JP2002519332A - 微生物によって引き起こされる表面感染症の治療または予防に使用するための医薬調製物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、細菌、真菌、ウイルスなどによって引き起こされる感染症、炎症および／または腫瘍の治療および／または予防のための医薬に関するものであり、該医薬は、活性量のポリカチオン性ペプチドまたはタンパク質、および処置すべき組織のｐＨを前以て選択した範囲内に保持するための緩衝液を含む。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 （技術分野） 本発明は、微生物、とりわけCandidaによって引き起こされる表面感染症の治
療または予防、およびその副作用の低減に使用するための医薬調製物に関する。

【０００２】 （背景技術） 知られているように、細菌、カビおよびウイルスによって引き起こされる身体
感染症は大きな問題である。これら感染症の多くは、糜爛（sores）または炎症
を起こした組織の形態で組織の表面に局部的に現れる。組織防御の第一線が攻撃
を受けた場合、たとえば、手術の際に起こるような口があいている創傷、床ずれ
または火傷、または腸炎、結腸炎、クローン病、あるいはヘリコバクター・ピロ
リ感染症の場合には、細菌の表面感染も起こることがあり、そのような表面感染
は今度は慢性の炎症、敗血症などの多くの望ましくない副作用へと導くことがあ
る。

【０００３】 口内での粘膜の細菌感染症、たとえば歯肉炎や歯周炎は、不衛生な口で起こり
うる。皮膚の細菌感染症はニキビとして現れる。口内炎および食道炎は、たとえ
ば腫瘍の化学療法の後の抵抗力の低下の結果として口および食道に起こりうる炎
症である。 これらタイプの感染症は、現在、第一に抗生物質の適用により治療している。
残念ながら、治療すべき細菌の多くはこれら抗生物質に対する耐性を獲得し、そ
れによって治療はますます困難となり、幾つかの場合には不可能となる。

【０００４】 組織の表面に起こりうるウイルス感染症は、しばしばヘルペスウイルス（アフ
テン（aften））または水疱性口内炎ウイルスの感染症の形態をとって現れる。 カビの感染症としては、たとえばカンジダ症、水虫が挙げられ、これらは局部
的な炎症や不快な匂いに導きうる。

【０００５】 Langenbeckにより１９３９年に発見されて以来、発疹チフスの原因であると最
初に考えられていた微生物、Candida属のものは、依然として増大する範囲の解
剖学的部位および臨床場面での感染症の病因である。正常な健康な個体において
は、酵母Candidaは共生生物として分類され、内部および外部の両表面を占める
。通常の環境では宿主と酵母ミクロフローラとの間の平衡状態が、この微生物の
無毒性の共生状態を保証している。この平衡状態は特異的な免疫応答によっての
みならず、唾液や粘膜分泌液に分泌される非特異的な因子、たとえばＩｇＡ、リ
ゾチーム、ラクトフェリンおよびヒストンによっても維持されている。この平衡
状態は、ある範囲の疾病素質の影響を受けうるが、最も一般的なものは免疫に障
害のある患者の場合である。たとえば、ヒト免疫不全症候群ウイルス（ＨＩＶ）
に感染したヒトでのカンジダ症の発症はＡＩＤＳおよびＡＩＤＳ関連病の出現と
極めて密接に関係しているため、これはセンター・フォア・ディジーズ・コント
ロール（Center for Disease Control）によってＡＩＤＳを定義するのに用いら
れている一つの因子である。C. albicansはＡＩＤＳの初期の段階で関係付けら
れているが、C. glabrataおよびC. kruseiによる感染症はＡＩＤＳの後期の段階
でますます広がっていく。

【０００６】 カンジダ症（たとえば、モニリア症を含む）、すなわち、上記に記載したよう
にCandida真菌タイプの一つ、たとえばCandida albicans、Candida tropicanaま
たはCandida glabrataによって引き起こされる感染症は、生体（ヒトあるいは動
物）の防御系が損われてそれによって体内に存在するCandidaがもはや制御でき
なくなったときに起こりうる。この種の状況は、たとえば、化学療法または放射
線療法を受けた癌患者のみならず、病気の後期にあるＡＩＤＳ患者、長期にわた
ってステロイド剤を使用した患者、たとえば移植患者、免疫応答を抑制するため
に医薬を使用した移植患者、手術患者のある種のグループ、糖尿病患者、スプル
ー（抗生物質を用いた治療後に極めて頻繁に発症する）を患う病気の赤ちゃん、
およびある種のグループの婦人でも起こりうる。感染症は、全胃腸管の表面また
は尿生殖器領域、たとえば口から気管支、食道および腸および膣／外陰部に現れ
、この疾患によって感染されうる。

【０００７】 （発明の開示） （発明が解決しようとする技術的課題） ＨＩＶの流行が出現する前は、口腔の真菌感染症がアムホテリシンＢやナイス
タチンなどのポリエン系抗生物質、およびミコナゾールやクロトリマゾールなど
のアゾール剤で治療されていた。ＨＩＶ陽性患者での高い再発率およびアムホテ
リシンＢで報告されている毒性の副作用は、第一次選択治療としてアゾール剤の
使用へと導いた。ケトコナゾールおよびイトラコナゾールは容易に吸収されない
ので、その使用は制限されている。フルコナゾールが選択薬となったが、その広
範な使用はその抗真菌効力に対するCandidaの耐性を増大させる結果となった。
さらに、抗真菌剤としての５−フルオロシトシンの使用は、臨床的にも有意なCa
ndidaの耐性株へと導いた。重篤に免疫抑制された患者の場合に真菌症の治療に
失敗する頻度が上昇してきているので、抗真菌剤の抗真菌活性をサポートする新
たな治療剤の開発に対する必要性が存在する。

【０００８】 カンジダ症はよく見受けられるものであり、ある状況では生命をも脅かすこと
がある。カンジダ症は現在のところ、非常にしばしば有効とは思われない医薬で
治療されている。というのは、カンジダのある種の子孫は使用した医薬に対する
耐性を獲得し、そのため病気を制御するには増大した投与量を投与しなければな
らず、あるいは非常に毒性の強い医薬を使用しなければならないからである。 従って、カンジダを治療または予防するのを助けることのできる容易に投薬で
きる医薬に対する強い必要性が存在する。

【０００９】 （その解決方法） 本発明の第一の側面に従い、請求項１に記載の医薬が提供される。 本発明者らは、驚くべきことに、その有効性がｐＨ依存性であり、それゆえ、
ある程度制御可能であることを示した。 本発明による医薬は、該医薬の活性成分が長期にわたって微生物と直接接触す
ることを可能とすることにより、微生物、とりわけカンジダにより感染した組織
を治療するのに用いることができる。この医薬は、感染症がどこに生じたか、す
なわち、皮膚、足、直腸、気管支、肛門あるいは膣に生じたかに応じて、パスタ
剤、クリーム剤、軟膏、ゲル剤、ローション剤またはスプレー剤の剤型であって
よい。塗布形態の医薬はまた、吸収剤、たとえば創傷の包帯に適用できる。

【００１０】 ＷＯ９０／１１７５４は、たとえば吸入のための圧入エアゾル剤を教示してい
る。 ＷＯ９４／２８９１１は、胃腸管内のｐＨを所望の値に変えることのできる化
合物を記載している。 たとえば、感染症が消化管、とりわけ口内で起こる場合には、医薬は徐放おし
ゃぶり錠剤（sucking tablet）（パステル剤）、カプセル剤またはチューイング
ガムの剤型をとってよい。錠剤の含量は好ましくは３０分以上局部的に存在し、
この時間の間、好ましくは４５分以上、最も好ましくは９０分以上活性であるの
が好ましい。感染症がさらに下部の消化管、たとえば十二指腸で起こる場合には
、医薬は、たとえばマイクロスフィア（microspheres）、コーチング顆粒剤また
はコーチング錠などのように活性成分が消化管の前以て決定した位置で放出され
るように被包された液剤の剤型をとってよい。

【００１１】 医薬に適した緩衝系はＷＯ９４／２８９１１に記載されている。 口内のｐＨを６〜６.５の値に制御するための緩衝系はＷＯ８８／０２６００
に記載されている。 最も適切な緩衝系は、マグネシウムまたは亜鉛の水酸化塩、炭酸塩またはクエ
ン酸塩を含む。

【００１２】 医薬は好ましくは、請求項３または４に記載するようなポリカチオン性のペプ
チドまたはタンパク質を含み、好ましくはさらに請求項５に記載するような緩衝
液を含み、その際、ペプチドおよび緩衝液は請求項６に記載するような量で含ま
れるのが好ましく、それによって治療すべき組織のｐＨをたとえば請求項２に記
載するような前以て選択した範囲に維持する。

【００１３】 ポリカチオン性のペプチドおよびタンパク質としては、好ましくはヒトラクト
フェリン（ｈ−Ｌｆ）、ウシラクトフェリン（ｂＬｆ）、ラクトフェリシン、コ
ンアルブミン、オボトランスフェリン、これらタンパク質中に存在するポリカチ
オン性のペプチド（ＥＰ第０５０３９３９号、同第０４７４５０６号、同第０５
１０９１２号または同第０４３８７５０号に記載）、ポリカチオン性ペプチドを
含むこれらタンパク質の加水分解物、アコニチルまたはスクシン化した誘導体な
どのこれらタンパク質の化学誘導体（陽性の基は保護されている）（ＥＰ第０４
０６４１６号および同第０５７５４３２号に記載）およびインドリシジン（indo
licidin）アナログが挙げられる。

【００１４】 また、アルファまたはベータデフェンシンのファミリー、好ましくは好中球ま
たはペネト細胞から単離したデフェンシン（たとえば、ＥＰ第０６８９５５０号
およびＥＰ第０７５０５０６号を参照）、１型または２型などのマガイニン（た
とえば、舌またはカエルの上皮組織からの粘液から単離できる）（ＷＯ９５−３
２２８７を参照）、ＨＮＰ−１またはＨＮＰ−３などのヒトデフェンシン、ラッ
トデフェンシン、たとえばＮＰ−１またはＮＰ−２、またはセクロピン（cecrop
ins）Ａ型またはＢ型、白血球からのプロテグリン（protegrins）（ＷＯ９７−
１８８２６を参照）、昆虫からのポリカチオン単離物（ＷＯ９７−３００８２を
参照）、およびメルクインデックス、第１０版、６８３頁に定義されているよう
なヒストンのポリカチオンも含まれる。ラクトフェリンは好ましくは変性させな
い。

【００１５】 他の適当なポリカチオン性ペプチドとしては、ラクトフェリンの加水分解物お
よびラクトフェリンに由来するカチオンに富むペプチドが挙げられる。 ラクトフェリンを用いる場合は、１００％鉄の飽和した形態およびアポ形態並
びにそれらの混合物を用いることができる。製品中のラクトフェリンの量は、治
療すべき組織が現行の医薬に対して感受性の微生物に対しては少なくとも０.１
ｍｇ／ｍｌおよび好ましくは１ｍｇ／ｍｌ以上、感受性でない微生物に対しては
１０ｍｇ／ｍｌ以上および好ましくは４０ｍｇ／ｍｌ以上の濃度に暴露されるこ
とを保証するものでなければならない。適用形態に応じて、少なくとも０.５μ
モル（０.４ｇ）のラクトフェリンおよび好ましくは５μモル以上のラクトフェ
リンを配合しなければならない。軟膏剤、クリーム剤、ローション剤またはスプ
レー剤中の濃度は、好ましくは少なくとも２.５ナノモル／ｍｌ製品および好ま
しくは製品１ｍｌ当たり０.１２μモル（０.１ｇ）以上のラクトフェリンである
。

【００１６】 緩衝液の量は、組織の粘膜層のｐＨを最も好ましくは７〜８の間に保持し、こ
のｐＨを少なくとも３０分間および好ましくは４５分間（この時間の間、活性成
分は組織と接触している）保持するために、充分に高くなければならない。この
ことを達成するためには、医薬のｐＨは７.２、好ましくは７.４以上であってよ
い。錠剤またはガム（１.２ｇ）の剤型をとる場合は、少なくとも１ミリモル、
好ましくは２ミリモル以上の緩衝液を配合しなければならず、軟膏剤、ゲル剤ま
たはローション剤の場合は好ましくは１０μモル以上配合しなければならない。
組織のｐＨは８.０を超えて上昇することがないことは重要である。というのは
、このようなｐＨは刺激作用があり組織の働きに影響を及ぼすからである。医薬
のｐＨがわずかに８.０を越えることは起こりうるが、このことはその後速やか
に７〜８のｐＨ値を可能にすべく決定されるべきである。医薬錠剤が口内にある
間の唾のｐＨ値は、好ましくは８を超えるｐＨでは２分間以内で、最も好ましく
は６０分間、７〜８のｐＨでなければならない。

【００１７】 緩衝液の例を下記の表１に列挙してある。必要なら、さらに濃縮した緩衝液を
医薬に含めることができる。表１ ：水中の緩衝液系、ｐＨは１８℃で測定 ｐＨ７.４ ７.６ ７.８ ８.０ ａ／ホウ砂(０.０５Ｍ) 11 ml 15 21 27 ホウ酸(０.２Ｍ) 89 ml 85 79 73 ｂ／ホウ砂(０.０５Ｍ) 52 54 56 ０.１Ｎ ＨＣｌ 48 46 44 ｃ／Na2HPO4(６６.７ｍＭ) 8 9 KH2PO4(３９.７８ｍＭ) 2 1 ｄ／Na2HPO4(０.２Ｍ) 90.85 93.65 95.75 97.25 クエン酸(０.１Ｍ) 9.15 6.35 4.25 2.75

【００１８】 ９４.７ｍｌの０.２Ｍ Ｎａ₂ＨＰＯ₄を４.３ｍｌの０.１Ｍクエン酸と混合し
たものは、ｐＨが７.７の緩衝液系を提供する。緩衝液系の他の例は、いわゆる
生物学的緩衝液である。ＰＯＰＳＯ（ピペラジン−Ｎ,Ｎ'−ビス[２−ヒドロキ
シプロパンスルホン酸]）、ＴＡＰＳＯ（３−[Ｎ−トリス(ヒドロキシメチル)メ
チルアミノ]−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸）またはＨＥＰＥＳ（Ｎ−[２
−ヒドロキシエチル]ピペラジン−Ｎ'−[２−エタンスルホン酸]）などの化合物
を用いることもできる。水中で０.４Ｍの溶液は、所望のｐＨが達成されるまで
０.２Ｎ水酸化ナトリウム溶液で滴定する。乾燥した後、粉末が得られ、これを
錠剤に用いることができる。

【００１９】 緩衝液系はまた、腸内適用についてはＷＯ９４−２８９１１の記載に従って、
口内適用についてはＥＰ第０３８１４１４号の記載に従って用いることができる
。リン酸カルシウムは、溶解性が悪く味が不快であるため加えないのが好ましい
。 口内でｐＨを７〜８の値に約３０分よりも長く保つため、酸中和剤を、たとえ
ば医薬当たり０.５〜１００および好ましくは０.８〜２０ミリ当量の量で加える
のが好ましい。

【００２０】 医薬はまた他の活性成分を含んでいてよく（たとえば、請求項７を参照）、該
成分は酸性化作用を付与しないのが好ましい。 医薬はまた、請求項８に記載のように標準的な既知の薬剤を含んでいてよい。 本発明者らは、上記に詳記したポリカチオンまたはタンパク質とこれら標準的
な薬剤との組み合わせが予期しない相乗効果を奏することを示した。

【００２１】 リゾチームもまた医薬に含まれていてよく、この場合には、知られているよう
に所定量の重炭酸塩（ＨＣＯ３−）およびチオシアン酸塩（ＳＣＮ−）も含まれ
ていなければならない。リゾチームの濃度は、一般に、錠剤当たり１０〜１００
０ｍｇ、クリーム剤、ゲル剤、ローション剤およびスプレー剤の場合は５〜１０
０ｍｇ／ｍｌであろう。病原体に対する特定のｓＩｇＡ、ＩｇＭまたはＩｇＧな
どの免疫グロブリンもまた含まれていてよい。 微生物に対する良好な活性は、アルキレングリコールモノエチルエーテルまた
はモノアルキルグリセリドエステルなどの界面活性剤もまた医薬に含まれている
場合に得ることができる。

【００２２】 金属イオン（たとえば亜鉛）などのような組織修復を助ける化合物もまた医薬
に含まれているのが好ましい。医薬中に取りこむことのできる化合物は、グルタ
ミン、０.１〜０.６ｇ／ｇ錠剤、ヌクレオチド、１〜１００μｇ／ｍｌクリーム
剤または０.１〜１０ｍｇ／錠剤、または１０〜１０００μｇ／ｍｌクリーム剤
または０.１〜５０ｍｇ／ｇ錠剤の量の血小板由来増殖因子や上皮増殖因子など
の増殖因子である。

【００２３】 さらに、特別の患者グループによって必要とされる場合には医薬はビタミンお
よびミネラルを含んでいてよい。たとえば、これらは、とりわけビタミンＢ１２
、Ａ、Ｂ６および葉酸またはその代謝等価物については１日に推奨される量の１
〜４×の量で含まれていてよい。 本発明の第二の側面によれば、請求項１１に記載の医薬が提供される。 上記に記載したように、本発明者らはそのような医薬が予期しない相乗的な働
きを奏することを示した。 本発明はさらに、表および図面を参照しながら下記実施例および結果により説
明されるであろう。

【００２４】実験 １．カンジダ種へのラクトフェリンの抗真菌活性に対するｐＨの影響材料および方法 生物 幾つかの口内Candida albicansおよびC. glabrata単離物（これらは抗真菌剤
に対する感受性が異なる）を、マイクロバイオロジー・ラボラトリー・アカデミ
ック・ホスピタル・グロニンゲン（Microbiology Laboratory Academic Hospita
l Groningen）（オランダ）の慣例の微生物サービスから入手した。すべての株
をサブローデキストロース寒天培地（ＳＤＡ；Oxiod, Unipath Ltd, 英国.）斜
面上で４℃で貯蔵した。

【００２５】アッセイ培地 使用した抗真菌剤不含培地であるサブロー液体培地（ＳＬＭ；Oxiod, Unipath
Ltd, 英国.、ｐＨ５.６）およびＲＰＭＩ１６４０培地（Ｌ−グルタミンｗ／ｏ
ＮａＨＣＯ₃，２％グルコースを添加、ｐＨ７.０、Gibco BRL、ペーズリー、ス
コットランド）を製造業者の指示に従って調製した。必要なら、ＮａＯＨを用い
てＳＬＭをｐＨ６.５および７.５に調整し、ＨＣＬを用いてＲＰＭＩをｐＨ５.
０および６.０に調整した。培地を０.２μｍのフィルターに通して滅菌した。

【００２６】抗真菌剤 ウシラクトフェリン（Numico B.V.、ワゲニンゲン、オランダ）およびフルコ
ナゾール（Diflucan^R I.V.; Pfizer B.V.、オランダ）をアッセイ培地中に適当
な濃度で溶解した。すべての懸濁液をマイクロタイタープレートに加える前に滅
菌ガラス管中で調製した。

【００２７】接種物 酵母単離物をＳＤＡ上、３５℃、空気中で２４時間増殖させた。これら培養液
から５つのコロニーを取り出して浮遊液を調製した。これらを１０ｍｌのＳＬＭ
中に浮遊させ、３５℃にて空気中で１８時間インキュベートしながら混合した。
この培養液から適当なｐＨ（５.６、６.５、７.５または５.０、６.０、７.０）
のＳＬＭかまたはＲＰＭＩ中の１：１０希釈液をインキュベートし、５時間混合
して増殖相の培養液を得た。これを攪拌し、濁度を５３０ｎｍで０.５のMcFarla
nd硫酸バリウム濁度標準の密度に調節し、１ｍｌあたり１×１０⁶〜５×１０⁶細
胞の濃度とした。これから適当なｐＨのＳＬＭかまたはＲＰＭＩ中での１：１０
０希釈により、試験接種物を１ｍｌあたり１×１０⁶〜５×１０⁴細胞の濃度に調
製した。接種物のサイズの確認は、スパイラルプレーター（Spiral Plater）、
モデルＣ（Spiral Systems, Inc.、シンシナティー、オハイオ、米国）を用いて
決定した。ＳＤＡを含むプレート上に１００μｌを自動的にプレーティングし、
これを空気中、３５℃で１８時間インキュベートし、濃度を製造業者の指示に従
って計算した。

【００２８】アッセイフォーマット 滅菌９６−ウエルプラスチックアッセイプレート（平底でぴったりした蓋付き
）（Corning Costar、ケンブリッジ、英国）に５０μｌの試験接種物を加えた。
適当な濃度の試験すべき抗真菌剤をウエルに加えた（７５〜１５０μｌ）。抗真
菌剤なしでの各カンジダ種の増殖の性質を決定するため、対照も含めた。ウエル
当たりの最終容量を、使用したアッセイ培地（ＳＬＭまたはＲＰＭＩ）で２００
μｌに調節した。

【００２９】インキュベーション、増殖曲線および終点基準 接種後、プレートを攪拌せずに３５℃で空気中にて４８時間インキュベートし
た。濁度の測定を、ウエルの中身をマルチチャンネルピペットで再懸濁した後に
自動マイクロプレート読取り器（Ｅｌ_x８００、Bio-Tek Instruments, Inc.、ウ
ィヌースキー、バーモント、米国）でｔ＝０時間、ｔ＝１８〜２４時間（１時間
毎）、および４８時間にて６３０ｎｍで行った。泡はすべて滅菌針の先端で除去
した。４８時間後に視覚的にまたは分光測光的に陽性の増殖を示さないウエルは
、ウエルの中身２０μｌをＳＤＡ上に接種し、その後に３５℃にて空気中で５日
間インキュベートすることにより確認した。最小阻止濃度（ＭＩＣ）は、使用し
た抗真菌剤についてナショナル・コミッティー・フォア・クリニカル・ラボラト
リー・スタンダーズ（National Committee for Clinical Laboratory Standards
）（１９９５）による推奨に従い、２４時間後にカンジダの増殖を実質的に阻止
する抗真菌剤の最低濃度として定義した。すべての実験を４回行った。

【００３０】結果 カンジダ種の増殖に対するｐＨの効果 C. glabrataをＳＬＭ中で３つの異なるｐＨでインキュベートしたとき、この
カンジダ種の増殖が培地のｐＨによって影響を受けることが観察された。図１か
ら明らかなように、C. glabrataＹ１１０は６.５または７.５のｐＨでは最適に
増殖したが、抗真菌アッセイで通常用いられる５.６のｐＨではカンジダの増殖
は有意に低かった。この結果から、最適に増殖している真菌の増殖の阻止を達成
することは最適状態に及ばずに増殖している真菌の阻止に比べて一層困難である
ことが予測できる。Candida albicansＹ１２７のＳＬＭ中での増殖の結果は、Ｙ
１１０の増殖曲線に匹敵するものであった（結果は示していない）。一方、Ｙ１
１０をＲＰＭＩ培地中で幾つかのｐＨにてインキュベートしたときには、ｐＨ５
.０での増殖が最適であるがｐＨ変化はＳＬＭでの結果に比べてＲＰＭＩ中での
Ｙ１１０の増殖曲線にそれほど影響を及ぼさないことが観察された（図２）（図
中、ＡＵは吸収単位（absorption units）である）。

【００３１】幾つかのｐＨでのカンジダ増殖の阻止 ラクトフェリン−Ｙ１１０ 所定の範囲の濃度のラクトフェリンをC. glabrataＹ１１０とともにＳＬＭ中
でｐＨ５.６、６.５または７.５にて２４時間インキュベートし、カンジダ増殖
の阻止の違いを観察した。図３（ａ−ｉ）から明らかなように、５.６のｐＨで
は１０ｍｇ／ｍｌのラクトフェリンはカンジダ増殖を完全に阻止するには充分で
はなかったが、一方、７.５のｐＨでは１０ｍｇ／ｍｌのラクトフェリンの存在
はこのカンジダ種の増殖の完全な停止という結果となった。この結果は、ＲＰＭ
Ｉ中で幾つかのｐＨで試験したときも同様であった（図４（ａ−ｉ））。この場
合も、ｐＨ５.０および６.０では１０ｍｇ／ｍｌのラクトフェリンはカンジダ増
殖を完全に阻止するには充分ではなかったが、７.０のｐＨでは増殖を完全に阻
止することができた。

【００３２】フルコナゾール−Ｙ１１０ フルコナゾールの抗真菌活性は、ｐＨおよび培地の影響下でＹ１１０に対して
上記ラクトフェリンの活性と類似のパターンを示した。図５（ａ−ｉ）および図
６（ａ−ｉ）において、培地のｐＨが上昇するとこのカンジダ種の一層有効な阻
止という結果となったことがわかる。

【００３３】ラクトフェリン−Ｙ１２７ 図７（ａ−ｈ）から明らかなように、Ｙ１１０の結果とは対照的に、ラクトフ
ェリンの阻止活性に対するＳＬＭのｐＨの影響はカンジダＹ１２７に対してはそ
れほど顕著ではなかった。しかしながら、ラクトフェリンの抗真菌活性をＭＩＣ
値として表したときには（下記を参照）、一層低いＭＩＣ値が一層高いｐＨで検
出された（表１）（下記を参照）。 最小阻止濃度（ＭＩＣ）は、使用した幾つかの抗真菌剤についてＮＣＣＬＳに
よる推奨に従い、２４時間後にカンジダの増殖を実質的に阻止する抗真菌剤の最
低濃度として定義した。

【００３４】最小阻止濃度に対するｐＨおよび培地の効果 幾つかのｐＨおよび培地で試験したカンジダ単離物に対するラクトフェリンお
よびフルコナゾールのＭＩＣ値を、ＮＣＣＬＳによる推奨に従い、抗真菌剤およ
びカンジダ種を２４時間インキュベートした後に決定した。その結果を表２に示
す。フルコナゾールおよびラクトフェリンともにカンジダ阻止において一層高い
ｐＨでより有効であることがわかる。さらに、フルコナゾールの抗真菌作用は、
使用した培地の種類によってそれほど大きくは影響を受けなかった。ＳＬＭおよ
びＲＰＭＩについて殆ど同様のＭＩＣ値が決定された。しかしながら、ラクトフ
ェリンの抗真菌作用に対しては培地の種類は大きく影響を及ぼす。一層高いｐＨ
で試験したときにはラクトフェリンのＭＩＣ値の低下が観察された。さらに、Ｓ
ＬＭに比べてＲＰＭＩ培地中で試験したときにＭＩＣ値が３０〜１０００倍低下
したことは、ＲＰＭＩ中で試験したときのカンジダ増殖のはるかに有効な阻止を
示していた。

【００３５】結論 ＳＬＭ中でインキュベートしたカンジダ単離物はｐＨ７.５で最適に増殖する
。 ＲＰＭＩ中でインキュベートしたカンジダ単離物はｐＨ５、６または７で殆ど
同様に増殖する。 使用した培地のｐＨの上昇は、ラクトフェリンまたはフルコナゾールのいずれ
かによるカンジダ増殖の一層有効な阻止という結果となり、ＭＩＣ値の低下が観
察された。 ラクトフェリンの抗真菌活性は、ｐＨ７.５のＲＰＭＩ中でインキュベートし
たカンジダ単離物に対して試験したときに有意に（３０〜１０００倍）上昇した
。

【００３６】表２ ．ＳＬＭまたはＲＰＭＩ培地中で幾つかのｐＨでインキュベートしたカンジ
ダ単離物に対するフルコナゾールおよびラクトフェリンの最小阻止濃度（ＭＩＣ
） カンジダ単離物 培地 ｐＨ フルコナゾール ラクトフェリン （ｍｇ／ｍｌ） （ｍｇ／ｍｌ） Ｙ１１０ ＳＬＭ ５.６ ０.２０ ２８.０ Ｙ１１０ ＳＬＭ ６.５ ０.１０ ３１.０ Ｙ１１０ ＳＬＭ ７.５ ０.１０ １.２７ Ｙ１１０ ＲＰＭＩ ５.０ ０.２５ ＞１００ Ｙ１１０ ＲＰＭＩ ６.０ ０.１１ ＞１００ Ｙ１１０ ＲＰＭＩ ７.０ ０.０６ ０.１０ Ｙ１２７ ＳＬＭ ５.６ − ４８.９ Ｙ１２７ ＳＬＭ ６.５ − ４６.３ Ｙ１２７ ＳＬＭ ７.５ − ２４.９

【００３７】 ２．パステル剤（おしゃぶり錠剤）のための調合物の調製およびインビボ分解お
よびｐＨ安定化効果についての試験 調合物の例： （Ａ）調合物 Ｉ ＩＩ ラクトフェリン ８.２７ ７.８７ 緩衝液 ０.６（６％） １.０（１０％） アルギン酸Ｎａ １.０ １.０（１０％） アスパルテーム ０.０５ ０.０５（０.５％） エアロシル（Aerosil） ０.０３ ０.０３（０.３％） ステアリン酸マグネシウム ０.０５ ０.０５（０.５％） 香味剤 ０.０５ 合計 １０.０ １０.０ｍｇ 錠剤重量 ３０２ｍｇ ３２１ｍｇ 活性成分（ラクトフェリン）の量は錠剤当たり２５０ｍｇである。

【００３８】実験 緩衝液系は、１８９.４ミリモルのＮａ₂ＨＰＯ₄および４.３ミリモルのクエン
酸からなっていた。 男性および女性のボランティアのいずれかの頬に錠剤を入れた。全活性化合物
は５００ｍｇであった。実験の間は食事および／または飲用は禁じられた。前以
て決定した時間に唾の試料を採取し、そのｐＨを測定した。残りの材料はラクト
フェリン含量を決定するために貯蔵した。 インビトロでの分解に対応して、すべてのボランティアは２時間後に口内に固
形分が残っていないと言明した。 不快を表明するボランティアはいなかった。

【００３９】結果 最初のｐＨが６.５よりも低かった場合には、調合物ＩおよびＩＩの両者につ
いて唾液のｐＨの上昇が認められた。平均の最終ｐＨは７〜８であることが認め
られたが、このｐＨ範囲ではインビトロの実験に基づいてラクトフェリンの最大
の抗カンジダ作用を期待できる。

【００４０】Ｂ．抗カンジダ錠剤 成分 錠剤（約１.２ｇ） ４００ｋｇの 当たりの量 バッチ当たり 初乳ＷＰＩ抽出物 ６００ｍｇ １７２ｋｇ デキストロース（Emdex） ２８０ ９５ 重炭酸ナトリウム １００ ３４ 重炭酸カリウム １００ ３４ ソルビトール ５６ １９ 重炭酸マグネシウム ２４ ９.１ ペパーミント ３８ １３ 二塩基性リン酸マグネシウム １６ ５.５ 炭酸カルシウム １１ ３.８ ステアリン酸亜鉛 １７ ６.１ シリカ １８ ６.２ ペパーミント香料 ０.８ｍｇ ０.３

【００４１】 医薬品質の成分を用いた。ウシの初乳を基剤として採用した。これは当該技術
分野で知られた方法を用いて精製してカゼインおよび脂質を除去した。ホエー画
分を陽イオン交換クロマトグラフィーにより精製し、基本画分を当該技術分野で
記載されているように滅菌濾過し噴霧乾燥した。 ホエー画分は、（ウシ）ラクトフェリン、リゾチームおよびラクトペルオキシ
ダーゼからなっていた。単離したラクトフェリンの鉄飽和度は３０％未満であっ
た。 ４００ｋｇのバッチについて上記に示した量の成分を、均一な混合物が得られ
るまで混合した。混合物を標準打錠機に移し、硬錠剤が得られるような圧力下で
操作した。錠剤のｐＨは約７.９であった。 錠剤は食後１日３回使用できる。

【００４２】Ｃ．抗ウイルス／抗真菌錠剤 成分 錠剤当たりの量 コンアルブミン ３００ｍｇ リゾチーム（卵白から） ５０ｍｇ（約２.５^*１０ ６ＩＵ） カタラーゼ（ウシ肝臓から） ５０ｍｇ（約１５０,０００ＩＵ） ステアリン酸マグネシウム １８ クエン酸亜鉛 ４０ リン酸水素二ナトリウム １００ リン酸水素カリウム ８０ シリカ １８ ペパーミント香料 １ ペパーミント ４０ アスパルテーム ２ ソルビトール ６０ 実施例Ｂに記載の製造法を用いた。

【００４３】Ｄ．抗ウイルス／抗真菌ゲル剤 成分 ゲル１００ｇあたりの量 初乳（ＷＰＩ）抽出物 １０ｇ ショ糖 １０ ゲランガム（Gellan gum） １ クエン酸マグネシウム ０.５ クエン酸亜鉛 ０.３ クエン酸カルシウム ０.２ リン酸水素カリウム １ 炭酸水素ナトリウム ０.３ フルーツ香料 ０.６ 水 約７７

【００４４】 ウシを公知の方法を用いてウイルス（ＣＭＶ、ＨＩＶ、ヘルペス）および真菌
（カンジダ）のカクテルで高度免疫した。最初の３日間の乳（初乳）を基剤成分
として用いた。これを当該技術分野で知られた方法を用いて精製してカゼインお
よび脂質を除去した。ホエー画分を陽イオン交換クロマトグラフィーにより精製
し、基本画分を当該技術分野で記載されているように滅菌濾過し噴霧乾燥した。 ゲランガム、ショ糖、クエン酸塩およびリン酸塩を沸騰水に溶解した。６５℃
に冷却した後、初乳粉末を加えた。この溶液を冷却し、ゲルを小さな立方体に切
断した。切片ゲル（サイコロ）は所望の時間の間、口内で舌下に保持することが
できる。

【００４５】Ｅ．およびＦ．錠剤ウイルスまたは真菌 実施例２の錠剤に示した組成において、コンアルブミンを３０ｍｇのＰＧ−１
または４０ｍｇのデフェンシンＨＮＰ−１で置き換えた。

【００４６】Ｇ．クリーム剤 成分 １００ｇあたりの量 セチルアルコール １５ｇ 白ロウ １ プロピレングリコール １０ ラウリル硫酸ナトリウム ２ ラクトフェリシン ０.２ Ｎａ２ＨＰＯ４ ６.８ クエン酸 ０.１５ 水 約６５ｍｌ

【００４７】 上記成分を、すべての成分が溶解し懸濁液が均一になるまで５０℃で充分に混
合する。クリーム剤は、Candida albicansに感染した組織に塗布することができ
る。 これら実施例Ｂ〜Ｇでは、緩衝液系は実施例Ａと同じものを採用した、すなわ
ち、Ｎａ₂ＨＰＯ₄を０.２Ｍおよびクエン酸を０.１Ｍで、水で６５ｍｌとした。

【００４８】 ３．カンジダの臨床単離物に対する抗真菌剤と組み合わせたラクトフェリンの相
乗的抗真菌作用はじめに 重篤に免疫が抑制されている患者、とりわけＨＩＶ感染患者の場合に口腔咽頭
カンジダ症の治療に失敗する頻度が増大していることから、一般的な抗真菌剤の
活性を強化する新たな治療用化合物の開発に対する必要性が存在する。カンジダ
種の臨床単離物に対するフルコナゾール、アムホテリシンＢおよび５−フルオロ
シトシンと組み合わせたヒト、ウシおよび鉄涸渇（iron-depleted）ラクトフェ
リンの抗真菌作用をインビトロで調べた。

【００４９】 ９６−ウエルプレート中で適当な濃度の抗真菌剤をカンジダの接種物に加え、
各抗真菌剤の最小阻止濃度（ＭＩＣ）を３５℃で空気中にて２４時間インキュベ
ーションした後に決定した。ラクトフェリンと他の抗真菌剤との組み合わせ効果
のために、８倍の薬剤希釈の希釈マトリックスを調製し、相乗的なまたは拮抗的
な抗真菌活性を計算した。

【００５０】 カンジダの臨床単離物に対してラクトフェリンの異なる抗真菌活性が観察され
た。ＭＩＣ値は、一般に０.５〜１００ｍｇ．ｍｌ^-1の範囲として決定された。
興味深いことには、組み合わせ実験ではラクトフェリンと試験した３つの抗真菌
剤を用いて予期せず顕著な共同活性がカンジダの増殖に対して観察された。ラク
トフェリンとフルコナゾールとの使用が最も成功した組み合わせであると思われ
た。フルコナゾールを比較的少量のラクトフェリンと組み合わせた場合には、フ
ルコナゾールの最小有効濃度の有意の低減が認められた。そのような組み合わせ
はなお完全な増殖阻止という結果となり、５０％までの相乗作用が幾つかのカン
ジダ種に対して認められた。

【００５１】 本発明の場合には、幾つかの一般的な抗真菌剤と組み合わせたラクトフェリン
の、カンジダの幾つかの臨床単離物に対する抗真菌作用を調べた。ラクトフェリ
ンと抗真菌剤との間の潜在的な共同的または相乗的抗カンジダ活性は、抗真菌剤
療法の際に抗真菌剤のより低い投与量を可能にする。

【００５２】生物 幾つかの口内Candida albicans、C. glabrataおよびC. tropicalis単離物（こ
れらは抗真菌剤に対する感受性が異なる）を、アカデミック・ホスピタル・グロ
ニンゲン（オランダ）の慣例の微生物サービスから入手した。すべての感受性試
験においてC. albicans ＡＴＣＣ１０２３１を対照として用いた。すべての株を
サブローデキストロース寒天培地（ＳＤＡ；Oxiod, Unipath Ltd, 英国.）斜面
上で４℃で貯蔵した。

【００５３】アッセイ培地 使用した抗真菌剤不含培地であるサブロー液体培地（ＳＬＭ；Oxiod, Unipath
Ltd, 英国.、ｐＨ５.６）およびＲＰＭＩ１６４０培地（Ｌ−グルタミンｗ／ｏ
ＮａＨＣＯ₃，２％グルコースを添加、ｐＨ７.０、Gibco BRL、ペーズリー、ス
コットランド）を製造業者の指示に従って調製した。

【００５４】抗真菌剤 ウシラクトフェリン、ヒトラクトフェリン（ともにNumico B.V.、ワゲニンゲ
ン、オランダ）、フルコナゾール（Diflucan^R I.V.; Pfizer B.V.、オランダ）
および５−フルオロシトシン（Ancotil^R、Roche Nederland B.V.、ミジンドレヒ
ト、オランダ）をアッセイ培地中に適当な濃度で溶解した。アポラクトフェリン
を、Masson, P.L.およびHeremans, J.F.により以前に記載された方法（Metal-co
mbining properties of Human Lactoferrin (Red Milk Protein) The Involveme
nt of Bicarbonate in the reaction, Eur. J. Biochem, 6(1968)579-584）に従
って０.１Ｍクエン酸に対して一夜透析することによりウシラクトフェリンから
調製し、同様に取り扱った。アムホテリシンＢ（Fungizone^R、Bristol-Myers Sq
uibb Company、ウォルデン、オランダ）を滅菌水中に５ｍｇ／ｍｌの濃度に調製
し、さらにアッセイ培地中で希釈した。すべての懸濁液をマイクロタイタープレ
ートに加える前に滅菌ガラス管中で調製した。 ラクトフェリン調製物中に存在する内毒素の抗真菌活性を排除するため、リポ
多糖（ＬＰＳ、Biowhittaker, Inc.、ウォーカービル、メリーランド、米国）単
独の抗カンジダ作用をも本発明のアッセイ系で１〜１０００ｐｇ／ｍｌの範囲で
試験した。

【００５５】接種物 酵母単離物をＳＤＡ上、３５℃、空気中で２４時間増殖させた。これら培養液
から５つのコロニーを取り出して浮遊液を調製した。これらを１０ｍｌのＳＬＭ
中に浮遊させ、３５℃にて空気中で１８時間インキュベートしながら混合した。
この培養液からＳＬＭ中の１：１０希釈液を５時間インキュベートして、増殖相
の培養液を得た。後者の浮遊液もまたインキュベーションしながら混合した。こ
れを攪拌し、濁度を５３０ｎｍで０.５のMcFarland硫酸バリウム濁度標準の密度
に調節し、１ｍｌあたり１×１０⁶〜５×１０⁶細胞の濃度とした。これからＳＬ
Ｍ中での１：１００希釈により、試験接種物を１ｍｌあたり１×１０⁴〜５×１
０⁴細胞の濃度に調製した。接種物のサイズの確認は、スパイラルプレーター、
モデルＣ（Spiral Systems, Inc.、シンシナティー、オハイオ、米国）を用いて
決定した。ＳＤＡを含むプレート上に１００μｌを自動的にプレーティングし、
これを空気中、３５℃で１８時間インキュベートし、濃度を製造業者の指示に従
って計算した。

【００５６】アッセイフォーマット 滅菌９６−ウエルプラスチックアッセイプレート（平底でぴったりした蓋付き
）（Corning Costar、ケンブリッジ、英国）に５０μｌの試験接種物を加えた。
適当な濃度の試験すべき抗真菌剤をウエルに加えた（７５〜１５０μｌ）。抗真
菌剤なしでの各カンジダ種の増殖の性質を決定するため、対照も含めた。ウエル
当たりの最終容量を、使用したアッセイ培地（ＳＬＭまたはＲＰＭＩ）で２００
μｌに調節した。

【００５７】インキュベーション、増殖曲線および終点基準 接種後、プレートを攪拌せずに３５℃にて空気中で４８時間インキュベートし
た。濁度の測定を、ウエルの中身をマルチチャンネルピペットで再懸濁した後に
自動マイクロプレート読取り器（Ｅｌ_x８００、Bio-Tek Instruments, Inc.、ウ
ィヌースキー、バーモント、米国）でｔ＝０時間、ｔ＝１８〜２４時間（１時間
毎）、および４８時間にて６３０ｎｍで行った。泡はすべて滅菌針の先端で除去
した。４８時間後に視覚的にまたは分光測光的に陽性の増殖を示さないウエルは
、ウエルの中身２０μｌをＳＤＡ上に接種し、その後に３５℃にて空気中で５日
間インキュベートすることにより確認した。 すべての実験を４回行った。

【００５８】相乗実験 カンジダ種の増殖に対するラクトフェリンとフルコナゾール、アムホテリシン
Ｂおよび５−フルオロシトシンとの組み合わせ効果を、ＭＩＣ値の決定に使用し
た実験条件下で調べた。８倍の薬剤希釈の希釈マトリックス（８×８）を調製し
た。三次元表面の図表に基づき、相乗作用および拮抗作用のパーセントをPricha
rd, M.N.およびShipman, C., Jr.によって記載された方法（A three-dimensiona
l model to analyze drug-drug interactions, Antiviral Res. 14(1990) 181-2
06）に従って計算した。簡単に説明すると、個々の薬剤の用量−応答値から２つ
の抗真菌剤の組み合わせの理論的な付加効果を計算した。ついで、得られた理論
的な用量−応答曲線を実際の実験的な用量−応答曲線と比較した。２つの抗真菌
剤の付加的な相互作用のためには実際の実験的な用量−応答曲線は理論的なもの
と符号しなければならないが、これら値よりも高いかまたは低いピークはそれぞ
れ相乗作用または拮抗作用を示す。

【００５９】 相乗実験は以下のようにして行った。 すべての実験を４回行い、すべての測定したＵＶ値をブランクのＵＶ値に対し
て補正した。 一例として、C. glabrataＹ１１０に対するフルコナゾールとラクトフェリン
との間の相乗作用を記載する。

【００６０】 （１）ブランクのカンジダ増殖を２４時間、６回測定した。カンジダ増殖は、６
３０ｎｍでのＵＶ濁度を測定することにより行った。 結果：１.０４６；１.２１７；１.１６０；１.２４９；１.２１２；１.２１５ 平均：１.１８３ これらＵＶ値をその後、実験の間に達成しうる最大のカンジダ増殖とし、それ
ゆえ１００％と関連させた。

【００６１】 （２）個々の医薬について用量応答曲線を作成した。カンジダ増殖を医薬の存在
下で測定した。ついで、個々の医薬によるカンジダ増殖の阻止パーセントを、最
大のカンジダ増殖（１.１８３＝１００％）との関連で記載した（阻止＝１００
％−増殖）。その結果を表３に示す。

【００６２】表３ フルコナゾールについても ラクトフェリン ＵＶ 阻止 フルコナゾール ＵＶ 阻止（ｍｇ／ｍｌ） （ｍｇ／ｍｌ） 100 0.002 99.80 0.5 0.004 99.61 75 0.011 98.92 0.33 0.003 99.76 50 0.068 93.39 0.2 0.003 99.76 25 0.232 77.28 0.1 0.618 39.47 10 0.669 34.48 0.033 1.127 0.00 5 0.647 36.68 0.01 1,154 0.00 1 0.927 9.21 0.0066 1.167 0.00 0.5 1.122 0.00 0.0033 1.150 0.00

【００６３】 （３）ついで、互いに８×８の異なる医薬希釈を試験することにより、カンジダ
増殖に対するラクトフェリンとフルコナゾールとの組み合わせの効果を測定し、
その後、結果をＵＶ測定により得、ついでパーセント阻止を比較した。

【００６４】実験 手順１：８×８希釈のＵＶ測定（表４を参照）。ブランクの補正の値の結果、負
の値が得られた。表４ Flu 0.5 0.33 0.2 0.1 0.033 0.01 0.0066 0.0033 LF 100 0.000 0.002 0.000 -0.002 0.009 0.000 0.000 0.003 75 -0.003 -0.004 0.001 -0.003 0.001 0.008 0.005 0.008 50 -0.004 -0.003 -0.002 -0.003 0.005 0.016 0.017 0.032 25 -0.005 -0.004 -0.004 -0.003 0.010 0.060 0.084 0.116 10 -0.013 -0.012 -0.009 -0.007 0.054 0.321 0.429 0.508 5 -0.008 -0.008 -0.005 -0.004 0.190 0.503 0.570 0.616 1 -0.015 -0.015 -0.014 -0.002 0.336 0.673 0.722 0.746 0.5 -0.016 -0.016 -0.015 0.003 0.752 0.955 1.011 0.944

【００６５】 手順２：％阻止（表５）、最大カンジダ増殖（１.１８３＝１００％）；（阻止
＝１００−％阻止）。表５ Flu 0.5 0.33 0.2 0.1 0.033 0.01 0.0066 0.0033 LF 100 100.00 99.83 100.00 100.17 99.24 100.00 100.00 99.75 75 100.21 100.30 99.96 100.21 99.96 99.28 99.54 99.28 50 100.34 100.25 100.17 100.25 99.58 98.65 98.56 97.30 25 100.38 100.30 100.30 100.21 99.20 94.97 92.94 90.24 10 101.10 101.01 100.76 100.59 95.44 72.87 63.74 57.06 5 100.68 100.68 100.42 100.34 83.94 57.49 51.82 47.94 1 101.27 101.27 101.18 100.17 71.60 43.12 38.98 36.95 0.5 101.35 101.35 101.27 99.75 36.44 19.28 14.55 20.21

【００６６】 これら最後の結果を用い、三次元の増殖阻止曲線を作成し、それによってたと
えば図８に示すように、組み合わせた阻止作用を上から眺めることができる。 ついで、カンジダ増殖のパーセント阻止をPrichard, M.N.およびShipman, C.,
Jr.によって記載された方法（"A three-dimensional model to analyze drug-d
rug interactions", Antiviral Res. 14(1990) 181-206、９９頁、式７）に従っ
て計算した。ラクトフェリンとフルコナゾールとは作用機構が異なると推定され
た。このようにして、これらは以下のように組み合わされる。 Ｚ＝Ｘ＋Ｙ(１−Ｘ) → Ｚ＝Ｘ＋Ｙ(１００−Ｘ／１００）（式７） （式中、ＸおよびＹの値は％であることに注意すべきである） Ｚ＝医薬Ｘ（ラクトフェリン）と医薬Ｙ（フルコナゾール）との組み合わせに
よって引き起こされる全阻止； Ｘ＝医薬Ｘ（ラクトフェリン）のみによって引き起こされる阻止； Ｙ＝医薬Ｙ（フルコナゾール）のみによって引き起こされる阻止。

【００６７】 手順１表６ Flu 0.5 0.33 0.2 0.1 0.033 0.01 0.0066 0.0033 LF 100 100.00 100.00 100.00 99.88 99.80 99.80 99.80 99.80 75 100.00 100.00 100.00 99.35 98.92 98.92 98.92 98.92 50 99.97 99.98 99.98 96.00 93.39 93.39 93.39 93.39 25 99.91 99.94 99.94 86.25 77.28 77.28 77.28 77.28 10 99.74 99.84 99.84 60.34 34.48 34.48 34.48 34.48 5 99.75 99.84 99.84 61.67 36.68 36.68 36.68 36.68 1 99.64 99.78 99.78 45.04 9.21 9.21 9.21 9.21 0.5 99.61 99.76 99.76 39.47 0.00 0.00 0.00 0.00

【００６８】 実験的に測定した％阻止（ポイント（point）３、手順１参照）を最後にカン
ジダ増殖阻止（ポイント４、手順１）について補正した。 （表５−表６） 手順２表７ Flu 0.5 0.33 0.2 0.1 0.033 0.01 0.0066 0.0033 LF 100 0.00 -0.17 0.00 0.29 -0.56 0.20 0.20 -0.06 75 0.22 0.30 -0.04 0.86 1.04 0.36 0.61 0.36 50 0.36 0.27 0.19 4.26 6.19 5.26 5.17 3.91 25 0.47 0.35 0.35 13.97 21.92 17.69 15.67 12.96 10 1.36 1.17 0.92 40.25 60.96 38.39 29.27 22.59 5 0.92 0.83 0.58 38.67 47.26 20.81 15.14 11.26 1 1.62 1.49 1.41 55.13 62.39 33.91 29.77 27.74 0.5 1.74 1.60 1.51 60.28 36.44 19.28 14.55 20.21 これらの値を三次元曲線に表示した（図９）。

【００６９】ｐＨ効果 以上の結果は、ｐＨ５.０の反応条件下でラクトフェリン（Ｌｆ）は１００ｍ
ｇ／ｍｌの濃度で活性ではなく、ｐＨ６.０ではＬｆは１０ｍｇ／ｍｌの濃度で
比較的活性であり、ｐＨ７.０ではＬｆは５ｍｇ／ｍｌの濃度で活性であったこ
とを示している。 他の培地（ＳＡＢ）において、このことはｐＨ５.６、６.５および７.５にお
いて認められた。

【００７０】相乗作用 以上の結果はまた、ラクトフェリンがアゾール剤、とりわけフルコナゾールの
作用を強化することをも示している。感受性のない子孫Ｙ１２７では、フルコナ
ゾールとの良好な相乗作用を奏するにはラクトフェリンの濃度は唾中で少なくと
も１４ｍｇ／ｌでなければならず、良好な相乗的抗真菌作用を得るには少なくと
も５０ｍｇ／ｍｌでなければならない。感受性のカンジダ子孫Ｙ１１１では、Ｌ
ｆの濃度は約２ｍｇ／ｍｌ以上でなければならない。一層高い濃度、たとえば４
ｍｇ／ｍｌでは抗真菌相乗作用もまた認められた。

【００７１】結果の検討 カンジダ増殖の阻止 種々の形態のラクトフェリン（ウシ、ヒトおよびウシアポラクトフェリン）の
抗真菌活性を、C. albicans、C. glabrataおよびC. tropicanaの様々な臨床単離
物に対して決定し、現在用いられている抗真菌剤へのカンジダ種の感受性と比較
した。ＭＩＣをＮＣＣＬＳによる推奨に従って抗真菌剤およびカンジダ種を２４
時間インキュベーションした後に決定し、表８に示した。

【００７２】表８ ．カンジダ種に対する幾つかの抗真菌剤の最小阻止濃度（ＭＩＣ）¹

【表１】 １：最小阻止濃度（ＭＩＣ）は、使用した幾つかの抗真菌剤についてのＮＣＣＬ
Ｓによる推奨に従い［２５］、２４時間後にカンジダの増殖を実質的に阻止した
抗真菌剤の最小濃度として定義した。すべての実験を４回行った。 ２：単離物１０２３１はＡＴＣＣ株である。 ３：すべてのＹ−単離物は、臨床の、大抵は口内のカンジダ単離物である。 ４：これら単離物はＳＬＭの代わりにＲＰＭＩ培地中で試験した。 ５：「−」は決定しなかったことを意味する。

【００７３】 ヒトラクトフェリンの抗真菌活性はウシ変異体と匹敵するかまたは活性が劣る
ので（結果は示していない）、他のすべての実験は入手が一層容易であることか
らウシラクトフェリンを用いて続行した。ウシラクトフェリンおよびウシアポラ
クトフェリンはともに等価な抗真菌活性を示した。これら２つの変異体について
認められたＭＩＣはすべて同じ範囲であり、ＳＬＭ培地中で試験したカンジダ種
については０.５〜１００ｍｇ／ｍｌの範囲であった。

【００７４】 ラクトフェリンはリポ多糖（ＬＰＳ）に結合することができる。初期の実験に
おいて（詳記しない）、これら乳タンパク質中のＬＰＳ含量（５ｐｇ／ｍｇタン
パク質）が決定された。これら乳タンパク質の抗真菌活性へのＬＰＳの寄与を排
除するため、試験系中のＬＰＳの抗真菌活性を調べた。１０００ｐｇ／ｍｌまで
の濃度のＬＰＳでカンジダ種の死滅は観察されなかった。１００ｍｇ／ｍｌまで
の濃度のラクトフェリンは５００ｐｇ／ｍｌのＬＰＳを含むので、カンジダ種の
阻止は主として乳タンパク質自体によって引き起こされると推定された。

【００７５】フルコナゾールおよびラクトフェリンの組み合わせ カンジダ単離物Ｙ１１０の増殖に対するフルコナゾールおよびラクトフェリン
の組み合わせ効果を図８に示す。このカンジダ種は、たとえば１０ｍｇ／ｍｌの
ラクトフェリンと組み合わせた５０μｇ／ｍｌのフルコナゾールを用いて増殖が
既に完全に阻止され、この単離物に対するＭＩＣ値はそれぞれ１５９μｇ／ｍｌ
および３９ｍｇ／ｍｌであることがわかった（表４）。このことは、それぞれの
ＭＩＣ値から外挿されるものよりも少ない抗真菌剤を用いたカンジダ増殖の完全
な阻止を意味していた。このことは、ラクトフェリンおよびフルコナゾールの他
の組み合わせについても説明している（図８）。フルコナゾールとラクトフェリ
ンとの幾つかの組み合わせは、図９に示すようにＹ１１０に対して非常に相乗的
な抗カンジダ作用という結果となった。

【００７６】 ＋５％〜＋５０％基準線よりも高い作用が観察された。たとえば、０.５ｍｇ
／ｍｌのラクトフェリンと１００μｇ／ｍｌのフルコナゾールとの組み合わせは
５０％の相乗的抗カンジダ作用という結果となり、一方、３.３μｇ／ｍｌのフ
ルコナゾールと組み合わせた２５ｍｇ／ｍｌのラクトフェリンは５％しか余分な
抗カンジダ作用を誘発しなかった。フルコナゾールまたはラクトフェリンの濃度
の上昇（そのＭＩＣ値への）は、より低い相乗作用を示した。このことは、フル
コナゾールの濃度がそのＭＩＣ値に近づくにつれてそれ自体で既に完全なカンジ
ダ増殖の阻止が可能であることから予期された。この単離物についてはラクトフ
ェリンとフルコナゾールとの間で拮抗的な抗カンジダ活性は観察されなかった。

【００７７】 ラクトフェリンに対してかなり非感受性のカンジダ単離物である（１００ｍｇ
／ｍｌのＭＩＣ値）Ｙ１２７は、１μｇ／ｍｌのフルコナゾールと組み合わせた
１０ｍｇ／ｍｌのラクトフェリンを用いて完全に阻止され、一方、フルコナゾー
ルのＭＩＣは１０μｇ／ｍｌであった（図１０）。さらに、カンジダ増殖阻止に
ついて相乗作用と同様に拮抗作用が−２０％〜＋４０％、２０％の拮抗作用〜４
０％の相乗作用の範囲で観察された。１ｍｇ／ｍｌのラクトフェリンと０.０５
μｇ／ｍｌのフルコナゾールとの組み合わせは２０％の拮抗作用、すなわちラク
トフェリンおよびフルコナゾールの個々の阻止作用に基づいて理論的に予期され
るよりも２０％低いカンジダ増殖の阻止という結果となり、一方、０.５μｇ／
ｍｌのフルコナゾールと組み合わせた２５ｍｇ／ｍｌのラクトフェリンは４０％
もの余分な増殖阻止を誘発した（図１１）。

【００７８】 同様に、ラクトフェリンに対して一層感受性の株の一つであるＹ１１１は、ラ
クトフェリンとフルコナゾールとの組み合わせを用いて有効に阻止された。この
単離物に対する両化合物のＭＩＣ値の５０％の低減は、カンジダ増殖の完全な阻
止という結果となった（１０μｇ／ｍｌのフルコナゾールと組み合わせた１ｍｇ
／ｍｌのラクトフェリン）。フルコナゾールとラクトフェリンとの共同作用は、
両化合物を少量で用いると（０.００５ｍｇ／ｍｌのラクトフェリンおよび０.３
μｇ／ｍｌのフルコナゾール）拮抗的であり（１０％）、０.５ｍｇ／ｍｌのラ
クトフェリンおよび１０μｇ／ｍｌのフルコナゾールを用いると相乗的であった
（５０％）。

【００７９】アムホテリシンＢとラクトフェリンとの組み合わせ アムホテリシンＢとラクトフェリンとを組み合わせた場合にも単離物Ｙ１１０
に対してカンジダ増殖の有効な阻止が観察された。カンジダ増殖の完全な阻止は
、０.５ｍｇ／ｍｌのラクトフェリンおよび０.１μｇ／ｍｌのアムホテリシンＢ
を用いて観察された（図１２）。さらに、カンジダ増殖の拮抗的（１０％）およ
び相乗的（３０％）阻止がともに示された（図１３）。

【００８０】 また、単離物Ｙ１２７に対しては、ラクトフェリンとアムホテリシンＢとの組
み合わせは、完全なカンジダ阻止を得るのに充分なラクトフェリンまたはアムホ
テリシンＢの濃度のそれほど顕著でない低下という結果となった。カンジダ増殖
の完全な阻止は、ＭＩＣ値に近いアムホテリシンＢまたはラクトフェリンの濃度
を用いた場合のみ達成することができた。Ｙ１２７に対してもこの組み合わせの
拮抗作用（１０％）および相乗作用（３０％）を観察することができた。３０％
の相乗作用は３０ｍｇ／ｍｌのラクトフェリンを０.１μｇ／ｍｌのアムホテリ
シンＢと組み合わせて用いて検出されたが、これはアムホテリシンＢ自体のＭＩ
Ｃ値（ＭＩＣ値：０.１５μｇ／ｍｌ）と比較して小さな低下でしかなった。

【００８１】５−フルオロシトシンとラクトフェリンとの組み合わせ ５−フルオロシトシンとラクトフェリンとの組み合わせは、単離物Ｙ１１０の
増殖の有効な阻止という結果となった。１００％の増殖阻止は、０.０２ｍｇ／
ｍｌのラクトフェリンと組み合わせて０.０００８μｇ／ｍｌの５−フルオロシ
トシン（そのＭＩＣ値に比べて３０倍の低下）を用いて観察された。抗真菌剤の
この組み合わせは、０.０１ｍｇ／ｍｌのラクトフェリンと組み合わせて０.０２
５μｇ／ｍｌの５−フルオロシトシンを用いてＹ１１０に対して５０％の相乗活
性を示した。また、０.０１ｍｇ／ｍｌのラクトフェリンと組み合わせて０.００
１μｇ／ｍｌの５−フルオロシトシンを用いて、増殖阻止に対する５％の低い拮
抗作用が観察された。

【００８２】 C. tropicalis単離物Ｙ１４０は５−フルオロシトシン耐性の単離物である（
表４をも参照）。５−フルオロシトシンとラクトフェリンとの組み合わせのみを
用いてＹ１４０に対する抗真菌作用を調べたところ、９０％の阻止が達成された
。１０ｍｇ／ｍｌのラクトフェリンおよび１０μｇ／ｍｌの５−フルオロシトシ
ンを用いた１５％の相乗作用、および０.００１ｍｇ／ｍｌのラクトフェリンお
よび４５μｇ／ｍｌの５−フルオロシトシンを用いた１０％の拮抗作用が認めら
れた。 カンジダ種へのラクトフェリンの抗真菌活性に対する唾液の影響を調べた。

【００８３】材料および方法 生物 C. glabrataＹ１１０をアカデミック・ホスピタル・グロニンゲン（オランダ
）の慣例の微生物サービスから入手し、サブローデキストロース寒天培地（ＳＤ
Ａ；Oxiod, Unipath Ltd, 英国.）斜面上で４℃で貯蔵した。

【００８４】アッセイ培地 使用した抗真菌剤不含培地であるサブロー液体培地（ＳＬＭ；Oxiod, Unipath
Ltd, 英国.、ｐＨ５.６）およびＲＰＭＩ１６４０培地（Ｌ−グルタミンｗ／ｏ
ＮａＨＣＯ₃，２％グルコースを添加、ｐＨ７.０、Gibco BRL、ペーズリー、ス
コットランド）を製造業者の指示に従って調製した。ＳＬＭまたはＲＰＭＩのｐ
ＨをＮａＯＨを用いて７.５に調整した。培地を０.２μｍのフィルターに通して
滅菌した。

【００８５】唾液 唾液をヒトボランティアから採取した。２０００×ｇで１０分間遠心分離した
後、唾液のｐＨを測定した。唾液を０.２μｍのフィルターに通して滅菌し、使
用するときまで−２０℃で貯蔵した。唾液をアッセイ培地（ＲＰＭＩおよびＳＬ
Ｍ）（通常の濃度の２倍であった）に加え（１：１）、通常の濃度のＲＰＭＩお
よびＳＬＭとした。

【００８６】抗真菌剤 ウシラクトフェリン（Numico B.V.、ワゲニンゲン、オランダ）およびフルコ
ナゾール（Diflucan^R I.V.; Pfizer B.V.、オランダ）をアッセイ培地中に適当
な濃度で溶解した。すべての懸濁液をマイクロタイタープレートに加える前に滅
菌ガラス管中で調製した。

【００８７】接種物 酵母単離物をＳＤＡ上、３５℃、空気中で２４時間増殖させた。これら培養液
から５つのコロニーを取り出して浮遊液を調製した。これらを１０ｍｌのＳＬＭ
中に浮遊させ、３５℃にて空気中で１８時間インキュベートしながら混合した。
この培養液からＳＬＭかまたはＲＰＭＩ（ｐＨ７.５）中の１：１０希釈液を５
時間インキュベートし、５時間混合して、増殖相の培養液とした。これを攪拌し
、濁度を５３０ｎｍで０.５のMcFarland硫酸バリウム濁度標準の密度に調節し、
上記に記載したように１ｍｌあたり１×１０⁶〜５×１０⁶細胞の濃度とした。こ
れからＳＬＭ中での１：１００希釈により、試験接種物を１ｍｌあたり１×１０ ⁴ 〜５×１０⁴細胞の濃度に調製した。接種物のサイズの確認は、スパイラルプレ
ーター、モデルＣ（Spiral Systems, Inc.、シンシナティー、オハイオ、米国）
を用いて決定した。ＳＤＡを含むプレート上に１００μｌを自動的にプレーティ
ングし、これを空気中、３５℃で１８時間インキュベートし、濃度を製造業者の
指示に従って計算した。

【００８８】アッセイフォーマット 滅菌９６−ウエルプラスチックアッセイプレート（平底でぴったりした蓋付き
）（Corning Costar、ケンブリッジ、英国）に５０μｌの試験接種物を加えた。
適当な濃度の試験すべき抗真菌剤をウエルに加えた（７５〜１５０μｌ）。抗真
菌剤なしでの各カンジダ種の増殖の性質を決定するため、対照も含めた。ウエル
当たりの最終容量を、使用したアッセイ培地（ＳＬＭまたはＲＰＭＩ）で２００
μｌに調節した。

【００８９】インキュベーション、増殖曲線および終点基準 接種後、プレートを攪拌せずに３５℃にて空気中で４８時間インキュベートし
た。濁度の測定を、ウエルの中身をマルチチャンネルピペットで再懸濁した後に
自動マイクロプレート読取り器（Ｅｌ_x８００、Bio-Tek Instruments, Inc.、ウ
イヌースキー、バーモント、米国）でｔ＝０時間、ｔ＝１８〜２４時間（１時間
毎）、および４８時間にて６３０ｎｍで行った。泡はすべて滅菌針の先端で除去
した。４８時間後に視覚的にまたは分光測光的に陽性の増殖を示さないウエルは
、ウエルの中身２０μｌをＳＤＡ上に接種し、その後に３５℃にて空気中で５日
間インキュベートすることにより確認した。

【００９０】 最小阻止濃度（ＭＩＣ）は、使用した抗真菌剤についてＮＣＣＬＳによる推奨
に従い、２４時間後にカンジダの増殖を実質的に阻止する抗真菌剤の最低濃度と
して定義した。すべての実験を４回行った。

【００９１】結果 カンジダ種の増殖に対する唾液の作用 アッセイ培地ＳＬＭに唾液を添加すると、図２２に示すようにCandida glabra
taＹ１１０の増殖速度のわずかな遅延という結果となった。しかしながら、イン
キュベーションの２４時間後に存在するカンジダ種の量は同じであった。一方、
アッセイ培地ＲＰＭＩに唾液を添加すると、カンジダ増殖の殆ど完全な阻止とい
う結果となった（図２３（ａ，ｂ，ｃ））。５％の唾液のみを添加すると対照（
０％唾液）と比較して若干のカンジダ増殖を示した。それゆえ、本発明者らは、
他の実験でもＳＬＭ培地と組み合わせて唾液を用いた（５０％／５０％）。

【００９２】唾液の存在下でのカンジダ増殖の阻止 ラクトフェリン−Ｙ１１０ 所定範囲のラクトフェリンを唾液の存在下でC. glabrataＹ１１０とともに２
４時間インキュベートした。図２４および２５から明らかなように、カンジダの
増殖速度は唾液の存在下で遅くなった。対照実験でもすでに影響が観察された（
図１）。しかしながら、ラクトフェリンは依然としてカンジダ単離物の増殖を有
効に阻止できた。唾液の存在下でのカンジダ単離物の増殖の遅延はまた、ＭＩＣ
値にも反映された。ＳＬＭ中で試験したラクトフェリンのＭＩＣは１１.７ｍｇ
／ｍｌであったが、一方、ＳＬＭ／唾液ではＭＩＣは若干低かった（９.６ｍｇ
／ｍｌ）。このことは、増殖の遅い真菌はその増殖を一層早く阻止するので予測
されたことであった。さらに、唾液の成分自体もカンジダの増殖を阻止すること
ができる。

【００９３】フルコナゾール−Ｙ１１０ フルコナゾールの抗真菌活性もまた、上記ラクトフェリンの活性と比較して同
じようなパターンを唾液の存在下でＹ１１０に対して示す（図２６（ａ−ｈ）お
よび２７（ａ−ｈ））。フルコナゾールのＭＩＣ値は、ＳＬＭ中では０.１ｍｇ
／ｍｌであり、ＳＬＭ／唾液中では０.０４ｍｇ／ｍｌであった。

【００９４】唾液の存在下でのフルコナゾールとラクトフェリンとの組み合わせ ｐＨ７.５のＳＬＭ中でのカンジダ単離物Ｙ１１０の増殖に対するフルコナゾ
ールおよびラクトフェリンの組み合わせ効果を図２８に示す。このカンジダ種は
、たとえば０.５ｍｇ／ｍｌのラクトフェリンと組み合わせた５０μｇ／ｍｌの
フルコナゾールを用いてその増殖をすでに完全に阻止したことがわかったが、一
方、この単離物に対するそのＭＩＣはそれぞれ１００μｇ／ｍｌおよび１１ｍｇ
／ｍｌであった（上記参照）。このことは、それぞれのＭＩＣ値から外挿される
ものよりも少ない抗真菌剤を用いたカンジダ増殖の完全な阻止を意味していた。
このことは、ラクトフェリンおよびフルコナゾールの他の組み合わせについても
説明している（図２８）。フルコナゾールとラクトフェリンとの幾つかの組み合
わせは、図２９に示すようにＹ１１０に対して非常に相乗的な抗カンジダ作用と
いう結果となった。

【００９５】 ±５％〜±５０％基準線よりも高い作用が観察された。たとえば、０.５ｍｇ
／ｍｌのラクトフェリンと３３μｇ／ｍｌのフルコナゾールとの組み合わせは５
０％の相乗的抗カンジダ作用という結果となり、一方、３３μｇ／ｍｌのフルコ
ナゾールと組み合わせた２５ｍｇ／ｍｌのラクトフェリンは５％しか余分な抗カ
ンジダ作用を誘発しなかった。フルコナゾールまたはラクトフェリンの濃度の上
昇（そのＭＩＣ値への）は、より低い相乗作用を示した。このことは、フルコナ
ゾールの濃度がそのＭＩＣ値に近づくにつれてそれ自体で既に完全なカンジダ増
殖の阻止が可能であることから予期された。この単離物についてはラクトフェリ
ンとフルコナゾールとの間で拮抗的な抗カンジダ活性は観察されなかった。

【００９６】 唾液の存在下（５０％）でのＹ１１０へのフルコナゾールおよびラクトフェリ
ンの組み合わせの添加は、完全な阻止の一層低濃度の抗真菌剤の方へのシフトと
いう結果となった（図３０）。ＳＬＭ／唾液中でのＹ１１０に対する両抗真菌剤
のＭＩＣ値は通常のＳＬＭ培地中でのＭＩＣ値に比べて低かったが（上記参照）
、両化合物の組み合わせはなお一層、このカンジダ単離物の増殖の一層有効な阻
止となった。たとえば、０.０１ｍｇ／ｍｌのラクトフェリンと３μｇ／ｍｌの
フルコナゾールとの組み合わせはＳＬＭ／唾液培地中でカンジダ増殖の完全な阻
止を示したが、通常のＳＬＭ培地ではこの組み合わせは１１％の阻止であった。

【００９７】 ＳＬＭ／唾液中でインキュベートしたＹ１１０に対するこの組み合わせの相乗
的な抗真菌活性を図３１に示す。ＳＬＭ単独で観察された相乗作用に比べて、イ
ンキュベーション培地への唾液の添加は、ラクトフェリンとフルコナゾールとの
相乗的な組み合わせの量の増大という結果となった。基準線より６５％高い作用
が、１μｇ／ｍｌのラクトフェリンおよび３３μｇ／ｍｌのフルコナゾールの組
み合わせを用いて観察された。一方、３０％の拮抗作用が１０μｇ／ｍｌのラク
トフェリンおよび０.１μｇ／ｍｌのフルコナゾールの組み合わせを用いて観察
された。 本発明は上記の記載に限られるものではない。要求する権利はむしろ下記の特
許請求の範囲によって決定される。

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】 ＳＬＭ中でのC. glabrata Ｙ１１０の増殖に対するｐＨ効果を示
す。

【図２】 ＲＰＭＩ中でのC. glabrata Ｙ１１０の増殖に対するｐＨ効果を
示す。

【図３】 （ａ−ｉ）ＳＬＭ−Ｙ１１０でのラクトフェリンによるカンジダ
増殖阻止に対するｐＨおよび培地の影響を示す。

【図４】 （ａ−ｉ）ＲＰＭＩ−Ｙ１１０でのラクトフェリンによるカンジ
ダ増殖阻止に対するｐＨおよび培地の影響を示す。

【図５】 （ａ−ｉ）ＳＬＭ−Ｙ１１０でのフルコナゾールによるカンジダ
増殖阻止に対するｐＨおよび培地の影響を示す。

【図６】 （ａ−ｉ）ＲＰＭＩ−Ｙ１１０でのフルコナゾールによるカンジ
ダ増殖阻止に対するｐＨおよび培地の影響を示す。

【図７】 （ａ−ｈ）ＳＬＭ−Ｙ１２７でのラクトフェリンによるカンジダ
増殖阻止に対するｐＨおよび培地の影響を示す。

【図８】 Candida glabrata単離物Ｙ１１０の増殖に対するラクトフェリン
およびフルコナゾールの共同阻止作用を示す。示しているのは三次元用量応答グ
ラフの頂部高度（top elevation）である。

【図９】 C. glabrata単離物Ｙ１１０の増殖に対するラクトフェリンおよ
びフルコナゾールの共同阻止作用を示す。グラフはこれら２つの化合物の組み合
わせで観察される相乗作用（すなわち、予測される付加効果（additivity）を上
回る阻止の強化）の量を示している。示しているのは相乗プロットの前部高度（
front elevation）である。相乗作用の量は右側に灰色のバーで示してある。

【図１０】 Candida albicans単離物Ｙ１２７の増殖に対するラクトフェリ
ンおよびフルコナゾールの共同阻止作用を示す。示しているのは三次元用量応答
グラフの頂部高度である。カンジダ増殖に対する阻止作用の量は右側に灰色のバ
ーで示してある。

【図１１】 C. albicans単離物Ｙ１２７の増殖に対するラクトフェリンお
よびフルコナゾールの共同阻止作用を示す。グラフはこれら２つの化合物の組み
合わせで観察される相乗作用（すなわち、予測される付加効果を上回る阻止の強
化）の量を示している。示しているのは相乗プロットの前部高度である。相乗作
用の量は右側に灰色のバーで示してある。

【図１２】 Candida glabarata単離物Ｙ１１０の増殖に対するラクトフェ
リンおよびアムホテリシンＢの共同阻止作用を示す。示しているのは三次元用量
応答グラフの頂部高度である。カンジダ増殖に対する阻止作用の量は右側に灰色
のバーで示してある。

【図１３】 Candida glabrata単離物Ｙ１１０の増殖に対するラクトフェリ
ンおよびアムホテリシンＢの共同阻止作用を示す。グラフはこれら２つの化合物
の組み合わせで観察される相乗作用（すなわち、予測される付加効果を上回る阻
止の強化）の量を示している。示しているのは相乗プロットの前部高度である。
相乗作用の量は右側に灰色のバーで示してある。

【図１４】 ラクトフェリンおよび５−フルオロシトシンを用いたC. glabr
ataＹ１１０の増殖阻止の程度を示す。

【図１５】 ラクトフェリンおよびアムホテリシンＢを用いたC. albicans
Ｙ１２７の増殖阻止の程度を示す。

【図１６】 ラクトフェリンおよびフルコナゾールを用いたC. glabrataＹ
１１１の増殖阻止の程度を示す。

【図１７】 ラクトフェリンおよび５−フルオロシトシンを用いたC. tropi
canaＹ１４０の増殖阻止の程度を示す。

【図１８】 ラクトフェリンおよびアムホテリシンＢの相乗的抗真菌活性を
示す。

【図１９】 ラクトフェリンおよび５−フルオロシトシンの相乗的抗真菌活
性を示す。

【図２０】 ラクトフェリンおよびアムホテリシンＢの相乗的抗真菌活性を
示す。

【図２１】 ラクトフェリンおよびフルコナゾールの相乗的抗真菌活性を示
す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 35/00 Ｃ０７Ｋ 5/11 Ｃ０７Ｋ 5/097 7/06 5/11 7/08 7/06 14/79 7/08 Ａ６１Ｋ 37/14 14/79 37/02 (31)優先権主張番号 ９８２０３７６５．７ (32)優先日 平成10年11月６日(1998．11．6) (33)優先権主張国 欧州特許庁（ＥＰ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，Ｇ Ｈ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ， ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，Ｍ Ｗ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ， ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 ディルク・クラース・フォッケ・メイヤー オランダ、エヌエル−9724アーエヌ・フロ ニンヘン、パルクラーン17番 (72)発明者 ロベルト・ヨハン・ヨーゼフ・ハヘマン オランダ、エヌエル−2742エーヴェー・ワ ッデインクスフェーン、ウェイデゾーム52 番 (72)発明者 イェルン・ヨハネス・マリア・ファン・デ ン・ベルフ オランダ、エヌエル−3971ハーセー・ドリ ーベルヘン、ナサウラーン21番 Ｆターム(参考） 4C084 AA02 BA01 BA08 BA16 BA17 BA18 BA23 BA24 BA26 BA44 MA01 MA02 MA05 MA13 MA17 MA28 MA35 NA05 ZB262 ZB332 ZB352 ZC751 4H045 AA10 AA30 BA12 CA40 EA29 FA16

Claims (22)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 細菌、真菌、ウイルスなどによって引き起こされる感染症、
   炎症および／または腫瘍の治療および／または予防のための医薬であって、活性
   量のポリカチオン性ペプチドまたはタンパク質、および処置すべき組織のｐＨを
   前以て選択した範囲内に保持するための緩衝液を含むことを特徴とする医薬。
2. 【請求項２】 該緩衝液が、処置すべき組織のｐＨを約５〜８.５の範囲に
   保持し、好ましくは処置すべき組織のｐＨを約７〜８の範囲に保持する、請求項
   １に記載の医薬。
3. 【請求項３】 該ポリカチオン性ペプチドまたはタンパク質が、 ヒトラクトフェリン、ウシラクトフェリン、ラクトフェリシン、コンアルブミ
   ン（オボトランスフェリン）、これらタンパク質中に存在するポリカチオン性の
   ペプチド、ラクトフェリンの加水分解物、およびラクトフェリンに由来するカチ
   オンに富むペプチド； 下記配列（１）〜（１５）から選ばれるアミノ酸配列を有するポリペプチド、
   またはカルボキシ末端にアミドを有するその誘導体： （１）Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ； （２）Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ； （３）Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ； （４）Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ｍｅｔ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ； （５）Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ； （６）Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ； （７）Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ； （８）Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ； （９）Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ｍｅｔ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ； （１０）Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｍｅｔ−Ｌｙｓ； （１１）Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ
   −Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ； （１２）Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ
   −Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ； （１３）Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｔｒｐ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ
   −Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ； （１４）Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ａｓｎ
   −Ｍｅｔ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ； （１５）Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ
   −Ｍｅｔ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ； 下記アミノ酸配列（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）の一つを含むペプチド： 【化１】 （式中、Ｃｙｓ^*はジスルフィド結合の生成を防ぐためにチオール基がブロック
   されたシステインを表す）；およびその混合物および薬理学的および食品学的に
   許容しうるその塩； 下記特定のアミノ酸配列（ａ）〜（ｌ）から選ばれるアミノ酸配列の一つから
   なるペプチド、またはカルボキシ末端にアミドを有するその誘導体： （ａ）Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ａｓｎ （ｂ）Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ （ｃ）Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ （ｄ）Ｔｒｐ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ （ｅ）Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ （ｆ）Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｇｌｎ （ｇ）Ｔｒｐ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ （ｈ）Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ （ｉ）Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ａｓｐ （ｊ）Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ （ｋ）Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｇｌｎ （ｌ）Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｇｌｎ、 および抗菌剤を製造するためのラクトフェリン加水分解物、およびその化学的
   誘導体、その際、かかる誘導体によってタンパク質を構成するアミノ酸残基のア
   ミノ基の極性が負の残基へと化学的に修飾されている； マガイニン、セクロピンＡ型またはＢ型、プロテグリン、インドリシジンアナ
   ログ、昆虫から単離可能なポリカチオン、およびヒストンなどのαまたはβデフ
   ェンシンのファミリーに属するポリカチオン； その混合物；および 薬理学的におよび食品学的に許容しうる塩 より本質的になる群から選ばれる、請求項１または２に記載の医薬。
4. 【請求項４】 該ポリカチオン性ペプチドがラクトフェリンである、請求項
   ３に記載の医薬。
5. 【請求項５】 該緩衝液が、炭酸塩、リン酸塩、トロメタミン、およびテト
   ラヒドロキシプロピルエチレンジアミン緩衝液、および／またはその適当な塩、
   とりわけクエン酸塩より本質的になる群から選ばれる、請求項１ないし４のいず
   れかに記載の医薬。
6. 【請求項６】 少なくとも０.５マイクロモル、好ましくは５マイクロモル
   またはそれ以上のポリカチオン性ペプチドまたはタンパク質を含み、緩衝液を少
   なくとも１マイクロモル、好ましくは２マイクロモルまたはそれ以上含む、請求
   項１ないし５のいずれかに記載の医薬。
7. 【請求項７】 該緩衝液を単位投与医薬当たり０.５〜１００ミリ当量のＨ⁺ および好ましくは０.８〜２０ミリ当量のＨ⁺の範囲で含む、請求項１ないし６の
   いずれかに記載の医薬。
8. 【請求項８】 標準の賦形剤、希釈剤および担体のうちの１またはそれ以上
   をさらに含む、請求項１ないし７のいずれかに記載の医薬。
9. 【請求項９】 標準的な抗真菌剤、抗菌剤、および／または抗ウイルス剤、
   好ましくはアゾール化合物、５−フルオロシトシン、ポリエン類、たとえばピマ
   リシン、フンジシジン、およびアムホテリシンＢ、とりわけフルコナゾール、ア
   ムホテリシンＢおよび５−フルオロシトシンよりなる群から選ばれたものをさら
   に含む、請求項１ないし８のいずれかに記載の医薬。
10. 【請求項１０】 抗真菌剤を０.０２５ｍｇ〜５０ｍｇ、好ましくは０.５〜
    ５ｍｇの範囲で含む、請求項９に記載の医薬。
11. 【請求項１１】 細菌、真菌、ウイルスなどによって引き起こされる感染症
    、炎症および／または腫瘍の治療および／または予防のための医薬であって、別
    個に投与しうる細菌、真菌およびウイルス用医薬と組み合わせて相乗的な薬理効
    果が得られるようにポリカチオン性ペプチドまたはタンパク質を前以て決定した
    レベルで含むことを特徴とする医薬。
12. 【請求項１２】 該ポリカチオン性ペプチドまたはタンパク質が請求項３ま
    たは４に記載の群から選ばれたものであり、少なくとも１０ｍｇ／ｍｌ体液、た
    とえば少なくとも２０ｍｇ／ｍｌ体液、好ましくは少なくとも６０ｍｇ／ｍｌ体
    液、および最も好ましくは少なくとも１００ｍｇ／ｍｌ体液の量で含まれる、請
    求項１１に記載の医薬。
13. 【請求項１３】 請求項９に記載の１またはそれ以上の抗真菌剤および／ま
    たは請求項８に記載の１またはそれ以上の賦形剤、希釈剤または担体をさらに含
    む、請求項１２に記載の医薬。
14. 【請求項１４】 該抗真菌剤を少なくとも０.１ｍｇ／ｍｌ、および好まし
    くは少なくとも０.２ｍｇ／ｍｌの量で含む、請求項１３に記載の医薬。
15. 【請求項１５】 下記剤型のうちの１またはそれ以上を有する、請求項１な
    いし１４のいずれかに記載の医薬および／または薬理学的に許容しうるその塩：
    錠剤、スプレー剤、軟膏剤、ゲル剤、液剤。
16. 【請求項１６】 請求項３または４に記載のポリカチオン性ペプチドまたは
    タンパク質、および請求項５に記載の緩衝液を含む組成物。
17. 【請求項１７】 ポリカチオン性ペプチドまたはタンパク質を請求項１０に
    記載の濃度範囲で含む組成物。
18. 【請求項１８】 医薬を調製するための請求項１６または１７に記載の組成
    物の使用。
19. 【請求項１９】 細菌、真菌およびウイルスなどによって引き起こされる感
    染症、炎症および／または腫瘍の治療および／または予防のための請求項１４ま
    たは１５に記載の組成物の使用。
20. 【請求項２０】 カンジダ症を治療するための請求項１９に記載の組成物の
    使用。
21. 【請求項２１】 細菌、真菌およびウイルスなどによって引き起こされる感
    染症、炎症および／または腫瘍、とりわけカンジダ症の治療用医薬を製造するた
    めの請求項１６または１７に記載の組成物の使用。
22. 【請求項２２】 請求項１６または１７に記載の組成物の有効量を患者に投
    与することを含む、細菌、真菌およびウイルスなどによって引き起こされる感染
    症、炎症および／または腫瘍の治療および／または予防方法。