【発明の詳細な説明】
Gタンパク質共役受容体を用いた標的遺伝子導入
関連出願情報
本出願は1997年6月26日に出願された(アメリカ)合衆国仮出願第60/050,843
号の恩典を請求するものである。
政府支援陳述
本発明は(米国)国立衛生研究所から授与された認可番号HL51818号下に政府
の支援によりなされた。政府は本発明における一部の権利を有する。
発明の分野
本発明は真核細胞への核酸の導入に有効な方法および系に関する。
発明の背景
特定の外来または天然遺伝子配列を哺乳動物細胞へ導入するとともにその遺伝
子の発現を調節する能力は、医学および生物学の研究分野において重要な意味が
ある。このような能力は遺伝子調節の研究、および疾患を治療する治療的主剤の
デザインのための手段を提供する。
特定の外来または天然遺伝子配列の哺乳動物細胞への導入は、まず遺伝子配列
を適切な核酸ベクターへ導入することにより促進される。このような組換えベク
ターを所望の宿主細胞へ導入することが可能である各種方法が開発されている。
DNA形質転換またはトランスフェクションを含む方法に対して、ウイルスベク
ターの使用により広範囲の宿主細胞に組換え分子を迅速に導入することができる
。特に、ウイルスベクターは宿主細胞への組換え核酸ベクターを導入する効率を
増大するために使用されている。哺乳動物細胞における外来遺伝子の形質導入お
よび発現のためのベクターとして使用されているウイルスの中には、SV40ウ
イルス(例えば、H.Okayamaら、Molec.Cell Biol.5,1131-1142(1985)参照
)、ウシパピローマウイルス(例えば、D.DiMaioら、Proc.natl.Acad.Sci.
USA 79,4030-4034(1982)参照)、アデノウイルス(例えば、J.E.Morinら、P
roc.Natl.Acad.Sci.USA 84,4626(1987)参照)、アデノ随伴ウイルス(A
AV、例えば、N.Muzyczkaら、J.Clin.Inves.94,1351(1994)参照)、単
純ヘルペスウイルス(例えば、A.l.Gellerら、Science 241,1667(1988)参照
)、などがある。
哺乳動物細胞へ組換え分子を導入する努力は、上述したウイルスまたはレトロ
ウイルスで感染される多くの細胞の無力により阻害されている。例えば、レトロ
ウイルスでの制限として、ウイルス受容体として使用される膜タンパク質の発現
レベルに部分的に基づく比較的限られた宿主範囲が挙げられる。M.P.Kavanaugh
ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91,7071−7075(1994)。
したがって、技術上、標的細胞に遺伝子を導入し、発現させる方法の改良が必
要である。
発明の要約
受容体媒介遺伝子導入の現在の方法の欠点は、本発明の方法および複合体によ
り克服される。特に、本発明は、細胞表面受容体により摂取されるウイルスベク
ターの速度制限ステップが、当初考えられていたように、ウイルスの受容体との
結合事象ではなく、受容体自体のインターナリゼーションであるという、本発明
人による意外な発見に基づくものである。したがって、本発明は、真核細胞内へ
の核酸の導入を促進する新しい複合体に関する。本発明は、特異的細胞型への転
移ベクターのターゲッティング、細胞へのベクターの付着およびベクターの細胞
性インターナリゼーションの調節を可能とする。
本発明は、細胞によりインターナリゼーションされる受容体に転移ベクターを
結合することを含む。この受容体は、特異的リガンドへの細胞の曝露時に細胞に
よりインターナリゼーションされるか、またはそのために受容体が誘導されて該
リガンドへの曝露によりインターナリゼーションするとみられるか、いずれかで
る受容体である。
図面の簡単な説明
図1は、本発明のウイルス受容体複合体を示す略図である。この図はインター
ナリゼーションする7つの膜貫通受容体にターゲッティングされるアデノウイル
スを示す。
図2は、本発明の特別の実施例を略図で示す。
図3は、ルーメンNECA(A2bアゴニスト)、イソプロテレノール(isopro
terenol)、ブラジキニン、またはATP(すべて10-4M)に対するヒト気道
上皮のC1分泌反応のグラフ表示である。
図4Aは、連続的に投与され(○)、または予め形成された抱合体(▲)とし
てのHA−P2Y2−A9と比較したA9ヌル細胞(●)におけるbs−Ab濃
度と遺伝子導入効率との間の用量効果関係のグラフ表示である。
図4Bは、特異的または非特異的bs−Abで前処理したHA−P2Y2−A
9およびA9ヌル細胞における、またはATPγSでの前処理によるHA−P2
Y2受容体の長期にわたる脱感作後におけるbs−Abによる遺伝子導入の増大
の特異性を評価する試験のグラフ表示である。
図5は、HA付加(tagged)BKII受容体を発現するヌルA9およびA9細胞
におけるbs−Abによる遺伝子導入のグラフ表示である。
図6は、HA付加(tagged)P2Y2受容体とβ2受容体およびアデノウイル
ス線維タンパク質に対するbs−AbによるCHO細胞内の遺伝子導入のグラフ
表示である。
図7は、野生型(■)以外のアストロサイトーマ細胞を発現する(●)P2Y2
受容体におけるイノシトールリン酸のビオチン−UTP刺激のグラフ表示であ
る。
図8は、ビオチン−Adに対するストレプトアビジンにより抱合されるビオチ
ン−UTP存在下のA9(wt)およびHA−P2Y2−A9細胞における遺伝
子導入の刺激のグラフ表示である。
図9Aは、P2Y2受容体を発現するアストロサイトーマ細胞におけるU2P4
およびUTPのアゴニスト潜在能の比較のグラフ表示である。
図9Bは、嚢胞性線維症痰におけるUTPと比較したU2P4の代謝安定性のグ
ラフ表示である。
発明の詳細な説明
本発明について、本発明の好ましい実施例が示された添付図面を参考にして以
下にさらに詳細に述べる。しかし、本発明は多くの異なる態様で実施することが
でき、本明細書中に記載された実施例に限定されると解釈するべきではない。む
しろ、これらの実施例は、本開示が当業者に対して発明の範囲を完全にカバーす
るように提供される。同じ数字は同じ要素を指す。
本発明の移入ベクター受容体複合体は、細胞内にインターナリゼーションされ
ることが可能である受容体に結合される移入ベクターを含む。移入ベクターは外
来核酸配列(例えば、遺伝子)を含むとともに、外来のタンパク質またはペプチ
ドを発現することができる。以下でさらに詳細に述べる特に好ましい実施例にお
いて、移入ベクターは受容体に対して特異的な抗体、前記受容体を特異的に結合
する移入ベクターにより発現されるペプチド、または天然もしくは修飾リガンド
のそれぞれにより7膜貫通(7−TM)受容体にターゲッティングされる。移入
ベクターは、以下でさらに詳細に述べるように、ウイルスベクター、プラスミド
、オリゴヌクレオチド、またはRNA/DNAキメラ分子を含む適切なベクター
のいずれでもよい。7−TM受容体と標的複合体との相互作用により受容体−複
合体インターナリゼーションが生じ、それにより移入ベクターにより保持される
ヘテロ核酸を発現される細胞内に導入する。
本発明のウイルス移入ベクター
本発明の1実施例を図1を参考にして述べる。この実施例では、本発明の複合
体(すなわち、抱合体)が7−TM受容体20に付着したウイルスベクター10
(図中ではアデノウイルスとして示されている)を含み、受容体20は細胞表面
100に存在する。ウイルスベクター10は二重特異性架橋(bridging)抗体3
0により7−TM受容体20に付着されている。二重特異性架橋抗体30はウイ
ルスベクターを特異的に結合する1抗体40からなる。抗体40は、7−TM受
容体20を特異的に結合する抗体50に化学架橋されている。
ウイルスベクター10はアデノウイルスベクター(AdV)として図示されて
いるが、本発明は、ヒトおよび非ヒトのレトロウイルス(すなわち、モロニーマ
ウス白血病ウイルスおよびレンチウイルスなどマロニーウイルス)ベクター、ア
デノ随伴ウイルス(AAV)ベクター、およびヘルペスウイルスベクターを含む
が、これらに限定されない他のウイルスベクターで実施できることが理解される
(図2)。本発明のウイルスベクターは弱毒ウイルスであってもよく、または当
業者に周知の方法のいずれかにより非複製的に提供されてもよい。
しかし、ベクターとしてアデノウイルスを使用が現在、好ましい。
本発明のウイルスベクターは外来核酸の含有能を有することになる。ヘテロ核
酸の送達は標的細胞内のヘテロ核酸の複製、およびその後のヘテロタンパク質の
生成を促進する。本明細書中ではヘテロタンパク質が標的細胞のタンパク質また
はフラグメントとして規定され、タンパク質のすべてまたは1部分は標的細胞で
表されていない。核酸または遺伝子配列は、細胞内に遺伝子を送達するために用
いられるウイルスベクターの野生型(例えば、野生型アデノウイルスゲノム)に
天然に存在しない場合はヘテロと言われる。本明細書中で用いられる「核酸配列
」または「遺伝子配列」という用語は、核酸分子(好ましくはDNA)を指示す
ることが意図されている。この遺伝子配列はDNA、cDNA、合成DNA、R
NAまたはその組合せから誘導され得る。この遺伝子配列は、天然に発生するイ
ントロンを含有することも含有しないこともあるゲノムDNAを含有し得る。さ
らに、このゲノムDNAはプロモーター配列またはポリアデニル化配列と関連し
て得ることができる。本発明の遺伝子配列はcDNAであることが好ましい。ゲ
ノムDNAまたはcDNAはいくつかの方法で得ることができる。ゲノムDNA
は技術上周知の手段により適切な細胞から抽出するとともに精製することができ
る。または、mRNAを細胞から分離するとともに、これを用いて逆転写、また
は他の手段によりcDNAを調製することができる。
本発明のベクターを構成するための標準技術は当業者に周知であり、Sambrook
ら、分子クローニング:実験マニュアル第2版(Cold Spring Harbor,NY,1989
)などの引例に見ることができる。DNAのフラグメントを連結するために各種
の方法が利用可能であり、その選択はDNAフラグメントの末端の性質に依存す
るとともに、その選択は当業者により容易になされる。
当業者には正しく認識されるように、挿入されるヘテロ遺伝子配列または各配
列の核酸配列はいすれの核酸配列でもよい。例えば、挿入されるヘテロ遺伝子配
列はレポーター遺伝子配列または選択可能なマーカー遺伝子配列でもよい。本明
細書中で用いられるレポーター遺伝子は、発現されていると、その存在または活
性をモニターすることができるタンパク質が生成されることになる遺伝子配列で
ある。適切なレポーター遺伝子の例として、ガラクトキナーゼ、β−ガラクトシ
ダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、β−ラクタマーゼ
、等の遺伝子が挙げられる。または、レポーター遺伝子配列は、その発現が細胞
生理に影響を及ぼす遺伝子産物を生成する遺伝子配列であってもよい。
選択可能なマーカー遺伝子は、タンパク質の発現能のある遺伝子配列であって
、その存在によってそのタンパク質を含有する細胞を選択的に増殖させることを
可能にするような遺伝子配列である。選択可能なマーカー遺伝子の例として、抗
生物質(例えば、ピューロマイシン、アンピシリン、テトラサイクリン、カナマ
イシン、等)に対する宿主耐性を付与し、またはアミノ酸類似体に対する宿主耐
性を付与し、もしくは付加炭素源またはその他の許容不可能な培養条件下に細菌
の増殖を可能とすることができる遺伝子配列が挙げられる。遺伝子配列がレポー
ター遺伝子と選択可能なマーカー遺伝子の両方であってもよい。本発明の最も好
ましいレポーター遺伝子は、大腸菌(E.coli)のβ−ガラクトシダーゼをコー
ドするlacZ遺伝子、およびピューロマイシン耐性をコードする遺伝子である
。
好ましいレポーター遺伝子または選択可能なマーカー遺伝子配列は、正常細胞
におけるベクターの認識または選択を十分に可能とする。本発明の1実施例では
、レポーター遺伝子配列は哺乳動物細胞に通常認められない酵素または他のタン
パク質をコードし、したがって、その存在はこのような細胞におけるベクターの
存在を明確に確立することができる。
ヘテロ遺伝子配列には、適切な生物学的活性タンパク質またはポリペプチド、
免疫原性または抗原性タンパク質もしくはポリペプチド、または治療的活性タン
パク質もしくはポリペプチドのコード配列も含まれる。好ましくは、ヘテロ遺伝
子配列は治療的活性タンパク質またはポリペプチドである。特に好ましい1実施
例では、ヘテロ遺伝子は嚢胞性線維症膜貫通調節(CFTR)タンパク質または
生物学的活性類似体、フラグメント、またはその誘導体をコードする。または、
ヘテロ遺伝子配列には、アンチセンスRNA配列などRNA配列に対して相補的
な配列が含まれ、このアンチセンス配列は個体に投与して個体の細胞における相
補的ポリヌクレオチドの発現を抑制することができる。
ヘテロ遺伝子の発現は免疫原性または抗原性タンパク質もしくはポリペプチド
を供給して抗体反応を達成し、この抗体は動物の血液、血清または腹水など体液
から採取することができる。
もちろん、挿入されるヘテロ遺伝子配列として、プロモーター、開始配列、ま
たはプロセシング配列をすでに保持する遺伝子配列を使用することが可能である
。
本発明の非ウイルスベクター
他の好ましい実施例では、移入ベクターは非ウイルスである。他の適切なベク
ターとして、オリゴヌクレオチド(RNA、DNA、合成および修飾核酸を含む
)、プラスミド、およびE.Kometzにより報告されたRNA/DNAキメラ分子
が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の非ウイルス移入ベクターは、
ウイルスベクターに関して上述した外来核酸を含むこともできる。オリゴヌクレ
オチド、プラスミド、およびRNA/DNAキメラ分子は、技術上周知の適切な
方法により合成または生成することができる。
本発明の7膜貫通受容体
本発明による受容体は7−TM受容体のファミリーに属する。一般に、S.Wat
sonら、The G-Protein Linked Receptor FacsBook,Academic Press,New York
(1994)、Kingらに対する米国特許第5,482,835号を参照。
当業者であれば、7−TM受容体がGタンパク質共役受容体であることを正し
く認識する。哺乳動物のGタンパク質共役受容体、およびこれらの受容体をコー
ドする核酸配列であればすべて、本発明の実施に使用することができる。このよ
うな受容体として、ドーパミン受容体、ムスカリン性コリン作動性受容体、∀−
アドレナリン作動性受容体、オピエート受容体、カンナビノイド受容体、セロト
ニン受容体、β−アドレナリン作動性受容体、およびプリン受容体(purincepto
rs)が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書中で用いられる「受容体
」という用語は、言及された受容体のサブタイプ、および同受容体をコードする
核酸配列とともに、突然変異株や相同体を包含することが意図されている。
好ましくは、本発明による使用のための7−TM受容体はプリン受容体(例え
ば、P2Y1、P2Y2、P2Y4、P2Y6およびP2YII)、アドレナリン作動
性受容体(すなわち、A1、A2、およびA3、ならびにそのサブタイプ)、ブ
ラジキニン受容体(例えば、BKIおよびBKII)、またはβ−アドレナリン受
容体(例えば、β1、β2およびβ3)である。また、C5A補体受容体も好ましい
。さらに好ましいのは、P2Y2、BKII、A2B、β2、およびC5A受容体であり
、P2Y2が最も好ましい。このため、本発明を実施するために用いられるリガ
ンドとして、ヌクレオチド、ヌクレオシド、カテコールアミン(例えば、ドーパ
ミン、5−ヒドロキシトリプトファン)、C5A、およびブラジキニンが挙げら
れる。
P2Y2(P2Uとしても知られる)−プリン受容体は、ATP、UTPおよび
その類似体との活性化時にインターナリゼーションを受ける。これらの受容体型
はヒト呼吸上皮のルーメン表面で数が豊富である。Mason,S.J.ら、1991、Br
.J.Pharmacol.103,1649-1656。ATP/UTPによるこれらの受容体の活性
化によるAdVのP2Y2受容体との分子接合は、エンドソーム内へのベクター
リガンド受容体のインターナリゼーションにつながるため、WD上皮内へのAd
Vの代替エントリー経路を供給し、その後の遺伝子発現につながる。
本発明の抗体
図1および図2に示されているように、ヘテロ核酸を保持する移入ベクターを
細胞内のインターナリゼーションのための7−TM受容体にターゲッティングす
る1つの方法は、二重特異性架橋抗体によるものである。一般に、二重特異性抗
体は目的の移入ベクターと7−TM受容体の両方のエピトープ(すなわち、移入
ベクターを特異的に認識する結合領域および7−TM受容体を特異的に認識する
結合領域)に対して向けられ、それにより移入ベクターと受容体との間の「架橋
」を形成する。7−TM受容体への二重特異性架橋抗体の結合には受容体のイン
ターナリゼーションが含まれる。結合抗体移入ベクター複合体は7−TM受容体
とともにインターナリゼーションされ、それによりヘテロ核酸を保持する移入ベ
クターを細胞内に導入する。本発明のこの実施例によれば、移入ベクターはウイ
ルスベクターであることが好ましく、AdVがさらに好ましく、二重特異性抗体
はアデノウイルスの線維(こぶ)タンパク質に対して向けられるモノクローナル
抗体を含む。
本明細書中で用いられる「抗体」という用語は、IgG、IgM、IgD、お
よびIgEを含む全種類の免疫グロブリンを指示する。もちろん、IgMおよび
IgGが特に好ましい。これらの抗体はモノクローンまたはポリクローンであっ
てよく、(例えば)マウス、ラット、ウサギ、ウマ、またはヒトを含むいずれの
種の起源でもよく、キメラ抗体であってもよい。例えば、M.Walkerら、Molec.
Immunol.26,403-11(1989)を参照。これらの抗体はReadingの米国特許第4,47
4,893号、またはCabillyら、米国特許第4,826,567号に記載された方法に従って
生成される組換えモノクローン抗体であってもよい。また、これらの抗体はSege
lらの米国特許第4,676,980号に記載された方法に従って生成される特異性抗体に
より化学的に構成することもできる。
抗体はポリクローンまたはモノクローンであってもよく、モノクローンが好ま
しい。好ましい実施例では、これらの抗体は標的受容体と移入ベクターの両方に
特異的である架橋抗体である。この実施例によれば、架橋抗体はアデノウイルス
線維(こぶ)タンパク質に向けられたモノクローン抗体であることが好ましい。
また、目的の7−TM受容体の特異性エピトープに向けられたモノクローン抗体
も好ましい。
7−TM受容体に対する抗体により結合されるエピトープ(すなわち、特異性
結合部位)に結合する抗体は、競合的結合測定法における7−TM受容体に対す
る標識抗体と競合する能力など周知の方法に従って同定することができる。
本発明の範囲内に含まれる抗体フラグメントとして、例えば、Fab、F(a
b’)2フラグメントおよびFcフラグメント、ならびにIgG以外の抗体から
得られる対応するフラグメントが挙げられる。このようなフラグメントは周知の
方法により生成することができる。
本発明を実施するために使用されるポリクローン抗体は、周知の方法に従って
、7−TM受容体に対するモノクローン抗体が結合する抗原で適切な動物(例え
ば、ウサギ、ヤギ、等)を免疫化し、その動物から免疫血清を採取するとともに
、その免疫血清からポリクローン抗体を分離することにより生成することができ
る。
本発明を実施するために使用されるモノクローン抗体は、KohlerとMilstein、
Nature 265,495-97(1975)の方法に従ってハイブロドーマ細胞株において生成
することができる。例えば、適切な抗体を含有する溶液をマウスに注入し、十分
な時間後に、マウスを屠殺して脾細胞を得ることができる。次に、典型的にはポ
リエチレングリコールの存在下に、脾細胞を骨髄腫細胞またはリンパ腫細胞で融
合することで不死化し、ハイブリドーマ細胞を生成する。次にハイブリドーマ細
胞を適切な培地で増殖させ、所望の特異性を有するモノクローン抗体のために上
清をスクリーニングする。モノクローンFabフラグメントは当業者に周知の組
換え技術により大腸菌において生成することができる。例えば、W.Huse,Scien
ce 246,1275-81(1989)を参照。
7−TM(例えば、P2Y2)受容体に対して特異的な抗体は、技術上周知の
タンパク質展示ファージ法により得ることもできる。当業者であれば、本明細書
中に開示された方法を実施するために有用とみられるその多くの特異的イムノア
ッセイフォーマットおよび変種に精通することになる。一般に、E.Maggio、酵
素イムノアッセイ、(1980)(CRC Press,Inc.,Boca Raton,FL)を参照、ま
た「リガンド−受容体相互作用の調節方法およびその応用」という名称のSkold
らに対する米国特許第4,727,022号、「抗原のイムノアッセイ」という名称のFor
restらに対する米国特許第4,659,678号、「モノクローン抗体を用いたイムノメ
トリックアッセイ」という名称のDavidらに対する米国特許第4,376,110号、「特
異的受容体アッセイにおける巨大分子環境制御」という名称のLitmanらに対する
米国特許第4,275,149号、「チャネリングを使用した試薬および方法」という名
称のMaggioらに対する米国特許第4,233,402号、および「標識として補酵素を使
用したヘテロ特異性結合アッセイ」という名称のBoguslaskiらに対する米国特許
第4,230,767号を
参照。出願人は特に、本明細書中に引用される米国特許の引例すべての開示を本
明細書中で参考として援用することを意図している。
本明細書中に記載した抗体は、沈降など周知の方法に従って診断的アッセイに
適切な固形支持体(例えば、ラテックスやポリスチレンなどの材料で形成された
ビード、プレート、スライドまたはウェル)と結合することができる。同様に、
本明細書中に記載された抗体は、周知の方法に従って、放射性同位体標識(例え
ば、35S、125I、131I)、酵素標識(例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、
アルカリホスファターゼ)、および蛍光標識(例えば、フルオレセイン)など検
出可能な群に結合することができる。本明細書中で用いられる「抗原等価体」と
いう用語は、それにより等価が確立されるように求められるタンパク質またはペ
プチドに結合する抗体に結合するタンパク質またはペプチドを指示する。このよ
うな抗原等価体を選択するために用いられる抗体は、本明細書中では「選択抗体
」と呼ばれる。
非抗体に基づくターゲッティング法
本発明はインターナリゼーションのために7−TM受容体に移入ベクターをタ
ーゲッティングする手段として二重特異性架橋抗体に関して上述されている。図
2に示されているように、代替のターゲッティング法として、ペプチドおよび7
−TM受容体アゴニスト/アンタゴニストを利用した方法が挙げられる。
ペプチドに関して、ペプチドは7−TM受容体に結合する天然リガンドであり
得る。7−TM受容体のペプチドアゴニストおよびアンタゴニストは技術上周知
である。また、新規の7−TM受容体アゴニスト/アンタゴニストが、Kingらに
対する米国特許第5,482,835号により記載されたように同定することができる。
または、このペプチドはタンパク質展示ファージ法、または7−TM受容体に結
合する技術上の他の方法により同定することができる。
ペプチドを合成または生成する方法は技術上周知である。特別な1実施例では
、ペプチドをコードする核酸が、AdVこぶタンパク質をコードする遺伝子に融
合または挿入され、こぶペプチドキメラタンパク質が発現されるようにする。例
えば、外来核酸がこぶタンパク質のC末端またはH1ループ領域で発現し得るこ
とが知られている。別の実施例では、ペプチドのコンカトマーが発現される。
さらに別の代替として、「受容器体(receptorbodies)」に組込まれたペプチ
ドでターゲッティングを達成することができる。一般に、受容器体は7−TM受
容体に結合するペプチドが受容体の細胞内領域に置換される切れた(truncated
)受容体である。例えば、切れたBKII受容体を7−TM受容体のためのペプチ
ドリガンドに融合することができる。この複合体は切れた受容体によりこぶタン
パク質領域におけるブラジキニンを発現する組換えAdVに結合する。こうして
、切れたBKII受容体に融合されたペプチドリガンドはこの複合体を細胞表面の
そのコグネイト受容体にターゲッティングする。
さらに別の代替では、移入ベクターは7−TM受容体の化学的に連結された高
アフィニティーアゴニスト/アンタゴニストにより7−TM受容体にターゲッテ
ィングすることができる。高アフィニティーアゴニスト/アンタゴニストは、上
述したように、ペプチドであってもよい。または、ATP、UTP、ジヌクレオ
チド(以下でさらに詳細に述べる)、およびその誘導体など他の分子である。
特別の1実施例では、P2Y2受容体のターゲッティングアゴニストとしてビ
オチン(B)−UTPが用いられる。B−UTPはストレプトアビジン(SA)
の存在下にビオチン化ウイルス移入ベクターと相互作用し、P2Y2受容体にタ
ーゲッティングされるウイルス−ビオチン−SA−ビオチン−UTP複合体を示
すことがある。または、オリゴヌクレオチド、プラスミド、およびRNA/DN
Aキメラ分子を合成または生成し、B−UTPまたは他の適切な標識ヌクレオチ
ドを組込むことができる。
さらに別の実施例では、以下でさらに詳細に述べるようにスルホ−N−ヒドロ
キシスクシンイミド(NHS)を用いて高アフィニティーアゴニスト/アンタゴ
ニストを移入ベクターに直接連結することができる。
ビオチンおよび共有抱合体
本発明を実施するために用いることができる化合物の例として、式:
[化1][式中、Aはプリン基またはピリミジン基(例えば、アデニン、グアニン、チミ
ン、シトシン、ウラシル)(それぞれのプリンまたはピリジン基は、プリンの場
合に窒素3との共有結合により、またはピリミジンの場合に窒素1との共有結合
により、リボースまたはデオキシリボース環に接合されることが好ましい)、R1
はHまたはOH、およびnは1ないし6、好ましくは3または4である。]を
有する化合物が挙げられる。移入ベクターは、適切な位置(例えば、ピリミジン
の炭素5、またはプリンの炭素2もしくは8)での結合ポリマー鎖の共有的接合
によるなど適切な手段により、共有的または非共有的にプリン基またはピリミジ
ン基、もしくは対応するリボースまたはデオキシリボース環に接合または結合さ
れされ、その結合基にリガンドが共有的に付着し、またはその結合基にビオチン
基が付着し、ビオチン基はリガンド(以下参照)に接合されるとともに2つのビ
オチン基は互いに両方のビオチン基が接合または結合するアビジン基の手段によ
り接合される。
本発明を実施するために用いることができるリガンドの特別な例として、式:
[化2]
[式中、AおよびBはそれぞれ独立してプリン基またはピリミジン基(例えばア
デニン、グアニン、チミン、シトシン、ウラシル)であり、好ましくは、Aはウ
ラシルおよびBはシトシンであり;
R1およびR2はそれぞれ独立してHまたはOHからなる群から選択され;
nは1ないし6、好ましくは3または4であり;
前記移入ベクターは、上述と同じように、AまたはB、もしくは結合基の手段
により直接的または間接的のいずれかにより、AまたはBが結合されているリボ
ースまたはデオキリボースに共有的または非共有的に結合または接合されている
]を有するリガンドが挙げられる。
本発明を実施するために用いられる結合基は、一般に、水溶性ポリマーおよび
水不溶性ポリマーを含むポリマーである。水溶性、または親水性の結合基が好ま
しい。これらのポリマーは反復モノマー単位の延長自在鎖であり、その連鎖長に
沿って官能基を保持または含有し得る。典型的に共有結合により、リガンドまた
はベクターの結合基として機能するように機能化できる多数のポリマーが周知で
あり、当業者には容易に正しく認識されよう。例として、デキストランなど多糖
類、ポリビニルアルコール、ポリリシンなどポリペプチド、およびポリアクリル
酸が挙げられるが、これらに限定されない。リガンドおよびベクターは、その遊
離鎖端を含むいずれかの立体配座または位置における結合基に結合し得る。一般
に、結合基は2ないし24個の炭素の鎖を含むことになり、上述したように置換
されることが最適である。
ビオチンは従来の技術によりリガンドに共有的に接合されるとともに、両方の
ビオチン基は周知の技術に従ってアビジンまたはストレプアビジン基に接合され
、ベクターおよびリガンドの抱合体を形成することができる。
ビオチンが共有的に接合されるリガンドの例として、
[化3]
[式中、R2はHまたはOH、好ましくはOHであり;nは1ないし4に等しく
、好ましくは3である。]が挙げられる。このような化合物は周知であり、市販
されている。式中示されているウリジンは、上述したように別のプリンまたはピ
リミジン基と置換でき、適切な位置におけるプリンまたはピリミジン基に共有的
に接合される上記のビオチン基とウリジン基との間に示されたビオチンおよび結
合ポリマー鎖と置換することができる(例えば、ピリミジンにおける5個の炭素
など環炭素、またはプリンにおける2ないし8個の炭素)。重要なことは、オリ
ゴヌクレオチド(例えば、DNA、RNA、または5または10ないし30また
50基のキメラ)がこのようにしてビオチンに結合された1個またはそれ以上の
基で合成でき、こうしてビオチン化されるオリゴヌクレオチドは、アビジンの手
段により本明細書中に記載されたようにビオチン化リガンドに結合できることで
ある。
ビオチン基は、Pierce(3747 N.Meridian Road,P.O.Box.117,Rockford.
IL 61105)より入手可能な、EZ−LINKTMスルホ−NHS−LC−ビオチン
化キットの手段によりベクター(特にウイルスベクターなど遊離アミン基を有す
るベクター)に共有的に接合することができる。ベクター上の第一級アミンをビ
オチン化するために使用できる化合物の例は、Pierceより入手可能なスルホ−N
HS−LC−ビオチンであり、以下の構造式を有する:
[化4]
別の実施例では、上述したスルホ化合物に示されたビオチン基は除去し、上述し
たように、リガンドとの共有結合で置換し、ベクターからリガンドへの直接の共
有結合を得ることができる。
本発明の標的細胞
造血幹細胞、リンパ球、血管内皮細胞、呼吸上皮細胞、角質細胞、骨格筋心筋
細胞、神経細胞およびがん細胞が、対外(ex vivo)または体内(in vivo)いず
れかの治療的遺伝子導入の標的として提案されている。例えば、A.D.Miller,N
ature 357,455-460(1992)、R.C.Mulligan,Science 260,926-932(1993)を
参照。これらの細胞や他の真核細胞が本発明のベクターおよび方法の適切な標的
細胞である。本発明の1つの利点は、通常は移入ベクター、すなわちウイルスベ
クターを結合することがない細胞にヘテロ核酸をターゲッティングするために使
用できることである。
特に、7−TM受容体ファミリーからの受容体を発現する細胞はすべて本発明
による使用に適切な標的である。プリン受容体(例えば、P2Y1、P2Y2、P
2Y4、P2Y6、P2Y11)、アデノシン受容体(すなわち、A1、A2、A3)
、ブラジキニン受容体(例えば、BKI、BKII)、またはβ−アドレナリ作動
性受容体(例えば、β1、β2、β3)を発現する細胞が好ましい。さらに好まし
いのは、P2Y2受容体、A2B受容体、β2受容体、C5A受容体を発現する細胞で
あり、P2Y2受容体を発現する細胞が最も好ましい。また、呼吸上皮細胞、特
に分化柱状気道上皮細胞も標的として好ましい。これらの細胞は、気道上皮細胞
のルーメン表面との抱合体を含有するエアロゾルの投与によるなど、試験管内(
in vitro)または体内(in vivo)抱合体として投与することができる。
遺伝子導入技術
本発明の方法は、広い系統範囲の宿主細胞内に標的細胞核とは別にヘテロ核酸
を送達ための手段を提供する。本発明のベクター、方法および薬物調製剤は、治
療またはその他の方法として、所望のタンパク質またはペプチドを必要とする対
象にタンパタ質またはペプチドを投与する方法において追加的に有用である。こ
のようにして、タンパク質またはペプチドは対象の体内(in vivo)で生成する
こ
とができる。対象は、その対象がタンパク質またはペプチドの欠乏を有するとい
う点で、または治療もしくはその他の方法として、およびさらに以下で説明する
ように、対象におけるタンパク質またはペプチドの産生が一部の治療的効果を付
与するという点で、タンパタ質またはペプチドを必要としていると考えられる。
本発明の遺伝子導入技術にはいくつかの用途がある。最も迅速な用途はおそら
くペプチドおよびタンパク質の機能的ドメインのプロセシングを明らかにするこ
とである。プロセシングおよび細胞運命の細胞特異的差異を試験するために、タ
ンパク質のクローンcDNAまたはゲノム配列を培養株、または体内の異なる細
胞型内に導入することができる。強力なプロモーターの制御下にコード配列を配
置することにより、実質的量の所望タンパク質を生成することができる。さらに
、タンパク質プロセシング、細胞内ソーティング、または生物学的活性に含まれ
る特異性残基は、コード配列の間欠残基における突然変異の変化により測定する
ことができる。
本発明の遺伝子導入技術は、タンパク質の発現を制御し、細胞内イベントを調
節するその能力を評価する手段を提供するために適用することもできる。分化に
おけるその役割など、タンパク質の一部の機能は組織培養で試験することができ
るが、重要な特性の変化をモニターするために発生における異なる時点で生体内
(in vivo)への再導入も必要となる。
遺伝子導入は、特異性遺伝子の発現を調節する核酸配列および細胞因子を試験
する手段を提供する。このような試験の1つの方法が、試験すべき調節要素を報
告された遺伝子に融合し、その後にレポーター遺伝子の発現を評価することであ
ろう。
遺伝子導入は疾患状態を理解するとともに治療を提供する上で実質的に有力な
用途も有する。欠陥遺伝子が知られ、クローンされている多数の遺伝性疾患が存
在する。一部では、これらのクローン遺伝子の機能が知られている場合もある。
一般に、上記の疾患状態は2種類に分類される。すなわち、一般に劣性遺伝性で
ある、通常、酵素の欠陥状態と、優性遺伝性である、少なくとも場合により収縮
調節タンパク質または構造タンパク質を伴う不均衡状態である。欠陥状態疾患の
ためには、遺伝子導入を用いて正常な遺伝子を罹患組織に導入し置換治療が行え
るほか、アンチセンス突然変異を用いた疾患用の動物モデルを作製することも考
えられる。不均衡疾患状態のためには、遺伝子導入を用いてモデル系での疾患状
態を生成し、これを疾患状態を妨害するために用いることも考えられる。このた
め、本発明の方法は遺伝疾患の治療を可能とする。本明細書中で用いられるよう
に、疾患を引き起こし、またはそれをさらに重篤にする欠陥または不均衡を部分
的または完全に軽減することにより、疾患状態が治療される。突然変異を引き起
こし、または欠陥を修正する核配列の部位特異性組込みの使用も可能である。
特に好ましい1実施例では、本発明は呼吸上皮における外来CFTRタンパク
質を発現するために使用される。この実施例によれば、CFTR遺伝子を保持す
るAdV移入ベクターを用いることが好ましい。AdV−CFTRは、上述した
ように、スルホ−NHSリンカーによりジヌクレオチドUP4Cに直接結合され
る。呼吸上皮の尖端表面上のUP4CのP2Y2受容体への結合により、上皮細胞
内に完全なUP4C−スルホ−NHS−AdV−CFTR複合体のインターナリ
ゼーションが誘導される。
薬物調製剤、対象、および投与方法
本発明に従って治療される適切な対象として、トリと哺乳動物の対象が挙げら
れ、哺乳動物が好ましい。本発明に従って治療される必要のある哺乳動物であれ
ばすべて適切である。ヒト対象が好ましい。両性およびすべての発育段階(すな
わち、新生児、乳児、小児、青年、成人)のヒト対象を本発明に従って治療する
ことができる。嚢胞性線維症に罹患したヒト対象が好ましい。
本発明の活性化合物jはその薬剤的に許容可能な塩として調製することができ
る。薬剤的に許容可能な塩は、親化合物の所望の生物学的活性を保持するととも
に、望ましくな毒性作用を付与することがない塩である。このような塩の例は、
例えば、(a)塩素、臭化水素酸、硫酸、リン酸、硝酸等など無機酸で形成され
る酸付加塩と、例えば、酢酸、シュウ酸、酒石酸、コハク酸、マレイン酸、フマ
ル酸、グルコン酸、クエン酸、リンゴ酸、アスコルビン酸、安息香酸、タンニン
酸、パルミチン酸、アルギン酸、ポリグルタミン酸、ナフタリンスルホン酸、ポ
リガラツクロン酸、等など有機酸で形成される塩、および(b)塩素、臭素、お
よびヨウ素など元素アニオンで形成される塩である。
本発明の活性化合物は、経口、直腸、経粘膜、局所または腸管投与;筋内、皮
下、髄内注入を含む非経口デリバリーのほか、くも膜下、直接静脈内、静脈内、
腹腔内、鼻腔内、または眼内注入を含む適切な手段により必要とする対象に投与
することができる。または、局所ではなく全身、例えば、デポーまたは持続放出
調製剤で本化合物を投与することもできる。肺への投与が好ましい。
本明細書中に開示された活性化合物は、対象が吸入する活性化合物からなる呼
吸に適した粒子のエアロゾル懸濁液の投与により投与されることが好ましい。呼
吸に適した粒子は液体または固体であってもよい。
活性化合物を含む液体粒子のエアロゾルは、圧力駆動型エアロゾル噴霧器また
は超音波噴霧器など適切な手段により生成することができる。例えば、米国特許
第4,501,729号を参照。噴霧器は、狭いベンチュリ穴を通して圧縮ガス、典型的
に空気または酸素を加速する手段または超音波攪拌の手段のいずれかにより、活
性成分の溶液または懸濁液を治療的エアロゾルミストに変換する市販の装置であ
る。噴霧器に使用するための可溶性調製剤は液体担体中の活性成分からなり、活
性成分は40%w/w間での調製剤を含むが、好ましくは20%w/w未満であ
る。担体は典型的に水(および最も好ましくは発熱物質を含有しない滅菌水)ま
たは希釈水性アルコール溶液であり、例えば塩化ナトリウムの添加により体液と
等張で生成されていることが好ましい。
任意の添加剤として、調製剤が滅菌生成されていない場合は保存剤が挙げられ
、例えば、メチルヒドロキシ安息香酸、酸化防止剤、香気剤、精油、緩衝剤およ
び界面活性剤が挙げられる。
活性化合物を含む個体粒子のエアロゾルは同様に固体粒子の薬剤エアロゾル発
生器で生成することができる。対象に個体粒子薬剤を投与するためのエアロゾル
発生器は、上で説明したように、呼吸可能である粒子を生成するとともに、ヒト
の投与に適切な速度での予め規定され計量された用量の薬剤を含有する容量のエ
アロゾルを発生する。個体粒子エアロゾル発生器の1つの実例となる型は吸入器
である。吸入による投与のための適切な調製剤として、吸入器の手段により送達
され、またはスナッフルのやり方で鼻腔内に摂取され得る微細に粉砕される粉末
が挙げられる。吸入器では、粉末(例えば、本明細書中に記載された治療を実施
するために有効な計量された用量)は、典型的にゼラチンまたはプラスチックで
作製されたカプセルまたはカートリッジに格納され、これらはそのままで貫通ま
たは開放され、粉末は吸入時に装置から抜かれる空気により、または手動操作ポ
ンプの手段により送達される。吸入器で使用される粉末は、活性成分のみまたは
活性成分、ラクトースなど適切な粉末希釈液、および任意の界面活性剤を含有す
る粉末ブレンドからなる。活性成分は、典型的に調製剤の0.1ないし100w
/wを含む。実例となるエアロゾル発生器の第2の型は、計量された用量の吸入
器を含む。計量された用量の吸入器は加圧エアロゾル調合器であり、典型的に液
化推進剤中の活性成分の懸濁液または溶液調整剤を含む。使用時にこれらの装置
は計量された用量、典型的に10ないし150μlを送達するために適合した弁
を通して調製剤を放出し、活性成分を含有する微細粒子スプレーを生成する。適
切な推進剤として、一部のクロロフッ素化合物、例えば、ジクロロジフルオロメ
タン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロフルオロメタンおよびその混合物が
挙げられる。調製剤は追加的に1つまたはそれ以上の助溶剤、例えば、エタノー
ル、オレイン酸またはトリオール酸ソルビタンなど界面活性剤、酸化防止剤およ
び適切な香気剤を含む。
固体粒子または液体粒子に関係なく、エアロゾルは分当たり約10ないし15
0リットル、好ましくは分当たり約30ないし150リットル、および最も好ま
しくは分当たり約60リットルの速度でエアロゾル発生器により生成することが
できる。大量の薬剤を含有するエアロゾルはさらに迅速に投与することができる
。
本明細書中に開示された活性化合物またはその薬剤的に許容可能な塩の投与量
は、治療される状態および患者の状態によって変動するが、一般に対象の気道表
面で活性化合物の融解濃度を達成するために十分な量である約10-7ないし約1
0-3モル/リットルであり、さらに好ましくは約10-6ないし約3×10-4モル
/リットルである。投与される活性化合物の特定の調製剤の溶解性によって、1
日量は1または7単位で分割投与することができる。他の化合物は本発明の活性
化合物、またはその塩と同時に投与することができる。
本発明の活性剤を含有する固体または液体の粒子製剤として、呼吸可能な大き
さの粒子、すなわち、吸入時に口および喉頭を通過し、気管支および肺胞に入る
のに十分に小さな大きさの粒子を含めるべきである。一般に、約1ないし5ミク
ロンの範囲の大きさ(さらに好ましくは、4.7ミクロン未満の大きさ)の粒子
が呼吸可能である。エアロゾル中に含まれる呼吸不可能な大きさの粒子は咽頭に
沈着して嚥下されるため、エアロゾル中の呼吸不可能な粒子の量は最小限に抑え
ることが好ましい。鼻腔投与では、10〜500μmの大きさの粒子が鼻腔内に
確実にするために好ましい。
本発明の活性化合物の投与において、化合物は分離して(同時にまたは連続的
に)または交互に投与することができ、好ましくは、前形成抱合体として前混合
し投与することができる。実例として、目的のヘテロ核酸を保持する適切な用量
の移入ベクターとして、ターゲッティング分子(すなわち、二重特異性架橋抗体
、ペプチド、ビオチン−UTP、等)と前混合することができ、複合体を対象に
投与することができる。
本発明による調製剤の製造において、活性剤または生理学的に許容可能な塩も
しくはその遊離基は典型的に、とりわけ、許容可能な担体と混合される。もちろ
ん、担体は調製剤中の他の成分と親和性という意味で許容可能である必要があり
、患者の心身に有害であってはならない。担体は固体でも液体でも、その両方で
もよく、単位用量調製剤、例えば、活性化合物の約0.5%ないし99%重量を
含有するカプセルとして化合物と調製されていることが好ましい。1つまたはそ
れ以上の活性化合物を本発明の調製剤中に組込むことができ、この調製剤は基本
的に化合物の混合を含む公知の製剤法のいずれかにより調製することができる。
活性化合物の呼吸可能な乾燥粒子を含有する組成物は、活性化合物を乳鉢およ
び乳棒で粉砕し、微粉化した組成物を400メッシュフィルタに通し、解体また
は分解し大きな集塊とする。
薬剤組成物はエアロゾルの調製を促進するために使用される分散剤を任意に含
有することができる。適切な分散剤はラクトースであり、これは適切な比(例え
ば、重量で1対1)でベンズアミルまたはフェンアミルと混合することができる
。
要約すれば、本発明の移入ベクターを用いて分割または非分割細胞のいずれか
に安定にトランスフェクションを行うとともに、安定にヘテロ遺伝子を発現する
ことができる。このベクター系を用いることにより、細胞の生理に影響を及ぼし
得るタンパク質をコードする遺伝子を、分割または非分割細胞に導入することが
今や可能となる。このため、本発明のベクターは疾患状態の遺伝子治療、または
細胞生理学の実験的修飾に有用と言える。
本発明を述べたところで、解説目的のみのために本明細書中に含まれるいくつ
かの実施例を参考にして同発明を解説するが、これらは本発明の限定を意図する
ものではない。
実施例1
ヒト気道上皮のモデル
上皮細胞は、Grayら、1996、Am.J.Respir.Cell Mol.Biol.14,104-112に
より記載されたものと同様の手順を用いてCFおよび非CF鼻腔および気管支気
道上皮から誘導する。過剰なドナー組織を示す主幹/葉気管支の切除鼻介または
部分を、ノースカロリナ大学のヒト対象の権利の保護に関するChapel Hill施設
内委員会の後援で肺移植の時点で得た。上皮細胞を報告された通り(Wu,R.ら
、1985.Am.Rev.Respir.Dis 132,311-320)、プロテアーゼXIV消化によ
り検体から取出したが、濾過ステップを省いた。1〜2x106細胞を修正LH
C9培地の100mm組織培養皿にコーティングする。Lechner,J.F.とLaveck
,M.A.1985.J.Tiss.Cult.Meth.9,43-48。修正には、EGF濃度を25n
g/mlに増大し、レチノイン酸濃度を5x10-8Mに調整するとともに、0.
5mg/mlのウシ血清アルブミンおよび0.8%ウシ下垂体抽出物を補充する
ことが含まれる。約75%の融合で、トリピシン処理により細胞を収穫し、修正
培地において、トランスウェル−コル(Transwell-Col)インサート(Corning-C
ostar、24mmΦ、孔サイズ0.4μm)上の密度2.5x105細胞で継代1
細胞をコーティングした。培地は、LHC基底(Biofluids)とDMEM−Hの
50:50の混合液を基底として用い、アムホテリシンおよびゲンタマイシンを
省くとともに、EGF濃度を0.5ng/mlに低下したことを除き、補充LH
C9とほぼ同じである。細胞が融合まで増殖した後(4〜6日)、培養株の先端
表面を使用す
るまでさらに25〜30日間、気液界面に出す。
培養34日後の非CF鼻気道から誘導したヒトWDの初期組織学的分析は、上
皮が偽重層気道粘液線毛であることを示し、生体内(in vivo)でヒト鼻気道に
存在するものを代表する豊富なシリア線毛および細胞型が認められる。
実施例2
7膜貫通受容体
WD細胞の頂膜での発現
調査を行い、もしあれば、7−TM受容体がWD気道上皮細胞の頂膜に局在し
ていることを確認した。WD細胞の培養株をNECA(A2b受容体アゴニスト)
、イソプレテレノール、ブラジキニン、またはATP(すべて10-4Mで)に曝
露するとともに、C1分泌反応性を測定した。図3に示されているように、C1
反応がすべてのアゴニストの存在下に検出されたが、最大の反応はATPの存在
下に確認された。これらの結果は、機能的アデノシン、β−アドレナリン作動性
、ブラジキニンおよびプリノ受容体が気道上皮の先端表面に存在することを強く
示している。
実施例3
ヒトPDおよびWD気道上皮細胞における
AdVの結合およびインターナリゼーション
AdV結合ではなく、アデノウイルスベクター(ADV)インターナリゼーシ
ョン、RTE WD培養株への低効率の遺伝子導入の結果となる速度制限ステッ
プを示す実験をヒト培養株で繰り返し行い、同じ速度制限ステップが存在するか
どうかを測定する。これが実際に該当する場合は、細胞はインターナリゼーショ
ンの速度低下を示すが、これらの細胞型に結合するAdVの量を増強することで
WD培養株への遺伝子導入効率を増大することが可能と考えられる。PDまたは
WD培養株に曝露された所定濃度のAdVについては、細胞に曝露した全AdV
の約0.1〜1%のみが洗浄後にも付着していた。1回の曝露で達成した上のA
dV結合の増強は、AdVの細胞との結合を増大によりインターナリゼーション
イ
ベントがAdVエントリーにつながる確率を増大するため、遺伝子導入の増大に
つながる。
ヒト培養株における無効果な遺伝子導入の速度制限ステップを測定するために
、PDおよびWD培養株を35S−Ad5VLacZ(1.2x1010p)に曝露
し、ヒト培養株におけるAdV結合、インターナリゼーションおよび導入遺伝子
発現の分析を行う。AdV濃度の増大および/またはAdVへの曝露期間の影響
を調べるため、PDおよびWD培養株を4℃下に多数の時点(1〜24時間)に
一連の濃度(107〜1012p/ml)で35S−Ad5VLacZ(Pickles,R
.J.,1996.Human Gene Therapy 7,921-931)に曝露し、その後に培養株を培
地中で洗浄し、3群に分けて分析する。結合を細胞関連放射能として測定する。
結合AdVのインターナリゼーションは培養株を6時間37℃に移した後、非イ
ンターナリゼーション放射能除去後の細胞関連放射能の測定により測定する。発
現はβ−gal活性を測定する前に48時間37℃に培養株を移すことにより測
定する。分当たりの放射能カウント(CPM)およびβ−gal活性は、生体内
(in vivo)の上皮との直接比較が可能であるように、ベクターに曝露した細胞
の先端表面区域は最も適切な基準であるため、細胞表面の名目上の表面区域に関
して標準化する。
PD細胞では、特異性培養時間に、10倍の濃度増大により、受容体取り込み
の飽和および発現系が生じない限り、AdV付着、インターナリゼーションおよ
び遺伝子発現が生じるとみられる。WD培養株では、AdV付着の10倍の増大
が予想されるが、インターナリゼーションおよび発現の対応する10倍の増大は
予想されない。これらのデータは、結合の増大のみがWD培養株における速度制
限ステップ(インターナリゼーション)を克服するのではないことを示す。
実施例4
P2Y2受容体へのAdVベクターのターゲッティング
P2Y2受容体が外来リガンドを結合し、インターナリゼーションする能力に
基づくターゲッティングのための受容体の候補であるという考えを試験するため
に、われわれはレトロウイルス遺伝子導入によりHAタグヒトP2Y2受容体(
細胞
外N末端上のHAタグ)を発現するCHOおよびA9細胞(両方はAdVによる
誘導は不可能)を得た。対象細胞ではなく、A9細胞を発現するHA−P2Y2
受容体は、休止条件下に蛍光標識抗HA Abで染色する。アゴニスト[ATP
γS(10-4M)]曝露では、受容体の約80%が45分以内にインターナリゼ
ーションされる。P2Y2受容体のインターナリゼーションはコートピットを介
して媒介される。
次に、二重特異性抗体(bs−Ab)法を用いて、P2Y2受容体が遺伝子導
入を媒介するかどうかを試験した。インフルエンザ赤血球凝集素に対する抗体H
A.11(BabCO)(坑HA)を、1321N1アストロサイトーマ細胞で
発現するヒトP2Y2受容体の細胞外ドメインに挿入されたHAエピトープに対し
て向ける。架橋抗体は、中性のpHでm−マレイミドベンゾイル−N−ヒドロキ
シスルホスクシンアミドエステル(スルホ−MBS、Pierce、Rockford、IL)ま
たはN−(γ−マレイミドブチルロキシ)スルホスクシンエステル(スルホ−G
MBS、Pierce、Rockford、IL)で坑線維(こぶ)抗体を反応させることにより
生成される。メルカプトエチルアミン、および塩分除去による坑HAの削減後、
2つの抗体を混合し、ジスルフィド架橋結合形成を可能とする。二官能抗体を線
維タンパク質およびHAカラム上の連続クロマトグラフィにより精製する。
このAd線維(こぶ)およびHAエピトープタグ(∀線維x∀HA)に対する
bs−Abを用いて、A9細胞を発現するヌルとではなく、HA−P2Y2受容
体とのbs−AbおよびAdVの結合が明らかにされている。A9−HA−P2
Y2細胞と結合されたAdVは、bs−Abの非存在下ではなく存在下に明らか
にされている。
さらに重要なのは、A9およびCHOにおけるP2Y2受容体特異性遺伝子導
入が、bs−Ab法を用いて達成されていることである。使用した1プロトコー
ル、すなわち(1)A9細胞を発現するHA−P2Y2受容体とA9細胞を発現
するヌルベクターの各種濃度のbs−Ab(坑HA/坑線維こぶ;NIHのD.Sege
l博士の実験室におけるR.Pickles博士により生成)の4℃下での連続曝露の後
、AdV−lacZ(粒子○1=104);(2)アゴニスト(ATPγS、1
0−4M)による37℃下での1時間の培養後、培地で24時間培養;および(
3)la
c陽性細胞の割合の計数および計算による遺伝子導入効率の定量により、A9細
胞を発現するHA−P2Y2受容体がbs−mAb濃度の関数としてAd−la
cZにより形質導入されるが、ヌルA9細胞は形質導入されないことが確認され
た(図4A)。実際に、ほぼ100%の遺伝子導入効率が30μ/mlのbs−
Abで近づいているように思われる。
前形成抱合体を用いた第2のプロトコールでは、〜10μg/mlのbs−A
bでピークに達する遺伝子導入の増加が確認された(図4A)。高bs−Ab濃
度での形質導入効率の低下は、標的の非結合bs−Abによる競合を反映してい
ると考えられる。
HAとビオチン(∀HA/∀ビオチン)に対するbs−Abおよびビオチン化
アデノウイルスベクターによるHA−P2Y2−RA9細胞への遺伝子導入の同
様の増大。最後に、A9−HA−P2Y2−R細胞におけるbs−Abにより確
認された遺伝子導入の特異性を評価した(図4B)。Ad−LacZおよびAT
PγSに曝露されたHA−P2Y2−A9細胞はほぼ100%のLacZの発現
を示した。これに対して、不適切なbs−Ab(坑Ha/坑AD P1エピトー
プ)ではLacZ発現はほとんど確認されず、40倍を超える遊離坑HA抗体の
存在下でも、高濃度のアゴニストに24時間、前曝露されていた細胞においても
確認されなかった(これにより細胞表面受容体の減少作用を誘導する)。これら
のデータにより、HA−P2Y2受容体が坑HAb−Abとの特異性相互作用を
介して遺伝子導入を媒介することが確認される。
実施例5
他の細胞摂取の利用
WD培養株内へのAdVエントリーを増大する機序
インターナリゼーションを受ける受容体へのAdVのターゲッティングによる
遺伝子導入の有効性は、受容体のインターナリゼーション効率に依存する。P2
Y2−受容体のインターナリゼーション効率を試験するために、ヒトP2Y2受容
体(細胞外ドメイン内に挿入されたインフルエンザ赤血球凝集素(HA)エピト
ーブ−タグによる)が、1321N1ヒトアストロサイトーマ細胞において過剰
発現されている。S.StromekとT.K.Hardon、Molecular Pharmacology 54,in p
ress(1988)。P2Y2発現細胞を37℃下に非加水分解性ATP類似体、AT
PγSで培養した。特異性時点で、アゴニスト添加後、4%パラホルムアルデヒ
ド中で透過せずに固定し、洗浄した。モノクローン坑HA抗体を細胞で培養した
後、Cy3抱合ヤギ坑マウスIgG二次抗体(Jackson Immuno Research Labs)
で培養した。坑HAに対するP2Y2受容体の利用可能性は蛍光顕微鏡で視覚化
した。アストロサイトーマ細胞はATPγSの非存在下にP2Y2受容体の存在
のために固定するとともに免疫染色し、30分後にATPγS曝露を行った。ア
ゴニストの継続的存在において、血漿膜および点状蛍光シグナルからの免疫活性
の明らかな喪失が認められ、エンドソーム内への隔絶化を示している。酵素結合
抗体免疫(ELISA)アッセイによりインターナリゼーションを定量し、80%の
効率が認められた(1時間のATPγS曝露による受容体部位の喪失、Ken Hard
on博士、私信)。これはアストロサイトーマ細胞株において、活性受容体のイン
ターナリゼーションが有効に発生していることを示す。
実施例6
極性化上皮の頂膜上の遺伝子導入
融合MDCK腎細胞を極性AdV耐性上皮のモデルとして用いた。HA−Ps
Y2受容体を発現するMDCK細胞において、受容体は尖端表面上に局在してい
た。細胞を坑HAおよび坑マウスIgGFITCに4℃下で曝露し、受容体の局
在を共焦点顕微鏡で測定した。極性MDCK細胞の頂膜におけるHA−PsY2
受容体は、部分的に受容体のインターナリゼーションにより脱感作していること
が確認された。AdV−GFP(緑色の蛍光タンパク質)およびATPγSを連
続的に投与したHA−PsY2受容体へ向けられたbs−Abは、ネオ発現MD
CK細胞と比較して、HA−PsY2受容体に形質導入を生じさせる。このため
、HA−PsY2受容体特異性遺伝子導入が、極性AdV耐性細胞で達成された
。
実施例7
ブラジキニンII(B2K)受容体を発現するA9細胞および
P2Y2受容体またはβ2受容体を発現するCHO細胞における
遺伝子導入
上記方法の一般の応用性が他の細胞型および他の受容体で明らかにされている
。
HAエピトープタグBKII受容体を発現するA9細胞およびネオマイシンのみ
を発現するA9細胞を、ブラジキニンの存在下に二重特異性抗体(坑線維こぶx
坑HA)およびAdVに曝露した。簡単に言えば、4℃下に細胞を二重特異性抗
体の非存在下または存在下に培養し(bs−Ab、10μg/ml、2時間)、
洗浄するとともに、AdVLacZ(1010粒子、2時間)に曝露し、洗浄する
とともに、ブラジキニンに曝露した(BK、1μM、37℃下に2時間)。次に
、遺伝子発現が標準法で評価されるまで細胞を37℃で24時間維持した。図5
は、有効な遺伝子発現がアゴニストで受容体を活性化することで遺伝子導入を強
化したbs−AbとAdVの両方で培養したHAB2K発現細胞でのみ生じるこ
とを示している。AdVのみではほとんど発現は確認されず、AdV+bs−A
bの存在下には中等度のレベルのみが確認された(リガンドの非存在下でも低レ
ベルの受容体のターンオーバーを示す)。処理に関係なく、ヌルA9細胞では、
きわめてわずかなLacZ発現が確認された。追加の試験では、HAエピトープ
タグβ2−アドレナリン受容体を発現するCHO細胞(AdV付着受容体を欠く
チャイニーズハムスター卵巣細胞)および野生型(wt)CHOを、濃度を増大
した二重特異性抗体(坑線維こぶx坑HA)およびAdVに連続的に曝露し、最
終的にイソプロテロノールに曝露した。簡単に言えば、4℃下に細胞を二重特異
性抗体の非存在下または存在下に培養し(bs−Ab、0.1〜10μg/ml
、2時間)、洗浄するとともに、AdVLacZ(1010粒子、2時間)に曝露
し、洗浄するとともに、ブラジキニンに曝露した(BK、1μM、37℃下に2
時間)。次に、任意の単位で示されたLacZ発現細胞の密度計測により評価さ
れるまで細胞を37℃で24時間維持した。図6A〜Bは、HA−P2Y2−R
(図6A)受容体またはHA−β2(図6B)受容体を発現するCHO細胞のみ
での遺伝子発現のbs−Ab用量依存性増加を示している。
実施例8
ビオチン化アゴニスト
ベクターをHA−P2Y2受容体(または別の7−TM受容体)にターゲッテ
ィングする別の方法は、標的分子として修飾アゴニスト/アンタゴニストへの化
学結合によるものである。基本型アゴニストリンカーがビオチン(B)−UTP
であり、これはピリミジン基の5の位置をビオチンに接続する16個の炭素リン
カーを含有する。B−UTPはP2Y2受容体のアゴニストである(図7)。蛍
光試験では、P2Y2受容体を発現するCHO細胞をストレプトアビジン−テキ
サスレッド(TR)と抱合したB−UTPに曝露すると、B−UTPが誘発され
、P2Y2受容体とインターナリゼーションすることが明らかにされている。
別の試験では、B−UTPによる遺伝子ターゲッティングをHA−P2Y2受
容体を発現するA9細胞で評価した。HA−P2Y2−A9細胞を連続的にB−
UTP、ストレプトアビジン(SA)、およびB−AD(LacZを発現するビ
オチン標識アデノウイルス)に曝露した。HA−P2Y2−A9細胞のおよそ9
0%がLacZ発現を示した(図8)。これに対して、野生型A9細胞では、低
レベルのLacZ発現のみが確認された。
実施例9
ジヌクレオチドアゴニスト
ベクターとの結合のためのUTPの非加水分解性で生物学的に活性類似体が開
発されている。ジヌクレオチドU2P4は理想的な特性を有する。図9に示されて
いるように、U2P4は生物学的反応を誘導する上でUTPと対等であり、嚢胞性
線維症(CF)痰における加水分解に対して耐性である。
実施例10
AdVインターナリゼーションの検討
ヒトPDおよびWD培養株におけるプロセス
αvβ3/5インテグリンはインターナリゼーションを媒介するが、試験管内(i
n vitro)上皮細胞内へのAdの付着は媒介しないことが報告されている25。W
D
培養株の頂膜および/または基底側膜との膜結合αVβ3/5インテグリンの局在
は、AdV媒介遺伝子導入におけるこれらの分子の役割を理解する上で重要であ
る。これらのインテグリンに対する多くの異なる抗体の利用可能性により、測定
すべき極性上皮におけるそれらの局在が可能となる。これらのインテグリンはR
GDアミノ酸配列を含有するペプチドの受容体でもある。多くの試験により、R
GDペプチドはαVβ3/5インテグリンとの相互作用により上皮細胞へのAdV
媒介遺伝子導入を抑制することが示されている。この実施例は、PDおよびWD
培養株におけるAdV結合、インターナリゼーションおよび導入遺伝子発現に対
するRGDペプチドの影響を解説するものである。
インテグリン抗体特異性免疫沈降法は、αvβ3/5インテグリンを局在するた
めに、当初はRTE WD培養株で開発された。これらのインテグリンに対する
抗体が市販されていないため、われわれは、ラットαvβ3/5インテグリン37と
交差反応することがわかっているヒト内皮細胞ビトロネクチン受容体に対して生
じた抗体(R838、ペンシルヴァニア州立大学(PA)、Steven Albelda博士よ
り贈呈)を得て、用いられている。簡単に言えば、WD培養株の頂ドメインまた
は基底側ドメインのいずれかを4℃下にスルホ−NHS−ビオチン(0.5mg
/ml、Pierce)に曝露し、外膜タンパク質のみをビオチン化した。非変性溶解
緩衝液(タンパク質分解酵素抑制剤の存在下に)中に細胞を可溶化した後、タン
パク質を免疫沈降するとともに、非還元条件下に4〜12%アクリルアミドゲル
(Novex)上でウェスタン分析により分離した。ビオチン化タンパク質をストレ
プトアビジン抱合ペロキシダーゼ二次抗体でプロービングするとともに、ECL
分析(Supersignal CL-HRP,Pierce)により検出した。R833により同定され
たビオンチン化タンパク質を図5に示されており(125kDのバンドはαVに
対応し、97kDはβ3/5サブユニットに対応する)、RTE細胞の基底側膜お
よびHeLa細胞には存在するが、WD培養株の頂膜には存在しないように見え
、ビトロネクチン受容体がこれらの細胞型の尖端には局在していないことを示し
ている。頂膜におけるこれらのインテグリンの非存在は、これらの培養株内の低
レートのAdVインターナリゼーションに原因があると考えられる。
実施例11
ヒトPDおよびWD細胞株に存在するインテグリンの
同定および局在
ヒトPDおよびWD培養株の頂膜および/または基底側膜からのタンパク質を
、個々の表面を4℃でスルホ−NHS−ビオチンに曝露することにより選択に分
離した。標準免疫沈降実験を選択的ヒト抗体(LM609、αVβ3;P1F6
、αVβ5;VR147、αv;P4G11、β1;CD61、β3;坑β5および
R838、αVβ3/5;すべてChemicon Inc(CA)より入手)で行った。この手
順により、頂膜および/または基底側膜に対するαvβの検出および局在が可能
である。
実施例12
RGDペプチドによるAdVインターナリゼーションの干渉
上述したように、RGDペプチドの非存在下および存在下に、PDおよびWD
培養株におけるアデノウイルス付着、インターナリゼーションおよび導入遺伝子
発現を測定する。ヘクサペプチド、生物活性GRGDSP(Gibco-RRL)および
不活性対象ペプチドGRGESP(Gibco-RRL)を、AdV(1010p/ml)
を添加する前に4℃で2時間、最終濃度0.1〜0.4mg/mlでPDおよび
WD培養株に投与する。AdV媒介遺伝子導入の低下でより有力であると報告さ
れている、サイクリックRGDペプチド(Immunodynamics,La Jolla,CA)も用
いる。AdV付着、インターナリゼーションおよび導入遺伝子発現の分析は上述
したように行う。
実施例13
AdVエントリーの細胞摂取過程の検討
上皮細胞に対するAdVの初期付着は線維(こぶ)タンパク質を介して生じる
。線維タンパク質のみでインターナリゼーションおよびエンドソーム形成を誘発
するのに十分であるかどうか、または線維の役割はウイルスを局在するとともに
、遺伝性エンドソームイベントを利用するためにあるのかどうかは不明である。
しかし、細胞質内のAdVおインターナリゼーションは、部分的にαVβ3/5に
より媒介される。T.J.Wickhamら、Cell、73、309-319(1993)。αVβ3/5イ
ンテグリンは、WD培養株および軟骨性気道上皮の頂膜には存在しないか、また
は数が少なく、これらの細胞におけるインターナリゼーションおよび遺伝子導入
効率の低さの原因になっていると考えられている。したがって、細胞内のAdV
のエントリーの原因と考えられる細胞摂取過程について調べる。第1に、線維(
こぶ)タンパク質−細胞相互作用の機能的役割を理解するために、われわれはこ
ぶタンパク質をAdと同じ口径の蛍光ミクロスフェアに抱合し、共焦点顕微鏡に
よりPDおよびWD細胞に対するこぶスフェアの初期相互作用を評価する。われ
われは特に増大した特異性または非特異性結合がインターナリゼーションやおそ
らく発現を増大するという仮説を試験する。第2に、われわれはWD培養株にお
けるヒトαvβ3/5インテグリンを過剰発現させ、このタンパク質を頂膜に向け
る。これが実行可能な場合は、われわれは頂膜上のαvβ3/5発現がインターナ
リゼーションおよび遺伝子発現の速度制限ステップであるという仮説を試験する
。第3に、Adにより利用される細胞エントリー経路を理解するために、われわ
れはコートピット受容体媒介エンドサイトーシスで不完全であるか、または完全
である細胞株を調べる。われわれは、高濃度のAdVが非特異性エントリー経路
を用いて細胞内へのアクセスを得るという仮説を試験する。最後に、実験的構想
として、他の細胞摂取機序、すなわち外来リガンドにより刺激されるとエンドサ
イトーシスを受ける特異性受容体型へのAdVのターゲッティングの利用により
WD細胞内へのAdVのインターナリゼーション効率を増大する方法を試験する
。
実施例14
完全および不完全な受容体媒介エンドサイトーシスによる
HeLa細胞株内へのAdVインターナリゼーション
アデノウイルスの細胞内へのエントリーは細胞内経路、すなわちコートピット
、非特異性飲作用、または食作用を介した受容体媒介エンドサイトーシスの数に
よる摂取を反映するものである。R.M.Steinmanら、J.Cell Biol.96,1-27。
われわれは、完全または不完全な受容体媒介エンドサイトーシスに対するコート
ピ
ット受容体媒介エンドサイトーシスおよび非特異性飲作用の役割を試験する。野
生型ダイナミンタンパク質または突然変異型、mDyn(TET誘導性プロモー
ターにより制御)のいずれかを過剰発現し得るHeLa細胞変異が生成されてい
る。H.Damkeら、J.Cell Biol.127,915-934。通常、ダイナミンは血漿膜の研
究における「ピンチング」によるコートピットエンドソーム形成および機能の原
因である。野生型ダイナミンを過剰発現するHeLa細胞は、親細胞に比べて摂
取過程の機能的および形態的変化を示さない。mDynを過剰発現する細胞はコ
ートピットを形成し、血漿膜を陥入するが、細胞質内へのコート小嚢を出芽する
ことはない。受容体媒介エンドサイトーシスのリガンド(EGFおよびトランス
フェリン)は、mDynを発現する細胞内へインターナリゼーションされること
はないが、リガンド−受容体結合、コートピットアッセンブリー、コートピット
内へ受容体のレクリートメントおよび血漿膜のインターナリゼーションはすべて
変化を受けない。受容体媒介エンドサイトーシスの非存在下に、非特異性飲作用
は最初は無変化のままであるが、時間とともに混乱をきたし、受容体媒介エンド
サイトーシスの喪失を補償する。
実施例15
HeLa細胞内へのAdVエントリーのための摂取過程
野生型またはmDyn(Sandra Schmid,Scripps Research Institute,LaJol
la,CAより贈呈)のいずれかを過剰発現するHeLaを用いて、これらの細胞内
へのAdVエントリーのために一般に行われている摂取過程を試験する。一連の
AdV濃度を試験し、高力価のAdVが非特異性過程による細胞摂取につながる
かどうかを試験する。簡単に言えば、野生型またはmdynダイナミンを発現す
るプラスチック上で増殖した変異HeLa細胞の単層を4℃で2時間、Ad5V
LacZ(106〜1011i.u./ml、MOl〜1−105に対応)に曝露し
、洗浄せずに37℃で0〜24時間に移し、この時点で細胞を洗浄するとともに
、β−gal酵素アッセイを行う前に37℃で48時間維持する。特異性時点で
2つの細胞株で確認された遺伝子発現の差は、AdVエントリーに対する受容体
媒介エンドサイトーシスの関与を反映するものである。これとともに、われわれ
は蛍光ミクロスフェアで比較試験を行い(付着こぶタンパク質の使用不使用によ
る)、特異性および非特異性摂取過程とこれらのタンパク質との相互作用を詳述
する。
実施例16
他の細胞摂取の利用
WD培養株内へのAdVエントリーを増大する機序
インターナリゼーションを受ける受容体へのAdVのターゲッティングによる
遺伝子導入の有効性は、受容体のインターナリゼーション効率に依存する。P2
Y2−受容体のインターナリゼーション効率を試験するために、ヒトP2Y2受容
体(細胞外ドメイン内に挿入されたインフルエンザ赤血球凝集素(HA)エピト
ープ−タグによる)が、1321N1ヒトアストロサイトーマ細胞において過剰
発現されている。P2Y2発現細胞を37℃下に非加水分解性ATP類似体、A
TPγSで培養した。特異性時点で、アゴニスト添加後、4%パラホルムアルデ
ヒド中で透過せずに固定し、洗浄した。モノクローン坑HA抗体を細胞で培養し
た後、Cy3抱合ヤギ坑マウスIgG二次抗体(Jackson Immuno Research Labs
)で培養した。坑HAに対するP2Y2受容体の利用可能性は蛍光顕微鏡で視覚
化した。細胞はa)ATPγSの非存在下、またはb)30分のATPγS曝露
後に、P2Y2受容体の存在のために固定するとともに免疫染色した。アゴニス
トの継続的存在において、血漿膜および点状蛍光シグナルからの免疫活性の明ら
かな喪失が認められ、エンドソーム内への隔絶化を示している。酵素結合抗体免
疫(ELISA)アッセイによりインターナリゼーションを定量し、80%の効率が
認められた(1時間のATPγS曝露による受容体部位の喪失、Ken Hardon博士
、私信)。これはアストロサイトーマ細胞株において、活性受容体のインターナ
リゼーションが有効に発生していることを示す。
実施例17
ヒトPDおよびWD培養株における導入遺伝子発現の分析
一連のウイルス力価を(106〜1011感染単位/ml:MOl〜1−105に
対応)とともに曝露時間(1〜24時間)を増大し、頂膜および/または基底側
膜のいずれかの適用により、PDおよびWD培養株をAd5VLacZに曝露し
、得られる遺伝子発現に対する濃度と時間の影響を試験する。この試験に用いた
ベクターは、UNC遺伝子治療コアにより生成されるとともに滴定されている。
培養は37℃および/または4℃下に行う。前者の温度は試験すべき潜在的細胞
摂取過程を可能にし、後者の温度は、受容体のリサイクリングおよび/またはイ
ンターナリゼーションの非存在下に、それらの受容体へのリガンドの初期付着を
測定するための標準化法である。遺伝子発現は、定性的および定量的手段(それ
ぞれ、X−gal組織化学および標準比色酵素アッセイ)によりAdVへの最初
の曝露後48時間に評価する。Pickles,R.J.ら、1996、Human Gene Therapy
7,921-931を参照。
本発明はその特別の実施例とともに記載されているが、本発明はさらに修正可
能であることが理解されよう。本出願は一般に本発明の原理に従う本発明の変形
、使用または適応をすべて包含することを意図しており、上述した本発明の実施
例の範囲の範囲に記載された基本的な特徴に適用されるように、本発明が付与す
る技術内で周知の、または慣習的な実施内で本開示からの逸脱を含むものである
。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Target gene transfer using G protein-coupled receptor
Related application information
No. 60 / 050,843 (U.S. Provisional Application No. 60 / 050,843, filed June 26, 1997)
Claim the benefit of the issue.
Government support statement
This invention is a government application under Grant No. HL51818 awarded by the (United States) National Institutes of Health.
With the support of The government has certain rights in the invention.
Field of the invention
The present invention relates to methods and systems effective for introducing nucleic acids into eukaryotic cells.
Background of the Invention
Introduction of specific foreign or native gene sequences into mammalian cells and their inheritance
The ability to regulate offspring expression has important implications in medical and biological research.
is there. This ability is important for studies of gene regulation and for the use of therapeutic agents to treat diseases.
Provide the means for design.
The introduction of a particular foreign or native gene sequence into a mammalian cell involves first inserting the gene sequence
Is introduced into an appropriate nucleic acid vector. Such a recombinant vector
Various methods have been developed that allow the introduction of a protein into a desired host cell.
For methods involving DNA transformation or transfection,
Can quickly introduce recombinant molecules into a wide range of host cells
. In particular, viral vectors improve the efficiency of introducing recombinant nucleic acid vectors into host cells.
Used to increase. Transduction of foreign genes in mammalian cells
Some viruses used as vectors for expression and expression include SV40 virus.
Ils (see, for example, H. Okayama et al., Molec. Cell Biol. 5, 1131-1142 (1985)).
), Bovine papilloma virus (eg, D. DiMaio et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 79, 4030-4034 (1982)), adenoviruses (see, for example, JE Morin et al., P.
roc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 4626 (1987)), adeno-associated virus (A
AV, e.g. Muzyczka et al. Clin. Inves. 94, 1351 (1994))
Pure herpes virus (see, for example, A.l. Geller et al., Science 241, 1667 (1988)).
),and so on.
Efforts to introduce recombinant molecules into mammalian cells have been
Inhibited by the inability of many cells to be infected with the virus. For example, retro
Expression of membrane proteins used as viral receptors as a restriction in the virus
Relatively limited host ranges based in part on levels. M.P. Kavanaugh
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 7071-7075 (1994).
Therefore, technically, it is necessary to improve the method for introducing and expressing a gene into a target cell.
It is important.
Summary of the Invention
A drawback of current methods of receptor-mediated gene transfer is that the methods and complexes of the present invention
Is overcome. In particular, the invention relates to viral vectors that are ingested by cell surface receptors.
The speed limiting step of the virus, as originally thought,
The invention is not a binding event but an internalization of the receptor itself
It is based on unexpected discoveries by humans. Therefore, the present invention is directed to eukaryotic cells.
A new complex that facilitates the introduction of nucleic acids. The present invention provides for the conversion to a specific cell type.
Targeting transfer vectors, attaching vectors to cells and vector cells
Allows for the regulation of sexual internalization.
The present invention provides a transfer vector for a receptor that is internalized by a cell.
Including combining. This receptor is exposed to cells upon exposure of the cells to specific ligands.
Is more internalized or, for that reason, the receptor is induced to
Expected to be internalized by exposure to ligand
Receptor.
BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES
FIG. 1 is a schematic diagram showing the virus receptor complex of the present invention. This figure shows the interface
Adenoviruses targeted to seven transmembrane receptors
Show
FIG. 2 schematically shows a special embodiment of the invention.
FIG. 3 shows the lumen NECA (A2bAgonists, isoproterenol (isopro
terenol), bradykinin, or ATP (all 10-FourM) Human airway against
It is a graphic representation of the epithelial C1 secretion response.
FIG. 4A shows continuous administration (○) or preformed conjugate (▲).
HA-P2YTwoBs-Ab concentration in A9 null cells (●) compared to A9
5 is a graphical representation of the dose-effect relationship between degree and gene transfer efficiency.
FIG. 4B shows HA-P2Y pretreated with specific or non-specific bs-Abs.Two-A
In A9 and A9 null cells or ATPγHA-P2 by pre-processing in S
YTwoIncreased gene transfer by bs-Ab after prolonged receptor desensitization
5 is a graphical representation of a test for evaluating the specificity of the test.
FIG. 5 shows HA-tagged BK.IINull A9 and A9 cells expressing the receptor
5 is a graphic representation of gene transfer by bs-Ab in FIG.
FIG. 6 shows HA-tagged P2Y.TwoReceptor and β2 receptor and adenovirus
Graph of gene transfer in CHO cells by bs-Ab to sarcolemma protein
It is a display.
FIG. 7 shows that (●) P2Y expressing astrocytoma cells other than wild type (■)Two
5 is a graphical representation of biotin-UTP stimulation of inositol phosphates at the receptor.
You.
FIG. 8 shows biotin conjugated by streptavidin to biotin-Ad.
A9 (wt) and HA-P2Y in the presence of N-UTPTwo-Inheritance in A9 cells
It is a graphical representation of the stimulus of child introduction.
FIG. 9A shows P2YTwoU in astrocytoma cells expressing the receptorTwoPFour
5 is a graphical representation of a comparison of agonist potency of UTP and UTP.
FIG. 9B shows U compared to UTP in cystic fibrosis sputum.TwoPFourMetabolic stability
This is a rough display.
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
The present invention will now be described with reference to the accompanying drawings, in which preferred embodiments of the invention are shown.
This is described in more detail below. However, the present invention can be implemented in many different ways.
Yes, and should not be construed as limited to the embodiments set forth herein. M
On the contrary, these examples are not intended to limit the scope of the present disclosure to those skilled in the art.
As provided. Like numbers refer to like elements.
The transfer vector receptor complex of the present invention is internalized in a cell.
Transfer vector linked to a receptor capable of being transferred. Transfer vector is outside
Containing a foreign nucleic acid sequence (eg, a gene) and a foreign protein or peptide.
Can be expressed. In a particularly preferred embodiment described in more detail below,
And the transfer vector is an antibody specific for the receptor, and specifically binds the receptor.
Peptides expressed by transfer vectors, or natural or modified ligands
Are targeted to seven transmembrane (7-TM) receptors. Import
Vectors may be viral vectors, plasmids, as described in more detail below.
Suitable vector comprising an RNA, oligonucleotide, or RNA / DNA chimeric molecule
Either may be used. The interaction between the 7-TM receptor and the target complex results in the receptor-
Coalescence internalization occurs and is thereby retained by the transfer vector
The heteronucleic acid is introduced into the cell to be expressed.
Virus transfer vector of the present invention
One embodiment of the present invention will be described with reference to FIG. In this embodiment, the composite of the present invention
Viral vector 10 whose body (ie, conjugate) is attached to 7-TM receptor 20
(Shown as adenovirus in the figure), and receptor 20 is located on the cell surface.
There are 100. Viral vector 10 contains bispecific bridging antibody 3
0 is attached to the 7-TM receptor 20. Bispecific cross-linked antibody 30
And one antibody 40 that specifically binds to the virus vector. Antibody 40 was 7-TM
It is chemically cross-linked to an antibody 50 that specifically binds the container 20.
Viral vector 10 is illustrated as an adenovirus vector (AdV).
However, the present invention is directed to human and non-human retroviruses (ie, Moloneema).
Maloney virus) vectors such as mouse leukemia virus and lentivirus)
Including deno-associated virus (AAV) vectors, and herpes virus vectors
It can be understood that this can be performed with other viral vectors, including but not limited to
(FIG. 2). The viral vector of the present invention may be an attenuated virus or
It may be provided non-replicated by any of the methods well known to those skilled in the art.
However, it is presently preferred to use adenovirus as a vector.
The viral vector of the present invention will have the ability to contain foreign nucleic acids. Heteronuclear
Delivery of the acid involves replication of the heteronucleic acid in the target cell, and subsequent
Promotes production. As used herein, a heteroprotein refers to a target cell protein or
Is defined as a fragment, and all or a portion of the protein is
Not represented. Nucleic acids or gene sequences are used to deliver genes into cells.
The wild-type (eg, wild-type adenovirus genome) of the viral vector
If it does not occur naturally, it is called hetero. As used herein, "nucleic acid sequence"
The term "" or "gene sequence" refers to a nucleic acid molecule, preferably DNA.
It is intended to be This gene sequence is DNA, cDNA, synthetic DNA, R
NA or a combination thereof. This gene sequence is a naturally occurring gene.
It may contain genomic DNA, which may or may not contain an intron. Sa
In addition, this genomic DNA is associated with a promoter sequence or polyadenylation sequence.
Can be obtained. Preferably, the gene sequence of the present invention is a cDNA. Get
Nome DNA or cDNA can be obtained in several ways. Genomic DNA
Can be extracted from appropriate cells and purified by any means known in the art.
You. Alternatively, mRNA is separated from cells and used for reverse transcription or
Can prepare cDNA by other means.
Standard techniques for constructing the vectors of the present invention are well known to those skilled in the art and are described in Sambrook.
Et al., Molecular Cloning: Experimental Manual Second Edition (Cold Spring Harbor, NY, 1989)
)). Various types of DNA fragments to ligate
Are available, the choice of which depends on the nature of the ends of the DNA fragments.
And the choice is easily made by those skilled in the art.
As will be appreciated by those skilled in the art, the inserted heterogeneic sequence or
The nucleic acid sequence in the row may be any nucleic acid sequence. For example, the inserted heterogeneous gene
The sequence may be a reporter gene sequence or a selectable marker gene sequence. Honcho
The reporter gene used in the textbook, when expressed, indicates its presence or activity.
A gene sequence that will produce a protein that can be monitored for sex
is there. Examples of suitable reporter genes include galactokinase, β-galactosyl
Dase, chloramphenicol acetyltransferase, β-lactamase
And the like. Alternatively, the reporter gene sequence may be expressed in a cell
It may be a gene sequence that produces a gene product that affects physiology.
The selectable marker gene is a gene sequence capable of expressing a protein,
That its presence allows the selective growth of cells containing the protein.
Gene sequences that allow it. Examples of selectable marker genes include anti-
Raw materials (eg, puromycin, ampicillin, tetracycline, kana
Confer host resistance to amino acids, or host resistance to amino acid analogs.
Bacterium that imparts or enhances its ability to add to the carbon source or other unacceptable culture conditions.
Gene sequences capable of allowing the growth of E. coli. Gene sequence reports
It may be both a target gene and a selectable marker gene. Most preferred of the present invention
A preferred reporter gene encodes E. coli β-galactosidase.
LacZ gene and a gene encoding puromycin resistance
.
A preferred reporter gene or selectable marker gene sequence is a normal cell
Sufficiently enables the recognition or selection of the vector. In one embodiment of the present invention
Reporter gene sequences may contain enzymes or other proteins not normally found in mammalian cells.
Encodes protein and, therefore, its presence depends on the vector in such cells.
The existence can be clearly established.
Heterogene sequences include suitable biologically active proteins or polypeptides,
Immunogenic or antigenic protein or polypeptide, or therapeutically active protein
Also included are coding sequences for proteins or polypeptides. Preferably, heterogeneous
The child sequence is a therapeutically active protein or polypeptide. One particularly preferred implementation
In examples, the heterogene is a cystic fibrosis transmembrane regulatory (CFTR) protein or
Encodes a biologically active analog, fragment, or derivative thereof. Or
The heterogene sequence is complementary to an RNA sequence, such as an antisense RNA sequence.
The antisense sequence is administered to the individual and the phase in the cells of the individual is
The expression of the complementary polynucleotide can be suppressed.
Expression of the heterogene is immunogenic or antigenic protein or polypeptide
To achieve an antibody reaction, which can be performed in body fluids such as animal blood, serum, or ascites.
Can be collected from
Of course, the inserted heterogene sequence may include a promoter, a start sequence,
Or use gene sequences that already contain processing sequences
.
Non-viral vector of the present invention
In another preferred embodiment, the transfer vector is non-viral. Other suitable vectors
Oligonucleotides (including RNA, DNA, synthetic and modified nucleic acids)
), Plasmid, and E. coli. RNA / DNA chimeric molecule reported by Kometz
But not limited thereto. The non-viral transfer vector of the present invention comprises
Foreign nucleic acids as described above for viral vectors can also be included. Oligonucleotide
Otides, plasmids, and RNA / DNA chimeric molecules can be any suitable
It can be synthesized or produced by any method.
Seven transmembrane receptors of the present invention
The receptors according to the invention belong to the family of 7-TM receptors. In general, Wat
son et al., The G-Protein Linked Receptor FacsBook, Academic Press, New York
(1994), U.S. Patent No. 5,482,835 to King et al.
One skilled in the art will appreciate that the 7-TM receptor is a G protein-coupled receptor.
Recognize it. Mammalian G protein-coupled receptors and coding for these receptors
Any nucleic acid sequence to be used can be used in the practice of the present invention. This
Such receptors include dopamine receptors, muscarinic cholinergic receptors, ∀-
Adrenergic receptor, opiate receptor, cannabinoid receptor, seroto
Nin receptor, β-adrenergic receptor, and purincepto receptor
rs), but is not limited thereto. "Receptor" as used herein
The term "" encodes the subtype of the receptor referred to, and the receptor
Along with the nucleic acid sequence, it is intended to include mutant strains and homologs.
Preferably, the 7-TM receptor for use according to the invention is a purine receptor (e.g.,
For example, P2Y1, P2YTwo, P2YFour, P2Y6And P2YII), Adrenaline activated
Sex receptors (ie, A1, A2, and A3, and subtypes thereof),
Radikinin receptors (eg, BKIAnd BKII) Or β-adrenergic
Condition (eg, β1, ΒTwoAnd βThree). Also, C5AComplement receptors are also preferred
. More preferred is P2YTwo, BKII, A2B, ΒTwo, And C5AIs a receptor
, P2YTwoIs most preferred. Therefore, the rigger used to implement the present invention
Nucleotides, nucleosides, catecholamines (eg, dopa
Min, 5-hydroxytryptophan), C5A, and bradykinin.
It is.
P2YTwo(P2U-Purine receptors include ATP, UTP and
Receives internalization upon activation with its analog. These receptor types
Is abundant on the rumen surface of human respiratory epithelium. Mason, S.M. J. Et al., 1991, Br
. J. Pharmacol. 103, 1649-1656. Activity of these receptors by ATP / UTP
P2Y of AdVTwoMolecular conjugation with the receptor is performed by the vector into the endosome.
Ad into WD epithelium to lead to ligand receptor internalization
Provides an alternative entry pathway for V and leads to subsequent gene expression.
Antibodies of the invention
As shown in FIGS. 1 and 2, the transfer vector carrying the heteronucleic acid
Targeting the 7-TM receptor for intracellular internalization
One method is with bispecific cross-linked antibodies. Generally, bispecific anti
The body is capable of transfecting both the transfer vector of interest and the 7-TM receptor epitope (ie,
Binding region that specifically recognizes vector and specifically recognizes 7-TM receptor
Binding region) and thereby "crosslinking" between the transfer vector and the receptor.
Is formed. Binding of the bispecific cross-linked antibody to the 7-TM receptor requires receptor in
Includes turnover. The conjugated antibody transfer vector complex is a 7-TM receptor
With the transfer vector that retains the heterologous nucleic acid.
The cell is introduced into the cell. According to this embodiment of the invention, the transfer vector is
Preferably a Lus vector, more preferably AdV, and a bispecific antibody.
Is a monoclonal directed against the adenovirus fiber protein
Including antibodies.
The term "antibody" as used herein includes IgG, IgM, IgD, and the like.
All immunoglobulins, including and immunoglobulins, are indicated. Of course, IgM and
IgG is particularly preferred. These antibodies are monoclonal or polyclonal.
Any (including (for example) mouse, rat, rabbit, horse, or human)
It may be of species origin or chimeric antibody. For example, M. Walker et al., Molec.
Immunol. 26, 403-11 (1989). These antibodies are disclosed in Reading U.S. Pat.
No. 4,893, or according to the method described in Cabilly et al., U.S. Pat.No. 4,826,567.
The produced recombinant monoclonal antibody may be used. In addition, these antibodies are
specific antibodies produced according to the method described in U.S. Pat.
It can also be made more chemically.
Antibodies can be polyclonal or monoclonal, preferably monoclonal.
New In a preferred embodiment, these antibodies are directed to both the target receptor and the transfer vector.
Cross-linked antibodies that are specific. According to this example, the cross-linking antibody is an adenovirus
Preferably, it is a monoclonal antibody directed against the fiber (knot) protein.
Also, a monoclonal antibody directed to a specific epitope of the desired 7-TM receptor
Is also preferred.
The epitope bound by the antibody to the 7-TM receptor (ie, specificity
Antibody that binds to the 7-TM receptor in a competitive binding assay.
Can be identified according to well-known methods such as the ability to compete with a labeled antibody.
Antibody fragments included within the scope of the present invention include, for example, Fab, F (a
b ') From 2 and Fc fragments and antibodies other than IgG
The corresponding fragments obtained are mentioned. Such fragments are well known
It can be generated by a method.
Polyclonal antibodies used to practice the present invention can be prepared according to well-known methods.
Suitable animals with antigens to which monoclonal antibodies to the 7-TM receptor bind (eg,
Immunize rabbits, goats, etc.) and collect immune serum from the animals.
Can be produced by separating polyclonal antibodies from their immune serum
You.
Monoclonal antibodies used to practice the invention are described by Kohler and Milstein,
Produced in a hybridoma cell line according to the method of Nature 265, 495-97 (1975)
can do. For example, a solution containing the appropriate antibody is injected into mice and
After some time, the mice can be sacrificed to obtain splenocytes. Next, typically
Fusion of splenocytes with myeloma or lymphoma cells in the presence of polyethylene glycol
Immobilization results in the production of hybridoma cells. Next, the hybridoma
The cells are grown in a suitable medium and the cells are raised for monoclonal antibodies with the desired specificity.
Screen Qing. Monoclonal Fab fragments are known to those of skill in the art.
It can be produced in E. coli by replacement techniques. For example, W. Huse, Scien
ce 246, 1275-81 (1989).
7-TM (for example, P2YTwo) Antibodies specific for the receptor are well known in the art.
It can also be obtained by the protein display phage method. If a person skilled in the art
Many specific immunoassays which may be useful for performing the methods disclosed therein
You will be familiar with essays formats and variants. Generally, E. Maggio, yeast
See Elementary Immunoassay, (1980) (CRC Press, Inc., Boca Raton, FL).
Skold, entitled "Method of regulating ligand-receptor interaction and its application"
U.S. Patent No. 4,727,022 to Ford et al., Entitled "
U.S. Patent No. 4,659,678 to Rest et al., "Immunomethod Using Monoclonal Antibodies.
U.S. Patent No. 4,376,110 to David et al.
Litman et al. Entitled "Macromolecular Environmental Control in Differential Receptor Assays"
U.S. Pat. No. 4,275,149, entitled "Reagents and Methods Using Channeling"
U.S. Pat.No. 4,233,402 to Maggio et al.
US Patent to Boguslaski et al. Entitled "Heterospecific Binding Assay Using"
No. 4,230,767
reference. Applicants specifically disclose the disclosures of all U.S. patent references cited herein.
It is intended to be incorporated by reference in the specification.
The antibodies described herein can be used in diagnostic assays according to well-known methods, such as precipitation.
A suitable solid support (eg, formed of a material such as latex or polystyrene)
Beads, plates, slides or wells). Similarly,
The antibodies described herein can be labeled with radioisotopes (eg,
If35S,125I,131I), enzyme labels (eg, horseradish peroxidase,
Alkaline phosphatase) and fluorescent labels (eg fluorescein)
They can be combined into available groups. As used herein, "antigen equivalent"
The term refers to the protein or vector for which equivalence is sought.
Indicates a protein or peptide that binds to an antibody that binds to the peptide. This
Antibodies used to select such antigen equivalents are referred to herein as "selected antibodies."
".
Non-antibody based targeting method
The present invention provides a transfer vector for the 7-TM receptor for internalization.
The means for targeting are described above for bispecific cross-linked antibodies. Figure
As shown in FIG. 2, alternative targeting methods include peptide and 7
-A method using a TM receptor agonist / antagonist.
For peptides, peptides are natural ligands that bind to the 7-TM receptor
obtain. Peptide agonists and antagonists of the 7-TM receptor are well known in the art.
It is. Also, a new 7-TM receptor agonist / antagonist has been described by King et al.
No. 5,482,835.
Alternatively, the peptide can be conjugated to the protein display phage method or to the 7-TM receptor.
It can be identified by other technically compatible methods.
Methods for synthesizing or producing peptides are well known in the art. In one particular embodiment,
The nucleic acid encoding the peptide is fused to the gene encoding the AdV gall protein.
Are inserted or inserted such that the knot peptide chimeric protein is expressed. An example
For example, it is possible that the foreign nucleic acid can be expressed at the C-terminal or H1 loop region of the knot protein
And is known. In another embodiment, a concatemer of the peptide is expressed.
As yet another alternative, pepti incorporated into "receptorbodies"
Targeting can be achieved with Generally, the receptor body is a 7-TM receiver.
Truncated peptide binding to the receptor is replaced by the intracellular region of the receptor
) The receptor. For example, a broken BKIIPeptide for 7-TM receptor
Can be fused to a ligand. The complex is humped by a broken receptor.
Binds to recombinant AdV expressing bradykinin in the protein region. In this way
BKIIPeptide ligand fused to the receptor binds this complex to the cell surface.
Target to that cognate receptor.
In yet another alternative, the transfer vector is a chemically linked high-ligand of the 7-TM receptor.
Targeting 7-TM receptors with affinity agonists / antagonists
Can be done. High affinity agonists / antagonists
As mentioned, it may be a peptide. Or ATP, UTP, dinucleo
And other molecules such as tides (described in more detail below), and derivatives thereof.
In one particular embodiment, P2YTwoBi as a receptor targeting agonist
Otin (B) -UTP is used. B-UTP is streptavidin (SA)
Interacts with the biotinylated virus transfer vector in the presence of P2YTwoReceptor
-Shows the virus-biotin-SA-biotin-UTP complex to be targeted
Sometimes. Alternatively, oligonucleotides, plasmids, and RNA / DN
A chimeric molecule is synthesized or produced and B-UTP or other suitable labeled nucleoti
Can be incorporated.
In yet another embodiment, as described in more detail below, sulfo-N-hydro
High affinity agonist / antago using xysuccinimide (NHS)
The nyst can be directly ligated to the transfer vector.
Biotin and covalent conjugate
Examples of compounds that can be used to practice the invention include those of the formula:
[Formula 1]Wherein A is a purine group or a pyrimidine group (eg, adenine, guanine, thymidine
, Cytosine, uracil) (each purine or pyridine group is
Covalent bond to nitrogen 3 or, in the case of pyrimidines, to nitrogen 1
Is preferably conjugated to a ribose or deoxyribose ring), R1
Is H or OH, and n is 1 to 6, preferably 3 or 4. ]
Compounds. The transfer vector is located at the appropriate location (eg, pyrimidine
Covalent attachment of the linked polymer chain at carbon 5 of the thiol or carbon 2 or 8 of the purine
By any suitable means, such as by covalent or non-covalent
Group or a corresponding ribose or deoxyribose ring.
Ligand is covalently attached to the binding group, or biotin is attached to the binding group.
The biotin group is attached to the ligand (see below) and the two biotin groups are attached.
The otyne group is formed by means of an avidin group where both biotin groups are joined or bound to each other.
Are joined.
As a specific example of a ligand that can be used to practice the present invention, the formula:
[Formula 2]
Wherein A and B each independently represent a purine group or a pyrimidine group (eg,
Denine, guanine, thymine, cytosine, uracil), preferably A is
Rasil and B are cytosines;
R1And RTwoAre each independently selected from the group consisting of H or OH;
n is 1 to 6, preferably 3 or 4;
The transfer vector may be A or B, or a means for a linking group, as described above.
The ribosome to which A or B is attached, either directly or indirectly
Covalently or non-covalently bound or conjugated to a source or deoxyribose
And a ligand having the following formula:
The linking groups used to practice the invention are generally water-soluble polymers and
It is a polymer containing a water-insoluble polymer. Water-soluble or hydrophilic binding groups are preferred
New These polymers are extendable chains of repeating monomer units, and
Along with a functional group. Typically, by covalent bonding, the ligand or
Is well known for its numerous polymers that can be functionalized to function as a linking group for vectors.
Yes, and will be readily appreciated by those skilled in the art. For example, polysaccharides such as dextran
, Polyvinyl alcohol, polypeptide such as polylysine, and polyacryl
Acids, but is not limited thereto. The ligand and the vector
It can be attached to a linking group in any conformation or position, including the off-chain end. General
In addition, the linking group will contain a chain of 2 to 24 carbons and will be substituted as described above.
It is best to be.
Biotin is covalently conjugated to the ligand by conventional techniques, and both
Biotin groups are conjugated to avidin or streptavidin groups according to well known techniques.
, A conjugate of a vector and a ligand.
As an example of a ligand to which biotin is covalently conjugated,
[Formula 3]
Wherein R2 is H or OH, preferably OH; n is equal to 1-4
, Preferably 3. ]. Such compounds are well known and commercially available
Have been. The uridine shown in the formula may be another purine or pi
Can be substituted for a lymidine group and is covalent to a purine or pyrimidine group at the appropriate position
The biotin and the bond shown between the biotin group and the uridine group conjugated to
(Eg, the five carbons in pyrimidines)
Ring carbon, or 2 to 8 carbons in purine). The important thing is
Gonucleotides (eg, DNA, RNA, or 5 or 10 to 30 or
50 chimeras) are thus linked to one or more of the biotins
Oligonucleotides that can be synthesized with a group and biotinylated in this way
The ability to bind a biotinylated ligand as described herein
is there.
The biotin group can be obtained from Pierce (3747 N. Meridian Road, P.O. Box. 117, Rockford.
EZ-LINK available from IL 61105)TMSulfo-NHS-LC-biotin
Vector (particularly a virus vector having a free amine group
Vector). Primary amine on vector
Examples of compounds that can be used to otinate are sulfo-N available from Pierce.
HS-LC-biotin, having the following structural formula:
[Formula 4]
In another embodiment, the biotin group shown in the sulfo compound described above is removed and
As described above, substitution with a covalent bond with the ligand
Covalent bonds can be obtained.
Target cells of the present invention
Hematopoietic stem cells, lymphocytes, vascular endothelial cells, respiratory epithelial cells, keratinocytes, skeletal muscle myocardium
Whether cells, nerve cells and cancer cells are foreign (ex vivo) or internal (in vivo)
These have been proposed as targets for therapeutic gene transfer. For example, A.D. Miller, N
357, 455-460 (1992), R.C.Mulligan, Science 260, 926-932 (1993)
reference. These and other eukaryotic cells are suitable targets for the vectors and methods of the present invention.
Cells. One advantage of the present invention is that it usually involves a transfer vector, ie, a viral vector.
Used to target heteronucleic acids to cells that do not bind the
It can be used.
In particular, all cells expressing a receptor from the 7-TM receptor family are of the present invention.
A suitable target for use by Purine receptors (eg, P2Y1, P2YTwo, P
2YFour, P2Y6, P2Y11), Adenosine receptor (ie, A1, ATwo, AThree)
, Bradykinin receptor (eg, BKI, BKII), Or β-adrenergic operation
Sex receptors (eg, β1, ΒTwo, ΒThree) Are preferred. Even more preferred
What is P2YTwoReceptor, A2BReceptor, βTwoReceptor, C5AIn cells that express the receptor
Yes, P2YTwoCells that express the receptor are most preferred. In addition, respiratory epithelial cells,
In addition, differentiated columnar airway epithelial cells are also preferred as targets. These cells are airway epithelial cells
In vitro, such as by administration of an aerosol containing a conjugate with the rumen surface
It can be administered as an in vitro or in vivo conjugate.
Gene transfer technology
The method of the present invention provides for heterologous nucleic acids in a broad phylogenetic host cell separately from the target cell nucleus.
Providing a means for delivering. The vectors, methods and drug preparations of the present invention
Treatment or other methods that require the desired protein or peptide
It is additionally useful in methods of administering a protein or peptide to an elephant. This
The protein or peptide is produced in the subject's body (in vivo)
This
Can be. The subject states that the subject has a protein or peptide deficiency
Or as a treatment or other method, and further described below
As such, production of a protein or peptide in a subject may have some therapeutic effect.
In terms of conferring, a protein or peptide may be required.
The gene transfer technology of the present invention has several uses. Probably the quickest application
Reveal the processing of functional domains of peptides and proteins
And To examine cell-specific differences in processing and cell fate,
The cloned cDNA or genomic sequence of the protein can be
Can be introduced into the cell type. Placing the coding sequence under the control of a strong promoter
This can produce a substantial amount of the desired protein. further
Included in protein processing, intracellular sorting, or biological activity
Specificity residues are measured by alterations in mutations at intermittent residues of the coding sequence
be able to.
The gene transfer technology of the present invention controls protein expression and regulates intracellular events.
It can also be applied to provide a means to evaluate its ability to moderate. For differentiation
Some functions of the protein, such as its role in tissue, can be tested in tissue culture.
At different points in development to monitor changes in important properties
Reintroduction (in vivo) is also required.
Gene transfer tests nucleic acid sequences and cellular factors that regulate specific gene expression
Provide a means to do so. One such test method is to report the regulatory elements to be tested.
Fusion to the reported gene, followed by evaluation of reporter gene expression.
Would.
Gene transfer has substantial potential in understanding disease states and providing therapy
It also has uses. There are a number of inherited diseases in which defective genes are known and cloned.
Exist. In some cases, the functions of these cloned genes are known.
Generally, the above disease states fall into two classes. That is, it is generally recessive
Some, usually a defective state of the enzyme and dominantly inherited, at least possibly contracted
Imbalance with regulatory or structural proteins. Defective state disease
For this purpose, gene transfer can be used to introduce a normal gene into the affected tissue for replacement therapy.
In addition, consider creating animal models for diseases using antisense mutations.
available. For imbalanced disease states, gene transfer should be used to
It is also conceivable to generate a condition and use it to interfere with a disease state. others
Thus, the methods of the present invention allow for the treatment of genetic disorders. As used herein
Some of the defects or imbalances that cause the disease or make it more severe
A targeted or complete alleviation treats the disease state. Cause a mutation
It is also possible to use site-specific integration of nuclear sequences to correct for this, or defects.
In one particularly preferred embodiment, the invention relates to a foreign CFTR protein in respiratory epithelium.
Used to express quality. According to this example, the CFTR gene is retained.
Preferably, an AdV transfer vector is used. AdV-CFTR is described above.
As shown, the sulfo-NHS linker allows the dinucleotide UPFourDirectly connected to C
You. UP on the apical surface of respiratory epitheliumFourP2Y of CTwoEpithelial cells by binding to receptors
Complete UP inFourInternalization of C-sulfo-NHS-AdV-CFTR complex
Induction is induced.
Drug preparation, subject, and method of administration
Suitable subjects to be treated according to the present invention include birds and mammalian subjects.
And mammals are preferred. Any mammal that needs to be treated according to the present invention
If all is appropriate. Human subjects are preferred. Bisexual and all stages of development (sun
(Ie, newborn, infant, child, adolescent, adult) human subject is treated in accordance with the present invention.
be able to. Human subjects with cystic fibrosis are preferred.
The active compound j of the present invention can be prepared as a pharmaceutically acceptable salt thereof.
You. Pharmaceutically acceptable salts retain the desired biological activity of the parent compound and
Is a salt that does not impart desirable toxic effects. Examples of such salts are
For example, (a) formed with an inorganic acid such as chlorine, hydrobromic acid, sulfuric acid, phosphoric acid, nitric acid, etc.
Acid addition salts such as acetic acid, oxalic acid, tartaric acid, succinic acid, maleic acid, and fumaric acid.
Luic acid, gluconic acid, citric acid, malic acid, ascorbic acid, benzoic acid, tannin
Acid, palmitic acid, alginic acid, polyglutamic acid, naphthalenesulfonic acid,
Salts formed with organic acids such as ligaracuronic acid, and (b) chlorine, bromine,
And salts formed with elemental anions such as iodine.
The active compounds according to the invention can be administered orally, rectally, transmucosally, topically or intestinal tract; intramuscularly, dermally
In addition to parenteral delivery including intramedullary infusion, subarachnoid, direct intravenous, intravenous,
Administered to the subject in need by appropriate means, including intraperitoneal, intranasal, or intraocular injection
can do. Or systemic rather than topical, eg, depot or sustained release
The compounds can also be administered as preparations. Pulmonary administration is preferred.
An active compound disclosed herein is a compound consisting of an active compound inhaled by a subject.
It is preferably administered by administration of an aerosol suspension of particles suitable for inhalation. Call
Particles suitable for absorption may be liquids or solids.
The aerosol of the liquid particles containing the active compound can be applied to a pressure driven aerosol nebulizer or
Can be generated by any suitable means, such as an ultrasonic nebulizer. For example, US Patent
See No. 4,501,729. The nebulizer is compressed gas, typically through a narrow venturi hole
Either by means of air or oxygen acceleration or by means of ultrasonic agitation.
A commercially available device that converts a solution or suspension of an active ingredient into a therapeutic aerosol mist.
You. Soluble preparations for use in nebulisers consist of the active ingredient in a liquid carrier,
The sexual component comprises a formulation between 40% w / w, but preferably less than 20% w / w
You. The carrier is typically water (and most preferably sterile, pyrogen-free water).
Or diluted aqueous alcoholic solution, for example, by adding sodium chloride to body fluids.
Preferably, it is produced isotonic.
Optional excipients include preservatives if the preparation is not sterile produced
For example, methylhydroxybenzoic acid, antioxidants, fragrances, essential oils, buffers and
And surfactants.
The aerosol of solid particles containing the active compound is likewise a drug aerosol from solid particles.
Can be generated with a livestock. Aerosol for administering solid particulate drug to a subject
The generator generates particles that are respirable, as described above, and
Volume of drug containing a predefined, metered dose of drug at a rate appropriate for the administration of the drug.
Generates an aerosol. One illustrative type of solid particle aerosol generator is an inhaler
It is. Delivered by inhaler means, as a suitable preparation for administration by inhalation
Finely ground powder that can be ingested or taken into the nasal passages in a snuffling manner
Is mentioned. In an inhaler, a powder (eg, performing the treatment described herein)
A metered dose effective to do so is typically in gelatin or plastic
It is stored in a manufactured capsule or cartridge, which
Or opened and the powder is released from the device on inhalation or by manual operation.
Delivered by pump means. The powder used in the inhaler may contain only the active ingredient or
Contains active ingredients, suitable powder diluents such as lactose, and optional surfactants
Powder blend. The active ingredient typically contains 0.1 to 100 w of the preparation.
/ W. A second type of illustrative aerosol generator is the inhalation of a metered dose.
Including vessel. Metered dose inhalers are pressurized aerosol dispensers, which are typically liquid
And a suspension or solution modifier of the active ingredient in the chemical propellant. When using these devices
Is a valve adapted to deliver a metered dose, typically 10-150 μl
Release of the preparation through to produce a fine particle spray containing the active ingredient. Suitable
Some chlorofluorinated compounds, such as dichlorodifluorometh
Tan, trichlorofluoromethane, dichlorofluoromethane and mixtures thereof
No. The preparation may additionally comprise one or more cosolvents, for example ethanol
Surfactants such as toluene, oleic acid or sorbitan triol, antioxidants and
And suitable flavoring agents.
The aerosol, regardless of solid or liquid particles, is about 10 to 15 per minute.
0 liters, preferably about 30 to 150 liters per minute, and most preferably
Or about 60 liters per minute by an aerosol generator
it can. Aerosols containing large amounts of drug can be administered more quickly
.
Dosage of the active compound disclosed herein or a pharmaceutically acceptable salt thereof
Will vary with the condition being treated and the condition of the patient, but will generally be
About 10 which is sufficient to achieve a melting concentration of the active compound on the surface.-7Or about 1
0-3Mol / l, more preferably about 10-6Or about 3 × 10-FourMole
/ Liter. Depending on the solubility of the particular preparation of active compound to be administered, 1
The daily dose can be divided and administered in 1 or 7 units. Other compounds have the activity of the present invention.
The compound, or a salt thereof, can be administered simultaneously.
As a solid or liquid particulate formulation containing the active agent of the present invention, a respirable size
Particles, i.e., pass through the mouth and larynx during inhalation and enter the bronchi and alveoli
Should include particles of small enough size. Generally, about 1 to 5 mi
Particles in the size range of RON (more preferably, less than 4.7 microns)
Is breathable. Non-breathable particles contained in the aerosol are in the pharynx
Minimizes the amount of non-respirable particles in the aerosol as it is deposited and swallowed
Preferably. In nasal administration, particles with a size of 10-500 μm
Preferred for assurance.
In administering the active compounds of the present invention, the compounds may be separated (simultaneously or sequentially).
) Or alternately, preferably premixed as a preformed conjugate
And can be administered. Illustratively, an appropriate dose to retain the heteronucleic acid of interest
Targeting vectors (ie, bispecific cross-linked antibodies)
, Peptide, biotin-UTP, etc.)
Can be administered.
In the preparation of a preparation according to the invention, the active agent or a physiologically acceptable salt may also be present.
Or the free radicals are typically mixed, inter alia, with an acceptable carrier. Rice cake
The carrier must be acceptable in terms of affinity with the other ingredients in the preparation
Should not be harmful to the patient's mind and body. The carrier can be solid or liquid, or both
And a unit dose preparation, for example, from about 0.5% to 99% by weight of the active compound.
It is preferable to prepare the capsule containing the compound. One or one
More active compounds can be incorporated into the preparations according to the invention, which preparations
It can be prepared by any of the known preparation methods including mixing of compounds.
Compositions containing dry, respirable particles of the active compound provide the active compound with a mortar and
The composition pulverized with a pestle and pulverized is passed through a 400 mesh filter,
Decomposes into large agglomerates.
The pharmaceutical composition optionally contains a dispersing agent used to facilitate the preparation of the aerosol.
Can have. A suitable dispersant is lactose, which has a suitable ratio (eg,
Can be mixed with benzamyl or fenamyl by weight 1: 1)
.
In summary, either split or undivided cells using the transfer vector of the invention
Stable transfection and stable expression of heterogenes
be able to. Use of this vector system may affect cell physiology.
The gene encoding the resulting protein can be introduced into divided or undivided cells.
Now it is possible. For this reason, the vectors of the present invention may be used for gene therapy of disease states, or
It can be useful for experimental modification of cell physiology.
Having described the invention, some of the text included herein for illustrative purposes only.
The present invention will be described with reference to such examples, but these are intended to limit the present invention.
Not something.
Example 1
Model of human airway epithelium
Epithelial cells are described in Gray et al., 1996, Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 14, 104-112
CF and non-CF nasal and bronchial air using procedures similar to those described above.
Derived from the tract epithelium. Resection of the trunk / lobe bronchi showing excess donor tissue
Part of the University of North Carolina's Chapel Hill Facility for the Protection of Human Rights
Obtained at the time of lung transplant, sponsored by an internal committee. Epithelial cells were reported as described (Wu, R. et al.
1985. Am. Rev. Respir. Dis 132, 311-320), by protease XIV digestion.
But removed the filtration step. 1-2x106Modify cells LH
Coat 100 mm tissue culture dishes in C9 medium. Lechner, J .; F. and Laveck
, M.A. 1985. J. Tiss. Cult. Meth. 9, 43-48. For correction, the EGF concentration was 25n
g / ml and increase the retinoic acid concentration to 5 × 10-8M and 0.
Supplement with 5 mg / ml bovine serum albumin and 0.8% bovine pituitary extract
It is included. Harvest and modify cells by trypsin treatment at approximately 75% fusion
In the culture medium, Transwell-Col insert (Corning-C)
ostar, 24mmΦ, pore size 0.4μm) density 2.5x10FivePassage 1 with cells
Cells were coated. The medium was composed of LHC basal (Biofluids) and DMEM-H.
A 50:50 mixture was used as a basis and amphotericin and gentamicin were used.
And supplemented LH except that the EGF concentration was reduced to 0.5 ng / ml.
It is almost the same as C9. After the cells have grown to fusion (4-6 days), the tip of the culture
Use surface
Until it reaches the gas-liquid interface for another 25-30 days.
Initial histological analysis of human WD derived from non-CF nasal airways after 34 days in culture,
Shows that the skin is a pseudo-stratified airway mucus fimbriae,
Abundant Syrian pili and cell types, representative of those present, are found.
Example 2
7 transmembrane receptor
Expression on the apical membrane of WD cells
Investigations were performed to determine if any 7-TM receptors were localized to the apical membrane of WD airway epithelial cells.
Confirmed that. A culture of WD cells was transformed into NECA (A2bReceptor agonist)
, Isopreterenol, bradykinin, or ATP (all 10-FourExposure to M)
Upon exposure, C1 secretion reactivity was measured. As shown in FIG.
Response was detected in the presence of all agonists, but the largest response was in the presence of ATP
Confirmed below. These results indicate a functional adenosine, β-adrenergic
Strongly suggests that bradykinin and purino receptors are present on the apical surface of airway epithelium
Is shown.
Example 3
In human PD and WD airway epithelial cells
AdV Binding and Internalization
AdV virus binding (AdV) internalization rather than AdV binding
And rate limiting steps resulting from inefficient gene transfer into RTE WD cultures.
Repeated experiments with human cultures to determine if the same rate limiting step exists
Measure whether or not. If this is the case, the cells are internalized.
Decrease the rate of AdV, but by increasing the amount of AdV that binds to these cell types
It is considered possible to increase the efficiency of gene transfer into the WD culture. PD or
For a given concentration of AdV exposed to the WD culture, the total AdV exposed to the cells
Only about 0.1 to 1% of the particles adhered after washing. A achieved on one exposure
Increased dV binding increases internalization by increasing AdV binding to cells
I
Increased gene transfer due to increased probability of venting to AdV entry
Connect.
To measure the rate-limiting step of ineffective gene transfer in human cultures
, PD and WD cultures35S-Ad5VLacZ (1.2 × 10TenExposure to p)
AdV binding, internalization and transgenes in human cultures
Analysis of expression is performed. Effect of increasing AdV concentration and / or duration of exposure to AdV
To check for porosity, PD and WD cultures were incubated at 4 ° C.
A series of concentrations (107-1012p / ml)35S-Ad5VLacZ (Pickles, R
. J., 1996. Human Gene Therapy 7, 921-931), followed by culture
Wash underground and analyze in three groups. Binding is measured as cell-associated radioactivity.
Internalization of the conjugated AdV was performed after transferring the cultures to 37 ° C for 6 hours.
It is determined by measuring cell-related radioactivity after removal of the internalization radioactivity. Departure
At present, the culture was transferred to 37 ° C. for 48 hours before measuring β-gal activity.
Set. Radioactivity counts per minute (CPM) and β-gal activity
Cells exposed to vector so that direct comparison with (in vivo) epithelium is possible
Since the tip surface area of the cell is the most appropriate criterion,
And standardize.
In PD cells, a 10-fold increase in concentration during the specific culture
AdV adherence, internalization and
And gene expression is likely to occur. 10-fold increase in AdV attachment in WD cultures
Is expected, but the corresponding 10-fold increase in internalization and expression is
Not expected. These data indicate that only increased binding was rate limiting in WD cultures.
It does not overcome the internal steps.
Example 4
P2YTwoTargeting AdV vectors to receptors
P2YTwoThe ability of receptors to bind and internalize foreign ligands
To test the idea that it is a candidate for a receptor for based targeting
In addition, we introduced HA-tagged human P2Y by retroviral gene transfer.TwoReceptor (
cell
CHO and A9 cells expressing the HA tag on the outer N-terminus (both by AdV)
Induction is impossible). HA-P2Y expressing A9 cells but not target cellsTwo
Receptors are stained with a fluorescently labeled anti-HA Ab under resting conditions. Agonist [ATP
γS (10-FourM)] With exposure, about 80% of the receptors were internalized within 45 minutes.
Is done. P2YTwoReceptor internalization via coat pit
Is mediated.
Next, using the bispecific antibody (bs-Ab) method, P2YTwoReceptor is gene-directed
Was tested to mediate entry. Antibody H against influenza hemagglutinin
A. 11 (BabCO) (anti-HA) on 1321N1 astrocytoma cells
Human P2Y to be expressedTwoFor the HA epitope inserted in the extracellular domain of the receptor
Turn around. The cross-linked antibody is used at neutral pH for m-maleimidobenzoyl-N-hydroxy
Disulfosuccinamide esters (Sulfo-MBS, Pierce, Rockford, IL)
Or N- (γ-maleimidobutylloxy) sulfosuccinyl ester (sulfo-G
MBS, Pierce, Rockford, IL) by reacting anti-fiber antibody
Generated. After reduction of anti-HA by mercaptoethylamine and salt removal,
The two antibodies are mixed to allow disulfide bridge formation. Line bifunctional antibody
Purify by continuous chromatography on fiber and HA columns.
For this Ad fiber (knot) and HA epitope tag (∀fiber x∀HA)
Using bs-Ab, HA-P2Y instead of null expressing A9 cellsTwoAcceptance
Binding of bs-Ab and AdV to the body has been demonstrated. A9-HA-P2
YTwoAdV bound to cells is apparent in the presence but not the absence of bs-Ab
Has been.
More importantly, P2Y in A9 and CHOTwoReceptor-specific gene transfer
Is achieved using the bs-Ab method. 1 protocol used
I.e., (1) HA-P2Y expressing A9 cellsTwoExpresses receptor and A9 cells
Bs-Ab at various concentrations of anti-null vector (anti-HA / anti-fiber knob; NIH D. Sege)
R. in Dr. l's laboratory After continuous exposure at 4 ° C)
, AdV-lacZ (particle 11 = 10Four); (2) agonists (ATPγS, 1
0-4M) for 1 hour at 37 ° C. followed by 24 hours in culture medium; and (
3) la
By counting the percentage of c-positive cells and quantifying the gene transfer efficiency by calculation, A9 cells
HA-P2Y expressing vesiclesTwoAd-la as a function of bs-mAb concentration
It was confirmed that cZ was transduced, but null A9 cells were not transduced.
(FIG. 4A). In fact, almost 100% gene transfer efficiency is 30 μ / ml bs-
Seems approaching with Ab.
In a second protocol using the preformed conjugate, -10 μg / ml bs-A
An increase in gene transfer reaching a peak at b was confirmed (FIG. 4A). High bs-Ab concentration
The decrease in transduction efficiency in the second degree reflects the competition of the target with unbound bs-Ab.
It is thought that.
Bs-Ab and biotinylation of HA and biotin (∀HA / ∀biotin)
HA-P2Y with adenovirus vectorTwo-Same as in gene transfer into RA9 cells
Like increase. Finally, A9-HA-P2YTwo-Bs-Ab in R cells
The specificity of the recognized gene transfer was evaluated (FIG. 4B). Ad-LacZ and AT
HA-P2Y exposed to PγSTwo-A9 cells have almost 100% LacZ expression
showed that. On the other hand, an inappropriate bs-Ab (anti-Ha / anti-AD P1
LacZ expression was hardly confirmed in step (p), and the free anti-HA antibody
In the presence or in cells previously exposed to high concentrations of agonist for 24 hours.
Not confirmed (this induces a cell surface receptor reducing effect). these
Data show that the HA-P2Y2 receptor demonstrates specific interaction with anti-HAb-Ab.
To mediate gene transfer.
Example 5
Use of other cell uptake
Mechanisms for increasing AdV entry into WD cultures
By targeting AdV to internalized receptors
The effectiveness of gene transfer depends on the internalization efficiency of the receptor. P2
YTwoHuman P2Y to test the internalization efficiency of the receptorTwoAcceptance
Body (influenza hemagglutinin (HA) epithelium inserted within extracellular domain)
Over-tag) in 1321N1 human astrocytoma cells
Has been expressed. S. Stromek and T.K. Hardon, Molecular Pharmacology 54, in p
ress (1988). P2YTwoExpressing cells at 37 ° C. at non-hydrolyzable ATP analog, AT
Cultured in PγS. At the time of specificity, 4% paraformaldehyde after addition of agonist
The cells were fixed without permeation in a buffer and washed. Monoclonal anti-HA antibody was cultured in cells
Later, Cy3-conjugated goat anti-mouse IgG secondary antibody (Jackson Immuno Research Labs)
And cultured. P2Y for pit HATwoReceptor availability visualized by fluorescence microscopy
did. Astrocytoma cells are expressed in P2Y in the absence of ATPγS.TwoPresence of receptor
The cells were fixed and immunostained, and ATPγS exposure was performed 30 minutes later. A
Immune activity from plasma membrane and punctate fluorescent signal in the continuous presence of gonist
Is apparent, indicating isolation into endosomes. Enzyme binding
The internalization was quantified by an antibody immunoassay (ELISA) assay and 80%
Efficiency was observed (receptor site loss due to 1 hour ATPγS exposure, Ken Hard
on, personal communication). It is an active receptor in astrocytoma cell lines.
Indicates that turnover is effectively occurring.
Example 6
Gene transfer on the apical membrane of polarized epithelium
The fused MDCK kidney cells were used as a model for polar AdV resistant epithelium. HA-Ps
YTwoIn MDCK cells expressing the receptor, the receptor is localized on the apical surface.
Was. The cells were exposed to anti-HA and anti-mouse IgGTITC at 4 ° C.
The presence was measured with a confocal microscope. HA-PsY in the apical membrane of polar MDCK cellsTwo
Receptors are partially desensitized by receptor internalization
Was confirmed. AdV-GFP (green fluorescent protein) and ATPγS
HA-PsY administered sequentiallyTwoThe bs-Ab directed to the receptor is a neo-expressed MD
HA-PsY compared to CK cellsTwoCauses the receptor to transduce. For this reason
, HA-PsYTwoReceptor-specific gene transfer was achieved in polar AdV-resistant cells
.
Example 7
A9 cells expressing bradykinin II (B2K) receptor and
P2YTwoReceptor or βTwoIn CHO cells expressing the receptor
Gene transfer
General applicability of the above methods has been demonstrated for other cell types and other receptors
.
HA epitope tag BKIIA9 cells expressing the receptor and neomycin only
Cells expressing A9 are expressed in the presence of bradykinin using a bispecific antibody
Anti-HA) and AdV. Briefly, cells are bispecific at 4 ° C.
Cultured in the absence or presence of the body (bs-Ab, 10 μg / ml, 2 hours)
After washing, AdVLacZ (10TenParticles, 2 hours) and wash
(Bk, 1 μM, 2 hours at 37 ° C.). next
Cells were maintained at 37 ° C. for 24 hours until gene expression was assessed by standard methods. FIG.
Enhance gene transfer by activating receptors with effective gene expression
It occurs only in HAB2K-expressing cells cultured on both immobilized bs-Ab and AdV.
Are shown. Almost no expression was confirmed with AdV alone, and AdV + bs-A
b, only moderate levels were observed (low levels even in the absence of ligand).
Indicate turnover of bell receptor). Regardless of the treatment, in null A9 cells,
Very little LacZ expression was confirmed. In additional studies, the HA epitope
CHO cells expressing tag β2-adrenergic receptor (lacking AdV adhesion receptor
Increase the concentration of Chinese hamster ovary cells) and wild-type (wt) CHO
Exposure to isolated bispecific antibodies (anti-fiber knob x anti-HA) and AdV
Finally exposed to isoproteronol. Briefly, bispecific at 4 ° C
Cultured in the absence or presence of a neutralizing antibody (bs-Ab, 0.1-10 μg / ml
, 2 hours), washing and AdVLacZ (10TenParticles, 2 hours)
And washed and exposed to bradykinin (BK, 1 μM,
time). Next, it was evaluated by measuring the density of LacZ-expressing cells expressed in arbitrary units.
The cells were maintained at 37 ° C. for 24 hours until they were released. 6A-B show HA-P2Y.Two-R
(FIG. 6A) Receptor or HA-βTwo(FIG. 6B) Only CHO cells expressing the receptor
Shows a bs-Ab dose-dependent increase in gene expression in E. coli.
Example 8
Biotinylated agonist
The vector is HA-P2YTwoTargeting the receptor (or another 7-TM receptor)
Another method of performing is to convert to a modified agonist / antagonist as a target molecule.
It is due to a scientific combination. Basic type agonist linker is biotin (B) -UTP
Which is a 16-carbon phosphorous connecting the 5 position of the pyrimidine group to biotin.
Contains car. B-UTP is P2YTwoIt is a receptor agonist (FIG. 7). firefly
In the light test, P2YTwoReceptor-expressing CHO cells are transformed into streptavidin-text
Exposure to B-UTP conjugated with Susabled (TR) induces B-UTP
, P2YTwoIt has been shown to internalize with the receptor.
In another test, gene targeting with B-UTP was performed using HA-P2YTwoReceiving
Evaluation was performed on A9 cells expressing the condition. HA-P2YTwo-A9 cells were continuously B-
UTP, streptavidin (SA), and B-AD (Bac expressing LacZ)
Otin-labeled adenovirus). HA-P2YTwo-About 9 of A9 cells
0% showed LacZ expression (FIG. 8). In contrast, in wild-type A9 cells, low
Only levels of LacZ expression were confirmed.
Example 9
Dinucleotide agonist
A non-hydrolyzable, biologically active analog of UTP is opened for binding to the vector.
Has been issued. Dinucleotide UTwoPFourHas ideal properties. Shown in FIG.
UTwoPFourIs equivalent to UTP in inducing a biological response and is cystic
Resistant to hydrolysis in fibrosis (CF) sputum.
Example 10
Examination of AdV internalization
Process in human PD and WD cultures
αvβ3/5Integrins mediate internalization, but in vitro (i
It has been reported that Ad adhesion does not mediate in epithelial cells (n vitro).twenty five. W
D
Membrane-bound αVβ with the apical and / or basolateral membrane of the culture3/5Integrin localization
Are important in understanding the role of these molecules in AdV-mediated gene transfer.
You. Due to the availability of many different antibodies to these integrins,
Their localization in the polar epithelium to be made possible. These integrins are R
It is also a receptor for peptides containing the GD amino acid sequence. Many tests show that R
GD peptide is αVβ3/5AdV on epithelial cells by interaction with integrin
It has been shown to suppress mediated gene transfer. This example is based on PD and WD
AdV binding, internalization and transgene expression in culture
The purpose of the present invention is to explain the effect of the RGD peptide.
Integrin antibody-specific immunoprecipitation3/5Localization of integrin
For this purpose, it was initially developed with an RTE WD culture. Against these integrins
Because antibodies are not commercially available, we used rat αvβ3/5Integrin37When
Liver for human endothelial cell vitronectin receptor known to cross-react
Antibody (R838, Dr. Steven Albelda, Pennsylvania State University (PA)
Has been used. Briefly, the top domain of the WD culture or
Indicates that any one of the basal domains is sulfo-NHS-biotin (0.5 mg) at 4 ° C.
/ Ml, Pierce) and only outer membrane proteins were biotinylated. Non-denaturing lysis
After solubilizing the cells in buffer (in the presence of a protease inhibitor),
Immunoprecipitation of protein and 4-12% acrylamide gel under non-reducing conditions
(Novex) by Western analysis. Strain biotinylated protein
Probing with a secondary antibody to putavidin-conjugated peroxidase and ECL
Detected by analysis (Supersignal CL-HRP, Pierce). Identified by R833
The biotinylated protein is shown in FIG. 5 (the 125 kD band is
Corresponding, 97 kD is β3/5(Corresponding to subunits), the basal lamina of RTE cells and
And HeLa cells but not in the apical membrane of WD cultures
Shows that vitronectin receptor is not localized at the apex of these cell types
ing. Absence of these integrins in the apical membrane indicates low levels in these cultures.
It is believed that the rate is due to AdV internalization.
Example 11
Of integrin present in human PD and WD cell lines
Identification and localization
Proteins from the apical and / or basolateral membranes of human PD and WD cultures
, By exposing individual surfaces to sulfo-NHS-biotin at 4 ° C.
Released. Standard immunoprecipitation experiments were performed using selective human antibodies (LM609, αVβThreeP1F6
, ΑVβFiveVR147, αv; P4G11, β1CD61, βThreePit βFiveand
R838, αVβ3/5All obtained from Chemicon Inc (CA)). This hand
Order allows detection and localization of αvβ to the apical and / or basolateral membrane
It is.
Example 12
Interference of AdV internalization by RGD peptide
As described above, PD and WD in the absence and presence of the RGD peptide
Adenovirus attachment, internalization and transgenes in culture
The expression is measured. Hexapeptide, bioactive GRGDSP (Gibco-RRL) and
The inactive target peptide GRGESP (Gibco-RRL) was converted to AdV (10Tenp / ml)
At a final concentration of 0.1-0.4 mg / ml for 2 hours at 4 ° C. before adding
Administer to WD cultures. Reported to be more potent in reducing AdV-mediated gene transfer
Also used for cyclic RGD peptide (Immunodynamics, La Jolla, CA)
I have. Analysis of AdV attachment, internalization and transgene expression is described above.
Do as you did.
Example 13
Examination of cell uptake process of AdV entry
Early AdV Adhesion to Epithelial Cells Occurs via Fiber (Hump) Protein
. Induces internalization and endosomal formation with fiber proteins alone
Whether or not the role of fibers is sufficient to localize the virus
It is unclear whether it is to take advantage of hereditary endosomal events.
However, AdV internalization in the cytoplasm is partially due to αVβ3/5To
More mediated. T. J. Wickham et al., Cell, 73, 309-319 (1993). αVβ3/5I
Integrins are absent from the apical membrane of WD cultures and cartilage airway epithelium, and
Are low in number and internalization and gene transfer in these cells
It is believed to be the cause of inefficiency. Thus, intracellular AdV
Investigate the process of cell uptake that may be the cause of the entry. First, the fibers (
To understand the functional role of protein-cell interactions, we
Protein is conjugated to fluorescent microspheres of the same diameter as Ad and confocal microscopy
The initial interaction of the hump spheres on PD and WD cells is better assessed. I
We find that increased specificity or non-specific binding is particularly important for internalization and
Test the hypothesis of increased expression. Second, we have a WD culture
Human αvβ3/5Overexpress integrin and direct this protein to the top membrane
You. If this is feasible, we have αvβ3/5Expression is internal
Test the hypothesis that it is a rate-limiting step for re-expression and gene expression
. Third, in order to understand the cell entry pathway utilized by Ad, we
It is incomplete or complete in coat pit receptor-mediated endocytosis
Find out which cell line is. We show that high concentrations of AdV are non-specific entry pathways
Test the hypothesis of gaining access into cells using. Finally, the experimental concept
As a consequence, when stimulated by other cellular uptake mechanisms, i.
By utilizing the targeting of AdV to specific receptor types that undergo itosis
Testing methods to increase the efficiency of internalization of AdV into WD cells
.
Example 14
By complete and incomplete receptor-mediated endocytosis
AdV internalization into HeLa cell lines
Adenovirus entry into cells is via the intracellular pathway, ie, coat pits.
The number of receptor-mediated endocytosis via nonspecific phagocytosis or phagocytosis
It reflects ingestion. R.M. Steinman et al. Cell Biol. 96, 1-27.
We have a coat for complete or incomplete receptor-mediated endocytosis
Pi
To test the role of citrate receptor-mediated endocytosis and nonspecific phagocytosis. field
Raw dynamin protein or mutant, mDyn (TET-inducible promoter
HeLa cell mutation that can overexpress any of
You. H. Damke et al. Cell Biol. 127, 915-934. Usually, dynamin is used to study plasma membranes.
Of coat pit endosome formation and function by “pinching” in research
It is a factor. HeLa cells overexpressing wild-type dynamin are more ingested than parental cells.
It does not show any functional or morphological changes during the sampling process. Cells overexpressing mDyn
Pits, invades the plasma membrane, but germinates coated vesicles into the cytoplasm
Never. Ligand for receptor-mediated endocytosis (EGF and trans
Ferrin) is internalized into cells expressing mDyn
No, but ligand-receptor binding, coat pit assembly, coat pit
Receptor recruitment into and plasma membrane internalization are all
No change. Non-specific phagocytosis in the absence of receptor-mediated endocytosis
Remains initially unchanged, but becomes confused over time, and receptor-mediated
Compensate for loss of cytosis.
Example 15
Uptake process for AdV entry into HeLa cells
Wild type or mDyn (Sandra Schmid, Scripps Research Institute, LaJol
la, CA), using HeLa that overexpresses any of these
Test the commonly used ingestion process for AdV entry into Series of
Testing AdV levels, high titers of AdV lead to cell uptake by non-specific processes
Test whether Briefly, it expresses wild-type or mdyn dynamin
Monolayers of mutated HeLa cells grown on plastic were grown at 4 ° C. for 2 hours with Ad5V.
LacZ (106-1011i. u. / Ml, MOl ~ 1-10FiveCorresponding to)
Transfer to 0-24 hours at 37 ° C. without washing, at which point cells are washed and
Maintain at 37 ° C. for 48 hours before performing the β-gal enzyme assay. At the point of specificity
The differences in gene expression observed between the two cell lines indicate that the receptor for the AdV entry
It reflects the involvement of mediated endocytosis. With this, we
Conducted a comparative test using fluorescent microspheres (with and without the use of attached bump proteins).
Details the specific and non-specific uptake processes and their interaction with these proteins
I do.
Example 16
Use of other cell uptake
Mechanisms for increasing AdV entry into WD cultures
By targeting AdV to internalized receptors
The effectiveness of gene transfer depends on the internalization efficiency of the receptor. P2
YTwoHuman P2Y to test the internalization efficiency of the receptorTwoAcceptance
Body (influenza hemagglutinin (HA) epithelium inserted within extracellular domain)
Is excessive in 1321N1 human astrocytoma cells
Has been expressed. P2YTwoExpressing the cells at 37 ° C. at non-hydrolyzable ATP analog, A
Cultured in TPγS. At the time of specificity, 4% paraformaldehyde after addition of agonist
Fixed in the hide without permeation and washed. Culturing monoclonal anti-HA antibody in cells
Followed by a Cy3-conjugated goat anti-mouse IgG secondary antibody (Jackson Immuno Research Labs
). P2Y for pit HATwoReceptor availability visualized by fluorescence microscopy
It has become. Cells are either a) in the absence of ATPγS or b) exposed to ATPγS for 30 minutes.
Later, P2YTwoFixed and immunostained for the presence of the receptor. Agonis
In the continuous presence of immunoglobulin, the immunoreactivity from plasma membrane and punctate fluorescent signals
Slight loss was observed, indicating isolation into endosomes. Enzyme-linked antibody free
Quantification of internalization by ELISA (ELISA) assay with 80% efficiency
(1 hour ATPγS exposure results in loss of receptor site, Dr. Ken Hardon
, Personal communication). It is an active receptor internal in astrocytoma cell lines.
Indicates that the resizing is occurring effectively.
Example 17
Analysis of transgene expression in human PD and WD cultures
A series of virus titers (106-1011Infection unit / ml: MOl〜1-10FiveTo
Increase the exposure time (1-24 hours) along with the apical and / or basal side
The PD and WD cultures were exposed to Ad5VLacZ by either application of the membrane.
Test the effect of concentration and time on the resulting gene expression. Used for this test
The vector has been generated and titrated by the UNC gene therapy core.
The cultivation is performed at 37 ° C and / or 4 ° C. The former temperature is the potential cell to be tested
The ingestion process is enabled, the latter temperature being used for receptor recycling and / or
Initial attachment of ligands to their receptors in the absence of internalization
This is a standardized method for measuring. Gene expression is assessed by qualitative and quantitative
X-gal histochemistry and standard colorimetric enzyme assays, respectively, to
Is evaluated 48 hours after exposure. Pickles, R. J. Et al., 1996, Human Gene Therapy
See 7, 921-931.
Although the invention has been described with reference to specific embodiments thereof, the invention may be further modified.
It will be understood that it is. The present application generally describes variations of the invention in accordance with the principles of the invention.
, Intended to cover all uses or indications, and the practice of the invention described above.
It is intended that the invention be applied to the basic features described in the scope of the examples.
Or any deviation from the present disclosure in well-known or customary practice in the art.
.
【手続補正書】特許法第184条の8第1項
【提出日】平成11年6月15日(1999.6.15)
【補正内容】
ヘテロ遺伝子の発現は免疫原性または抗原性タンパク質もしくはポリペプチド
を供給して抗体反応を達成し、この抗体は動物の血液、血清または腹水など体液
から採取することができる。
もちろん、挿入されるヘテロ遺伝子配列として、プロモーター、開始配列、ま
たはプロセシング配列をすでに保持する遺伝子配列を使用することが可能である
。
本発明の非ウイルスベクター
他の好ましい実施例では、移入ベクターは非ウイルスである。他の適切なベク
ターとして、オリゴヌクレオチド(RNA、DNA、合成および修飾核酸を含む)
、プラスミド、およびE.Kometzにより報告されたRNA/DNAキメラ分子が挙
げられるが、これらに限定されない。本発明の非ウイルス移入ベクターは、ウイ
ルスベクターに関して上述した外来核酸を含むこともできる。オリゴヌクレオチ
ド、プラスミド、およびRNA/DNAキメラ分子は、技術上周知の適切な方法
により合成または生成することができる。
本発明の7膜貫通受容体
当業者であれば、7−TM受容体がGタンパク質共役受容体であることを正し
く認識する。哺乳動物のGタンパク質共役受容体、およびこれらの受容体をコー
ドする核酸配列であればすべて、本発明の実施に使用することができる。このよ
うな受容体として、ドーパミン受容体、ムスカリン性コリン作動性受容体、α−
−アドレナリン作動性受容体、オピエート受容体、カンナビノイド受容体、セロ
トニン受容体、β−−アドレナリン作動性受容体、およびプリン受容体が挙げら
れる。
ビオチンおよび共有抱合体
本発明を実施するために用いることができる化合物の例として、式:
[化1][式中、Aはプリン基またはピリミジン基(例えば、アデニン、グアニン、チミ
ン、シトシン、ウラシル)(それぞれのプリンまたはピリミジン基は、プリンの
場合に窒素9との共有結合により、またピリミジンの場合に窒素1との共有結合
により、リボースまたはオキシリボース環に接合されることが好ましい)、R1は
HまたはOH;およびnは1乃至6、好ましくは3または4である。]を有する
化合物が挙げられる。移入ベクターは、適切な位置(例えば、ピリミジンの炭素
5、もしくはプリンの炭素2または8)での結合ポリマー鎖の共有的接合による
など適切な手段により、共有的または非共有的にプリン基もしくはピリミジン基
、または対応するリボースまたはデオキシリボース環に接合または結合され、そ
の結合基にリガンドが共有的に付着し、またはその結合基が付着し、ビオチン基
はリガンド(以下参照)に接合されるとともに2つのビオチン基は互いに両方の
ビオチン基が接合または結合するアビジン基の手段により接合される。
本発明を実施するために用いることができるリガンドの特別な例として、式:
[化2]
噴霧器に使用するための可溶性調製剤は液体担体中の活性成分からなり、活性成
分は40%w/w間での調製剤を含むが、好ましくは20%w/w未満である。
担体は典型的に水(および最も好ましくは発熱物質を含有しない滅菌水)または
希釈水性アルコール溶液であり、例えば塩化ナトリウムの添加により体液と等張
で精製されていることが好ましい。
任意の添加物として、調製剤が滅菌生成されていない場合は保存剤が挙げられ
、例えば、メチルヒドロキシ安息香酸、酸化防止剤、香気剤、精油、緩衝液およ
び界面活性剤が挙げられる。
活性化合物を含む固体粒子のエアロゾルは同様に固体粒子の薬剤エラロゾル発
生器で生成することができる。被験者に固体粒子薬剤を投与するためのエラロゾ
ル発生器は、上で説明したように、呼吸可能である粒子を生成するとともに、ヒ
トの投与に適切な速度での予め規定され計量された用量の薬剤を含有する容量の
エアロゾルを発生する。固体粒子エアロゾル発生器の1つの実例となる型は吸入
器である。吸入による投与のための適切な調製剤として、吸入器の手段により送
達され、またはスナッフルのやり方で鼻腔内に摂取され得る微細に粉砕される粉
末が挙げられる。吸入器では、粉末(例えば、本明細書中に記載された治療を実
施するために有効な計量された用量)は、典型的にゼラチンまたはプラスチック
で作成されたカプセルまたはカートリッジに格納され、これらはそのままで貫通
または開放され、粉末または吸入時に装置から抜かれる空気により、または手動
操作ポンプの手段により送達される。吸入器で使用される粉末は、活性成分のみ
または活性成分、ラクトースなど適切な粉末希釈液、および任意の界面活性剤を
含有するブレンドからなる。活性成分は、典型的に調製剤の0.1乃至100w
/wを含む。計量された用量の吸入器は加圧エアロゾル調合器であり、典型的に
液化推進剤中の活性成分の懸濁液または溶液調製剤を含む。使用時にこれらの装
置は計量され用量、典型的に10乃至150μlを送達するために適合した弁を
通して調製剤を放出し、活性成分を含有する微細粒子スプレーを生成する。
実施例2
7膜貫通受容体
WD細胞の頂膜での発現
調査を行い、もしあれば、7−TM受容体がWD気道上皮細胞の頂幕に局在し
ていることを確認した。WD細胞の培養株をNECA(Ab2受容体アゴニスト)、
イソプレテレノール、ブラジキニン、またはATP(すべて10-4Mで)に曝露
するとともに、C1分泌反応性を測定した。図3で示されているように、C1反
応がすべてのアゴニストの存在下に検出されたが、最大の反応はATPの存在下
に確認された。これらの結果は、機能的アデノシン、β−アドレナリン作動性、
ブラジキニンおよびプリノ受容体が気道上皮の先端表面に存在することを強く示
している。
実施例3
ヒトPDおよびWD気道上皮細胞における
AdVの結合およびインターナリゼーション
AdV結合ではなく、アデノウイルスベクター(ADV)インターナリゼーシ
ョン、RTEWD培養株への低効率の遺伝子導入の結果となる速度制限ステップ
を示す実験をヒト培養株で繰り返し行い、同じ速度制限ステップが存在するかど
うかを測定する。これが実際に該当する場合は、細胞はインターナリゼーション
の速度低下を示すが、これらの細胞型に結合するAdVの量を増強することでW
D培養株への遺伝子導入効率を増大することが可能と考えられる。PDまたはW
D培養株に曝露された所定濃度のAdVについては、細胞に曝露した全AdVの
約0.1〜1%のみが洗浄後にも付着していた。1回の曝露で得られる上記のA
dV結合の増強は、AdVの細胞との結合を増大によりインターナリゼージョン
イベントがAdVエントリーにつながる確率を増大するため、遺伝子導入の増大
につながる。
ヒト培養株における無効果な遺伝子導入の速度制限ステップを測定するため、
PDおよびWD培養株をS−Ad5VLacZ(1.2×1010P)に曝露し、
ヒト培養株におけるAdV結合、インターナリゼージョンおよび遺伝子発現の分
析を行う。
アゴニスト[ATPγS(10-4M)]曝露では、受容体の約80%が45分以
内にインターナリゼーションされる。P2Y2受容体のインターナリゼーション
はコートピットを介して媒介される。
次に、二重特異性抗体(bs−Ab)法を用いて、P2Y2受容体が遺伝子導
入を媒介するかどうかを試験した。インフルエンザ赤血球凝集素に対する抗体H
A.11(BabCO)(抗HA)を、1321N1アストロサイトーマ細胞で発
現するヒトP2Y2受容体の細胞外ドメインに挿入されたHAエピトープに対し
て向ける。架橋抗体は、中性のpHでm−マレイミドベンゾイル−N−ヒドロキ
シスルホスクシンアミドエステル(スルホ−MBS、Pierce、Rockford、IL)ま
たはN−(γ−マレイミドブチルロキシ)スルホスクシンエステル(スルホ−G
MBS、Pierce、Rockford、IL)で抗線維(こぶ)抗体を反応させることにより
生成される。メルカプトエチルアミン、および塩分除去による抗HAの削減後、
2つの抗体を混合し、ジスルフィド架橋結合形成を可能とする。二官能抗体を線
維タンパク質およびHAカラム上の連続クロマトグラフィにより精製する。
Ad線維(こぶ)およびHAエピトープタグ(α線維xaHA)に対するこの
bs−Abを用いて、A9細胞を発現するヌルとではなく、HA−P2Y2受容
体とのbs−AbおよびAdVの結合が明らかにされている。A9−HA−P2
Y2細胞と結合されたAdVは、bs−Abの非存在下ではなく、存在下に明ら
かにされている。
さらに重要なのは、A9およびCHOにおけるP2Y2受容体特異性遺伝子導
入が、bs−Ab法を用いて達成されていることである。使用した1プロトコー
ル、すなわち(1)A9細胞を発現するHA−P2Y2受容体とA9細胞を発現
するヌルベクターの各種濃度のbs−Ab(抗HA/抗線維こぶ;NIHのD.Sege
l博士の実験室におけるR.Pickles博士により生成)の4℃下での連続曝露の後
、AdV−lacZ(粒子○1=104);(2)アゴニスト(ATPγS、10-4
M)による37℃下での1時間の培養後、培地で24時間培養;および(3)la
c陽性細胞の割合の計数および計算による遺伝子導入効率の定量により、A9細
胞を発現するHA−P2Y2受容体がbs−mAb濃度の関数としてAd−
lacZにより形質導入されるが、ヌルA9細胞は形質導入されないことが確認
された(図4A)。実際に、ほぼ100%の遺伝子導入効率が30μg/mlのb
s−Abで近づいているように思われる。
前形成抱合体を用いた第2のプロトコールでは、〜10μg/mlのbs−A
bでピークに達する遺伝子導入の増加が確認された(図4A)。高bs−Ab濃度
での形質導入効率の低下は、標的の非結合bs−Abによる競合を反映している
と考えられる。
HAとビオチン(αHA/αビオチン)に対するbs−Abおよびビオチン化
アデノウイルスベクターによるHA−P2Y2−RA9細胞への遺伝子導入の同
様の増大。最後に、A9−HA−P2Y2−R細胞におけるbs−Abにより確
認された遺伝子導入の特異性を評価した(図4B)。Ad−LacZおよびATP
γSに曝露されたHA−P2Y2−RA9細胞はほぼ100%のLacZの発現
を示した。これに対して、不適切なbs−Ab(抗Ha/抗AD P1エピトープ
)ではLacZ発現はほとんど確認されず、40倍を超える遊離抗HA抗体の存
在下でも、高濃度のアゴニストに24時間、前曝露されていた細胞においても確
認されなかった(これにより細胞表面受容体の減少作用を誘導する)。これらのデ
ータにより、HA−P2Y2受容体が抗HAb−Abとの特異的相互作用を介し
て遺伝し導入を媒介することが確認される。
実施例5
他の細胞摂取の利用
WD培養株内へのAdVエントリーを増大する秩序
インターナリゼーションを受ける受容体へのAdVのターゲッティングによる
遺伝子導入の有効性は、受容体のインターナリゼーション効率に依存する。P2
Y2−受容体のインターナリゼーション効率を試験するために、ヒトP2Y2受容
体(細胞外ドメイン内に挿入されたインフルエンザ赤血球凝集素(HA)エピト
ープータグによる)が、1321N1ヒトアストロサイトーマ細胞において過剰
発現されている。S.StromekとT.K.Hardon、Molecular Pharmacology 54,in pres
s(1988)。P2Y2発現細胞を37℃下に非加水分解性ATP類似体、ATPγS
で培養した。特異性時点で、アゴニスト添加後、4%パラホルムアルデヒド中で
透過せずに固定し、洗浄した。モノクローン抗HA抗体を細胞で培養した
後、Cy3抱合ヤギ抗マウスIgG二次抗体(Jackson Immuno Research Labs)で
培養した。抗HAに対するP2Y2受容体の利用可能性は蛍光顕微鏡で視覚化し
た。アストロサイトーマ細胞はATPγSの非存在下にP2Y2受容体の存在の
ために固定するとともに免疫染色し、30分後にATPγS曝露を行った。
HAエピトープタグBKII受容体を発現するA9細胞およびネオマイシンのみ
を発現するA9細胞を、ブラジキニンの存在下に二重特異性抗体(抗線維こぶx
抗HA)およびAdVに曝露した。簡単に言えば、4℃下に細胞を二重特異性抗
体の非存在下または存在下に培養し(bs−Ab、10μg/ml、2時間)、洗
浄するとともに、AdVLacZ(1010粒子、2時間)に曝露し、洗浄すると
ともに、ブラジキニン曝露した(BK、1μM、37℃下に2時間)。次に、遺伝
子発現が標準法で評価されるまで細胞を37℃で24時間維持した。図5は、有
効な遺伝子発現がアゴニストで受容体を活性化することで遺伝し導入を強化した
bs−AbとAdVの両方で培養したHAB2K発現細胞でのみ生じることを示
している。AdVのみではほとんど発現は確認されず、AdV+bs−Abの存
在下には中等度のレベルのみが確認された(リガンドの非存在下でも低レベルの
受容体のターンオーバーを示す)。処置に感家なく、ヌルA9細胞では、きわめ
てわずかなLacZ発現が確認された。追加の試験では、HAエピトープタグβ
2−アドレナリン受容体を発現するCHO細胞(AdV付着受容体を欠くチャイ
ニーズハムスター卵巣細胞)および野生型(Wt)CHOを、濃度を増大した二
重特異性抗体(抗線維こぶx抗HA)およびAdVに連続的に曝露し、最終的に
イソプロテノールに曝露した。簡単に言えば、4℃下に細胞を二重特異性抗体の
非存在下または存在下に培養し(bs−Ab、0.1〜10μg/ml、2時間)
、洗浄するとともに、ブラジキニンに曝露した(BK、1μM、37℃下に2時
間)。次に、任意の単位で示されたLacZ発現細胞の密度計測により評価され
る間で細胞を37℃で24時間維持した。図6A〜Bは、HA−P2Y2−R(
図6A)受容体またはHA−β2(図6B)受容体を発現するCHO細胞のみで
の遺伝子発現のbs−Ab用量依存性増加を示している。
実施例8
ビオチン化アゴニスト
ベクターをHA−P2Y2受容体(または別の7−TM受容体)にターゲッティ
ングする別の方法は、標的分子として修飾アゴニスト/アンタゴニストへの化学
結合によるものである。基本型アゴニストリンカーがビオチン(B)−UTPで
あり、これはピリミジン基の5の位置をビオチンに接続する16個の炭素リンカ
ーを含有する。B−UTPはP2Y2受容体のアゴニストである(図7)。
蛍光試験では、P2Y2受容体を発現するCHO細胞をストレプトアビジン−
テキサスレッド(TR)と抱合したB−UTPに曝露すると、B−UTPが誘発
され、P2Y2受容体とインターナリゼーションすることが明らかにされている
。
別の試験では、B−UTPによる遺伝子ターゲッティングをHA−P2Y2受
容体を発現するA9細胞で評価した。HA−P2Y2−A9細胞を連続的にB−
UTP、ストレプトアビジン(SA)、およびB−AD(LacZを発現するビオ
チン標識アデノウイルス)に曝露した。HA−P2Y2−A9細胞のおよそ90%
がLacZ発現を示した(図8)。これに対して、野生型A9細胞では、低レベル
のLacZ発現のみが確認された。
実施例9
ジヌクレオチドアゴニスト
ベクターとの結合のためのUTPの非加水分解性で生物学的に活性類似体が開
発されている。ジヌクレオチドU2P4は理想的な特性を有する。図9に示されて
いるように、U2P4は生物学的反応を誘導する上でUTPと対等であり、嚢胞性
線維症(CF)痰における加水分解に対して耐性である。
実施例10
AdVインターナリゼーションの検討
ヒトPDおよびWD培養株におけるプロセス
αvβ3/5インテグリンはインターナリゼーションを媒介するが、試験管内上
皮細胞内へのAdの付着は媒介しないことが報告されている。WD培養株の頂膜
および/または基底側膜との膜結合αvβ3/5インテグリンの局在は、AdV媒
介遺伝子導入におけるこれらの分子の役割を理解する上で重要である。これらの
インテグリンに対する多くの異なる抗体の利用可能性により、測定すべき極性上
皮におけるそれらの局在が可能となる。これらのインテグリンはRGDアミノ酸
配列を含有するペプチドの受容体でもある。多くの試験により、RGDペプチド
はαvβ3/5インテグリンとの相互作用により上皮細胞へのAdV媒介遺伝子導
入を抑制することが示されている。この実施例は、PDおよびWD培養株におけ
るAdV結合、インターナリゼーションおよび導入遺伝子発現に対するRGBペ
プチドの影響を説明するものである。
インテグリン抗体特異性免疫沈降法は、αvβ3/5インテグリンを局在するた
めに、当初はRTE WD培養株で開発された。これらのインテグリンに対する
抗体が市販されていないため、われわれは、ラットαvβ3/5インテグリンと交
差反応することがわかっているヒト内皮細胞ビトロネクチン受容体に対して生じ
た抗体(R838、ペンシルヴェニア州立大学(PA)、スティーブン・アルベル
ダ博士より贈呈)を得て用いられている。簡単に言えば、WD培養株の頂ドメイ
ンまたは基底側ドメインのいずれかを4℃下にスルホ−NHS−ビオチン(0.
5mg/ml。Pierce)に曝露し、外膜タンパク質のみをビオチン化した
。非変性溶解緩衝液(タンパク質分解酵素抑制剤の存在下に)中に細胞を可溶化
した後、タンパク質を免疫沈降するとともに、非還元条件下に4〜12%アクリ
ルアミドゲル(Novex)上でウェスタン分析により分離した。ビオチン化タ
ンパク質をアトレプトアビジン抱合ペロキシダーゼ二次抗体でプロービングする
とともに、ECL分析(スーパーシグナルCL−HRP、Pierce)。R83
3により同定されたビオチン化タンパク質は図5に示されており(125kDの
バンドはαvに対応し、97kDはβ3/5サブユニットに対応する)、RTE細胞
の基底側膜およびHeLa細胞には存在するが、WD培養株の頂膜には局在して
いないことを示している。頂膜におけるこれらのインテグリンの非存在は、これ
らの培養株内における低レートのAdVインターナリゼーションに原因があると
考えられる。
実施例11
ヒトPDおよびWD細胞株に存在するインテグリンの
同定および局在
ヒトPDおよびWD培養株の頂膜および/または基底側膜からのタンパク質を
、個々の表面を4℃でスルホ−NHS−ビオチンに曝露することにより選択に分
離した。標準免疫沈降実験を選択的ヒト抗体(LM609、αvβ3;P1F6
、αvβ5;VR147、αv;P4G11,β1;CD61,β3;抗β5および
R838、αvβ3/5;すべてChemicon Inc(CA)より入手)で行った。
特許請求の範囲
1. 細胞内にヘテロ核酸を送達する方法において、
前記細胞に抱合体を接触させるステップであって、前記抱合体は移入ベク
ターおよびリガンドを含み、前記移入ベクターは前記細胞内に送達されるヘテロ
核酸を含み、前記リガンドはGタンパク質共役受容体に結合するとともに、前記
細胞は前記ベクターを前記細胞内にインターナリゼーションされる条件下に、前
記Gタンパク質共役受容体を発現するステップを含む方法。
2. 前記ベクターはウイルスベクターである、請求項1に記載の方法。
3. 前記ベクターはアデノウイルスベクター、アデノウイルス随伴ウイルス
ベクター、ヒトレトロウイルスベクター、非ヒトレトロウイルスベクター、およ
びヘルペスウイルスベクターからなる群から選択されるウイルスベクターである
、請求項1に記載の方法。
4. 前記ウイルスベクターはレンチウイルスベクターおよびモロニーマウス
白血病ウイルスベクターからなる群から選択される、請求項3に記載の方法。
5. 前記ベクターはオリゴヌクレオチドである、請求項1に記載の方法。
6. 前記リガンドは抗体である、請求項1に記載の方法。
7. 前記リガンドはペプチドである、請求項1に記載の方法。
8. 前記リガンドはヌクレオチド、ヌクレオシド、カテコールアミン、C5
A、およびブラジキニンからなる群から選択される、請求項1に記載の方法。
9. 前記リガンドはGタンパク質共役受容体アゴニストおよびGタンパク質
共役受容体アンタゴニストからなる群から選択される、請求項1に記載の方法。
10. 前記抱合体は共有抱合体である、請求項1に記載の方法。
11. 前記細胞は気道上皮細胞である、請求項1に記載の方法。
12. 前記細胞は分化柱上上皮細胞である、請求項1に記載の方法。
13. 前記接触させるステップは試験管内(in vitro)で実施される、請求項
1に記載の方法。
14. 前記接触させるステップは生体内(in vivo)で実施される、請求項1
に
記載に方法。
15. 前記抱合体は前記接触させるステップ前に形成される請求項1に記載の
方法。
16. ウイルスベクターに特異的に結合する第1の結合領域と、Gタンパク質
共役受容体の細胞外エピトープに特異的に結合する第2の結合領域とを含む二重
特異性抗体。
17. 細胞内ヘテロ核酸を送達するために有用な抱合体であって、前記抱合体
は移入ベクターとリガンドを含み、前記移入ベクターは前記細胞内に送達される
ヘテロ核酸を含むとともに、前記リガンドはGタンパク質はGタンパク質共役受
容体に特異的に結合する抱合体。
18. 前記ベクターはウイルスベクターである、請求項17に記載の抱合体。
19. 前記ベクターはアデノウイルスベクター、アデノウイルス随伴ウイルス
ベクター、ヒトレトロウイルスベクター、非ヒトレトロウイルスベクター、およ
びヘルペスウイルスベクターからなる群から選択されるウイルスベクターである
、請求項17に記載の方法。
20. 前記ウイルスベクターはレンチウイルスベクターおよびモロニーマウス
白血病ウイルスベクターからなる群から選択される、請求項17に記載の方法。
21. 前記ベクターは抗体である、請求項17に記載の方法。
22. 前記リガンドはペプチドである、請求項17に記載の方法。
23. 前記リガンドはヌクレオチド、ヌクレオシド、カテコールアミン、C5
A、およびブラジキニンからなる群から選択される、請求項17に記載の方法。
24. 前記リガンドはGタンパク質共役受容体アゴニストおよびGタンパク質
共役受容体アンタゴニストからなる群から選択される、請求項17に記載の方法
。
25. 前記抱合体は共有抱合体である、請求項17に記載の方法。
26. 前記ベクターはアデノウイルスベクターである請求項3に記載の方法。
27. 前記リガンドはブラジキニンである、請求項8に記載の方法。
28. 前記リガンドはUTPもしくはその類似体または誘導体である、請求項
8に記載の方法。
29. 前記リガンドはU2P4である、請求項28に記載の方法。
30. 前記リガンドはアデノウイルスこぶタンパク質である、請求項1に記載
の方法。
31. 前記Gタンパク質共役受容体は、ドーパミン受容体、ムスカリンコリン
作動性受容体、α−アドレナリン作動性受容体、オピエート受容体、カンナビノ
イド受容体、セロトニン受容体、β−アドレナリン受容体、プリン受容体、およ
びC5A補体受容体からなる群から選択される、請求項1に記載の方法。
32. 前記Gタンパク質共役受容体はブラジキニン受容体である、請求項1に
記載の方法。
33. 前記タンパク質共役受容体はP2Y2受容体である、請求の範囲第1項
に記載の方法。
34. 前記細胞はヒト細胞である、請求項1に記載の方法。
35. 前記ヘテロ核酸は治療的タンパク質またはペプチドをコードする、請求
項1に記載の方法。
36. 前記ヘテロ核酸は免疫原性タンパク質またはペプチドをコードする、請
求項1に記載の方法。
37. 前記ヘテロ核酸は嚢胞性線維症膜貫通調節タンパク質もしくはその生物
学的に活性な類似体、断片または誘導体である、請求項1に記載の方法。
38. 前記ヘテロ核酸はアンチセンス配列をコードする、請求項1に記載の方
法。
39. 前記ウイルスベクターはアデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルス
ベクター、ヒトレトロウイルスベクター、非ヒトレトロウイルスベクター、およ
びヘルペスウイルスベクターからなる群から選択される、請求項16に記載の二
重特異性抗体。
40. 前記ウイルスベクターはレンチウイルスベクターおよびモロニーマウス
白血病ウイルスベクターからなる群から選択される、請求項39に記載の方法。
41. 前記ウイルスベクターはアデノウイルスベクターである、請求項39に
記載の二重特異性抗体。
42. 前記Gタンパク質共役受容体は、ドーパミン受容体、ムスカリンコリン
作動性受容体、α−アドレナリン作動性受容体、オピエート受容体、カンナビノ
イド受容体、セロトニン受容体、β−アドレナリン受容体、プリン受容体、およ
びC5A補体受容体からなる群から選択される、請求項16に記載の二重特異性
抗体。
43. 前記Gタンパク質共役受容体はブラジキニン受容体である、請求項42
に記載の二重特異性抗体。
44. 前記タンパク質共役受容体はP2Y2受容体である、請求項42に記載
の二重特異性抗体。
45. 前記二重特異性抗体はモノクローナル抗体を含む、請求項16に記載の
二重特異性抗体。
46. 前記二重特異性抗体はアデノウイルス線維タンパク質に対して向けられ
たモノクローナル抗体を含む、請求項45に記載の二重特異性抗体。
47. 前記ベクターはアデノウイルスベクターである、請求項19に記載の抱
合体。
48. 前記リガンドはブラジキニンである、請求項23に記載の抱合体。
49. 前記リガンドはUTPもしくはその類似体または誘導体である、請求項
23に記載の抱合体。
50. 前記リガンドはU2P4である、請求項49に記載の抱合体。
51. 前記リガンドはアデノウイルスこぶタンパク質である、請求項17に記
載の方法。
52. 前記Gタンパク質共役受容体は、ドーパミン受容体、ムスカリンコリン
作動性受容体、α−アドレナリン作動性受容体、オピエート受容体、カンナビノ
イド受容体、セロトニン受容体、β−アドレナリン受容体、プリン受容体、およ
びC5A補体受容体からなる群から選択される、請求項17に記載の抱合体。
53. 前記Gタンパク質共役受容体はブラジキニン受容体である、請求項17
に記載の抱合体。
54. 前記タンパク質共役受容体はP2Y2受容体である、請求項17に記載
の抱合体。
55. 製剤的に容認される担体で請求項17の抱合体を含む製剤。
56. ヘテロ核酸を極性化内皮細胞内に送達する方法において、
前記極性化上皮細胞に抱合体を接触させるステップであって、前記抱
合体は移入ベクターおよびリガンドを含み、前記移入ベクターは前記細胞内に送
達されるヘテロ核酸を含み、前記リガンドは前記極性化上皮細胞の先端表面上の
受容体に特異的に結合するステップを含む方法。
57. 前記極性化上皮細胞は極性化気道上皮細胞である、請求項56に記載の
方法。
58. 前記極性化上皮細胞は極性化腎上皮細胞である、請求項56に記載の方
法。
59. 核酸を被験者に投与する方法において、
前記被験者に抱合体を投与するステップであって、前記抱合体は移入
ベクターおよびリガンドを含み、前記移入ベクターはヘテロ核酸を含み、前記リ
ガンドはGタンパク質共役受容体に結合するとともに、前記リガンドは前記抱合
体が細胞により発現されるGタンパク質結合受容体に結合し、前記ベクターを前
記細胞内にインターナリゼーションされる条件下に、前記Gタンパク質共役受容
体に特異的に結合するステップを含む方法。
60. 前記被験者はヒト被験者である、請求項59に記載の方法。
61. 前記被験者は嚢胞性線維症を有する、請求項60に記載の方法。
62. 前記抱合体は、経口、直腸、経粘膜、局所、腸、吸入、静脈内、筋肉内
、皮下、骨髄内、クモ膜下、直接心室内、腹膜内、鼻腔内、および眼内投与から
なる群から選択される経路により被験者に投与される、請求項59に記載の方法
。
63. 前記抱合体は肺に投与される、請求項59に記載の方法。
64. 前記Gタンパク質共役受容体は極性化上皮細胞の先端表面上に発現され
る、請求項59に記載の方法。
65. 前記極性化上皮細胞は極性気道上皮細胞である、請求項64に記載の方
法。[Procedure of Amendment] Article 184-8, Paragraph 1 of the Patent Act
[Submission date] June 15, 1999 (June 15, 1999)
[Correction contents]
Expression of the heterogene is immunogenic or antigenic protein or polypeptide
To achieve an antibody reaction, which can be performed in body fluids such as animal blood, serum, or ascites.
Can be collected from
Of course, the inserted heterogene sequence may include a promoter, a start sequence,
Or use gene sequences that already contain processing sequences
.
Non-viral vector of the present invention
In another preferred embodiment, the transfer vector is non-viral. Other suitable vectors
Oligonucleotides (including RNA, DNA, synthetic and modified nucleic acids)
, Plasmids, and chimeric RNA / DNA molecules reported by E. Kometz
But not limited thereto. The non-viral transfer vector of the present invention comprises
The exogenous nucleic acid described above with respect to the Rus vector can also be included. Oligonucleotide
Plasmids, and RNA / DNA chimeric molecules can be prepared by any suitable method known in the art.
Can be synthesized or produced.
Seven transmembrane receptors of the present invention
One skilled in the art will appreciate that the 7-TM receptor is a G protein-coupled receptor.
Recognize it. Mammalian G protein-coupled receptors and coding for these receptors
Any nucleic acid sequence to be used can be used in the practice of the present invention. This
Such receptors include dopamine receptor, muscarinic cholinergic receptor, α-
-Adrenergic receptors, opiate receptors, cannabinoid receptors, cello
Including tonin receptors, β-adrenergic receptors, and purine receptors
It is.
Biotin and covalent conjugate
Examples of compounds that can be used to practice the invention include those of the formula:
[Formula 1]Wherein A is a purine group or a pyrimidine group (eg, adenine, guanine, thymidine
, Cytosine, uracil) (each purine or pyrimidine group is
In some cases by covalent bonding to nitrogen 9 and in the case of pyrimidines by covalent bonding to nitrogen 1
Is preferably conjugated to a ribose or oxyribose ring), R1Is
H or OH; and n is 1 to 6, preferably 3 or 4. Has
Compounds. The transfer vector is placed at the appropriate location (eg, the pyrimidine carbon
5 or by covalent conjugation of the binding polymer chain at carbon 2 or 8) of the purine
Purine group or pyrimidine group covalently or non-covalently by appropriate means such as
Or bonded or bonded to the corresponding ribose or deoxyribose ring,
The ligand is covalently attached to the binding group of
Is conjugated to a ligand (see below) and the two biotin groups are
The biotin group is conjugated by means of an avidin group which is conjugated or bound.
As a specific example of a ligand that can be used to practice the present invention, the formula:
[Formula 2]
Soluble preparations for use in nebulisers consist of the active ingredient in a liquid carrier,
The minute contains the preparation between 40% w / w, but preferably less than 20% w / w.
The carrier is typically water (and most preferably sterile pyrogen-free water) or
Dilute aqueous alcohol solution, for example, isotonic with body fluids by addition of sodium chloride
Preferably, it is purified by
Optional additives include preservatives if the preparation is not sterile produced
For example, methylhydroxybenzoic acid, antioxidants, fragrances, essential oils, buffers and
And surfactants.
Aerosols of solid particles containing the active compound are likewise produced by drug erosols of solid particles.
Can be generated with a livestock. Elarozo for administering solid particulate drugs to subjects
The generator generates particles that are respirable, as described above, and
Volume containing a pre-defined and metered dose of the drug at a rate appropriate for the administration of the drug.
Generates an aerosol. One illustrative type of solid particle aerosol generator is inhalation
It is a vessel. Delivery by inhaler means, as a suitable preparation for administration by inhalation
Finely ground powder that can be reached or taken into the nasal passages in a snuffling manner
End. Inhalers provide a powder (e.g., to deliver the treatment described herein).
A metered dose effective to apply) is typically gelatin or plastic
Stored in capsules or cartridges made in
Or opened, by powder or air bleeding out of the device on inhalation or manually
It is delivered by means of an operating pump. The powder used in the inhaler is only the active ingredient
Or the active ingredient, a suitable powder diluent such as lactose, and any surfactant
Consisting of a blend. The active ingredient typically contains 0.1-100 w of the preparation.
/ W. Metered dose inhalers are pressurized aerosol dispensers, typically
Includes a suspension or solution preparation of the active ingredient in a liquefied propellant. When using these devices
The device has a valve adapted to deliver a metered dose, typically 10-150 μl.
Release the formulation through the process to produce a fine particle spray containing the active ingredient.
Example 2
7 transmembrane receptor
Expression on the apical membrane of WD cells
Investigations revealed that, if any, the 7-TM receptor was localized on the apex of WD airway epithelial cells
Confirmed that. A culture of WD cells was transformed into NECA (Ab2Receptor agonist),
Isopreterenol, bradykinin, or ATP (all 10-FourExposure to M)
At the same time, C1 secretion reactivity was measured. As shown in FIG.
Response was detected in the presence of all agonists, but the greatest response was in the presence of ATP
Was confirmed. These results indicate that functional adenosine, β-adrenergic,
Strong indication that bradykinin and purino receptors are present on the apical surface of airway epithelium
are doing.
Example 3
In human PD and WD airway epithelial cells
AdV Binding and Internalization
AdV virus binding (AdV) internalization rather than AdV binding
, Rate limiting step resulting in inefficient gene transfer into RTEWD cultures
Was repeated on human cultures to determine if the same rate limiting step was present.
Measure. If this is the case, the cells will be internalized.
, But by increasing the amount of AdV that binds to these cell types,
It is considered possible to increase the efficiency of gene transfer into the D culture. PD or W
For a given concentration of AdV exposed to the D culture, the total AdV exposed to the cells was
Only about 0.1-1% adhered after washing. The above A obtained in one exposure
Enhanced dV binding is due to increased internalization of AdV with cells
Increased gene transfer due to increased probability of events leading to AdV entry
Leads to.
To measure the rate-limiting step of ineffective gene transfer in human cultures,
The PD and WD cultures were S-Ad5VLacZ (1.2 × 10TenP),
Analysis of AdV binding, internalization and gene expression in human cultures
Perform analysis.
Agonist [ATPγS (10-FourM)] With exposure, about 80% of the receptors
Internalized within. P2YTwoReceptor internalization
Is transmitted through the court pit.
Next, using the bispecific antibody (bs-Ab) method, P2YTwoReceptor is gene-directed
Was tested to mediate entry. Antibody H against influenza hemagglutinin
A. 11 (BabCO) (anti-HA) was generated in 1321N1 astrocytoma cells
The human P2Y that appearsTwoFor the HA epitope inserted in the extracellular domain of the receptor
Turn around. The cross-linked antibody is used at neutral pH for m-maleimidobenzoyl-N-hydroxy
Disulfosuccinamide esters (Sulfo-MBS, Pierce, Rockford, IL)
Or N- (γ-maleimidobutylloxy) sulfosuccinyl ester (sulfo-G
MBS, Pierce, Rockford, IL)
Generated. After reducing anti-HA by mercaptoethylamine and salt removal,
The two antibodies are mixed to allow disulfide bridge formation. Line bifunctional antibody
Purify by continuous chromatography on fiber and HA columns.
This for Ad fibers (bumps) and HA epitope tag (α-fiber xaHA)
Using bs-Ab, HA-P2Y instead of null expressing A9 cellsTwoAcceptance
Binding of bs-Ab and AdV to the body has been demonstrated. A9-HA-P2
YTwoAdV bound to cells is apparent in the presence, but not in the absence, of bs-Ab.
Has been crab.
More importantly, P2Y in A9 and CHOTwoReceptor-specific gene transfer
Is achieved using the bs-Ab method. 1 protocol used
I.e., (1) HA-P2Y expressing A9 cellsTwoExpresses receptor and A9 cells
Bs-Ab (anti-HA / anti-fibrous bumps) at various concentrations of the null vector
R. in Dr. l's laboratory After continuous exposure at 4 ° C)
, AdV-lacZ (particles 1 = 10Four); (2) agonists (ATPγS, 10-Four
M) for 1 hour at 37 ° C., followed by 24 hours in culture medium; and (3) la
By counting the percentage of c-positive cells and quantifying the gene transfer efficiency by calculation, A9 cells
HA-P2Y expressing vesiclesTwoThe receptor has Ad- as a function of bs-mAb concentration.
Transduced by lacZ but not null A9 cells
(FIG. 4A). In fact, almost 100% of gene transfer efficiency is 30 μg / ml b
It appears to be approaching with the s-Ab.
In a second protocol using the preformed conjugate, -10 μg / ml bs-A
An increase in gene transfer reaching a peak at b was confirmed (FIG. 4A). High bs-Ab concentration
Reduced transduction efficiency reflects competition by unbound bs-Ab of target
it is conceivable that.
Bs-Ab and biotinylation for HA and biotin (αHA / αbiotin)
HA-P2Y with adenovirus vectorTwo-Same as in gene transfer into RA9 cells
Like increase. Finally, A9-HA-P2YTwo-Bs-Ab in R cells
The specificity of the gene transfer confirmed was evaluated (FIG. 4B). Ad-LacZ and ATP
HA-P2Y exposed to γSTwoRA9 cells express almost 100% LacZ
showed that. In contrast, inappropriate bs-Abs (anti-Ha / anti-ADP1 epitope
), LacZ expression was hardly confirmed, and the presence of free anti-HA
In the presence of cells that had been exposed to high concentrations of agonist for 24 hours.
Not observed (this induces a cell surface receptor-reducing effect). These de
Data, HA-P2YTwoThrough specific interaction with the anti-HAb-Ab
Is confirmed to be inherited and mediate transfer.
Example 5
Use of other cell uptake
Order to increase AdV entry into WD cultures
By targeting AdV to internalized receptors
The effectiveness of gene transfer depends on the internalization efficiency of the receptor. P2
YTwoHuman P2Y to test the internalization efficiency of the receptorTwoAcceptance
Body (influenza hemagglutinin (HA) epithelium inserted within extracellular domain)
Over-tagged) in 1321N1 human astrocytoma cells
Has been expressed. S. Stromek and T.K.Hardon, Molecular Pharmacology 54, in pres
s (1988). P2YTwoThe expressing cells were incubated at 37 ° C. with a non-hydrolyzable ATP analog, ATPγS.
And cultured. At the time of specificity, in 4% paraformaldehyde after agonist addition
Fixed without permeation and washed. Monoclonal anti-HA antibody was cultured in cells
Later, a Cy3-conjugated goat anti-mouse IgG secondary antibody (Jackson Immuno Research Labs) was used.
Cultured. P2Y against anti-HATwoReceptor availability visualized by fluorescence microscopy
Was. Astrocytoma cells are expressed in P2Y in the absence of ATPγS.TwoOf the presence of the receptor
The cells were fixed and immunostained, and exposed to ATPγS 30 minutes later.
HA epitope tag BKIIA9 cells expressing the receptor and neomycin only
Of A9 cells expressing ubiquitin in a bispecific antibody (anti-fibrillated x) in the presence of bradykinin.
(Anti-HA) and AdV. Briefly, cells are bispecific at 4 ° C.
Culture in the absence or presence of the body (bs-Ab, 10 μg / ml, 2 hours), wash
Clean and AdVLacZ (10TenParticles, 2 hours)
Both were exposed to bradykinin (BK, 1 μM, 2 hours at 37 ° C.). Next, genetics
Cells were maintained at 37 ° C. for 24 hours until offspring expression was assessed by standard methods. FIG.
Efficient gene expression is inherited by activating the receptor with an agonist, enhancing transduction
Shown only occurs in HAB2K expressing cells cultured with both bs-Ab and AdV
are doing. Almost no expression was confirmed with AdV alone, and the presence of AdV + bs-Ab
Only moderate levels were observed in the presence (low levels in the absence of ligand).
Indicate receptor turnover). Not impressed with the treatment, with null A9 cells,
A slight LacZ expression was confirmed. In an additional test, the HA epitope tag β
CHO cells expressing 2-adrenergic receptor (chai lacking AdV adhesion receptor)
Needs hamster ovary cells) and wild-type (Wt) CHO
Continuous exposure to bispecific antibodies (anti-fibulous x anti-HA) and AdV
Exposure to isoproteinol. Briefly, cells were incubated at 4 ° C for bispecific antibodies.
Culture in the absence or presence (bs-Ab, 0.1-10 μg / ml, 2 hours)
, Washed and exposed to bradykinin (BK, 1 μM, 2 hours at 37 ° C.)
while). Next, evaluation was performed by measuring the density of LacZ-expressing cells expressed in arbitrary units.
The cells were maintained at 37 ° C. for 24 hours. 6A-B show HA-P2Y2-R (
FIG. 6A) Only in CHO cells expressing the receptor or the HA-β2 (FIG. 6B) receptor.
Shows a bs-Ab dose-dependent increase in gene expression of
Example 8
Biotinylated agonist
The vector is HA-P2YTwoTargeting the receptor (or another 7-TM receptor)
Another method of chemistry is to use a modified agonist / antagonist as the target molecule.
It is due to the combination. Basic agonist linker is biotin (B) -UTP
Which is a 16-carbon linker connecting the 5 position of the pyrimidine group to biotin.
Contains B-UTP is P2YTwoIt is a receptor agonist (FIG. 7).
In the fluorescence test, P2YTwoReceptor expressing CHO cells were transformed into streptavidin-
Exposure to B-UTP conjugated to Texas Red (TR) induces B-UTP
Has been shown to internalize with the P2Y2 receptor
.
In another test, gene targeting with B-UTP was performed using HA-P2YTwoReceiving
Evaluation was performed on A9 cells expressing the condition. HA-P2YTwo-A9 cells were continuously B-
UTP, streptavidin (SA), and B-AD (Bio expressing LacZ
(Tin-labeled adenovirus). HA-P2YTwo-Approximately 90% of A9 cells
Showed LacZ expression (FIG. 8). In contrast, low levels were observed in wild-type A9 cells.
Only LacZ expression was confirmed.
Example 9
Dinucleotide agonist
A non-hydrolyzable, biologically active analog of UTP is opened for binding to the vector.
Has been issued. Dinucleotide UTwoPFourHas ideal properties. Shown in FIG.
UTwoPFourIs equivalent to UTP in inducing a biological response and is cystic
Resistant to hydrolysis in fibrosis (CF) sputum.
Example 10
Examination of AdV internalization
Process in human PD and WD cultures
αvβ3/5Integrins mediate internalization, but not in vitro
It has been reported that it does not mediate the attachment of Ad into skin cells. Top membrane of WD culture
And / or membrane-bound αvβ with basal membrane3/5Integrin localization is based on AdV media
It is important to understand the role of these molecules in mediated gene transfer. these
Due to the availability of many different antibodies against integrins,
Their localization in the skin is possible. These integrins are RGD amino acids
It is also a receptor for peptides containing sequences. Many studies have shown that RGD peptides
Is αvβ3/5AdV-mediated gene transfer to epithelial cells by interacting with integrins
It has been shown to suppress ingress. This example demonstrates the use of PD and WD cultures.
RGB vectors for AdV binding, internalization and transgene expression
This explains the effect of the peptide.
Integrin antibody-specific immunoprecipitation3/5Localization of integrin
For this purpose, it was initially developed with an RTE WD culture. Against these integrins
Because antibodies are not commercially available, we used rat αvβ3/5Exchange with integrin
Human endothelial cells known to respond differentially to the vitronectin receptor
Antibody (R838, Pennsylvania State University (PA), Stephen Alber
(Donated by Dr. Da). Simply put, the top domain of the WD culture
Sulfo-NHS-biotin (0.
5 mg / ml. Pierce) and only outer membrane proteins were biotinylated.
. Solubilize cells in non-denaturing lysis buffer (in the presence of protease inhibitors)
Followed by immunoprecipitation of the protein and 4-12% acrylic acid under non-reducing conditions.
Separated by Western analysis on Luamide gel (Novex). Biotinylated
Probing proteins with a secondary antibody to pereptidase conjugated to atreptavidin
Along with ECL analysis (super signal CL-HRP, Pierce). R83
The biotinylated protein identified by 3 is shown in Figure 5 (125 kD
The band corresponds to αv and 97 kD is β3/5Subunit), RTE cells
Is present in the basolateral membrane and HeLa cells, but localized in the apical membrane of the WD culture.
Is not shown. The absence of these integrins in the apical membrane
Low-rate AdV internalization in these cultures may be responsible for
Conceivable.
Example 11
Of integrin present in human PD and WD cell lines
Identification and localization
Proteins from the apical and / or basolateral membranes of human PD and WD cultures
, By exposing individual surfaces to sulfo-NHS-biotin at 4 ° C.
Released. Standard immunoprecipitation experiments were performed using selective human antibodies (LM609, αvβThreeP1F6
, ΑvβFiveVR147, αv; P4G11, β1CD61, βThree; Anti-βFiveand
R838, αvβ3/5All obtained from Chemicon Inc (CA)).
Claims
1. In a method for delivering a heteronucleic acid into a cell,
Contacting the cell with a conjugate, wherein the conjugate is an import vector.
And the transfer vector comprises a heterologous vector delivered into the cell.
A nucleic acid, wherein the ligand binds to a G protein-coupled receptor,
The cell is subjected to conditions under which the vector is internalized into the cell.
Expressing the G protein-coupled receptor.
2. 2. The method according to claim 1, wherein said vector is a viral vector.
3. The vector is an adenovirus vector, an adenovirus-associated virus
Vector, human retroviral vector, non-human retroviral vector, and
Virus vector selected from the group consisting of
The method of claim 1.
4. The virus vector is a lentivirus vector and Moloney mouse
4. The method of claim 3, wherein the method is selected from the group consisting of a leukemia virus vector.
5. 2. The method according to claim 1, wherein said vector is an oligonucleotide.
6. 2. The method of claim 1, wherein said ligand is an antibody.
7. 2. The method according to claim 1, wherein said ligand is a peptide.
8. The ligand may be a nucleotide, nucleoside, catecholamine, C5
The method of claim 1, wherein the method is selected from the group consisting of A, and bradykinin.
9. The ligand is a G protein-coupled receptor agonist and a G protein
2. The method of claim 1, wherein the method is selected from the group consisting of a coupled receptor antagonist.
10. 2. The method of claim 1, wherein said conjugate is a covalent conjugate.
11. 2. The method of claim 1, wherein said cells are airway epithelial cells.
12. 2. The method of claim 1, wherein said cells are differentiated epithelial cells.
13. 4. The method of claim 1, wherein the contacting is performed in vitro.
2. The method according to 1.
14. 2. The method of claim 1, wherein the contacting is performed in vivo.
To
How to describe.
15. 2. The method of claim 1, wherein the conjugate is formed before the contacting step.
Method.
16. A first binding region that specifically binds to a viral vector, and a G protein
A second binding region that specifically binds to an extracellular epitope of a coupled receptor
Specific antibodies.
17. A conjugate useful for delivering an intracellular heteronucleic acid, said conjugate
Comprises a transfer vector and a ligand, wherein the transfer vector is delivered into the cell
In addition to the heteronucleic acid, the ligand is a G protein coupled receptor.
Conjugates that specifically bind to the body.
18. 18. The conjugate according to claim 17, wherein said vector is a viral vector.
19. The vector is an adenovirus vector, an adenovirus-associated virus
Vector, human retroviral vector, non-human retroviral vector, and
Virus vector selected from the group consisting of
A method according to claim 17 ,.
20. The virus vector is a lentivirus vector and Moloney mouse
18. The method of claim 17, wherein the method is selected from the group consisting of a leukemia virus vector.
21. 18. The method according to claim 17, wherein said vector is an antibody.
22. 18. The method of claim 17, wherein said ligand is a peptide.
23. The ligand may be a nucleotide, nucleoside, catecholamine, C5
18. The method of claim 17, wherein the method is selected from the group consisting of A, and bradykinin.
24. The ligand is a G protein-coupled receptor agonist and a G protein
18. The method of claim 17, wherein the method is selected from the group consisting of a coupled receptor antagonist.
.
25. 18. The method of claim 17, wherein the conjugate is a covalent conjugate.
26. 4. The method according to claim 3, wherein said vector is an adenovirus vector.
27. 9. The method according to claim 8, wherein said ligand is bradykinin.
28. The ligand is UTP or an analog or derivative thereof.
9. The method according to 8.
29. The ligand is UTwoPFour29. The method of claim 28, wherein
30. 2. The method according to claim 1, wherein the ligand is an adenovirus gall protein.
the method of.
31. The G protein-coupled receptor is a dopamine receptor, muscarinic choline
Agonist receptor, α-adrenergic receptor, opiate receptor, cannabino
Id receptor, serotonin receptor, β-adrenergic receptor, purine receptor, and
2. The method of claim 1, wherein the method is selected from the group consisting of C5A and C5A complement receptors.
32. The method according to claim 1, wherein the G protein-coupled receptor is a bradykinin receptor.
The described method.
33. The protein-coupled receptor is P2YTwoClaim 1 which is a receptor
The method described in.
34. 2. The method according to claim 1, wherein said cells are human cells.
35. Wherein the heteronucleic acid encodes a therapeutic protein or peptide.
Item 1. The method according to Item 1.
36. The heterologous nucleic acid encodes an immunogenic protein or peptide.
The method of claim 1.
37. The heteronucleic acid is a cystic fibrosis transmembrane regulatory protein or an organism thereof.
2. The method of claim 1, which is a biologically active analog, fragment or derivative.
38. 2. The method of claim 1, wherein said heteronucleic acid encodes an antisense sequence.
Law.
39. The virus vector is an adenovirus vector, an adeno-associated virus
Vector, human retroviral vector, non-human retroviral vector, and
17. The method according to claim 16, which is selected from the group consisting of:
Bispecific antibody.
40. The virus vector is a lentivirus vector and Moloney mouse
40. The method of claim 39, wherein the method is selected from the group consisting of a leukemia virus vector.
41. The method of claim 39, wherein the viral vector is an adenovirus vector.
A bispecific antibody as described.
42. The G protein-coupled receptor is a dopamine receptor, muscarinic choline
Agonist receptor, α-adrenergic receptor, opiate receptor, cannabino
Id receptor, serotonin receptor, β-adrenergic receptor, purine receptor, and
17. The bispecific of claim 16, wherein the bispecific is selected from the group consisting of C5A and C5A complement receptors.
antibody.
43. 43. The G protein-coupled receptor is a bradykinin receptor.
2. The bispecific antibody according to 1.
44. The protein-coupled receptor is P2YTwo43. The receptor of claim 42, which is a receptor.
Bispecific antibodies.
45. 17. The method of claim 16, wherein the bispecific antibody comprises a monoclonal antibody.
Bispecific antibodies.
46. The bispecific antibody is directed against an adenovirus fiber protein
46. The bispecific antibody of claim 45, wherein said antibody comprises a monoclonal antibody.
47. 20. The vector of claim 19, wherein said vector is an adenovirus vector.
United.
48. 24. The conjugate of claim 23, wherein said ligand is bradykinin.
49. The ligand is UTP or an analog or derivative thereof.
24. The conjugate according to 23.
50. The ligand is UTwoPFour50. The conjugate of claim 49, wherein
51. 18. The method of claim 17, wherein the ligand is an adenovirus gall protein.
The method described.
52. The G protein-coupled receptor is a dopamine receptor, muscarinic choline
Agonist receptor, α-adrenergic receptor, opiate receptor, cannabino
Id receptor, serotonin receptor, β-adrenergic receptor, purine receptor, and
18. The conjugate of claim 17, wherein the conjugate is selected from the group consisting of C5A and C5A complement receptor.
53. 18. The G protein-coupled receptor is a bradykinin receptor.
The conjugate according to claim 1.
54. The protein-coupled receptor is P2YTwo18. The receptor of claim 17, which is a receptor.
Conjugate.
55. A formulation comprising the conjugate of claim 17 in a pharmaceutically acceptable carrier.
56. In a method for delivering a heterologous nucleic acid into polarized endothelial cells,
Contacting the conjugate with the polarized epithelial cells, wherein the conjugate is
The conjugation includes a transfer vector and a ligand, and the transfer vector is delivered into the cell.
The heterologous nucleic acid to be reached, wherein the ligand is
A method comprising the step of specifically binding to a receptor.
57. 57. The method of claim 56, wherein the polarized epithelial cells are polarized airway epithelial cells.
Method.
58. 57. The method of claim 56, wherein said polarized epithelial cells are polarized renal epithelial cells.
Law.
59. In a method of administering a nucleic acid to a subject,
Administering the conjugate to the subject, wherein the conjugate is transferred.
The transfer vector comprises a heterologous nucleic acid;
Gand binds to a G protein-coupled receptor and the ligand binds to the conjugate
The body binds to a G protein-coupled receptor expressed by the cell,
The G protein-coupled receptor under conditions for internalization in the cell.
A method comprising the step of specifically binding to the body.
60. 60. The method of claim 59, wherein said subject is a human subject.
61. 61. The method of claim 60, wherein said subject has cystic fibrosis.
62. The conjugate may be oral, rectal, transmucosal, topical, intestinal, inhalation, intravenous, intramuscular
From subcutaneous, intramedullary, subarachnoid, direct intraventricular, intraperitoneal, intranasal, and intraocular administration
60. The method of claim 59, wherein the method is administered to the subject by a route selected from the group consisting of:
.
63. 60. The method of claim 59, wherein said conjugate is administered to the lung.
64. The G protein-coupled receptor is expressed on the apical surface of polarized epithelial cells
60. The method of claim 59, wherein
65. 65. The method of claim 64, wherein the polarized epithelial cells are polar airway epithelial cells.
Law.
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(51)Int.Cl.7 識別記号 FI テーマコート゛(参考)
A61K 38/00 C12N 15/00 A
39/395 A61K 37/02
(81)指定国 EP(AT,BE,CH,CY,
DE,DK,ES,FI,FR,GB,GR,IE,I
T,LU,MC,NL,PT,SE),OA(BF,BJ
,CF,CG,CI,CM,GA,GN,ML,MR,
NE,SN,TD,TG),AP(GH,GM,KE,L
S,MW,SD,SZ,UG,ZW),EA(AM,AZ
,BY,KG,KZ,MD,RU,TJ,TM),AL
,AM,AT,AU,AZ,BA,BB,BG,BR,
BY,CA,CH,CN,CU,CZ,DE,DK,E
E,ES,FI,GB,GE,GH,GM,GW,HU
,ID,IL,IS,JP,KE,KG,KP,KR,
KZ,LC,LK,LR,LS,LT,LU,LV,M
D,MG,MK,MN,MW,MX,NO,NZ,PL
,PT,RO,RU,SD,SE,SG,SI,SK,
SL,TJ,TM,TR,TT,UA,UG,US,U
Z,VN,YU,ZW
(72)発明者 ピックルス、レイモンド、エル
アメリカ合衆国、ノースカロライナ州
27576 チャペル ヒル、スミス アヴェ
ニュー 420──────────────────────────────────────────────────続 き Continued on the front page (51) Int.Cl. 7 Identification symbol FI Theme coat ゛ (Reference) A61K 38/00 C12N 15/00 A 39/395 A61K 37/02 (81) Designated countries EP (AT, BE, CH, CY, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LU, MC, NL, PT, SE), OA (BF, BJ, CF, CG, CI, CM, GA, GN, ML, MR, NE, SN, TD, TG), AP (GH, GM, KE, LS, MW, SD, SZ, UG, ZW), EA (AM, AZ, BY, KG, KZ, MD) , RU, TJ, TM), AL, AM, AT, AU, AZ, BA, BB, BG, BR, BY, CA, CH, CN, CU, CZ, DE, DK, EE, ES, FI, GB, GE, GH, GM, GW, HU, ID, IL, IS, JP, KE, KG, KP, KR, KZ, LC, LK, LR, LS, LT, LU, LV, MD, MG , MK, MN, MW, MX, NO, NZ, PL, PT, RO, RU, SD, SE, SG, SI, SK, SL, TJ, TM, TR, TT, UA, UG, US, UZ, VN, YU, ZW (72) Inventor Pickles, Raymond, El. United States, 27576 Chapel Hill, Smith Ave.