JP2002171961A - New yeast and yeast extract - Google Patents

New yeast and yeast extract

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JP2002171961A
JP2002171961A JP2000375410A JP2000375410A JP2002171961A JP 2002171961 A JP2002171961 A JP 2002171961A JP 2000375410 A JP2000375410 A JP 2000375410A JP 2000375410 A JP2000375410 A JP 2000375410A JP 2002171961 A JP2002171961 A JP 2002171961A
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幸博 中條
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日本たばこ産業株式会社
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Abstract

PROBLEM TO BE SOLVED: To provide an yeast extract, in which glutamic acid content is increased without adding glutamic acid as an additive, having thick taste and high potency of delicious taste.
SOLUTION: An yeast extract comprising at least 3% (based on extract solid content) glutamic acid derived from glutamic acid intracellularly isolated is obtained by digesting an yeast containing free glutamic acid in an amount of ≥15 mg per g dried yeast cell in the cell. The yeast extract in the present invention has remarkably thick taste, as compared with yeast extract to which glutamic acid is added as an additive.
COPYRIGHT: (C)2002,JPO

Description

【発明の詳細な説明】 DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

【0001】 [0001]

【発明の属する技術分野】本発明は新規酵母エキスとその製造方法に関する。 The present invention relates to a method for manufacturing the same with a new yeast extract. 酵母エキスは天然調味料として利用されている。 Yeast extract has been used as a natural seasoning.

【0002】 [0002]

【従来の技術】酵母エキスの工業的生産は、主としてパン酵母、ビール酵母、キャンディダ属の酵母を消化することにより行われ、生成されるアミノ酸やペプチド、ヌクレオチドの呈味成分からなる天然調味料として利用されてきた。 Industrial production of the Prior Art yeast extract, primarily baker's yeast, brewer's yeast, is carried out by digesting the yeast of the genus Candida, amino acid or peptide is generated, natural seasoning consisting taste components of nucleotide It has been used as. これらの酵母エキスはビーフ代替や複雑味を付与するための隠し味に使用されている。 These yeast extract has been used in the secret ingredient for imparting a beef substitute and complex taste. これらの旨味は、ペプチド成分やイノシン酸、グアニル酸等のヌクレオチド成分の呈味に大きく依存したものであり、旨味力価はあまり高くはなく、酵母エキスの持つ不快な酵母臭の存在により、食品への添加量をあまり増やすことができないことから、その用途は限られたものになっていた。 These taste the peptide component and inosinic acid, which has largely dependent on the taste of the nucleotide components, such as guanylate not so high umami titer, the presence of unpleasant yeast odor possessed by yeast extract, food the amount from the fact that can not be much increase to, its use had become what was limited. さらに酵母エキスの味質はペプチドやヌクレオチドが中心であり、幅の広い比較的濃厚な後味を特徴としたものであり、先味感のあるすっきりとした旨味には乏しい。 Further taste quality of yeast extract is centered peptides and nucleotides, which was characterized by wide relatively thick aftertaste width, poor in neat taste of first taste sensation.

【0003】酵母エキスの旨味力価を高めるため、また、いわゆる先味感を呈するアミノ酸と後味感を呈するヌクレオチド成分からなる複合調味料的特性を目指すため酵母エキスに添加物としてグルタミン酸ナトリウム等を添加(以下「外添」という。)した調味料も製造されている。 [0003] For enhancing the taste titer of yeast extract, also adding sodium glutamate and the like as an additive in a yeast extract for aiming the composite seasoning properties consisting of a nucleotide components which represent the amino acid and aftertaste sensation exhibiting a so-called first taste sensation It has also been produced (hereinafter referred to as "external addition".) the seasoning. しかし、近年の天然志向、健康志向に伴いグルタミン酸ナトリウムを添加した調味料を嫌う消費者が増加し、調味料業界も天然調味料を志向する趨勢になっている。 However, in recent years of natural-oriented, consumers dislike the seasoning was added sodium glutamate with the health-conscious increases, seasoning industry has also become a trend that oriented the natural seasonings. このような背景から、グルタミン酸ナトリウムを外添することなく旨味力価が高い酵母エキス、即ちグルタミン酸含量が高い酵母エキスが望まれていた。 Against this background, umami titer is high yeast extract without externally added sodium glutamate, i.e. glutamic acid content is high yeast extract has been desired.

【0004】原核生物、即ちコリネ型細菌や大腸菌等を用いたグルタミン酸の工業的生産方法は従来から広く知られているところである。 [0004] prokaryotes, namely industrial production methods of glutamic acid using coryneform bacteria and E. coli, such as is where is widely known from the prior art. たとえば、前記細菌のトリカルボン酸サイクルの1酵素である2−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性を低下させることにより生産培地中にグルタミン酸を多量に放出蓄積させた例が報告されている。 For example, example in which a large amount of releasing accumulated glutamic acid production medium by lowering certain 2-ketoglutarate dehydrogenase activity in 1 enzyme tricarboxylic acid cycle of the bacterium have been reported. しかし、これら細菌細胞内のグルタミン酸濃度が増加したか否かについては知られていなかった。 However, for whether glutamate concentration in these bacterial cells was increased it was not known. 更に、 In addition,
たとえ酵母細胞のKGD活性を低下させたとしても、真核生物である酵母は複雑な代謝制御系に支配されており、KGD活性の低下のみでグルタミン酸が蓄積されるとは考えられていなかった。 Even if reduced the KGD activity of the yeast cells, has not been considered as yeast is a eukaryotic are governed by complex metabolic control system, glutamate only decrease the KGD activity is accumulated.

【0005】一方、グルタミン酸のアナログに耐性を有する酵母の変異株を培養することにより、酵母細胞内に直接グルタミン酸を蓄積させることも試みられている。 On the other hand, by culturing a mutant strain of yeast resistant to analogs of glutamic acid, attempts have been made to accumulate directly glutamic acid into yeast cells.
細胞内の遊離グルタミン酸濃度が高い酵母を消化することによりグルタミン酸含量が高い酵母エキスが製造できることはEP592785に開示されているが、その酵母エキスの味のバランスや酵母臭に関する記述がないため、旨味力価の増加は想像できるもののそれ以外の効果については確認できない状況である。 Because it can be produced glutamic acid content is higher yeast extract by the free glutamic acid concentration in the cell digest high yeast are disclosed in EP592785, there is no description of balance and yeast odor taste of the yeast extract, flavor strength the increase in value is a situation that can not be sure about the effect of the others but can imagine.

【0006】 [0006]

【発明が解決しようとする課題】本発明者らは、グルタミン酸を外添することなくグルタミン酸含量が高い酵母エキスを製造する技術を確立し、その味質に及ぼす効果を確認することを目的として検討を開始した。 The present inventors have [0006], the study for the purpose of establishing a technology for manufacturing a glutamic acid content is high yeast extract without externally added glutamate, to confirm the effect on the taste It was started.

【0007】すなわち、本発明は外添でないグルタミン酸の含有量を好ましくはエキス固形分に対して約3%以上に高めたことにより、旨味力価が高く且つ単にグルタミン酸を外添した場合には得られない味の厚みをもった酵母エキスを提供する。 Namely, obtained when the present invention is that by preferably the content of glutamic not externally added was increased to more than about 3% with respect to extract solids, flavor titer was high and simply externally added to glutamic acid It is not to provide a taste yeast extract having a thickness of.

【0008】本発明はさらに、上記酵母エキスの製造方法ならびに上記酵母エキスの製造に用いる、細胞内に乾燥菌体1g当たり15mg以上の遊離グルタミンを含有する酵母を提供する。 [0008] The present invention further used for the production of preparation and the yeast extract of the yeast extract, providing a yeast containing free glutamine or more dry cells 1g per 15mg intracellularly.

【0009】本発明はさらに、上記酵母の取得方法も提供する。 [0009] The present invention further provides method of obtaining the above yeast.

【0010】 [0010]

【課題を解決するための手段】本発明者らは上記課題を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、(1)2−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ(KGD)及び/又はグルタミン酸デカルボキシラーゼ(GAD)の活性を低下させた酵母の中に、細胞内の遊離グルタミン酸及び遊離グルタミンの濃度が上昇するものが存在すること、(2)このような酵母をグルタミナーゼの存在下に消化することにより、グルタミン酸含量が高い酵母エキスが製造できること、(3)このようにして製造された酵母エキスの味は、驚くべきことに従来の酵母エキスにグルタミン酸を外添したものに比べて味の「厚み」が強いことを見出した。 The present inventors have SUMMARY OF THE INVENTION As a result of extensive studies to solve the above problems, the activity of (1) 2-ketoglutarate dehydrogenase (KGD) and / or glutamic acid decarboxylase (GAD) Some reduced yeast, that is what the concentration of free glutamic acid and free glutamic intracellular rises there, (2) by digesting such yeast in the presence of glutaminase, glutamic acid content is higher yeast the extract can be produced, (3) taste of thus produced in the yeast extract was found to glutamate in a conventional yeast extract surprisingly compared to those externally added that strong "thickness" taste . 更に、(4)KGD活性とともにグルタミンシンセターゼ(GS)活性を低下させた酵母はグルタミン酸を選択的に細胞内に蓄積するものの、それより得られた酵母エキスはグルタミン酸を外添したものと同様に「厚み」の少ないものであることを確認し、本発明に到達した。 Further, (4) Although yeast reduced the glutamine synthetase (GS) activity with KGD activity accumulates selectively within cells glutamate, it from the resulting yeast extract in a manner similar to that externally added glutamate sure they are less "thickness", we have reached the present invention.

【0011】即ち、本発明の本質は細胞内に遊離のグルタミンを蓄積する酵母から酵母エキスを製造した場合には、特異的にその味の「厚み」が増大することを見出したことにある。 [0011] That is, the essence of the present invention in the case of producing a yeast extract from the yeast that accumulates free glutamine into cells, specifically "thickness" of the flavor is in the finding that increased. 更には、細胞内に蓄積されたグルタミンをグルタミナーゼでグルタミン酸に変換することにより、旨味力価も同時に高めることが可能となることも本発明を構成するもう1つの要素である。 Furthermore, by converting the stored glutamine into cells glutamic acid glutaminase, it is another constituting component of the present invention that taste titer becomes possible to increase simultaneously. 以下本発明を詳細に説明する。 The present invention will be described in detail. 遊離グルタミンを蓄積する酵母使用する酵母としては食品として許容される酵母であればよく、サッカロミセス属、キャンディダ属、ハンゼヌラ属、ピキア属等に属する酵母が例示されこれらを元株として利用することができるが、サッカロミセス属等の1倍体胞子を形成する能力と雌雄交雑による2倍体化が可能な酵母であることが以下に述べる育種を実施する上で望ましい。 If The yeast yeast used to accumulate free glutamine yeast acceptable as food may, Saccharomyces, genus Candida, Hansenula, yeast belonging to the genus Pichia and the like may be exemplified to utilize them as the parent strain possible, it is diploid reduction capable yeast by ability and sex crossed to form a haploid spores of Saccharomyces such as is desirable in the practice of breeding as described below.

【0012】本発明の細胞内遊離グルタミン濃度が高い酵母は、グルタミン酸やグルタミンの代謝に関与する酵素系の遺伝子に変異を導入することにより育種可能である。 [0012] intracellular free glutamine concentration is high yeast of the present invention can be bred by introducing a mutation in a gene of the enzyme system involved in the metabolism of glutamate and glutamine. 変異を導入する遺伝子としては、2−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ遺伝子kgd1、グルタミン酸デカルボキシラーゼ遺伝子gad1があげられる。 Examples of the gene mutated, 2-ketoglutarate dehydrogenase gene Kgd1, glutamate decarboxylase gene gad1 the like. 但し、これらの遺伝子に対して変異を導入しても全ての酵母で細胞内遊離グルタミン量が増加するわけではなく、変異の導入により細胞内遊離グルタミン量が増加する酵母株を選択することが重要である。 However, not intracellular free glutamine amount increases in all yeast by introducing mutation to these genes, important to choose a yeast strain intracellular free glutamine amount increases by the introduction of mutation it is.

【0013】近年の遺伝子操作技術の進歩に伴い、酵母の特定の遺伝子に特定の変異を導入することは容易に実施可能であり、遺伝子破壊の技術や部位特異的突然変異の技術を用いることにより、kgd1やgad1に変異を導入し、これらの遺伝子産物の活性が低下した株や欠損した株を作製することができる。 [0013] With the recent advances in genetic engineering techniques, by introducing a specific mutation into a specific gene of the yeast is readily carried out by using the technology of the technology and site-specific mutagenesis of the gene disruption , it is possible to introduce a mutation into kgd1 or GAD1, the activity of these gene products producing strains or defective strains decreased. 特にサッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cere Especially Saccharomyces cerevisiae (Saccharomyces cere
visiae)ではゲノムの全塩基配列が公知となっており、PCRの技術を用いて容易にkgd1やgad1 Visiae) In full nucleotide sequence of the genome has been known, readily kgd1 and using PCR techniques gad1
遺伝子をクローニングすることが可能である。 It is possible to clone the gene. 目的とする遺伝子の少なくとも一部を含むDNA断片をPCRにより増幅し、これを大腸菌の宿主−ベクター系を用いてクローニングする。 A DNA fragment containing at least part of the gene of interest was amplified by PCR, which host E. coli - cloned using vector systems. クローニングされた断片の塩基配列を確認し、変異を導入したい遺伝子の断片であることを確認した後、変異の導入に使用する。 To confirm the nucleotide sequence of the cloned fragment was confirmed to be a fragment of a gene to be mutated and used for introduction of mutation. サッカロミセス・ Saccharomyces
セレビシエ以外の酵母を用いる場合でも、サッカロミセス・セレビシエのゲノムの配列を基に設計したプライマーを用いてPCRを行うことにより、目的の遺伝子を増幅することが可能な場合もある。 Even if yeast is used other than S. cerevisiae, by performing PCR using primers designed based on the sequence of the genome of Saccharomyces cerevisiae, it may be possible to amplify the gene of interest. また、PCRでのクローニングが困難である場合には、目的の遺伝子産物(酵素)を精製し、そのアミノ酸配列を調べることによりクローニング用のプライマーやプローブを設計して確度高くクローニングを行うことも可能である。 Further, when cloning in PCR is difficult to purify the desired gene product (the enzyme), can also be performed with high reliability cloning primers were designed and probes for cloning by examining the amino acid sequence it is.

【0014】クローニングしたkgd1、gad1等を含む遺伝子断片を用いてこれら遺伝子に変異を起こす方法として、遺伝子破壊によるものが便利である。 [0014] As a method of causing mutations in these genes with a gene fragment containing the cloned Kgd1, GAD1 like, it is convenient by gene disruption. 即ち、 In other words,
目的とする遺伝子のコーディング領域の一部であり、かつ蛋白質のN−末端およびC−末端に相当する部分を含まないDNA断片を制限酵素等を用いて切り出し、これを酵母用のyIp型ベクターに接続する。 A part of the coding region of the gene of interest, and cut out a DNA fragment which does not include a portion corresponding to the N- and C- termini of the protein using restriction enzymes or the like, this in yIp type vector for yeast Connecting. これを用いて酵母の形質転換を行い、遺伝子破壊株を選択する。 And the cells of the yeast and used to select a gene-disrupted strain. 酵母の形質転換用ベクターとしては、抗生物質等の薬剤耐性遺伝子をマーカーに利用したものが形質転換株を選択する上で有利である。 The transformation vector of yeast, which utilizes a drug resistance genes such as antibiotic markers is advantageous in selecting the transformants.

【0015】遺伝子破壊以外の方法として、部位特異的突然変異(Nucleic Acids Res. 10,6487-6500 (1982)) [0015] As an alternative gene disruption, site-specific mutagenesis (Nucleic Acids Res. 10,6487-6500 (1982))
も利用することができる。 It can also be utilized. 公知の定法を用いて、クローニングしたDNA断片のコーディング領域に欠失、挿入、置換等の変異を導入する。 Using a known conventional method, deletion in the coding region of the cloned DNA fragments, insertion, introducing a mutation of substitution, and the like. この場合は、変異が導入された株を効率よく検出するためには、薬剤耐性マーカーを有するyEp型やyRp型のプラスミドとの同時形質転換を行い、薬剤耐性を示すコロニーから選択することにより、目的の変異が導入された株を高頻度に選択することが可能になる。 In this case, in order to detect better strain mutation is efficiently performs cotransformation with yEp type or yRp type plasmid with a drug resistance marker, by selecting from the colonies resistant to the drug, it is possible to select a strain which desired mutation has been introduced with high frequency.

【0016】こうして変異を導入したDNAを酵母のゲノムへ導入する工程にも形質転換法が利用できる。 [0016] Thus, the mutations were introduced DNA can also use the transformation method in the step of introducing into the genome of yeast. すなわち変異が導入されたDNA断片を用いて酵母の形質転換を行い、変異DNAがゲノムDNAと置換された酵母を選択する。 That using a DNA fragment mutation is performed transformation of yeast, for selecting a mutant DNA is replaced with the genomic DNA yeast. 形質転換には公知の定法、即ちプロトプラスト法、アルカリ・カチオン法やエレクトロポレーション法が利用できる。 Known conventional method for transformation, namely the protoplast method, alkali cation method or electroporation method can be used. 目的の変異がゲノム中に導入されたかどうかは、PCRによる確認も可能であるし、遺伝子産物である酵素の活性を定法(α-ketoglutarate dehyd Whether desired mutation has been introduced into the genome, to confirm by PCR is possible, a standard method the activity of the enzyme is a gene product (α-ketoglutarate dehyd
rogenase:J. Biol. Chem 249,3660-3670(1969), Advanc rogenase:.. J Biol Chem 249,3660-3670 (1969), Advanc
e in Biophysics(Kotani,M.,ed) Vol 9,pp.187-227,Uni e in Biophysics (Kotani, M., ed) Vol 9, pp.187-227, Uni
v. of Tokyo press, Glutamate decarboxylase: Meth.B . V of Tokyo press, Glutamate decarboxylase: Meth.B
iochem.Anal. 4,285-306 (1957), Biochem.Biophys.Re iochem.Anal. 4,285-306 (1957), Biochem.Biophys.Re
s. Commun. 28,525-530(1967), Biochemistry 9,226-23 s. Commun. 28,525-530 (1967), Biochemistry 9,226-23
3(1970), Glutamine synthetase:Anal.Biochem., 95, 2 3 (1970), Glutamine synthetase:. Anal.Biochem, 95, 2
75-285 (1979))に従い測定することでも確認できる。 Also it can be confirmed by measuring in accordance with 75-285 (1979)).

【0017】先にも述べたように、酵母の中にはKGD [0017] As mentioned earlier, KGD Some of the yeast
やGADの活性を低下させることによりグルタミンやグルタミン酸を細胞内に高濃度に蓄積するものとしないものとが存在するが、一方、遺伝子工学の技術、即ち遺伝子破壊や部位特異的突然変異を用いることにより、これらの差を容易に判別できることが可能となり、選別された優秀な株を育種の元株として利用することにより、確度高く本発明の酵母が育種可能となることを意味する。 Glutamine and glutamic acid by decreasing the activity of or GAD are present and what does and does not accumulate in high concentrations in the cell, while, genetic engineering techniques, i.e. the use of a gene disruption or site-specific mutagenesis makes it possible to these differences can be easily determined, by utilizing the sorted excellent strain as original strain breeding, with high reliability yeast of the present invention is meant to be a possible breeding.
具体的には、遺伝子破壊や部位特異的突然変異を用いてこれらの変異(遺伝子破壊)を導入後、該酵母を培養し、公知の方法を用いて細胞内の遊離グルタミン及び遊離グルタミン酸濃度を測定することにより、本発明に利用可能な酵母を選択することができる。 Specifically, after the introduction of these mutations (gene disruption) using gene disruption or site-specific mutagenesis, by culturing the yeast, measuring free glutamine and free glutamic acid concentration in the cells using methods known by can select yeast usable in the present invention. 変異株(遺伝子破壊株)選択の基準は、細胞内に多くのグルタミン酸やグルタミンを蓄積していることである。 Criteria mutant (gene-disrupted strain) option is to have accumulated a number of glutamate and glutamine in the cell. そのような酵母をグルタミナーゼ存在下に消化することでグルタミン酸含量が高く、かつ味に厚みのある酵母エキスが製造できる。 Glutamic acid content is higher by digesting such yeast in the presence of glutaminase, and can be produced yeast extract thick taste.

【0018】細胞内グルタミン及びグルタミン酸濃度は以下のようにして測定する。 [0018] Intracellular glutamine and glutamic acid concentration is measured as follows. 酵母の培養液より遠心分離により酵母菌体を集め、適宜水洗を行った後に凍結乾燥を行う。 It collected yeast cells by centrifugation from the culture medium of the yeast, lyophilization after the appropriate washing. 凍結乾燥した酵母菌体(重量既知)を水に懸濁後、ガラスビーズで破砕し、さらにその遠心上清に対して熱水抽出を行う。 After suspending lyophilized yeast cells (weight known) in water, and crushed with glass beads, performing hot water extraction on further its supernatant. これをそのまま、及びグルタミナーゼ反応を行ったものの双方につき、アミノ酸分析等の既知の方法でグルタミン酸濃度を測定し、グルタミナーゼ反応の前後におけるグルタミン酸濃度を比較することにより細胞内遊離グルタミン酸と遊離グルタミンの濃度が算出される。 Which is directly and per both those conducted glutaminase reaction, glutamate concentrations were determined by known methods of amino acid analysis, etc., the concentration of intracellular free glutamic acid and free glutamic By comparing glutamate concentration before and after the glutaminase reaction It is calculated. また、アミノ酸分析装置の条件を変更することにより、グルタミナーゼ反応前の抽出液におけるグルタミンとグルタミン酸とをそれぞれ同時に定量することも可能である。 Further, by changing the conditions of the amino acid analyzer, it is also possible to simultaneously quantify the glutamine and glutamic acid in the extraction liquid before the glutaminase reaction, respectively.

【0019】酵母にkgd1またはgad1変異を単独で導入した場合には、酵母の乾燥重量1g当たり16〜 [0019] When introducing kgd1 or gad1 mutation alone yeast, 16 per dry weight 1g of yeast
22mgの遊離グルタミンと21〜30mgの遊離グルタミン酸が蓄積され、この酵母を消化することで固形分当たり12〜15%のグルタミン酸を含む酵母エキスが製造できる。 Free glutamic acid free glutamine and 21~30mg of 22mg is accumulated, it can be prepared yeast extract containing glutamic acid 12 to 15% per solids by digesting the yeast. このようにして得られた酵母エキスの呈味の特徴は、単にグルタミン酸を所要量外添して製造されたものに比して旨味の感応時間が長く、かつこく味、塩なれ効果等が付随しており、更に味に厚みが加わって全体的に調和のとれたものである。 Thus features of the taste of the yeast extract thus obtained is simply longer sensitive time flavor compared to those produced by required amount externally added glutamate, and body taste, saltiness effect or the like attendant and it is one in which further balanced overall harmony subjected to any thickness taste. この呈味の特徴は酵母エキス中のグルタミン酸において、少なくとも3%以上が細胞内遊離グルタミン由来であることに一応の臨界的意義があると推察される。 In glutamate of this aspect of taste is in the yeast extract, it is presumed that at least 3% or more is critical significance of tentatively to be derived from intracellular free glutamine. そしてこの3%以上の遊離グルタミンを乾燥酵母1g中の量に換算すると少なくとも15mgになる。 When the converting the free glutamine of more than 3% of the amount of dry yeast 1g is at least 15 mg.

【0020】細胞内にグルタミンが蓄積する酵母を消化することにより味に厚みのある酵母エキスができる理由は明らかではないが、グルタミンの蓄積により細胞内窒素代謝のバランス、即ちアミノ酸と有機酸とのバランスが変化し、その結果厚みのある酵母エキスができるものと推察される。 [0020] Although no reason is obvious that it is a yeast extract with a thick taste by glutamine in the cell digest yeast to accumulate, the accumulation of glutamine intracellular nitrogen metabolic balance, i.e. the amino acid and organic acid balance change is assumed that it is a yeast extract with a resulting thickness. また酵母を消化する際にグルタミナーゼ反応の工程を追加することで遊離のグルタミンを効率よくグルタミン酸に変換することができ、旨味力価の点でも優れた酵母エキスが製造できる。 Also it is possible to convert the free glutamine by adding a step of glutaminase reaction when digesting yeast efficiently glutamic acid, also excellent yeast extract in terms of taste titer can be produced. 旨味力価の高い酵母エキスを製造するためには、細胞内の遊離グルタミンと遊離グルタミン酸との濃度の合計が30mg/g乾燥菌体以上となることが望ましい。 To produce a high flavor titers yeast extract, it is desirable that the total concentration of free glutamine and free glutamic acid in the cell is 30 mg / g dry cells or more.

【0021】本発明において、KGDおよびGADの活性を低下させることにより細胞内グルタミンが増加する酵母の具体例として、サッカロミセス・セレビシエIF [0021] In the present invention, specific examples of yeast intracellular glutamine is increased by reducing the activity of KGD and GAD, Saccharomyces cerevisiae IF
O10150があげられる。 O10150 and the like. この株は実験室酵母として財団法人発酵研究所より誰でも購入可能である。 This strain can be purchased by anyone from the Institute for Fermentation as laboratory yeast. サッカロミセス・セレビシエIFO10150に対し、kgd For Saccharomyces cerevisiae IFO10150, kgd
1遺伝子破壊を実施することにより、この株は細胞内に16mg/g乾燥菌体以上と、元株の約2.5倍の遊離グルタミンを蓄積する。 By performing the 1 gene disruption, this strain accumulates a 16 mg / g dry cells or in cells, about 2.5 times the free glutamine parent strain. またこの株に対してgad1遺伝子破壊を行うと、細胞内遊離グルタミン含量は21m The Doing gad1 gene disruption with respect to this strain, intracellular free glutamine content 21m
g/g乾燥菌体となる。 The g / g dry cells. さらにkgd1とgad1の両者を破壊した場合には24mg/g乾燥菌体の遊離グルタミンを蓄積できる。 When further destroy both kgd1 and gad1 can accumulate free glutamine 24 mg / g dry cells.

【0022】一方、同じサッカロミセス・セレビシエでもYPH499、YPH500、YPH501株(何れもストラタジーン(Stratagene)社より購入可能)に対しkgd1破壊を行っても、細胞内遊離グルタミン量は4.0〜4.8mg/g乾燥菌体程度と、元株と比べてほとんど増加しない。 On the other hand, YPH499, YPH500, YPH501 strain (all available from Stratagene (Stratagene) Co.) to be subjected to destruction Kgd1, intracellular free glutamine amount in the same Saccharomyces cerevisiae 4.0 to 4. and 8 mg / g dry cells about, hardly increases as compared with the parent strain. これらの株に対してg g against these strains
ad1遺伝子破壊を行うと、細胞内遊離グルタミンは僅かに増加し6.0〜6.4mg/g乾燥菌体となるが、 Doing ad1 gene disruption, but the intracellular free glutamine increased slightly 6.0~6.4mg / g dry cells,
kgd1とgad1の双方を破壊してもgad1破壊株と比べてグルタミン量は増加しない。 Glutamine amount compared also gad1 disrupted strain to destroy both of kgd1 and gad1 does not increase.

【0023】実用酵母においても同様に遺伝子破壊によるグルタミン蓄積量が変化する株と変化しない株に選別することができる。 [0023] Also in the industrial yeast it can be selected in strains that do not change the strain which varies glutamine accumulated amount due Similarly gene disruption. 通常実用酵母は2倍体の形で存在するが、これより胞子を形成させ、1倍体の形で遺伝子破壊による評価を行う。 Usually industrial yeast in the form of a diploid, which than form a spore, performs evaluation by gene disruption in the form of a haploid. 胞子形成により得られる1倍体酵母の中で、遺伝子破壊により細胞内遊離グルタミン量が増加する株を選別することができる。 Among the haploid yeast obtained by sporulation can be screened strains intracellular free glutamine amount increases by gene disruption. 選択された1倍体酵母に対し、部位特異的突然変異(Nucleic Acids Res. To haploid yeast selected, site-directed mutagenesis (Nucleic Acids Res.
10, 6487-6500 (1982))や、通常の変異誘発剤を用いた突然変異の誘発を実施し、KGDやGADの活性が低下した株を選択することにより、本発明の酵母が育種できる。 10, 6487-6500 (1982)) and typically mutagenic agent carried mutations induced using, by selecting a strain in which the activity of KGD or GAD is lowered, the yeast of the present invention can be bred. 一般に1倍体酵母は2倍体酵母に比べて生育速度が遅い場合が多いことから、育種された1倍体酵母を元に2倍体酵母を作製することも交雑や細胞融合の技術を用いれば可能である。 Generally since the haploid yeast is often the growth rate is slower than the diploid yeast, also using techniques crosses or cell fusion to produce a diploid yeast based on haploid yeast bred it is possible to be.

【0024】また、遺伝子破壊や部位特異的突然変異を導入した酵母をそのまま酵母エキスの製造に利用することは可能であるが、組換えDNA技術を用いて作製した酵母を食品原料として利用するためのガイドラインはまだ制定されていない。 Further, it is possible to use a yeast introduced with the gene disruption or site-specific mutagenesis as in the production of yeast extract, in order to use the yeast produced using recombinant DNA technology as a food ingredient the guidelines have not yet been enacted. そこで、組換えDNA技術を利用することなく上記のような酵母を育種することが実質的には重要になってくる。 Therefore, to breed yeast as described above without the use of recombinant DNA technology are essentially becomes important. 遺伝子破壊などの操作により選択された元株、即ち部位特異的突然変異や遺伝子破壊により選択された元株、即ち細胞内グルタミン量を増加させる能力のある株を元株とし、これらに紫外線照射や変異誘導物質による突然変異を施し、KGDやGAD活性の低下した株を選択することで食品衛生上問題のない酵母を育種することができる。 Parent strain selected by the operation such as gene disruption, i.e. site-directed mutagenesis or gene disruption by the selected parent strain, i.e. the strain capable of increasing intracellular glutamine weight and parent strain, Ya these to ultraviolet radiation subjected to mutation by mutagenic substances, it is possible to breed yeast with no food hygiene problem by selecting a reduced strain of KGD and GAD activity. 幸いにも、kgd1破壊株はエタノール、グリセリンまたはピルビン酸等を単一炭素源として生育できない表現型を有する場合が多く、これを指標として目的の変異株を選択することも可能である。 Fortunately, the kgd1 disrupted strain ethanol, often have a phenotype that can not grow glycerin or pyruvate as the sole carbon source, it is possible to select a mutant strain of interest to this as an index. また、直接細胞内グルタミン濃度を測定することによっても目的の変異株が選択できる。 Further, mutant strains of interest can be selected by measuring the direct intracellular glutamine concentration. 選択された変異株は、そのままでは生育速度や収率が悪い場合が多いため、交雑や細胞融合を繰り返すことにより生育速度や収率がよく、かつ細胞内グルタミン濃度が高い株を育種することができる。 The selected mutants, since it is has often poor growth rate or yield, that is the growth rate and yield by repeated crossing and cell fusion well, and breeding lines high intracellular glutamine concentration it can. 酵母エキスの調製酵母の培養方法は既知の方法と何ら変わりはない。 Culture method of preparing yeast of yeast extract is no different known methods. 蔗糖やグルコース、液糖、廃糖蜜等を炭素源として、アンモニアや尿素を窒素源として含む培地で該酵母を培養する。 Sucrose and glucose, liquid sugar, molasses and the like as a carbon source, culturing the yeast in a medium containing ammonia or urea as a nitrogen source. 酵母によるアルコール発酵を抑えるため、酸素の供給は充分に行う必要があるが、酸素が過剰に供給されるとグルタミン酸やグルタミンの蓄積が低下する場合もあるため、あらかじめ酵母株毎に最適の酸素供給量を求めておくと良い。 To suppress the alcoholic fermentation by yeast, the supply of oxygen must be sufficiently performed, since oxygen is excessive accumulation of the supplied when glutamate or glutamine sometimes lowered, optimum oxygen supply in advance for each yeast strain good idea to determine the amount. 培養終了後、遠心分離や濾過により酵母菌体を集める。 After completion of the culture, collecting the yeast cells by centrifugation or filtration.

【0025】集めた酵母菌体より酵母エキスを得る場合も公知の方法が利用可能である。 The collected known method may obtain a yeast extract from yeast cells are available. 典型的な例を示せば、 If Shimese a typical example,
酵母に水を添加し、酵母の細胞壁を溶解することにより内部に含まれる成分を抽出する。 Water was added to the yeast, to extract the components included in the internal by dissolving the cell wall of yeast. その後、酵母の有する酵素および/または外部から添加した酵素により酵素分解する。 Thereafter, enzyme decomposed by enzymes added from the enzyme and / or external with the yeast.

【0026】酵母の有する酵素で自己消化するには、4 [0026] In order to self-digestion with the enzyme having the yeast, 4
0〜55℃で6〜72時間反応すればよい。 0-55 may be reacted 6-72 hours at ° C.. 酵素を添加して消化する場合は、タンパク質の分解にはプロテアーゼ、細胞壁の溶解には細胞壁溶解酵素、グルタミンのグルタミン酸への変換にはグルタミナーゼ、呈味性核酸の生成にはデアミナーゼおよびヌクレアーゼ等を必要に応じて添加する。 When digestion by adding enzymes for the degradation of proteins have protease, cell wall lysis enzymes to lysis of the cell walls, glutaminase the conversion to glutamine glutamate, deaminase and nucleases such as the generation of taste nucleic acid added according to. 酵素を添加する際は、原料酵母由来の酵素が存在していてもよいし、失活していてもよい。 When adding enzymes to enzymes derived from the raw material yeast may also be present, it may be deactivated.

【0027】酵素を添加する順序は、先ず細胞壁溶解酵素を添加し、次いで必要に応じてプロテアーゼを添加して反応させる。 The order of addition of the enzyme is first added cell wall lysis enzymes, followed by addition reaction of a protease as needed. その後、さらにグルタミナーゼを添加して反応させてもよい。 It may then be further reacted by addition of glutaminase. グルタミナーゼとの反応は、グルタミン酸の量を高めて酵母エキスの呈味力価を高めるため本発明の好ましい態様である。 Reaction with glutaminase is a preferred embodiment of the present invention to enhance the taste titer of yeast extract to enhance the amount of glutamic acid. さらに、得られた酵母エキスの核酸成分による旨味を向上させるため、酵母の核酸をエキス中に抽出することも好ましい。 Further, to improve the flavor by nucleic acid component of the obtained yeast extract, it is also preferable to extract nucleic acids of yeast during extract. その場合は、反応物をpH8.5付近で約65℃、2時間程加熱することにより酵母中の核酸を十分に効率良くエキス中に抽出することができる。 In that case, it is possible to extract the reaction product of about 65 ° C. at around pH 8.5, a sufficiently efficient in extract nucleic acids in yeast by heating about 2 hours. こうして得られた酵母エキスは、さらに例えば約90℃、30分程度の加熱により菌体内の酵素および添加した各種酵素を失活させることが好ましい。 The thus obtained yeast extract is further for example about 90 ° C., it is preferred to inactivate the enzyme and the added various enzymes in the cells by heating for about 30 minutes.

【0028】上記の各種酵素は、市販されている酵素をそのまま使用することができる。 [0028] The various enzymes can be used as it is an enzyme that is commercially available. 例えば、プロテアーゼとしてはプロテアーゼA「アマノ」(天野製薬)、プロテアーゼN「アマノ」(天野製薬)等が、細胞壁溶解酵素としては、YL−15(天野製薬)、キタラーゼM For example, Protease A "Amano" Protease (Amano Seiyaku), Protease N "Amano" (Amano Pharmaceutical), and examples of the cell wall lytic enzyme, YL-15 (Amano Pharmaceutical), Kitaraze M
(クミアイ化成)等が、グルタミナーゼとしてはグルタミナーゼダイワC100(大和化成)、グルタミナーゼF「アマノ」(天野製薬)等が、デアミナーゼとしてはデアミザイム(天野製薬)、ヌクレアーゼとしてはヌクレアーゼ「アマノ」(天野製薬)が挙げられる。 (Kumiai Chemical Industry Co., Ltd.) and the like, transglutaminase Daiwa C100 as the glutaminase (Yamato Kasei), glutaminase F "Amano" (Amano Pharmaceutical Co., Ltd.) and the like, as the deaminase Deamizaimu (Amano Pharmaceutical Co., Ltd.), as the nuclease nuclease "Amano" (Amano Pharmaceutical Co.) and the like. これらの酵素は通常、原料に対して0.01%〜5%(好ましくは0.1〜2%)が添加される。 These enzymes generally 0.01% to 5% relative to the raw material (preferably 0.1-2%) is added. プロテアーゼの反応はpH4〜7(好ましくは5〜6)、温度40〜60℃ The reaction of the protease is pH 4-7 (preferably 5-6), the temperature 40 to 60 ° C.
(好ましくは40〜55℃)で行い、反応時間は1〜7 (Preferably 40 to 55 ° C.) carried by, the reaction time is 1-7
2時間(好ましくは16〜24時間)が適当である。 2 hours (preferably 16-24 hours) are suitable. その他の各酵素反応の温度は各酵素の至適温度、至適pH Other temperatures of the enzymatic reaction is optimum temperature for each enzyme, optimum pH
域であれば問題ない。 If the frequency is no problem. 各反応時間はそれぞれ0.5〜8 Each reaction time is 0.5 to 8
時間(好ましくは1〜4時間)が適当である。 Time (preferably 1-4 hours) are suitable.

【0029】これらにより、本発明の酵母を消化して得られたエキスの乾燥固形分中のグルタミン酸量は12% [0029] These, the glutamic acid content in the dry solids of the extract obtained by digesting the yeast of the present invention 12%
以上となる。 Greater than or equal to. 酵素反応後は酵素を熱失活し、遠心分離もしくはフィルタープレス等で菌体残渣を除き上清を得る。 After the enzyme reaction was heat inactivated enzyme, to obtain the supernatant except for cell residues by centrifugation or filter press and the like. 目的に応じて上清はUFやMF等で膜濾過し、澄明化を行うとよい。 Supernatant according to the purpose is membrane filtration in UF and MF, etc., may perform clarification. 得られた液を目的の固形分量まで濃縮する。 The resulting solution is concentrated to a solid content of interest. 濃縮以外に粉末化をおこなってもよい。 It may be performed powdered besides concentrated. 粉末化はスプレードライや凍結乾燥などを適宜選択するとよい。 Powdering may be selected as appropriate spray drying or freeze drying.
粉末化の際に助剤を用いてもよい。 It may be used aids in powdered. このようにして製造された酵母エキスはグルタミン酸の旨味が強く酵母エキスの複雑な呈味と相俟って良好な呈味を示すとともに、 Together exhibit good taste I Thus yeast extract produced by the complex taste coupled with a strong yeast extract taste of glutamic acid,
グルタミン酸を外添した場合には見られない厚みがあり、調味料として非常に好ましい呈味を示す。 Is thick not seen when externally added glutamate, they show very favorable taste as a seasoning.

【0030】以下実施例により本発明の詳細を説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。 The present invention will be explained in more detail by the following Examples, but the present invention is not limited thereto.

【0031】 [0031]

【実施例】遺伝子破壊株の作製と確認は以下に示す方法を用いた。 Preparation and verification of EXAMPLES Gene disruption strain using the methods described below. (1)2−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ遺伝子(k (1) 2-ketoglutarate dehydrogenase gene (k
gd1)のクローニングと遺伝子破壊 サッカロミセス・セレビシエIFO10150より、ニッポンジーン社製ゲノム抽出キット(ISOPLAN gd1) Cloning and from gene disruption Saccharomyces cerevisiae IFO10150, manufactured by Nippon Gene Co., Ltd. genome extraction kit (ISOPLAN
T)を用いてゲノムDNAを抽出した。 T) Genomic DNA was extracted using a. ゲノムDNA約100ngに、配列表の配列番号1に示したプライマーDNA約1μgと配列表の配列番号2に示したプライマーDNA約1μgを加えた。 Genomic DNA of about 100 ng, was added a primer DNA of about 1μg shown in SEQ ID NO: 2 and a primer DNA of about 1μg shown in SEQ ID NO: 1. これを液量50μlで宝酒造社製LA−Taqを用いてPCRを行った。 This was subjected to PCR using TaKaRa LA-Taq in the liquid volume 50 [mu] l. PCRの条件は、95℃0.5分、55℃1分、72℃1.5分の25サイクルとした。 PCR conditions, 95 ° C. 0.5 min, 55 ° C. 1 min, and a 72 ° C. 1.5 min 25 cycles. 約1.3kbの断片の増幅を確認し、これをQIAGEN社製DNA精製キットで精製した。 To confirm amplification of the fragment of about 1.3 kb, which was purified by QIAGEN Inc. DNA purification kit. PCR産物を制限酵素SacIで消化し、pKF The PCR product was digested with restriction enzymes SacI, pKF
18のSacI切断点に組み込み、エシェリシア・コリ(Escherichia coli)JM109株(宝酒造社より購入)にエレクトロポレーション法により導入した。 18 built-in SacI cutting point of, was introduced by electroporation method into Escherichia coli (Escherichia coli) JM109 strain (Takara Shuzo Co., purchased from). 組み換えプラスミドを調整後、挿入断片のDNA配列を確認した結果、挿入断片は配列表の配列番号3に示すDNA配列を有することを確認した。 After adjusting the recombinant plasmid, the results confirming the DNA sequence of the insert, the insert was confirmed to have a DNA sequence shown in SEQ ID NO: 3. 挿入断片はサッカロミセス・セレビシエのkgd1遺伝子のコーディング領域(1015アミノ酸残基をコードしている)の中で80番目から497番目のアミノ酸残基に相当する部分であった。 Insert was a portion corresponding to 497 amino acid residues from the 80th in the coding region of kgd1 gene Saccharomyces cerevisiae (coding for 1015 amino acid residues).

【0032】この挿入断片を再度SacIで切り出し、 [0032] cut out with SacI this insert again,
yIp型のシャトルベクターであるpAUR101(宝酒造)のSacI切断点に組込んだ組換えプラスミドp yIp type is a shuttle vector pAUR101 (Takara Shuzo) recombinant plasmid p incorporated into the SacI cutting point of the
AUR101−KGD1を作製した。 The AUR101-KGD1 was prepared. このプラスミドには挿入断片中に制限酵素NruI切断点が存在するため、この制限酵素で切断したプラスミドを用いてエレクトロポレーション法により酵母の形質転換を実施した。 Therefore the plasmid present restriction enzyme NruI cleavage point in the insert, was performed transformation of yeast by electroporation method using the cut plasmid for this restriction enzyme.
YPD寒天培地(10g/L酵母エキス,20g/Lペプトン,20g/Lグルコース,20g/L寒天)上で0.5μg/mlのオーレオバシジンに耐性を示す形質転換株につき、Shiio, I. and Ujigawa-Takeda, K., Ag YPD agar medium (10 g / L yeast extract, 20 g / L peptone, 20 g / L glucose, 20 g / L agar) per transformant resistant to aureobasidin of 0.5 [mu] g / ml on, Shiio, I. and Ujigawa-Takeda, K., Ag
ric.Biol.Chem., 44, 1897-1904 (1980)に記載された方法で2−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性を測定した。 ric.Biol.Chem., 44, to measure the 2-ketoglutarate dehydrogenase activity by the method described in 1897-1904 (1980).

【0033】(2)グルタミン酸デカルボキシラーゼ遺伝子(gad1)のクローニングと遺伝子破壊 PCRのプライマーとして配列表の配列番号4および5 [0033] (2) glutamate decarboxylase gene (GAD1) ​​SEQ ID NO: 4 and 5 of the Sequence Listing as primers for cloning the gene disruption PCR of
のDNAを用いた。 Using the DNA. 酵母のゲノムDNAを鋳型とし、上記と同じ条件でPCRを行い、約1.0kbの断片の増幅を確認した。 Genomic DNA of yeast as a template, PCR was carried out under the same conditions as above, to confirm the amplification of the fragment of about 1.0 kb. 増幅されたDNAを精製した後、制限酵素SacIで消化し、pKF18のSacI切断点に挿入した。 The amplified DNA was purified, digested with the restriction enzymes SacI, and inserted into the SacI cutting point of PKF18. 挿入断片のDNA配列を配列表の配列番号6に示した。 It shows the DNA sequence of the insert in SEQ ID NO: 6 of the Sequence Listing. この断片は、サッカロミセス・セレビシエのg This fragment, of Saccharomyces cerevisiae g
ad1遺伝子のコーディング領域(586アミノ酸残基をコードしている)の中で141番目から461番目までのアミノ酸残基に相当する部分であった。 ad1 gene was a part corresponding to amino acid residues from 141 th to 461 th in the coding region of (encoding 586 amino acid residues).

【0034】この挿入断片を酵母のyIp型ベクターであるpI−RED1(東洋紡績)に組み込み、pI−R [0034] Embedded in the pI-RED1 this insert is yIp type yeast vectors (Toyobo), pI-R
ED1−GAD1を得た。 It was obtained ED1-GAD1. このプラスミドが挿入断片上に唯一有する制限酵素切断点NruIでプラスミドDN Plasmid DN restriction enzyme cleavage point NruI this plasmid has only on insert
Aを消化し、これを用いてエレクトロポレーション法により酵母の形質転換を行った。 Was digested A, it was transformed yeast by electroporation method using the same. YPD寒天培地上で10 On YPD agar medium 10
0μg/mlのシクロヘキシミドに耐性を示す形質転換株につき、Okada, Y.and Shimada, C., Brain. Res., 9 0 Pg / ml of per transformants showing resistance to cycloheximide, Okada, Y.and Shimada, C., Brain. Res., 9
8, 202-206 (1975)に記載された方法を用いてグルタミン酸デカルボキシラーゼ活性を測定した。 8 were measured glutamate decarboxylase activity using the method described in 202-206 (1975). ただし、この活性測定の際に行うγ‐アミノ酪酸量の測定は島津製作所製アミノ酸分析装置ALC−1000を用いて定量した。 However, measurement of γ- aminobutyric acid amount performed when the activity measurement was quantified using a Shimadzu amino acid analyzer ALC-1000.

【0035】(3)グルタミンシンセターゼ遺伝子(g [0035] (3) glutamine synthetase gene (g
ln1)のクローニングと遺伝子破壊 PCRのプライマーとして配列表の配列番号7および8 SEQ ID NO: of the Sequence Listing as primers for cloning the gene disruption PCR of ln1) 7 and 8
のDNAを用いた。 Using the DNA. 酵母のゲノムDNAを鋳型とし、上記と同じ条件でPCRを行い、約0.4kbの断片の増幅を確認した。 Genomic DNA of yeast as a template, PCR was carried out under the same conditions as above, to confirm the amplification of the fragment of about 0.4 kb. 増幅されたDNAを精製した後、制限酵素SacIで消化し、pKF18のSacI切断点に挿入した。 The amplified DNA was purified, digested with the restriction enzymes SacI, and inserted into the SacI cutting point of PKF18. 挿入断片のDNA配列を配列表の配列番号9に示した。 It shows the DNA sequence of the insert in SEQ ID NO: 9. この断片は、サッカロミセス・セレビシエのg This fragment, of Saccharomyces cerevisiae g
ln1遺伝子のコーディング領域(351アミノ酸残基をコードしている)の中で92番目から232番目までのアミノ酸残基に相当する部分であった。 ln1 gene was a part corresponding to amino acid residues from 92 th to 232 th in the coding region of (encoding 351 amino acid residues).

【0036】この挿入断片を酵母のyIp型ベクターであるpI−RED1に組み込み、pI−RED1−GL The incorporation of this insert into pI-RED1 is yIp type yeast vectors, pI-RED1-GL
N1を得た。 To give the N1. このプラスミドが挿入断片上に唯一有する制限酵素切断点Eco0109IでプラスミドDNAを消化し、これを用いてエレクトロポレーション法により酵母の形質転換を行った。 This plasmid was digested plasmid DNA with the restriction enzyme cleavage points Eco0109I having only on insert, was transformed yeast by electroporation method using the same. YPD寒天培地上で100μ 100μ on YPD agar medium
g/mlのシクロヘキシミドに耐性を示す形質転換株につき、Stadtman, ER et al, Anal. Biochem., 95, 2 Resistant to g / ml of cycloheximide per transformant, Stadtman, ER et al, Anal. Biochem., 95, 2
75-285 (1979)に記載された方法を用いてグルタミンシンセターゼ活性を測定した。 It was measured glutamine synthetase activity using the method described in 75-285 (1979).

【0037】(4)細胞内遊離グルタミン及び遊離グルタミン酸濃度の測定 合成培地(6.7g/LYeast Nitrogen [0037] (4) intracellular free glutamine and measurement of synthetic medium free glutamic acid concentration (6.7g / LYeast Nitrogen
Base(Difco社製),20g/Lグルコース,必要に応じて0.5μg/mlのオーレオバシジンまたは100μg/mlのシクロヘキシミドを添加した)50mlを含む500ml容バッフル付きフラスコで、30℃、120rpmのロータリーシェーカーにより18時間の振盪培養を行った。 Base (Difco Co.), 20 g / L glucose, in 500ml-volume baffled flask containing supplemented with 0.5 [mu] g / ml of aureobasidin or 100 [mu] g / ml of cycloheximide optionally) 50 ml, 30 ° C., of 120rpm and shaking culture was performed for 18 hours by a rotary shaker. 酵母菌体を1500× 1500 × yeast cells
gで4℃、5分の遠心分離により集菌し、2回水洗を行った後、洗浄菌体を回収した。 g at ​​4 ° C., the cells were collected by centrifugation for 5 minutes, after washed with water twice, and recovered washed cells. これを凍結乾燥して乾燥菌体重量を測定した。 This was measured dry cell weight and lyophilized. 乾燥菌体約30mgを1.5ml The dried cells about 30mg 1.5ml
容エッペンドルフチューブに入れ、これに450μlの蒸留水と480mgのガラスビーズ(BRAUN社製、 Placed in Eppendorf tube, to which glass beads of distilled water and 480mg of 450 [mu] l (BRAUN Corp.,
0.45−0.50mm)を加え、トミー社製マイクロチューブミキサーを用いて最大回転数にて2分間攪拌した。 0.45-0.50Mm) and the mixture was stirred for 2 minutes at maximum rpm using a TOMY Co. micro tube mixer. これを氷上で2分間冷却した。 This was cooled on ice for 2 minutes. この操作を4回繰り返すことにより、酵母細胞を破砕した。 By repeating this operation 4 times, to disrupt the yeast cells. 遠心分離(10 Centrifugation (10
000×g、4℃、5分)により上清を回収し、これを95℃で15分間加熱して蛋白を沈殿させた。 000 × g, 4 ° C., the supernatant was collected by 5 minutes), which was precipitated protein was heated for 15 minutes at 95 ° C.. 反応物の一部を取り、残りに10mg/mlのグルタミナーゼ A portion of the reaction product remaining in the 10mg / ml glutaminase
ダイワC−100の溶液を等量添加し、37℃で20分反応させた。 Was added in equal amounts of a solution of Daiwa C-100, it was reacted for 20 minutes at 37 ° C.. 遠心分離(10000×g、4℃、5分) Centrifuged (10000 × g, 4 ℃, 5 minutes)
により沈殿物を除去した。 The precipitate was removed by. グルタミナーゼ反応前後のサンプルにつき島津製作所製アミノ酸分析装置ALC−1 Manufactured by Shimadzu Corporation amino acid per sample before and after the glutaminase reaction analyzer ALC-1
000を用いてアミノ酸分析を行い、両者の差からグルタミンの量を求めた。 Perform amino acid analysis using a 000 to determine the amount of glutamine from the difference therebetween. 分析されたグルタミン及びグルタミン酸の量と、用いた酵母乾燥菌体重量から細胞内遊離グルタミンと遊離グルタミン酸量を求めた。 The amount of the analyzed glutamine and glutamic acid, from yeast cell dry weight using seeking a free glutamic acid content intracellular free glutamine.

【0038】(5)酵母の培養 酵母をYPD平板培地で一昼夜培養後、一白金耳を合成培地(6.7g/LYeast Nitrogen Ba [0038] (5) After overnight incubation the culture yeast of the yeast in YPD plate medium, synthesize loopful medium (6.7g / LYeast Nitrogen Ba
se(Difco社製),20g/Lグルコース,必要に応じて0.5μg/mlのオーレオバシジンまたは1 se (Difco Co.), 20 g / L glucose, a 0.5 [mu] g / ml optionally aureobasidin or 1
00μg/mlのシクロヘキシミドを添加した)10m 00μg / ml of cycloheximide was added) 10 m
lに接種し、上記(4)と同様の条件で30℃で24時間培養した。 Was inoculated into l, and cultured for 24 hours at 30 ° C. under the same conditions as in the above (4). この培養液のOD660nmを分光光度計 The OD660nm of the culture spectrophotometer
UV-160A(島津製作所)で測定した。 It was measured with a UV-160A (Shimadzu). 次にこの培養液をシードとし、50mlの合成培地に対しOD660nm Next, the seed of the culture solution, OD660nm for the synthetic medium of 50ml
値が0.063±0.002となるように接種し、30 Values ​​were inoculated so that 0.063 ± 0.002, 30
℃で18時間培養した。 They were cultured for 18 hours at ℃. 得られた培養液を遠心分離(1 The resulting culture was centrifuged (1
500xg,5分)し、得られた菌体を生理食塩水で洗浄した。 500 × g, 5 minutes), the obtained cells were washed with saline. 洗浄後、上記と同様の条件にて遠心分離し、菌体を集めた。 After washing, centrifuged under the same conditions as described above to collect the cells.

【0039】実施例1 組換えプラスミドpAUR101−KGD1のNruI [0039] NruI of Example 1 recombinant plasmid pAUR101-KGD1
消化物を用いてサッカロミセス・セレビシエIFO10 Using a digest Saccharomyces cerevisiae IFO10
150の形質転換を行った。 The transformation of the 150 were carried out. オーレオバシジン耐性を示すコロニーにつき、2−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性がないことを確認した(0.62nmol/mi Per colonies showing aureobasidin resistance, it was confirmed that no 2-ketoglutarate dehydrogenase activity (0.62nmol / mi
n/mg protein以下)後、細胞内遊離グルタミン及び遊離グルタミン酸濃度を測定した。 n / mg protein or less) after was measured intracellular free glutamine and free glutamic acid concentration. 対照として、pAUR101で形質転換したIFO10150を用いた。 As a control, it was used IFO10150 transformed with pAUR101. 細胞内遊離グルタミンと遊離グルタミン酸の濃度は、対照株でそれぞれ7.4mg/g乾燥菌体、1 The concentration of intracellular free glutamine as free glutamic acid, respectively in the control strain 7.4 mg / g dry cells, 1
0.6mg/g乾燥菌体であったのに対し、遺伝子破壊株ではそれぞれ16.2mg/g乾燥菌体、21.5m While 0.6 mg / g was dried cells, each in the gene-disrupted strain 16.2 mg / g dried cells, 21.5M
g/g乾燥菌体であった。 Was g / g dry cells.

【0040】実施例2 組み換えプラスミドpI−RED1−GAD1のNru [0040] Nru of Example 2 recombinant plasmid pI-RED1-GAD1
I消化物を用いてサッカロミセス・セレビシエIFO1 By using the I digest Saccharomyces cerevisiae IFO1
0150の形質転換を行った。 The transformation of 0150 were carried out. シクロヘキシミド耐性を示すコロニーにつき、グルタミン酸デカルボキシラーゼ活性がない(0.01U/mg以下)ことを確認後、細胞内遊離グルタミン及び遊離グルタミン酸濃度を測定した。 Per colonies showing resistance to cycloheximide, after confirming that there are no glutamic acid decarboxylase activity (0.01 U / mg or less) were measured intracellular free glutamine and free glutamic acid concentration. 対照としてベクターDNAによる形質転換株を用いた。 With transformed strain with a vector DNA as a control. 細胞内遊離グルタミンと遊離グルタミン酸の濃度は、対照株でそれぞれ6.8mg/g乾燥菌体、10. The concentration of intracellular free glutamine as free glutamic acid, respectively in the control strain 6.8 mg / g dry cells, 10.
3mg/g乾燥菌体であったのに対し、遺伝子破壊株ではそれぞれ21.2mg/g乾燥菌体、27.1mg/ While was 3 mg / g dry cells, each in the gene-disrupted strain 21.2 mg / g dry cell, 27.1 mg /
g乾燥菌体であった。 It was g dry cells.

【0041】実施例3 上記実施例1で得られた形質転換株に対し、さらに実施例2と同様の方法を用いてGAD1遺伝子を破壊した。 [0041] For transformant strain obtained in Example 3 above Example 1, was further disrupt the GAD1 gene using the same method as in Example 2.
酵素活性を確認することにより遺伝子破壊を確認し、細胞内グルタミン及び遊離グルタミン酸濃度の測定を行った。 Gene disruption was confirmed by confirming the enzymatic activity was measured in intracellular glutamine and free glutamic acid concentration. 遺伝子を2重に破壊した株では、細胞内遊離グルタミンと遊離グルタミン酸の濃度はそれぞれ24.2mg The strains disrupted gene doubly, respectively concentration of free glutamate intracellular free glutamine 24.2mg
/g乾燥菌体、29.7mg/g乾燥菌体であった。 / G dried cells, it was 29.7 mg / g dry cells.

【0042】比較例1 組換えプラスミドpAUR101−KGD1のNruI [0042] NruI of Comparative Example 1 recombinant plasmid pAUR101-KGD1
消化物を用いてサッカロミセス・セレビシエYPH49 Using a digest Saccharomyces cerevisiae YPH49
9の形質転換を行った。 9 of the transformation was carried out. オーレオバシジン耐性を示すコロニーにつき、2−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性がないことを確認した後、細胞内遊離グルタミン及び遊離グルタミン酸濃度を測定した。 Per colonies showing aureobasidin resistance, after confirming that there is no 2-ketoglutarate dehydrogenase activity was measured intracellular free glutamine and free glutamic acid concentration. 対照として、pAU As a control, pAU
R101で形質転換したYPH499を用いた。 Using YPH499 transformed with R101. 細胞内遊離グルタミンと遊離グルタミン酸の濃度は、対照株でそれぞれ4.6mg/g乾燥菌体、7.4mg/g乾燥菌体であったのに対し、遺伝子破壊株ではそれぞれ4. The concentration of intracellular free glutamine as free glutamic acid, respectively in the control strain 4.6 mg / g dried cells, while was 7.4 mg / g dry cells, each in the gene-disrupted strain 4.
4mg/g乾燥菌体、6.7mg/g乾燥菌体であった。 4 mg / g dry cell was 6.7 mg / g dry cells.

【0043】比較例2 組み換えプラスミドpI−RED1−GAD1のNru [0043] Nru of Comparative Example 2 recombinant plasmid pI-RED1-GAD1
I消化物を用いてサッカロミセス・セレビシエYPH4 By using the I digest Saccharomyces cerevisiae YPH4
99の形質転換を行った。 It was transformed 99. シクロヘキシミド耐性を示すコロニーにつき、グルタミン酸デカルボキシラーゼ活性がないことを確認後、細胞内遊離グルタミン及び遊離グルタミン酸濃度を測定した。 Per colonies showing resistance to cycloheximide, after confirming that there are no glutamic acid decarboxylase activity, it was measured intracellular free glutamine and free glutamic acid concentration. 対照としてベクターDNA Vector DNA as a control
による形質転換株を用いた。 Using the transformed strain by. 細胞内遊離グルタミンと遊離グルタミン酸の濃度は、対照株でそれぞれ3.9mg The concentration of intracellular free glutamine as free glutamic acid, respectively in the control strain 3.9mg
/g乾燥菌体、6.2mg/g乾燥菌体であったのに対し、遺伝子破壊株ではそれぞれ6.5mg/g乾燥菌体、9.9mg/g乾燥菌体であった。 / G dried cells, while was 6.2 mg / g dry cells, each in the gene-disrupted strain 6.5 mg / g dried cells were 9.9 mg / g dry cells.

【0044】比較例3 上記比較例1で得られた形質転換株に対し、さらに比較例2と同様の方法を用いてGAD1遺伝子を破壊した。 [0044] For transformant strain obtained in Comparative Example 3 Comparative Example 1 was further disrupt the GAD1 gene using the same method as in Comparative Example 2.
酵素活性を確認することにより遺伝子破壊を確認し、細胞内遊離グルタミン及び遊離グルタミン酸濃度の測定を行った。 Gene disruption was confirmed by confirming the enzymatic activity was measured in intracellular free glutamine and free glutamic acid concentration. 遺伝子を二重に破壊した株では、細胞内遊離グルタミンと遊離グルタミン酸の濃度はそれぞれ7.8m The strain was disrupted gene doubly, respectively concentration of free glutamate intracellular free glutamine 7.8m
g/g乾燥菌体、11.1mg/g乾燥菌体であった。 g / g dry cells, was 11.1 mg / g dry cells.

【0045】実施例4 実施例1、2及び3で得られた酵母をそれぞれ乾燥固形分当たり20g用い、固形分10%になるように水を加え、十分に撹拌懸濁した。 [0045] EXAMPLE 4 Examples 1, 2 and the resulting yeast used 20g per each dry solids at 3, water was added to a 10% solids, it was thoroughly stirred suspension. この懸濁液を40%NaOH The suspension 40% NaOH
溶液でpH5.7に調整した後、細胞壁溶解酵素YL− After adjusting to pH5.7 with a solution, the cell wall lytic enzyme YL-
15(天野製薬)を乾燥固形分当たり0.1%添加し、 15 (Amano Pharmaceutical) was added 0.1% per dry solids,
45℃で8時間反応させた。 It was reacted for 8 hours at 45 ° C.. 反応後、70℃で30分加熱して酵素を失活させ、37℃まで冷却した。 After the reaction, the enzyme was inactivated by heating 30 minutes at 70 ° C., and cooled to 37 ° C.. グルタミナーゼダイワC−100(大和化成)を固形分あたり1 Transglutaminase Daiwa C-100 (Yamato Kasei) a per solids 1
%添加し、37℃で1時間反応させた。 % Was added and allowed to react for 1 hour at 37 ° C.. 反応終了後、7 After completion of the reaction, 7
0℃で30分加熱した後、遠心分離により上清を得た。 0 After heating for 30 minutes at ° C., to obtain a supernatant by centrifugation.
得られた上清を凍結乾燥し、酵母エキス粉末を得た。 The resulting supernatant was lyophilized to obtain yeast extract powder. エキス固形分回収率は52%〜56%であった。 Extract solids recovery was 52% to 56%. グルタミン酸含量は、対照とした非欠損酵母を用いたエキスで5.9%、2−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ欠損酵母を用いたエキスで12.6%、グルタミン酸デカルボキシラーゼ欠損酵母を用いたエキスで15.1%、両酵素が欠損した酵母を用いたエキスで16.2%であった。 Glutamic acid content is 5.9% in extract with non-deficient yeast as a control, 12.6% in extract with 2-ketoglutarate dehydrogenase deficient yeast, in extract with glutamate decarboxylase-deficient yeast 15.1 %, both enzymes was 16.2% in extract using defective yeast. 得られたエキスの味質は、欠損酵母を用いたエキスにおいてグルタミン酸の旨味が非常に強く感じられるものであり、独特の味の厚みが感じられた。 Taste quality of the resulting extract, taste of glutamic acid in the extract using defective yeast is one that is felt very strongly, I felt the thickness of the unique taste.

【0046】実施例5 実施例1、2及び3で得られた酵母をそれぞれ乾燥固形分当たり20g用い、固形分10%になるように水を加え、十分に撹拌懸濁した。 [0046] EXAMPLE 5 Examples 1, 2 and the resulting yeast used 20g per each dry solids at 3, water was added to a 10% solids, it was thoroughly stirred suspension. この懸濁液を40%NaOH The suspension 40% NaOH
溶液でpH8.5に調整した後、65℃で2時間加熱し、90℃で30分加熱した。 After adjusting to pH8.5 with a solution, heated at 65 ° C., and heated for 30 minutes at 90 ° C.. この液を75%リン酸でpH5.8に調整し、プロテアーゼN「アマノ」を基質タンパク質当たり0.2%添加し、52℃で12時間反応させた。 The solution was adjusted to pH5.8 with 75% phosphoric acid, protease N to "Amano" was added 0.2% per substrate protein, was reacted for 12 hours at 52 ° C.. 70℃で30分間加熱し、酵素失活を行い、 It was heated at 70 ° C. 30 minutes, subjected to enzyme deactivation,
さらに、75%リン酸でpHを5.3に調整した後、ヌクレアーゼ「アマノ」(天野製薬)を乾燥固形分当たり0.04%添加し、64℃で4時間反応させた。 Furthermore, after adjusting the pH to 5.3 with 75% phosphoric acid was added nuclease "Amano" (Amano Pharmaceutical) 0.04% per dry solids, was allowed to react for 4 hours at 64 ° C.. ヌクレアーゼによる反応後、40%NaOH溶液でpHを5. After reaction with nuclease, the pH at 40% NaOH solution 5.
6に調整した。 It was adjusted to 6. デアミザイム(天野製薬)を乾燥固形分当たり0.04%添加し、45℃で2時間反応させた。 Deamizaimu (Amano Pharmaceutical) was added 0.04% per dry solids, was allowed to react for 2 hours at 45 ° C..
この後、酵素失活のために70℃で30分加熱し、遠心分離により上清を得た。 Thereafter, by heating 30 minutes at 70 ° C. For enzyme deactivation, the supernatant was obtained by centrifugation. 得られた上清を凍結乾燥し、酵母エキス粉末を得た。 The resulting supernatant was lyophilized to obtain yeast extract powder. エキス固形分回収率は50%〜5 Extract solids recovery rate of 50% to 5
2%であった。 It was 2%. グルタミン酸含量及び(イノシン酸+グアニル酸)含量は、対照とした非欠損酵母を用いたエキスで4.2%及び1.8%、2−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ欠損酵母を用いたエキスで14.0%及び1.7%、グルタミン酸デカルボキシラーゼ欠損酵母を用いたエキスで17.4%および1.8%、両酵素が欠損した酵母を用いたエキスで19.1%及び1.8%であった。 Glutamic acid content and (inosinic acid + guanylate) content is 4.2% and 1.8% in extract with non-deficient yeast as a control, 14.0% in extract with 2-ketoglutarate dehydrogenase deficient yeast and 1.7%, 17.4% in extract using glutamate decarboxylase-deficient yeast and 1.8% were 19.1% and 1.8% in the extract using a yeast two enzyme is deficient. 得られたエキスの味質は、欠損酵母を用いたエキスにおいてグルタミン酸と(イノシン酸+グアニル酸)による旨味の相乗作用が強く引き出され、旨味が非常に強く感じられるものであった。 Taste quality of the resulting extract, synergism umami by glutamate and in the extract using a deficient yeast (inosinic acid + guanylate) is pulled strongly, flavor was achieved felt very strongly. またこの酵母エキスにも独特の味の厚みが感じられた。 The thickness of the unique taste was felt also in the yeast extract.

【0047】比較例4 組み換えプラスミドpI−RED1−GLN1のEco [0047] Comparative Example 4 recombinant plasmid pI-RED1-GLN1 of Eco
0109I消化物を用いて実施例1で得られたkgd1 0109I digests obtained in Example 1 by using kgd1
破壊株を更に形質転換した。 The disrupted strain was further transformed. シクロヘキシミド耐性を示すコロニーにつき、グルタミンシンセターゼ活性がない(0.01U/mg以下)ことを確認後、細胞内遊離グルタミン及び遊離グルタミン酸濃度を測定した。 Per colonies showing resistance to cycloheximide, after confirming that there are no glutamine synthetase activity (0.01 U / mg or less) were measured intracellular free glutamine and free glutamic acid concentration. kgd kgd
1とgln1とを同時に破壊した株では、細胞内遊離グルタミンと遊離グルタミン酸の濃度はそれぞれ40.2 1 and the strain and gln1 destroyed simultaneously, each with a concentration of free glutamate intracellular free glutamine 40.2
mg/g乾燥菌体、4.4mg/g乾燥菌体であった。 mg / g dried cells were 4.4 mg / g dry cells.

【0048】この酵母より、実施例4と実質的に同じ方法を用いて酵母エキスを製造した。 [0048] From this yeast was prepared yeast extract using substantially the same procedure as in Example 4. エキス固形分回収率は53%であり、グルタミン酸含量は15.0%であった。 Extract solids recovery rate was 53%, glutamic acid content was 15.0%. 得られたエキスには、グルタミン酸の旨味は強く感じられたものの、独特の味の厚みは感じられなかった。 The resulting extract, although the taste of glutamate was felt strongly, did not feel the thickness of the unique taste.

【0049】実施例6 細胞内遊離グルタミン濃度が酵母エキスの味の厚みに及ぼす影響につき、熟練したパネラー(グルタミン酸ナトリウムを識別する閾値が100ppm以下である人)2 [0049] Example 6 intracellular free glutamine concentration for the impact on the thickness of the taste of the yeast extract, skilled panelists (person threshold for identifying the sodium glutamate is 100ppm or less) 2
5人により旨味強度と味の厚みの差を比較した。 And compared the difference between the taste strength and taste of the thickness by five people. 官能評価には、実施例4で得られた酵母エキス4種、即ち対照株由来のもの(エキスA)、kgd1破壊株由来のもの(エキスB)、gad1破壊株由来のもの(エキスC) The sensory evaluation, the resulting yeast extract four in Example 4, i.e., those derived from the control strain (extract A), those derived from kgd1 disruption strain (extract B), those derived from gad1 disruption strain (Extract C)
とkgd1、gad1の同時破壊株由来のもの(エキスD)と、比較例4で得られたkgd1、gln1同時破壊株由来のもの(エキスE)を用いた。 When kgd1, gad1 derived from simultaneous disrupted strain of (extract D), was used Kgd1 obtained in Comparative Example 4, Gln1 those derived from simultaneous disruption strain (extract E).

【0050】官能評価の結果を表1に示したが、旨味力価についてはエキスAに比べてエキスB、C、D、Eが1%の危険率で勝っており、B、C、Eの間には有意差は認められなかった。 [0050] While the results of the sensory evaluation are shown in Table 1, for the umami titer extract B compared to Extract A, C, D, and win E is at risk of 1%, B, C, E- no significant difference was observed between. また、エキスBとエキスDとの比較ではエキスDが5%の危険率で優れていると評価された。 Further, in comparison with the extract B and extract D was evaluated as excellent in risk rate extract D is 5%. 一方、味の厚みについては、エキスAに比べてB、 On the other hand, the thickness of the taste, compared to extract A B,
C、Dが5%の危険率で勝っていると評価されたが、エキスEはエキスAとの間で有意差はなかった。 C, and D were evaluated as winning a critical rate of 5%, extract E were no significant differences between the extract A.

【0051】 [0051]

【表1】 [Table 1]

【0052】以上のデータより酵母エキスの味の厚みは、原料酵母細胞内の遊離グルタミンの濃度が少なくとも15mg/g乾燥菌体以上の場合に発現していることが確認された。 [0052] or taste of the thickness of the yeast extract from the data, that the concentration of free glutamine in raw yeast cells expressing the case of more than at least 15 mg / g dry cells was confirmed. この細胞内遊離グルタミンの値は酵母エキスを製造した場合エキス固形分当たり3%のグルタミン酸に相当する。 The value of the intracellular free glutamine equivalent to 3% of glutamic acid per extract solids when prepared yeast extract.

【0053】 [0053]

【発明の効果】酵母におけるグルタミン酸およびグルタミンの代謝に関与する遺伝子を変異することにより、細胞内に多量に遊離グルタミンと遊離グルタミン酸を蓄積する酵は母が育種できた。 By mutating the genes involved in the metabolism of glutamate and glutamine in yeast according to the present invention, enzyme accumulating free glutamic acid and a large amount of free glutamine in cells mother could be bred. また該酵母をグルタミナーゼを併用して消化することでグルタミン酸含量が高く呈味力価に優れ、さらに従来の酵母エキスにはない味の厚みが付与された呈味バランスの良い酵母エキスが製造できるようになった。 Further to the yeast excellent glutamate content higher taste titer by digestion in combination with glutaminase, it still produced a good yeast extract of taste balance thickness is imparted flavor over traditional yeast extract Became.

【0054】 [0054]

【配列表】 <110> 日本たばこ産業株式会社 <120> 新規酵母及び酵母エキス <130> 002663 <160> 9 <210> 1 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 1 aagagctcaa cccaaagatt ccagctacaa aggc 34 <210> 2 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 2 aagagctctg gcatctgtgt ggaacttatg tctc 34 <210> 3 <211> 1294 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 3 aagagctcaa cccaaagatt ccagctacaa aggcttttca ggctcctccc agtatcagta 60 actttcccca gggtaccgaa gcagctccct tagggaccgc aatgactggt tcagtagatg 120 agaacgtctc cattcatcta aaagtgcaat tgctatgtag agcttaccaa gttagaggtc 180 atttaaaagc ccatatagat cctttaggga tctcatttgg tagtaataaa aataaccctg 240 ttcctccgga attgactcta gactactacg gctttagcaa acacgatctt gataaagaaa 300 tcaacctagg acctggtatc ctgccaaggt ttgcaaggga cgggaaatct aaaatgtctc 360 tgaaagagat tgtggatcat ctagaaaagt tatattgttc ctcttatggg gtacaataca 420 cacatattcc atctaagcaa aagtgtgatt ggttaagaga gagaattgag attcctgaac 480 cttaccaata tacagtggac caaaagagac aaatcttaga tagattaa [Sequence Listing] <110> Japan Tobacco Inc. <120> New yeast and yeast extract <130> 002663 <160> 9 <210> 1 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 1 aagagctcaa cccaaagatt ccagctacaa aggc 34 <210> 2 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 2 aagagctctg gcatctgtgt ggaacttatg tctc 34 <210> 3 <211> 1294 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 3 aagagctcaa cccaaagatt ccagctacaa aggcttttca ggctcctccc agtatcagta 60 actttcccca gggtaccgaa gcagctccct tagggaccgc aatgactggt tcagtagatg 120 agaacgtctc cattcatcta aaagtgcaat tgctatgtag agcttaccaa gttagaggtc 180 atttaaaagc ccatatagat cctttaggga tctcatttgg tagtaataaa aataaccctg 240 ttcctccgga attgactcta gactactacg gctttagcaa acacgatctt gataaagaaa 300 tcaacctagg acctggtatc ctgccaaggt ttgcaaggga cgggaaatct aaaatgtctc 360 tgaaagagat tgtggatcat ctagaaaagt tatattgttc ctcttatggg gtacaataca 420 cacatattcc atctaagcaa aagtgtgatt ggttaagaga gagaattgag attcctgaac 480 cttaccaata tacagtggac caaaagagac aaatcttaga tagattaa ca tgggccactt 540 cttttgagtc attcttatct acaaaatttc caaatgataa gaggttcggt ttagaaggtt 600 tggaaagtgt tgttccaggt attaaaactt tggttgatcg ttctgttgaa ttgggtgtag 660 aagatattgt tttgggtatg gctcaccgtg gtagattgaa cgttttatcc aatgtggtcc 720 gtaaaccaaa tgaatctatt ttttctgaat ttaagggttc gagcgctcgc gatgatattg 780 aaggatcggg tgatgtcaag taccatttgg gtatgaacta ccaaagacca actacgtctg 840 gtaagtacgt caatttatcg ctggtggcaa atccttctca tttagaatcc caagatccag 900 ttgttcttgg tagaactaga gctttattgc atgccaagaa cgatttgaag gaaaaaacaa 960 aggccttagg tgtgttatta catggtgatg ctgcttttgc tgggcagggt gttgtttatg 1020 aaaccatggg tttcttgacc ctaccagaat actctactgg tggtactatt catgttatta 1080 caaacaacca gatcggattc actacggatc caagatttgc aaggtccaca ccatatcctt 1140 ccgatttggc taaggccatt gatgccccaa ttttccatgt taacgctaat gacgtggaag 1200 ctgtgacctt tattttcaat ttagccgcag aatggagaca taagttccac acagatgcca 1260 gagacataag ttccacacag atgccagagc tctt 1294 <210> 4 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 4 aagagctctc ccgatgaaga accaataggc ca tgggccactt 540 cttttgagtc attcttatct acaaaatttc caaatgataa gaggttcggt ttagaaggtt 600 tggaaagtgt tgttccaggt attaaaactt tggttgatcg ttctgttgaa ttgggtgtag 660 aagatattgt tttgggtatg gctcaccgtg gtagattgaa cgttttatcc aatgtggtcc 720 gtaaaccaaa tgaatctatt ttttctgaat ttaagggttc gagcgctcgc gatgatattg 780 aaggatcggg tgatgtcaag taccatttgg gtatgaacta ccaaagacca actacgtctg 840 gtaagtacgt caatttatcg ctggtggcaa atccttctca tttagaatcc caagatccag 900 ttgttcttgg tagaactaga gctttattgc atgccaagaa cgatttgaag gaaaaaacaa 960 aggccttagg tgtgttatta catggtgatg ctgcttttgc tgggcagggt gttgtttatg 1020 aaaccatggg tttcttgacc ctaccagaat actctactgg tggtactatt catgttatta 1080 caaacaacca gatcggattc actacggatc caagatttgc aaggtccaca ccatatcctt 1140 ccgatttggc taaggccatt gatgccccaa ttttccatgt taacgctaat gacgtggaag 1200 ctgtgacctt tattttcaat ttagccgcag aatggagaca taagttccac acagatgcca 1260 gagacataag ttccacacag atgccagagc tctt 1294 <210> 4 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 4 aagagctctc ccgatgaaga accaataggc tg 32 <210> 5 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 5 aagagctcgg cacttctgga tattcttcgt gg 32 <210> 6 <211> 960 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 6 tcccgatgaa gaaccaatag gctgtgccac cacaggttct agtgaggcaa tcatgttggg 60 tggactcgcc atgaaaaaaa gatgggaaca cagaatgaag aatgctggta aagatgcttc 120 caagccgaac attataatgt cttctgcgtg ccaagtggca ttagagaagt ttacgagata 180 ttttgaagtg gaatgccgat tggttccggt atcccacaga agccatcata tgcttgaccc 240 agagtcgtta tgggattatg tagatgagaa cactattggc tgttttgtaa ttttaggaac 300 cacctacact ggccatttgg aaaatgtaga gaaagttgca gatgtcttgt cccaaattga 360 ggccaagcat cctgattgga gcaatactga tattccaatc catgcggatg gcgcttcagg 420 tgggtttatt atcccatttg gctttgaaaa agagcacatg aaagcttatg gcatggaacg 480 ttgggggttc aaccatccgc gtgtggttag tatgaacact agtggtcata agtttggctt 540 aaccactccc ggtctgggtt gggtgctatg gagagatgaa tccttactgg ctgatgaatt 600 gagattcaaa ctaaagtacc tcggtggcgt ggaagaaact ttcggtttga atttttcaag 660 acctggattt caagttgtcc atcaatactt caattttgtt tctctaggcc att tg 32 <210> 5 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 5 aagagctcgg cacttctgga tattcttcgt gg 32 <210> 6 <211> 960 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 6 tcccgatgaa gaaccaatag gctgtgccac cacaggttct agtgaggcaa tcatgttggg 60 tggactcgcc atgaaaaaaa gatgggaaca cagaatgaag aatgctggta aagatgcttc 120 caagccgaac attataatgt cttctgcgtg ccaagtggca ttagagaagt ttacgagata 180 ttttgaagtg gaatgccgat tggttccggt atcccacaga agccatcata tgcttgaccc 240 agagtcgtta tgggattatg tagatgagaa cactattggc tgttttgtaa ttttaggaac 300 cacctacact ggccatttgg aaaatgtaga gaaagttgca gatgtcttgt cccaaattga 360 ggccaagcat cctgattgga gcaatactga tattccaatc catgcggatg gcgcttcagg 420 tgggtttatt atcccatttg gctttgaaaa agagcacatg aaagcttatg gcatggaacg 480 ttgggggttc aaccatccgc gtgtggttag tatgaacact agtggtcata agtttggctt 540 aaccactccc ggtctgggtt gggtgctatg gagagatgaa tccttactgg ctgatgaatt 600 gagattcaaa ctaaagtacc tcggtggcgt ggaagaaact ttcggtttga atttttcaag 660 acctggattt caagttgtcc atcaatactt caattttgtt tctctaggcc att cagggta 720 tagaacacaa ttccaaaatt ctctatttgt tgcaagagcg 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───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 中條 幸博 静岡県田方郡大仁町三福金山194−1 日 本たばこ産業株式会社食品研究センター内 Fターム(参考) 4B018 LE03 LE05 MD81 MF01 4B024 AA03 AA05 BA74 BA80 CA04 GA14 HA01 4B047 LB03 LB06 LB07 LB09 LE06 LF02 LF08 LG15 LG56 LP18 4B064 CA06 CA19 CC24 CE02 DA10 4B065 AA80X AA80Y AB01 AC20 BA02 CA17 CA41 ────────────────────────────────────────────────── ─── front page of the continuation (72) inventor Yukihiro Nakajo Shizuoka Prefecture Tagata District ohito Mifuku Jinshan 194-1 days the tobacco industry Co., Ltd. food research Center in the F-term (reference) 4B018 LE03 LE05 MD81 MF01 4B024 AA03 AA05 BA74 BA80 CA04 GA14 HA01 4B047 LB03 LB06 LB07 LB09 LE06 LF02 LF08 LG15 LG56 LP18 4B064 CA06 CA19 CC24 CE02 DA10 4B065 AA80X AA80Y AB01 AC20 BA02 CA17 CA41

Claims (6)

    【特許請求の範囲】 [The claims]
  1. 【請求項1】 細胞内に、乾燥菌体1g当たり15mg To 1. A intracellularly, dry cells 1g per 15mg
    以上の遊離グルタミンを含有する酵母。 Yeast containing the above free glutamine.
  2. 【請求項2】 酵母が2−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性及びグルタミン酸デカルボキシラーゼ活性のいずれか一方又は双方が低下した変異株である請求項1記載の酵母。 2. A yeast according to claim 1, wherein one or both of the yeast 2-ketoglutarate dehydrogenase activity and glutamate decarboxylase activity is a mutant strain having reduced.
  3. 【請求項3】 細胞内に、乾燥菌体1g当たり15mg To 3. intracellularly, dry cells 1g per 15mg
    以上の遊離グルタミンを含有する酵母を消化する工程を含んでなる、細胞内遊離グルタミン由来のグルタミン酸をエキス固形分に対して少なくとも3%含む酵母エキスの製造方法。 Comprising the step of digesting the yeast containing the above free glutamine, method for producing a yeast extract containing at least 3% glutamate-derived intracellular free glutamine respect extract solids.
  4. 【請求項4】 消化される酵母が請求項2記載の酵母である、請求項3記載の方法。 4. A yeast is digested is a yeast according to claim 2, method of claim 3.
  5. 【請求項5】 請求項3または4記載の方法により製造された酵母エキス。 5. A method according to claim 3 or 4 yeast extract produced by the method described.
  6. 【請求項6】 細胞内遊離グルタミン由来のグルタミン酸をエキス固形分に対して少なくとも3%含むことを特徴とする酵母エキス。 6. Yeast extract glutamate-derived intracellular free glutamine, which comprises at least 3% relative to extract solid.
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Cited By (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2006129835A (en) * 2004-11-09 2006-05-25 Takeda-Kirin Foods Corp Yeast essence highly containing glutamic acid and method for producing the same
WO2009110624A1 (en) * 2008-03-04 2009-09-11 味の素株式会社 γ-GLUTAMULCYSTEINE-PRODUCING YEAST, AND METHOD FOR PRODUCTION OF YEAST EXTRACT
WO2009123019A1 (en) 2008-03-31 2009-10-08 株式会社 興人 Yeast mutant and yeast extract
WO2010058527A1 (en) 2008-11-18 2010-05-27 アサヒビール株式会社 Method for producing yeast with high glutamic acid content
WO2010058616A1 (en) * 2008-11-18 2010-05-27 アサヒビール株式会社 Method for production of glutamic acid-rich yeast
WO2010058551A1 (en) 2008-11-18 2010-05-27 アサヒビール株式会社 Method for producing amino-acid-rich yeast
EP2368444A1 (en) * 2008-12-24 2011-09-28 Angel Yeast Co., Ltd. Yeast extract with high glutamic acid content and producing method thereof
JP2013116101A (en) * 2011-10-31 2013-06-13 Kohjin Life Sciences Co Ltd Yeast cell wall fraction with high food fiber content
JP5363120B2 (en) * 2006-12-27 2013-12-11 日本たばこ産業株式会社 Sweet based amino acid-rich seasoning composition and yeasts get it

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS4834898B1 (en) * 1968-06-06 1973-10-24
DE4234240A1 (en) * 1992-10-10 1994-04-14 Huels Chemische Werke Ag Yeasts with high natural glutamic acid content
JPH09149787A (en) * 1995-11-30 1997-06-10 Daiwa Kasei Kk Acidic glutaminase and its use
JPH10327802A (en) * 1997-05-27 1998-12-15 Asahi Chem Ind Co Ltd Yeast essence composition and yeast mutant strain for obtaining the same
JP2000189169A (en) * 1998-03-18 2000-07-11 Ajinomoto Co Inc L-glutamate productive bacterium and production of l- glutamic acid

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS4834898B1 (en) * 1968-06-06 1973-10-24
DE4234240A1 (en) * 1992-10-10 1994-04-14 Huels Chemische Werke Ag Yeasts with high natural glutamic acid content
JPH09149787A (en) * 1995-11-30 1997-06-10 Daiwa Kasei Kk Acidic glutaminase and its use
JPH10327802A (en) * 1997-05-27 1998-12-15 Asahi Chem Ind Co Ltd Yeast essence composition and yeast mutant strain for obtaining the same
JP2000189169A (en) * 1998-03-18 2000-07-11 Ajinomoto Co Inc L-glutamate productive bacterium and production of l- glutamic acid

Cited By (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP4651361B2 (en) * 2004-11-09 2011-03-16 キリンフードテック株式会社 High glutamic acid content yeast extract and a method of manufacturing the same
JP2006129835A (en) * 2004-11-09 2006-05-25 Takeda-Kirin Foods Corp Yeast essence highly containing glutamic acid and method for producing the same
JP5363120B2 (en) * 2006-12-27 2013-12-11 日本たばこ産業株式会社 Sweet based amino acid-rich seasoning composition and yeasts get it
WO2009110624A1 (en) * 2008-03-04 2009-09-11 味の素株式会社 γ-GLUTAMULCYSTEINE-PRODUCING YEAST, AND METHOD FOR PRODUCTION OF YEAST EXTRACT
JPWO2009110624A1 (en) * 2008-03-04 2011-07-14 味の素株式会社 Process for the preparation of γ- guru Tamil-cysteine-producing yeast and yeast extract
JP2009261253A (en) * 2008-03-31 2009-11-12 Kohjin Co Ltd Yeast mutant and yeast extract
WO2009123019A1 (en) 2008-03-31 2009-10-08 株式会社 興人 Yeast mutant and yeast extract
US9084435B2 (en) 2008-03-31 2015-07-21 Kohjin Co., Ltd. Yeast mutant and yeast extract
EP2949745A1 (en) 2008-11-18 2015-12-02 Asahi Group Holdings, Ltd. Method for producing amino acid-rich yeast
WO2010058527A1 (en) 2008-11-18 2010-05-27 アサヒビール株式会社 Method for producing yeast with high glutamic acid content
JP2011115180A (en) * 2008-11-18 2011-06-16 Asahi Breweries Ltd Method for producing yeast containing glutamic acid at high concentration
JP4503700B1 (en) * 2008-11-18 2010-07-14 アサヒビール株式会社 The method of manufacturing high glutamic acid-containing yeast
JP4757944B2 (en) * 2008-11-18 2011-08-24 アサヒビール株式会社 Yeast extract
WO2010058616A1 (en) * 2008-11-18 2010-05-27 アサヒビール株式会社 Method for production of glutamic acid-rich yeast
JP2010148517A (en) * 2008-11-18 2010-07-08 Asahi Breweries Ltd Yeast with high glutamic acid content
JP5730579B2 (en) * 2008-11-18 2015-06-10 アサヒグループホールディングス株式会社 Method for producing amino acid-rich yeast
US9005683B2 (en) 2008-11-18 2015-04-14 Asahi Group Holdings, Ltd. Method for producing yeast with high glutamic acid content
WO2010058551A1 (en) 2008-11-18 2010-05-27 アサヒビール株式会社 Method for producing amino-acid-rich yeast
EP2368444A4 (en) * 2008-12-24 2012-05-30 Angel Yeast Co Ltd Yeast extract with high glutamic acid content and producing method thereof
JP2012507265A (en) * 2008-12-24 2012-03-29 安▲チ▼酵母股▲フェン▼有限公司Angelyeast Co., Ltd High glutamic acid content yeast extract and a method of manufacturing the same
EP2368444A1 (en) * 2008-12-24 2011-09-28 Angel Yeast Co., Ltd. Yeast extract with high glutamic acid content and producing method thereof
JP2013116101A (en) * 2011-10-31 2013-06-13 Kohjin Life Sciences Co Ltd Yeast cell wall fraction with high food fiber content

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