JP2001509488A - 敗血症治療薬、その製造及び使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は敗血症治療薬、その製造及び使用に関する。発明の応用分野は製薬業と医療である。本発明の課題は重要な成分としてリポ多糖結合タンパク質LBPを含む薬剤によって解決される。また本発明はLBPの変異型、突然変異体及びハイブリッドタンパク質を包含する。ヒトLBPのほかにネズミ又はイエウサギLBPも使用することができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 本発明は敗血症治療薬、その製造及び使用に関する。本発明の応用分野は製薬
業及び医療である。

【０００２】 しばしば致命的な合併症を伴う敗血症は、医療において多くの場合最も恐れら
れ、治療上克服しがたい病症に属し、西欧諸国だけで毎年数十万人の犠牲者をも
たらす。抗生物質は効果があまりにも遅く、細菌性毒素の放出を阻止せず、一部
では強化さえするので、新規な治療法を緊急に求めなければならない。細菌性毒
素によって引き起こされる、宿主の身体によるメッセンジャー物質(サイトカイ ン)の散布は、敗血症の症状の発生における発病連鎖の最も重要な要素である。 一方では最も重要な毒素である細菌性リポ多糖(LPS)を抗体で阻止し又は身体固 有のいわゆる好炎症サイトカインを拮抗するといった種々の新しい治療法は、大
規模な臨床研究で全く効果がなかった(C.Natansonら、Ann.Intern.Med.120,771
-783(1994年))。

【０００３】 本発明の根底にあるのは、敗血症治療薬を開発する課題である。

【０００４】 この課題は主要な成分としてリポ多糖結合タンパク質LBPを含む薬剤によって 解決される。

【０００５】 本発明の特徴は請求項1ないし11に含まれている。ヒトLBPのほかにネズミ又は
イエウサギLBPも使用することができる。

【０００６】 LBPの構造は知られており、その調製は急性期cDNA遺伝子バンクからクローン を分離し、続いて配列決定し、アミノ酸配列を導き出すことによって行われる。
発現ベクターでのcDNAのクローニング及びバキュロウイルスによる昆虫細胞の共
感染によって組換えLBPが作られる。

【０００７】 クローン化されたLPS結合タンパク質(LBP)は高親和性LPSを結合し、敗血症の 発症中に急性期タンパク質として血清中に散布される。実施例で示すように、LB
PはLPS効果を阻止し、マウスに与えると、LPSによって引き起こされた敗血症を 抑制し、死亡率を極めて有意に減少する。このことは敗血症の発病と同時に及び
事前に使用した場合に当てはまる。従ってLBPは敗血症の予防に適していると思 われる。LPSはグラム陽性菌により発病した敗血症及び「全身性炎症応答症候群(
systematic inflammatory response syndrome)」、創傷によって引き起こされた
、敗血症と同じ症状、グラム陰性腸内菌の「転移(Translocation)」による症状 でも中心的役割を果たすから、LBPによるLPS効果の阻止はこれらの劇的な症状を
改善することができる。

【０００８】 高活性組換えLBPのほかに、機能を変え最適化した突然変異体も本発明の実現 のために同様に適しており、敗血症治療薬として同じく使用される。

【０００９】 本発明の実現のためのもう1つの基本的な可能性は、クローン化したLBP遺伝子
を強力CMVプロモーターの後方で高い肝活性を有するアデノウイルスベクターに クローニングして、LBPの肝臓発現とともに遺伝子転移を得ることである。

【００１０】 本発明は *グラム陰性菌によって発病した敗血症 *グラム陽性菌によって発病した敗血症 *創傷及び負傷によって発病した全身性炎症応答症候群(SIRS) に応用することができる。

【００１１】 次に実施例と図により本発明を詳述する。

【００１２】 LBPの調製 全LBP cDNAを強力ポリヘドリンプロモ一夕ー及びグルタチオンSトランスフェ ラーゼ(GST)cDNAの後方でpACHLT-Bベクター(Pharmigen、米国サンジエゴ)にクロ
ーニングして、GST融合タンパク質を発現させる。次にSf-9昆虫細胞の500mlの細
胞培養をこのベクター及びバキュロウイルスDNA(同じく米国サンジエゴPharmige
nの「Baculogo1d」即ち線形化した形のバキュロウイルスDNA)で感染させる。細 胞を2日後に溶解し、溶菌液を「バッチ」法でトリトンxl0Oの存在でグルタチオ ンセファロースに結合する。次にトロンビン消化によりLBPを融合パートナーか ら分離し、続いてトリトンの除去のためにカルビオソルブ(Calbiosorb)で処理し
、残留トロンビンの除去のためにべンザミジンセファロースで処理する。純LBP の最終濃度は0,3-0,5mg/mlである。

【００１３】 簡単な解説 高用量のLBPはin vitroで、細菌性毒素LPSによって引き起こされる重要な敗血
症メディエーター分子即ちTNFの合成を抑制する。マウスでこのタンパク質及び その他のメディエーターの生産がLBPの同時投与により同じく抑制される。またL
PS投与により誘起される肝障害がLBPによって防止され、マウスの生存数を有意 に高める。このようにしてLBPの投与は敗血症でLPS効果を防止するようであり、
敗血症の治療のための新しい治療原理をなす。

【図面の簡単な説明】

【図1】マウスのマクロファージ細胞ラインをin vitroで種々の濃度の細菌性 毒素LPSで刺激し、LBPに応じて敗血症メディエーターTNFを合成する。体内に見 られない高いLPS濃度の場合は、LBPはTNF合成に影響しない。ところが低いLPS量
によるマクロファージの刺激は、in vivoで急性期に現れる、また外因的添加に よっても得られるような高いLBP濃度によって阻止される。

【図2】ここでは血清の存在でのLBPの添加もマクロファージ細胞ラインのTNF 生産を抑制することが示される。血清中にあるLBPがその原因である。

【図3】外的に供給されるLBP量が一定の場合、血清濃度を増加すると、やはり
TNF合成が抑制される。

【図4】ここでは外的投与で生じるマウスのLBPレベルが高いLPS投与で生じる 急性期レベルに相当し、従って生理的であることが示される。

【図5】マウスでLBPの同時投与によりLPSが誘起するサイトカインの散布を抑 制することができる。A:TNF、B:IL-6

【図6】またLPSによって引き起こされ、ALT酵素の増加により検出される肝障 害がLBPの当時投与により抑制される。

【図7】LBPの投与はLPS敗血症モデルの死亡率を有意に減少する。各群20頭の マウスで実施。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ 15/09 15/00 Ａ

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】リポ多糖結合タンパク質(LBP)、その変異型、突然変異体又はハ イブリッドタンパク質を含む敗血症治療薬。
2. 【請求項２】ヒトLBPを含む請求項1に記載の薬剤。
3. 【請求項３】マウスLBPを含む請求項1に記載の薬剤。
4. 【請求項４】イエウサギLBP又はラットLBPを含む請求項1に記載の薬剤。
5. 【請求項５】ハイブリッドタンパク質即ち殺菌性/透過性増加タンパク質(BPI)
   のLPS(リポ多糖)結合部位を有するLBP及びカブトガニ抗LPS因子(LALF)のLPS結合
   部位を有するLBPを含む請求項1に記載の薬剤。
6. 【請求項６】LPS結合部位の領域(アミノ酸91-101)で個々のアミノ酸交換によ り機能が改善された点突然変異による変異型を含む請求項1に記載の薬剤。
7. 【請求項７】バキュロウイルス系及びCHO細胞でLBPをまず融合タンパク質とし
   て発現し、次いでそれ自体公知の分離法で融合パートナーにより精製することを
   特徴とする請求項1ないし6に記載の薬剤の製造方法。
8. 【請求項８】グラム陰性菌により発病した敗血症の治療のための請求項1ない し6に記載の薬剤の使用。
9. 【請求項９】グラム陽性菌により発病した敗血症の治療のための請求項1ない し6に記載の薬剤の使用。
10. 【請求項１０】創傷及び負傷により発病した敗血症の治療のための請求項1な いし6に記載の薬剤の使用。
11. 【請求項１１】LBP遺伝子を強力プロモーター、とりわけCMVプロモーターの後
    方でアデノウイルス因子にクローニングし、続いて当該の肝細胞に遺伝子転移を
    行うことを特徴とする請求項1に記載の薬剤。