JP2002515013A - Methods and compositions for modulating CD28 expression - Google Patents

Methods and compositions for modulating CD28 expression

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Abstract

(57)【要約】 Ｔ細胞においてＣＤ２８遺伝子を減少させることができるオリゴマーを提供する。特別の配列に加え、本発明は３ないし５個の塩基によって離された少なくとも２つのＧＧＧＧの配列を有するオリゴマーのクラスを含む。標的はＣＤ２８遺伝子、５’非翻訳領域および開始コドン、およびそれらの各転写体を含む。方法は、移植片−対−受容者病、敗血症性シュック症候群、ウイルス病、乾癬、Ｉ型（インシュリン依存性）糖尿病、甲状腺炎、類肉腫症、多発性硬化症、自己免疫ぶどう膜炎、慢性関節リウマチ、全身性紅斑性狼瘡および炎症性腸病を含めた免疫系−媒介病における免疫系に対する病因効果を調節するための該オリゴマーの使用を含む。   (57) [Summary] Oligomers capable of reducing the CD28 gene in T cells are provided. In addition to the specific sequences, the invention includes a class of oligomers having at least two GGGG sequences separated by three to five bases. Targets include the CD28 gene, the 5 'untranslated region and the start codon, and their respective transcripts. Methods include graft-versus-recipient disease, septic Shock syndrome, viral disease, psoriasis, type I (insulin-dependent) diabetes, thyroiditis, sarcoidosis, multiple sclerosis, autoimmune uveitis, chronic Including the use of the oligomer to modulate the pathogenic effects on the immune system in immune system-mediated diseases, including rheumatoid arthritis, systemic lupus erythematosus and inflammatory bowel disease.

Description

【発明の詳細な説明】 ＣＤ２８発現を調節するための方法および組成物 Ｉ．発明の分野 本発明は、オリゴマー、特に免疫系媒介病を治療するのに効果的なオリゴマー の使用を通じて遺伝子発現を調節する分野にある。 ＩＩ．発明の背景 免疫系は高等生物の生命を危うくする感染から保護する非常に重要な役割を演 じ、多数の病気の病因の非常に重要な一部も演じる。免疫系が一部を演じるそれ らの病気は、免疫系が自己抗原と反応する自己免疫疾患、例えば、全身性紅斑性 狼瘡、または外来性抗原に対する反応によって開始される免疫調節に関連した病 気、例えば、移植拒絶で観察される移植片−対−受容者病を含む。 多くの共通するＴ−細胞媒介による病気の病因および病状悪化は異常Ｔ−細胞 活性化によって誘起される不適切な免疫応答に由来する。活性化Ｔ−細胞の存在 が多くのＴ−細胞媒介皮膚病で報告されている（Ｓｉｍｏｎら，（１９９４）Ｊ ．Ｉｎｖｅｓｔ Ｄｅｒｍ．，１０３：５３９−５４３）。例えば、 ４００万人のアメリカ人を含めた西欧人口の２％が罹っている乾癬は、ケラチノ サイト過剰増殖および活性化Ｔ−細胞の異常な表皮浸潤によって特徴付けされる 皮膚障害である。多くの報告は、乾癬（Ｂａａｄｓｇａａｒｄら，（１９９０） Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ Ｄｅｒｍ．，９５：２７５−２８２，Ｃｈａｎｇら，（１９ ９２）Ａｒｃｈ．Ｄｅｒｍ，１２３：１４７９−１４８５，Ｓｃｈｌａａｋら， （１９９４）Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍ．，１０２：１４５−１４９）および ＡＩＤＳによって悪化された乾癬(Ｄｕｖｉｃ(１９９０)Ｊ.Ｉｎｖｅｓｔ Ｄｅ ｒｍ．，９０：３８Ｓ−４０Ｓ)の病因におけるこれらの活性化Ｔ−細胞の主要 な役割を示唆している。乾癬においては、活性化された病変Ｔ−細胞はＴｈ１サ イトカイン（ＩＬ−２、インターフェロン−ガンマ）を支配的に放出する（Ｓｃ ｈｌａａｋら，(１９９４)Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ Ｄｅｒｍ．，１０２：１４５−１ ４９）。これらの分泌されたサイトカインは、正常ケラチノサイトを誘導して、 乾癬病巣で見い出されている（Ｂａａｄｓｇａａｒｄら，（１９９０）Ｊ．Ｉｎ ｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍ．，９５：２７５−２８２）のと同一の表現型（ＨＬＡ Ｄ Ｒ＋／ＩＣＡＭ−１＋）を発現させる。また、そのイン・ビト ロおよびイン・ビボのプロ炎症特性によって、かつそれが乾癬病巣からの活性化 Ｔ−細胞およびケラチノサイト双方によって大量に分泌されるので、ＩＬ−８は 、ケラチノサイト過剰増殖のごとき乾癬皮膚で観察された病理学的変化の主要な 誘因であると考えられる。さらに、受容体のＢ７ファミリー（活性化ＡＰＣで見 い出されるＣＤ２８に対するリガンド）の１つであるＢＢ１が、乾癬であるが冒 されていない皮膚ケラチノサイトで発現することが示されている（Ｎｉｃｋｏｌ ｏｆｆら，（１９９３）Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，１４２：１０２９−１ ０４０）。 Ｉ型（インシュリン依存性）糖尿病、甲状腺炎、類肉腫症、多発性硬化症、自 己免疫ブドウ膜炎、慢性関節リウマチ、全身性紅斑性狼瘡、炎症性腸病（クロー ンのおよび潰瘍性結腸炎）および自己免疫肝炎を含めた多数の他の病気が異常Ｔ −細胞活性化によって引き起こされると考えられる。加えて、敗血症性ショック および腫瘍−誘導悪液質を含めた種々の症候群がＴ−細胞活性化およびリンホカ インの潜在的毒性レベルの生成の増大に関与し得る。また、正常Ｔ−細胞活性化 は、「外来性」ドナー組織の効果的破壊のために必要なシグナルを供することに よって、移植された細胞および器官の拒絶を媒介する。 Ｔ−細胞増殖および特異的免疫調節サイトカインの遺伝子発現および分泌は２ つの独立したシグナルを必要とする。最初のシグナルは、特異的Ｔ−細胞受容体 ／ＣＤ３複合体による、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面上の主要組織適合性複合 体分子によって提示された抗原の認識を含む。Ｔ−細胞およびＡＰＣ間の抗原− 非特異的細胞間相互作用は、抗原に対するＴ−細胞応答を調節するように働く第 ２のシグナルを提供する。これらの第２のまたは共刺激性シグナルは、抗原に対 するＴ−細胞応答の大きさを決定する。共刺激された細胞は、特異的サイトカイ ン遺伝子転写のレベルを増大させることによって、および選択されたｍＲＮＡを 安定化することによって反応する。共刺激不存在下での、Ｔ−細胞活性化は、未 発達アネルギー的Ｔ−細胞応答となる。キー共刺激シグナルの一つは、Ｔ−細胞 表面受容体ＣＤ２８とＡＰＣ上のＢ７−関連分子との相互作用によって供される （ＬｉｎｓｌｅｙおよびＬｅｂｄｅｔｔｅｒ（１９９３）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍ ｍｕｎｏｌ．，１１：１９１−２１２）。ＣＤ２８は（Ｂ−細胞抗体産生用のヘ ルパー機能を供する）ＣＤ４＋Ｔ−細胞の９５％、および（細胞傷害性機能を有 する）ＣＤ８＋Ｔ−細胞の５０％で構成的に発現される（Ｙａｍａｄａら，(１ ９８５)Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５：１１６４−１１６８）。抗原性ま たはイン・ビトロ分裂促進刺激により、ある種の免疫調節サイトカインと同様、 ＣＤ２８の表面レベルのさらなる誘導が起こる。これらは、Ｔ−細胞の細胞周期 進行に必要なインターロイキン−２（ＩＬ−２）、種々の抗−ウイルスおよび抗 −腫瘍効果を示すインターフェロン−ガンマ、および好中球およびリンパ球に対 する優れた走化性因子として知られているインターロイキン−８（ＩＬ−８）を 含む。これらのサイトカインはＴ−細胞活性化のＣＤ２８経路によって調節され ることが示されている（Ｆｒａｓｅｒら，（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５１ ：３１３−３１６，Ｓｅｄｅｒら，（１９９４）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７９ ：２９９−３０４，Ｗｅｃｈｓｌｅｒら，（１９９４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １５３：２５１５−２５２３）。ＩＬ−２、インターフェロン−ガンマ、および ＩＬ−８は広範囲の免疫応答を促進するのに必須であって、多くのＴ−細胞媒介 病気状態で過剰発現されることが示されている。 アレルギー性接触皮膚炎および偏平苔癬のごときいくつかの Ｔ−細胞媒介皮膚傷害において、ＣＤ２８は大部分の皮膚および表皮ＣＤ３＋Ｔ −細胞で高レベルで発現されたが、正常皮膚および基底細胞癌（非Ｔ−細胞媒介 皮膚病）ではそうでなく、ＣＤ２８は脈管周囲Ｔ−細胞でのみ発現された。同様 に、アレルギー性接触皮膚炎および偏平苔癬の双方において、Ｂ７発現は皮膚樹 状細胞、皮膚ＡＰＣおよびケラチノサイトで見い出されたが、正常皮膚および基 底細胞癌では見い出されなかった(Ｓｉｍｏｎら，（１９９４），Ｊ．Ｉｎｖｅ ｓｔ Ｄｅｒｍ．，１０３：５３９−５４３）。従って、これはＣＤ２８／Ｂ７ 経路がＴ−細胞媒介皮膚病の重要なメディエーターであることを示唆する。 自己寛容の喪失によって引き起こされたある種の自己免疫疾患に関連する異常 Ｔ−細胞活性化は、専ら、ＣＤ２８＋Ｔ−細胞の存在および活性化された専門的 ＡＰＣ（単球、マクロファージまたは樹状細胞）上のそのリガンドＢ７の発現に よって特徴付けられる。これらは、自己免疫グラベス甲状腺炎（Ｇａｒｃｉａ− Ｃｏｚａｒら，(１９９３)Ｔｍｍｕｎｏｌ．，１２：３２）、類肉腫症（Ｖａｎ ｄｅｎｂｅｒｇｈら、（１９９３）Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，５：３１７−３ ２１），慢性関節 リウマチ（Ｖｅｒｗｉｌｇｈｅｎら（１９９４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５３ ：１３７８−１３８５）および全身性紅斑性狼瘡（Ｓｆｉｋａｋｉｓら，（１９ ９４）Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，９６：８−１４）を含む。移植さ れた細胞および器官の拒絶を媒介する正常Ｔ−細胞活性化において、Ｔ−細胞受 容体従事の間におけるその適切なＢ７リガンドによるＣＤ２８の結合は、例えば 、ドナー組織上の外来性抗原に対する適切な同種異系応答に非常に重要である（ Ａｚｕｍａら，（１９９２）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７５：３５３−３６０， Ｔｕｒｋａら，（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８ ９ ：１１１０２−１１１０５）。 自己免疫疾患に対する伝統的な療法は、Ｔ−細胞活性化；自己抗原に対する自己 反応性免疫応答におけるエフェクター過程、を妨げない。ステロイドおよび非ス テロイド抗−炎症性薬物(ＮＳＡＩＤＳ)のごとき薬物が現在、症候群を緩和する のに使用されているが、それらは該病気の進行を妨げることができない。加えて 、ステロイドは骨粗鬆症、器官毒性および糖尿病の誘導のごとき副作用を有する 可能性があり、軟骨変性プロセスを加速する可能性があり、２ないし８時間まで の間にいわゆるポス ト−注射発赤を引き起こしかねない。ＮＳＡＩＤＳは胃腸管副作用を有し、顆粒 球減少症および医原性肝炎の危険を増加しかねない。また、免疫抑制性薬物が、 特に進行した病気状態において、もう１つの治療形態として使用される。しかし ながら、これらの薬物は全免疫系を抑制し、しばしば治療は高血圧および腎毒性 を含めた重篤な副作用を有する。またサイクロスポリンおよびＦＫ５０６のごと き確立された免疫抑制剤はＣＤ２８−依存性Ｔ−細胞活性化経路を阻害できない （Ｊｕｎｅら，(１９８７)Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，７：４４７２−４４ ８１）。 免疫系媒介病を治療するための現在利用可能な医薬および方法の欠点に鑑みる と、かかる病気を治療するための新しい方法および組成物を提供するのは興味深 い。 ＩＩＩ．発明の概要 主題の発明は、免疫系媒介病の治療のための方法および組成物を提供する。本 発明の組成物は、注目する細胞においてＣＤ２８の発現を低下させる特性を有し 、これは免疫系媒介病において免疫系の病因効果を減じる。また、ＣＤ２８発現 を低下させる主題の方法は、ＣＤ２８+Ｔ細胞の抗原性刺激の効果を低 下させ、それによりＣＤ２８+Ｔ細胞の活性化のレベルおよびＴ細胞活性化に関 連するインターロイキン−２、インターフェロン−ガンマおよびインターロイキ ン−８を含めたサイトカインの放出を低下させる方法として供される。本発明の 組成物はＣＤ２８の発現を低下させることができる多くの異なるオリゴマーを含 む。 本発明の１つの態様は、ＣＤ２８の発現に干渉することによってＣＤ２８の発 現を低下させることができるオリゴマーを提供することである。本発明のオリゴ マーは、ＣＤ２８遺伝子もしくはＣＤ２８遺伝子転写体、またはこれらの一部に 対して核酸塩基配列相同性を有し、ここに該相同性は細胞内条件下で核酸二本鎖 らせんまたは三本鎖らせんの形態を可能とするのに十分なものである。本発明の オリゴマーはＤＮＡ、ＲＮＡ、またはその種々の合成アナログであってよい。特 別の具体例において、３ないし５個の塩基によって分離されたＧＧＧＧの少なく とも２つの配列よりなる１１ないし５０塩基を有するオリゴマー。 本発明のもう１つの態様は、注目する細胞、特に天然でＣＤ２８を発現する細 胞における本発明のオリゴマーの細胞内発現 用の遺伝子工学によるベクターを提供することである。 本発明のもう１つの態様は、本発明の１以上の異なるオリゴマーよりなる医薬 処方を提供することである。該医薬処方は身体への投与または身体に再導入すべ き細胞への投与の種々の形態に適合し得る。 本発明のもう１つの態様は、免疫系媒介病のための処置方法を提供することで ある。本発明の方法は、有効量の本発明のオリゴマーを投与することによってＣ Ｄ２８発現を調節することを含む。本発明の方法は、自己免疫疾患を治療する方 法、炎症、応答を低下させる方法、選択されたサイトカインの生産を低下させる 方法、Ｔ細胞を不活化させる方法、および移植患者を免疫抑制する方法を含む。 ＩＶ．図面の簡単な記載 図１は、ＣＤ２８遺伝子の５’非翻訳領域の配列（１Ａ）およびヒトＣＤ２８ のｍＲＮＡ配列（１Ｂ、１Ｃ）である。図１Ｂおよび１Ｃはポリヌクレオチド配 列の異なる連続（ｃｏｎｔｉｇｕｏｕｓ）部分を表す。 図２は、種々のＣＤ２８−特異的および対照ホスホロチオエートおよびホスホ ロチオエート−３’ヒドロキシルプロピルア ミンオリゴヌクレオチドで処理した後の生育できる（生）Ｔ−細胞のパーセント のグラフ表示である。 図３は、２のドナー（ＧＶ０１０およびＪＣ０１１）からのヒトＴ−細胞にお ける抗−ＣＤ３モノクローナル抗体／ＰＭＡ−誘導ＣＤ２８発現（Ａ）、ならび に同一の２のドナーからの末梢血液Ｔ−細胞における抗−ＣＤ３モノクローナル 抗体／ＰＭＳ−誘導ＣＤ２８発現に対するＣＤ２８−特異的および対照ホスホロ チオエート（Ｂ、バッチ１および２）およびホスホロチオエート−３’ヒドロキ シプロピルアミン（Ｃ）オリゴヌクレオチドの効果のグラフ表示である。 図４は、Ａ）ドナーＫＳ００６からのヒトＴ−細胞におけるマイトジェンによ るＴ−細胞増殖の誘導、およびＢ）抗−ＣＤ３モノクローナル抗体／ＰＭＡ−誘 導ヒトＴ−細胞増殖に対するＣＤ２８−特異的および対照ホスホロチオエートオ リゴヌクレオチドの効果のグラフ表示である。 図５は、ヒトＴ−細胞における抗−ＣＤ３モノクローナル抗体およびＰＭＡに よるインターロイキン−２−（ＩＬ−２）産生の誘導（Ａ）、ならびにヒト末梢 Ｔ−細胞における抗−ＣＤ３モノクローナル抗体／ＰＭＡ−誘導ＴＬ−２産生に 対するＣ Ｄ２８−特異的および対照ホスホロチオエート（Ｂ）ホスホロチオエート−３’ ヒドロキシプロピルアミン（Ｃ）の効果のグラフ表示である。 図６は、ヒトＴ−細胞における抗−ＣＤ３モノクローナル抗体およびＰＭＡに よるインターフェロン−ガンマ（ＩＦＮγ）産生の誘導（Ａ）、ならびにヒト末 梢Ｔ−細胞における抗−ＣＤ３モノクローナル抗体／ＰＭＡ−誘導インターフェ ロン−ガンマ産生に対するＣＤ２８−特異的および対照ホスホロチオエート（Ｂ ）ホスホロチオエート−３’ヒドロキシプロピルアミン（Ｃ）オリゴヌクレオチ ドの効果のグラフ表示である。 図７は、ヒトＴ−細胞における抗−ＣＤ３モノクローナル抗体によるインター ロイキン−８（ＩＬ−８）の誘導（Ａ）、ならびにヒト末梢Ｔ−細胞における抗 −ＣＤ３モノクローナル抗体／ＰＭＡ誘導ＩＬ−８産生に対するＣＤ２８−特異 的および対照ホスホロチオエート（Ｂ）ホスホロチオエート−３’ヒドロキシプ ロピルアミン（Ｃ）オリゴヌクレオチドの効果のグラフ表示である。 図８は、インターロイキン−２受容体（ＩＬ−２Ｒ、ＣＤ２５としても知られ ている）の誘導（Ａ）、及びＣＤ２８−特異 的および対照ホスホロチオエート３’ヒドロキシプロピルアミンオリゴヌクレオ チドで処理したまたは処理しないヒト末梢Ｔ−細胞における抗−ＣＤ３モノクロ ーナル抗体およびＰＭＡによる細胞内接着分子−１（ＩＣＡＭ−１、ＣＤ５４と しても知られている）発現（Ｂ）のグラフ表示である。 図９は、抗−ＣＤ２８モノクローナル抗体およびＰＭＡ処理の前後におけるＨ ＵＴ７８（Ａ）およびＪｕｒｋａｔ（Ｂ）ヒトＴ−細胞系におけるＣＤ２８発現 、および抗−ＣＤ３モノクローナル抗体およびＰＭＡ−処理Ｊｕｒｋａｔ細胞に おけるＣＤ２８−特異的ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの効果（Ｃ）の グラフ表示である。 図１０は、抗−ＣＤ３モノクローナル抗体およびＰＭＡ−処理ＨＵＴ７８（Ａ ）およびＪｕｒｋａｔ（Ｂ）ヒトＴ−細胞系におけるインターロイキン−２産生 に対するＣＤ２８−特異的ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの効果のグラ フ表示である。 図１１は、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドによるアクセサリー分子の 表面発現および活性化Ｔ細胞におけるサイトカイン分泌の効果のグラフ表示であ る。 図１２は、ＣＤ２８およびＣＤ２５ｍＲＮＡレベルに対するホスホロチオエー トオリゴヌクレオチドの効果のグラフ表示である。 図１３は、機能的ＣＤ２８発現に対する阻害性効果に関するオリゴヌクレオチ ドＲＴ０３Ｓ（配列番号：４４）およびＲＴ０４Ｓ（配列番号：４５）の特異性 のグラフ表示である。 図１４は、ＣＤ２８−特異的オリゴヌクレオチド、ＲＴ０３Ｓ（配列番号：４ ４）およびＲＴ０５Ｓ（配列番号：４５）によるイン・ビトロでの寛容性誘導の グラフ表示である。 図１５は、細胞外上清（頂部パネル）およびＪｕｒｋａｔ細胞溶解物（底部パ ネル）における32Ｐ−標識ホスホロチオエート、ＲＴ０３Ｓ（配列番号：４４） およびＲＴＣ０６Ｓ（配列番号：４８）のイン・ビトロ安定性のグラフ表示であ る。 Ｖ．特別の具体例の詳細な記載 ここに免疫系媒介病を治療するための方法および組成物を記載し、ここに、所 望の治療効果はＣＤ２８の発現を減少させることによって達成され、これにより 、活性化ＣＤ２８+Ｔ細胞機能を阻害し、他の免疫系細胞の活性化を低下させる 。本発明者らは、抗原−依存性Ｔ細胞活性化が、ＣＤ２８+Ｔ細胞にお けるＣＤ２８の発現を低下させることによって阻害され得ることを見い出した。 本発明は、Ｔ細胞におけるＣＤ２８の発現を低下させるのに用いることができる 多数の化合物を提供する。 ここに記載する本発明は、Ｔ細胞におけるＣＤ２８発現の低下はＴ細胞の抗原 −特異的活性化に干渉できるという発見を含む。該発見は、ＣＤ２８を標的とす るオリゴマーで、およびＣＤ２８発現を低下させる非オリゴマー化合物で、免疫 系媒介病を治療する多数の方法を提供するのに用いることができる。本出願に記 載したＣＤ２８発現を低下させる生物学的効果の発見を使用することによって、 免疫系媒介病の多数の治療方法が提供され、かかる方法はいまだ合成または精製 されていない非オリゴマー化合物を使用することができる。 本発明の１つの態様は、「アンチセンス」オリゴヌクレオチドまたは「アンチ センス療法」の使用としばしば呼ばれる確立された技術にて、ある種の遺伝子の 遺伝子発現を阻害するのに用いることができるオリゴマーを提供することである 。構築およびアンチセンスの使用に関する多数の文献が利用できる。かかる文献 の例は：Ｓｔｅｉｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６１：１００４−１０１２（１９９ ３）；Ｍｉｌｌｉｇａｎら，Ｊ．Ｍ ｅｄ．Ｃｈｅｍ．，３６：１９２３−１９３７（１９９３）；Ｈｅｌｅｎｅら， Ｊ．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１０４９：９９−１２５（１ ９９０）；Ｗａｇｎｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ，３７２：３３３−３３５（１９９４） ；およびＣｒｏｏｋｅおよびＬｅｂｌｅｕ，Ａｎｔｉ−ｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａ ｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ＣＲＣＰｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒ ａｔｏｎ（１９９３）。本明細書で用いる「アンチセンス」なる語は、特に断り のない限り、ポリヌクレオチドとで二本鎖または三本鎖（トリプレックス）らせ んを形成して遺伝子発現に干渉できる（オリゴヌクレオチドを含めた）オリゴマ ーをいう。これらの文献および他の同様の文献に記載されているアンチセンスデ ザインの原理および使用を、本発明のＣＤ２８特異的オリゴヌクレオチドの具体 例を設計し、作成し、使用するのに当業者は使用することができる。 本発明のオリゴマーはＣＤ２８遺伝子の発現を調節できる。本発明のオリゴマ ーは、ＣＤ２８転写体（またはその一部）とハイブリダイズすることによって二 本鎖ポリヌクレオチドらせんを、またはＣＤ２８遺伝子の一部または複数の一部 とハイブリダイズすることによって二本鎖ポリヌクレオチドらせんを形 成することができる特性を有するオリゴマーを含み、ここにらせん形成は細胞内 条件下で起こり得る。また、本発明のオリゴマーは分子デコイとして作用するこ とによって、および転写因子とＣＤ２８遺伝子の非翻訳領域の調節要素との蛋白 質−核酸相互作用を妨げることによって、遺伝子発現の調節を行うことができる 。加えて、本発明のオリゴマーは、ＣＤ２８遺伝子の一部または複数の一部とで 三本鎖ポリヌクレオチドらせんを形成できるものを含み、ここに、該らせん形成 は細胞内条件下で起こり得る。核酸塩基間の（例えば、アデニン−チミジン、シ トシン−グアニン、ウラシル−チミジン）二本鎖または三本鎖両らせん塩基対合 関係は当業者に知られており、本発明のオリゴマーの設計で使用できる。そこで 本発明の所与のオリゴマーとで二本鎖らせんまたは三本鎖らせん形成が起こり得 るＣＤ２８遺伝子またはＣＤ２８遺伝子転写体はそのオリゴマーにより「標的化 された」と言われる。 ヒトＣＤ２８はＴ細胞のサブユニットの表面に存在する９０−ｋＤａホモダイ マー膜貫通糖蛋白質である。ＣＤ２８はほとんどのＣＤ４+Ｔ細胞および約５０ ％のＣＤ８+Ｔ細胞に存在する。ヒトＣＤ２８をコードするＤＮＡ配列は、とり わけ、Ｌ ｅｅら，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１４５：３４４−３５ ２（１９９０）中、およびＧｅｎＢａｎｋのごとき公衆がアクセス可能な遺伝子 データバンクで見い出すことができるごとく解読されている。ヒトＣＤ２８遺伝 子は４つのエクソンからなり、各々は、予測される蛋白質の機能的ドメインを規 定する。種々のサイズの転写産物がヒトＣＤ２８遺伝子から産生されてきたこと が観察されている。本発明のオリゴマーは、ＣＤ２８遺伝子の公表されたヌクレ オチド配列またはＣＤ２８遺伝子から誘導されたｃＤＮＡの配列を参照すること によって設計できる。本発明の組成物および方法は、非ヒト哺乳動物からの非ヒ トＣＤ２８遺伝子の配列を参照することによって、ヒト以外の哺乳動物で使用す るのに容易に適合させることができる。非ヒトＣＤ２８遺伝子の配列は、とりわ け、ヒト（または他の哺乳動物）から従前に同定されているＣＤ２８遺伝子を遺 伝子ライブラリーハイブリダイゼーションプローブおよび／またはＰＣＲ（ポリ メラーゼ鎖反応）増幅プライマーとして用いることによって得ることができる。 ＣＤ２８遺伝子の公表されたヌクレオチド配列は正確であると信じられている一 方、もし公表されたＣＤ２８のヌクレオチド塩基配列が配列決 定エラーを含んでいるとしても、当業者ならば本発明を実施できる。公表された 配列における適当なヌクレオチド塩基配列エラーは、とりわけ、本発明のオリゴ マーによって標的化されたＣＤ２８遺伝子（またはＣＤ２８遺伝子転写体）の領 域を再度配列決定することによって検出できる。再配列決定は通常のＤＮＡ配列 決定技術によって行うことができる。 本発明のオリゴマーは、好ましくは、約１１ないし約５０の核酸塩基単位から なる。本発明のオリゴマーが５０核酸塩基単位よりもかなり長くできることは当 業者ならば容易に理解できるであろう。本発明のより好ましい具体例において、 オリゴマーは約８ないし約２５の核酸塩基単位；より好ましくは約１４核酸塩基 単位ないし約２２核酸塩基単位からなる。本発明のオリゴマーについての好まし いサイズ制限は、細胞外で細胞に投与されるべきであって、例えば、標的受容体 細胞の遺伝子操作用のベクターから生産された細胞内産生ＣＤ２８特異的オリゴ マーには適用できないオリゴマーのみに関する。 本発明のオリゴマーは多数の異なる核酸塩基配列を有し得る。本発明のオリゴ マーは、ＣＤ２８の発現を低下させるために（核酸−核酸相互作用を介して）ハ イブリダイズさせることによっ て、あるいは（核酸−蛋白質相互作用を介して）ＣＤ２８遺伝子の非翻訳配列を 認識する非核酸分子にハイブリダイズさせることによって、ＣＤ２８の発現をＣ Ｄ２８遺伝子のＣＤ２８転写体の実質的にいずれかの領域に低下させるように選 択することができる。例えば、本発明のオリゴマーは、（種々の区別される領域 の組合せを含めた）ＣＤ２８転写体の翻訳領域、ＣＤ２８転写体の非翻訳領域、 ＣＤ２８転写体の非スプライス領域、ＣＤ２８遺伝子イントロン、ＣＤ２８プロ モーター配列、およびＣＤ２８調節配列、ＣＤ２８転写体の５’キャップ領域、 ＣＤ２８遺伝子暗号領域等にハイブリダイズできるように選択できる。本発明の オリゴマーによるＣＤ２８遺伝子およびＣＤ２８遺伝子転写体の好ましい具体例 は、ＣＤ２８遺伝子（およびその転写体）の翻訳および／または転写開始領域に ある。オリゴマーの核酸塩基対配列の選択を通じてらせん形成が起こり得るＣＤ ２８またはＣＤ２８遺伝子転写体の位置を変化させることによって、オリゴマー の能力、例えば所望の生物学的効果を生じるのに必要な量が変化するであろう。 本発明のオリゴマーの好ましい具体例は最高の可能な能力を有する。本発明の種 々のオリゴマーの能力は、当業者に公知の種々のイン・ビトロ・ アッセイによって測定できる。かかるアッセイの例は、本出願の実験セクション に見い出すことができる。当業者ならば、ＣＤ２８遺伝子以外の遺伝子位置にも 存在するポリヌクレオチド配列に標的化されるオリゴマーを生じさせるのは望ま しくないことを認識するであろう。例えば、ＣＤ２８転写体の５’非翻訳領域に おけるＡｌｕ配列に標的化されたオリゴマーを生成するのは望ましくないであろ う（ＣＤ２８の該Ａｌｕ領域はＬｅｅら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏ ｌｏｇｙ，１４５：３４４−３５２（１９９０））。ＣＤ２８以外の遺伝子また は遺伝子の転写体とで二本鎖または三本鎖を形成するオリゴマーの使用は、Ｇｅ ｎＢａｎｋのごとき公衆がアクセスできるデータベースに存在するポリヌクレオ チド配列情報に対してオリゴマーヌクレオチド塩基配列の相同性サーチを行うこ とによって最小化することができる。 本発明の好ましい具体例において、主題のオリゴマーは、選択された標的配列 に完全に相補的な核酸塩基を呈する。すなわち、該オリゴマーにおける各核酸塩 基は、二重（または三重）らせんのもう１つの鎖上の第２（または第３）の核酸 塩基との塩基対合関係に入ることができる。しかしながら、当業者なら ば、ＣＤ２８遺伝子標的に特異的なおよび／またはＣＤ２８発現を阻害できる種 々のオリゴマーは、ＣＤ２８遺伝子（いずれかの鎖）、ＣＤ２８遺伝子転写体、 またはＣＤ２８−特異的調節蛋白質に対する完全なハイブリダイゼーションを欠 くヌクレオチド塩基配列を有し得ることを認識するであろう。 本発明のオリゴマーの好ましい具体例は以下の核酸塩基配列： ５’ＴＴＧＴＣＣＴＧＡＣＧＡＴＧＧＧＣＴＡ３’（配列番号：１）ＲＴ０１ ５’ＡＧＣＡＧＣＣＴＧＡＧＣＡＴＣＴＴＴＧＴ３’（配列番号：２）ＲＴ０ ２ ５’ＴＴＧＧＡＧＧＧＧＧＴＧＧＴＧＧＧＧ３’(配列番号：３)ＲＴ０３ ５’ＧＧＧＴＴＧＧＡＧＧＧＧＧＴＧＧＴＧＧＧＧ３’（配列番号：４）ＲＴ ０４ 本発明の特に好ましい具体例において、ＲＴ０１、ＲＴ０２、ＲＴ０３、およ びＲＴ０４に示したヌクレオチド塩基配列はホスホロチオエートである。特に好 ましいオリゴマーは、Ｔａｍら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．２２：９７７− ９８６（１ ９９４）に記載されているホスホロチオエート−３’ヒドロキシプロピルアミン である。 本発明のオリゴマーは、細胞外で適用され内在化された本発明のオリゴマーを 有して、Ｔ細胞におけるＣＤ２８の発現を低下させるように設計できる。加えて 、本発明のオリゴマーは、該オリゴマーが遺伝子発現ベクターの使用を介して細 胞内で産生された場合にＣＤ２８の発現を低下させるように設計できる。ＣＤ２ ８発現の阻害は、（Ｉ）ＣＤ２８遺伝子転写との干渉、（ｉｉ）ＣＤ２８遺伝子 転写体の転写との干渉、（ｉｉｉ）ＣＤ２８遺伝子転写体のプロセッシング、ま たは（Ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）のいずれかの組合せを介して行うことが できる。ＣＤ２８発現の干渉の正確な程度およびメカニズムは、個々のオリゴマ ーの構造、オリゴマーのヌクレオチド塩基配列、オリゴマーの用量、主題のオリ ゴマーを投与する手段等のごとき因子に依存するであろう。 本明細書で用いる「オリゴマー」なる用語は、天然に生じるポリヌクレオチド 、例えばＤＮＡ、ＲＮＡ、およびＤＮＡまたはＲＮＡとで二本鎖または三本鎖ら せんいずれかを形成できる能力を有する天然に生じる核酸の人工的アナログ双方 をいう。 天然に生じるポリヌクレオチドの人工的アナログである多くのオリゴマーは、そ れらを本発明の方法で用いるためにＤＮＡまたはＲＮＡよりも優れたものとする 特性を有する。これらの特性はＤＮＡ／ＲＮＡに対するより高い親和性、エンド ヌクレアーゼ耐性、エキソヌクレアーゼ耐性、脂質溶解性、ＲＮＡｓｅＨ活性化 等を含む。例えば、増強された脂質溶解性および／またはヌクレアーゼ消化に対 する耐性は、ヌクレオチド間ホスホジエステル結合中のホスフェート酸素に代え てアルキル基またはアルコキシ基で置き換えて、アルキルホスホネート、オリゴ ヌクレオチドまたはアルキルホスホトリエステルオリゴヌクレオチドを形成する ことによって得られる。これらのごとき非イオン性オリゴマーは、相補的核酸配 列との安定な複合体を形成する能力を保持しつつ、ヌクレアーゼ加水分解に対す る耐性の増加および／または細胞摂取の増大によって特徴付けられる。 天然に生じる核酸のアナログである多数のオリゴマーは明示的にここに記載さ れ、および／または当業者に知られており、将来開発され得る核酸アナログであ る多数のオリゴマーは、ＣＤ２８遺伝子の発現を阻害するように、当業者によっ て容易に適合され得ることが認識されるであろう。ＣＤ２８遺伝子（お よびその転写体）を標的化するような適当な核酸塩基配列の選択によって、本発 明のオリゴマーとして使用され得る種々の現在入手できるＤＮＡ／ＲＮＡアナロ グの簡単な総括は後記にて供する。それらの文献に記載された種々のオリゴマー は、本発明の方法および組成物においてＣＤ２８発現の阻害に適合され得るオリ ゴマーの異なる可能な具体例の例であり、限定ではない。 メチルホスホネート（および他のアルキルホスホネート）オリゴマーは、溶液 中および不溶性ポリマー支持体上双方にて、種々の方法によって調製できる（Ａ ｇｒａｗａｌおよびＦｉｆｔｉｎａ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，６：３ ００９−３０２４（１９７９）；Ｍｉｌｌｅｒら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１８ ：５１３４−５１４２（１９７９）；Ｍｉｌｌｅｒら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈ ｅｍ．，２５５：９６５９−９６６５（１９８０）；Ｍｉｌｌｅｒら，Ｎｕｃｌ ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１１：５１８９−５２０４（１９８３）；Ｍｉｌｌｅ ｒら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，１１：６２２５−６２４２（１９８３） ；Ｍｉｌｌｅｒら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２５：５０９２−５０９７（１ ９８６）；Ｓｉｎｈａら， Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ，２４：８７７−８８０（１９８３）；Ｄｏ ｒｍａｎら，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，４０：９５−１０２（１９８４）；Ｊａ ｇｅｒおよびＥｎｇｅｌｓ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ，２５：１４３ ７−１４４０（１９８４）；Ｎｏｂｌｅら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１２ ：３３８７−３４０４（１９８４）Ｃａｌｌａｈａｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８３：１６１７−１６２１（１９８６）；Ｋｏ ｚｉｏｌｋｉｅｗｉｃｚら，Ｃｈｅｍｉｃａ Ｓｃｒｉｐｔａ，２６：２５１− ２６０（１９８６）；ＡｇｒａｗａｌおよびＧｏｏｄｃｈｉｌｄ，Ｔｅｔｒａｈ ｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，３８：３５３９−３５４２（１９８７）；Ｌｅｓｎｉ ｋｏｗｓｋｉら，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ,２８:５５３５−５５３８ (１９８７)；Ｓａｒｉｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５ ：７４４８−７４５１（１９８８））。 オリゴマーとして使用されるさらなるオリゴリボヌクレオチドアナログはＩｎ ｏｖａら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１５：６１３１（１９８７ ）（２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド），Ｔｎｏｖａら，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ ．，２１ ５ ：３２７（１９８７）。 ホスホロチオエートおよびホスホロジチオエートの製法および使用法の記載は 、とりわけ、以下の刊行物：米国特許第５，２９２，８７５号、米国特許第５， ２８６，７１７号、米国特許第５，２７６，０１９号、米国特許第５，２６４， ４２３号、米国特許第５，２１８，１０３号、米国特許第５，１９４，４２８号 、米国特許第５，１８３，８８５号、米国特許第５，１６６，３８７号、米国特 許第５，１５１，５１０号、米国特許第５，１２０，８４６号、米国特許第４， ８１４，４４８号、米国特許第４，８１４，４５１号、米国特許第４，０９６， ２１０号、米国特許第４，０９４，８７３号、米国特許第４，０９２，３１２号 、米国特許第４，０１６，２２５号、米国特許第４，００７，１９７号、米国特 許第３，９７２，８８７号、米国特許第３，９１７，６２１号、米国特許第３， ９０７，８１５号、Ｄａｇｌｅら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１８：４ ７５１−４７５７（１９９０）、Ｌｏｋｅら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６：３４７４−３４７８（１９８９）、ＬａＰｌａｎｃｈｅ ら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１４：９０８１（１９８６）およ びＳｔ ｅｃら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０６：６０７７（１９８４）、および Ｓｔｅｉｎら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．，１６：３２０９−３２２１（ １９８８）中に見い出すことができる。 ホスホルアミダイトの製法および使用法の記載は、とりわけ、以下の刊行物： Ａｇｒａｗａｌら・Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８５：７０７９ −７０８３（１９８８）、Ｄａｇｌｅら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１ ８ （６）：４７５１−４７５７（１９９０），Ｄａｇｌｅら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉ ｄｓ Ｒｅｓ．，１９（８）：１８０５-１８１０（１９９１）中に見い出すこ とができる。 注目する他のポリヌクレオチドアナログは骨格構造にチオアセテートのアセタ ールを有する化合物を含む。かかる化合物の製法および使用方法の記載は、とり わけ、Ｇａｏら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３１：６２２８−６２３６（１９ ９２）、Ｑｕａｅｄｆｌｉｅｇら,Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ.，３３（ ２１）：３０８１−３０８４（１９９２）、Ｊｏｎｅｓら，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅ ｍ．，５８：２９８３−２９９１（１９９３）中に見い出すことができる。 注目する他のポリヌクレオチドアナログは、骨格構造にシリルおよびシロキシ 架橋を有する化合物を含む。かかる化合物の製法および使用方法の記載は、とり わけ、ＯｇｉｌｖｉｅおよびＣｏｒｍｉｅｒ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔ ｔ．，２６（３５）：４１５９−４１６２（１９８５）、Ｃｏｒｍｉｅｒおよび Ｏｇｉｌｖｉｅ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１６（１０）：４５８３− ４５９４（１９８８）、ＰＣＴ公開ＷＯ９４／０６８１１中に見い出すことがで きる。 注目する他のポリヌクレオチドアナログは骨格構造中にシリルおよびアセトア ミデート架橋を有する化合物を含む。かかる化合物の製法および使用方法の記載 は、とりわけ、Ｇａｉｔら，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，Ｐｅｒｋｉｎ Ｔｒａｎ ｓ．１：１６８４（１９７４）、ＭｕｎｇａｌｌおよびＫａｉｓｅｒ，Ｊ．Ｏｒ ｇ．Ｃｈｅｍ．４２（４）：７０３−７０６（１９７７）、およびＣｏｕｌｌら ，およびＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，２８（７）：７４５−７４８（ １９８７）中に見い出すことができる。 モルホリノをベースとする骨格結合を有するポリヌクレオチドアナログも記載 されている。かかるヌクレオチドアナログの 製法および使用方法についての情報は、とりわけ、米国特許第５，０３４，５０ ６号、第５，２３５，０３３号、第５，０３４，５０６号、第５，１８５，４４ ４号中に見い出すことができる。 種々のアミン、ペプチド、および他のアキラルおよび／または中性結合を有す るポリヌクレオチドアナログが記載されている：Ｃｌａｕｆｉｅｌｄら，Ｂｉｏ ｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，３（１２） ：２７７１−２７７６（１９９３）、Ｍｅｓｍａｅｋｅｒら，Ｂｉｏｏｒｇａｎ ｉｃ ＆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，４（３）：３９５−３９８ （１９９４）、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．，３３（２） ：２２６−２２９（１９９４）、米国特許第５，１６６，３１５号および米国特 許第５，１４２，０４７号中に見い出すことができる。 サブユニット間にチオエステルおよび他の硫黄結合を有するポリヌクレオチド は、とりわけ、ＳｃｈｎｅｉｄｅｒおよびＢｒｅｎｎｅｒ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒ ｏｎ Ｌｅｔｔ．，３１（３）：３３５−３３８（１９９０）、Ｈｕａｎｇら， Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，５６：３８６９−３８８２（１９９１）； ＭｕｓｉｃｋｉおよびＷｉｄｌａｎｓｋｉ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ ．，３２（１０）：１２６７−１２７０（１９９１）；ＨｕａｎｇおよびＷｉｄ ｌａｎｓｋｉ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，３３（１９）：２６５７ −２６６０（１９９２），およびＲｅｙｎｏｌｄら，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，５７ ：２９８３−２９８５（１９９２）、およびＰＣＴ公開ＷＯ９１／１５５０ ０に記載されている。 注目する他のポリヌクレオチドアナログはペプチド核酸（ＰＮＡ）および関連 ポリヌクレオチドアナログを含む。ペプチド核酸の製法および使用方法の記載は 、とりわけ、Ｂｕｃｈａｄｔら，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１１ （１９９３）およびＰＣＴ公開ＷＯ９３／１２１２９中に見い出すことができる 。 アンチセンス阻害で用いる他のオリゴマーは、Ｔｈｕｏｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎ ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８４：５１２９−５１３３（１９８７）、米国特 許第５，２１７，８６６号、Ｌａｍｏｎ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ ａｃｔｉｏｎ，２１：１−８（１９９３）（２’−Ｏ−アルキルオリゴリボヌク レオチド）、Ｏｎｏら，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃ ｈｅｍｉｓｔｒｙ，４：４９９−５０８（１９９３）（デオキシリボースの１’ −位にアミノリンカーを担持する２’−デオキシウリジンアナログ）、Ｋａｗａ ｓａｋｉら，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，３６：８３１−８４１（１９９３）（２ ’−デオキシ−２’−フルオロホスホロチオエートオリゴヌクレオチド）、ＰＣ Ｔ公開ＷＯ９３／２３５７０、Ａｕｇｕｓｔｙｎｓら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２１（２０）：４６７０−４６７６（１９９３）。 加えて、デュプレックスの安定性を増加させるおよび／または細胞摂取を増加 させるようにオリゴマーをさらに修飾することができる。かかる修飾の例は「配 列−特異的結合のためのアミドまたはカルバメート結合を含有するコンフォメー ション的に拘束されたオリゴマー」なる発明の名称のＰＣＴ公開ＷＯ９３／２４ ５０７、Ｎｉｅｌｓｅｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ,２５４：１４９７−１５００（１ ９９１）、「修飾されたヌクレオチド間結合」なる発明の名称のＰＣＴ公開ＷＯ ９２／０５１８６および、共に「新規結合を持つオリゴヌクレオチドアナログ」 なる発明の名称の１９９０年１０月２４日に出願されたＰＣＴ公開ＷＯ９１／０ ６６２９および１９９１年４月２４日に出願さ れた米国特許第５，２６４，５６２号、「偽ヌクレオシドおよび偽ヌクレオチド ならびにそれらのポリマー」なる発明の名称のＰＣＴ公開ＷＯ９１／１３０８０ 、「２’−修飾されたオリゴヌクレオチド」なる発明の名称のＰＣＴ公開ＷＯ９ １／０６５５６、「エキソヌクレアーゼ耐性オリゴヌクレオチドおよびその製法 」なる発明の名称の１９９０年６月５日に出願されたＷＯ９０／１５０６５、お よび米国特許第５，２５６，７７５号中に見い出すことができる。 本発明のオリゴマーは種々の核酸塩基よりなる。ＤＮＡまたはＲＮＡ、例えば 、シトシン、アデニン、グアニン、チミジン、ウラシル、およびヒポキサンチン において天然にあることが見い出されている核酸塩基に加えて、本発明のオリゴ マーは、天然に生じる酸塩基の合成アナログである１種以上の核酸塩基を含有し てもよい。かかる天然に生じない複素環塩基は、限定されるものではないが、ア ザおよびデアザピリミジンアナログ、アザおよびデアザプリンアナログならびに 他の複素環塩基アナログを含み、ここに、プリンおよびピリミジン環の１種以上 の炭素および窒素原子はヘテロ原子、例えば、酸素、硫黄、セレン、リン等によ って置換されている。好ましい塩基部位は、二 本鎖ポリヌクレオチドにおいて相補的鎖上の天然に生じる塩基との塩基対合構造 関係を維持するように二本鎖ポリヌクレオチドの１の鎖に取り込むことができる 塩基である。 本発明は、種々の免疫障害を治療する多くの方法を提供する。病気に言及して ここに使用する「治療」または「治療する」なる用語は、予防および個体に既に 存在する徴候の緩和の両方をいう。治療は病気の開始を妨げることにおいて、ま たは病気に伴う徴候を低下させることにおいて完全に効果的である必要はない。 徴候における重症度、徴候の開始の遅延、または徴候の重症度の進行の遅延のい ずれの低下も患者に望ましい。本発明の方法によって治療できる免疫障害は、Ｃ Ｄ２８発現Ｔ細胞が望ましくない特発性効果を媒介するまたはそれに寄与する病 気を含む。ＣＤ２８発現の阻害の結果、通常は活性化ＣＤ２８+Ｔ細胞によって 生成されるサイトカインの発現が低下され、かかるサイトカインはインターロイ キン−２、インターフェロン−ガンマ、およびインターロイキン−８を含む。従 って、本発明の方法は、限定されるものではないが、病因がインターロイキン− ２、インターフェロン−ガンマ、インターロイキン−８、またはその組合せを介 して媒介され、それによりＴ細胞媒介免 疫応答が妨げられまたは低下する病気を治療する方法を含む。主題のオリゴマー を患者に投与することによって治療され得る免疫応答の例は器官移植拒絶、敗血 症性ショック、腫瘍−誘導悪液質、および多数の自己免疫疾患を含む。主題の方 法によって治療され得る自己免疫病は、Ｉ型（インシュリン依存性）糖尿病、甲 状腺炎、類肉腫症、多発性硬化症、自己免疫ブドウ膜炎、潰瘍性結腸炎、形成不 全貧血、全身性紅斑性狼瘡、慢性関節リウマチ、寄生虫誘発炎症および肉芽腫、 クローン病、乾癬、多発性筋炎、皮膚筋炎、強皮症、脈管炎、乾癬性関節炎、グ ラベス病、重症筋無力症、自己免疫肝朋管病等を含めた異常Ｔ細胞活性化によっ て媒介される病気を含む。加えて、本発明の方法および組成物は、病因効果が少 なくとも部分的には活性化ＣＤ２８+Ｔ細胞から分泌されるリンホカインによっ て媒介される敗血症ショックおよび腫瘍−誘導悪液質を含めた種々の症候群の治 療を提供する。 本発明の病気治療方法は、有効量の主題のオリゴマーを患者に投与する工程よ りなる。患者に投与すべきＣＤ２８−特異的オリゴマーの正確な投与量、すなわ ち、有効量は、治療すべき具体的病気、治療組成物中の正確なオリゴマー（また は複数の オリゴマー）、患者の年齢および状態等のごとき多数の因子に従い変化するであ ろう。適当な試薬投与のためのプロトコルは当業者によく知られており、とりわ け、ＲｅｍｉｎｇｔｏｎのＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ（最 新版），Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐ ａ．等中に見い出すことができる。 患者にＣＤ２８標的化オリゴマーを直接投与することに加え、本発明では、Ｃ Ｄ２８+細胞（またはＣＤ２８を発現する可能性を有する細胞）を（他の細胞と 共にまたはそれを伴わずに）患者から取り出し、本発明の１種以上の異なるオリ ゴマーで形質転換する治療方法が考えられる。形質転換は当業者によく知られた 種々の手段、例えば、エレクトロポレーション、ＤＯＴＭＡまたはＤＯＳＰＡの ごときカチオン性脂質等のうちいずれかによるものであってよい。次いで、形質 転換した細胞を身体に再度導入することができる。 本発明のもう１つの態様は、ＣＤ２８−特異的オリゴマーを投与することによ って免疫疾患を治療する方法であり、ここに、該オリゴマーを組換えポリヌクレ オチド発現ベクターを介して細胞内で産生させる。細胞内で産生されたＣＤ２８ −特異的オ リゴマーは必ずしもＲＮＡまたはＤＮＡ分子ではない。注目するポリヌクレオチ ド配列の発現のための組換えポリヌクレオチドベクターは分子生物学分野の当業 者によく知られている。注目するポリヌクレオチドの発現のための組換えベクタ ーの詳細な記載は、とりわけ、「(体細胞遺伝子療法)Ｓｏｍａｔｉｃ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ」Ｐ．Ｌ．Ｃｈａｎｇ編，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒ ａｔｏｎ（１９９５），Ｒ．Ｃ．Ｍｕｌｌｉｇａｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６０： ９２９−９３２（１９９３），Ｆ．Ｗ．Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２ ５６ ：８０８−８７３（１９９２）、Ｃｕｌｖｅｒら，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈ ｅｒ．，２：１０７−１０９等中に見い出すことができる。遺伝子工学により免 疫障害を治療する主題の方法で用いる適当な組換えベクターは、Ｔ細胞のゲノム に組み込まれ得るものであるか、あるいはＴ細胞の細胞質で複製され得るものい ずれかである。細胞内投与で用いるＣＤ２８−特異的オリゴマーは、好ましくは 、細胞外投与のためのＣＤ２８−特異的オリゴマーよりもかなり長い。細胞内Ｃ Ｄ２８投与の主題の方法の好ましい具体例において、ＣＤ２８−特異的オリゴマ ーは１種以上の全ＣＤ２８転写体または全ＣＤ２８遺伝子に相補 的である；しかしながら、適当な細胞内で産生されるＣＤ２８−特異的オリゴマ ーは長さがかなり短いものであってよい。細胞外で投与されるＣＤ２８−特異的 オリゴマーとは異なり、ＣＤ２８−特異的オリゴマーは細胞内摂取または細胞外 酵素による加水分解に関する問題を提示しない。細胞内ＣＤ２８−特異的オリゴ マーを用いる主題の方法は、ＣＤ２８−特異的オリゴマーをコードする組換えベ クターを患者に直接投与することを含み得る。別法として、ＣＤ２８−特異的オ リゴマー産生ベクターは、患者から取り出した細胞（すなわち、体細胞、Ｔ細胞 、全血、骨髄等）に直接投与することもでき、それにより、形質転換細胞が産生 される。形質転換された細胞を引き続いて患者に再導入することができる。 また、本発明は、特に、本発明の１種以上のオリゴマーを発現できる発現ベク ターを提供する。一般に、かかる発現ベクターは、作動可能な組合せにて、プロ モーターおよびＴ細胞でＣＤ２８の発現を阻害できるオリゴマーをコードするポ リヌクレオチド配列よりなる。多くの異なるプロモーターを本発明のベクターで 用いることができるが、好ましいプロモーターはＴ細胞で高レベル発現を誘導で きるものである。現在利用できる発 現ベクター、特に、遺伝子治療用に明示的に設計されたベクターは、本発明のＣ Ｄ２８−標的化オリゴマーの発現に容易に適合できる。該ベクターは、Ｓａｍｂ ｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ,第２版,Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉ ｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ ，Ｙ，（１９８９）に記載されているもののごとき通常の遺伝子工学を用いてＣ Ｄ２８−標的化オリゴマーの発現に適合させることができる。 本発明のもう１つの態様は、免疫系媒介病の治療行うための本発明のオリゴマ ーの投与用の医薬処方を提供するものである。これらの医薬処方は医薬科学の分 野の当業者によって容易に生産できる。かかる処方は１種以上の本発明のオリゴ マーよりなる；しかしながら、１種を超える異なるタイプのオリゴマーよりなる 本発明の具体例において、該オリゴマーは好ましくは相互にハイブリダイズでき ないように選択される。本発明の医薬処方は、経口、静脈内、筋肉内、腹腔内、 局所投与等を含めた、選択された投与方法に適した多数の方法で身体に投与する のに適合できる。１種以上の本発明の異なるオリゴマーを含むことに加えて、主 題の医薬処方は１種以上の生物学的に活性でない 化合物、すなわち、（長期保存を促進するための）安定化剤、乳化剤、結合剤、 粘稠化剤、塩、防腐剤等のごとき賦形剤を含むこともできる。 非経口投与のための処方は、緩衝液、希釈剤、および他の適当な添加剤を含有 し得る滅菌水性溶液を含むことができる。本発明の医薬処方は、組成物中のオリ ゴマーの細胞摂取を促進するように設計でき、例えば、オリゴマーを適当なリポ ソーム中にカプセル化することができる。 局所投与のための医薬処方は、局所治療に特に有用である。局所治療用の処方 は、軟膏、スプレイ、ゲル、懸濁液、ローション、クリーム等を含む。局所投与 用の処方は、主題のオリゴマー以外に、イソプロパノール、グリセロール、パラ フィン、ステアリルアルコール、ポリエチレングリコール等のごとき公知の担体 物質を含むことができる。医薬上許容される担体は公知の化学吸収促進剤を含む こともできる。吸収促進剤の例は、例えば、ジメチルアセトアミドである（米国 特許第３，４７２，９３１号）、トリクロロ−エタノールまたはトリフルオロエ タノール（米国特許第３，８９１，７５７号）、ある種のアルコール、その混合 物（英国特許第１，００１，９４９号）、およ び英国特許出願第１，４６４，９７５号）。 主題のオリゴマーの治療的使用に加えて、オリゴマーはＴ細胞活性化の研究用 の分析研究所の手段としても使用できる。Ｔ細胞はＣＤ２８および抗原特異的Ｔ 細胞受容体以外にいくつかの表面受容体を有する。複数受容体媒介経路の間の可 能なおよび現実の相互作用のために、選択された受容体の個々の生物学的特性の 研究で困難が持ち上がる。Ｔ細胞におけるＣＤ２８発現を減少させるメカニズム を提供することによって、本発明のオリゴマーおよび方法は、ＣＤ２８活性化経 路とは独立してＴ細胞挙動を研究するための有用な研究室的方法を提供する。 本発明は以下の実施例を参照することによってよく理解できる。以下の実施例 は本発明を説明する目的で供したものであって、本発明の制限と解釈されるべき ではない。ＶＩ．実施例−シリーズ１ オリゴヌクレオチド オリゴヌクレオチドは標準的にホスホルアミダイト化学を用いて自動ＤＮＡ合 成器（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓモデル３９４）で合成した。β− シアノエチルホスホルアミダイト、合成試薬およびＣＰＧポリステレンカラムは Ａｐｐｌ ｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（ＡＢＩ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）から 購入した。３’−ＡｍｉｎｏＭｏｄｉｆｉｅｒ Ｃ３ ＣＰＧカラムはＧｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｓｔｅｒｌｉｎｇ，ＶＡ）から購入した。ホスホロチオエ ートオリゴヌクレオチドについては、標準的な酸化ボトルをテトラエチルチウラ ムジスルフィド／アセトニトリルで置き換え、標準ＡＢＩホスホロチオエートプ ログラムをホスホロチオエート結合の段階的付加で用いた。制御された孔のガラ スカラムからの切断の後、５５℃にて濃水酸化アンモニウムでオリゴヌクレオチ ドを８時間処理することによって保護基を取り除いた。オリゴヌクレオチドを、 逆相ｓｅｍｉｐｒｅｐＣ８カラム（ＡＢＩ）を用いるＨＰＬＣによって精製した 。ＤＭＴ保護基の切断、８０％酢酸での処理およびエタノール沈殿に続き、生成 物の精製を分析用Ｃ１８カラム（Ｂｅｃｋｍａｎ，Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，ＣＡ） を用いるＨＰＬＣによってアッセイした。＞９０％純度の全てのオリゴヌクレオ チドを凍結乾燥して乾固させた。オリゴヌクレオチドを滅菌脱イオン水（ＩＣＮ 、Ｃｏｓｔａ Ｍｅｓａ）中で復元し、ＣＤ２６０ｎｍの評価に続いて４００μ Ｍに調整し、アリコットを採取し、実験に先立って−２０℃で保 存した。全ての場合において、少なくとも３バッチの表１にリストした各オリゴ ヌクレオチドを用いた。 細胞系およびＴ細胞精製 健康なドナーからの６０ｍｌ血液のフィコール−ハイパック密度勾配遠心によ り、末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）をバフィコートから単離した。次いで、Ｔ− 細胞に特異的なＬｙｍｐｈｏｋｗｉｋリンパ球単離試薬（ＬＫ−２５Ｔ、Ｏｎｅ Ｌａｍｂｄａ，Ｃａｎｏｇａ Ｐａｒｋ，ＣＡ）を用いてＴ−細胞をＰＢＭＣ から精製した。次いで、平均量４０−６０×１０6Ｔ−細胞を、３７℃にて、２ ０−３０ｍｌＲＰＭＩ−ＡＰ５（２０μＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ７．４、５ ％自己血漿、０．０５％２−メルカプトエタノールを含有するＲＰＭＩ−１６４ ０培地（ＩＣＮ、Ｃｏｓｔａ Ｍｅｓａ，ＣＡ）中で一晩インキュベートして、 いずれの汚染接着性細胞も除去した。全ての実験において、Ｔ−細胞をＲＰＭＩ −ＡＰ５で洗浄し、次いで、２−３×１０6細胞／ｍｌの細胞濃度にて９６−ウ ェルマイクロタイタープレート上で平板培養した。 Ｔ−細胞リンパ腫細胞系、Ｊｕｒｋａｔ Ｅ６−１（ＣＤ２８＋／ＣＤ４＋） 細胞（１５２−ＴＩＢ）およびＨＵＴ７８（ＣＤ２８−／ＣＤ４＋）細胞（ＴＩ Ｂ−１６１）（ＡＴＣＣ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）をＲＰＭＩ−１０（２０ μＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ７．４、１０％胎児ウシ血清（ＦＣＳ）（Ｈｙｃ ｌｏｎｅ，Ｌｏｇａｎ，ＵＴ）、１％Ｌ−グルタミンおよび１％ペニシリン／ス トレプトマイシンを含有するＲＰＭＩ−１６４０培地）中で維持した。 マイトジェン−誘導Ｔ−細胞活性化およびオリゴヌクレオチド処理 ヒト末梢Ｔ−細胞リンパ腫細胞系（０．２−０．３×１０6）の添加に先立ち 、二連の９６−ウェルマイクロタイタープレートを精製抗−ＣＤ３モノクローナ ル抗体（ｍＡｂ）（６．２５−２００ｎｇ／ウェル）（Ｃｌｏｎｅ ＨＩＴ ３ ａ，Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）でプレコートし、冷リ ン酸緩衝化生理食塩水、ｐＨ７．４（ＰＢＳ）で２回洗浄した。抗−ＣＤ３ ｍ Ａｂ−処理Ｔ−細胞を２ｎｇフォルボール１２−ミリステート１３−アセテート （ＰＭＡ）（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）の添加によって さら に活性化し、３７℃で４８時間インキュベートした。活性化の直後に抗−ＣＤ３ ／ＰＭＡ−活性化Ｔ−細胞を１−２０μＭＣＤ２８−特異的および対照オリゴヌ クレオチドで処理し、２４時間後に再処理した。二連プレートのうちの１つを免 疫蛍光分析に用い、上清をサイトカイン実験で用い、第２のプレートをＴ−細胞 増殖分析で用いた。 免疫蛍光実験 活性化に続き、第１二連マイクロプレートからの１５０ｍｌの上清を細胞誘導 サイトカイン産生の分析のためのもう１つのマイクロプレートに移した。残存す る細胞を等張生理食塩水、ｐＨ７．４（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｍ ａｎｓｆｉｅｌｄ，ＭＡ）で２回洗浄し、５０ｍｌの等張生理食塩水に再懸濁し 、２つの試料に分けた。１の試料のアリコットをＰＥ−ＣＤ２８／ＦＩＴＣ−Ｃ Ｄ４またはＰＥ−ＣＤ５４／ＦＩＴＣ−ＣＤ２５ｍＡｂで共染色し、第２のアリ コットをＰＥ／ＦＩＴＣ−標識イソタイプ−対合対照モノクローナル抗体で染色 することによって非特異的蛍光を評価した。全ての蛍光−標識モノクローナル抗 体はＢｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ（Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）から入手し た。飽和ｍＡｂ濃度を用い、 ４℃で４５分間インキュベーションを行った。ＦＡＣＳｓｃａｎフローサイトメ トリー（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）での分析に先立ち、ＰＢＳ中で洗 浄することによって取り込まれなかった標識を除去した。抗原密度はゲートした 生細胞で間接的に測定し、蛍光の平均チャンネル（ＭＣＦ）として表した。特異 的抗原（ＣＤ５４、ＣＤ２５）の表面発現は、ＦＩＴＣ−またはＰＥ−標識抗原 −特異的ｍＡｂ染色細胞のＭＣＦからＦＩＴＣ−またはＰＥ−標識イソタイプ− 対合（ＩｇＧ１）対照ｍＡｂ−染色細胞のＭＣＦを差し引くことによって得られ た平均チャンネルシフト（ＭＣＳ）として表した。別法として、ＣＤ２８ｍＡｂ で染色した細胞のＣＤ４+−サブセットの表面発現は、ＣＤ２８−ＣＤ４−細胞 のＭＣＦからＣＤ２８+ＣＤ４+のＭＣＦを差し引くことによって決定した、対照 未処理およびオリゴヌクレオチド一処理細胞の生存率は、バイタル（ｖｉｔａｌ ）染料、ヨウ化プロピジウム（５μｇ／ｍｌ最終濃度）で染色することによって 、複数ドナーにおける全てのオリゴヌクレオチドの各バツチで決定した。ヨウ化 プロピジウムを除去した生細胞のパーセントを、１−２０μＭの用量範囲におけ る全てのオリゴヌクレオチドの全てのバッチでの処理の 後にフローサイトメトリーによって求め、＞９０％（範囲９０−９９％）であっ た。 サイトカイン分析 細胞誘導ヒトサイトカイン濃度は最初の二連マイクロプレートからの上清で測 定した。インターロイキン−２（ＩＬ−２）レベルにおけるマイトジェンー誘導 変化は、商業的に入手可能なＥＬＩＳＡキット（Ｒ ＆ Ｄ ｓｙｓｔｅｍ Ｑ ｕａｎｔｉｋｉｎｅキット、ミネアポリス、ＭＮ）を用いるか、あるいはＩＬ− ２−依存性細胞系、ＣＴＬＬ−２（ＡＴＣＣ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）を用 いるバイオアッセイによって測定した。インターフェロン−ガンマおよびインタ ーロイキン−８(ＩＬ−８)におけるマイトジェン一誘導変化は、各々、Ｅｎｄｏ ｇｅｎ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）およびＲ ＆ Ｄ ｓｙｓｔｅｍ（Ｑｕａ ｎｔｉｋｉｎｅキット，ミネアポリス，ＭＮ）からのキットを用いるＥＬＩＳＡ によって測定した。全てのＥＬＩＳＡ結果は、ｐｇ／ｍｌとして表し、ＣＴＬＬ −２バイオアッセイは１分当たりのカウントとして表し、これはＣＴＬＬ−２細 胞による3Ｈ−チミジン（ＩＣＮ、Ｃｏｓｔａ Ｍｅｓａ，ＣＡ）のＩＬ−２依 存性の細胞取り込みを表す。Ｔ−細胞増殖アッセイ 全ての実験における第２の二連マイクロプレートをマイトジェン−誘導Ｔ−細 胞増殖の変化につき分析した。抗−ＣＤ３／ＰＭＡ活性化に続き、オリゴヌクレ オチドの不存在下および存在下で、細胞を１μＣｉ Ｈ−チミジン（ＩＣＮ，Ｃ ｏｓｔａ Ｍｅｓａ，ＣＡ）でパルスし、３７℃で一晩インキュベートした。放 射性標識の取り込みによって評価したマイトジェン−誘導細胞増殖は、細胞を収 穫し、Ｗａｌｌａｃ Ｂｅｔａｐｌａｔｅカウンター（Ｗａｌｌａｃ，Ｇａｉｔ ｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）でシンチレーション計数することによって測定した。 ＣＤ２８−特異的オリゴヌクレオチドによる活性化ヒトＴ−細胞におけるＣＤ ２８発現の阻害 ヒトＴ−細胞の抗−ＣＤ３／ＰＭＡ処理は、（免疫蛍光分析を用いる）ＣＤ２ ８の表面発現を休止Ｔ−細胞における１２２±７．７４のＭＣＳから、１５０± ９．２７のＭＣＳに増加させた（ｎ＝９）。休止および活性化Ｔ−細胞における ＣＤ２８発現の差異はマイトジェン−誘導ＣＤ２８発現として定義される（図３ Ａ）。図３Ｂおよび３Ｃは、２のドナーにおけるＣＤ２８−特異的および対照オ リゴヌクレオチドのホスホロチオエ ート（Ｓ−オリゴマーと示す、図３Ｂ）およびホスホロチオエート−３’アミン （Ａ−オリゴマーと示す、図３Ｃ）形態での、および２の別々のバッチの各オリ ゴマーでの抗−ＣＤ３／ＰＭＡ−活性化Ｔ−細胞の処理を示す。２−１０μＭの 用量範囲において、４つの候補オリゴヌクレオチド、ＲＴ０１−ＲＴ０４（表１ ）のうち、ＲＴ０３およびＲＴ０４からのホスホロチオエートおよびホスホロチ オエート３’アミンの両形態はマイトジェン−誘導ＣＤ２８発現の最も活性な阻 害剤であり、共に５μＭ以下において５０％（ＩＣ50）を越えて誘導ＣＤ２８発 現を阻害した。長さが異なるこれらの２のオリゴヌクレオチドは、ＣＤ２８遺伝 子の転写開始部位の５’側上流の二本鎖ＤＮＡのストレッチとハイブリダイズす るように設計した。対照オリゴヌクレオチドＲＴＣ０１（配列番号：５）−ＲＴ ＣＯ６（配列番号：１０）（表１）では、マイトジェン−誘導ＣＤ２８発現の同 様の用量−依存性阻害は観察されなかった。全ての実験は、７のドナーからのＴ −細胞を用いて少なくとも３バッチの各オリゴヌクレオチドで行った。ＣＤ２８ 発現のオリゴヌクレオチド調節がヒトＴ−細胞で示され得るという事実は非常に 重要である。何故ならば、末梢、表皮および皮膚Ｔ−リンパ球が ＣＤ２８−特異的オリゴヌクレオチドの意図した標的だからである。 ＣＤ２８−特異的オリゴヌクレオチドによるマイトジェン−誘導Ｔ−細胞増殖 の阻害 抗−ＣＤ３／ＰＭＡ処理の分裂促進効果は、休止Ｔ−細胞の活性化後に観察さ れる増大した増殖によって示すことができる。１分当たりのカウントとして表さ れる3Ｈ−チミジンの取り込みは、活性化Ｔ−細胞では３０１６４１±４７８５ ６（ｎ＝９）、休止Ｔ−細胞では６５０±５６６（ｎ＝９）であった。Ｔ−細胞 増殖に対する抗−ＣＤ３およびＰＭＡの効果は図４Ａに示すごとく相乗的であっ た。図４Ｂは、抗−ＣＤ３／ＰＭＡ−活性化Ｔ−細胞増殖に対するＣＤ２８−特 異的および対照ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの効果の代表的実験を示 す。全て２−１０μＭの用量範囲における少なくとも７つの別々の実験において 、ＲＴ０３およびＲＴ０４のホスホロチオエート(データ示さず)およびホスホロ チオエート−３’アミン（図４Ｂ）両形態はマイトジェン−誘導Ｔ−細胞増殖の 最も活性な阻害剤であり、４５％までＴ−細胞増殖を阻害する。対照オリゴヌク レオチド、ＲＴＣ０１（配列番号：６）−ＲＴＣ０６（配列番 号：１０）では、マイトジェン−誘導Ｔ−細胞増殖の同様の用量−依存性阻害は 観察されなかった。ここに、ＣＤ２８−特異的オリゴヌクレオチド、ＲＴ０３お よびＲＴ０４での処理は、活性化Ｔ−細胞の過剰増殖を逆行させることができ、 かくして、ＣＤ２８経路の調節はＴ−細胞活性化、Ｔ−細胞増殖の１の非常に重 要な生物学的機能に対して有意な効果を有することを示した。 ＣＤ２８−特異的オリゴヌクレオチドによる活性化Ｔ−細胞誘導サイトカイン 産生の阻害 活性化Ｔ−細胞はＩＬ−２、インターフェロン−ガンマおよびＩＬ−８を含め た種々の免疫調節サイトカインを産生する。ＴＬ−２およびＩＬ−８に対するＣ Ｄ２８−誘導制限要素は両遺伝子につきプロモーター配列にあることが示され、 続いてＣＤ２８経路によって調節されていることが示されている（Ｆｒａｓｅｒ ら，（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５１：３１３−３１６，Ｓｅｄｅｒら，（ １９９４）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７９：２９９−３０４）。インターフェロン −ガンマもＣＤ２８経路によって調節されることが示されている（Ｗｅｃｈｓｌ ｅｒら，Ｊ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５３：２５１５−２５２３（１ ９９４））。休止Ｔ−細胞の抗−ＣＤ３／ＰＭＡ処理は全ての３つのサイトカイ ンのＴ−細胞−誘導レベルを劇的に増加させた（図５Ａ、６Ａおよび７Ａ）。図 ５、６および７は、各々、同一の代表的なドナーからの活性化Ｔ−細胞における 、ＩＬ−２、インターフェロン−ガンマ、およびＩＬ−８産生に対するＣＤ２８ −特異的および対照オリゴヌクレオチドのホスホロチオエート（Ｂ）およびホス ホロチオエート３’アミン（Ｃ）バージョンの効果を示す。ＣＤ２８−特異的オ リゴヌクレオチドＲＴ０３（配列番号：３）およびＲＴ０４（配列番号：４）は 活性化Ｔ−細胞においてマイトジェン−誘導ＩＬ−２、インタ−フェロン−ガン マ、およびＩＬ−８産生を用量依存的に阻害したが、対照オリゴヌクレオチド、 ＲＴＣ０１（配列番号：５）−ＲＴＣ０６（配列番号：１０）（データは示さず ）は阻害しなかった。ＣＤ２８−特異的オリゴヌクレオチドのホスホロチオエー ト（ＩＣ50５μＭ）およびホスホロチオエート−３’アミン（ＩＣ50１０μＭ） 両形態は２−１０μＭの用量範囲で同等に活性であった。全ての３つサイトカイ ンについての同様の結果が、４以上の異なるドナーで観察された。これらの観察 は、ＣＤ２８−特異的オリゴヌクレオチドもＴ−細胞のＣＤ２ ８経路の複数のエフェクター分子を調節できることを示す。 ＣＤ２８発現のオリゴヌクレオチド阻害の特異性 ＣＤ２８−特異的オリゴヌクレオチド、ＲＴ０３およびＲＴ０４の特異性を３ つの方法によって評価した。 （１）ＣＤ２８−非依存的Ｔ−細胞活性化マーカー 第１の方法は、これらのＣＤ２８−特異的オリゴヌクレオチドが、ＣＤ２８共 刺激経路とは独立して作用するヒトＴ−細胞活性化マーカー以外の発現を阻害で きるか否かを判断するものであった。休止Ｔ−細胞の活性化は、ＩＬ−２受容体 （ＣＤ２５）、および細胞内接着性分子ＩＣＡＭ−１（ＣＤ５４）の両者の発現 を有意に増加させる。しかしながら、これらの両アクセサリー分子はＣＤ２８経 路とは独立して調節される（Ｊｕｎｅら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，７： ４４７２−４４８１（１９８７），Ｄａｍｌｅら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４ ９ ：２５４１（１９９２））。図８は、マイトジェン−活性化Ｔ−細胞における ＣＤ２５（図８Ａ）およびＣＤ５４（図８Ｂ）に対するＣＤ２８−特異的および 対照オリゴヌクレオチドの効果を示す。２−１０μＭの用量範囲の全てのＣＤ２ ８−特異的および対照オリゴヌクレオチドでの処理の後に、ＣＤ２５およ びＣＤ５４両者の活性化Ｔ−細胞発現において有意な減少は観察されなかった。 これは、それらの標的蛋白質の発現を阻害するにおけるＣＤ２８−特異的オリゴ ヌクレオチドの特異性を明らかに示す。 （２）ＣＤ２８−陰性Ｔ−細胞系、ＨＵＴ７８ 第２の方法は、ＣＤ２８＋、Ｔ−細胞白血病細胞系、Ｊｕｒｋａｔ Ｅ６−１ およびＣＤ２８−、Ｔ−細胞白血病細胞系、ＨＵＴ７８におけるマイトジェン− 誘導ＩＬ−２産生を比較することによって、−ＣＤ２８経路は実際にＣＤ２８− 特異的オリゴヌクレオチドに対する標的であることを示すものであった。図９Ａ は、ＣＤ２８の構成的レベルはＪｕｒｋａｔ Ｅ６−１細胞において活性化に際 して増加する（図９Ｂ）が、休止および活性化ＨＵＴ７８細胞両者ではＣＤ２８ 発現はないことを確認するものである。ＣＤ２８＋Ｊｕｒｋａｔ Ｅ６−１細胞 においては、ＣＤ２８−特異的であるが対照ではないオリゴヌクレオチドはマイ トジェン−誘導ＣＤ２８発現を阻害でき（図９Ｃ）、またマイトジェン−誘導Ｉ Ｌ−２産生を阻害できた（図１０Ｂ）。反対に、ＣＤ２８−ＨＵＴ ７８細胞に おいては、マイトジェン−誘導ＩＬ−２産生はＣＤ２８−特異的および対 照オリゴヌクレオチドによって影響されなかった（図１０Ａ）。これは、ＣＤ２ ８−調節ＩＬ−２産生のみを阻害するこれらのオリゴヌクレオチドの特異性を明 らかに示す。 （３）ＣＤ２８経路の特異的活性化 第３の方法は、マイトジェン単独でＴ−細胞を活性化するのに用いたものと同 一のプロトコルを用い、マイトジェン（抗−ＣＤ３／ＰＭＡ）と組み合わせて抗 −ＣＤ２８モノクローナル抗体を用いて、ＣＤ２８経路を介して休止Ｔ−細胞を 特異的に活性化するものであった。ＰＭＡまたは抗−ＣＤ３ｍＡｂと組み合わせ た抗−ＣＤ２８ｍＡｂは、従前には、休止Ｔ−細胞に対する共刺激シグナルを供 し、Ｔ−細胞増殖およびサイトカイン産生のＴＣＲ−依存性ではなくＣＤ２８− 依存性増加のみを促進することが示されている（Ｊｕｎｅら，（１９８７）Ｍｏ ｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，７：４４７２−４４８１）。対照オリゴヌクレオチ ドではなくＣＤ２８−特異的オリゴヌクレオチドのホスホロチオエートおよびホ スホロチオエート３’アミンバージョンは、抗−ＣＤ２８／マイトジェン−活性 化休止Ｔ−細胞におけるＩＬ−２、ＩＬ−８およびインターフェロン−ガンマ産 生のＣＤ２８−依存性活性化およびＴ−細胞増殖を 阻害できた（データは示さず）。これは、ＣＤ２８−特異的オリゴヌクレオチド がＴ−細胞活性化のＣＤ２８経路に対してのみ作用することを明らかに示す。 ＶＩＩ．実施例−シリーズ２ オリゴヌクレオチド オリゴヌクレオチドはＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ３９４ ＤＮ Ａ合成器で合成した。ホスホロチオエート結合は、標準的な酸化ボトルをテトラ エチルチウラムジスルフイド／アセトニトリルで置き換えた後に導入した。オリ ゴヌクレオチドの純度は分析ＨＰＬＣによって評価した。＞９０％純度の全ての オリゴヌクレオチドを凍結乾燥して乾固させ、水中で復元した（４００μＭ）。 表３および５にリストした少なくとも３バッチの各オリゴマーを用いた。オリゴ ヌクレオチドの５’標識はＴ４ポリヌクレオチドキナーゼおよび32Ｐ−γＡＴＰ を用いて達成された。 Ｔ細胞活性化実験 密度勾配遠心、続いてのＬｙｍｐｈｏｋｗｉｔ（Ｏｎｅ Ｌａｍｂｄａ）を用 いるＴ細胞富化によって、末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）を健康なドナーから単 離した。汚染単球をプラス チックへの接着によって除去した。精製Ｔ細胞は、＞９９％ＣＤ２+、＜１％Ｈ ＬＡ−ＤＲ+および＜５％ＣＤ２５+であった。 Ｊａｒｋａｔ Ｅ６−１（ＣＤ２８+／ＣＤ４+）Ｔ細胞およびＨＵＴ ７８（Ｃ Ｄ２８-／ＣＤ４+）Ｔ細胞、および単球細胞系ＴＨＰはＡＴＣＣから入手した。 細胞は０．２−０．３×１０6／ウェルの濃度で培養し、プレート−固定化抗− ＣＤ３モノクローナル抗体（ｍＡｂ）（ＨＩＴ３Ａ ０．２５μｇ／ｍｌ）（Ｐ ｈａｒｍｉｎｇｅｎ）および２ｎｇフォルボール１２−ミリステート１３−アセ テート（ＰＭＡ）（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）で活性化した。 免疫蛍光実験 細胞をＰＥ−ＣＤ２８／ＦＩＴＣ−ＣＤ４またはＰＥ−ＣＤ５４／ＦＩＴＣ− ＣＤ２５ｍＡｂいずれかあるいはＰＥ／ＦＩＴＣ−標識イソタイプ−対合対照（ Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で共染色した。細胞表面抗原密度（ＣＤ２ ８、ＣＤ５４、ＣＤ２５）はフローサイトメトリー（ＦＡＣＳｃａｎ，Ｂｅｃｔ ｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）によって確認した。生存率は、複数ドナーからの対 照未処理およびオリゴ−処理ＣＤ４+細胞において、ヨウ化プロピジウム（５μ ｇ／ｍｌ）を除去 して評価し、全てのオリゴヌクレオチドの１−１０μＭの各バッチとの４８イン キュベーション後に、典型的には、＞９０％（範囲９０−９９％）であった。 増殖およびサイトカインアッセイ 増殖応答は各アッセイの最後の１６時間での3Ｈ−チミジン（１μＣｉ，ＩＣ Ｎ）取り込みを測定することによって評価した。細胞をフィルター上に収穫し、 ＤＮＡ合成をＷａｌｌａｃ Ｂｅｔａｐｌａｔｅカウンターでシンチレーション 計数することによって測定した。培養上清中のサイトカイン濃度は、ＩＬ−２、 ＩＬ−８（Ｒ ＆ Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ）およびＩＦＮ−γ（Ｅｎｄｏｇｅｎ）の ＥＬＩＳＡキットを用いるか、あるいはＩＬ−２−依存性細胞系ＣＴＬＬ−２（ ＡＴＣＣ）を用いるバイオアッセイによってアッセイした。 ＲＴ−ＰＣＲおよびサザーン分析 全細胞ＲＮＡはＴｒｉｚｏｌ試薬（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ）を用いて抽出した。 ｃＤＮＡ合成反応（Ｐｒｏｍｅｇａ）はオリゴマー（ｄＴ）15プライマーおよび ＡＭＶ逆転写酵素（Ｈ．Ｃ．）を用いて行った。ＰＣＲ反応（ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲキット、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ）は３μｌの ｃＤＮＡ、ｄＮＴＰ（各２００μＭ）、０．５μＭの各プライマーおよび１ユニ ットのＴａｑポリメラーゼを含有する５０μｌ混合物よりなるものであった。使 用したプライマーは以下のものであった：ＣＤ２８、５’−ＣＴＧＣＴＣＴＴＧ ＧＣＴＣＴＣＡＡＣＴＴ−３’（センス）および５’ＡＡＧＣＴＡＴＡＧＣＡＡ ＧＣＣＡＧＧＡＣ−３’（アンチセンス）、インターロイキン−２受容体ｐ５ ５アルファ鎖プライマー（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）およびｐＨＥ７リボソーム遺 伝子。Ｋａｏ，Ｈ．−Ｔ．，Ｎｅｖｉｎｓ，Ｊ．Ｒ．（１９８３）Ｍｏｌ．Ｃｅ ｌｌ．Ｂｉｏｌ．３，２０５８−２０６５。増幅条件は９４℃における４５秒間 、５７℃における１分間および７２℃における２分間の３５サイクル、続いての ７２℃における８分間であった。ＰＣＲ産物を２％アガロースで分離し、２０× ＳＳＣ中、一晩でＨｙｂｏｎｄ Ｎ＋膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ）に移し、０．４Ｍ ＮａＯＨを用いて固定化した。ブロットを32Ｐ−γＡＴＰ標識オリゴヌクレオ チドプローブでハイブリダイズさせた。次いで、洗浄したブロットをＰｈｏｓｐ ｈｏｒＩｍａｇｅｒを用いて分析した。ＭＣＲおよびアロ抗原−特異的Ｔ細胞アッセイ ＭＬＲ応答については、ＰＢＭＣをＨＬＡ−異種個人からのマイトマイシンＣ −処理（５０μｇ／ｍｌ）ＰＢＭＣと共に培養した（１：１）。アロ抗原−特異 的Ｔ細胞アッセイにおいて、破傷風毒素で感作した健康ドナーのＰＢＭＣから単 離したＴ細胞を、破傷風毒素（２μＭ／ｍｌ、Ｌｉｓｔ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｓ）の存在下で自己マイトマイシンＣ−処理ＰＢＭＣと共に培養した（１：１） 。両アッセイにおいて、２×１０ 細胞／ウェルをさらなる分析に先立って３７ ℃において６日間培養した。 イン・ビトロでのオリゴヌクレオチド安定性実験 一時的オリゴヌクレオチド安定性分析を従前に記載されているごとくに行った （Ｔａｍ，Ｒ．Ｃ．，Ｌｉ，Ｙ．，Ｎｏｏｎｂｅｒｇ，Ｓ．，Ｈｗａｎｇ，Ｄ． Ｇ．，Ｌｕｉ，Ｇ．，Ｈｕｎｔ，Ｃ．Ａ．，Ｇａｒｏｖｏｙ，Ｍ．Ｒ．（１９９ ４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２２，９７７−９８６）。オリゴ ヌクレオチド分解プロフィールは電気泳動によって評価し、Ｎｉｃｋｓｐｉｎカ ラムを用いて定量した。ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドによるＣＤ２８発現の阻害は特異的で あって、活性化Ｔ細胞機能に影響する。 図１１は、アクセサリー分子の表面発現に対する、および活性化Ｔ細胞におけ るサイトカイン分泌に対する表３からのホスホロチオエートオリゴヌクレオチド の効果を示す。使用したオリゴマーはＣＤ２８遺伝子の５’非翻訳領域にハイブ リダイズするように設計し、アンチセンス（ＡＳ）またはＧ−リッチ配列いずれ かであった。対照オリゴマーはセンス鎖（ＳＳ）または相補鎖（ＣＳ）配列いず れかであった。抗−ＣＤ３抗体およびＰＭＡでの休止Ｔ細胞（Ｒ）の４８時間処 理は、アクセサリー分子ＣＤ２８（Ａ）、ＣＤ２５（Ｂ）およびＣＤ５４（Ｃ） の、およびサイトカインＩＬ−２（Ｄ）、ＩＦＮγ（Ｅ）およびＩＬ−８（Ｆ） の発現（Ａｃ）を増加させた。データは、三連試料の平均標準偏差として表す。 活性化−誘導Ｔ細胞機能に対する表３からのホスホロチオエートの２μＭ（■） 、５μＭ の累積効果は、免疫蛍光分析（アクセサリー分子）によって、およびＣＴＬＬ− ２バイオアッセイ（ＩＬ−２）およびＥＬＩＳＡ（ＩＦＮγ、ＩＬ−８）を用い る分泌されたサイトカイン のレベルの測定によってモニターした。ゲートした生ＣＤ４+細胞における表面 抗原密度（ＭＣＳ）は、ＩｇＧ１対照と比較した蛍光の平均チャンネルの増加と して測定した。3Ｈ−チミジンのＩＬ−２−依存性細胞取り込みは、１分当たり のカウント（ｃｐｍ）として測定し、免疫反応性ＩＦＮγおよびＩＬ−８はｐｇ ／ｍｌとして表した。全て単一ドナーから単離したＴ細胞について行った実験か ら得られた、示したデータは９の別々のドナーからの実験を代表する。 データは、選択されたホスホロチオエートオリゴマー（表３）がＣＤ+４Ｔ細 胞における活性化−誘導ＣＤ２８発現を特異的 にブロックできることを示す。代表的なドナーにおいて（図１１Ａ）、活性化− 誘導ＣＤ２８発現はホスホロチオエートオリゴマーＲＴ０３Ｓ（配列番号：４４ ）およびＲＴ０４Ｓ（配列番号：４５）（ＩＣ50≦５μＭ）によって用量依存的 に阻害されたが、ＩＬ−２受容体（ＣＤ２５）または細胞内接着性分子−１（Ｉ ＣＡＭ−１またはＣＤ５４）発現はそうではなかった。アンチセンスオリゴマー ＲＴ０１Ｓ（配列番号：４２）またはＲＴ０２Ｓ（配列番号：４３）または対照 オリゴマーＲＴＣ０１Ｓ（配列番号：４６）、ＲＴＣ０２Ｓ（配列番号：４７） およびＲＴＣ０６Ｓ（配列番号：４８）では同様の阻害は観察されなかった。さ らに、本発明者らは、活性化ヒトＴ細胞において転写をブロックすることによっ て、活性オリゴマーが活性化−誘導ＣＤ２８を調節するという証拠を提供した。 １０μＭにおいて、代表的な対照オリゴＲＴＣ０６Ｓ（配列番号：４８）ではな く、ＲＴ０３Ｓ（配列番号：４４）およびＲＴ０４Ｓ（配列番号：４５）が、Ｉ Ｌ−２受容体ｍＲＮＡではなくＣＤ２８の活性化−誘導レベルの発現を低下させ た（図１２）。 図１２は、ＣＤ２８およびＣＤ２５ｍＲＮＡレベルに対する１０μＭにおける ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの効 果を示す。特異的放射性標識プローブを用い、全細胞ＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲおよ びサザーン分析の後に、オリゴヌクレオチドＲＴ０３Ｓ（配列番号：４４）（レ ーン４）、ＲＴＣ０６Ｓ（配列番号：６４）（レーン５）およびＲＴ０３Ｄ（配 列番号：４９）（レーン６）の存在下または不存在下（レーン２）において、Ｃ Ｄ２８およびＣＤ２５ｍＲＮＡの休止（レーン１）および抗−ＣＤ３／ＰＭＡ− 活性化（６時間）レベルを検出した。ＣＤ２８プローブはエクソン２（５’−Ａ ＣＧＧＧＧＴＴＣＡＡＣＴＧＴＧＡＴＧＧＧＡＡＡＴＴＧＧＧＣＡＡ−３’）か ら誘導され、ＩＬ−２受容体については、プローブは元のプライマーミックスか ら生成させた。ｐＨＥ７センスプライマーから生じたプローブとのハイブリダイ ゼーションに続いて、同等負荷を評価した。ＣＤ２８−欠乏ＨＵＴ（７）および ＴＨＰ（８）細胞系を対照として用いた。示したデータは３つの別々の実験を代 表するものである。 かくして、生物学的に活性なホスホロチオエートによる、ＣＤ２８ｍＲＮＡレ ベルの特異的阻害は、ＣＤ２８表面蛋白質に対する効果と平行していた。さらに 、活性オリゴマーは、ＲＴ０１Ｓ（配列番号：４２）またはＲＴ０２Ｓ（配列番 号：４３） あるいは対照オリゴマーＲＴＣ０１Ｓ（配列番号：４６）、ＲＴＣ０２Ｓ（配列 番号：４７）およびＲＴＣ０６Ｓ（配列番号：４８）ではなく、ＲＴ０３Ｓ（配 列番号：４４）およびＲＴ０４Ｓ（配列番号：４５）が、サイトカインＩＬ−２ 、ＩＦＮγおよびＩＬ−８の抗−ＣＤ３／ＰＭＡ−誘導合成を顕著に阻害した（ ＩＣ50≦５μＭ、範囲２−１０μＭ）（図１１Ｂ）ように、活性化一誘導Ｔ細胞 機能をなくさせた。 別の共刺激経路も活性化Ｔ細胞においてリンホカイン合成を誘導し得るので（ Ｄａｍｌｅ，Ｎ．Ｋ．，Ｋｌｕｓｓｍａｎ，Ｋ．，Ｌｉｎｓｌｅｙ，Ｐ．Ｓ．， Ａｒｕｆｆｏ，Ａ．（１９９２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４８，１９８５−１ ９９２）、ＲＴ０３Ｓ（配列番号：４４）およびＲＴＯ４Ｓ（配列番号：４５） の生物学的活性が機能的ＣＤ２８発現に対して特異的であるか否かを決定するの が重要であった。従って、本発明者らは、ＣＤ２８+（Ｔ細胞白血病細胞株Ｊｕ ｒｋａｔ Ｅ６−１）およびＣＤ２８-（Ｔ細胞リンパ腫細胞株ＨＵＴ７８）に おける抗−ＣＤ３／ＰＭＡ−誘導ＩＬ−２産生に対するホスホロチオエートの効 果を比較した。図１３にまとめるように、抗−ＣＤ３抗体およびＰＭＡでの休止 細胞（Ｒ）の４８時間処理は、 ＨＵＴ ７８（Ａ、左側）細胞ではなくＪｕｒｋａｔ（Ａ、右側）においてＣＤ ２８発現（Ａｃ）を増加させた。しかしながら、活性化は、Ｊｕｒｋａｔ（Ｃ、 左側）およびＨＵＴ ７８（Ｄ、左側）細胞におけるＩＬ−２産生を増加させた 。１μＭ いて、活性オリゴヌクレオチドＲＴ０３Ｓ（配列番号：４４）およびＲＴ０４Ｓ （配列番号：４５）は、活性化Ｊｕｒｋａｔ細胞でＣＤ２８発現（Ｂ）およびＩ Ｌ−２レベル（Ｃ、右側）を阻害したが、活性化ＨＵＴ ７８細胞（Ｄ、右側） においてＣＤ２８−非依存性ＩＬ−２分泌に対して効果を有しなかった。示した データは、３つの別々の実験を代表するものである。 図１３Ａにおいて、免疫フローサイトメトリー分析により、休止および活性化 ＨＵＴ ７８細胞双方におけるＣＤ２８発現の不存在が確認され、他方、Ｊｕｒ ｋａｔ Ｅ６−１細胞における活性化によりＣＤ２８の構成的レベルが増加した 。さらに、Ｊｕｒｋａｔ Ｅ６−１細胞において、ＲＴ０３Ｓ(配列番号：４４) およびＲＴ０４Ｓ（配列番号：４５）（範囲１−１０μＭ）は、活性化−誘導Ｃ Ｄ２８発現（図１３Ｂ）およびＩＬ−２産生(図１３Ｃ)を有意に阻害した。反対 に、活性化ＨＵＴ ７ ８細胞は同様レベルのＩＬ−２を産生したが、このリンホカインの匹敵するオリ ゴ−依存性阻害は観察されなかった（図１３Ｄ）。 また、本発明者らは、抗−ＣＤ３との組み合わせにより特異的抗−ＣＤ２８ｍ Ａｂによって指示されたＴ細胞活性化（ＣＤ２８、ＩＬ−２、ＩＬ−８およびＩ ＦＮγ）は、生物学的に活性なホスホロチオエートオリゴマーによってブロック されることを示した（データは示さず）。ＣＤ２８分子の直接的架橋はＴ細胞増 殖およびサイトカイン産生のＴＣＲ−依存性ではなくＣＤ２８−依存性の増加の みを促進することが従前に示されている（Ｊｕｎｅ，Ｃ．Ｈ．，ｌｅｄｂｅｔｔ ｅｒ，Ｊ．Ａ．，Ｇｉｌｌｅｓｐｉｅ，Ｍ．Ｍ．，Ｌｉｎｄｓｔｅｎ，Ｔ．，Ｔ ｈｏｍｐｓｏｎ，Ｃ．Ｂ．(１９８７)Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，７，４４ ７２−４４８１）。一緒に考え合わすと、本発明者らのデータは、活性オリゴマ ーの生物活性はＴ細胞活性化のＣＤ２８経路に対して特異的であることを強く示 唆する。 アロ抗原−依存性Ｔ細胞アッセイにおけるＴ細胞増殖応答の阻害およびホスホ ロチオエートオリゴヌクレオチドによる初代同種（ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ）混合 リンパ球反応 本発明者らは、次に、イン・ビトロにおける抗原−特異的一次免疫応答のブロ ックにおいて、ＣＤ２８−特異的オリゴヌクレオチドＲＴ０３Ｓ（配列番号：４ ４）およびＲＴ０４Ｓ（配列番号：４５）の効果を比較した。図１４に、ＣＤ２ ８の休止（Ａ、Ｂ）および活性化（Ｅ、Ｆ）レベルを破傷風毒素−特異的Ｔ細胞 アッセイ（頂部パネル、ＡおよびＢ）および混合リンパ球反応（底部パネル、Ｅ およびＦ）について示す。ＣＤ４+、ＣＤ２８−ｈｉＴ細胞のパーセントは、Ａ 、Ｂ、ＥおよびＦにつき右側の記号で示す。オリゴマー活性は、表１からの１μ Ｍ ホロチオエートオリゴヌクレオチドが各アッセイにおいてＣＤ２８−ｈｉ発現Ｔ 細胞（Ｃ、Ｇ）および活性化Ｔ細胞増殖（Ｄ、Ｈ）のパーセントを低下させる２ 回の添加（０および９６時間）の能力によって評価した。Ｔ細胞の活性化は、破 傷風毒素に応答して（頂部バネル）、またはマイトマイシン−Ｃ処理刺激剤ＰＢ ＭＣ（Ｙ）（底部パネル）による応答Ｔ細胞（Ｘ）の刺激の後に、誘導された。 これらのデータは３回の別々の実験を代表するものである。 図１４において、破傷風毒素−特異的Ｔ細胞アッセイ（図１ ４Ｂ）および初代混合リンパ球反応（図１４Ｆ）双方を用い、本発明者らは、ア ッセイ期間６日後において活性化−誘導ＣＤ２８−ｈｉ発現Ｔ細胞の亜集団の出 現を観察した。ＲＴ０３Ｓ（配列番号：４４）およびＲＴ０４Ｓ（配列番号：４ ５）（２−１０μＭ）の添加の結果、ＣＤ２８−ｈｉ発現が用量依存的に減少し （図１４Ｃ、１４Ｇ）、破傷風毒素−特異的（図１４Ｄ）なおよび応答細胞抗原 −特異的（図１４Ｈ）なＴ細胞増殖が対応して減少した。ＲＴ０１Ｓ（配列番号 ：４２）または対照オリゴマーＲＴＣ０１Ｓ（配列番号：４６）、ＲＴＣ０２Ｓ （配列番号：４７）またはＲＴＣ０６Ｓ（配列番号：４８）では同様の効果は観 察されなかった。 イン・ビトロのオリゴヌクレオチド安定性はホスホロチオエートオリゴヌクレ オチドの生物学的活性を延ばす。 ホスホロチオエートのヌクレオチド間結合でのオリゴマーの修飾はヌクレアー ゼ耐性を賦与し、かくして、イン・ビトロ生物活性を１−２時間から２４時間に 延ばし得ることが知られている（Ｓｔｅｉｎ，Ｃ．Ａ．，Ｃｈｅｎｇ，Ｙ．Ｃ． （１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６１，１００４−１０１２）。表４は、維続的 存在（Ｃ）または続いての第２日における細胞外媒質か らのオリゴヌクレオチドの除去における（Ｄ）、表面ＣＤ２８発現に対するホス ホロチオエートＲＴ０３Ｓ（配列番号：４４）およびＲＴＣ０６Ｓ（配列番号： ４８）の一時的効果を示す。モニタリングは免疫フローサイトメトリーによって 行った。結果は、活性化Ｔ細胞（ＭＣＦA）およびオリゴヌクレオチド−処理活 性化Ｔ細胞（ＭＣＦX）の表面抗原発現の差として表す。第２日ないし４日にお ける休止Ｔ細胞におけるＣＤ２８発現は範囲１１９−１２１であった。「ＮＤ」 は識別できる差がないことを表す。 表４に示すごとく、ＲＴ０３Ｓ（配列番号：４４）の効果の持続は、２４時間 を超え、オリゴマー用量に対して、第２日、第３日および第４日を通じて持続し た。しかしながら、ＲＴ０３Ｓ（配列番号：４４）の第２日における細胞外媒質 からの除去により、阻害活性は２４時間維持され、次いで、次の２４時間以内に 完全に消滅した。代表的な対照オリゴ、ＲＴＣ０６Ｓ（配列番号：４８）に関し ては、同一時間経過を通じて、オリゴマー活性は観察されなかった。活性化Ｔ細 胞増殖のオリゴー媒介阻害では同様の現象が観察された（データは示さず）。ホ スホロチオエート修飾によって供された生物学的利用性の増大だけではＲＴ０３ Ｓ（配列番号：４４）の顕著に延長された生物活性を説明できない。従って、本 発明者らは、延長された効果の持続は、ＲＴ０３Ｓ（配列番号：４４）の二次構 造によって供されるさらなるイン・ビトロ安定性と関連づけられることを示した 。 図１５に、細胞外上清（頂部パネル）およびＪｕｒｋａｔ細胞溶解物（底部パ ネル）における32Ｐ−標識ホスホロチオエートＲＴ０３Ｓ（配列番号：４４）お よびＲＴＣ０６Ｓ（配列番号：４８）のイン・ビトロ安定性に対するテスト結果 をまと める。（Ａ）各オリゴヌクレオチド（２０００ｃｐｍ）の時間−依存性分解（０ −９６時間）は、２０％ポリアクリルアミド変性ゲル上での電気泳動、続いての Ｐｈｏｓｐｈｏｌｍａｇｅｒを用いる可視化によって評価した。（Ｂ）時間ｔ＝ ０に対する、各時間の時点で残存する完全な全長32Ｐ−ＲＴ０３Ｓ（配列番号： ４４）（°）および32Ｐ−ＲＴＣ０６Ｓ（配列番号：４８）（・）のパーセント を、細胞外上清の１００００ｃｐｍおよび細胞溶解物からのＮｉｃｋｓｐｉｎカ ラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）溶出物で測定した。分子量標準（Ｓｔｄ）、 Ｐ− ｄＮＴＰ（Ｎ）および遊離32Ｐ−オルトホスフェート（Ｐ）を同時に分析した。 図１５Ａにおいて、電気泳動像は、細胞外上清（Ｓ）および細胞溶解物（Ｌ） 双方につき、Ｊｕｒｋａｔ細胞との９６時間のインキュベーション後に、ＲＴＣ ０６Ｓ（配列番号：４８）よりもかなり多い完全な32Ｐ−標識ＲＴ０３Ｓ（配列 番号：４４）が残存したことを、明らかに示している。Ｎｉｃｋｓｐｉｎカラム データはこの観察と一致する（図１５Ｂ）。ここで、９６時間後におけるＲＴ０ ３Ｓ（配列番号：４４）から回収された完全なオリゴマーは５４％（Ｓ）および ５９％（Ｌ）であ って、ＲＴＣ０６Ｓ（配列番号：４８）からのものは１０％(Ｓ)および３４％（ Ｌ）であった。加えて、二次構造単独では、そのホスホロジエステルカウンター パートＲＴ０３Ｄは、イン・ビトロ安定性実験からはほとんど生物学的活性を有 さず（表５）、２４時間の半減期を有したに過ぎなかった（データ示さず）から 、ＲＴ０３Ｓ（配列番号：４４）の増大したヌクレアーゼ耐性および生物学的活 性の持続を説明するのに十分ではない。 表５のデータの調製において、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドのイン ・ビトロ活性を、抗−ＣＤ３／ＰＭＡ−活性化末梢Ｔ−細胞におけるＣＤ２８発 現を阻害する能力、およびＪｕｒｋａｔＴ細胞における活性化ＩＬ−２産生に対 する能力によって決定した。結果は、７回の実験において阻害範囲がＣＤ２８発 現の５２−７９％であって、ＩＬ−２の生産の範囲が７６−８９％である５μＭ ＲＴ０３Ｓ（配列番号：４４）の活性（１００％）に対する相対値として表す 。ＲＴ０３Ｄ（配列番号：４９）のホスホジエステル形態についての値は括弧に 入れる。 イン・ビトロで生物学的活性を賦与する最小配列の同定 活性なホスホロチオエートＲＴ０３Ｓ（配列番号：４４）は、ヒトＣ２８遺伝 子の５’非翻訳領域にハイブリダイズするように元来設計された１８量体であり 、連続する４つのＧの２セットを含有する配列を有する。ヒトＴ細胞における活 性化−誘導ＣＤ２８発現およびＪｕｒｋａｔＴ細胞におけるＣＤ２８−依存性Ｉ Ｌ−２産生の阻害に対して決定的な配列関連因子を同定するために、塩基をＲＴ ０３Ｓにつき選択的に付加し、欠失させまたは置換し、親オリゴマーに対する相 対活性を評価した(表 ５)。５’末端における３個のＧの付加（ＲＴ０４Ｓ）または４個の両Ｇ配列（ ＲＴ０５Ｓ（配列番号：５１）、ＲＴ０９Ｓ（配列番号：５２））の間の領域で の１以上のＴのＡへの変化は、ＲＴ０３Ｓ（配列番号：４４）に対しての相対阻 害効果を低下させなかった。興味深いことに、センス配列（ＲＴ１１Ｓ（配列番 号：５０））は、ＲＴ０３Ｓ（配列番号：４４）に対しての相対活性の変化を示 さなかった。しかしながら、反対に、４個のＧ（ＲＴ１０Ｓ（配列番号：５３） 、ＲＴ２４Ｓ（配列番号：５４）、ＲＴ２５Ｓ（配列番号：５５）、ＲＴ２３Ｓ （配列番号：５６）（配列番号：５６））の両セット内の１以上のＧの欠失また はシトシン（Ｃ）による置換の結果、ＲＴ０３Ｓ（配列番号：４４）に対しての 相対活性が顕著に喪失した。ＲＴ０３Ｓ（配列番号：４４）における最初の４個 のＧの５’側の６個の残基の欠失は、オリゴヌクレオチド（ＲＴ１８Ｓ（配列番 号：５７））の阻害活性に対して効果を有しなかった。反対に、両４個Ｇ配列の 間の残基の減少（ＲＴ１９Ｓ（配列番号：５８））または増加（ＲＴ２０Ｓ（配 列番号：６１）、ＲＴ２１Ｓ（配列番号：６２））は、ＲＴ０３Ｓ（配列番号： ４４）に対する相対阻害活性を劇的に低下させた。ＴＧＧＧＧ， ＧＧＧＧまたはＲＴ１５Ｓ（配列番号：６３）のごとき４個の連続的Ｇを含有す る配列はＲＴ０３Ｓ（配列番号：４４）に対す相対阻害活性をほとんどまたは全 く有しなかった。これらのデータは、ＲＴ０３Ｓ（配列番号：４４）の生物学的 活性は、３−５個の残基によって離された４個の連続するＧの２セットよりなる 特異的配列モチーフに依存することを示す。 ＣＤ２８機能を破壊することによって付与された免疫寛容原性（Ｂｏｕｓｓｉ ｏｔｉｓ，Ｖ．Ａ．，Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｇ．Ｊ．，Ｇｒａｙ，Ｇ．，Ｇｒｉｂｂ ｅｎ，Ｊ．，Ｎａｄｌｅｒ，Ｌ．Ｍ．（１９９３）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７ ８，１７５３−１７６３）を考慮すると、ＣＤ２８発現のオリゴ−媒介阻害が、 イン・ビトロにおけるＴ細胞アネルギーおよびアロ抗原−特異的免疫寛容を誘導 するのにより効果的な戦略であり得るか否かを調べるのが重要であった。本発明 者らは、ホスホロチオエートオリゴマーＲＴ０３Ｓ（配列番号：４４）およびＲ Ｔ０４Ｓが、オリゴマー用量に対するｍＲＮＡおよび成熟蛋白質レベル双方を低 下させることによってヒトＣＤ４+Ｔ細胞において抗−ＣＤ３／ＰＭＡ−誘導Ｃ Ｄ２８発現を阻害したことを示した。さらに、標的特異性を示すために、本発明 者らは、Ｉ Ｌ−２受容体およびＩＣＡＭ−１発現に対するオリゴ−媒介効果：ＣＤ２８経路 とは独立して調節させることが知られている２つのアクセサリー分子（Ｄａｍｌ ｅ，Ｎ．Ｋ．ら，（１９９２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８，１９８５−１９９ ２；Ｊｕｎｅ，Ｃ．Ｈ．ら（１９８７）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．７，４４ ７２−４４８１；Ｓｔｅｉｎ，Ｃ．Ａ．ら，Ｙ．−Ｃ．（１９９３）Ｓｃｉｅｎ ｃｅ ２６１，１００４−１０１２；Ｂｏｕｓｓｉｏｔｉｓ，Ｖ．Ａ．ら，（１ ９９３）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７８，１７５３−１７６３）を調べた。対応し て、両活性化メッセージおよびＣＤ２５の蛋白質レベルおよびＣＤ５４の表面発 現はオリゴマー作用に対して耐性であった。 ＣＤ２８経路を介する共刺激は、活性化Ｔ細胞においてＩＬ−２、ＩＦＮγお よびＩＬ−８のごとき免疫調節サイトカインの発現を間接的に誘導する（Ｆｒａ ｓｅｒ，Ｊ．Ｄ．ら，（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５１，３１３−３１６ Ｊｅｎｋｉｎｓ，Ｍ．Ｋ．ら，（１９９１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７，２４ ６１−２４６６；Ｓｅｄｅｒ，Ｒ．Ａ．ら（１９９４）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１ ７９，２９９−３０４；Ｗｅｃｈｓｌｅｒ，Ａ．Ｓ．ら（１９９４）Ｊ．Ｉｍｍ ｕｎｏｌ．１５３， ２５１５−２５２３）。免疫寛容原性が成功するためには、活性ＣＤ２８−特異 的オリゴマーはこの機能を阻害しなければならない。活性オリゴマーの投与の結 果、活性化−誘導ＩＬ−２、ＩＦＮγおよびＩＬ−８産生が同時に調節された。 ＣＤ２８−依存性機能を阻害する活性オリゴマーの強烈な特異性を強調するため に、本発明者らは、それらがＣＤ２８−欠乏細胞系ＨＵＴ ７８において活性化 −誘導ＩＬ−２産生を妨げることができないことを示した。さらに、活性化Ｔ− 細胞におけるＩＬ−８産生の最大オリゴ−媒介阻害は５０％を決して超えず、こ れは、ＣＤ２８−非依存性ＩＬ−８産生を誘導する別の調節経路が保持されてい ることを示唆する。活性化−誘導ＣＤ２８レベルの阻害の結果、両ＭＬＲおよび 破傷風−毒素−特異的Ｔ細胞アッセイにおいてＴ細胞増殖が劇的に低下したので 、オリゴマー活性はポリクローナル的に活性化されたＴ細胞に制限されなかった 。かくして、本発明者らの活性オリゴマーは、イン・ビトロでアロ抗原−特異的 免疫寛容を媒介し、ＣＴＬＡ ４ Ｉｇ、高親和性Ｂ７バインダーで観察された ごときＴ細胞低応答性（Ｔａｎ，Ｐ．，Ａｎａｓｅｔｔｉ，Ｃ．，Ｈａｎｓｅｎ ，Ｊ．Ａ．，Ｍｅｌｒｏｓｅ，Ｊ．，Ｂｒｕｎｖａｎｄ，Ｍ．， Ｂｒａｄｓｈａｗ，Ｊ．，Ｌｅｄｂｅｔｔｅｒ，Ｊ．Ａ．，Ｌｉｎｓｌｅｙ，Ｐ ．Ｓ．（１９９３）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７７，１６５−１７３）を誘導す るためのリガンド捕獲戦略に対する有望な代替法を提供する。 活性ファルマコフォアの効果の持続を測定するにおいて、本発明者らは、ＲＴ ０３Ｓ（配列番号：４４）が驚くべきことにオリゴマー処理９６時間後において さえ、活性化ＣＤ２８発現およびＣＤ２８−依存性Ｔ細胞増殖双方の持続的阻害 を示したことを観察した。オリゴマーの除去により阻害活性の完全な逆行が２４ 時間以内に起こったので、生物活性は毒性に関連付けられなかった。さらに、ホ スホロチオエートＲＴ０３Ｓ（配列番号：４４）およびＲＴ０６Ｓ（配列番号： ４８）の比較により、本発明者らのイン・ビトロ安定性実験は、ＲＴ０３Ｓ（配 列番号：４４）におけるＧ−リッチ配列によって媒介された二次構造は、典型的 にはホスホロチオエートに関連したヌクレアーゼ活性を２−ないし４−倍増加さ せることを示した（Ｓｔｅｉｎ，Ｃ．Ａ．，Ｃｈｅｎｇ，Ｙ．Ｃ．（１９９３） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６１，１００４−１０１２）。32Ｐ−ＲＴ０３Ｓ（配列番号 ：４４）の延長された半減期はその生物活性の持続 と相関した。加えて、ＲＴＯ３Ｄ（ＲＴ０３Ｓ（配列番号：４４）のホスホジエ ステルカウンターパート）は、イン・ビトロ安定性および生物活性が共に低下し 、従前の報告（Ｍａｌｔｅｓｅ，Ｊ．−Ｙ．，Ｓｈａｒｍａ，Ｈ．Ｗ．，Ｖａｓ ｓｉｌｅｖ，Ｌ．，Ｎａｒａｙａｎａｎ，Ｒ．（１９９５）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａ ｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２３，１１４６−１１５１）と合致する観察であった。従っ て、二次構造によって付与される安定性は単にＲＴ０３Ｓ（配列番号：４４）の 生物活性の増大の原因であるというのではない。かくして、ホスホロチオエート 修飾および二次構造双方によって付与されたヌクレアーゼ安定性はＲＴ０３Ｓ（ 配列番号：４４）の延長された阻害活性を説明できる。 ハイブリダイゼーション−依存性アンチセンスおよびアンチジーンモデルにお ける単一塩基対置換は実質的に活性を低下させることができる（Ｍａｌｔｅｓｅ ，Ｊ．−Ｙ．，Ｓｈａｒｍａ，Ｈ．Ｗ．，Ｖａｓｓｉｌｅｖ，Ｌ．，Ｎａｒａｙ ａｎａｎ，Ｒ．（１９９５）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２３，１ １４６−１１５１）。反対に、ＣＤ２８−特異的オリゴマーの活性は、４個のＧ の両セット内で引き続いての置換が起 きたときだけに劇的に減少し、オリゴマー機能に対する規定された構造要件を示 唆した。加えて、ＲＴ０３Ｓ（配列番号：４４）に存在する二次構造のカチオン 安定化（１００ｍＭ ＫＣｌおよびＮａＣｌ）後の、オリゴマー融解曲線はＧ− カルテット形成を示唆する（Ｈａｒｄｉｎ，Ｃ．Ｃ．，Ｗａｔｓｏｎ，Ｔ．，Ｃ ｏｒｒｅｇａｎ，Ｍ．，Ｂａｉｌｅｙ，Ｃ．（１９９２）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔ ｒｙ ３１，３３３−８４１）転移プロフィールを示した（データは示さず）。 考え合わすと、本発明者のデータは、このクラスのＣＤ２８−特異的オリゴマー はハイブリダイゼーション−非依存性メカニズムを介して作用していて、恐らく はＧ−カルテツト形成を通じて、配列の二次構造はオリゴマー活性の限界を定め ているという証拠を提供する。同様に、Ｂｅｎｎｅｔｔ，Ｃ．Ｆ．，Ｃｈｉａｎ ｇ，Ｍ．Ｙ．，Ｗｉｌｓｏｎ−Ｌｉｎｇａｒｄｏ，Ｌ．，Ｗｙａｔｔ，Ｊ．Ｒ． （１９９４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２，３２０２−３２０９ は、それらのホスホロチオエートオリゴマーの活性は３以上の連続するＧの２セ ットを含有する配列における可能なＧ−カルテット形成に基づくことを示し、こ れはヒトホスホリパーゼＡのオリゴ−媒介調節は特異的核酸− 蛋白質相互作用を通じるものであることを示唆した。 ある範囲のＧ−カルテット構造による特異的蛋白質認識がテロメア、セントロ メア（Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ，Ｅ．Ｈ．（１９９０）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２ ６５，５９１９−５９２１）、免疫グロブリンのスイッチ領域（Ｓｈｉｍｉｚｕ ，Ａ．，Ｈｏｎｊｏ，Ｔ．（１９８４）Ｃｅｌｌ ３６，８０１−８０３）およ びアプタマー（ａｐｔａｍｅｒ）と呼ばれるあるクラスの調節オリゴマー（Ｂｏ ｃｋ．Ｌ．Ｃ．，Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｌ．Ｃ．，Ｌａｔｈａｍ，Ｊ．Ａ．，Ｖｅｒ ｍａａｓ，Ｅ．Ｈ．，Ｔｏｏｌｅ，Ｊ．Ｊ．（１９９２）Ｎａｔｕｒｅ ３５５ ，５６４−５６６；Ｈｕｉｚｅｎｇａ，Ｄ．Ｅ．，Ｓｚｏｓｔａｋ，Ｊ．Ｗ．（ １９９５）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３４，６５６−６６５；Ｂｅｒｇａｎ， Ｒ．，Ｃｏｎｎｅｌｌ，Ｙ．，Ｆａｈｍｙ，Ｂ．，Ｋｙｌｅ，Ｅ．，Ｎｅｃｋｅ ｒｓ，Ｌ．（１９９４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２，２１５０ −２１５４）で示されている。本発明者らの実験において、テロメアにおけるも ののごとき（Ｓｍｉｔｈ，Ｆ．Ｗ．，Ｆｅｉｇｏｎ，Ｊ．（１９９２）Ｎａｔｕ ｒｅ ３５６，１６４−１６７）、４つの連続するＧのセットから分子間４本鎖 Ｇ− カルテット構造を形成できるオリゴマーはＣＤ２８発現を弱く阻害した。この例 は、そのＧ−リッチ配列がｃ−ｍｙｃ発現を阻害することが他の者によって従前 に示されている（Ｂｕｒｇｅｓｓ，Ｔ．Ｌ．，Ｆｉｓｈｅｒ，Ｅ．Ｆ．，Ｒｏｓ ｓ，Ｓ．Ｌ．，Ｂｒｅａｄｙ，Ｊ．Ｖ．，Ｑｉａｎ，Ｙ．−Ｘ．，Ｂａｙｅｗｉ ｔｃｈ，Ｌ．Ａ．，Ｃｏｈｅｎ，Ａ．Ｍ．，Ｈｅｒｒｅｒａ，Ｃ．Ｊ．，Ｈｕ， Ｓ．Ｓ．−Ｆ．，Ｋｒａｍｅｒ，Ｔ．Ｂ．，Ｌｏｔｔ，Ｆ．Ｄ．，Ｍａｔｒｉｎ ，Ｆ．Ｈ．，Ｐｉｅｒｃｅ，Ｇ．Ｆ．，Ｓｉｍｏｎｅｔ，Ｌ．，Ｆａｒｒｅｌｌ ，Ｃ．Ｌ．（１９９５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２ ，４０５１−４０５５における配列１４）ＲＴ１５Ｓ（配列番号：６３）であっ た。もう１つのＧ−リッチ構造、分子間Ｇ−カルテットはトロンビンのアプタマ ー阻害を媒介することが示されている（Ｗａｎｇ，Ｋ．Ｙ．，ＭｃＣｕｒｄｙ， Ｓ．，Ｓｈｅａ，Ｒ．Ｇ．，Ｓｗａｍｉｎａｎｔｈａｎ，Ｓ．，Ｂｏｌｔｏｎ， Ｐ．Ｈ．（１９９３）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３２，１９８９−１９０４； Ｍａｃａｙａ，Ｒ．Ｆ．，Ｓｃｈｕｌｔｚｅ，Ｐ．，Ｓｍｉｔｈ，Ｆ．Ｗ．，Ｒ ｏｅ，Ｊ．Ａ．，Ｆｅｉｇｏｎ，Ｊ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎ ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０，３７４５−３７４９）。ＲＴ０３Ｓ （配列番号：４４）の配列解析は、残基３−４、７−８、１２−１３および１６ −１７の対となったＧはかかるＧ−カルテット構造を潜在的に形成できることを 予測する。しかしながら、分子内カルテットを破壊する残基１−６（ＲＴ１８Ｓ （配列番号：５７））の除去は、ＣＤ２８発現およびＣＤ２８−依存性ＩＬ−２ 産生の阻害をブロックするにおいて不十分であった。これらのデータは、ＲＴ０ ３Ｓ（配列番号：４４）の活性は１つおきの（ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ）Ｇ−カ ルテット構造から生じることを示唆する。 ＲＴ０３Ｓ（配列番号：４４）は、事実、ダイマーＧ−カルテット形成に必須 であることが他の者によって予測されているモチーフ（Ｓｍｉｔｈ，Ｆ．Ｗ．， Ｆｅｉｇｏｎ，Ｊ．（１９９３）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３２，８６８２− ８６９２）に似た１２量体配列を有する。ダイマーＧ−カルテットは交互に平行 および反平行であるＤＮＡの２の鎖から生じ得る。ここに、連続する鎖は４つの スタックされたＧ−カルテットを形成する４個のＧを与える。４つの塩基が連続 する４個のＧの２セットを分離する１２個の残基よりなる各鎖のモチーフは、形 成 および安定性と関連した。本発明者らは、コアの１２量体配列（ＲＴ１８Ｓ（配 列番号：５７））はＲＴ０３Ｓ（配列番号：４４）と同様の活性を有することを 示した。また、４個のＧの両領域内のＧないしＣ置換（ＲＴ１０Ｓ（配列番号： ５３、ＲＴ２３Ｓ（配列番号：５６）、ＲＴ２４Ｓ（配列番号：５４）、ＲＴ２ ５Ｓ（配列番号：５５））の結果、ＲＴ０３Ｓ（配列番号：４４）に対して相対 阻害活性が５６−６９％喪失した。同様に、Ｇのセットを分離する塩基の挿入（ ＲＴ２０Ｓ（配列番号：６１）、ＲＴ２１Ｓ（配列番号：６２））または欠失（ ＲＴ１９Ｓ（配列番号：５８））は相対的生物活性を５２−７０％だけ低下させ た。考え併せると、これらのデータは、ダイマーＧ−カルテットを形成する能力 を有する特異的配列モチーフは機能的ＣＤ２８発現のホスホロチオエートオリゴ −媒介阻害に非常に重要であることを示唆する。 このタイプのダイマーＧ−カルテットがその生物学的効果を発揮するメカニズ ムは知られていない。しかしながら、いくつかの系列の証拠は、恐らくは、ダイ マーＧ−カルテットプロモーター配列と特異的転写因子との相互作用を競合的に 妨げることによって、このモチーフが本発明者らの活性オリゴマーをデ コイとして機能することを可能としているという仮説を裏付ける。１）ＣＤ２８ 遺伝子の上流領域に対応するオリゴマー（ＲＴ１１Ｓ（配列番号：５０））はＲ Ｔ０３Ｓ（配列番号：４４）と等価な生物学的活性を呈した。２）本発明者らの 活性オリゴマーは非アンチセンスメカニズムを介して機能する。３）これらのオ リゴマーはＣＤ２８ ｍＲＮＡ発現を調節した；よって、これらの生物活性は直 接的標的蛋白質相互作用に関連していなかった。４）Ｇ−リッチプロモーター領 域が優勢で（Ｅｖａｎｓ，Ｔ．，Ｓｃｈｏｎ，Ｅ．，Ｇｒａｚｙｎａ，Ｇ．Ｍ． ，Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ，Ｊ．，Ｅｆｓｔｒａｉａｄｉｓ，Ａ．（１９８４）Ｎｕ ｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１２，８０４３−８０５；Ｋｉｌｐａｔｒｉ ｃｋ，Ｍ．Ｗ．，Ｔｏｒｒｉ，Ａ．，Ｋａｎｇ，Ｄ．Ｓ．，Ｅｎｇｌｅｒ，Ｊ． Ａ．，Ｗｅｌｌｓ，Ｒ．Ｄ．（１９８６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１，１ １３５０−１１３５４；Ｃｌａｒｋ，Ｓ．Ｐ．，Ｌｅｗｉｓ，Ｃ．Ｄ．，Ｆｅｌ ｓｅｎｆｅｌｄ，Ｇ．，(１９９０)Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１８ ，５１１９−５１２６）、Ｇ−カルテット−形成プロモーター配列が一般的な調 節現象であるという可能性を増大させる。５）二本鎖オリゴマー は転写因子Ｅ２Ｆに対するデコイとして作用し得る（Ｍｏｒｉｓｈｉｔａ，Ｒ． ，Ｇｉｂｂｏｎｓ，Ｇ．Ｈ．，Ｈｏｒｕｃｈｉ，Ｍ．，Ｅｌｌｉｓｏｎ，Ｋ．Ｅ ．，Ｎａｋａｊｉｍａ，Ｍ．，Ｚｈａｎｇ，Ｌ．，Ｋａｎｅｄａ，Ｙ．，Ｏｇｉ ｈａｒａ，Ｔ．，Ｄｚａｕ，Ｖ．Ｊ．（１９９５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２，５８５５−５８５９）。６）Ｇ−リッチオリゴマー はＳｐｌ転写因子の誘導を媒介することが示されている（Ｐｅｒｅｚ，Ｊ．Ｒ． ，Ｌｉ，Ｙ．，Ｓｔｅｉｎ，Ｃ．Ａ．，Ｍａｊｕｍｄｅｒ，Ｓ．，ｖａｎ Ｏｏ ｒｓｈｏｔ，Ａ．，Ｎａｒａｙａｎａｎ，Ｒ．（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１，５９５７−５９６１）。 出典明示による取り込み 引用した全ての特許、特許出願および刊行物は出典明示して本明細書の一部と みなす。 同等物 前記明細書は当業者が本発明を実施するのを可能とするのに十分であると解釈 される。事実、本発明を実施するためになされる有機化学または関連分野の当業 者に自明な前 記の種々の変形は以下の請求の範囲内にあることを意図する。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION               Methods and compositions for modulating CD28 expression I.Field of the invention   The present invention relates to oligomers, especially oligomers effective for treating immune system mediated diseases In the field of regulating gene expression through the use of II.Background of the Invention   The immune system plays a very important role in protecting higher organisms from life-threatening infections. It also plays a very important part in the etiology of many diseases. That the immune system plays a part These diseases are autoimmune diseases in which the immune system reacts with self antigens, such as systemic erythematous Lupus, or a disease associated with immunomodulation initiated by a response to a foreign antigen Qi, eg, graft versus recipient disease observed in transplant rejection.   The pathogenesis and exacerbation of many common T-cell mediated diseases is abnormal T-cell Derived from an inappropriate immune response triggered by activation. Presence of activated T-cells Have been reported in many T-cell mediated dermatoses (Simon et al., (1994) J. . Invest Derm. ,103: 539-543). For example, Psoriasis, which affects 2% of the Western European population, including 4 million Americans, is Characterized by site hyperproliferation and abnormal epidermal infiltration of activated T-cells It is a skin disorder. Many reports have been published on psoriasis (Baadsgaard et al., (1990) J. Invest Derm. ,95: 275-282, Chang et al., (19 92) Arch. Derm,123: 1479-1485, Schlaak et al. (1994) J. Am. Invest. Derm. ,102145-149) and Psoriasis exacerbated by AIDS (Duvic (1990) J. Invest De rm. ,90: 38S-40S) the major role of these activated T-cells in the pathogenesis Suggest a role. In psoriasis, activated lesional T-cells are Th1 cells. Predominantly release Itokine (IL-2, interferon-gamma) (Sc hlaak et al., (1994) J. Mol. Invest Derm. ,102: 145-1 49). These secreted cytokines induce normal keratinocytes, It has been found in psoriatic lesions (Baadsgaard et al., (1990) J. In. vest. Derm. ,95: 275-282) (HLA D) R + / ICAM-1 +). Also, its in-bit By pro-inflammatory properties of b and in vivo and it activates from psoriatic lesions Because it is secreted in large quantities by both T-cells and keratinocytes, IL-8 Major pathological changes observed in psoriatic skin such as keratinocyte hyperproliferation It is considered an incentive. In addition, the B7 family of receptors (see BB1, one of the ligands released for CD28, is a psoriasis Has been shown to be expressed in untreated skin keratinocytes (Nickol off et al., (1993) Am. J. Pathology,142: 1029-1 040).   Type I (insulin-dependent) diabetes, thyroiditis, sarcoidosis, multiple sclerosis, Autoimmune uveitis, rheumatoid arthritis, systemic lupus erythematosus, inflammatory bowel disease Numerous other diseases including abnormal and ulcerative colitis) and autoimmune hepatitis -It is thought to be caused by cell activation. In addition, septic shock And various syndromes, including tumor-induced cachexia, are associated with T-cell activation and lymphokases. May be involved in the generation of potential toxicity levels of the quinone. Also, normal T-cell activation Will provide the necessary signals for the effective destruction of "exogenous" donor tissue. Thus, it mediates the rejection of transplanted cells and organs.   Gene expression and secretion of T-cell proliferation and specific immunoregulatory cytokines is 2 Requires two independent signals. The first signal is a specific T-cell receptor Histocompatibility complex on the surface of antigen presenting cells (APC) by the / CD3 complex Includes recognition of antigens presented by body molecules. Antigen between T-cells and APC- Non-specific cell-cell interactions are those that act to regulate T-cell responses to antigens. 2 signals are provided. These second or costimulatory signals will Determine the magnitude of the T-cell response. The co-stimulated cells are By increasing the level of gene transcription and Reacts by stabilizing. T-cell activation in the absence of costimulation is not yet A developmental anergic T-cell response results. One of the key costimulatory signals is T-cell Provided by the interaction of surface receptor CD28 with B7-related molecules on APC (Linsley and Lebdetter (1993) Ann. Rev. Im munol. ,11: 191-212). CD28 is used for the production of B-cell antibodies. 95% of CD4 + T- cells (providing looper function) and (having cytotoxic function) Constitutively expressed in 50% of CD8 + T-cells (Yamada et al., (1) 985) Eur. J. Immunol.Fifteen: 1164-1168). Antigenic Or in vitro mitogenic stimuli, as well as certain immunomodulatory cytokines Further induction of surface levels of CD28 occurs. These are the T-cell cell cycle Interleukin-2 (IL-2) required for progression, various anti-viruses and anti- -Interferon-gamma showing tumor effects and against neutrophils and lymphocytes Interleukin-8 (IL-8), which is known as an excellent chemotactic factor, Including. These cytokines are regulated by the CD28 pathway of T-cell activation (Fraser et al., (1991) Science,251 : 313-316, Seder et al., (1994) J. Mol. Exp. Med. ,179 : 299-304, Wechsler et al., (1994) J. Am. Immunol. , 153: 2515-2523). IL-2, interferon-gamma, and IL-8 is essential for promoting a wide range of immune responses and has many T-cell mediated It has been shown to be overexpressed in disease states. Some such as allergic contact dermatitis and lichen planus In T-cell mediated skin injury, CD28 is responsible for most skin and epidermal CD3 + T -Normal skin and basal cell carcinoma (non-T-cell mediated) expressed at high levels in cells CD28 was only expressed on perivascular T-cells. As well In both allergic contact dermatitis and lichen planus, B7 expression was Cells found in dendritic cells, skin APCs and keratinocytes, but not in normal skin and Were not found in basal cell carcinoma (Simon et al., (1994), J. Inve. st Derm. ,103: 539-543). Therefore, this is CD28 / B7 Suggests that the pathway is an important mediator of T-cell mediated dermatosis.   Abnormalities associated with certain autoimmune diseases caused by loss of self-tolerance T-cell activation is solely due to the presence of CD28 + T-cells and activated specialized Expression of its ligand B7 on APCs (monocytes, macrophages or dendritic cells) Is characterized by: These are autoimmune Gloves thyroiditis (Garcia- Cozar et al., (1993) Tmunol. ,12: 32), sarcoidosis (Van) Denbergh et al., (1993) Int. Immunol. , 5: 317-3 21), chronic joint Rheumatism (Verwighhen et al. (1994) J. Immunol.,153 : 1378-1385) and systemic lupus erythematosus (Sfikakis et al., (19) 94) Clin. Exp. Immunol. ,96: 8-14). Transplanted In normal T-cell activation that mediates rejection of isolated cells and organs, Binding of CD28 by its appropriate B7 ligand during engagement is, for example, Critical for proper allogeneic response to foreign antigens on donor tissue ( Azuma et al., (1992) J. Mol. Exp. Med. ,175: 353-360, Turka et al., (1992) Proc. Nat. Acad. Sci. USA,8 9 11102-11105). Traditional therapies for autoimmune diseases are T-cell activation; Does not interfere with effector processes in the reactive immune response. Steroids and non-steroids Drugs such as the steroid anti-inflammatory drugs (NSAIDS) now alleviate the syndrome But they cannot prevent the progress of the disease. in addition , Steroids have side effects such as induction of osteoporosis, organ toxicity and diabetes May accelerate cartilage degeneration process, up to 2 to 8 hours So-called post between G-May cause injection redness. NSAIDS have gastrointestinal side effects, granules May increase the risk of cytopenia and iatrogenic hepatitis. Also, immunosuppressive drugs It is used as another form of treatment, especially in advanced disease states. However However, these drugs suppress the entire immune system, often treating hypertension and nephrotoxicity Have serious side effects, including Also for cyclosporin and FK506 Established immunosuppressants fail to inhibit CD28-dependent T-cell activation pathway (June et al., (1987) Mol. Cell. Biol.,7: 4472-44 81).   In view of the shortcomings of currently available medicines and methods for treating immune system mediated diseases It is interesting to provide new methods and compositions for treating such diseases. No. III.Summary of the Invention   The subject invention provides methods and compositions for the treatment of an immune system-mediated disease. Book The compositions of the invention have the property of reducing CD28 expression in cells of interest. , Which diminishes the pathogenic effects of the immune system in immune system-mediated diseases. CD28 expression The subject method of reducing CD28+Reduces the effect of antigenic stimulation of T cells Let down, so CD28+T cell activation level and T cell activation Linked interleukin-2, interferon-gamma and interleukin The present invention is provided as a method for reducing the release of cytokines including -8. Of the present invention The composition comprises a number of different oligomers that can reduce the expression of CD28. No.   One aspect of the present invention relates to the expression of CD28 by interfering with the expression of CD28. An object of the present invention is to provide an oligomer capable of reducing the appearance. Oligo of the invention Mer is associated with the CD28 gene or CD28 gene transcript, or a portion thereof. Has homology to the nucleic acid base sequence, wherein the homology is a nucleic acid duplex under intracellular conditions. Sufficient to allow for helical or triple-stranded helical forms. Of the present invention The oligomer may be DNA, RNA, or various synthetic analogs thereof. Special In another embodiment, the amount of GGGG separated by 3 to 5 bases is less. Oligomers having 11 to 50 bases each consisting of two sequences.   Another aspect of the invention is directed to cells of interest, particularly cells that naturally express CD28. Expression of the oligomer of the present invention in cells To provide a genetically engineered vector for use.   Another aspect of the present invention relates to a medicament comprising one or more different oligomers of the present invention. Is to provide a prescription. The pharmaceutical formulation should be administered to the body or reintroduced into the body. It can be adapted to various forms of administration to the cells.   Another aspect of the present invention is to provide a method for treating an immune system mediated disease. is there. The method of the invention comprises administering an effective amount of an oligomer of the invention to a C Modulating D28 expression. The method of the present invention is useful for treating autoimmune diseases. Methods, methods to reduce inflammation, response, reduce production of selected cytokines Methods, methods of inactivating T cells, and methods of immunosuppressing transplant patients.   IV.Brief description of drawings   FIG. 1 shows the sequence (1A) of the 5 'untranslated region of the CD28 gene and human CD28. MRNA sequences (1B, 1C). 1B and 1C show the polynucleotide arrangement. Represents the different contiguous parts of a column.   FIG. 2 shows various CD28-specific and control phosphorothioates and phosphodiesters. Rothioate-3'hydroxylpropyla Percentage of viable (live) T-cells after treatment with min oligonucleotide Is a graph display.   FIG. 3 shows human T-cells from two donors (GV010 and JC011). -CD3 monoclonal antibody / PMA-induced CD28 expression (A), and -CD3 monoclonal in peripheral blood T-cells from two identical donors CD28-specific and control phosphoro for antibody / PMS-induced CD28 expression Thioate (B, batches 1 and 2) and phosphorothioate-3'hydroxy 5 is a graphical representation of the effect of a cypropylamine (C) oligonucleotide.   Figure 4 shows A) mitogen in human T-cells from donor KS006. B) Anti-CD3 monoclonal antibody / PMA-induced CD28-specific and control phosphorothioate on human T-cell proliferation 5 is a graphical representation of the effect of a lignonucleotide.   FIG. 5 shows that anti-CD3 monoclonal antibody and PMA in human T-cells Of interleukin-2- (IL-2) production (A) and human peripheral Anti-CD3 monoclonal antibody / PMA-induced TL-2 production in T-cells For C D28-specific and control phosphorothioate (B) phosphorothioate-3 ' 4 is a graphical representation of the effect of hydroxypropylamine (C).   FIG. 6 shows that anti-CD3 monoclonal antibody and PMA on human T-cells. Of interferon-gamma (IFNγ) production (A) and human powder Anti-CD3 monoclonal antibody / PMA-induced interface in peripheral T-cells CD28-specific and control phosphorothioate (B ) Phosphorothioate-3'hydroxypropylamine (C) oligonucleotides 7 is a graphical representation of the effect of the sword.   FIG. 7 shows the interaction of anti-CD3 monoclonal antibody in human T-cells. Induction of leukin-8 (IL-8) (A) and anti-tumor activity in human peripheral T-cells -CD3 monoclonal antibody / CD28-specific for PMA-induced IL-8 production Target and control phosphorothioate (B) phosphorothioate-3'hydroxyp 5 is a graphical representation of the effect of ropylamine (C) oligonucleotide.   FIG. 8 shows the interleukin-2 receptor (IL-2R, also known as CD25). (A), and CD28-specific And control phosphorothioate 3'hydroxypropylamine oligonucleotides Anti-CD3 Monoclonal in Human Peripheral T-Cells Treated or Not Treated with Tide Intracellular adhesion molecule-1 (ICAM-1, CD54 and (Also known)) is a graphical representation of expression (B).   FIG. 9 shows anti-CD28 monoclonal antibody and H before and after PMA treatment. CD28 expression in UT78 (A) and Jurkat (B) human T-cell lines And anti-CD3 monoclonal antibody and PMA-treated Jurkat cells Of the effect of CD28-specific phosphorothioate oligonucleotide (C) on This is a graph display.   FIG. 10 shows anti-CD3 monoclonal antibody and PMA-treated HUT78 (A ) And Jurkat (B) Interleukin-2 production in human T-cell lines Of the effect of CD28-specific phosphorothioate oligonucleotides on Display.   FIG. 11 shows that phosphorothioate oligonucleotides 5 is a graphical representation of the effects of cytokine secretion on surface expressed and activated T cells. You.   FIG. 12 shows phosphorothioate versus CD28 and CD25 mRNA levels. 5 is a graphical representation of the effect of a tri-oligonucleotide.   FIG. 13. Oligonucleotides for inhibitory effects on functional CD28 expression. Specificity of RT03S (SEQ ID NO: 44) and RT04S (SEQ ID NO: 45) Is a graph display.   FIG. 14 shows the CD28-specific oligonucleotide, RT03S (SEQ ID NO: 4). 4) and induction of tolerance in vitro by RT05S (SEQ ID NO: 45) This is a graph display.   FIG. 15 shows extracellular supernatant (top panel) and Jurkat cell lysate (bottom panel). Flannel)32P-labeled phosphorothioate, RT03S (SEQ ID NO: 44) And graphic representation of the in vitro stability of RTC06S (SEQ ID NO: 48). You. V.Detailed description of special examples   Described herein are methods and compositions for treating immune system mediated diseases, wherein The desired therapeutic effect is achieved by reducing the expression of CD28, whereby Activated CD28+Inhibits T cell function and reduces activation of other immune system cells . We believe that antigen-dependent T cell activation can+T cells Found to be able to be inhibited by reducing the expression of CD28 in mice. The invention can be used to reduce the expression of CD28 on T cells A number of compounds are provided.   The invention described herein provides that the reduction of CD28 expression on T cells is an antigen of T cells. -Including the finding that it can interfere with specific activation. The discovery targets CD28 Immunization with oligomers and non-oligomeric compounds that reduce CD28 expression It can be used to provide a number of methods for treating system-borne diseases. Note in this application By using the described discovery of biological effects that reduce CD28 expression, Numerous methods of treating immune system mediated diseases are provided, and such methods are still synthetic or purified. Non-oligomeric compounds that have not been used can be used.   One aspect of the invention is an "antisense" oligonucleotide or "antisense" oligonucleotide. Established techniques, often called the use of "sense therapy," To provide an oligomer that can be used to inhibit gene expression . Numerous literature is available on construction and use of antisense. Such literature Examples of: Stein et al., Science,261: 1004-1012 (199 3); Milligan et al. M ed. Chem. ,361923-1937 (1993); Helene et al., J. Biochim. Biophys. Acta,1049: 99-125 (1 990); Wagner, Nature,372: 333-335 (1994) And Crooke and Lebleu, Anti-sense Research rch and Applications, CRCPress, Boca R aton (1993). As used herein, the term “antisense” is specifically noted. Unless double-stranded or triple-stranded with polynucleotides Oligomers (including oligonucleotides) that can form genes and interfere with gene expression - The antisense data described in these and other similar documents The principle and use of Zyne are described in the context of the CD28-specific oligonucleotides of the invention. Those skilled in the art can use the examples to design, create, and use the examples.   The oligomer of the present invention can regulate the expression of the CD28 gene. Oligomers of the invention Is hybridized to the CD28 transcript (or a portion thereof) by hybridization. A single-stranded polynucleotide helix, or a portion or portions of the CD28 gene Forms a double-stranded polynucleotide helix by hybridizing with Include oligomers that have the property of being able to form Can occur under conditions. Further, the oligomer of the present invention may act as a molecular decoy. And proteins of transcription factors and regulatory elements of the untranslated region of the CD28 gene Regulation of gene expression can be achieved by preventing quality-nucleic acid interactions . In addition, the oligomers of the present invention may be combined with a part or parts of the CD28 gene. Including those capable of forming a triple-stranded polynucleotide helix, wherein the helix formation Can occur under intracellular conditions. Between nucleobases (eg, adenine-thymidine, Tosin-guanine, uracil-thymidine) Double or triple stranded helix base pairing The relationships are known to those skilled in the art and can be used in designing the oligomers of the invention. Therefore Double or triple helix formation can occur with a given oligomer of the invention. The CD28 gene or CD28 gene transcript is "targeted" by its oligomers. Was done. "   Human CD28 is a 90-kDa homozygous on the surface of T cell subunits. It is a transmembrane glycoprotein. CD28 is most CD4+T cells and about 50 % CD8+Present in T cells. The DNA sequence encoding human CD28 is Why L ee et al., Journal of Immunology,145: 344-35 2 (1990), and a publicly accessible gene such as GenBank It has been deciphered as can be found in the data bank. Human CD28 inheritance The offspring consist of four exons, each regulating a functional domain of the predicted protein. Set. Transcripts of various sizes have been produced from the human CD28 gene Have been observed. The oligomers of the present invention may comprise the published nucleic acids of the CD28 gene. See otide sequence or sequence of cDNA derived from CD28 gene Can be designed by The compositions and methods of the present invention provide non-human mammals with non-human mammals. Can be used in mammals other than humans by referring to the sequence of the CD28 gene. Can be easily adapted to The sequence of the non-human CD28 gene The CD28 gene previously identified from humans (or other mammals). Gene library hybridization probes and / or PCR (poly Merase chain reaction) It can be obtained by using as an amplification primer. The published nucleotide sequence of the CD28 gene is believed to be accurate. On the other hand, if the nucleotide sequence of the published CD28 is Those skilled in the art can implement the present invention even if it includes a fixed error. Published Appropriate nucleotide sequence errors in the sequence are, inter alia, Region of the CD28 gene (or CD28 gene transcript) targeted by the The region can be detected by resequencing. Resequencing is a normal DNA sequence This can be done by a decision technique.   The oligomer of the invention preferably comprises from about 11 to about 50 nucleobase units. Become. It is important to note that the oligomers of the invention can be significantly longer than 50 nucleobase units. The trader will understand easily. In a more preferred embodiment of the present invention, The oligomer is from about 8 to about 25 nucleobase units; more preferably about 14 nucleobases Consists of units to about 22 nucleobase units. Preferred for oligomers of the invention Large size restrictions should be administered extracellularly to cells, e.g., Intracellularly produced CD28-specific oligo produced from a vector for genetic manipulation of cells Only those oligomers that are not applicable to the mer.   The oligomer of the invention may have a number of different nucleobase sequences. Oligo of the invention Hammer (via nucleic acid-nucleic acid interactions) to reduce CD28 expression. By letting it hybridize Or (via nucleic acid-protein interaction) the untranslated sequence of the CD28 gene By hybridizing to a non-nucleic acid molecule that recognizes Selected to reduce to substantially any region of the CD28 transcript of the D28 gene. You can choose. For example, the oligomers of the present invention may comprise (various distinct regions The translated region of the CD28 transcript, the untranslated region of the CD28 transcript, Unspliced region of CD28 transcript, CD28 gene intron, CD28 pro A motor sequence, and a CD28 regulatory sequence, the 5 'cap region of the CD28 transcript, It can be selected so that it can hybridize to the CD28 gene coding region or the like. Of the present invention Preferred Specific Examples of Oligomeric CD28 Gene and CD28 Gene Transcript Is located in the translation and / or transcription initiation region of the CD28 gene (and its transcript). is there. CDs where helix formation can occur through selection of oligomeric nucleobase pair sequences By changing the position of the 28 or CD28 gene transcript, Capacity, for example, the amount required to produce the desired biological effect. Preferred embodiments of the oligomer of the invention have the highest possible capacity. Seeds of the present invention The ability of each oligomer is determined by various in vitro assays known to those of skill in the art. It can be measured by an assay. Examples of such assays are described in the experimental section of the present application. Can be found in Those skilled in the art will appreciate that gene positions other than the CD28 gene It is desirable to generate oligomers that are targeted to an existing polynucleotide sequence. You will recognize that it is not good. For example, in the 5 'untranslated region of the CD28 transcript It is undesirable to generate oligomers targeted to Alu sequences in (The Alu region of CD28 is described in Lee et al., Journal of Immunol. logy,145: 344-352 (1990)). Genes other than CD28 or Describes the use of oligomers to form double or triple strands with gene transcripts, Polynucleotides in publicly accessible databases such as nBank Perform homology search of oligomer nucleotide base sequence against peptide sequence information And can be minimized by   In a preferred embodiment of the invention, the subject oligomer comprises a selected target sequence. Nucleobases completely complementary to That is, each nucleic acid salt in the oligomer The group is a second (or third) nucleic acid on another strand of a double (or triple) helix A base pairing relationship with a base can be entered. However, if you are skilled in the art Species specific for the CD28 gene target and / or capable of inhibiting CD28 expression Each oligomer comprises a CD28 gene (either strand), a CD28 gene transcript, Or lacks complete hybridization to the CD28-specific regulatory protein It will be appreciated that it may have a nucleotide base sequence.   Preferred specific examples of the oligomer of the present invention are the following nucleobase sequences:   5'TTGTTCCTGACGATGGGCTA3 '(SEQ ID NO: 1) RT01   5'AGCAGCCTGAGCATCTTTGT3 '(SEQ ID NO: 2) RT0 2   5'TTGGAGGGGGTGGTGGGG3 '(SEQ ID NO: 3) RT03   5'GGGTTGGAGGGGGTGGTGGGGG3 '(SEQ ID NO: 4) RT 04   In particularly preferred embodiments of the present invention, RT01, RT02, RT03, and And the nucleotide base sequence shown in RT04 is phosphorothioate. Especially good Preferred oligomers are described in Tam et al., Nucl. Acid. Res. 22: 977- 986 (1 994). The phosphorothioate-3'hydroxypropylamine described in It is.   The oligomer of the present invention is obtained by applying the oligomer of the present invention that has been applied extracellularly and internalized. And can be designed to reduce the expression of CD28 on T cells. in addition In addition, the oligomer of the present invention is characterized in that the oligomer is obtained through the use of a gene expression vector. It can be designed to reduce CD28 expression when produced in the vesicle. CD2 8 inhibition of (I) interference with CD28 gene transcription, (ii) CD28 gene Interference with transcript transcription, (iii) processing of CD28 gene transcript, Or through any combination of (I), (ii) and (iii) it can. The exact extent and mechanism of interference of CD28 expression will depend on the particular oligomer Structure, oligomer nucleotide sequence, oligomer dose, subject orientation It will depend on factors such as the means by which the sesame is administered.   The term "oligomer" as used herein refers to a naturally occurring polynucleotide. For example, DNA, RNA, and double-stranded or triple-stranded with DNA or RNA. Both artificial analogues of naturally occurring nucleic acids capable of forming either Say. Many oligomers, which are artificial analogues of naturally occurring polynucleotides, are Make them superior to DNA or RNA for use in the method of the invention Has characteristics. These properties indicate a higher affinity for DNA / RNA, Nuclease resistance, exonuclease resistance, lipid solubility, RNAseH activation And so on. For example, against enhanced lipid solubility and / or nuclease digestion Resistance replaces the phosphate oxygen in the internucleotide phosphodiester bond. Alkyl phosphonate, oligo Form nucleotide or alkyl phosphotriester oligonucleotides Obtained by: Nonionic oligomers such as these are complementary nucleic acid sequences. Against nuclease hydrolysis while retaining the ability to form a stable complex with the array And / or increased cellular uptake.   A number of oligomers that are analogs of naturally occurring nucleic acids are explicitly described herein. And / or nucleic acid analogs known to those of skill in the art and which may be developed in the future. Many oligomers have been identified by those skilled in the art as inhibiting the expression of the CD28 gene. It will be appreciated that it can be easily adapted. CD28 gene And its transcripts) by selecting an appropriate nucleobase sequence to target Various currently available DNA / RNA analogs that can be used as light oligomers A brief summary of this is provided below. Various oligomers described in those documents Can be adapted to inhibit CD28 expression in the methods and compositions of the present invention. It is a non-limiting example of different possible embodiments of the gommer.   Methyl phosphonate (and other alkyl phosphonate) oligomers It can be prepared by various methods, both in and on insoluble polymer supports (A grawal and Fiftina, Nucl. Acids Res. ,6: 3 009-3024 (1979); Miller et al., Biochemistry,18 : 5134-5142 (1979); Miller et al. Biol. Ch em. ,255: 9659-9665 (1980); Miller et al., Nucl. . Acids Res. ,11: 5189-5204 (1983); Mille r et al., Nucl. Acids Res,11: 6225-6242 (1983) Miller et al., Biochemistry,25: 5092-5097 (1 986); Sinha et al., Tetrahedron Lett,24: 877-880 (1983); Do rman et al., Tetrahedron,40: 95-102 (1984); Ja. ger and Engels, Tetrahedron Lett,25: 143 7-1440 (1984); Noble et al., Nucl. Acids Res. ,12 : 3387-3404 (1984) Callahan et al., Proc. Nat l. Acad. Sci. USA,83: 1617-1621 (1986); Ko Ziolkiewicz et al., Chemica Scripta,26: 251- 260 (1986); Agrawal and Goodchild, Tetrah. edron Lett. ,38: 3539-3542 (1987); Lesni. kowski et al., Tetrahedron Lett,28: 5535-5538 (1987); Sarin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA,85 : 7448-7451 (1988)).   A further oligoribonucleotide analog used as an oligomer is In ova et al., Nucleic Acids Res. ,Fifteen: 6131 (1987) ) (2'-O-methyl ribonucleotide), Tnova et al., FEBS Lett. . ,21 5 : 327 (1987).   The description of the preparation and use of phosphorothioate and phosphorodithioate In particular, the following publications: US Pat. No. 5,292,875, US Pat. No. 286,717; U.S. Pat. No. 5,276,019; U.S. Pat. No. 423, US Pat. No. 5,218,103, US Pat. No. 5,194,428. U.S. Pat. No. 5,183,885; U.S. Pat. No. 5,166,387; No. 5,151,510; U.S. Pat. No. 5,120,846; U.S. Pat. No. 814,448, U.S. Pat. No. 4,814,451, U.S. Pat. No. 4,096, No. 210, U.S. Pat. No. 4,094,873, U.S. Pat. No. 4,092,312 U.S. Pat. No. 4,016,225; U.S. Pat. No. 4,007,197; No. 3,972,887, U.S. Pat. No. 3,917,621, U.S. Pat. No. 907,815, Dagle et al., Nucl. Acids Res. ,18: 4 751-4757 (1990); Loke et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA,86: 3474-3478 (1989), LaPlanche Et al., Nucleic Acids Res. ,14: 9081 (1986) and And St ec et al. Am. Chem. Soc.106: 6077 (1984), and Stein et al., Nucl. Acids. Res. ,16: 3209-3221 ( 1988).   Descriptions of the preparation and use of phosphoramidites can be found, inter alia, in the following publications: Agrawal et al., Proc. Natl. Acad. Sci. ,85: 7079 -7083 (1988), Dagle et al., Nucl. Acids Res. ,1 8 (6): 4751-4757 (1990), Dagle et al., Nucl. Aci ds Res. , 19 (8): 1805-1810 (1991). Can be.   Other polynucleotide analogues of interest are thioacetate acetates in the backbone structure. Including compounds having a phenolic compound. A description of the preparation and use of such compounds is provided in Gao et al., Biochemistry,31: 6228-6236 (19 92), Quaedflieg et al., Tetrahedron Lett.,33( 21): 3081-3084 (1992); Jones et al. Org. Che m. ,58: 2983-2991 (1993).   Other polynucleotide analogs of interest include silyl and siloxy on the backbone structure. Includes compounds with crosslinks. A description of the preparation and use of such compounds is provided in Ogilvie and Cormier, Tetrahedron Let t. ,26(35): 4159-4162 (1985), Cormier and Ogilvie, Nucl. Acids Res. ,16(10): 4583- 4594 (1988), which can be found in PCT Publication WO 94/06811. Wear.   Other polynucleotide analogs of interest include silyl and acetoacetates in the backbone structure. Includes compounds with midate crosslinks. Description of the preparation and use of such compounds Are, inter alia, Gait et al. Chem. Soc. , Perkin Tran s.1: 1684 (1974); Mungall and Kaiser, J .; Or g. Chem.42(4): 703-706 (1977), and Coul et al. , And Tetrahedron Lett. ,28(7): 745-748 ( 1987).   Also describes polynucleotide analogues with morpholino-based backbone linkages Have been. Of such nucleotide analogs Information on methods of making and using can be found, inter alia, in US Pat. No. 5,034,50. No. 6, No. 5,235,033, No. 5,034,506, No. 5,185,44 It can be found in No. 4.   Has various amines, peptides, and other achiral and / or neutral bonds Polynucleotide analogs have been described: Claufield et al., Bio. organic & Medicinal Chem. Lett. ,3(12) : 2771-2776 (1993); Mesmaeker et al., Bioorgan. ic & Medical Chem. Lett. ,4(3): 395-398 (1994), Angew. Chem. Int. Ed. Engl. , 33 (2) : 226-229 (1994); U.S. Patent No. 5,166,315; It can be found in No. 5,142,047.   Polynucleotides with thioester and other sulfur bonds between subunits Are, inter alia, Schneider and Brenner, Tetrahedr on Lett. ,31(3): 335-338 (1990), Huang et al., J. Org. Chem. ,56: 3869-3882 (1991); Musici and Widlanski, Tetrahedron Lett . ,32(10): 1267-1270 (1991); Huang and Wid. Lanski, Tetrahedron Lett. , 33 (19): 2657. -2660 (1992), and Reynold et al. Org. Chem. ,57 : 2983-2985 (1992), and PCT Publication WO 91/1550. 0.   Other polynucleotide analogs of interest are peptide nucleic acids (PNA) and related Includes polynucleotide analogs. For a description of the methods for producing and using peptide nucleic acids, In particular, Buchadt et al., Trends in Biotech. , 11 (1993) and PCT publication WO 93/12129. .   Other oligomers for use in antisense inhibition are described in Thong et al., Proc. N atl. Acad. Sci. ,84: 5129-5133 (1987), US No. 5,217,866, Lamon, Biochem. Soc. Trans action,21: 1-8 (1993) (2'-O-alkyl oligoribonucleic acid) Leotide), Ono et al., Bioconjugate C hemistry,4: 499-508 (1993) (1 'of deoxyribose 2'-deoxyuridine analog bearing an amino linker in the -position), Kawa Saki et al. Med. Chem. ,36: 831-841 (1993) (2 '-Deoxy-2'-fluorophosphorothioate oligonucleotide), PC T Publication WO 93/23570, Augustins et al., Nucl. Acids Res. ,21(20): 4670-4676 (1993).   In addition, increase duplex stability and / or increase cell uptake The oligomer can be further modified to cause Examples of such modifications are Conformations containing amide or carbamate linkages for column-specific binding PCT Publication WO93 / 24 entitled "Application-Constrained Oligomers" 507, Nielsen et al., Science,254: 1497-1500 (1 991), PCT published WO entitled "modified internucleotide linkage" 92/05186 and both "oligonucleotide analogs with novel bonds" PCT Publication No. WO 91/0 filed on Oct. 24, 1990 with the name of the invention 6629 and filed on April 24, 1991 U.S. Patent No. 5,264,562, "Pseudonucleosides and pseudonucleotides. And their polymers ", PCT Publication WO91 / 13080 entitled" Invention ". PCT Publication WO9, entitled "2'-Modified Oligonucleotide" 1/06556, "Exonuclease-resistant oligonucleotide and method for producing the same WO 90/15065, filed on June 5, 1990, entitled And in US Patent No. 5,256,775.   The oligomer of the present invention consists of various nucleobases. DNA or RNA, for example , Cytosine, adenine, guanine, thymidine, uracil, and hypoxanthine In addition to the nucleobases found to be naturally occurring in The mers contain one or more nucleobases that are synthetic analogs of naturally occurring acid bases. You may. Such non-naturally occurring heterocyclic bases include, but are not limited to, The and deazapyrimidine analogs, aza and deazapurine analogs and Including other heterocyclic base analogs, wherein one or more of purine and pyrimidine rings Carbon and nitrogen atoms are heteroatoms such as oxygen, sulfur, selenium, phosphorus, etc. Has been replaced. Preferred base sites are two Base-pairing structures with naturally occurring bases on complementary strands in single-stranded polynucleotides Can be incorporated into one strand of a double-stranded polynucleotide to maintain the relationship Is a base.   The present invention provides a number of methods for treating various immune disorders. Mentioning the disease As used herein, the terms "treatment" or "treat" refer to prophylaxis and to individuals already. Refers to both the relief of existing symptoms. Treatment is in preventing the onset of the disease. Or it need not be completely effective in reducing the symptoms associated with the disease. Severity at sign, delayed onset of sign, or delayed progression of sign severity Decreased slippage is also desirable for patients. The immune disorder that can be treated by the method of the present invention is C Diseases in which D28-expressing T cells mediate or contribute to unwanted idiopathic effects Involve your mind. Inhibition of CD28 expression usually results in activation of CD28+By T cells The expression of cytokines produced is reduced, and such cytokines Kin-2, interferon-gamma, and interleukin-8. Obedience Thus, the method of the present invention is not limited, but the etiology may be 2, via interferon-gamma, interleukin-8, or a combination thereof And thus T cell-mediated immunity Includes methods of treating diseases where the epidemic response is impeded or reduced. Subject oligomer Examples of immune responses that can be treated by administering to a patient are organ transplant rejection, sepsis Includes fulminant shock, tumor-induced cachexia, and a number of autoimmune diseases. Subject Autoimmune diseases that can be treated by the method include type I (insulin-dependent) diabetes, Thyroiditis, sarcoidosis, multiple sclerosis, autoimmune uveitis, ulcerative colitis, malformation Global anemia, systemic lupus erythematosus, rheumatoid arthritis, parasite-induced inflammation and granuloma, Crohn's disease, psoriasis, polymyositis, dermatomyositis, scleroderma, vasculitis, psoriatic arthritis, Abnormal T cell activation, including Labes' disease, myasthenia gravis, Includes diseases mediated by In addition, the methods and compositions of the present invention have a reduced etiological effect. Activated CD28 at least partially+Lymphokines secreted by T cells Cure of various syndromes including septic shock and tumor-induced cachexia mediated by cancer Provide treatment.   The method for treating a disease of the present invention comprises administering an effective amount of a subject oligomer to a patient. It becomes. The exact dose of the CD28-specific oligomer to be administered to the patient, ie That is, the effective amount depends on the particular disease to be treated, the exact oligomer in the therapeutic composition (and Is more than one Oligomers), the age and condition of the patient, and so on. Would. Protocols for the administration of appropriate reagents are well known to those of skill in the art, and Remington's Pharmaceutical Sciences New Edition), Mack Publishing Company, Easton, P. a. And so on.   In addition to administering the CD28 targeting oligomer directly to the patient, the present invention D28+Cells (or cells that have the potential to express CD28) Removed from the patient (with or without), one or more different orientations of the invention Therapeutic methods of transformation with Gomer are possible. Transformation is well known to those skilled in the art Various means, such as electroporation, DOTMA or DOSPA It may be based on any of cationic lipids and the like. Then the trait The transformed cells can be reintroduced into the body.   Another aspect of the invention provides for administering a CD28-specific oligomer. A method for treating an immune disease, wherein the oligomer is a recombinant polynucleotide. It is produced intracellularly via an otide expression vector. CD28 produced intracellularly -Specific A ligomer is not necessarily an RNA or DNA molecule. Polynucleotides of interest Recombinant polynucleotide vectors for the expression of nucleic acid sequences are Well-known to the person. Recombinant vectors for expression of polynucleotides of interest For a detailed description of “Somatic Gene Therapy,   Therapy "P. L. Chang edition, CRC Press, Boca R aton (1995), R.A. C. Mulligan, Science,260: 929-932 (1993); W. Anderson, Science,2 56 : 808-873 (1992); Culver et al., Hum. Gene Th er. ,2: 107-109 and the like. Exempted by genetic engineering A suitable recombinant vector for use in the subject method of treating an epidemic disorder is the T cell genome. That can be integrated into the cell or replicated in the cytoplasm of T cells It is misplaced. The CD28-specific oligomer used for intracellular administration is preferably , Much longer than CD28-specific oligomers for extracellular administration. Intracellular C In a preferred embodiment of the subject method of administering D28, a CD28-specific oligomer is provided. Is complementary to one or more whole CD28 transcripts or the whole CD28 gene However, CD28-specific oligomers produced in appropriate cells The key can be quite short in length. CD28-specifically administered extracellularly Unlike oligomers, CD28-specific oligomers can be taken up or extracellularly Does not present problems with enzymatic hydrolysis. Intracellular CD28-specific oligo The subject method using a mer comprises a recombinant vector encoding a CD28-specific oligomer. May include administering the receptor directly to the patient. Alternatively, the CD28-specific The ligomer-producing vector can be obtained from cells (ie, somatic cells, T cells) , Whole blood, bone marrow, etc.), thereby producing transformed cells. Is done. The transformed cells can subsequently be reintroduced into the patient.   In addition, the present invention particularly relates to expression vectors capable of expressing one or more oligomers of the present invention. To provide In general, such expression vectors are available in operable combinations Polypeptides encoding oligomers capable of inhibiting CD28 expression in motors and T cells Consisting of a nucleotide sequence. Many different promoters can be used with the vectors of the present invention. Although it can be used, preferred promoters are those that are capable of inducing high level expression in T cells. It can be. Currently available departures Current vectors, particularly those explicitly designed for gene therapy, use the C Can be readily adapted for expression of D28-targeted oligomers. The vector is Samb Look, et al., Molecular Cloning, Second Edition, Cold Spri. ng Harbor Press, Cold Spring Harbor, N , Y, (1989) using conventional genetic engineering techniques. D28-can be adapted for expression of targeted oligomers.   Another aspect of the present invention relates to an oligomer according to the present invention for treating an immune system mediated disease. The present invention provides a pharmaceutical formulation for administration of a drug. These pharmaceutical formulations are part of the pharmaceutical sciences. Can be easily produced by those skilled in the field. Such a formulation may comprise one or more oligos of the invention. But consisting of more than one different type of oligomer In embodiments of the present invention, the oligomers are preferably capable of hybridizing to each other. Not selected. The pharmaceutical formulation of the present invention is oral, intravenous, intramuscular, intraperitoneal, Administer to the body in a number of ways appropriate for the chosen mode of administration, including topical administration Can be adapted to In addition to containing one or more different oligomers of the invention, The title pharmaceutical formulation is not one or more biologically active Compounds, ie, stabilizers (to promote long-term storage), emulsifiers, binders, Excipients such as thickening agents, salts, preservatives and the like can also be included.   Formulations for parenteral administration include buffers, diluents, and other suitable additives It can include a sterile aqueous solution, which can be The pharmaceutical formulation of the present invention comprises an orifice in the composition. Gomers can be designed to promote cellular uptake, e.g., It can be encapsulated in a sosome.   Pharmaceutical formulations for topical administration are particularly useful for topical treatment. Prescription for topical treatment Include ointments, sprays, gels, suspensions, lotions, creams and the like. Topical administration Formulations for isopropanol, glycerol, para Known carriers such as fin, stearyl alcohol, polyethylene glycol, etc. Can contain substances. Pharmaceutically acceptable carriers include known chemical absorption enhancers You can also. An example of an absorption enhancer is, for example, dimethylacetamide (US Patent No. 3,472,931), trichloro-ethanol or trifluoroe Tanol (US Pat. No. 3,891,757), certain alcohols, and mixtures thereof (GB 1,001,949) and And British Patent Application No. 1,464,975).   In addition to the therapeutic use of the subject oligomers, the oligomers may be used to study T cell activation. Can also be used as a means of analytical laboratories. T cells are CD28 and antigen specific T It has several surface receptors in addition to cell receptors. Possible between multiple receptor-mediated pathways Of the individual biological properties of the selected receptor for effective and real interactions Difficulties rise with research. Mechanisms for reducing CD28 expression in T cells By providing the oligomer, the oligomers and methods of the present invention can A useful laboratory method for studying T cell behavior independent of tracts is provided.   The present invention can be better understood by reference to the following examples. Examples below Is provided for the purpose of describing the invention and should be construed as a limitation of the invention. is not.VI. Example-Series 1 Oligonucleotide   Oligonucleotides are typically synthesized automatically using phosphoramidite chemistry. Synthesized with a generator (Applied Biosystems model 394). β- Cyanoethyl phosphoramidite, synthesis reagent and CPG polysterene column Appl from ied Biosystems (ABI, Foster City, CA) Purchased. The 3'-AminoModifier C3 CPG column is Glen   Purchased from Research (Sterling, VA). Phosphorothioe For standard oligonucleotides, use a standard oxidation bottle with tetraethylthiura Replace with mdisulfide / acetonitrile and use standard ABI phosphorothioate The program was used for stepwise addition of phosphorothioate linkages. Controlled hole gala After cleavage from the column, the oligonucleotide was concluded with concentrated ammonium hydroxide at 55 ° C. The protecting group was removed by treating the compound for 8 hours. Oligonucleotides, Purified by HPLC using a reverse phase semiprep C8 column (ABI) . Cleavage of the DMT protecting group, treatment with 80% acetic acid and ethanol precipitation followed by formation Purification of the product was performed on an analytical C18 column (Beckman, Fullerton, CA). Assayed by HPLC using All oligonucleotides> 90% pure The tide was lyophilized to dryness. Oligonucleotides are sterilized in deionized water (ICN , Costa Mesa) and evaluation of CD260 nm followed by 400 μm. M, aliquots are collected and kept at -20 ° C prior to the experiment. Existed. In all cases, at least three batches of each oligo listed in Table 1 Nucleotides were used.   Cell lines and T cell purification   By Ficoll-Hypaque density gradient centrifugation of 60 ml blood from healthy donors Peripheral blood mononuclear cells (PBMC) were isolated from buffy coat. Then, T- Cell specific Lymphowik lymphocyte isolation reagents (LK-25T, One   Lambda, Canada Park, CA) to T-cells from PBMC Was purified. Then the average amount 40-60 × 106T-cells were incubated at 37 ° C for 2 hours. 0-30 ml RPMI-AP5 (20 μM HEPES buffer, pH 7.4, 5 % Autologous plasma, RPMI-164 containing 0.05% 2-mercaptoethanol 0 overnight (ICN, Costa Mesa, CA) Any contaminating adherent cells were removed. In all experiments, T-cells were Wash with AP5, then 2-3 × 10696-cells at a cell concentration of cells / ml Plated on well microtiter plates.   T-cell lymphoma cell line, Jurkat E6-1 (CD28 + / CD4 +) Cells (152-TIB) and HUT78 (CD28- / CD4 +) cells (TI B-161) (ATCC, Rockville, MD) with RPMI-10 (20 μM HEPES buffer, pH 7.4, 10% fetal calf serum (FCS) (Hyc Lone, Logan, UT), 1% L-glutamine and 1% penicillin / s RPMI-1640 medium containing treptomycin).   Mitogen-induced T-cell activation and oligonucleotide treatment   Human peripheral T-cell lymphoma cell line (0.2-0.3 × 106Prior to the addition of Duplicate 96-well microtiter plates were purified from anti-CD3 monoclonal Antibody (mAb) (6.25-200 ng / well) (Clone HIT 3 a, Pharmingen, San Diego, CA) Washed twice with phosphate buffered saline, pH 7.4 (PBS). Anti-CD3m Ab-treated T-cells were treated with 2 ng phorbol 12-myristate 13-acetate By adding (PMA) (Calbiochem, La Jolla, CA) Further And incubated at 37 ° C. for 48 hours. Immediately after activation anti-CD3 / PMA-activated T-cells were incubated with 1-20 μM CD28-specific and control oligonucleotides. Treated with nucleotide and retreated after 24 hours. Exempt one of the double plates The supernatant was used for cytokine experiments and the second plate was used for T-cell Used for proliferation analysis.   Immunofluorescence experiments   Following activation, 150 ml of supernatant from the first duplicate microplate was cell induced Transferred to another microplate for analysis of cytokine production. Survive Cells in isotonic saline, pH 7.4 (Becton Dickinson, M. wash, twice, and resuspended in 50 ml of isotonic saline. Divided into two samples. Aliquots of one sample were taken from PE-CD28 / FITC-C Co-stained with D4 or PE-CD54 / FITC-CD25 mAb, Cots stained with PE / FITC-labeled isotype-matched control monoclonal antibody To evaluate non-specific fluorescence. All fluorescent-labeled monoclonal antibodies The body was obtained from Becton Dickinson (San Jose, CA). Was. Using the saturated mAb concentration, Incubation was performed at 4 ° C. for 45 minutes. FACSscan flow cytometer Prior to analysis in a tree (Becton Dickinson), wash in PBS. Unincorporated label was removed by purification. Antigen density gated Measured indirectly in live cells and expressed as mean channel of fluorescence (MCF). Peculiar Expression of specific antigens (CD54, CD25) is determined by FITC- or PE-labeled antigen -Specific mAb stained cells from MCF to FITC- or PE-labeled isotype- Obtained by subtracting the MCF of paired (IgG1) control mAb-stained cells Mean channel shift (MCS). Alternatively, the CD28 mAb CD4 of cells stained with+-Surface expression of a subset of CD28-CD4-cells MCF to CD28+CD4+Control determined by subtracting the MCF of Viability of untreated and oligonucleotide-treated cells was determined by vital (vital) ) By staining with a dye, propidium iodide (5 μg / ml final concentration) Was determined for each batch of all oligonucleotides in multiple donors. Iodide The percentage of viable cells with propidium depletion was over the 1-20 μM dose range. Processing of all batches of all oligonucleotides Later determined by flow cytometry,> 90% (range 90-99%). Was.   Cytokine analysis   Cell-induced human cytokine concentrations were measured in supernatants from the first duplicate microplate. Specified. Mitogen induction at interleukin-2 (IL-2) level The changes were performed using commercially available ELISA kits (R & D system Q). antikine kit, Minneapolis, MN) or IL- For a 2-dependent cell line, CTLL-2 (ATCC, Rockville, MD) It was measured by a bioassay. Interferon-gamma and interferon The mitogen-induced changes in leukin-8 (IL-8) were each determined by Endo. gen (Cambridge, MA) and R & D system (Qua ELISA using a kit from N. kinkine kit, Minneapolis, MN) Was measured by All ELISA results are expressed as pg / ml and CTLL -2 bioassay is expressed as counts per minute, which is the CTLL-2 cell count. By vesicleThreeH-thymidine (ICN, Costa Mesa, Calif.) IL-2 dependent Represents intact cellular uptake.T-cell proliferation assay   The second duplicate microplate in all experiments was mitogen-induced T-cells. Changes in vesicle growth were analyzed. Following activation of anti-CD3 / PMA, oligonucleotides In the absence and presence of otide, cells were cultured with 1 μCi H-thymidine (ICN, C Osta Mesa, CA) and incubated overnight at 37 ° C. Release Mitogen-induced cell proliferation as assessed by incorporation of radioactive label Harvest, Wallac Betaplate Counter (Wallac, Gait hersburg, MD).   CD in human T-cells activated by CD28-specific oligonucleotide Inhibition of 28 expression   Anti-CD3 / PMA treatment of human T-cells was performed with CD2 (using immunofluorescence analysis). 8 from a MCS of 122 ± 7.74 in resting T-cells from 150 ± The MCS was increased to 9.27 (n = 9). In resting and activated T-cells The difference in CD28 expression is defined as mitogen-induced CD28 expression (FIG. 3). A). Figures 3B and 3C show CD28-specific and control animals in two donors. Phosphorothioe of lignonucleotides (Shown as S-oligomer, FIG. 3B) and phosphorothioate-3 ′ amine (Shown as A-oligomer, FIG. 3C) in each form and in two separate batches. Figure 4 shows treatment of anti-CD3 / PMA-activated T-cells with sesame. 2-10 μM In the dose range, four candidate oligonucleotides, RT01-RT04 (Table 1 )), Phosphorothioate and phosphorothioate from RT03 and RT04 Both forms of the oleate 3 'amine are the most active inhibitors of mitogen-induced CD28 expression. Both are 50% (IC50) Beyond the induction CD28 Inhibited the present. These two oligonucleotides, which differ in length, Hybridizes with a stretch of double-stranded DNA 5 ′ upstream of the transcription initiation site of the offspring. It was designed to be. Control oligonucleotide RTC01 (SEQ ID NO: 5) -RT In CO6 (SEQ ID NO: 10) (Table 1), the mitogen-induced CD28 expression was No similar dose-dependent inhibition was observed. All experiments were performed with T from 7 donors. -Performed with at least 3 batches of each oligonucleotide using cells. CD28 The fact that oligonucleotide regulation of expression can be demonstrated in human T-cells is very much is important. Because peripheral, epidermal and cutaneous T-lymphocytes Because it is the intended target of the CD28-specific oligonucleotide.   Mitogen-induced T-cell proliferation by CD28-specific oligonucleotides Inhibition   The mitogenic effect of anti-CD3 / PMA treatment was observed after activation of resting T-cells. Can be indicated by increased proliferation. Expressed as counts per minute BeThreeH-thymidine incorporation was 301641 ± 4785 in activated T-cells. 6 (n = 9) and 650 ± 566 (n = 9) for resting T-cells. T-cell The effects of anti-CD3 and PMA on proliferation were synergistic as shown in FIG. 4A. Was. FIG. 4B shows CD28-specific versus anti-CD3 / PMA-activated T-cell proliferation. Representative experiments showing the effect of different and control phosphorothioate oligonucleotides are shown. You. In at least 7 separate experiments, all in the 2-10 μM dose range , RT03 and RT04 phosphorothioates (data not shown) and phosphorothioates Thioate-3'amine (FIG. 4B) Both forms of mitogen-induced T-cell proliferation It is the most active inhibitor and inhibits T-cell proliferation by up to 45%. Control oligonucleotide Reotide, RTC01 (SEQ ID NO: 6) -RTC06 (SEQ ID NO: 6) No. 10), a similar dose-dependent inhibition of mitogen-induced T-cell proliferation was Not observed. Here, CD28-specific oligonucleotides, RT03 and And treatment with RT04 can reverse the hyperproliferation of activated T-cells, Thus, regulation of the CD28 pathway is critical for T-cell activation, one of T-cell proliferation. It has significant effects on important biological functions.   Activated T-cell derived cytokines by CD28-specific oligonucleotides Inhibition of production   Activated T-cells include IL-2, interferon-gamma and IL-8 Produce various immunomodulatory cytokines. C for TL-2 and IL-8 The D28-inducible restriction element has been shown to be in the promoter sequence for both genes; It has subsequently been shown to be regulated by the CD28 pathway (Fraser Et al., (1991) Science.251: 313-316, Seder et al., ( 1994) J. Am. Exp. Med.179: 299-304). interferon -Gamma has also been shown to be regulated by the CD28 pathway (Wechsl er et al., J. Immunol.153: 2515-2523 (1 994)). Anti-CD3 / PMA treatment of resting T-cells was Dramatically increased the T-cell-induced levels of the protein (FIGS. 5A, 6A and 7A). Figure 5, 6 and 7 are each in activated T-cells from the same representative donor For IL-2, IL-2, interferon-gamma, and IL-8 production The phosphorothioate (B) and phos of the specific and control oligonucleotides 9 shows the effect of the holothioate 3 'amine (C) version. CD28-specific Ligonucleotides RT03 (SEQ ID NO: 3) and RT04 (SEQ ID NO: 4) Mitogen-induced IL-2, interferon-cancer in activated T-cells And dose-dependently inhibited IL-8 production, but with control oligonucleotides, RTC01 (SEQ ID NO: 5) -RTC06 (SEQ ID NO: 10) (data not shown) ) Did not inhibit. Phosphorothioes of CD28-specific oligonucleotides To (IC505 μM) and phosphorothioate-3 ′ amine (IC5010 μM) Both forms were equally active in the 2-10 μM dose range. All three Cytokai Similar results were observed for four or more different donors. These observations Shows that CD28-specific oligonucleotides also bind to CD2 8 shows that multiple effector molecules in eight pathways can be regulated.   Specificity of oligonucleotide inhibition of CD28 expression   The specificity of the CD28-specific oligonucleotides, RT03 and RT04, was 3 Were evaluated by two methods.   (1) CD28-independent T-cell activation marker   The first is that these CD28-specific oligonucleotides are Inhibits expression of other than human T-cell activation markers that act independently of the stimulation pathway It was to judge whether it was possible or not. Activation of resting T-cells is triggered by IL-2 receptor (CD25) and expression of both intracellular adhesion molecule ICAM-1 (CD54) Are significantly increased. However, both of these accessory molecules are It is regulated independently of the road (June et al., Mol. Cell Biol.,7: 4472-4481 (1987), Damle et al. Immunol. ,14 9 : 2541 (1992)). FIG. 8 shows in mitogen-activated T-cells. CD28-specific for CD25 (FIG. 8A) and CD54 (FIG. 8B) and 4 shows the effect of a control oligonucleotide. All CD2 in the 2-10 μM dose range After treatment with 8-specific and control oligonucleotides, CD25 and No significant decrease in activated T-cell expression of both CD54 and CD54 was observed. This is because CD28-specific oligos in inhibiting the expression of their target proteins The nucleotide specificity is clearly shown.   (2) CD28-negative T-cell line, HUT78   The second method uses CD28 +, a T-cell leukemia cell line, Jurkat E6-1. And mitogens in CD28-, a T-cell leukemia cell line, HUT78 By comparing the induced IL-2 production, the -CD28 pathway actually It indicated that it was a target for a specific oligonucleotide. FIG. 9A Shows that constitutive levels of CD28 are activated upon activation in Jurkat E6-1 cells. (FIG. 9B), but CD28 is present in both resting and activated HUT78 cells. This confirms that there is no expression. CD28 + Jurkat E6-1 cells In, the oligonucleotides CD28-specific but not control Togen-induced CD28 expression can be inhibited (FIG. 9C) and mitogen-induced I L-2 production could be inhibited (FIG. 10B). Conversely, CD28-HUT 78 cells Mitogen-induced IL-2 production was CD28-specific and paired. Unaffected by the control oligonucleotide (FIG. 10A). This is CD2 The specificity of these oligonucleotides, which inhibit only 8-regulated IL-2 production, was demonstrated. Shown clearly.   (3)Specific activation of the CD28 pathway   The third method is the same as that used to activate T-cells with mitogen alone. Antibody in combination with mitogen (anti-CD3 / PMA) using one protocol Resting T-cells via CD28 pathway using CD28 monoclonal antibody It was specifically activated. Combined with PMA or anti-CD3 mAb Anti-CD28 mAb previously provided a costimulatory signal for resting T-cells. And CD28-, but not TCR-dependent, T-cell proliferation and cytokine production Have been shown to promote increased dependence only (June et al., (1987) Mo). l. Cell Biol. ,7: 4472-4481). Control oligonucleotide Phosphorothioate and phosphorylation of CD28-specific oligonucleotides but not Suholothioate 3 'amine version has anti-CD28 / mitogen-activity IL-2, IL-8 and interferon-gamma production in activated resting T-cells Raw CD28-dependent activation and T-cell proliferation Could be inhibited (data not shown). This is a CD28-specific oligonucleotide Clearly show that only acts on the CD28 pathway of T-cell activation. VII.Example-Series 2 Oligonucleotide   Oligonucleotides are from Applied Biosystems 394 DN A synthesizer was used. Phosphorothioate linkages convert standard oxidation bottles into tetra Introduced after replacement with ethylthiuram disulphide / acetonitrile. Ori Gonucleotide purity was assessed by analytical HPLC. > 90% pure all Oligonucleotides were lyophilized to dryness and reconstituted in water (400 μM). At least three batches of each oligomer listed in Tables 3 and 5 were used. Oligo The 5 'label of the nucleotide is T4 polynucleotide kinase and32P-γATP Was achieved using   T cell activation experiment   Using density gradient centrifugation followed by Lymphokit (One Lambda) T cell enrichment allows peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) to be isolated from healthy donors. Released. Plus contaminated monocytes Removed by adhesion to tics. Purified T cells have> 99% CD2+, <1% H LA-DR+And <5% CD25+Met. Jarkat E6-1 (CD28+/ CD4+) T cells and HUT 78 (C D28-/ CD4+) T cells and the monocyte cell line THP were obtained from the ATCC. Cells are 0.2-0.3 × 106Per well / plate, plate-immobilized anti- CD3 monoclonal antibody (mAb) (HIT3A 0.25 μg / ml) (P harmingen) and 2 ng phorbol 12-myristate 13-ace Activated with tate (PMA) (Calbiochem).   Immunofluorescence experiments   Cells were isolated from PE-CD28 / FITC-CD4 or PE-CD54 / FITC- Either CD25 mAb or PE / FITC-labeled isotype-matched control ( (Becton Dickinson). Cell surface antigen density (CD2 8, CD54, CD25) are flow cytometry (FACScan, Bect) on Dickinson). Survival rates are Untreated and oligo-treated CD4+In cells, propidium iodide (5 μl g / ml) 48 oligonucleotides with each batch of 1-10 μM of all oligonucleotides. After cuvulation, it was typically> 90% (range 90-99%).   Proliferation and cytokine assays   The proliferative response was over the last 16 hours of each assay.ThreeH-thymidine (1 μCi, IC N) Evaluated by measuring incorporation. Harvest cells on filter, Scintillation of DNA synthesis with Wallac Betaplate counter It was determined by counting. The cytokine concentration in the culture supernatant was IL-2, IL-8 (R & D System) and IFN-γ (Endogen) Using an ELISA kit or using the IL-2-dependent cell line CTLL-2 ( (ATCC).   RT-PCR and Southern analysis   Total cellular RNA was extracted using Trizol reagent (GIBCO / BRL). cDNA synthesis reaction (Promega) is oligomer (dT)FifteenPrimer and AMV reverse transcriptase (HC) was used. PCR reaction (GeneAmp PCR kit, Perkin-Elmer Cetus) contains 3 μl cDNA, dNTPs (200 μM each), 0.5 μM each primer and 1 unit Consisted of a 50 μl mixture containing the kit Taq polymerase. Use The primers used were: CD28, 5'-CTGCCTCTTG GCTCTCAACTT-3 '(sense) and 5' AAGCTATAGCAA   GCCAGGAC-3 '(antisense), interleukin-2 receptor p5 5 alpha chain primer (Stratagene) and pHE7 ribosome Denko. Kao, H .; -T. , Nevins, J. et al. R. (1983) Mol. Ce ll. Biol. 3,2058-2065. Amplification conditions are 94 ° C for 45 seconds. 35 cycles of 1 minute at 57 ° C. and 2 minutes at 72 ° C., followed by 8 minutes at 72 ° C. The PCR products were separated on 2% agarose and 20x Transfer to Hybond N + membrane (Amersham) overnight in SSC, 0.4M   Immobilized using NaOH. Blot32P-γATP-labeled oligonucleotide Hybridization was performed with a tide probe. The washed blots were then transferred to Phosp. Analysis was performed using horImager.MCR and alloantigen-specific T cell assays   For the MLR response, PBMC were converted to HLA-mitomycin C from xenogeneic individuals. -Cultured with treated (50 μg / ml) PBMC (1: 1). Alloantigen-specific In a dynamic T cell assay, PBMCs from healthy donors sensitized with tetanus toxin were simply The released T cells were isolated from tetanus toxin (2 μM / ml, List Biological). cultured with self-mitomycin C-treated PBMC in the presence of s) (1: 1) . In both assays, 2 x 10 cells / well were treated with 37 cells prior to further analysis. The cells were cultured at 6 ° C for 6 days.   In vitro oligonucleotide stability experiments   Temporary oligonucleotide stability analysis was performed as previously described (Tam, RC, Li, Y., Noonberg, S., Hwang, D .; G. FIG. Lui, G .; Hunt, C .; A. Garovoy, M .; R. (199 4) Nucleic Acids Res. ,22, 977-986). Oligo Nucleotide degradation profiles were assessed by electrophoresis and were performed by Nickspin It was quantified using ram.Inhibition of CD28 expression by phosphorothioate oligonucleotides is specific As such, it affects activated T cell function.   FIG. 11 shows surface expression of accessory molecules and in activated T cells. Phosphorothioate oligonucleotides from Table 3 for cytokine secretion The effect of is shown. The oligomer used was a hybrid in the 5 'untranslated region of the CD28 gene. Designed to redisy, either antisense (AS) or G-rich sequences It was. Control oligomers have no sense (SS) or complementary (CS) sequence That was it. 48 h treatment of resting T cells (R) with anti-CD3 antibody and PMA The theory is that the accessory molecules CD28 (A), CD25 (B) and CD54 (C) And cytokines IL-2 (D), IFNγ (E) and IL-8 (F) Expression (Ac) was increased. Data are expressed as mean standard deviation of triplicate samples. 2 μM of phosphorothioate from Table 3 for activation-induced T cell function (細胞) , 5μM The cumulative effect of was determined by immunofluorescence analysis (accessory molecules) and by CTLL- 2 Bioassay (IL-2) and ELISA (IFNγ, IL-8) Secreted cytokines The level was monitored by measurement. Gated raw CD4+Surface in cells Antigen density (MCS) is the increase in mean channel of fluorescence compared to the IgG1 control. And measured.ThreeIL-2-dependent cellular uptake of H-thymidine per minute Of immunoreactive IFNγ and IL-8 in pg / Ml. Experiments performed on T cells, all isolated from a single donor? The data shown obtained are representative of experiments from 9 separate donors.   Data shows that selected phosphorothioate oligomers (Table 3) have CD+4T fine Specific for activation-induced CD28 expression in vesicles Indicates that it can be blocked. In a representative donor (FIG. 11A), activation- Induced CD28 expression was determined by phosphorothioate oligomer RT03S (SEQ ID NO: 44). ) And RT04S (SEQ ID NO: 45) (IC50≦ 5 μM) Was inhibited by IL-2 receptor (CD25) or intracellular adhesion molecule-1 (I CAM-1 or CD54) expression was not. Antisense oligomer RT01S (SEQ ID NO: 42) or RT02S (SEQ ID NO: 43) or control Oligomers RTC01S (SEQ ID NO: 46), RTC02S (SEQ ID NO: 47) And similar inhibition was not observed with RTC06S (SEQ ID NO: 48). Sa In addition, we have found that by blocking transcription in activated human T cells, Provided evidence that active oligomers regulate activation-induced CD28. At 10 μM, not the representative control oligo RTC06S (SEQ ID NO: 48). RT03S (SEQ ID NO: 44) and RT04S (SEQ ID NO: 45) Reduces the expression of activation-induced levels of CD28 but not L-2 receptor mRNA (FIG. 12).   FIG. 12 shows CD28 and CD25 mRNA levels at 10 μM. Effectiveness of phosphorothioate oligonucleotides The result is shown. Using a specific radiolabeled probe, RT-PCR and And Southern analysis, the oligonucleotide RT03S (SEQ ID NO: 44) 4), RTC06S (SEQ ID NO: 64) (lane 5) and RT03D (control Column number: 49) in the presence or absence (lane 2) of (lane 6) Resting of D28 and CD25 mRNA (lane 1) and anti-CD3 / PMA- Activation (6 hours) levels were detected. The CD28 probe uses exon 2 (5'-A CGGGGTTCAACTGTGATGGGGAAATTGGGCAA-3 ') For the IL-2 receptor, the probe is the original primer mix. Generated. Hybridization with probe generated from pHE7 sense primer Following the session, the equivalent load was evaluated. CD28-deficient HUT (7) and The THP (8) cell line was used as a control. The data shown represent three separate experiments. It is something to represent.   Thus, the CD28 mRNA level by the biologically active phosphorothioate Bell's specific inhibition paralleled the effect on the CD28 surface protein. further And the active oligomer is RT01S (SEQ ID NO: 42) or RT02S (SEQ ID NO: 42). No .: 43) Alternatively, control oligomers RTC01S (SEQ ID NO: 46), RTC02S (sequence No. 47) and RTC06S (SEQ ID NO. 48), but not RT03S (SEQ ID NO: 48). (SEQ ID NO: 44) and RT04S (SEQ ID NO: 45) are the cytokines IL-2 Significantly inhibited the anti-CD3 / PMA-induced synthesis of IFNγ and IL-8 ( IC50≦ 5 μM, range 2-10 μM) (FIG. 11B). Lost function.   Since another costimulatory pathway can also induce lymphokine synthesis in activated T cells ( Damle, N.M. K. Krussman, K .; Linsley, P .; S. , Aruffo, A .; (1992) J.I. Immunol. , 148, 1985-1 992), RT03S (SEQ ID NO: 44) and RTO4S (SEQ ID NO: 45) Determining whether the biological activity of is specific for functional CD28 expression Was important. Therefore, we have determined that CD28+(T cell leukemia cell line Ju rkat E6-1) and CD28-(T cell lymphoma cell line HUT78) Of phosphorothioate on anti-CD3 / PMA-induced IL-2 production in mice The results were compared. As summarized in FIG. 13, resting on anti-CD3 antibody and PMA The treatment of the cells (R) for 48 hours CD on Jurkat (A, right) but not on HUT 78 (A, left) cells 28 expression (Ac) was increased. However, activation was not possible with Jurkat (C, Increased IL-2 production in left (left) and HUT 78 (D, left) cells. . 1 μM And active oligonucleotides RT03S (SEQ ID NO: 44) and RT04S (SEQ ID NO: 45) shows CD28 expression (B) and I in activated Jurkat cells. L-2 levels (C, right) were inhibited, but activated HUT 78 cells (D, right) Had no effect on CD28-independent IL-2 secretion. Indicated Data is representative of three separate experiments.   In FIG. 13A, quiescence and activation were determined by immuno-flow cytometry analysis. The absence of CD28 expression in both HUT78 cells was confirmed, while Jur Activation in kat E6-1 cells increased constitutive levels of CD28 . Furthermore, in Jurkat E6-1 cells, RT03S (SEQ ID NO: 44) And RT04S (SEQ ID NO: 45) (range 1-10 μM) activate-induced C D28 expression (FIG. 13B) and IL-2 production (FIG. 13C) were significantly inhibited. Opposition Activated HUT 7 Eight cells produced similar levels of IL-2, but with comparable lymphokines No go-dependent inhibition was observed (FIG. 13D).   We also found that specific anti-CD28m in combination with anti-CD3 Ab Directed T Cell Activation (CD28, IL-2, IL-8 and I FNγ) is blocked by biologically active phosphorothioate oligomers (Data not shown). Direct cross-linking of CD28 molecules leads to T cell expansion CD28-dependent but not TCR-dependent increase in proliferation and cytokine production Has been shown previously (June, CH, ledbett). er, J. et al. A. , Gillespie, M .; M. , Lindsten, T .; , T hompson, C.M. B. (1987) Mol. Cell Biol. , 7,44 72-4481). Taken together, our data show that active oligomers Strongly suggests that the biological activity of T-cells is specific for the CD28 pathway of T cell activation Hinting.   Inhibition of T cell proliferative response and phospho in alloantigen-dependent T cell assays Primary allogenic mixing with rothioate oligonucleotides Lymphocyte reaction   We then proceed to block the antigen-specific primary immune response in vitro. The CD28-specific oligonucleotide RT03S (SEQ ID NO: 4) 4) and RT04S (SEQ ID NO: 45) were compared. FIG. 14 shows CD2 Resting (A, B) and activating (E, F) levels of tetanus toxin-specific T cells Assays (top panels, A and B) and mixed lymphocyte reaction (bottom panels, E And F). CD4+, The percentage of CD28-hiT cells is A , B, E and F are indicated by symbols on the right side. The oligomer activity was 1 μm from Table 1. M The holothioate oligonucleotide was tested for CD28-hi expressed T in each assay. Decrease the percentage of cells (C, G) and activated T cell proliferation (D, H) 2 Evaluated by the ability of single additions (0 and 96 hours). Activation of T cells In response to tetanus toxin (top panel) or mitomycin-C treated stimulant PB Induced after stimulation of responder T cells (X) by MC (Y) (bottom panel). These data are representative of three separate experiments.   In FIG. 14, tetanus toxin-specific T cell assay (FIG. 1) Using both 4B) and the primary mixed lymphocyte reaction (FIG. 14F), we Generation of a subpopulation of activated-induced CD28-hi expressing T cells after 6 days of assay The current was observed. RT03S (SEQ ID NO: 44) and RT04S (SEQ ID NO: 4) 5) As a result of the addition of (2-10 μM), CD28-hi expression decreased in a dose-dependent manner. (FIG. 14C, 14G), tetanus toxin-specific (FIG. 14D) and responder cell antigen -Specific (Fig. 14H) T cell proliferation was correspondingly reduced. RT01S (SEQ ID NO: : 42) or control oligomer RTC01S (SEQ ID NO: 46), RTC02S (SEQ ID NO: 47) or RTC06S (SEQ ID NO: 48) showed no similar effect. I wasn't.   In vitro oligonucleotide stability is determined by phosphorothioate oligonucleotides Prolongs the biological activity of otide.   Modification of oligomers at phosphorothioate internucleotide linkages is a nucleus Confer resistance to zeolites, thus increasing in vitro biological activity from 1-2 hours to 24 hours It is known that it can be extended (Stein, CA, Cheng, YC. (1993) Science 261, 1004-1012). Table 4 is persistent Presence (C) or subsequent extracellular medium on day 2 (D) in the removal of these oligonucleotides, Holothioate RT03S (SEQ ID NO: 44) and RTC06S (SEQ ID NO: 44) 48) shows a temporary effect. Monitoring is by immunoflow cytometry went. The results show that activated T cells (MCFA) And oligonucleotide-treatment activity Transformed T cells (MCFX) Is expressed as the difference in surface antigen expression. On the second or fourth day CD28 expression in resting T cells in the range 119-121. "ND" Indicates that there is no discernable difference.   As shown in Table 4, the duration of the effect of RT03S (SEQ ID NO: 44) was 24 hours And persists through days 2, 3 and 4 for the oligomer dose Was. However, extracellular media on day 2 of RT03S (SEQ ID NO: 44) , The inhibitory activity is maintained for 24 hours and then within the next 24 hours It has completely disappeared. For a representative control oligo, RTC06S (SEQ ID NO: 48) No oligomer activity was observed over the same time course. Activation T fine A similar phenomenon was observed with oligo-mediated inhibition of cell growth (data not shown). E The increased bioavailability provided by the suholothioate modification alone results in RT03 The significantly prolonged biological activity of S (SEQ ID NO: 44) cannot be explained. Therefore, the book We believe that the duration of the prolonged effect is due to the secondary structure of RT03S (SEQ ID NO: 44). Has been shown to be associated with additional in vitro stability provided by .   FIG. 15 shows extracellular supernatant (top panel) and Jurkat cell lysate (bottom panel). Flannel)32P-labeled phosphorothioate RT03S (SEQ ID NO: 44) Results for in vitro stability of RTC and RTC06S (SEQ ID NO: 48) Dress up Confuse. (A) Time-dependent degradation of each oligonucleotide (2000 cpm) (0 -96 hours), electrophoresis on a 20% polyacrylamide denaturing gel, followed by Evaluated by visualization using Phosphormagger. (B) Time t = Complete length remaining at each time point relative to 032P-RT03S (SEQ ID NO: 44) (°) and32Percent of P-RTC06S (SEQ ID NO: 48) (•) Were obtained from 10,000 cpm of extracellular supernatant and Nickspin cells from cell lysate. Measured on ram (Pharmacia) eluate. Molecular weight standard (Std), P- dNTP (N) and free32P-orthophosphate (P) was analyzed simultaneously.   In FIG. 15A, the electrophoresis image shows the extracellular supernatant (S) and the cell lysate (L). For both, RTC after 96 hours incubation with Jurkat cells. 06S (SEQ ID NO: 48)32P-labeled RT03S (sequence No. 44) is clearly shown. Nickspin column The data is consistent with this observation (FIG. 15B). Here, RT0 after 96 hours Complete oligomer recovered from 3S (SEQ ID NO: 44) was 54% (S) and 59% (L) Thus, those from RTC06S (SEQ ID NO: 48) are 10% (S) and 34% ( L). In addition, the secondary structure alone has its phosphorodiester counter Part RT03D has almost biological activity from in vitro stability studies. Not (Table 5), which had only a 24-hour half-life (data not shown). , Increased nuclease resistance and biological activity of RT03S (SEQ ID NO: 44) Not enough to explain sexual persistence.  In preparing the data in Table 5, the phosphorothioate oligonucleotide -In vitro activity of CD28 expression in anti-CD3 / PMA-activated peripheral T-cells The ability to inhibit expression and activated IL-2 production in Jurkat T cells. Determined by your ability to do so. The results show that the inhibition range was CD28 from 7 experiments. 5 μM at the current 52-79% and the range of IL-2 production is 76-89%   Expressed as a relative value to the activity (100%) of RT03S (SEQ ID NO: 44) . Values for the phosphodiester form of RT03D (SEQ ID NO: 49) are in parentheses. Put in.   Identification of the smallest sequence conferring biological activity in vitro   Active phosphorothioate RT03S (SEQ ID NO: 44) is a human C28 gene An 18-mer originally designed to hybridize to the 5 'untranslated region of the offspring , A sequence containing two sets of four consecutive Gs. Activity in human T cells Sex-induced CD28 expression and CD28-dependent I in Jurkat T cells To identify sequence-related factors that are critical for inhibition of L-2 production, bases were converted to RT Selectively add, delete or substitute for the 03S Activity was evaluated (Table 5). Addition of three Gs at the 5 'end (RT04S) or four G-sequences ( In the region between RT05S (SEQ ID NO: 51) and RT09S (SEQ ID NO: 52) The change of one or more T's to A's is relative inhibition to RT03S (SEQ ID NO: 44). Did not reduce the harm effect. Interestingly, the sense sequence (RT11S (SEQ ID NO: No .: 50)) shows the change in relative activity to RT03S (SEQ ID NO: 44). I didn't. However, conversely, four G (RT10S (SEQ ID NO: 53) , RT24S (SEQ ID NO: 54), RT25S (SEQ ID NO: 55), RT23S Deletion of one or more Gs in both sets of (SEQ ID NO: 56) (SEQ ID NO: 56) or Is the result of substitution with cytosine (C), resulting in a change in RT03S (SEQ ID NO: 44). Significant loss of relative activity. First four in RT03S (SEQ ID NO: 44) Deletion of 6 residues on the 5 'side of G was performed using oligonucleotide (RT18S (SEQ ID NO: No .: 57)) had no effect on the inhibitory activity. Conversely, both 4 G sequences A decrease (RT19S (SEQ ID NO: 58)) or an increase (RT20S (position Column number: 61), RT21S (SEQ ID NO: 62)) is RT03S (SEQ ID NO: 44) dramatically reduced its relative inhibitory activity. TGGGGG, Contains four consecutive G's, such as GGGG or RT15S (SEQ ID NO: 63) Sequence has little or no relative inhibitory activity against RT03S (SEQ ID NO: 44). Did not have. These data indicate the biological properties of RT03S (SEQ ID NO: 44). Activity consists of two sets of four consecutive G's separated by 3-5 residues It shows that it depends on a specific sequence motif.   Immune tolerance conferred by disrupting CD28 function (Boussi otis, V .; A. , Freeman, G .; J. Gray, G .; , Gribb en, J. et al. , Nadler, L .; M. (1993) J. Amer. Exp. Med. , 17 8,1753-1763), oligo-mediated inhibition of CD28 expression is Induces T cell anergy and alloantigen-specific immune tolerance in vitro It was important to find out if this could be a more effective strategy. The present invention We have found that phosphorothioate oligomer RT03S (SEQ ID NO: 44) and R T04S lowers both mRNA and mature protein levels relative to oligomer dose Human CD4+Anti-CD3 / PMA-induced C in T cells It was shown that D28 expression was inhibited. In addition, to demonstrate target specificity, the present invention Those who have I Oligo-mediated effects on L-2 receptor and ICAM-1 expression: CD28 pathway Accessory molecules (Daml) that are known to be regulated independently of e, N. K. (1992) J. et al. Immunol. 148, 1985-199 2; H. (1987) Mol. Cell Biol. 7,44 72-4481; Stein, C.I. A. Et al. -C. (1993) Science ce 261, 1004-1012; Boussiotis, V .; A. (1 993) J. Exp. Med. 178, 1753-1763). Correspondingly Activation messages and protein levels of CD25 and surface expression of CD54 At present it was resistant to oligomer action.   Co-stimulation via the CD28 pathway is associated with IL-2, IFNγ and Indirectly induces expression of immunoregulatory cytokines such as IL-8 and IL-8 (Fra , Ser. D. Et al., (1991) Science 251, 313-316. Jenkins, M .; K. (1991) J. Am. Immunol. 147, 24 61-2466; Seder, R .; A. (1994) J. Am. Exp. Med. 1 79, 299-304; Wechsler, A .; S. (1994) J. Am. Imm unol. 153, 2515-2523). Active CD28-specific for successful tolerogenicity The target oligomer must inhibit this function. Conclusion of administration of active oligomer As a result, activation-induced IL-2, IFNγ and IL-8 production were simultaneously regulated. To highlight the intense specificity of active oligomers that inhibit CD28-dependent function In addition, we found that they were activated in the CD28-deficient cell line HUT78. -Indicates that it cannot prevent induced IL-2 production. Furthermore, activated T- The maximum oligo-mediated inhibition of IL-8 production in cells never exceeds 50%, It holds another regulatory pathway that induces CD28-independent IL-8 production. Suggest that Inhibition of activation-induced CD28 levels resulted in both MLR and As T cell proliferation was dramatically reduced in the tetanus-toxin-specific T cell assay Oligomer activity was not restricted to polyclonally activated T cells . Thus, our active oligomers are alloantigen-specific in vitro. Mediates tolerance and was observed with CTLA 4 Ig, a high affinity B7 binder T cell low responsiveness (Tan, P., Anasetti, C., Hansen) , J. et al. A. , Melrose, J. et al. Brunvand, M .; , Bradshaw, J .; , Ledbetter, J. et al. A. , Linsley, P . S. (1993) J. Amer. Exp. Med. 177, 165-173) Provide a promising alternative to ligand capture strategies.   In measuring the duration of the effect of an active pharmacophore, we used RT 03S (SEQ ID NO: 44) surprisingly 96 hours after oligomer treatment Even, persistent inhibition of both activated CD28 expression and CD28-dependent T cell proliferation Was observed. The complete reversal of the inhibitory activity was 24 Biological activity was not associated with toxicity as it occurred within hours. In addition, Suholothioate RT03S (SEQ ID NO: 44) and RT06S (SEQ ID NO: 48), our in vitro stability experiments show that RT03S (control The secondary structure mediated by the G-rich sequence in SEQ ID NO: 44) is typical Increases the nuclease activity associated with phosphorothioate by 2- to 4-fold (Stein, CA, Cheng, YC (1993)). Science 261, 1004-1012).32P-RT03S (SEQ ID NO: : 44) The extended half-life of the And correlated. In addition, the phosphodiester of RTO3D (RT03S (SEQ ID NO: 44)) Stella counterparts) have reduced in vitro stability and biological activity. And previous reports (Maltese, J.-Y., Sharma, HW, Vas. silev, L .; Narayanan, R .; (1995) Nucleic A cids Res. 23, 1146-1151). Follow Thus, the stability conferred by the secondary structure is simply that of RT03S (SEQ ID NO: 44). It is not the cause of the increased biological activity. Thus, phosphorothioate The nuclease stability conferred by both modification and secondary structure is RT03S ( Explain the extended inhibitory activity of SEQ ID NO: 44).   Hybridization-dependent antisense and antigene models Single base pair substitutions can substantially reduce activity (Maltese , J. et al. -Y. , Sharma, H .; W. , Vassilev, L .; , Naray anan, R .; (1995) Nucleic Acids Res. , 23,1 146-1151). Conversely, the activity of the CD28-specific oligomer is 4 G Subsequent replacements in both sets Dramatically reduced only when they came, showing defined structural requirements for oligomer function Incited. In addition, a secondary structure cation present in RT03S (SEQ ID NO: 44) After stabilization (100 mM KCl and NaCl), the oligomer melting curve was G- Suggest quartet formation (Hardin, CC, Watson, T., C orregan, M .; , Bailey, C .; (1992) Biochemist ry 31, 333-841) showed a transfer profile (data not shown). Taken together, our data suggest that this class of CD28-specific oligomers Is acting via a hybridization-independent mechanism, presumably The secondary structure of the sequence defines the limits of oligomer activity through G-quartet formation. Provide evidence that you are. Similarly, Bennett, C .; F. , Chian g, M. Y. , Wilson-Lingardo, L .; Wyatt, J .; R. (1994) Nucleic Acids Res. 22,3202-3209 Indicate that the activity of their phosphorothioate oligomers is more than two consecutive G Which is based on possible G-quartet formation in sequences containing This is because oligo-mediated regulation of human phospholipase A is specific nucleic acid- It was suggested that it was through protein interaction.   Specific protein recognition by a range of G-quartet structures is Black (Burnburn, EH (1990) J. Biol. Chem. 2) 65, 5919-5921), the switch region of immunoglobulin (Shimizu) , A. Honjo, T .; (1984) Cell 36, 801-803) and A class of regulatory oligomers called Bo and aptamers (Bo ck. L. C. Griffin, L .; C. , Latham, J .; A. , Ver masas, E.A. H. , Toole, J .; J. (1992) Nature 355 Huizenga, D., 564-566; E. FIG. , Szostak, J .; W. ( 1995) Biochemistry 34, 656-665; Bergan, R. , Connell, Y .; Fahmy, B .; , Kyle, E.A. , Necke rs, L .; (1994) Nucleic Acids Res. 22,2150 −2154). In our experiments, we found that No. (Smith, FW, Feigon, J. (1992) Natu) re 356, 164-167) from a set of four consecutive G's G- Oligomers capable of forming quartet structures weakly inhibited CD28 expression. This example Has been shown by others that its G-rich sequence inhibits c-myc expression. (Burguess, TL, Fisher, EF, Ross) s, S. L. Bready, J .; V. , Qian, Y .; -X. , Bayewi tch, L .; A. Cohen, A .; M. , Herrera, C .; J. , Hu, S. S. -F. , Kramer, T .; B. , Lott, F .; D. , Matrin , F. H. Pierce, G .; F. , Simonet, L .; , Farrell , C.I. L. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 14) RT15S (SEQ ID NO: 63). Was. Another G-rich structure, the intermolecular G-quartet, is an aptamer of thrombin. -Has been shown to mediate inhibition (Wang, KY, McCurdy, S. , Shea, R .; G. FIG. Swamitanthan, S .; , Bolton, P. H. (1993) Biochemistry 32, 1989-1904; Macaya, R .; F. , Schultze, P .; , Smith, F .; W. , R oe, J .; A. , Feigon, J. et al. (1993) Proc. N atl. Acad. Sci. ScL USA 90, 3745-3749). RT03S Sequence analysis of (SEQ ID NO: 44) revealed residues 3-4, 7-8, 12-13 and 16 -17 pairs G could potentially form such a G-quartet structure. Predict. However, residues 1-6 (RT18S, which disrupts the intramolecular quartet) (SEQ ID NO: 57)) removal of CD28 expression and CD28-dependent IL-2 It was insufficient to block production inhibition. These data are RT0 The activity of 3S (SEQ ID NO: 44) is shown in alternate G- Suggests arising from the lutet structure.   RT03S (SEQ ID NO: 44) is in fact essential for dimer G-quartet formation Motifs predicted by others (Smith, FW, Feigon, J .; (1993) Biochemistry 32, 8682- 8692). Dimer G-quartets are alternately parallel And two strands of DNA that are antiparallel. Here, there are four consecutive chains Provide 4 G's that form a stacked G-quartet. 4 consecutive bases The motif of each chain consisting of 12 residues separating two sets of four G Success And related to stability. The present inventors have determined that the core 12-mer sequence (RT18S ( Column No. 57)) has the same activity as RT03S (SEQ ID NO: 44). Indicated. In addition, G to C substitutions (RT10S (SEQ ID NO: 53, RT23S (SEQ ID NO: 56), RT24S (SEQ ID NO: 54), RT2 As a result of 5S (SEQ ID NO: 55)), relative to RT03S (SEQ ID NO: 44) The inhibitory activity was lost by 56-69%. Similarly, insertion of a base that separates a set of G ( RT20S (SEQ ID NO: 61), RT21S (SEQ ID NO: 62)) or deletion ( RT19S (SEQ ID NO: 58)) reduced relative biological activity by 52-70%. Was. Taken together, these data indicate the ability to form dimer G-quartets Is a phosphorothioate oligo for functional CD28 expression -Suggests that it is very important for mediated inhibition.   Mechanism by which this type of dimer G-quartet exerts its biological effects Is unknown. However, some lines of evidence are probably Competitively evaluates the interaction between the mer G-quartet promoter sequence and specific transcription factors By interfering, this motif de-activates our active oligomers. Supports the hypothesis that it can function as a carp. 1) CD28 The oligomer corresponding to the upstream region of the gene (RT11S (SEQ ID NO: 50)) is R It exhibited a biological activity equivalent to T03S (SEQ ID NO: 44). 2) The present inventors Active oligomers function via a non-antisense mechanism. 3) These e Rigomers regulated CD28 mRNA expression; thus, their biological activity was directly It was not directly related to the target protein interaction. 4) G-rich promoter region Region is predominant (Evans, T., Schon, E., Grazyna, GM. , Patterson, J .; , Estraiadis, A .; (1984) Nu cleic Acids Res. 12,8043-805; Kilpatri ck, M .; W. , Torri, A .; Kang, D .; S. Engler, J. et al. A. , Wells, R .; D. (1986) J. Am. Biol. Chem. 261,1 1350-11354; Clark, S .; P. Lewis, C .; D. , Fel Senfeld, G .; , (1990) Nucleic Acids Res. 18 , 5119-5126), where the G-quartet-forming promoter sequence is a common promoter. Increase the likelihood of a nodal phenomenon. 5) Double-stranded oligomer Can act as a decoy for the transcription factor E2F (Morishita, R .; Gibbons, G .; H. , Horuchi, M .; Ellisson, K .; E . , Nakajima, M .; , Zhang, L .; , Kaneda, Y .; , Ogi hara, T .; , Dzau, V .; J. (1995) Proc. Natl. Aca d. Sci. USA 92, 5855-5859). 6) G-rich oligomer Mediates induction of the Spl transcription factor (Perez, JR et al. , Li, Y .; , Stein, C .; A. , Majunder, S .; , Van Oo rshot, A .; Narayan, R .; (1994) Proc. Natl . Acad. Sci. USA 91, 5957-5961).                          Incorporation by source   All patents, patent applications, and publications cited are incorporated by reference and incorporated herein by reference. I reckon.                                  Equivalent   The above specification is interpreted as being sufficient to enable one skilled in the art to practice the invention. Is done. In fact, one skilled in the art of organic chemistry or related Obvious to the person The various modifications described are intended to be within the scope of the following claims.

【手続補正書】 【提出日】平成１０年８月２８日（１９９８．８．２８） 【補正内容】 請求の範囲 １． Ｔ細胞においてＣＤ２８遺伝子発現を低下させることができるオリゴマー 。 ２． 該オリゴマーがＣＤ２８遺伝子転写体にハイブリダイズできる請求項１記 載のオリゴマー。 ３． 該オリゴマーがＣＤ２８の開始コドンにハイブリダイズする請求項２記載 のオリゴマー。 ４． 該オリゴマーがＣＤ２８遺伝子にハイブリダイズできる請求項１記載のオ リゴマー。 ５． 該オリゴマーがＣＤ２８の転写開始コドンにハイブリダイズする請求項４ 記載のオリゴマー。 ６． 該オリゴマーが少なくとも１１以上５０以下の核酸塩基からなる請求項１ 記載のオリゴマー。 ７． 該オリゴマーがＤＮＡまたはＲＮＡ分子である請求項１記載のオリゴマー 。 ８． ２２未満の塩基を有し、配列５’ＴＴＧＴＣＣＴＧＡＣＧＡＴＧＧＧＣＴ Ａ３’（配列番号：１）を含む請求項１記載のオリゴマー。 ９．２２未満の塩基を有し、配列５’ＡＧＣＡＧＣＣＴＧＡＧＣＡＴＣＴＴＴＧ Ｔ３’（配列番号：２）を含む請求項１記載のオリゴマー。 １０． ２２未満の塩基を有し、配列５’ＴＴＧＧＡＧＧＧＧＧＴＧＧＴＧＧＧ Ｇ３’（配列番号：３）を含む請求項１記載のオリゴマー。 １１． ２２未満の塩基を有し、配列５’ＧＧＧＴＴＧＧＡＧＧＧＧＧＴＧＧＴ ＧＧＧＧ３’（配列番号：４）を含む請求項１記載のオリゴマー。 １２． ３ないし５個の塩基によって離されたＧＧＧＧの少なくとも２の配列よ りなる１１ないし５０塩基を持つホスホロチオエート骨格を有する請求項１記載 のオリゴヌクレオチド。 １３． 少なくとも部分的にＣＤ２８によって媒介される病気の治療に用いる医 薬組成物の製造における請求項１に記載のオリゴマーの使用であって、治療法が 該オリゴマーを有効量患者に投与する工程よりなる事を特徴とする使用。 １４． 少なくとも部分的にＣＤ２８によって媒介される病気の治療に用いる医 薬組成物の製造における３乃至５個の塩基によって離されたＧＧＧＧの少なくと も２の配列よりなる１１乃至５０塩基を有するオリゴマーの使用であって、該治 療法が該オリゴマーを有効量患者に投与する工程よりなる事を特徴とする使用。 １５． 該オリゴマーが配列５’ＴＴＧＧＡＧＧＧＧＧＴＧＧＴＧＧＧＧ３’（ 配列番号：３）よりなる請求項１３記載の使用。 １６． 該オリゴマーが配列５’ＧＧＧＴＴＧＧＡＧＧＧＧＧＴＧＧＴＧＧＧＧ ３’（配列番号：４）よりなる請求項１３記載の使用。 １７． 該投与工程がさらに以下の工程： 患者からＣＤ２８−発現細胞を取り出し； 該オリゴマーを該細胞に導入し、それにより、オリゴマーで形質転換された細 胞が生じ、次いで、該オリゴマーで形質転換された細胞を患者に戻すことよりな る請求項１３−１６記載の使用。 １８． 該投与工程がさらに以下の工程： ドナーからＣＤ２８−発現細胞を取り出し； 該オリゴマーを該細胞に導入し、それにより、オリゴマーで形質転換された細 胞が生じ、次いで、該オリゴマーで形質転換された細胞を患者に導入することよ りなる請求項１３−１６記載の使用。 １９． 該オリゴマーが発現ベクターの転写によって生じたものである請求項１ ３−１６記載の使用。 ２０． ベクターが、作動可能な組合せにおいて、プロモーター、およびＴ細胞 におけるＣＤ２８の誘導性発現を阻害できるオリゴマーをコードするポリヌクレ オチドよりなる組換え発現ベクター。 ２１． 請求項１記載のオリゴマーよりなる医薬処方。 ２２． 該オリゴマーが長さが１１ないし５０塩基であって、３ないし５個の塩 基によって離されたＧＧＧＧの少なくとも２つの配列よりなる請求項２１記載の 医薬処方。 ２３． 該オリゴマーが長さが１８ないし５０塩基であって、配列５’ＴＴＧＧ ＡＧＧＧＧＧＴＧＧＴＧＧＧＧ３’（配列番号：３）よりなる請求項２１記載の 医薬処方。 ２４． 該オリゴマーが長さが１８ないし５０塩基であって、配列５’ＧＧＧＴ ＴＧＧＡＧＧＧＧＧＴＧＧＴＧＧＧＧ３’（配列番号：４）よりなる請求項２１ 記載の医薬処方。 ２５． 請求項２１−２４記載の少なくとも２つの異なるオリゴマーよりなる医 薬処方。 ２６． 該処方が非経口投与に適した請求項２１−２５記載の医薬処方。[Procedure amendment] [Date of submission] August 28, 1998 (1998.8.28) [Content of amendment] Claims 1. Oligomers capable of reducing CD28 gene expression in T cells. 2. 2. The oligomer according to claim 1, wherein said oligomer is capable of hybridizing to a CD28 gene transcript. 3. 3. The oligomer according to claim 2, wherein said oligomer hybridizes to a start codon of CD28. 4. 2. The oligomer according to claim 1, wherein said oligomer is capable of hybridizing to the CD28 gene. 5. The oligomer according to claim 5, wherein the oligomer hybridizes to a transcription initiation codon of CD28. 6. The oligomer according to claim 1, wherein the oligomer comprises at least 11 and no more than 50 nucleobases. 7. 2. The oligomer according to claim 1, wherein said oligomer is a DNA or RNA molecule. 8. 2. The oligomer according to claim 1, having less than 22 bases and comprising the sequence 5 'TGTTCCTGACGATGGGGCT A3' (SEQ ID NO: 1). 2. The oligomer according to claim 1 having less than 9.22 bases and comprising the sequence 5'AGCAGCCTGAGCATCTTTGT T3 '(SEQ ID NO: 2). 10. 2. The oligomer according to claim 1, having less than 22 bases and comprising the sequence 5'TTGGAGGGGGTGGTGGGG G3 '(SEQ ID NO: 3). 11. 2. An oligomer according to claim 1 having less than 22 bases and comprising the sequence 5'GGGTTGGAGGGGGGTGGTGGGG3 '(SEQ ID NO: 4). 12. 2. The oligonucleotide according to claim 1, having a phosphorothioate backbone with 11 to 50 bases consisting of at least two sequences of GGGG separated by 3 to 5 bases. 13. Use of an oligomer according to claim 1 in the manufacture of a pharmaceutical composition for the treatment of a disease mediated at least in part by CD28, wherein the method of treatment comprises administering to the patient an effective amount of the oligomer. Characterized use. 14． Use of an oligomer having 11 to 50 bases consisting of at least 2 sequences of GGGG separated by 3 to 5 bases in the manufacture of a pharmaceutical composition for use in the treatment of a disease mediated at least in part by CD28. The use wherein the method of treatment comprises administering to the patient an effective amount of the oligomer. 15. 14. Use according to claim 13, wherein said oligomer consists of the sequence 5'TTGGAGGGGGTGGGTGGG3 '(SEQ ID NO: 3). 16. 14. Use according to claim 13, wherein said oligomer consists of the sequence 5'GGGTTGGAGGGGGTGGTGGGGG 3 '(SEQ ID NO: 4). 17． Removing the CD28-expressing cells from the patient; introducing the oligomer into the cells, thereby producing cells that have been transformed with the oligomer, and then cells that have been transformed with the oligomer. 17. The use according to claims 13-16, comprising returning to the patient. 18. Removing the CD28-expressing cells from the donor; introducing the oligomer into the cells, thereby producing cells transformed with the oligomer, and then cells transformed with the oligomer 17. The use according to claims 13-16, comprising introducing to the patient. 19. 17. Use according to claims 13-16, wherein said oligomer is produced by transcription of an expression vector. 20. A recombinant expression vector wherein the vector comprises, in operable combination, a promoter and a polynucleotide encoding an oligomer capable of inhibiting inducible expression of CD28 in T cells. 21. A pharmaceutical formulation comprising the oligomer of claim 1. 22. 22. The pharmaceutical formulation according to claim 21, wherein said oligomer is 11 to 50 bases in length and consists of at least two sequences of GGGG separated by 3 to 5 bases. 23. 22. A pharmaceutical formulation according to claim 21 wherein said oligomer is 18 to 50 bases in length and consists of the sequence 5'TTGG AGGGGGTGGTGGGG3 '(SEQ ID NO: 3). 24. 22. The pharmaceutical formulation according to claim 21, wherein said oligomer is 18 to 50 bases in length and consists of the sequence 5'GGGTTGGAGGGGGTGGTGGGGG3 '(SEQ ID NO: 4). 25. Pharmaceutical formulations comprising at least two different oligomers according to claims 21-24. 26. The pharmaceutical formulation according to claims 21-25, wherein said formulation is suitable for parenteral administration.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＭ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，Ｂ Ｒ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＥＥ，ＦＩ，ＧＥ，ＨＵ ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ， ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，Ｎ Ｏ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of front page    (81) Designated countries EP (AT, BE, CH, DE, DK, ES, FR, GB, GR, IE, IT, LU, M C, NL, PT, SE), AM, AU, BB, BG, B R, BY, CA, CN, CZ, EE, FI, GE, HU , JP, KE, KG, KP, KR, KZ, LK, LR, LT, LU, LV, MD, MG, MN, MW, MX, N O, NZ, PL, RO, RU, SD, SI, SK, TJ , TT, UA, UZ, VN

Claims (1)

【特許請求の範囲】 １．Ｔ細胞においてＣＤ２８遺伝子発現を低下させることができるオリゴマー 。 ２．該オリゴマーがＣＤ２８遺伝子転写体にハイブリダイズできる請求項１記 載のオリゴマー。 ３．該オリゴマーがＣＤ２８の開始コドンにハイブリダイズできる請求項２記 載のオリゴマー。 ４．該オリゴマーがＣＤ２８遺伝子にハイブリダイズできる請求項１記載のオ リゴマー。 ５．該オリゴマーがＤ２８の転写間始コドンにハイブリダイズする請求項４記 載のオリゴマー。 ５．該オリゴマーが少なくとも１１以上５０以下の核酸塩基からなる請求項１ 記載のオリゴマー。 ６．該オリゴマーがＤＮＡまたはＲＮＡ分子である請求項１記載のオリゴマー 。 ７．２２未満の塩基を有し、配列５’ＴＴＧＴＣＣＴＧＡＣＧＡＴＧＧＧＣＴ Ａ３’（配列番号：１）を含む請求項１記載のオリゴマー。 ８．２２未満の塩基を有し、配列５’ＡＧＣＡＧＣＣＴＧＡＧＣＡＴＣＴＴＴ ＧＴ３’（配列番号：２）を含む請求項１記載のオリゴマー。 ９．２２未満の塩基を有し、配列５’ＴＴＧＧＡＧＧＧＧＧＴＧＧＴＧＧＧＧ ３’（配列：３）を含む請求項１記載のオリゴマー。 １０．２２未満の塩基を有し、配列５’ＧＧＧＴＴＧＧＡＧＧＧＧＧＴＧＧＴ ＧＧＧＧ３’（配列番号：４）を含む請求項１記載のオリゴマー。 １１．３ないし５個の塩基によって離されたＧＧＧＧの少なくとも２の配列よ りなる１１ないし５０塩基を持つホスホロチオエート骨格を有する請求項１記載 のオリゴヌクレオチド。 １２．少なくとも部分的にＣＤ２８によって媒介される病気の治療方法であっ て、該方法が有効量の請求項１記載のオリゴマーを患者に投与する工程よりなる 該方法。 １３．少なくとも部分的にＣＤ２８によって媒介される病気の治療方法であっ て、該方法が有効量の３ないし５個の塩基によって離されたＧＧＧＧの少なくと も２の配列よりなる１１な いし５０塩基を有するオリゴマーを患者に投与する工程よりなる該方法。 １４．該オリゴマーが配列５’ＴＴＧＧＡＧＧＧＧＧＴＧＧＴＧＧＧＧ３’（ 配列番号：３）よりなる請求項１３記載の方法。 １５．該オリゴマーが配列５’ＧＧＧＴＴＧＧＡＧＧＧＧＧＴＧＧＴＧＧＧＧ ３’（配列番号：４）よりなる請求項１３記載の方法。 １６．該投与工程がさらに以下の工程： 患者からＣＤ２８−発現細胞を取り出し； 該オリゴマーを該細胞に導入し、それにより、オリゴマーで形質転換された細 胞が生じ、次いで、該オリゴマーで形質転換された細胞を患者に戻すことよりな る請求項１２−１５記載の方法。 １７．該投与工程がさらに以下の工程： ドナーからＣＤ２８−発現細胞を取り出し； 該オリゴマーを該細胞に導入し、それにより、オリゴマーで形質転換された細 胞が生じ、次いで、該オリゴマーで形質転換された細胞を患者に導入することよ りなる請求項１２−１５記 載の方法。 １６．該オリゴマーが発現ベクターの転写によって生じたものである請求項１ ２−１５記載の方法。 １７．該ベクターが、作動可能な組合せにおいて、プロモーター、およびＴ細 胞におけるＣＤ２８の誘導性発現を阻害できるオリゴマーをコードするポリヌク レオチドよりなる組換え発現ベクター。 １７．請求項１記載のオリゴマーよりなる医薬処方。 １８．該オリゴマーが長さが１１ないし５０塩基であって、３ないし５個の塩 基によって離されたＧＧＧＧの少なくとも２つの配列よりなる請求項１７記載の 医薬処方。 １９．該オリゴマーが長さが１８ないし５０塩基であって、配列５’ＴＴＧＧ ＡＧＧＧＧＧＴＧＧＴＧＧＧＧ３’（配列番号：３）よりなる請求項１７記載の 医薬処方。 ２０．該オリゴマーが長さが１８ないし５０塩基であって、配列５’ＧＧＧＴ ＴＧＧＡＧＧＧＧＧＴＧＧＴＧＧＧＧ３’（配列番号：４）よりなる請求項１７ 記載の医薬処方。 ２１．請求項１７−２０記載の少なくとも２つの異なるオリゴマーよりなる医 薬処方。 ２２．該処方が非経口投与に適した請求項１７−２１記載の医薬処方。[Claims]   1. Oligomers capable of reducing CD28 gene expression in T cells .   2. 2. The oligomer of claim 1, wherein said oligomer is capable of hybridizing to a CD28 gene transcript. Oligomers listed.   3. 3. The method of claim 2, wherein said oligomer is capable of hybridizing to the initiation codon of CD28. Oligomers listed.   4. 2. The method of claim 1, wherein said oligomer is capable of hybridizing to the CD28 gene. Rigomer.   5. 5. The oligomer of claim 4, wherein said oligomer hybridizes to a D28 transcriptional start codon. Oligomers listed.   5. 2. The oligomer according to claim 1, wherein the oligomer comprises at least 11 and no more than 50 nucleobases. The oligomer as described above.   6. 2. The oligomer according to claim 1, wherein said oligomer is a DNA or RNA molecule. .   With less than 7.22 bases and the sequence 5'TTGTTCCTGACGATGGGGCT 2. The oligomer according to claim 1, comprising A3 '(SEQ ID NO: 1).   Having less than 8.22 bases and having the sequence 5'AGCAGCCTGAGCATCTTT 2. The oligomer according to claim 1, comprising GT3 '(SEQ ID NO: 2).   With less than 9.22 bases and the sequence 5'TTGGAGGGGGTGTGTGGGGG 2. The oligomer according to claim 1, comprising 3 '(sequence: 3).   10. The sequence 5'GGGTTGGAGGGGGTGGGT having less than 10.22 bases 2. The oligomer according to claim 1, comprising GGGG3 '(SEQ ID NO: 4).   11. at least two sequences of GGGG separated by 3 to 5 bases 2. A phosphorothioate skeleton having 11 to 50 bases. Oligonucleotides.   12. A method of treating a disease mediated, at least in part, by CD28. Wherein the method comprises the step of administering to the patient an effective amount of the oligomer of claim 1. The method.   13. A method of treating a disease mediated, at least in part, by CD28. Thus, the method comprises at least one of GGGG separated by an effective amount of 3 to 5 bases. 11 consisting of 2 arrays Administering the oligomer having 50 bases to the patient.   14． The oligomer has the sequence 5 'TTGGAGGGGGTGGTGGGGG3' ( 14. The method according to claim 13, comprising SEQ ID NO: 3).   15. The oligomer has the sequence 5'GGGTTGGAGGGGGTGGTGGGGG 14. The method according to claim 13, comprising 3 '(SEQ ID NO: 4).   16. The administration step further comprises the following steps:   Removing CD28-expressing cells from the patient;   The oligomer is introduced into the cells, whereby the cells transformed with the oligomer are introduced. Vesicles form, and then return the cells transformed with the oligomer to the patient. 16. The method according to claim 12-15.   17． The administration step further comprises the following steps:   Removing CD28-expressing cells from the donor;   The oligomer is introduced into the cells, whereby the cells transformed with the oligomer are introduced. Cells are formed, and then the cells transformed with the oligomer are introduced into a patient. Claim 12-15 The method described.   16. 2. The oligomer according to claim 1, wherein said oligomer is produced by transcription of an expression vector. The method according to 2-15.   17． The vector comprises, in operable combination, a promoter and a T-cell. Encoding an oligomer capable of inhibiting inducible expression of CD28 in cells A recombinant expression vector comprising leotide.   17． A pharmaceutical formulation comprising the oligomer of claim 1.   18. The oligomer is 11 to 50 bases in length and has 3 to 5 salts 18. The method of claim 17, comprising at least two sequences of GGGG separated by a group. Pharmaceutical prescription.   19. The oligomer is 18 to 50 bases in length and has the sequence 5'TTGG 18. The method according to claim 17, comprising AGGGGGTGGGTGGGG3 '(SEQ ID NO: 3). Pharmaceutical prescription.   20. The oligomer is 18 to 50 bases in length and has the sequence 5'GGGT 18. It comprises TGGAGGGGGTGTGGGGG3 '(SEQ ID NO: 4). A pharmaceutical formulation as described.   21. A medical device comprising at least two different oligomers according to claims 17-20. Drug prescription.   22. The pharmaceutical formulation according to claim 17-21, wherein said formulation is suitable for parenteral administration.
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