JP2002504106A

JP2002504106A - オイル・イン・ウォーターワクチン組成物

Info

Publication number: JP2002504106A
Application number: JP50158899A
Authority: JP
Inventors: ガルコン，ナタリー; マリークリスティーヌアリーヌフランソワーズモマン，パトリシア
Original assignee: スミスクラインビーチャムバイオロジカルズソシエテアノニム
Priority date: 1997-06-11
Filing date: 1998-06-03
Publication date: 2002-02-05
Also published as: CN1260723A; TR199903048T2; BR9810614A; NO996133L; PL337488A1; GB9711990D0; HUP0004001A3; AU8336598A; KR20010013644A; CO4940401A1; CA2293444A1; HUP0004001A2; IL133126A0; ZA984969B; AR012959A1; WO1998056414A1; AU728759B2; NO996133D0; EP0999852A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、トリグリセリドを含む、実質的に300〜600nmの油滴径を有する改良された安定なオイル・イン・ウォーターエマルション、及びそれらのワクチンアジュバントとしての使用に関する。

Description

【発明の詳細な説明】オイル・イン・ウォーターワクチン組成物本発明は、オイル・イン・ウォーター（Ｏ／Ｗ）ワクチン組成物の改良に関する。特に、本発明は、トリグリセリドを含むことにより改良されている、代謝可能な油スクアレン、α−トコフェロール、TWEEN80を含むオイル・イン・ウォーターエマルションに基づくワクチンアジュバント製剤に関し、更に、これらのワクチンアジュバントは、任意に、QuilA(好ましくはQS21)及び3D-MPLの免疫学的に活性な画分を含み得る。トリカプリリン（C₂₇H₅₀O₆）は、トリグリセリドファミリーの油であり、当該技術分野で周知である（The Lipid Handbook（1986）Eds．Gunstone，F.，Harwo od，J.及びPadley，F．(Chapman and Ha11，page 368〜377)。 QS21は、南アメリカの木、Quillaja Saponaria Molinaの樹皮からのサポニンのHPLCで精製された非毒性画分であり、その生産方法は、米国特許第5,057,540 号に開示される（QA21としても知られる）。３De−Ｏ−アシル化モノホスホリル脂質Ａは、Ribi Immunochem，Montanaにより製造される公知のアジュバントである。それは、化学的に、４，５、又は６のアシル化鎖との３のDe−Ｏ−アシル化モノホスホリル脂質Ａの混合物として供給される。あるいは、それは、GB 2,220,211（Ribi）の開示に従って製造することができる。３De−Ｏ−アシル化モノホスホリル脂質Ａの好ましい型及びその製造方法は国際特許出願第92／116556に開示される。オイル・イン・エマルション自体は当該技術分野で公知であり、アジュバント組成物として役立つと示唆されている（EP 0 399 843）。国際特許出願WO95／17210は、免疫刺激剤QS21及び／又は3D-MPLと共に任意に調剤された、スクアレン、α−トコフェロール、及びTWEEN80に基づくエマルションシステムを開示する。これらは、特定のモデルシステムにおける細胞障害性Ｔ細胞を含む広範囲の免疫応答の極めて潜在的なインデューサーである。CTL応答の誘導は、標的抗原の酵素分解が細胞質内でおこる、標的細胞の感染又は腫瘍抗原の非制御の合成の間に自然におこる。この現象は、病原体由来の細胞質ペプチド又は腫瘍特異的抗原がTh１経路に入り、MHCクラスＩ分子と会合した細胞の表面上に提示されるのを許容する。ワクチン抗原が宿主細胞の細胞質に入らず、複製しないなら、それはTh２経路に入り、最終的に、MHCクラスII分子と会合した細胞の表面上に提示されるであろう。この別の経路は、一般に、Ｔ−ヘルパー応答及び抗原特異的応答を生ずる。上述の通り、ワクチン接種の後、病原体特異的抗原は宿主細胞の細胞質に入らず、それゆえ、Th１経路に入らず、最終的にCTL応答を誘導しないであろう。Th １応答が刺激されたと認識されたシグナルは、Th１型サイトカイン、例えばIFN −γ及びIL−２の生産を増強させる。IFN−γ分泌は、寄生体、細菌及びウイルスを含む細胞内病原体に対する保護的応答に関連する。IFN−γによる白血球の活性化は細胞内病原体の殺傷力を増強し、Fcレセプターの発現を増加させる。特にリンホトキシン（TH１細胞の別の産物）と共同作用で、直接的な細胞毒性も生じ得る。IFN−γは、保護の主要な内在性エフェクターであるNH細胞のインデューサー及び産物の両方でもある。TH型応答は、IFN−γ又は他のメカニズムのいずれかを通して、ネズミIgG2aイムノグロブリンアイソタイプのための好ましい補助を与える。 3D-MPL及びQS21と共に調剤された上述の特許出願(国際特許出願WO95／17210) に言及されるオイル・イン・ウォーターエマルションはTh１型免疫応答の潜在的なインデューサーである。従って、抗原と会合した時のこれらのアジュバントは、Th１応答と関連するIgGのサブアイソタイプ(ネズミIgG2a)を有利に刺激し、大きなレベルのIFN−γ生産及び抗原特異的細胞障害性Ｔリンパ球(CTL)応答も誘導するであろう。塩基性オイル・イン・ウォーター／QS21／3D-MPL製剤が強力な細胞溶解性Ｔリンパ球応答を誘導し得るという観察結果は、これらの特定の動物モデルにおける応答が病気に対する保護を誘導することが示されているので、重大である。上述の国際特許出願WO95／17210に記載される例は、異なる径の油の液滴を生ずる製剤の種々の方法を比較している。光子コリレーション分光法（マス・ディストリビューション）により測定した約500nmの粒径を有する調製物は優れたアジュバント特性を示した。この研究は、IgG2a／ｂ抗体タイター及び細胞媒介性免疫性(CMI)の増加に関して、大きなサイズの油滴でアジュバントから得られる大きな利益を強調する。使用が先に議論されている国際特許出願WO95／17210のエマルションは、慣用的な非Th−１誘導性アジュバントより明らかに大きな利点を有する。より大きな粒子が免疫応答を誘導するための最大の大きさの液滴であるとして調製物の中で目立っているという事実にかかわらず、それは安定性の欠如という欠点を有する。不幸なことに、エマルション中の油滴の大きなサイズのため、免疫応答の誘導のために有益であるがそのエマルションは分解する。実際、均一なワクチン調製物を得るために、エマルションは使用直前に作られなければならない。本発明は、エマルション不安定性の問題を解決し、最適なアジュバント性のための大きなオイル・イン・ウォーター液滴の好ましい径を保持する。これは、トリグリセリド油の存在下でのオイル・イン・ウォーターエマルションの調剤により達成された。本発明のオイル・イン・ウォーターエマルションは安定である。これにより、油滴の径は長期間にわたって比較的一定のレベルを保持する。好ましくは、本発明のエマルションは、４℃で１年、好ましくは２年にわたってクリームにならず、又は２相に分離しないであろう。従って、本発明の１つの好ましい実施形態において、３De−Ｏ−アシル化モノホスホリル脂質Ａにコンジュゲートした抗体、 QS21、トリグリセリド及びオイル・イン・ウォーターエマルションを含むワクチン又は医薬製剤を供する。ここで、トリグリセリドは、トリカプリリンであり得、オイル・イン・ウォーターエマルションは、代謝性油（例えばスクアレン）、 α−トコフェロール及びTWEEN80を含む。このような製剤は広範囲の一価又は多価ワクチンのために適する。更に、オイル・イン・ウォーターエマルションはSp an85を含み得る。３De−Ｏ−アシル化モノホスホリル脂質Ａの好ましい形態は、第92116556-Smithkline Beecham Brological s.a．で公開された国際特許出願に開示される。安定なオイル・イン・ウォーターエマルション内に見い出される油滴の大きさの範囲は本発明の重要な点である。本発明の実施形態は光子コリレーション分光法により測定して実質的に300〜600nm、好ましくは実質的に約350〜550nm、最も好ましくは実質的に450〜500nmの直径であろうと考えられる。本明細書に記載される例の多くは実質的に500nmの液滴の大きさを有するが、本発明は、油滴が実質的に500nm超の径であるオイル・イン・ウォーターエマルションに適用でき、これにより油滴は600nm又はそれ超の範囲内であり得ることが当業者に認められよう。従って、油滴の径は実質的に500〜600nmの範囲内であり得る。本発明に実質的に関連する定義は、油滴の数の80％超、好ましくは90％超、最も好ましくは95％超が上述の範囲内にあることである。いずれのオイル・イン・ウォーター組成物もがヒト投与のために適切であるために、エマルションシステムの油相は代謝性の油を含まなければならない。代謝性油という用語の意味は当該技術分野で公知である。代謝性とは、“代謝によって変換され得ること ”として定義することができる（Dorland's Illustrated Medical Dictionary， W.B.Sanders Company，25th edition(1974)）。油は、受容体に毒性でなく、かつ代謝によって変換され得る植物油、魚油、動物油又は合成油のいずれかであり得る。ナッツ、種子、及び穀物は植物油の一般的なソースであるみ得る。スクアレン（２，６，10，15，19，23−ヘキサメチル−２，６，10，14 ，18，22−テトラコサヘキサエン）は、サメ肝臓油に大量に並びにオリーブ油、コムギ胚芽油、コメヌカ油、及びイーストに少量、見い出される不飽和油であり、本発明に用いるために特に好ましい油である。スクアレンは、それがコレステロールの生合成における中間体であるという事実により代謝性油である（Merck index，10th Edition，entry no.8619）。オイル・イン・ウォーターエマルションは、それ自体で又は他のアジュバントもしくは免疫刺激剤と共に利用することができ、それゆえ、本発明の重要な実施形態は、スクアレン又は他の代謝性油、トリグリセリド、例えばトリカプリリン、α−トコフェロール、及びポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート(TWE EN80^TM)を含むオイル・イン・ウォーター製剤である。オイル・イン・ウォーターエマルションは、span85及び／又はLecithinも含み得る。これにより、１つの特定の実施形態において、本発明は、スクアレン、TWEEN80^TM、α−トコフェロールからなるオイル・イン・ウォーターエマルションを含むアジュバント組成物であって、該エマルション内の油滴が実質的に300〜600nmの平均径を有する組成物を含む。本発明は、スクアレン、TWEEN80^TM、α−トコフェロールからなるオイル・イン・ウォーターエマルション、及び抗原又は抗原調製物を含むワクチンであって、該エマルション内の油滴が実質的に300〜600nmの平均径を有するワクチンも供する。別の好ましい実施形態において、上述のアジュバント組成物又はワクチン組成物は、QS21及び3D-MPLを更に含む。好ましくは、本発明のワクチン製剤は、ヒト病原体に対して免疫応答を誘発することができる抗原又は抗原組成物を含む。ここで、抗原又は抗原組成物は、HI V−１(例えばtat，nef，gp120又はgp160)、ヒトヘルペスウイルス、例えはgDもしくはその誘導体又はHSV1もしくはHSV2からのICP27のようなImmediate Earlyタンパク質、サイトメガロウイルス(特にヒト)(例えばgB又はその誘導体)、ロタウイルス（例えば弱毒化ウイルス）、エプスタイン・バールウイルス（例えばgp35 0又はその誘導体）、Varicella Zosterウイルス（例えばgpＩ，II及びIE63）から、又は、肝炎ウイルス、例えばＢ型肝炎ウイルス（例えばＢ型肝炎表面抗原又はその誘導体）、Ａ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス及びＥ型肝炎ウイルスから、又は他のウイルス病原体、例えばパラミキソウイルス：Respiratory Syncyt ialウイルス（例えばＦ及びＧタンパク質又はその誘導体）、パラインフルエンザウイルス、麻疹ウイルス、おたふくかぜウイルス、ヒトパピローマウイルス（例えば、HPV6，11，16，18、例えばＬ１，Ｌ２，Ｅ６又はＥ７抗原）、フラビウイルス（例えば黄熱病ウイルス、デングー熱ウイルス、ダニ媒介脳炎ウイルス、日本脳炎ウイルス）又はインフルエンザウイルスから、又は細菌原、例えばネイッセリア種（Neisse ria spp. ）、例えばＮ．ゴノリヘア（N.gonorrhea）及びＮ．メニンギチジス(N ．meningltidis )(例えばカプセル状ポリサッカライド及びそのコンジュゲート、トランスフェリン結合タンパク質、ラクトフェリン結合タンパク質、Pilcアドヘシン)；ストレプトコッカス種（Streptococcus spp.）、例えば、Ｓ．ニューモニアエ(S ．pneumoniae)(例えば、カプセル状ポリサッカライド及びそのコンジュゲート、PsaA，PspA、ストレプトリシン、コリン結合タンパク質)、Ｓ．ピオゲネス(S ．pyogenes)(例えばＭタンパク質又はそのフラグメント、C5Aプロテアーゼ、リポテイコ酸)、Ｓ．アガラクチアエ(S ．agalactiae)、Ｓ．ムタンス（S ．m utans ）；ヘモフィルス種（Haemophilus spp.）、例えばＨ．インフルエンザＢ型(H ．influenza)(例えば、PRP及びそのコンジュゲート)、ノン・タイパブルＨ．インフルエンザ(non typeable H ．influenzae)(例えばOMP26、高分子量アドヘシン、Ｐ５，Ｐ６、リポプロテインＤ)、Ｈ．デュクレイ（H ．ducreyi）；モラキセラ種（Moraxella spp.）、例えばブランハメラ・カタルハリス（Branhamell a catarrhalis ）としても知られるＭ．カタラリス(M ．catarrhalis)(例えば、高及び低分子量アドヘシン及びインバシン)；バルデテラ種（Bordetella spp ．）、例えばＢ．ペルツシス(B ．pertussis)(例えば、ペルタクチン、百日咳毒素又はその誘導体、繊維状ヘマグルチロニン、アデニレートシクラーゼ、フィムブリエ)、Ｂ．パラペルチシス（B ．parapertussis）及びＢ．ブロンキセプチカ（B ． bronchiseptica ）；マイコバクテリア種（Mycobacterium spp.）、例えば、Ｍ．ツベルクロシス(M ．tuberculosis)(例えば、ESAT6，Antigen85A，-B又は-C)、Ｍ．ボビス（M ．b ovis ）、Ｍ．レプラエ（M ．leprae）、Ｍ．アビウム（M ．avium）、Ｍ．パラツベルクロシス（M ．paratuberculosis）、Ｍ．スメグマチス（M ．smegmatis）；レジオネラ種（Legionella spp ．）、例えばＬ．ニューモフィラ（L ．pneumophi la ）；エスケニキア種（Escherichia spp.）、例えば腸毒性大腸菌（例えばコロニゼーション因子、熱不安定性毒素又はその誘導体、熱安定性毒素又はその誘導体）、腸出血性大腸菌、腸病原性大腸菌（例えばシガ(shiga)毒素様毒素又はその誘導体）；ビブリオ種（Vibrio spp ．）、例えばＶ．コレラ(V ．cholera)(例えばコレラ毒素又はその誘導体)；シゲラ種（Shigella spp ．）、例えばＳ．ソンネイ（S ．sonnei）、Ｓ．ジセンテリアエ（S ．dysenteriae）、Ｓ．フレクスネリイ（S ．fexnerii）；ヤエルシニア種（Yersinia spp ．）、例えばＹ．エンテロコリチカ(Y ．enterocolitica)(例えばYopタンパク質)、Ｙ．ペスチス（Y ．p estis ）、Ｙ．シュードツベルクロシス（Y ．pseudotuberculosis）；カンピロバクター種（Campylobacter spp.）、例えばＣ．ジェジュニ（C．jejuni)(例えば、毒素、アドヘシン及びインバシン)及びＣ．コリ（C ．coli）；サルモネラ種（Salmonella spp ．）、例えば、Ｓ．タイフィ（S ．typhi）、Ｓ．パラタイフィ（S ．paratyphi ）、Ｓ．コレラエスイス（S ．choleraesuis）、Ｓ．エンテリチジス（S ．enteritidis）；リステリア種（Listeria spp ．）、例えばＬ．モノサイトゲネス（L ．monocytogenes）；ヘリコバクター種（Helicobacter spp ．）、例えばＨ．ピロリ(H ．pylori)(例えばウレアーゼ、カタラーゼ、空胞化毒素)；シュードモナス種（Pseudomonas spp.)、例えばＰ．アエルギノサ（P ．aeruginosa ）；スタフィロコッカス種（Staphylococcus spp ．）、例えばＳ．アウレウス（S ．aureus ）、Ｓ．エビダーミジス（S ．epidermidis）；エンテロコッカス種（E nterococcus spp ．）、例えばＥ．ファエカリス（E ．faecalis）、Ｅ．ファエシウム（E ．faecium）；クロストリジウム種（Clostridium spp.）、例えばＣ．テタニ(C ．tetani)(例えば破傷風毒素及びその誘導体)、Ｃ．ボツリヌム(C ．botulinum)(例えばボツリヌス毒素及びその誘導体)、Ｃ．ジフィシレ(C ．difficile)(例えば、クロストリジウム毒素Ａ又はＢ及びその誘導体)；バチルス種（Bacillus spp ．）、例えばＢ．アントラシス(B ．anthracis)(例えば、ボツリヌス毒素及びその誘導体)；コリネバクテリウム種（Corynebacterium spp.）、例えばＣ．ジフテリアエ(C ．diphth eriae )(例えばジフテリア毒素及びその誘導体)；ボレリア種（Borrelia spp ．）、例えばＢ．ブルグドルフェリ(B ．burgdorferi)(例えばOspA，OspC，DbpA，Dbp B)、Ｂ．ガリニイ(B ．garinii)(例えばOspA，OspC，DbpA，DbpB)、Ｂ．アフゼリイ(B ．afzelii)(例えばOspA，OspC，DbpA，DbpB)、Ｂ．アンデルソニィ(B ．ande rsonii )(例えばOspA，OspC，DbpA，DbpB)、Ｂ．ヘルムシイ（B ．hermsii）；エールリチア種（Ehrlichia spp.）、例えばＥ．エクイ（E ．equi）及びヒト顆粒球Ehrlichiosisの作因体；リケットシア種（Rickettsia spp ．）、例えばＲ．リケットシイ（R ．rickettsii）；クラミジア種（Chlamydia spp.）、例えばＣ．トラコマチス(C ．trachomatis)(例えば、MOMP、ヘパリン結合タンパク質)、Ｃ．ニューモニアエ(C ．pneumoniae)(例えばMOMP、ヘパリン結合タンパク質)、Ｃ．シタチ（C ．psittaci）；レプトスピラ種（Leptospira spp ．）、例えばＬ．インテロガンス（L ．interrogans）；トレポネマ種（Treponema spp.）、例えばＴ．パリドゥム(T ．palidum)(例えばレア外膜タンパク質)、Ｔ．デンチコラ（T ．d enticola ）、Ｔ．ヒオジセンテリアエ（T ．hyodysenteriae）から；又は寄生体、例えばプラスモジウム種（Plasmodium spp ．）、例えばＰ．ファルシパルム（P ．falciparu m ）；トキソプラズマ種（Toxoplasma spp ．）、例えばＴ．ゴンジイ(T ．gondii) (例えばSAG2，SAG3，Tg34)；エンタモエバ種（Entamoeba spp.）、例えばＥ．ヒストリチカ（E ．histolytica）；バベシア種（Babesia spp.）、例えばＢ．ミクロチ（B ．microti）；トリパノソマ種（Trypanosoma spp.）、例えばＴ．クルジ（T ．cruzi）；ジアルジア種（Giardia spp.）、例えばＧ．ランブリア（G ．lam blia ）；レシマニア種（Leshmania spp.）、例えばＬ．メジャー（L ．major)；ニューモサイスチス種（Pneumocystis spp ．）、例えばＰ．カリニイ（P ．carin ii ）；トリコモナス種（Trichomonas spp.）、例えばＴ．バギナリス（T ．vagin alis ）；スキゾストマ種（Schisostoma spp.）、例えばS．mansoni（S ．mansoni ）から、又はイースト、例えばカンジダ種（Candida spp.）、例えばＣ．アルビカンス（C ．albicans）；クリプトコッカス種（Cryptococcus spp ．）、例えばＣ．ネオホルマンス（C ．neoformans）から得られる。Ｂ型肝炎表面抗原の誘導体は当該技術で公知であり、とりわけ、欧州特許出願 EP-A-414 374;EP-A-0 304 578及びEP 198-474に記載されるPreS1，PreS2 S抗原を含む。１つの好ましい態様において、本発明のワクチン製剤は、特にCHO細胞内で発現される場合に、HIV−１抗原、gp120を含む。更なる実施形態において、本発明のワクチン製剤は、先に定義されるようなgD2tを含む。本発明の好ましい実施形態において、クレームされるアジュバントを含むワクチンは、生殖器の疣贅の原因であると考えられるHPVウイルス（HPV6又はHPV11等）、及び子宮頸癌の原因であるHPVウイルス（HPV16，HPV18等）を含む。ワクチンの特に好ましい型は、Ｌ１粒子又はキャプソメア、並びにHPV6及びHPV11タンパク質Ｅ６，Ｅ７，ＬＩ、及びＬ２から選択された１又は複数の抗原を含む融合タンパク質を含む。融合タンパク質の最も好ましい型は、GB95／5478.7に開示されるL2E7、及びGB97／7953.5に開示されるプロテインＤ（１／３）−Ｅ７である。本発明のワクチンは、マラリアを引きおこす寄生体由来の抗原を更に含む。例えば、プラスモジア・ファルシパルム（Plasmodia falciparum）からの好ましい抗原はRTS，S及びTRAPを含む。RTSは、Ｂ型肝炎ウイルスの表面（Ｓ）抗原に、Ｂ型肝炎表面抗原のプレＳ２部分の４つのアミノ酸を通して連結したＰ．ファルシパルムのサ−カムスポロゾイテ（CS）タンパク質のＣ末端部分全てを実質的に含む。その全ての構造は、UK特許出願9124390.7号から優先権を主張するWO93／1 0152の国際特許出願PCT／EP92／02591に開示される。イースト内で発現される場合、RTSはリポプロテイン粒子として生産され、それが、HBVからのＳ抗原と同時に発現される場合、それは、RTS，Sとして知られる混合粒子を作り出す。TRAP抗原はWO90／01496の国際特許出願PCT／GB89／00895に記載される。本発明の好ましい実施形態はマラリアワクチンであり、その抗原調製物はRTS，S及びTRAP抗原の組合せを含む。多段階マラリアワクチンの成分としての候補となり得る他の変形体は、Ｐ．ファシパルムMSP1，AMA1，MSP3，E13A，GLURP，RAP1，RAP2，Seque strin，PfEMP1，Pt332，LSA1，LSA3，STARP，SALSA，PfEXP1，Pfs25，Pfs28，PF S27／25，Pfs16，Pfs48／45，Pfs230及びプラスモジウム種(Plasmodium spp.)のそれらのアナログである。本製剤は、抗腫瘍抗原も含み得、免疫治療的癌治療のために役立つ。例えば、アジュバント製剤は、腫瘍拒絶抗原、例えば前立腺、乳、直腸結腸、肺、膵臓、腎臓又は黒色腫癌のためのものでの利用性を見い出す。典型的な抗原には、MAGE1及びMAGE3又は黒色腫の治療のための他のMAGE抗原、PR AME，BAGE又はGAGEがある（Robbins and Kawakamj，1996，Curren t Opinions in Immunology 8，pps 628-636;Van den Eynde et al .，Internati onal Journal of Clinical & Laboratory Research(submitted 1997);Correale et al．(1997)，Journal of the National Cancer Institure 89，p293）。実際、これらの抗原は広範囲の腫瘍型、例えば黒色腫、肺癌、肉腫及び膀胱癌内で発現される。他の腫瘍特異的抗原は、本発明のアジュバントと共に用いるために適しており、これらに限らないが、前立腺特異的抗原(PSA)又はHer-2／neu，KSA(G A733)，MUC-1及び癌胚抗原(CEA)を含む。従って、本発明の一態様において、本発明によるアジュバント組成物及び腫瘍拒絶抗原を含むワクチンを供する。本発明の１つの特に好ましい実施形態は、ホルモン抗原ゴナドトロピン放出ホルモン（GnRH）を含むワクチン組成物である。この抗原の免疫原コンジュゲートはWO95／20600，EP 0117934，US 4,302,386及びUS 5,006,334に開示される。このようなワクチンは、癌の治療において特に役立つ。本発明の組成物はボレリア種（Borrelia sp.）由来の抗原を含むワクチンを製剤するのに用いられよう。例えば、抗原は、核酸、病原体由来抗原又は抗原性調製物、組換え生産されたタンパク質又はペプチド、及びキメラ融合タンパク質を含み得る。特に、抗原はOspA である。OspAは、宿主細胞（大腸菌）により(Lipo-OspA)と呼ばれる脂質化型の全体の成熟タンパク質であっても非脂質化誘導体であってもよい。このような非脂質化誘導体は、インフルエンザウイルスの非構造タンパク質(NSI)の最初の81 のＮ末端アミノ酸、及び完全なOspAタンパク質を有する非脂質化NSI-OspA融合タンパク質を含み、別に、MDP-OspAは３つの更なるＮ末端アミノ酸を有するOspAの非脂質化型である。本発明のワクチンは、アレルギーの予防又は治療のために用いることができる。このようなワクチンは、アレルゲン特異的(例えば Derp1)及びアレルゲン非特異的抗原（例えばstanworthデカペプチド）を含むであろう。本発明の更なる態様において、医療に用いるための本明細書に記載されるワクチンを供する。本発明のワクチン調製物は、前記ワクチンを粘膜経路を通して、例えば経口又は鼻内経路を通して、又は非経口経路、例えば筋内経路により投与することにより、病気になりやすい又はそれを患う哺乳動物を保護又は治療するのに用いることができる。本発明の一実施形態において、トリカプリリン：代謝性油、好ましくはスクアレンの比は、１：10〜10：１、好ましくは１：５〜５：１のオーダーであろう。 QS21：3D-MPLの比は、典型的には、１：10〜10：１、好ましくは１：５〜５：１のオーダー、しばしば実質的に１：１であろう。最適な共同作用のための好ましい範囲は2.5：１〜１：１の3D-MPL：QS21である。典型的には、ヒト投与のため、QS21及び3D-MPLは、投与量当り１μｇ〜1000μｇ、好ましくは10μｇ〜500μ ｇ、より好ましくは20〜200μｇ、より好ましくは20〜100μｇ、そして最も好ましくは10〜50μｇでワクチン中に存在するであろう。典型的には、水中の油は、２〜10％のスクアレン、２〜10％のα−トコフェロール及び0.3〜３％のTWEEN80 を含むであろう。好ましくは、スクアレン：α−トコフェロールの比は１に等しい又は１より小さい。なぜならこれは、より安定なエマルションを供するからである。Span85は、１％のレベルでも存在し得る。特定の場合、本発明のワクチンは、別の安定剤を更に含むであろう。ワクチン調製物は、一般にNew Trends and Developments in Vaccines，edited by Voller et al.，University Park Pres s，Baltimore，Maryland，U.S.A．1978に記載される。リポソーム内への被包は、例えばFullerton、米国特許4,235,877に記載される、タンパク質の高分子へのコンジュゲーションは、例えば、Likhite、米国特許4,372,9 45に、及びArmorら、米国特許4,474,757に記載される。各々のワクチン中のタンパク質の量は、典型的なワクチン接種者において大きな逆の副作用なく免疫保護応答を誘導する量として選択される。このような量は、用いる特定の免疫原及びいかに供されるかに依存して様々であろう。一般に、各々の投与量は、１〜1000μｇ、好ましくは２〜100μｇ、最も好ましくは４〜4 0μｇのタンパク質を含むであろう。特定のワクチンのための最適な量は、被検体における適切な免疫応答の観察に関する標準的研究により確認することができる。最初のワクチン接種の後、被検体に、１又は数回の適当に間隔をあけたブースター免疫化を行うことができる。例に記載されるオイル・イン・ウォーターエマルションを生産する方法は、油相をPBS／TWEEN80^TM溶液と混合し、次にホモジェナイザーを用いてホモジナイズすることを含み、その混合物をシリンジ針に２回、通すことを含む方法が少量の液体をホモジナイズするために適しているであろうことは当業者に明らかであろう。同様に、マイクロフルーダイザー（６barの最大入力圧（約850barの出力圧）における２分の時間の最大50回のM110Sマイクロフルイディクスマシン）での乳化過程は、より少い又はより多い容量のエマルションを作るように当業者により適合され得るであろう。この適合は、必要な径の油滴の調製物が達成されるまで、生じたエマルションの測定を含む慣用的な実験により達成することができよう。本発明の製剤は、予防及び治療目的の両方のために用いることができる。また、本発明は、２年間、安定でないオイル・イン・ウォーターエマルションを安定化させるための方法であって、トリグリセリドを油相に添加することを含む方法を供する。好ましくは、この方法に用いるトリグリセリドはトリカプリリンである。実施例１．アジュバント製剤有機相（α−トコフェロール、トリカプリリン及びスクアレン）、水性相(PBS )、及び１又は複数の乳化剤(TWEEN80を含む)から構成されるオイル・イン・ウォーターエマルションアジュバントを、WO95／17210に記載されるのと同様に製造する。 TWEEN80をリン酸緩衝塩類溶液(PBS)に溶かしてPBS中0.4％の溶液を供する。10 0mlのエマルションを供するために、５ｇのDLα−トコフェロール、０〜５mlのスクアレン、及び０〜５mlのトリカプリリンをゆっくりと加え、次にボルラキレングして全体を混合した。油相を撹拌しながら、90mlのPBS／TWEEN80溶液を滴下して加え、全体を混合する。次に、生じた調製物をホモジナイザー(ultrathurax型)を用いてホモジナイズする（あるいは、少量について、シリンジに２回、通すことによりホモジナイズすることができる）。その調製物をマイクロフルーダイザー(M110Sマイクロフルーディクスマシーン )を通すことにより乳化する。そのエマルションを、６barの最大入力圧（約850b arの出力圧）で２分、最大50回、行う。生じた油滴は約300〜600nmの大きさを有する。テストしたオイル・イン・ウォーターエマルションの詳細について、表１を参照のこと。表１．安定性アッセイに用いるための任意にトリカプリリンを含むSB26エマルションの製剤実施例２．アジュバント安定性１先の実施例に記載されるアジュバントの安定性を、種々の時間及び保存条件で研究した。アジュバント調製物の最初の大きさを75℃で８時間の保存、37又は45 ℃で１ヶ月の保存、４℃で12ヶ月の保存、又は3000×ｇでの遠心を含む加速衰弱テスト後に見い出されたものと比較した。オイル・イン・ウォーター滴の平均径は、光子相関分光法により測定し、カウント数（CR）、強度分布、重量分布、及び粒子の平均径として表した（表５）。以前は不安定であった大きな粒子のオイル・イン・ウォーターエマルションアジュバント製剤へのトリカプリリンの添加は、これらのエマルションを、長期にわたって安定にする。本発明は、この潜在的に研究所ベースのアジュバントシステムを、長期の商業的環境に用いることを可能にする。実施例３．アジュバント安定性２アジュバント安定性実験（実施例２を参照）を、長期にわたってくり返した。結果を表６に示す。結果は、トリカプリリンを含むオイル・イン・ウォーターエマルションがそれを含まないものと比べて、長期間にわたって安定であることを証明する。実施例４．安定なオイル・イン・ウォーターエマルションアジュバントを用いるマウスでのワクチン接種研究 Balb／ｃマウスのグループに、マラリア抗原RTS，S，HIVgp120、オイル・イン・ウォーターエマルション、及び任意にトリカプリリンを含む実験用ワクチンを、３回（０，14，28日目）に筋内に免疫化した。用いたSB26オイル・イン・ウォーターエマルションは、WO95／17210に記載される技術に従って調製した。これらのエマルションは、500nmの平均油滴径を有し、１ヶ月の半減期を有した。SB6 2(150nm−２年超、安定)もWO95／17210に記載される技術に従って作り、生じた免疫応答がトリカプリリンの添加によって妨げられないことを確認するために比較した。 SB26T1及びSB26T2.5は約500nmの平均粒径を有し、２年にわたって安定である。３De−Ｏ−アシル化モノホスホリル脂質Ａ（3D-MPL）はGB 2220211（Ribi）から周知である。QS21は、南アメリカの木Quillaja Saponaria Molinaの樹皮からのサポニンのHPLC精製した非毒性画分であり、その生産の方法は、（QA21として）米国特許第 5,057,540号に開示される。３回目のワクチン接種後14日の、体液性応答についての結果を以下の表２に示す。要約すると、SB26Tは極めて能力のあるワクチンアジュバントとして機能した。形成された応答は、より小さな液滴径のオイル・イン・ウォーターエマルション（SB62）により形成されたものより大きかった。表２．HBsAg特異的抗体応答単離した脾臓細胞及び膝窩リンパ節細胞の両方のCTL応答も測定した。結果を図２に示す。要約すると、SB62製剤は、３回目のワクチン接種後14日目に測定してRTS，S特異的（HBs抗原CTL特異性により測定)CTL活性を上手く誘導した。２つのSB26T製剤も、CTL活性の相当するレベルを誘導した。実施例５．マウスにおけるアジュバントシステムにより形成された抗体のアイソタイププロフィールの研究実施例４に記載されるワクチン接種実験の間に、最後のワクチン接種後14日目にサンプルを採取した。そのサンプルを、形成されたIgGサブアイソタイプのプロフィールを研究するために市販の標準ELISAアッセイによりアッセイした。結果を図１及び表３に示す。要約すると、安定なエマルションアジュバントは、同様のIgGサブアイソタイプを刺激し、強力なTh１及びTh２型免疫応答を示した。表３．HBsAg特異的抗体アイソタイプ比実施例６．安定なオイル・イン・ウォーターエマルションアジュバントを用いるアカゲザルにおけるワクチン接種研究５匹のアカゲザルのグループを、表４に示されるワクチン製剤で３回（０，28 及び84日目）、免疫化した。抗原RTS，S及びgp120を上述の通り生産した。そのワクチンは、左(gp120)又は右（RTS，Ｓ）足の背部にボーラス注入として筋内に投与した。各々のワクチンの最終容量は0.5mlであった。表４．アカゲザル研究に用いたワクチン製剤各々のワクチン接種後14日目に、血液サンプルをとり、抗原特異的及び細胞媒介応答についてアッセイした。サル末梢血液単核細胞（PBMC）の抗原特異的増殖応答を以下の手順を用いてアッセイした：・５％FCS及び抗体を含むRPMI1640培地中の（Falcon丸底組織培養処理した96 ウエルプレート中の）２×10⁵／mlの密度のficoll単離したPBL 100μｌを４回重複で培養する。ELIspotアッセイのために平底フラスコ培養プレートを用いることに注意のこと。・要求される濃度で希釈物当り100μlのタンパク質を加える。培地のみを陰性対照として含め、ConA（５μｇ／ml）を陽性対照として含める。・細胞を72時間、培養した後、１μCi／ウエルの３Ｈ−チミジンを加える。・16〜18時間、完全な培地中20倍希釈した3H-TdR（１mCi／mlストック）20μ ｌを加える。・プレートハーベスターを用いて培養物を特別のフィルタープレート上に収集する。・β−カウンターで放射能を測定する。全ての細胞培養物を37℃、７％CO₂、90％湿度でインキュベートする。抗RTS，S体液性応答(HBs抗原を用いて測定)を、ELISA技術（実施例１を参照）を用いてアッセイし、結果を図３に示す。抗gp120体液性応答を、ELISA技術（実施例１を参照）を用いてアッセイし、結果を図４に示す。PBMC増殖により測定した抗RTS，S及びgp120細胞媒介応答を図５に示す。表５．アジュバント安定性（実施例12を参照のこと）表６．アジュバント安定性（実施例13を参照のこと）

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】平成１１年６月１６日（１９９９．６．１６）【補正内容】請求の範囲１．安定なオイル・イン・ウォーターエマルションを含むアジュバント組成物であって、その油滴が300〜600nmの範囲の平均直径を有し、その油相が、スクアレン、α−トコフェロール及びトリグリセリドを含むことを特徴とするアジュバント組成物。２．安定なオイル・イン・ウォーターエマルションを含むアジュバント組成物であって、その油滴が300〜600nmの範囲の平均直径を有し、該オイル・イン・ウォーターエマルションがスクアレン；α−トコフェロール； TWEEN80^TMを含む乳化剤；及びトリグリセリドを含むことを特徴とするアジュバント組成物。３．安定なオイル・イン・ウォーターエマルションを含むアジュバント組成物であって、その油滴が300〜600nmの範囲の平均直径を有し、前記オイル・イン・ウォーターエマルションが代謝性油及びトリグリセリドを含み、前記アジュバントが、QS21及び3D-MPLから選択される免疫刺激剤を更に含むことを特徴とするアジュバント組成物。４．前記代謝性油がスクアレンであることを特徴とする請求項３に記載のアジュバント組成物。５．前記トリグリセリドがトリカプリリンであることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載のアジュバント組成物。６．前記トリグリセリド：代謝性油の比が１：10〜10：１の範囲内にあることを特徴とする先の請求項のいずれかに記載のアジュバント組成物。７．前記トリグリセリド：代謝性油の比が１：５〜５：１の範囲内にあることを特徴とする先の請求項のいずれかに記載のアジュバント組成物。８．前記オイル・イン・ウォーターエマルションが、１又は複数の免疫調節剤を更に含むことを特徴とする請求項１又は２のいずれかに記載のアジュバント組成物。９．前記免疫調節剤が、QS21及び3D-MPLを含む群から選択されることを特徴とする請求項８に記載のアジュバント組成物。 10．安定剤、例えばポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート(TWEEN80^TM )を更に含む請求項１又は３のいずれか一に記載のアジュバント組成物。 11．抗原又は抗原調製物を更に含む請求項１〜10のいずれか一に記載のアジュバント組成物を含むワクチン組成物。 12．前記抗原又は抗原調製物が、ヒト免疫不全ウイルス；単純ヘルペスウイルス１型；単純ヘルペスウイルス２型；ヒトサイトメガロウイルス；Ａ，Ｂ，Ｃ又はＥ型肝炎ウイルス；RSウイルス；ヒトパピローマウイルス；インフルエンザウイルス；サルモネラ、ナイセリア；ボレリア；クラミジア；ボルデテラ；プラスモディウム及びトキソプラズマを含む群から調製されることを特徴とする請求項 11に記載のワクチン組成物。 13．前記抗原調製物が腫瘍抗原から得られることを特徴とする請求項11に記載のワクチン組成物。 14．前記抗原調製物が、ゴナドトロピン放出ホルモン（GnRH）から得られることを特徴とする請求項11に記載のワクチン組成物。 15．油滴が300〜600nmの範囲の平均直径を有するオイル・イン・ウォーターエマルションと、抗原又は抗原調製物と、QS21と、3D-MPLと、を含むワクチン組成物であって、該オイル・イン・ウォーターエマルションが、代謝性油、トリカプリリン、TWEEN80^TM、及びα−トコフェロールを含むことを特徴とするワクチン組成物。 16．オイル・イン・ウォーターエマルションと、トリカプリリンと、3D-MPLと、QS21と、抗原又は抗原調製物と、を混合することを含む請求項11 〜15のいずれか一に記載のワクチン組成物を製造するための方法。 17．ウイルス、細菌、又は寄生体による疾患になりやすい又はそれを患うヒトを治療するために適した薬剤の製造のための請求項11〜14のいずれか一に記載のワクチンの使用。 18．癌を患うヒトを治療するために適した薬剤の製造のための請求項11〜14のいずれか一に記載のワクチンの使用。 19．油相が代謝性油及びα−トコフェロールを含む、２年間安定であり続けないオイル・イン・ウォーターエマルションを安定化する方法であって、該オイル・イン・ウォーターエマルションの油相にトリグリセリドを添加することを含む方法。 20．前記トリグリセリドがトリカプリリンであることを特徴とする請求項19に記載の方法。 21．前記代謝性油がスクアレンであることを特徴とする請求項19に記載の方法。【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】平成１２年１２月１４日（２０００．１２．１４）【補正内容】（１）明細書第７頁第６〜７行の「Pilcアドヘシン」を、『PilC、アドヘシン』と訂正する。（２）明細書第11頁第２行の「GB97／7953.5」を『GB9717953.5』と訂正する。（３）明細書第11頁第19行の「E13A」を『EBA』に訂正する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｋ 39/02 Ａ６１Ｋ 39/02 39/095 39/095 39/10 39/10 39/112 39/112 39/118 39/118 39/12 39/12 39/145 39/145 39/245 39/245 39/29 39/29 Ａ６１Ｐ 31/00 Ａ６１Ｐ 31/00 31/04 31/04 31/14 31/14 31/16 31/16 31/18 31/18 31/20 31/20 31/22 31/22 33/00 33/00 33/06 33/06 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者モマン，パトリシアマリークリスティーヌアリーヌフランソワーズベルギー国，ベ−1330 リクサンサール, リュドゥアンスティテュ 89，スミスクラインビーチャムバイオロジカルズソシエテアノニム

Claims

【特許請求の範囲】１．安定なオイル・イン・ウォーターエマルションを含むアジュバント組成物であって、その油滴が300〜600nmの範囲の平均直径を有することを特徴とするアジュバント組成物。２．安定なオイル・イン・ウォーターエマルションを含むアジュバント組成物であって、該オイル・イン・ウォーターエマルションが代謝性油及びトリグリセリドを含むことを特徴とするアジュバント組成物。３．安定なオイル・イン・ウォーターエマルションを含むアジュバント組成物であって、その油滴が300〜600nmの範囲の平均直径を有し、前記オイル・イン・ウォーターエマルションが代謝性油及びトリグリセリドを含むことを特徴とするアジュバント組成物。４．安定なオイル・イン・ウォーターエマルションを含むアジュバント組成物であって、その油滴が350〜550nmの範囲の平均直径を有し、前記オイル・イン・ウォーターエマルションが代謝性油及びトリグリセリドを含むことを特徴とするアジュバント組成物。５．前記代謝性油がスクアレンであることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載のアジュバント組成物。６．前記トリグリセリドがトリカプリリンであることを特徴とする請求項２〜５のいずれかに記載のアジュバント組成物。７．前記トリグリセリド：代謝性油の比が１：10〜10：１の範囲内にあることを特徴とする請求項２〜６のいずれかに記載のアジュバント組成物。８．前記トリグリセリド：代謝性油の比が１：５〜５：１の範囲内にあることを特徴とする請求項２〜６のいずれかに記載のアジュバント組成物。９．前記オイル・イン・ウォーターエマルションが、１又は複数の免疫調節剤を更に含むことを特徴とする先の請求項のいずれかに記載のアジュバント組成物。 10．前記免疫調節剤が、QS21；3D-MPL；及びα−トコフェロールを含む群から選択されることを特徴とする請求項９に記載のアジュバント組成物。 11．安定剤、例えばポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート(TWEEN80^TM )を更に含む請求項１〜10のいずれか一に記載のアジュバント組成物。 12．抗原又は抗原調製物を更に含む請求項１〜11のいずれか一に記載のアジュバント組成物を含むワクチン組成物。 13．前記抗原又は抗原調製物が、ヒト免疫不全ウイルス；単純ヘルペスウイルス１型；単純ヘルペスウイルス２型；ヒトサイトメガロウイルス；Ａ，Ｂ，Ｃ又はＥ型肝炎ウイルス；RSウイルス；ヒトパピローマウイルス；インフルエンザウイルス；サルモネラ、ナイセリア；ボレリア；クラミジア；ボルデテラ；プラスモディウム及びトキソプラズマを含む群から調製されることを特徴とする請求項 12に記載のワクチン組成物。 14．前記抗原調製物が腫瘍抗原から得られることを特徴とする請求項12に記載のワクチン組成物。 15．前記抗原調製物が、ゴナドトロピン放出ホルモン（GnRH）から得られることを特徴とする請求項12に記載のワクチン組成物。 16．油滴が300〜600nmの範囲の平均直径を有するオイル・イン・ウォーターエマルションと、抗原又は抗原調製物と、QS21と、3D-MPLと、を含むワクチン組成物であって、該オイル・イン・ウォーターエマルションが、代謝性油、トリカプリリン、TWEEN80^TM）及びα−トコフェロールを含むことを特徴とするワクチン組成物。 17．オイル・イン・ウォーターエマルションと、トリカプリリンと、3D-MPLと、QS21と、抗原又は抗原調製物と、を混合することを含む請求項13〜16のいずれか一に記載のワクチン組成物を製造するための方法。 18．ウイルス、細菌、又は寄生体による疾患になりやすい又はそれを患うヒトを治療するために適した薬剤の製造のための本明細書に実質的に記載される調製物の使用。 19．癌を患うヒトを治療するために適した薬剤の製造のための本明細書に実質的に記載される調製物の使用。 20．２年間安定であり続けないオイル・イン・ウォーターエマルションを安定化する方法であって、該オイル・イン・ウォーターエマルションの油相にトリグリセリドを添加することを含む方法。 21．前記トリグリセリドがトリカプリリンであることを特徴とする請求項20に記載の方法。