JP2001511012A

JP2001511012A - 腫瘍崩壊性／免疫原性相補アデノウイルスベクター系

Info

Publication number: JP2001511012A
Application number: JP53473898A
Authority: JP
Inventors: アルマニー、ラモン; ファン、シャンミン; ザーン、ウェイ−ウェイ
Original assignee: バクスターインターナショナルインコーポレイテッド
Priority date: 1997-02-10
Filing date: 1998-01-23
Publication date: 2001-08-07
Also published as: US20020142989A1; EP0968281A2; US6403370B1; WO1998035028A2; CA2280237A1; WO1998035028A3

Abstract

(57)【要約】本発明は、腫瘍細胞のような標的細胞を殺すための組成物を包含する。組成物は、相補的機能を示し、そして標的細胞中での複製に互いに依存しあう第一および第二のアデノウイルスベクターを含む。上記アデノウイルスベクターの内の１つは、直接的にまたは間接的に標的細胞を殺す標的細胞中のアデノウイルスベクターの増殖を制御および制限する標的細胞活性化プロモーターまたは機能欠失を有する。アデノウイルスベクターの内の１つは、標的細胞中で発現され、そして抗癌免疫応答を誘導できるタンパク質をコードする遺伝子を包含する。標的細胞は、例えば、肝癌、乳癌、黒色腫、結腸癌または前立腺癌細胞でありうる。本発明のベクターは、標的細胞が、例えば血管の平滑筋細胞でありうる場合に、再狭窄のような他の疾患を治療するのに活用することもできうる。

Description

【発明の詳細な説明】腫瘍崩壊性／免疫原性相補アデノウイルスベクター系発明の分野本発明は、アデノウイルスベクターおよび疾患を治療する際のそれらの使用法の分野にある。発明の背景基本的なアデノウイルスベクターの技術アデノウイルス（Ａｄ）は、６０−９０ｎｍの直径を有するエンベロープなしの正二十面体（２０面および１２頂点）のタンパク質カプシドと、内部ＤＮＡ／タンパク質コアとから構成される（Horwitz、1990年）。外側カプシドは、２４０のヘキソン（１面当たり１２のヘキソン）と１２のペントンベースを形成するように幾何学的に配列された、２５２のカプソメアから構成される；後者は各頂点に位置し、そこからアンテナ様繊維が突き出ている。この構造は、感染中、Ａｄを細胞に接着させるのに対応している。野生型Ａｄは、８７％のタンパク質と１３％のＤＮＡとを含有し、ＣｓＣｌ中で、１．３４ｇ／ｍｌの密度を示す。Ａｄの二重鎖線状ＤＮＡゲノムは、およそ３６ｋｂであり、従来、１００マップ単位（ｍｕ）に分割されている。そのウイルスゲノムの各末端は、逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）と称される１００−１５０ｐｂの繰返ＤＮＡ配列を有する。左側末端（１９４−３８５ｂｐ）は、カプシド化のためのシグナル（パッケージングシグナル）を含有する。ＩＴＲおよびパッケージングシグナルの両方が、アデノウイルスＤＮＡ複製およびパッケージ化に必要なシス作動要素である（Sussenbach 、1984年；Philipson、1984年）。２、３の主要な際立った特色を示すアデノウイルス５型（Ａｄ５）ゲノムの簡単な地図は、図１に描かれる(Stratford-PerricaudetおよびPerricaudet、1991 年；GrahamおよびPrevec、1991年)。そのゲノムの初期（Ｅ）および後期（Ｌ）領域は、数種の転写単位を含有し、そしてウイルスＤＮＡ複写の開始にしたがって分割されている。Ｅ１領域（Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂ）は、ウイルスゲノム並びに２、３の細胞遺伝子の転写の制御の原因になるタンパク質をコードする(Nevins 、1993年)。Ｅ２領域（Ｅ２ＡおよびＥ２Ｂ）の発現は、ウイルスＤＮＡ複製に必要とされるタンパク質の合成を導く(PetterssonおよびRoberts、1986年)。Ｅ３領域からのタンパク質は、細胞毒性Ｔ細胞および腫瘍壊死因子による細胞溶解を回避する(WoldおよびGooding、1991年)。Ｅ４タンパク質は、ＤＮＡ複製、後期遺伝子発現およびスプライシング、並びに宿主細胞シャットオフに関与する(H albertら、1985年)。ウイルスカプシドタンパク質の大半を含む後期遺伝子の産物は、主要後期プロモーター（ＭＬＰ）によって起動される２０ｋｂの一次転写物のプロセシング後に発現される(ShawおよびZiff、1980年)。ＭＬＰ（１６．８ｍｕに位置した）は、感染の後期相の間、特に有効であり、このプロモーターから発せられたｍＲＮＡは５'三分割リーダー（ＴＬ）配列を保持しており、これは宿主細胞ｍＲＮＡとは対照的に上記転写物に対する宿主細胞の優先性を増加する。１９６０年代にＡｄとサル・ウイルス４０（ＳＶ４０）との間のハイブリッドの観察の直後に、異種遺伝子の発現のためのベクターとしてＡｄを使用するとが開始された。それ以来、（ａ）Ａｄが、広範に研究され、そして真核細胞の遺伝子調節のためのモデル系として十分に特徴づけられ、それがベクターの開発に対する充実した基礎となったため、（ｂ）ベクターが容易に得られそして容易に操作されるため、（ｃ）Ａｄが未分割細胞を含め、高い感染性を示しながら、インビトロでおよびインビボで広範な宿主範囲を示すため、（ｄ）Ａｄ粒子が、比較的安定であり、そして高力価、例えば１０¹⁰−１０¹²のプラーク形成単位（ＰＦＵ）／ｍｌで得ることができるため、（ｅ）アデノウイルスの生活サイクルは、宿主細胞ゲノムに組込まれることを必要とせず、したがって、Ａｄベクターによって送出される外来遺伝子が、エピソームで発現され、それによってインビボで使用される場合でも低いゲノム毒性を示すので、（ｆ）副作用が、野生型Ａｄによる米国新兵のワクチン接種の後に報告されておらず、インビボでの遺伝子転移に対して安全であることを示しているため、という理由によって、Ａｄベクターは、最近の遺伝子療法の分野で主要なウイルスベクターの内の１つに徐々に発展した。Ａｄベクターは、真核細胞の遺伝子発現(Lev reroら、1991年；Ghosh-Choudhury、186)、ワクチンの開発(GranhausおよびHorw itz、1992年；GrahamおよびPrevec、1992年)、および動物モデルでの遺伝子転移（Stratford-PerricaudetおよびPerricaudet、1991年；Stratford-Perricaudet ら、1992年；Richら、1993年）に首尾よく使用された。インビボで組換えＡｄを様々な組織に投与するための実験的経路は、気管内点滴注入(Rosenfeldら、1992 年)、筋肉内注射(Quantinら、1992年)、末梢静脈注射（HerzおよびGerard、1993 年）および脳への定位接種（LaSalleら、1993年）を包含した。ヒトでの初期のＡｄ介在遺伝子療法の治験は、肺組織に対への嚢胞性繊維症膜貫通調節タンパク質（ＣＦＴＲ）遺伝子の転移であった(Crystalら、1994年)。遺伝子−転移介在抗癌免疫性癌遺伝子療法に最も有効な最近の攻略法の内の１つは、腫瘍−宿主関係の改変し、宿主免疫系による悪性細胞の認識および破壊を容易にすることに関与する。腫瘍罹患個体では、有効な免疫応答の欠乏は、部分的に、弱い腫瘍細胞の抗原性、免疫同時刺激の欠乏、または腫瘍特異的免疫抑制環境のいずれかに起因する可能性がある。腫瘍細胞へのサイトカインの遺伝子転移は、有効な抗腫瘍性免疫応答の増大のための攻略法を供する(Millerら、1994年)。近年、多数のサイトカイン遺伝子が単離され、クローン化され、そして特徴付けされた。ＩＬ−２のような特定のこれらの免疫調節剤の全身投与で、抗腫瘍応答を生じた。しかし、これらの多くの生理物質の使用には、臨床的効果を生じるのに必要とされる高濃度のためにかなりの毒性が伴った。全身投与から得られるかなりの好ましくない効果と限界に近い治療結果との組合わせは、腫瘍細胞自身がサイトカインを生成するように腫瘍細胞を遺伝子的に操作するような成果を刺激した(Rosenbergら、1989年)。動物モデルでは、遺伝子修飾腫瘍細胞は、抗腫瘍応答を刺激するワクチンとして使用されてきた(Millerら、1994年；DranoffおよびMulligan、1995年)。サイトカイン遺伝子の転移を指向した腫瘍の魅力は、局所に産生されるサイトカインが、免疫学的にさらに効果的であり、そして全身毒性を起こさないことである。高い局所濃度のサイトカイン（類）を組合せで新生細胞上に発現される腫瘍抗原は、外因性サイトカイン投与で再生産することが実際的に不可能な免疫学上の微小環境を作り出す。このようなサイトカイン産生腫瘍細胞によって作り出されるこの免疫学上の微小環境は、細胞毒性Ｔリンパ球の生成を生じる結果となることが示された。多数の様々な動物モデルでは、サイトカイン産生腫瘍細胞が、腫瘍発生性を減少させ、そして免疫学的に重要な分子の発現を増加させるのに有効であることが示された(Millerら、1994年；DranoffおよびMUlligan、1995年)。当初の抗腫瘍性拒絶は、非特異的炎症反応に付随されるようである。しかし、サイトカイン分泌腫瘍細胞の拒絶は、ほとんどの例で、Ｔ細胞依存性である全身性腫瘍特異的免疫の発生を導いた。さらに、新しい証拠では、同時刺激分子Ｂ７によるＴ細胞の同時刺激が、Ｔ細胞活性化において陽性または陰性の効果の両方を示すことが示されている(Leach ら、1996年)。ＩＣＡＭ−Ｉ、ＬＦＡ−３およびＶＣＡＭ−ＩのようなＴ細胞に対する他の同時刺激分子も、抗腫瘍反応の誘導に関与していた(Springer、1990 年)。最も強力なこれらの同時刺激シグナルは、抗原提示細胞の表面上にその主要リガンドＢ７−１（ＣＤ８０）およびＢ７−２（ＣＤ８６）のいずれかまたは両方と、Ｔ細胞上のＣＤ２８との作用によって供される(Lenschowら、1996年)。様々なモデル系では、Ｂ７ｃＤＮＡでトランスフェクトされた腫瘍細胞が、修飾および非修飾の腫瘍細胞の両方に対する強力な抗腫瘍反応を誘導した(Townsend およびAllison、1993年)。２つのクラスの分子によって異なる経路が利用されるが、クラスＩおよびクラスIIのＭＨＣ分子の両方が、腫瘍抗原の提示に関与することが長年知られている。クラスＩのＭＨＣは、インビトロで腫瘍特異的ＣＴＬを活性化することが示されてきた。腫瘍ワクチン化についての初期研究は、ＭＨＣクラスＩ遺伝子のトランスフェクションを含み、そしてマウスモデルでの腫瘍発生中および／または転移中の腫瘍細胞の抑制を生じた(Huiら、1984年；Wallichら、1 985年)。ＭＨＣクラスII遺伝子は、腫瘍特異的Ｔ−ヘルパー細胞の活性化に関与することが示され、そしてクラスII遺伝子の腫瘍細胞への導入が、腫瘍発生を減少させ、そして親腫瘍に対する全身性免疫反応を生じた(Ostrand-Rosenberg、19 90年)。これらのポジティブな結果にもかかわらず、ＭＨＣ発現のレベルと免疫原性との間の関係が、腫瘍モデルの間で一貫性がない。研究者らは、ＭＨＣ／ペプチド複合体による抗原提示に影響を及ぼす、Ｂ７同時刺激分子のような他のコファクターによって矛盾が起こることを信じ始めている。インターフェロン・ガンマ（ＩＦＮ−γ）は、例えば、マクロファージを活性化し、そして炎症反応で重要な役割を果たす多面的サイトカインである(Billiau 、1996年)。この多面的サイトカインは、ＭＨＣクラスＩおよびクラスII抗原の強力な誘導物質でもあり、したがって、免疫応答を増強する能力がある(Wallach ら、1982年；Chenら、1986年)。低レベルのＭＨＣクラスＩを発現する非免疫原性のネズミ癌腫セルラインへのネズミＩＦＮ−γをコードするｃＤＮＡのレトロウイルスの形質導入のみが、ＭＨＣクラスＩ抗原発現の上昇調節をわずかに誘導し、そして抗腫瘍ＣＤ８⁺ＴＩＬを発生させた。腫瘍拒絶に続いて、親細胞を用いた再チャレンジから得られる長期持続性保護が誘導された(Nicholasら、1992年)。さらに、微量転移を示すマウスに多量のＩＦＮ− γを産生する腫瘍細胞を接種することで、ＣＴＬの誘導によりこれらのマウスはほとんど完全に治癒した(Porgadorら、1993年)。ヒトＩＦＮ−γについてのｃＤＮＡは、ヒト腎臓癌細胞および黒色腫細胞に誘導されもした(Gansbacherら、199 2年；Gastlら、1992年)。ＩＦＮ−γを分泌する腎臓癌細胞は、ＭＨＣクラスII 抗原発現の誘導と同様に、ＭＨＣクラスＩ抗原、β２−ミクログロブリンおよび細胞内接着分子Ｉの発現が増加していることが示された。しかし、ｎｕ／ｎｕマウスに移植されたヒト腎臓癌セルラインによる肺瘍形成は、ＩＦＮ−γ分泌によって影響を及ぼされなかった一方で、ＩＬ−２産物は、腫瘍の成長を阻害した。多くの他のサイトカイン、ケモカイン、およびインタークリンは、抗腫瘍免疫性を引出す上で数種の異なる役割を果たすことが示されてきた(Allioneら、1994 年；Plata-SalamanおよびBorkoski、1994年；ZhangおよびFang、1995年)。複数のサイトカインや免疫刺激因子の遺伝子の遺伝子転移を用いたさらなる研究は、より強力な抗癌免疫性の誘導を得た(Vaglianiら、1996年)。サイトカインまたは免疫調節因子遺伝子も、癌の遺伝子療法に対するさらに有効な攻略法を開発するための他の遺伝子転移と組合せて使用された(ZhangおよびFang、1995年)。癌の遺伝子操作されたウイルス療法１９２０年代以来、ウイルスは、腫瘍崩壊を誘導するために活用されてきた( 総説文献参照；SinkovicsおよびHorvath、1993年)。時々、自然のヒトのウイルス感染が、白血病またはリンパ腫の寛解を誘導する。生存ウイルスを腫瘍罹患患者に接種することは、１９４０年代後期に開始された。初期の研究では、黒色腫を治療するために弱毒化生狂犬病ワクチンが利用され、そして部分的寛解を誘導した。これは、種々の悪性疾患におけるミクソ−、パラミクソ−およびアルボウイルスの効果を測定するための臨床的治験に繋がった。腫瘍の偶発的な一過性後退が観察されたが、しかし、後退は、最終的に、腫瘍の再成長と患者の死に至った。他の研究者らは、血管内、腫瘍内、経口摂取、または吸入を含めた様々な経路によって癌を治療するためにリンパ球減少症ネズミウイルス、生存ムンプスウイルスまたはヒトエンテロウイルスを使用したが、証拠書類で立証された癌治療のケースはなかった(SinkovicsおよびHorvath、1993年)。パルボウイルスは、核中で複製し、そして昆虫、鳥、およびヒトを含めた様々の哺乳類に感染できる小型の一本鎖ＤＮＡウイルスである。脊椎動物のパルボウイルスは、Ａｄのようなヘルパーウイルスに対するアデノ関連ウイルスの必要性に基づいて、アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）および自律性パルボウイルスの群に分けられる。しかし、その区別は、完全ではない。パルボウイルス複製は、その内のいくつかが、細胞増殖および分化の間に発現される宿主細胞因子に依る(CotmoreおよびTa rtersall、1987年)。パルボウイルス感染の結果は、宿主細胞の生理学的状態に依存する。最近の研究は、新生形質転換に関与した多数のヒトおよびネズミ細胞が、それらの正常な前駆細胞であるより、マウスの自律性パルボウイルスネズミのミニットウイルス（ＭＶＭ）のプロトタイプ株ＭＶＭｐまたはＨ−１の死滅効果に明かにいっそう感受性があることを示した(Cornelisら、1988年；Cornelis ら、1990年；Spegelaereら、1991年)。新生形質転換による自律性パルボウイルス−宿主相互作用の分子機構の基本的な調節は、ほとんど理解されていないが、ウイルスの形質転換依存性複製の潜在的用途は、腫瘍特異的死滅のための組換えベクターの開発のためと考えられてきた(Russellら、1992年；Dupontら、1994年)。しかし、予備試験の結果は、有効な形質転換細胞の死滅を誘導するウイルスベクターには、別の機構が必要とされることを示した(Francis Dupont博士との私信)。野生型の生きたヒトアデノウイルスは、頚部癌を治療するのに利用された(Smi thら、1956年)。大量のウイルスが、腫瘍内、動脈内または静脈内接種によって患者に与えられた。癌細胞の壊死以外の感知できる病態または変化は観察されなかった。剖検の結果では、注入されたウイルスが、頚部腫瘍にのみ局所的影響を生じること、そして骨盤組織での腫瘍の進行性成長または転移の成長に影響を及ぼさないという臨床的観察を確認した。遺伝子療法でのＡｄベクターの用途は、急速に開発された。癌の遺伝子療法のための遺伝子操作されたＡｄの使用可能性が、多くの異なる攻略法で広範に調べられた(Descampsら、1996年)。サイトカイン、インターフェロン、同時刺激分子または因子のようなタンパク質をコードするＡｄベクターを介する送出が、種々の動物モデルで抗癌免疫性を誘導した(Addisonら、1995年；Zhangら、1996年)。しかし、ヒト癌の治療におけるこのタイプのアプローチ法の効果は、依然として臨床治験により測定されるべきである。腫瘍特異的または組織特異的プロモーター／エンハンサーカセットの活用癌のための免疫−遺伝子療法およびウイルス−介在遺伝子療法の両方は、癌細胞死滅において治療効率または特異性のいずれかに制限を示した。後者については、新規なアプローチ法が、腫瘍細胞に特異的な遺伝子発現を標的とする目標で提案され、そして試験された。ウイルス表面の遺伝的または生化学的修飾によって細胞表面レセプターを介して感染性組換えウイルスベクターを細胞にターゲティングする上で進展となった。代替アプローチ法は、腫瘍細胞および同じ発生系列から誘導される関連の正常細胞に対するエフェクター遺伝子の発現を制限する系列特異的プロモーターを用いて転写レベルで癌細胞を標的にすることである(Hart、1996年)。この手段で標的とされた腫瘍タイプの例としては、結腸(Osakiら、1994年；Richards ら、1995年)、肺(Osakiら、1994年；Smithら、1994年)；乳房(Manomeら、1994年 )、肝細胞癌腫(Huberら、1991年；Idoら、1995年；Kanekoら、1995年)、および黒色腫（Vileら、1993年；Sidersら、1996年）が挙げられる。腫瘍または組織特異的プロモーター／エンハンサーの使用は、さらに「ウイルス指向性酵素／プロドラッグ療法」(ＶＤＥＰＴ)と呼ばれる治療アプローチ法で使用された(Huberら、1991年)。これらの研究では、プロドラッグ活性化遺伝子の組織−または腫瘍−特異的な発現により腫瘍死滅効率の増強および正常細胞でのこのような療法の副作用（「バイスタンダー（第三者）効果」）の減少が示された(Manomeら、1994年；DiMaioら、1994年)。 α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）プロモーター／エンハンサーカセットは、肝細胞癌腫におけるウイルス指向性腫瘍崩壊効果を誘導するためにＡｄベクターからのＥ１発現を制御するのに利用された(Hallenbeckら、1996年)。腫瘍特異的複製感応アデノウイルス（ＴＳＲＣＡ）ベクターの第一世代についての概念の立証として、野生型ＡｄのＡｄ５Ｅ１プロモーターを、ＡＦＰプロモーターの修飾したものに置換した。高レベルのＡＦＰを発現する試験されたヒト肝細胞癌腫セルラインの３分の２で、ベクターが複製することが示された。さらに、ビリオン粒子当たりおよそ５００−１０００の肝細胞癌腫細胞が、１３日アッセイで破壊された。２つの肝臓セルライン、２つの肺癌セルライン、１つの結腸癌セルライン、および１つの頚部癌セルラインで、ほとんど乃至はまったく複製は観察されず、その各々は、ＡＦＰを産生しなかった。さらに、肺組織が、ヒトにおけるＡｄ複製のための初期標的であるので、研究者らは、ベクターの複製のための正常なヒト肺上皮および内皮細胞の２つの初期培養物を試験した。いずれの初期培養物も、ベクターの複製を支持し、それにより癌細胞死滅でのベクターの特異性が示された(Hallenbeckら、1996年)。研究者らは、ＴＳＲＣＡベクターとして同じタイプの設計を用いた様々な癌の他の腫瘍特異的プロモーター／エンハンサーの使用も提案した。野生型ウイルスを用いた癌の療法は、まれにしか耐久性のある完全な寛解を生じなかった。毒素、サイトカインまたは免疫刺激因子をコードする遺伝子を送出する遺伝子操作されたウイルスベクターを使用することは、動物モデルを用いた特定の励みになる結果を示した。しかし、これらの方法の臨床的用途は、癌細胞に対するベクターまたは遺伝子の発現を特異的に標的とする能力のなさによって制限される。ＴＳＲＣＡアプローチ法は、癌細胞でのＡｄベクターの複製を通して腫瘍特異的死滅を持ち込んだが、それは、腫瘍崩壊効果を誘導する可能性がある。腫瘍退縮が局所環境に限定されるので、この方法は、制限される。さらに、異種ＤＮＡをＴＳＲＣＡベクターに挿入するための許容量は、４ｋｂ未満に限定される。本発明は、現在のＴＳＲＣＡ方法論の制限に対する解決策を提供する。本発明の薬剤および方法論は、サイトカイン、ケモカイン、腫瘍抑制剤、および／または免疫調節因子をコードする複数の遺伝子発現カセットを担持するＴＳＲＣＡの開発を考慮に入れる。これらの明らかな制限のための解決策を持込みそして提供する本発明の発明は、当業者に理解される。発明の概要本発明は、腫瘍細胞のような標的細胞を死滅する組成物を包含する。その組成物は、相補的機能を示し、標的細胞中での複製の対して互いに共通に依存性がある第一および第二のアデノウイルスベクターを包含する。上記アデノウイルスベクターの内の１つは、標的細胞活性化プロモーターまたは標的細胞中のアデノウイルスの増殖を制御および制限する初期遺伝子を有する。アデノウイルスベクターの内の１つは、標的細胞中でのＡｄの複製サイクルを支持できる部分的Ａｄゲノムを包含する。標的細胞中でのこれらのベクターの複製は、直接的にまたは間接的に標的細胞を殺す。標的細胞は、例えば、肝癌、乳癌、黒色腫、肺癌、結腸癌または前立腺癌細胞でありうる。本発明のベクターは、標的細胞が、例えば血管の平滑筋細胞でありうる場合に、再狭窄のような他の疾患を治療するのに活用することもできうる。本発明は、さらに、腫瘍細胞中で活性化され、そしてＡｄＥ１遺伝子に作用可能に連結されるプロモーターを包含するアデノウイルスベクター（「制御ベクター」）を含む。Ｅ１遺伝子の産物は、腫瘍細胞中でＡｄベクターの複製を制御する。ＡＤＥＩ遺伝子の欠失を、制御Ａｄに、腫瘍細胞中でのウイルス複製を特異的に駆り立てるように使用することもできる。制御ベクターは、さらに、タンパタ質が腫瘍細胞中で発現されるような免疫調節タンパク質を発現するカセットを含有することもできる。腫瘍活性化プロモーターは、例えば、α−フェトプロテインプロモーター、ＤＦ−３ムチンエンハンサー、チロシナーゼプロモーター、癌胎児性（ＣＥＡ）プロモーター、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）プロモーター、またはＨ₁パルボウイルスプロモーターでありうる。免疫調節タンパク質は、例えば、ＩＦＮ−γのようなインターフェロン（ＩＦＮ）、Ｂ７．１のようなＢ７同時刺激分子、インターロイキン、ケモカイン、脛瘍特異的抗原でありうる。他の用途としては、プロモーターは、細胞周期に特異的に誘導されるかまたは合成のプロモーター／エンハンサーでもよい。この発明は、さらに、腫瘍細胞中で制御ベクターおよび補足ベクターの複製に必要とされるタンパク質を供給する「補足的ベクター」を包含する。この発明は、さらに、ベクターが複製でき、そして大量にパッケージ化されるセルラインをトランスフェクトすることによって、本発明のベクターを作製し、そして精製する方法をも包含する。例えば、塩化セシウム（ＣｓＣｌ）遠心分離のような生化学的技術を用いて精製を達成できる。本発明は、さらに、１.）１種または複数の治療的遺伝子を担持するベクターの許容性を増加させる；２.）細胞型または組織特異的転写制御領域に作用可能に連結したＡｄＥ１タンパク質をコードする遺伝子を提供することによって、宿主細胞または組織の型に特異的なアデノウイルス複製を標的とする；３.）局所および離れた部位での腫瘍増殖に対する免疫応答を増加させる腫瘍細胞中の免疫調節タンパク質またはタンパク質の発現を誘導する；４.）免疫調節タンパク質の発現を誘導し、特異的細胞型に対してアデノウイルスの複製を転写的に標的とする、以後「相補−Ａｄベクター系」の系と称する、組織特異的な相互に依存するアデノウイルスベクターの組成物を提供する、という修飾アデノウイルスベクターを提供する。サイトカイン、ケモカイン、腫瘍抗原、ＭＨＣ分子、細胞接着分子および／または他の免疫調節因子のようなエフェクター遺伝子の送出により、全身性抗癌免疫応答の誘導と、Ａｄベクターの特異的殺腫瘍効果を組合せるために必要とされるベクターおよび方法論を提供することが本発明の目的である。好ましくは、本発明は、免疫調節または腫瘍抑制遺伝子を含む単独または複数の発現カセットを送出するために活用されうる大きな遺伝子担持許容性を示す制御−Ａｄベクターを提供する。実際に、相補−Ａｄベクター系は、全身性抗癌免疫応答と一緒に局所の特異的殺腫瘍効果を誘導する。したがって、本発明の別の目的は、原発性および転移癌細胞の排除のための局所および離れた部位での特異的腫瘍細胞死滅を提供することである。本発明のさらに別の目的は、腫瘍細胞を溶解させ、そしてエフェクター遺伝子を送出する上で、複製について互いに相補的であり、そして別々の役割を示す２種のＡｄベクターを提供することである。したがって、本発明は、Ｅ１領域欠失または置換および修飾または未修飾パッケージングシグナルを有する補足−Ａｄベクターを提供し、そしてそれは、制御−Ａｄのパッケージングのために必要なウイルスＤＮＡ複製およびカプシドタンパク質を提供する。好ましい具体例では、補足Ａｄベクターは、修飾パッケージングシグナルを示し、そして制御−Ａｄベクターは、補足−Ａｄの転写と複製とのトランス活性化のための組織特異的または腫瘍活性化プロモーター／エンハンサーカセットによって制御された補足ＡｄベクターおよびＥ１領域にわたるパッケージングの利点を得るために、野生型パッケージングシグナルを示す。さらに、本発明の目的は、サイトカインが、局所に産生され、したがって、免疫学上さらに有効な系を提供するが、全身性毒性を起こさないような腫瘍指向性サイトカイン遺伝子転移を提供することである。明かに好ましくない影響と、全身性投与から得られる限界に近い治療結果との組合せは、サイトカインを腫瘍細胞自体で産生するために腫瘍細胞を遺伝子操作する努力を刺激した(Rosenbergら、1989年)。本発明が、癌の遺伝子療法への使用に限定されないことは、当業者に理解される。本発明の他の使用が予測される。図面の簡単な説明図１．Ａｄ５のゲノムおよび転写単位Ａｄ５ゲノムの長さは約３６ｋｂであって、１００の地図単位（ｍｕ）に分割されている。点線矢印は、初期（Ｅ）転写を表し、そして実線矢印は、後期（Ｌ）転写を表す。転写の方向は、矢印によって示される。矢印の間の間隔は、介在配列を示す。箱は、主要な後期プロモーターおよび三つに分かれたリーダー配列（ＭＬＰ）の配置を表す。１ｍｕでの実線三角形は、パッケージングシグナルの位置を表す。図２．相補Ａｄベクター系の概念系の２つの主要な構成要素が示される：補足Ａｄ、および制御Ａｄベクター。制御−Ａｄが有する特異的プロモーター／エンハンサーの活性化によりヘルパー細胞から得られたＥ１−トランス活性化によって、補足Ａｄは、それ自身を複製し、カプシドを形成する後期タンパク質を産生する。しかし、補足Ａｄと関連したパッケージング弱化のために、補足Ａｄゲノムをカプシドにパッケージ化するのは非効率である。制御Ａｄベクターゲノムの存在下で、補足Ａｄは、さらに、制御ＡｄベクターゲノムのＤＮＡ複製を支持し、それは、限定量のパッケージングタンパク質に対して高い親和性を示すそれの野生型パッケージングシグナルのために、優先的にパッケージ化される。Ａｄベクターのさらなる精製は、超遠心のような生化学的または物理的方法によって達成することができる。図３．Ａｄ５のパッケージングシグナルウイルスゲノムの左側末端にあるＡｄ５のパッケージングシグナルの配列および位置が示されている。パッケージングシグナルモチーフとして同定される７つのＡ−反復がある。Ａ−反復の共通配列が、図面の底部に提案される。図４．補足的Ａｄおよび制御Ａｄベクターの表現型ヘルパーウイルスおよび制御Ａｄベクターの一般的構造が示されている。後者は、単独または複数の遺伝子発現カセットを備え、３６ｋｂ遺伝子までの送出許容性を有している。図５．腫瘍崩壊／免疫原性Ａｄベクター系の基本組成物系の基本要素は、補足Ａｄベクターと制御Ａｄベクターである。（Ａ）補足Ａｄベクターは、Ｅ１置換第一世代Ａｄに類似するが、しかしそのパッケージングシグナルの部分的な欠失を示す。Ｅ１領域は、レポーター遺伝子に置換され、β −ｇａｌタンパク質のためのｌａｃＺ遺伝子がここにある。（Ｂ）Ａｄゲノム（パッケージングシグナルとともに２つのＩＴＲ）の最少のシス要素のみを含有する制御Ａｄは、ＡｄＥ１遺伝子（Ａｄ５Ｅ１）を起動するプロモーター／エンハンサーを担持する。プロモーター／エンハンサーは、癌性または形質転換細胞のような標的細胞中で特異的に活性化される。この要素の制御下でのＡｄＥ１遺伝子は、腫瘍細胞中で特異的に転写される。その後、Ｅ１タンパク質は、レポーター遺伝子に置換されたＥ１領域を有する補足ウイルスのゲノムをトランス活性化し、そしてさらに、制御Ａｄのパッケージングが細胞中で望まれるように操作したパッケージングシグナルをも有している。Ｅ１タンパク質によって活性化された補足Ａｄウイルスは、腫瘍細胞中で複製でき、それによりこれらの細胞の溶解を生じる。図６．弱化された補足ＡｄＨβのパッケージを発生するシャトルベクターの構築ＧＴ５０００を構築するために、シグナル配列、ｍｔΨをパッケージ化する突然変異体をＰＣＲによって増幅し、２８．９ｍｕまで伸ばしたＡｄ５配列（ＧＴ４００４）でシャトルベクター中に置換した。ｐＴｋ−βから得たβ−ｇａｌ発現カセットを、ＧＴ５０００のＥ１欠失部にクローン化して、最終シャトルベクターＧＴ５００１を得た。図７．ＡｄＨβの発生Ａ．シャトルベクターＧＴ５００１（図６参照）を、２９３細胞中のｐＪＭ１７でコトランスフェクトさせた。これらのプラスミドの間（Ａｄ５の９．２４から２８．９ｍｕ）の相同性の７Ｋｂ領域での組換えは、ＧＴ５００１から由来する左側部分をパッケージ化可能なウイルスを生じる。底部に示されるＡｄＨβの左側領域中の数字は、Ａｄ５ｎｔ配列に対応し、そしてパッケージングシグナル中での二重の欠失およびβ−ｇａｌ発現カセットが挿入されるＥ１中での欠失の伸長を例示する。Ｂ．２週間のこのコトランスフェクションの後、いくつかの青色プラークが単離され、そしてパッケージングシグナルでの突然変異が、オリゴ７および８を用いたＰＣＲによって分析された。増幅フラグメントのサイズである、野生型パッケージングシグナル（ｗｔΨ）について３１０ｂｐおよび突然変異体パッケージングシグナル（ｍｔΨ）について１７７ｂｐが、１Ｋｂラダーで示されるとおり、２％アガロースゲルで区別されうる。ギブコＢＲＬ（GibcoBRL） (メリーランド州、ゲチスバーグ（Gaithresburg、MD）)から入手した１ＫｂＤＮＡラダーマーカー；ｗｔΨおよびｍｔΨ ＰＣＲコントロール、ここでｖＤＮＡはＥ１−欠失ベクター、Ａｄ−ＣＭＶβｇａｌ、およびｄｌ１０／２８ウイルスからそれぞれ抽出されたもの；青色プラータ、Ｘ−ｇａｌで青に染色されたプラータから得られるｖＤＮＡ；白色プラーク、Ｘ−ｇａｌで青に染色されなかったプラークから得られるｖＤＮＡ。図８．制御ＡｄベクターｐＧＴ８０２７のクローニングＥ１遺伝子を含有するフラグメントを、ｐＡＦＰＧＦＰ中のＡＦＰプロモーターの下流に挿入して、ｐＧＴ８０２５を形成した。ＲＳＶ／Ｂ７およびＥＦｐ／ＩＦＮ−γの発現カセットを、ｐＧＴ８０２６を形成するようにＰａｃＩ部位でＡｄベクターｐＧＴ５４０５にクローン化した。その後、ＡＦＰプロモーターの制御下のＥ１遺伝子を、ＮｏｔＩ部位でｐＧＴ８０２６に挿入して、最終的な制御ベクターｐＧＴ８０２７を得た。図９．制御ＡｄベクターｐＧＴ８０２８のクローニングＥ１遺伝子を含有するフラグメントを、ｐ４およびｐ３８プロモーターと完全なＮＳ１遺伝子とを含むＨ１自律性パルボウイルスの部分的ゲノムの下流に挿入した。その後、ｐ４およびｐ３８パルボウイルスプロモーターの制御下のＥ１遺伝子を、ＮｏｔＩ部位でｐＧＴ８０２６に挿入して、最終的な制御ベクターｐＧＴ８０２８を得た。図１０．腫瘍崩壊／免疫原性相補Ａｄベクターの多様な可能性使用の必要性にしたがって設定され得る補足Ａｄ（Ａ）および制御Ａｄ（Ｂ）の様々な構造が示されている。多様性のクリティカルな態様は、２種のベクターが、Ｅ１遺伝子および／または他の初期遺伝子のようなＡｄゲノム機能で互いに相補することである。２種ベクターの相補要素は、表（Ｃ）に列記される。移入遺伝子および支持要素は、制御Ａｄベクターに主に含まれるが、しかし、これは、特定の環境でのそれらの要素のための補足Ａｄの必要性を除外しない。細胞周期インデューサーをコードする初期Ａｄ遺伝子の欠失は、正常な休止細胞のアデノウイルスの複製能力を終わりにさせるが、制御Ａｄには、欠失ウイルス遺伝子産物の片方で欠点を示す腫瘍細胞中で相補Ａｄベクターの複製および増殖を特異的に起動させる。２つの例は、それぞれ、ｐ５３−欠失（または突然変異）または網膜芽腫欠失（または突然変異）腫瘍細胞でのウイルス増殖に施しうるウイルスタンパク質Ｅ１ｂ−ｐ５５およびＥ１ｂである。図１１．相補的Ａｄベクター系を発生させる方法相補的ウイルスベクター系を発生させるために、類似の収量を得る可能性のある２つの異なる相補プロトコールを使用できる。第一のものでは、制御Ａｄプラスミドを、ＡｄＨβから得たｖＤＮＡとコトランスフェクトさせ、そしてＣＰＥが観察されるまでヘルパー細胞を培養する。第二の方法では、制御ベクタープラスミドとｐＢＨＧ１０との当初のコトランスフェクションの３日後、ＡｄＨβを補足ウイルスとして添加し、そしてＣＰＥが観察されるまで、細胞を培養する。図１２．腫瘍崩壊性／免疫原性相補Ａｄベクター系の臨床上の使用アプローチ法腫瘍崩壊性制御Ａｄは、ヘルパーセルラインでの２種のプラスミドのコトランスフェクションによって発生される。制御Ａｄプラスミドは、腫瘍活性化プロモーター／エンハンサーによって調節された１種またはそれ以上のＡｄ遺伝子を含有し、補足Ａｄプラスミドは、Ａｄ遺伝子の残りを含有し、そしてヘルパーセルラインは、制御Ａｄの腫瘍活性化プロモーターが機能する腫瘍由来セルラインである。制御Ａｄおよび補足Ａｄは、補足セルライン中でお互いに補い、そしてウイルス混合物として増殖する。ベクター混合物は、ＣｓＣｌ勾配を通して精製でき、そして局所または全身に腫瘍マスまたは外科的に除去後の腫瘍床に注射できる。腫瘍活性化プロモーター／エンハンサーは、腫瘍細胞中でＡｄＥ１遺伝子を特異的に転写させて、補足Ａｄの転写および複製をトランス活性化するＥ１ＡおよびＥ１Ｂタンパク質を生成する。制御Ａｄベクターは、さらに、補足Ａｄの増殖により複製する。制御Ａｄの複製は、高コピー数の制御Ａｄゲノムを産生し、それは、特異的抗癌免疫性を誘導する免疫調節遺伝子の高レベル発現を支持する。腫瘍細胞中の補足Ａｄの増殖は、腫瘍細胞の溶解を生じる。この系は、局所の殺腫瘍効果および離れた転移の拒絶を起こす全身性抗腫瘍反応を生じる。発明の詳細な説明本発明が、癌および他の疾患の治療のために使用される最近の遺伝子治療技術を実質的に改善する試薬および方法論を供することは、当業者に予測される。本発明は、新形成および他の疾患を治療するのに有用な共通に依存性の相補的組織特異的複製可能なアデノウイルス（Ａｄ）ベクター系を提供する。その系は、制御Ａｄベクター、補足Ａｄを包含する。制御Ａｄは、最少Ａｄシス要素（逆方向末端反復配列あるいは「ＩＴＲ」およびパッケージングシグナル）およびＡｄＥ１遺伝子の発現を引き起こす腫瘍−または組織−特異的プロモーター／エンハンサーカセットを有する。制御Ａｄベクターは、さらに、免疫調節遺伝子または他の初期領域遺伝子のような目的の遺伝子を有する発現カセットを包含する。補足Ａｄは、弱化パッケージングシグナル、Ｅ１領域の欠失、および置換を伴うかまたは伴わないＡｄゲノムの残りを包含する。この系を用いてこのように製造されたＡｄベクターは、相互に依存性があり、そして「相補Ａｄベクター」と称される一対のヒト組換えアデノウイルスを含む。その系の最も直接的用途は、癌の遺伝子療法である。腫瘍マスを感染する局所または全身注射により、ベクターは、腫瘍細胞中で優先的に複製でき、そして免疫調節タンパク質を発現し、それは、好ましくは局所殺腫瘍効果および全身性抗原免疫反応の誘導を生じる。遺伝子の分野で習熟した者は、本発明を実施するのに有用な技術を認識する。分子クローニング(MolecularCloning)；実験室マニュアル（A Laboratory Manua l）(Sambrookら、1989年、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス)、遺伝子発現技術(Methods in Enzymology、１８５巻、D.Goeddel編集、19 91年。アカデミック・プレス、カリフォルニア州サンディエゴ(San Diego、CA)) 、ＰＣＲプロトコールズ：方法および適用に対する指針(Innisら、1990年、アカデミック・プレス、カリフォルニア州サンデイエゴ(San Diego、CA))、動物細胞の培養：基本的技術のマニュアル、２版、(R.I.Freshney、1987年、リス、インク.、ニューヨーク州、ニューヨーク)、抗体：実験室マニュアル(HarlowおよびL ane、1988年、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー、ニューヨーク州コールド・スプリング・ハーバー(Cold Spring Harbor，NY))、タンパク質精製についての指針：メソッズ・イン・エンザイモロジー（Methods in Enzymolog y）１８２巻、(M.P.Deutscher編、アカデミック・プレス、カリフォルニア州サンディエゴ(San Diego、CA))。この用途の範囲内で、ＤＮＡ分子は、明示されたプラスミド、ウイルス、自律複製配列、ファージまたは一本または二本鎖ＤＮＡの線状セグメントまたはあらゆる源から由来したＲＮＡである。レポーター構築体は、アッセイ可能な産物をコードする遺伝子を包含する下部染色体および精製ＤＮＡ分子として定義される。組織特異的または腫瘍特異的手段で発現される遺伝子は、生物中の１つまたはそれ以上の第二の組織とは対照的に１つの組織で多量の発現を例示するものである。エフェクター遺伝子は、遺伝子によってコードされるポリペプチドの発現により、生物、組織または細胞に効果を供するあらゆる遺伝子として定義される。非相同ＤＮＡは、アデノウイルスゲノム以外の源から単離されたアデノウイルス構築物に導入されるＤＮＡとして定義される。移入遺伝子は、生物のゲノムに正常に存在する以外の生物のゲノムに挿入された遺伝子として定義される。組換えアデノウイルスベクターは、そのゲノムに含まれる非相同ＤＮＡの少なくとも１種のセグメントを有するアデノウイルスとして定義される。アデノウイルス粒子は、野生型または組換え体の両方を含めた感染性アデノウイルスとして定義される。アデノウイルスは、アデノウイルスゲノム内でコードされるタンパタ質によりカプシド化されたＤＮＡ分子を含むが、これに限定されない。組換えアデノウイルス粒子は、アデノウイルス遺伝材料並びにアデノウイルス遺伝物質以外の遺伝物質を含めた少なくとも１つの他の源から由来したゲノムの少なくとも一部を有する感染性アデノウイルスとして定義される。治療可能な状態は、医療起源のものとして一般に定義される治療のものに限定はされないが、これらをを含めた、治療の形態の投与によって改変されうる生物の状態として定義される。抗原は、抗体が結合し、そしてさらに、免疫反応の活性化と抑圧もしくは抑制との両方を含めた、免疫反応を刺激する能力のあるあらゆる分子を含めものとして定義される。腫瘍抑制遺伝子は、そのタンパク質産物の発現により、限定はされないが、成長抑制または誘導を含めた、腫瘍の発生を抑制する働きをする遺伝子として定義される。成長抑制遺伝子は、そのタンパク質産物の発現により、細胞の成長を抑制する働きをする遺伝子として定義される。ガン遺伝子は、癌を引き起こす遺伝子として定義される。免疫調節遺伝子は、その核酸またはタンパク質産物の発現により、免疫反応を改変する働きをする遺伝子として定義される。遺伝的状態は、限定されないが、その遺伝子の野生型形態およびその遺伝子のあらゆる突然変異形態を含めた、少なくとも１つの特定遺伝子の発現の少なくとも部分的な結果である生物の状態としてこの出願では定義される。発現カセットは、適切な細胞型でコード化タンパク質の発現のために十分な転写調節領域または転写制御領域に作用可能に結合したレポーターまたはエフェクター遺伝子のためのコーディング配列を包含するＤＮＡフラグメントである。当業者によって使用される際に、現在、ほとんどのアデノウイルスベクターは、Ｅ１領域で欠失され、そして欠けているＥ１機能を供する２９３セルラインで増殖される(Grahamら、1977年)。他の場合には、ヘルパーウイルスが、ウイルスゲノムの大きな欠失を含むベクターをパッケージングするのに使用される。しかし、このような系の主要な不利益は、パッケージ化されたウイルスの大半がヘルパーウイルス（本発明では、補足Ａｄに類似する）であることである。出願人らは、先に、１９９６年５月３１日に出願された米国特許出願番号第０８／６５８，９６１号で、パッケージングシグナルの部分的欠失を示すヘルパーベクターによるＡｄベクターゲノム中での大きな欠失の相補が示された。この出願は、参照してここに組込まれる。補足ベクターは、さらに、β−ｇａｌ発現カセットにより置換されるＥ１領域を有し、したがって、２９３細胞中で増殖される必要がある。補足ベクターは、それらの欠失したアデノウイルス遺伝子を有する制御Ａｄベクターを補う。本発明では、語句「制御Ａｄベクター」は、Ｅ１遺伝子領域を除いて、アデノウイルスコーディング配列が、欠失され、そしてベクターは、複製およびパッケージングに必要な最少要素で構成されるベクターと表される。「補足Ａｄベクター」は、制御Ａｄベクターおよび補足Ａｄベクターの両方の複製およびパッケージングを維持するために必要とされるタンパク質を供する。本発明では、補足Ａｄベクターで失われた初期Ａｄ遺伝子（Ｅ１、Ｅ４またはＥ２）を含む制御Ａｄベクターが供される。この追加の配列で、制御Ａｄは、制御Ａｄは、補足Ａｄ（ヘルパーのヘルパーとして作用する）の複製を支持する可能性がある。したがって、２種のベクター、補足Ａｄおよび制御Ａｄは、増殖について互いに他方に依存する。補足Ａｄおよび制御Ａｄの両方の腫瘍特異的増殖を付与するために、アデノウイルス複製に必要な１種またはそれ以上の初期遺伝子のプロモーターは、腫瘍特異的または腫瘍活性化プロモーターに置換される。Ｅ１、Ｅ２およびＥ４のような複製に必要な任意のアデノウイルス遺伝子が利用できる；そして例えば、α− フェトプロテイン、ＣＥＡ、メラノトランスフェリン、Ｅｒｂ−Ｂ２、チロシナーゼ、ＭＵＣ１、ＰＳＡのような腫瘍特異的活性を示す任意のプロモーターを使用できる。特に、本発明は、α−フェトプロテインプロモーターに置換されるＥ１Ａプロモーターと共にＥ１領域を含む制御Ａｄベクターを含む。α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）プロモーターを利用でき、そして制御Ａｄおよび補足Ａｄ（すなわち、注射の部位で）と同時感染された細胞のみが、制御Ａｄおよび補足Ａｄの増殖を支持する。両方のウイルスが、類似の量で産生されると(補足Ａｄのパッケージングシグナルの部分的欠失または修飾の効果のために)、近隣細胞は同時感染し、そしてそれらの細胞が、ＡＦＰプロモーターからのＥ１発現を駆り立てることができる場合(多くの肝細胞癌腫腫瘍細胞がそうできるように)、両方のウイルスは増殖を継続する。注射部位からの距離が遠くなるほど(腫瘍または術後の腫瘍床)、同時感染の機会は低くなり、したがって、ベクター拡大が停止される。これは、漏れる腫瘍特異的プロモーターと共に、ベクター拡大が全身性でありうる単独の腫瘍崩壊ベクターの筋書きを越えた重大な安全性の利点でありうる。先行技術を越えた本発明の別の利点は、２種の欠乏性ベクターの組合せが、治療上の非相同ＤＮＡのためにさらにもうひとつの余地を見越す。腫瘍特異的プロモーターを担持する単独腫瘍崩壊性Ａｄベクターで、ベクターへの追加のエフェクター遺伝子のために４ｋｂ未満の余地がある。本発明では、外因性非ウイルスＤＮＡのための制御Ａｄの許容量は、３６Ｋｂまでである。抗腫瘍能力を伴う任意の遺伝子は、制御Ａｄに組込むことができる。１つの好ましい具体例では、同時刺激分子Ｂ７．１およびインターロイキンＩＦＮ−γのような免疫刺激遺伝子は、２つの発現カセットとして制御Ａｄに組込まれる。１．相補性Ａｄベクター系ａ．系の組成物相補性Ａｄベクター系は、２つの主要な部分から構成される。：（１）Ｅ１欠失させるかまたは置換されるパッケージング弱化補足Ａｄベクターおよび（２）ウイルスゲノムの最少量のシス要素を有するのみである同族体Ａｄベクターが、制御Ａｄベクターと称されるＥ１または他の初期段階遺伝子を有する。これらのベクターは、補足ＡｄのためにＥ１トランス活性化様の２９３細胞および／またはパッケージングシグナルの制御を許容するＡｄヘルパーセルラインで増殖されうる。補足Ａｄは、それ自身を複製し、そして制御Ａｄベクターをトランス相補化するのに有用でありうる全てのウイルス遺伝子および要素を有する。他方、制御Ａｄベクターは、ＡｄＤＮＡ複製およびパッケージングのためのシス要素であるＩＴＲおよび野生型パッケージングシグナルを有する。制御Ａｄは、２つの異なる方法：プロモーター置換および／または機能性欠失によって制御できる：（１）プロモーター置換：ウイルス置換の制御のための初期遺伝子の自然のウイルスプロモーターは、非相同性プロモーターに置換でき、それは、標的細胞中でのみ活性であるかまたは誘導性がある。例えば、アデノウイルスのＥ１ａプロモーターは、ウイルス複製サイクルのイニシエーターである。Ｅ１ａプロモーターは、主に肝癌腫細胞で活性があるα−フェトプロテインプロモーターに置換することができる。系列特異的であるかまたは腫瘍細胞中で特異的に活性化できるプロモーターの他の例は、図５Ｃに列記される。（２）機能性欠失：標的細胞中でのウイルス複製サイクルに必須でないアデノウイルス遺伝子は、欠失でき、それは、非標的細胞中の非許容性のものから得られる標的細胞中でのウイルス特異的増殖を分化しうる。例えば、腫瘍細胞は、通常、周期内の細胞であり、それでアデノウイルスの正常な休止状態の細胞の周期を誘導する機能はもはや必要とされない。細胞周期インデューサーをコードするアデノウイルス遺伝子の欠失は、正常の休止細胞でのアデノウイルスの複製の能力をなくする。２つの例は、それぞれ、ｐ５３−欠失（または突然変異）および網膜芽腫欠失（または突然変異）腫瘍細胞でのウイルス増殖について施し得るウイルスタンパク質Ｅ１ｂ−ｐ５５およびＥ１ｂである。制御Ａｄベクターの残りは、移入遺伝子または非相同ＤＮＡから構成される。２９３細胞に類似するＡｄヘルパーセルラインは、補足Ａｄの転写および複製をトランス活性化させるためのＡｄＥ１遺伝子を起動させるプロモーターを活性化する能力を示す。細胞は、さらに補足Ａｄのパッケージング弱化の制御機構も有する。これらの細胞は、制御Ａｄの助けなしに補足Ａｄを増殖させるために使用しうる。ｂ．系を操作する機構この系の設計は、ヘルパー細胞または標的細胞中での活性化された組織特異的または腫瘍活性化プロモーターを有することである。プロモーターは、制御Ａｄによって担持されるＥ１遺伝子の転写を駆動する。Ｅ１遺伝子産物は、すぐに、補足Ａｄゲノムの転写および複製プログラムを起動できる。制御Ａｄゲノムは、さらに同時に複製されうる。Ａｄのパッケージングタンパク質が感染細胞中に少量で存在するトランス作用因子であって、Ａｄのパッケージングのための律速段階となる。野生型パッケージングシグナルは、操作されたシグナルより高い親和性を示すパッケージングタンパク質によって認識されるので、パッケージングシグナル中での突然変異を有する補足ウイルスゲノムのパッケージ化は、野生型パッケージングシグナルを有する制御ウイルスゲノムの存在下で部分的にまたは完全に抑制でき、それは、制御Ａｄベクターの優先的なパッケージングを確実にする。したがって、２つのウイルスベクターは、相互に依存性である。さらに、他の初期領域（Ｅ２、Ｅ３および／またはＥ４）中の補足Ａｄの欠失または置換と、対応する遺伝子を有する制御Ａｄの装備とは、制御Ａｄのパッケージングおよび力価とを増加し、また制御Ａｄに関する補足Ａｄのより一層の依存性を増加しうる。これは、抗癌相補Ａｄベクターの開発に特に有用である。Ａｄベクターの精製が使用のために必要とされる場合、相補Ａｄベクターは、さらに、生物学、生化学またはＣｓＣｌ勾配を用いる超遠心のような物理的方法をにより精製できる(図２)。ｃ．系の能力高い遺伝子送出能は、この相補Ａｄベクター系の主要な特性の内の１つである。両方のＡｄベクターは、非相同ＤＮＡを担持できる。最大のパッケージング許容量は、ゲノムの約１０５％、すなわち約３８ｋｂである(Ghosh-Choudhuryら、1987年)。制御Ａｄベクター中のウイルスのシス要素のサイズは、１ｋｂ未満に削減でき、そして補足ＡＤ中の欠失Ｅ１およびＥ３遺伝子は、別に８ｋｂの空間を加えることができるので、非相同ＤＮＡを担持する相補的Ａｄベクターの総許容量は、理論的には４５ｋｂまで可能である。非相同ＤＮＡは、移入遺伝子発現カセットまたは調節要素のいずれかでありうる。発現カセットは、単独または複数、ニシストロン性または多シストロン性である可能性がある。調節要素は、移入遺伝子の維持、転写およびベクターターゲティングを制御するＤＮＡ配列でありえる。相補的Ａｄベクターに作り出された空間のため、これらの内の全てが可能になる。２．パッケージングー弱化補足的Ａｄａ．補足Ａｄのプロトタイプ構造補足Ａｄベクターは、２つの構造的特性を示す：部分的な野生型Ａｄゲノムと操作されたパッケージングシグナルとを含有する(図３)。制御Ａｄベクターに依存するために、補足Ａｄは、最近のＥ１欠失または置換のように複製能が欠失しているにちがいない。制御Ａｄベクターの存在下でそれのパッケージングの制御の目的として、補足体は、パッケージングで弱化されなければならない（以下に詳述される）。したがって、補足Ａｄの一般的構造は、Ｅ１領域とパッケージングシグナルとが操作される以外は全ての野生型ゲノムを有するＡｄベクターとして要約できる。しかし、Ｅ２およびＥ４のようなＡｄの他の必須の調節遺伝子は、さらに操作されるかまたは置換されうる。ウイルスゲノムは、さらに、補足Ａｄの複製応答能を奪うために、または制御Ａｄベクターの複製とパッケージングとを容易にするための補足Ａｄのゲノムサイズを減少させるために、さらに様々の断片に断片化することもできる。補足的Ａｄの力価が明かに影響を及ぼされなかった限り、ウイルス複製での欠点および補足Ａｄのパッケージングでの弱化との両方が補足Ａｄの構造の設計する上で考慮される。ｂ．補足Ａｄの一般的機能補足Ａｄの主要な機能は、制御Ａｄベクターのパッケージングのためのカプシドを供給し、そしてウイルス増殖により標的細胞を溶解させることである。この機能を満たすために、それは、制御Ａｄによって担持されるＥ１遺伝子の標的細胞による組織特異的プロモーターの活性化に依存するものではあるが、補足Ａｄは、それ自身で再生できなければならない。補足的なゲノムのＤＮＡ複製および転写は、影響されない。さもなければ、後期遺伝子産物の収量は、それに応じて影響され、そして制御Ａｄベクターの力価は減少される。補足Ａｄのパッケージング弱化の厳密さは、大いに減少できる。この条件下の補足Ａｄは機能し、制御Ａｄベクターと一緒に移入遺伝子を送出する可能性もある。ｃ．パッケージング弱毒化の設計補足Ａｄをパッケージングする弱化の目的は、制御Ａｄベクターに対する補足Ａｄの過剰増殖に関する能力を減少させることである。これは、制御Ａｄベクターの比較的高い力価が特定の用途に必要とされる場合に特に重要である。補足Ａｄが、相補的Ａｄベクター系を形成する制御Ａｄベクターと一緒に残っているに違いないので、補足Ａｄのパッケージング機能は、完全には能力を奪わないように設計される。以下は、補足的Ａｄのパッケージング弱化についての設計の可能性である。 −パッケージングシグナル突然変異Ａｄ５パッケージングシグナルは、機能的に余分である反復要素から構成される（Hearingら、1987年）(図４)。パッケージングシグナル要素の部分的欠失は、野生型パッケージングシグナルを示すＡｄの数倍からおよそ百倍まで、突然変異体のＡｄの収量を減少させることを示した(GrableおよびHearing、1992年)。したがって、パッケージングシグナル突然変異の設計は、野生型Ａｄパッケージングシグナルから得られるＡ繰返しのモチーフの部分的欠失を組込むことになる。 −合成パッケージングシグナルＡｄ５パッケージングシグナルが、共通のＡ（アデノシン）富化モチーフ（例えば、Ａ−繰返し：ＴＡＡＡＴＴＴＧ）を有するので、選択されたＡ反復または任意の合成ＤＮＡモチーフのタンデム反復の列の組込みは、パッケージングタンパク質に対する人工的パッケージングシグナルの親和性を変化させ、そして補足Ａｄのパッケージングを変える可能性がある。 −パッケージングシグナル干渉Ａｄパッケージングシグナルは、実際に、パッケージングタンパク質によって認識され、そして結合されうる特定のＤＮＡ配列である。シグナルに対するパッケージングタンパク質の有効な結合で干渉するために、他のＤＮＡ結合配列は、補足ＡｄのパッケージングシグナルのＡ反復列の範囲内にまたは隣接しておくことができる。挿入結合部位は、特に、補足Ａｄのパッケージングシグナルが突然変異され、そしてパッケージングタンパク質による結合の親和性が減少される条件下で、ＡｄパッケージングシグナルへのＡｄパッケージングタンパク質の結合を位置的に競うことができるそれらの同族体ＤＮＡ結合タンパク質によって高い親和性の結合が得られる。 −パッケージングシグナル再配置Ａｄパッケージングシグナルは、自然には、野生型Ａｄゲノムの左側末端に配置される。パッケージングシグナルが、右側末端に置かれ、そしてなお機能があるという報告がある。この証拠は、パッケージングシグナルが、転座できることを示す。非野生型位置に操作されたパッケージングシグナルを配置できる設計は、補足Ａｄのパッケージング効率をさらに弱化させるのに有用でありうる。さらに、パッケージングシグナルを別の所に移動するのは、補足Ａｄの操作されたパッケージングシグナルと制御Ａｄベクターの野生型パッケージングシグナルとの間の相同組換えを通して、野生型Ａｄに戻る補足Ａｄの復帰の可能性を最小限にするのに助けになりうる。補足Ａｄのパッケージングを弱化させるために、２つの態様が考えられる：シス要素およびトランス作用因子。したがって、他の可能な設計は、これらの２つの態様またはこれらの２つの態様の任意の組合せに向けることができる。シス要素は、Ａ反復であり、そしてトランス作用因子は、パッケージングタンパク質である。さらに、系による制御Ａｄベクターの高い力価出力が犠牲とすることなしにパッケージングする制御可能な機構を考慮すべきである。３．制御Ａｄベクターａ．制御Ａｄベクターの基本構造Ａｄベクターは、ＩＴＲの融合を介して環化プラスミド形態として使用される(Graham、1984年)。制御Ａｄベクターの最も簡単なプラスミド形態は、ＩＴＲ融合、プラスミドＤＮＡ複製起点、ＡｄＥ１遺伝子、およびポリクローニング部位を含有する環状ＤＮＡである。ＩＴＲ融合は、地図単位０から１までの野生型Ａｄの左側末端、および地図単位９９から１００までの右側末端に含まれ、そこでＡｄのＤＮＡ複製起点が、ＩＴＲおよび左側ＩＴＲの次に配置される野生型パッケージングシグナルの両方に位置する。制御Ａｄベクターは、２つの異なる方法で制御されうる：プロモーター置換および機能欠失。欠失を伴うかまたは伴わないＡｄＥ１領域遺伝子は、Ｅ１遺伝子を制御する、組織特異的または腫瘍活性化または他のプロモーター／エンハンサーを有する特定の発現カセット内の制御Ａｄによって担持される。図５は、制御Ａｄベクターの基本的組成を表す。ｂ．制御Ａｄベクターの構造的および機能的可能性制御Ａｄベクターの基本構造に基づいて、他のＤＮＡ配列および要素は、実施例と同様に追加できる。 −移入遺伝子の発現カセット発現カセットは、基本的転写単位である。付与遺伝子の簡便な発現カセットは、通常、プロモーター、目的の遺伝子、およびポリアデニル化（ポリＡ）シグナルから構成される線状ＤＮＡ構造である。発現カセット内で、２つまたはそれ以上の遺伝子は、ＲＮＡの翻訳またはスプライシングのための追加の要素が、遺伝子間で提供される限り、２−またはポリ−シストロン性構造を形成させることができる。一般に、制御Ａｄベクターは、１つまたは複数の移入遺伝子発現カセットを有することができる。 −ベクターＤＮＡ保持の機能的要素それらは、発現カセットを標的細胞ゲノムへ組込むのを助けるか、または制御Ａｄベクターを標的細胞中でエピソームの形態として維持する要素である。 −ＤＮＡ転写の制御のための制御要素それらは、エンハンサー、レセプターまたは活性化結合部位、イントロン、５'または３'未翻訳領域などのような転写制御機能を有する要素である。 −ベクターおよび移入遺伝子ターゲティングのための要素ターゲティングは、少なくとも２つのレベルで達成することができる。ベクター表面修飾および組織特異的発現。組織特異的プロモーターは、あらゆる細胞型での発現を避けるのに利用できるが、それは、インビボで送出するために標的にされる。 −他の支持要素それらは、真核生物または原核生物の細胞のＤＮＡ複製起点、プラスミドまたはベクター選択マーカー、およびベクターの骨格でありうる。ｃ．制御Ａｄベクターの高力価産生のための設計高力価産生の制御Ａｄベクターは、本発明の主要な目的の内の１つである。他のウイルスベクターを越えたＡｄベクターの利点の内の１つは、高力価標品のＡｄベクターを得ることが可能であることである。Ａｄの高力価標品である理由は、主に、高コピー数のウイルスゲノムと共に多量のウイルスカプシドタンパク質の生成による。以下は、高力価制御Ａｄベクターを生成するための方法についての考慮の例である。 −増強されたＤＮＡ複製Ａｄは、ＤＮＡ複製のためのそれ自身の酵素系を有する。Ｅ２領域タンパク質は、ウイルスＤＮＡ複製に対応する主要なトランス作用要素である。複製起点は、ウイルスゲノムの両方の末端にあるシス要素である。制御Ａｄゲノム複製を増強するために、補足ウイルスから発現された十分量のＥ２タンパク質が供されるべきである。Ｅ２領域タンパク質の高レベル発現は、補足ウイルスにあるものに加えて、さらにＥ２遺伝子を制御Ａｄゲノムに添加することによって達成することもできる。制御Ａｄゲノムのコピー数の増加による他の機構も考慮される。 −増強されたパッケージングシグナルより多くのまたはよりよいパッケージング配列(一方の末端または両方でタンデム反復をさらに追加するか、または合成パッケージングシグナルを生成するかのいずれか)。 −増強されたパッケージングプロセスＡｄのパッケージングプロセスおよび機構は、明らかに理解されていない。Ａｄのパッケージングシグナル以外のＤＮＡ結合タンパク質が、パッケージングに相乗的な役割を果たすかどうかは確かでない。そうであれば、パッケージングの碇を降ろす点と言われ、Ａｄゲノムに自然に存在するＤＮＡ結合タンパク質のための配列は、制御Ａｄゲノムに戻す必要があるかもしれない。４．ＡｄヘルパーセルラインＡＤヘルパーセルラインは、多量の相補的ＡＤウイルスを提供するのに使用される。セルラインが、制御Ａｄにより担持されたＡｄＥ１遺伝子の転写のトランス活性化を示すので、それは、すぐに補足Ａｄゲノムの転写および複製プログラムを活性化させる。２９３細胞におけるものとの差異は、Ｅ１フラグメントが、制御Ａｄによって担持されるように設計され、そして補足Ａｄゲノムと重なり合う配列はないことである。ＡｄＥ１遺伝子を制御するプロモーター／エンハンサーを活性化するその細胞の持つ能力は、細胞が、相補的Ａｄベクターのためのヘルパー細胞として機能することで重要である。ヘルパー細胞の遺伝子操作のための他の要素は、高コピー数の制御Ａｄベクターの産生を支持し、制御Ａｄベクターのパッケージングを増強し、そして補足Ａｄのパッケージングを弱化する遺伝子である。４．本発明は、以下の用途に特に有用である。ａ．ベクターの腫瘍内または全身注射による局所殺腫瘍性効果および全身性抗癌免疫性Ａｄベクターは、インビボでの培養腫瘍細胞および様々な型の固形腫瘍モデルでの強力な感染性を示す。Ａｄベクターのこの特徴づけは、癌の治療のために利用されてきた。治療の効率は、感染腫瘍細胞での相補的Ａｄの複製および増殖、およびベクターにより送出される遺伝子の発現の腫瘍崩壊効果に依る。サイトカイン、ケモカイン、インターロイキン、および免疫調節の組合わせた機能を示す多重遺伝子が、全身性抗癌免疫反応を最適化する必要がある。相補的Ａｄベクターは、多重遺伝子を送出する能力を有し、そして癌細胞に感染する腫瘍内または全身性注射のための抗癌Ａｄを構築するのに有用である。ｂ．インビボで標的細胞機能を修飾するか、または遺伝子修飾による標的細胞の成長を制御するためＡｄベクターは、高い力価のウイルスの産生で他のウイルスベクターを越えた利点を示し、それはインビボ遺伝子療法で有用である。瘢痕組織、前立腺肥大、血管ネオインテマのような上皮または内皮増殖性疾患を治療するために、増殖細胞の遷移的に組織特異的抑制を示す相補的Ａｄベクターは、局所用途に有用でありうる。したがって、それは、遺伝子修飾により、インビボで標的細胞機能を修飾するか、または標的細胞の増殖を調節するのに有用である。ｃ．ベクターの表面修飾によりインビボで標的細胞または組織に移入遺伝子を特異的に送出するため例えば、ヘキソンおよび繊維の遺伝子は、特定のエピトープまたはリガンド（例えば、ＩｇＧのＦｃフラグメントに結合するプロテインＡ）と融合するように操作できる。これらの修飾遺伝子は、ターゲティング剤として他のリガンドと作用すべき表面部位を有するウイルスの世代についての組換えウイルスゲノムに戻すことができる。したがって、ウイルス粒子は、組織または細胞認識能力を有する。ｅ．直接インビボアプローチ法を介したＡｄ介在ワクチン化に使用するためワクチン化の目的のために、Ｅ１置換Ａｄベクターの免疫原性は、有益である可能性があり、それは、Ａｄ基礎の組換えワクチンの開発に使用されてきた。このタイプの用途のための制御Ａｄベクターの寄与は、Ｅ１置換Ａｄベクターをヘルパーウイルスとして使用し、そして抗原の遺伝子を同時送出させ、免疫増強することである。Ｅ１の特定の制御は、誘導性プロモーターのような特定のプロモーター／エンハンサーを用いて設計されえた。ｇ．アデノウイルス学および新規ベクター構築の基本的研究および開発の道具として使用されるために相補的Ａｄベクター系それ自身は、アデノウイルス学に優れた価値を示す。実行可能性および操作の構築および例示は、すでにその分野に際立った進歩をもたらした。補足Ａｄおよび制御Ａｄは、Ａｄの研究およびそれの潜在的な用途のための都合のよい道具でありうる。これは、特に、制御Ａｄベクターにも当てはまる。制御Ａｄの複製、パッケージング、および増殖の効率の特徴付けは、重要な情報を伴う分野を提供する。ｈ．遺伝子転写および治療の分野で他の方法論との組合せで使用されるためにＡｄベクターは、ポリリシン、リポソーム、および他の接合物質と一緒に、遺伝子送出複合体として使用された。相補的Ａｄベクターは、これらのタイプの組合せでも使用された。ｉ．遺伝子転写および治療の分野での他の目的のために使用するために相補的Ａｄベクター系は、上で検討されたものに加えて、遺伝子転写および治療のために使用されるべき素晴らしい潜在力を示す。可能性は、遺伝子転写および治療の分野のさらなる開発に出合う。実施例１腫瘍特異的α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）プロモーター／エンハンサーによって駆動されたＥ１遺伝子を含有し、そして免疫調節遺伝子を発現する制御Ａｄベクターの構築本発明は、新形成を治療するのに使用できるアデノウイルスベクターに関する。互いに相補性であり、そして必須のウイルス遺伝子を駆動する腫瘍特異的プロモーターを含有する２つの欠損ベクターの組合せによってベクターを作製する。好ましい具体例では、ベクターは、ウイルス遺伝子全部で欠失され(制御Ａｄ)、そしてα−フェトプロテインプロモーターＥ１カセットを含有するベクターを、突然変異パッケージングシグナルを伴うＥ１欠失ヘルパーと組合せる。補足Ａｄを、パッケージングシグナルで欠失させて、制御Ａｄを越えるそのパッケージングの利点を減少させる。アデノウイルスヌクレオチド１９４から２４７、そして２７４から３５８までのパッケージングシグナル二重欠失を伴う補足Ａｄ（ＡｄＨβ）は、図６、７Ａおよび７Ｂに示されるとおり構築して得た。肝細胞癌腫の特徴の内の１つは、患者のほとんどが、血清中で高いα−フェトプロテイン（ＡＦＰ）レベルを示すことである(Engstromら、1997年)。この高レベルのＡＦＰ発現は、ＡＦＰ遺伝子の５'−隣接配列によって転写的に制御され、それは、肝細胞癌腫で起こるが、周囲の正常な肝臓では生じない。肝細胞癌腫でのＡＦＰプロモーター／エンハンサーの特異性は、ＡｄＥ１遺伝子の特定の制御を相補Ａｄベクター系について可能にする。本発明は、肝癌特異的転写活性についてＡＦＰ遺伝子の５'−隣接配列の下流に配置されたＡｄＥ１遺伝子を有する発現カセットを提供する。カセットは、制御Ａｄベクター（ｐＧＴ８０２５）によって担持される。抗癌免疫応答の誘導のために、Ｂ７．１同時刺激因子およびインターフェロン−γをコードするｃＤＮＡを含む２つの追加の発現カセットは、制御Ａｄベクターに含まれる。制御ＡｄベクターｐＧＴ８０２５を構築するために、グリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子を、ｐＡＦＰＧＦＰ中のＳａｌＩ（平滑末端）／ＮｏｔＩ部位から切り出し、そしてｐｃＥ１中のＳｐｅＩ（平滑末端）／ＮｏｔＩ部位から切り出されたＥ１領域に置換される。その後、ＮｏｔＩリンカーを、ＡＦＰプロモーターの５'でＸｈｏＩ部位でライゲートさせた。その後、ＲＳＶ／Ｂ７−１およびＥＦｐ／ＩＦＮ−γを含有する発現カセットを、ＰａｃＩで消化させることにより、ｐＢ７／ＩＦＮ−γから切り出した。その後、発現カセットを、ｐＧＴ５４０５のＰａｃＩ部位にクローン化させて、ｐＧＴ８０２６を得た。その後、ＡＦＰ／Ｅ１発現カセットを含有するフラグメントを、ＮｏｔＩを用いてｐＦＴ２０８５から切り出し、そしてｐＧＴ８０２６のＮｏｔＩ部位に挿入して、制御ＡｄベクターｐＧＴ８０２７を得た(図８)。その後、制御Ａｄベクターを利用して、補足ＡｄのＤＮＡで、ＨｅｐＧ２セルラインのようなＡＦＰプロモーターを活性化できるヘルパーセルラインにコトランスフエクションにより、「相補的Ａｄ」ベクター系を得る。相補的Ａｄベクターの生成は、また、ヘルパーセルラインへの制御Ａｄベクターのトランスフェクション、続いての補足Ａｄの感染の結果、制御Ａｄの救援のために生じうる。実施例４にさらに詳細が供される。実施例２Ｈ１自律性パルボウイルスプロモーターによって駆動されたＥ１遺伝子を含有する制御Ａｄベクターの構築パルボウイルス誘導細胞毒性に対する新形成細胞の感受性を増加させるのは、完全なパルボウイルス生活サイクルまたは少なくともいくつかのそれの段階を持続するそれらの能力を増強することによって達成される。悪性疾患形質転換が、産生、核転位、およびウイルスＮＳタンパク質の活性を調節し、細胞毒性を引き起こし、例えばＤＮＡ複製、ｐ３８プロモータのトランス活性化及びウィルス発生のウィルスのライフサイクルの連鎖を許すので、分子レベルで、非構造転写単位の産物は、この選択作用に主要な役割を果たす(Cornelisら、1990 年；Spegelaereら、1991年)。自律性のウイルス生物学上の特性（接種伝染性、腫瘍親和性、腫瘍抑制活性、およびヒト細胞で複製する能力）のこの基準で、げっ歯類のパルボウイルスは、腫瘍細胞標的遺伝子療法のためのベクター形態に操作された(Russellら、1992年；Dupontら、1994年)。本発明は、ＡｄＥ１遺伝子の腫瘍特異的転写活性のためのＨ１自家性パルボウイルス制御要素を含み、ウイルスの腫瘍親和性および腫瘍複製特性に基づいてもいる相補的Ａｄベクター系を提供する。Ｈ１自家性パルボウイルスプロモーターの制御下でＡｄＥ１遺伝子を有する制御Ａｄベクターの構築は、ｐ４およびｐ３８プロモーターおよびＨ１自家性パルボウイルスの完全なＮＳ１遺伝子を含有するプラスミドｐＦＨ１の増幅によって行われた(図９)。ＮｏｔＩリンカーは、ｐ３８プロモーターの３'末端でｐＦＨ１のＥｃｌｌ３６II部位に連結された。その後、Ｅ１アデノウイルス遺伝子を、ｐＦＨ１−ＮｏｔＩのＸｂａｌ／ＮｏｔＩ領域でｐ３８プロモーターの下流に挿入した。その後、別のＮｏｔＩリンカーを、ｐ４プロモーターの５'末端でＳａｌＩ部位にライゲートした。その後、ｐ４およびｐ３８プロモーターの制御下でＥ１遺伝子を含むＮｏｔＩフラグメントを、ｐＧＴ８０２６（実施例１）のＮｏｔＩ部位に挿入して、制御ＡｄベクターｐＧ８０２８を生じた。Ｈ１自家性パルボウイルスプロモーターによる制御で相補的Ａｄの発生について、ヘルパー細胞は、ｐ４およびｐ３８プロモーターを活用できる。Ｈｅｌａ、ジャーケット(Jarket)、ＫＭＭＳＴ６、ＭＲＣ−５、ＦＲＥＪ４、Ｕ９３７、ＴＨＰ−１等のような多くの癌セルラインまたは形質転換細胞が、この目的を担うことができる。実施例３癌および他の疾患の遺伝子療法のための相補的Ａｄベクターの多様性実施例１および２は、それぞれＡｄＥ１を駆動する組織特異的および腫瘍活性化プロモーター／エンハンサーを用いて相補的Ａｄベクター系についての２種の設計を例示する。図１０は、系の他の可能性を表す。補足Ａｄおよび制御Ａｄのゲノムは、１つのベクターまたは一方が他方を補うような他のものの中のＡｄ遺伝子の置換を含み得る。Ｅ１遺伝子は制御Ａｄゲノム中に主として含まれている。２つのベクターの間の相補的要素は、図１０Ｃに列記される。移入遺伝子および支持要素は、一般に制御Ａｄベクターに関係するが、補足Ａｄは、特定の環境下ではこのような遺伝子を含有する可能性がある。細胞周期インディーサーをコードする初期Ａｄ遺伝子の欠失は、正常な休止細胞でのアデノウイルスの複製能をなくするが、制御Ａｄが欠失ウイルス遺伝子産物の片方に欠陥を有する腫瘍細胞中で補足Ａｄベクターの複製および増殖を特異的に駆動させる。２つの例は、それそれｐ５３−欠失（または突然変異）または網膜芽腫欠失（または突然変異）腫瘍細胞中でのウイルス増殖に施しうるウイルスタンパク質Ｅ１ｂ−ｐ５５およびＥ１ｂである。実施例４癌の遺伝子療法のための相補的Ａｄベクターの発生および用途相補的ＡＤウイルスベクターを発生させるために、ヘルパーセルラインは、制御Ａｄで生じるＥ１遺伝子の特異的プロモーターを利用できる。本発明は、利用できそして類似の結果を生じることができる２つの別個の相補的プロトコールを提供する。図１１は、ウイルス生成プロセスを記述する。これらの方法の第一は、制御Ａｄプラスミドは、精製した補足ＡｄＤＮＡと一緒にヘルパー細胞２９３にコトランスフェクトする。コトランスフエクトに続いて、細胞障害効果（ＣＰＥ）が観察されるまで、ヘルパー細胞を培地に維持する。第二の方法では、補足ＡｄプラスミドｐＢＨＧ１０と制御Ａｄプラスミドとの当初のコトランスフェクションの３日後、補足Ａｄ（ＡｄＨβ）により宿主細胞を感染させて、制御Ａｄを救済する。ＣＰＥが現れるまで治療細胞を、培地に維持し、そしてウイルスを３回の凍結／解凍サイクルによって収穫する。上述の方法論のいずれかを利用した後、溶解物の収穫に続いて、溶解物（産生した制御Ａｄの０継代）を使用して、新鮮な９０％の集密度の単層の２９３細胞（１から３の増幅スケールを用いて）に感染させた。感染の１日後、蛍光顕微鏡下で制御Ａｄを検出し、そしてヘルパーの存在を、Ｘ−ｇａｌ染色によって検出した。補足ウイルスが、溶解物に存在する場合、細胞のさらなるインキュベーションにより、ＣＰＥの出現を伴う制御および補足混合物の増幅を行った(この単層の新たな溶解物が、ミニウイルスの１継代と考えられる)。補足物が溶解物に存在しない場合、制御Ａｄ単独では、複製せず、そして新規補足物の添加によってのみＣＰＥは新規ウイルスを発生させる。したがって、補足Ａｄの存在は、Ｘ −ｇａｌ染色によって評価でき、そしてＣＰＥの出現によりさらに高い感受性で評価できる。相補的Ａｄベクターの単離に続いて、ウイルスは、ＣｓＣｌ勾配を用いて細胞骸から精製でき、そして局所的にまたは全身的に注射して、腫瘍マスまたは手術による除去に続く腫瘍床に感染させる。腫瘍活性化プロモーター／エンハンサーは、腫瘍細胞中で特異的にＡｄＥ１遺伝子を転写して、さらに補足Ａｄの転写および複製プログラムをトランス活性化できるＥ１ＡおよびＥ１Ｂタンパク質を産生する。制御Ａｄベクターも、補足Ａｄの増幅と共に複製する。制御Ａｄの複製は、高コピー数の制御Ａｄゲノムを産生し、それは、免疫調節遺伝子の高レベル発現を支持して、特異的抗癌免疫性を誘導できる。補足Ａｄの増殖は、腫瘍細胞を溶解し、そしてさらに近隣細胞へ感染するとともに免疫反応を発生させる役割を果たす。継続性局所殺腫瘍効果は、距離転移の拒絶に関与する全身性抗腫瘍反応に至る(図１２)。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者ファン、シャンミンアメリカ合衆国 60048 イリノイ州リバティヴィルダーネルストリート 1915 (72)発明者ザーン、ウェイ−ウェイアメリカ合衆国 60048 イリノイ州リバティヴィルダーネルストリート 1915

Claims

【特許請求の範囲】１．相補的遺伝子配列を有し、そして標的細胞中での複製のために互いに依存しあう第一および第二のアデノウイルスベクターを含む組成物であって、その第一のアデノウイルスベクターが標的細胞活性化プロモーターかまたは機能性欠失を有し、これらが標的細胞に対して第一および第二のアデノウイルスベクターの増殖を制御および制限し、標的細胞を直接的または間接的に死滅させる組成物。２．アデノウイルスベクターの内の１つが、標的細胞を直接的に、または間接的に死滅させるタンパク質をコードする請求項１に記載の組成物。３．標的細胞が、腫瘍細胞である請求項１に記載の組成物。４．アデノウイルスベクターの内の１つが、標的細胞中で活性化されたプロモーターを有する制御ベクターである請求項１に記載の組成物。５．アデノウイルスベクターの内の１つが、標的細胞中に施しうるウイルス遺伝子中の機能的な欠失を有する制御ベクターである請求項１に記載の組成物。６．アデノウイルスベクターの内の１つが、制御アデノウイルスベクターの増殖を支持する補足アデノウイルスベクターである請求項１に記載の組成物。７．アデノウイルスベクターの内の１つまたは両方が、免疫調節タンパク質または他の機能性タンパク質をコードし、タンパク質が標的細胞内で発現される遺伝子を含む請求項１に記載の組成物。８．腫瘍活性化プロモーターが、α−フェトプロテインプロモーター、ＤＦ−３ムチンエンハンサー、チロシナーゼプロモーター、ＣＥＡプロモーター、ＰＳＡプロモーター、Ｈ₁パルボウイルスプロモーター、誘導性プロモーターおよび合成プロモーターからなる群から選択される請求項１に記載の組成物。９．免疫調節タンパク質が、インターフェロン−α、Ｂ７同時刺激因子、インターロイキン、ケモカイン、および腫瘍特異的抗原からなる群から選択される請求項１に記載の組成物。１０．標的細胞が、肝癌、乳癌、黒色腫、肺癌、結腸癌および前立腺癌からなる群選択される請求項１に記載の組成物。１１．図８に図示され、ｐＧＴ８０２７と名付けられたアデノウイルスベクターを含む組成物。１２．図９に図示され、ｐＧＴ８０２８と名付けられたアデノウイルスベクターを含む組成物。１３．ＩＴＲ配列を有する制御Ａｄベクター配列と、パッケージング配列と、ＡｄＥ１タンパク質をコードする遺伝子に作用可能に連結された細胞−もしくは組織− 特異的転写制御領域と、および免疫調節タンパク質をコードする遺伝子に作用可能に連結された転写制御領域とを含むアデノウイルスベクターで宿主細胞をトランスフェクトし、トランスフェクトした宿主細胞を、操作されたパッケージングシグナルを有する補足−Ａｄウイルスで感染させ、そして宿主細胞から得られる細胞不含溶解物を調製することを備える、請求項１に記載の組成物を調製する方法であって、該細胞不含溶解物が、感染性の、複製制御組換え、制御−Ａｄベクターおよび補足Ａｄベクターを含むことを特徴とする組成物を調製する方法。１４．請求項１記載の組成物を、制御Ａｄベクターの組織特異的プロモーターから遺伝子発現を起動させる能力を有する宿主細胞に感染させ、そして前記宿主細胞から細胞不含溶解物を調製し、そして制御Ａｄベクターと補足Ａｄベクターとの混合物を含む相補Ａｄベクターを単離することを備える、疾患を治療するための相補Ａｄベクターを得る方法。１５．請求項１記載の組成物を、制御Ａｄベクターの組織特異的プロモーターから遺伝子発現を起動させる能力を有する宿主細胞に感染させ、前記宿主細胞から細胞不含溶解物を調製し、制御Ａｄベクターおよび補足Ａｄベクターを精製し、そして補足Ａｄベクターから制御Ａｄベクターを分離することを備える、相補Ａｄベクターを調製する方法。１６．ＩＴＲ配列、パッケージング配列、ＡｄＥ１タンパク質をコードする遺伝子に作用可能に連結される細胞−または組織−特異的転写制御領域、および免疫調節タンパク質をコードする遺伝子に作用可能に連結される転写制御領域を有する制御Ａｄベクター配列と、改変されたパッケージングシグナルを有する補足Ａｄベクター配列とを、宿主細胞に、コトランスフェクトし、そして宿主細胞から細胞不含溶解物を調製することを備える、疾患を治療するための相補的Ａｄベクターを得る方法であって、細胞不含溶解物が、感染性の複製修復相補アデノウイルスベクター粒子を含有することを特徴とする相補Ａｄベクターを得る方法。１７．アデノウイルスＩＴＲ、パッケージングシグナル、および第一および第二の転写制御領域を包含し、該転写制御領域の各々が、エフェクターまたはレセプター遺伝子に作用可能に連結されることを特徴とする感染性の複製欠陥組換えアデノウイルス粒子を得るのに有用なアデノウイルスベクター。１８．前記パッケージングシグナルが野生型パッケージングシグナルである請求項１７のアデノウイルスベクター。１９．前記第一の転写性の特異的に制御された領域が、細胞または組織特異的手段で機能する請求項１７のアデノウイルスベクター。２０．前記エフェクター遺伝子が、ＡｄＥ１タンパク質をコードする請求項１７のアデノウイルスベクター。２１．前記第一の特異的に制御された転写領域が、ＡｄＥ１タンパク質をコードするエフェクター遺伝子に作用可能に連結される細胞−もしくは組織−特異的なまたは誘発性の手段で機能する請求項１７のアデノウイルスベクター。２２．前記第一の転写制御領域が、α−フェトプロテインプロモーター／エンハンサーであり、そしてＡｄＥ１タンパク質をコードするエフェクター遺伝子に作用可能に連結される請求項１７のアデノウイルスベクター。２３．前記第二の転写制御領域が、免疫調節タンパク質をコードする遺伝子に作用可能に連結される請求項１７のアデノウイルスベクター。２４．前記第二の転写制御領域が、Ｂ７．１タンパク質をコードする遺伝子に作用可能に連結される請求項１７のアデノウイルスベクター。２５．さらに、免疫調節タンパク質をコードする遺伝子に作用可能に連結される第三の転写制御領域を包含する請求項１７のアデノウイルスベクター。２６．さらに、ＩＦＮ−γをコードする遺伝子に作用可能に連結される第三の転写制御領域を包含する請求項１７のアデノウイルスベクター。２７．前記第一の転写制御領域が、α−フェトプロテインプロモーター／エンハンサーであり、そしてＡｄＥ１タンパク質をコードするエフェクター遺伝子に作用可能に連結され、前記第二の転写制御領域が、Ｂ７．１タンパク質をコードする遺伝子に作用可能に連結され、前記ＤＮＡ分子が、さらに、ＩＦＮ−γをコードする遺伝子に作用可能に連結した第三の転写制御領域を包含する請求項１７のアデノウイルスベクター。２８．図８に図示され、ｐＧＴ８０２７と名付けられたアデノウイルスベクター。２９．図９に図示され、ｐＧＴ８０２８と名付けられたアデノウイルスベクター。３０．部分的野生型Ａｄゲノムおよび修飾弱化パッケージングシグナルを包含する補足Ａｄベクター。３１．ＡｄゲノムのＥ１領域が、欠失されるか、または置換される請求項３０の補足Ａｄベクター。３２．ＡｄゲノムのＥ２領域が、欠失されるか、または置換される請求項３０の補足Ａｄベクター。３３．ＡｄゲノムのＥ４領域が、欠失されるか、または置換される請求項３０の補足Ａｄベクター。３４．ＡｄゲノムのＥ１領域およびＥ２領域が、欠失されるか、または置換される請求項３０の補足Ａｄベクター。３５．ＡｄゲノムのＥ１領域およびＥ４領域が、欠失されるか、または置換される請求項３０の補足Ａｄベクター。３６．ＡｄゲノムのＥ１、Ｅ２およびＥ４領域が、欠失されるか、または置換される請求項２９の補足Ａｄベクター。３７．患者に、ＡｄＥ１タンパク質をコードする遺伝子に作用可能に連結される腫瘍特異的転写制御領域、免疫調節タンパク質をコードする遺伝子に作用可能に連結される第二の転写制御領域を有する制御Ａｄベクターと、改変パッケージングシグナルおよび欠失Ｅ１領域を有する補足Ａｄベクターとを、腫瘍内に局所投与または全身投与し、それにより、局所および全身性抗腫瘍免疫応答が発生するように組換えアデノウイルスベクターが腫瘍細胞中で増殖することを特徴とする癌を治療する方法。３８．ＡｄＥ１遺伝子からのＥ１ｂまたはＥ１ｂ−ｐ５５遺伝子中に欠失を有する制御Ａｄベクターであって、Ｅ１ａ遺伝子が組織特異的または腫瘍活性化転写制御領域の制御下にあり、第二の転写制御領域が免疫調節タンパク質をコードする遺伝子に作用可能に連結されている制御Ａｄベクターと、改変パッケージングシグナルおよび欠失Ｅ１領域を有する補足Ａｄベクターとを含む相補的Ａｄベクターの感染により、癌を治療する方法。３９．請求項３記載の組成物の局所で腫瘍内にまたは全身投与することを含む癌を治療する方法。