JP2002131327A - Novel biochip and its making method - Google Patents

Novel biochip and its making method


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JP2002131327A JP2001226243A JP2001226243A JP2002131327A JP 2002131327 A JP2002131327 A JP 2002131327A JP 2001226243 A JP2001226243 A JP 2001226243A JP 2001226243 A JP2001226243 A JP 2001226243A JP 2002131327 A JP2002131327 A JP 2002131327A
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PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a novel method usable to immobilize a biomaterial that is a polymer, used for obtaining a biological biochip, and also suited to mass production. SOLUTION: This novel method for making a biochip is characterized in that microcarriers made by immobilizing the biomaterial and a patterned substrate made by immobilizing the carriers thereon are immobilized by hydrophobic interaction by using a random in-liquid self-organizing method.



【0001】 [0001]

【発明の属する技術分野】本発明は、生体材料を固定化した微小担体と疎水性固定部を備えたパターン化基板を、無作為液中自己組織化法を用いて疎水性相互作用により固定化することを特徴とする、新規なバイオチップの作製方法に関する。 The present invention relates to the patterned substrate having a fine carrier and a hydrophobic stationary part immobilized biological material, immobilized by hydrophobic interaction using in random liquid self-assembly method characterized in that it relates to a method for manufacturing a novel biochip.

【0002】 [0002]

【従来の技術】DNAチップやプロテインチップを作製する方法として、幾つかの技術が現在用いられている。 2. Description of the Related Art As a method for making a DNA chip or protein chip, a number of techniques currently used.
フォトリソグラフィを利用した固相合成法は、幾何級数的種類の生体高分子オリゴマーの全種類を高密度に合成、配列できる技術である。 Solid phase synthesis methods using photolithography, densely synthesized all types of geometric type of biopolymer oligomer is SEQ possible techniques. しかし、固相合成方法であるため長い鎖長のポリマーを得ることができず、蛋白質のような高次構造を有する材料の固定化方法には適用できない。 However, it is impossible to obtain a polymer of chain length for a solid-phase synthesis method can not be applied to method for immobilizing material having a conformation such as proteins. また、多種類のフォトマスクを利用する工程数の多い方法であるため、低コスト化には向いていない。 Moreover, it therefore, not suitable for cost reduction is often the method of the number of steps that utilize various types of photomasks.
また、スタンプ法は、あらかじめ用意した多種類の材料をチップ上に並べていく技術である。 Moreover, stamping is going side by side a wide variety of materials prepared in advance on the chip technology. 任意の材料に適用できるが、個々の材料の固定は、物理・化学吸着か、簡単な条件で反応が進行する固定化法に限定される。 Can be applied to any material, fixed of the individual materials are either physical and chemical adsorption, reaction with a simple condition is limited to immobilization method proceeds.

【0003】 [0003]

【発明が解決しようとする課題】そこで、上記の従来のバイオチップの作製方法の欠点を補うことが可能であり、量産にも適した、新規のバイオチップの作製方法を開発することが、本発明の課題である。 [SUMMARY OF THE INVENTION Therefore, it is possible to compensate for the disadvantages of the above methods for manufacturing a conventional biochip, also suitable for mass production, to develop a method for manufacturing a new biochip, the it is an object of the invention.

【0004】 [0004]

【課題を解決するための手段】本発明者らは、高集積型バイオチップの開発にあたり、生体材料の新しい固定化方法を提案した。 The present inventors Means for Solving the Problems] are In developing highly integrated biochip, we proposed a new method for immobilizing biological materials. 即ち、生体材料を基板上に直接固定化するのではなく、微小担体に固定化した後、担体をパターン化した基板上に固定化する2段階の固定化方法を採用した。 That is, the biomaterial not directly immobilized on a substrate, after immobilizing the microcarrier, employing a two-step immobilization method for immobilizing on the substrate patterning the carrier. 第二段階目の基板上への固定化方法として、微小化した担体群を、無作為液中自己組織化法により、疎水性相互作用を介して微小担体を基板に固定化した。 As immobilization method to the second stage on the substrate, the micronized carrier group, by random fluid self-assembly method, was immobilized microcarrier to the substrate through a hydrophobic interaction. 無作為液中自己組織化法については下記に詳しく述べるが、この方法によると固定化材料の種類の増加や固定化領域の微小化に際してもその工程が複雑にならず、生体材料の活性を損なうことなく固定化できると期待される。 Although described in detail below for random fluid self-assembly method, also not complicated is the process upon miniaturization of the type of growth and immobilization region of the immobilized material by this method, impairs the activity of the biomaterial It is expected to be immobilized without. また本方法を用いることにより、多くの分析を同時に行えると共に、微小化により試薬や試料の消費量の抑制や複合的情報の取得が期待されている。 By using this method also, the enabling many simultaneously analyzed, obtaining reagents and consumption suppression and complex information of the sample is expected by micronization. 本発明の方法は、このための微小担体の作製の方法、および配置の親和力として薄板のダイシングにより得た微小担体とパターン化疎水性膜を有する基板との疎水性相互作用を用いた方法に関するものである。 The method of the present invention, a method of using a hydrophobic interaction with the substrate having a microcarrier and the patterned hydrophobic film obtained by micro method for manufacturing a carrier sheet dicing as affinity, and arrangement for the it is.

【0005】 [0005]

【発明の実施の形態】本発明のバイオチップの作製方法は、生体材料を微小担体に対して固定化する過程と、その担体を配置する過程より成る。 The method for manufacturing a biochip of the embodiment of the present invention includes the steps of immobilizing a biomaterial against microcarrier consists of the process of placing the carrier. 微小担体に対する固定化では個別に各種の生体材料をカバーガラスに固定化した後、ダイシングマシーンで100〜400μm角に切った担体に固定化する。 After immobilization on a cover glass of various biomaterials individually immobilized for microcarrier is immobilized on a carrier cut into 100~400μm angle dicing machine. これを適当な量ずつ配合し、担体として性質が等しく化学・生化学的に性質が異なる微小担体の懸濁液を得る。 This was compounded by appropriate amounts to give a suspension of equal chemical and biochemical properties different from the microcarrier nature as the carrier. 後者の配置工程では無作為液中自己組織化法により、担体の疎水性相互作用を用いて基板と結合させる。 By random solution self-assembly process in the latter arrangement step, it is combined with the substrate using a hydrophobic interaction support. 基板上の形状や材料を制御することによっても、配置用サイトを格子上に並べておくことができる。 By controlling the shape and material of the substrate also, the placement site may have been arranged in the matrix.

【0006】無作為液中自己組織化法とは、スピンコーター上に設置した液体中でこのサイト付近に先の担体懸濁液を滴下し、そのスピンコーターを回すことで重力、 [0006] The random fluid self-assembly method, gravity by dropwise previous carrier suspension near the site in a liquid which is placed on a spin coater, turn the spin coater,
遠心力、疎水性相互作用また種々の親和力によって1つのサイトに一つだけの担体を配置させる方法である。 Centrifugal force, a method of arranging only the carrier one one site by hydrophobic interaction The various affinity. たとえば重力や疎水性相互作用によって、サイトの中に、 For example, by gravity or hydrophobic interaction, within the site,
ほぼそのサイトと同じ大きさの担体を落とし込むと、2 When dropped substantially carriers of the same size as the site 2
つ目以降は入ることができない。 One eye or later can not enter. 基板上に多くのサイトを用意して十分な数の担体を滴下すると、一度に数多くのサイトに担体を配置させることが可能であり、この様な方法を自己組織化法という。 When prepared the many sites on the substrate is dropped a sufficient number of carriers, it is possible to arrange the carrier on the number of sites at a time, such a method of self-assembly method. 懸濁液に化学的、生化学的に性質が異なる生体材料を固定化した担体の混合物を用いれば、最終的に多種類の生体材料を密に固定化した基板を得ることができる。 Chemically suspension, by using a mixture of biochemically carrier properties with immobilized different biomaterials, ultimately a wide variety of biological materials can be obtained a substrate which is tightly immobilized. このとき特定の生体材料を固定化した担体が基板上のどこに配置されるかは制御されていないので、本発明の方法においては無作為に組織化される。 Since carriers with immobilized specific biomaterial this time or is not controlled is placed anywhere on the substrate, in the method of the present invention are randomly organized. 本発明の方法において、センサー応答のキャリブレーション等によって、最終的な位置を知ることが可能となる。 In the method of the present invention, the calibration or the like of the sensor response, it is possible to know the final position. この様に、生物材料を固定化した微小担体と基板とを結合させるにあたり、無作為液中自己組織化法によって疎水性相互作用を利用して結合させた事が、本発明の最も大きな特徴である。 Thus, when coupling the the microcarrier and a substrate with immobilized biological material, it was bound using the hydrophobic interaction by random fluid self-assembly method, the most significant feature of the present invention is there.

【0007】本発明は、パターン化基板及び生体材料固定化担体を備えたバイオチップである。 [0007] The present invention is a biochip having a patterned substrate and biomaterial immobilization. ここで、疎水性固定部と生体材料固定化担体は、疎水性相互作用により結合している。 Here, the hydrophobic stationary part and biomaterial immobilization carrier are linked by a hydrophobic interaction. 尚、パターン化基板は基板とその基板の片面に配列した複数の疎水性固定部とを備えており、その基板の疎水性固定部の間は親水性である。 Incidentally, the patterned substrate is provided with a plurality of hydrophobic stationary portions arranged on one surface of the substrate and its substrate, between the hydrophobic stationary portion of the substrate is hydrophilic. また、生体材料固定化担体は微小担体、その微小担体の片面の表層に形成した疎水性コーティング、更にその微小担体の他方の片面に固定化した生体成分又は生体成分類似物質を備えている。 The biological material immobilized carrier comprises a fine carrier, one surface of the surface layer to form hydrophobic coating of the microcarrier, further other immobilized biological components or biological components analogs on one surface of the microcarrier. ここで固定化する生体成分又は生体成分類似物質として、核酸、蛋白質、脂質、生体模倣有機分子、細胞及びこれらの複合体が挙げられる。 As a biological component or biological components similar substances immobilizing wherein nucleic acids, proteins, lipids, biomimetic organic molecule, cell and complexes thereof. ここでいう生体模倣分子は、生体機能材料が持つ特異的認識能や、 Biomimetic molecules referred to herein, and specific recognition ability with biofunctional material,
信号変換機能などに相当する機能を発現するか、もしくは安定化や信号伝達のように他の機能を支援する分子を指す。 Or express a function corresponding to such signal conversion functions, or molecules that support other functions as stabilizing and signal transduction. 認識能については、精密合成による認識分子やモレキュラーインプリンティング法によって得られた分子認識ポリマー、分子認識能を目的として得られるコンビナトリアル化学の産物などがある。 For recognition ability, and the like precise synthesis by the recognition molecules or molecular imprinting method molecular recognition polymers obtained by combinatorial chemistry obtained for the purpose of molecular recognition ability product. 信号変換機能については、触媒能を有する分子、光学特性が変化する分子、 The signal conversion function, molecules with catalytic activity, molecules which optical characteristics vary,
酸化または還元されうる分子、重量変化を起こす分子などがある。 Molecules that can be oxidized or reduced, and the like molecules undergoing weight change. 支援機能には疎水場、または親水場などにより他の生体材料を安定化させる分子のほか、固定化を仲介する分子、電子伝達する導電性分子などがある。 The support functions Other molecules that stabilize other biomaterials due hydrophobic field, or hydrophilic field, molecules that mediate immobilization, there is a conductive molecule electron transfer. また、上記の構造より成るパターン化基板及び生体材料固定化担体もまた、本発明の範囲内である。 Also, patterned substrate and biomaterial-immobilized carrier formed of the structure described above are also within the scope of the present invention.

【0008】本発明のバイオチップアレイの構造を、図1に示す。 [0008] The structure of a biochip array of the present invention, shown in FIG. パターン化基板は、スライドガラス等の基板(1)上に、疎水性固定部(2)が複数存在しているという構造をしている。 Patterned substrate, on the substrate (1) such as a slide glass, and the structure of the hydrophobic stationary part (2) there are a plurality. パターン化基板は、親水性部分(8)の間に疎水性部分(9)が格子状に配列されている、という構造となっている。 Patterned substrate has a structure that the hydrophobic portion (9) are arranged in a grid between the hydrophilic part (8). 一方、生体材料固定化担体は、疎水性コーティング(3)、カバーガラス等の微小担体(4)、クロムコーティング(5)、金コーティング(6)及び生体材料(7)の順番に層を形成している。 On the other hand, the biomaterial immobilization pellets, hydrophobic coating (3), microcarriers (4), such as a cover glass, chromium coating (5), a gold coating (6) and layers were formed in the order of the biomaterial (7) ing. ここで、微小担体(4)の大きさは約10〜500 The size of the microcarriers (4) is about 10 to 500
μmで、厚さは1〜120μmであることが望ましい。 In [mu] m, it is desirable that the thickness is 1~120Myuemu.
また、疎水性コーティング(3)の厚さは1分子層〜約1.0μm、クロムコーティング(5)の厚さは約20 Further, the hydrophobic coating (3) the thickness of one molecular layer to about 1.0 .mu.m, the thickness of the chromium coating (5) about 20
0オングストローム、金コーティング(6)の厚さは約2000オングストロームであることが望ましい。 0 angstroms, it is desirable that the thickness of the gold coating (6) is approximately 2000 Angstroms. 更に、基板(1)の厚さは約0.5〜5mm、疎水性固定部(2)の厚さは1分子層〜約2.0μmであることが望ましい。 Further, the thickness of the substrate (1) is about 0.5 to 5 mm, the thickness of the hydrophobic stationary part (2) is desirably one molecular layer to about 2.0 .mu.m. 疎水性固定部(2)と疎水性コーティング(3)は、疎水性相互作用により結合しており、上述した無作為液中自己組織化法によって、パターン化基板に生体材料固定化担体が結合したバイオチップを作製することができる。 Hydrophobic fixed part (2) and the hydrophobic coating (3) is linked by hydrophobic interaction, by random fluid self-assembly method described above, the biomaterial-immobilized carrier is bound to the patterned substrate it can be produced biochip. 無作為液中自己組織化法の原理より、微小担体(4)の大きさと疎水性固定部(2)の大きさはほぼ等しくなるように作製する必要がある。 The principle of random fluid self-assembly method, the size of the size and hydrophobic stationary part of the microcarrier (4) (2) should be prepared to be substantially equal.

【0009】上記の生体材料固定化担体は、以下の様な過程で作製することができる。 [0009] The biomaterial immobilization pellets can be prepared by the following such processes. (1)親水性のカバーガラスの片面の表層を、疎水性コーティングした後に焼成を行う。 (1) one side of the surface layer of hydrophilic cover glass, and baked after hydrophobic coating. (2)前記カバーガラスの疎水性コーティングを行わなかった面にクロムを蒸着してクロム蒸着層を形成する。 (2) the by depositing chromium on the surface was not a hydrophobic coating of the cover glass to form a chromium vapor deposited layer. (3)前記クロム蒸着層の上に金を蒸着して金蒸着層を形成する。 (3) gold is deposited to form a gold vapor-deposited layer on the chromium deposition layer. (4)前記金蒸着層をジチオジプロピオン酸で処理し、 (4) the gold deposition layer was treated with dithiodipropionic acid,
更にエチル−ジメチルアミノプロピルカルボジイミドで処理を行った後にアビジンを作用させることにより、アビジンで修飾した金の層を形成する。 Further ethyl - by the action of avidin after the treatment with dimethylaminopropyl carbodiimide, to form a layer of gold modified with avidin. (5)前記アビジンで修飾した金の層にビオチン化した生体成分を結合させる。 (5) coupling the biotinylated biological components in a layer of gold modified with the avidin. (6)カッターで切断する。 (6) is cut with a cutter.

【0010】ここで、疎水性相互作用を与えることができる限り、疎水性コーティングを行う目的で種々の材料を使用する事が出来る。 [0010] Here, as long as it can impart hydrophobic interaction, it is possible to use various materials for the purpose of performing a hydrophobic coating. その際に、環状パーフルオロポリマーを用いることが好ましく、CYTOPを用いることが特に好ましい。 In this case, it is preferable to use a cyclic perfluoropolymer, it is particularly preferable to use CYTOP. CYTOPの化学構造式を化1に、 Chemical structural formula of Formula 1 of CYTOP,
物理的特性を表1に、それぞれ示す。 The physical properties in Table 1, respectively. CYTOPにより疎水性コーティングを行った後に、コーティングを行わなかった面にクロムと金で蒸着を行う(図2)。 After the hydrophobic coating by CYTOP, vapor deposition is performed with chrome and gold on the surface was not coated (Fig. 2). クロムで蒸着を行うのは、金はガラスに対する付着性が良くないために、金の前にクロムの蒸着層を作製する必要があるからである。 Perform deposition with chromium, gold because poor adhesion to glass, it is necessary to produce a vapor deposited layer of chromium before gold.

【0011】 [0011]

【化1】 [Formula 1]

【0012】 [0012]

【表1】 [Table 1]

【0013】金をジチオジプロピオン酸で処理を行うことにより、チオール基を介してジチオジプロピオン酸は金と結合する。 [0013] By performing the processing in dithiodipropionic acid gold, dithiodipropionic acid via the thiol group binds to the gold. その後、ジチオジプロピオン酸とエチル−ジメチルアミノプロピルカルボジイミドを反応させることにより、イミドを結合させる。 Thereafter, dithiodipropionic acid and ethyl - by reacting dimethylaminopropyl carbodiimide, to bind the imide. 更にアビジンと反応させるとイミドが遊離して、ペプチド結合を介してアビジンが金蒸着層の上に結合する。 Further reacted imide free and avidin, avidin via a peptide bond is bound on a gold deposition layer. このような反応を用いて固定化したアビジンにビオチン化DNAを作用させると、ビオチン−アビジン親和性相互作用により、微小担体上にDNAが固定化される(図3)。 When such the action of biotinylated DNA reaction immobilized avidin with biotin - avidin affinity interactions, DNA is immobilized on the microcarrier (Figure 3). この様にして固定化したDNAにFITCでラベル化したDNAが結合すると、FITCの蛍光により検出することが可能である。 When DNA was labeled with FITC to immobilized DNA in this way is bonded, it is possible to detect the fluorescence of the FITC. また、同様の反応を用いて、DNAのみならず、ポリペプチドを固定化することも可能である。 Further, using the same reaction, not only DNA, it is also possible to immobilize the polypeptide.

【0014】また、上記のパターン化基板は、以下の様な過程で作製することができる。 [0014] The patterned substrate can be prepared by the following such processes. (1)親水性のスライドガラスの片面の表層を、疎水性コーティングした後に焼成を行う。 (1) one side of the surface layer of hydrophilic glass slide and baked after hydrophobic coating. (2)前記カバーガラスの疎水性コーティングを行った面にクロムを蒸着してクロム蒸着層を形成する。 (2) the by depositing chromium on the surface subjected to hydrophobic coating of the cover glass to form a chromium vapor deposited layer. (3)前記クロム蒸着層の上に金を蒸着して金蒸着層を形成する。 (3) gold is deposited to form a gold vapor-deposited layer on the chromium deposition layer. (4)前記金蒸着層にフォトレジストを作用させ、露光した後に現像を行う。 (4) by the action of the photoresist on the gold deposition layer, development is performed after exposure. (5)前記金蒸着層のエッチングを行った後に、フォトレジストを除去する。 (5) after the etching of the gold deposition layer, the photoresist is removed. (6)前記クロム蒸着層のエッチングを行った後に、前記疎水性コーティングのエッチングを行う。 (6) after the etching of the chromium deposition layer is etched in the hydrophobic coating. (7)フォトレジストを除去して、残っている金及びクロムを再びエッチングして除去する。 (7) The photoresist is removed to remain again etched and removed the gold and chromium are.

【0015】ここで、疎水性相互作用を与えることができる限り、疎水性コーティングを行う目的で種々の材料を使用する事が出来る。 [0015] Here, as long as it can impart hydrophobic interaction, it is possible to use various materials for the purpose of performing a hydrophobic coating. その際に、環状パーフルオロポリマーを用いることが好ましく、商品名CYTOPを用いることが特に好ましい。 In this case, it is preferable to use a cyclic perfluoropolymer, it is particularly preferable to use the trade name CYTOP. その様にして疎水性コーティングを行った面に、クロムと金で蒸着を行う。 On the surface was hydrophobic coating that way, vapor deposition is performed in chrome and gold. この金蒸着層にフォトレジストを作用させ、露光した後に現像を行うことにより、パターン化基板の形状をプリントしたフォトレジスト層を作製する。 The gold-deposited layer by the action of photoresist, by performing development after exposure, to produce a photoresist layer was printed shape of the patterned substrate. そのために、金蒸着層のエッチングを行った際に、感光していない部分のみが除去され、パターン化基板の形状のプリントの通りに溝が形成される。 Therefore, when performing the etching of the evaporated gold layer, only a portion which is not exposed to light is removed, the groove is formed as a patterned substrate in the form of printing. フォトレジストを除去した後に、クロム蒸着層及び疎水性コーティングのエッチングを行って、疎水性コーティングを有さない部分をパターン化基板の溝の形状に作製する。 After removal of the photoresist, and etching of the chromium deposition layer and a hydrophobic coating, to produce a part having no hydrophobic coating to the shape of the grooves of the patterned substrate. それから、残った金蒸着層とクロム蒸着層を除去すると、疎水性コーティングされたサイトと疎水性コーティングされていない溝だけが残り、バターン化基板が作製される(図4)。 Then, upon removal of the remaining gold-deposited layer and the chromium deposition layer, only the grooves that are not sites and hydrophobic coating which is hydrophobic coating remains, Bataan of the substrate is prepared (FIG. 4).

【0016】更に本発明は、上記の方法により作製した生体材料固定化担体とパターン化基板とを、無作為液中自己組織化法を用いて、疎水性相互作用によって固定化することにより、バイオチップを作製する方法である。 [0016] The present invention, and a biomaterial-immobilized carrier and the patterned substrate prepared by the above method, using in random liquid self-assembly method, by fixing by hydrophobic interaction, Bio it is a method of making a chip.
ここで、無作為液中自己組織化法とは、上述したように、回転しているスピンコーター中において、液体に懸濁させた生体材料固定化担体を、パターン化基板上に結合させる方法である(図1)。 Here, the random fluid self-assembly method, as described above, in a spin coater which rotates, were suspended in a liquid biological material immobilized carrier, a way of binding to the patterned substrate there (Fig. 1). パターン化基板上に作製した疎水性被覆のパターンの大きさは、生体材料固定化担体とほぼ同一であるので、1つの基板パターンには1 The size of the pattern of hydrophobic coating prepared in patterned on the substrate, because it is almost identical to the biomaterial-immobilized carrier, the one board pattern 1
つの微小担体しか結合しない、という特質を有する。 One microcarrier only bind have the characteristics of. 本方法において、あるパターンにどの様な微小担体が結合するかは制御されず、無作為である。 In this method, what kind of microcarrier in a pattern are attached is not controlled, it is random.

【0017】更に本発明において、生体材料固定化担体に何らかの識別子を持たせることもまた可能である。 [0017] In addition the present invention, it is also possible to have some identifier to biomaterial immobilization. ここで「識別子」とは、前記担体を区別することを可能とするために前記担体上に記載された指標を、包括的に意味するものである。 Here, the "identifier" is an index that is described on the carrier in order to be able to distinguish the carrier, is intended to mean comprehensively. 本発明において採用している無作為液中自己組織化法においては、生体材料を固定化した担体が基板上のどこに配置されるかを制御することはできない。 In randomized fluid self-assembly method is employed in the present invention, the carrier with immobilized biological material can not be controlled either disposed anywhere on the substrate. そのために、生体材料を固定化した担体に識別子を付与して、各々の生体材料固定化担体が配置された位置を識別することを可能することにより、本発明の有用性は更に高くなる。 Therefore, the biomaterial of the identifier assigned to the immobilized support, by possible to identify the position where each of the biomaterial immobilized carrier is disposed, the utility of the present invention is further increased. よって本発明者らは、何らかの識別子を生体材料固定化担体に付与することにより、その識別子を指標として配置操作後に何がどこに配置されたかを確認するための手段もまた開発した。 Accordingly, the present inventors have found that by providing some identifier to biomaterial immobilization carrier, was also developed means to see what later deployment operation that identifier as an index is placed anywhere.

【0018】下記の実施例においては、フォトリソグラフィーの手法によって生体材料固定化担体が有している金薄膜を部分的に取り除くことにより、識別子を構成するタグの種々のパターンを書き分けて、そのパターンの配列の組み合わせを読み取ることにより各担体の識別を行っている。 [0018] In the examples below, by removing the gold film biomaterial immobilization support by a technique of photolithography has partially been wade through various patterns of tag constituting the identifier, the pattern It is carried out identification of each carrier by reading the combination of the sequence. 即ち、金蒸着をしたカバーガラス基板上にフォトリソググラフィーによりタグを書き込んだ後に、 In other words, after writing a tag by a photolithographic grayed Photography on the cover glass substrate on which the gold deposition,
エッチングにより金薄膜を除去し、タグを構成しているパターンの種々の組み合わせを作製することにより、そのパターンを識別子として機能させた。 The gold thin film is removed by etching, by making various combinations of patterns that constitute the tag, it is made to function the pattern as an identifier. より具体的には、2x5の格子状の微小タイルから成るタグを用いて、1つの微小タイルを1ビットとしてタイルの有無のパターンを二進法の数字に変換することにより、識別のための数字を書き込んだ。 More specifically, by converting with a tag consisting of a lattice-shaped tile of 2x5, one pattern of the presence or absence of tiles tile as 1 bit numbers binary, writing numbers for identification I.

【0019】本発明の識別子は、その他の様々な構成をとることが可能である。 The identifier of the present invention can take various other configurations. 実施例においては格子状の微小タイルのパターンの配列を識別子として採用したが、例えばバーコードの様に並列に配置している複数の線の組み合わせを用いて、それらの線の太さにより識別させることもまた可能であると思われる。 Although in the embodiment employing the arrangement of the pattern of the lattice-shaped tile as an identifier, for example using a combination of a plurality of lines are arranged in parallel like a bar code, it is identified by the thickness of the lines it is also appears to be possible. 生体材料固定化担体上に記載することが可能であって、個々の担体を識別する機能することを可能とする「識別子」としての機能を有する限り、どの様な手段によりパターンを書き分ける方法を用いても、本発明の範囲内であると解されるべきである。 A it can be described in the biomaterial immobilized on a carrier, as long as it has a function as "identifier" which enables them to function identifies the individual carriers, using methods classify and write up a pattern by any kind of means even, it is to be understood that within the scope of the present invention.

【0020】リソグラフィー等の手段により記載される2次元的形状の特徴により識別する手段は、全て本発明の範囲内であると理解されるべきである。 The means for identifying the characteristics of the two-dimensional shape described by means of lithography or the like, it should be understood that all are within the scope of the present invention. 即ち本発明の識別子は、太さ、長さ、大きさの違う図形、またはその組み合わせ、文字、文字に類する形状等により記載されることが可能である。 That identifier of the present invention, thickness, length, shape different sizes, or a combination thereof, letters, can be described by shape similar to the character. 更に2次元的形状のみならず、エッチング深さの様な3次元的形状の他、担体上への堆積や固定化あるいは担体の表面改善によって得られる薄膜の形状、厚み、材質、およびそれらの組み合わせに伴う特徴によって識別する「識別子」によっても本発明の目的を達することが可能であり、本発明の範囲内であると解されるべきである。 Furthermore not only the two-dimensional shape, other three-dimensional shapes, such as etch depth, the shape of the thin film obtained by surface improvement of the deposition and immobilization or support onto the support, the thickness, material, and combinations thereof also by the "identifier" for identifying the characteristics with a can achieve the purpose of the present invention, it is to be understood that within the scope of the present invention.

【0021】また、識別子としての機能を有するパターンを生体材料固定化担体に記載する手段は、実施例において述べているフォトリソグラフィーによるエッチッングに限定されるものではない。 Further, means for describing the pattern which has a function as an identifier to a biomaterial-immobilized carrier is not limited to the Etchinngu by photolithography stated in the examples. パターンを記載する手段のその他の例として、紫外線リソグラフィー、X線リソグラフィー、電子ビームリソグラフィー、レーザーパターニング、集束イオンビームパターニング、スクリーン印刷、スタンプなどの手段考えられる。 Other examples of means for describing the pattern, UV lithography, X-rays lithography, electron beam lithography, laser patterning, focused ion beam patterning, screen printing, conceivable means, such as stamping. しかしそれらに限定されるものではなく、担体に識別子を記載することができる限り、どの様な手段を用いても本発明の範囲内であると解されるべきである。 But not limited to, as long as it can be described an identifier to the carrier, using any kind of means should also be understood to be within the scope of the present invention.

【0022】 [0022]

【実施例】(実施例1) (試薬)CYTOP(cyclized perflu [Example] (Example 1) (reagent) CYTOP (cyclized perflu
oro polymer(CPFP)の商品名、型番: oro trade name of polymer (CPFP), model number:
CTL−809M)またCYTOP溶液剤の(C 4 Of CTL-809M) The CYTOP solutions (C 4
9 )N(型番:CT−Solv180)は旭化成のものを用いた。 F 9) N (model number: CT-Solv180) was used as the Asahi. 3,3'−ジチオジプロピオン酸は、PF 3,3'-dithiodipropionic acid, PF
ALTZ&BAUER社のものを用いた。 It was used of ALTZ & BAUER company. 基板超音波洗浄用のアセトン、NHS(N−ヒドロキシコハク酸イミド)、アビジン(分子量67000、卵白由来)、トリス、塩化ナトリウム、エタノール、ヨウ化カリウム、水酸化ナトリウム、フェリシアン化カリウムは和光純薬工業のものを用いた。 Acetone board ultrasonic cleaning, NHS (N-hydroxysuccinimide), avidin (molecular weight 67000, from egg white), tris, sodium chloride, ethanol, potassium iodide, sodium hydroxide, potassium ferricyanide is the Wako Pure Chemical Industries, using things. EDC(塩酸1−エチル−3−(3 EDC (1-ethyl-3- (3
−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド)は東京化成工業のものを用いた。 - dimethylaminopropyl) carbodiimide) was used as the Tokyo Chemical Industry.

【0023】生体材料としては、5'末端に各々ビオチン及びFITCを修飾した0.2μMスケールの二重螺旋DNAをニッシンボーに委託合成した。 [0023] The biological material, 5 'of 0.2μM scale respectively modified biotin and FITC-terminated double helix DNA was entrusted synthesized Nissin baud. 塩基配列は各々、5'−GAAAAAAAATGACGTCATCC Each nucleotide sequence, 5'-GAAAAAAAATGACGTCATCC
G−3'(CRE(21bp))、5'−AGGAAT G-3 '(CRE (21bp)), 5'-AGGAAT
(20bp))、そして5'−GAAAAAAAATG (20bp)), and 5'-GAAAAAAAATG
TTGGCA−3'(CRE−random(41b TTGGCA-3 '(CRE-random (41b
p))である。 A p)). ポジ型レジストのOFPR−800とその専用現像液のNMD−3;2.38(産業用)は東京応化工業のものを用いた。 NMD-3 of OFPR-800 positive resist and a private developer thereof; 2.38 (industrial) was used as the Tokyo Ohka Kogyo. ヨウ素は岸田化学のものを用いた。 Iodine was used Kishida Chemical. 基板洗浄用溶媒には、電子工業用(関東化学)アセトンを、その他の試薬には化学・生化学用特級またはその相当品を用いた。 The substrate washing solvent, for the electronics industry (the Kanto Chemical) acetone, using chemical-biochemical grade or equivalent to other reagents. 水はクリーンルームプロセスでは超純水(18.0MΩ・cm)を、その他の場合は蒸留水(49.5×10 -6 Scm,pH4.86)を用いた。 Water is a clean room processes ultrapure water (18.0MΩ · cm), otherwise distilled water (49.5 × 10 -6 Scm, pH4.86 ) was used.

【0024】(カバーガラスの微小加工およびパターン化した基板の作製)カバーガラスの微小加工の微細加工についての模式図を、図2に示した。 [0024] The micro-machining (fine machining and patterned for manufacturing a substrate of the cover glass) cover glass a schematic view of the microfabrication, shown in FIG. まず、カバーガラス基板(0.10〜0.12mm、18mm×18m First, a cover glass substrate (0.10~0.12mm, 18mm × 18m
m、西ドイツ)の表面は超音波洗浄器(W−222、H m, the surface of West Germany) is an ultrasonic cleaner (W-222, H
onda)を用いて純水、アセトン、純水の順にそれぞれ30分間洗浄した。 Pure water using a onda), and washed for 30 minutes each acetone, then with pure water. そして、カバーガラスの片面はスピンコーター(1H−D3、MIKASA)により50 Then, one surface of the cover glass by a spin coater (1H-D3, MIKASA) 50
0rpmで10秒、1000〜4000rpmで20秒にして、(C 49 )Nの溶剤液で0.45〜9重量% 10 seconds at 0 rpm, and 20 seconds at 1000~4000rpm, 0.45~9 wt% in a solvent solution of (C 4 F 9) N
の濃度に希釈させたCYTOPをピペットで100μL 100μL a CYTOP which was diluted to the concentration pipetted
滴下させることによって0.5〜2.0μmの厚さでコーティングして疎水性にした。 And hydrophobic coated with a thickness of 0.5~2.0μm by dropping.

【0025】次に、115℃の恒温オーブン(DS6 Next, 115 ℃ constant temperature oven (DS6
4、ヤマト科学)の中に入れて4時間ハードベーキングした。 4, was 4 hours, hard baking put into the Yamato Scientific). そして、その反対面上にタングステンボートを用いる抵抗加熱型の小型真空蒸着装置(SVC−700T The resistance heating-type small vacuum evaporation apparatus using tungsten boat on its opposite surface (SVC-700T
URBO−TM、サンユウ)を用いてクロムを厚さ約2 URBO-TM, Sanyu) having a thickness of about 2 chromium using
00オングストローム蒸着し、その後真空を破ることなく続けて金(純度99.99%、フルヤ金属)を厚さ約2000オングストローム蒸着した。 And 00 angstrom vapor deposition, and then continued without breaking the vacuum gold (purity of 99.99%, Furuya metal) was a deposition thickness of about 2000 angstroms. 膜厚は水晶振動子(6MHz PKG10、LEYBOLD INFIC The film thickness crystal oscillator (6MHz PKG10, LEYBOLD INFIC
ON)を用いる膜厚モニター(TM−200R、Max Thickness using ON) Monitor (TM-200R, Max
tek)で測定し、蒸着速度をクロムの場合は0.5〜 Measured in tek), 0.5~ if the deposition rate of chromium
1.0オングストローム/sで、金の場合は5.0〜1 1.0 angstrom / s, in the case of gold from 5.0 to 1
0.0オングストローム/sの範囲になる様に調節した。 It was adjusted so as to be in the range of 0.0 Å / s. 真空度はイオン真空ゲージ(ULVAC GI−T The degree of vacuum ion vacuum gauge (ULVAC GI-T
L3)で測り、10 -6 torrから開始した。 Measure in L3), it was started from 10 -6 torr. 蒸着後、 After the deposition,
アニーリング等の処理は施さなかった。 Processing such as annealing was not performed.

【0026】金蒸着のカバーガラス基板上に、図3のような過程でチオール誘導体およびアビジンを介して5' [0026] on the cover glass substrate of gold deposited, 5 through a process thiol derivatives and avidin as shown in FIG. 3 '
末端にビオチン修飾したDNAを固定した。 Fixing the biotin modified DNA end. まず、1m First of all, 1m
M濃度の3、3'−ジチオジプロピオン酸水溶液3mL Of M concentration 3,3'-dithiodipropionic acid solution 3mL
の中に金蒸着のカバーガラスを室温で20分間浸した。 Coverslips gold deposited was immersed for 20 minutes at room temperature in the.
水溶液に100mg/mLの濃度にしたNHSとEDC NHS to give a concentration of 100 mg / mL in an aqueous solution and EDC
を混合液としてカルボキシル酸と30分反応させた後乾燥させた。 The dried After carboxylic acid and 30 min the reaction as a mixed solution. アビジンを緩衝液(pH7.9、10mMトリス−塩酸、0.2M塩化ナトリウム)で0.2mg/ Avidin buffer (pH 7.9 Tris - HCl, 0.2 M NaCl) at 0.2 mg /
mLとなるように調製した1mLの溶液に1時間浸して置いた。 Placed soaked 1 hour in a solution of the prepared 1mL so that mL. 1M濃度のエタノールアミン水溶液1mLにカバーガラスを30分間浸して未反応のカルボキシル基を不活性化した。 To 1M concentration of the ethanolamine solution 1mL soak the cover glass 30 minutes unreacted carboxyl groups were inactivated. アビジン修飾した金を緩衝液(pH7. Avidin-modified gold buffer (pH7.
9、10mMトリス−塩酸、0.2M塩化ナトリウム) 9,10mM Tris - hydrochloric acid, 0.2M sodium chloride)
にビオチン化DNAを1μMになるようにした1mLの溶液に25℃で30分間浸して置いた。 Biotinylated DNA was placed immersed for 30 minutes at 25 ° C. to a solution of 1mL that was set to 1μM to. ここで、ビオチン化DNA鎖はアビジン分子の4つの結合サイトの1つと結合する。 Here, the biotinylated DNA strand to one binding of the four binding sites for avidin molecule. ビオチン化DNAの固定量はDNA溶液に浸す時間により制御できた。 A fixed amount of biotinylated DNA was be controlled by time soaking in the DNA solution.

【0027】そして、図2の4番目に示すようにビオチン化DNA修飾したカバーガラスを粘着性のダイシングテープ(Adwill D−210、LINTEC)に付けた後ダイシングンマシン(A−WD−10A、東京精密)を用いてダイヤモンドカッタ(52D−0.1T [0027] Then, a dicing down machine (A-WD-10A after applying the biotinylated DNA modified coverslip as shown in the fourth FIG sticky dicing tape (Adwill D-210, LINTEC), Tokyo diamond cutter using a precision) (52D-0.1T
−40H、アサヒダイヤモンド)で0.5mm/sの速度で純水を注ぎかけながら100〜400μm角の大きさに切り分けて数多くのビオチン化DNAを修飾した微小担体が作製できた。 -40H, Asahi Diamond) at 0.5 mm / s rate in a number of microcarriers having a modified biotinylated DNA is cut into the size of 100~400μm angle while applying pouring pure water could be produced. その後、5分間ダイシングテープにUV照射して粘着性をUV照射前19600mN/2 Then, before UV irradiation to tack UV irradiating for 5 minutes dicing tape 19600mN / 2
5mm(カタログ値)からUV照射後250mN/25 5mm after UV irradiation from the (catalog value) 250mN / 25
mmに落として担体が取れ易くした。 It was easy to take the carrier off to mm. この工程によりチオール誘導体およびアビジンを介して5'末端にビオチン修飾したDNAを固定した1000〜8000個位の微小担体を作製することができた。 It could be produced 1000-8000 units position of microcarrier fixing the DNA with biotin-modified at the 5 'end via a thiol derivative and avidin this process.

【0028】パターン化した基板の作製についての模式図を図4に示した。 [0028] The schematic diagram of the production of patterned substrate shown in FIG. まず、マイクロスライドガラス基板(1.2〜1.5mm、76mm×26mm、S−12 First, micro slide glass substrates (1.2~1.5mm, 76mm × 26mm, S-12
25、マツナミガラス)をダイヤモンドカッターで3等分した後その表面は超音波洗浄器を用いて純水、アセトン、純水の順にそれぞれ30分間洗浄した。 25, the surface after the Matsunami Glass) was divided into three equal parts with a diamond cutter was washed for 30 minutes each pure water, acetone, then with pure water using an ultrasonic cleaner. そして、スライドガラスの片面にスピンコーターにより500rp Then, 500Rp by a spin coater on one surface of the slide glass
mで10秒、1000〜4000rpmで20秒間、 10 seconds m, 20 seconds 1000~4000Rpm,
(C 49 )Nの溶剤液で9重量%の濃度に希釈させたCYTOPをピペットで100μL滴下することによって、0.5〜2.0μmの厚さで疎水性にコーティングした。 By the (C 4 F 9) CYTOP which was diluted to a concentration of 9 wt% with a solvent solution of N to 100μL pipetted, it was coated on the hydrophobic with a thickness of 0.5 to 2.0 [mu] m. 次に115℃の恒温オーブン中に入れて4時間ハードベーキングした。 Next 4 hours the hard bake placed in a constant temperature oven at 115 ° C.. この上にクロムと金を各々約20 Each about 20 of chromium and gold on the
0オングストロームと2000オングストロームに蒸着した。 It was deposited to 0 angstroms and 2000 angstroms.

【0029】金を蒸着したスライドガラス基板に対し、 [0029] On the other slide glass substrate with a deposit of gold,
クラス10のクリーンルームでポジ型のフォトレジストのOFPR−800を7〜8滴落としてスピンコート(1H−DXII、ミカサ)し、(1回目:500rp Spin coating (1H-DXII, Mikasa) and OFPR-800 clean room of positive photoresist Class 10 dropped 7-8 drops, and (first time: 500Rp
m/10秒、スロープ:10秒、2回目:4000rp m / 10 seconds, slope: 10 seconds, the second time: 4000rp
m/20秒、スロープ:5秒)、プリベーク(80℃、 m / 20 sec, the slope: 5 seconds), pre-baked (80 ° C.,
30分)(DK300、ヤマトサイエンティフィック) 30 minutes) (DK300, Yamato Scientific)
の後、マスクアライナー(MJB3 UV400、Ka After, a mask aligner (MJB3 UV400, Ka
rl Suss)を用いて8秒間露光し、現像液のNM Exposed for 8 seconds using a rl Suss), NM developer
D−3に30秒間浸して現像した後、超純水で2度洗い流した後窒素ガスを吹かして乾燥させた。 After developing immersed in D-3 30 seconds and dried by smoking a nitrogen gas after washing twice with ultrapure water.

【0030】ポストベーク(80℃、30分)の後、金のエッチング液(ヨウ化カリウム40g、ヨウ素10 The post-baking (80 ° C., 30 minutes) after the etchant gold (potassium iodide 40 g, iodine 10
g、水400mL)で金のエッチングを行い、超純水で2度洗い流した後窒素ガスを吹かして乾燥させた。 g, water 400 mL) etched gold, and dried smoking a nitrogen gas after washing twice with ultrapure water. ついで、アセトン洗浄でフォトレジストを除去した後2度洗い流した後窒素ガスを吹かして乾燥させた。 Then dried by smoking a nitrogen gas after washing twice after removing the photoresist with acetone wash. 続けて、クロムのエッチング液(水酸化ナトリウム40g、フェリシアン化カリウム100g、水400mL)でクロムのエッチングを行い、超純水で2度洗い流した後窒素ガスを吹かして乾燥させた。 Subsequently, it performed etchant chromium (sodium hydroxide 40 g, potassium ferricyanide 100 g, water 400 mL) etching chromium and dried smoking a nitrogen gas after washing twice with ultrapure water. また、2×10 -5 Torr以下で酸素プラズマ(ISCCM、500V、イオン化密度1.0mA/cm 2以下、RF power 100 The oxygen plasma below 2 × 10 -5 Torr (ISCCM, 500V, ionization density 1.0 mA / cm 2 or less, RF power 100
W)(EIS−200ER、ELIONIX)を2分間照射することによりCYTOPをエッチングさせた。 W) (EIS-200ER, was etched CYTOP by irradiating ELIONIX) 2 min. 再び、残っているクロムと金を全部エッチングさせた。 Again, the chromium and gold remaining was all etching. この工程によりスライドガラスの片面に親水性および疎水性部分に分けて数多くのサイトを作製することができた。 Could be produced a number of sites is divided into one surface hydrophilic and hydrophobic portions of the slide glass by this process.

【0031】(パターン化した基板上への担体の固定) [0031] (fixed carrier to patterned substrate)
パターン化した基板上に微小加工した担体を疎水性相互作用による無作為液中自己組織化法で付けるためスピンコーターの回転部に図1の様にシャーレを載せ、その中央部にパターン化した基板を固定してから純水を貯めた。 Place the dish as in Figure 1 minute processed carrier patterned substrate to the rotating part of the spin coater for applying a random solution self-assembly method by hydrophobic interaction, and patterned at its center substrate securing the had saved the pure water from. ここに150−400個の担体を入れると水上に浮くので300rpmで6分間回転させると担体が重力、 Here, since the float on water when put 150-400 amino carrier is rotated for 6 minutes at 300rpm the carrier gravity,
遠心力および疎水性相互作用による担体群の無作為液中自己組織化によりパターン化した基板に付いた。 With the patterned substrate by random solution self-assembly of the centrifugal force and the vehicle group by hydrophobic interaction.

【0032】図1は、無作為液中自己組織化法を用いた疎水性相互作用によるパターン化した基板への担体の固定化により作製した、DNAチップアレイの模式図を現わす。 [0032] Figure 1 was made by immobilizing the carrier to patterned substrate by hydrophobic interaction using in random liquid self-assembly method, Wath a schematic view of a DNA chip array current. パターン化した基板の疎水性部分にビオチン化D Biotinylated D in the hydrophobic portion of the patterned substrate
NA修飾した担体の疎水性部分が疎水性相互作用により数多くの所で付いてDNAチップアレイになる。 The hydrophobic portion of NA modified carrier is DNA chip array with a number of places by hydrophobic interaction.

【0033】一方、懸濁液に化学、生化学的に性質が異なる生体材料を固定化した担体の混合物を用いれば、最終的に他種類の生体材料を密に固定化したDNAチップアレイを得ることができる。 On the other hand, the use of the suspension to a chemical, a mixture of biochemically carrier properties with immobilized different biomaterials, to finally obtain DNA chip array densely immobilize other types of biomaterials be able to. 作製したDNAチップアレイに図3の最後の部分のようにビオチン化DNA修飾した担体に緩衝液(pH7.9、10mMトリス−塩酸、 Buffer biotinylated DNA modified carrier as the last part of Figure 3 the prepared DNA chip array (pH 7.9 Tris - HCl,
0.2M塩化ナトリウム)にFITC修飾したDNAを適当な濃度にして1mLの溶液に60℃で30分間浸して置いて二重螺旋を結合させた。 The FITC modified DNA in 0.2M sodium chloride) in the appropriate concentration at soaked for 30 minutes at 60 ° C. to a solution of 1mL was bound to a double helix. 二重螺旋DNAが結合したかは暗室でFITC用蛍光フィルター付きの蛍光顕微鏡(励起光450〜490nm、吸収光515〜56 Double helix DNA is bound or fluorescence microscope with FITC fluorescent filters in a dark room (excitation light 450-490 nm, absorbing light 515-56
5nm、分光510nm)(LEICAMZ FLII 5nm, the spectral 510nm) (LEICAMZ FLII
I、Leica)で励起させると蛍光が確認でき、その明るさによっても濃度がわかる。 I, and is excited by Leica) fluorescence can be confirmed, it is understood that concentration also by its brightness.

【0034】(疎水性相互作用力の測定)パターン化した基板のCYTOP面上に微細加工した担体が疎水性相互作用により、どの位の力で固定化されているかを調べるため図5のようにスピンコーターの回転部にシャーレを載せ、その中央部にパターン化した基板を動かないように固定化してから純水を貯めた。 [0034] (Measurement of hydrophobic interaction forces) patterned microfabricated carrier CYTOP plane of the substrate by hydrophobic interactions, as shown in FIG. 5 to examine whether the immobilized in how much force Place the dish in the rotating part of the spin coater was pooled pure water from the immobilized so as not to move the patterned substrate at its center. ここにCYTOPの溶剤液の(C 49 )Nに0.45〜9.0重量%の濃度に希釈したCYTOPを1000〜4000rpmの速度で0.5〜2.0μmの厚さにスピンコーティングした150〜400個の担体を入れて300rpmで6 Here CYTOP solvent solution of (C 4 F 9) spin coating a CYTOP diluted to a concentration of 0.45 to 9.0% by weight N to a thickness of 0.5~2.0μm at a rate of 1000~4000rpm 6 300rpm put 150 to 400 pieces of carriers was
分間回転させると担体が重力、遠心力および疎水性相互作用による担体群の無作為液中自己組織化によりパターン化した基板のCYTOP面に付いた。 Rotating carrier with gravity, the CYTOP surface of the substrate was patterned by random solution self-assembly of a carrier group by the centrifugal forces and hydrophobic interactions min. そして、図1のDNAチップアレイの拡大図の様に、担体の金の面ではなくCYTOP面がパターン化した基板のCYTOP面に接する担体数をカウンターで数えて疎水性相互作用力が測られた。 Then, like the enlarged view of DNA chip array in Figure 1, hydrophobic interaction forces the number of carriers in contact with CYTOP surface of the substrate CYTOP surface rather than the surface was patterned gold carrier counted at the counter is measured . ついで、100〜900rpmの間で6分間スピンコーターを回転させて遠心力および疎水性相互作用力によりパターン化した基板上の担体がどれ程付いているか、図1の上記の拡大図のようにパターン化した基板のCYTOP面から剥離した担体の数を数えて測った。 Pattern then either carrier on a plate which was patterned by a centrifugal force and hydrophobic interaction force by rotating the 6 min spin coater between 100~900rpm is attached how much, as in the above enlarged view of FIG. 1 measured by counting the number of carriers peeled from CYTOP surface of phased substrate. 疎水性相互作用の結合力の測定を示した図を、図5 A diagram showing the measurement of the bond strength of the hydrophobic interactions, 5
に示す。 To show.

【0035】(接触角の測定)動的接触角(DCA、d [0035] (Measurement of the contact angle) dynamic contact angle (DCA, d
ynamic contact angle)の測定により高分子固体が空気中から水中へあるいは水中から空気中へ移行する時の表面における分子鎖と分子鎖の凝集状態の再編成挙動が評価される。 ynamic contact angle measured by polymer solids) is evaluated reorganization behavior state of aggregation of the molecular chains and the molecular chains in the surface when migrating from the water or into water from air into the air. そこで、ここでは「動的Wilhelmy平板法」の原理によりCYTOP基板の疎水性程度を測るため動的接触角(DCA−10 Therefore, where dynamic contact angle to measure the hydrophobicity of about CYTOP substrate by the principle of "dynamic Wilhelmy plate method" (DCA-10
0、オリエンテック)を測定した。 0, was measured Orientec). まず、カバーガラス基板の両面上に0.45〜9.0重量%濃度のCYTO First, CYTO of 0.45 to 9.0 wt% concentration on both sides of the cover glass substrate
Pを1000〜4000rpmの濃度で0.5〜2.0 The P at a concentration of 1000~4000rpm 0.5~2.0
μmの厚さにスピンコーティングさせた。 It was spin-coated to a thickness of μm. 次に115℃ Then 115 ℃
の恒温オーブンの中に入れて4時間ハードベーキングした。 For 4 hours, hard baking placed in a constant temperature oven. そして、CYTOPの動的接触角を測定した。 Then, to measure the dynamic contact angle of the CYTOP. 動的接触角の測定は25℃で純水の液体中にカバーガラスを20.0mm/分の速度に保ちながら浸潰−引き上げを3回行ってその平均値を取った。 Measurement of the dynamic contact angle Hita潰 while keeping the cover glass on the speed of 20.0 mm / min while the pure water liquid at 25 ° C. - took an average value by performing three times pulling a. この時の浸潰−引き上げに要する力を高感度荷重検出器を用いて動的接触角を測定した。 At this time of Hita潰 - and the force required for pulling measuring the dynamic contact angle by using a high-sensitivity load detector.

【0036】(疎水性相互作用による担体の固定)無作為液中自己組織化法を用いて疎水性相互作用によりパターン化した基板上に微小加工した担体を付けるためにスピンコーター装置を使い、その回転部にシャーレを載せ、その中央部にパターン化した基板を固定してから純水を貯めた。 The use of a spin coater apparatus for applying micro processed carrier patterned on the substrate by hydrophobic interactions with the random solution self-assembly method (fixed carrier by hydrophobic interactions), the Place the dish in the rotating part, it was pooled pure water after fixing the substrate was patterned in the center portion. ここに150〜400個の担体を入れると水面に担体が群れになって集まって浮くので、300r Since the carrier on the surface of the water when this item is 150 to 400 pieces of the carrier floats gathered become a herd, 300r
pmで6分間回転させると重心、遠心力および疎水性相互作用により担体群パターン化した基板上部分に付いた。 Rotating 6 minutes pm with the center of gravity, the substrate moiety support group patterned by centrifugal force and hydrophobic interactions. 図6に、パターン化基板上に担体が結合している写真を示す。 6 shows a photograph of carrier is bonded to the patterned substrate. 図6において疎水性相互作用により、基板の疎水性パターンの部分に、単体が固定されていることが見られる。 By hydrophobic interaction in FIG. 6, the portion of the hydrophobic pattern on the substrate, that alone is fixed seen. また、図6の(a)に担体を正面から見た写真を、(b)に担体を側面から見た写真を、(c)に担体を斜めから見た写真を、それぞれ示す。 Further, the photographs viewed carrier from the front in FIG. 6 (a), a photograph viewed carrier from the side (b), the pictures viewed carrier obliquely from (c), the respectively.

【0037】また、懸濁液に化学、生化学的に性質が異なる生体材料を固定化した担体の混合物を用いれば、多種類の生体材料を密に固定化した多項目測定及び高集積アレイ型DNAチップアレイを得ることができる。 Further, the chemical to the suspension, by using a mixture of biochemically carrier properties with immobilized different biomaterials, multi-measuring and integration array densely immobilized many types of biological material it is possible to obtain a DNA chip array. まず、異なる生体材料を基板に固定させた後、担体を作製する。 First, after fixing the different biomaterial substrate, to produce a carrier. ついで、担体の混合物を用いて無作為液中自己組織化法を用いた疎水性相互作用によりパターン化した基板上に固定して、最終的に新しい多項目測定及び高集積DNA化チップアレイを作製することができる。 Then, the carrier mixture is fixed randomly solution patterned on the substrate by hydrophobic interaction using the self-organization method using the, producing finally a new multi-measuring and high integration DNA Chip Array can do.

【0038】図7に、ビオチン化したCRE、Rand [0038] FIG. 7, biotinylated CRE, Rand
om、CRE−Randomをそれそれ固定化した担体上に、それらと相補的なFITC修飾したDNAを結合させた時の蛍光を検出した結果を示す。 om, the CRE-Random thereto it immobilized on a carrier, it shows fluorescence result of detection of when coupled them with complementary FITC modified DNA. 上段はCREを固定化した担体に、3種類のFITC修飾したDNAを添加した結果であり、CREに相補的なDNAを結合させた左側の写真のみに蛍光が検出された。 The carrier upper part of immobilizing CRE, a three FITC modified DNA results obtained by adding, fluorescence was detected only in the photograph of the left bound with DNA complementary to CRE. 中段はRan The middle is Ran
domを固定化した担体に、3種類のFITC修飾したDNAを添加した結果であり、Randomに相補的なDNAを結合させた、真ん中の写真のみに蛍光が検出された。 dom to immobilized carrier, the result of adding three kinds of FITC modified DNA, was coupled DNA complementary to Random, fluorescence was detected only in the photograph in the middle. 下段はCRE−Randomを固定化した担体に、3種類のFITC修飾したDNAを添加した結果であり、CRE−Randomに相補的なDNAを結合させた右側の写真のみに蛍光が検出された。 Lower the carrier with immobilized CRE-Random, the result of adding three kinds of FITC modified DNA, fluorescence was detected only on the right side of the photograph bound with DNA complementary to CRE-Random. これにより、 As a result,
本発明の方法により作製されたDNAが固定化された担体において、固定化されたDNAに特異的な相補的DN In support fabricated DNA is immobilized by the method of the present invention, complementary DN specific for immobilized DNA
Aが結合することが示された。 A was shown to bind.

【0039】(疎水性相互作用力の測定)無作為液中自己組織化を用いた疎水性相互作用により図1のようにパターン化した基板に担体の金の面ではなくCYTOP面が接する確率とパターン化した基板に担体がどれ程の力で固定されているか図5のようなスピンコーター装置を用いて遠心力と流速によりパターン化した基板から担体が剥離する割合を調べた。 The probability of (hydrophobic interaction force measurements) CYTOP surface rather than by hydrophobic interaction using the random liquid self-organization in terms of gold carrier patterned substrate as in FIG. 1 is in contact carrier from the substrate was patterned by the centrifugal force and flow rate, such using a spin coater as if FIG patterned carrier substrate is fixed with a force of about which examined the rate of peeling. 結果を図8に示す。 The results are shown in Figure 8. まず、 First of all,
9.0重量%濃度でCYTOPをコーティングしたパターン化した基板と担体に対してパターン化した基板に担体の金の面ではなくCYTOP面が接する確率は80% 9.0% strength by weight in coating a CYTOP was patterned substrate and the probability that the CYTOP surface not in contact with the surface of the gold patterned carrier substrate against the carrier 80%
位であったが、カバーガラスにCYTOPをコーティングしないと40%位まで下がり、パターン化した基板と担体共に疎水性に処理するより接する確率はずっと劣る。 Although a it was the position, down to the 40% position uncoated CYTOP the cover glass, the probability of contact than treated hydrophobic patterned substrate and support both the inferior much. また、パターン化した基板と担体共に親水性に処理すると担体の親水性部分が接する確率は70%位で、疎水性に処理した基板より劣った。 Further, when processed hydrophilic patterned substrate and the support both the probability that the hydrophilic portion of the carrier contact the 70% position, inferior substrates treated hydrophobic.

【0040】次に、疎水性相互作用によりパターン化した基板に担体がどれ程の力で固定化されているかを、C Next, whether or carrier substrate was patterned by hydrophobic interaction is immobilized by the force of how much, C
YTOPの濃度を0.45〜9.0重量%に変えてコーティングしたパターン化した基板と150〜400個の担体に対して調べて、その結果を図9に示した。 Examine respect coated patterned substrate with 150 to 400 amino carrier by changing the concentration of YTOP to 0.45 to 9.0 wt%, and the results are shown in Figure 9. 9.0 9.0
重量%濃度のCYTOPをコーティングしたパターン化した基板と担体に対しては100〜900rpmの間でスピンコーターの遠心力と流速によってもパターン化した基板上に担体が95%以上まで付いていることが判る。 Have a weight% concentration of the carrier on a plate which was patterned by centrifugal force and flow rate of the spin coater between 100~900rpm for coated patterned substrate and carrier CYTOP of are marked up more than 95% understood. また、パターン化した基板と担体にCYTOPの濃度を薄めるか違うように(各々0.45と9.0 重量%)してコーティングすると担体のパターン化した基板への固定力が80〜90%位まで低くなったが、同じ濃度と厚さによっては結合力の差はほぼなかった。 Also, patterned substrate and carrier as different or dilute the concentration of the CYTOP (each 0.45 and 9.0 wt%) to the coating to the patterned fixing force to the substrate carrier 80 to 90% position until becomes lower, but the difference between the binding force was almost no the same concentration and thickness. 一方、 on the other hand
CYTOPをコーティングしなかったカバーガラス(親水性)に対しては疎水性相互結合力は30%以下まで下がってしまい、疎水性相互作用力が劣ることが判る。 Hydrophobic interactions avidity to the cover glass was not coated with CYTOP (hydrophilic) is cause down to 30% or less, it can be seen that the hydrophobic interaction force is inferior. そして、パターン化した基板と担体共に親水性に処理すると親水性相互作用力は50%位まで下がってしまい、疎水性相互作用力より劣ることが判った。 The hydrophilic interaction force when treated hydrophilic patterned substrate and support both the cause down to 50% position was found to be inferior to hydrophobic interaction forces. 以上の結果により本研究ではパターン化した基板と担体に9.0重量% 9.0 wt% to the substrate carrier in the present study was patterned by the above results
濃度のCYTOPを4000rpmでコーティングに利用した。 Using CYTOP of concentration in the coating at 4000rpm.

【0041】(接触角の測定)CYTOPのコーティング濃度により担体とパターン化した基板の疎水性相互作用力が違うので、カバーガラス両面にCYTOPをコーティングしてCYTOPの動的接触角を測ってその結果を図10に示した。 [0041] (Measurement of contact angle) The hydrophobic interaction forces of a substrate on which a carrier with patterned by coating the concentration of CYTOP is different, the results by measuring the dynamic contact angle of the CYTOP coating the CYTOP the cover glass sided It is shown in Figure 10. カバーガラスのみの動的接触角は7 The dynamic contact angle of the cover glass only 7
4.2°であった。 4.2 was °. また、0.45〜9.0重量%のC Further, 0.45 to 9.0 wt% of C
YTOPの濃度別の動的接触角は84.3〜88.7° Concentration another dynamic contact angle of YTOP is 84.3 to 88.7 °
で、濃度が高まると強くなった。 In, it grew stronger when the concentration is increased. 一方、図10から判るように9.0重量%濃度のCYTOPを1000〜40 On the other hand, the CYTOP of 9.0 wt% concentration as can be seen from FIG. 10 1000-40
00rpmの速度でスピンコーティングすると動的接触角は88.3〜88.9°で、その差はあまりなかった。 The dynamic contact angle when spin coating at a speed of 00rpm at from 88.3 to 88.9 °, the difference was not so much.

【0042】この結果は担体とパターン化した基板が疎水性相互作用により固定されており、またCYTOPの濃度が高まると図10のようにパターン化した基板と担体の疎水性相互作用が強くなることを示唆する。 [0042] This result substrate which was the carrier and the patterned is fixed by hydrophobic interaction, also be hydrophobic interactions patterned substrate and the carrier as shown in FIG. 10 when increasing the concentration of the CYTOP is strong It suggests. また、 Also,
CYTOPの濃度が低くなると付く力が弱まることが判る。 Concentration of CYTOP it can be seen that weakened the power to stick to be lower.

【0043】本発明により、厚膜用CYTOPを用いて作製したパターン化疎水性膜を有する基板に、DNAを固定化してダイシングにより得た微小担体を液中で無作為液中自己組織化法を用いた疎水性相互作用により、任意の位置に配置することができた。 [0043] The present invention, on a substrate having a patterned hydrophobic film fabricated using the thick film CYTOP, randomized fluid self-assembly method microcarrier obtained by dicing with immobilized DNA in a liquid to by hydrophobic interaction using, it could be placed anywhere. このDNA反応を蛍光によって確認することができた。 The DNA reaction can be confirmed by fluorescence. また、液中でのパターン化疎水性膜と担体との疎水性相互作用力は他の作用力より優れていて、多項目測定用の高集積型DNAチップアレイとして応用可能な技術であることが示された。 Further, it hydrophobic interaction force between the patterned hydrophobic membrane with a carrier in liquid is better than the other acting force, is applicable technology as a high-integrated DNA chip arrays for multi-measuring It was shown.

【0044】実施例1においては、新しい生体材料固定化方法は配置直後にどの材料がどこに配置されたかの情報が失われている。 [0044] In Example 1, a new biomaterial immobilization methods have information on which material disposed where the is lost immediately after placement. 生体材料そのものの応答を用いてキャリブレーション等により最終的な位置が確認できるほか、微小担体に対する配置前に別のマーキング操作を施しておくか色々の形を取っておけば、最終的な位置を知ることが可能となる。 Using the response of the biological material itself Guests can check the final position by the calibration or the like, if taking or various forms previously subjected to another marking operation prior to deployment against the microcarrier, the final position it is possible to know to become. 一方、より多くの担体を配置、固定化するために安定なパターン化疎水性膜の形状を作製していく必要がある。 On the other hand, placing more carriers, it is necessary to prepare a form of stable patterned hydrophobic membrane to immobilize. そこで、下記の実施例2において、個々の微小担体の識別を可能とするタグを付与したバイオチップの作製を試みた。 Therefore, in Example 2 below, it was tried to prepare a biochip assign tags to allow identification of individual microcarrier. 更に、実施例2においては微小担体との壁を基板上に作製し、配置時の安定性の向上をはかった。 Further, in the second embodiment to produce a wall of the microcarrier on the substrate, thereby improving the arrangement when the stability.

【0045】(実施例2) (微小担体の作製)微小担体を作製するカバーガラス(0.04〜0.06mm,30mmx30mm)を、 [0045] (Example 2) (Preparation of microcarriers) cover glass to produce a microcarrier (0.04~0.06mm, 30mmx30mm),
超音波洗浄器を用いて純水、アセトン、純水の順にそれぞれ30分間洗浄した。 Pure water using an ultrasonic cleaner, and washed for 30 minutes each acetone, then with pure water. カバーガラスの一方をCYTO CYTO one of the cover glass
P(9.0重量%、0.5μm)でスピンコートした。 P (9.0 weight%, 0.5μm) was spin-coated with.
カバーガラスを115℃で4時間ベーキングした。 Cover glass was 4 hours and baked at 115 ° C.. クロム層(0.5〜1.0オングストローム/s,200オングストローム)と金層(5.0〜10.0オングストローム/s,2000オングストローム)を、もう一方の面に蒸着した。 Chromium layer (0.5 to 1.0 Å / s, 200 Å) and gold layer (5.0 to 10.0 Å / s, 2000 Angstroms) was deposited on the other side. フォトリソグラフィーを用いてネガ型のフォトレジスト(OMR83)を作用させて微粒子にタグを与え、ホットプレート上で100℃で1分間ベーキングした。 By applying a photoresist (OMR83) of negative given tag microparticles using photolithography, and baked for 1 minute at 100 ° C. on a hot plate. フォトマスクを通じて、UV光(MJB3 Through the photo-mask, UV light (MJB3
UV400、カールザーツ)をレジスト膜に4秒間照射した。 UV400, Karuzatsu) was irradiated for 4 seconds on the resist film. OMR現像液で現像し、洗浄して窒素ガスで乾燥させた。 Developed with OMR developer, washed and dried with nitrogen gas. 100℃で1分間ベーキングした後、金のエッチング液(KI:I 2 :H 2 O=4:1:40)とクロムのエッチング液(NaOH:K After baking for 1 minute at 100 ° C., the etching solution of gold (KI: I 2: H 2 O = 4: 1: 40) as the etching solution of chromium (NaOH: K 3 [Fe(CN) 3 [Fe (CN)
6 ]:H 2 O=2:5:20)の中で30秒間エッチングを行った。 6]: H 2 O = 2 : 5: 20) for 30 seconds etching was carried out in the. 剥離したOMR層のエッチングを行い、金表面を酸素プラズマ(67Pa,100SCCM,20 Etching is performed peeled OMR layer, a gold surface oxygen plasma (67 Pa, 100 SCCM, 20
0W)に5分間暴露して親水性とした。 Was a hydrophilic were exposed 5 minutes to 0W). 切断するために、カバーガラスを粘着テープに固定した。 To cut to secure the cover glass to the adhesive tape. ダイシングマシーンを用いて、カバーガラスを100〜400μm By using a dicing machine, 100~400μm the cover glass
の微小担体に切断した。 It was cut into small carrier. UV光を粘着テープに5分間照射して、微粒子を剥離した。 Was irradiated for 5 minutes with UV light to the adhesive tape was peeled off particulates. この過程によりタグを付した微小担体が得られた。 Micro carriers tagged was obtained by this process.

【0046】図11(a)は、タグにおける各ビットの数字であり、リソグラフィーにより微小担体にそのタグを書き込んだ。 [0046] Figure 11 (a) is a of each bit in the tag numbers, writing the tags to microcarrier by lithography. 1つの微小タイルが1ビットを意味するとした場合には、この8ビットにより0〜255を表すことが可能である。 If one tile has to mean 1-bit may be by the 8-bit representative of 0 to 255. SPとEPはビットの出発点と終末点を表し、微小担体に常に書かれている。 SP and EP represent the starting point and end point of the bit, it is always written microcarrier. 図11(b) Figure 11 (b)
は図11(a)に基づいたタグであり、2進法の010 Is a tag based on FIG. 11 (a), the binary 010
110001(10進法の数字でいうと88)を示している。 110001 (referred to in the decimal digits and 88) shows. また、図11(c)は微小担体のSEM写真であり、図11(b)の”010110001”という数字がリソグラフィーによって微小担体上に書かれており、 Further, FIG. 11 (c) is a SEM photograph of the microcarrier is written on the microcarrier is figure of "010 110 001" shown in FIG. 11 (b) by lithography,
ダイシングマシーンにより分割した。 It was divided by the dicing machine. 微小担体の大きさは300x300μm 2である。 The size of the microcarrier is 300x300μm 2. ダイシングマシーンにより種々の大きさの微小担体が得られた。 Microcarriers of different sizes were obtained by dicing machine. 図11(c) Figure 11 (c)
において、10x10μm 2 /ビットであるタグを明確にみることができた。 In could be seen clearly the tag is 10x10μm 2 / bit. この過程により、微小担体上に他のタグを書くこともできる。 This process can also be written other tags on microcarrier.

【0047】(DNAの固定化)実施例1と同様の方法で、金蒸着を行ったカバーガラス基板上にビオチン修飾したDNAを固定した。 [0047] In the same manner as in Example 1 (Immobilization of DNA), was immobilized biotin modified DNA to the cover glass substrate subjected to gold deposition. 1mM濃度の3、3'−ジチオジプロピオン酸水溶液3mLの中に、金蒸着したカバーガラスを室温で20分間浸した。 Some 3,3'-dithiodipropionic acid solution 3mL of 1mM concentration, the coverslips gold deposited was immersed for 20 minutes at room temperature. 金の上のカルボキシル酸をEDCの存在下でNHSと反応させた後に乾燥した。 Carboxylic acid on gold and dried after the reaction with NHS in the presence of EDC. 活性化したカルボキシル基を有する金を、1mLのアビジン(100μg/mL)の緩衝液(pH7.9、 Buffer gold with activated carboxyl group, 1 mL of avidin (100μg / mL) (pH7.9,
10mMトリス−塩酸、0.2M塩化ナトリウム)中に1時間浸した。 10mM Tris - HCl, soaked for 1 hour in 0.2M sodium chloride). 何回か水溶液で洗浄しても、金からアビジンは除去されなかった。 Be washed several times with an aqueous solution, avidin from gold was not removed. アビジンが結合した金を、エタノールアミン(1M)の水溶液(1mL)に30分間浸して、カルボキシル基を不活化してβ−ヒドロキシエチルアミドにした。 The gold avidin is bound, by immersing in an aqueous solution of ethanolamine (1M) (1mL) 30 minutes to a carboxyl group to inactivation to β- hydroxyethyl amide. コントロール実験として、アビジンの緩衝液(1mL中10μg)の中にそのままの金を浸したところ、アビジンの吸着はほとんど観察されなかった。 As a control experiment, was immersed as gold in the avidin buffer (1 mL of 10 [mu] g), the adsorption of avidin was hardly observed. アビジンの濃度を1mL中において30〜200μ 30~200μ the concentration of avidin in a 1mL
gまで増加したところ、非特異的な吸着が観察された。 Was increased to g, nonspecific adsorption was observed.
アビジンが結合した金を、ビオチン化したDNAの緩衝溶液(20〜21bp、1μM)1mL中に25℃で3 The gold avidin is bound, a buffer solution of biotinylated DNA (20~21bp, 1μM) 3 at 25 ° C. in 1mL
0分間浸した。 Soaked for 10 minutes. 固定化量をコントロールするために金を取り出した。 It was removed money to control the amount of immobilization. アビジン分子の4つの結合サイトの1つと結合するとして、ビオチン化したDNA鎖を計算した。 As with one coupling of the four binding sites avidin molecules were calculated biotinylated DNA strand.
ビオチン化DNAの固定量はDNA溶液に浸す時間により制御できた。 A fixed amount of biotinylated DNA was be controlled by time soaking in the DNA solution.

【0048】(パターン化した基板の作製)スライドガラスを、超音波洗浄器を用いて純水、アセトン、純水の順にそれぞれ30分間洗浄した。 [0048] The (patterned Preparation of substrate) glass slides were washed for 30 minutes each pure water, acetone, then with pure water using an ultrasonic cleaner. そして、スライドガラスの片面をCYTOPによりスピンコートして、115 Then, the spin-coated with CYTOP one side of the slide glass, 115
℃で4時間ベーキングした。 For 4 hours baking at ℃. クロム/金層をCYTOP CYTOP the chromium / gold layer
上に蒸着し、ホットプレート上で200℃で15分間ベーキングしてこの表面を乾燥させた。 Deposited on top and the surface is dried and baked for 15 minutes at 200 ° C. on a hot plate. ネガ型フォトレジスト(XP SU−8 50)を、スピンコーターによりスライドガラス上に滴下し、ホットプレート上で10 Negative photoresist (XP SU-8 50), was dropped on a slide glass with a spin coater, 10 on a hot plate
0℃で30分間ベーキングした。 It was baked for 30 minutes at 0 ℃. フォトマスクを通じてスライドガラスをUV光に20秒間暴露した。 It was exposed for 20 seconds a slide glass to UV light through a photo mask. ホットプレート上において100℃で30分間ベーキングし、自然に冷却した。 It baked 30 minutes at 100 ° C. on a hot plate, and cooled naturally. SU−8現像液中で30分間現像し、現像液で洗浄し、窒素ガスで乾燥した。 Developed for 30 minutes in SU-8 developer, and washed with developer, and dried with nitrogen gas. SU−8 50の表面を酸素プラズマに5分間暴露し、親水性とした。 The surface of the SU-8 50 was exposed for 5 minutes to an oxygen plasma, it was hydrophilic. 金とクロムの層を30秒間エッチングし、洗浄して窒素ガスで乾燥した。 A layer of gold and chromium for 30 seconds etched, washed and dried with nitrogen gas. パターン化した基板は、25〜30μm Patterned substrates, 25~30μm
の厚さの壁を有する格子縞模様であった。 It was a checkerboard pattern having a thickness of the wall of. 大きさは、全ての側において100x100〜500x500μm 2 The size is, 100x100~500x500μm 2 on all sides
である。 It is. パターン化した基板はそれぞれ、親水性と疎水性の部位に分けられた。 Each patterned substrate was divided into portions of the hydrophilic and hydrophobic. 10 3 〜10 4 /cm 2の親水性及び疎水性部位が得られた。 10 3 to 10 of 4 / cm 2 hydrophilic and hydrophobic sites was obtained.

【0049】図12は、リソグラフィーと酸素プラズマプロセッシングにより作製された、パターン化基板を示す。 [0049] Figure 12 is produced by lithography and oxygen plasma processing, showing a patterned substrate. 星印で示した範囲は親水性の部分を、残りは疎水性の部分を示す。 Range indicated by asterisks part of the hydrophilic and the remainder shows the portion of the hydrophobic. このパターン化基板は100x100μ The patterned substrate is 100x100μ
2 (10000サイト/cm 2 )であった。 m was 2 (10000 sites / cm 2). 高さが2 Height 2
5〜30μmの壁を全ての側面に規則的に作製したために、配列した後の微小担体の安定性は高いであろうと予測される。 To prepared regularly on all sides of the walls of 5 to 30 [mu] m, the stability of the microcarrier after sequence is predicted that it would be expensive. また、500x500μm 2のパターン化基板を作製することも可能であった。 It was also possible to produce a patterned substrate 500x500μm 2. 図12(a)は作製された壁の拡大図であり、親水性部分と壁との間のエッチングが巧みであることが示されている。 12 (a) is an enlarged view of the prepared wall, etching between the hydrophilic part and the wall is shown to be skillful. 壁を明確に見ることができ、またフォトリソグラフィーを用いて、種々の大きさの疎水性部位を得ることができる。 Can see the walls clearly, also using photolithography, it is possible to obtain various sizes of hydrophobic moiety.

【0050】(担体のパターン化した基板上への配置) [0050] (located on the substrate was patterned carrier)
種々の固定化DNAとタグの両方を有する約5000個の担体を含む懸濁液(エタノール90%+蒸留水10 Suspension containing about 5000 carriers with a variety of both immobilized DNA tag (Ethanol 90% + distilled water 10
%)の中に、パターン化した基板を入れた。 In%), it was placed in a substrate and patterned. 重力と疎水性相互作用により、無作為液中自己組織化を用いて微小担体を基盤に付着させ、パターン化基板の疎水性部位の各々に無作為に配列した。 By gravity and hydrophobic interactions, the microcarrier is attached to base with random fluid self-assembly, arranged randomly in each of the hydrophobic moiety of the patterned substrate. この過程により、集約型のD With this process, intensive D
NAチップマイクロアレイを組み立てることができた。 I was able to assemble the NA chip microarray.

【0051】図13は、無作為液中自己組織化を用いて、疎水性相互作用によりタグを有する担体をパターン化基板上に配列させた、集積型DNAチップマイクロアレイのSEM写真を示す。 [0051] Figure 13 uses a random solution self-assembly, the tag was arranged in a patterned substrate carrier having a hydrophobic interaction, an SEM photograph of the integrated DNA chip microarrays. 星型と四角型の各部位はそれぞれ、親水性と疎水性の部位を示す。 Each respective portions of the star and square-type and a portion of the hydrophilic and hydrophobic. 微小担体がパターン化基板上の疎水性部位に配列する確立は約75〜85 Establishing the microcarrier are arranged in hydrophobic sites on the patterned substrate was about 75 to 85
%であった。 %Met. 図13において担体の厚さは約50μmであり、周囲に壁(25〜30μm)があるために、担体は強固に三次元的に配列することができる。 13 The thickness of the carrier is about 50 [mu] m, because of the wall (25~30μm) around the carrier can be arranged firmly three-dimensionally. 各担体をタグによって区別することができるために、多くの種類のDNAが担体に固定化されたときに各DNAを区別することが可能となる。 In order to be able to distinguish each carrier by the tag, it is possible to distinguish each DNA when many types of DNA immobilized on a carrier. タグの例として、2進法の”010 Examples of tag, binary "010
11000”というタグや”01100011”というタグが挙げられ、これらは10進法の88という数字と99という数字を、それぞれ示している。 It includes tag called 01100011 "" tag Ya as "11000, which the figure of number 99 of 88 decimal, respectively.

【0052】(ハイブリダイゼーション)固定化したD [0052] (hybridization) immobilized D
NAプローブ(ビオチン化したDNA)が結合した金を、ハイブリダイゼーション緩衝液に入れて、次いでF The gold NA probe (biotinylated DNA) is bound, placed in a hybridization buffer, then F
ITC修飾した標的cDNA(0.1pM〜1μM,5 ITC modified target cDNA (0.1pM~1μM, 5
μL)と反応させることによりハイブリダイゼーションの実験を行った。 Experiments were carried out of the hybridization by reaction with μL). ハイブリダイゼーションは蛍光強度の変化により確認した。 Hybridization was confirmed by the change in fluorescence intensity. 非相補的なDNA結合(1μM, Non-complementary DNA binding (1 [mu] M,
5μL)もまた評価した。 5μL) was also evaluated. 蛍光顕微鏡(励起光450〜 Fluorescence microscope (excitation light 450
490nm、吸収光515〜565nm)(LEICA 490nm, absorption light 515~565nm) (LEICA
MZ FLIII、Leica)により暗室で蛍光を確認し、光度によりDNAハイブリダイゼーションの検討を行った。 MZ FLIII, Leica) was confirmed by fluorescence in a dark room, was examined of DNA hybridization by the luminous intensity.

【0053】図14は、DNAチップマイクロアレイにおける、FITC修飾された標的cDNAの濃度(0. [0053] Figure 14 is the DNA chip microarrays, FITC modified concentration of the target cDNA (0.
1pMから1μM)に依存した蛍光強度の変化を示す。 It shows the change in fluorescence intensity depending on the 1 [mu] M) from 1 pM.
図14(a)において、10 -13 Mから10 -6 Mの範囲内の濃度でAとBのプライマリーDNAがそれらのcD 14 in (a), 10 -13 concentration on the primary DNA of A and B in the range from 10 -6 M M is their cD
NAとハイブリダイズした時、濃度増加により蛍光強度がほとんど直線的に増加するという関係が観察された。 When NA hybridizes, relationship fluorescence intensity almost linearly increases were observed by increasing concentrations.
蛍光強度はcDNAの濃度に依存していた。 Fluorescence intensity was dependent on the concentration of the cDNA. しかし図1 However, Figure 1
4(b)は、プライマリーDNAのcDNAではないサンプルと反応させた結果である。 4 (b) is a result of the reaction with the sample is not a cDNA primary DNA. FITC標識された標的cDNAがプライマリーDNAとハイブリダイズしなかったために、この場合には蛍光は見られなかった。 For FITC labeled target cDNA was not primary DNA hybridized, fluorescence in this case it was not observed. これらの結果は、このDNAチップアレイを用いてDNA These results, using the DNA chip array DNA
を認識することが可能であることを意味している。 Which means that it is possible to recognize.

【0054】図15は、DNAチップマイクロアレイにおける、種々の標的cDNAがハイブリダイズした後の蛍光変化を示す。 [0054] Figure 15 shows the change in fluorescence after the DNA chip microarrays, various target cDNA was hybridized. 各プライマリーDNAを担体に固定化した後に各担体を懸濁液中で混合してチップパターン上に配列させた。 Each primary DNA were mixed with each carrier in suspension after immobilization on a carrier is arranged on a chip pattern. 図15(a)はDNAチップマイクロアレイを示しており、プライマリーDNAは標的cDNA FIG. 15 (a) shows a DNA chip microarrays, primary DNA is the target cDNA
とハイブリダイズしていないために蛍光は検出されない。 No fluorescence is detected because it does not hybridize with. FITC標識された標的cDNAを順次投入した。 It was sequentially charged with FITC labeled target cDNA.
図15(b)はA'のcDNAを投入したときの結果であり、A'のcDNAとハイブリダイズした時だけに丸型の点線内に蛍光が見られた。 FIG. 15 (b) 'are results when charged with the cDNA of, A' A fluorescence was observed only in the round within the dotted line when the cDNA hybridized. その上に図15(c)においてB'のcDNAを、更に図15(d)においてA'+B'のcDNAを投入した時に、ハイブリダイズすることによって丸型の点線内に蛍光が見られた。 'The cDNA of further A in FIG. 15 (d)' FIG 15 (c) in B thereon when introducing cDNA of + B ', the fluorescence was seen in dotted the round by hybridizing. これらの結果は、この方法がDNAチップマイクロアレイに適用できることを示している。 These results indicate that this method can be applied to DNA chip microarrays.

【0055】 [0055]

【発明の効果】本発明により、生体材料を固定化した微小担体と担体を固定化したパターン化基板を、無作為液中自己組織化法を用いて疎水性相互作用により固定化することを特徴とする、新規なバイオチップの作製方法が与えられた。 According to the present invention, characterized by immobilizing the immobilized patterned substrate immobilized microcarrier and carrier biomaterials, by hydrophobic interaction with in random liquid self-assembly method to, a method for manufacturing a novel biochip is given.


【図1】 図1は、本発明のバイオチップアレイの構造を示した図である。 FIG. 1 is a diagram showing a structure of a biochip array of the present invention.

【図2】 図2は、微小担体の作製方法の概要を示す図である。 Figure 2 is a diagram showing an outline of a manufacturing method of microcarrier.

【図3】 図3は、微小担体にDNAを結合させる過程を示す図である。 Figure 3 is a diagram showing a process of binding the DNA to the microcarrier.

【図4】 図4は、パターン化基板の作製工程の概要を示す図である。 Figure 4 is a diagram showing an outline of the patterned substrate manufacturing process.

【図5】 図5は、スピンコーターの遠心力を用いて、 Figure 5, using a centrifugal force of the spin coater,
担体群の疎水性相互作用を測定する装置を示す図である。 Is a diagram showing an apparatus for measuring a hydrophobic interaction support group.

【図6】 図6は、疎水性相互作用により、基板の疎水性パターンの部分に固定された担体を示す写真である。 Figure 6 is a hydrophobic interaction, a photograph showing a carrier that is fixed to a portion of the hydrophobic pattern on the substrate.

【図7】 図7は、ビオチン化DNAを固定化した担体に対する、相補的なFITC化DNAの結合を示した写真である。 Figure 7, to immobilized carrier biotinylated DNA, DNA that is a photograph showing the binding of complementary FITC of DNA.

【図8】 図8は、パターン化基板に対して担体のCY Figure 8, CY carrier relative to the patterned substrate
TOP面が接する確率を示す図である。 Is a diagram illustrating the probability of TOP surface contact.

【図9】 図9は、種々の濃度のCYTOP処理における、パターン化基板に残った担体の割合を示すグラフである。 Figure 9 is a graph showing the CYTOP processing of various concentrations, the ratio of the remaining carrier to the patterned substrate.

【図10】 図10は、種々の濃度のCYTOP処理における、動的接触角を示すグラフである。 Figure 10 is the CYTOP processing of various concentrations is a graph showing the dynamic contact angle.

【図11】 図11は、本発明において使用したタグの構成を示す模式図(a,b)及びタグを付した微小担体の写真(c)である。 Figure 11 is a schematic diagram showing a configuration of a tag used in the present invention (a, b) and microcarrier photograph of tagged (c).

【図12】 図12は、親水性部位と疎水性部位を有するパターン化基板の写真である。 Figure 12 is a photograph of a patterned substrate having a hydrophilic site and a hydrophobic site.

【図13】 図13は、無作為液中自己組織化を用いてタグを有する担体をパターン化基板上に配列させたDN Figure 13 were arranged in a patterned substrate carrier having a tag using a random solution self-assembled DN
Aチップマイクロアレイの写真である。 It is a photograph of the A chip microarray.

【図14】 図14は、標的cDNAの濃度に依存した蛍光強度の変化を示す図である。 Figure 14 is a graph showing changes in fluorescence intensity depending on the concentration of the target cDNA.

【図15】 図15は、種々の標的cDNAがハイブリダイズした後の蛍光変化を示す図である。 Figure 15 is a diagram showing a change in fluorescence after various target cDNA is hybridized.


1 基板、2 固定部、3 疎水性コーティング、4 1 substrate, 2 fixed part, 3 hydrophobic coating, 4
微小担体、5 クロムコーティング、6 金コーティング、7 生体材料、8 親水性部分、9 疎水性部分 Microcarrier, 5 chromium coating, 6 gold coating, 7 biomaterials, 8 hydrophilic portion, 9 a hydrophobic moiety

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl. 7識別記号 FI テーマコート゛(参考) // G01N 33/53 G01N 33/53 M C12N 15/00 F (72)発明者 チョイ ヨン−ソン 石川県能美郡辰口町旭台1−50 学生寄宿 舎5−107号室 Fターム(参考) 4B024 AA11 CA01 HA12 4B029 AA07 AA23 BB15 BB20 CC03 CC07 ────────────────────────────────────────────────── ─── of the front page continued (51) Int.Cl 7 identification mark FI theme Court Bu (reference) // G01N 33/53 G01N 33/53 M C12N 15/00 F (72) inventor Choi Yong -. Son Ishikawa Prefecture Nomi-gun Tatsunokuchi Asahidai 1-50 student boarding house 5-107, room F-term (reference) 4B024 AA11 CA01 HA12 4B029 AA07 AA23 BB15 BB20 CC03 CC07

Claims (10)

    【特許請求の範囲】 [The claims]
  1. 【請求項1】 バイオチップであり、当該バイオチップはパターン化基板及び生体材料固定化担体とを備え、当該パターン化基板は基板と当該基板の片面に配列した複数の疎水性固定部とを備え、当該基板の疎水性固定部の間は親水性であり、当該生体材料固定化担体は微小担体、当該微小担体の片面の表層に形成した疎水性コーティング及び当該微小担体の他方の片面に固定化した生体成分又は生体成分類似物質を備え、当該疎水性固定部と当該生体材料固定化担体は疎水性相互作用により結合していることを特徴とする、バイオチップ。 1. A is a biochip, said biochip comprising a patterned substrate and biomaterial immobilization carrier, the patterned substrate comprises a plurality of hydrophobic stationary portions arranged on one side of the substrate and the substrate , between the hydrophobic stationary portion of the substrate is hydrophilic, the biomaterial immobilization pellets immobilized to the other side of microcarrier, the hydrophobic coating and the microcarrier formed on the surface of one side of the microcarrier and comprising a biological component or biological components similar substance, the hydrophobic stationary portion and the biomaterial-immobilized carrier is characterized that it is bound by hydrophobic interactions, the biochip.
  2. 【請求項2】 前記生体成分又は生体成分類似物質が核酸、蛋白質、脂質、生体模倣有機分子、細胞及びこれらの複合体よりなる群より選択された、請求項1記載のバイオチップ。 Wherein said biological component or biological components similar materials nucleic acids, proteins, lipids, biomimetic organic molecules, selected from the group consisting of cells and complexes thereof, according to claim 1, wherein the biochip.
  3. 【請求項3】 個々の前記生体材料固定化担体を識別ための識別子を、前記生体材料固定化担体上に有していることを特徴とする、請求項1又は請求項2記載のバイオチップ。 Wherein an identifier for identifying each of the biomaterial-immobilized carrier, characterized in that it comprises the biomaterial immobilized on a carrier, according to claim 1 or claim 2, wherein the biochip.
  4. 【請求項4】 前記識別子が、前記生体材料固定化担体上に記載された格子状のタグのパターンにより構成されていることを特徴とする、請求項3記載のバイオチップ。 Wherein said identifier is characterized by being composed by the pattern of the grid-shaped tag described in the biomaterial immobilized on a carrier, according to claim 3, wherein the biochip.
  5. 【請求項5】 微小担体、当該微小担体の片面の表層に形成した微小担体疎水性コーティング及び当該微小担体の他方の片面に固定化した生体成分又は生体成分類似物質を備える、バイオチップ用の生体材料固定化担体。 5. A microcarrier comprises the other of immobilized biological components or biological components analogs on one surface of the microcarrier hydrophobic coating and the microcarrier formed on the surface of one side of the microcarrier, living for the biochip material immobilized carrier.
  6. 【請求項6】 前記生体成分又は生体成分類似物質が核酸又は蛋白質、脂質、生体模倣有機分子、細胞及びこれらの複合体よりなる群より選択された、請求項5記載の生体材料固定化担体。 Wherein said biological component or biological components similar materials nucleic acids or proteins, lipids, biomimetic organic molecules, cells and selected from the group consisting of complexes, according to claim 5, wherein the biomaterial immobilization.
  7. 【請求項7】 識別ための識別子を更に有していることを特徴とする、請求項5又は請求項6記載の生体材料固定化担体。 7., characterized in that it comprises further an identifier for identifying, according to claim 5 or claim 6 biomaterial immobilized carrier according.
  8. 【請求項8】 基板と当該基板の片面に格子状に配列した固定部とを備える、バイオチップ用のパターン化基板。 8. and a fixing portion which are arranged in a grid pattern on one surface of the substrate and the substrate, the patterned substrate for the biochip.
  9. 【請求項9】 請求項5ないし請求項7記載の生体材料固定化担体と、請求項8記載のパターン化基板とを、無作為液中自己組織化法を用いて、疎水性相互作用により固定化することにより、バイオチップを作製する方法。 9. A biomaterial-immobilized carrier of claims 5 to 7, wherein the patterned substrate according to claim 8, using a random solution self-assembly method, fixed by hydrophobic interaction by reduction, a method of making a biochip.
  10. 【請求項10】 前記無作為液中自己組織化法が、前記生体材料固定化担体の懸濁液を液体中に滴下して当該液体を回転させることにより、前記パターン化基板の前記疎水性固定部に前記生体材料固定化担体を配置することより成る、請求項9記載の方法。 Wherein said random liquid self-assembly method, by rotating the liquid added dropwise a suspension of the biological material immobilized carrier in the liquid, the hydrophobic fixing of the patterned substrate made of the placing biomaterial immobilized carrier that the parts, the method of claim 9, wherein.
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WO2007145228A1 (en) * 2006-06-13 2007-12-21 National Institute Of Advanced Industrial Science And Technology Method for manufacturing microarray

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