JP2002516671A

JP2002516671A - 生菌チーズの製造法

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Publication number: JP2002516671A
Application number: JP2000551620A
Authority: JP
Inventors: ロス，レイノルズ・ポール; フィッツジェラルド，ジェラルド・フランシス; コリンズ，ジョン・ケビン; オサリバン，ジェラルド・クリストファー; スタントン，キャサリーン・ジェラルディーン
Original assignee: Enterprise Ireland
Current assignee: Enterprise Ireland
Priority date: 1998-05-29
Filing date: 1999-05-26
Publication date: 2002-06-11
Anticipated expiration: 2019-05-26
Also published as: DE69902260T2; JP4203981B2; ATE220857T1; AU4161199A; US6872411B1; WO1999062348A1; EP1082021A1; DE69902260D1; EP1082021B1

Abstract

(57)【要約】生菌チーズ、例えばチェダーチーズを製造するための方法は、非病原性で、酸および胆汁耐性であり、そしてヒト上皮細胞に接着する、ラクトバチルス・パラカゼイ株の０．０５−０．５％接種原を、スターター補助物としてチーズ乳に添加する、ここで前記Ｌ．パラカゼイ株は、熟成期中、１０⁷ ｃｆｕ／ｇまたはそれより以上のレベルに増殖することが可能である、ことを含む。該Ｌ．パラカゼイ株は、比較的低い接種原で添加されても、熟成８か月に渡り、チーズ中で高細胞数（１０⁸ ｃｆｕ／ｇを上回る）に増殖することが見出される。該Ｌ．パラカゼイ株の存在は、チーズ組成、風味および香りに、無視できる影響しか持たないことが見出される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】技術分野本発明は、生菌チーズの製造、および特に、消費時に、生存可能な、活発に増
殖している添加細菌株を含む、生菌チーズの製造に関する。

【０００２】背景技術健康およびよい生活状態を維持するため、生菌含有製品の重要性が、消費者の
選択に影響を及ぼす重要な因子となってきている結果、それらの提唱される健康
特性を利用する商業的関心が増加しているのに加え、こうした製品のための市場
が迅速に成長しそして拡大してきている。すでに市場にある生菌食品の大多数、
例えば発酵乳およびヨーグルトは、新鮮な製品であり、そして一般的に製造後数
日または数週間で消費される。対照的に、固いチーズ、例えばチェダーは、２年
までの長い熟成時間を有する。

【０００３】生菌細菌は、「生きている」微生物と記載され、ある数で摂取されると、固有
の基本栄養以上に、健康上の利益を発揮する。生菌は、食品構成要素または非食
品調製どちらで消費されてもよい。こうした細菌を含む食品は、「機能する食品
」のカテゴリーに属し、そしてこれらは「健康に陽性の影響を有すると主張され
る食品」と記載される。こうした製品は、先進世界中により広い人気を得て、そ
して認められてきており、そして既に日本および米国でよく認められている。さ
らに、生菌の提唱される健康特性を利用する商業的関心が増加していることは、
市場のこの部門の迅速な成長および拡大に、重要な点で、寄与してきている。

【０００４】生菌生物、例えばラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）およびビフ
ィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ｓｐｐ．を取り込む乳製
品の潜在的な健康促進効果は、近年の主な研究努力を刺激してきている。今日ま
で、これらの培養の最も一般的な食品搬送系は、新鮮な発酵乳製品、例えばヨー
グルトおよび発酵乳と共に、培養を添加した非発酵乳であった。

【０００５】現在、市場に少数の「生菌チーズ」があるものの、生菌生物のキャリアーとし
てのチーズに関する報告は比較的少ない。

【０００６】１９９４年、ＤｉｎａｋａｒおよびＭｉｓｔｒｙ（Ｊ．ＤａｉｒｙＳｃｉ
．７７：２８５４−２８６４）は、ビフィズス菌（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒ
ｉｕｍｂｉｆｉｄｕｍ）を、スターター補助物（ａｄｊｕｎｃｔ）として、チ
ェダーチーズに取り込んだ。本株は、チーズ中でよく生存し、そして熟成６か月
であっても、チーズの風味（ｆｌａｖｏｕｒ）、きめ（ｔｅｘｔｕｒｅ）または
外見に不都合な影響を与えず、およそ２ｘ１０⁷ ｃｆｕ／ｇの生存能力を
維持した。この例により、チェダーが、長い期間に渡り、高レベルで生菌生物を
維持するのに適した環境を提供することが可能であることが示唆される。しかし
、熟成期間中、チーズ中でビフィズス菌の増殖は観察されず、そしてしたがって
、ビフィドバクテリウム株は、製造および／または熟成中、増殖せず、そしてし
たがって、比較的高い接種原で、添加しなければならないことを強調することが
重要である。別の研究では、ビフィドバクテリウムを、Ｌｂ．アシドフィルス（
ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）株Ｋｉと組み合わせ、ゴーダチーズ製造のスターター
として用いた（Ｇｏｍｅｓ，Ａ．Ｍ．Ｐ．ら（１９９５）；Ｎｅｔｈ．Ｍｉ
ｌｋＤａｉｒｙＪ．４９：７１−９５）。２つの株を単独のスターターと
して用いると、両株とも、比較的大量の接種原（３％）を要し、そしてチーズ製
造技術を適応させる必要があった。この場合、おそらくビフィドバクテリウムに
よる酢酸産生のため、熟成９週間後、生じた製品のチーズの風味に重大な影響が
あった。

【０００７】生菌効果を発揮するため、培養は消費時まで、食品製品中で生存能力を維持し
なければならない。これは、チェダーチーズでは、製造後何か月も後である。

【０００８】チーズは、乳漿タンパク質／カゼイン比が、牛乳のものを上回らず、そしてレ
ンネットの作用により牛乳を凝集させた後、乳漿排出により得られる、乳製品で
ある。乳酸菌を含むスターター培養が、チーズ作成中、ラクトースを代謝するの
に、まず必要とされ、それにより酢酸が生じ、そしてｐＨが減少する。例えば、
チェダーチーズ製造中、スターターラクトコッカス（ｌａｃｔｏｃｏｃｃｉ）が
増殖し、塩処理時には、およそ１０⁹ないし１０¹⁰ ｃｆｕ／ｇの最大レベルに
達する。しかし、チーズ中の条件、例えば水分中の高い塩（Ｓ／Ｍ）、低いｐＨ
、発酵可能炭水化物の欠如および熟成の低温は、熟成の早い週のうちに、スター
ター数を劇的に減少させる結果につながる可能性がある。減少の速度は、株のい
くつかの特性に依存し、これには、自己溶解特性、塩耐性およびファージ抵抗性
が含まれる。同時に、非スターター乳酸菌（ＮＳＬＡＢ）と称される、主にラク
トバチルス（Ｌｂ．プランタルム（ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、カゼイ（ｃａｓｅ
ｉ）およびブレビス（ｂｒｅｖｉｓ））およびペジオコッカス（ペジオコッカス
・ペントサケウス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓｐｅｎｔｏｓａｃｅｕｓ））から
なる非病原性生物集団が、一般的に２−１６℃で行われる過程である、チーズ熟
成につれ、増殖する。ＮＳＬＡＢは、製造段階中、チーズ乳に入り込むかまたは
、減弱状態で低温殺菌を生き抜くと考えられる。にもかかわらず、その数は迅速
に増加し、熟成チェダーチーズ中で１０⁷ないし１０⁸ ｃｆｕ／ｇの最大レベル
に達する。実際、熟成チーズにおいて、ＮＳＬＡＢは、主な菌叢として存在する
可能性がある。チーズの品質を決定する際のその役割は不明なままである。ＮＳ
ＬＡＢは、一般的に、Ｒｏｇｏｓａまたはラクトバチルス選択（ＬＢＳ）寒天上
での好気性プレート計数を用い、数えられる。

【０００９】消費時に生菌製品に最終的に必要とされるものに対応する量で、チーズに生菌
株を添加するのは、費用効率が高くない可能性がある。むしろ、必要とされるの
は、スターター補助物として、低い接種原でチーズに添加することが可能であり
、そしておよそ＞１０⁷ ｃｆｕ／ｇの必要とされる値に増殖する、生菌株であ
る。

【００１０】したがって、チェダーなどの長い熟成時間を持つ生菌チーズに必要とされるの
は、製造および熟成期間中、生存しそして増殖することが可能な生菌株である。

【００１１】発明の開示本発明は、生菌チーズを製造するための方法であって、非病原性で、酸および
胆汁耐性であり、そしてヒト上皮細胞に接着する、ラクトバチルス・パラカゼイ
株の０．０５−０．５％接種原を、スターター補助物としてチーズ乳に添加する
、ここで前記Ｌ．パラカゼイ株は、熟成期中、１０⁷ ｃｆｕ／ｇまたはそれ以
上のレベルに増殖することが可能である、ことを含む前記方法を提供する。

【００１２】我々は、前記のＬ．パラカゼイ株が、チーズ製造過程を生き抜く能力および熟
成／貯蔵期間中、増殖しそして生き抜く能力を有することを発見した。本発明の
方法に用いられるＬ．パラカゼイ株はまた、以下に示されるように、胃腸管通過
を生き抜く能力も有する。添加されたＬ．パラカゼイ株の存在は、チーズ組成、
風味および香りに対し無視できる影響しか持たないことが見出されてきている。

【００１３】好ましくは、チーズ乳に、Ｌ．パラカゼイの０．１−０．２５％接種原を添加
する。やはり好ましくは、熟成期は少なくとも６か月である。さらに好ましくは、熟成期は８か月またはそれ以上である。

【００１４】本発明の方法に用いられるＬ．パラカゼイ株は、本明細書に記載されるように
、低接種原で添加された際、チーズ中で、熟成８か月に渡り、高い細胞数に増殖
することが見出されてきている。

【００１５】したがって、本発明の１つの態様において、Ｌ．パラカゼイは、熟成期中、１
０⁸ ｃｆｕ／ｇまたはそれ以上のレベルに増殖することが可能である。

【００１６】好ましくは、Ｌ．パラカゼイは、３７℃またはそれ以上の温度に耐性である。やはり好ましくは、Ｌ．パラカゼイは、数えることが可能であり、そして常住
菌叢から区別することが可能である。

【００１７】より好ましくは、添加Ｌ．パラカゼイ細胞を、各株に関し、はっきり区別され
るＤＮＡフィンガープリントを生成することを可能にする無作為増幅多型ＤＮＡ
（ＲＡＰＤ）法により、数えそして区別する。

【００１８】用いられるＲＡＰＤは、チーズの天然菌叢により生じるものから、明らかに区
別することが可能な、各株に関する、はっきり区別されるＤＮＡフィンガープリ
ントの生成を可能にする。

【００１９】好ましくは、製造されるチーズは固いチーズである。特に好ましい態様において、チーズはチェダーチーズである。

【００２０】チェダーチーズは、本明細書に記載されるように、生菌微生物のキャリアーと
して、特に利点を有する。チェダーチーズは、より伝統的な生菌食品（例えばヨ
ーグルトおよび発酵乳）よりも高いｐＨを有し、長期の生存を維持する、より安
定した環境を提供する。さらに、該チーズのマトリックスおよびその比較的高い
脂肪含有量は、胃腸管（ＧＩＴ）通過中、生菌細菌に対する保護を提供する。

【００２１】本発明と一致して用いられるＬ．パラカゼイ株は、実施例に記載されるような
、研究目的のためのいくつかの他の株と共に、制限される材料移送合意（Ｍａｔ
ｅｒｉａｌｓＴｒａｎｓｆｅｒＡｇｒｅｅｍｅｎｔ）下に、Ｕｎｉｖｅｒｓ
ｉｔｙＣｏｌｌｅｇｅＣｏｒｋから得た。

【００２２】Ｌ．パラカゼイ株は、チーズ製造で使用するのに必要とされる特性を有するこ
とが見出されたが、例えば、調べたラクトバチルス・サリバリウス（ｓａｌｉｖ
ａｒｉｕｓ）株は、熟成期間中に死んだ。

【００２３】本明細書において用いるＬ．パラカゼイ株は、チーズおよびＧＩＴ両方の微小
菌叢に影響を与えるのに必要な能力、乳製品に基づく培地、例えば乳漿およびフ
ァージ阻害性培地中で増殖する培養能力、並びにチーズ製品の製造中および貯蔵
寿命中、生存しおよび／または増殖する培養能力を有する。

【００２４】本発明はまた、ラクトバチルス・パラカゼイ株ＮＦＢＣ３３８あるいはその
突然変異体または変異体（ｖａｒｉａｎｔ）も提供する。

【００２５】また、本発明は、ラクトバチルス・パラカゼイ株ＮＦＢＣ３６４あるいはそ
の突然変異体または変異体も提供する。

【００２６】これらの細菌の試料は、１９９８年５月２９日、ＴｈｅＮａｔｉｏｎａｌ
ＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓｏｆＩｎｄｕｓｔｒｉａｌａｎｄＭａｒｉｎｅ
ＢａｃｔｅｒｉａＬｉｍｉｔｅｄ（ＮＣＩＭＢ）に寄託されており、そして
それぞれ寄託番号ＮＣＩＭＢ４０９５４およびＮＣＩＭＢ４０９５５を与え
られている。

【００２７】本発明のさらなる態様において、先に定義されるような、生存可能な、活発に
増殖しているＬ．パラカゼイ株を、前記Ｌ．パラカゼイをスターター補助物とし
て使用し、製造した後、１０⁷ ｃｆｕ／ｇまたはそれ以上の量、含む、消費準
備の整った生菌チーズが提供される。特に好ましいチーズは、チェダーチーズである。

【００２８】生菌チェダーチーズは、本発明に一致し、高レベルのＬ．パラカゼイ株（１０ ⁸ ｃｆｕ／ｇチーズ）を、製造者に比較的低い費用で、そして同一の製造法を
用い、製造することが可能である。重要なことに、我々は、これらの株の取り込
みは、香り、風味およびきめを含む、チーズの品質に対し、陰性の影響を与えな
いことを示してきている。さらに、我々の結果により、チーズはまた、製品の明
らかな年齢相違にも関わらず、ＧＩＴに対する生存細胞の搬送に関し、ヨーグル
トに比べ好ましいことも示唆される。

【００２９】

【実施例】

本発明は以下の実施例により、さらに例示されるであろう：

【００３０】実施例１生菌株同定／計数添加生菌株をうまく計数するための必要条件は、食品製品に見られる、天然の
、しばしば複雑な微小菌叢からこれらを選択的に同定することが可能なことであ
る。ＮＳＬＡＢは、熟成中、チーズ中で１０⁷−１０⁸ ｃｆｕ／ｇまでのレベル
に達する可能性があるため、これらのＮＳＬＡＢからスターター補助物として添
加するラクトバチルスを選択的に計数することを目的とするいくつかの方法を評
価する必要があった。

【００３１】本実施例に用いられる生菌ラクトバチルス株は、ヒト胃腸管から以前単離され
ており、そしてアイルランド、ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＣｏｌｌｅｇｅＣｏｒ
ｋ、微生物学部のＪ．Ｋ．Ｃｏｌｌｉｎｓ教授から、前述の材料移送合意下に
得た。これらの株は、総細胞タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析により、Ｌ．サ
リバリウス（ｓｓｐ．サリバリウス）およびＬ．パラカゼイ（ｓｓｐ．パラカゼ
イ）と同定され（Ｒｅｕｔｅｒ，Ｇ．（１９９０）Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒ
ｉａｍｉｃｒｏｆｌｏｒａ９：１０７−１１８）、そしてＬｂ．サリバリウ
スＮＦＢＣ３１０、ＮＦＢＣ３２１およびＮＦＢＣ３４８並びにＬ．パラ
カゼイＮＦＢＣ３３８およびＮＦＢＣ３６４と命名された。８週齢の商業的
なチェダーチーズから以前得た、ＮＳＬＡＢラクトバチルス株（Ｌｂ．クルバト
ゥス（ｃｕｒｖａｔｕｓ）ＤＰＣ２０４２および２０８１、Ｌ．プランタルム
ＤＰＣ２１０２および２１４２並びにＬ．カゼイｓｓｐ．カゼイＤＰＣ２０
４７および２１０３）は、乳製品研究センターの培養コレクションから得た。す
べてのラクトバチルス株は、日常的に、嫌気性条件下（‘Ａｎａｅｒｏｃｕｌｔ
Ａ’ガスパック；Ｍｅｒｃｋ、ドイツ・ダルムシュタットを備えた嫌気性ビン
）で、ＭＲＳブロス（Ｄｉｎａｋａｒ，Ｐ．およびＶ．Ｖ．Ｍｉｓｔｒｙ（
１９９４））（ＤｉｆｃｏＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、米国ミシガン州デトロ
イト）中で、ＮＳＬＡＢおよび生菌株それぞれに対し、３０℃および３７℃で培
養した。固形培地は、ブロス培地に１．５％寒天を添加することにより調製した
。ストック培養は、４０％グリセロール補足ＭＲＳブロス中で、−８０℃で維持
した。各培養は、ストックから使用する前にＭＲＳブロス中で、２回継代培養し
た。Ｃｈｒ．Ｈａｎｓｅｎ’ｓＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（アイルランド・
コーク・リトルアイランド）から、凍結乾燥ペレットの形で得た、ラクトコッカ
ス・ラクティス（ｌａｃｔｉｓ）ｓｓｐ．クレモリス（ｃｒｅｍｏｒｉｓ）株２
２７および２２３を、チーズ製造のためのスターターとして用いた。これらは、
熱処理（９０℃で３０分）１０％（ｗ／ｖ）還元脱脂粉乳（ＲＳＭ）中で２１℃
で一晩増殖させた。

【００３２】チーズの細菌学的解析接種チーズ乳および熟成中のチーズにおけるラクトバチルス（生菌補助物およ
びＮＳＬＡＢ両方）の生存能力を、３０℃での嫌気性インキュベーション５日後
、ＬＢＳ寒天上で測定する一方、スターターラクトコッカスを、３０℃でのイン
キュベーション３日後、ＬＭ１７寒天上で計数した。チーズ乳およびチーズ中の
腸内細菌（ｃｏｌｉｆｏｒｍ）は、バイオレット・レッド胆汁寒天（ＶＲＢＡ；
Ｏｘｏｉｄ）上で、３７℃で２４時間計数した。チーズは、熟成中、間隔を置い
て、細菌学的解析のため、二つ組で無菌的に試料を採取した。チーズ試料を無菌
２％（ｗ／ｖ）クエン酸三ナトリウム中で乳化し、最大回復（ｒｅｃｏｖｅｒｙ
）希釈に希釈し、そして適切な希釈を蒔いた。１、３および６か月後間隔で、各
チーズ由来の２０の個々のラクトバチルスコロニーをＲＡＰＤ−ＰＣＲ解析のた
め、ＬＢＳ寒天プレートから無作為に選択した。

【００３３】ａ）ラクトバチルス補助物の胆汁および温度耐性生菌およびＮＳＬＡＢラクトバチルス単離体両方の胆汁に対する耐性を調べる
ため、各ラクトバチルス株のＭＲＳブロス一晩培養を、最大回復希釈に連続希釈
し（ＯｘｏｉｄＬｔｄ．、英国ハンプシャー・ベイシングストーク）、そして
適切な希釈を０、０．１、０．３、０．５、１．０または３．０％ブタ胆汁（Ｓ
ｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ．、英国ドーセット・プール）と共にＭＲＳ
寒天上に蒔いた。インキュベーション３日後、プレートを調べ、そしてコロニー
が存在する場所、その数および大きさを記録した。生菌ラクトバチルスの温度耐
性を、適切な希釈の一晩培養をＬＢＳ寒天（ＢｅｃｈｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏ
ｎ、米国メリーランド州コッキースビル）上に蒔き（Ｒｏｇｏｓａ，Ｍ．ら（
１９５１）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ６２：１３２−１３３）、そしてプレー
トを嫌気的にどちらも３７℃（これらの株の増殖の最適温度）および４２℃でイ
ンキュベーションすることにより、調べた。５日後に得られたコロニー数を比較
した。同じ方法で、チェダーチーズから単離した後の、これらの株およびＮＳＬ
ＡＢの温度耐性もまた、調べた。

【００３４】ヒト由来ラクトバチルスおよび選択したＮＳＬＡＢ両方の胆汁および温度耐性
は、まず、これらのパラメーターのどちらかが製品から補助物を選択するための
基本を成すことが可能であることを期待し、測定した。生菌補助物およびＮＳＬ
ＡＢラクトバチルス株両方は、その胆汁耐性に関し、かなり異なった。０．３％
胆汁で阻害される、スターター補助物として添加されたラクトバチルスに比べ、
本実施例に用いた２つのＮＳＬＡＢ単離体は、３％までのレベルでブタ胆汁に耐
性であった。したがって、胆汁耐性に基づく選択は、本実施例において、チェダ
ーチーズに取り込まれた生菌補助物ラクトバチルスを、ＮＳＬＡＢラクトバチル
スから区別するのに有用ではないであろう。同様に、温度耐性は、ＮＳＬＡＢか
らの生菌ラクトバチルスの選択の基本として用いることは不可能であった。アイ
リッシュチェダーチーズから単離されるＮＳＬＡＢは、４５℃で増殖しないが、
いくつかのヒト由来生菌ラクトバチルスは、こうした温度に抵抗することが可能
である（Ｋａｎｄｌｅｒ，Ｏ．およびＷｅｉｓｓ，Ｎ．（１９８９）Ｐ．Ｈ
．Ａ．Ｓｎｅａｔｈ（監修），Ｂｅｒｇｅｙ’ｓｍａｎｕａｌｏｆｄｅ
ｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，中，Ｖｏｌ．２．Ｔ
ｈｅＷｉｌｌｉａｍｓ＆ＷｉｌｋｉｎｓＣｏ．、メリーランド州バルテ
ィモア）。４２℃の温度を、ＮＳＬＡＢからの生菌株の選択的計数に関し評価し
た。新鮮な培養または熟成初期のチェダーチーズから単離した生菌ラクトバチル
ス株は、４２℃で増殖することが可能であったが、熟成チーズから単離した場合
、この温度で増殖することができなかった。さらに、いくつかのＮＳＬＡＢラク
トバチルスは、４２℃で増殖することが可能であることが見出され、この方法が
、チェダーチーズからのヒト由来生菌ラクトバチルス株に関し、非選択性である
ことが確認された。

【００３５】ｂ）ＲＡＰＤ−ＰＣＲ解析各生菌ラクトバチルス株に対し、そしてチェダーチーズから単離されたラクト
バチルスコロニーから増殖させた培養に対し、ＲＡＰＤ−ＰＣＲ解析を行った。
ＨｏｆｆｍａｎおよびＷｉｎｓｔｏｎの方法（Ｈｏｆｆｍａｎ，Ｃ．Ｓ．およ
びＷｉｎｓｔｏｎ，Ｆ．（１９９７）Ｇｅｎｅ５７：２６７−２７２）の修
飾法を用い、１．５ｍｌのＭＲＳブロス一晩培養から、ゲノムＤＮＡを単離し
た。本方法は、細胞を溶解するため、ガラスビーズでの剪断（ｓｈｅａｒｉｎｇ
）を利用し、そしてＣｏａｋｌｅｙら（Ｃｏａｋｌｅｙ，Ｍ．ら（１９９６）
；Ｊ．Ｉｎｓｔ．Ｂｒｅｗ．１０２：３４４−３５４）に略述されるよう
に修飾した。続くＰＣＲ増幅で、抽出ＤＮＡ１マイクロリットルを用い、該増幅
は、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ（米国コネチカット州ノーウォーク）ＤＮＡ熱サ
イクル装置中で２５μｌの総体積で行った。使用した方法は、本質的にＣｏａｋ
ｌｅｙら（（１９９６）上記）に記載される通りであり、そしてＰｈａｒｍａｃ
ｉａＢｉｏｔｅｃｈ（スウェーデン・ウプサラ）から得た、任意のヌクレオチ
ド配列（５’ＡＴＧＴＡＡＣＧＣＣ３’）の単一のプライマーを用いた。以下の
温度プロフィールを用い、ＤＮＡを３５サイクル増幅した：９３℃で１分間変性
、３６度で１分間アニーリングした後、７２℃で１分間重合。最初の変性段階中
、反応混合物にＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（０．６２５単位、Ｂｉｏｌｉｎｅ
）を添加した（ホットスタート）。５および１０μｌの間のＰＣＲ反応物を、１
．５％（ｗ／ｖ）アガロース（Ｓｉｇｍａ）ゲル上で、エチジウムブロミド染色
と共に解析した。分子量標準として１００ｂｐラダー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）
を用いた。ゲルをおよそ３時間、１００Ｖで泳動し、そして紫外線透照（ＵＶ
ｔｒａｎｓｉｌｌｕｍｉｎａｔｉｏｎ）により、ＤＮＡを視覚化した。

【００３６】その結果、任意のプライマーを用いたＰＣＲを伴う、無作為増幅多型ＤＮＡ（
ＲＡＰＤ）法を用い、各生菌株に関し、ＤＮＡフィンガープリントを生成した。
各ラクトバチルス株は、再現可能な、はっきり区別されるＤＮＡフィンガープリ
ントを生じ、これらは、それぞれのＮＳＬＡＢラクトバチルスのものとは実質的
に異なることが見出された。したがって、ＲＡＰＤ法は、生菌株をうまく同定す
る手段であることが証明され、そしてチェダーチーズ中のＮＳＬＡＢ菌叢から株
を選択的に同定する手段である可能性があることが立証された。

【００３７】実施例２チェダーチーズへのラクトバチルス種の取り込み各チーズおけ中で、まず２５Ｌの低温殺菌全乳を用い、実験室規模のチーズ
製造試験（試験１および２）を行った。野生のラクトバチルスの混入を制限する
ため、これらのチーズは、ＭｃＳｗｅｅｎｅｙ，Ｐ．ら（（１９９４）；Ｉｒ
ｉｓｈＪ．Ａｇｒｉｃ．ＦｏｏｄＲｅｓ．３３：１８３−１９２）に
より記載されるように、調節された細菌学的条件下で製造した。１．５％接種原
の混合株スターター培養を用い、そして各試験において、１つのおけ（おけ１）
は、スターターのみが添加されたコントロールとして作用した。各試験おけに、
１０％ＲＳＭ中で一晩増殖させた１つの生菌ラクトバチルス株を、スターター
培養に対する補助物として添加した。試験１では、生菌補助物Ｌ．サリバリウス
ＮＦＢＣ３４８およびＬ．パラカゼイＮＦＢＣ３６４を、接種原レベル０．
１％で、それぞれおけ２およびおけ３に添加した。第二の試験では、Ｌ．サリバ
リウスＮＦＢＣ３１０（おけ２）、Ｌ．サリバリウスＮＦＢＣ３２１（おけ
３）およびＬ．パラカゼイＮＦＢＣ３３８（おけ４）に、０．２％のレベルで
接種した。その後、以下のように、標準的方法にしたがい、チェダーチーズを製
造した：スターターおよび補助物添加３５分後、０．０７ｍｌ／リットルの濃
度で、フィルター滅菌レンネット（Ｃｈｒ．Ｈａｎｓｅｎ’ｓＬａｂｏｒａ
ｔｏｒｉｅｓ）を添加し、そしておよそ４０分後に凝乳（ｃｕｒｄ）を取った。
凝乳を３９℃に加熱し、ｐＨ６．１に調節し、そしておよそｐＨ５．３で粉
砕した。２．８％（ｗ／ｗ）の率で塩を添加し、そして凝乳を鋳型に入れ、そし
ておよそ２００ｋＰａで一晩加圧した。チーズを鋳型からはずし、真空パック
し、そして８℃でおよそ８．５か月間熟成させた。続いて、実験室規模のチーズ
中で、熟成中、高い生存能力を維持することが見出された、２つの補助ラクトバ
チルス株を用い、２つのパイロット規模のチーズ製造試験（試験３および４）を
行った。各試験において、各々、標準化（脂肪：タンパク質＝１）低温殺菌全乳
４５０リットルを含む、１つの実験および１つのコントロールの、２つのおけを
用いた。実験室規模試験と同様、１．５％接種原のスターター２２３および２２
７を各おけに添加した。さらに、各試験において、実験おけ（おけ２）は、スタ
ーター補助物として添加された、Ｌ．パラカゼイＮＦＢＣ３６４（試験３）ま
たはＮＦＢＣ３３８（試験４）のどちらかの０．１％接種原を含んだ。チーズ
製造法は、塩レベルが２．７％であり、そして凝乳をおよそ４１３ｋＰａで一
晩加圧した以外は、実験室規模のチーズに関し、先に記載した通りであった。

【００３８】まず、実験室規模のチーズ試験を、微生物学的に調節された（したがって熟成
中の多数のＮＳＬＡＢの成長を制限する）条件下で行い、チェダーチーズ中の５
つの生菌ラクトバチルス株の反応を評価した。まず、接種目的のため、ＲＳＭに
おけるこれらの株の反応を調べた。どの株も牛乳中でよく反応せず（わずか１０ ⁷ −１０⁸ ｃｆｕ／ｍｌのレベルしか達成されず）、そして続いて非タンパク分
解性であるか、または弱くしかタンパク質分解性でなかった（データは示されて
いない）。したがって、スターター補助物としてこれらのＬ．サリバリウスおよ
びパラカゼイ株の０．１−０．２％接種原を用いると、表１に示されるように、
チーズ製造中、実験おけ中で、比較的低レベルの１０⁴−１０⁵ ｃｆｕ／ｍｌ牛
乳が得られた。すべての補助物ラクトバチルスは、これらのチーズ製造過程を生
き抜くことが見出され、そして牛乳中の増殖が劣っており、そして低い接種原を
用いたとすると、該過程中の酸産生にはいかなる影響も持たないことが示された
（データは示されていない）。結果により、ＮＦＢＣ３６４およびＮＦＢＣ
３３８Ｌ．パラカゼイ補助物（それぞれ試験１のおけ３、試験２のおけ４）で
製造されたチーズは、熟成８か月後、これらの生菌株を高レベルで含むことが示
された：それぞれ図１Ａおよび２Ａに示されるように、最終計数９．２ｘ１
０⁷および１．４ｘ１０⁸ ｃｆｕ／ｇが達成された。

【００３９】表１補助物および／またはスターター培養での接種後の、チェダーチーズ製造に用い
た牛乳中の細菌計数（ｃｆｕ／ｍｌ）

【表１】 ¹２２７／２２３＝Ｌ．ラクティスｓｓｐ．クレモリス２２７＋２２３² ＮＤ＝検出不可能³ 試験１および２のチーズは、微生物学的に調節された条件下で、実験室規模で
製造した。⁴ 試験３および４のチーズは、実験室規模のチーズで熟成中、優れた生存を示し
た、２つのラクトバチルス補助物株（ＮＦＢＣ３３８およびＮＦＢＣ３６４
）を用い、パイロット規模で製造した。

【００４０】図１Ｂ−１Ｄは、各チーズ由来の、それぞれの数のラクトバチルス単離体のＲ
ＡＰＤＰＣＲプロフィールである（Ｂ、ＣおよびＤ）；レーン１は製造時、チ
ーズに添加された生菌ラクトバチルス株のＲＡＰＤプロフィールを示す一方、レ
ーン１９（Ｂ）およびレーン１１（ＣおよびＤ）で１００ｂｐラダーが示され
、そしてすべての他のレーン（Ｂ、ＣおよびＤ）は、６か月熟成チーズ由来のラ
クトバチルス単離体のＲＡＰＤプロフィールを示す。

【００４１】図２Ｂ−２Ｄは、各チーズ由来の、それぞれの数のラクトバチルス単離体のＲ
ＡＰＤＰＣＲプロフィールである（Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥ）；レーン１は製造時
、チーズに添加された生菌ラクトバチルス株のＲＡＰＤプロフィールを示す一方
、レーン１１（Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥ）で１００ｂｐラダーが示され、そしてす
べての他のレーン（Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥ）は、６か月熟成チーズ由来のラクトバ
チルス単離体のＲＡＰＤプロフィールを示す。

【００４２】Ｌ．パラカゼイ株ＮＦＢＣ３６４およびＮＦＢＣ３３８に関し生成された
ＲＡＰＤＰＣＲフィンガープリント（図１Ｄおよび図２Ｅ、レーン１）並びに
チーズから単離されたラクトバチルスに関し得られたもの（図１Ｄおよび図２Ｅ
、レーン２−１０および１２−２０）を比較し、同一であることが見出され、高
レベルの生菌株が確認された。対照的に、株ＮＦＢＣ３１０が添加されたチー
ズ（試験２のおけ２）中で、ラクトバチルスは高レベルに増殖し（１ｘ１０ ⁸ ｃｆｕ／ｇ）、そして続いて熟成中このレベルを維持しつづけた（図２Ａ）
が、これらのラクトバチルス（図２Ｃ、レーン２−１０および１２−２０）は、
ＲＡＰＤＰＣＲにより、ＮＳＬＡＢと同定された。Ｌ．サリバリウス補助物Ｎ
ＦＢＣ３４８およびＮＦＢＣ３２１（それぞれ、試験１のおけ２および試験
２のおけ３）を含むチーズ中のラクトバチルスのレベルは、熟成４か月後、それ
ぞれ１．２ｘ１０⁵ ｃｆｕ／ｇおよび８．６ｘ１０⁴ ｃｆｕ／ｇに減
少した（図１Ａおよび２Ａ）が、これらのレベルは、わずかに増加し、熟成８か
月後、それぞれ３．５ｘ１０⁵ ｃｆｕ／ｇおよび１．１ｘ１０⁶ ｃｆ
ｕ／ｇの最終レベルに達した。興味深いことに、これらの各チーズから６か月後
に採取した単離体の遺伝子フィンガープリントにより、これらのラクトバチルス
が主にＮＳＬＡＢであることが明らかになった（それぞれ、図１Ｃおよび図２Ｄ
）。したがって、本実施例に用いられたＬ．サリバリウス株は、熟成中、チェダ
ーチーズにおいて、生存能力を維持しなかった。さらに、補助物株が減少してい
るこれらのチーズから単離されたＮＳＬＡＢの多く（図１Ｃ、レーン３−６およ
び図３Ｄ、レーン１２−１８）および生菌補助物がまったく添加されなかったコ
ントロールチーズから単離されたＮＳＬＡＢの多く（図１Ｂ、レーン９−１３お
よび図２Ｂ、レーン３−９）は、同一のＰＣＲ生成ＤＮＡフィンガープリントを
生じた。これは、ＤＮＡが同一の株から得られたことを示唆し、そしてこれらの
チーズのＮＳＬＡＢ集団において、特定のラクトバチルス株が主であることを示
す。

【００４３】続いて、パイロット規模チーズ試験を行い、実験室規模試験で高レベルに生存
した２つのＬ．パラカゼイ株、ＮＦＢＣ３３８およびＮＦＢＣ３６４のみを
チェダーチーズに取り込んだ。これらの株は、表１に示されるように、それぞれ
１．７および８．９ｘ１０⁵ ｃｆｕ／ｍｌチーズ乳の接種原で試験３のお
け２（ＮＦＢＣ３３８）および試験４のおけ２（ＮＦＢＣ３６４）に添加し
た。その後、ＮＦＢＣ３３８およびＮＦＢＣ３６４は両方とも、チーズ中で
、それぞれ１．１ｘ１０⁷および２．７ｘ１０⁷ ｃｆｕ／ｇの最初の数
から、熟成３か月後に１．５および２．９ｘ１０⁸ ｃｆｕ／ｇの間のレベ
ルに達し、そして生存能力は、熟成期間の残りに関し、このレベルで維持された
（図３Ａおよび４Ａ）。実験室規模チーズにおけるように、これらの結果は、こ
れらの各チーズ由来のいくつかの単離体（図３Ｂおよび４Ｂ）のＲＡＰＤＰＣ
Ｒ解析（実施例１に記載されるようなもの）により確認した。

【００４４】まとめると、実験室およびパイロット規模のチーズ試験からのデータは、生菌
としての潜在能力に関し選択された株のチェダーチーズ中の持続性に関する、分
子に基づく証拠を提供する。「生菌」食品の有益な影響を正当に評価するため、
上に示されるように、生存生菌生物が、製品１グラムまたは１ミリリットル当た
り、少なくとも１０⁷生存細胞のレベルで存在するべきであることが提唱されて
きている。本発明に一致して得られる生菌含有チーズは、１０⁸ ｃｆｕ／ｇチ
ーズまでのレベルを含み、したがって、「生菌」食品製品に関する規準を満たす
。

【００４５】また、すべての試験のコントロールチーズにおけるラクトコッカススターター
数が、熟成期間中、特有の減少を示したことにも注目しなければならない（図１
Ａ、２Ａ、３Ａおよび４Ａ）。しかし、これらのスターター生物を計数するのに
用いられたＬＭ１７培地上のラクトバチルスの増殖のため、補助物ラクトバチル
スが添加されていないチーズ中のスターターのみを、そしてまた熟成初期段階で
のみ、モニターすることが可能であった。

【００４６】ＲＡＰＤＰＣＲ解析は、同定法として用いた場合、生菌Ｌ．パラカゼイ株が
増殖し、そしてチーズ中で高い生存率（１０⁸ ｃｆｕ／ｇ）を維持する一方、
使用された特定のＬ．サリバリウス補助物株は、こうした適用に適していないよ
うであることを決定することが可能であった。さらに、これらの生菌ラクトバチ
ルス株のチェダーチーズ中での多数の生存は、チーズおけ中の比較的低い接種原
（０．１−０．２％）を用い、そしていかなる点でもチーズ製造過程を改変する
ことなく達成された。これが可能であったのは、これらの株がスターター補助物
として添加されたためであり、そしてしたがってこれらの株はチーズ製造中の酸
産生に必要ではないためであった。したがって、生菌生物をチェダーチーズに取
り込むための本発明の方法は、産業に特定の利益を提供し；現存のチーズ製造技
術の改変は必要とされず、そして低接種原のため、低い費用を必要とするのみで
ある。

【００４７】実施例３チーズ組成解析おろしたチーズ試料を、塩に関し、電位差測定法（ＩｒｉｓｈＤａｉｒｙ
Ｆｅｄｅｒａｔｉｏｎ（１９７９）；Ｃｈｅｅｓｅａｎｄｐｒｏｃｅｓｓｅ
ｄｃｈｅｅｓｅ．Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｃｈｌｏｒｉｄｅ
ｃｏｎｔｅｎｔ：ｐｏｔｅｎｔｉｏｍｅｔｒｉｃｔｉｔｒａｔｉｏｎｍｅｔ
ｈｏｄ．ＩＤＦＳｔａｎｄａｒｄ８８）により、脂肪に関し、Ｇｅｒｂｅ
ｒ法（ＩｒｉｓｈＳｔａｎｄａｒｄ（１９５５）；Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏ
ｎｏｆｔｈｅｐｅｒｃｅｎｔａｇｅｆａｔｉｎｃｈｅｅｓｅ．Ｉ
ｒｉｓｈＳｔａｎｄａｒｄ．６９）により、水分に関し、１０２℃でのオー
ブン乾燥（ＩｒｉｓｈＤａｉｒｙＦｅｄｅｒａｔｉｏｎ（１９８２）；Ｄｅ
ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｔｏｔａｌｓｏｌｉｄｓｃｏｎｔ
ｅｎｔ（ｃｈｅｅｓｅａｎｄｐｒｏｃｅｓｓｅｄｃｈｅｅｓｅ）ＩＤＦ
Ｓｔａｎｄａｒｄ４Ａ）により、そしてタンパク質に関し、ＬＥＣＯＦＰ
−４２８窒素測定装置上で、二重で解析した。２０ｇのおろしたチーズと１２
ｍｌのＨ₂Ｏを混合することにより調製したスラリーのｐＨを、標準的なｐＨ
メーター（Ｒａｄｉｏｍｅｔｅｒ、デンマーク・コペンハーゲン）を用いて測定
した。

【００４８】チーズの組成は、表２に示されるように、チェダーに典型的な範囲内であるこ
とが見出された。

【００４９】表２コントロールおよび生菌チェダーチーズの組成¹

【表２】 ¹二重解析の平均² 水分中の塩

【００５０】試験１のチーズに関し、水分中の塩（おけ３）、脂肪（すべてのおけ）および
ｐＨ（おけ１）に関するいくつかの変則的な値が得られたが、これは実験室規模
で、チーズ製造パラメーター（すなわち温度）を調節することが困難であること
を反映する。対照的に、パイロット規模試験に関し、得られたすべての組成解析
値は、概して、チェダーに典型的な範囲内だった。したがって、コントロールお
よび実験チーズに関し観察される、匹敵する値（表２）は、生菌ラクトバチルス
のスターター補助物としての取り込み、および多数の生存が、チーズ組成に直接
的な影響を持たないことを示す。

【００５１】実施例４チェダーチーズの感覚的評価地元のチーズ製造工場の商業的採点者が、３および６か月熟成後のチーズを、
盲検で、等級付けした。それぞれ最大スコア４５および４０で、風味／香りおよ
びさわり（ｂｏｄｙ）／きめに関し、チーズを等級付けした。商業的チェダーチ
ーズには、風味／香りおよびさわり／きめに関し、それぞれ、３８および３１の
最低スコアが必要とされる。試験２のコントロールチーズを除き、熟成６か月後
、すべてのチーズは、感覚的規準に関し、商業的等級であると記載することが可
能であり、表３に示されるように、風味／香りおよびさわり／きめに関し、それ
ぞれ、３８および３１の最低スコアを達成した。

【００５２】表３６か月でのチェダーチーズの感覚的評価

【表３】 ¹最大スコア＝４５；最小商業的スコア＝３８² 最大スコア＝４０；最小商業的スコア＝３１

【００５３】ラクトバチルス補助物は、以前、チェダーチーズの風味を改善することが報告
されてきている（Ｂｒｏｏｍｅ，Ｍ．Ｄ．ら（１９９０）；Ａｕｓｔ．Ｊ．
ＤａｉｒｙＴｅｃｈｎｏｌ．４５：６７−７３）が、いくつかの場合、風
味の欠陥に責任があった（Ｐｕｃｈａｄｅｓ，Ｒ．ら（１９８９）；Ｊ．Ｆ
ｏｏｄＳｃｉ．５４：８８５−８８８）。本例では、高レベルのラクトバチ
ルス補助物を含む、実験室規模のチーズは、コントロールチーズのものに匹敵す
る風味およびきめを有することが見出され、これらの生菌ラクトバチルスをチェ
ダーチーズに添加しても、感覚的規準にいかなる不都合な影響も持たないことが
示される。さらに、より大規模で繰り返した際、高レベルのこれらの補助物の存
在により、感覚的パラメーターは、依然、影響されなかった。

【００５４】実施例５実験室規模チェダーチーズのタンパク質分解本質的にＡｎｄｒｅｗｓ（Ａｎｄｒｅｗｓ，Ａ．Ｔ．（１９８３）；Ｊ．
ＤａｉｒｙＲｅｓ．５０：４５−５５）の濃縮用ゲル系を用い、Ｐｒｏｔｅ
ａｎＩＩｘｉ垂直スラブゲル装置（Ｂｉｏ−ＲａｄＬａｂｏｒａｔｏｒｉ
ｅｓ，Ｌｔｄ．、英国ハーツ・ワットフォード）を用い、尿素−ＰＡＧＥ（Ｓ
ｈａｌａｂｉ，Ｓ．Ｌ．およびＦｏｘ，Ｐ．Ｆ．（１９８７）；Ｉｒｉｓｈ
Ｊ．ＦｏｏｄＳｃｉ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．１１：１３５−１５１）によ
り、チーズを解析した。１０ｍｇのおろしたチーズを、１ｍｌの試料緩衝液
に分散させ、そして５０℃で５分間加熱することにより、チーズ試料を調製した
。使用まで試料を−２０℃で保存し、そして１０μｌをゲルに適用した。カゼイ
ンナトリウム（５μｌ）を比較目的のための標準として用いた。濃縮用ゲルを通
じ、２８０Ｖで、そして分離用ゲルを通じ３００Ｖで試料を電気泳動した。
ＢｌａｋｅｓｌｅｙおよびＢｏｅｚｉの直接染色法（Ｂｌａｋｅｓｌｅｙ，Ｒ
．Ｗ．およびＪ．Ａ．Ｂｏｅｚｉ（１９７７）；Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ
８２：５８２−５８１）を用い、クーマシー・ブリリアント・ブルーＧ２５０
で、ゲルを染色した。

【００５５】ＫｕｃｈｒｏｏおよびＦｏｘ（Ｋｕｃｈｒｏｏ，Ｃ．Ｎ．およびＦｏｘ，
Ｐ．Ｆ．；（１９８２）；Ｍｉｌｃｈｗｉｓｓｅｎｓｈｃａｆｔ３７：３３１
−３３５）の方法にしたがい、各チーズの水可溶性抽出物（ｐＨ４．６）を調
製し、そして凍結乾燥した。ＷａｔｅｒｓＨＰＬＣ系（ＷａｔｅｒｓＣｈｒ
ｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙＤｉｖｉｓｉｏｎ、米国マサチューセッツ州ミルフォ
ード）に取り付けたＴＳＫ２０００ＳＷ（ＢｅｃｋｍａｎＩｎｓｔｒｕｍ
ｅｎｔｓＬｔｄ．、英国ハイウィッカム）ゲル浸透カラム（７．５ｍｍｘ
６０ｃｍ）を用い、サイズ排除ＨＰＬＣにより、これらの凍結乾燥抽出物中
のペプチドのサイズ分布を測定した。０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を含
む３０％アセトニトリルで、１ｍｌ／分の流速で、カラムを溶出させた。凍結
乾燥水可溶性抽出物をＨＰＬＣ等級の水で還元し（３ｍｇ／ｍｌ）、Ｗｈａｔ
ｍａｎ０．２μｍフィルターを通じ濾過し、そして２０μｌをカラムに適用し
た。カラム溶出物は、２１４ｎｍで連続的にモニターした。ＰＣＭｉｎｉｃ
ｈｒｏｍ系（ＶＧＤａｔａＳｙｓｔｅｍｓ、英国チェシャー）を用い、デー
タを集め、そして結果を、先に用意した較正曲線に比較した。

【００５６】Ｌｙｎｃｈら（Ｌｙｎｃｈ，Ｃ．Ｍ．ら（１９９６）；Ｉｎｔ．Ｄａｉｒ
ｙＪ．６：８５１−８６７）に記載されるように、ＢｅｃｋｍａｎＰ−Ｎ
３３８０５２Ｎａ⁺カラム（１２ｃｍｘ０．５ｃｍ）を備えたＢｅ
ｃｋｍａｎＳｙｓｔｅｍ６３００高性能解析装置（ＢｅｃｋｍａｎＩｎｓ
ｔｒｕｍｅｎｔｓＬｔｄ．、英国ハイウィッカム）を用い、水可溶性抽出物中
の個々の遊離アミノ酸（ＦＡＡ）を測定した。コンピューター制御Ｍｉｎｉｃｈ
ｒｏｍデータプロセシングパッケージを用い、クロマトグラムを集めた。アミノ
酸濃度はμｇ／ｍｌチーズ抽出物として表現され、その後μｇ／ｇチーズに変換
した。

【００５７】熟成８か月後の全チーズ試料の尿素−ＰＡＧＥ電気泳動パターン（図５）は、
チェダーに典型的であり、そしてコントロールチーズおよび補助物ラクトバチル
スを用い製造したものの間に主なタンパク質分解の度合いでのいかなる相違も示
さなかった。

【００５８】図５は、熟成８か月後のコントロール（レーン２および５）および実験（レー
ン３、４、６、７および８）チェダーチーズの尿素−ＰＡＧＥを示す。レーン１
はカゼインナトリウム標準を含む。

【００５９】チーズ由来の水可溶性抽出物中のペプチドの分子量分布（サイズ排除ＨＰＬＣ
により測定されるようなもの）は、熟成中のチーズにおけるタンパク質分解の度
合いのさらなる指標として利用可能である；タンパク質分解の度合いが高ければ
、生成される低分子量ペプチドのレベルも高くなる。熟成６か月後、これらの低
分子量ペプチド（＜５００Ｄａ）のレベルは、すべてのチーズで高レベルに集
積していることが見出された（データは示されていない）。さらに、コントロー
ルおよび実験チーズにおいて、補助物ラクトバチルスが高レベルで生存している
チーズ（試験１のおけ３、試験２のおけ４のチーズ）においても、同様のレベル
が検出され、小ペプチドの生成により示されるような、チーズ中のタンパク質分
解の度合いは、補助物添加により影響を受けないことが示される。しかし、熟成
６か月後、添加ラクトバチルスを用い製造したチーズにおいて、より高いレベル
の個々のＦＡＡが検出された（図６）。

【００６０】図６は、試験１（Ａ）および試験２（Ｂ）の６か月齢コントロールおよび実験
チェダーチーズの水可溶性抽出物中の個々の遊離アミノ酸の濃度を示す。

【００６１】最も重要なことに、いかなる補助物も添加されていないコントロールチーズ中
よりも、添加ラクトバチルスを用い製造したチーズ中で、セリン、メチオニン、
ロイシンおよびフェニルアラニンの濃度（試験１）に加えグルタミン酸およびバ
リンの濃度（試験２）が高かった（図６）。これは、熟成中、ラクトバチルス補
助物が減少したチーズにも当てはまることが見出された。これは、該生物が死に
、そして溶解する際の、細胞内ペプチダーゼの放出により、説明される可能性が
ある。したがって、一般的に、該結果は、補助物ラクトバチルスが、高レベルで
生存していてもいなくても、ＦＡＡ形成の増加により立証されるように、チーズ
中のタンパク質分解に寄与していたことを示唆する。

【００６２】上記の結果は、チェダーチーズに取り込まれた、生菌Ｌ．パラカゼイ株が、ス
ターター補助物として特に適していることが証明されたことを示す。これらの株
は、比較的低い接種原で添加されても、熟成８か月に渡り、チーズ中で高細胞数
に成長及び増殖することが見出された。さらに、ＲＡＰＤＰＣＲは、これらの
生菌補助物をＮＳＬＡＢから区別するのに非常に有用であることが証明された。
さらに、コントロールチーズからの結果により、特定のＮＳＬＡＢ株が主である
ことが示唆される。チーズ熟成中のタンパク質分解は、ＦＡＡ形成レベルで、補
助物により影響を受ける一方、チーズの風味、きめおよび外見は、影響を受けな
かった。これらの生菌補助物のチェダーチーズへの取り込みは、本明細書に記載
されるように、チーズ製造技術の改変なしに達成することが可能であり、したが
って、本系は商業的利用に魅力的なものになっている。これらの結果は、チェダ
ーチーズが、付随する利点と共に、消費者にこれらの株を搬送する、効率的なビ
ヒクル（ｖｅｈｉｃｌｅ）であることを示す。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１Ａは、実施例２に記載されるように、試験１におけるチーズ熟成
中のラクトバチルスおよびスターターの生存を示す、時間（日数）に対するｌｏ
ｇｃｆｕ／ｇのグラフである。図１Ｂ−１Ｄは、実施例２に記載されるように、各チーズ由来の、それぞれの
数のラクトバチルス単離体のＲＡＰＤＰＣＲプロフィールである。

【図２】図２Ａは、実施例２に記載されるように、試験２におけるチーズ熟成
中のラクトバチルスおよびスターターの生存を示す、時間（日数）に対するｌｏ
ｇｃｆｕ／ｇのグラフである。図２Ｂ−２Ｅは、実施例２に記載されるように、各チーズ由来の、それぞれの
数のラクトバチルス単離体のＲＡＰＤＰＣＲプロフィールである。

【図３】図３Ａは、実施例２に記載されるように、試験３におけるチーズ熟成
中のラクトバチルスおよびスターターの生存を示す、時間（日数）に対するｌｏ
ｇｃｆｕ／ｇのグラフである。図３Ｂは、実施例２に記載されるように、おけ２のチーズ由来の、それぞれの
数のラクトバチルス単離体のＲＡＰＤＰＣＲプロフィールを示す。

【図４】図４Ａは、実施例２に記載されるように、試験４におけるチーズ熟成
中のラクトバチルスおよびスターターの生存を示す、時間（日数）に対するｌｏ
ｇｃｆｕ／ｇのグラフである。図４Ｂは、実施例２に記載されるように、おけ２のチーズ由来の、それぞれの
数のラクトバチルス単離体のＲＡＰＤＰＣＲプロフィールを示す。

【図５】図５は、実施例５に記載されるように、熟成８か月後のコントロール
および実験チェダーチーズの尿素ＰＡＧＥである。

【図６】図６Ａは、実施例５に記載されるように、試験１に見られる、６か月
齢のコントロールおよび実験チーズの水可溶性抽出物中の個々の遊離アミノ酸の
濃度を示す。図６Ｂは、実施例５に記載されるように、試験２に見られる、６か月齢のコン
トロールおよび実験チーズの水可溶性抽出物中の個々の遊離アミノ酸の濃度を示
す。

【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書

【提出日】平成１２年６月１０日（２０００．６．１０）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】請求項１

【補正方法】変更

【補正内容】

【手続補正２】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００１１

【補正方法】変更

【補正内容】

【００１１】発明の開示本発明は、生菌チーズを製造するための方法であって、ヒト胃腸管から単離さ
れた、非病原性で、酸および胆汁耐性であり、そしてヒト上皮細胞に接着する、
ラクトバチルス・パラカゼイ株の０．０５−０．５％接種原を、スターター補助
物としてチーズ乳に添加する、ここで前記Ｌ．パラカゼイ株は、熟成期中、１０ ⁷ ｃｆｕ／ｇまたはそれ以上のレベルに増殖することが可能である、ことを含
む前記方法を提供する。

【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書

【提出日】平成１２年８月１６日（２０００．８．１６）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】請求項１２

【補正方法】変更

【補正内容】

【手続補正２】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】請求項１３

【補正方法】変更

【補正内容】

【手続補正３】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００２４

【補正方法】変更

【補正内容】

【００２４】本発明はまた、ラクトバチルス・パラカゼイ株ＮＦＢＣ３３８も提供する。

【手続補正４】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００２５

【補正方法】変更

【補正内容】

【００２５】また、本発明は、ラクトバチルス・パラカゼイ株ＮＦＢＣ３６４も提供する
。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者フィッツジェラルド，ジェラルド・フランシスアイルランド共和国カウンティ・コーク，ミッドルトン，バトラーズタウン (72)発明者コリンズ，ジョン・ケビンアイルランド共和国カウンティ・コーク，ドウクロイン，スプール・ヒル (72)発明者オサリバン，ジェラルド・クリストファーアイルランド共和国コーク，バリンベルティグ，キュアン・ボウイ (72)発明者スタントン，キャサリーン・ジェラルディーンアイルランド共和国カウンティ・コーク，キルウォース，グレイグＦターム(参考） 4B001 AC31 BC14 EC05 4B065 AA30X AC05 AC20 BB24 CA42

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】生菌チーズを製造するための方法であって、非病原性で、酸
および胆汁耐性であり、そしてヒト上皮細胞に接着する、ラクトバチルス・パラ
カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｐａｒａｃａｓｅｉ）株の０．０５−０
．５％接種原を、スターター補助物（ａｄｊｕｎｃｔ）としてチーズ乳に添加す
る、ここで前記Ｌ．パラカゼイ株は、熟成期中、１０⁷ ｃｆｕ／ｇまたはそれ
以上のレベルに増殖することが可能である、ことを含む前記方法。
【請求項２】Ｌ．パラカゼイの０．１−０．２５％接種原をチーズ乳に添
加する、請求項１の方法。
【請求項３】熟成期が少なくとも６か月である、請求項１または２の方法
。
【請求項４】熟成期が８か月またはそれ以上である、先の請求項のいずれ
かに記載の方法。
【請求項５】Ｌ．パラカゼイが、熟成期中に、１０⁸ ｃｆｕ／ｇまたは
それ以上のレベルに増殖することが可能である、先の請求項のいずれかに記載の
方法。
【請求項６】Ｌ．パラカゼイが、３７℃またはそれ以上の温度に耐性であ
る、先の請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項７】Ｌ．パラカゼイが、数えることが可能であり、そして常住菌
叢から区別することが可能である、いかなる先行する請求項でもよい請求項の方
法。
【請求項８】添加Ｌ．パラカゼイ細胞を、各株に関し、はっきり区別され
るＤＮＡフィンガープリントを生成することを可能にする無作為増幅多型ＤＮＡ
（ＲＡＰＤ）法により、数えそして区別する、請求項７の方法。
【請求項９】製造されるチーズが、固いチーズである、いかなる先行する
請求項でもよい請求項の方法。
【請求項１０】チーズがチェダーチーズである、請求項９の方法。
【請求項１１】実質的に、本明細書に記載され、そして例示される、請求
項１の方法。
【請求項１２】ラクトバチルス・パラカゼイ株ＮＦＢＣ３３８あるいは
その突然変異体または変異体（ｖａｒｉａｎｔ）。
【請求項１３】ラクトバチルス・パラカゼイ株ＮＦＢＣ３６４あるいは
その突然変異体または変異体。
【請求項１４】請求項１−１３のいかなる１つでもよい請求項に定義され
るような、生存可能な、活発に増殖しているＬ．パラカゼイ株を、前記Ｌ．パラ
カゼイをスターター補助物として使用し、製造した後、１０⁷ ｃｆｕ／ｇまた
はそれ以上の量、含む、消費準備の整った生菌チーズ。
【請求項１５】チェダーチーズである、請求項１４の生菌チーズ。
【請求項１６】実質的に、本明細書に記載され、そして例示される、請求
項１４の生菌チーズ。