JP2002045178A - 新規イミダーゼ及びそれを用いたβ−カルバモイルカルボン酸誘導体の製造方法 - Google Patents
新規イミダーゼ及びそれを用いたβ−カルバモイルカルボン酸誘導体の製造方法Info
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- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】 新規イミダーゼおよびそれを用いたβ−カル
バモイルカルボン酸誘導体の製造方法を提供することを
課題とする。 【解決手段】 アルスロバクター属微生物から、新規イ
ミダーゼを精製し、該イミダーゼを環状イミドに作用さ
せて、開環体を生成させる。
バモイルカルボン酸誘導体の製造方法を提供することを
課題とする。 【解決手段】 アルスロバクター属微生物から、新規イ
ミダーゼを精製し、該イミダーゼを環状イミドに作用さ
せて、開環体を生成させる。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、環状イミドの加水
分解を触媒するイミダーゼ及びそれを用いた環状イミド
の開環体の製造方法、並びに微生物及び／又は微生物処
理物を用いた環状イミドの開環体の製造方法に関する。
分解を触媒するイミダーゼ及びそれを用いた環状イミド
の開環体の製造方法、並びに微生物及び／又は微生物処
理物を用いた環状イミドの開環体の製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】有用な環状イミドの開環体としては、例
えば３−カルバモイル−α−ピコリン酸等が挙げられ、
これは生理活性又は薬理活性成分（医薬品、農薬など）
の中間原料として使用することができる。この３−カル
バモイル−α−ピコリン酸の化学的製造法においては、
２，３−ピリジンジカルボキシイミドをアルカリ中で加
水分解する方法があるが、イミドの加水分解反応によ
り、３−カルバモイル−α−ピコリン酸と２−カルバモ
イル−β−ピコリン酸の混合物となり、経済的に有利な
製造方法とは言えない。また生化学的手法により環状イ
ミドを加水分解する方法としてラット肝臓のイミダーゼ
によるイミド類の加水分解例の報告（Ｙ．Ｙａｎｇら
Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ
Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２６８，１０８７０（１９９
３））があるが、物質の生産を目的とした方法ではな
く、また、加水分解反応の位置特異性を検討した報告で
はない。
えば３−カルバモイル−α−ピコリン酸等が挙げられ、
これは生理活性又は薬理活性成分（医薬品、農薬など）
の中間原料として使用することができる。この３−カル
バモイル−α−ピコリン酸の化学的製造法においては、
２，３−ピリジンジカルボキシイミドをアルカリ中で加
水分解する方法があるが、イミドの加水分解反応によ
り、３−カルバモイル−α−ピコリン酸と２−カルバモ
イル−β−ピコリン酸の混合物となり、経済的に有利な
製造方法とは言えない。また生化学的手法により環状イ
ミドを加水分解する方法としてラット肝臓のイミダーゼ
によるイミド類の加水分解例の報告（Ｙ．Ｙａｎｇら
Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ
Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２６８，１０８７０（１９９
３））があるが、物質の生産を目的とした方法ではな
く、また、加水分解反応の位置特異性を検討した報告で
はない。
【０００３】そこで、アルスロバクター（Arthrobacte
r）属に属する微生物による２，３−ピリジンジカルボ
キシイミドから３−カルバモイル−α−ピコリン酸の選
択的合成方法が報告されているが（平成１１年度日本生
物工学会大会講演要旨集（1999）、p182）、この様な選
択的合成を触媒する酵素の精製および詳細な特性評価は
行われておらず、また、他の種類の環状イミドに作用し
て開環体を生成することについても明かにされていなか
った。
r）属に属する微生物による２，３−ピリジンジカルボ
キシイミドから３−カルバモイル−α−ピコリン酸の選
択的合成方法が報告されているが（平成１１年度日本生
物工学会大会講演要旨集（1999）、p182）、この様な選
択的合成を触媒する酵素の精製および詳細な特性評価は
行われておらず、また、他の種類の環状イミドに作用し
て開環体を生成することについても明かにされていなか
った。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、環状イミド
を加水分解して開環体を生成するイミダーゼ及びそれを
用いた環状イミドの開環体の製造方法、並びに微生物及
び／又は微生物処理物を用いた環状イミドの開環体の製
造方法を提供することを課題とする。
を加水分解して開環体を生成するイミダーゼ及びそれを
用いた環状イミドの開環体の製造方法、並びに微生物及
び／又は微生物処理物を用いた環状イミドの開環体の製
造方法を提供することを課題とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、アルスロ
バクター（Arthrobacter）属に属する微生物より、２，
３−ピリジンジカルボキシイミドから３−カルバモイル
−α−ピコリン酸の選択的合成を触媒するイミダーゼを
精製することに成功し、本発明を完成した。また、前記
イミダーゼが他の種類の環状イミドから、その開環体を
生成することを見いだし、本発明を完成した。さらに、
２，３−ピリジンジカルボキシイミドにアルスロバクタ
ー属に属する微生物を作用することにより、３−カルバ
モイル−α−ピコリン酸を製造できることから、本発明
を完成した。
バクター（Arthrobacter）属に属する微生物より、２，
３−ピリジンジカルボキシイミドから３−カルバモイル
−α−ピコリン酸の選択的合成を触媒するイミダーゼを
精製することに成功し、本発明を完成した。また、前記
イミダーゼが他の種類の環状イミドから、その開環体を
生成することを見いだし、本発明を完成した。さらに、
２，３−ピリジンジカルボキシイミドにアルスロバクタ
ー属に属する微生物を作用することにより、３−カルバ
モイル−α−ピコリン酸を製造できることから、本発明
を完成した。
【０００６】すなわち、本発明は、下記（１）及び
（２）に記載の理化学的性質を有するイミダーゼ（以
下、本発明酵素と称する）を提供する。 （１）作用：環状イミドを加水分解し、開環体を生成す
る。 （２）基質特異性：フタルイミド、２，３−ピリジンジ
カルボキシイミド、３，４−ピリジンジカルボキシイミ
ド、４−アミノフタルイミド、Ｎ−ヒドロキシフタルイ
ミド、Ｎ−アミノフタルイミド、Ｎ−ブロモフタルイミ
ド、Ｎ−メチルフタルイミド、Ｎ−（シクロヘキシルチ
オ）フタルイミド、５−メチルイサチンの環状イミドを
加水分解するが、ヒダントイン、ジヒドロウラシル、グ
ルタル酸イミド、コハク酸イミドの環状イミドを加水分
解しない。
（２）に記載の理化学的性質を有するイミダーゼ（以
下、本発明酵素と称する）を提供する。 （１）作用：環状イミドを加水分解し、開環体を生成す
る。 （２）基質特異性：フタルイミド、２，３−ピリジンジ
カルボキシイミド、３，４−ピリジンジカルボキシイミ
ド、４−アミノフタルイミド、Ｎ−ヒドロキシフタルイ
ミド、Ｎ−アミノフタルイミド、Ｎ−ブロモフタルイミ
ド、Ｎ−メチルフタルイミド、Ｎ−（シクロヘキシルチ
オ）フタルイミド、５−メチルイサチンの環状イミドを
加水分解するが、ヒダントイン、ジヒドロウラシル、グ
ルタル酸イミド、コハク酸イミドの環状イミドを加水分
解しない。
【０００７】本発明酵素は、さらに下記（３）〜（５）
に記載の理化学的性質を有することが挙げられる。 （３）ＴＳＫ Ｇ３０００ＳＷ（トーソー（株））を用
いたゲル濾過法により測定される分子量：約１０１，０
００ダルトン （４）ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動におい
て、少なくとも３２，５００ダルトンと推定されるポリ
ペプチドのバンドを示す。 （５）アミノ末端のアミノ酸配列が配列番号１で示され
るポリペプチドを含む。
に記載の理化学的性質を有することが挙げられる。 （３）ＴＳＫ Ｇ３０００ＳＷ（トーソー（株））を用
いたゲル濾過法により測定される分子量：約１０１，０
００ダルトン （４）ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動におい
て、少なくとも３２，５００ダルトンと推定されるポリ
ペプチドのバンドを示す。 （５）アミノ末端のアミノ酸配列が配列番号１で示され
るポリペプチドを含む。
【０００８】本発明酵素は、さらに下記（６）〜（９）
に記載の理化学的性質を有することが挙げられる。 （６）至適ｐＨ：９付近（２，３−ピリジンジカルボキ
シイミドを基質とした場合） （７）至適温度：４５℃付近（２，３−ピリジンジカル
ボキシイミドを基質とした場合） （８）安定ｐＨ：５〜９付近（３０℃、２０分の処理） （９）安定温度：約３０℃未満（ｐＨ７．４、２０分の
処理）
に記載の理化学的性質を有することが挙げられる。 （６）至適ｐＨ：９付近（２，３−ピリジンジカルボキ
シイミドを基質とした場合） （７）至適温度：４５℃付近（２，３−ピリジンジカル
ボキシイミドを基質とした場合） （８）安定ｐＨ：５〜９付近（３０℃、２０分の処理） （９）安定温度：約３０℃未満（ｐＨ７．４、２０分の
処理）
【０００９】本発明酵素は、さらに下記（１０）及び
（１１）に記載の理化学的性質を有することが挙げられ
る。 （１０）阻害：ｐ−クロロメルクリ安息香酸塩によって
活性が阻害される。Ｆｅ2+によって活性が阻害される。 （１１）ミカエリス定数（Ｋｍ）： 約２．０７×１０-4Ｍ（フタルイミドを基質とした場
合） 約６．６７×１０-4Ｍ（２，３−ピリジンジカルボキシ
イミドを基質とした場合） 約３．３３×１０-4Ｍ（３，４−ピリジンジカルボキシ
イミドを基質とした場合）
（１１）に記載の理化学的性質を有することが挙げられ
る。 （１０）阻害：ｐ−クロロメルクリ安息香酸塩によって
活性が阻害される。Ｆｅ2+によって活性が阻害される。 （１１）ミカエリス定数（Ｋｍ）： 約２．０７×１０-4Ｍ（フタルイミドを基質とした場
合） 約６．６７×１０-4Ｍ（２，３−ピリジンジカルボキシ
イミドを基質とした場合） 約３．３３×１０-4Ｍ（３，４−ピリジンジカルボキシ
イミドを基質とした場合）
【００１０】また本発明は、フタルイミド、２，３−ピ
リジンジカルボキシイミド、３，４−ピリジンジカルボ
キシイミド、４−アミノフタルイミド、Ｎ−ヒドロキシ
フタルイミド、Ｎ−アミノフタルイミド、Ｎ−ブロモフ
タルイミド、Ｎ−メチルフタルイミド、Ｎ−（シクロヘ
キシルチオ）フタルイミド、５−メチルイサチンからな
る群から選択される環状イミドに、本発明酵素を作用さ
せて、環状イミドの開環体を作成することを含む、環状
イミドの開環体の製造方法を提供する。
リジンジカルボキシイミド、３，４−ピリジンジカルボ
キシイミド、４−アミノフタルイミド、Ｎ−ヒドロキシ
フタルイミド、Ｎ−アミノフタルイミド、Ｎ−ブロモフ
タルイミド、Ｎ−メチルフタルイミド、Ｎ−（シクロヘ
キシルチオ）フタルイミド、５−メチルイサチンからな
る群から選択される環状イミドに、本発明酵素を作用さ
せて、環状イミドの開環体を作成することを含む、環状
イミドの開環体の製造方法を提供する。
【００１１】さらに本発明は、フタルイミド、３，４−
ピリジンジカルボキシイミド、４−アミノフタルイミ
ド、Ｎ−ヒドロキシフタルイミド、Ｎ−アミノフタルイ
ミド、Ｎ−ブロモフタルイミド、Ｎ−メチルフタルイミ
ド、Ｎ−（シクロヘキシルチオ）フタルイミド、５−メ
チルイサチンから選択される環状イミドに作用し、それ
ぞれの開環体を生成する能力を有する微生物および／ま
たは微生物処理物を、フタルイミド、３，４−ピリジン
ジカルボキシイミド、４−アミノフタルイミド、Ｎ−ヒ
ドロキシフタルイミド、Ｎ−アミノフタルイミド、Ｎ−
ブロモフタルイミド、Ｎ−メチルフタルイミド、Ｎ−
（シクロヘキシルチオ）フタルイミド、５−メチルイサ
チンからなる群から選択される環状イミドに作用させ
て、該環状イミドの開環体を生成させることを特徴とす
る環状イミドの開環体の製造方法を提供する。
ピリジンジカルボキシイミド、４−アミノフタルイミ
ド、Ｎ−ヒドロキシフタルイミド、Ｎ−アミノフタルイ
ミド、Ｎ−ブロモフタルイミド、Ｎ−メチルフタルイミ
ド、Ｎ−（シクロヘキシルチオ）フタルイミド、５−メ
チルイサチンから選択される環状イミドに作用し、それ
ぞれの開環体を生成する能力を有する微生物および／ま
たは微生物処理物を、フタルイミド、３，４−ピリジン
ジカルボキシイミド、４−アミノフタルイミド、Ｎ−ヒ
ドロキシフタルイミド、Ｎ−アミノフタルイミド、Ｎ−
ブロモフタルイミド、Ｎ−メチルフタルイミド、Ｎ−
（シクロヘキシルチオ）フタルイミド、５−メチルイサ
チンからなる群から選択される環状イミドに作用させ
て、該環状イミドの開環体を生成させることを特徴とす
る環状イミドの開環体の製造方法を提供する。
【００１２】また、前記微生物は、アルスロバクター属
に属する微生物であることが挙げられる。
に属する微生物であることが挙げられる。
【００１３】
【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。 ＜本発明酵素＞本発明酵素の理化学的性質について説明
する。 （１）作用：環状イミドを加水分解し、開環体を生成す
る。この環状イミドの加水分解は、位置特異的に行われ
ること、具体的には、２，３−ピリジンジカルボキシイ
ミド（一般式１）を基質とした場合、２−カルバモイル
−β−ピコリン酸（一般式２）よりも、３−カルバミル
−α−ピコリン酸（一般式３）が選択的に生成されるこ
とが確認されている。また、フタルイミド、２，３−ピ
リジンジカルボキシイミド、３，４−ピリジンジカルボ
キシイミド等の芳香族環状イミドにおいて高い活性を示
すことも確認されている。
する。 （１）作用：環状イミドを加水分解し、開環体を生成す
る。この環状イミドの加水分解は、位置特異的に行われ
ること、具体的には、２，３−ピリジンジカルボキシイ
ミド（一般式１）を基質とした場合、２−カルバモイル
−β−ピコリン酸（一般式２）よりも、３−カルバミル
−α−ピコリン酸（一般式３）が選択的に生成されるこ
とが確認されている。また、フタルイミド、２，３−ピ
リジンジカルボキシイミド、３，４−ピリジンジカルボ
キシイミド等の芳香族環状イミドにおいて高い活性を示
すことも確認されている。
【００１４】
【化１】
【００１５】（２）基質特異性：フタルイミド（一般式
４）、２，３−ピリジンジカルボキシイミド（一般式
１）、３，４−ピリジンジカルボキシイミド（一般式
５）、４−アミノフタルイミド（一般式６）、Ｎ−ヒド
ロキシフタルイミド（一般式７）、Ｎ−アミノフタルイ
ミド（一般式８）、Ｎ−ブロモフタルイミド（一般式
９）、Ｎ−メチルフタルイミド（一般式１０）、Ｎ−
（シクロヘキシルチオ）フタルイミド（一般式１１）、
５−メチルイサチン（一般式１２）の環状イミドを加水
分解するが、ヒダントイン、ジヒドロウラシル、グルタ
ル酸イミド、コハク酸イミドの環状イミドを加水分解し
ない。
４）、２，３−ピリジンジカルボキシイミド（一般式
１）、３，４−ピリジンジカルボキシイミド（一般式
５）、４−アミノフタルイミド（一般式６）、Ｎ−ヒド
ロキシフタルイミド（一般式７）、Ｎ−アミノフタルイ
ミド（一般式８）、Ｎ−ブロモフタルイミド（一般式
９）、Ｎ−メチルフタルイミド（一般式１０）、Ｎ−
（シクロヘキシルチオ）フタルイミド（一般式１１）、
５−メチルイサチン（一般式１２）の環状イミドを加水
分解するが、ヒダントイン、ジヒドロウラシル、グルタ
ル酸イミド、コハク酸イミドの環状イミドを加水分解し
ない。
【００１６】
【化２】
【００１７】本発明の酵素は、上記の芳香族環状イミド
や、フタルイミドのＮ置換誘導体等の環状イミドを加水
分解する。一方、既知の環状アミド加水分解酵素の基質
である、ヒダントイン、ジヒドロウラシル、２，４−チ
アゾリジンジオン等の環式ウレイドや、グルタル酸イミ
ド、コハク酸イミド、２−メチルコハク酸イミド等の単
環式イミドには加水分解しない。以上のことから、本発
明酵素は既知の酵素ではないと考えられる。
や、フタルイミドのＮ置換誘導体等の環状イミドを加水
分解する。一方、既知の環状アミド加水分解酵素の基質
である、ヒダントイン、ジヒドロウラシル、２，４−チ
アゾリジンジオン等の環式ウレイドや、グルタル酸イミ
ド、コハク酸イミド、２−メチルコハク酸イミド等の単
環式イミドには加水分解しない。以上のことから、本発
明酵素は既知の酵素ではないと考えられる。
【００１８】また、上記の（１）、（２）に記載の理化
学的性質は、例えば、基質と生成物との間に、光吸収、
蛍光、旋光度などの光学特性に差異がある場合、それを
指標として光学機器で測定する分光学的方法や、ＨＰＬ
Ｃを用いた基質と生成物の同定やそれぞれの量の変化を
測定する方法等により確認することができる。
学的性質は、例えば、基質と生成物との間に、光吸収、
蛍光、旋光度などの光学特性に差異がある場合、それを
指標として光学機器で測定する分光学的方法や、ＨＰＬ
Ｃを用いた基質と生成物の同定やそれぞれの量の変化を
測定する方法等により確認することができる。
【００１９】（３）ＴＳＫ Ｇ３０００ＳＷ（トーソー
（株））を用いたゲル濾過法により測定される分子量：
約１０１，０００ダルトン （４）ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動におい
て、少なくとも３２，５００ダルトンと推定されるポリ
ペプチドのバンドを示す。 （５）アミノ末端のアミノ酸配列が配列番号１で示され
るポリペプチドを含む。
（株））を用いたゲル濾過法により測定される分子量：
約１０１，０００ダルトン （４）ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動におい
て、少なくとも３２，５００ダルトンと推定されるポリ
ペプチドのバンドを示す。 （５）アミノ末端のアミノ酸配列が配列番号１で示され
るポリペプチドを含む。
【００２０】上記の（３）、（４）、（５）に記載の理
化学的性質は、後記実施例に示した方法により確認する
ことができる。ここで、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動において、32,500ダルトンおよび30,000ダル
トンの分子量と推定される２本のポリペプチドのバンド
が示されており、また、それぞれのバンドについてアミ
ノ末端のアミノ酸配列が全く同じ配列であることから、
30,000ダルトンのポリペプチドは、32,500ダルトンのポ
リペプチドがプロテアーゼ消化を受けて生成したもので
あることが示唆される。また、本発明酵素の分子量か
ら、前記32,500ダルトンのポリペプチドのホモ３量体で
あることが示唆される。
化学的性質は、後記実施例に示した方法により確認する
ことができる。ここで、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動において、32,500ダルトンおよび30,000ダル
トンの分子量と推定される２本のポリペプチドのバンド
が示されており、また、それぞれのバンドについてアミ
ノ末端のアミノ酸配列が全く同じ配列であることから、
30,000ダルトンのポリペプチドは、32,500ダルトンのポ
リペプチドがプロテアーゼ消化を受けて生成したもので
あることが示唆される。また、本発明酵素の分子量か
ら、前記32,500ダルトンのポリペプチドのホモ３量体で
あることが示唆される。
【００２１】（６）至適ｐＨ：９付近（２，３−ピリジ
ンジカルボキシイミドを基質とした場合） （７）至適温度：４５℃付近（２，３−ピリジンジカル
ボキシイミドを基質とした場合） （８）安定ｐＨ：５〜９付近（３０℃、２０分の処理） （９）安定温度：約３０℃未満（ｐＨ７．４、２０分の
処理） 上記の（６）〜（９）に記載の理化学的性質は、後記実
施例に示した方法により確認することができる。
ンジカルボキシイミドを基質とした場合） （７）至適温度：４５℃付近（２，３−ピリジンジカル
ボキシイミドを基質とした場合） （８）安定ｐＨ：５〜９付近（３０℃、２０分の処理） （９）安定温度：約３０℃未満（ｐＨ７．４、２０分の
処理） 上記の（６）〜（９）に記載の理化学的性質は、後記実
施例に示した方法により確認することができる。
【００２２】（１０）阻害：ｐ−クロロメルクリ安息香
酸塩によって活性が阻害される。Ｆｅ2+によって活性が
阻害される。このように本発明酵素は、通常状態の活性
を１００％とした場合、ＳＨ阻害剤であるｐ−クロロメ
ルクリ安息香酸塩（１ｍＭ）の存在下で活性が２０〜３
０％程度、また金属イオンのＦｅ2+（１ｍＭ）の存在下
で活性が５０〜６０％程度となり、活性が阻害される。 （１１）ミカエリス定数（Ｋｍ）： 約２．０７×１０-4Ｍ（フタルイミドを基質とした場
合） 約６．６７×１０-4Ｍ（２，３−ピリジンジカルボキシ
イミドを基質とした場合） 約３．３３×１０-4Ｍ（３，４−ピリジンジカルボキシ
イミドを基質とした場合）
酸塩によって活性が阻害される。Ｆｅ2+によって活性が
阻害される。このように本発明酵素は、通常状態の活性
を１００％とした場合、ＳＨ阻害剤であるｐ−クロロメ
ルクリ安息香酸塩（１ｍＭ）の存在下で活性が２０〜３
０％程度、また金属イオンのＦｅ2+（１ｍＭ）の存在下
で活性が５０〜６０％程度となり、活性が阻害される。 （１１）ミカエリス定数（Ｋｍ）： 約２．０７×１０-4Ｍ（フタルイミドを基質とした場
合） 約６．６７×１０-4Ｍ（２，３−ピリジンジカルボキシ
イミドを基質とした場合） 約３．３３×１０-4Ｍ（３，４−ピリジンジカルボキシ
イミドを基質とした場合）
【００２３】＜本発明の酵素を用いた環状イミド開環体
の製造方法＞本発明酵素を用いて環状イミドの開環体を
製造する方法としては、上述した環状イミドを酵素に作
用させて、生成物の開環体を製造することができるもの
であれば特に限定されるものではなく、例えば、酵素を
含む溶液に基質を添加させて製造する方法や、固定化酵
素を用いた反応器によって製造する方法等が挙げられ
る。そこで本明細書において、本発明酵素は、精製若し
くは部分精製された酵素、及びそれらの固定化物全てを
含有する概念として用いられる。さらに、反応条件とし
ては温度４〜５０℃、好ましくは２０〜３０℃の範囲で
行い、ｐＨ４．０〜１１、好ましくはｐＨ５．０〜１０
の範囲で行う。環状イミドの濃度は０．０００１〜８０
％、好ましくは０．０１〜５０％の範囲が望ましく、必
要ならば反応の間、環状イミドは追補添加される。ま
た、反応溶液の組成としてはシクロヘキサノンなどの有
機溶媒等を含み、二相反応系のものを用いるのが、非酵
素的加水分解を抑えることができ好ましい。
の製造方法＞本発明酵素を用いて環状イミドの開環体を
製造する方法としては、上述した環状イミドを酵素に作
用させて、生成物の開環体を製造することができるもの
であれば特に限定されるものではなく、例えば、酵素を
含む溶液に基質を添加させて製造する方法や、固定化酵
素を用いた反応器によって製造する方法等が挙げられ
る。そこで本明細書において、本発明酵素は、精製若し
くは部分精製された酵素、及びそれらの固定化物全てを
含有する概念として用いられる。さらに、反応条件とし
ては温度４〜５０℃、好ましくは２０〜３０℃の範囲で
行い、ｐＨ４．０〜１１、好ましくはｐＨ５．０〜１０
の範囲で行う。環状イミドの濃度は０．０００１〜８０
％、好ましくは０．０１〜５０％の範囲が望ましく、必
要ならば反応の間、環状イミドは追補添加される。ま
た、反応溶液の組成としてはシクロヘキサノンなどの有
機溶媒等を含み、二相反応系のものを用いるのが、非酵
素的加水分解を抑えることができ好ましい。
【００２４】＜本発明の微生物を用いた環状イミド開環
体の製造方法＞本発明の微生物による製造方法で使用さ
れる微生物、微生物処理物は、フタルイミド、３，４−
ピリジンジカルボキシイミド、４−アミノフタルイミ
ド、Ｎ−ヒドロキシフタルイミド、Ｎ−アミノフタルイ
ミド、Ｎ−ブロモフタルイミド、Ｎ−メチルフタルイミ
ド、Ｎ−（シクロヘキシルチオ）フタルイミド、５−メ
チルイサチンから選択される環状イミドに作用し、それ
ぞれの開環体を生成する能力を有するものであれば、特
に限定されるものではないが、上述した本発明酵素、ま
たは、その機能的に均等な酵素を産生する微生物、該微
生物処理物が挙げられる。
体の製造方法＞本発明の微生物による製造方法で使用さ
れる微生物、微生物処理物は、フタルイミド、３，４−
ピリジンジカルボキシイミド、４−アミノフタルイミ
ド、Ｎ−ヒドロキシフタルイミド、Ｎ−アミノフタルイ
ミド、Ｎ−ブロモフタルイミド、Ｎ−メチルフタルイミ
ド、Ｎ−（シクロヘキシルチオ）フタルイミド、５−メ
チルイサチンから選択される環状イミドに作用し、それ
ぞれの開環体を生成する能力を有するものであれば、特
に限定されるものではないが、上述した本発明酵素、ま
たは、その機能的に均等な酵素を産生する微生物、該微
生物処理物が挙げられる。
【００２５】この様な微生物としては、例えばアルスロ
バクター（Arthrobacter）属に属する微生物が挙げら
れ、具体的菌株としては、アルスロバクター・エスピー
（Arthrobacter sp.）ＭＣＩ３６５２株、アルスロバク
ター・エスピー（Arthrobactersp.）ＭＣＩ３６５３株
およびこれらの近縁種が挙げられる。ＭＣＩ３６５２
株、ＭＣＩ３６５３株は、本発明者らにより天然土壌か
ら分離された菌株であり、それぞれ工業技術院生命工学
技術研究所（茨城県つくば市東一丁目１番３号）に平成
１１年１月２１日に受領され、ＦＥＲＭ Ｐ−１７１５
４およびＦＥＲＭ Ｐ−１７１５５として寄託されてい
る。
バクター（Arthrobacter）属に属する微生物が挙げら
れ、具体的菌株としては、アルスロバクター・エスピー
（Arthrobacter sp.）ＭＣＩ３６５２株、アルスロバク
ター・エスピー（Arthrobactersp.）ＭＣＩ３６５３株
およびこれらの近縁種が挙げられる。ＭＣＩ３６５２
株、ＭＣＩ３６５３株は、本発明者らにより天然土壌か
ら分離された菌株であり、それぞれ工業技術院生命工学
技術研究所（茨城県つくば市東一丁目１番３号）に平成
１１年１月２１日に受領され、ＦＥＲＭ Ｐ−１７１５
４およびＦＥＲＭ Ｐ−１７１５５として寄託されてい
る。
【００２６】ＭＣＩ３６５２株及びＭＣＩ３６５３株
は、１）グラム陽性桿菌、２）好気性、３）芽胞を形成
しない、４）多形性を示す、５）グルコース等の糖類か
ら酸を生成しない、６）細胞壁の主要アミノ酸としてリ
ジンを有する、７）細胞壁のアシル基型はアセチル型、
８）主要なイソプレノイドキノンはメナキノンＭＫ９
（Ｈ2）を有する、などの特徴を有している。これらの
特徴から、上記菌株はバージェイズマニュアル・システ
マティック・バクテリオロジー〔Bergey's Manualof Sy
stematic Bacteriology〕第２巻、１２８８〜１３０１
頁（１９８６）に記載されているアルスロバクター（Ar
throbacter）属に帰属するものと考えられた。
は、１）グラム陽性桿菌、２）好気性、３）芽胞を形成
しない、４）多形性を示す、５）グルコース等の糖類か
ら酸を生成しない、６）細胞壁の主要アミノ酸としてリ
ジンを有する、７）細胞壁のアシル基型はアセチル型、
８）主要なイソプレノイドキノンはメナキノンＭＫ９
（Ｈ2）を有する、などの特徴を有している。これらの
特徴から、上記菌株はバージェイズマニュアル・システ
マティック・バクテリオロジー〔Bergey's Manualof Sy
stematic Bacteriology〕第２巻、１２８８〜１３０１
頁（１９８６）に記載されているアルスロバクター（Ar
throbacter）属に帰属するものと考えられた。
【００２７】また、上記２種の菌株は、細胞壁のアミノ
酸および糖組成より、アルスロバクター ウレアファシ
エンス（Arthrobacter ureafaciens）またはアルスロバ
クター シトレウス（Arthrobacter citreus）に近縁で
あることが示唆された。そこで、上記２種の菌株の１６
ＳｒＤＮＡ（約１５００ｂｐ）の塩基配列をそれぞれ決
定し、データーベースにおいて検索を行った。その結
果、ＭＣＩ３６５２株と、アルスロバクター ウレアフ
ァシエンス及びアルスロバクター シトレウスとの相同
性は、それぞれ９９．４％及び９５．８％であった。さ
らに、ＭＣＩ３６５２株と、ＭＣＩ３６５３株との相同
性は、９９．３％であった。従って以上のことから、運
動性の有無で相違が見られたが、ＭＣＩ３６５２株及び
ＭＣＩ３６５３株は、アルスロバクター ウレアファシ
エンスに帰属させるのが妥当と考えられた。また上記２
種の菌株は、コロニー色調、無機窒素源利用、および１
６Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列の相違から、同種異株であるこ
とが判明した。
酸および糖組成より、アルスロバクター ウレアファシ
エンス（Arthrobacter ureafaciens）またはアルスロバ
クター シトレウス（Arthrobacter citreus）に近縁で
あることが示唆された。そこで、上記２種の菌株の１６
ＳｒＤＮＡ（約１５００ｂｐ）の塩基配列をそれぞれ決
定し、データーベースにおいて検索を行った。その結
果、ＭＣＩ３６５２株と、アルスロバクター ウレアフ
ァシエンス及びアルスロバクター シトレウスとの相同
性は、それぞれ９９．４％及び９５．８％であった。さ
らに、ＭＣＩ３６５２株と、ＭＣＩ３６５３株との相同
性は、９９．３％であった。従って以上のことから、運
動性の有無で相違が見られたが、ＭＣＩ３６５２株及び
ＭＣＩ３６５３株は、アルスロバクター ウレアファシ
エンスに帰属させるのが妥当と考えられた。また上記２
種の菌株は、コロニー色調、無機窒素源利用、および１
６Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列の相違から、同種異株であるこ
とが判明した。
【００２８】微生物の培養に用いる培養液としては、特
に限定されるものではないが、微生物が資化しうる炭素
源、窒素源、及び無機イオン等が含まれる。炭素源とし
ては、グルコース、フルクトース、サッカロース等の炭
水化物、グリセロール、マンニトール、キシリトール、
リビトール等のポリアルコール類、有機酸その他が適宜
使用される。窒素源としては、NZアミン、トリプトー
ス、酵母エキス、ポリペプトン、肉エキス、大豆抽出物
などの有機窒素源、あるいは硫酸アンモニウム塩、硝酸
アンモニウム塩などの無機窒素源、その他などが適宜使
用される。無機イオンとしては、リン酸イオン、マグネ
シウムイオン、鉄イオン、マンガンイオン、モリブデン
イオンその他が必要に応じ適宜使用される。更に、イノ
シトール、パントテン酸、ニコチン酸アミドその他のビ
タミン類を必要に応じ添加することは有効である。酵素
の誘導剤として、イミド類が適宜使用される。培養は、
好気的条件下に、ｐＨ約３〜１１、温度約４〜５０℃の
適当な範囲に制御しつつ１〜１００時間行う。
に限定されるものではないが、微生物が資化しうる炭素
源、窒素源、及び無機イオン等が含まれる。炭素源とし
ては、グルコース、フルクトース、サッカロース等の炭
水化物、グリセロール、マンニトール、キシリトール、
リビトール等のポリアルコール類、有機酸その他が適宜
使用される。窒素源としては、NZアミン、トリプトー
ス、酵母エキス、ポリペプトン、肉エキス、大豆抽出物
などの有機窒素源、あるいは硫酸アンモニウム塩、硝酸
アンモニウム塩などの無機窒素源、その他などが適宜使
用される。無機イオンとしては、リン酸イオン、マグネ
シウムイオン、鉄イオン、マンガンイオン、モリブデン
イオンその他が必要に応じ適宜使用される。更に、イノ
シトール、パントテン酸、ニコチン酸アミドその他のビ
タミン類を必要に応じ添加することは有効である。酵素
の誘導剤として、イミド類が適宜使用される。培養は、
好気的条件下に、ｐＨ約３〜１１、温度約４〜５０℃の
適当な範囲に制御しつつ１〜１００時間行う。
【００２９】本発明の微生物を用いた製造方法において
は、上記微生物の１種あるいは２種以上を用いて製造す
ることができる。微生物、微生物処理物としては、具体
的には、培養して得られた上記微生物をそのまま、ある
いは培養して得られた上記微生物を公知の手法で処理し
たもの、即ち、アセトン処理したもの、凍結乾燥処理し
たもの、物理的または酵素的に破砕したもの等の微生物
処理物、およびそれらの活性画分を用いることができ
る。
は、上記微生物の１種あるいは２種以上を用いて製造す
ることができる。微生物、微生物処理物としては、具体
的には、培養して得られた上記微生物をそのまま、ある
いは培養して得られた上記微生物を公知の手法で処理し
たもの、即ち、アセトン処理したもの、凍結乾燥処理し
たもの、物理的または酵素的に破砕したもの等の微生物
処理物、およびそれらの活性画分を用いることができ
る。
【００３０】さらには、このようにして得られた微生
物、微生物処理物等を通常の固定化技術を用いて、すな
わち、ポリアクリルアミド、カラギーナンゲル等の担体
に固定化したもの等を用いることも可能である。そこで
本明細書において、「微生物及び／または微生物処理
物」の用語は、上述の微生物、微生物処理物、及びそれ
らの固定化物全てを含有する概念として用いられる。
物、微生物処理物等を通常の固定化技術を用いて、すな
わち、ポリアクリルアミド、カラギーナンゲル等の担体
に固定化したもの等を用いることも可能である。そこで
本明細書において、「微生物及び／または微生物処理
物」の用語は、上述の微生物、微生物処理物、及びそれ
らの固定化物全てを含有する概念として用いられる。
【００３１】環状イミドの開環体を製造する方法とし
て、上述した微生物を培養し、得られた微生物及び／ま
たは微生物処理物に、環状イミドを添加し反応させ環状
イミドの開環体を得る方法、培地に環状イミドを添加し
培養と反応を同時に行う方法、あるいは培養終了後、環
状イミドを添加して更に反応を行う方法等を適宜用いる
ことができる。反応は温度４〜７０℃、好ましくは２０
〜５０℃の範囲で行い、ｐＨ２〜１１、好ましくは５〜
１０の範囲で行う。環状イミドの濃度は０．０００１〜
８０％、好ましくは０．０１〜５０％の範囲が望まし
く、必要ならば反応の間、環状イミドは追補添加され
る。
て、上述した微生物を培養し、得られた微生物及び／ま
たは微生物処理物に、環状イミドを添加し反応させ環状
イミドの開環体を得る方法、培地に環状イミドを添加し
培養と反応を同時に行う方法、あるいは培養終了後、環
状イミドを添加して更に反応を行う方法等を適宜用いる
ことができる。反応は温度４〜７０℃、好ましくは２０
〜５０℃の範囲で行い、ｐＨ２〜１１、好ましくは５〜
１０の範囲で行う。環状イミドの濃度は０．０００１〜
８０％、好ましくは０．０１〜５０％の範囲が望まし
く、必要ならば反応の間、環状イミドは追補添加され
る。
【００３２】培養及び反応で得られた環状イミドの開環
体の採取方法としては、微生物などの固形分を遠心分
離、フィルタープレス、限外濾過などの通常の分離装置
により除去した後に反応液を、有機溶媒による抽出、晶
析、カラムクロマトグラフィー、濃縮、蒸留などの分離
精製手段に供することにより光学活性体を得ることがで
き、分離精製手段は単独でまたは複数の手段を組み合わ
せて利用できる。前記有機溶媒としては例えばブタノー
ルなどのアルコール類、へキサン、シクロへキサン、ト
ルエン等の炭化水素類、クロロホルム、塩化メチレンな
どのハロゲン化炭化水素類、酢酸エチル、酢酸メチルな
どのエステル類、シクロヘキサノンなどのケトン類、エ
ーテル類、これらの混合溶媒などが利用できる。特にシ
クロヘキサノンは２，３−ピリジンジカルボキシイミド
の反応において有効である。本発明の微生物による製造
方法では、微生物またはその処理物の活性を利用して環
状イミドから環状イミドの開環体を簡便な方法で経済的
に有利に製造できる。
体の採取方法としては、微生物などの固形分を遠心分
離、フィルタープレス、限外濾過などの通常の分離装置
により除去した後に反応液を、有機溶媒による抽出、晶
析、カラムクロマトグラフィー、濃縮、蒸留などの分離
精製手段に供することにより光学活性体を得ることがで
き、分離精製手段は単独でまたは複数の手段を組み合わ
せて利用できる。前記有機溶媒としては例えばブタノー
ルなどのアルコール類、へキサン、シクロへキサン、ト
ルエン等の炭化水素類、クロロホルム、塩化メチレンな
どのハロゲン化炭化水素類、酢酸エチル、酢酸メチルな
どのエステル類、シクロヘキサノンなどのケトン類、エ
ーテル類、これらの混合溶媒などが利用できる。特にシ
クロヘキサノンは２，３−ピリジンジカルボキシイミド
の反応において有効である。本発明の微生物による製造
方法では、微生物またはその処理物の活性を利用して環
状イミドから環状イミドの開環体を簡便な方法で経済的
に有利に製造できる。
【００３３】
【実施例】以下に実施例を示し、本発明を具体的に説明
するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものでは
ない。
するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものでは
ない。
【００３４】〔参考例１〕ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ（０．０
３％）、酵母エキス（０．０１％）、グリセロール
（１．０％）、ＮＨ4Ｃｌ（０．４％）、フタルイミド
（０．５％）、リン酸緩衝液（１００ｍＭ、ｐＨ７．
０）を含む液体培地（以下、「培地Ａ」と称する）にて
培養したアルスロバクター・エスピー（Arthrobacter s
p.）ＭＣＩ３６５２株の湿菌体１ｇを、２ｍＬの酢酸ナ
トリウム緩衝液（ｐＨ５．５）に懸濁し、そこへ２０ｍ
Ｍの２，３−ピリジンジカルボキシイミド（ＰＤＩ）を
含むシクロヘキサノン溶液２ｍＬを添加し、３０℃、３
００ｒｐｍにて振とう反応を行った。このようにして反
応を行うことにより、ＰＤＩは有機相から供給され、そ
して反応が水相で行われることとなり、ＰＤＩの自然に
起きる無作為な加水分解を防ぐことができる。
３％）、酵母エキス（０．０１％）、グリセロール
（１．０％）、ＮＨ4Ｃｌ（０．４％）、フタルイミド
（０．５％）、リン酸緩衝液（１００ｍＭ、ｐＨ７．
０）を含む液体培地（以下、「培地Ａ」と称する）にて
培養したアルスロバクター・エスピー（Arthrobacter s
p.）ＭＣＩ３６５２株の湿菌体１ｇを、２ｍＬの酢酸ナ
トリウム緩衝液（ｐＨ５．５）に懸濁し、そこへ２０ｍ
Ｍの２，３−ピリジンジカルボキシイミド（ＰＤＩ）を
含むシクロヘキサノン溶液２ｍＬを添加し、３０℃、３
００ｒｐｍにて振とう反応を行った。このようにして反
応を行うことにより、ＰＤＩは有機相から供給され、そ
して反応が水相で行われることとなり、ＰＤＩの自然に
起きる無作為な加水分解を防ぐことができる。
【００３５】反応４０分後、遠心分離（3,500ｒｐｍ、
１０分）により酢酸ナトリウム緩衝液相と、シクロヘキ
サン相を分離後、それぞれの相におけるＰＤＩ含量をＨ
ＰＬＣ（カラム：Cosmosil 5C18AR-II、溶媒組成：水／
アセトニトリル／トリフルオロ酢酸＝９０／１０／０．
１、送液量：１ｍＬ／ｍｉｎ、検出器：ＵＶ２１０ｎ
ｍ）で分析したところ、ＰＤＩの消失が観察されたの
で、シクロヘキサン相を２０ｍＭ ＰＤＩを含む新たな
シクロヘキサン溶液に交換し、さらに８０分間反応を継
続した。図１に反応の進行に伴うＰＤＩの減少、３−カ
ルバモイル−α−ピコリン酸（α−３ＣＰ）、２−カル
バモイル−β−ピコリン酸（β−２ＣＰ）、２，３−ピ
リジンジカルボン酸（ＰＤＣ）の生成を示す。計１２０
分の反応において累計４０ｍＭのＰＤＩから、３６．６
ｍＭのα−３ＣＰ、２．１ｍＭのβ−２ＣＰが生成し
た。
１０分）により酢酸ナトリウム緩衝液相と、シクロヘキ
サン相を分離後、それぞれの相におけるＰＤＩ含量をＨ
ＰＬＣ（カラム：Cosmosil 5C18AR-II、溶媒組成：水／
アセトニトリル／トリフルオロ酢酸＝９０／１０／０．
１、送液量：１ｍＬ／ｍｉｎ、検出器：ＵＶ２１０ｎ
ｍ）で分析したところ、ＰＤＩの消失が観察されたの
で、シクロヘキサン相を２０ｍＭ ＰＤＩを含む新たな
シクロヘキサン溶液に交換し、さらに８０分間反応を継
続した。図１に反応の進行に伴うＰＤＩの減少、３−カ
ルバモイル−α−ピコリン酸（α−３ＣＰ）、２−カル
バモイル−β−ピコリン酸（β−２ＣＰ）、２，３−ピ
リジンジカルボン酸（ＰＤＣ）の生成を示す。計１２０
分の反応において累計４０ｍＭのＰＤＩから、３６．６
ｍＭのα−３ＣＰ、２．１ｍＭのβ−２ＣＰが生成し
た。
【００３６】〔実施例１〕３Ｌの培地Ａに、アルスロバ
クター・エスピーＭＣＩ３６５２株を接種し、５Ｌジャ
ーファーメンターを用いて２８℃、４８時間培養した。
計６Ｌの培地から得られた２５ｇの湿菌体を２５ｍＬの
２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）に懸濁後、ダ
イノ-ミル（DYNO-MILL、ウイリー・エー・バコーフェン
社製）によりガラスビーズで破砕し、破砕液を遠心分離
（10,000rpm、３０分）することにより無細胞抽出液を
得た。得られた無細胞抽出液について、DEAE-Sephacel
カラム（ファルマシア社製）を用いたアニオン交換クロ
マトグラフィーを行い、塩化ナトリウムの濃度勾配溶出
により本酵素活性を有する画分を回収した。さらに得ら
れた活性画分について硫酸アンモニウムによる塩析を行
い、活性を示す４０−６０％飽和画分を回収した。この
画分を Phenyl-Sepharose HR10/10カラム（ファルマシ
ア社製）を用いた疎水性カラムクロマトグラフィーによ
り精製し、最後に Mono Q 5/5カラム（ファルマシア社
製）を用いたアニオン交換クロマトグラフィーを行い、
最終精製酵素標本を得た。
クター・エスピーＭＣＩ３６５２株を接種し、５Ｌジャ
ーファーメンターを用いて２８℃、４８時間培養した。
計６Ｌの培地から得られた２５ｇの湿菌体を２５ｍＬの
２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）に懸濁後、ダ
イノ-ミル（DYNO-MILL、ウイリー・エー・バコーフェン
社製）によりガラスビーズで破砕し、破砕液を遠心分離
（10,000rpm、３０分）することにより無細胞抽出液を
得た。得られた無細胞抽出液について、DEAE-Sephacel
カラム（ファルマシア社製）を用いたアニオン交換クロ
マトグラフィーを行い、塩化ナトリウムの濃度勾配溶出
により本酵素活性を有する画分を回収した。さらに得ら
れた活性画分について硫酸アンモニウムによる塩析を行
い、活性を示す４０−６０％飽和画分を回収した。この
画分を Phenyl-Sepharose HR10/10カラム（ファルマシ
ア社製）を用いた疎水性カラムクロマトグラフィーによ
り精製し、最後に Mono Q 5/5カラム（ファルマシア社
製）を用いたアニオン交換クロマトグラフィーを行い、
最終精製酵素標本を得た。
【００３７】さらに各精製工程におけるタンパク質の酵
素活性を、１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．
０）、１．２５ｍＭの２，３−ピリジンジカルボキシイ
ミド、０．０３mgの各精製工程におけるタンパク質を含
む、２００μＬの反応液を３０℃にてインキュベートす
ることにより反応を行い、基質２，３−ピリジンジカル
ボキシイミドの減少にともなう２８５ｎｍの吸光度の減
少を吸光光度計にてモニターすることにより測定した。
各工程における、総タンパク質量、総活性、比活性、及
び精製度を表１に示す。
素活性を、１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．
０）、１．２５ｍＭの２，３−ピリジンジカルボキシイ
ミド、０．０３mgの各精製工程におけるタンパク質を含
む、２００μＬの反応液を３０℃にてインキュベートす
ることにより反応を行い、基質２，３−ピリジンジカル
ボキシイミドの減少にともなう２８５ｎｍの吸光度の減
少を吸光光度計にてモニターすることにより測定した。
各工程における、総タンパク質量、総活性、比活性、及
び精製度を表１に示す。
【００３８】
【表１】 表１ ──────────────────────────────────── 精製工程 総タンパク質量 総活性 比活性 精製度 （mg） （μmol/min）（μmol/min/mg） 倍 ──────────────────────────────────── 無細胞抽出液 1150 645 0.56 1 DEAE-Sephacel 344 542 1.58 2.8 硫酸アンモニウム画分 96.6 177 1.83 3.24 Phenyl-Sepharose 3.80 168 44.3 78.6 HR10/10 Mono Q HR5/5 0.34 23.0 68.6 123 ────────────────────────────────────
【００３９】得られた本酵素標本は、SDS-PAGE（１２．
５％ポリアクリルアミド）において２本のバンドを示
し、分子量マーカーとして（タンパク質分子量マーカー
「第一」III、第一化学薬品株式会社製）を用いた場
合、その分子量はそれぞれ32,500および30,000ダルトン
であると推定された。この２本のバンドをPVDF膜に転写
後切り出し、それぞれのＮ末端アミノ酸配列をプロテイ
ンシークエンサー（Model476A、アプライドバイオシス
テムズ社製）により自動エドマン分解法にて解読した。
その結果、それぞれのポリペプチドのＮ末端アミノ酸配
列は、下記に示すように、測定したＮ末端アミノ酸の最
初の３０アミノ酸が全く同一であることが明かにされ
た。 30,000ダルトンのポリペプチド：ＸＤＮＲＬＹＤＹＳＡ
ＩＶＤＲＰＡＬＱＷＰＤＧＫＲＶＡＦＹＶＧ（配列番号
１） 32,500ダルトンのポリペプチド：ＸＤＮＲＬＹＤＹＳＡ
ＩＶＤＲＰＡＬＱＷＰＤＧＫＲＶＡＦＹＶＧＬＮＩＤ
（配列番号２）
５％ポリアクリルアミド）において２本のバンドを示
し、分子量マーカーとして（タンパク質分子量マーカー
「第一」III、第一化学薬品株式会社製）を用いた場
合、その分子量はそれぞれ32,500および30,000ダルトン
であると推定された。この２本のバンドをPVDF膜に転写
後切り出し、それぞれのＮ末端アミノ酸配列をプロテイ
ンシークエンサー（Model476A、アプライドバイオシス
テムズ社製）により自動エドマン分解法にて解読した。
その結果、それぞれのポリペプチドのＮ末端アミノ酸配
列は、下記に示すように、測定したＮ末端アミノ酸の最
初の３０アミノ酸が全く同一であることが明かにされ
た。 30,000ダルトンのポリペプチド：ＸＤＮＲＬＹＤＹＳＡ
ＩＶＤＲＰＡＬＱＷＰＤＧＫＲＶＡＦＹＶＧ（配列番号
１） 32,500ダルトンのポリペプチド：ＸＤＮＲＬＹＤＹＳＡ
ＩＶＤＲＰＡＬＱＷＰＤＧＫＲＶＡＦＹＶＧＬＮＩＤ
（配列番号２）
【００４０】また、本酵素標本を未変性下でゲル濾過法
（TSK G3000-SW、トーソー（株）社製）により分子量を
測定したところ、分子量マーカーとして（MW-MARKER（H
PLC）、オリエンタル酵母株式会社製）を用いた場合、1
0,100ダルトンであること推定された。以上のことか
ら、分子量30,000ダルトンのポリペプチドは、分子量3
2,000ダルトンのポリペプチドがプロテアーゼ消化を受
けて生成されたものであることが示唆され、さらに本酵
素は分子量32,500のタンパク質から構成されるとする
と、ホモ３量体であると示唆された。
（TSK G3000-SW、トーソー（株）社製）により分子量を
測定したところ、分子量マーカーとして（MW-MARKER（H
PLC）、オリエンタル酵母株式会社製）を用いた場合、1
0,100ダルトンであること推定された。以上のことか
ら、分子量30,000ダルトンのポリペプチドは、分子量3
2,000ダルトンのポリペプチドがプロテアーゼ消化を受
けて生成されたものであることが示唆され、さらに本酵
素は分子量32,500のタンパク質から構成されるとする
と、ホモ３量体であると示唆された。
【００４１】〔実施例２〕１００ｍＭリン酸カリウム緩
衝液（ｐＨ７．０）、１．２５ｍＭ ２，３−ピリジン
ジカルボキシイミド、０．２ユニットの実施例１と同様
の精製方法により得られた本酵素標本（１ユニットは
２，３−ピリジンジカルボキシイミドを基質として１分
間に１マイクロモルの基質を変換する酵素量）を含む、
２００μＬの反応液を３０℃にてインキュベートするこ
とにより反応を行った。反応の進行は基質２，３−ピリ
ジンジカルボキシイミドの減少にともなう２８５ｎｍの
吸光度の減少を吸光光度計にてモニターすること、ある
いは、基質２，３−ピリジンジカルボキシイミドの減少
をＨＰＬＣ（カラム：Cosmosil 5C18AR-II、溶媒組成：
水／アセトニトリル／トリフルオロ酢酸＝９０／１０／
０．１、送液量：１ｍＬ／ｍｉｎ、検出器：ＵＶ２１０
ｎｍ）にて定量することにより行った。反応終了後の反
応液をＨＰＬＣにより分析したところ、３−カルバモイ
ル−α−ピコリン酸と２−カルバモイル−β−ピコリン
酸が、約８５：１５の比で生成していた。
衝液（ｐＨ７．０）、１．２５ｍＭ ２，３−ピリジン
ジカルボキシイミド、０．２ユニットの実施例１と同様
の精製方法により得られた本酵素標本（１ユニットは
２，３−ピリジンジカルボキシイミドを基質として１分
間に１マイクロモルの基質を変換する酵素量）を含む、
２００μＬの反応液を３０℃にてインキュベートするこ
とにより反応を行った。反応の進行は基質２，３−ピリ
ジンジカルボキシイミドの減少にともなう２８５ｎｍの
吸光度の減少を吸光光度計にてモニターすること、ある
いは、基質２，３−ピリジンジカルボキシイミドの減少
をＨＰＬＣ（カラム：Cosmosil 5C18AR-II、溶媒組成：
水／アセトニトリル／トリフルオロ酢酸＝９０／１０／
０．１、送液量：１ｍＬ／ｍｉｎ、検出器：ＵＶ２１０
ｎｍ）にて定量することにより行った。反応終了後の反
応液をＨＰＬＣにより分析したところ、３−カルバモイ
ル−α−ピコリン酸と２−カルバモイル−β−ピコリン
酸が、約８５：１５の比で生成していた。
【００４２】その他の基質、フタルイミド、３，４−ピ
リジンジカルボキシイミド、４−アミノフタルイミド、
Ｎ−ヒドロキシフタルイミド、Ｎ−アミノフタルイミ
ド、Ｎ−ブロモフタルイミド、Ｎ−メチルフタルイミ
ド、Ｎ−（シクロヘキシルチオ）フタルイミド、５−メ
チルイサチンについても同様の反応を行い、基質の減少
をＨＰＬＣにて定量した。生成物の確認も同様に行い、
ＨＰＬＣで確認できる生成物は１ピークのみであり、対
応する環状イミドの開環体が定量的に生成していること
を確認した。また、反応における各基質の濃度、酵素の
相対活性、ミカエリス定数（Km）、Vmax、Vmax/Kmを、
表２に示す。また、表２中において、フタルイミド、
２，３−ピリジンジカルボキシイミド、３，４−ピリジ
ンジカルボキシイミド、４−アミノフタルイミド、Ｎ−
ヒドロキシフタルイミド、Ｎ−アミノフタルイミド、Ｎ
−ブロモフタルイミド、Ｎ−メチルフタルイミド、Ｎ−
（シクロヘキシルチオ）フタルイミド、５−メチルイサ
チンは、それぞれ、化合物Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、
Ｈ、Ｉ、Ｊとして示してある。
リジンジカルボキシイミド、４−アミノフタルイミド、
Ｎ−ヒドロキシフタルイミド、Ｎ−アミノフタルイミ
ド、Ｎ−ブロモフタルイミド、Ｎ−メチルフタルイミ
ド、Ｎ−（シクロヘキシルチオ）フタルイミド、５−メ
チルイサチンについても同様の反応を行い、基質の減少
をＨＰＬＣにて定量した。生成物の確認も同様に行い、
ＨＰＬＣで確認できる生成物は１ピークのみであり、対
応する環状イミドの開環体が定量的に生成していること
を確認した。また、反応における各基質の濃度、酵素の
相対活性、ミカエリス定数（Km）、Vmax、Vmax/Kmを、
表２に示す。また、表２中において、フタルイミド、
２，３−ピリジンジカルボキシイミド、３，４−ピリジ
ンジカルボキシイミド、４−アミノフタルイミド、Ｎ−
ヒドロキシフタルイミド、Ｎ−アミノフタルイミド、Ｎ
−ブロモフタルイミド、Ｎ−メチルフタルイミド、Ｎ−
（シクロヘキシルチオ）フタルイミド、５−メチルイサ
チンは、それぞれ、化合物Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、
Ｈ、Ｉ、Ｊとして示してある。
【００４３】
【表２】 表２ ──────────────────────────────────── 基質 濃度 相対活性 Ｋｍ Ｖmax Ｖmax/Ｋm （mM） （％） （mM） （μmol/min/mg）（μmol/min/mg/mM） ──────────────────────────────────── 化合物Ａ 0.6 49.5 0.207 15.8 76.3 化合物Ｂ 1.25 100 0.667 114 171 化合物Ｃ 1.25 70.2 0.333 133 399 化合物Ｄ 0.6 0.461 n.d n.d n.d 化合物Ｅ 1.25 2.24 n.d n.d n.d 化合物Ｆ 1.25 0.474 n.d n.d n.d 化合物Ｇ 1.0 0.509 n.d n.d n.d 化合物Ｈ 1.25 n.d n.d n.d n.d 化合物Ｉ 0.6 3.61 n.d n.d n.d 化合物Ｊ 1.0 0.952 n.d n.d n.d ──────────────────────────────────── n.dは未測定。
【００４４】〔実施例３〕実施例１と同様の精製方法に
よって得られた本酵素標本の、至適ｐＨ、至適温度、安
定ｐＨ、安定温度等の特性評価を行った。尚、以下の標
準測定条件、１．２５ｍＭ ２，３−ピリジンジカルボ
キシイミド、０．２ユニットの本酵素標本を含む容量２
００μlの反応液、２８５ｎｍの吸光度の減少に基づい
た２，３−ピリジンジカルボキシイミド減少量の測定方
法は特に記載の無い限り同一であるものとする。 至適ｐＨ 上記の標準測定条件において、反応を３０℃の温度で行
い、緩衝液とｐＨを変えることにより、緩衝液とｐＨの
影響を調べた結果を図２に示す。図２中、□は酢酸／酢
酸ナトリウム緩衝液、◇はリン酸カリウム緩衝液、○は
トリス／ＨＣｌ緩衝液、△はホウ酸塩／ＮａＯＨ緩衝液
である。その結果、ｐＨ９付近が至適ｐＨであることが
判明した。 至適温度 上記の標準測定条件において、１００ｍＭリン酸カリウ
ム緩衝液を含む反応液（ｐＨ７．０）で、３０〜６０℃
まで温度を変化させることにより、温度の影響を調べた
結果を図３に示す。その結果、４５℃付近が至適温度で
あることが判明した。 安定ｐＨ 上記の標準測定条件において、３０℃、２０分間の処理
で、緩衝液とｐＨを変え、緩衝液とｐＨの影響を調べた
結果を図４に示す。図２中、□は酢酸／酢酸ナトリウム
緩衝液、◇はリン酸カリウム緩衝液、○はトリス／ＨＣ
ｌ緩衝液、△はグリシン／ＮａＯＨ緩衝液である。その
結果、ｐＨ５〜９付近が安定ｐＨであることが判明し
た。 安定温度 上記の標準測定条件において、１００ｍＭリン酸カリウ
ム緩衝液を含む反応液（ｐＨ７．４）、２０分間の処理
で、２０〜６０℃まで温度を変化させることにより、温
度の影響を調べた結果を図５に示す。その結果、約３０
℃未満が安定温度であることが判明した。
よって得られた本酵素標本の、至適ｐＨ、至適温度、安
定ｐＨ、安定温度等の特性評価を行った。尚、以下の標
準測定条件、１．２５ｍＭ ２，３−ピリジンジカルボ
キシイミド、０．２ユニットの本酵素標本を含む容量２
００μlの反応液、２８５ｎｍの吸光度の減少に基づい
た２，３−ピリジンジカルボキシイミド減少量の測定方
法は特に記載の無い限り同一であるものとする。 至適ｐＨ 上記の標準測定条件において、反応を３０℃の温度で行
い、緩衝液とｐＨを変えることにより、緩衝液とｐＨの
影響を調べた結果を図２に示す。図２中、□は酢酸／酢
酸ナトリウム緩衝液、◇はリン酸カリウム緩衝液、○は
トリス／ＨＣｌ緩衝液、△はホウ酸塩／ＮａＯＨ緩衝液
である。その結果、ｐＨ９付近が至適ｐＨであることが
判明した。 至適温度 上記の標準測定条件において、１００ｍＭリン酸カリウ
ム緩衝液を含む反応液（ｐＨ７．０）で、３０〜６０℃
まで温度を変化させることにより、温度の影響を調べた
結果を図３に示す。その結果、４５℃付近が至適温度で
あることが判明した。 安定ｐＨ 上記の標準測定条件において、３０℃、２０分間の処理
で、緩衝液とｐＨを変え、緩衝液とｐＨの影響を調べた
結果を図４に示す。図２中、□は酢酸／酢酸ナトリウム
緩衝液、◇はリン酸カリウム緩衝液、○はトリス／ＨＣ
ｌ緩衝液、△はグリシン／ＮａＯＨ緩衝液である。その
結果、ｐＨ５〜９付近が安定ｐＨであることが判明し
た。 安定温度 上記の標準測定条件において、１００ｍＭリン酸カリウ
ム緩衝液を含む反応液（ｐＨ７．４）、２０分間の処理
で、２０〜６０℃まで温度を変化させることにより、温
度の影響を調べた結果を図５に示す。その結果、約３０
℃未満が安定温度であることが判明した。
【００４５】
【発明の効果】本発明により、環状イミドから開環体を
生成することができるイミダーゼが提供される。また、
本発明のイミダーゼは、基質２，３−ピリジンジカルボ
キシイミドから選択的に３−カルバモイル−α−ピコリ
ン酸を生成できるため、特に有用環状イミドの開環体の
選択的な合成を行う製造方法が提供される。さらに、微
生物を用いた環状イミドの開環体の製造方法が提供され
る。
生成することができるイミダーゼが提供される。また、
本発明のイミダーゼは、基質２，３−ピリジンジカルボ
キシイミドから選択的に３−カルバモイル−α−ピコリ
ン酸を生成できるため、特に有用環状イミドの開環体の
選択的な合成を行う製造方法が提供される。さらに、微
生物を用いた環状イミドの開環体の製造方法が提供され
る。
【００４６】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> 三菱化学株式会社（Mitsubishi Chemical Corporation） <120> 新規イミダーゼ及びそれを用いたβ−カルバモイルカルボン酸誘導体の製 造方法 <130> J05276 <160> 2 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 30 <212> PRT <213> Arthrobacter ureafaciens <220> <221> UNSURE <222> (1) <223> Xaa=unkwnon <400> 1 Xaa Asp Asn Arg Leu Tyr Asp Tyr Ser Ala Ile Val Asp Arg Pro Ala 1 5 10 15 Leu Gln Trp Pro Asp Gly Lys Arg Val Ala Phe Tyr Val Gly 20 25 30 <210> 2 <211> 34 <212> PRT <213> Arthrobacter ureafaciens <220> <221> UNSURE <222> (1) <223> Xaa=unkwnon <400> 2 Xaa Asp Asn Arg Leu Tyr Asp Tyr Ser Ala Ile Val Asp Arg Pro Ala 1 5 10 15 Leu Gln Trp Pro Asp Gly Lys Arg Val Ala Phe Tyr Val Gly Leu Asn 20 25 30 Ile Asp
【図１】 本発明のイミダーゼによる、酵素反応の時間
経過による基質および反応生成物の濃度の変化を示す。
経過による基質および反応生成物の濃度の変化を示す。
【図２】 本発明のイミダーゼの２，３−ピリジンジカ
ルボキシイミドの加水分解における至適ｐＨを明かにす
る、ｐＨと相対活性との関係を示す。
ルボキシイミドの加水分解における至適ｐＨを明かにす
る、ｐＨと相対活性との関係を示す。
【図３】 本発明のイミダーゼの２，３−ピリジンジカ
ルボキシイミドの加水分解における至適温度を明かにす
る、温度と相対活性との関係を示す。
ルボキシイミドの加水分解における至適温度を明かにす
る、温度と相対活性との関係を示す。
【図４】 本発明のイミダーゼのｐＨ安定性を明かにす
る、ｐＨと相対活性との関係を示す。
る、ｐＨと相対活性との関係を示す。
【図５】 本発明のイミダーゼの温度安定性を明かにす
る、温度と相対活性との関係を示す。
る、温度と相対活性との関係を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｒ 1:06） Ｃ１２Ｒ 1:06） (Ｃ１２Ｎ 1/20 (Ｃ１２Ｎ 1/20 Ｃ１２Ｒ 1:06） Ｃ１２Ｒ 1:06） (Ｃ１２Ｐ 13/02 (Ｃ１２Ｐ 13/02 Ｃ１２Ｒ 1:06） Ｃ１２Ｒ 1:06） (Ｃ１２Ｐ 17/12 (Ｃ１２Ｐ 17/12 Ｃ１２Ｒ 1:06） Ｃ１２Ｒ 1:06） Ｆターム(参考） 4B050 CC01 FF04E FF09E FF11E LL05 4B064 AE02 AE49 CA02 CA21 CB06 CC03 CD12 DA16 4B065 AA13X AC14 BA22 BB13 CA16 CA18 CA31 CA44 CA47
Claims (7)
- 【請求項１】 下記理化学的性質を有するイミダーゼ。 （１）作用：環状イミドを加水分解し、開環体を生成す
る。 （２）基質特異性：フタルイミド、２，３−ピリジンジ
カルボキシイミド、３，４−ピリジンジカルボキシイミ
ド、４−アミノフタルイミド、Ｎ−ヒドロキシフタルイ
ミド、Ｎ−アミノフタルイミド、Ｎ−ブロモフタルイミ
ド、Ｎ−メチルフタルイミド、Ｎ−（シクロヘキシルチ
オ）フタルイミド、５−メチルイサチンの環状イミドを
加水分解するが、ヒダントイン、ジヒドロウラシル、グ
ルタル酸イミド、コハク酸イミドの環状イミドを加水分
解しない。 - 【請求項２】 さらに下記の理化学的性質を有する、請
求項１記載のイミダーゼ。 （３）ＴＳＫ Ｇ３０００ＳＷ（トーソー（株））を用
いたゲル濾過法により測定される分子量：約１０１，０
００ダルトン （４）ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動におい
て、少なくとも３２，５００ダルトンと推定されるポリ
ペプチドのバンドを示す。 （５）アミノ末端のアミノ酸配列が配列番号１で示され
るポリペプチドを含む。 - 【請求項３】 さらに下記の理化学的性質を有する、請
求項１又は２記載のイミダーゼ。 （６）至適ｐＨ：９付近（２，３−ピリジンジカルボキ
シイミドを基質とした場合） （７）至適温度：４５℃付近（２，３−ピリジンジカル
ボキシイミドを基質とした場合） （８）安定ｐＨ：５〜９付近（３０℃、２０分の処理） （９）安定温度：約３０℃未満（ｐＨ７．４、２０分の
処理） - 【請求項４】 さらに下記理化学的性質を有する、請求
項１〜３の何れか一項記載のイミダーゼ。 （１０）阻害：ｐ−クロロメルクリ安息香酸塩によって
活性が阻害される。Ｆｅ2+によって活性が阻害される。 （１１）ミカエリス定数（Ｋｍ）： 約２．０７×１０-4Ｍ（フタルイミドを基質とした場
合） 約６．６７×１０-4Ｍ（２，３−ピリジンジカルボキシ
イミドを基質とした場合） 約３．３３×１０-4Ｍ（３，４−ピリジンジカルボキシ
イミドを基質とした場合） - 【請求項５】 フタルイミド、２，３−ピリジンジカル
ボキシイミド、３，４−ピリジンジカルボキシイミド、
４−アミノフタルイミド、Ｎ−ヒドロキシフタルイミ
ド、Ｎ−アミノフタルイミド、Ｎ−ブロモフタルイミ
ド、Ｎ−メチルフタルイミド、Ｎ−（シクロヘキシルチ
オ）フタルイミド、５−メチルイサチンからなる群から
選択される環状イミドに、請求項１〜４のいずれか一項
に記載のイミダーゼを作用させて、該環状イミドの開環
体を生成させることを特徴とする環状イミドの開環体の
製造方法。 - 【請求項６】 フタルイミド、３，４−ピリジンジカル
ボキシイミド、４−アミノフタルイミド、Ｎ−ヒドロキ
シフタルイミド、Ｎ−アミノフタルイミド、Ｎ−ブロモ
フタルイミド、Ｎ−メチルフタルイミド、Ｎ−（シクロ
ヘキシルチオ）フタルイミド、５−メチルイサチンから
選択される環状イミドに作用し、それぞれの開環体を生
成する能力を有する微生物および／または微生物処理物
を、フタルイミド、３，４−ピリジンジカルボキシイミ
ド、４−アミノフタルイミド、Ｎ−ヒドロキシフタルイ
ミド、Ｎ−アミノフタルイミド、Ｎ−ブロモフタルイミ
ド、Ｎ−メチルフタルイミド、Ｎ−（シクロヘキシルチ
オ）フタルイミド、５−メチルイサチンからなる群から
選択される環状イミドに作用させて、該環状イミドの開
環体を生成させることを特徴とする環状イミドの開環体
の製造方法。 - 【請求項７】 前記微生物は、アルスロバクター属に属
する微生物である、請求項６記載の環状イミドの開環体
の製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000231765A JP2002045178A (ja) | 2000-07-31 | 2000-07-31 | 新規イミダーゼ及びそれを用いたβ−カルバモイルカルボン酸誘導体の製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000231765A JP2002045178A (ja) | 2000-07-31 | 2000-07-31 | 新規イミダーゼ及びそれを用いたβ−カルバモイルカルボン酸誘導体の製造方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2002045178A true JP2002045178A (ja) | 2002-02-12 |
Family
ID=18724549
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000231765A Pending JP2002045178A (ja) | 2000-07-31 | 2000-07-31 | 新規イミダーゼ及びそれを用いたβ−カルバモイルカルボン酸誘導体の製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2002045178A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1326993C (zh) * | 2005-05-25 | 2007-07-18 | 山西大学 | 一种环亚胺水解酶基因及其表达蛋白的应用 |
-
2000
- 2000-07-31 JP JP2000231765A patent/JP2002045178A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1326993C (zh) * | 2005-05-25 | 2007-07-18 | 山西大学 | 一种环亚胺水解酶基因及其表达蛋白的应用 |
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