接近性が決定されている。 15% and 20% of the proximity has been determined.

【0127】 [0127]

【表1】 [Table 1]

【0128】 タンパク質の個々のアミノ酸についての見出された接近できる表面積(ACC) [0128] found the approach can be the surface area of ​​the individual amino acids of the protein (ACC)
を、その個々のアミノ酸についての接近できる表面積(Creighton 表に見出される)により割り算する場合、%での接近性が得られる。 And if dividing by the approach can surface area (found in Creighton table) for that individual amino acid, accessibility of the% is obtained. 修飾される残基を見出すためには、上記方法を、インヒビターCI−2と共に複合体におけるスブチリシンBPN'のX−線構造体に適用した(Brookhaven Protein To find the residues to be modified, the method was applied to X- line structure subtilisin BPN 'in complex with the inhibitor CI-2 (Brookhaven Protein
Data Bank におけるエントリー2SNI)。 Entry in the Data Bank 2SNI).

【0129】 前記構造体におけるスブチリシンBPN' 及び2種の金属イオンのみを、分析するために使用した。 [0129] Using only subtilisin BPN 'and two metal ions in the structure, in order to analyze. 両イオンは、カルシウムイオンである。 Both ions are calcium ions. それらは部位1及び部位2に見出される。 They are found in sites 1 and 2. 分析の結果は、下記表に見出される。 The results of the analysis can be found in the table below. 縦列は、Cα 及びCβへの金属イオンからのÅでの距離、及び修飾する個々の残基についてのDSSPにより決定される場合の接近性を示す。 Column indicates the accessibility of as determined by DSSP for individual residues distances and modifications in Å from the metal ion to Cα and C.beta.

【0130】 [0130]

【表2】 [Table 2]

【0131】 [0131]

【表3】 [Table 3]

【0132】 [0132]

【表4】 [Table 4]

【0133】 下記式は、BPN -の部位1及び2における好ましい機能的置換を示す。 [0133] The following formulas, BPN - shows a preferred functional substitution at sites 1 and 2. Gly80に関しては、置換G to S/T, G to N/Q 及びG to K/Dとは、位置80におけるグリシンが好ましくは、セリン/トレオニン又はアスパラギン/グルタミン又はリシン/ Regarding Gly80, substituted G-to S / T, and G-to N / Q and G-to K / D, glycine is preferred at position 80, serine / threonine or asparagine / glutamine or lysine /
アスパラギン酸により置換され得ることを意味する。 Means that may be substituted with aspartic acid.

【0134】 [0134]

【表5】 [Table 5]

【0135】 [0135]

【表6】 [Table 6]

【0136】 例2. [0136] Example 2. PD498 Brookhavenタンパク質データバンク(PDB)形式におけるX−線結晶学により決定 Determined by X- ray crystallography of PD498 Brookhaven Protein Data Bank (PDB) format
される場合のPD498の三次元構造:本発明のための基礎を形成する三次元構造を解明するために使用される配列は、配列番号2に開示されるような、バチルスsp. PD498, NCIMB No.40484に由来する280個のアミノ酸から成る。 PD498 of the three-dimensional structure when being:. Sequence used to elucidate the three-dimensional structure forming the basis for the present invention, as disclosed in SEQ ID NO: 2, Bacillus sp PD498, NCIMB No consisting of 280 amino acids derived from the .40484.

【0137】 PD498の構造は、”X−Ray Structure Determination”, Stout, GK and Jen [0137] structure of the PD498 is, "X-Ray Structure Determination", Stout, GK and Jen
sen, LH, John Wiley & Sons, Inc. NY, 1989, 及び”Protein Crystallograp sen, LH, John Wiley & Sons, Inc. NY, 1989, and "Protein Crystallograp
hy” by Blundell, TL and Johnson, LN, Academic Press, London, 1990に与えられるX−線結晶学方法に関する原理に従って解明された。同形置換法を用いて、2.2Å決定でのPS498の解明された結晶構造についての構造座標が、付録1 hy "By Blundell, using TL and Johnson, LN, Academic Press, London, 1990 was solved in accordance with the principle of X- ray crystallography methods given. isomorphous replacement method, was elucidated in PS498 in 2.2Å decision structure coordinates for the crystal structure, Appendix 1
における標準PDB形式(Brookhaven タンパク質データベース)に与えられる。 Given standard PDB format (Brookhaven protein database) in. 付録1は本出願の一部を形成することは、理解されるべきである。 Appendix 1 to form a part of this application should be understood.

【0138】 付録1においては、酵素のアミノ酸残基が、3文字アミノ酸コード(大文字) [0138] In Appendix 1, the amino acid residue of the enzyme, the three-letter amino acid code (uppercase)
により同定される。 They are identified by. PD498は、3種の結合された金属イオンを有する。 PD498 has three binding metal ions. 部位1は、スブチリシンBPN Part 1, subtilisin BPN
'における部位1と同等であり、そしてカルシウムイオンを含む。 It is equivalent to the portion 1 in the 'and contains calcium ions. 部位2はスブチリシンBPN' における同等物を有さず、そしてカルシウムイオンを含む。 Site 2 has no equivalent in subtilisin BPN ', and comprises calcium ions. 部位3は、スブチリシンBPN'における第2の部位と同じ領域に存在し、そしてナトリウムイオン及びモノプロピレングリコールリガンドを含む。 Site 3 is present in the same region as the second site in subtilisin BPN ', and containing sodium ions and monopropylene glycol ligands. 例1に開示される上記方法の適用は、次のものをもたらす: Application of the method disclosed in Example 1 leads to the following:

【0139】 [0139]

【表7】 [Table 7]

【0140】 [0140]

【表8】 [Table 8]

【0141】 [0141]

【表9】 [Table 9]

【0142】 下記表は、PD498の部位1,2及び3における好ましい機能的置換を示す。 [0142] The following table shows the preferred functional substitution at sites 1, 2 and 3 of the PD498.

【表10】 [Table 10]

【0143】 [0143]

【表11】 [Table 11]

【0144】 [0144]

【表12】 [Table 12]

【0145】 例3. [0145] Example 3. サビナーゼこの例に関しては、Brookhaven タンパク質データバンクにおけるX−線構造エントリー1SVNが使用された。 Savinase For this example, X- ray structural entry 1SVN in Brookhaven Protein Data Bank were used. 部位1は、カルシウムイオンを含み、そしてスブチリシンBPN'における部位1と同等の位置に存在する。 Site 1 contains calcium ions and are present in the equivalent position and site 1 in subtilisin BPN '. 部位2は、スブチリシンBPN'における部位2と同等の位置でカルシウムイオンを含む。 Sites 2, containing calcium ions in an equivalent position and site 2 in subtilisin BPN '. 次の表においては、連続番号付けが適用され、そして構造ファイルに使用される番号付けシステムではない。 In the following table, continuous numbering is applied, and not the numbering system used in the structure file.

【0146】 [0146]

【表13】 [Table 13]

【0147】 [0147]

【表14】 [Table 14]

【0148】 下記表は、サビナーゼの部位1及び2における好ましい機能的置換を示す。 [0148] The following table shows the preferred functional substitution at sites 1 and 2 of Savinase.

【表15】 [Table 15]

【0149】 [0149]

【表16】 [Table 16]

【0150】 例4. [0150] Example 4. アミラーゼ(AA560)この例に関しては、AA560の構造は、WO96/23874号(引用により本明細書に組み込まれる)に開示されるBAN/Termamylα−アミラーゼ構造を用いて相同性モデリングにより見出された。 Amylase (AA560) For this example, the structure of the AA560 is found by homology modeling using the BAN / Termamylα- amylase structure disclosed in Patent WO96 / 23874 (incorporated herein by reference). この構造は2種の金属イオンを含む。 The structure comprises two metal ions. 両部位1及び2 Both sites 1 and 2
は、カルシウムイオンを含む。 It includes calcium ions. この例は、相同構造からの座標を用いて構築するモデルにより決定される三次元構造がいかにして、免疫応答を低めるために修飾され得る、リガンド結合部位の残基を同定するために使用され得るかを示す。 This example is a three-dimensional structure is how to determined by the model constructed using coordinates from a homologous structure can be modified to reduce the immune response, is used to identify residues of the ligand binding site indicating whether the get. 上記開示される方法の適用は、次のものをもたらす: Application of the method disclosed above results in the following:

【0151】 [0151]

【表17】 [Table 17]

【0152】 [0152]

【表18】 [Table 18]

【0153】 [0153]

【表19】 [Table 19]

【0154】 [0154]

【表20】 [Table 20]

【0155】 下記表は、アミラーゼAA560の部位1及び2における好ましい機能的置換を示す。 [0155] The following table shows the preferred functional substitution at sites 1 and 2 of the amylase AA560. ASN126に関しては、置換 ”N to D/E” とは、置換126におけるアスパラギンが好ましくは、アスパラギン酸又はグルタミン酸、リシン又はアルギニン、又はアラニン又はシステインにより置換され得ることを意味する。 With respect to Asnl26, the substituted "N to D / E", the asparagine is preferred in the substituted 126, it means that the aspartic acid or glutamic acid, may be substituted by lysine or arginine, or alanine, or cysteine.

【0156】 [0156]

【表21】 [Table 21] 例5. Example 5. 活性化されたビス−PEG−1000とのサビナーゼ変異体R241Kの接合 228mgのサビナーゼ変異体を、約30mlの反応体積において、510mgのN−スクシンイミジルカーボネート活性化ビス−PEG1000と共に、50mMの硼酸ナトリウム(p Savinase variants of junction 228mg of Savinase variants R241K and bis-PEG-1000 which is activated in a reaction volume of approximately 30 ml, N-together with the succinimidyl carbonate activated bis -PEG1000 of 510 mg, boric acid 50mM sodium (p
H9.5)においてインキュベートした。 H9.5) were incubated in. 反応を、0.5MのNaOHの添加にによりpHを、 The reaction, the pH by the addition of a 0.5M NaOH,
9.0〜9.5に維持しながら、磁気撹拌を用いて、周囲温度で行った。 While maintaining 9.0-9.5, using a magnetic stirrer, it was carried out at ambient temperature. 反応時間は、 The reaction time is,
2時間であった。 It was 2 hours.

【0157】 反応を、1MのHClを添加し、6.0の最終pHにすることににより停止した。 [0157] The reaction, HCl was added 1M, were stopped by to a final pH of 6.0. 過剰の試薬を、Filtron−Ultrasetteを用いて、限外濾過により除去し、そして最終生物を、50nMの硼酸ナトリウム、150mMのNaCl、1mMのCaCl 2 , 50%のモノプロピレングリコールの溶液(pH6.0)において、−20℃で貯蔵した。 The excess reagents using a Filtron-Ultrasette, was removed by ultrafiltration, and the final organism, sodium borate 50 nM, 150 mM of NaCl, 1 mM of CaCl 2, 50% solution of monopropylene glycol (pH 6.0 in), and stored at -20 ° C.. 親酵素に比較される場合、残留活性は、ペプチド基質(スクシニル−Ala−Ala When compared to the parent enzyme, residual activity, peptide substrate (succinyl -Ala-Ala
−Pro−Phe−p−ニトロ−アニリド)に対して100%接近した。 -Pro-Phe-p-nitro - approaching 100% relative anilide).

【0158】 例6. [0158] Example 6. 活性化されたビス−PEG−2000とのサビナーゼ変異体R24Kの接合 353mgのサビナーゼ変異体を、約35mlの反応体積において、1621mgのN−スクシンイミジルカーボネート活性化ビス−PEG2000と共に、50mMの硼酸ナトリウム(p Savinase variants of junction 353mg of Savinase mutant R24K of bis-PEG-2000 which is activated in a reaction volume of approximately 35 ml, N-together with the succinimidyl carbonate activated bis -PEG2000 of 1621Mg, boric acid 50mM sodium (p
H9.5)においてインキュベートした。 H9.5) were incubated in. 反応を、0.5MのNaOHの添加にによりpHを、 The reaction, the pH by the addition of a 0.5M NaOH,
9.0〜9.5に維持しながら、磁気撹拌を用いて、周囲温度で行った。 While maintaining 9.0-9.5, using a magnetic stirrer, it was carried out at ambient temperature. 反応時間は、 The reaction time is,
2時間であった。 It was 2 hours. 反応を、1MのHClを添加し、6.0の最終pHにすることににより停止した。 The reaction, HCl was added 1M, were stopped by to a final pH of 6.0. 過剰の試薬を、Filtron−Ultrasetteを用いて、限外濾過により除去し、そして最終生物を、50nMの硼酸ナトリウム、150mMのNaCl、1mMのCaCl 2 , 50 The excess reagents using a Filtron-Ultrasette, was removed by ultrafiltration, and the final organism, sodium borate 50 nM, 150 mM of NaCl, 1 mM of CaCl 2, 50
%のモノプロピレングリコールの溶液(pH6.0)において、−20℃で貯蔵した。 In% solution of monopropylene glycol (pH 6.0), and stored at -20 ° C.. 親酵素に比較される場合、残留活性は、ペプチド基質(スクシニル−Ala−Ala When compared to the parent enzyme, residual activity, peptide substrate (succinyl -Ala-Ala
−Pro−Phe−p−ニトロ−アニリド)に対して100%接近した。 -Pro-Phe-p-nitro - approaching 100% relative anilide).

【0159】 例7. [0159] Example 7. R241KbPEG1000及びR241KbPEG2000のラットにおけるIgEレベルの決定方法: サンプル管理:個々のサンプルを、0.075mgのタンパク質/mlに希釈し、そして R241KbPEG1000 and R241KbPEG2000 method for determining IgE levels in rats: Sample Management: Individual samples were diluted to a protein / ml of 0.075 mg, and
1.5mlに等分した。 It was equally divided into 1.5ml. それらの画分を、使用まで、−20℃での貯蔵のために貯蔵所に送った。 Their fractions, until used, was sent to the reservoir for storage at -20 ℃. さらに、それぞれの画分100μlを、研究の開始、中間及び最後での免疫化学分析のために−20℃での実験用冷蔵庫に貯蔵した。 Furthermore, each fraction 100 [mu] l, the start of the study, and stored in a laboratory refrigerator at -20 ° C. for immunochemical analysis at the middle and end. 個々の免疫化及び個々の分析のために、新しい画分を採取した。 For individual immunization and individual analysis, it was taken a new fraction.

【0160】 免疫化:20の気管内免疫化を、100μlの0.9%(w/v)のNaCl(対照グループ) [0160] Immunization: an endotracheal immunization of 20, 0.9% of 100μl of (w / v) NaCl (control group)
、又は100μlの前記タンパク質希釈溶液により毎週行った。 , Or were performed weekly by the protein dilution of 100 [mu] l. グループ5は、サビナーゼの修飾されていないR241k変異体を受け、グループ6はR241K−ビス−S−P Group 5 receives R241k variants unqualified Savinase, Group 6 R241K- bis -S-P
EG1000を受け、そしてグループ7はR241K−ビス−S−PEG2000を受けた。 It received the EG1000, and group 7 received a R241K- bis -S-PEG2000. 個々のグループは10匹のラットを含んだ。 Each group contained 10 rats. 血液サンプル(2ml)を、あらゆる2回目の免疫化の1週間後、眼から採取した。 Blood samples (2ml), one week after every second immunization, were taken from the eye. 血清を血液凝固及び遠心分離により得た。 Serum was obtained by blood coagulation and centrifugation.

【0161】 ELISA:特異的IgEレベルを、ラットIgEに対して特異的なELISAを用いて決定した。 [0161] ELISA: Specific IgE levels were determined using an ELISA specific for the rat IgE. 血清を、非希釈度から出発して、1/2希釈度で滴定した。 Serum, starting from non-dilution was titrated with 1/2 dilution. 光学密度を、492/6 The optical density, 492/6
20nmで測定した。 It was measured at 20nm. 結果は図1に示される。 The results are shown in Figure 1. そこにおいて見出され得るように、接合されたサビナーゼ変異体R241KのIgEレベルは、サビナーゼ変異体R241Kに比較して、低められる。 As can be found in which, IgE levels joined Savinase variants R241K as compared to Savinase mutant R241K, is reduced.

【0162】 例8. [0162] Example 8. サビナーゼ変異体R241Q, R241E, R241H及びR241KのマウスにおけるIgEレ Savinase variant R241Q, R241E, IgE in mice R241H and R241K les
ベルの決定生後9週目の雌のBalb/cマウスを、野生型サビナーゼ、及び位置R241において単一の突然変異を有する変異体(R241Q, R241E, R241H, R241K)により、20週連続して、皮下免疫化した。 Determining age 9 weeks female Balb / c mice bell, wild-type Savinase, and position variants with single mutations in R241 (R241Q, R241E, R241H, R241K) by, for 20 consecutive weeks, It was subcutaneously immunized. 隔週ごとに、IgG1及びIgE血清レベルを、ELISAにより決定した。 For each bi-weekly, the IgG1 and IgE serum levels were determined by ELISA.

【0163】 サンプル管理:個々のサンプルを、0.010mgのタンパク質/mlに希釈し、そして [0163] Sample Management: Individual samples were diluted to a protein / ml of 0.010mg, and
1.5mlに等分した。 It was equally divided into 1.5ml. それらの画分を、使用まで、−20℃での貯蔵のために貯蔵所に送った。 Their fractions, until used, was sent to the reservoir for storage at -20 ℃. さらに、それぞれの画分100μlを、研究の開始、中間及び最後での免疫化学分析のために−20℃での実験用冷蔵庫に貯蔵した。 Furthermore, each fraction 100 [mu] l, the start of the study, and stored in a laboratory refrigerator at -20 ° C. for immunochemical analysis at the middle and end. 個々の免疫化及び個々の分析のために、新しい画分を採取した。 For individual immunization and individual analysis, it was taken a new fraction.

【0164】 免疫化:20の皮下免疫化を、100μlの0.9%(w/v)のNaCl(対照グループ)、 [0164] Immunization: 20 subcutaneous immunization, 0.9% of 100μl (w / v) of NaCl (control group),
又は100μlの前記タンパク質希釈溶液により毎週行った。 Or it was performed weekly by the protein dilution of 100 [mu] l. グループ1は、野生型サビナーゼを受け、グループ2は(R241Q)を受け、グループ3は(R241H)を受け、グループ4は(R241E)を受け、そしてグループ5は(R241K)を受けた。 Group 1 receives a wild-type Savinase, Group 2 receives (R241Q), Group 3 receives (R241H), Group 4 receives (R241E), and Group 5 received a (R241K). 個々のグループは10匹のマウスを含んだ。 Each group contained 10 mice. 血液サンプル(100μl)を、あらゆる2 Blood samples (100μl), every 2
回目の免疫化の1週間後、眼から採取した。 One week after the round eyes of immunization, it was taken from the eye. 血清を血液凝固及び遠心分離により得た。 Serum was obtained by blood coagulation and centrifugation.

【0165】 ELISA:特異的IgG1レベルを、マウスIgG1に対して特異的なELISAを用いて決定した。 [0165] ELISA: The specific IgG1 levels were determined using ELISA specific to mouse IgG1. 血清を、1:160から出発して、1/2希釈度で滴定した。 Sera 1: 160 starting from, and titrated with 1/2 dilution. 特異的IgEレベルを、マウスIgEに対して特異的なELISAを用いて決定した。 Specific IgE levels were determined using ELISA specific to mouse IgE. 血清を、非希釈度から出発して、1/2希釈度で滴定した。 Serum, starting from non-dilution was titrated with 1/2 dilution. 光学密度を、492/620nmで測定した。 The optical density was measured at 492/620 nm. 統計学的分析:データ組間の差異を、非母数方法、すなわちKruskal−Wallis Statistical analysis: Differences between data sets, nonparametric methods, i.e. Kruskal-Wallis
Test及びDunn's Multiple Comparison Test を用いることによって分析した。 It was analyzed by using the Test and Dunn's Multiple Comparison Test. 結果は図2に示される。 The results are shown in Figure 2. そこにおいて見出され得るように、サビナーゼ変異体のIgEレベルは、有意に低められる。 As can be found in which, IgE level of Savinase variants are significantly reduced.

【0166】 [0166]

【表22】 [Table 22]

【0167】 [0167]

【表23】 [Table 23]

【0168】 [0168]

【表24】 [Table 24]

【0169】 [0169]

【表25】 [Table 25]

【0170】 [0170]

【表26】 [Table 26]

【0171】 [0171]

【表27】 [Table 27]

【0172】 [0172]

【表28】 [Table 28]

【0173】 [0173]

【表29】 [Table 29]

【0174】 [0174]

【表30】 [Table 30]

【0175】 [0175]

【表31】 [Table 31]

【0176】 [0176]

【表32】 [Table 32]

【0177】 [0177]

【表33】 [Table 33]

【0178】 [0178]

【表34】 [Table 34]

【0179】 [0179]

【表35】 [Table 35]

【0180】 [0180]

【表36】 [Table 36]

【0181】 [0181]

【表37】 [Table 37]

【0182】 [0182]

【表38】 [Table 38]

【0183】 [0183]

【表39】 [Table 39]

【0184】 [0184]

【表40】 [Table 40]

【0185】 [0185]

【表41】 [Table 41]

【0186】 [0186]

【表42】 [Table 42]

【0187】 [0187]

【表43】 [Table 43]

【0188】 [0188]

【表44】 [Table 44]

【0189】 [0189]

【表45】 [Table 45]

【0190】 [0190]

【表46】 [Table 46]

【0191】 [0191]

【表47】 [Table 47]

【0192】 [0192]

【表48】 [Table 48]

【0193】 [0193]

【表49】 [Table 49]

【0194】 [0194]

【表50】 [Table 50]

【0195】 [0195]

【表51】 [Table 51]

【0196】 [0196]

【表52】 [Table 52]

【0197】 [0197]

【表53】 [Table 53]

【0198】 [0198]

【表54】 [Table 54]

【0199】 [0199]

【表55】 [Table 55]

【0200】 [0200]

【表56】 [Table 56]

【0201】 [0201]

【表57】 [Table 57]

【0202】 [0202]

【表58】 [Table 58]

【0203】 [0203]

【表59】 [Table 59]

【0204】 [0204]

【表60】 [Table 60]

【0205】 [0205]

【表61】 [Table 61]

【0206】 [0206]

【表62】 [Table 62]

【0207】 [0207]

【表63】 [Table 63]

【0208】 [0208]

【表64】 [Table 64]

【0209】 [0209]

【表65】 [Table 65]

【0210】 [0210]

【表66】 [Table 66]

【0211】 [0211]

【表67】 [Table 67]

【0212】 [0212]

【表68】 [Table 68]

【0213】 [0213]

【表69】 [Table 69]

【0214】 [0214]

【表70】 [Table 70]

【0215】 [0215]

【表71】 [Table 71]

【0216】 [0216]

【表72】 [Table 72]

【0217】 [0217]

【表73】 [Table 73]

【0218】 [0218]

【表74】 [Table 74]

【0219】 [0219]

【表75】 [Table 75]

【0220】 [0220]

【表76】 [Table 76]

【0221】 [0221]

【表77】 [Table 77]

【0222】 [0222]

【表78】 [Table 78]

【0223】 [0223]

【表79】 [Table 79]

【0224】 [0224]

【表80】 [Table 80]

【0225】 [0225]

【表81】 [Table 81]

【0226】 [0226]

【表82】 [Table 82]

【0227】 [0227]

【表83】 [Table 83]

【0228】 [0228]

【表84】 [Table 84]

【0229】 [0229]

【表85】 [Table 85]

【0230】 [0230]

【表86】 [Table 86]

【0231】 [0231]

【表87】 [Table 87]

【0232】 [0232]

【表88】 [Table 88]

【0233】 [0233]

【表89】 [Table 89]

【0234】 [0234]

【表90】 [Table 90]

【0235】 [0235]

【表91】 [Table 91]

【0236】 [0236]

【表92】 [Table 92]

【0237】 [0237]

【表93】 [Table 93]

【0238】 [0238]

【表94】 [Table 94]

【0239】 [0239]

【表95】 [Table 95]

【0240】 [0240]

【表96】 [Table 96]

【0241】 [0241]

【表97】 [Table 97]

【0242】 [0242]

【表98】 [Table 98]

【0243】 [0243]

【表99】 [Table 99]

【0244】 [0244]

【表100】 [Table 100]

【0245】 [0245]

【表101】 [Table 101]

【0246】 [0246]

【表102】 [Table 102]

【0247】 [0247]

【表103】 [Table 103]

【0248】 [0248]

【表104】 [Table 104]

【0249】 [0249]

【表105】 [Table 105]

【0250】 [0250]

【表106】 [Table 106]

【0251】 [0251]

【表107】 [Table 107]

【0252】 [0252]

【表108】 [Table 108]

【0253】 [0253]

【表109】 [Table 109]

【0254】 [0254]

【表110】 [Table 110]

【0255】 [0255]

【表111】 [Table 111]

【0256】 [0256]

【表112】 [Table 112]

【0257】 [0257]

【表113】 [Table 113]

【0258】 [0258]

【表114】 [Table 114]

【0259】 [0259]

【表115】 [Table 115]

【0260】 [0260]

【表116】 [Table 116]

【0261】 [0261]

【表117】 [Table 117]

【0262】 [0262]

【表118】 [Table 118]

【0263】 [0263]

【表119】 [Table 119]

【0264】 [0264]

【表120】 [Table 120]

【0265】 [0265]

【表121】 [Table 121]

【0266】 [0266]

【表122】 [Table 122]

【0267】 [0267]

【表123】 [Table 123]

【0268】 [0268]

【表124】 [Table 124]

【0269】 [0269]

【表125】 [Table 125]

【0270】 [0270]

【表126】 [Table 126]

【0271】 [0271]

【表127】 [Table 127]

【配列表】 [Sequence Listing]

【図面の簡単な説明】 BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS

【図1】 図1は、ラットにおける組み込まれたIgE抗体レベルを示す。 FIG. 1 shows the IgE antibody levels incorporated in rats.

【図2】 図2は、マウスにおける組み込まれた特異的IgEレベルを示す。 Figure 2 shows the specific IgE levels incorporated in mice.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl. 7識別記号 FI テーマコート゛(参考) A61P 37/06 A61P 37/08 37/08 A61K 37/48 (81)指定国 EP(AT,BE,CH,CY, DE,DK,ES,FI,FR,GB,GR,IE,I T,LU,MC,NL,PT,SE),OA(BF,BJ ,CF,CG,CI,CM,GA,GN,GW,ML, MR,NE,SN,TD,TG),AP(GH,GM,K E,LS,MW,SD,SL,SZ,TZ,UG,ZW ),EA(AM,AZ,BY,KG,KZ,MD,RU, TJ,TM),AE,AL,AM,AT,AU,AZ, BA,BB,BG,BR,BY,CA,CH,CN,C R,CU,C ────────────────────────────────────────────────── ─── of the front page continued (51) Int.Cl. 7 identification mark FI theme Court Bu (reference) A61P 37/06 A61P 37/08 37/08 A61K 37/48 (81) designated States EP (AT, BE, CH , CY, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, I T, LU, MC, NL, PT, SE), OA (BF, BJ, CF, CG, CI, CM, GA, GN , GW, ML, MR, NE, SN, TD, TG), AP (GH, GM, K E, LS, MW, SD, SL, SZ, TZ, UG, ZW), EA (AM, AZ, BY, KG, KZ, MD, RU, TJ, TM), AE, AL, AM, AT, AU, AZ, BA, BB, BG, BR, BY, CA, CH, CN, C R, CU, C ,DE,DK,DM,EE,ES,FI ,GB,GD,GE,GH,GM,HR,HU,ID, IL,IN,IS,JP,KE,KG,KP,KR,K Z,LC,LK,LR,LS,LT,LU,LV,MA ,MD,MG,MK,MN,MW,MX,NO,NZ, PL,PT,RO,RU,SD,SE,SG,SI,S K,SL,TJ,TM,TR,TT,TZ,UA,UG ,UZ,VN,YU,ZA,ZW (72)発明者 アンデルセン,キム ビルボウル デンマーク国,デーコー−2100 コペンハ ーゲン エー,4テーホー,テシンゲガー デ 31 (72)発明者 エルンスト,ステフェン デンマーク国,デーコー−2880 バグスバ エルト,ノボ アレ,ノボ ノルディスク アクティーゼルスカブ (72)発明者 ログゲン,エルウィン ルド デンマーク国,デー , DE, DK, DM, EE, ES, FI, GB, GD, GE, GH, GM, HR, HU, ID, IL, IN, IS, JP, KE, KG, KP, KR, K Z, LC, LK, LR, LS, LT, LU, LV, MA, MD, MG, MK, MN, MW, MX, NO, NZ, PL, PT, RO, RU, SD, SE, SG, SI, S K, SL , TJ, TM, TR, TT, TZ, UA, UG, UZ, VN, YU, ZA, ZW (72) inventor Andersen, Kim Birubouru Denmark, Deko -2100 Copenhagen er, 4 Teho, Teshingega de 31 ( 72) inventor Ernst, Steffen Denmark, Deko -2880 Bagusuba elutriation, Novo array, Novo Nordisk acty Angeles turnip (72) inventor Rogugen, Erwin field Denmark, Day ー−2880 バグスバ エルト,ノボ アレ,ノボ ノルディスク アクティーゼルスカブ Fターム(参考) 4B018 MD20 ME07 ME14 4B035 LC09 LG15 LG51 LP59 4B050 CC02 CC07 GG03 LL01 LL02 LL04 LL10 4C076 CC41 EE01 EE06 EE08 EE13 EE30 EE31 EE36 EE37 EE38 FF67 4C084 AA02 AA07 DC01 DC02 DC23 DC24 DC25 DC26 DC27 DC28 MA02 NA06 ZB08 ZB13 ZC80 Over -2880 Bagusuba elutriation, Novo array, Novo Nordisk acty Angeles Cub F-term (reference) 4B018 MD20 ME07 ME14 4B035 LC09 LG15 LG51 LP59 4B050 CC02 CC07 GG03 LL01 LL02 LL04 LL10 4C076 CC41 EE01 EE06 EE08 EE13 EE30 EE31 EE36 EE37 EE38 FF67 4C084 AA02 AA07 DC01 DC02 DC23 DC24 DC25 DC26 DC27 DC28 MA02 NA06 ZB08 ZB13 ZC80

Claims (34)

    【特許請求の範囲】 [The claims]
  1. 【請求項1】 1又は複数のアミノ酸残基が修飾されている、低められた免疫応答を有するポリペプチドであって、前記アミノ酸残基のCα−原子が前記ポリペプチドに結合されるリガントから15Åよりも短い位置に位置することを特徴とするポリペプチド。 1. A one or more amino acid residues are modified, a polypeptide with reduced immune responses, 15 Å from Riganto the Cα- atoms of the amino acid residue is coupled to the polypeptide polypeptide being located at a position shorter than.
  2. 【請求項2】 前記ポリペプチドが低められたアレルゲン性を有する請求項1記載のポリペプチド。 2. A polypeptide according to claim 1 having the polypeptide is the lowered allergenicity.
  3. 【請求項3】 前記アミノ酸残基のCβ−原子が前記Cα−原子よりもリガンドに接近して位置する請求項1又は2記載のポリペプチド。 3. A process according to claim 1 or 2, wherein the polypeptide Cβ- atoms of the amino acid residue is located close to the ligand than the Cα- atoms.
  4. 【請求項4】 前記アミノ酸残基のCα−原子が前記リガンドから10Åよりも短い位置に位置し、そして前記アミノ酸残基が少なくとも15%の接近性(acces Wherein said is Cα- atom of the amino acid residues located in position shorter than 10Å from the ligand, and the amino acid residues at least 15% of the accessibility (acces
    sibility)を有する請求項1〜3のいずれか1項記載のポリペプチド。 Set forth in any one polypeptide of claim 1 having sibility).
  5. 【請求項5】 前記リガンドが、金属又は金属イオンである請求項1〜4のいずれか1項記載のポリペプチド。 Wherein said ligand is any one of claims of the polypeptide of claim 1 is a metal or metal ions.
  6. 【請求項6】 前記ポリペプチドがアミノ酸残基の置換により修飾される請求項1〜5のいずれか1項記載のポリペプチド。 Wherein said polypeptide is set forth in any one polypeptide of claims 1 to 5 is modified by substitution of amino acid residues.
  7. 【請求項7】 前記修飾されたポリペプチドが変異体の種々のライブラリーから選択されている請求項1〜6のいずれか1項記載のポリペプチド。 Wherein said modified polypeptide is various according to any one of the polypeptides of claims 1 to 6, which is selected from a library of mutants.
  8. 【請求項8】 前記置換するアミノ酸が、リシン残基の形でのアミノ基、又はアスパラギン酸もしくはグルタミン酸残基の形でのカルボキシル基、又はシステイン残基の形でのSH−基を含む請求項6記載のポリペプチド。 8. amino acids the replacement, claims, including SH- groups in the form of a carboxyl group, or a cysteine ​​residue in the form of amino acid or aspartic acid or glutamic acid residue, in the form of lysine residues 6, wherein the polypeptide.
  9. 【請求項9】 前記修飾が、アミノ酸残基の保存性置換、例えばアルギニン:リシン置換、又はアスパラギン:アスパラギン酸/グルタミン酸又はグルタミン:アスパラギン酸/グルタミン酸置換、又はトレオニン/セリン:システイン置換により調製される請求項6記載のポリペプチド。 Wherein said modification, conservative substitutions of amino acid residues, such as arginine: is prepared by cysteine ​​substitution: lysine substituted, or aspartic aspartate / glutamate or glutamine: aspartic acid / glutamic acid substitutions, or threonine / serine polypeptide of claim 6 wherein.
  10. 【請求項10】 前記ポリペプチドが、前記ポリペプチドに1又は複数のポリマー分子を結合し、それにより、ポリペプチド−ポリマー接合体を提供することによって修飾される請求項1〜9のいずれか1項記載のポリペプチド。 Wherein said polypeptide, said polypeptide 1 or combining multiple polymer molecules, whereby the polypeptide - any one of claims 1 to 9 which is modified by providing a polymer conjugate above, wherein the polypeptide.
  11. 【請求項11】 前記接合体の親ポリペプチド成分が、1〜1000kDa, 好ましくは4〜100kDa, より好ましくは12〜60kDaの分子量を有する請求項10記載のポリペプチド。 11. A parent polypeptide component of the conjugate, 1~1000kDa, preferably 4~100KDa, more preferably the polypeptide of claim 10 having a molecular weight of 12~60KDa.
  12. 【請求項12】 前記ポリペプチドに結合されるポリマー分子が、0.1〜100 12. A polymer molecule to be coupled to the polypeptide, 0.1
    kDa, 好ましくは0.1〜60kDa, より好ましくは0.3〜5kDa, 最も好ましくは1〜2 kDa, preferably 0.1~60kDa, more preferably 0.3~5kDa, most preferably 1 to 2
    kDaの分子量を有する請求項10のポリペプチド。 Polypeptide of claim 10 having a molecular weight of kDa.
  13. 【請求項13】 前記ポリペプチド又は親ポリペプチドが、オキシドレダクターゼ、例えばラッカーゼ及びスーパーオキシドジスムターゼ(SOD);ヒドラーゼ、例えばカルボヒドラーゼ、アミラーゼ、プロテアーゼ、特にズブチリシン;トランスフェラーゼ、例えばトランスグルタミナーゼ(TGアーゼ);イソメラーゼ、例えばタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ(PDI);リアーゼ、例えばペクチン酸リアーゼの群から選択された酵素である請求項1〜12のいずれか1 Wherein said polypeptide or parent polypeptide, oxidoreductase, such as laccases and Superoxide dismutase (SOD); hydrolases, for example carbohydrases, amylases, proteases, especially subtilisin; transferases, e.g. transglutaminase (TG-ase); isomerase , for example, protein disulfide isomerase (PDI); lyase, any one of claims 1 to 12 is an enzyme selected for example from the group of pectate lyase
    項記載のポリペプチド。 Above, wherein the polypeptide.
  14. 【請求項14】 前記ポリペプチド又は親ポリペプチドが、PD498, Savinas 14. The polypeptide or parent polypeptide, PD498, Savinas
    e(商標), BPN - 、アミラーゼ、プロテイナーゼK、プロテイナーゼR、スブチリシンDY、Lion Y, Rennilase(商標), JA16, Alcalase(商標)である請求項1 e (TM), BPN -, amylase, proteinase K, proteinase R, subtilisin DY, Lion Y, Rennilase (R), according to claim 1 which is JA16, Alcalase (TM)
    3記載のポリペプチド。 3 wherein the polypeptide.
  15. 【請求項15】 前記接合体のポリペプチド又は親ポリペプチドが、次の1 15. A polypeptide or parent polypeptide of the conjugate, the following 1
    又は複数の置換、すなわち位置86, 87, 7, 47, 51, 219, 12, 218, 10, 11, 53, Or more substitutions, i.e. position 86, 87, 7, 47, 51, 219, 12, 218, 10, 11, 53,
    28, 1, 65, 61, 63, 67, 60, 69, 55, 44, 45, 111, 115, 109, 215, 200, 202 28, 1, 65, 61, 63, 67, 60, 69, 55, 44, 45, 111, 115, 109, 215, 200, 202
    , 170, 268, 250, 152, 254, 136, 269, 246, 141でのアミノ酸残基がK, D, E又はCにより置換されているPD498変異体、好ましくはR250k,R250D, R250E, R250C , 170, 268, 250, 152, 254, 136, 269, 246, amino acid residues K at 141, D, E or PD498 variant which is substituted by C, preferably R250k, R250D, R250E, R250C
    である請求項14記載のポリペプチド。 Claim 14, wherein the polypeptide is.
  16. 【請求項16】 前記ポリペプチド又は親ポリペプチドが、次の1又は複数の置換、すなわち位置77, 2, 5, 43, 214, 206, 22, 215, 14, 17, 9, 36, 211, 16. The polypeptide or parent polypeptide, following one or more substitutions, i.e. position 77, 2, 5, 43, 214, 206, 22, 215, 14, 17, 9, 36, 211,
    195, 197, 154, 163, 247, 265, 251, 143, 127, 260, 131, 128, 243でのアミノ酸残基がK, D, E又はCにより置換されているBPN -変異体、好ましくはR247K, R 195, 197, 154, 163, 247, 265, 251, 143, 127, 260, 131, 128, amino acid residues K at 243, D, BPN substituted by E or C - mutant, preferably R247K, R
    247D, R247E, R247Cである請求項14記載のポリペプチド。 247D, R247E, claim 14 of the polypeptide is R247C.
  17. 【請求項17】 前記ポリペプチド又は親ポリペプチドが、次の1又は複数の置換、すなわち位置75, 2, 42, 208, 200, 14, 22, 17, 189, 241, 125, 125, 17. The polypeptide or parent polypeptide, following one or more substitutions, i.e. position 75, 2, 42, 208, 200, 14, 22, 17, 189, 241, 125, 125,
    141, 245, 249, 237, 254, 157でのアミノ酸残基が、K, D, E又はCにより置換されているSavinase(商標)変異体、好ましくはR241K, R241D, R241E, R241C 141, 245, 249, 237, 254, amino acid residues at 157, K, D, E or variants Savinase substituted (TM) by C, preferably R241K, R241D, R241E, R241C
    である請求項14記載のポリペプチド。 Claim 14, wherein the polypeptide is.
  18. 【請求項18】 前記ポリペプチド又は親ポリペプチドが、次の1又は複数の置換、すなわち位置124, 126, 128, 159, 160, 166, 185, 186, 189, 190, 19 18. The polypeptide or parent polypeptide, following one or more substitutions, i.e. position 124, 126, 128, 159, 160, 166, 185, 186, 189, 190, 19
    3, 194, 195, 196, 198, 201, 202, 203, 209, 210, 214, 242, 244, 247, 296, 3, 194, 195, 196, 198, 201, 202, 203, 209, 210, 214, 242, 244, 247, 296,
    298, 299, 302, 303, 304, 306, 307, 308, 310, 311, 314, 345, 347, 405, 4 298, 299, 302, 303, 304, 306, 307, 308, 310, 311, 314, 345, 347, 405, 4
    06, 407, 408, 409, 433, 434, 435, 436, 437, 475, 476, 477, 478でのアミノ酸残基がK, D, E又はCにより置換されているアミラーゼ変異体である請求項14 06, 407, 408, 409, 433, 434, 435, 436, 437, 475, 476, 477, amino acid residues 478 are amylase variants which have been substituted K, D, by E or C claims 14
    記載のポリペプチド。 The description of the polypeptide.
  19. 【請求項19】 前記ポリマー分子が、合成ポリマー分子、例えば枝分かれ 19. The polymer molecules, synthetic polymer molecules, for example, branched
    PEG、ポリビニルアルコール(PVA)、ポリカルボン酸、ポリ−(ビニルピロリドン)及びポリ−D, L−アミノ酸、又は天然に存在するポリマー分子、例えばデキストラン、例えばカルボキシメチルデキストラン、及びセルロース、例えばメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、及びキトサンの加水分解物、 PEG, polyvinyl alcohol (PVA), polycarboxylic acid, poly - (vinyl pyrrolidone) and poly -D, L-amino acids, or polymeric molecules present in nature, such as dextran, for example, carboxymethyl dextran, and cellulose, such as methylcellulose, carboxy methyl cellulose, ethyl cellulose, hydroxyethyl cellulose, hydroxypropyl cellulose, and chitosan hydrolysates,
    澱粉、例えばヒドロキシエチル−澱粉、ヒドロキシプロピル−澱粉、グリコーゲン、アガロース、グアーガム、イヌリン、プルラン、キサンガム、カラゲニン、 Starches, such as hydroxyethyl - starch, hydroxypropyl - starch, glycogen, agarose, guar gum, inulin, pullulan, xanthan gum, carrageenan,
    ペクチン及びアルギン酸の群から選択された天然又は合成のホモ−及びヘテロポリマーを含んで成る群から選択される請求項10又は12記載のポリペプチド。 Homo pectin and selected natural or synthesized from the group of alginic acid - and claim 10 or 12, wherein the polypeptide is selected from the group comprising a hetero polymer.
  20. 【請求項20】 前記修飾されたポリペプチドが、サビナーゼ変異体R241Kb 20. The modified polypeptide, Savinase variant R241Kb
    PEG1000又はR241KbPEG2000である請求項19記載のポリペプチド。 PEG1000 or R241KbPEG2000 claim 19, wherein the polypeptide.
  21. 【請求項21】 前記修飾されたポリペプチドが、サビナーゼ変異体R241Q, 21. The modified polypeptide, Savinase variant R241Q,
    R241E, R241H又はR241Kである請求項1〜7のいずれか1項記載のポリペプチド。 R241E, R241H or any one of claims polypeptide of claims 1 to 7 is R241K.
  22. 【請求項22】 低められた免疫応答を有するポリペプチドを調製するための方法であって、 a)注目の親ポリペプチドの三次元構造の表面上に位置するアミノ酸を同定し、 b)修飾されるべき、前記親ポリペプチドの前記三次元構造の表面上の標的アミノ酸残基を選択し、 c)段階b)において選択された1又は複数のアミノ酸残基を、他のアミノ酸残基により置換し、そして/又は d)段階b)及び/又は段階c)におけるアミノ酸残基にポリマー分子をカップリングする、 段階を含んで成る方法。 22. A method for preparing a polypeptide with reduced immune responses, and identify amino acid located on the surface of the three-dimensional structure of the parent polypeptide in a) interest, b) modified Rubeki, wherein the parent polypeptide selected targeted amino acid residues on the surface of the three-dimensional structure, c) one or more amino acid residues selected in step b), was replaced by another amino acid residue and / or d) step b) the polymer molecules coupled to the amino acid residue at and / or step c), comprising the step.
  23. 【請求項23】 前記アミノ酸残基のCα−原子が前記ポリペプチドに結合されるリガントから15Åよりも短い位置に位置する請求項22記載の方法。 23. The method of claim 22, wherein the Cα- atoms of the amino acid residue is located at position less than 15Å from Riganto coupled to the polypeptide.
  24. 【請求項24】 前記アミノ酸残基のCβ−原子が前記Cα−原子よりもリガンドに接近して位置する請求項22又は23記載の方法。 24. The method of claim 22 or 23 A method according Cβ- atoms of said amino acid residue is located close to the ligand than the Cα- atoms.
  25. 【請求項25】 前記アミノ酸残基のCα−原子が前記リガンドから10Åよりも短い位置に位置し、そして前記アミノ酸残基が少なくとも15%、好ましくは少なくとも20%、より好ましくは少なくとも30%の接近性を有する請求項22〜 25. Located in Cα- atom positions less than 10Å from the ligand of the amino acid residues, and the amino acid residues at least 15%, preferably at least 20%, more preferably at least 30% of the approach claim 22 to have a sex
    24のいずれかの1項記載の方法。 The method of any one of claims 24.
  26. 【請求項26】 前記段階a)において言及されるポリペプチドの表面上に位置するアミノ酸残基の同定が、注目の親ペプチドの三次元構造を分析するコンピュータープログラムにより行われる請求項22〜25のいずれか1項記載の方法。 26. Identification of amino acid residues located on the surface of the polypeptide referred to in the step a) is, according to claim 22 to 25 is performed by a computer program to analyze the three-dimensional structure of the parent peptide attention the method of any one of claims.
  27. 【請求項27】 前記段階b)が、前記親ポリペプチドの表面上のアルギニン又はリシン残基を選択することを含んで成る請求項22〜26のいずれか1項記載の方法。 27. The method of claim 26, wherein step b) is, any one method according to claim 22 to 26 comprising selecting an arginine or lysine residue on the surface of the parent polypeptide.
  28. 【請求項28】 前記段階b)において同定される1又は複数のアルギニン残基が段階c)におけるリシン残基により置換される請求項27記載の方法。 28. The method of claim 27, wherein the one or more arginine residues identified in said step b) is replaced by a lysine residue in step c).
  29. 【請求項29】 産業製品のアレルゲン性を低めるためへの請求項1〜21 29. Claim for for reducing the allergenicity of industrial products 1-21
    のいずれか1項記載の修飾されたポリペプチドの使用。 The use of modified polypeptides according to any one of.
  30. 【請求項30】 医薬の免疫原性を低めるためへの請求項1〜21のいずれか1項記載の修飾されたポリペプチドの使用。 30. The use of modified polypeptide of any one of claims 1 to 21 to for reducing the immunogenicity of pharmaceuticals.
  31. 【請求項31】 請求項1〜21のいずれか1項記載の修飾されたポリペプチド及びさらに、産業製品に使用される成分を含んで成る組成物。 31. A modified polypeptide of any one of claims 1 to 21 and further, compositions comprising ingredients used in industrial products.
  32. 【請求項32】 前記産業製品が、洗剤、例えば洗濯、皿洗い又は硬質表面洗浄製品、例えば生物−フィルム製品又は食品又は飼料製品、又は繊維製品である請求項31記載の組成物。 32. The industrial product, a detergent, for example laundry, dishwashing or hard surface cleaning product, for example, biological - film product or food or feed products, or claim 31 composition wherein the textile.
  33. 【請求項33】 請求項1〜21のいずれか1項記載の修飾されたポリペプチド、及びさらに、パーソナルケア製品、特にスキンケア製品を含んで成る請求項32記載の組成物。 33. The modified polypeptide of any one of claims 1 to 21, and further, personal care products, according to claim 32 A composition according to particular comprising skin care products.
  34. 【請求項34】 請求項1〜21のいずれか1項記載の修飾されたポリペプチド、及びさらに、医薬に使用される成分を含んで成る組成物。 34. A modified polypeptide of any one of claims 1 to 21, and further, a composition comprising a component used in the pharmaceutical.
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