JP2001522479A - レーザ走査顕微鏡の校正装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 有利には共焦点レーザ操作顕微鏡の校正装置ないしは校正方法であって、対象物（１）が走査ビーム（２）により走査される形式のものにおいて、簡単かつ任意の頻度で実施可能な構成のために、中間結像（１１）の面に配置された校正手段（１２）が同じく走査ビーム（２）により走査される。

Description

【発明の詳細な説明】 ［発明の名称］ レーザ走査顕微鏡の校正装置 ［技術分野］ 本発明は、有利には共焦点レーザ走査顕微鏡の校正装置に関し、ここで対象物 は走査ビームにより走査される。さらに本発明は相応する方法に関する。 ［技術的背景］ 微細対象物を表示するためにレーザ走査顕微鏡、とりわけ共焦点のレーザ走査 顕微鏡がますます使用されるようになっている。共焦点構成に基づき、このよう なシステムは構造体を３次元結像するのに非常に適し、厚い試料を蛍光撮像する 際には驚くほどの画像品質が得られる。しかしこのようなシステムを定量分析に 使用する際には、システムの構成に大きな困難性が発生する。すなわち絶対強度 を測定すべき場合に困難性が発生する。 レーザの強度は通常、管電流の調整によって所定の領域にわたり調整変化され る。マルチラインレーザおよび混合ガスレーザの場合、それに加えてラインの強 度特性も相互に変化する。さらに、すべてのレーザにおいて強度の緩慢な変化（ ドリフト）と強度の急速な変化（ノイズ、モード変動）が発生する。レーザの自 動光制御によって通常は次のような場合に寿命が短縮される。すなわち、これも 大きな電流によって補償される内部調整不良が発生する場合である。 さらなる問題として、対物レンズの瞳開口度の大きさが異なる。しかしこの対 物レンズをビームによって、顕微鏡の回折限界に近い分解能を達成するために照 射しなければならないから、試料に向かって拡大されるレーザの光量は対物レン ズに依存して大きく異なることになる。 検知器前方の共焦点ピンホールは通常、微細機械的に構成され、大きさの校正 を必要とする。しかし点像分布関数の一部を“切り出した”際のピンホール作用 もまたそれぞれの倍率に依存する。 共焦点レーザ走査顕微鏡では通常、フォトマルチプライヤ（光電増倍器）が検 知器として使用される。測定すべき信号の大きなダイナミック特性のため通常は 、高電圧をフォトマルチプライヤのダイノードに使用する。所定の高電圧に対し てＰＭＴ（光電増倍管）の出力信号は入力強度に対して線形であるが、ＰＭＴに おける増幅率は高電圧に依存して非線形であり、個別に大きく変化する。 別の問題は、モノモード光導波ファイバは種々のレーザモードを選別すること ができ、これによりレーザのモード変動が強度変動につながり得ることである。 レーザへの逆反射はレーザ内部の制御機構を妨害することがあり、これが強度変 動につながることがある。 さらにミラーによるビームの高速走査の際には、慣性と制御器の不完全性によ り走査ビームが目標軌跡から偏差する。これはとりわけ最速で走査された座標に 対して発生する。 実際上の理由から、システムの関与するすべての成分を個別に補正し、校正す ることは非常に面倒である。 ［発明の開示］ 本発明の課題は、（有利には共焦点の）レーザ走査顕微鏡の校正装置であって 成分全体の校正を簡単な手段により行うことができるものを提供することであり 、自動校正も可能であるようにするべきである。さらに本発明は、相応する方法 を提供するものである。 冒頭に述べた形式の本発明の装置は前記課題を請求項１に記載の構成によって 解決する。これによれば、（有利には共焦点の）レーザ顕微鏡の校正装置におい て、中間結像面に校正手段が配置されており、この校正手段も同じく走査ビーム によって走査される。 本発明によれば、システムの成分全体を個別に補正および校正することに意味 がないことが認識される。むしろ簡単な手段により、システム全体ないしは成分 の大多数を同時に校正することができる。ここで光源の明度変動は検知の際に考 慮可能である。このような校正は、中間結像面に相応の校正手段を配置し、この 校正手段が対象物と同じく走査ビームにより掃引ないしは走査される。このこと により校正を本来の撮像中に、ないしは対象物の走査前および／または走査後に 行うことができる。 特に有利には、校正手段は中間結像面で本来の画像野の領域に旋回導入可能で ある。この限りにおいて校正手段は中間画像の箇所、画像野へ配置される。しか し校正手段を、本来の画像野の外にある中間結像の縁部に配置することも考えら れる。この場合このような装置構成は定置とすることができる。校正手段を移動 するための機構はこの場合には必要ない。従ってこれは本発明の思想の特に簡単 な構成である。 校正手段は一方では測定手段、他方では基準構造体とすることができる。これ はどの成分を校正するかによる。測定手段としては検知手段が考えられ、この検 知手段はレーザ出力（Leistung）測定およびレーザ校正に用いる。具体的には検 知手段はフォトダイオードとすることができる。 校正手段が基準構造体である場合には、校正すべき成分に応じて、多数の種々 異なる構造体を使用できる。基準構造体は例えばグリッド（格子）として構成す 校正に用いる。 同じように基準構造体をテープとして構成することも考えられる。このテープ もまた画像位置校正に用いることができる。 基本的に基準構造体は別の実施例の枠内で有利には面状のパターン（Muster） として構成することができる。このパターンはスキャナないしは走査ビームの往 復運動の位相校正に用いる。 基準構造体は３次元構造体とすることもできる。この３次元構造体は光学系な いしはピンホール位置の校正に用いる。３次元構造体（３Ｄ構造体）は、段、切 欠部等とすることができる。 基準構造体の別の実施例の枠内では、この構造体をアクティブに例えば発光手 段として構成することが可能である。この発光手段は検知器の校正に用いる。発 光手段はまた種々異なるスペクトルを有することができ、具体的には発光ダイオ ードとすることができる。 さらに基準構造体を走査ビームと交互作用を示す手段として構成することも可 能である。ここでは有利には公知の反射手段、吸光手段、蛍光（発光）手段また は偏光手段とすることができる。 校正手段の構成（測定手段および／または基準構造体）に関しては、これをラ スタ状またはジグザグ状（メアンダ状）に配置すると有利である。さらに校正手 段を校正テンプレートないし型板（Schablone）に配置するか、または校正テン プレートに構成することもできる。校正テンプレートは、エッチングされた構造 体を備えた精密プレートとすることができる。このプレート自体はエポキシ樹脂 プレートとして構成することができ、有利には経年変化を回避するために金メッ キされる。 とりわけ校正プレートの定常的配置の点では、これが画像野の大きさに相応す る切欠部を有し、この切欠部を通して走査スキャンビームが妨げられずに通常の 結像のため通過できるようにすると有利である。ここでの校正手段は相応して校 正テンプレートの縁部に配置される。切欠部は円形または正方形に構成すること ができる。相応して校正テンプレートは、校正手段を担持する、有利には固定の 円形リング面、または−校正テンプレートが正方形に構成されている場合には− 空間的にフレーム（ラーメン）状の面を有することができる。この場合、校正手 段はフレーム脚部により担持（ないし支持）される。 同じように校正テンプレートを、走査ビームのビーム路中で旋回可能なディス クとして構成することもできる。このような構成では、校正テンプレートを旋回 するための相応の機構が必要になる。 要素を最適に校正するためには、校正テンプレートをできるだけ走査すべき対 象物の近傍に配置すべきである。特に有利には、校正テンプレートは走査すべき 対象物の近傍ないし直近に（unmittelbar an）、または前方に配置される。 本発明の方法に関しては、前に述べた課題は請求項２８の構成によって解決さ れる。これによれば上位概念として記載の方法において、中間結像の面に配置さ れた校正手段を走査ビームにより走査する。すなわち、校正手段が中間結像の面 に常時あるか、または校正のために旋回されるかは関係ない。校正手段が定置の 校正手段であれば、この校正手段は中間結像の縁部であって、本来の画像野の外 側に配置され、そこでも−本来の画像野の外側でも−走査される。 校正は手動または自動で行うことができる。ここでは、校正をレーザ光源の投 入接続直後に行うことができる。しかし同じように、校正を対象物走査ないしは 画像撮像の前および／または後に実行することもできる。これも同じように手動 または自動で行われる。 さらに校正を自動データ補正に利用することができる。この場合一方では校正 データを、他方では測定値を計算器に供給し、そこで処理する。 本発明の思想を有利に構成および改善する種々の手段がある。これについては 請求項１および２８の従属請求項を、また図面に基づく以下の本発明の実施例の 説明を参照されたい。本発明の有利な実施例の説明と関連して、一般的な有利な 構成および改善形態も説明される。 ［図面の簡単な説明］ 図１は、略示された中間画像を備えた共焦点レーザ走査顕微鏡の基本構成を示 す概略図である。 ［実施例］ 図１は、共焦点レーザ走査顕微鏡を校正するための装置の概略図である。ここ で対象物１は走査ビーム２により走査される。本発明の思想をよりよく理解する ために、図には対象物１を走査する走査ビーム２だけではなく、スキャナ３，レ ーザ光源４および検知器５も示されている。レーザビーム６は光源４から放射さ れ、ビームスプリッタ７と適切な光学系８を介してスキャナ３に到達する。そこ から走査ビーム２は接眼レンズ９と対物レンズ１０を介して対象物１へ偏向され る。接眼レンズ９と対物レンズ１０との間には、中間画像１１があり、この中間 画像の面に校正手段１２が配置されている。 ここに選択された実施例では、校正手段１２は中間画像１１の縁部であって、 本来の画像野１３の外側に配置されている。このために校正テンプレート１４が 設けられており、この校正テンプレートは画像野１３の大きさに相応する切欠部 １５を有する。校正手段１２は校正テンプレート１４の縁部に配置されている。 ここには種々のシンボルにより種々異なる校正手段１２が概略的に示されている 。問題となる校正手段１２−測定手段および基準構造体−に関しては、繰り返し を避けるため明細書の概説部分を参照されたい。いずれにしろ重要なことは、校 正手段１２はパッシブ形またはアクティブ形の校正手段１２とすることができ、 パッシブ形校正手段１２は扁平または３次元に構成することができる。 別の有利な構成に関しては、繰り返しを避けるために明細書の概説部分を参照 されたい。 参照符号リスト １ 対象物 ２ 走査ビーム ３ スキャナ ４ レーザ光源 ５ 検知器 ６ レーザビーム ７ ビームスプリッタ ８ 光学系 ９ 接眼レンズ １０ 対物レンズ １１ 中間画像 １２ 校正手段 １３ 画像野 １４ 校正テンプレート １５ 校正テンプレート内の切欠部

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． 有利には共焦点のレーザ走査顕微鏡の校正装置であって、対象物（１） が走査ビーム（２）により走査される形式の装置において、 中間結像（１１）の面に配置された校正手段（１２）が同じく走査ビーム（２ ）により走査される、 ことを特徴とする装置。 ２． 該校正手段（１２）は、該中間結像（１１）の面内において画像野（１ ３）の領域へ旋回導入可能である、請求項１記載の装置。 ３． 該校正手段（１２）は該中間結像（１１）の縁部であって、本来の画像 野（１３）の外側に配置されている、請求項１記載の装置。 ４． 該校正手段（１２）は測定手段である、請求項１から３までのいずれか １項記載の装置。 ５． 該測定手段は検知手段として構成されており、該検知手段はレーザ出力 測定およびレーザ校正に使用される、請求項４記載の装置。 ６． 該検知手段はフォトダイオードである、請求項５記載の装置。 ７． 該校正手段（１２）は基準構造体である、請求項１から３までのいずれ か１項記載の装置。 ８． 該基準構造体はグリッドとして構成されており、該グリッドは画像寸法 の校正および／または線形性校正に用いる、請求項７記載の装置。 ９． 該基準構造体はテープとして構成されており、該テープは画像位置校正 に用いる、請求項７記載の装置。 １０． 該基準構造体は有利には扁平なパターンとして構成されており、該パ ターンはスキャナ（３）の往復運動の位相校正に用いる、請求項７記載の装置。 １１． 該基準構造体は３次元構造体として構成されており、該３次元構造体 はピンホール位置の校正等の光学系の校正に用いる、請求項７記載の装置。 １２． 該３次元構造体は段、切欠部等である、請求項１１記載の装置。 １３． 該基準構造体は発光手段として構成されており、該発光手段は検知器 （５）の校正に用いる、請求項７記載の装置。 １４． 該発光手段は種々異なるスペクトルを有する、請求項１３記載の装置 。 １５． 該発光手段は発光ダイオードである、請求項１３または１４記載の装 置。 １６． 該基準構造体は、走査ビーム（２）との交互作用を示す手段として構 成されている、請求項７記載の装置。 １７． 該走査ビーム（２）との交互作用を示す手段は、公知の反射手段、吸 光手段、蛍光手段、または偏光手段である、請求項１６記載の装置。 １８． 該校正手段（１２）−測定手段および／または基準構造体−はラスタ 状に配置されている、請求項１から１７までのいずれか１項記載の装置。 １９． 該校正手段（１２）−測定手段および／または基準構造体−はジグザ グ状（メアンダ状）に配置されている、請求項１から１７までのいずれか１項記 載の装置。 ２０． 該校正手段（１２）−測定手段および／または基準構造体−は校正テ ンプレート（１４）に配置されているかないしは形成されている、請求項１から １９までのいずれか１項記載の装置。 ２１． 該校正テンプレート（１４）は、エッチングされた構造体を備えた精 密プレートである、請求項２０記載の装置。 ２２． 該精密プレートは有利には金メッキされたエポキシ樹脂プレートとし て構成されている、請求項２１記載の装置。 ２３． 該校正テンプレート（１４）は、画像野（１３）の大きさに相応する 切欠部（１５）を有する、請求項２０から２２までのいずれか１項記載の装置。 ２４． 該校正テンプレート（１４）は、校正手段（１２）を担持する、有利 には固定の円形リング面を含む、請求項２０から２２までのいずれか１項記載の 装置。 ２５． 該校正テンプレート（１４）は、走査ビーム（２）のビーム路中へ旋 回導入可能なディスクとして構成されている、請求項２０から２２までのいずれ か１項記載の装置。 ２６． 該校正テンプレート（１４）は走査すべき対象物（１）の近傍に配置 されている、請求項２０から２５までのいずれか１項記載の装置。 ２７． 該校正テンプレート（１４）は、走査すべき対象物（１）の直近に、 またはその前方に配置されている、請求項２０から２５までのいずれか１項記載 の装置。 ２８． 有利には共焦点のレーザ走査顕微鏡の校正方法であって、対象物（１ ）が走査ビーム（２）により走査され、請求項１から２７までのいずれか１項記 載の装置に適用される方法において、 中間結像（１１）の面に配置された校正手段（１２）を走査ビーム（２）によ り走査する、 ことを特徴とする方法。 ２９． 該校正手段（１２）を該中間結像（１１）の縁部であって、本来の画 像野（１３）の外側で走査する、請求項２８記載の方法。 ３０． 校正を、レーザ光源（４）の投入接続直後に行う、請求項２８または ２９記載の方法。 ３１． 校正を、対象物走査ないしは撮像の前および／または後に行う、請求 項２８または２９記載の方法。 ３２． 校正を手動で開始する、請求項２８から３１までのいずれか１項記載 の方法。 ３３． 校正を自動で開始する、請求項２８から３１までのいずれか１項記載 の方法。 ３４． 校正を自動データ補正に利用する、請求項２８から３３までのいずれ か１項記載の方法。