JP2002300894A - Single nucleotide polymorphic typing method - Google Patents

Single nucleotide polymorphic typing method

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JP2002300894A
JP2002300894A JP2002019752A JP2002019752A JP2002300894A JP 2002300894 A JP2002300894 A JP 2002300894A JP 2002019752 A JP2002019752 A JP 2002019752A JP 2002019752 A JP2002019752 A JP 2002019752A JP 2002300894 A JP2002300894 A JP 2002300894A
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Inventor
Yusuke Nakamura
Yozo Onishi
Koichi Ozaki
Toshihiro Tanaka
Akira Yamada
祐輔 中村
洋三 大西
浩一 尾崎
亮 山田
敏博 田中
Original Assignee
Inst Of Physical & Chemical Res
理化学研究所
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Abstract

PROBLEM TO BE SOLVED: To type several thousand SNP sites with a relatively small amount of genome DNA. SOLUTION: This single nucleotide polymorphic typing method comprises an amplification process for simultaneously amplifying a plurality of base sequences containing at least one single nucleotide polymorphic site with a genome DNA and pairs of primers, and a typing process for discriminating a base at the single nucleotide polymorphic site contained in the base sequence with the base sequences amplified in the amplification process.

Description

【発明の詳細な説明】 DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

【0001】 [0001]

【発明の属する技術分野】本発明は、ゲノムDNAにおける一塩基多型(いわゆる、「SNP」)部位の多型を判定する際に使用される一塩基多型タイピング方法に関する。 The present invention relates to the single nucleotide polymorphisms in genomic DNA (so-called "SNP") regarding single nucleotide polymorphism typing method is used to determine the polymorphism site.

【0002】 [0002]

【従来の技術】ヒトの姿形が千差万別であるように、30 BACKGROUND OF THE INVENTION As figure type of person is an infinite variety, 30
億からなる遺伝暗号も個人間で比較するとかなり多くの部位で異なっている。 Is different in quite a lot of sites and the genetic code are also compared between individuals consisting billion. この遺伝暗号の違いを遺伝子多型(ポリモルフィズム)と呼んでおり、代表的な遺伝子多型として一塩基多型が知られている。 The difference between this genetic code is called a genetic polymorphism (polymorphism), single nucleotide polymorphisms are known as typical genetic polymorphisms.

【0003】一塩基多型(SNP:single nucleotide poly [0003] The single nucleotide polymorphism (SNP: single nucleotide poly
morphism)とは、複数の個体間における1塩基の違いを意味する。 Morphism) means a single nucleotide difference between a plurality of individuals. SNPは、その存在する位置によってcSNP(codi SNP is, cSNP by its present position (codi
ng SNP)とgSNP(genome SNP)に分類され、cSNPには、さらにsSNP(silent SNP)、rSNP(regulatory SNP)及びiSNP ng SNP) and is classified into gSNP (genome SNP), the cSNP, further sSNP (silent SNP), rSNP (regulatory SNP) and iSNP
(intron SNP)が含まれる。 (Intron SNP) are included. 本明細書においては、一塩基多型(以下、「SNP」という)が生じている部位、すなわち、ゲノムDNAにおいて、SNPが生じている所定の塩基を「一塩基多型部位」又は「SNP部位」と称する。 In the present specification, single nucleotide polymorphisms (hereinafter, referred to as "SNP") site occurs, i.e., in the genomic DNA, a predetermined base SNP has occurred "single nucleotide polymorphism site" or "SNP site referred to as ".

【0004】SNP部位は、ヒトゲノム中に300万〜1000万箇所あると考えられている。 [0004] The SNP site is believed to be from 3 million to 10 million places in the human genome. これらのSNPには、タンパク質の発現調節又は機能等に影響を与えるものがあり、 These SNP, while others affect the expression of proteins regulating or function like,
体質や疾病に対する易罹患性等の個人差に関与しているものがあると考えられている。 It is believed that those involved in individual differences, such as susceptibility to constitution and diseases. したがって、SNPに関する情報を得ることによって、個人の体質に応じた医療(オーダーメイド医療)を行うことができる。 Therefore, it is possible by obtaining information about the SNP, performing a medical according to constitution of the individual (personalized medicine). このため、SNPの発見及び同定が盛んに行われており、すでに多数のSNPが報告されている。 Therefore, SNP discovery and identification have been actively conducted, it has been reported already many SNP.

【0005】今後は、各SNPが疾病、薬物に対する応答性又は体質等に対してどのような影響を与えるのかといった知見を解析することとなる。 [0005] In the future, so that the respective SNP analyzes knowledge such what effect the response or extender or illnesses to drugs. このためには、先ず、 To do this, first of all,
各個人のSNPがどのようなものであるか、すなわち、SNP Or SNP of each individual is what kind of things, ie, SNP
部位の塩基を判別する作業(SNPタイピング)を行わなければならない。 Work to determine the site of the base must be performed (SNP typing). このSNPタイピングは、一人あたり数十万箇所のSNP部位について行われるといった、大規模な解析作業となる。 The SNP typing, such as is done for the SNP site hundreds of thousands of places per capita, a large-scale analysis work.

【0006】具体的に、SNPタイピングとしては、ゲノムDNAを用いたタックマンPCR法、インベーダー法、SniP [0006] Specifically, as the SNP typing, Taqman PCR method using the genomic DNA, invader method, SNIP
er法、MALDI-TOF-MASS法、RCA法及びDNAチップ法等を挙げることができる。 er method, MALDI-TOF-MASS method and a RCA method and DNA chip method. これらいずれの方法においても、1 In any of these methods, 1
箇所のSNP部位についてタイピングを行うために、少なくとも数十ngのゲノムDNAを必要とする。 To perform typing for the SNP site locations, it requires at least several tens of ng of genomic DNA. すなわち、数十万箇所のSNP部位についてタイピングを行う場合、一人あたり数mgのゲノムDNAを必要とする。 In other words, in the case of performing the typing for the SNP site hundreds of thousands of places, and require the genomic DNA of the number of per capita mg.

【0007】しかしながら、数mgのゲノムDNAを得るためには、一人から1リットル近くの血液を採取しなければならず、事実上、一人から数mgのゲノムDNAを得ることは不可能である。 [0007] However, in order to obtain the number mg of genomic DNA, must be taken one liter near the blood from one person, in fact, it is not possible to obtain a number mg of genomic DNA from one person. このため、一人について数十万箇所に及ぶSNP部位のタイピングを一度に行うことはできないのが現状である。 For this reason, at present, it can not be performed the SNP site of typing spanning hundreds of thousands of places for one person at a time.

【0008】 [0008]

【発明が解決しようとする課題】そこで、本発明は、このような実状に鑑みて案出されたものであり、比較的に少量のゲノムDNAを用いて数十万箇所に及ぶSNP部位についてタイピングを行うことのできる一塩基多型タイピング方法を提供することを目的とする。 [SUMMARY OF THE INVENTION Therefore, the present invention has such a in view of the circumstances be devised, typing for the SNP site spanning several hundred thousand points with a relatively small amount of genomic DNA and to provide a single nucleotide polymorphism typing method capable of performing.

【0009】 [0009]

【課題を解決するための手段】上述した目的を達成した本発明に係る一塩基多型タイピング方法は、少なくとも一つ以上の一塩基多型部位を含む複数の塩基配列を、ゲノムDNA及び複数対のプライマーを用いて同時に増幅する増幅工程と、上記増幅工程で増幅した複数の塩基配列を用いて、当該塩基配列に含まれる一塩基多型部位の塩基を判別するタイピング工程とを含むものである。 Means for Solving the Problems] single nucleotide polymorphism typing method of the present invention which achieves the above object, a plurality of base sequences including at least one single nucleotide polymorphism site, genomic DNA and pairs an amplifying step of amplifying simultaneously using primers, using a plurality of base sequences amplified in the amplification step, is intended to include a typing step of determining the single nucleotide polymorphic site nucleotide included in the nucleotide sequence. また、本発明に係る一塩基多型タイピング方法においては、上記増幅工程でホットスタート法を用いたポリメラーゼ連鎖反応を利用することが好ましい。 In the single nucleotide polymorphism typing method of the present invention, it is preferable to use the polymerase chain reaction using hot start method in the amplification step.

【0010】さらに、本発明に係る一塩基多型タイピング方法においては、上記増幅工程で50対以上のプライマーを使用することが好ましい。 Furthermore, in the single nucleotide polymorphism typing method of the present invention, it is preferable to use 50 or more pairs of primers in the amplification step. さらにまた、本発明に係る一塩基多型タイピング方法においては、上記タイピング工程でインベーダー法又はタックマンPCR法を用いることが好ましい。 Furthermore, in the single nucleotide polymorphism typing method of the present invention, it is preferable to use a Invader method or the TaqMan PCR method in the above typing step. さらにまた、上記増幅工程では、10ng Furthermore, in the above amplification process, 10 ng
〜40ngのゲノムDNAを使用することが好ましい。 It is preferred to use genomic DNA ~40Ng.

【0011】 [0011]

【発明の実施の形態】以下、本発明に係る一塩基多型タイピング方法について詳細に説明する。 BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION Hereinafter, will be described in detail for single nucleotide polymorphism typing method of the present invention.

【0012】本発明に係る一塩基多型タイピング方法では、先ず、解析対象のゲノムDNA及び複数対のプライマーを用いて、少なくとも一つ以上の一塩基多型部位を含む塩基配列を複数同時に増幅する増幅工程を行う。 [0012] In single nucleotide polymorphism typing method of the present invention, first, using the primers of the genomic DNA and a plurality of pairs of analyzed, a plurality simultaneously amplifying a base sequence comprising at least one or more single nucleotide polymorphism site the amplification process. その後、増幅工程で増幅した塩基配列を用いてタイピングを行うタイピング工程を行う。 Thereafter, the typing step of performing typing using the amplified nucleotide sequence in the amplification process.

【0013】1. [0013] 1. 増幅工程本方法において、解析対象のゲノムDNAは、従来より公知の手法を用いて抽出することができる。 In the amplification step the method, the genomic DNA to be analyzed can be extracted using known techniques conventionally. また、解析対象のゲノムDNAは、例えば、 In addition, the genomic DNA to be analyzed is, for example,
ヒトから採取した末梢血液より白血球を単離し、単離した白血球から定法に従って抽出することができる。 Leukocytes from peripheral blood collected from a human can be isolated and extracted according to a conventional method from the isolated leukocytes. 特に、本方法では、数十万箇所のSNPをタイピングする場合、約数十μgのゲノムDNAを準備すればよい。 In particular, in this way, the SNP hundreds of thousands locations if typing, may be prepared genomic DNA of about several tens of [mu] g. 言い換えると、本法によれば、数mlの末梢血液から数十万箇所の In other words, according to this method, from a few ml of peripheral blood several hundreds of thousand places
SNPをタイピングすることができる。 It is possible to typing the SNP.

【0014】増幅工程では、鋳型DNAとして準備したゲノムDNAと、タイピング対象のSNP部位を含む塩基配列を増幅する複数対のプライマーとを用いて、いわゆる、マルチプレックスポリメラーゼ連鎖反応(マルチプレックスPCR)を行う。 [0014] In the amplification step, a genomic DNA prepared as a template DNA, using the primer pairs for amplifying the nucleotide sequence containing the SNP site of the typing target, so-called multiplex polymerase chain reaction (multiplex PCR) do. ここで、複数対のプライマーは、SNP部位を挟む100〜300bpDNA断片を増幅できるように設計されることが好ましい。 Here, the primer pairs are preferably designed to amplify a 100~300bpDNA fragment flanking the SNP site. これらプライマーは、17〜25塩基であり、18〜22塩基であることがより好ましい。 These primers are 17-25 bases, and more preferably 18 to 22 bases. これらプライマーは、タイピング対象のSNP部位を挟み込むように、例えば、GenBank等のデータベースに蓄積された塩基配列情報に基づいて設計される。 These primers, so as to sandwich the SNP site of the typing target, for example, is designed based on the nucleotide sequence information stored in databases such as GenBank.

【0015】増幅工程は、初めに鋳型DNA(ゲノムDNA) [0015] amplification step, initially a template DNA (genomic DNA)
を熱変性させ、その後、鋳型DNAを変性させる熱変性工程、複数のプライマーを正確にアニーリングさせるアニーリング工程及びアニールしたプライマーからDNA鎖を合成する伸長工程からなるサイクルを繰り返し、最後に、さらにDNA鎖を伸長させる伸長工程を行う。 The heat denatured, then heat denaturing step to denature the template DNA, repeating a cycle composed of an extension step of synthesizing a DNA strand from annealing and annealed primers to accurately annealed a plurality of primers, finally, further DNA strands performing elongation step of extending the. なお、 It should be noted that,
各工程における設定温度及び設定時間については、適宜設定することが好ましい。 The set temperature and set time in each step, it is preferable to appropriately set.

【0016】このような増幅工程においては、例えば10 [0016] In such amplification step, for example 10
0対のプライマーを用いて100領域の塩基配列を増幅する場合、鋳型DNA量を10〜40ngとすることが好ましい。 0 When amplifying the base sequence of 100 regions using primer pairs, it is preferable that the 10~40ng the amount of template DNA. 鋳型DNA量が10ng未満である場合には、100領域全てを増幅することが困難となる。 When the amount of template DNA is less than 10ng, it is difficult to amplify all 100 area. 言い換えると、増幅工程において鋳型DNA量が10ng以上であれば、後述するタイピング工程で確実にタイピングできる程度のDNA断片を増幅することができる。 In other words, if the amount of template DNA in the amplification process is more 10 ng, it is possible to amplify a DNA fragment of a degree that can be reliably typing in the typing step described later. また、鋳型DNA量が40ngを越える場合には、数十万箇所のSNPについてタイピングを行うとすると、多量のゲノムDNAを必要としてしまうため現実的ではない。 Further, when the amount of template DNA is more than 40ng, when to perform the typing for the SNP hundreds of thousands locations, not practical for would require a large amount of genomic DNA.

【0017】このような増幅工程において、いわゆるホットスタート法を適用することが好ましい。 [0017] In this amplification process, it is preferable to apply the so-called hot-start technique. ホットスタート法とは、プライマーのミスアニーリングやオリゴマー化を防止すべく反応溶液が高温になってから、DNAポリメラーゼによる伸長反応を開始させる手法である。 The hot start method, is a technique from the reaction solution in order to prevent mistakes annealing or oligomerization primer becomes a high temperature, to initiate the extension reaction by DNA polymerase. 具体的に、ホットスタート法としては、PCRに必須な組成のうち少なくとも一種を、反応溶液が高温になった時に初めて添加する方法、ワックスバリアーを使用する方法、DNAポリメラーゼに対するモノクローナル抗体を利用する方法が挙げられる。 Specifically, the hot start method, at least one of the essential composition PCR, a method of first adding When the reaction solution was hot, the method of using wax barrier, methods of using monoclonal antibodies to DNA polymerase and the like.

【0018】ワックスバリアーを使用する方法では、先ず、反応容器内に固形のワックスを介して、DNAポリメラーゼ及び鋳型DNAを含む上層溶液と、プライマー及びd [0018] In the method using a wax barrier, firstly, through the wax solids in the reaction vessel, and the upper layer solution containing DNA polymerase and template DNA, primers and d
NTPを含む下層溶液とを分離させておく。 Allowed to separate and the lower layer solution containing NTP. その後、所定の温度にまで加熱することによって、ワックスが溶融して上層溶液及び下層溶液が混合し、初めてPCRを進行させる。 Thereafter, by heating to a predetermined temperature, the upper layer solution and a lower layer solution wax is melted and mixed, to advance the first PCR.

【0019】DNAポリメラーゼに対するモノクローナル抗体を利用する方法では、反応溶液が所定の温度になるまで、DNAポリメラーゼとモノクローナル抗体とを結合させ、DNAポリメラーゼを不活性化する。 [0019] In the method using a monoclonal antibody against the DNA polymerase until the reaction solution reaches a predetermined temperature, by combining the DNA polymerase and monoclonal antibodies, to inactivate the DNA polymerase. その後、反応溶液が所定の温度(約70度以上)にまで加熱されると、 Thereafter, the reaction solution is heated to a predetermined temperature (approximately 70 degrees or more),
モノクローナル抗体が不可逆的に熱変性してDNAポリメラーゼから遊離する。 Monoclonal antibodies are liberated from irreversibly heat denatured by DNA polymerase. これにより、DNAポリメラーゼは活性化し、PCRが進行することとなる。 Thus, DNA polymerase activation, so that the PCR progresses.

【0020】このように、いずれの方法であってもホットスタート法を用いることによって、各プライマーがミスアニーリングを起こした状態で伸長反応が進行してしまうことや、プライマー同士のオリゴマー化の発生を防止することができ、望ましくないDNA断片を増幅してしまうことを防止することができる。 [0020] Thus, by using the hot start technique be any method, and each primer will be elongation reaction proceeds in the state that caused the miss annealing, the occurrence of oligomerization of primers it is possible to prevent undesirable DNA fragment can be prevented from being amplified to.

【0021】増幅工程において、上述したようなホットスタート法を適用した場合には、300対以上のプライマーを用いて、300領域以上の塩基配列を同時に増幅することができる。 [0021] In the amplification step, in the case of applying the hot-start method as described above, it may use the 300 or more pairs of primers, simultaneously to amplify a nucleotide sequence of more than 300 regions. したがって、本方法において、上述したようなホットスタート法を適用することによって、より多くの塩基配列を同時に増幅できるため、より多くのSN Accordingly, in this method, by applying the hot-start method as described above, it is possible to simultaneously amplify more nucleotide sequences, more SN
Pについてタイピングを行うことができる。 Typing can be performed for the P.

【0022】2. [0022] 2. タイピング工程タイピング工程は、上述した増幅工程で増幅したDNA断片を用いて複数のSNPについてタイピングを行う工程である。 Typing step typing step is a step of typing for a plurality of SNP using a DNA fragment amplified in the amplification step described above. 本方法では、増幅工程で得られたDNA断片を用いて、例えば、タックマンP In this method, using the DNA fragment obtained in the amplification step, for example, Taqman P
CR法又はインベーダー法を適用してタイピングを行うことができる。 It is possible to perform typing by applying the CR method or invader method.

【0023】タックマンPCR法とは、蛍光標識したアレル特異的オリゴヌクレオチド(以下、アレル特異的オリゴと称する)とタイピング対象のSNPを含む鋳型DNAとTa [0023] The Taqman PCR method, fluorescence-labeled allele-specific oligonucleotide (hereinafter, referred to as allele specific oligonucleotide) and a template DNA containing a typing target SNP Ta
q DNAポリメラーゼとによるPCRを利用した方法である(Livak, KJ Genet. Anal. 14, 143 (1999); Morris PCR with the q DNA polymerase is a method of utilizing (Livak, KJ Genet Anal 14, 143 (1999);.. Morris
T. et al., J. Clin.Microbiol. 34, 2933 (1996))。 T. et al., J. Clin.Microbiol. 34, 2933 (1996)).
アレル特異的オリゴ(タックマンプローブともいう)は、 Allele-specific oligonucleotide (also referred to as a Taqman probes),
SNP情報に基づいて設計することができ、5'末端にFAMや It can be designed based on the SNP information, FAM Ya at the 5 'end
VICなどの蛍光レポーター色素Rによって標識されており、同時に3'末端がクエンチャーQ(消光物質)によって標識されている(図1)。 VIC is labeled with a fluorescent reporter dye R, such as, is labeled 3 'end with a quencher Q (quenching substance) simultaneously (Figure 1). 従って、この状態ではクエンチャーが蛍光エネルギーを吸収するため、タックマンプローブからの蛍光は検出できない。 The quencher thus in this state to absorb fluorescent energy, fluorescence from TaqMan probe can not be detected. また、タックマンプローブの3'末端はリン酸化されているため、PCR反応中にタックマンプローブからの伸長反応は起こらない(図1)。 Moreover, since the 3 'end of the TaqMan probe is phosphorylated, it does not occur extension reaction from Taqman probe during a PCR reaction (Figure 1).

【0024】このタックマンプローブと、SNPを含む領域を増幅するように設計したプライマーとTaq DNAポリメラーゼとを用いて、鋳型DNAについてPCRを行うと、次の反応が起こる。 [0024] and the Taqman probe, using the primers and Taq DNA polymerase were designed to amplify the region containing the SNP, when performing PCR for template DNA, the following reaction takes place. まず、タックマンプローブが鋳型DNA First, Taqman probe template DNA
の特異的な配列にハイブリダイゼーションし(図2a)、 Specific sequences and hybridization (Fig. 2a),
同時に、鋳型DNAにハイブリダイゼーションしたPCRプライマーからの伸長反応が起こる(図2b)。 At the same time, the extension reaction from the PCR primers hybridized to the template DNA occurs (Figure 2b). この際、Taq In this case, Taq
DNAポリメラーゼは、5'ヌクレアーゼ活性を有しているため、PCRプライマーからの伸長反応がタックマンプローブの5'末端まで達すると、タックマンプローブにおける蛍光レポーター色素Rを含むヌクレオチドを切断する(図2c)。 DNA polymerase, 'because it has nuclease activity, extension reaction PCR primer 5 of the Taqman probe' 5 reaches to the end, to cut the nucleotides containing a fluorescent reporter dye R in Taqman probe (Figure 2c). このように、蛍光レポーター色素Rを含むヌクレオチドが切断されると、蛍光レポーター色素RがクエンチャーQの影響を受けなくなり、蛍光を呈することとなる。 Thus, when the nucleotide containing a fluorescent reporter dye R is cleaved, a fluorescent reporter dye R is not affected by the quencher Q, so that the exhibit fluorescence. したがって、蛍光検出器により蛍光レポーター色素Rの蛍光を検出することによって、タックマンプローブと鋳型DNAとのハイブリダイズを確認することができる。 Therefore, by detecting the fluorescence of a fluorescent reporter dye R by a fluorescence detector, it is possible to confirm the hybridization with Taqman probe and the template DNA.

【0025】例えば、図3に示すように、SNP部位がAのアレル(アレル1とする)と、Gのアレル(アレル2とする)が存在すると仮定する。 [0025] For example, as shown in FIG. 3, it is assumed that the SNP site and the allele of the A (a allele 1), (a allele 2) allele of G exists. アレル1に特異的なタックマンプローブをFAMで標識するとともに、アレル2に特異的なタックマンプローブをVICで標識する(図3)。 Specific Taqman probes as well as labeled with FAM allele 1 are labeled with VIC specific Taqman probes allele 2 (Fig. 3).
これら2種類のタックマンプローブをPCR試薬に添加し、 These two Taqman probes were added to PCR reagents,
タイピング対象のSNPを含む鋳型DNAについてタックマン Taqman the template DNA containing the SNP typing target
PCRを行う。 PCR carried out. PCRを行うと、タイピング対象のSNP部位に相補的な塩基配列を持つタックマンプローブから、蛍光レポーター色素Rを含むヌクレオチドが遊離して蛍光を呈する。 Doing PCR, exhibits a Taqman probe having a nucleotide sequence complementary to the SNP site of the typing target, a fluorescent nucleotides are liberated containing a fluorescent reporter dye R. その後、蛍光検出器にてFAM及びVICの蛍光強度を測定する。 Thereafter, measuring the fluorescence intensity of FAM and VIC a fluorescence detector.

【0026】その結果、蛍光検出器にてFAMの強い蛍光を検出し、VICの蛍光をほとんど検出しない場合、鋳型D [0026] As a result, detected a strong fluorescence of the FAM with a fluorescence detector, if you do not hardly detectable fluorescence of VIC, mold D
NAにおけるSNPがアレル1のホモ接合体であるとタイピングできる。 SNP in NA can typing as homozygous allele 1. また、蛍光検出器にてFAMとVICの両者の蛍光を検出する場合、鋳型DNAにおけるSNPがアレル1及びアレル2のヘテロ接合体であるとタイピングできる。 Further, it typing a case, SNP in the template DNA is a heterozygous allele 1 and allele 2 of detecting both the fluorescence of FAM and VIC a fluorescence detector. さらに、蛍光検出器にてVICの強い蛍光を検出し、FAMの蛍光をほとんど検出しない場合、鋳型DNAにおけるSNPがアレル2のホモ接合体であるとタイピングできる。 Furthermore, to detect the intense fluorescence of VIC a fluorescence detector, if not almost detect the fluorescence of the FAM, SNP in the template DNA can be typed as homozygous alleles 2.

【0027】一方、インベーダー法とは、タイピング対象のSNPを含むDNAと、タイピング対象のSNPのそれぞれのアレルに特異的な2種類のレポータープローブ及び1種類のインベーダープローブと、DNAの構造を認識して切断するという特殊なエンドヌクレアーゼ活性を有する酵素とを用いる方法である(Livak, KJ Biomol. Eng. [0027] On the other hand, the Invader method, recognizes a DNA containing the SNP typing target, with a specific 2 types of reporter probes and one invader probe to each of the allele typing target SNP, the structure of DNA a method of using an enzyme having the specific endonuclease activity that cleaves Te (Livak, KJ Biomol. Eng.
14, 143-149 (1999); Morris T. et al., J. Clin.Micr 14, 143-149 (1999);. Morris T. et al, J. Clin.Micr
obiol. 34, 2933 (1996); Lyamichev, V. et al., Scie obiol 34, 2933 (1996);.. Lyamichev, V. et al, Scie
nce, 260, 778-783 (1993)等)。 nce, 260, 778-783 (1993), etc.). インベーダー法は、アレル特異的オリゴとタイピング対象のSNPを含むDNAとをハイブリダイゼーションすることによりSNP部位をタイピングすることができる。 Invader method can be typing the SNP site by hybridizing a DNA containing allele-specific oligos and typing the target SNP. インベーダー法では、2種類の非標識オリゴと1種類の蛍光標識オリゴを用いる。 The invader method, using two unlabeled oligonucleotides and one of the fluorescent-labeled oligos. 2種類の非標識オリゴのうちのひとつは、アレルプローブと呼ばれるものである。 One of the two types of non-labeled oligonucleotide is what is called allele probe.

【0028】アレルプローブは、ゲノムDNA(鋳型DNA) [0028] allele probe, genomic DNA (template DNA)
とハイブリダイズして相補鎖を形成するハイブリダイズ領域と、ゲノムDNAの配列とは無関係な配列を有してゲノムDNAとハイブリダイズしない領域(フラップという)とから構成され、ハイブリダイズ領域のうち最も5' And hybridized regions that form complementary strands hybridize, the sequence of the genomic DNA is constructed from a region which is not genomic DNA hybridized with a unrelated sequences (called flaps), most of the hybridizing region Five'
側をSNPに対応する塩基としている(図4a)。 And a base corresponding to the side to SNP (Fig. 4a). すなわち、アレルプローブは、ゲノムDNAにおけるSNP部位(図 That is, the allele probe, SNP site (Figure in genomic DNA
4a中「A」)を含み、当該SNP部位から5'側の領域と相補鎖を形成しうるハイブリダイズ領域と、SNPに対応する塩基(図4a中「T」)の5'側に付加されたフラップとを備えている。 During 4a includes "A"), from the SNP site 5 are added to the side 'hybridizing region capable of forming a region with a complementary strand of side 5 of the base (in FIG. 4a "T") corresponding to the SNP' It was and a flap. なお、フラップは、後述するフレットプローブの所定の領域と相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドである。 Incidentally, the flap is an oligonucleotide having a sequence complementary to the predetermined region of the FRET probe to be described later.

【0029】もうひとつの非標識オリゴは、インベーダープローブと呼ばれている。 [0029] Another non-labeled oligonucleotide is referred to as the invader probe. このインベーダープローブは、SNP部位(図4b中「A」)からゲノムDNAの3'側方向に向かって相補的にハイブリダイズするように設計されている(図4b)。 The invader probe is designed to complementarily hybridize toward the SNP site (in Fig. 4b "A") to the 3 'side direction of genomic DNA (Fig. 4b). 但し、SNP部位に対応する配列(図4b However, sequences corresponding to the SNP site (Fig. 4b
中、「N」)は任意の塩基でよい。 In "N") may be any base. 従って、鋳型であるゲノムDNAと上記2つのプローブをハイブリダイゼーションさせると、SNP部位にインベーダープローブの1塩基(N)が割り込むように侵入する(図4c)。 Accordingly, when the genomic DNA and the two probes are template is hybridized, single-base invader probe SNP site (N) enters to interrupt (Fig. 4c).

【0030】蛍光標識オリゴは、ゲノムDNAと全く無関係な配列であり、SNPの種類によらず配列は共通である。 [0030] Fluorescent labeled oligonucleotide is completely unrelated sequence and genomic DNA, sequence irrespective of the type of SNP are common. この蛍光標識オリゴをフレット(FRET)プローブ(f The fluorescent-labeled oligo fret (FRET) probe (f
luorescence resonance energy transfer probe)という(図5)。 luorescence resonance energy transfer probe) that (Fig. 5). FRETプローブの5'末端の塩基(レポーター) The FRET probe 5 'end base (reporter)
には蛍光色素Rが標識されており、その上流にはクエンチャーQが結合している。 Fluorochrome R are labeled, the upstream attached quencher Q to. 従って、この状態ではクエンチャーが蛍光を吸収するため、蛍光検出器では蛍光を検出できない。 The quencher thus in this state to absorb the fluorescence can not detect fluorescence in a fluorescence detector.

【0031】また、FRETプローブの5'末端(レポーター塩基)から一定領域(領域1とする)は、その領域1よりも3'側の領域と向き合って相補的な配列となるように設計されている(これを領域2という)。 Further, 5 of the FRET probe '(a region 1) constant region from the end (the reporter bases), 3 than the region 1' are designed to be complementary to a sequence opposite the side of the region are (this is called the region 2). 従って、領域1は領域2と自分自身で相補鎖を形成する(図5)。 Therefore, region 1 forms a complementary strand in the region 2 and itself (Fig. 5). また、この相補鎖形成領域よりもさらに3'方向の領域、すなわち、領域2の3'末端側は、アレルプローブにおけるフラップとハイブリダイズして相補鎖を形成できるように設計されている(図5)。 Also, three more than the complementary strand forming regions 'direction of a region, i.e., 3 areas 2' end is designed so as to form a flap and hybridized to a complementary strand in the allele probe (Fig. 5 ).

【0032】インベーダー法では、DNAの特殊な構造を認識して切断する特殊なエンドヌクレアーゼ活性を有する酵素(5'ヌクレオチダーゼ)の1つであるクリベース(cleavase)を用いる。 [0032] In the invader method, using cleavase (cleavase) which is one of the enzyme (5 'nucleotidase) having the specific endonuclease activity which recognizes and cleaves a special structure of DNA. クリベースは、ゲノムDNA、アレルプローブ及びインベーダープローブがSNP位置で3 Cleavase genomic DNA, allele probe and the invader probe at the SNP position 3
重になった時に、アレルプローブのSNP位置の3'側を切断することができる。 When it is heavy, it is possible to cut the 3 'side of the SNP position of the allele probe. 従って、図4cのように3つの塩基が並び、5'末端がフラップ状になっている部分を認識して、そのフラップ部分を切断する。 Accordingly, the arrangement of three bases as in Figure 4c, 5 'end recognizes the portion adapted like a flap is cut the flap portion. すなわち、このSNP In other words, this SNP
部位の構造がクリベースにより認識され(図6a)、SNP Structure sites are recognized by cleavase (Figure 6a), SNP
部位に対応する塩基でアレルプローブが切断されフラップ部分が遊離する(図6b)。 Allele probe with bases corresponding to sites flap section is cut free (Figure 6b).

【0033】次に、アレルプローブから遊離したフラップ部分は、FRETプローブと相補的な配列をもつため相補結合する(図6c)。 Next, the flap portion released from the allele probe is complementary coupling for having a sequence complementary to the FRET probe (Fig. 6c). このとき、フラップのSNP部位がFRE In this case, SNP site of the flap FRE
T自身の相補結合部位に割り込んで侵入する。 Entering interrupt the complementary binding site of the T itself. クリベースは再びこの構造を認識して蛍光色素を有するレポーター塩基を切断する。 Cleavase cleaves the reporter nucleotide having fluorescent dye aware of this structure again. 切断された蛍光色素は、クエンチャーの影響を受けなくなり、蛍光を呈する(図6d)。 Cut fluorochromes are no longer affected by the quencher exhibit fluorescence (Figure 6d). なお、アレルプローブにおけるSNPに対応する塩基がSNP部位とマッチしない場合は、図7に示すように、クリベースが認識する特異的なDNA構造をとらないため、アレルプローブは切断されず、フラップが遊離しない。 In the case where the base corresponding to the SNP in the allele probe does not match the SNP site, as shown in FIG. 7, since the cleavase takes no specific DNA structure recognized, allele probe is not cleaved, the flap is free do not do. 従って、この場合には、レポーター塩基に結合した蛍光色素は蛍光を呈しないこととなる。 Therefore, in this case, a fluorescent dye attached to a reporter nucleotide becomes not exhibit fluorescence.

【0034】具体的に、例えば、あるSNP部位がT又はC [0034] Specifically, for example, SNP site T or C
を取りうる場合、インベーダープローブ、T用のアレルプローブ、及びSNPに対応するレポーター塩基にFAMを結合させたフレットプローブ、並びにこれとは別にインベーダープローブ、C用のアレルプローブ、及びSNPに対応するレポーターにVICを結合させたフレットプローブとを準備し、全て混合してインベーダー法を行う。 If can take, invader probe, an allele probe for T, and FRET probe was bound to FAM reporter base corresponding to SNP and separately invader probe from this, allele probe for C, and reporters corresponding to SNP prepare the fRET probe bound with VIC to, perform invader method by mixing all. そして、蛍光検出器によってFAM及びVICの蛍光強度を検出することによって、SNP部位のタイピングを行う。 Then, by detecting the fluorescence intensity of FAM and VIC by fluorescence detector, it performs typing SNP sites. すなわち、検出の結果、強いFAMの蛍光を検出し、VICの蛍光を検出できない場合には、SNPがT/Tのホモ接合体であるとタイピングできる。 That is, the result of detection, detecting fluorescence of strong FAM, if it can not detect the fluorescence of the VIC, SNP can be typing as homozygous for T / T. また、検出の結果、FAM及びVIC両方の蛍光が検出できる場合には、SNPがT/Cのヘテロ接合体であるとタイピングできる。 As a result of the detection, when the fluorescence of both FAM and VIC can be detected, SNP can be typing with a heterozygous T / C. さらに、検出の結果、 In addition, the detection result,
強いVICの蛍光を検出し、FAMの蛍光を検出できない場合には、SNPがT/Tのホモ接合体であるとタイピングできる。 Detecting fluorescence of a strong VIC, if it can not detect the fluorescence of the FAM, SNP can be typing as homozygous for T / T.

【0035】ところで、タイピング工程においては、いわゆるSniPer法を用いてもよい。 By the way, in the typing process, it may be used so-called SniPer method. SniPer法とは、RCA(ro The SniPer method, RCA (ro
lling circle amplification)法と呼ばれる手法を基本原理とするものであり、環状の一本鎖DNAを鋳型としてD lling circle Amplification) is intended to the basic principle of technique called method, D a single-stranded DNA circular as template
NAポリメラーゼがその上を移動しながら相補鎖DNAを連続して合成していくものである。 In which NA polymerase will be synthesized continuously complementary strand DNA while moving thereon. この方法によれば、DN According to this method, DN
A増幅が起こった場合に生じる発色反応の有無を測定することによってSNPをタイピングすることができる(Liz It can be typing SNP by measuring the presence or absence of a color reaction which occurs when A amplification has occurred (Liz
ardi, PM et al., Nature Genet., 19, 225-232 (19 ardi, PM et al., Nature Genet., 19, 225-232 (19
98); Piated, AS et al., Nature Biotech., 16, 35 98);.. Piated, AS et al, Nature Biotech, 16, 35
9-363 (1998))。 9-363 (1998)).

【0036】特に、タイピング工程では、上述した如何なる方法を用いた場合においても図8aに示すようなカード1を使用することが好ましい。 [0036] In particular, the typing process, it is preferred to also use the card 1 as shown in Figure 8a in the case of using any method described above. このカード1は、一主面にマトリックス状に配設された多数のウェル2と、各ウェル2の周囲に突出するように形成された壁面3と、隣接するウェル2間に形成された複数の溝4とを有している。 The card 1 has a plurality of wells 2 disposed in a matrix on one principal surface, the wall 3 formed so as to protrude around each well 2, a plurality of which are formed between adjacent wells 2 and a groove 4.
例えば、限定されないが、カード1としては、24列×16 For example, without limitation, as the card 1, 24 rows × 16
行の合計384個のウェル2が形成されたものを用いることができる。 It can be used as the total 384 wells 2 row is formed.

【0037】カード1を用いてタイピング工程を行う場合、先ず、上述した増幅工程で得られたDNA断片をPCR反応溶液のままウェル2に分注する。 [0037] When performing typing process using the card 1, first, the DNA fragment obtained in the amplification step described above wells 2 the dispensing remains PCR reaction solution. その後、分注されたP After that, the dispensed P
CR反応溶液を乾燥させることによって、ウェル2の底面に乾燥したDNA断片が存在することとなる。 By drying the CR reaction solution, and the presence of dry DNA fragments on the bottom of the well 2.

【0038】その後、図8bに示すように、タイピング工程に必要な溶液、例えばインベーダー法に必要な溶液をウェル2に分注する。 [0038] Thereafter, as shown in FIG. 8b, the solution necessary for the typing process, for example, the invader method solution to note well 2 bisection required. このとき、タイピング工程に必要な溶液は、ウェル2の容積を超えた量で壁面3の上部に表面張力で分注される。 At this time, the solution required for typing process is dispensed by the surface tension at the top of the wall 3 in an amount exceeding the volume of the well 2. また、タイピング工程に必要な溶液をウェル2に分注することによって、ウェル2内に乾燥した状態で存在するDNA断片が当該溶液に溶解する。 Further, the solution by dispenses well 2 binary necessary to typing process, DNA fragment present in a dry condition in the well 2 is dissolved in the solution. タイピング工程に必要な溶液をウェル2に分注する際には、一枚のカード1に配設された複数のウェル2に同時に分注できる非接触型の分注機を用いることが好ましい。 The solution necessary for the typing process when dispenses well 2 binary, it is preferable to use a non-contact dispensing machine can be dispensed simultaneously to the plurality of wells 2 disposed on a single card 1.
非接触型の分注機によれば、ウェル2内部と接触しないため、複数のカード1間におけるコンタミネーションの発生を防止できる。 According to a non-contact dispensing machine, because it does not contact the inner well 2, it is possible to prevent occurrence of contamination between multiple cards 1.

【0039】次に、図8cに示すように、カード1の一主面を覆うに足る大きさのプラスティックプレート5を、 Next, As shown in FIG. 8c, a plastic plate 5 having a size enough to cover one main surface of the card 1,
カード1の一主面上に載置する。 It is placed on one main surface of the card 1. これにより、ウェル2に分注された溶液は、ウェル2の外部に流出する。 Accordingly, the solution was dispensed wells 2 binary flows out to the outside of the well 2. 流出した溶液の大部分は、溝4内に留まる。 Most of the leaked solution, remains in the groove 4.

【0040】次に、一主面にプラスティックプレート5 Next, plastic plate 5 on one main surface
を載置した状態のカード1を、超音波溶着装置で超音波処理することによって、当該プラスティックプレート5 By the card 1 mounted state, sonicated in an ultrasonic welding apparatus, the plastic plate 5
とカード1とを溶着する。 And to weld the card 1. 具体的には、図8dに示すように、壁面3の上面とプラスティックプレート5とが接触しているため、この接触箇所で溶着することができる。 Specifically, as shown in FIG. 8d, since the top and plastic plate 5 of the wall 3 is in contact, it can be welded in the contact portions.

【0041】このように、カード1を用いてタイピング工程を行うことによって、例えば加熱処理に供した場合であっても、ウェル2内における泡沫の発生を防止でき、且つ、ウェル2内に分注した溶液の流出を防止できる。 [0041] Thus, by performing the typing process using the card 1, for example, even when subjected to heat treatment, it is possible to prevent the occurrence of foam in the well 2, and, in the well 2 dispensing the outflow of solution can be prevented. このため、タイピング工程においてカード1を用いることによって、蛍光色素等の検出感度を向上させることができる。 Therefore, by using the card 1 in the typing process, it is possible to improve the detection sensitivity of such a fluorescent dye. また、ウェル2の容積が0.6μlであるようなカード1を用いた場合には、タイピング工程に要する溶液量を大幅に減少させることができるため、SNPタイピングに要するコストを大幅に削減することができる。 Further, when the volume of the well 2 with the card 1 such that 0.6μl, since it is possible to greatly reduce the amount of solution required for the typing process, significantly reduce the cost required for SNP typing it can.

【0042】さらに、カード1を用いてタイピング工程を行う場合には、タイピング工程に含まれる加熱処理等を、恒温水槽を用いて行うことが好ましい。 [0042] Further, in the case of performing the typing process using the card 1, the heat treatment or the like contained in the typing process, it is preferably carried out using a constant temperature water bath. 恒温水槽を用いることによって、一度に多数のカード1を用いてタイピング工程を行うことができる。 By using a constant-temperature water bath, it is possible to perform typing process using a number of card 1 at a time. すなわち、例えばサーマルサイクラー装置を用いた場合には、一度に多数のカード1を用いた処理が困難であるため、恒温水槽を用いて行うことが好ましい。 That is, for example in the case of using a thermal cycler device, since it is difficult process using a large number of cards at a time, is preferably carried out using a constant temperature water bath.

【0043】3. [0043] 3. 本方法の効果本方法では、採取又は抽出したゲノムDNAを増幅工程で増幅し、増幅したDNA断片を用いることで、目的のSNPについてタイピングを行うことができる。 In effect the method of the present method, the collected or extracted genomic DNA was amplified in the amplification step, using the amplified DNA fragment, it is possible to perform typing for the SNP of interest. したがって、本方法によれば、ゲノムDN Therefore, according to this method, genomic DN
Aが少量であっても、数十万箇所のSNPをタイピングすることができる。 A even with a small amount, it is possible to typing SNP hundreds of thousands locations. 具体的に、本方法によれば、10万箇所の Specifically, according to this method, 100,000 points
SNPをタイピングする場合、1箇所のSNPについて約0.1ng If you are typing the SNP, about the one place of SNP 0.1ng
のゲノムDNAを要すると換算できるため、約10μgのゲノムDNAを準備すればよい。 Since can be converted to require the genomic DNA, may be prepared genomic DNA of about 10 [mu] g. 約10μgのゲノムDNAは、ヒトから採取した末梢血液1.25mlから抽出することができる。 Genomic DNA of about 10μg can be extracted from peripheral blood 1.25ml collected from human.

【0044】これに対して、ゲノムDNA自体を用いてインベーダー法等のSNPタイピングを行う場合には、1箇所のSNPについて数十ngのゲノムDNAを要するため、10万箇所のSNPをタイピングするのに数mgのゲノムDNAを準備しなければならない。 [0044] On the contrary, when performing SNP typing Invader method or the like using genomic DNA itself, since it takes several tens of ng of genomic DNA for one position of the SNP, to typing SNP 100,000 points It must be prepared a few mg of genomic DNA. 数mgのゲノムDNAは、末梢血液を5 Number mg of genomic DNA, 5 peripheral blood
00ml以上採取しなければならず、現実的に準備することができない。 Must be taken more than 00ml, it is not possible to prepare realistic.

【0045】 [0045]

【実施例】以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。 EXAMPLES Hereinafter, the present invention is described in greater detail with reference to examples, but the technical scope of the present invention is not limited to these examples. 実施例1ゲノムDNAの調製インフォームドコンセントを得た被験者から採取した抹消血液より、白血球を単離しゲノムDNAを抽出した。 From Example 1 Genomic DNA peripheral blood collected from a subject to obtain a preparation informed consent was extracted isolated genomic DNA leukocytes. ゲノムDNA Genomic DNA
の抽出は、ゲノム解析ラボマニュアル(中村祐輔編 シュプリンガー・フェアラーク東京)の方法に従って以下の通り行った。 The extraction was carried out as follows according to the method of genome analysis lab manual (Yusuke ed., Springer-Verlag Tokyo Nakamura). 血液10mlを50mlのファルコンチューブに移し、室温で3000rpm、5分間遠心を行った。 Blood 10ml transferred to 50ml Falcon tubes were centrifuged 3000 rpm, 5 min at room temperature. ピペットにて上清(血清)を採取した後、RBC溶解バッファー(10 After the supernatant was collected (serum) with a pipette, RBC lysis buffer (10
mMNH 4 HCO 3 , 144mM NH 4 Cl)を30ml加えた。 mMNH 4 HCO 3, 144mM NH 4 Cl) was added 30 ml. 沈殿がほぐれるまで混和した後、室温で20分放置した。 After mixing until precipitation loosened and allowed to stand at room temperature for 20 minutes. 室温で3000rp 3000rp at room temperature
m、5分間遠心を行った後、ピペットにて上清(血清) After the centrifugal m, 5 minutes, the supernatant with a pipette (serum)
を捨て、白血球のペレットを得た。 The discarded, it was to give the white blood cells of the pellet. RBC溶解バッファーを30ml加え、同様の操作をさらに2回行った。 RBC lysis buffer was added 30 ml, was carried out two more times the same operation. 白血球のペレットにProteinase Kバッファー(50mM Tris-HCl(pH Proteinase pelleted leukocytes K buffer (50mM Tris-HCl (pH
7.4), 100mM NaCl, 1mM EDTA(pH8.0))を4ml、10% SDSを 7.4), 100mM NaCl, and 1 mM EDTA and (pH8.0)) 4ml, 10% SDS
200μl、10mg/ml Proteinase Kを200μl加え、転倒混和した後、37℃で一晩静置した。 200 [mu] l, a 10 mg / ml Proteinase K was added 200 [mu] l, was mixed by inversion and allowed to stand overnight at 37 ° C.. フェノールを4ml加え、 Phenol added 4ml,
ローテーター(Rotator T-50, Taitec)にて4時間ゆっくりと転倒混和した。 For 4 hours slowly Invert at rotator (Rotator T-50, Taitec). 室温で3000rpm、10分間遠心を行い、上層を新しいチューブに回収した。 Was centrifuged 3000 rpm, 10 min at room temperature, the upper layer was collected into a new tube. 4mlのフェノール-クロロホルム-イソアミルアルコール(容積比25:24: 4ml of phenol - chloroform - isoamylalcohol (volume ratio 25:24:
1)を加え、同様に2時間転倒混和した後、遠心した。 1) was added and after 2 hours mixing by inversion was similarly centrifuged. 上層を新しいチューブに回収し、4mlのクロロホルム-イソアミルアルコール(容積比24:1)を加え、同様に30分転倒混和した後、遠心した。 The upper layer was collected into a new tube, chloroform 4 ml - isoamyl alcohol (volume ratio 24: 1) was added and after 30 minutes Invert similarly, and centrifuged. 上層を新しいチューブに回収し、8M 酢酸アンモニウム400μl、イソプロパノール4ml The upper layer was collected into a new tube, ammonium 8M acetic 400 [mu] l, isopropanol 4ml
を加え、転倒混和した。 It was added and mixed by inversion. 糸状の白色析出物(DNA)を2ml容のチューブに回収し、70%エタノールを1ml加え、転倒混和した。 White precipitate filamentous a (DNA) were collected 2ml volume of the tube, 70% ethanol was added 1 ml, was mixed by inversion. 新しい2ml容のチューブにDNAを回収し風乾した後、TE溶液(10mM Tris-HCl(pH7.4), 1mM EDTA(pH7. After DNA was recovered and air-dried to a new 2ml ml tube, TE solution (10mM Tris-HCl (pH7.4), 1mM EDTA (pH7.
4))を500μl加え、溶解後、ゲノムDNAサンプルとした。 4)) was added 500 [mu] l, dissolved, and genomic DNA samples.

【0046】 実施例2ゲノムDNAの増幅実施例1で得たゲノムDNAのうち40ngを用いて50μl系にてPCRを行った。 [0046] PCR was performed in 50μl system using 40ng of genomic DNA obtained in the amplification Example 1 Example 2 genomic DNA. 反応液には、各50pmol の200種類のプライマー(10 The reaction solution, 200 kinds of primers each 50 pmol (10
0対、配列番号1〜200)、EX-TaqDNAポリメラーゼ(宝酒造株式会社製)10ユニット、TaqStart(CLONTECH Labo 0 vs, SEQ ID NO: 1~200), EX-TaqDNA polymerase (Takara Shuzo Co., Ltd.) 10 units, TaqStart (CLONTECH Labo
ratories社製)0.55μgを混入している。 It is mixed in the ratories Co., Ltd.) 0.55μg. このTaqStart This TaqStart
は、EX-TaqDNAポリメラーゼに対する抗体であり、反応液に加えることによってホットスタートを行うことができる。 Is an antibody against EX-Taq DNA polymerase, it is possible to perform hot start by adding to the reaction solution.

【0047】また、PCRは、GeneAmp PCR system 9700 [0047] In addition, PCR is, GeneAmp PCR system 9700
(Applied Biosystems社製)で行った。 It was carried out in (Applied Biosystems, Inc.). 最初に94℃、2 First to 94 ℃, 2
分でDNAを変性させた後、94℃、15秒の変性工程、60 After denaturing the DNA min, 94 ° C., of 15 seconds denaturation step, 60
℃、45秒のアニーリング工程、72℃、3分の伸長工程から成るサイクルを35回繰り返し、さらに72℃、3分で伸長させた。 ° C., 45 seconds annealing step, 72 ° C., the cycle repeated 35 times consisting of 3 minutes extension step, further 72 ° C., was extended at 3 minutes. このPCRでは、表1に示すように、SNP番号(表1中「SNP ID」と記す)1〜100を含む複数のDNA断片を同時に増幅することができる。 In the PCR, as shown in Table 1, SNP number (in Table 1 referred to as "SNP ID") can be simultaneously amplifying multiple DNA fragment containing 1 to 100.

【0048】 [0048]

【表1】 [Table 1]

【0049】 実施例3インベーダー法によるタイピング実施例2に記載したPCR後の試料を0.2μlずつ100個に分注し、インベーダーアッセイキット(Third Wave Tec [0049] Example 3 a sample after PCR as described in typing Example 2 by the invader method dispensed into 100 by 0.2μl min, Invader assay kit (Third Wave Tec
hnology社製)を用いて100種類のSNPタイピングを行った。 It was carried out 100 types of SNP typing using the hnology Co., Ltd.). すなわち、キットに含まれる、シグナルバッファー In other words, it included in the kit, the signal buffer
0.5μl、FRETプローブ0.5μl、構造特異的DNA分解酵素0.5μl、アレル特異的プローブ1μlに試料0.5μl 0.5 [mu] l, FRET probes 0.5 [mu] l, structure-specific DNA degrading enzyme 0.5 [mu] l, sample 0.5 [mu] l to allele-specific probes 1μl
を加え、反応体積を10μlに調製した。 It was added thereto to prepare a reaction volume 10 [mu] l. FRETプローブは異なる蛍光色素(FAM、VIC)で標識され、異なるフラップ相補的配列を有する2種類を用いる。 FRET probes are labeled with different fluorescent dyes (FAM, VIC), using two types having different flaps complementary sequence. 一対のプローブは2種類のFRETプローブに対応するフラップ部分を有する。 A pair of probes having a flap portion corresponding to the two types of FRET probes. この反応液をABI7700(Applied Biosystems)を用いて、95℃、5分、続いて63℃、15分インキュベートし、この間に発した蛍光を同機を用いて検出した。 The reaction liquid using ABI7700 the (Applied Biosystems), 95 ℃, 5 min, followed by 63 ° C., for 15 minutes, and detecting fluorescence emitted during this period with the aircraft.

【0050】SNP番号1のプローブにより異なる3サンプルをタイピングした結果を図9a,b,cにそれぞれ示す。 [0050] respectively three different samples by SNP numbers 1 probe Figure 9a the result of typing, b, to c. Drawing
9において、実線はFAMの蛍光、波線はVICの蛍光を示す。 In 9, a solid line fluorescence of FAM, the wavy line indicates the fluorescence of VIC. 図9aに示すように、このサンプルでは、VICによる蛍光のみが上昇している。 As shown in FIG. 9a, in this sample, only the fluorescence is increased by VIC. このことは、このサンプル中におけるSNP番号1の塩基が、両アレルともVICで標識されたFRETプローブに相補的なフラップを持つ特異的プローブに対応すること、すなわち、このサンプルがホモ接合体であることを示している。 This base SNP No. 1 during this sample, correspond to the specific probe having a complementary flap FRET probes labeled with VIC both alleles, i.e., the sample is a homozygote It is shown that. 図9bのサンプルの場合、 For the sample of Figure 9b,
一方のアレルがFAMで標識されたFRETプローブに相補的なフラップを持つ特異的プローブに対応し、他方のアレルがVICで標識されたFRETプローブに相補的なフラップを持つ特異的プローブに対応することを示している。 That one allele corresponds to the specific probe having a complementary flap FRET probes labeled with FAM, the other allele corresponds to a specific probe having a complementary flap FRET probe labeled with VIC the shows. すなわち、本サンプルはヘテロ接合体であることを示している。 That indicates that the sample is heterozygous. なお、図9cに示すサンプルは、FAMで標識されたF Incidentally, the samples shown in Figure 9c, labeled with FAM F
RETプローブに相補的なフラップを持つ特異的プローブに対応するホモ接合体であることが示された。 It has been shown in RET probe homozygous corresponding to specific probe having a complementary flap. また、SN In addition, SN
P番号1〜100について、98%のSNPについて蛍光が検出された。 For P number 1-100, fluorescence was detected for 98% of SNP. この結果は、本法を用いることにより1SNPにつき0.4ngという極少量のゲノムDNAでタイピングが可能であったことを示している。 This result indicates that typing was possible with very small amounts of genomic DNA that 0.4ng per 1SNP by using this method.

【0051】一方、0.4ngのゲノムDNAを用いて直接インベーダー法を行った場合には、図10に示すように、蛍光を検出することができず、タイピングが不可能であった。 Meanwhile, when performing direct Invader method using the genomic DNA of 0.4ng, as shown in FIG. 10, it is impossible to detect the fluorescence, it was impossible to typing. これは、アッセイに用いたDNA量(0.4ng)が少なかったため、検出に十分な蛍光が得られなかったものと考えられる。 This is because the amount of DNA used in the assay (0.4 ng) was small, a sufficient fluorescence detection is considered that could not be obtained.

【0052】 実施例4改良方法実施例3で説明したタイピング方法を改良して、より少量のゲノムDNAを用いたタイピング方法を検討した。 [0052] to improve the typing method described in Example 4 improved method in Example 3, was examined typing method using lower amounts of genomic DNA. なお、本例では、96穴の In this example, the 96
PCR用プレートを用いて、一度の増幅反応で96個のDNA断片を各穴にて増幅した。 Using PCR plate, and the 96 DNA fragments in a single amplification reaction is amplified by each well. また、本実施例4で行ったタイピング方法のフローチャートを図11に示した。 Also, a flow chart of typing methods were carried out in this Example 4 are shown in FIG. 11.

【0053】実施例2で得られたPCR産物を希釈後、384 [0053] After dilution of the PCR product obtained in Example 2, 384
穴のディープウェルに移した後、図8aに示したカードのウェル(容積0.6μl)に0.8μl分注した。 After transfer to the deep well of the well and dispensed 0.8μl minute in wells (volume 0.6 [mu] l) of the card shown in FIG. 8a. 分注には、Ro The dispensing, Ro
bbins社製の自動分注機Tangoを用いた。 Using an automatic dispenser Tango of bbins Corporation. 自動分注機Tang Automatic dispenser Tang
oを用いて384穴のディープウェルを有するプレート1枚から、96枚のカードにPCR産物を分注した。 From one plate having a deep well of a 384 well using o, was dispensed PCR products into a 96 cards. 自動分注機T Automatic dispenser T
angoは、384サンプルを一度に同時に分注することができ、一度の操作により8枚のカードに分注することができる。 ango is, 384 samples to be able to dispense at the same time once, it can be dispensed with eight of the card by a single operation. その後、室温で自然乾燥することによって分注したPCR産物を乾燥させた。 Then dried PCR products dispensed by air drying at room temperature.

【0054】次に、インベーダーアッセイキット(Thir Next, Invader assay kit (Thir
d Wave Technology社製)キットに含まれる、シグナルバッファー0.03μl、FRETプローブ0.03μl、構造特異的DNA分解酵素0.03μl及びアレル特異的プローブ0.06 Included in the d Wave Technology Inc.) kit, signal buffer 0.03Myueru, FRET probes 0.03Myueru, structure-specific DNA degrading enzyme 0.03Myueru and allele-specific probes 0.06
μlをウェル内に分注した。 The μl was dispensed into the wells minute. これら溶液は、Cartesian These solutions, Cartesian
Technologies社製の非接触型分注機PixSys4200を用いた。 Using Technologies Co., Ltd. of the non-contact type dispenser PixSys4200. 非接触型分注機PixSys4200は、384個のウェルを有するカード8枚に対して、上述した溶液を同時に分注することができる。 Contactless dispenser PixSys4200 can against eight cards having 384 wells, dispense above solution at the same time.

【0055】次に、カードにプラスチッププレートと載置した後、Branson社製の超音波溶着装置を用いて、超音波溶着処理を行った。 Next, after placing the positive tip plate on the card, using a Branson Co. ultrasonic welding apparatus, it was subjected to ultrasonic welding process. これにより、384個のウェルにを有するカードを96枚準備することができた。 Thus, it was possible to prepare 96 cards having 384 wells. 次に、TA Then, TA
ITEC社製の恒温水槽を用いて95℃、5分、続いて63℃、6 95 ° C. using ITEC Co. constant temperature water bath, 5 min, followed by 63 ° C., 6
0分インキュベートした。 0 minutes and incubated. その後、Applied Biosystems Then, Applied Biosystems
社製の蛍光検出装置ABI7900を用いて、カードの各ウェルから生ずる蛍光を検出してタイピングを行った。 Using company made of the fluorescence detection apparatus ABI7900, it was typed by detecting fluorescence produced from each well of the card. 結果を図12に示す。 The results are shown in Figure 12. 図12において横軸はVIC/ROXのシグナル強度を示し、縦軸はFAM/ROCのシグナル強度を示す。 The horizontal axis in FIG. 12 shows the signal intensity of VIC / ROX, the vertical axis represents the signal intensity of FAM / ROC. 図12中、右下のスポット群はVIC/ROXシグナルが強くFAM/ROCシグナルが弱い。 In FIG. 12, spot a group of lower right is weak strongly FAM / ROC signal VIC / ROX signal. 右下のスポット群に含まれるサンプルは、アレル1のホモ接合体であることを示している。 Samples included in the spot group in the lower right indicate that homozygous allele 1. また同様に、右上のスポット群は、アレル1 Similarly, the upper right corner of the spot group, allele 1
とアレル2とのヘテロ接合体であることを示している。 Indicates that the heterozygote of allele 2.
さらに同様に、左上のスポット群は、アレル2のホモ接合体であることを示している。 Furthermore Similarly, the upper left spot group is shown to be homozygous for the allele 2.

【0056】図12に示したように、本実施例4によれば、一タイピングに含まれるゲノムDNA量を0.1ngとした場合でも、蛍光を高感度に検出することができ、アレルを明確に識別することができ、確実にタイピングを行うことができた。 [0056] As shown in FIG. 12, according to the fourth embodiment, even when the 0.1ng genomic DNA amount included in one typing, it is possible to detect the fluorescence with high sensitivity, allele clearly the It can be identified and can be reliably performed typing. したがって、増幅工程において、一つの Therefore, in the amplification process, one
PCR反応に供するゲノムDNAは、約10ngとなる。 Genomic DNA subjected to PCR reactions, approximately 10 ng. このように、実施例4に従えば、実施例3の方法と比較して約1/ Thus, according to Example 4, approximately as compared with the method of Example 3 1 /
4量のゲノムDNAでタイピングを行うことができる。 Typing can be performed in 4 of genomic DNA.

【0057】 [0057]

【発明の効果】以上、詳細に説明したように、本発明に係る一塩基多型タイピング方法では、極く少量のゲノム Effect of the Invention] As described above in detail, in single nucleotide polymorphism typing method of the present invention, only small amounts of genomic
DNAを用いて数十万箇所に及ぶSNP部位についてタイピングを行うことができる。 DNA can be carried out typing for the SNP site spanning several hundred thousand points with. したがって、本発明に係る一塩基多型タイピング方法によれば、極く少量のゲノムDNA Therefore, according to the single-nucleotide polymorphism typing method of the present invention, only small amounts of genomic DNA
を用いて、短時間、且つ低コストで数十万箇所に及ぶSN With a short time, and SN ranging hundreds of thousands locations at low cost
P部位についてタイピングを行うことができる。 Typing can be performed for the P-site.

【0058】 [0058]

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> RIKEN <120> A method for SNP typing <130> RJH13-173S <150> JP2001-25700 <151> 2001-02-01 <160> 200 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 1 ccagcaggac ttggtgacag 20 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 2 gcaagaagca gccagatcaa g 21 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 3 cagccaccca ctcagtcttg 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 4 aggtcctggc tctgcgtaac 20 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 5 gcttgagact caccctctga tg 22 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 6 gtcccgactt gaaggtc [Sequence Listing] SEQUENCE LISTING <110> RIKEN <120> A method for SNP typing <130> RJH13-173S <150> JP2001-25700 <151> 2001-02-01 <160> 200 <170> PatentIn Ver. 2.0 < 210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 1 ccagcaggac ttggtgacag 20 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 2 gcaagaagca gccagatcaa g 21 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 3 cagccaccca ctcagtcttg 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 4 aggtcctggc tctgcgtaac 20 <210> 5 <211 > 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 5 gcttgagact caccctctga tg 22 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220 > <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 6 gtcccgactt gaaggtc cac 20 <210> 7 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 7 tctgccaagc agaaacctag ag 22 <210> 8 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 8 ggcaccttga gaggaatgc 19 <210> 9 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 9 ctttccgaca acgagagcg 19 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 10 cacctggact ctgcatcctg 20 <210> 11 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 11 aggccgtgag ggaatgatg 19 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 12 gggtgtctag catggtgctg 20 <210> 13 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 13 ttcagcatag ctccagaagg 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ctccagaagg c 21 <21 0> 14 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 14 tttggaccct tgtcctaaca ac 22 <210> 15 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 15 tggctcacta aatgcactac cac 23 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 16 acctggaggt gaagcgagac 20 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 17 accacaggct ccaggaagtg 20 <210> 18 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 18 tgcgtttgca ctggtaggc 19 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 19 cactcccacc accatcactg 20 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 20 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Primer <400> 20 gctcacggaa ctcgaagacg 20 <21 0> 21 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 21 caggtgacat cactgtcaga gc 22 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 22 acctgctgct gttgaagctg 20 <210> 23 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 23 cgttggaagc ctgtactcct tag 23 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 24 aggagagctc acccgaagtg 20 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 25 ggcacctctc caggattgtg 20 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 26 gaagccaggg caagtcattg 20 <210> 27 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 27 cccaaggccc actgtgttac 20 <2 0> 21 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 21 caggtgacat cactgtcaga gc 22 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213 > Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 22 acctgctgct gttgaagctg 20 <210> 23 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 23 cgttggaagc ctgtactcct tag 23 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 24 aggagagctc acccgaagtg 20 <210> 25 < 211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 25 ggcacctctc caggattgtg 20 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220 > <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 26 gaagccaggg caagtcattg 20 <210> 27 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 27 cccaaggccc actgtgttac 20 <2 10> 28 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 28 cctggtgcca agtggtcaag 20 <210> 29 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 29 gagcattgcc ctcctcactg 20 <210> 30 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 30 gtgccacaat tgatatgacc ag 22 <210> 31 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 31 gcctctacct ttaccgtccg 20 <210> 32 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 32 gccacctccc tgtcttcatc 20 <210> 33 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 33 cagcttcagg ccaaatgtat g 21 <210> 34 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 34 tcacacctcc tcctccattg 20 <21 10> 28 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 28 cctggtgcca agtggtcaag 20 <210> 29 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 29 gagcattgcc ctcctcactg 20 <210> 30 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 30 gtgccacaat tgatatgacc ag 22 <210> 31 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 31 gcctctacct ttaccgtccg 20 <210> 32 <211 > 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 32 gccacctccc tgtcttcatc 20 <210> 33 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 33 cagcttcagg ccaaatgtat g 21 <210> 34 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 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Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 48 tgttccctga tcctcatcca g <210> 42 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 42 tcgaaacaga agatgtggct g 21 <210> 43 <211> 20 <212> DNA < 213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 43 cagcagcaac aacaaccgtc 20 <210> 44 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence : Primer <400> 44 cccaagtgtg gtaggtttac aatg 24 <210> 45 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 45 gaaatgcctc cctggaacag 20 <210> 46 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 46 ctctgccaag cccatcttg 19 <210> 47 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence < 220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 47 tccctgagcc caggtaagtc 20 <210> 48 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 48 tgttccctga tcctcatcca g 21 <210> 49 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 49 catcctcgtc actgactaat agcg 24 <210> 50 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 50 tcaacagcga actccacctg 20 <210> 51 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 51 gccagggact gaagctgaac 20 <210> 52 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 52 aaagcatcag tgggcagaat c 21 <210> 53 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 53 tggtgagtgg tgaggtatta gcag 24 <210> 54 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 54 cactacatgg cacctcagga ag 22 <210> 55 <211> 21 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<400> 68 gcaacagcct gaatgtacac ag 22 <210> 69 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence : Primer <400> 69 ctgagggtcc cttcaccaag 20 <210> 70 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 70 gcaacagcct gaatgtacac ag 22 <210> 71 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 71 ccactgtcct ggctcagatg 20 <210> 72 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 72 gaggatgtca cggttccagt c 21 <210> 73 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 73 gtgaccttcc tctgtcctat tacg 24 <210> 74 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 74 tttcagcagg gacagagtcg 20 <210> 75 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 75 gtgaccttcc tctgtcctat tacg 24 <210> 76 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Prim 69 ctgagggtcc cttcaccaag 20 <210> 70 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 70 gcaacagcct gaatgtacac ag 22 <210> 71 <211> 20 < 212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 71 ccactgtcct ggctcagatg 20 <210> 72 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 72 gaggatgtca cggttccagt c 21 <210> 73 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 73 gtgaccttcc tctgtcctat tacg 24 <210> 74 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 74 tttcagcagg gacagagtcg 20 <210> 75 <211> 24 <212> DNA < 213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 75 gtgaccttcc tctgtcctat tacg 24 <210> 76 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Prim er <400> 76 tttcagcagg gacagagtcg 20 <210> 77 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 77 gtgaccttcc tctgtcctat tacg 24 <210> 78 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 78 tttcagcagg gacagagtcg 20 <210> 79 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 79 atccactggc cattctgctg 20 <210> 80 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 80 gctcaaggca gactggtgtc 20 <210> 81 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 81 aggcagacaa atcgccactc 20 <210> 82 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 82 tgcatgggct tcagtagagc 20 <210> 83 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Prime er <400> 76 tttcagcagg gacagagtcg 20 <210> 77 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 77 gtgaccttcc tctgtcctat tacg 24 <210> 78 < 211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 78 tttcagcagg gacagagtcg 20 <210> 79 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220 > <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 79 atccactggc cattctgctg 20 <210> 80 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 80 gctcaaggca gactggtgtc 20 <210> 81 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 81 aggcagacaa atcgccactc 20 <210> 82 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence 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<213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 96 tctgaattcc cattcttcat gc 22 <210> 97 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence :Primer <400> 97 ggccaaaggt tccaggagag 20 <210> 98 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 98 cgatgcagag actgtccaga g 21 <210> 99 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 99 ggccaaaggt tccaggagag 20 <210> 100 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 100 cgatgcagag actgtccaga g 21 <210> 101 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 101 cctcctcagt ttctccagcg 20 <210> 102 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 102 tgggcatctg aatggaagc 19 <210> 103 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 103 accaatccaa gggctaggtg 20 <210> 104 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Se : Primer <400> 97 ggccaaaggt tccaggagag 20 <210> 98 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 98 cgatgcagag actgtccaga g 21 <210> 99 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 99 ggccaaaggt tccaggagag 20 <210> 100 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence < 220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 100 cgatgcagag actgtccaga g 21 <210> 101 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400 > 101 cctcctcagt ttctccagcg 20 <210> 102 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 102 tgggcatctg aatggaagc 19 <210> 103 <211> 20 < 212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 103 accaatccaa gggctaggtg 20 <210> 104 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Se quence:Primer <400> 104 caggtccagc agtgatccat ac 22 <210> 105 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 105 gttacaaacc tgacttgtgg ctc 23 <210> 106 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 106 ggctatgagt tcccgctcag 20 <210> 107 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 107 gccaaacaat ccctcatgat ac 22 <210> 108 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 108 atgcttcctc taccatggcg 20 <210> 109 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 109 tcccaactca 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tcccaactca tttcagcatc tc 22 <210> 110 <211 > 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 110 tgtctgcctc cctgactctg 20 <210> 111 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Descrip tion of Artificial Sequence:Primer <400> 111 ttaactggcc ctgtctggtg 20 <210> 112 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 112 gtgcacacag aggtgtagcg 20 <210> 113 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 113 gggcttcttc tgcatgtgtg 20 <210> 114 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 114 tgcttcccac tgttctcagc 20 <210> 115 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 115 aaacctcact gtctgcttcc tg 22 <210> 116 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 116 caggtgagat cggcacactc 20 <210> 117 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 117 ccacctgtaa gaacagaagt ggc 23 <210> 118 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220 tion of Artificial Sequence: Primer <400> 111 ttaactggcc ctgtctggtg 20 <210> 112 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 112 gtgcacacag aggtgtagcg 20 < 210> 113 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 113 gggcttcttc tgcatgtgtg 20 <210> 114 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 114 tgcttcccac tgttctcagc 20 <210> 115 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 115 aaacctcact gtctgcttcc tg 22 <210> 116 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 116 caggtgagat cggcacactc 20 <210> 117 <211 > 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 117 ccacctgtaa gaacagaagt ggc 23 <210> 118 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220 > <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 118 acccaagttt gggactctgc 20 <210> 119 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 119 tttggccttg tttgcctctg 20 <210> 120 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 120 aaggccacag tttgagaacg 20 <210> 121 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 121 gagtgtggtc cataaacttg gc 22 <210> 122 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 122 accacgtctc tagccagtcg 20 <210> 123 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 123 gctgtgtgac gttaggccag 20 <210> 124 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 124 agatactggg ttccatccgc 20 <210> 125 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Se > <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 118 acccaagttt gggactctgc 20 <210> 119 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 119 tttggccttg tttgcctctg 20 <210> 120 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 120 aaggccacag tttgagaacg 20 <210> 121 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 121 gagtgtggtc cataaacttg gc 22 <210> 122 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 122 accacgtctc tagccagtcg 20 <210> 123 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 123 gctgtgtgac gttaggccag 20 <210 > 124 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 124 agatactggg ttccatccgc 20 <210> 125 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Se quence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 125 gttctcggag gtggctcttg 20 <210> 126 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 126 ccacatcact ctctcctgca tc 22 <210> 127 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 127 gcttattcct gcaaggcgtc 20 <210> 128 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 128 aatggaagcc aaaggcacag 20 <210> 129 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 129 gcttattcct gcaaggcgtc 20 <210> 130 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 130 aatggaagcc aaaggcacag 20 <210> 131 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 131 gcttattcct gcaaggcgtc 20 <210> 132 <211> 20 <212> DNA <213> Ar quence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 125 gttctcggag gtggctcttg 20 <210> 126 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer < 400> 126 ccacatcact ctctcctgca tc 22 <210> 127 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 127 gcttattcct gcaaggcgtc 20 <210> 128 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 128 aatggaagcc aaaggcacag 20 <210> 129 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> < 223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 129 gcttattcct gcaaggcgtc 20 <210> 130 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 130 aatggaagcc aaaggcacag 20 <210> 131 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 131 gcttattcct gcaaggcgtc 20 <210> 132 <211> 20 <212> DNA < 213> Ar tificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 132 aatggaagcc aaaggcacag 20 <210> 133 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 133 aaccctgagc ctgtcacctg 20 <210> 134 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 134 tgagccctga atgcgagtag 20 <210> 135 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 135 tgtgaccttc ctggctcttc 20 <210> 136 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 136 agcctcactg acatgccttg 20 <210> 137 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143 tggcttgagg ttctggcttc 20 <210> 144 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 144 tgtgacgggt aaggcagatg 20 <210> 145 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 145 cctatgctca gccaaggtca g 21 <2 > DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 139 caatattagc tccaccgagg c 21 <210> 140 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 140 cctcgccaac taaatgcaga c 21 <210> 141 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 141 cataagccga gtggtacaga gc 22 <210> 142 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 142 tccaaaggcc atagtttacc aag 23 <210> 143 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 143 tggcttgagg ttctggcttc 20 <210> 144 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 144 tgtgacgggt aaggcagatg 20 <210> 145 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 145 cctatgctca gccaaggtca g 21 <2 10> 146 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 146 agaaccacct gggctgctac 20 <210> 147 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 147 cctatgctca gccaaggtca g 21 <210> 148 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 148 agaaccacct gggctgctac 20 <210> 149 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 149 ctgtgatggg ctgcagaatg 20 <210> 150 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 150 ggagagcctc cagttcaagc 20 <210> 151 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 151 cacccagtgc agccttatag c 21 <210> 152 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 152 acctccctct ctgc 10> 146 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 146 agaaccacct gggctgctac 20 <210> 147 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 147 cctatgctca gccaaggtca g 21 <210> 148 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 148 agaaccacct gggctgctac 20 <210> 149 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 149 ctgtgatggg ctgcagaatg 20 <210> 150 <211 > 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 150 ggagagcctc cagttcaagc 20 <210> 151 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 151 cacccagtgc agccttatag c 21 <210> 152 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 152 acctccctct ctgc cttctg 20 <210> 153 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 153 accacggagt ctggcatcac 20 <210> 154 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 154 cggtcagaac aaagagagtg gaac 24 <210> 155 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 155 tttgtccttg ggcttggtag 20 <210> 156 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 156 cagggagagg tatacgatgg tg 22 <210> 157 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> 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<220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 157 cccatcccgt taaagcactt ag 22 <210> 158 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 158 aggatgggct tcccactcag 20 <210> 159 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 159 cccatcccgt taaagcactt ag 22 <210> 160 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 160 aggatgggct tcccactcag 20 <210> 161 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 161 gtgtgctttg tttggtttgc atag 24 <210> 162 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 162 ctgggaatgt gccagcaag 19 <210> 163 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 163 gtgtgctttg tttggtttgc atag 24 <210> 164 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 164 ctgggaatgt gccagcaag 19 <210> 165 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 165 gtgtgctttg tttggtttgc atag 24 <210> 166 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificia 159 cccatcccgt taaagcactt ag 22 <210> 160 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 160 aggatgggct tcccactcag 20 <210> 161 <211> 24 < 212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 161 gtgtgctttg tttggtttgc atag 24 <210> 162 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223 > Description of Artificial Sequence: Primer <400> 162 ctgggaatgt gccagcaag 19 <210> 163 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 163 gtgtgctttg tttggtttgc atag 24 <210> 164 <211> 19 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cagaggaatg c 21 <210> 171 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 171 caaacaggtc acatttgctg aag 23 <210> 172 <211 > 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 172 tggcccacac agactaataa gc 22 <210> 173 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220 > <223> Descri ption of Artificial Sequence:Primer <400> 173 caaacaggtc acatttgctg aag 23 <210> 174 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 174 tggcccacac agactaataa gc 22 <210> 175 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 175 ggaggcctga cagccatatc 20 <210> 176 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 176 gccatatgtg gaacaagcag c 21 <210> 177 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 177 ttctttctgc catcaagttg c 21 <210> 178 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 178 gctttgccag gagcctagtg 20 <210> 179 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 179 tgtgatcttc caattcctcc tg 22 <210> 180 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Seque ption of Artificial Sequence: Primer <400> 173 caaacaggtc acatttgctg aag 23 <210> 174 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 174 tggcccacac agactaataa gc 22 <210> 175 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 175 ggaggcctga cagccatatc 20 <210> 176 <211> 21 <212> DNA < 213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 176 gccatatgtg gaacaagcag c 21 <210> 177 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 177 ttctttctgc catcaagttg c 21 <210> 178 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 178 gctttgccag gagcctagtg 20 <210> 179 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 179 tgtgatcttc caattcctcc tg 22 <210> 180 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Seque nce <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 180 tatggcaggg aaggaagcac 20 <210> 181 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 181 tggtgaagct gctggatgac 20 <210> 182 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 182 gacacccacc aaagcatgta taac 24 <210> 183 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 183 tgcaccagac agggtagctg 20 <210> 184 <211> 346 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 184 ccatccagcc aagtccttgt agtgcaccag acagggtagc tgccatccag ccaagtcctt 60 gtagccagac ggcttagagc actgcgagag catccaccag agtgggacgg atgaagatga 120 acgcatccca gcagccctct tagcttgcct tgaacttgct ctgccacacc tgccctttat 180 tggtctctcc agcaggtaca ggcacgcctt catctctgca agctccctca tgtcctggtg 240 cattgagctg cgaagagagc cagaggatca caggtcgtag gcagatgcca tccagactgg 300 g nce <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 180 tatggcaggg aaggaagcac 20 <210> 181 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer < 400> 181 tggtgaagct gctggatgac 20 <210> 182 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 182 gacacccacc aaagcatgta taac 24 <210> 183 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 183 tgcaccagac agggtagctg 20 <210> 184 <211> 346 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> < 223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 184 ccatccagcc aagtccttgt agtgcaccag acagggtagc tgccatccag ccaagtcctt 60 gtagccagac ggcttagagc actgcgagag catccaccag agtgggacgg atgaagatga 120 acgcatccca gcagccctct tagcttgcct tgaacttgct ctgccacacc tgccctttat 180 tggtctctcc agcaggtaca ggcacgcctt catctctgca agctccctca tgtcctggtg 240 cattgagctg cgaagagagc cagaggatca caggtcgtag gcagatgcca tccagactgg 300 g tcagtgctc catgtgggaa tcggtgtcaa ggcacatcac atggtc 346 <210> 185 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 185 tgcaccagac agggtagctg 20 <210> 186 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 186 ccatccagcc aagtccttgt ag 22 <210> 187 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 187 ccagacggct tagagcactg 20 <210> 188 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 188 cgagagcatc caccagagtg 20 <210> 189 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 189 ggacggatga agatgaacgc 20 <210> 190 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 190 atcccagcag ccctcttagc 20 <210> 191 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description tcagtgctc catgtgggaa tcggtgtcaa ggcacatcac atggtc 346 <210> 185 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 185 tgcaccagac agggtagctg 20 <210> 186 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 186 ccatccagcc aagtccttgt ag 22 <210> 187 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> < 223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 187 ccagacggct tagagcactg 20 <210> 188 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 188 cgagagcatc caccagagtg 20 <210> 189 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 189 ggacggatga agatgaacgc 20 <210> 190 <211> 20 <212> DNA < 213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 190 atcccagcag ccctcttagc 20 <210> 191 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 191 ttgccttgaa cttgctctgc 20 <210> 192 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 192 cacacctgcc ctttattggt c 21 <210> 193 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 193 tctccagcag gtacaggcac 20 <210> 194 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 194 gccttcatct ctgcaagctc 20 <210> 195 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 195 cctcatgtcc tggtgcattg 20 <210> 196 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 196 agctgcgaag agagccagag 20 <210> 197 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 197 gatcacaggt cgtaggcaga tg 22 <210> 198 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> of Artificial Sequence: Primer <400> 191 ttgccttgaa cttgctctgc 20 <210> 192 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 192 cacacctgcc ctttattggt c 21 < 210> 193 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 193 tctccagcag gtacaggcac 20 <210> 194 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 194 gccttcatct ctgcaagctc 20 <210> 195 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 195 cctcatgtcc tggtgcattg 20 <210> 196 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 196 agctgcgaag agagccagag 20 <210> 197 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 197 gatcacaggt cgtaggcaga tg 22 <210> 198 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 198 ccatccagac tgggtcagtg 20 <210> 199 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 199 ctccatgtgg gaatcggtg 19 <210> 200 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 200 tcaaggcaca tcacatggtc 20 Description of Artificial Sequence: Primer <400> 198 ccatccagac tgggtcagtg 20 <210> 199 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 199 ctccatgtgg gaatcggtg 19 < 210> 200 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 200 tcaaggcaca tcacatggtc 20

【0059】 [0059]

【配列表フリーテキスト】配列番号1〜200は合成プライマーである。 Sequence Listing Free Text SEQ ID NO: 1 to 200 is a synthetic primer.

【図面の簡単な説明】 BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS

【図1】タックマンプローブを模式的に示す図である。 1 is a diagram schematically showing a Taqman probe.

【図2】タックマンPCR法の各工程を概略的に示す図である。 2 is a diagram schematically showing each step of TaqMan PCR.

【図3】蛍光標識を付したタックマンプローブを模式的に示す図である。 3 is a diagram schematically showing a Taqman probe marked with a fluorescent label.

【図4】インベーダー法を概略的に示す図である。 [4] Invader method is a diagram schematically showing.

【図5】フレットプローブを模式的に示す図である。 The Figure 5 FRET probe is a diagram schematically illustrating.

【図6】インベーダー法を概略的に示す図である。 [6] Invader method is a diagram schematically showing.

【図7】アレルとマッチしないプローブを模式的に示す図である。 [7] The probe does not match the allele is a diagram schematically illustrating.

【図8】タイピング工程に用いるカードの要部断面図である。 8 is a fragmentary cross-sectional view of a card used in the typing process.

【図9】SNP番号1をタイピングした結果を示す特性図である。 9 is a characteristic diagram showing the results of the SNP number 1 and typing.

【図10】ゲノムDNAを直接インベーダー法に用いてタイピングした結果を示す特性図である。 [Figure 10] using the genomic DNA directly invader method is a characteristic diagram showing a result of typing.

【図11】実施例4に示したタイピング方法のフローチャートである。 11 is a flowchart of a typing method shown in Example 4.

【図12】実施例4における、VIC/ROX及びFAM/ROXのシグナル強度を測定した結果を示す特性図である。 In [12] Example 4 is a characteristic diagram showing the results obtained by measuring the signal strength of the VIC / ROX and FAM / ROX.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 田中 敏博 東京都港区白金台4−6−1 東京大学医 科学研究所内 理化学研究所 遺伝子多型 研究センター内 (72)発明者 大西 洋三 東京都港区白金台4−6−1 東京大学医 科学研究所内 理化学研究所 遺伝子多型 研究センター内 (72)発明者 尾崎 浩一 東京都港区白金台4−6−1 東京大学医 科学研究所内 理化学研究所 遺伝子多型 研究センター内 (72)発明者 山田 亮 東京都港区白金台4−6−1 東京大学医 科学研究所内 理化学研究所 遺伝子多型 研究センター内 Fターム(参考) 4B024 AA01 AA11 CA03 CA09 HA14 4B063 QA13 QA19 QQ43 QQ58 QR32 QR56 QR62 QS25 QS34 QX02 ────────────────────────────────────────────────── ─── of the front page continued (72) inventor Toshihiro Tanaka, Minato-ku, Tokyo 4-6-1 Shirokanedai Tokyo University of Medical Science in the Institute RIKEN SNP research in the Center (72) inventor Yozo Onishi, Minato-ku, Tokyo Shirokanedai 4-6-1 Institute of Medical Science, University of Tokyo in the RIKEN SNP research in the Center (72) inventor Koichi Ozaki, Minato-ku, Tokyo 4-6-1 Shirokanedai Institute of Medical Science, University of Tokyo in the RIKEN gene polymorphism research Center in (72) inventor Ryo Yamada, Minato-ku, Tokyo 4-6-1 Shirokanedai Institute of Medical Science, University of Tokyo in the RIKEN SNP research Center in the F-term (reference) 4B024 AA01 AA11 CA03 CA09 HA14 4B063 QA13 QA19 QQ43 QQ58 QR32 QR56 QR62 QS25 QS34 QX02

Claims (5)

    【特許請求の範囲】 [The claims]
  1. 【請求項1】 少なくとも一つ以上の一塩基多型部位を含む複数の塩基配列を、ゲノムDNA及び複数対のプライマーを用いて同時に増幅する増幅工程と、上記増幅工程で増幅した複数の塩基配列を用いて、当該塩基配列に含まれる一塩基多型部位の塩基を判別するタイピング工程とを含む一塩基多型タイピング方法。 The method according to claim 1 a plurality of base sequences including at least one single nucleotide polymorphism site, an amplifying step of amplifying simultaneously using primers genomic DNA and a plurality of pairs, the plurality of nucleotide sequences amplified by the amplifying step using single nucleotide polymorphism typing method and a typing step of determining the single nucleotide polymorphic site nucleotide included in the nucleotide sequence.
  2. 【請求項2】 上記増幅工程では、ホットスタート法を用いたポリメラーゼ連鎖反応を利用することを特徴とする請求項1記載の一塩基多型タイピング方法。 The method according to claim 2 wherein said amplification step, single nucleotide polymorphism typing method of claim 1, wherein utilizing the polymerase chain reaction using a hot start method.
  3. 【請求項3】 上記増幅工程では、50対以上のプライマーを使用することを特徴とする請求項1記載の一塩基多型タイピング方法。 The method according to claim 3, wherein said amplification step, single nucleotide polymorphism typing method of claim 1, wherein the use of more than 50 pairs of primers.
  4. 【請求項4】 上記タイピング工程では、インベーダー法又はタックマンPCR法を用いることを特徴とする請求項1記載の一塩基多型タイピング方法。 Wherein in the above typing step, single nucleotide polymorphism typing method of claim 1, which comprises using the Invader method or TaqMan PCR.
  5. 【請求項5】 上記増幅工程では、10ng〜40ngのゲノム The method according to claim 5 wherein the amplification step, the genome of 10ng~40ng
    DNAを使用することを特徴とする請求項1記載の一塩基多型タイピング方法。 Single nucleotide polymorphism typing method of claim 1, wherein the use of DNA.
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