【発明の詳細な説明】
均質蛍光検定および遺伝子発現の活性化の測定法
発明の分野
本発明は、改良された蛍光レポーター検定システムおよび化合物およびコンビ
ナトリアルライブラリーのスクリーニングにおけるその使用に関する。
発明の背景
薬理活性に関する化合物のスクリーニングは、特定の遺伝子発現の活性化また
は抑制などの薬理学的に適切なプロセスに対する化合物の影響を測定する手段に
依存する。現在、これは、酵素または蛍光蛋白質などの容易に検出可能な「レポ
ーター」遺伝子と結合した対象となる遺伝子のプロモーター領域を含むＤＮＡ構
造の処理により行われる。構築物をレシピエント細胞中にトランスフェクション
し、レポーター遺伝子の発現に対する化合物の影響を、細胞により産生される酵
素または蛍光蛋白質のレベルを分析することにより測定する。広く用いられるレ
ポーター遺伝子の例は、クロラムフェニコール アセチルトランスフェラーゼ（
ＣＡＴ）、ホタルルシフェラーゼ、ベータガラクトシダーゼ（ベータ−ｇａｌ）
、分泌アルカリホスファターゼまたは緑蛍光蛋白質（ＧＦＰ）を包含する。最近
、細菌ベータラクタマーゼを用いた系が記載されているが、ここでは、細胞透過
性蛍光基質を酵素により開裂させ、これにより蛍光発光波長のシフトを誘発する
（特許出願番号ＷＯ９６３０５４０−ＡＬ；Ｚｌｏｋａｒｎｉｋ Ｇら、Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ ２７９、８４−８８、１９９８）。
現在の方法は、面倒であり、ハイスループットスクリーニングまたはコンビナ
トリアルライブラリーのスクリーニングに容易に適用できないことが判明してい
る。ＣＡＴ、ベータ−ｇａｌおよびルシフェラーゼはすべて細胞溶解を必要とし
、このため、これらを選択可能なマーカーとして使用できず、安定にトランスフ
ェクションされたセルラインの選択は、同時に発現された抗生物質耐性マーカー
に応じて時間のかかるプロセスになる。加えて、ＣＡＴ検定は、反応生成物のク
ロ
マトグラフ検出または間接抗体検出のいずれかを必要とし、これはハイスループ
ットスクリーニングにとっては不都合であり、一方、ルシフェラーゼはシグナル
発生の期間が限定されていて、これが今度はシグナル測定の時間を限定する。Ｇ
ＦＰは、ＧＦＰ分子あたり唯一つの蛍光団しか存在しないので感度の限界を有し
、したがって、多数の細胞を必要とする。ＧＦＰ分子はさらに非常に安定であり
、そのため遺伝子発現の減少をモニターするのに不適当である。ＧＦＰはさらに
その吸収または発光波長内で強く蛍光を発光するかまたは吸光する化合物のスク
リーニングにも適さない。後者の問題は、さらにベータラクタマーゼの読みにも
当てはまり、分泌されたアルカリホスファターゼは、内因性アルカリホスファタ
ーゼ活性による高い基底値の悪影響を受ける。多重化（細胞１個あたり１以上の
遺伝子の発現の測定を可能にする）は前記読みのすべてに関して困難である。こ
のように、当業界において、一連の化合物のハイスループットスクリーニングお
よび特定の標的遺伝子の発現を修飾する試薬に関するコンビナトリアルライブラ
リーのスクリーニングについての改良されたプロセスが必要とされる。
公知の方法の多くの欠点ならびにそれにより満たされない多くの要求を本発明
は目的とし、以下により詳細に記載するように、公知の方法よりも数多くの利点
がもたらされる。
発明の要約
本発明は蛍光性レポーター検定システムに関する。
本発明はさらに、均質蛍光レポーター検定システムに関する。
本発明はさらに、時間分解蛍光レポーター検定システムに関する。
本発明はさらに、縮小検定様式に適合するレポーター検定システムに関する。
本発明はさらに、本発明の蛍光レポーター検定システムを用いたハイスループ
ットスクリーニングを行う方法に関する。
本発明はさらに、本発明の蛍光レボーター検定システムを用いたコンビナトリ
アルライブラリーのスクリーニング法に関する。
本発明はさらに、本発明の蛍光レポーター検定システムおよび本発明の方法に
より同定される化合物に関する。
発明の詳細な記載
本明細書において言及する、特許および特許出願を包含するが、これに限定さ
れないあらゆる出版物は、出典明示により、各出版物がそれぞれ全文記載されて
いるかのように本発明の一部とする。
本発明は、完全細胞おける遺伝子発現を可能にし、ナノウェルフォーマットに
おける検定の使用を妨げる可能性のある洗浄工程が無く、トランスフェクション
されていない細胞において内因性活性がなく、細胞１個あたり１以上の遺伝子の
発現の測定を可能にし（多重化）、高いシグナル対ノイズ比および長い読取期間
を有する、改良された蛍光レポータースクリーニングシステムに関する。
本発明の蛍光レポーター検定システムは、光学的読取を生成できる細胞外マー
カーを用いる。これは、細胞を溶解することなく検出および定量化することがで
き、化合物の蛍光により影響を受けず、多様化を可能にし、洗浄工程を必要とせ
ず、哺乳動物細胞において内因性基底値が無く、基底値が低く、出現期間が長い
。
本発明の蛍光レポーター検出システムは、プロモーター／エンハンサー領域を
コードするヌクレオチド配列、１またはそれ以上の結合パートナーまたは光学シ
グナルを生成できる他の分子をコードする配列を含有する細胞外蛋白質（本明細
書において細胞表面または分泌蛋白質のいずれかと定義する）含有配列；レシピ
エント細胞;光学シグナルを生成および／または向上するのに必要なアクセサリ
ー分子および光学検出装置を含む。好ましくは、細胞外蛋白質は異種発生性（本
明細書において、レシピエントセルタイプにより自然に産生されない蛋白質と定
義する）である。核酸構築物を、細胞表面または分泌蛋白質の発現が、プロモー
ター／エンハンサー領域により行われ、後者は薬理学的に関連する蛋白質標的由
来であるように調製する。このような標的の一例は、骨芽細胞において特異的に
発現され、新骨マトリックス（トランスジェニックマウスにおける高レベルの骨
芽細胞発現をもたらし、骨芽細胞において選択的に存在する蛋白質と結合するマ
ウスプロ−アルファ１（Ｉ）コラーゲンプロモーターの最少配列の同定 Ｒｏｓ
ｓｅ
ｒｔ−ＪＡ；Ｃｈｅｎ−ＳＳ；Ｅｂｅｒｓｐａｅｃｈｅｒ−Ｈ；Ｓｍｉｔｈ−Ｃ
Ｎ；ｄｅ−Ｃｒｏｍｂｒｕｇｇｈｅ−Ｂ Ｐｒｏｃ−Ｎａｔｌ−Ａｃａｄ−Ｓｃ
ｉ−ＵＳＡ．１９９６；９３（３）；１０２７−３１）の形成に関連する１型コ
ラーゲンのプロ−アルファα１鎖である。細胞外蛋白質は、コーディング配列内
のフレーム内に挿入されているかまたはコーディング配列に追加された光学シグ
ナル生成配列を用いて構築され、膜ターゲティングまたは分泌を特定する追加的
配列を有する（Ｄｕｆｆａｕｄ ＧＤら、ｉｎ：Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ
ｉｎ Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ、第２章、２４巻、Ａ
ｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ ＮＹ、１９８５）。光学シグナルは、直接、例え
ばホタルルシフェラーゼをコードする配列を挿入することにより生成できる。好
ましくは、光学シグナルは、例えば、蛍光色素または光学的に検出可能な生成物
を生じることができる酵素などの光学活性成分を含む外因性結合パートナーに関
する結合部位を提供することにより間接的に生成できる。いずれの場合でも、レ
シピエント細胞（異種配列）上に天然に存在しないかまたはレシピエント細胞に
より生成されないポリペプチド配列を、基底値を最小にするために用いるのが好
ましい。間接的な光学的読取に関して適当な細胞外蛋白質の例は、２またはそれ
以上の特定のエピトープ標識が細胞外領域に挿入された表皮成長因子（ＥＧＦ）
レセプターである。特定のエピトープ標識（ＤＥＴ）は、好ましくは、特異性モ
ノクローナル抗体、例えば、ＢＨ１０株［Ｒａｔｎｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ，３１
３：２７７−２８４（１９８５）］由来の酵母発現ＨＩＶ−１ｇｐ１６０分子で
のマウスの免疫化により調製されたモノクローナル抗体１７８．１［Ｔｈｉｒｉ
ａｒｔら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４３：１８３２−１８３６（１９８９）参
照］により認識されるヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ−１）エピトープ蛋白
質ｇｐ１２０（またはｇｐ１６０）由来の１１アミノ酸エピトープなどにより認
識される短鎖非哺乳動物ポリペプチド配列である。ＤＥＴの他の例は、Ｅａｓｔ
ｍａｎ Ｋｏｄａｋ、Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ ＮＹより商業的に入手可能なＦＬＡ
Ｇ標識システムである。この例において、ＥＧＦレセプターの各分子は、２つの
ＤＥＴのそれぞれのタンデムコピーを有し、該コピーは分子内で反復して、追加
的結合部位をもたらす。別法として、ＤＥＴ配列はヒト成長ホルモンなどの分泌
蛋白質中に挿入してもよい。このような細胞外蛋白質の手段に関しては多くのバ
リエーションがある事は理解できる。このようなバリエーションはすべて本発明
の範囲に含まれる。
このように、構築物の最少の基本的特徴は、プロモーター／エンハンサー領域
、膜または分泌−ターゲティングシグナル配列、細胞表面蛋白質に関するトラン
スメンブランまたは膜挿入領域および光学的に読取可能なシグナルを直接または
間接的に生成できるポリペプチドである。
本発明のさらに別の好ましい構成要素は、光学シグナルの生成または向上のた
めのアクセサリー分子を提供することである。このような分子は、これに限定さ
れないが、蛍光色素、光生成酵素に関する基質または酵素に関する色生成化学物
質を包含する。好ましい例において、２つの外因性結合パートナーが提供され、
そのそれぞれは、細胞外蛋白質の細胞外領域中に挿入されたＤＥＴ配列の１つを
認識する。別法として、細胞外結合パートナーの一方または両方は、前記プロモ
ーターまたはエンハンサー構築物中で用いた、選択されたレシピエント細胞上に
存在しないかまたはこれにより生成されない天然に存在する細胞外蛋白質の空間
的に別個の領域を認識するので、結合した場合に、２つの外因性結合パートナー
が選択された蛍光団に関するエネルギー移動半径に匹敵するかまたはこれより少
ない距離離れる。このような外因性結合パートナーの例はＤＥＴに対するモノク
ローナル抗体である。これらの結合パートナーを、好ましくは共鳴エネルギー移
動可能な蛍光色素でそれぞれ標識する。好ましくは、色素の１つは時間分解蛍光
（発光）が可能である。このような色素の例は、テルビウムキレート／クリプテ
ート［Ｓｅｌｖｉｎ ＰＲ およびＨｅａｒｓｔ（ＪＥ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９１：１００２４−１００２８、１９９４）］およびテトラ
メチルロードアミン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ
）である。抗体を蛍光色素で標識する方法は当業界で公知である。
本発明のさらに別の好ましい要素は、レシピエント細胞である。この細胞は、
真核または原核生物起源であってよく、前者の場合、体細胞性または生殖細胞系
である。好ましいセルタイプは、哺乳動物、好ましくは培地中で維持できるヒト
セルラインである。このようなセルラインの例は、ヒト胚腎臓セルラインＨＥＫ
２９３であり、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔ
ｉｏｎより入手可能である。哺乳動物細胞の核酸構築物を用いたトランスフェク
ション法は、当業者に周知である。プロモーターの性質に応じて、細胞外蛋白質
の発現を開始するためにホルモンまたは他の物質で細胞を刺激する必要がある。
本発明のさらに好ましい成分は、光学シグナルを検出し、測定できる装置であ
る。このような装置は、光学シグナルの強度および波長に関連した数値またはグ
ラフ出力を生じなければならない。これは光学シグナルの波長に対して感受性で
なければならず、光学シグナルの生成を助ける電磁放射線源、たとえば蛍光団の
励起光源を含んでもよい。さらに、励起放射線を離散時間間隔に適用し、測定が
励起終結後特定の時間に開始されるように時間遅延機構を含んでもよい。このよ
うな装置の例は、蛍光計、蛍光相関分光光度計、発光計、分光光度計、ＣＣＤカ
メラ、光子計測器および蛍光活性化セルソーターである。このような装置は、商
業的供給源から容易に入手できる。
本発明の蛍光レポーター検定システムを用いる際、ポリヌクレオチド構築物を
選択されたレシピエント細胞中にトランスフェクションする。プロモーターが細
胞環境中で活性ならば、これは細胞外蛋白質の発現を起動し、細胞表面のディス
プレーまたはタンデム結合パートナーを有する蛋白質の分泌に至る。細胞表面蛋
白質を利用して高レベルの構築物を発現する細胞は、標識した外因性結合パート
ナーを添加し、続いて蛍光活性化セルソーティングにより選択される。分泌マー
カーを生じる細胞を限界希釈によりクローン化し、光学シグナルに関して培地を
モニターすることにより選択する。
光学シグナルを検出するために、アクセサリー分子を培地に添加する。例えば
、共鳴エネルギー移動が可能な蛍光色素で標識したモノクローナル抗−ＤＥＴ抗
体を添加する。細胞外蛋白質上のそれぞれの認識部位との結合により、蛍光色素
を共鳴エネルギー移動の臨界半径内になり、ドナーまたはアクセプター色素から
の発光を用いて、高レベルの細胞外蛋白質を発現する細胞を選択する。これらの
細
胞を、前記のように繰返し選択に付し、安定な形質転換体を生成する。光学シグ
ナルを、前記のような適当な検出装置を用いることにより検出する。
安定な形質転換細胞集団が得られたら、細胞を化合物コレクションまたはコン
ビナトリアルライブラリーをスクリーニングするのに用いる。細胞を、好ましく
は１００個以上の群に分けて試験ウェル中にプレートして、レポーター発現レベ
ルの細胞外−細胞内変動を平均する。試験化合物を添加すると、ホルモンまたは
対象となるプロモーター領域に対して適当の他の物質の誘発を伴うかまたは伴わ
ない。最適の発現および表面ディスプレーまたはレポーターの分泌をさせるのに
適当な間隔の後、補助剤を各ウェルに添加する。光学シグナルを適当な検出装置
を用いて定量化する。
多重化検定に関して、細胞を２またはそれ以上の同じ細胞外蛋白質であるが、
各構築を行う異なるプロモーター領域を有する細胞外蛋白質構築物とコトランス
フェクションする。各構築物に関して、光学シグナル生成配列を選択して、別個
のシグナルを得る。たとえば、ペプチド結合パートナーを、これらが異なる外因
性結合パートナーと相互作用するように選択する。この例において、細胞をＤＥ
Ｔ−１ＤＥＴ２と結合するプロモーター１およびＤＥＴ−１ＤＥＴ３またはＤＥ
Ｔ３−ＤＥＴ４と結合するプロモーター２でトランスフェクションする。アクセ
サリー分子をそれぞれ異なる吸光または発光波長の蛍光団で標識する。例えば、
ＤＥＴ１に対する抗体をテルビウムキレート／クリプテート(発光５４５ｎｍ)、
抗−ＤＥＴ２をＴＭＲ（励起５５０ｎｍ 発光５７５ｎｍ）および抗−ＤＥＴ３
をサマリウムキレート／クリプテート（発光６５５ｎｍ）およびＤＥＴ４をＣｙ
５（Ａｍｅｒｓｈａｍ、Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ Ｈｅｉｇｈｔｓ ＩＬ）（励起６
５０ｎｍ 発光６７０ｎｍ）で標識する。化合物の１または他のプロモーター活
性に対する特異的効果が測定できるように安定な形質転換体を両方の構造の発現
に関して前記のように選択する。蛍光発光を５７５ｎｍと６７０ｎｍの両方でモ
ニターする以外は前記のように行い、試験化合物のスクリーニングを行う。
既存のレポーター遺伝子システムと比較したこのプロセスの利点は、１）試験
化合物または細胞成分の蛍光に感受性でない時間分解色素の使用が可能になるこ
と、２）試験化合物による多重化および消光の回避に関する蛍光団の自由な選択
が可能になること、３）細胞溶解を必要としないので、安定な形質転換体の選択
が簡易化されること、４）シグナルが長期間存在するので、時間依存性イメージ
ングを検出に用いることができること、５）複数の蛍光団を各アクセサリー分子
と結合させることができ、複数の結合パートナー配列を感度の増加のために細胞
外蛋白質に添加できること、６）洗浄工程が必要でなく、ハイスループットスク
リーニングが簡易化されること、７）結合パートナーを、微生物、ウイルス、真
菌、昆虫、または人工供給源から、このような分子が哺乳動物細胞上に内因的に
存在しないように選択できること、８）シグナル生成に関して２つの特異的結合
事象が互いに緊密して起こる必要性により、また時間分解色素の使用によりシグ
ナル対ノイズ比が増加することである。
さらに工夫することなく、当業者は前記載事項を用いて本発明を最大限に活用
することができると考えられる。本発明の好ましい具体例はすでに記載したが、
本発明は本明細書に開示した事項に限定されるのではなく、以下の請求項の範囲
内のすべての修飾についての権利は保持されると考えられる。Description: FIELD OF THE INVENTION The present invention relates to an improved fluorescence reporter assay system and its use in screening compounds and combinatorial libraries. Background of the Invention Screening compounds for pharmacological activity relies on means to determine the effect of the compound on pharmacologically relevant processes such as activation or suppression of a particular gene expression. Currently, this is accomplished by processing a DNA structure containing the promoter region of the gene of interest linked to an easily detectable "reporter" gene, such as an enzyme or a fluorescent protein. The construct is transfected into recipient cells and the effect of the compound on reporter gene expression is determined by analyzing the level of enzyme or fluorescent protein produced by the cells. Examples of widely used reporter genes include chloramphenicol acetyltransferase (CAT), firefly luciferase, beta-galactosidase (beta-gal), secreted alkaline phosphatase or green fluorescent protein (GFP). Recently, systems using bacterial beta-lactamase have been described, in which a cell-permeable fluorescent substrate is enzymatically cleaved, thereby inducing a shift in fluorescence emission wavelength (Patent Application No. WO9630540-AL; Zlokarnik G Et al., Science 279, 84-88, 1998). Current methods have proven to be cumbersome and not readily applicable to high-throughput screening or screening combinatorial libraries. CAT, beta-gal and luciferase all require cell lysis, so they cannot be used as selectable markers and the selection of stably transfected cell lines requires that co-expressed antibiotic resistance markers It becomes a time consuming process accordingly. In addition, CAT assays require either chromatographic or indirect antibody detection of reaction products, which is disadvantageous for high-throughput screening, while luciferase has a limited duration of signal generation, This in turn limits the time of signal measurement. GFP has limited sensitivity because there is only one fluorophore per GFP molecule, and therefore requires a large number of cells. GFP molecules are also very stable and are therefore unsuitable for monitoring reduced gene expression. GFP is also unsuitable for screening for compounds that fluoresce or absorb strongly within its absorption or emission wavelength. The latter problem also applies to the reading of beta-lactamases, wherein secreted alkaline phosphatase is adversely affected by high basal values due to endogenous alkaline phosphatase activity. Multiplexing (which allows the measurement of the expression of one or more genes per cell) is difficult with all of the above readings. Thus, there is a need in the art for an improved process for high-throughput screening of a range of compounds and screening combinatorial libraries for reagents that modulate the expression of specific target genes. The present invention is directed to the many disadvantages of the known methods, as well as the many requirements not met thereby, and offers a number of advantages over the known methods, as described in more detail below. SUMMARY OF THE INVENTION The present invention relates to a fluorescent reporter assay system. The invention further relates to a homogeneous fluorescent reporter assay system. The invention further relates to a time-resolved fluorescent reporter assay system. The invention further relates to a reporter assay system adapted to a reduced assay format. The present invention further relates to a method for performing high-throughput screening using the fluorescent reporter assay system of the present invention. The present invention further relates to a method for screening a combinatorial library using the fluorescent reporter assay system of the present invention. The invention further relates to a fluorescent reporter assay system of the invention and a compound identified by the method of the invention. DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION All publications, including but not limited to patents and patent applications, referred to in this specification are herein incorporated by reference, as if each publication were individually described in full. Partial. The present invention allows for gene expression in whole cells, no washing steps that could interfere with the use of the assay in a nanowell format, no endogenous activity in non-transfected cells, and more than one per cell. An improved fluorescent reporter screening system that allows for the measurement of the expression of genes (multiplexing) and has a high signal-to-noise ratio and long readout periods. The fluorescent reporter assay system of the present invention uses extracellular markers that can generate optical readings. It can be detected and quantified without lysing the cells, is unaffected by the fluorescence of the compound, allows for diversification, does not require a washing step, and has no endogenous basal values in mammalian cells , The base value is low and the appearance period is long. The fluorescent reporter detection system of the present invention comprises an extracellular protein (as used herein) containing a nucleotide sequence encoding a promoter / enhancer region, one or more binding partners or a sequence encoding another molecule capable of producing an optical signal. Containing cells (defined as either cell surface or secreted proteins); recipient cells; including accessory molecules and optical detection devices necessary to generate and / or enhance the optical signal. Preferably, the extracellular protein is xenogenic (defined herein as a protein not naturally produced by the recipient cell type). The nucleic acid construct is prepared such that expression of the cell surface or secreted protein is driven by a promoter / enhancer region, the latter being derived from a pharmacologically relevant protein target. One example of such a target is a mouse that is specifically expressed in osteoblasts, provides high levels of osteoblast expression in the new bone matrix (transgenic mice, and binds to proteins that are selectively present in osteoblasts). Identification of Minimal Sequence of Pro-Alpha 1 (I) Collagen Promoter Rosesert-JA; Chen-SS; Eberspacher-H; Smith-CN; de-Crombrugge-B Proc-Natl-Acad-Sci-USA. 93 (3); 1027-31) is the pro-alpha α1 chain of type 1 collagen. Extracellular proteins are constructed using optical signal-generating sequences inserted in frame or added to the coding sequence and have additional sequences that specify membrane targeting or secretion (Duffaud GD et al., in: Current Topics in Membrane and Transport, Chapter 2, Vol. 24, Academic Press NY, 1985). Optical signals can be generated directly, for example, by inserting a sequence encoding firefly luciferase. Preferably, the optical signal can be generated indirectly, for example, by providing a binding site for an exogenous binding partner that includes an optically active component such as a fluorescent dye or an enzyme capable of producing an optically detectable product. . In each case, it is preferred to use a polypeptide sequence that is not naturally present on the recipient cell (heterologous sequence) or that is not produced by the recipient cell to minimize basal values. An example of an extracellular protein suitable for indirect optical reading is the epidermal growth factor (EGF) receptor in which two or more specific epitope tags have been inserted into the extracellular region. A specific epitope tag (DET) is preferably used to immunize mice with a specific monoclonal antibody, such as a yeast-expressed HIV-1 gp160 molecule from strain BH10 [Ratner et al., Nature, 313: 277-284 (1985)]. 178.1 [Thiri art et al., J. Immunol. Immunol. 143: 1832-1836 (1989)], a short non-mammalian polypeptide recognized by an 11 amino acid epitope derived from the human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) epitope protein gp120 (or gp160) and the like. Is an array. Another example of DET is the FLAG labeling system, commercially available from Eastman Kodak, Rochester NY. In this example, each molecule of the EGF receptor has a tandem copy of each of the two DETs, which repeats within the molecule to provide additional binding sites. Alternatively, the DET sequence may be inserted into a secreted protein such as human growth hormone. It can be appreciated that there are many variations on such extracellular protein means. All such variations are included in the scope of the present invention. Thus, the minimal essential features of the construct are, directly or indirectly, a promoter / enhancer region, a membrane or secretion-targeting signal sequence, a transmembrane or membrane insertion region for cell surface proteins, and an optically readable signal. It is a polypeptide that can be produced. Yet another preferred component of the present invention is to provide accessory molecules for generating or enhancing an optical signal. Such molecules include, but are not limited to, fluorescent dyes, substrates for light-generating enzymes or color-forming chemicals for enzymes. In a preferred example, two exogenous binding partners are provided, each of which recognizes one of the DET sequences inserted into the extracellular region of an extracellular protein. Alternatively, one or both of the extracellular binding partners may be spatially free of naturally occurring extracellular proteins that are not present on or produced by the selected recipient cells used in the promoter or enhancer construct. , So that when bound, the two exogenous binding partners are separated by a distance comparable to or less than the energy transfer radius for the selected fluorophore. An example of such an exogenous binding partner is a monoclonal antibody against DET. Each of these binding partners is preferably labeled with a fluorescent dye capable of resonance energy transfer. Preferably, one of the dyes is capable of time-resolved fluorescence (emission). Examples of such dyes are terbium chelates / cryptates [Selvin PR and Hearst (JE. Proc. Natl. Acad. Sci. 91: 100240028, 1994)] and tetramethylrhodoamine (Molecular Probes, Eugene, OR). It is. Methods for labeling antibodies with fluorescent dyes are known in the art. Yet another preferred element of the present invention is a recipient cell. The cell may be of eukaryotic or prokaryotic origin, in the former case being somatic or germline. Preferred cell types are mammals, preferably human cell lines that can be maintained in culture. An example of such a cell line is the human embryonic kidney cell line HEK 293, which is available from the American Type Culture Collection. Transfection methods for mammalian cell nucleic acid constructs are well known to those of skill in the art. Depending on the nature of the promoter, it may be necessary to stimulate the cells with hormones or other substances to initiate extracellular protein expression. Further preferred components of the present invention are devices that can detect and measure optical signals. Such devices must produce numerical or graphical outputs related to the intensity and wavelength of the optical signal. It must be sensitive to the wavelength of the optical signal and may include a source of electromagnetic radiation to assist in generating the optical signal, such as a fluorophore excitation light source. In addition, the excitation radiation may be applied at discrete time intervals, and include a time delay mechanism such that the measurement is started at a specific time after the end of the excitation. Examples of such devices are fluorimeters, fluorescence correlation spectrophotometers, luminometers, spectrophotometers, CCD cameras, photon counters and fluorescence activated cell sorters. Such devices are readily available from commercial sources. When using the fluorescent reporter assay system of the present invention, the polynucleotide construct is transfected into selected recipient cells. If the promoter is active in the cellular environment, it drives the expression of extracellular proteins, leading to cell surface display or secretion of proteins with tandem binding partners. Cells that express high levels of the construct utilizing cell surface proteins are selected by adding a labeled exogenous binding partner, followed by fluorescence-activated cell sorting. Cells that produce secretory markers are cloned by limiting dilution and selected by monitoring the medium for optical signals. Accessory molecules are added to the medium to detect the optical signal. For example, a monoclonal anti-DET antibody labeled with a fluorescent dye capable of resonance energy transfer is added. Binding to each recognition site on the extracellular protein brings the fluorescent dye within the critical radius of resonance energy transfer and uses luminescence from donor or acceptor dyes to select cells that express high levels of extracellular protein I do. These cells are repeatedly subjected to selection as described above to generate stable transformants. The optical signal is detected by using a suitable detection device as described above. Once a stable transformed cell population is obtained, the cells are used to screen a compound collection or combinatorial library. Cells are plated into test wells, preferably in groups of 100 or more, and the extracellular-intracellular variations in reporter expression levels are averaged. Addition of the test compound may or may not involve the induction of hormones or other substances appropriate for the promoter region of interest. After an appropriate interval for optimal expression and secretion of the surface display or reporter, adjuvants are added to each well. The optical signal is quantified using a suitable detection device. For multiplex assays, cells are co-transfected with two or more of the same extracellular protein constructs but with a different promoter region for each construction. For each construct, the optical signal generating sequence is selected to obtain a separate signal. For example, peptide binding partners are chosen such that they interact with different exogenous binding partners. In this example, cells are transfected with a promoter 1 that binds DET-1DET2 and a promoter 2 that binds DET-1DET3 or DET3-DET4. The accessory molecules are labeled with fluorophores of different absorption or emission wavelengths. For example, an antibody against DET1 is terbium chelate / cryptate (emission 545 nm), anti-DET2 is TMR (excitation 550 nm emission 575 nm) and anti-DET3 is samarium chelate / cryptate (emission 655 nm), and DET4 is Cy5 (Amersham, Arlington Heights). ) (Excitation 650 nm emission 670 nm). Stable transformants are selected as described above for expression of both structures so that the specific effect of the compound on one or the other promoter activity can be determined. Screening for test compounds is performed as described above, except that fluorescence emission is monitored at both 575 nm and 670 nm. The advantages of this process over existing reporter gene systems are that 1) it allows the use of time-resolved dyes that are not sensitive to the fluorescence of the test compound or cellular components; 3) no need for cell lysis, which simplifies the selection of stable transformants. 4) Since signals are present for a long time, time-dependent imaging 5) a plurality of fluorophores can be bound to each accessory molecule, and a plurality of binding partner sequences can be added to extracellular proteins for increased sensitivity; 6) a washing step is required 7) the binding partner can be used for microbial, viral, fungal, insect, or artificial From sources, such molecules can be selected such that they are not endogenous on mammalian cells; 8) the need for two specific binding events to occur closely with each other for signal generation; and the use of time-resolved dyes. Increases the signal-to-noise ratio. Without further elaboration, it is believed that one skilled in the art can, using the preceding description, utilize the present invention to its fullest extent. Although the preferred embodiments of the invention have been described above, it is to be understood that the invention is not limited to what is disclosed herein, but that all modifications within the scope of the following claims are retained. Can be
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フロントページの続き
(72)発明者 ダニントン，ダミアン・ジェイ
アメリカ合衆国19444ペンシルベニア州ラ
ファイエット・ヒル、フォーサイシア・コ
ート23番
(72)発明者 ムーア，キース・ジェイ
イギリス、ハートフォードシャー、ウェル
ウィン、ウィルガ・ロード57番────────────────────────────────────────────────── ───
Continuation of front page
(72) Inventors Dunnington, Damian Jay
United States 19444 LA, Pennsylvania
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