【発明の詳細な説明】
軟体動物における促進された成長および真珠の生産
本発明は、一般に、軟体動物を成長促進因子に曝すことによって、真珠を生産
する軟体動物の成長を促進する方法に関する。外因性成長促進因子を発現し得る
トランスジェニック軟体動物、および真珠を養殖する方法がまた提供される。
発明の背景
真珠は、長い間その光沢および輝きの両方について評価されるすばらしい宝石
であると考えられてきた。その「宝石」としての習慣的な分類に関わらず、真珠
は、軟体動物により生産される、動物起源の生産物である。真珠は、一般的に、
軟体動物の組織に異物が埋め込まれた場合に、形成される。異物を取り除くこと
ができない場合、その軟体動物は、その上皮組織または「外套膜」組織から分泌
される炭酸カルシウム組成物で異物を覆う。J.Taburiaux,Pearls：それらの起源
処理および同定、(D.Ceriog-Hughes、Trans.、Chilton Book Co.、1986)。この
分泌物質は、「真珠層」と呼ばれる。長い期間の後、異物は真珠層で覆われ、そ
して一般に真珠として知られるものになる。
「天然真珠」の生産は、もっぱらカキの上皮組織へ異物が埋め込まれる偶然の
出来事に依存するので、カキあたりにおけるこのような天然真珠の収量は低い。
真珠に対する世界的なより高い要求に応じて、カキ業者は、カキの組織に異物を
人工的に導入し始めた。このプロセスから得られる真珠は、「養殖真珠」と呼ば
れる。真珠を養殖することにより、業者は、カキが真珠を生産するために必要な
全ての出発物質を獲得したことを確認し得た。さらに、所望のサイズおよび形の
異物を利用することにより、業者は、ある程度、真珠養殖プロセスの最終産物を
制御し得た。Taburiaux、前出、を参照のこと。
現代の商業的な真珠養殖は、いくつかの種の真珠貝および他の軟体動物（アワ
ビ、クラム、ムラサキガイを含む）を用いて実施される。真珠貝は、成体として
野生から収集されるか、幼体として野生から捕獲されるか、あるいは稚貝回収者
によって「稚貝」として野生から捕獲されるか、または孵化場で繁殖ストック(b
roodstock)を産卵することによって生産され得る。次いでそのカキは、真珠の生
産における使用のために養殖される。一般に、前成体カキとしてまた記載される
、稚貝または幼体のカキはまた、それらが成体のサイズに達し、そして真珠生産
に使用するために十分な大きさになるまでに少なくとも一年の養殖が必要である
。
典型的な真珠養殖プロセスでは、異物、または「核」を、軟体動物、代表的に
はカキの種の生殖組織に植え付ける。「半球形(mabe)」真珠が生産される場合、
この核は軟体動物の貝殻に直接付着され、アクセプター軟体動物の外套膜組織に
直接接触する。外套膜は、カキの器官の集団(collection)を覆う上皮組織の層お
よびカキの貝殼（または殻）の間の組織の層である。これらの器官および外套膜
は、本明細書中で、集合的に軟体動物の「体」と呼ばれる。この外套膜の外側の
部分は、一般に、殻皮層形成および真珠層生産を担う。
従来の真珠養殖において、分離物または「ドナー」軟体動物由来の外套膜組織
の小片は、核の植え付けと同時に外套膜に植え付けられる。核および必要に応じ
てドナー組織が植え付けられる軟体動物は、一般に、「アクセプター」貝殻また
は「アクセプター」軟体動物と呼ばれる。任意の理論と結びつけることなく、ド
ナー外套膜組織は、「真珠嚢」として核を覆い、そして真珠を形成する真珠層を
分泌し、一方アクセプター軟体動物は、プロセスのための栄養分の貯蔵庫として
作用すると考えられている。Taburiaux、前出、を参照のこと。
核の植え付けから真珠の採集までの期間は、18カ月から３年かかり得る。この
長いプロセスに関連する費用の他に、真珠養殖に必要なこの長い期間はまた、カ
キが生存してプロセスを完了しない危険性あるいは色が悪い物質の混入、真珠形
成における圧力の変化、または２つ形成した真珠の集合による真珠の形の変化の
ように、真珠形成において欠陥が生じるという危険性を増加させる。この危険性
は、より大きな真珠が所望される場合にさらに増加される。このようなより大き
な真珠は、より大きな軟体動物および真珠を形成するためのより長い期間を必要
とする。最後に、真珠貝の価格が高いので、大量の真珠養殖のために、これらの
カキを「再利用すること」が所望される。しかし、現在、わずか約３分の１の真
珠貝しか再養殖されていない。Taburiaux、前出、を参照のこと。従って、稚貝
の生産および養殖に必要な期間、ならびに真珠養殖プロセスに必要な期間の削減
が所望される。
東洋カキ(Crassostrea virginica)を、成長促進生物活性ペプチドの種類に曝
すことにより、幼体および成体カキの両方の成長速度を増加させたことが報告さ
れている。Paynter & Chen、Biol.Bull．181：459-462(1991)。特に、ニジマス
成長ホルモンを用いるこれらのカキの外因性の処理は、コントロール群における
それらのカキ以上に貝殼の高さおよび組織の重量を増加させたことが報告された
。
さらに、成長制御ホルモン（インスリンおよび成長ホルモンのような哺乳動物
起源の成長制御ホルモンを含む）の利用は、幼生後のアワビの成長速度を促進す
るのに有効であることが報告されている。Morse、Aquaculture、39：263-282(19
84)、を参照のこと。
本発明は、真珠を生産する軟体動物の成長速度を促進する方法を提供し、そし
てまた促進された成長速度を有する軟体動物を提供する。促進された成長速度は
、真珠生産においてそれらを使用する前に、稚貝が養殖されるのに必要な時間を
削減する。さらに、真珠を生産する軟体動物の成長速度を増加させる結果、植え
付けした核の周囲の真珠層生産の速度が増加し、従って、真珠のための養殖時間
が削減される。このような養殖時間の削減はまた、再養殖され得る軟体動物の数
を増加させ、さらに費用を削減する。それゆえ、真珠生産の収量は、より早い前
養殖および養殖プロセス、真珠軟体動物の再利用により増加され、ならびに生産
された真珠における欠陥を減少する。
発明の要旨
本発明の１つの実施態様は、真珠を生産する軟体動物の成長を促進する方法を
提供する。この方法は、プロモーター配列に作動可能に連結されている成長促進
因子をコードするセグメントを含有する核酸配列を軟体動物の生殖系列に導入す
る工程を包含し、それによりこのセグメントが軟体動物において、成長促進因子
を発現し得る。
別の実施態様において、本発明はまた、トランスジェニック軟体動物を提供し
、軟体動物の生殖系列は外因性の核酸配列を含有する。この外因性の核酸配列は
、
成長促進因子をコードするセグメントを含有し、そして軟体動物において成長促
進因子を発現し得る。
さらなる実施態様において、本発明はまた、真珠を養殖する方法を提供する。
この方法は、アクセプター軟体動物に核を導入する工程を包含する。必要に応じ
て、この方法は、アクセプター軟体動物へドナー軟体動物由来の外套膜組織を同
時導入することを包含し得る。アクセプター軟体動物は、有効量の成長促進因子
に曝され、そして養殖される。養殖後、真珠は、アクセプター軟体動物より採集
される。
好ましい実施態様において、アクセプター軟体動物は、約１nMから約10mMの成
長促進因子の濃度、そしてより好ましくは、約0.1μMから約100μMの成長促進因
子の濃度で成長促進因子を含有する溶液に、アクセプター軟体動物を浸すことに
よって、成長促進因子に曝される。このような曝露は、一般的に約毎月から毎週
まで、または約毎日まで行われる。
関連する実施態様において、アクセプター軟体動物は、アクセプター軟体動物
の内部に、成長促進因子を含有する組成物を挿入することによって成長促進因子
に曝される。成長促進因子を含有する組成物の挿入は、例えば、軟体動物の内部
に組成物を注入するか、または軟体動物の内部に組成物を手で置くことによって
行われる。このような組成物は、溶液中にはない成長促進因子を必要に応じて含
むか、または制御放出組成物のようにマトリックス内に組み込まれ、それにより
成長促進因子の放出が低レベルで一定な制御放出組成物を必要に応じて含む。
さらなる実施態様において、本発明はまた、アクセプター軟体動物に、核およ
びドナー軟体動物由来の外套膜組織を導入する工程を包含する真珠を養殖する方
法を提供する。ここで、ドナー軟体動物は成長促進因子をコードする外因性の核
酸配列を含有し、この配列はプロモーター配列に作動可能に連結され、それによ
りこのドナー由来のこの外套膜組織は、この成長促進因子を発現し得る。次いで
、アクセプター軟体動物を養殖する。この養殖の後、真珠をアクセプター軟体動
物より採集する。
あるいは、別の実施態様において、本発明は、アクセプター軟体動物に核を導
入する工程および必要に応じてこのアクセプター軟体動物にドナー軟体動物由来
の外套膜組織を同時に導入する工程（このアクセプター軟体動物は、成長促進因
子をコードする外因性の核酸配列を含有し、この配列は、プロモーター配列に作
動可能に連結され、それによりアクセプター軟体動物は成長促進因子を発現し得
る）；このアクセプター軟体動物を養殖する工程；およびこのアクセプター軟体
動物より真珠を採集する工程、を包含する真珠を養殖する方法を提供する。
さらに別の実施態様において、本発明は、核および必要に応じてドナーの外套
膜組織の導入の前に、有効量の成長促進因子に軟体動物を曝す工程を包含する真
珠を養殖する方法を提供する。アクセプター軟体動物の内部に、核および必要に
応じて、ドナー軟体動物由来の外套膜組織を導入した後、アクセプター軟体動物
を養殖し、そしてそれらから真珠を採集する。好ましくは、曝露時期は、軟体動
物が幼体、幼生、または胚の軟体動物である。
本発明の種々の実施態様について、成長促進因子は、好ましくは、インスリン
、インスリン様成長因子、および成長ホルモンからなる群より選択される。より
好ましくは、成長促進因子は、ブタ、ウシ、またはヒトの成長ホルモンまたはイ
ンスリンである。最も好ましくは、成長促進因子は、ブタ、ウシ、またはヒトの
インスリンである。
プロモーター配列に作動可能に連結されている外因性の核酸配列を含むこれら
の実施態様については、好ましいプロモーター配列は、RSV-LTR、アクチン、お
よびメタロチオネインプロモーター配列からなる群より選択される。
本発明の実施態様の好ましい軟体動物は、Pinctada maxima、Pinctada marger
itifera、Pinctada martensi fucata、Pinctada radiata、Pinctada vulgaris、
Pinctada fucata、Pinctada maculata、Pinctada albina、Pteria penguin、Uni
onides sp.、およびHaliotis sp.からなる群より選択される。アクセプター軟体
動物およびドナー軟体動物を包含する実施態様について、このような軟体動物は
、この群より独立して選択される。
好ましい実施態様の説明
Ｉ．総論
本発明の目的は、真珠を生産する軟体動物の成長を促進する方法を提供するこ
と、およびこのような促進された成長特性を有する軟体動物を提供することであ
る。これらの方法および軟体動物は、加工時間を減少するため、ならびに真珠を
生産する軟体動物のサイズおよび生産数を増加させるために、真珠養殖プロセス
において有用である。
本発明において特に有用な軟体動物は、Pteria penguin、Pinctada maxima、P
inctada margeritifera、Pinctada martensi fucata、Pinctada radiata、Pinct
ada vulgaris、Pinctada fucata、Pinctada albina、およびPinctada maculata
のようなカキ種を包含する。他の真珠を生産する軟体動物は、Haliotis属のアワ
ビおよびUnionides属の淡水産イシガイを包含する。Taburiaux、前出を参照のこ
と。用語、軟体動物は、一般に、成体軟体動物、ならびにその幼体、幼生、およ
び胚の形態を包含するために用いられる。
促進された成長特性を有する軟体動物は、一般に、正常な成長特性を有する軟
体動物と比較して、以下の特性の１つ以上における増加を示す：貝殻の高さ、貝
殻の長さ、総重量、または組織量。軟体動物についての促進された成長速度は、
同様の環境における同様のサイズおよび年齢の正常な軟体動物のものより、約1
〜150、10〜100、または20〜50％大きい単位時間あたりの量、長さ、または高さ
における変化である。例えば、10mm/月の貝殻の長さにおける増加を示す正常な
カキは、約10.1mm/月〜約25mm/月の促進された増加速度を有する。
さらに、成長速度が促進された軟体動物はまた、促進された成長速度を有さな
い軟体動物よりも増加した殻皮層形成および貝殻沈着を有する。このような増大
した殻皮層形成および貝殻沈着はまた、真珠層の生産速度を増大させ、その結果
、真珠形成速度を増大させる。さらに、促進された成長速度を有して、より大き
なサイズに達した軟体動物は、その内部により大きな核および／または真珠を宿
し得る。従って、成長速度が促進された軟体動物により生産される真珠、または
本発明の方法に従って成長促進因子を発現し得る組織内で生産される真珠は、一
般に、同様の条件下で同様の期間養殖した場合に成長促進がされない軟体動物に
よ
って形成される真珠より、約５％〜50％大きい直径を有する。従って、成長が促
進されない軟体動物中で養殖された真珠が直径約10mmである場合、促進された成
長速度を有する軟体動物中で同じ期間にわたって養殖された真珠は、直径約10.5
mm〜約15mmの間である。あるいは、促進された成長速度を有する軟体動物は、正
常な成長速度を有する軟体動物よりも約５〜30％少ない時間で所定の直径を有す
る真珠を生産する。
一般に、成長促進因子は、生存する生物に直接的または間接的に曝した場合に
その生物の成長を誘導し、その結果、生物の成長速度を、その生物の生まれつき
の成長よりも増大させる化合物を包含する。従って、生物の生存に不可欠な化合
物、すなわち栄養素、酸素、または水は、成長促進因子の定義に含まれない。成
長促進因子の例は、成長ホルモン、成長因子、インスリン、およびインスリン様
ペプチドを包含する。さらに、成長促進因子は、軟体動物中の天然の成長誘導物
質の放出を誘導する因子を包含する。これらの内分泌学的な「引き金」は、軟体
動物の天然の成長誘導物質の増大した発現をもたらし、それにより、促進された
成長速度をもたらす。これらの成長関連ホルモンの引き金は、他の脊椎動物にお
いて記載されている。
本発明において有用な特異的成長ホルモンは、魚類の成長ホルモン、すなわち
、ニジマス（AgellonおよびChen、DNA 5:463-471(1986)）、ギンザケ（Villasen
orら、Gene 65:239-246）、およびナマズ（Tangら、Mol．Mar．Biol．and Biote
ch.，2(4):198-206）、ならびにウシ、ブタ、およびヒトの成長ホルモンを包含
する。同様に、本発明において特に有用なインスリンは、例えばブタ、ウシ、お
よびヒトのインスリンのような哺乳動物のインスリンを包含する。例えば、Plis
etskayaら、Gen．Comp．Endocrin.，35:133-145(1978)、Morse，D.E.，Aquacult
ure，39:263-282(1984)を参照のこと。例えばヒトおよび軟体動物のインスリン
様ペプチド（「MIP」）ようなインスリン様ペプチドもまた、本発明の方法およ
び軟体動物における成長促進因子として有用である。例えば、Smitら、J．Mol．
Endocrin.，11:103-113(1993)、Smitら、Mol．Brain Research，14:7-12(1992)
を参照のこと。これらの因子のアナログまたはアミノ酸配列改変体もまた、包含
される。
II．外因性成長促進因子のトランスジェニック発現による軟体動物の成長を促進 する方法、およびそのように発現し得る軟体動物
本発明は、軟体動物の成長速度を促進するための方法、および促進された成長
速度を有する軟体動物を提供する。さらに、プロモーター配列に作動可能に連結
された成長促進因子をコードするセグメントを含む外因性の核酸配列を軟体動物
に誘導することにより、この軟体動物を生産し、そして本方法を実施する。これ
により、この軟体動物は成長促進因子を発現し得る。
DNAセグメントは、別のDNAセグメントと機能的な関係に置かれる場合に、作動
可能に連結される。例えば、配列の転写を刺激する場合、プロモーターまたはエ
ンハンサーは、コード配列に対して作動可能に連結される；ポリペプチドがポリ
ペプチドの分泌に関係するプレタンパク質として発現する場合、シグナル配列に
対するDNAは、そのポリペプチドをコードするDNAに対して作動可能に連結される
。一般に、作動可能に連結されるDNA配列は隣接しており、そしてシグナル配列
の場合には、隣接および読み取り相の中の両方である。しかし、エンハンサーは
、転写を制御するコード配列と隣接する必要はない。連結は、都合のよい制限部
位、あるいはそれらの位置に挿入されたアダプター、またはリンカーでの連結に
より達成される。
外因性DNAセグメントは、細胞に対して外来のものであるか、または、細胞に
対して同種のものであるが、しかし宿主細胞ゲノム内においてそのエレメントが
通常見出されない位置にあるものである。例えば、外因性DNAセグメントは、そ
れらが導入される生物以外の種、属、科などに由来する異種核酸配列を包含する
。外因性DNAセグメントはまた、異種のプロモーター配列に作動可能に連結され
た同種のコード配列、あるいは同種のプロモーター配列に作動可能に連結された
異種のコード配列を包含する。外因性DNAセグメントは、天然のゲノム中に存在
しないような、多数の遺伝子コピーの核酸配列をさらに包含する。複数のコピー
が存在すると、天然のゲノム中での発現に関連して、成長促進因子の増大した生
産をもたらし得る。外因性DNAセグメントは、外因性ポリペプチドを得るために
発現される。
好ましい実施態様において、成長促進因子をコードする核酸配列は、成長ホル
モン、インスリン、およびインスリン様ペプチドをコードする核酸の群より選択
される。多様な成長ホルモンの核酸配列もまた報告されている。例えば、Agello
nおよびChen、DNA 5:463-471(1986)、Villasenorら、Gene 65:239-246、およびT
angら、Mol．Mar．Biol．And Biotech.，2(4):198-206を参照のこと。インスリ
ン関連ペプチド、ならびに特にヒトおよび軟体動物のインスリン様ペプチドの核
酸配列が、報告されている。例えば、Smitら、J．Mol．Endocrin.，11:103-113(
1993)、Smitら、Mol．Brain Research，14:7-12(1992)を参照のこと。同様に、
様々なインスリン（例えば、ヒト、ブタ、およびウシの）の核酸配列が報告され
ており、これらはまた、GenBankより入手可能である。本発明の成長促進因子を
コードする他の核酸は、合成、または例えばPCR法を用いて直接ゲノムライブラ
リーからクローン化され得る。例えば、Albertsら、Molecular Biology of the
Cell(第２版．1989)、Sambrookら、Molecular Cloning:A Laboratory Manual(C.
S.H.P．第２版．1989)を参照のこと。成長促進因子をコードする核酸配列は、ゲ
ノムDNA、cDNA、ミニ遺伝子（すなわち、発現に不必要な選択されたイントロン
領域を含まないゲノム遺伝子）またはこれらの任意のハイブリッドであり得る。
一旦クローン化されると、所望の配列は、適切なプロモーター配列につなげら
れる。本発明において有用なプロモーター配列は、原核生物起源または真核生物
起源のプロモーターを包含する。一般に、哺乳動物細胞内で機能するプロモータ
ーは、例えば魚類または軟体動物のような下等な真核生物形態においても機能す
る。好ましいプロモーター配列は、トリRous肉腫ウイルスの長い末端反復配列（
RSV-LTR）（例えば、Chenら、Mol．Marine．Biol．and Biotech.，2(2):88-95(1
993)、Dunhamら、Mol．Marine Biol．and Biotech.，1(4/5):380-389(1992)を参
照のこと)、誘導性マウスメタロチオネイン-Iプロモーター、ならびにアクチン
、pgk、tk、およびdhfrのプロモーターである。必要に応じて、コード配列は、
さらなる制御配列（例えば、エンハンサー、3'および／または5'非翻訳領域、3'
および／または5'隣接領域、イントロン配列、発現された場合に細胞からの成長
促進因子の分泌を導き得るシグナル配列、およびポリアデニル化部位）に作動可
能に連結される。さらなる調節配列は、しばしば、成長促進因予のコード配列お
よび／またはプロモーターに本来隣接する配列から得られる。
いくつかのトランスジーンにおいて、成長促進因子をコードする配列は、成長
促進因子が融合タンパク質として発現されるように、第２の外因性のタンパク質
コード配列に対してインフレームで融合される。第２の外因性タンパク質の全て
または一部の存在は、軟体動物細胞内での成長促進因子の標的化、安定性、受容
性、および／またはプロセシング性を促進または助長し得る。
核酸配列は、トランスジェニック軟体動物を作製するために、軟体動物の胚の
生殖系列に導入される。トランスジェニック軟体動物は、体細胞および生殖系列
細胞（体細胞変異を受ける可能性のあるいくつかの細胞を除いて）の全てが、少
なくとも１コピーの導入されたトランスジーンを含有しており、このトランスジ
ーンは、軟体動物の生殖系列または軟体動物の祖先に初期胚段階で導入されてい
る軟体動物である。例えば、核酸は、１細胞段階（すなわち接合子）または２細
胞段階で個々の軟体動物胚に導入され得る。１細胞段階でDNAを導入することに
より、生殖系列に取り込まれる確率が高くなる。遅い段階での取り込みは、しば
しば、一部の細胞のみが組み込まれたトランスジーンを有する、モザイク状の軟
体動物をもたらす。次いで、その後の育種が、本物のトランスジェニック軟体動
物を単離するために必要とされる。
外因性の核酸配列を胚細胞に導入する方法は、マイクロインジェクション（米
国特許第4,873,292号を参照のこと）、エレクトロポレーション、ウイルス形質
導入などを包含する。例えば、成長促進因子をコードする核酸は、このような核
酸をトランスジェニック魚類に導入するために記載された方法と同じ手順を用い
て、軟体動物に導入され得る。例えば、Dunhamら、前出、Chenら、前出を参照の
こと。あるいは、外因性の核酸セグメントは、受精させた軟体動物の卵のエレク
トロポレーションにより軟体動物に導入される。エレクトロポレーションの条件
は、哺乳動物細胞への核酸のエレクトロポレーションのために従来用いられる条
件と同じである。Sambrookら、前出を参照のこと。時折、外因性のDNAの取り込
みは、重要な細胞機能を破壊する。しかし、このような軟体動物は、未熟死、奇
形、または減少したサイズおよび重量などのような他の識別可能な特徴のいずれ
かにより、容易に排除される。
軟体動物のゲノムにおける組み込まれたトランスジーンの存在は、組織生検か
らDNAを抽出する工程、および核酸配列の存在について、例えば、成長促進因子
の外因性核酸配列に特異的なプローブを用いるDNAのサザン解析によって分析す
る工程により確認される。トランスジーンの発現は、同様のプローブを用いる生
検由来のRNAのノーザン解析によって確認される。あるいは、生検のタンパク質
抽出物は、発現される成長促進因子に対する抗体をプローブとして用いる、ウエ
スタンブロッティング、放射性免疫アッセイ（radioimmunoassay）、またはELIS
Aにより分析される。本物のトランスジェニック状態は、P1軟体動物からF1後代
にトランスジーンが伝達されることにより確立される。P1軟体動物は、他のP1軟
体動物または非トランスジェニック軟体動物のいずれかと交配され得る。トラン
スジェニック軟体動物の近親交配は、導入されたトランスジーンについてホモ接
合体である軟体動物株を確立するために用いられ得る。
III．真珠の養殖方法
本発明は、真珠養殖プロセスに関与する、軟体動物の成長を促進することによ
って真珠を養殖する方法を提供する。現代の商業的な真珠の養殖において、外来
の塊、つまり「核」が、軟体動物の生殖腺組織に導入または植え付けられる。こ
の核を受ける軟体動物は、母軟体動物またはアタセプター軟体動物と呼ばれる。
核は、その周りに軟体動物が真珠相を生産する任意の外来の塊を包含する。この
ような核は、他の軟体動物由来の貝殻の断片、金属球、または他の同様の形態の
物体のような、一般に小さな球形の物体である。このような核のサイズおよび形
状は、所望の真珠のサイズおよび形状に依存する。従って、本発明は、任意の所
望の形状の真珠を生産するための、特別の（custom）形状の核を提供する。
一般に、軟体動物の外套膜部分由来の組織断片はまた、核とともにアクセプタ
ー軟体動物の生殖腺組織中に植え付けられる。この外套膜組織を得た軟体動物は
、「ドナー」軟体動物と呼ばれる。一般に、外套膜組織は、異なるドナー軟体動
物から採取されるが、外套膜組織は、アクセプター軟体動物から得て、そしてア
クセプター軟体動物の生殖腺組織に核とともに再植え付けされ得る。従って、い
くつかの例では、アクセプター軟体動物は、ドナー軟体動物でもあり得る。同様
に、
アクセプター軟体動物とドナー軟体動物とが同じ種であることが好ましいが、こ
れは、場合によっては必要でない。核およびドナー外套膜組織の植え付けは、真
珠養殖プロセスにおいて普通の従来法によって実施される。
必要に応じて、核は、例えば、真珠の生産において、アクセプター軟体動物の
貝殻と外套膜との間に植え付けされ得る。この場合においては、ドナー外套膜組
織の植え付けは省略され得る。
Ａ．外因性成長促進因子への軟体動物の曝露
本発明の一つの実施態様は、前成体期の軟体動物（例えば、幼体、稚貝、幼生
の軟体動物）を、効果的な量の成長促進因子に曝し、それによって軟体動物の成
長速度が促進される工程を包含する、真珠の養殖のための方法を提供する。軟体
動物が成体サイズに達したとき、核、および必要に応じてドナー軟体動物由来の
外套膜組織をこの軟体動物に導入する。次いで、軟体動物を養殖し、これから真
珠を採取する。軟体動物が成体サイズに達したかどうかは、特定の真珠を産生す
る軟体動物についての産業的な標準に依存し、そしてその結果として、種によっ
て変化する。例えば、より大きな種のHaliotisは、より典型的なカキの種である
Pinctada maximaより大きな成体サイズである。
真珠養殖プロセスにおける使用のための、軟体動物の稚貝の養育（本明細書中
で「前養殖」と呼ぶ）には、24カ月以上かかり得る。本発明は、幼体または幼生
の軟体動物の成長速度を促進することにより、真珠養殖の前養殖局面をはかどら
せる。本発明の他の局面で記載したように、軟体動物の稚貝を効果的な量の成長
促進因子に曝すことは、約１×10-9Ｍ(１nM)〜約１×10-2Ｍ(10mM)の濃度の成長
促進因子を含む溶液中にこの稚貝を浸すことを含み得る。さらに好ましいのは、
成長促進因子が約１×10-6Ｍ(１μM)〜約１×10-4Ｍ(100μM)の濃度で存在する
溶液である。さらに、このような浸漬処理は、好ましくは、成長促進因子を含む
組成物中に稚貝を、約30分〜約10時間浸すことを含み、そして所望の結果を達成
するために必要なだけ頻繁に実行され得る。好ましくは、このような処理は、前
養殖プロセスの一期間またはこのプロセスを通じて、毎日、週２回、毎週、２週
間ごと、または月ごとに行われる。
別の実施態様において、本発明は、アクセプター軟体動物に、核および必要に
応じてドナー軟体動物由来の外套膜組織を導入する工程、および効果的な量の成
長促進因子にアクセプター軟体動物を曝す工程を包含する真珠養殖の方法を提供
する。次いで、アクセプター軟体動物を養殖し、これから真珠を採集する。再び
、核をカキの貝殻とアクセプター軟体動物の外套膜との間に植え付ける場合、ド
ナー軟体動物由来の外套膜組織の植え付けを省略し得る。
成長促進因子にアクセプター軟体動物を曝すことは、種々の形態を取り得る。
一つの実施態様において、成長促進因子に曝される植え付けられたアクセプター
軟体動物は、効果的な量の成長促進因子を含む溶液に浸される。この浸漬処理は
、幼体または幼生のカキについて記載した処理と実質的に同じ様式で行われる。
再び、これらの処理は、好ましくは、真珠養殖プロセスの一期間またはこのプロ
セスを通じて、毎日、週２回、毎週、２週間ごと、または月ごとに行われる。よ
り好ましくは、この処理は軟体動物の自然の成長時期の間に行われる。
別の実施態様において、上述の効果的な量の成長促進因子を含む溶液は、植え
付けられたアクセプター軟体動物の殻の間に手で導入される。一つの実施態様に
おいて、上述の成長促進因子を含む溶液は、軟体動物の身体または外套膜の空間
に直接注入される。これらの注入は、一般的に、植え付けられたアクセプター軟
体動物に対して実行されるが、植え付けの前に行われても良い。これらの注入は
数多くの方法により実行され得る。すなわち以下のような方法である。アクセプ
ター軟体動物の対置している殻の間にシリンジ針を挿入すること（いくつかのカ
キの種(すなわちPinctada maxima)に殻の間には自然な間隙が存在している）、
２つの殻の接合部に小さな穴を開けるためにＶ字形の切込みを削り取ること、ま
たは殻の間に成長促進因子の注入を可能にするために、殻に小さな穴を開けるこ
と。好ましくは、成長促進因子を含む溶液は、約0.5〜約2.0mLの容量で注入する
。より好ましくは、軟体動物の身体を含む器官または組織を貫かないように、軟
体動物の外套膜または外套膜外の空間に注入する。再び、注入処理が毎日、週２
回、毎週、２週間ごと、または月ごとに行われる。
上述の溶液中の効果的な量の成長促進因子は、使用する特定の成長促進因子に
より変化する。一般に、効果的な量は、軟体動物が曝される溶液中の成長促進因
子の濃度と、個々の曝露処理の長さと、曝露処理の回数および頻度との組み合わ
せとして定義される。
成長促進因子は、普通、上述の溶液中に約１×10-9Ｍ(１nM)〜約１×10-2Ｍ(1
0mM)の濃度で存在している。成長促進因子が約１×10-6Ｍ(１μM)〜約１×10-4
Ｍ(100μM)の濃度で存在する溶液がより好ましい。好ましくは、成長促進因子は
、海水または他の適切な生理食塩水溶液に分散される。
関連する実施態様において、本発明はまた、植え付けられたアクセプター軟体
動物の組織における成長促進因子を含む制御放出組成物の挿入を提供する。制御
放出組成物は、一般に錠剤、カプセル、またはリポソームの形態であり、その結
果、この組成物は軟体動物の組織内に、一定の低レベルの成長促進因子を放出し
ながら保持される。これらの制御放出組成物は、一般に、マトリックス中に成長
促進因子を組み込み、その結果、この組成物は、効果的な量の成長促進因子を、
持続される時間にわたって放出し得る。詳細には、成長促進因子は、軟体動物に
有害な分解生成物を生じることなく、周囲環境への成長促進因子の一定の低レベ
ル放出を持続させるために、ある時間にわたってゆっくりと分解する障壁に囲ま
れたビーズ、カプセル、マイクロカプセル内に含まれている。障壁として有用な
組成物は、一般に市販されており、例えば、一般に薬学的応用に使用される組成
物を含む。Hellerら、Advanced Drug Delivery Rev.10:163-204(1993)、およびT
yrrellら、Biochim.Biophys.Acta 457:259-302(1976)を参照のこと。あるいは、
成長促進因子はまた、マトリックスに吸着され、それによって成長促進因子は養
殖環境においてこのマトリックスからゆっくりと放出され得る。
好ましくは、制御放出組成物は、アクセプター軟体動物の身体または組織中に
挿入される。好ましくは、制御放出組成物は、真珠形成の近接区域においてより
高濃度の成長促進因子の領域をつくり出すように、軟体動物の生殖腺組織に直接
挿入され得る。
軟体動物の最小のマニュアル操作でアクセプター軟体動物の成長促進因子への
曝露を可能にすることに加えて、これらの制御放出組成物のゆっくりとした溶解
特性は、これらが真珠層形成のための核として作用することを妨げる。
養殖に続いて、従来の方法により、真珠はアクセプター軟体動物から採集され
る。次いで、これらの軟体動物は、所望であれば、繰り返しの真珠養殖のために
再び植え付けられ得る。Ｂ．成長促進因子を発現し得るトランスジェニック軟体動物を用いる真珠養殖
先に記述したように、近年の真珠養殖プロセスは、一般に、核および外套膜組
織の一片をアクセプター軟体動物の生殖腺組織に植え付けまたは挿入することを
包含する。しかし、このプロセスは、例えば、半球形をした真珠が所望であれば
、変化し得る。
本発明の特定の実施態様において、核およびドナー軟体動物由来の外套膜組織
が、トランスジェニックアクセプター軟体動物に植え付けられる。このトランス
ジェニックアクセプター軟体動物は、プロモーター配列に作動可能に連結された
、成長促進因子をコードするセグメントを含む外因性の核酸配列を含む。このこ
とによってトランスジェニックアクセプター軟体動物は成長促進因子を発現し得
る。
あるいは、アクセプター軟体動物に植え付けられる外套膜組織は、トランスジ
ェニックドナー軟体動物より得られる。次いで、このドナー軟体動物は、プロモ
ーター配列に作動可能に連結された、成長促進因子をコードするセグメントを含
む外因性の核酸配列を含む。ドナー軟体動物由来の植え付けられた細胞は、それ
ゆえ成長促進因子を発現し得る。この特定の実施態様は、環境中へのトランスジ
ェニック軟体動物種の放出を避けることが望ましい場合、特に有用である。それ
ゆえ、この実施態様は、商業的真珠養殖操作の規模で容易に実行される。
上述の実施態様は、トランスジェニックアクセプター軟体動物またはトランス
ジェニックドナー軟体動物のいずれかについて述べられているが、アクセプター
軟体動物およびドナー軟体動物のいずれかまたは両方がトランスジェニックであ
り得る。すなわち、外因性の成長促進因子を発現し得る。
本発明は以下の実施例によってさらに例示される。これらの実施例は単に本発
明の局面を例示するにすぎず、本発明を制限する意図はない。
実施例
本明細書中で用いる全ての試薬は、特に記載がなければ市販されている。実施例１：一般的なカキ生産
以下の多くの実施例のために、種々の成長段階のカキを使用する。従って、最
初の実施例は、卵細胞から成体カキへのカキの養育および養殖について記載する
。
典型的な卵を抱いた繁殖ストックのカキは、自然の産卵期の直前に野生から採
取される。これらのカキは、自然の産卵温度よりわずかに低い温度にて、フロー
スルーまたは再循環している海水中に維持される。この温度は典型的には約25℃
〜約30℃である。生殖腺の視覚的観察により産卵条件にあると判断されると、温
度を約５℃〜約８℃上昇させる。この温度上昇が通常産卵を誘導する。
産卵の誘導の際、カキは雌雄を同定され、それによって別の容器に置かれる。
産卵が完了したら、カキはそれぞれの水槽から取り出され、精子および卵の懸濁
液を回収して混合する。受精させたら、幼生養殖を始めるために卵を別の水槽に
移す。
受精卵を１mlあたり約20〜約30個の密度で保存し、曝気された水槽中で24〜48
時維持する。この間に、卵が孵化する。卵からかえった幼生をふるい上に採取し
、１mlあたり約20幼生の密度で水槽に入れ、藻を餌として与える。餌は典型的に
は珪藻とIsochrysis galbanaとの混合物であり、幼生水槽中で20,000〜30,000細
胞／mlの密度である。
幼生が成長するにつれて、この密度は減少する。典型的には、幼生がペディペ
リジャー（pediveliger）段階に達したとき、この密度は１mlあたり２〜３まで
減少する。変態のために、いくつかの種は、このプロセスの間付着する基質の添
加を必要とするが、他の種は単に水槽の底に住み着くだけである。変態はいくつ
かの種においては化学的に誘導され得る。
変態に続いて、幼カキ（ここで稚貝と呼ぶ）は、フロースルーコンテナ（例え
ばアップウェラー(upweller)またはダウンウェラー(downweller)）に移され、成
体に達するまで粗く濾過された海水を与えられる。実施例２：浸漬
Ａ．稚貝の成長促進
幼体カキに対する成長プロモーターの効果を評価するために、以下の実験を行
った：
長さが約１mmの幼体真珠カキ(Pinctada margeritifera)を、商業的供給源から
入手した。これらの幼体を28℃の閉再循環水槽中に維持し、Thallasiosiraおよ
びIsochrysisを与えた。幼体のサブセットを、10-6Mのインスリンを含む海水に
浸し、一方、別のグループを海水のみに浸した。１週間後、処理グループは、非
処理グループより30パーセント高い成長を示した。連続１週間、浸すことにより
、非処理グループの成長より幼体カキの連続的で加速的な成長が生じた。どちら
のグループでも死亡は観察されなかった。
Ｂ．アクセプター有殻軟体動物(shell)成長および真珠産生の促進
ほぼ同齢の成体カキを商業的孵化場から入手する。直径10mmの球形の核および
他の成体カキ由来の外套膜組織の25mm2サンプルを、これらのカキに植え付ける
。これらの植え付け物を与えられたカキの半数を、約10μM〜のブタインスリン
を含む10倍容量の濾過された周囲海水に浸すことにより処理する。この処理は、
成長期を通じて14日毎に行われ、非成長期間に終わる。残りの半数はコントロー
ルグループであり、インスリンとの接触がない以外は同じ操作にかけられる。
12カ月間の処理後、処理グループのカキは、非処理グループのカキより大きな
成長率を示す。両方のグループのカキを開け、その中で産生された真珠を採集し
、乾燥し、重量およびその直径を計測する。インスリン処理にかけられたカキか
ら得た真珠は、コントロールグループにより産生された真珠より大きな乾燥重量
および長い直径を示す。実施例３：制御放出組成物
Heller（前出）により記載されたような、ゆっくりと放出されるインスリンカ
プセルを、試験グループのカキの組織または生殖腺に挿入する。インスリンカプ
セルの挿入と同時に、直径10mmの核およびドナーカキ由来の外套膜組織の25mm2
サンプルを、試験カキの生殖腺組織の別の切り口に挿入する。このカキを閉じ、
正常な養殖条件に戻す。12ヶ月間の養殖後、試験カキを開き、そして真珠を採集
する。これらの試験カキから採集された真珠は、コントロールグループにより産
生された真珠より長い直径および大きな乾燥重量を有する。実施例４：成長促進因子の注入
幼体Pinctada maximaカキをその養殖条件から取り出す。18ゲージの針を、各
カキの背面のＶ字形の切り込みから外套膜空間に挿入する。１mlの100mMインス
リン溶液をカキに注入する。注入されたカキを１時間水の外に保持する。処理後
、カキを正常な養殖条件に戻す。注入を成長期の間14日毎に繰り返す。12ヶ月後
、このカキは、コントロールグループのカキより大きな成長率を示す。実施例５：トランスジェニックカキの作製
ヒトインスリンのcDNA配列は記載されている（Gen Bank Acc．No.L15440を参
照のこと）。３’および５’非翻訳領域ならびにポリアデニル化シグナルを含む
cDNAコード配列を、SalIリンカーの付加により改変し、Gormanら(Proc.Natl.Aca
d.Sci．(USA)79:6777-6781(1982))に記載のように、pRSV-2ベクター内のSalI部
位でラウス肉腫ウイルスの長末端反復(RSV-LTR)プロモーター／エンハンサー配
列に連結する。このことによって、cDNAコード配列を580bpのLTR配列および3.7k
bのpRSVのフランキング配列に連結する。ベクターの増殖後、注入に適切なトラ
ンスジーンを提供するために、ベクターを線状化する。
線状化されたトランスジーンを、商業的孵化場より入手するかまたは研究室で
産卵および受精させたPinctada maxima由来の受精卵にエレクトロポレートする
。この卵をカキの稚貝および幼体カキまで養殖する。RSV-LTR-インスリントラン
スジーンの存在を、カキ組織の生検からアッセイする。染色体DNAを抽出し、こ
のトランスジーンにハイブリダイズし得るプライマーを用いて増幅する。増幅産
物をゲル電気泳動により検出する。ヒトインスリンの発現を、生検由来のタンパ
ク質抽出物のウェスタンブロティングにより検出する。創始トランスジェニック
カキを、トランスジェニック子孫を作製するために近親交配する。トランスジェ
ニ
ック子孫の状態および発現を、創始カキについて記載したものと同じ方法を用い
てアッセイする。
ヒトインスリン配列を発現する幼体トランスジェニックカキを、ほぼ同サイズ
および同齢の正常なカキのコントロールグループと同じ条件下で養殖する。12ヶ
月間の養殖後、トランスジェニックカキは、コントロールグループのカキより高
い成長率を示す。実施例６：トランスジェニックカキを用いる真珠養殖
真珠養殖プロセスに対する成長促進因子の発現の効果を示すために、２つのサ
ブセットのカキを提供する。セット１は、コントロールグループに比べて促進さ
れた成長速度を示す実施例５のカキを含む。セット２は、「正常」Pinctada max
imaカキ、すなわち非トランスジェニックカキを含む。
これらのカキに直径10mmの球形の核およびドナー外套捲く組織の25mm2サンプ
ルを植え付ける。以下のセットのアクセプターカキおよびドナーカキを用いる。
１．トランスジェニックアクセプターカキ、正常ドナーカキ
２．正常アクセプターカキ、トランスジェニックドナーカキ
３．トランスジェニックアクセプターカキ、トランスジェニックドナーカキ
４．正常アクセプターカキ、正常ドナーカキ（コントロール）
アクセプターカキを海洋環境で12カ月間養殖する。養殖プロセスの終了時、グ
ループ１、２、および３のカキから得られる真珠は、コントロールグループによ
り産生される真珠より直径が長く、そして大きな乾燥重量を有している。
前述の発明を、明確さおよび理解のためにいくらか詳細に記載したが、形態お
よび詳細の種々の変化を、本発明の真の範囲から逸脱することなくなし得ること
は、この開示を読めば当業者には明確であろう。本願に引用された全ての刊行物
および特許書類は、各個の刊行物または特許書類が個々にそのように表示されて
いる場合と同じ程度に、すべての目的のためにその全体を参考として援用される
。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Enhanced growth and pearl production in mollusks
The present invention generally provides for the production of pearls by exposing molluscs to growth promoting factors.
The present invention relates to a method for promoting the growth of mollusks. Can express exogenous growth promoting factors
Also provided are transgenic mollusks and methods of culturing pearls.
Background of the Invention
Pearls are a wonderful gem that has long been valued for both its luster and brilliance
Has been considered to be. Regardless of its customary classification as a "gem", pearls
Is a product of animal origin, produced by molluscs. Pearls are generally
Formed when a foreign body is implanted in a mollusc tissue. Removing foreign objects
If not, the mollusk will secrete from its epithelial or "mantle" tissue
Foreign matter is covered with the calcium carbonate composition to be applied. J. Taburiaux, Pearls: Their Origin
Processing and Identification, (D. Ceriog-Hughes, Trans., Chilton Book Co., 1986). this
The secretory material is called "nacre". After a long period, the foreign body is covered with nacre and
And what is commonly known as pearls.
The production of “natural pearls” is based solely on the accidental insertion of foreign matter into oyster epithelial tissue.
The yield of such natural pearls per oyster is low, depending on the event.
In response to the world's higher demands on pearls, oyster traders have added foreign matter to oyster tissue.
Started to introduce artificially. Pearls obtained from this process are called “cultured pearls”
It is. Cultivating pearls allows traders to find the oysters needed to produce pearls.
It could be confirmed that all starting material had been obtained. In addition, the desired size and shape
By using foreign materials, merchants can, to some extent, end products of the pearling process.
Controlled. See Taburiaux, supra.
Modern commercial pearl cultivation is based on several species of pearl mussels and other mollusks
(Including bi, crumb and mussels). Pearl mussels as adults
Collected from the wild, captured from the wild as a juvenile, or fry collector
By breeding stock (b
roodstock). Then the oysters are raw pearls
Farmed for use in production. Generally, also described as pre-adult oysters
Oysters, juveniles or juvenile oysters also reach the size of adults and produce pearls
Requires at least one year of aquaculture to be large enough to be used for
.
In a typical pearl culture process, a foreign body, or "nucleus," is introduced into a mollusk, typically
Is planted in the reproductive tissue of oyster seeds. If “hemispherical (mabe)” pearls are produced,
This nucleus attaches directly to mollusk shells and enters the mantle tissue of the acceptor mollusk.
Make direct contact. The mantle is a layer of epithelial tissue and a layer of oyster organ collection.
And the layer of tissue between the oyster shell (or shell). These organs and mantle
Are collectively referred to herein as the "body" of a mollusk. Outside of this mantle
The part is generally responsible for shell formation and nacre production.
In conventional pearl culture, mantle tissue from isolates or "donor" molluscs
Are implanted in the mantle simultaneously with the implantation of the nucleus. Nuclear and as required
The molluscs into which donor tissue is implanted are generally referred to as “acceptor” shells or
Are called "acceptor" molluscs. Without linking to any theory,
The mantle tissue covers the nucleus as a "pearl sac" and forms the nacre that forms the pearl.
Secretes, while acceptor mollusks serve as nutrient reservoirs for the process
It is thought to work. See Taburiaux, supra.
The period from planting the nucleus to collecting the pearls can take 18 months to 3 years. this
In addition to the costs associated with long processes, this long period required for pearl farming also
Danger that the key will not survive and complete the process
Change in pressure during growth or change in pearl shape due to the aggregation of two formed pearls
As such, it increases the risk of defects occurring in pearl formation. This danger
Is further increased if larger pearls are desired. Bigger like this
Pearls need longer periods to form larger mollusks and pearls
And Finally, the price of pearl oysters is so high that
It is desirable to "reuse" oysters. However, at present, only about one third of the true
Only ostriches have been recultured. See Taburiaux, supra. Therefore, the mussel
The time needed to produce and farm pearls and the time required for the pearling process
Is desired.
Exposing oriental oysters (Crassostrea virginica) to a type of growth-promoting bioactive peptide
Increased the growth rate of both juvenile and adult oysters.
Have been. Paynter & Chen, Biol.Bull. 181: 459-462 (1991). In particular, rainbow trout
Exogenous treatment of these oysters with growth hormone is
It was reported that they increased shell height and tissue weight over those oysters
.
In addition, growth control hormones (such as mammals such as insulin and growth hormone)
Use of growth-regulating hormones of origin) enhances the growth rate of abalone after larvae
Has been reported to be effective. Morse, Aquaculture, 39: 263-282 (19
84).
The present invention provides a method for enhancing the growth rate of a pearl-producing mollusk,
Also provide mollusks having an enhanced growth rate. The accelerated growth rate is
The time required for the larvae to be cultured before using them in pearl production
Reduce. In addition, increasing the growth rate of pearl-producing mollusks,
The rate of nacre production around the attached nucleus is increased, and therefore the culture time for pearls
Is reduced. Such reductions in farming time also affect the number of mollusks that can be re-cultured.
Increase and further reduce costs. Therefore, pearl production yields were earlier
Increased and produced by aquaculture and aquaculture processes, pearl mollusc recycling
Reduce defects in burned pearls.
Summary of the Invention
One embodiment of the present invention relates to a method of promoting the growth of a pearl-producing mollusk.
provide. The method comprises the steps of: promoting growth associated with the promoter sequence;
Introduction of a nucleic acid sequence containing a factor-encoding segment into the mollusc germline
That the segment is a growth promoting factor in molluscs.
Can be expressed.
In another embodiment, the present invention also provides a transgenic mollusk
The mollusc germline contains exogenous nucleic acid sequences. This exogenous nucleic acid sequence
,
Contains segments encoding growth promoters and promotes growth in molluscs
The factor may be expressed.
In a further embodiment, the present invention also provides a method of culturing pearls.
The method involves introducing a nucleus into an acceptor mollusc. As needed
In this method, the mantle tissue from the donor mollusk is transferred to the acceptor mollusc.
May be included. Acceptor molluscs have an effective amount of growth promoting factor
Exposed and cultured. After farming, pearls are collected from acceptor mollusks
Is done.
In a preferred embodiment, the acceptor mollusc has a composition of about 1 nM to about 10 mM.
The concentration of the long promoter, and more preferably, about 0.1 μM to about 100 μM of the growth promoter.
Immersing the acceptor mollusk in a solution containing growth-promoting factors at the offspring concentration
Thus, it is exposed to growth promoting factors. Such exposure is generally about monthly to weekly.
Up to or about every day.
In a related embodiment, the acceptor mollusk is an acceptor mollusc
Growth-promoting factor by inserting a composition containing the growth-promoting factor inside the
Exposed to Insertion of a composition containing a growth-promoting factor can be performed, for example, inside a mollusk.
By injecting the composition into the mollusk or by placing the composition by hand inside a mollusk
Done. Such compositions optionally include growth promoting factors not in solution.
Or incorporated into a matrix as a controlled release composition, thereby
A controlled release composition where the release of the growth promoting factor is low and constant is optionally included.
In a further embodiment, the present invention also provides the acceptor mollusk with a nucleus and
Culturing pearls, including the step of introducing mantle tissue from the donor and donor mollusk
Provide the law. Here, donor molluscs are exogenous nuclei that encode growth-promoting factors.
An acid sequence, which is operably linked to the promoter sequence, thereby
The mantle tissue from the donor can express the growth promoting factor. Then
Farm, acceptor mollusks. After this aquaculture, pearls are used
Collect from things.
Alternatively, in another embodiment, the invention provides for introducing a nucleus into an acceptor mollusc.
The acceptor mollusk and, if necessary, the donor mollusk
Simultaneously introducing the mantle tissue of the animal (this acceptor mollusc
It contains an exogenous nucleic acid sequence that encodes a
Operably linked so that the acceptor mollusk can express a growth promoting factor.
Culturing the acceptor mollusc; and the acceptor mollusc
Collecting a pearl from an animal.
In yet another embodiment, the present invention provides a method comprising:
A method comprising exposing the mollusk to an effective amount of a growth promoting factor prior to the introduction of the membrane tissue.
Provide a method of cultivating beads. Inside the acceptor mollusc, nucleus and need
Accordingly, after introducing the mantle tissue from the donor mollusk, the acceptor mollusc
And harvest pearls from them. Preferably, the time of exposure is
The object is a juvenile, larval, or embryonic mollusc.
For various embodiments of the invention, the growth promoting factor is preferably insulin.
, Insulin-like growth factor, and growth hormone. Than
Preferably, the growth promoting factor is porcine, bovine, or human growth hormone or yeast.
This is Surin. Most preferably, the growth promoting factor is porcine, bovine, or human.
Insulin.
Those containing an exogenous nucleic acid sequence operably linked to a promoter sequence.
For preferred embodiments, preferred promoter sequences are RSV-LTR, actin,
And a metallothionein promoter sequence.
Preferred molluscs of embodiments of the present invention are Pinctada maxima, Pinctada marger
itifera, Pinctada martensi fucata, Pinctada radiata, Pinctada vulgaris,
Pinctada fucata, Pinctada maculata, Pinctada albina, Pteria penguin, Uni
onides sp., and Haliotis sp. Acceptor soft body
For embodiments involving animals and donor molluscs, such molluscs may be
, Independently selected from this group.
Description of the preferred embodiment
I.General remarks
It is an object of the present invention to provide a method for promoting the growth of pearl-producing molluscs.
And to provide mollusks having such enhanced growth characteristics.
You. These methods and mollusks reduce processing time, and
To increase the size and number of mollusks produced, the pearl culture process
It is useful in.
Particularly useful molluscs in the present invention are Pteria penguin, Pinctada maxima, P
inctada margeritifera, Pinctada martensi fucata, Pinctada radiata, Pinct
ada vulgaris, Pinctada fucata, Pinctada albina, and Pinctada maculata
Oyster species such as Other pearl-producing molluscs are the millet of the genus Haliotis
And freshwater mussels of the genus Unionides. Taburiaux, see above
When. The term mollusk generally refers to adult molluscs and their larvae, larvae, and
It is used to include morphology of embryos.
Mollusks with enhanced growth characteristics are generally those that have normal growth characteristics.
Shows an increase in one or more of the following characteristics compared to somatic animals: shell height, shellfish
Shell length, total weight, or tissue mass. The accelerated growth rate for mollusks is
About 1 more than that of a normal mollusc of similar size and age in a similar environment
Amount, length, or height per unit time ~ 150, 10-100, or 20-50% larger
Is the change in For example, a normal showing an increase in shell length of 10 mm / month
Oysters have an enhanced rate of increase from about 10.1 mm / month to about 25 mm / month.
In addition, molluscs with enhanced growth rates also do not have an enhanced growth rate.
With increased shell coat formation and shell deposits than in molluscs. Such an increase
Shell formation and shell deposition also increase the rate of nacre production, and consequently
Increases the rate of pearl formation. In addition, it has a larger growth rate with an enhanced growth rate
Molecules that have reached a large size harbor larger nuclei and / or pearls inside
I can do it. Thus, pearls produced by molluscs whose growth rate has been enhanced, or
Pearls produced in a tissue capable of expressing a growth-promoting factor according to the method of the present invention include:
In general, mollusks that do not promote growth when cultured under similar conditions for similar periods of time
Yo
Has a diameter that is about 5% to 50% larger than the pearl formed. Therefore, growth is encouraged
If pearls cultured in unmoulded mollusks are approximately 10 mm in diameter, enhanced growth
Pearls cultured over the same period in molluscs with long velocities have a diameter of about 10.5
mm to about 15 mm. Alternatively, mollusks with enhanced growth rates are positive.
Have a given diameter in about 5-30% less time than molluscs with normal growth rates
To produce pearls.
In general, growth-promoting factors are present when exposed directly or indirectly to living organisms.
Induces the growth of the organism, and consequently the growth rate of the organism
And compounds that increase the growth of the compound. Therefore, compounds that are essential for the survival of the organism
An entity, ie, a nutrient, oxygen, or water, is not included in the definition of a growth promoting factor. Success
Examples of long promoters include growth hormone, growth factors, insulin, and insulin-like
And peptides. In addition, growth promoting factors are natural growth inducers in molluscs.
Factors that induce the release of the substance. These endocrine "triggers"
Resulting in increased expression of the animal's natural growth inducer, and thereby enhanced
Brings growth rate. These growth-related hormones trigger other vertebrates.
It is described.
Specific growth hormones useful in the present invention are fish growth hormones,
Rainbow trout (Agellon and Chen, DNA 5: 463-471 (1986)), coho salmon (Villasen
or et al., Gene 65: 239-246) and catfish (Tang et al., Mol. Mar. Biol. and Biote).
ch., 2 (4): 198-206), and bovine, porcine, and human growth hormone.
I do. Similarly, particularly useful insulins in the present invention include, for example, pigs, cattle,
And mammalian insulin such as human insulin. For example, Plis
etskaya et al., Gen. Comp. Endocrin., 35: 133-145 (1978), Morse, D.E., Aquacult
ure, 39: 263-282 (1984). Eg human and mollusc insulin
Insulin-like peptides, such as peptide-like peptides ("MIP"), are also useful in the methods and methods of the present invention.
And growth-promoting factors in mollusks. See, for example, Smit et al. Mol.
Endocrin., 11: 103-113 (1993); Smit et al., Mol. Brain Research, 14: 7-12 (1992)
checking ... Analogues or amino acid sequence variants of these factors also include
Is done.
II.Promotes mollusc growth by transgenic expression of exogenous growth-promoting factors And mollusks that can be so expressed
The present invention relates to a method for enhancing the growth rate of a mollusk, and to an enhanced growth.
Provide a mollusc having a speed. In addition, operably linked to a promoter sequence
Exogenous nucleic acid sequence containing a segment encoding a modified growth promoter
To produce the mollusc and practice the method. this
This allows the mollusc to express a growth promoting factor.
A DNA segment is activated when it is placed into a functional relationship with another DNA segment.
Linked as possible. For example, to stimulate transcription of a sequence, a promoter or
The enhancer is operably linked to the coding sequence;
When expressed as a preprotein involved in peptide secretion,
The corresponding DNA is operably linked to the DNA encoding the polypeptide
. Generally, operably linked DNA sequences are contiguous and a signal sequence
Is both in the adjacent and read phases. However, enhancers
Need not be adjacent to the coding sequence that controls transcription. Linking is a convenient restriction
Position, or an adapter or linker inserted at those positions.
More achieved.
An exogenous DNA segment is foreign to a cell or
Allogeneic, but the element in the host cell genome
It is a position that is not normally found. For example, an exogenous DNA segment
Encompasses heterologous nucleic acid sequences derived from species, genera, families, etc. other than the organism into which they are introduced
. The exogenous DNA segment is also operably linked to a heterologous promoter sequence.
Operably linked to a homologous coding sequence or a homologous promoter sequence
Includes heterologous coding sequences. Exogenous DNA segments are present in the natural genome
Not include the nucleic acid sequence of multiple gene copies. Multiple copies
Is associated with increased production of growth-promoting factors in relation to expression in the natural genome.
Can result in birth. Exogenous DNA segments are used to obtain exogenous polypeptides.
Is expressed.
In a preferred embodiment, the nucleic acid sequence encoding the growth promoting factor is a growth hormone.
Select from the group of nucleic acids encoding mon, insulin, and insulin-like peptides
Is done. Various growth hormone nucleic acid sequences have also been reported. For example, Agello
n and Chen, DNA 5: 463-471 (1986), Villasenor et al., Gene 65: 239-246, and T
ang et al., Mol. Mar. Biol. See And Biotech., 2 (4): 198-206. Insuri
-Related peptides, and especially the nucleus of human and mollusc insulin-like peptides
The acid sequence has been reported. See, for example, Smit et al. Mol. Endocrin., 11: 103-113 (
1993), Smit et al., Mol. See Brain Research, 14: 7-12 (1992). Similarly,
Various insulin (eg, human, porcine, and bovine) nucleic acid sequences have been reported.
And these are also available from GenBank. The growth promoting factor of the present invention
Other nucleic acids to encode can be synthetic or directly genomic libraries, for example, using PCR.
Can be cloned. For example, Alberts et al., Molecular Biology of the
Cell (2nd edition. 1989), Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (C.
S.H.P. Second edition. 1989). The nucleic acid sequence encoding the growth promoter is
Nom DNA, cDNA, minigenes (ie, selected introns not required for expression)
Genomic gene without the region) or any hybrid thereof.
Once cloned, the desired sequence is ligated into the appropriate promoter sequence.
It is. Promoter sequences useful in the present invention can be of prokaryotic or eukaryotic origin.
Includes promoter of origin. Generally, a promoter that functions in mammalian cells
Also function in lower eukaryotic forms, such as fish or molluscs.
You. A preferred promoter sequence is the long terminal repeat of avian Rous sarcoma virus (
RSV-LTR) (for example, Chen et al., Mol. Marine. Biol. And Biotech., 2 (2): 88-95 (1
993), Dunham et al., Mol. Marine Biol. and Biotech., 1 (4/5): 380-389 (1992).
), Inducible mouse metallothionein-I promoter, and actin
, Pgk, tk, and dhfr promoters. If necessary, the code sequence
Additional regulatory sequences (eg, enhancers, 3 'and / or 5' untranslated regions, 3 '
And / or 5 'flanking regions, intron sequences, growth from cells when expressed
Signal sequence capable of directing secretion of facilitator, and polyadenylation site)
Linked to Noh. Additional regulatory sequences are often coding sequences for pro-growth promoters.
And / or derived from sequences that are naturally adjacent to the promoter.
In some transgenes, sequences encoding growth-promoting factors are
A second exogenous protein, such that the facilitator is expressed as a fusion protein.
Fused in frame to the coding sequence. All of the second exogenous protein
Or the presence of some targets for the targeting, stability, and acceptance of growth-promoting factors in mollusk cells.
Sex and / or processing ability.
The nucleic acid sequence is used to produce transgenic molluscs
Introduced into the germ line. Transgenic mollusks contain somatic and germline
All of the cells (except for some that may undergo somatic mutation)
It contains at least one copy of the introduced transgene.
Are introduced into the mollusc germline or molluscan ancestors at an early embryonic stage.
Mollusks. For example, nucleic acids can be in one cell stage (ie, zygote) or
It can be introduced into individual mollusc embryos at the blastocyst stage. Introducing DNA at the single-cell stage
Thus, the probability of being taken into the germ line increases. Late ingestion is often
Often, a mosaic-like soft having a transgene with only some cells integrated
Bring somatic animals. Subsequent breeding is then followed by real transgenic soft body movement.
Required to isolate the product.
Methods for introducing exogenous nucleic acid sequences into embryonic cells are microinjection (US
No. 4,873,292), electroporation, viral traits
Introduce and so on. For example, nucleic acids encoding growth promoters may be
Using the same procedure as described for introducing acids into transgenic fish
And can be introduced into molluscs. See, for example, Dunham et al., Supra, Chen et al., Supra.
thing. Alternatively, the exogenous nucleic acid segment is contained in the fertilized mollusc egg
It is introduced into mollusks by troporation. Electroporation conditions
Are the conditions conventionally used for electroporation of nucleic acids into mammalian cells.
Same as the case. See Sambrook et al., Supra. Occasionally uptake of exogenous DNA
Mi destroys important cell functions. However, such mollusks are immature, odd,
Any of the shape or other identifiable features such as reduced size and weight etc.
It is easily eliminated.
Presence of integrated transgenes in molluscan genomes suggests tissue biopsy
Extracting DNA from the DNA and the presence of the nucleic acid sequence, e.g., a growth promoting factor
Analyzed by Southern analysis of DNA using probes specific for the exogenous nucleic acid sequence of
Is confirmed by the following steps. Transgene expression was determined using a similar probe.
Confirmed by Northern analysis of test-derived RNA. Alternatively, the biopsy protein
The extracts were prepared using antibodies against the expressed growth-promoting factor as probes.
Stan blotting, radioimmunoassay, or ELIS
Analyzed by A. Real transgenic status is from P1 molluscs to F1 progeny
Is established by transmission of the transgene. P1 molluscs are the only other P1 mollusks
It can be bred with either somatic or non-transgenic molluscs. Tran
Inbred breeding of sgenic molluscs should be homozygous for the introduced transgene.
It can be used to establish a mollusc strain that is union.
III.How to grow pearls
The present invention is by promoting the growth of molluscs involved in the pearl culture process.
To provide a way to grow pearls. In modern commercial pearl farming,
Masses, or "nuclei," are introduced or implanted into the gonad tissue of molluscs. This
The molluscs that receive the nucleus are called mother molluscs or atasceptor molluscs.
The nucleus encompasses any extraneous mass around which molluscs produce nacreous phase. this
Such nuclei may be shell fragments, metal spheres, or other similar forms of shells from other mollusks.
A generally spherical object, such as an object. The size and shape of such nuclei
The shape depends on the desired pearl size and shape. Therefore, the present invention
Provides a custom shaped core to produce the desired shape of pearl.
In general, tissue fragments from the mantle portion of mollusks can also
-Implanted in the gonad tissue of molluscs. The molluscs that obtained this mantle tissue
, Called "donor" molluscs. In general, mantle tissue has different donor soft body movements.
Mantle tissue is obtained from an acceptor mollusc, and
The gonad tissue of a sceptor mollusc can be re-implanted with the nucleus. Therefore
In some examples, the acceptor mollusc may also be a donor mollusc. As well
To
Preferably, the acceptor mollusc and the donor mollusc are of the same species,
It is not necessary in some cases. Implantation of nuclear and donor mantle tissue is
It is carried out by the usual conventional methods in the pearl culture process.
If necessary, the nucleus may be used for acceptor molluscs, for example, in pearl production.
It can be implanted between the shell and the mantle. In this case, the donor mantle set
Weaving planting can be omitted.
A.Exposure of mollusks to exogenous growth promoting factors
One embodiment of the invention is directed to pre-adult molluscs (eg, juveniles, juveniles, larvae)
Of molluscs) to an effective amount of growth promoting factors, thereby
Provided is a method for pearl culturing, comprising a step in which long speed is promoted. Soft body
When an animal reaches adult size, it is derived from the nucleus and, if necessary, the donor mollusk.
Mantle tissue is introduced into the mollusc. The mollusks are then cultivated and
Collect beads. Whether a mollusc has reached adult size will produce a particular pearl
Relies on industry standards for mollusks, and as a result,
Change. For example, the larger species Haliotis is a more typical oyster species
Adult size larger than Pinctada maxima.
Rearing mollusc larvae for use in the pearl cultivation process (as used herein)
(Called “pre-culture”) can take more than 24 months. The invention relates to a juvenile or larva
The pre-culture phase of pearl culture by promoting the growth rate of mollusks
Let As described in other aspects of the invention, mollusc larvae are grown in effective amounts.
Exposure to the facilitator is about 1 × 10-9M (1 nM) to about 1 × 10-2M (10mM) concentration growth
This may include immersing the juveniles in a solution containing a facilitating factor. More preferably,
Growth factor is about 1 × 10-6M (1 μM) to about 1 × 10-FourPresent at a concentration of M (100 μM)
Solution. Further, such immersion treatment preferably includes a growth promoting factor
Including soaking the fry in the composition for about 30 minutes to about 10 hours, and achieving the desired result
It can be performed as often as necessary to Preferably, such processing is performed before
Twice a week, every week, every two weeks for a period of the aquaculture process or throughout this process
It is done every hour or every month.
In another embodiment, the present invention provides that the acceptor mollusc has
Introducing the mantle tissue from the donor mollusc, as appropriate, and an effective amount of
A method of pearl culture comprising exposing an acceptor mollusc to a long promoter
I do. The acceptor molluscs are then cultivated and pearls are collected therefrom. again
When the nucleus is implanted between the oyster shell and the mantle of the acceptor mollusk,
The implantation of mantle tissue from nervous molluscs may be omitted.
Exposing an acceptor mollusc to a growth promoting factor can take a variety of forms.
In one embodiment, an implanted acceptor exposed to a growth promoting factor
The molluscs are immersed in a solution containing an effective amount of a growth promoting factor. This dipping process
Performed in substantially the same manner as described for larval or larval oysters.
Again, these treatments are preferably for a period of the pearl culture process or this process.
This is done daily, twice a week, weekly, every two weeks, or monthly. Yo
More preferably, the treatment is performed during the natural growing season of the mollusk.
In another embodiment, the solution comprising an effective amount of a growth promoting agent as described above is planted.
Introduced by hand between the attached acceptor mollusk shells. In one embodiment
In addition, the solution containing the above-mentioned growth-promoting factor may be used in the space of the mollusk body or mantle.
Directly injected into These injections are generally implanted acceptor softeners.
Performed on somatic animals, but may be performed prior to planting. These injections
It can be implemented in a number of ways. That is, the following method is used. Accept
Inserting a syringe needle between the opposing shells of some mollusks (some
There are natural gaps between the shells of the cypress species (ie Pinctada maxima),
Cut a V-shaped cut to make a small hole in the joint of the two shells, or
A small hole in the shell to allow for the infusion of a growth-promoting agent between the shells.
When. Preferably, the solution containing the growth promoting factor is infused in a volume of about 0.5 to about 2.0 mL
. More preferably, it is softened so that it does not penetrate organs or tissues, including the mollusk body.
The injection is made into the mantle or extramantle space of the somatic animal. Again, the injection process is daily, 2 weeks
It is performed once a week, every two weeks, or every month.
The effective amount of growth promoter in the solution described above will depend on the particular growth promoter used.
More change. Generally, an effective amount is a growth promoting factor in the solution to which the molluscs are exposed.
Combination of offspring concentration, length of individual exposure treatment, and number and frequency of exposure treatments
Is defined as
Growth promoting factors are usually about 1 × 10-9M (1 nM) to about 1 × 10-2M (1
0 mM). Growth factor is about 1 × 10-6M (1 μM) to about 1 × 10-Four
More preferred are solutions present at a concentration of M (100 μM). Preferably, the growth promoting factor is
Dispersed in seawater or other suitable saline solution.
In a related embodiment, the present invention also provides an implanted acceptor soft body.
Provided is the insertion of a controlled release composition comprising a growth promoting factor in animal tissue. control
The release composition is generally in the form of a tablet, capsule, or liposome,
As a result, the composition releases certain low levels of growth-promoting factors in mollusc tissues.
While being held. These controlled release compositions generally grow in a matrix
Incorporating the promoter, so that the composition provides an effective amount of a growth promoter,
Can be released over a sustained period of time. Specifically, growth promoting factors are
A constant low level of growth promoting factors to the surrounding environment without producing harmful degradation products
Surrounded by a barrier that degrades slowly over time to maintain sustained release
Beads, capsules and microcapsules. Useful as a barrier
Compositions are generally commercially available, for example, compositions commonly used for pharmaceutical applications
Including things. Heller et al., Advanced Drug Delivery Rev. 10: 163-204 (1993), and T.
See yrrell et al., Biochim. Biophys. Acta 457: 259-302 (1976). Or,
Growth promoters are also adsorbed to the matrix, thereby growing them.
It can be released slowly from this matrix in the breeding environment.
Preferably, the controlled release composition is in the body or tissue of the acceptor mollusc.
Inserted. Preferably, the controlled release composition is more in the immediate area of pearl formation
Direct into mollusc gonad tissue to create areas of high growth-promoting factors
Can be inserted.
Minimal manual manipulation of mollusks to acceptor mollusk growth promoters
In addition to allowing exposure, slow dissolution of these controlled release compositions
Properties prevent them from acting as nuclei for nacre formation.
Following aquaculture, pearls are collected from acceptor molluscs by conventional methods.
You. These mollusks can then be used for repeated pearl farming, if desired.
It can be planted again.B. Pearl culture using transgenic mollusks capable of expressing growth promoting factors
As described above, modern pearl culture processes generally involve nuclear and mantle assemblies.
Implanting or inserting a piece of tissue into the gonad tissue of an acceptor mollusc
Include. However, this process can be performed, for example, if hemispherical pearls are desired.
Can change.
In certain embodiments of the invention, the mantle tissue from the nucleus and the donor mollusk
Are implanted in transgenic acceptor molluscs. This transformer
A genic acceptor mollusc is operably linked to a promoter sequence
, Exogenous nucleic acid sequences including segments encoding growth promoting factors. this child
Transgenic acceptor mollusks can express growth-promoting factors
You.
Alternatively, the mantle tissue implanted in the acceptor mollusc may be transgenic.
Obtained from enic donor molluscs. The donor mollusk is then
A segment encoding a growth-promoting factor operably linked to the promoter sequence.
Exogenous nucleic acid sequences. The implanted cells from the donor mollusk are
Therefore, a growth promoting factor can be expressed. This particular embodiment relates to transgenes into the environment.
It is particularly useful when it is desirable to avoid the release of the marine mollusc species. It
Thus, this embodiment is easily implemented on a commercial pearl farming operation scale.
The embodiments described above may be used in transgenic acceptor molluscs or transgenic
Generic donor molluscs have been described, but the acceptor
Either or both molluscs and donor molluscs are transgenic
Can get. That is, an exogenous growth promoting factor can be expressed.
The present invention is further illustrated by the following examples. These examples are simply
It is merely illustrative of the obvious aspects and is not intended to limit the invention.
Example
All reagents used herein are commercially available unless otherwise noted.Example 1: General oyster production
Oysters of various growth stages are used for many of the examples below. Therefore,
The first example describes oyster rearing and cultivation from egg cells to adult oysters
.
A breeding stock oyster with a typical egg is harvested from the wild just before the natural spawning season.
Taken. These oysters flow at slightly below the natural spawning temperature.
Maintained in through or recirculating seawater. This temperature is typically about 25 ° C
~ 30 ° C. If the gonads are visually determined to be in spawning conditions,
Increase the temperature from about 5 ° C to about 8 ° C. This increase in temperature usually induces spawning.
During the induction of spawning, the oysters are male and female identified and thereby placed in a separate container.
When spawning is complete, the oysters are removed from their respective tanks and sperm and egg suspension
Collect and mix the liquids. Once fertilized, transfer the eggs to a separate tank to begin larval aquaculture
Move.
Store the fertilized eggs at a density of about 20 to about 30 per ml and place them in an aerated tank for 24-48.
When to maintain. During this time, the eggs hatch. Collect the larvae returned from the eggs on a sieve
Place in a water tank at a density of about 20 larvae per ml and feed on algae. Bait is typically
Is a mixture of diatoms and Isochrysis galbana in a larval aquarium
The density of cells / ml.
As the larva grows, this density decreases. Typically, larvae are pedipes
When reaching the pediveliger stage, this density can be up to 2-3 per ml
Decrease. Due to metamorphosis, some species add substrate that adheres during this process.
Other species simply settle at the bottom of the aquarium, although addition is required. How many perverts
Some species may be chemically derived.
Following the metamorphosis, the young oysters (here called larvae) are flow-through containers (eg
Transfer to an upweller or downweller)
They are fed coarsely filtered seawater until they reach the body.Example 2: immersion
A.Promotion of fry growth
The following experiments were performed to evaluate the effect of the growth promoter on juvenile oysters.
Was:
Juvenile pearl oysters (Pinctada margeritifera), about 1 mm in length, were obtained from commercial sources
obtained. These juveniles were kept in a closed recirculating aquarium at 28 ° C, and Thallasiosira and
And Isochrysis. A subset of juveniles, 10-6In seawater containing M insulin
Immersion, while another group was immersed in seawater only. One week later, the processing group
It showed 30% higher growth than the treatment group. By soaking for one week in a row
However, there was a continuous and accelerated growth of juvenile oysters from the untreated group. Which
No deaths were observed in this group.
B.Promoting acceptor shell mollusc (shell) growth and pearl production
Approximately the same adult oysters are obtained from commercial hatcheries. A spherical core with a diameter of 10 mm and
25 mm of mantle tissue from other adult oystersTwoPlanting samples into these oysters
. Half of the oysters fed with these inoculations have about 10 μM of porcine insulin
Treated by immersion in 10 volumes of filtered ambient seawater containing This process
It occurs every 14 days throughout the growing season and ends during the non-growth period. The other half is control
The same operation is performed except that there is no contact with insulin.
After 12 months of treatment, the oysters in the treated group are larger than those in the untreated group
Shows the growth rate. Open the oysters of both groups and collect the pearls produced in them.
Dry, measure weight and its diameter. Oysters subjected to insulin treatment
The resulting pearls have a higher dry weight than the pearls produced by the control group.
And long diameter.Example 3 Controlled Release Composition
Slowly released insulin as described by Heller (supra)
Pussel is inserted into the oyster tissue or gonads of the test group. Insulin cap
Simultaneously with cell insertion, 25 mm of nucleus 10 mm in diameter and mantle tissue from donor oysterTwo
The sample is inserted into another cut in the gonad tissue of the test oyster. Close this oyster,
Return to normal culture conditions. After 12 months of culture, open test oysters and collect pearls
I do. Pearls collected from these test oysters were produced by a control group.
It has a longer diameter and greater dry weight than the pearls produced.Example 4: Infusion of growth promoting factors
Juvenile Pinctada maxima oysters are removed from their culture conditions. 18 gauge needle
The oyster is inserted into the mantle space through a V-shaped cut on the back. 1 ml of 100 mM
Inject the phosphorus solution into the oyster. Keep the injected oysters out of the water for 1 hour. After treatment
Return the oysters to normal farming conditions. The infusion is repeated every 14 days during the growth phase. 12 months later
This oyster shows a greater growth rate than the control oyster.Example 5: Production of transgenic oysters
The cDNA sequence of human insulin has been described (see Gen Bank Acc. No. L15440).
See). Includes 3 'and 5' untranslated regions and polyadenylation signal
The cDNA coding sequence was modified by the addition of a SalI linker, and Gorman et al. (Proc. Natl.
d.Sci. (USA) 79: 6777-6781 (1982)), the SalI portion in the pRSV-2 vector.
Rous sarcoma virus long terminal repeat (RSV-LTR) promoter / enhancer in position
Connect to columns. This allows the cDNA coding sequence to be converted to a 580 bp LTR sequence and a 3.7k
Ligation to the fRSV flanking sequence of b. After vector propagation, the appropriate tiger for injection
The vector is linearized to provide the gene.
Obtain the linearized transgene from a commercial hatchery or laboratory
Electroporates fertilized eggs from spawned and fertilized Pinctada maxima
. The eggs are cultivated to oyster larvae and juvenile oysters. RSV-LTR-insulin tran
The presence of the sgene is assayed from a biopsy of the oyster tissue. Extract chromosomal DNA and
Amplification is performed using a primer capable of hybridizing to the transgene. Amplification
Objects are detected by gel electrophoresis. Expression of human insulin is determined by
It is detected by western blotting of the extract of the dentin. Founding transgenic
Oysters are inbred to produce transgenic offspring. Transje
D
Status and expression of the offspring using the same methods as described for the founder oysters
Assay.
Transgenic oysters expressing human insulin sequences are approximately the same size
And cultured under the same conditions as the control group of normal oysters of the same age. 12 months
After monthly culture, transgenic oysters are higher than control group oysters
High growth rate.Example 6: Pearl culture using transgenic oysters
To demonstrate the effect of growth-promoting factors on the pearl culture process, two sources were used.
Provides busted oysters. Set 1 is promoted compared to the control group
Including the oysters of Example 5 that exhibit improved growth rates. Set 2 is "normal" Pinctada max
ima oysters, including non-transgenic oysters.
These oysters have a 10 mm diameter spherical nucleus and 25 mm of donor mantle-wrapped tissueTwoSump
Planting The following set of acceptor and donor oysters are used.
1. Transgenic acceptor oyster, normal donor oyster
2. Normal acceptor oyster, transgenic donor oyster
3. Transgenic acceptor oyster, transgenic donor oyster
4. Normal acceptor oyster, normal donor oyster (control)
Farm acceptor oysters in a marine environment for 12 months. At the end of the aquaculture process,
Pearls from loop 1, 2, and 3 oysters are provided by the control group.
It is longer in diameter than pearls produced and has a higher dry weight.
While the foregoing invention has been described in some detail for clarity and understanding, it has been described in form and form.
And changes in detail may be made without departing from the true scope of the invention.
Will be apparent to those of skill in the art upon reading this disclosure. All publications cited in this application
And patent documents, each publication or patent document is individually labeled as such.
Are incorporated by reference in their entirety for all purposes to the same extent as
.
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フロントページの続き
(72)発明者 ペインター，ケネディ ティー．，ジュニ
ア
アメリカ合衆国 メリーランド 21044,
コロンビア，デパーティッド サンセット
レーン 633
(72)発明者 チボデュー，フランシス アール.
アメリカ合衆国 カリフォルニア 94611,
オークランド，バルボア ドライブ 5826────────────────────────────────────────────────── ───
Continuation of front page
(72) Inventor Painter, Kennedy. , Juni
A
United States Maryland 21044,
Columbia, Departed Sunset
Lane 633
(72) Inventor Civodeu, Francis Earl.
United States California 94611,
Auckland, Balboa Drive 5826