JP2002506426A - Polynucleotide separation on non-porous polymer beads - Google Patents

Polynucleotide separation on non-porous polymer beads

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Abstract

(57)【要約】 本発明は、改良された分離および効率でポリヌクレオチドを分離するためのクロマトグラフィーの方法を記述する。当該方法は、非反応性の非極性表面を有しかつ多様な異なる重合性モノマーから作成される非多孔質ポリマービーズを使用する。 (57) SUMMARY The present invention describes a method of chromatography for separating polynucleotides with improved separation and efficiency. The method uses non-porous polymer beads having a non-reactive non-polar surface and made from a variety of different polymerizable monomers.

Description

【発明の詳細な説明】 非多孔質ポリマービーズ上でのポリヌクレオチド分離 発明の分野 本発明は非多孔質ポリマービーズを使用するポリヌクレオチドの分離に向けら れる。 発明の背景 ＤＮＡのようなポリヌクレオチドの分離は、伝統的にスラブゲル電気泳動もし くはキャピラリー電気泳動を使用して実施されている。しかしながら、ポリヌク レオチドの液体クロマトグラフィー分離は、分析を自動化しそしてそれらが分離 された後に画分を収集する能力のためより重要になっている。従って、液体クロ マトグラフィー（ＬＣ）によるポリヌクレオチド分離のためのカラムがより重要 になっている。 二本鎖ＤＮＡの分離のための高品質材料は、以前は、ボン(Bonn)らへの米国特 許第５，５８５，２３６号に開示されるポリマー性担体を基礎とし、これは、二 本鎖ＤＮＡが、逆相イオン対形成(ion pairing)クロマトグラフィー（ＲＰＩＰ Ｃ）として特徴づけられる方法を使用して、ゲル電気泳動に類似の選択性および 性能で大きさを基礎として分離され得ることを示した。しかしながら、記述され たクロマトグラフィー材料は最低３個の炭素を有するアルキル基で置換された非 多孔質ビーズに制限された。なぜなら、ボン(Bonn)らは、この置換を欠くポリマ ービーズを使用して分離を得ることにおいて不成功であったからである。加えて 、このポリマービーズは小さな一群のビニル芳香族モノマーに制限され、かつ、 ボン(Bonn)らは、他の材料で二本鎖ＤＮＡの分離を遂げることが不可能であった 。 改良された分離効率および分離度でポリヌクレオチドを分離するためのクロマ トグラフィーの方法に対する欲求が依然として存在する。 発明の要約 従って、本発明の一目的は、改良された分離および効率でポリヌクレオチドを 分離するためのクロマトグラフィーの方法を提供することである。 本発明の別の目的は、非反応性の非極性表面を有する非多孔質ポリマービーズ を使用するポリヌクレオチドの分離方法を提供することである。 多様な異なる重合性モノマーから作成される非多孔質ポリマービーズを使用す るポリヌクレオチドのクロマトグラフィー分離を提供することが、本発明の別の 目的である。 未置換、メチル置換、エチル置換、炭化水素置換もしくは炭化水素ポリマー置 換され得るポリマービーズを使用するポリヌクレオチドのクロマトグラフィー分 離を提供することが、本発明のさらなる一目的である。 本発明のなお別の目的は、製造工程の間に発生する汚染を除去するための段階 を包含することにより、改良されたポリマービーズを提供することである。 本発明のさらに別の目的は、多様な異なる溶媒系を使用するポリヌクレオチド の分離方法を提供することである。 これら、および以下の明細から明らかになるであろう本発明の他の目的は、本 発明により達成された。 要するに、ポリヌクレオチドの混合物を分離するための本発明の方法は、1500 までの塩基対を有するポリヌクレオチドの混合物を0.5ないし100ミクロンの平均 直径を有するビーズを含有する分離カラムを通して流 すこと、そして、ポリヌクレオチドの混合物を、（下に定義されるような）マッ チトイオンポリヌクレオチドクロマトグラフィー（Matched Ion Polynucleotide Chromatography)を使用して分離することを含んで成る。当該ビーズは、好まし くは、スチレン、置換スチレン、α−置換スチレンおよびジビニルベンゼンのよ うなモノおよびジビニル置換芳香族化合物；アクリレートおよびメタクリレート ；ポリプロピレンおよびポリエチレンのようなポリオレフィン；ポリエステル； ポリウレタン；ポリアミド；ポリカーボネート；ならびに商標テフロン［TEFLON ］で普遍的に知られるフルオロ置換エチレンを包含する置換ポリマーを包含する ポリマーから作成される。基材ポリマー(base polymer)はポリマーの混合物でも またあり得、その非限定的な例は、ポリ（スチレン−ジビニルベンゼン）および ポリ（エチルビニルベンゼン−ジビニルベンゼン）を包含する。ポリマーは未置 換であり得るか、または、メチル、エチル、炭化水素もしくは炭化水素ポリマー から成る群から選択される部分で置換され得る。炭化水素ポリマーは、場合によ っては23から1,000,000個までの炭素を有する。当該ビーズは、好ましくは約１ 〜５ミクロンの平均直径を有する。好ましい態様においては、予防措置が、それ らが多価陽イオン汚染物質を本質的に含まずかつビーズがいかなる残余の表面の 金属汚染物質も除去するように、例えば酸洗浄処理により処理されるように、ビ ーズの製造の間にとられる。本発明のビーズは最低0.05の（下で定義されるよう な）ＤＮＡ分離係数を有することを特徴とする。好ましい一態様においては、ビ ーズは最低0.5のＤＮＡ分離係数を有することを特徴とする。 本質的に金属を含まないビーズそれら自身に加えて、われわれは、至 適のピーク分離を達成するためには、分離カラム、およびカラム内に保持される もしくはカラムを通って流れる全プロセス溶液が、多価陽イオン汚染物質を本質 的に含まないべきであることもまた見出した。これは、カラムを多価陽イオンの 汚染から保護するために、分離カラムに進入する溶液に、カラム内に保持される もしくはこれを通って流れるプロセス溶液中に多価陽イオンを放出しない材料か ら作成されたプロセス溶液接触表面を有する成分を供給し(supply)そして送る(f eed)ことにより達成され得る。この系の成分のプロセス溶液接触表面は、好まし くは、チタン、被覆ステンレス鋼および有機ポリマーから成る群から選択される 材料である。 付加的保護のため、カラムに進入する溶離液溶液およびサンプル溶液中の多価 陽イオンは、樹脂床を多価陽イオン汚染から保護するために、これらの溶液がカ ラムに進入する前に当該溶液を多価陽イオン捕捉樹脂と接触させることにより除 去され得る。多価捕捉樹脂は、好ましくは陽イオン交換樹脂および／もしくはキ レート樹脂である。 本発明の方法は、約1500ないし2000までの塩基対を有する二本鎖ポリヌクレオ チドを分離するのに使用され得る。多くの場合、当該方法は、600までの塩基も しくは塩基対を有する、または５ないし80までの塩基もしくは塩基対を有するポ リヌクレオチドを分離するのに使用される。ポリヌクレオチドの混合物はポリメ ラーゼ連鎖反応産物であり得る。 当該方法は、5000psiより大きくない背圧を生じるように20℃ないし90℃の範 囲内の温度で実施される。当該方法はまた、好ましくは、水溶性である有機溶媒 も使用する。この溶媒は、好ましくは、アルコール、ニトリル、ジメチルホルム アミド、エステルおよびエーテルから成る群 から選択される。当該方法はまた、好ましくは、酢酸トリアルキルアミン、炭酸 トリアルキルアミンおよびリン酸トリアルキルアミンから選択される対イオン剤 も使用する。最も好ましい対イオン剤は、酢酸トリエチルアンモニウムもしくは トリエチルアンモニウムヘキサフルオロイソプロピルアルコールである。 別の局面において、本発明は、0.5〜100ミクロンの平均ビーズ直径を有するポ リマービーズを提供する。予防措置が、それらが多価陽イオン汚染物質を本質的 に含まずかつビーズがいかなる残余の表面の金属汚染物質も除去するように例え ば酸洗浄処理により処理されるように、ビーズの製造の間にとられる。一態様に おいては、当該ビーズは最低0.05のＤＮＡ分離係数を有することを特徴とする。 好ましい一態様においては、ビーズは最低0.5のＤＮＡ分離係数を有することを 特徴とする。ビーズは、好ましくは約１〜10ミクロンの平均直径を有し、そして 最も好ましくは約１〜５ミクロンの平均直径を有する。ビーズは、ビニル芳香族 モノマーのコポリマーから構成され得る。ビニル芳香族モノマーは、スチレン、 アルキル置換スチレン、α−メチルスチレンもしくはアルキル置換α−メチルス チレンであり得る。ビーズは、スチレン、Ｃ1-6アルキルビニルベンゼンおよび ジビニルベンゼンのコポリマーのようなコポリマーであり得る。ビーズは、ポリ ビニルアルコール、ヒドロキシ、ニトロ、ハロゲン（例えばブロモ）、シアノ、 アルデヒド、もしくはサンプルを結合しない他の基のような官能基を含有し得る 。ビーズは置換され得ないか、または、メチル、エチル、炭化水素もしくは炭化 水素ポリマーのような部分で置換され得る。好ましい態様においては、ビーズは オクタデシルで修飾されたポリ（エチルビニルベンゼン−ジビニルベンゼ ン）もしくはポリ（スチレン−ジビニルベンゼン）である。ビーズは、ジビニル ベンゼンもしくはブタジエンのような架橋性のジビニルモノマーもまた含有し得 る。 図面の簡単な説明 図１は、ＤＮＡ分離係数がどのように測定されるかの略図表示である。 図２は、アルキル化されたポリ（スチレン−ジビニルベンゼン）ビーズを含有 するカラムでのｐＵＣ１８ ＤＮＡ−ＨａｅIII消化断片のＭＩＰＣ分離である 。ピークは、溶離された断片の塩基対の数で印をつけられる(labeled)。 図３は、誘導体化されないポリ（スチレン−ジビニルベンゼン）の非多孔質の 2.1ミクロンのビーズを含有するカラムでのｐＵＣ１８ ＤＮＡ−ＨａｅIII消化 断片のＭＩＰＣ分離である。 図４は、溶媒としてアセトニトリルを使用して正のエンタルピーを示すアルキ ル化されたポリ（スチレン−ジビニルベンゼン）ビーズでの1nｋ対１／Ｔ［°Ｋ-1 ］のファントホッフプロットである。 図５は、溶媒としてアセトニトリルを使用して正のエンタルピーを示す誘導体 化されないポリ（スチレン−ジビニルベンゼン）ビーズでの1nｋ対１／Ｔ［°Ｋ-1 ］のファントホッフプロットである。 図６は、溶媒としてメタノールを使用して負のエンタルピーを示すアルキル化 されたポリ（スチレン−ジビニルベンゼン）ビーズでの1nｋ対１／Ｔ［°Ｋ-1］ のファントホッフプロットである。 図７はアルキル化されたビーズおよび溶媒としてアセトニトリルを使用する分 離である。 図８はアルキル化されたビーズおよび溶媒として50.0％メタノールを 使用する分離である。 図９はアルキル化されたビーズおよび溶媒として25.0％エタノールを使用する 分離である。 図１０はアルキル化されたビーズおよび溶媒として25.0％ウオツカ（100プル ーフ）を使用する分離である。 図１１はアルキル化されたビーズおよび溶媒として25.0％１−プロパノールを 使用する分離である。 図１２はアルキル化されたビーズおよび溶媒として25.0％１−プロパノールを 使用する分離である。 図１３はアルキル化されたビーズおよび溶媒として10.0％２−プロパノールを 使用する分離である。 図１４はアルキル化されたビーズおよび溶媒として10.0％２−プロパノールを 使用する分離である。 図１５はアルキル化されたビーズおよび溶媒として25.0％ＴＨＦを使用する分 離である。 図１６はアルキル化されないポリ（スチレン−ジビニルベンゼン）ビーズでの 組み合わせのアイソクラチック／勾配分離である。 発明の詳細な記述 その最も一般的な形態において、本発明の主題は、約0.5〜100ミクロン；好ま しくは１〜10ミクロン；より好ましくは１〜５ミクロンの平均直径を有する非多 孔質ポリマービーズで充填されたカラムを利用するポリヌクレオチドの分離であ る。1.0〜3.0ミクロンの平均直径を有するビーズが最も好ましい。 米国特許第５，５８５，２３６号において、ボン(Bonn)らは、この核 酸分離方法を逆相イオン対形成クロマトグラフィー（ＲＰＩＰＣ）と特徴づけた 。しかしながら、ＲＰＩＰＣは本発明に記述されるある不可欠の特徴を組み込ま ないため、別の用語、マッチトイオンポリヌクレオチドクロマトグラフィー（Ｍ ＩＰＣ）が選択された。本明細書で使用されるところのＭＩＰＣは、非極性ビー ズを使用して一本鎖および二本鎖ポリヌクレオチドを分離する方法と定義され、 ここで当該方法は対イオン剤、およびビーズから核酸を脱着するための有機溶媒 を使用し、また、ここで、ビーズは最低0.05のＤＮＡ分離係数を有すると特徴づ けられる。好ましい一態様においては、ビーズは最低0.5のＤＮＡ分離係数を有 する。至適の一態様においては、ビーズは最低0.95のＤＮＡ分離係数を有する。 本発明のビーズの性能は、二本鎖および一本鎖ＤＮＡのＭＩＰＣによる高効率 分離により立証される。われわれは、ビーズの性能を測定するための最良の基準 がＤＮＡ分離係数であることを見出した。これは、ｐＵＣ１８ ＤＮＡ−Ｈａｅ III制限消化物の257および267塩基対の二本鎖ＤＮＡ断片の分離度として測定さ れ、ここで、ピークの間の谷からピークの一方の頂上までの距離は基線(baselin e)から谷までの距離を越える(over)。図１の図解表示を参照すれば、ＤＮＡ分離 係数は、基線からピーク「ｂ」と「ｃ」との間の谷「ｅ」までの距離「ａ」、お よび谷「ｅ」からピーク「ｂ」もしくは「ｃ」の一方の頂上までの距離「ｄ」を 測定することにより決定される。ピーク高が同等でない場合、最高のピークが「 ｄ」を得るのに使用される。ＤＮＡ分離係数はｄ／（ａ＋ｄ）の比である。この 図解表示中の257および267塩基対のピークは高さが類似である。本発明の操作上 の(operational)ビーズは最低0.05のＤＮＡ 分離係数を有する。好ましいビーズは最低0.5のＤＮＡ分離係数を有する。 理論により束縛されることを願わず、われわれは、本明細書で明記されるよう なＤＮＡ分離係数に従うビーズは、分離されているポリヌクレオチドをビーズに 進入することから本質的に排除する孔径を有すると考える。本明細書で使用され るところの「非多孔質」という用語は、その中で使用される溶媒媒体中での分離 での最小のＤＮＡ断片の大きさおよび形状より小さい直径を有する表面孔を有す るビーズを示すことを定義される。それらの本来の状態でこれらの明記された最 大の大きさの制限を有する、もしくは必要とされる最大有効孔径を合致させるた めにそれらの孔径を減少させるよう処理されたポリマービーズが、本定義に包含 される。好ましくは、最低0.05のＤＮＡ分離係数を提供する全ビーズが、「非多 孔質」ビーズの定義内に包含されることを意図される。 本発明の非多孔質ビーズの表面の配座は、分離過程を妨害しないくぼみ(depre ssions)および浅いたて穴(pit)様構造を包含し得る。それを非多孔質にするため の多孔質ビーズの前処理は、ビーズ構造中の孔を満たすことができかつＭＩＰＣ 過程を有意に妨害しないいずれかの材料で遂げられ得る。 孔は、それを通って溶離液および他の物質がビーズ構造に進入し得る開放構造 である。孔は、しばしば、１個の孔に進入する液体が別の孔から出ることができ るように相互に連結される。われわれは、相互に連結される孔構造およびビーズ 中へのポリヌクレオチドの移動を可能にする寸法を有する孔は、分離の分離度を 損なうか、もしくは非常に長い保持時間を有する分離を生じると考える。しかし ながら、ＭＩＰＣでは、ビ ーズは「非多孔質」であり、そしてポリヌクレオチドはビーズ構造に進入しない 。 ポリヌクレオチドという用語は、１個のリボース（もしくはデオキシリボース ）から別のものまでリン酸残基を介して結合される不確定数のヌクレオチドを含 有する直鎖状ポリマーと定義される。本発明は、ＲＮＡまたは二本鎖もしくは一 本鎖ＤＮＡの分離で使用され得る。本発明の記述を単純にする目的上、そして制 限としてでなく、二本鎖ＤＮＡの分離が本明細書の実施例で記述されることがで き、全部のポリヌクレオチドが本発明の範囲内に包含されることが意図されるこ とが理解される。 カラムビーズのクロマトグラフィー効率は、主として、表面および近表面領域 の特性により影響される。この理由から、以下の記述はとりわけポリマービーズ の表面に近い領域(close-to-the-surface region)に関する。こうしたビーズの 本体および／もしくは中央は、本発明のポリマービーズの表面でもしくはその近 くで観察されるものと全く異なる化学および物理特性の組を表わし得る。 本発明の非多孔質ポリマービーズは二段法により製造され、ここで小さな種ビ ーズが適する重合性モノマーの乳化重合により最初に製造される。本発明の乳化 重合の手順はグッドウィン(Goodwin)ら（グッドウィン(J.W．Goodwin)、ハーン( J．Hearn)、ホー(C.C．Ho)とオットヴェイル(R.H．Ottweill)、Colloid & Polym er Sci.、(1974)、252:464-471）の手順の変法である。種ビーズを生じさせるた めの乳化重合工程で使用され得るモノマーは、スチレン、アルキル置換スチレン 、α−メチルスチレンおよびアルキル置換α−メチルスチレンを包含する。種ビ ーズがその後拡大され、そして場合によっては多様な基での置換により修飾さ れて本発明の非多孔質ポリマービーズを生じさせる。 乳化重合により製造される種ビーズは、ポリマービーズの大きさを増大させる ためのいずれかの既知の方法により拡大され得る。例えば、ポリマービーズは、 米国特許第４，５６３，５１０号に開示される活性化膨潤法(activated swellin g process)により拡大され得る。拡大もしくは膨潤されたポリマービーズは、架 橋性の重合性モノマーおよび重合開始剤でさらに膨潤される。重合は拡大された ポリマービーズの架橋密度を増大させ、そしてビーズの表面多孔性を減少させる 。適する架橋用単量体は、開始剤の存在下で重合が可能な最低２個の炭素−炭素 二重結合を含有する。好ましい架橋用単量体は、ジビニルモノマー、好ましくは アルキルおよびアリール（フェニル、ナフチルなど）ジビニルモノマーであり、 そしてジビニルベンゼン、ブタジエンなどを包含する。ポリマーの種ビーズの活 性化膨潤は、１から約100ミクロンまでの範囲にわたる平均直径を有するポリマ ービーズを製造するのに有用である。 あるいは、ポリマーの種ビーズは、単に、乳化重合から生じる種ラテックスを 加熱することにより拡大され得る。この代替は、活性化溶媒での種ビーズの活性 化膨潤に対する要求を排除する。代わりに、種ラテックスは、架橋用単量体のた めの水と混和する溶媒と一緒にもしくはこれを伴わずに、上述された架橋用単量 体および重合開始剤と混合される。適する溶媒は、アセトン、テトラヒドロフラ ン（ＴＨＦ）、メタノールおよびジオキサンを包含する。生じる混合物は、約１ 〜12時間、好ましくは約４〜８時間、重合開始剤の開始温度より下の温度、一般 には約10℃〜80℃、好ましくは30℃〜60℃で加熱される。場合によっては、混合 物の温度は10〜20％増大され得、そして混合物が追加の１ないし４時間加 熱され得る。重合開始剤に対するモノマーの比は、最低200の重合度を確実にす るために、最低100：１、好ましくは約100：１ないし約500：１、より好ましく は約200：１である。この重合度を有するビーズは、高圧液体クロマトグラフィ ー（ＨＰＬＣ）の応用で使用されるのに十分に圧安定性である。この熱膨潤法は 、約５ミクロンまで、好ましくは約２〜３ミクロンの平均直径を有するポリマー ビーズを得るようにビーズの大きさを約110〜160％増大させることを可能にする 。熱膨潤方法は、従って、前には活性化膨潤手順によってのみ到達可能なより小 さな粒子径を生じさせるのに使用され得る。 熱拡大の後に、過剰の架橋用単量体が除去され、そして粒子が紫外光もしくは 熱への曝露により重合される。重合は、例えば、拡大された粒子の重合開始剤の 活性化温度への加熱、および所望の重合度が達成されるまで重合を継続すること により実施され得る。継続された加熱および重合は500より大きい重合度を有す るビーズを得ることを可能にする。 本発明においては、ボン(Bonn)ら、もしくは米国特許第４，５６３，５１０号 により開示された充填物材料が、メチルもしくはエチル基または炭化水素ポリマ ー基でのポリマービーズの置換により修飾され得るか、あるいはその未修飾状態 で使用され得る。ポリマービーズは、ビーズをヨウ化メチルもしくはヨウ化エチ ルのようなアルキル化剤と接触させることにより１もしくは２個の炭素原子でア ルキル化され得る。アルキル化は、ポリマーブレンドの表面の芳香環で求電子芳 香族置換を遂げるためのフリーデルクラフツ触媒の存在下にポリマービーズをア ルキルハロゲン化物と混合することにより達成される。適するフリーデルクラフ ツ触媒は当該技術分野で公知であり、そして、塩化アルミニウム、三フッ 化ホウ素、四塩化スズなどのようなルイス酸を包含する。ビーズは、例えば上の 手順で、対応する炭化水素ハロゲン化物をヨウ化メチルの代わりに用いることに より炭化水素置換され得る。 本明細書で使用されるところの「炭化水素」という用語は、23から1,000,000 個までの炭素を有するアルキルおよびアルキル置換アリール基を包含することを 定義され、アルキル基は、アルデヒド、ケトン、エステル、エーテル、アルキル 基などを包含する多様な型の直鎖、分枝状鎖、環状、飽和、不飽和の非イオン性 官能基を包含し、また、アリール基は、フェニル、ナフチルなどを包含する単環 、二環および三環の芳香族炭化水素基のようなものを包含する。炭化水素置換の 方法は当該技術分野で慣習的かつ公知であり、そして本発明の一局面でない。置 換は、非極性の逆相官能基であるとみなされるヒドロキシ、シアノ、ニトロ基な どもまた含有し得る。本明細書で使用されるところの「炭化水素ポリマー」とい う用語は、ある炭化水素組成および23から1,000,000個までの炭素を有するポリ マーであることを定義される。 ボン(Bonn)の特許で報告されるクロマトグラフィー材料は最低３個の炭素を有 するアルキル基で置換された非多孔質ビーズに制限された。なぜなら、ボン(Bon n)らは、この置換を欠くポリマービーズを使用して分離を得ることにおいて不成 功であったからである。加えて、このポリマービーズは小さな一群のビニル芳香 族モノマーに制限され、かつ、ボン(Bonn)らは、他の材料で二本鎖ＤＮＡの分離 を遂げることが不可能であった。 本発明において、今や、驚くべきことに、二本鎖ＤＮＡの成功する分離が、誘 導体化されない非多孔質ビーズを使用して、ならびにメチル、 エチル、炭化水素もしくは炭化水素ポリマー置換で誘導体化されたビーズを使用 して達成され得ることが発見された。 本発明の基材ポリマーは他のポリマーでもまたあり得、その制限しない例は、 スチレン、置換スチレン、α−置換スチレンおよびジビニルベンゼンのようなモ ノおよびジビニル置換芳香族化合物；アクリレートおよびメタクリレート；ポリ プロピレンおよびポリエチレンのようなポリオレフィン；ポリエステル；ポリウ レタン；ポリアミド；ポリカーボネート；ならびに商標テフロン［TEFLON］で普 遍的に知られるフルオロ置換エチレンを包含する置換ポリマーを包含する。基材 ポリマーはポリマーの混合物でもまたあり得、その制限しない例は、ポリ（スチ レン−ジビニルベンゼン）およびポリ（エチルビニルベンゼン−ジビニルベンゼ ン）を包含する。これらのポリマーからのビーズの作成方法は当該技術分野で慣 習的かつ公知である（例えば、米国特許第４，９０６，３７８号を参照）。ビー ズの表面および表面近くの領域の物理特性が、クロマトグラフィー効率に対する 主要な影響を及ぼすものである。ポリマーは、誘導体化されるにしろされないに しろ、マッチトイオンポリヌクレオチドクロマトグラフィー分離のための非多孔 質の非反応性かつ非極性の表面を提供しなければならない。 本発明のビーズは、ＤＮＡを結合し得る、金属汚染物質もしくは他の汚染物質 の少ない量を有することもまた特徴とする。本発明の好ましいビーズは、いかな る多価陽イオン汚染物質（例えばＦｅ（III）、Ｃｒ（III）もしくはコロイド状 金属汚染物質）も本質的に排除するよう設計される酸洗浄処理のような汚染除去 処理を包含する製造の間の予防措置にかけられていることを特徴とする。非常に 純粋の非金属含有材料の みが、生じるビーズが最小限の金属含有量を有することができるためにビーズの 製造で使用されるべきである。 本質的に金属を含まないビーズそれら自身に加えて、われわれは、ＭＩＰＣの 間の至適のピーク分離を達成するためには、分離カラム、およびカラム内に保持 されるもしくはカラムを通って流れる全プロセス溶液が多価陽イオン汚染物質を 本質的に含まないべきであることもまた見出した。共通に所有される同時係属中 の米国特許出願番号８０／７４８，３７６（1996年11月13日に申請された）に記 述されるとおり、これは、カラムを多価陽イオン汚染から保護するために、分離 カラムに進入する溶液に、カラム内に保持されるもしくはこれを通って流れるプ ロセス溶液中に多価陽イオンを放出しない材料から作成されたプロセス溶液接触 表面を有する成分を供給し(supply)そして送る(feed)ことにより達成され得る。 この系の成分のプロセス溶液接触表面は、好ましくは、チタン、被覆ステンレス 鋼、不動態化ステンレス鋼および有機ポリマーから成る群から選択される材料で ある。 付加的保護のため、カラムに進入する溶離液溶液およびサンプル溶液中の多価 陽イオンは、樹脂床を多価陽イオン汚染から保護するために、これらの溶液がカ ラムに進入する前に当該溶液を多価陽イオン捕捉樹脂と接触させることにより除 去され得る。多価捕捉樹脂は、好ましくは陽イオン交換樹脂および／もしくはキ レート樹脂である。 ポリヌクレオチドの高分離度のクロマトグラフィー分離を達成するためには、 クロマトグラフィーカラムを固相のポリマービーズできつく充填することが一般 に必要である。カラム充填物材料でカラムを充填するいずれかの既知の方法が、 十分な高分離度の分離を得るために本発明で 使用され得る。典型的には、ポリマービーズのスラリーがポリマービーズの密度 と同等のもしくはより小さい密度を有する溶媒を使用して調製される。カラムが その後ポリマービーズのスラリーで満たされ、そして振動もしくは攪拌されてカ ラム中のポリマービーズの充填密度を向上させる。機械的振動もしくは超音波処 理が充填密度を向上させるのに典型的に使用される。 例えば、50×4.6mm直径のカラムを充填するには、2.0グラムのビーズが超音波 処理の助けを借りて10mLのメタノール中に懸濁され得る。この懸濁液がその後、 8,000psiの圧で50mLのメタノールを使用してカラムに充填される。これは充填床 の密度を向上させる。 本発明の分離方法は、一般に、ＤＮＡおよびＲＮＡの一本鎖および二本鎖ポリ ヌクレオチドのクロマトグラフィー分離に応用可能である。ポリヌクレオチドの 混合物を含有するサンプルは、ポリヌクレオチドの全合成、制限エンドヌクレア ーゼもしくは他の酵素または化学物質でのＤＮＡもしくはＲＮＡの切断、ならび にポリメラーゼ連鎖反応技術を使用して増殖および増幅された核酸サンプルから 生じ得る。 本発明の方法は約1500ないし2000までの塩基対を有する二本鎖ポリヌクレオチ ドを分離するのに使用され得る。多くの場合には、当該方法は、600までの塩基 もしくは塩基対を有する、または５ないし80までの塩基もしくは塩基対を有する ポリヌクレオチドを分離するのに使用される。 好ましい一態様においては、分離はマッチトイオンポリヌクレオチドクロマト グラフィー（ＭＩＰＣ）による。本発明の非多孔質ビーズは、ＤＮＡ分離を生じ させるための対イオン剤および溶媒勾配とともに機能することができる逆相材料 として使用される。ＭＩＰＣでは、ポリヌク レオチドが対イオンと対にされ、そしてその後、本発明の非多孔質ビーズを使用 する逆相クロマトグラフィーにかけられる。酢酸トリアルキルアミン、炭酸トリ アルキルアミン、リン酸トリアルキルアミン（ＴＥＡＡＨＰＯ4）などのような 揮発性である対イオン剤が本発明の方法での使用に好ましく、酢酸トリエチルア ンモニウム（ＴＥＡＡ）およびトリエチルアンモニウムヘキサフルオロイソプロ ピルアルコールが最も好ましい。 本発明のビーズを使用するＭＩＰＣによるＤＮＡの分離の間の至適なピーク分 離度を達成するために、当該方法は、好ましくは、20℃ないし90℃；より好まし くは30℃ないし80℃；最も好ましくは50℃ないし75℃の範囲内の温度で実施され る。１４．温度は、5000psiを越えない背圧を生じるよう選択される。一般に、 一本鎖断片の分離はより高温で実施されるべきである。 われわれは、分離が実施される温度が分離で使用される溶媒の選択に影響を及 ぼすことを見出した。一理由は、溶媒が、二本鎖ＤＮＡが２個の一本鎖、もしく は一本鎖および二本鎖ＤＮＡの１個の部分的に溶かされた(melted)複合体を形成 するように溶けることができる温度に影響を及ぼすことである。いくつかの溶媒 が、他の溶媒より良好に溶かされた構造を安定化し得る。溶媒が重要である他の 理由は、それが移動相と固定相との間のＤＮＡの輸送に影響を及ぼすからである 。アセトニトリルおよび１−プロパノールはこれらの場合で好ましい溶媒である 。最後に、溶媒の毒性（および費用）が重要であり得る。この場合は、メタノー ルがアセトニトリルを上回って好ましく、そして１−プロパノールがメタノール を上回って好ましい。 分離が上の範囲内の温度で実施される場合、水溶性である有機溶媒、例えば、 アルコール、ニトリル、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、テトラヒドロフラン （ＴＨＦ）、エステルおよびエーテルが好ましく使用される。水溶性の溶媒は、 本発明の操作の全条件下で水系と単一相として存在するものと定義される。本発 明の方法での使用にとりわけ好ましい溶媒は、メタノール、エタノール、２−プ ロパノール、１−プロパノール、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）およびアセトニ トリルを包含し、アセトニトリルが全体として最も好ましい。 われわれは、二本鎖ＤＮＡ断片のクロマトグラフィー分離が独特の収着エンタ ルピー（ΔＨsorp）を表わすことを決定した。２種の化合物（この場合は異なる 大きさのＤＮＡ断片）は、それらが異なる分配係数（Ｋ）を有する場合にのみ分 離され得る。ネルンストの分配係数は、移動相中のその濃度により割られる固定 相中の被検体の濃度（Ａ）と定義される。すなわち 分配係数（Ｋ）および保持係数（ｋ）は、以下の等式すなわち により関連づけられ、 商Ｖm／Ｖsはまた相体積比（Φ）とも呼ばれる。従って： ｋ＝ＫΦ 収着エンタルピーを算出するためには、以下の基礎的熱力学的等式が必要であ る。すなわち 最後の２式を変換することにより、われわれはファントホッフの等式： を得る。 プロット1nｋ対１／Ｔから、収着エンタルピーΔＨsorpがグラフの傾きから得ら れることができる（直線が得られる場合）。ΔＳsorpは相体積比（Φ）が既知で ある場合に算出され得る。 収着エンタルピーは正であり（ΔＨsorp＞０）、この分離が溶媒としてアセト ニトリルを使用して吸熱性であることを示し（図３および４）、また、溶媒とし てメタノールを使用すれば、収着エンタルピーΔＨsorpは負であり（ΔＨsorp＜ ０）、この分離が発熱性であることを示す（図５）。 （下の実施例で示されるような）熱力学的データは、本発明のビーズおよび溶 出溶媒に対するＤＮＡ−対イオン剤複合体の相対的親和性を示す。吸熱反応プロ ットはビーズに対するＤＮＡ複合体の好みを示す。発熱反応プロットは、溶媒に 対するビーズを上回るＤＮＡ複合体の好ましさを示す。本明細書に示されるプロ ットは実施例に記述されるようなアルキル化されたおよびアルキル化されない表 面についてである。大部分の液体クロマトグラフィー分離は発熱反応プロットを 示す。 本発明の他の特徴は例示的態様の以下の記述の間に明らかになることができ、 これらは本発明の具体的説明のために与えられかつその制限であることを意図さ れない。 本明細書に引用される全参考文献はこれによりそっくりそのまま引用により組 み込まれる。 下の実施例で過去時制で記述される処置は実験室で実施された。現在時制で記 述される処置は未だ実験室で実施されておらず、そして本出願の申請で実施する よう構成上縮小される。 実施例１ 非多孔質ポリ（スチレン−ジビニルベンゼン）粒子の製造 塩化ナトリウム（0.236g）を、1.0リットルの容積を有する反応器中の354mLの 脱イオン水に添加した。反応器に、機械的攪拌機、還流冷却器および気体導入チ ューブを装備した。塩化ナトリウムの溶解を、攪拌（350rpm）により補助される 不活性雰囲気（アルゴン）下、および上昇された温度（87℃）で実施した。新た に蒸留されたスチレン（33.7g）および50mLの脱イオン水に溶解された0.2184gの ペルオキソ二硫酸カリウム（Ｋ2Ｓ2Ｏ8）をその後添加した。これらの添加直後 に気体導入チューブを溶液から引き出しそして液体表面より上に位置を定めた。 反応混合物をその後、87℃で6.5時間攪拌した。この後、反応器の内容物を周囲 温度まで冷却し、そして第一段階から生じる1000mL体積の懸濁液中で54.6gの重 合されたスチレンの濃度を生じる体積まで希釈した。1000mL中の重合されたスチ レンの量は、機械的攪拌機になお付着するポリマーの量（およそ５〜10g）を包 含するよう算出した。懸濁液中の球状ビーズの直径を、光学顕微鏡検査により約 1.0ミクロンであると決定した。 第一段階から生じるビーズは、クロマトグラフィー充填物としての使用には一 般になお小さすぎかつ軟らかすぎる（低い圧安定性）。これらのビーズの軟度は 不十分な架橋度により引き起こされる。第二段階で、 ビーズを拡大しかつ架橋度を増大させる。 第二段階のプロトコルは、ウゲルシュタット(Ugelstad)ら（Adv．Colloid Int erface Sci.、13:101-140(1980)）により記述された活性化膨潤法を基礎とする 。活性化膨潤、もしくは第二合成段階を開始させるために、第一段階からのポリ スチレン種の水性懸濁液（200ml）を、最初に60mLのアセトン、そしてその後60m Lの１−クロロドデカン乳濁液と混合した。この乳濁液を調製するためには、0.2 06gのドデシル硫酸ナトリウム、49.5mLの脱イオン水および10.5mlの１−クロロ ドデカンを集め(brought together)、そして生じる混合物を０℃で４時間保ち、 そして、＜0.3ミクロンの微細な乳濁液が得られるまでの時間の期間全体の間、 超音波処理により混合した。ポリスチレン種、アセトンおよび１−クロロドデカ ン乳濁液の混合物を室温で約12時間攪拌し、この時間の間、ビーズの膨潤が発生 した。その後、アセトンを80℃での30分の蒸留により除去した。 アセトンの除去の後、膨潤されたビーズを、開始剤として2.5gの過酸化ジベン ゾイルもまた含有する310gのエチルジビニルベンゼンおよびジビニルベンゼン（ ＤＶＢ）（１：1.71）の混合物の添加によりさらに成長させた。成長は、攪拌、 および光学顕微鏡検査によっての時折の粒子径測定を伴い発生した。 膨潤および成長の段階の完了後に反応混合物を分離漏斗に移した。攪拌されな い溶液中で、過剰量のモノマーを、ポリマービーズの懸濁液を含有する層から分 離し、そしてそれに従って(thus)容易に分離され得た。ビーズの残存する懸濁液 を反応器に戻し、そして温度の段階的増大（63℃約７時間、73℃約２時間、そし て83℃約12時間）にかけ、重合度のさ らなる増大（＞500）につながった。この様式で製造されたビーズの孔径は水銀 多孔度測定(porosimetry)の検出限界より下であった(＜30Å)。 乾燥した後、段階２からの乾燥されたビーズ（10g）を、100mlのｎ−ヘプタン で４回、そしてその後以下、すなわち100mLのジエチルエーテル、100mLのジオキ サンおよび100mLのメタノールのそれぞれで２回、洗浄した。最後にビーズを乾 燥した。 実施例２ 酸洗浄処理 実施例１で製造されたビーズを、テトラヒドロフランで３回およびメタノール で２回洗浄した。最後に、ビーズを、100mLのテトラヒドロフランおよび100mLの 濃塩酸を含有する混合物中で12時間攪拌した。この酸処理の後に、ポリマービー ズを、中性（ｐＨ＝７）までテトラヒドロフラン／水の混合物で洗浄した。ビー ズをその後40℃で12時間乾燥した。 実施例３ 分離媒体の性能を試験するための標準的手順 分離粒子をＨＰＬＣカラムに充填し、そして標準ＤＮＡ混合物を分離するそれ らの能力について試験する。標準混合物は、それぞれ11、18、80、102、174、25 7、267、298、434、458および587塩基対を有する11個の断片を含有するｐＵＣ１ ８ ＤＮＡ−ＨａｅIII消化物（シグマ−アルドリッチ(Sigma-Aldrich)、Ｄ６２ ９３）である。標準品を水で希釈し、そして、0.25μgのＤＮＡの総量を含有す る５μLを注入する。 充填体積および充填極性に依存して、当該手順は、駆動溶媒(driving solvent )濃度、ｐＨおよび温度の選択を必要とする。分離条件を、257、267のピークの 保持時間が約６ないし10分であるように調節する。以下 の溶媒、すなわちメタノール、エタノール、２−プロパノール、１−プロパノー ル、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）もしくはアセトニトリルのいずれか１種を使 用し得る。対イオン剤を、酢酸トリアルキルアミン、炭酸トリアルキルアミン、 リン酸トリアルキルアミンもしくはポリヌクレオチド陰イオンと対にされたイオ ン(matched ion)を形成し得るいずれかの他の型の陽イオンから選択する。 この手順の一例として、図２は、オクタデシルで修飾された非多孔質のポリ（ エチルビニルベンゼン−ジビニルベンゼン）ビーズを使用する標準ＤＮＡ混合物 の高分離度を示す。この分離は以下の条件下で実施した。すなわち溶離液Ａ：0. 1MＴＥＡＡ、ｐＨ7.0；溶離液Ｂ：0.1MＴＥＡＡ、25％アセトニトリル；勾配： 流速は0.75mL／分であり、260nmでの検出ＵＶ、カラム温度50℃。ｐＨは7.0で あった。 図２でと同一の分離条件を使用するこの手順の別の例として、図３は、誘導体 化されないポリ（スチレン−ジビニルベンゼン）の非多孔質の2.1ミクロンのビ ーズを含有するカラムでの標準ＤＮＡ混合物の高分離度の分離である。 実施例４ 収着エンタルピー測定 ４種の断片（５μlのｐＵＣ１８ ＤＮＡ−ＨａｅIII消化物中に見出される17 4bp、257bp、267bpおよび298bp、0.04μgＤＮＡ／μl）を、オクタデシルで修飾 された非多孔質のポリ（スチレン−ジビニルベンゼン）ポリマービーズを使用し て異なる温度のアイソクラチック条件下で分離した。分離は、以下の条件下で、 ＤＮＡセップ［DNASep］（商標）カラム（トランスゲノミック インク(Transge nomic，Inc.)、カリフォルニア州サンノゼ）を装備された、トランスゲノミック (Transgenomic)ウェイヴ［WAVE］（商標）ＤＮＡ断片分析システム(DNA Fragmen t Analysis System)を使用して実施した。すなわち溶離液：0.75mL／分での0.1M 酢酸トリエチルアンモニウム、14.25％（ｖ／ｖ）アセトニトリル、250nmのＵＶ での検出、それぞれ35、40、45、50、55および60℃の温度。1nｋ対１／Ｔのプロ ットは、保持係数ｋが温度を増大させることに伴い増大していることを示す（図 ４）。これは、保持の機構が吸熱反応過程（ΔＨsorp＞０）を基礎とすることを 示す。 アルキル化されないポリ（スチレン−ジビニルベンゼン）ビーズでの同一の実 験は、1nｋ対１／Ｔのプロットについて負の傾きを与えたが、とは言えこのプロ ットはわずかに湾曲する（図５）。 オクタデシルで修飾された非多孔質のポリ（スチレン−ジビニルベンゼン）ビ ーズでの、しかし溶媒としてのアセトニトリルを置き換えるメタノールで実施さ れた同一の実験は、保持係数ｋが温度を増大させることに伴い減少していること を示すプロット1nｋ対１／Ｔを与えた(図６)。これは、保持の機構が発熱反応過 程（ΔＨsorp＜０）を基礎とすること を示す。 実施例５ アルキル化されたポリ（スチレン−ジビニルベンゼン）ビーズでの分離 溶離液を、溶出溶媒の脱着能力をＤＮＡ−対イオン複合体に対するビーズの誘 引特性に合致させるように選択する。ビーズの極性が減少するにつれて、より強 い（より有機性の）もしくはより高濃度の溶媒が必要とされることができる。メ タノールのようなより弱い有機溶媒は、一般に、アセトニトリルのようなより強 い有機溶媒より高濃度で必要とされる。 図７は、オクタデシルで修飾された非多孔質のポリ（エチルビニルベンゼン− ジビニルベンゼン）ビーズを使用するＤＮＡ制限断片の高分離度の分離を示す。 この実験は以下の条件で実施した。すなわち、カラム：50×4.6mm直径；移動相0 .1MＴＥＡＡ、ｐＨ7.2；勾配：３分で33−55％アセトニトリル、７分で55−66％ アセトニトリル、2.5分間65％アセトニトリル；１分で65−100％アセトニトリル ；そして1.5分で100−35％アセトニトリル。流速は0.75mL／分であり、260nmの 検出ＵＶ、カラム温度51℃。サンプルは５μL（＝0.2μgのｐＵＣ１８ ＤＮＡ −ＨａｅIII消化物）であった。 0.1M（ＴＥＡＡ）中のアセトニトリルを50.0％メタノールで置き換えて図７の 手順を反復することは図８に示される分離を与えた。 0.1M（ＴＥＡＡ）中のアセトニトリルを25.0％エタノールで置き換えて図７の 手順を反復することは図９に示される分離を与えた。 0.1M（ＴＥＡＡ）中のアセトニトリルを25％ウオツカ（ストリクナヤ(Stlichn aya)、100プルーフ）で置き換えて図７の手順を反復すること は図１０に示される分離を与えた。 図１１に示される分離は、以下のようにオクタデシルで修飾された非多孔質の ポリ（エチルビニルベンゼン−ジビニルベンゼン）ビーズを使用して得た。すな わち、カラム：50×4.6mm直径；移動相0.1Mテトラエチル酢酸（ＴＥＡＡ）、ｐ Ｈ7.3；勾配：３分で12-18％0.1MＴＥＡＡおよび25.0％１−プロパノール（溶離 液Ｂ）、７分で18−22％Ｂ、2.5分間22％Ｂ；１分で22−100％Ｂ；そして1.5分 で100−12％Ｂ。流速は0.75mL／分であり、260nmの検出ＵＶ、およびカラム温度 51℃。サンプルは５μL（＝0.2μgのｐＵＣ１８ ＤＮＡ−ＨａｅIII消化物）で あった。 図１２に示される分離は、以下のようにオクタデシルで修飾された非多孔質の ポリ（エチルビニルベンゼン−ジビニルベンゼン）ビーズを使用して得た。すな わち、カラム：50×4.6mm直径；移動相0.1MＴＥＡＡ、ｐＨ7.3；勾配：２分で15 −18％0.1MＴＥＡＡおよび25.0％１−プロパノール（溶離液Ｂ）、８分で18-21 ％Ｂ、2.5分間21％Ｂ；１分で21−100％Ｂ；そして1.5分で100−15％Ｂ。流速は 0.75mL／分であり、260nmの検出ＵＶ、およびカラム温度51℃。サンプルは５μL （＝0.2μgのｐＵＣ１８ ＤＮＡ−ＨａｅIII消化物）であった。 図１３に示される分離は、以下のようにオクタデシルで修飾された非多孔質の ポリ（エチルビニルベンゼン−ジビニルベンゼン）ビーズを使用して得た。すな わち、カラム：50×4.6mm直径；移動相0.1MＴＥＡＡ、ｐＨ7.3；勾配：３分で35 −55％0.1MＴＥＡＡおよび10.0％２−プロパノール（溶離液Ｂ）、10分で55−65 ％Ｂ、2.5分間65％Ｂ；１分で65−100％Ｂ；そして1.5分で100−35％Ｂ。流速は 0.75mL／分であり、260nmの検出ＵＶ、およびカラム温度51℃。サンプルは５μL （＝0.2μgのｐ ＵＣ１８ ＤＮＡ−ＨａｅIII消化物）であった。 図１４に示される分離は、以下のようにオクタデシルで修飾された非多孔質の ポリ（エチルビニルベンゼン−ジビニルベンゼン）ビーズを使用して得た。すな わち、カラム：50×4.6mm直径；移動相0.1MＴＥＡ2ＨＰＯ4、ｐＨ7.3；勾配：３ 分で35−55％0.1MＴＥＡ2ＨＰＯ4および10.0％２−プロパノール（溶離液Ｂ）、 ７分で55−65％Ｂ、2.5分間65％Ｂ；１分で65−100％Ｂ；そして1.5分で100−65 ％Ｂ。流速は0.75mL／分であり、260nmの検出ＵＶ、およびカラム温度51℃。サ ンプルは５μL（＝0.2μgのｐＵＣ１８ ＤＮＡ−ＨａｅIII消化物）であった。 図１５に示される分離は、以下のようにオクタデシルで修飾された非多孔質の ポリ（エチルビニルベンゼン−ジビニルベンゼン）ビーズを使用して得た。すな わち、カラム：50×4.6mm直径；移動相0.1MＴＥＡＡ、ｐＨ7.3；勾配：３分で６ −９％0.1MＴＥＡＡおよび25.0％ＴＨＦ（溶離液Ｂ）、７分で９−11％Ｂ、2.5 分間11％Ｂ；１分で11−100％Ｂ；そして1.5分で100−６％Ｂ。流速は0.75mL／ 分であり、260nmの検出ＵＶ、およびカラム温度51℃。サンプルは５μL（＝0.2 μgのｐＵＣ１８ ＤＮＡ−ＨａｅIII消化物）であった。 実施例６ ｄｓＤＮＡのアイソクラチック／勾配分離 以下は、非多孔質のポリ（スチレン−ジビニルベンゼン）ビーズを使用するｄ ｓＤＮＡのアイソクラチック／勾配分離である。アイソクラチック分離は、ビー ズに対するＤＮＡ／アルキルアンモニウムイオン対の選択性の大きな差異のため 、ＤＮＡ分離で実施されていない。しかしながら、勾配およびアイソクラチック 溶出条件の組み合わせを使用すること により、系の分離力が特定の大きさ範囲のＤＮＡについて高められ得る。例えば 、250〜300塩基対の範囲が、50×4.6mmの架橋ポリ（スチレン−ジビニルベンゼ ン）カラム、2.1ミクロンで、40℃で0.75mL／分で0.1MＴＥＡＡおよび14.25％ア セトニトリルの溶離液を使用することにより標的にされ得る。５μLのｐＵＣ１ ８ ＤＮＡ−ＨａｅIII消化物（0.2μg）をアイソクラチック条件下で注入し、 そして257、267および298塩基対のＤＮＡが、図１６に示されるとおり完全に分 離されて溶出した。その後、カラムを、９分で0.1MＴＥＡＡ／25％アセトニトリ ルでより大きな断片を一掃した。他の例では、初期のアイソクラチック段階（カ ラムの調子を整える(condition)ため）、その後勾配段階（特定の大きさの第一 群のＤＮＡを除去するもしくは標的にするため）、その後アイソクラチック段階 （異なる大きさ範囲の標的物質を分離するため）、そして最後にカラムを浄化す るための勾配段階が存在しうる。 実施例７ ポリ（スチレン−ジビニルベンゼン）ポリマービーズの表面上の残存する二重結 合の臭素化 50.0gのポリ（スチレン−ジビニルベンゼン）ポリマービーズを500gの四塩化 炭素に懸濁した。懸濁液を、（取りつけられた還流冷却器、分離漏斗および頭上 攪拌機をもつ）1000mLのガラス製反応器中に移した。混合物を20℃に保った。臭 素（100mL）を20分の期間にわたって添加した。添加が完了した後に攪拌を60分 間継続した。温度を50℃に上昇させて反応を完了させた（２時間）。 ポリマービーズを四塩化炭素および過剰の臭素から遠心分離によって分離し、 そしてテトラヒドロフラン（100mLで１回）およびメタノール （100mLで２回）で清浄にした。ポリマービーズを40℃で乾燥した。 このポリマービーズを50×4.6mm直径のカラムに充填し、そしてＤＮＡ分離係 数は実施例３の手順により試験される際に0.05より大きい。 実施例８ ポリ（スチレン−ジビニルベンゼン）ポリマービーズのニトロ化 1000mLのガラス製反応器中で、150mLの濃硝酸（65％）を100mLの濃硫酸と合わ せた。酸混合物を０〜４℃に冷却した。温度が＜４℃に低下した場合に50gのポ リ（スチレン−ジビニルベンゼン）ポリマービーズを継続的攪拌下にゆっくりと 添加した。添加が完了した後に50mLの硝酸（65％）を添加した。懸濁液を、５〜 10℃の温度を維持し、３時間攪拌した。 次の日に、反応を、氷を懸濁液に添加することによりクエンチした。ポリマー ビーズを遠心分離によって酸から分離した。ポリマービーズを、水、次いでテト ラヒドロフラン（100mLで４回）およびメタノール（100mLで４回）での洗浄段階 で、中性まで洗浄した。ポリマービーズを40℃で乾燥した。 このポリマービーズを50×4.6mm直径のカラムに充填し、そしてＤＮＡ分離係 数は実施例３の手順により試験される際に0.05より大きい。 前述は本発明の特定の態様を提示した一方、これらの態様は例のみとして提示 されたことが理解されるべきである。他者が、前述と異なるとは言え本明細書に 記述されかつ特許請求されるような本発明の技術思想および範囲から離れない変 形物を認めかつ実施することができることが期待される。Description: FIELD OF THE INVENTION The present invention is directed to the separation of polynucleotides using non-porous polymer beads. BACKGROUND OF THE INVENTION Separation of polynucleotides such as DNA has traditionally been performed using slab gel electrophoresis or capillary electrophoresis. However, liquid chromatography separations of polynucleotides have become more important due to the ability to automate the analysis and collect fractions after they have been separated. Therefore, columns for polynucleotide separation by liquid chromatography (LC) have become more important. High quality materials for the separation of double-stranded DNA were based on polymeric carriers previously disclosed in US Patent No. 5,585,236 to Bonn et al. Shows that DNA can be separated on a size basis with selectivity and performance similar to gel electrophoresis using a method characterized as reverse phase ion pairing chromatography (RPIP C). Was. However, the described chromatographic materials were limited to non-porous beads substituted with alkyl groups having at least three carbons. Bonn et al. Were unsuccessful in obtaining separations using polymer beads lacking this substitution. In addition, the polymer beads were restricted to a small group of vinyl aromatic monomers, and Bonn et al. Were unable to effect double-stranded DNA separation with other materials. There remains a need for chromatographic methods to separate polynucleotides with improved separation efficiency and resolution. SUMMARY OF THE INVENTION Accordingly, one object of the present invention is to provide a chromatographic method for separating polynucleotides with improved separation and efficiency. It is another object of the present invention to provide a method for separating polynucleotides using non-porous polymer beads having a non-reactive non-polar surface. It is another object of the present invention to provide a chromatographic separation of polynucleotides using non-porous polymer beads made from a variety of different polymerizable monomers. It is a further object of the present invention to provide a chromatographic separation of polynucleotides using polymer beads that can be unsubstituted, methyl substituted, ethyl substituted, hydrocarbon substituted or hydrocarbon polymer substituted. It is yet another object of the present invention to provide improved polymer beads by including a step for removing contamination that occurs during the manufacturing process. It is yet another object of the present invention to provide a method for separating polynucleotides using a variety of different solvent systems. These and other objects of the present invention, which will become apparent from the following specification, have been achieved by the present invention. In short, the method of the invention for separating a mixture of polynucleotides comprises flowing a mixture of polynucleotides having up to 1500 base pairs through a separation column containing beads having an average diameter of 0.5 to 100 microns; and Separating the mixture of polynucleotides using Matched Ion Polynucleotide Chromatography (as defined below). The beads are preferably mono- and divinyl-substituted aromatic compounds such as styrene, substituted styrene, α-substituted styrene and divinylbenzene; acrylates and methacrylates; polyolefins such as polypropylene and polyethylene; polyesters; And polymers including substituted polymers, including fluoro-substituted ethylene, universally known under the trademark TEFLON. The base polymer can also be a mixture of polymers, non-limiting examples of which include poly (styrene-divinylbenzene) and poly (ethylvinylbenzene-divinylbenzene). The polymer can be unsubstituted or substituted with a moiety selected from the group consisting of methyl, ethyl, hydrocarbon or hydrocarbon polymers. Hydrocarbon polymers optionally have from 23 to 1,000,000 carbons. The beads preferably have an average diameter of about 1-5 microns. In a preferred embodiment, precautions are taken so that they are essentially free of polycationic contaminants and the beads are treated to remove any residual surface metal contaminants, for example by an acid wash treatment. Taken during the manufacture of the beads. The beads of the invention are characterized by having a DNA separation factor of at least 0.05 (as defined below). In a preferred embodiment, the beads have a DNA separation factor of at least 0.5. In addition to the essentially metal-free beads themselves, we have found that to achieve optimal peak separation, the separation column, and the total process solution retained within or flowing through the column, It has also been found that it should be essentially free of multivalent cation contaminants. This is to ensure that the solution entering the separation column is free of materials that do not release polyvalent cations into the process solution retained within or flowing through the column to protect the column from polyvalent cation contamination. This can be accomplished by supplying and feeding components having the created process solution contact surface. The process solution contact surface of the components of the system is preferably a material selected from the group consisting of titanium, coated stainless steel and organic polymers. For additional protection, polyvalent cations in the eluent solution and sample solution entering the column may be added to the solution before entering the column to protect the resin bed from polycation contamination. Can be removed by contact with a polyvalent cation capture resin. The polyvalent capture resin is preferably a cation exchange resin and / or a chelate resin. The method of the invention can be used to separate double-stranded polynucleotides having from about 1500 to 2000 base pairs. Often, the method is used to separate polynucleotides having up to 600 bases or base pairs, or having from 5 to 80 bases or base pairs. The mixture of polynucleotides can be a polymerase chain reaction product. The method is performed at a temperature in the range of 20 ° C to 90 ° C to produce a back pressure of no more than 5000 psi. The method also preferably employs an organic solvent that is water soluble. This solvent is preferably selected from the group consisting of alcohols, nitriles, dimethylformamide, esters and ethers. The method also preferably employs a counter ionic agent selected from trialkylamine acetate, trialkylamine carbonate and trialkylamine phosphate. The most preferred counterion agent is triethylammonium acetate or triethylammonium hexafluoroisopropyl alcohol. In another aspect, the invention provides polymer beads having an average bead diameter of 0.5 to 100 microns. Precautions are taken during the manufacture of the beads so that they are essentially free of polycationic contaminants and the beads are treated, for example by an acid wash treatment, to remove any residual surface metal contaminants. To be taken. In one embodiment, the beads have a DNA separation factor of at least 0.05. In a preferred embodiment, the beads have a DNA separation factor of at least 0.5. The beads preferably have an average diameter of about 1 to 10 microns, and most preferably have an average diameter of about 1 to 5 microns. The beads may be composed of a copolymer of a vinyl aromatic monomer. The vinyl aromatic monomer can be styrene, alkyl substituted styrene, α-methyl styrene or alkyl substituted α-methyl styrene. Beads are styrene, C 1-6 It can be a copolymer, such as a copolymer of alkyl vinyl benzene and divinyl benzene. The beads may contain functional groups such as polyvinyl alcohol, hydroxy, nitro, halogen (eg, bromo), cyano, aldehyde, or other groups that do not bind the sample. The beads may not be substituted or may be substituted with moieties such as methyl, ethyl, hydrocarbon or hydrocarbon polymer. In a preferred embodiment, the beads are poly (ethylvinylbenzene-divinylbenzene) or poly (styrene-divinylbenzene) modified with octadecyl. The beads may also contain a crosslinkable divinyl monomer such as divinylbenzene or butadiene. BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS FIG. 1 is a schematic representation of how the DNA separation factor is measured. FIG. 2 is a MIPC separation of pUC18 DNA-HaeIII digested fragment on a column containing alkylated poly (styrene-divinylbenzene) beads. The peaks are labeled with the number of base pairs of the eluted fragment. FIG. 3 is a MIPC separation of pUC18 DNA-HaeIII digested fragment on a column containing non-porous 2.1 micron beads of underivatized poly (styrene-divinylbenzene). FIG. 4 shows 1 nk vs. 1 / T [° K] on alkylated poly (styrene-divinylbenzene) beads showing positive enthalpy using acetonitrile as solvent. -1 ] Is a Fant-Hoff plot. FIG. 5 shows 1 nk versus 1 / T [° K] on underivatized poly (styrene-divinylbenzene) beads showing positive enthalpy using acetonitrile as solvent. -1 ] Is a Fant-Hoff plot. FIG. 6 shows 1 nk vs. 1 / T [° K] on alkylated poly (styrene-divinylbenzene) beads showing negative enthalpy using methanol as the solvent. -1 7] is a Fantohoff plot of FIG. FIG. 7 is a separation using alkylated beads and acetonitrile as the solvent. FIG. 8 is a separation using alkylated beads and 50.0% methanol as solvent. FIG. 9 is a separation using alkylated beads and 25.0% ethanol as solvent. FIG. 10 is a separation using alkylated beads and 25.0% vodka (100 proof) as solvent. FIG. 11 is a separation using alkylated beads and 25.0% 1-propanol as solvent. FIG. 12 is a separation using alkylated beads and 25.0% 1-propanol as solvent. FIG. 13 is a separation using alkylated beads and 10.0% 2-propanol as solvent. FIG. 14 is a separation using alkylated beads and 10.0% 2-propanol as solvent. FIG. 15 is a separation using alkylated beads and 25.0% THF as solvent. FIG. 16 is the isocratic / gradient separation of the combination with unalkylated poly (styrene-divinylbenzene) beads. DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION In its most general form, the subject of the present invention is non-porous polymer beads having an average diameter of about 0.5-100 microns; preferably 1-10 microns; more preferably 1-5 microns. Separation of polynucleotides utilizing packed columns. Most preferred are beads having an average diameter between 1.0 and 3.0 microns. In US Pat. No. 5,585,236, Bonn et al. Characterized this method of nucleic acid separation as reversed-phase ion-pairing chromatography (RPIPC). However, another term, Matched Ion Polynucleotide Chromatography (MIPC) was chosen because RPIPC does not incorporate certain essential features described in this invention. MIPC, as used herein, is defined as a method of separating single- and double-stranded polynucleotides using non-polar beads, where the method comprises separating a counter-ionic agent, and nucleic acid from the beads. An organic solvent is used for desorption, where the beads are characterized as having a minimum DNA separation factor of 0.05. In one preferred embodiment, the beads have a DNA separation factor of at least 0.5. In one optimal embodiment, the beads have a DNA separation factor of at least 0.95. The performance of the beads of the invention is demonstrated by high efficiency MIPC separation of double- and single-stranded DNA. We have found that the best criterion for measuring bead performance is the DNA separation factor. It is measured as the resolution of a 257 and 267 base pair double stranded DNA fragment of the pUC18 DNA-Hae III restriction digest, where the distance from the valley between peaks to the top of one of the peaks is the baseline ( Over the distance from the baseline e) to the valley. Referring to the schematic representation of FIG. 1, the DNA separation factor is the distance “a” from the baseline to the valley “e” between peaks “b” and “c” and the peak “b” from the valley “e”. Alternatively, it is determined by measuring the distance “d” to one of the peaks of “c”. If the peak heights are not equal, the highest peak is used to get "d". The DNA separation factor is the ratio of d / (a + d). The peaks at 257 and 267 base pairs in this diagram are similar in height. The operational beads of the present invention have a minimum DNA separation factor of 0.05. Preferred beads have a minimum DNA separation factor of 0.5. Without wishing to be bound by theory, we believe that beads according to the DNA separation factor as specified herein have pore sizes that essentially exclude the polynucleotides being separated from entering the beads. Think about it. The term "non-porous" as used herein has a surface pore with a diameter smaller than the smallest DNA fragment size and shape upon separation in the solvent medium used therein. It is defined to indicate beads. Polymer beads that have these specified maximum size limits in their native state or that have been treated to reduce their pore size to meet the required maximum effective pore size are defined in this definition. Included. Preferably, all beads providing a DNA separation factor of at least 0.05 are intended to be included within the definition of "non-porous" beads. The conformation of the surface of the non-porous beads of the present invention may include depressions and shallow pit-like structures that do not interfere with the separation process. Pretreatment of the porous beads to make it non-porous can be accomplished with any material that can fill the pores in the bead structure and does not significantly interfere with the MIPC process. The pores are open structures through which eluents and other substances can enter the bead structure. The holes are often interconnected such that liquid entering one hole can exit another. We believe that interconnected pore structures and pores with dimensions that allow the transfer of polynucleotides into the beads impair the resolution of the separation or result in separations with very long retention times . However, in MIPC, the beads are "non-porous" and the polynucleotide does not enter the bead structure. The term polynucleotide is defined as a linear polymer containing an undefined number of nucleotides linked from one ribose (or deoxyribose) to another via phosphate residues. The invention can be used in the separation of RNA or double- or single-stranded DNA. For purposes of simplicity and not by way of limitation, the separation of double-stranded DNA can be described in the examples herein, and all polynucleotides are included within the scope of the present invention. It is understood that this is intended to be done. The chromatographic efficiency of column beads is mainly influenced by the properties of the surface and near-surface regions. For this reason, the following description especially relates to the close-to-the-surface region of the polymer beads. The body and / or center of such beads can represent a completely different set of chemical and physical properties than those observed at or near the surface of the polymer beads of the invention. The non-porous polymer beads of the present invention are made by a two-step process, wherein small seed beads are first made by emulsion polymerization of a suitable polymerizable monomer. The procedure of the emulsion polymerization of the present invention is described in Goodwin et al. (JW. Goodwin, J. Hearn, CC. Ho and RH. Ottweill, Colloid & Polymer Sci. , (1974), 252: 464-471). Monomers that can be used in the emulsion polymerization step to produce seed beads include styrene, alkyl substituted styrene, α-methyl styrene and alkyl substituted α-methyl styrene. The seed beads are then expanded and optionally modified by substitution with various groups to yield the non-porous polymer beads of the invention. Seed beads produced by emulsion polymerization can be expanded by any known method for increasing the size of polymer beads. For example, polymer beads can be expanded by the activated swelling process disclosed in US Pat. No. 4,563,510. The expanded or swollen polymer beads are further swollen with a crosslinkable polymerizable monomer and a polymerization initiator. Polymerization increases the crosslink density of the expanded polymer beads and reduces the surface porosity of the beads. Suitable crosslinking monomers contain a minimum of two carbon-carbon double bonds that can be polymerized in the presence of an initiator. Preferred crosslinking monomers are divinyl monomers, preferably alkyl and aryl (phenyl, naphthyl, etc.) divinyl monomers, and include divinylbenzene, butadiene, and the like. Activated swelling of the polymer seed beads is useful for producing polymer beads having an average diameter ranging from 1 to about 100 microns. Alternatively, the polymer seed beads can be expanded simply by heating the seed latex resulting from the emulsion polymerization. This alternative eliminates the requirement for activated swelling of the seed beads with the activating solvent. Alternatively, the seed latex is mixed with the crosslinking monomer and polymerization initiator described above, with or without a water-miscible solvent for the crosslinking monomer. Suitable solvents include acetone, tetrahydrofuran (THF), methanol and dioxane. The resulting mixture is heated for about 1 to 12 hours, preferably about 4 to 8 hours, at a temperature below the initiation temperature of the polymerization initiator, generally about 10 ° C to 80 ° C, preferably 30 ° C to 60 ° C. In some cases, the temperature of the mixture can be increased by 10-20% and the mixture can be heated for an additional 1-4 hours. The ratio of monomer to polymerization initiator is at least 100: 1, preferably from about 100: 1 to about 500: 1, more preferably about 200: 1, to ensure a degree of polymerization of at least 200. Beads having this degree of polymerization are sufficiently pressure stable to be used in high pressure liquid chromatography (HPLC) applications. This thermal swelling process allows the size of the beads to be increased by about 110-160% to obtain polymer beads having an average diameter of up to about 5 microns, preferably about 2-3 microns. Thermal swelling methods can therefore be used to produce smaller particle sizes previously only achievable by an activated swelling procedure. After thermal expansion, excess crosslinking monomer is removed and the particles are polymerized by exposure to ultraviolet light or heat. The polymerization can be carried out, for example, by heating the expanded particles to the activation temperature of the polymerization initiator and continuing the polymerization until the desired degree of polymerization is achieved. Continued heating and polymerization makes it possible to obtain beads having a degree of polymerization of more than 500. In the present invention, can the packing material disclosed by Bonn et al. Or U.S. Patent No. 4,563,510 be modified by replacement of polymer beads with methyl or ethyl groups or hydrocarbon polymer groups? , Or in its unmodified state. Polymer beads can be alkylated at one or two carbon atoms by contacting the beads with an alkylating agent such as methyl iodide or ethyl iodide. Alkylation is achieved by mixing the polymer beads with an alkyl halide in the presence of a Friedel-Crafts catalyst to effect electrophilic aromatic substitution at the aromatic ring on the surface of the polymer blend. Suitable Friedel-Crafts catalysts are known in the art and include Lewis acids such as aluminum chloride, boron trifluoride, tin tetrachloride, and the like. The beads can be hydrocarbon-substituted, for example, by using the corresponding hydrocarbon halide in place of methyl iodide in the procedure above. The term "hydrocarbon" as used herein is defined to include alkyl and alkyl-substituted aryl groups having from 23 to 1,000,000 carbons, where the alkyl group is an aldehyde, ketone, ester, Various types of linear, branched, cyclic, saturated, unsaturated, non-ionic functional groups including ethers, alkyl groups and the like are included, and aryl groups are simple groups including phenyl, naphthyl and the like. Such as ring, bicyclic and tricyclic aromatic hydrocarbon groups are included. Methods for hydrocarbon substitution are conventional and known in the art, and are not an aspect of the present invention. Substitutions can also contain hydroxy, cyano, nitro groups, and the like, which are considered to be non-polar reverse-phase functional groups. The term "hydrocarbon polymer" as used herein is defined as a polymer having a certain hydrocarbon composition and from 23 to 1,000,000 carbons. Chromatographic materials reported in the Bonn patent were limited to non-porous beads substituted with alkyl groups having at least three carbons. Bonn et al. Were unsuccessful in obtaining separations using polymer beads lacking this substitution. In addition, the polymer beads were restricted to a small group of vinyl aromatic monomers, and Bonn et al. Were unable to effect double-stranded DNA separation with other materials. In the present invention, now, surprisingly, the successful separation of double-stranded DNA has been derivatized using non-porous non-porous beads and with methyl, ethyl, hydrocarbon or hydrocarbon polymer substitution. It has been discovered that this can be achieved using beads. The base polymer of the present invention can also be other polymers, non-limiting examples of which include mono- and divinyl-substituted aromatic compounds such as styrene, substituted styrene, α-substituted styrene and divinylbenzene; acrylates and methacrylates; Polyesters such as polyethylene; polyesters; polyurethanes; polyamides; polycarbonates; and substituted polymers, including fluoro-substituted ethylene, commonly known under the trademark TEFLON. The base polymer can also be a mixture of polymers, non-limiting examples of which include poly (styrene-divinylbenzene) and poly (ethylvinylbenzene-divinylbenzene). Methods for making beads from these polymers are conventional and known in the art (see, for example, US Pat. No. 4,906,378). The physical properties of the surface and near-surface regions of the beads are the primary influence on chromatographic efficiency. The polymer, whether derivatized or not, must provide a non-porous, non-reactive and non-polar surface for matched ion polynucleotide chromatography separations. The beads of the invention are also characterized by having a low amount of metal or other contaminants that can bind DNA. Preferred beads of the present invention are decontaminated, such as acid wash treatments designed to essentially eliminate any polyvalent contaminants (eg, Fe (III), Cr (III) or colloidal metal contaminants). It is characterized by being subjected to precautionary measures during manufacture, including processing. Only very pure non-metal-containing materials should be used in the production of beads, since the resulting beads can have a minimal metal content. In addition to the essentially metal-free beads themselves, to achieve optimal peak separation during MIPC, we use a separation column and the total amount of particles retained or flowing through the column. It has also been found that the process solution should be essentially free of polyvalent cation contaminants. As described in commonly owned, co-pending US Patent Application No. 80 / 748,376 (filed November 13, 1996), this is to protect the column from polycation contamination. The solution entering the separation column is provided with a component having a process solution contacting surface made from a material that does not release polyvalent cations in the process solution held in or flowing through the column (supply ) And feed. The process solution contact surface of the components of the system is preferably a material selected from the group consisting of titanium, coated stainless steel, passivated stainless steel and organic polymers. For additional protection, polyvalent cations in the eluent solution and sample solution entering the column may be added to the solution before entering the column to protect the resin bed from polycation contamination. Can be removed by contact with a polyvalent cation capture resin. The polyvalent capture resin is preferably a cation exchange resin and / or a chelate resin. To achieve high resolution chromatographic separation of polynucleotides, it is generally necessary that the chromatography column be packed tightly with solid phase polymer beads. Any known method of packing a column with column packing material can be used in the present invention to obtain a sufficiently high resolution separation. Typically, a slurry of polymer beads is prepared using a solvent having a density equal to or less than the density of the polymer beads. The column is then filled with a slurry of polymer beads and shaken or agitated to increase the packing density of the polymer beads in the column. Mechanical vibration or sonication is typically used to increase the packing density. For example, to pack a 50 x 4.6 mm diameter column, 2.0 grams of beads can be suspended in 10 mL of methanol with the aid of sonication. This suspension is then loaded onto the column using 50 mL of methanol at a pressure of 8,000 psi. This increases the density of the packed bed. The separation method of the present invention is generally applicable to chromatographic separation of single- and double-stranded polynucleotides of DNA and RNA. A sample containing a mixture of polynucleotides may include total synthesis of polynucleotides, cleavage of DNA or RNA with restriction endonucleases or other enzymes or chemicals, and nucleic acid samples grown and amplified using polymerase chain reaction techniques. From. The method of the invention can be used to separate double-stranded polynucleotides having from about 1500 to 2000 base pairs. In many cases, the method is used to separate polynucleotides having up to 600 bases or base pairs, or having from 5 to 80 bases or base pairs. In a preferred embodiment, the separation is by matched ion polynucleotide chromatography (MIPC). The non-porous beads of the present invention are used as a reversed phase material that can function with a counterion agent and a solvent gradient to effect DNA separation. In MIPC, a polynucleotide is paired with a counterion and then subjected to reverse phase chromatography using the non-porous beads of the invention. Trialkylamine acetate, trialkylamine carbonate, trialkylamine phosphate (TEAAHPO Four ) Are preferred for use in the method of the invention, with triethylammonium acetate (TEAA) and triethylammonium hexafluoroisopropyl alcohol being most preferred. To achieve optimal peak resolution during the separation of DNA by MIPC using the beads of the invention, the method is preferably carried out at 20 ° C to 90 ° C; more preferably at 30 ° C to 80 ° C; It is preferably carried out at a temperature in the range from 50 ° C to 75 ° C. 14． The temperature is selected to produce a back pressure not exceeding 5000 psi. Generally, separation of single-stranded fragments should be performed at higher temperatures. We have found that the temperature at which the separation is performed affects the choice of solvent used in the separation. One reason is that the solvent dissolves so that the double-stranded DNA forms two single-stranded, or one partially melted complex of single- and double-stranded DNA. Is to affect the temperature at which it can occur. Some solvents can stabilize the dissolved structure better than others. Another reason solvent is important is that it affects the transport of DNA between the mobile and stationary phases. Acetonitrile and 1-propanol are the preferred solvents in these cases. Finally, the toxicity (and cost) of the solvent can be important. In this case, methanol is preferred over acetonitrile, and 1-propanol is preferred over methanol. If the separation is carried out at a temperature in the above range, organic solvents which are water-soluble, such as alcohols, nitriles, dimethylformamide (DMF), tetrahydrofuran (THF), esters and ethers are preferably used. A water-soluble solvent is defined as existing as a single phase with an aqueous system under all conditions of the operation of the present invention. Particularly preferred solvents for use in the method of the present invention include methanol, ethanol, 2-propanol, 1-propanol, tetrahydrofuran (THF) and acetonitrile, with acetonitrile as a whole being most preferred. We have found that chromatographic separation of double-stranded DNA fragments has a unique sorption enthalpy (ΔH sorp ). Two compounds, in this case different sized DNA fragments, can only be separated if they have different partition coefficients (K). The Nernst partition coefficient is defined as the concentration (A) of an analyte in the stationary phase divided by its concentration in the mobile phase. Ie The distribution coefficient (K) and the retention coefficient (k) are given by the following equations: Quotient V m / V s Is also called the phase volume ratio (Φ). Therefore: k = KΦ To calculate the sorption enthalpy, the following basic thermodynamic equations are needed. Ie By transforming the last two equations, we find the Van Hoff equation: Get. From the plot 1nk vs. 1 / T, the sorption enthalpy ΔH sorp Can be obtained from the slope of the graph (if a straight line is obtained). ΔS sorp Can be calculated if the phase volume ratio (Φ) is known. The sorption enthalpy is positive (ΔH sorp > 0), indicating that this separation is endothermic using acetonitrile as the solvent (FIGS. 3 and 4), and using methanol as the solvent, the sorption enthalpy ΔH sorp Is negative (ΔH sorp <0), indicating that this separation is exothermic (FIG. 5). Thermodynamic data (as shown in the examples below) shows the relative affinity of the DNA-counter ion agent conjugate for the beads and elution solvents of the invention. The endothermic plot shows the DNA complex preference for the beads. The exothermic reaction plot shows the preference of DNA complex over beads versus solvent. The plots shown herein are for alkylated and non-alkylated surfaces as described in the examples. Most liquid chromatographic separations show an exothermic plot. Other features of the present invention may become apparent during the following description of exemplary embodiments, which are provided for purposes of describing the present invention and are not intended to be a limitation thereof. All references cited herein are hereby incorporated by reference in their entirety. The treatment described in the past tense in the examples below was performed in the laboratory. The procedures described in the present tense have not yet been performed in the laboratory and have been reduced in configuration to perform in the present application. Example 1 Preparation of non-porous poly (styrene-divinylbenzene) particles Sodium chloride (0.236 g) was added to 354 mL of deionized water in a reactor having a volume of 1.0 liter. The reactor was equipped with a mechanical stirrer, reflux condenser and gas inlet tube. The dissolution of sodium chloride was carried out under an inert atmosphere (argon) assisted by stirring (350 rpm) and at elevated temperature (87 ° C.). 0.2184 g of potassium peroxodisulfate (K) dissolved in freshly distilled styrene (33.7 g) and 50 mL of deionized water Two S Two O 8 ) Was then added. Immediately after these additions, the gas inlet tube was withdrawn from the solution and positioned above the liquid surface. The reaction mixture was then stirred at 87 ° C. for 6.5 hours. After this, the reactor contents were cooled to ambient temperature and diluted to a volume that resulted in a concentration of 54.6 g of polymerized styrene in a 1000 mL volume suspension resulting from the first stage. The amount of polymerized styrene in 1000 mL was calculated to include the amount of polymer still attached to the mechanical stirrer (approximately 5-10 g). The diameter of the spherical beads in the suspension was determined to be about 1.0 micron by light microscopy. The beads resulting from the first stage are generally still too small and too soft (low pressure stability) for use as chromatography packing. The softness of these beads is caused by an insufficient degree of crosslinking. In the second step, the beads are expanded and the degree of crosslinking is increased. The second stage protocol is based on the activated swelling method described by Ugelstad et al. (Adv. Colloid Interface Sci., 13: 101-140 (1980)). To initiate the activated swelling or second synthesis step, add an aqueous suspension (200 ml) of the polystyrene seed from the first step, first with 60 ml acetone, and then 60 ml 1-chlorododecane emulsion And mixed. To prepare this emulsion, 0.206 g sodium dodecyl sulfate, 49.5 mL deionized water and 10.5 ml 1-chlorododecane were brought together and the resulting mixture was kept at 0 ° C. for 4 hours, It was then mixed by sonication during the entire period of time until a fine emulsion of <0.3 microns was obtained. The mixture of polystyrene seed, acetone and 1-chlorododecane emulsion was stirred at room temperature for about 12 hours, during which time swelling of the beads occurred. Thereafter, acetone was removed by distillation at 80 ° C. for 30 minutes. After removal of the acetone, the swollen beads were further grown by adding 310 g of a mixture of ethyldivinylbenzene and divinylbenzene (DVB) (1: 1.71), which also contained 2.5 g of dibenzoyl peroxide as an initiator. . Growth occurred with stirring and occasional particle size measurements by light microscopy. After completion of the swelling and growth stages, the reaction mixture was transferred to a separatory funnel. In unstirred solution, excess monomer was separated from the layer containing the suspension of polymer beads and could easily be separated accordingly. The remaining suspension of beads is returned to the reactor and subjected to a stepwise increase in temperature (63 ° C. for about 7 hours, 73 ° C. for about 2 hours, and 83 ° C. for about 12 hours), further increasing the degree of polymerization (> 500). Led to The pore size of beads produced in this manner was below the detection limit of mercury porosimetry (<30 °). After drying, the dried beads from step 2 (10 g) are washed four times with 100 ml of n-heptane and then twice with 100 ml of diethyl ether, 100 ml of dioxane and 100 ml of methanol each. did. Finally, the beads were dried. Example 2 Acid washing treatment The beads produced in Example 1 were washed three times with tetrahydrofuran and twice with methanol. Finally, the beads were stirred for 12 hours in a mixture containing 100 mL of tetrahydrofuran and 100 mL of concentrated hydrochloric acid. After this acid treatment, the polymer beads were washed with a mixture of tetrahydrofuran / water until neutral (pH = 7). The beads were then dried at 40 ° C. for 12 hours. Example 3 Standard Procedure for Testing the Performance of Separation Media Separation particles are packed into an HPLC column and tested for their ability to separate standard DNA mixtures. The standard mixture was a pUC18 DNA-HaeIII digest (Sigma-Aldrich (11) containing 11, 18, 80, 102, 174, 257, 267, 298, 434, 458 and 587 base pairs, respectively. Sigma-Aldrich), D62 93). Dilute the standard with water and inject 5 μL containing a total of 0.25 μg DNA. Depending on the loading volume and loading polarity, the procedure requires the choice of driving solvent concentration, pH and temperature. The separation conditions are adjusted so that the retention time of the 257, 267 peaks is about 6 to 10 minutes. Any one of the following solvents may be used: methanol, ethanol, 2-propanol, 1-propanol, tetrahydrofuran (THF) or acetonitrile. The counterion agent is selected from trialkylamine acetate, trialkylamine carbonate, trialkylamine phosphate or any other type of cation capable of forming a matched ion with the polynucleotide anion. I do. As an example of this procedure, FIG. 2 shows the high resolution of a standard DNA mixture using non-porous poly (ethylvinylbenzene-divinylbenzene) beads modified with octadecyl. This separation was performed under the following conditions. Eluent A: 0.1 M TEAA, pH 7.0; eluent B: 0.1 M TEAA, 25% acetonitrile; gradient: The flow rate is 0.75 mL / min, detection UV at 260 nm, column temperature 50 ° C. pH was 7.0. As another example of this procedure using the same separation conditions as in FIG. 2, FIG. 3 shows a standard DNA on a column containing non-porous 2.1 micron beads of underivatized poly (styrene-divinylbenzene). High resolution separation of the mixture. Example 4 Sorption Enthalpy Measurements Four fragments (174 bp, 257 bp, 267 bp and 298 bp, 0.04 μg DNA / μl found in 5 μl of pUC18 DNA-HaeIII digest) were converted to octadecyl modified non-porous poly. Separation under isocratic conditions at different temperatures using (styrene-divinylbenzene) polymer beads. Separations were performed under the following conditions using a Transgenomic Wave (TM) equipped with a DNASep ™ column (Transgenomic, Inc., San Jose, Calif.). ) It was performed using a DNA fragment analysis system. Eluent: 0.1 M triethylammonium acetate at 0.75 mL / min, 14.25% (v / v) acetonitrile, UV detection at 250 nm, temperatures of 35, 40, 45, 50, 55 and 60 ° C. respectively. The plot of 1 nk versus 1 / T shows that the retention factor k increases with increasing temperature (FIG. 4). This is because the holding mechanism is an endothermic reaction process (ΔH sorp > 0). The same experiment with unalkylated poly (styrene-divinylbenzene) beads gave a negative slope for the 1nk vs. 1 / T plot, although this plot was slightly curved (FIG. 5). The same experiment performed on non-porous poly (styrene-divinylbenzene) beads modified with octadecyl but with methanol replacing acetonitrile as the solvent shows that the retention factor k decreases with increasing temperature. A plot 1nk vs. 1 / T was given (FIG. 6). This is because the holding mechanism is an exothermic reaction process (ΔH sorp <0). Example 5 Separation on alkylated poly (styrene-divinylbenzene) beads The eluent is chosen so that the desorption capacity of the elution solvent matches the attractive properties of the beads for the DNA-counter ion complex. As the polarity of the beads decreases, stronger (more organic) or higher concentrations of solvent may be required. Weaker organic solvents, such as methanol, are generally required at higher concentrations than stronger organic solvents, such as acetonitrile. FIG. 7 shows high resolution separation of DNA restriction fragments using non-porous poly (ethylvinylbenzene-divinylbenzene) beads modified with octadecyl. This experiment was performed under the following conditions. Column: 50 × 4.6 mm diameter; mobile phase 0.1 M TEAA, pH 7.2; gradient: 33-55% acetonitrile in 3 minutes, 55-66% acetonitrile in 7 minutes, 65% acetonitrile in 2.5 minutes; 65 in 1 minute -100% acetonitrile; and 100-35% acetonitrile in 1.5 minutes. The flow rate is 0.75 mL / min, detection UV at 260 nm, column temperature 51 ° C. The sample was 5 μL (= 0.2 μg of pUC18 DNA-HaeIII digest). Replacing the procedure of FIG. 7 replacing acetonitrile with 50.0% methanol in 0.1M (TEAA) gave the separation shown in FIG. Replacing the procedure of FIG. 7 with replacement of acetonitrile in 0.1 M (TEAA) with 25.0% ethanol gave the separation shown in FIG. Replacing acetonitrile in 0.1 M (TEAA) with 25% vodka (Stlichnaya, 100 proof) and repeating the procedure of FIG. 7 gave the separation shown in FIG. The separation shown in FIG. 11 was obtained using non-porous poly (ethylvinylbenzene-divinylbenzene) beads modified with octadecyl as follows. Column: 50 × 4.6 mm diameter; mobile phase 0.1 M tetraethylacetic acid (TEAA), pH 7.3; gradient: 12-18% 0.1 M TEAA and 25.0% 1-propanol in 3 minutes (eluent B), 7 minutes 18-22% B at 2.5 minutes 22% B; 1 minute at 22-100% B; and 1.5 minutes at 100-12% B. The flow rate is 0.75 mL / min, detection UV at 260 nm, and column temperature 51 ° C. The sample was 5 μL (= 0.2 μg of pUC18 DNA-HaeIII digest). The separation shown in FIG. 12 was obtained using non-porous poly (ethylvinylbenzene-divinylbenzene) beads modified with octadecyl as follows. Column: 50 x 4.6 mm diameter; mobile phase 0.1 M TEAA, pH 7.3; gradient: 15-18% 0.1 M TEAA and 25.0% 1-propanol (eluent B) in 2 minutes, 18-21% B in 8 minutes. 21% B for 2.5 minutes; 21-100% B for 1 minute; and 100-15% B for 1.5 minutes. The flow rate is 0.75 mL / min, detection UV at 260 nm, and column temperature 51 ° C. The sample was 5 μL (= 0.2 μg pUC18 DNA-HaeIII digest). The separation shown in FIG. 13 was obtained using non-porous poly (ethylvinylbenzene-divinylbenzene) beads modified with octadecyl as follows. Column: 50 x 4.6 mm diameter; mobile phase 0.1 M TEAA, pH 7.3; gradient: 35-55% 0.1 M TEAA and 10.0% 2-propanol in 3 minutes (eluent B), 55-65% B in 10 minutes. 65% B for 2.5 minutes; 65-100% B for 1 minute; and 100-35% B for 1.5 minutes. The flow rate is 0.75 mL / min, detection UV at 260 nm, and column temperature 51 ° C. The sample was 5 μL (= 0.2 μg of pUC18 DNA-HaeIII digest). The separation shown in FIG. 14 was obtained using non-porous poly (ethylvinylbenzene-divinylbenzene) beads modified with octadecyl as follows. Column: 50 x 4.6 mm diameter; 0.1 MTEA mobile phase Two HPO Four PH 7.3; Gradient: 35-55% 0.1M TEA in 3 minutes Two HPO Four And 10.0% 2-propanol (eluent B), 55-65% B in 7 minutes, 65% B in 2.5 minutes; 65-100% B in 1 minute; and 100-65% B in 1.5 minutes. The flow rate is 0.75 mL / min, detection UV at 260 nm, and column temperature 51 ° C. The sample was 5 μL (= 0.2 μg of pUC18 DNA-HaeIII digest). The separation shown in FIG. 15 was obtained using non-porous poly (ethylvinylbenzene-divinylbenzene) beads modified with octadecyl as follows. Column: 50 x 4.6 mm diameter; mobile phase 0.1 M TEAA, pH 7.3; gradient: 6-9% 0.1 M TEAA and 25.0% THF in 3 minutes (eluent B), 9-11% B in 7 minutes, 2.5 11% B for 1 minute; 11-100% B for 1 minute; and 100-6% B for 1.5 minutes. The flow rate is 0.75 mL / min, detection UV at 260 nm, and column temperature 51 ° C. The sample was 5 μL (= 0.2 μg of pUC18 DNA-HaeIII digest). Example 6 Isocratic / Gradient Separation of dsDNA The following is an isocratic / gradient separation of dsDNA using non-porous poly (styrene-divinylbenzene) beads. Isocratic separation has not been performed in DNA separations due to the large difference in selectivity of DNA / alkylammonium ion pairs for beads. However, by using a combination of gradient and isocratic elution conditions, the separation power of the system can be enhanced for a particular size range of DNA. For example, a 50 x 4.6 mm crosslinked poly (styrene-divinylbenzene) column ranging from 250 to 300 base pairs, using 2.1 micron eluent of 0.1 M TEAA and 14.25% acetonitrile at 0.75 mL / min at 40 ° C. Can be targeted. 5 μL of the pUC18 DNA-HaeIII digest (0.2 μg) was injected under isocratic conditions, and 257, 267 and 298 base pairs of DNA were completely separated and eluted as shown in FIG. The column was then swept with larger fragments with 0.1 M TEAA / 25% acetonitrile in 9 minutes. In another example, an initial isocratic step (to condition the column), followed by a gradient step (to remove or target a first group of DNA of a particular size), followed by an isocratic step There may be a tick step (to separate target substances of different size ranges) and finally a gradient step to clean the column. Example 7 Bromination of residual double bonds on the surface of poly (styrene-divinylbenzene) polymer beads 50.0 g of poly (styrene-divinylbenzene) polymer beads were suspended in 500 g of carbon tetrachloride. The suspension was transferred into a 1000 mL glass reactor (with attached reflux condenser, separatory funnel and overhead stirrer). The mixture was kept at 20 ° C. Bromine (100 mL) was added over a period of 20 minutes. Stirring was continued for 60 minutes after the addition was complete. The temperature was raised to 50 ° C. to complete the reaction (2 hours). The polymer beads were separated from carbon tetrachloride and excess bromine by centrifugation and cleaned with tetrahydrofuran (1 x 100 mL) and methanol (2 x 100 mL). The polymer beads were dried at 40 ° C. The polymer beads are packed into a 50 x 4.6 mm diameter column and the DNA separation factor is greater than 0.05 when tested according to the procedure of Example 3. Example 8 Nitration of poly (styrene-divinylbenzene) polymer beads In a 1000 mL glass reactor, 150 mL of concentrated nitric acid (65%) was combined with 100 mL of concentrated sulfuric acid. The acid mixture was cooled to 0-4 ° C. When the temperature dropped to <4 ° C., 50 g of poly (styrene-divinylbenzene) polymer beads were added slowly with continuous stirring. After the addition was completed, 50 mL of nitric acid (65%) was added. The suspension was stirred for 3 hours, maintaining the temperature at 5-10 ° C. The next day, the reaction was quenched by adding ice to the suspension. The polymer beads were separated from the acid by centrifugation. The polymer beads were washed to neutrality with a wash step with water followed by tetrahydrofuran (4 × 100 mL) and methanol (4 × 100 mL). The polymer beads were dried at 40 ° C. The polymer beads are packed into a 50 x 4.6 mm diameter column and the DNA separation factor is greater than 0.05 when tested according to the procedure of Example 3. While the foregoing has presented specific embodiments of the present invention, it should be understood that these embodiments have been presented by way of example only. It is expected that others will be able to recognize and implement variations that do not depart from the spirit and scope of the invention as described and claimed herein, albeit different from the foregoing.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 30/48 Ｇ０１Ｎ 30/48 Ｄ Ｇ 30/88 30/88 Ｅ // Ｃ０８Ｆ 12/36 Ｃ０８Ｆ 12/36 36/00 36/00 (31)優先権主張番号 ６０／０６２，３２１ (32)優先日 平成９年10月17日(1997．10．17) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ６０／０６３，６２８ (32)優先日 平成９年10月27日(1997．10．27) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ６０／０６７，６７９ (32)優先日 平成９年12月５日(1997．12．5) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ６０／０７７，８７５ (32)優先日 平成10年３月13日(1998．3．13) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ０９／０５８，５８０ (32)優先日 平成10年４月10日(1998．4．10) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ， ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，Ｌ Ｓ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ， ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，Ｅ Ｅ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ， ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，Ｍ Ｄ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ， ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，Ｕ Ｚ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 テイラー，ポール・デイ アメリカ合衆国カリフオルニア州94301パ ロアルト・ホーソーンアベニユー248──────────────────────────────────────────────────続 き Continued on the front page (51) Int.Cl. 7 Identification symbol FI Theme coat ゛ (Reference) G01N 30/48 G01N 30/48 D G30 / 88 30/88 E // C08F 12/36 C08F 12/36 36/00 36/00 (31) Priority claim number 60 / 062,321 (32) Priority date October 17, 1997 (Oct. 17, 1997) (33) Priority claim country United States (US) (31) ) Priority claim number 60 / 063,628 (32) Priority date October 27, 1997 (Oct. 27, 1997) (33) Priority claim country United States (US) (31) Priority claim number 60/067 , 679 (32) Priority date December 5, 1997 (12.5 December 1997) (33) Priority claim country United States (US) (31) Priority claim number 60 / 077,875 (32) Priority date Heisei Heisei March 13, 1998 (March 13, 1998) (33) Priority claim country United States (US) (31) Priority claim number No. 09 / 058,580 (32) Priority date April 10, 1998 (1998.4.10) (33) Priority country United States (US) (81) Designated country EP (AT, BE, CH, CY) , DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LU, MC, NL, PT, SE), OA (BF, BJ, CF, CG, CI, CM, GA, GN, ML) , MR, NE, SN, TD, TG), AP (GH, GM, KE, LS, MW, SD, SZ, UG, ZW), EA (AM, AZ, BY, KG, KZ, MD, RU, TJ, TM), AL, AM, AT, AU, AZ, BA, BB, BG, BR, BY, CA, CH, CN, CU, CZ, DE, DK, EE, ES, FI, GB, GE, GH, GM, GW, HU, ID, IL, IS, JP, KE, KG, KP, KR, KZ, LC, LK, LR, LS, LT, L , LV, MD, MG, MK, MN, MW, MX, NO, NZ, PL, PT, RO, RU, SD, SE, SG, SI, SK, SL, TJ, TM, TR, TT, UA, UG, US, UZ, VN, YU, ZW (72) Inventor Taylor, Paul Day 248 Palo Alto Hawthorne Avenue, Calif., USA 248

Claims (1)

【特許請求の範囲】 １．ポリヌクレオチドの混合物の分離方法であって、1500までの塩基対を有する ポリヌクレオチドの混合物を、0.5ないし100ミクロンの平均直径を有するポリマ ービーズを含有する分離カラムを通して流すことを含んでなり、前記ビーズは、 未置換、メチル、エチル、炭化水素および炭化水素ポリマーから成る群から選択 される部分で本質的に完全に置換された表面組成を有し、かつ前記ビーズは最低 0.05のＤＮＡ分離係数を有することを特徴とし；そしてポリヌクレオチドの前記 混合物を分離することを含んで成る方法。 ２．前記ビーズが最低0.5のＤＮＡ分離係数を有することを特徴とする、請求の 範囲１の方法。 ３．前記ビーズが、メチル、エチル、炭化水素および炭化水素ポリマーから成る 群から選択される部分で置換され、前記炭化水素ポリマーが場合によっては23か ら1,000,000個までの炭素を有する、請求の範囲１の方法。 ４．前記部分が、ポリビニルアルコール、ヒドロキシ、ニトロ、ブロモ、シアノ およびアルデヒドから成る群から選択される官能基で置換される、請求の範囲３ の方法。 ５．前記分離が、マッチトイオンポリヌクレオチドクロマトグラフィーによる、 請求の範囲１の方法。 ６．前記ビーズが酸洗浄処理にかけられる、請求の範囲１の方法。 ７．前記ビーズが多価陽イオン汚染物質を本質的に含まない、請求の範囲１の方 法。 ８．前記ビーズが約１〜５ミクロンの平均直径を有する、請求の範囲１ の方法。 ９．前記ビーズが、モノおよびジビニル置換芳香族化合物、アクリレート、メタ クリレート、ポリオレフィン、ポリエステル、ポリウレタン、ポリアミド、ポリ カーボネートならびにフルオロ置換エチレンから選択されるポリマーから構成さ れる、請求の範囲１の方法。 １０．前記ビーズが炭化水素基もしくは置換炭化水素基で置換される、請求の範 囲１の方法。 １１．前記ポリヌクレオチドがＲＮＡを含んで成る、請求の範囲１の方法。 １２．前記ポリヌクレオチドがＤＮＡを含んで成る、請求の範囲１の方法。 １３．ポリヌクレオチドの前記混合物がポリメラーゼ連鎖反応産物である、請求 の範囲１の方法。 １４．前記方法が20℃ないし90℃の範囲内の温度で実施される、請求の範囲１の 方法。 １５．前記温度が5000psiを越えない背圧を生じるよう選択される、請求の範囲 １４の方法。 １６．前記方法が有機溶媒を使用し、前記有機溶媒が水溶性である、請求の範囲 １の方法。 １７．前記溶媒が、アルコール、ニトリル、ジメチルホルムアミド、テトラヒド ロフラン、エステルおよびエーテルから成る群から選択される、請求の範囲１６ の方法。 １８．ポリヌクレオチドの混合物が、酢酸トリアルキルアミン、炭酸トリアルキ ルアミンおよびリン酸トリアルキルアミンから選択される対イ オン剤を包含する、請求の範囲１の方法。 １９．対イオン剤が、酢酸トリエチルアンモニウムおよびトリエチルアンモニウ ムヘキサフルオロイソプロピルアルコールから選択される、請求の範囲１８の方 法。 ２０．0.5〜100ミクロンの平均ビーズ直径を有するポリマービーズ、および、最 低0.05のＤＮＡ分離係数を有することを特徴とする前記ビーズ。 ２１．前記ビーズが最低0.5のＤＮＡ分離係数を有する、請求の範囲２０のビー ズ。 ２２．前記ビーズが酸洗浄処理にかけられる、請求の範囲２０のビーズ。 ２３．前記ビーズが多価陽イオンを本質的に含まない、請求の範囲２０のビーズ 。 ２４．前記ビーズが約１〜10ミクロンの平均直径を有する、請求の範囲２０のビ ーズ。 ２５．前記ビーズが約１〜５ミクロンの平均直径を有する、請求の範囲２０のビ ーズ。 ２６．前記ビーズが、ビニル芳香族モノマーのコポリマーから構成される、請求 の範囲２０のビーズ。 ２７．前記ビニル芳香族モノマーが、スチレン、アルキル置換スチレン、α−メ チルスチレンおよびアルキル置換α−メチルスチレンから成る群から選択される 、請求の範囲２６のビーズ。 ２８．前記ビーズが、スチレン、Ｃ1-6アルキルビニルベンゼンおよびジビニル ベンゼンのコポリマーから構成される、請求の範囲２６のビーズ。 ２９．前記ビーズが、ポリビニルアルコール、ヒドロキシ、ニトロ、ブ ロモ、シアノおよびアルデヒドから成る群から選択される官能基で置換される、 請求の範囲２０のポリマービーズ。 ３０．前記ビーズが、メチル、エチル、炭化水素および炭化水素ポリマーから成 る群から選択される官能基で置換される、請求の範囲２０のビーズ。 ３１．前記ビーズが、ポリ（スチレン−ジビニルベンゼン）を含んで成る、請求 の範囲２０のビーズ。 ３２．前記ビーズが、モノおよびジビニル置換芳香族化合物、アクリレート、メ タクリレート、ポリオレフィン、ポリエステル、ポリウレタン、ポリアミド、ポ リカーボネートならびにフルオロ置換エチレンから選択されるポリマーを含んで 成る、請求の範囲２０のポリマービーズ。 ３３．前記ビーズが、メチル、エチル、炭化水素および炭化水素ポリマーから成 る群から選択される置換基で置換される、請求の範囲３２のポリマービーズ。 ３４．前記ビーズが、炭化水素および置換炭化水素から成る群から選択される置 換基で置換される、請求の範囲３２のポリマービーズ。 ３５．請求の範囲２０の、そしてジビニルベンゼンおよびブタジエンから選択さ れる架橋性のジビニルモノマーをさらに包含するビーズ。[Claims] 1. A method of separating a mixture of polynucleotides, comprising flowing a mixture of polynucleotides having up to 1500 base pairs through a separation column containing polymer beads having an average diameter of 0.5 to 100 microns. Has a surface composition essentially completely substituted with moieties selected from the group consisting of unsubstituted, methyl, ethyl, hydrocarbon and hydrocarbon polymers, and wherein the beads have a DNA separation factor of at least 0.05. And separating the mixture of polynucleotides. 2. The method of claim 1, wherein said beads have a DNA separation factor of at least 0.5. 3. 2. The method of claim 1, wherein said beads are substituted with a moiety selected from the group consisting of methyl, ethyl, hydrocarbon and a hydrocarbon polymer, wherein said hydrocarbon polymer optionally has from 23 to 1,000,000 carbons. . 4. 4. The method of claim 3, wherein said moiety is substituted with a functional group selected from the group consisting of polyvinyl alcohol, hydroxy, nitro, bromo, cyano, and aldehyde. 5. 2. The method of claim 1, wherein said separation is by matched ion polynucleotide chromatography. 6. 2. The method of claim 1, wherein said beads are subjected to an acid wash treatment. 7. 2. The method of claim 1, wherein said beads are essentially free of polycationic contaminants. 8. The method of claim 1, wherein the beads have an average diameter of about 1-5 microns. 9. The method of claim 1 wherein said beads are comprised of a polymer selected from mono- and divinyl-substituted aromatics, acrylates, methacrylates, polyolefins, polyesters, polyurethanes, polyamides, polycarbonates and fluoro-substituted ethylene. 10. 2. The method of claim 1, wherein said beads are substituted with a hydrocarbon group or a substituted hydrocarbon group. 11. 2. The method of claim 1, wherein said polynucleotide comprises RNA. 12. 2. The method of claim 1, wherein said polynucleotide comprises DNA. 13. 2. The method of claim 1, wherein said mixture of polynucleotides is a product of a polymerase chain reaction. 14． The method of claim 1, wherein said method is performed at a temperature in the range of 20C to 90C. 15. 15. The method of claim 14, wherein said temperature is selected to produce a back pressure not exceeding 5000 psi. 16. 2. The method of claim 1, wherein said method uses an organic solvent, said organic solvent being water-soluble. 17． 17. The method of claim 16, wherein said solvent is selected from the group consisting of alcohols, nitriles, dimethylformamide, tetrahydrofuran, esters and ethers. 18. The method of claim 1, wherein the mixture of polynucleotides comprises a counter ion selected from trialkylamine acetate, trialkylamine carbonate and trialkylamine phosphate. 19. 19. The method of claim 18, wherein the counter-ionic agent is selected from triethylammonium acetate and triethylammonium hexafluoroisopropyl alcohol. 20. Polymer beads having an average bead diameter of 0.5 to 100 microns, and said beads having a DNA separation factor of at least 0.05. 21. 21. The beads of claim 20, wherein said beads have a DNA separation factor of at least 0.5. 22. 21. The beads of claim 20, wherein said beads are subjected to an acid wash treatment. 23. 21. The bead of claim 20, wherein said bead is essentially free of multivalent cations. 24. 21. The beads of claim 20, wherein said beads have an average diameter of about 1-10 microns. 25. 21. The beads of claim 20, wherein said beads have an average diameter of about 1-5 microns. 26. 21. The bead of claim 20, wherein said bead is comprised of a copolymer of a vinyl aromatic monomer. 27. 27. The bead of claim 26, wherein said vinyl aromatic monomer is selected from the group consisting of styrene, alkyl substituted styrene, [alpha] -methyl styrene and alkyl substituted [alpha] -methyl styrene. 28. The beads are styrene, C 1-6 composed of a copolymer of alkyl vinyl benzene and divinyl benzene, beads range 26 of claims. 29. 21. The polymer bead of claim 20, wherein said beads are substituted with a functional group selected from the group consisting of polyvinyl alcohol, hydroxy, nitro, bromo, cyano, and aldehyde. 30. 21. The bead of claim 20, wherein said bead is substituted with a functional group selected from the group consisting of methyl, ethyl, hydrocarbon and hydrocarbon polymer. 31. 21. The bead of claim 20, wherein said bead comprises poly (styrene-divinylbenzene). 32. 21. The polymer bead of claim 20, wherein said beads comprise a polymer selected from mono- and divinyl-substituted aromatics, acrylates, methacrylates, polyolefins, polyesters, polyurethanes, polyamides, polycarbonates and fluoro-substituted ethylene. 33. 33. The polymer bead of claim 32, wherein said beads are substituted with a substituent selected from the group consisting of methyl, ethyl, hydrocarbon and hydrocarbon polymers. 34. 33. The polymer bead of claim 32, wherein said beads are substituted with a substituent selected from the group consisting of hydrocarbons and substituted hydrocarbons. 35. 21. The beads of claim 20 and further comprising a crosslinkable divinyl monomer selected from divinylbenzene and butadiene.
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