JP2002505885A - Enzymatic preparation of glucose syrup from starch - Google Patents

Enzymatic preparation of glucose syrup from starch

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JP2002505885A JP2000535766A JP2000535766A JP2002505885A JP 2002505885 A JP2002505885 A JP 2002505885A JP 2000535766 A JP2000535766 A JP 2000535766A JP 2000535766 A JP2000535766 A JP 2000535766A JP 2002505885 A JP2002505885 A JP 2002505885A
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    • C13K1/00Glucose; Glucose-containing syrups
    • C13K1/06Glucose; Glucose-containing syrups obtained by saccharification of starch or raw materials containing starch

Abstract

(57)【要約】 本発明はSEQ ID NO:2に示すVal54において置換を含んで成る又は別のターマミル様α−アミラーゼにおける対応の位置において置換を含んで成るターマミル様α−アミラーゼによりデンプンを処理する、グルコースシロップの調製のための方法に関連する。 (57) Abstract: The present invention is SEQ ID NO: treating starches with Termamyl-like α- amylase comprises a substitution at a corresponding position in the composed or another Termamyl-like α- amylase include substitutions at Val54 shown in 2 to relates to a method for the preparation of a glucose syrup. 本発明は更に本発明の方法により得られうるグルコースシロップ及び食品における成分としてのその使用に関連する。 The present invention relates to their use as a component in glucose syrup and food obtainable by further methods of the present invention. 本発明の目的は更に、骨格としてSEQ ID NO:2を用いる位置Val54において置換を有する又は別のターマミル様α−アミラーゼにおける対応の位置において置換を有するターマミル様α−アミラーゼのグルコースシロップの調製のための使用の提供にある。 An object of the present invention further, SEQ ID as a scaffold NO: for the preparation of glucose syrup Termamyl-like α- amylase having a substitution in the corresponding position in the or another Termamyl-like α- amylase having a substituent at the 2 using position Val54 It is to provide a use of.

Description

【発明の詳細な説明】 DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

【0001】 発明の分野 本発明は様々な産業上の利用性、特に食品産業における利用性のために極めて魅力的な特徴を有するデンプン加水分解物シロップの調製のための方法に関連する。 [0001] Field of the Invention The present invention relates to a method for the preparation of various industrial applicability, starch hydrolyzate syrup having a particularly highly attractive features for utilization in the food industry. 本発明は、その調製がデンプンの酸加水分解(即ち、非酵素的加水分解)を利用した場合にだけ従来可能であったシロップに近似する上記の種類のシロップを得るのにはじめて一種の酵素を利用することを可能にする。 The present invention, acid hydrolysis of the preparation starches (i.e., non-enzymatic hydrolysis) of the first kind to obtain the above type of syrup only approximates previously possible a syrup when using enzyme It makes it possible to use.

【0002】 発明の背景 42付近のDE(デキストロース当量)を有するグルコースシロップはハードボイルドキャンディー、トフィー、ファッジ、フォンダン等の製品の成分として産業において幅広く使用されている。 [0002] Glucose syrup having a DE (dextrose equivalent) in the vicinity of the background 42 of the invention is a hard boiled candy, toffee, fudge, are widely used in industry as a component of products such as fondants.

【0003】 伝統的に42DEグルコースシロップは標準の酸変換により製造されている。 [0003] Traditionally 42DE glucose syrup is produced by acid conversion standard.
デンプンスラリーはまずpH2にまで酸性にし、次いで高温且つ高圧で作動する連続リアクターの中に汲入れる。 Starch slurry is acidified to first pH 2, then placed 汲 in a continuous reactor operating at elevated temperature and pressure. 所定の時間経過後、そのリカーを周囲条件にもどし、中和し、透明にし、脱色し、そして最終シロップへと濃縮する。 After a predetermined time has elapsed, it returns to the liquor to ambient conditions, then neutralized, clarified, decolorized and concentrated to the final syrup. 図1に示すかかる酸変換グルコースシロップのプロファイルはスクロースが結晶化する傾向を低め、シェルグレイニングする傾向を遅くし、そして特徴的な「口内感触」に寄与する。 Profile of such acids converted glucose syrup shown in FIG. 1 is reduced the tendency of sucrose to crystallize, to slow down the tendency to shell-graining and contributes to a characteristic "mouth feel".

【0004】 今日、デンプンのグルコースシロップへの酵素的変換が提案されている。 [0004] Today, the enzymatic conversion of starch to glucose syrup has been proposed. しかしながら、かかるグルコースシロップは一般に伝統的に使用されている42DE However, such a glucose syrup are generally traditionally used 42DE
酸変換グルコースシロップとはかなり異なる糖スペクトルを有する。 The acid converted glucose syrups have significantly different sugar spectrum.

【0005】 発明の概要 本発明は伝統的な酸変換42DEグルコースシロップの糖スペクトルに近いそれを有する35〜45の範囲におけるDEを有するグルコースシロップがデンプンをターマミル(Termamyl)(登録商標)(これは市販のバチルス・リシェニホルミスα−アミラーゼである)の54W置換化変異体により処理することにより得ることができるという発見に基づくものである。 [0005] The present invention is traditional acid converted 42DE glucose syrup Termamyl glucose syrup starch having a DE in the range of 35 to 45 with it near the sugar spectrum (Termamyl) (R) (which is it is based on the discovery that can be obtained by treatment with 54W substituted variants of a is) commercial Bacillus licheniformis α- amylase.

【0006】 第一の観点において、本発明はSEQ ID NO:2に示すVal54において置換を含んで成る又は別のターマミル様α−アミラーゼにおける対応の位置において置換を含んで成るターマミル様α−アミラーゼによりデンプンを処理する、グルコースシロップの調製のための方法に関連する。 [0006] In a first aspect, the present invention is SEQ ID NO: The Termamyl-like α- amylase comprises a substitution at a corresponding position in the composed or another Termamyl-like α- amylase include substitutions at Val54 shown in 2 processing the starch, it relates to a method for the preparation of a glucose syrup.

【0007】 本発明は更に本発明の方法により得られうるグルコースシロップに関連する。 [0007] The present invention is related to the glucose syrup obtainable by further methods of the present invention.
更に、一の観点において、本発明はハードボイルドキャンディー、トフィー、ファッジ、フォンダン等の食品の成分としての本発明の方法により得られうる前記グルコースシロップの使用に関連する。 Further, in one aspect, the present invention pertains hard boiled candies, toffees, fudge, the use of the glucose syrup obtainable by the method of the present invention as a component of foods such as fondant.

【0008】 本発明の別の目的は骨格(即ち、親酵素)としてSEQ ID NO:2を利用して位置Val54又は別のターマミル様α−アミラーゼにおける対応の位置において置換を有するターマミル様α−アミラーゼのグルコースシロップの調製のための使用を提供する。 Another object of the present invention skeleton (i.e., the parent enzyme) as SEQ ID NO: Termamyl-like α- amylase having a substitution in the corresponding position in the position Val54 or another Termamyl-like α- amylase by utilizing 2 It provides the use for the preparation of glucose syrup.

【0009】 発明の詳細な説明 本発明は往々にして「42DEグルコースシロップ」と称されている伝統的な酸変換グルコースシロップの糖スペクトル及び特性に近いそれらを有する35〜 [0009] Detailed Description of the Invention The present invention has them closer to sugar spectrum and characteristics of the traditional acid conversion glucose syrup are then often referred to as "42DE glucose syrup" 35
45の範囲におけるDEを有する新規のグルコースシロップが、商標名ターマミル(登録商標)(Novo Nordisk)で販売されている商業的に入手可能なバチルス−リシェニホルミス(Bacillus licheniform New glucose syrups having a DE in the range of 45, trade name Termamyl (TM) (Novo Nordisk) are sold commercially available Bacillus - licheniformis (Bacillus Licheniform
is)α−アミラーゼのVal54 Trp(V54W)置換化変異体によるデンプンの処理により得られるという発見に基づく。 IS) alpha-amylase Val54 Trp (V54W) based on the discovery that obtained by treatment of starch by substituted variants. ターマミルのDNA及びタンパク質配列は各々SEQ ID NO:1及び2に示す。 DNA and protein sequences of Termamyl each SEQ ID NO in: shown in 1 and 2.

【0010】 B. [0010] B. リシェニホルミスα−アミラーゼ等のターマミル様α−アミラーゼのVa Licheniformis α- Termamyl-like α- amylase of Va such as amylase
l54の置換はWO97/41213(Novo Nordisk)から知られている。 Replacement of l54 is known from WO97 / 41213 (Novo Nordisk). しかしながら、Val54置換化変異体が酸変換42DEグルコースシロップの糖スペクトルに近いそれを有するシロップをデンプンから調製するのに利用できることは驚くべきことであり、なぜなら、親B. However, it is surprising that can be used to prepare a syrup having it close to the sugar spectrum of Val54 substituted variants acid converted 42DE glucose syrup from starch, because a parent B. リシェニホルミスα− Licheniformis α-
アミラーゼ(SEQ ID NO:2)により処理されたデンプンから調製されたシロップはそれとは異なり異なる糖スペクトルを有するからである。 Amylase (SEQ ID NO: 2) Syrup prepared from the treated starch by is because having different different sugar spectrum with it.

【0011】 第一の観点において、本発明は位置Val54において置換を含んで成るSE [0011] In a first aspect, the present invention comprises a substitution at position Val54 SE
Q ID NO:2に示すバチルス・リシェニホルミスα−アミラーゼ又はSE Q ID NO: Bacillus shown in 2 licheniformis α- amylase or SE
Q ID NO:2のVal54に対応する位置において置換されたターマミル様α−アミラーゼ(以下に定義)によるデンプンの処理により調製されたグルコースシロップ(又は特製シロップ)に関連する。 Q ID NO: related to Termamyl-like substituted in a position corresponding to Val54 of 2 alpha-amylase (as defined below) by glucose syrup which is prepared by treatment of starch (or special syrup).

【0012】 本発明のグルコースシロップはその糖スペクトル、即ち、デキストロース(D [0012] Glucose syrup of the present invention is its sugar spectrum, i.e., dextrose (D
P1)、マルトース(DP2)、マルトトリオース(DP3)、マルトテトラオース(DP4)、マルトペンタオース(DP5)及び多数の高級糖類、例えばD P1), maltose (DP2), maltotriose (DP3), maltotetraose (DP4), maltopentaose (DP5) and a number of higher saccharides, such as D
P10、等の組成の観点で伝統的な酸変換42DEシロップの特性に近いそれを有する。 P10, has it close to the characteristics of traditional acid converted 42DE syrup in terms of composition and the like. 流動学的特性、例えば粘度は、親B. Rheological properties, for example viscosity, parent B. リシェニホルミスα−アミラーゼ(即ち、SEQ ID NO:2)による処理により同じ条件下で調製された対応のシロップと比べ、伝統的な酸変換42DEシロップにはるかに近い。 Licheniformis α- amylase (i.e., SEQ ID NO: 2) by comparison with the corresponding syrup prepared under the same conditions by the process, much closer to the traditional acid converted 42DE syrup.

【0013】 図1〜3を比較することにより明らかとなりうる通り、Val54 Trp置換化ターマミル変異体によるデンプンの処理により調製されたグルコースシロップ(図3)は、親B. [0013] As can be apparent from a comparison of FIGS. 1~3, Val54 Trp substituted Termamyl glucose syrup which is prepared by treatment of the starch by mutant (Fig. 3), the parent B. リシェニホルミスα−アミラーゼを利用して調製したグルコースシロップ(図2)と比べ、酸変換42DEシロップの糖スペクトル(図1 Utilizing licheniformis α- amylase compared with glucose syrup was prepared (FIG. 2), a sugar spectrum of the acid converted 42DE syrup (Figure 1
)に近いそれを有する。 Have it close to).

【0014】 本発明のグルコースシロップを調製するためにVal54置換化バチルス・リシェニホルミスα−アミラーゼ変異体を利用することにより、親B. [0014] By utilizing the Val54 substituted Bacillus licheniformis α- amylase variant to prepare the glucose syrup of the present invention, a parent B. リシェニホルミスα−アミラーゼを利用して調製した対応のグルコースシロップと比較して、特にDP1及びDP4糖含有量が伝統的な42DE酸変換グルコースシロップのそれに近いレベルにまで上昇し、そしてDP5糖含有量は42DEグルコースシロップのそれに近いレベルにまで減少したことがわかる。 Compared to the corresponding glucose syrup was prepared using the licheniformis α- amylase, particularly elevated DP1 and DP4 sugar content to a level close to that of traditional 42DE acid converted glucose syrups, and DP5 sugar content it can be seen that was reduced to a level close to that of the 42DE glucose syrup. 更に、高級糖類の含有量も、図1〜3の左側のピークを比較することによりわかる通り、対応の親B Furthermore, the content of the higher saccharides also, as can be seen by comparing the left peak of Figure 1-3, the corresponding parent B
. リシェニホルミスα−アミラーゼ変換デンプングルコースシロップと比べ、酸変換42DEグルコースシロップのそれに近いレベルにまで上昇した。 Compared to licheniformis α- amylase converted starch glucose syrup, rose to a level close to that of acid converted 42DE glucose syrup.

【0015】 本発明に従うと、本発明のグルコースシロップを製造するために一種の酵素、 [0015] According to the present invention, one kind of enzyme to produce a glucose syrup of the present invention,
即ち、Val54置換化ターマミル様α−アミラーゼだけを利用することが必要とされる。 That is, it is required to use only Val54 substituted Termamyl-like α- amylase.

【0016】 本発明のグルコースシロップはデンプンをVal54置換化ターマミル様α− [0016] Glucose syrup of the present invention is starch Val54 substituted Termamyl-like α-
アミラーゼ変異体により20〜100時間、好ましくは50〜80時間、特に6 20 to 100 hours with amylase variant, preferably 50 to 80 hours, in particular 6
0〜75時間、約80〜105℃の範囲の温度で処理することにより調製できうる。 0-75 hours, can be prepared by treating at a temperature in the range of about 80 to 105 ° C.. そのpHはpH4〜7、好ましくはpH4.5〜6.5、特に約pH5.5〜6.2 The pH pH 4-7, preferably PH4.5~6.5, especially about pH5.5~6.2
の範囲内であるべきである。 It should be in the range of. 高度なカルシウム依存性を有するものと一般的に認められているターマミル様α−アミラーゼについての適当な条件を供与するため、20〜60ppm のCa 2+ 、好ましくは約40ppm のCa 2+を反応スラリーの中に存在させるべきである。 To donate appropriate conditions for Termamyl-like α- amylase generally accepted as having a high degree of calcium-dependent, Ca 2+ of 20~60Ppm, preferably the reaction slurry Ca 2+ from about 40ppm It should be present in the.

【0017】 デンプンの酸変換42DEシロップ型のグルコースシロップへの酵素的変換は以下を含む多数の利点を有するであろう: ・酵素変換は温和なプロセスである; ・有色前駆体ヒドロキシメチルフルフラールの生成の抑制; ・副産物としての無水グルコースの生成がない; ・酸性条件の緩和を理由に灰分含有量が低い; ・安価な下流処理及び精製。 The enzymatic conversion of the acid converted 42DE syrup type glucose syrup starch will have a number of advantages, including the following: - enzymatic conversion is a mild process; the product of & colored precursor hydroxymethylfurfural no anhydrous glucose as by-products produced; inhibition & low ash content because of relaxation of acidic conditions; - inexpensive downstream processing and purification.

【0018】 ターマミル様α−アミラーゼ本発明に従うと、ターマミル様変異体は、以下に定義する通り、本明細書におけるSEQ ID NO:2とアミノ酸レベルで高度な相同性を有するバチルス種により産生される任意のα−アミラーゼであってよい。 [0018] According to Termamyl-like α- amylase present invention, Termamyl-like variants, SEQ ID NO in the street, herein defined below: produced by Bacillus species having 2 and high degree of homology at the amino acid level it may be any α- amylase.

【0019】 かかる酵素の限定でない例は下記のバチルス種α−アミラーゼである: WO97/41213のSEQ ID NO:4に開示のB. [0019] Non-limiting examples of such enzymes are the Bacillus sp α- amylase the following: WO97 / 41213 of SEQ ID NO: 4 disclosed in B. アミロリケファシエンス(B.amyloliquefaciens)α−アミラーゼ:これは以下のSEQ ID NO:2に示すB. Amyloliquefaciens (B.amyloliquefaciens) α- amylase: This following SEQ ID NO: 2 are shown B. リシェニホルミスα−アミラーゼと約89%の相同性を示す;WO97/41213のSEQ ID NO:6に開示のB. Shows a licheniformis α- amylase and about 89% homology; WO97 / 41213 of SEQ ID NO: 6 to the disclosure of B. ステアロサーモフィルス(B.stearothermophilus) Stearothermophilus (B.stearothermophilus)
α−アミラーゼ。 Amylase α-. 更に、相同性α−アミラーゼにはバチルス種NCIB 122 Furthermore, Bacillus species homology α- amylase NCIB 122
89,NCIB 12512,NCIB 12513又はDSM 9375の株に由来するα−アミラーゼ(全てWO95/26397に詳細に説明)、及びT 89, NCIB 12512, NCIB 12513 or derived from a strain of DSM 9375 alpha-amylase (all WO95 / 26397 in detail below), and T
sukamotoら、 Biochemical and Biophysical Research Communications, 151 (1988), pp. 25-31 に記載のα−アミラーゼが挙げられる。 sukamoto et al, Biochemical and Biophysical Research Communications, 151 (1988), include α- amylases described in pp. 25-31.

【0020】 ターマミル様α−アミラーゼの定義の中に入る本発明に従って考慮されるその他のバチルス種α−アミラーゼはWO96/23873のSEQ ID NO: [0020] Other Bacillus species α- amylase considered according to the invention which fall within the Termamyl-like α- amylase definitions WO96 / 96/23873 of SEQ ID NO:
1,2,3及び7に開示のα−アミラーゼであり、特にWO96/23873に記載のものが含まれる。 A disclosure of α- amylase in 1, 2, 3 and 7, include those described in particular WO96 / 96/23873.

【0021】 上記のターマミル様α−アミラーゼの変異体及びハイブリドも考慮される。 [0021] Variants and hybrids of the above Termamyl-like α- amylase are also contemplated.

【0022】 本発明の一の態様において、親ターマミル様α−アミラーゼはSEQ ID [0022] In one aspect of the present invention, the parent Termamyl-like α- amylase is SEQ ID
NO:2及びSEQ ID NO:4のハイブリドα−アミラーゼである。 NO: 2 and SEQ ID NO: is a fourth hybrid α- amylase. 詳しくは、この親ハイブリドターマミル様α−アミラーゼはターマミル配列と同一、 The same details, and this parent hybrid Tama mill-like α- amylase Termamyl sequence,
即ち、SEQ ID NO:2に示すバチルス・リシェニホルミスα−アミラーゼと同一であってよいが、但しそのN末端の35個のアミノ酸残基(成熟タンパク質のそれ)はBAN(成熟タンパク質)、即ちSEQ ID NO:4に示すバチルス・アミロリケファシエンスα−アミラーゼのN末端の33個の残基により交換され(バチルス・アミロリケファシエンスα−アミラーゼのDNA配列はSEQ ID NO:3に示す)、それは更に下記の突然変異を有してよい: H156Y+A181T+N190F+A209V+Q264S(SEQ ID That, SEQ ID NO: may be the same as the Bacillus licheniformis α- amylase shown in 2, provided (that of the mature protein) 35 amino acid residues of the N-terminal BAN (mature protein), i.e. SEQ ID NO: Bacillus amyloliquefaciens α- amylase is replaceable by 33 residues of N-terminal shown in 4 (Bacillus amyloliquefaciens α- amylase DNA sequence shown in SEQ ID NO: 3), it is it may further have the following mutations: H156Y + A181T + N190F + A209V + Q264S (SEQ ID
NO:2の番号付けを使用)。 NO: 2 Use the numbering). このハイブリドはSOE−PCRにより構築されうる(Higuchi ら、1988, Nucleic Acids Research 16 : 7351)。 The hybrid may be constructed by SOE-PCR (Higuchi et al., 1988, Nucleic Acids Research 16: 7351).

【0023】 その他のターマミル様α−アミラーゼにはEP0,252,666に記載のB [0023] described in EP0,252,666 Other Termamyl-like α- amylase B
. リシェニホルミス(ATCC 27811)により産生されるα−アミラーゼ並びに91/00353及びWO94/18314において同定されたα−アミラーゼが挙げられる。 It includes α- amylases identified in α- amylase and 91/00353 and WO94 / 18314 produced by licheniformis (ATCC 27811). その他の市販のターマミル様α−アミラーゼはOptit Other commercial Termamyl-like α- amylase Optit
herm(商標)及びTakatherm(商標)(Solvayより入手可能)、Maxamyl(商標)(Gist−Brocades/Genencor herm (TM) and Takatherm (TM) (available from Solvay), Maxamyl (TM) (Gist-Brocades / Genencor
より入手可能)、Spezyme AA(商標)及びSpezyme Delt More available), Spezyme AA (TM) and Spezyme Delt
a AA(商標)(Genencorより入手可能)、並びにKeistase a AA (TM) (available from Genencor), and Keistase
(商標)(Daiwaより入手可能)である。 A (TM) (available from Daiwa).

【0024】 これらのα−アミラーゼ間で認められる実質的な相同性を理由に、これらは同じクラスのα−アミラーゼ、即ち、「ターマミル様α−アミラーゼ」に属すると考えられる。 [0024] substantial homology found between these α- amylase in reason, these are of the same class α- amylase, that is, is considered to belong to the "Termamyl-like α- amylase".

【0025】 従って、本明細書において、「ターマミル様α−アミラーゼ」なる語はアミノ酸レベルおいて、本明細書に記載のSEQ ID NO:2に示すアミノ酸配列を有するB. [0025] Thus, in the present specification, "Termamyl-like α- amylase" refers to keep the amino acid level, SEQ ID NO described herein: B. having 2 amino acid sequence shown in リシェニホルミスα−アミラーゼに対し実質的に相同性を示すα− Licheniformis α- amylase to exhibit substantially homologous α-
アミラーゼを意味することも意図する。 Also intended to mean the amylase. 換言すれば、「ターマミル様α−アミラーゼ」は本明細書におけるSEQ ID NO:2に示すアミノ酸配列を有するα−アミラーゼ又はSEQ ID NO:2と少なくとも60%、例えば少なくとも70%、例えば少なくとも75%、又は少なくとも80%、例えば少なくとも85%、少なくとも90%、又は少なくとも95%の相同性を示す任意のα− In other words, "Termamyl-like alpha-amylase" is SEQ ID herein NO: having the amino acid sequence shown in 2 alpha-amylase or SEQ ID NO: 2 with at least 60%, such as at least 70%, such as at least 75% , or at least 80%, such as at least 85%, at least 90%, or at least 95% homology to any indicated α-
アミラーゼをいう。 It refers to the amylase.

【0026】 「相同性」は任意の慣用のアルゴリズム、好ましくはGCGパッケージバージョン7.3(1993年6月)のGAPプログラムを利用し、3.0のGAP構築ペナルティー及び0.1のギャップ伸長ペナルティーであるGAPペナルティーのデフォルト値により決定できうる。 [0026] "homology" any of the conventional algorithm, preferably by using the GAP program of the GCG package version 7.3 (June 1993), 3.0 GAP construction penalty and 0.1 a gap extension penalty of It may be determined by default values ​​for GAP penalties is. (Genetic Computer Group (1991) Prog (Genetic Computer Group (1991) Prog
ramme Manual for the GCG Package, version 7, 575 Science Drive, Madison, ramme Manual for the GCG Package, version 7, 575 Science Drive, Madison,
Wisconsin, USA 53711)。 Wisconsin, USA 53711).

【0027】 ターマミル及びターマミル様α−アミラーゼ間の構造アラインメントを他のターマミル様α−アミラーゼにおける均等/対応の位置の同定のために利用できうる。 [0027] can be used to structure alignment between Termamyl and Termamyl-like α- amylase for the identification of the position of the equivalent / corresponding in other Termamyl-like α- amylase. かかる構造アラインメントを得る一の方法はGCGパッケージのPile Pile of one method GCG package to obtain such structural alignment
Upプログラムを、3.0のギャップ構築ペナルティー及び0.1のギャップ伸長ペナルティーであるギャップペナルティーのデフォルト値で利用することにある。 The Up program is to use the default values ​​of gap penalties is the gap extension penalty gap constructed penalty of 0.1 3.0. その他の構築アラインメント方法には疎水性クラスター分析(Goboriaud ら、(1987) FEBS LETTERS 224, pp. 149-155) 及びリバーススリーディング(Hube Hydrophobic cluster analysis Other construction alignment method (Goboriaud et al, (1987) FEBS LETTERS 224, pp. 149-155) and reverse scan reading (Hube
r, T ; Torda, AE, PROTEIN SCIENCE Vol. 7, No. 1, pp. 142-149 (1998))が挙げられる。 r, T;.. Torda, AE, PROTEIN SCIENCE Vol 7, No. 1, pp 142-149 (1998)) and the like.

【0028】 本発明の一の態様において、ターマミル様α−アミラーゼ変異体は下記のB. [0028] In one aspect of the present invention, Termamyl-like α- amylase variant of the following B.
リシェニホルミスα−アミラーゼ変異体(親B.リシェニホルミスα−アミラーゼはSEQ ID NO:2に示す)V54A,R,D,N,C,E,Q,G, Licheniformis α- amylase variant (parent B. licheniformis α- amylase SEQ ID NO: 2 shown in) V54A, R, D, N, C, E, Q, G,
H,I,L,K,M,F,P,S,T,W,Yのいずれか、又はSEQ ID H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, either Y, or SEQ ID
NO:2のVal54に対応する位置において置換されたターマミル様α−アミラーゼもしくは変異体(上記に定義)である。 NO: a Termamyl-like substituted at a position corresponding to Val54 of 2 alpha-amylase or variant (defined above).

【0029】 好適な態様において、このターマミル様α−アミラーゼ変異体はV54W,Y [0029] In a preferred embodiment, the Termamyl-like α- amylase variant V54W, Y
もしくはFの置換のいずれかを有するB. Or B. having any substitution of F リシェニホルミスα−アミラーゼ変異体の置換体、又は対応の位置において置換を有するターマミル様α−アミラーゼ変異体である。 Substituted product licheniformis α- amylase variant, or Termamyl-like α- amylase variants with substitutions in the corresponding positions.

【0030】 本発明の変異体の構築 Val54変異体は当業界において公知の標準の技術、例えばMorinagaら(19 [0030] Variants of constructs Val54 variants of the present invention is in the art known standard techniques, for example, Morinaga et al. (19
84), Biotechnology 2, p. 646-639及び米国特許第4,760,025号に記載の部位特異的突然変異誘発等により構築されうる。 84) can be constructed by site-directed mutagenesis as described in, Biotechnology 2, p. 646-639 and U.S. Patent No. 4,760,025. α−アミラーゼをコードするDNA配列に突然変異を導入するその他の適当な方法はNelson and Long (1989) Other suitable methods of introducing mutations into DNA sequences encoding the α- amylase Nelson and Long (1989)
, Analytical Biochemistry 180, p. 147-151 に記載されている。 It is described in Analytical Biochemistry 180, p. 147-151. この方法はP This method is P
CR反応において一のプライマーとして化学合成DNA鎖を利用することにより導入した所望の突然変異を含むPCRフラグメントの3段階作製を包含する。 It includes three steps for manufacturing a PCR fragment containing the desired mutation introduced by using a chemically synthesized DNA strand as one of the primers in CR reactions. P
CR作製したフラグメントから、突然変異を担持するDNAフラグメントを制限エンドヌクレアーゼによる切断により単離し、そして発現プラスミドの中に再挿入する。 From CR produced fragments, mutant isolated by cleavage with restriction DNA fragments endonuclease carrying, and reinserted into an expression plasmid.

【0031】 Val54変異体は当該変異体をコードするDNA配列を含んで成る微生物をこの変異体の産生を誘導する条件下で培養することにより発現されうる。 [0031] Val54 mutants may be expressed by culturing a microorganism comprising a DNA sequence encoding the variant under conditions that induce the production of this mutant. 次いでこの変異体を得られる培養ブロスから回収できうる。 Then it can be recovered from the culture broth obtained by this variant. 当業界において公知のその他の方法も利用してよい。 Other methods known in the art may also be utilized. 例えば、WO97/41213はVal54変異体を提供するための適当な方法を開示する。 For example, WO97 / 41213 discloses a suitable method for providing Val54 mutants.

【0032】 本発明は更に上記の説明及び下記の実施例の欄において説明する本発明の方法により得られうるグルコースシロップに関連する。 [0032] The present invention is further related to the glucose syrup obtainable by the method of the present invention described in the column of the above description and the examples below. 更に、一の観点において、本発明はハードボイルドキャンディー、トフィー、ファッジ、フォンダン、等の食品の成分としての本発明の方法により得られうるグルコースシロップの使用に関連する。 Further, in one aspect, the present invention pertains hard boiled candies, toffee, fudge, fondant, to use glucose syrup obtainable by the method of the present invention as a component of food like.

【0033】 別の観点において、本発明は骨格としてSEQ ID NO:2を利用して位置Val54又は別のターマミル様α−アミラーゼにおける対応の位置において置換されたターマミル様α−アミラーゼのグルコースシロップの調製のための使用に関連する。 [0033] In another aspect, the present invention SEQ ID NO as backbone: Preparation of Glucose syrup has been Termamyl-like α- amylase substitution in the corresponding position in the position Val54 or another Termamyl-like α- amylase by utilizing 2 associated with the use of for. このターマミル様変異体は任意の上記のものであってよい。 The Termamyl-like mutant may be of any of the above.

【0034】 材料及び方法 材料 酵素: 位置Val54 Trpで置換されたSEQ ID NO:2に示すNovo [0034] Materials and methods Materials Enzymes: Position Val54 SEQ ID substituted with Trp NO: Novo shown in 2
Nordisk由来のターマミル(登録商標)。 Nordisk origin of Termamyl (registered trademark). この変異体はWO97/41 This mutant WO97 / 41
213に記載の通りにして調製できうる。 It can be prepared as described in 213. その他の材料: Cerestar由来のワキシーメイズスターチ。 Other material: waxy maize starch from Cerestar.

【0035】 方法 DEの測定 サンプル中のDE(デキストロース当量は炭水化物を還元する量〔デキストロース当量として測定〕として定義)は溶解した乾燥物質の総重量のw/w%として示す。 [0035] DE measurement in a sample of how DE (dextrose equivalent is defined as the amount [dextrose measured as equivalent] of reducing carbohydrates) are shown as w / w% of the total weight of the dry substance dissolved. これはネオキュプロインアッセイにより測定した(Dygert, Li Florida This was measured by neocuproine assay (Dygert, Li Florida
na (1965) Anal. Biochem. No 368)。 na (1965) Anal. Biochem. No 368). このネオキュプロインアッセイの原理は、 The principle of this neocuproine assay,
CuSO 4をサンプルに加え、Cu ++を還元糖により還元し、そして生成されたネオキュプロイン錯体を450nmで測定することにある。 Adding CuSO 4 to the sample, and reduced by a reducing sugar Cu ++, and there the generated neocuproine complex to measure at 450nm.

【0036】 一般的分子生物学法 DNA操作及び形質転換は分子生物学の標準的な方法を利用して実施した(Sa [0036] General molecular biology methods DNA manipulations and transformations were performed using standard methods of molecular biology (Sa
mbrookら (1989) Molecular cloning : A laboratory manual, Cold Spring Har mbrook et al. (1989) Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Har
bor lab., Cold Spring Harbor, NY ; Ausubel, FMら (編)「Current protoc . Bor lab, Cold Spring Harbor, NY; Ausubel, FM, et al. (Eds.) "Current protoc
ols in Molecular Biology」John Wiley and Sons, 1995 ; Harwood, CR, and ols in Molecular Biology ", John Wiley and Sons, 1995; Harwood, CR, and
Cutting, SM (編)「Molecular Biological Methods for Bacillus 」John W Cutting, SM (ed.) "Molecular Biological Methods for Bacillus" John W
iley and Sons, 1990)。 iley and Sons, 1990).

【0037】 DNA操作のための酵素は供給者の説明書に従って使用した。 [0037] enzymes for DNA manipulations were used according to the supplier's instructions.

【0038】 実施例 例1 酸変換型酵素式グルコースシロップの調製グルコースシロップは、30%のDS(30%の乾燥固体)ワキシーメイズスターチ、40ppm のCa 2+ (CaCl 2として添加)、pH6.0を含むデンプンスラリーを0.1mg酵素タンパク質/gのVal54 Trp置換化バチルス・ [0038] Preparation glucose syrup Example Example 1 acid conversion enzyme expression glucose syrup, 30% of DS (30% dry solids) waxy maize starch, (added as CaCl 2) Ca 2+ of 40 ppm, pH 6.0 Val54 Trp substitution of 0.1mg enzyme protein / g of starch slurry containing Bacillus
リシェニホルミスα−アミラーゼで処理することにより調製した。 It was prepared by treating licheniformis α- amylase. 温度は95℃ Temperature is 95 ℃
で1時間、そして80℃で72時間保った。 In 1 hour and kept at 80 ° C. 72 hours.

【0039】 20及び72時間の処理を経て調製されたグルコースシロップの糖プロファイルを以下の表1に示す。 [0039] indicates 20 and the sugar profile glucose syrup prepared through the processing of 72 hours in Table 1 below.

【0040】 [0040]

【表1】 [Table 1]

【0041】 表1:V54W置換化バチルス・リシェニホルミスα−アミラーゼによる20及び72時間の処理の後の糖プロファイル。 [0041] Table 1: V54W glycoprofile after treatment for 20 and 72 hours by substitution of the Bacillus licheniformis α- amylase. 得られるシロップのDEも示す。 Also DE of the resulting syrup shown.

【0042】 図3は予備加熱調理した5%のワキシーメイズスターチ基質をVal54 T [0042] FIG. 3 is 5% of the waxy maize starch substrate was pre-cooked Val54 T
rp置換化バチルス・リシェニホルミスα−アミラーゼにより60℃で24時間処理することにより得られるグルコースシロップの糖スペクトルを示す。 It shows the sugar spectrum of the resulting glucose syrup by 24 hours at 60 ° C. by rp substituted Bacillus licheniformis α- amylase. 図2は似た条件下で天然バチルス・リシェニホルミスα−アミラーゼで処理した類似の基質の糖スペクトルを示す。 Figure 2 shows the sugar spectrum of similar substrate treated with native Bacillus licheniformis α- amylase under conditions similar.

【配列表】 [Sequence Listing]

【図面の簡単な説明】 BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS

【図1】 42DE酸変換グルコースシロップの糖スペクトル。 [1] 42DE sugar spectrum of the acid converted glucose syrup.

【図2】 ターマミル(即ち、SEQ ID NO:2に示すNovo Nordisk [Figure 2] Termamyl (i.e., SEQ ID NO: 2 are shown Novo Nordisk
由来のバチルス・リシェニホルミスα−アミラーゼ)変換グルコースシロップの糖スペクトル。 Bacillus licheniformis α- amylase) sugar spectrum conversion glucose syrup derived.

【図3】 本発明のV54W置換化バチルス・リシェニホルミスα−アミラーゼ変異対変換グルコースシロップの糖スペクトル。 [Figure 3] V54W substituted Bacillus licheniformis α- amylase variant to sugar spectrum conversion glucose syrup of the present invention.

【図4】 6種の親ターマミル様α−アミラーゼのアミノ酸配列のアラインメント。 Alignment of FIG. 4] 6 kinds of parent Termamyl-like α- amylase amino acid sequence. 最も左側の数字は下記の対応のアミノ酸配列を示す: 1:バチルス種α−アミラーゼ; 2:カオアミルα−アミラーゼ; 3:バチルス種α−アミラーゼ; 4:B. Leftmost numbers indicate corresponding amino acid sequence: 1: Bacillus sp α- amylase; 2: Kaoamiru α- amylase; 3: Bacillus species α- amylase; 4: B. アミロリケファシエンスα−アミラーゼ(BAN)(SEQ ID N Amyloliquefaciens α- amylase (BAN) (SEQ ID N
O:3); 5:バチルス・リシェニホルミスα−アミラーゼ(SEQ ID NO:2); 6:Tsukamoto ら、Biochemical and Biophysical Research Communications, 1 O: 3); 5: Bacillus licheniformis α- amylase (SEQ ID NO: 2); 6: Tsukamoto et al, Biochemical and Biophysical Research Communications, 1
51 (1988), pp 25-31 に開示のα−アミラーゼ。 51 (1988), disclosed in pp 25-31 alpha-amylase.

【手続補正書】特許協力条約第34条補正の翻訳文提出書 [Procedure amendment] of the Patent Cooperation Treaty Article 34 correction translation filings

【提出日】平成12年2月12日(2000.2.12) [Filing date] 2000 February 12 (2000.2.12)

【手続補正1】 [Amendment 1]

【補正対象書類名】明細書 [Correction target document name] specification

【補正対象項目名】特許請求の範囲 [Correction target item name] the scope of the appended claims

【補正方法】変更 [Correction method] change

【補正内容】 [Correction contents]

【特許請求の範囲】 [The claims]

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 EP(AT,BE,CH,CY, DE,DK,ES,FI,FR,GB,GR,IE,I T,LU,MC,NL,PT,SE),OA(BF,BJ ,CF,CG,CI,CM,GA,GN,GW,ML, MR,NE,SN,TD,TG),AP(GH,GM,K E,LS,MW,SD,SL,SZ,UG,ZW),E A(AM,AZ,BY,KG,KZ,MD,RU,TJ ,TM),AL,AM,AT,AU,AZ,BA,BB ,BG,BR,BY,CA,CH,CN,CU,CZ, DE,DK,EE,ES,FI,GB,GD,GE,G H,GM,HR,HU,ID,IL,IN,IS,JP ────────────────────────────────────────────────── ─── of the front page continued (81) designated States EP (AT, BE, CH, CY, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, I T, LU, MC, NL, PT, SE ), OA (BF, BJ, CF, CG, CI, CM, GA, GN, GW, ML, MR, NE, SN, TD, TG), AP (GH, GM, K E, LS, MW, SD, SL, SZ, UG, ZW), E A (AM, AZ, BY, KG, KZ, MD, RU, TJ, TM), AL, AM, AT, AU, AZ, BA, BB, BG, BR, BY , CA, CH, CN, CU, CZ, DE, DK, EE, ES, FI, GB, GD, GE, G H, GM, HR, HU, ID, IL, IN, IS, JP ,KE,KG,KP,KR,KZ,LC,LK,LR, LS,LT,LU,LV,MD,MG,MK,MN,M W,MX,NO,NZ,PL,PT,RO,RU,SD ,SE,SG,SI,SK,SL,TJ,TM,TR, TT,UA,UG,UZ,VN,YU,ZW Fターム(参考) 4B024 AA05 BA13 BA80 CA04 DA05 EA04 GA11 HA01 4B050 CC03 DD02 LL02 LL05 4B064 AF12 CA21 CB07 CC03 CC24 CD22 , KE, KG, KP, KR, KZ, LC, LK, LR, LS, LT, LU, LV, MD, MG, MK, MN, M W, MX, NO, NZ, PL, PT, RO, RU, SD, SE, SG, SI, SK, SL, TJ, TM, TR, TT, UA, UG, UZ, VN, YU, ZW F-term (reference) 4B024 AA05 BA13 BA80 CA04 DA05 EA04 GA11 HA01 4B050 CC03 DD02 LL02 LL05 4B064 AF12 CA21 CB07 CC03 CC24 CD22

Claims (9)

    【特許請求の範囲】 [The claims]
  1. 【請求項1】 デンプンをターマミル(Termamyl)様α−アミラーゼにより処理するグルコースシロップの調製方法であって、ここで当該α−アミラーゼはSEQ ID NO:2において示すVal54における置換又は別のターマミル様α−アミラーゼにおける対応の位置における置換を含んで成る、方法。 1. A process for the preparation of glucose syrups that processes the starch Termamyl (Termamyl) like α- amylase, wherein said α- amylase SEQ ID NO: substitution or another Termamyl-like in Val54 shown in 2 alpha - comprises a substitution at a corresponding position in the amylase method.
  2. 【請求項2】 前記変異体が骨格としてB. Wherein B. said variant as a scaffold リシェニホルミス(B.lic Licheniformis (B.lic
    heniformis)を利用して下記の変異体 V54A,R,D,N,C,E,Q,G,H,I,L,K,M,F,P,S,T Heniformis) using the following variants V54A, R, D, N, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T
    ,W,Y のいずれかであるか、又は対応の置換を有する別のターマミル様変異体である、 , W, or is either Y, or a corresponding another Termamyl-like variants with substitutions in,
    請求項1記載の方法。 The method of claim 1, wherein.
  3. 【請求項3】 前記ターマミル様変異体がV54W,YもしくはFの置換体の一つであるか、又は別のターマミル様α−アミラーゼの対応の変異体である、 Wherein the Termamyl-like variants V54W, a Y or whether it is one of the substituents of F, or another corresponding variants of Termamyl-like α- amylase,
    請求項2記載の方法。 The method of claim 2 wherein.
  4. 【請求項4】 前記デンプンを請求項2〜4のいずれか1項のα−アミラーゼ変異体で20〜100時間、好ましくは50〜80時間、特に60〜75時間処理する、請求項1〜3のいずれか1項記載の方法。 Wherein 20 to 100 hours at α- amylase variant of any one of claims 2 to 4, said starch, preferably for 50 to 80 hours, in particular 60 to 75 hours, according to claim 1 to 3 any one method according.
  5. 【請求項5】 請求項1〜4のいずれか1項記載の方法により得られうるグルコースシロップ。 5. A glucose syrup obtainable by the method of any of claims 1-4.
  6. 【請求項6】 食品中の成分としての請求項5記載のグルコースシロップの使用。 6. Use of glucose syrup of claim 5 wherein as a component of the food.
  7. 【請求項7】 グルコースシロップの調製のための骨格としてSEQ ID NO:2を利用して位置Val54において置換を有するターマミル様α−アミラーゼ又は別のターマミル様α−アミラーゼの使用。 7. A scaffold as SEQ ID NO for the preparation of glucose syrup: Use of Termamyl-like α- amylase or another Termamyl-like α- amylase having a substituent at 2 position Val54 utilized.
  8. 【請求項8】 SEQ ID NO:2に示すB. 8. SEQ ID NO: 2 are shown B. リシェニホルミスα−アミラーゼが変異体ならその骨格である、請求項7記載の使用。 Licheniformis α- amylase is its backbone if variant, the use of claim 7 wherein.
  9. 【請求項9】 前記変異体が骨格としてB. 9. B. The variant as a scaffold リシェニホルミスα−アミラーゼを利用してV54A,R,D,N,C,E,Q,G,H,I,L,K,M,F V54A utilizing licheniformis α- amylase, R, D, N, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, F
    ,P,S,T,W,Yのいずれかであるか、又は対応の置換を有する別のターマミル様変異体である、請求項8記載の使用。 , P, S, T, W, or is either Y, or another Termamyl-like variants with substitutions in correspondence Use according claim 8.
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