JP2001269196A - Quantitative method for nucleic acid in test object and method for counting number of molecule of nucleic acid in test object - Google Patents

Quantitative method for nucleic acid in test object and method for counting number of molecule of nucleic acid in test object

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JP2001269196A
JP2001269196A JP2000085048A JP2000085048A JP2001269196A JP 2001269196 A JP2001269196 A JP 2001269196A JP 2000085048 A JP2000085048 A JP 2000085048A JP 2000085048 A JP2000085048 A JP 2000085048A JP 2001269196 A JP2001269196 A JP 2001269196A
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Tadashi Fukami
Kenichi Hirano
憲一 平野
正 深見
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Hamamatsu Photonics Kk
浜松ホトニクス株式会社
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Abstract

PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a method for precisely and quantitatively determining a nucleic acid in a test object such as a small amount of a gene or a mRNA in a specimen. SOLUTION: The number of molecule of the nucleic acid in the test object initially existing in the specimen is counted and quantitatively determined by dividedly injecting a PCR solution containing a target DNA derived from the nucleic acid in the test object into a channel of a capillary plate, treating the capillary plate with temperature cycling of PCR without doing anything else, multiplying the target DNA in the channel by PCR and specifying and counting a channel exhibiting fluorescence caused by the multiplied target DNA through image analysis.

Description

【発明の詳細な説明】 DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

【0001】 [0001]

【発明の属する技術分野】本発明は、極微量で試料中に存在する遺伝子またはmRNAなどの核酸を定量する方法に関する。 The present invention relates to relates to a method of quantifying a nucleic acid, such as a gene or mRNA present in the sample in trace amounts. さらに詳しくは、本発明はPCRに基づき、極微量で試料中に存在する遺伝子またはmRNAなどの核酸または該核酸に由来する標的DNAを増幅させて、もともと試料に存在した核酸の分子数を計数する方法、並びに該計数結果から核酸の濃度を定量する方法に関する。 More particularly, the present invention is based on the PCR, very small amount in exacerbating the target DNA from a nucleic acid or nucleic acid such as a gene or mRNA present in the sample, and counts the original number of molecules of nucleic acids present in the sample method, and a method for determining the concentration of nucleic acid from the regimen counting results.

【0002】 [0002]

【従来の技術】インビトロ核酸増幅技術は、少量の核酸の検出、および分析のための強力な手段を提供してきた。 BACKGROUND OF THE INVENTION In vitro nucleic acid amplification techniques have provided powerful tools for detection of small amounts of nucleic acids, and analysis. このような技術は、感染症および遺伝的疾患の診断、生化学的分析のための遺伝子の単離、並びに法医学における特定の核酸の検出のおいて格段の進歩をもたらした。 Such techniques, diagnosis of infectious diseases and genetic diseases, isolation of genes for biochemical analysis, and resulted in a remarkable progress had up for detection of specific nucleic acids in forensic medicine. 現在、最も汎用性のある技術は、耐熱性ポリメラーゼ(Taq po1ymerase)を用いたポリメラーゼ連鎖反応(Po1ymerase Chain R Currently, the most versatile technology, polymerase chain reaction using a thermostable polymerase (Taq po1ymerase) (Po1ymerase Chain R
eaction(以下PCRまたはPCR法という)) eaction (hereinafter referred to as PCR or PCR method))
であり、DNA(断片)を理論的には10億倍以上に増幅し得る。 , And the theoretically a DNA (fragment) can be amplified more than 10 billion times. しかしながら、PCRにおける増幅効率および正確さは、処理温度、前記核酸の塩基配列、反応溶液成分の濃度や種類等の様々な要因によって左右され、測定対象である核酸分子の数(濃度)をPCR最終産物の濃度測定またはPCR過程におけるリアルタイム測定によって正確に決定することは、困難であった。 However, the amplification efficiency and accuracy in the PCR, the processing temperature, the base sequence of the nucleic acid, the reaction solution is affected by various factors concentration and type of components, PCR final number of nucleic acid molecule to be measured (concentration) it has been difficult to accurately determine the real-time measurement of the concentration measurement or PCR process product.

【0003】このような状況下、微量な遺伝子を正確に定量する試みとして、最近「デジタルPCR」という技術が提案された。 [0003] Under such circumstances, as an attempt to accurately quantify the small amount of gene, recent technology called "digital PCR" it has been proposed. Bert Vogelsteinら、 Bert Vogelstein, et al.,
Proc. Proc. Natl. Natl. Acad. Acad. Sci. Sci. USA,96 USA, 96
巻,9236−9241頁を参照。 Winding, pp. 9236-9241. この方法に従うと、 According to this method,
定量すべき遺伝子試料をPCR溶液で限界希釈し、タイタープレートの穴(ウエル)に分注する。 The gene sample to be quantified limiting dilution PCR solution is dispensed into the hole (well) of the titer plate. タイタープレート上で試料溶液のPCRを行わせ、前記遺伝子に由来するDNAを増幅した後、蛍光プローブ等を用いて、各穴の蛍光信号を計測し、増幅されたDNAが蛍光を発する穴の数を計数する。 To perform the PCR of the sample solution on the titer plate, after amplifying the DNA derived from the gene, the number of holes with a fluorescent probe such as a fluorescent signal of each well was measured, amplified DNA to fluoresce for counting. 前記限界希釈によって、各穴には1分子のDNAが存在すると仮定してもよいので、蛍光を発する穴の数が試料中のDNA分子の数、すなわち試料中のmRNA量に対応し、遺伝子を定量できることになる。 By the limiting dilution, since it is assumed to DNA of 1 molecule exists in each well, the number of DNA molecules having the sample holes fluoresce, ie corresponds to the mRNA content of the sample, the gene so that can be quantified. この方法は、残念ながら以下に言及する幾つもの潜在的な問題を抱えている。 This method, suffer from a number of potential problems mentioned below, unfortunately.

【0004】タイタープレート上でPCRを行わせ、D [0004] PCR was performed on a microtiter plate, D
NA増幅が検出できるまでにはPCRのサイクルを60 The PCR cycle until NA amplification can be detected 60
回程度行う必要がある。 It is necessary to carry out the order of times. しかしながら、PCRのサイクル回数が40を超えると、目的のPCR増幅物以外のP However, when the number of cycles of PCR is more than 40, P other than PCR amplification of interest
CR産物が生成し、該増幅物を汚染する(以下、非特異的DNA増幅という)ことが当業者に認識されている。 CR product is produced, contaminating the amplified product (hereinafter, referred to as non-specific DNA amplification) It has been recognized by those skilled in the art.
これには、2つの原因が考えられる。 This includes, two causes can be considered. その1つは、偶然にPCR溶液中に混入した微量のDNAがPCRによって増幅されることで、一般に「キャリーオーバー」と呼ばれる。 One is that the trace amounts of DNA were mixed in PCR solution by chance is amplified by PCR, generally referred to as "carry-over". この現象はPCR溶液中の標的DNAの濃度が低くなれば、より顕著になる。 This phenomenon the lower the concentration of the target DNA in PCR solution, becomes more pronounced. 他の1つは、プライマー同士が二本鎖を形成し、これが鋳型となり、PCRによって増幅されることで、非特異的増幅産物をもたらす。 The other is a primer to each other to form a duplex, which is a template, it is amplified by PCR, resulting in non-specific amplification products.
これを避けるために、サイクル数は、一般的に40回以上としないことが当業者に了解されている。 To avoid this, the number of cycles generally be not more than 40 times are understood to those skilled in the art. いずれにしろ、前記デジタルPCR法は、60回以上のサイクル数を必要とするので、目的のPCR増幅物と所望でない混在PCR増幅物との区別がつきにくくなり、正確なDN In any case, the digital PCR method, since it requires the number of 60 or more cycles, becomes difficult to distinguish between the mixed PCR amplification was undesirable and PCR amplification of interest, accurate DN
Aの定量は、当然難しくなる。 Determination of A is of course difficult. このような非特異的DN Such non-specific DN
A増幅を回避するには、幾つかの対処策が既に知られているが、いずれも煩雑な操作または高価な試薬が要求される。 To avoid A amplification, although some countermeasure is already known, both complicated operations or expensive reagents are required. 例えば、1)DNA合成の基質として用いる塩基の一つdTTPの替わりにdUTPを加えてDNA合成を行い、次のPCRにおいてDNAに取り込まれたdU For example, 1) dU in addition to dUTP instead of one dTTP base used as a substrate for DNA synthesis performed DNA synthesis, was incorporated into DNA in subsequent PCR
TPの部分を切断する酵素を加える方法、2)異なるプライマー対を2種類用いて2段階のPCRを行う方法、 How to make enzymes that cut portions of TP, 2) a method of performing two-step PCR using two different primer pairs,
3)増幅するDNA中の適当な塩基配列を特異的に切断する制限酵素をPCR高温処理前の溶液に加えてキャリーオーバーDNAを除去する方法等が公知である。 3) a method for removing a specifically cleaving restriction enzyme PCR hot pretreatment solution plus carryover DNA an appropriate base sequence of amplified in DNA are well known.

【0005】さらに、デジタルPCR法では、限界希釈を得るために種々の倍率に希釈して、例えばタイタープレートの穴の総数の半分にDNA分子が含まれるように条件設定しなくてはならない。 [0005] Further, in the digital PCR method, and diluted to various magnifications in order to obtain a limiting dilution, e.g., must be the condition setting to include DNA molecules to half of the total number of holes in the titer plate.

【0006】また、デジタルPCR法では、タイタープレートの穴の総数の半分にDNA分子が含まれるように限界希釈した場合、ポアソン分布から、1つの穴にDN [0006] In the digital PCR method, DN if half of the total number of holes in the titer plate was limiting dilution to include DNA molecules from Poisson distribution, the one hole
A分子が2分子入る確率が12%、3分子入る確率が3 Probability that A molecule enters two molecules of 12%, 3 molecules entering probability 3
%、と無視できない。 %, It can not be ignored. このため、計数した穴の数とDN For this reason, the number of counted hole and DN
A分子の数が一致せず、評価にぶれがでて、定量の信頼性が薄れる。 Number of A molecules do not match, out the blur evaluation, fades reliability of quantification.

【0007】 [0007]

【発明が解決しようとする課題】以上のようなデジタルPCR法の問題点に鑑み、試料中の微量な遺伝子やmR In view of the problems of the digital PCR method as described above that [0008], trace genes and mR of the sample
NAなどの核酸の分子数を正確に決定(すなわち、計数する)し、核酸の濃度を含めて定量するためにデジタルPCR法にかわる方法が望まれる。 Accurately determine the number of molecules of nucleic acid such as NA (i.e., counting to), and an alternative to the digital PCR method to quantify, including the concentration of nucleic acid is desired. 従って、本発明は、 Accordingly, the present invention is,
デジタルPCR法の問題点を解決し、簡便かつ正確に試料中の被検体核酸を定量する方法、または被検体核酸の分子数の計数方法を提供することを目的とする。 To solve the problems of the digital PCR method, and an object thereof is to provide a simple and how accurately quantify the analyte nucleic acid in the sample or counting method of the number of molecules of the subject nucleic acids.

【0008】 [0008]

【課題を解決するための手段】すなわち、本発明に従えば、被検体核酸の定量方法であって、試料からの被検体核酸に由来する標的DNA、および蛍光試薬を含むPC That Means for Solving the Problems], according to the present invention includes a method of quantifying analyte nucleic acid, the target DNA derived from the subject the nucleic acid from the sample, and a fluorescent reagent PC
R溶液を調製する第1の工程と、所定の数のチャンネルを備えたキャピラリープレートに前記PCR溶液を載せる第2の工程と、前記キャピラリープレートの両面を弾力性のある透明な板で密閉し、前記PCR溶液を前記各チャンネルに封入する第3の工程と、前記両面が密閉されたキャピラリープレートを予め設定した温度サイクルに曝し、前記被検体核酸に由来する標的DNAのPCR Sealed with a first step and a second step of placing the PCR solution capillary plate having a channel of a predetermined number, the transparent plate on both sides of the capillary plate a resilient preparing the R solution, the third step and the both surfaces exposed to a temperature cycle which is set in advance the capillary plate is sealed, PCR of target DNA derived from the the subject nucleic acid to encapsulate the PCR solution to each channel
を行わせる第4の工程と、前記両面が密閉されたキャピラリープレートを蛍光測定に供し、蛍光を発する蛍光性チャンネルの数を計数し、ここで該蛍光性チャンネルは前記PCRによって増幅された被検体核酸に由来する標的DNAを含むチャンネルである第5の工程と、を含むことを特徴とする被検体核酸の定量方法が提供される。 A fourth step of causing the, subjecting the capillary plate, wherein both sides is sealed in fluorescence measurements, the subject counts the number of fluorescent channels fluoresce, wherein the fluorescent properties channel is amplified by the PCR Determination method of the subject nucleic acid comprising a fifth step of a channel containing the target DNA from the nucleic acid, is provided.

【0009】また、本発明は、前記第5の工程に続いて、前記計数された蛍光性チャンネルの数に基づいて被検体核酸の濃度を求める工程を含むことを特徴とする上記被検体核酸の定量方法を提供する。 Further, the present invention, subsequent to the fifth step, the subject nucleic acid, which comprises the step of determining the concentration of analyte nucleic acid based on the number of the counted fluorescence channels It provides a quantitative method.

【0010】また、本発明は、キャピラリープレートをタンパク質の吸着阻害剤で前処理する工程をさらに含むことを特徴とする上記被検体核酸の定量方法を提供する。 [0010] The present invention also provides a method of quantifying the analyte nucleic acid, characterized in that it further comprises a step of pretreating the capillary plate adsorption inhibitor of protein.

【0011】好ましくは、上記被検体核酸の定量方法において、蛍光試薬がマイナーグローブ結合型の蛍光色素、または蛍光エネルギー移動を利用した蛍光プローブオリゴヌクレオチドからなる。 [0011] Preferably, in the method for quantifying the analyte nucleic acid, consisting of a fluorescent probe oligonucleotide fluorescent reagent using minor groove binding type fluorescent dye or fluorescence energy transfer.

【0012】また、好ましくは、上記被検体核酸の定量方法において、キャピラリープレートの両面を密閉する弾力性のある透明な板がシリコンゴム製である。 [0012] Preferably, in the method for quantifying the analyte nucleic acid, a transparent plate with a resilient sealing the both surfaces of the capillary plate is made of silicone rubber.

【0013】さらに、本発明の別の側面によれば、被検体核酸の分子数の計数方法であって、試料からの被検体核酸に由来する標的DNA、および蛍光試薬を含むPC Furthermore, according to another aspect of the present invention, PC including a counting method of the number of molecules of the subject nucleic acid, the target DNA derived from the subject the nucleic acid from the sample, and a fluorescent reagent
R溶液を調製する第1の工程と、所定の数のチャンネルを備えたキャピラリープレートに前記PCR溶液を載せる第2の工程と、前記キャピラリープレートの両面を弾力性のある透明な板で密閉し、前記PCR溶液を前記各チャンネルに封入する第3の工程と、前記両面が密閉されたキャピラリープレートを予め設定した温度サイクルに曝し、前記被検体核酸に由来する標的DNAのPCR Sealed with a first step and a second step of placing the PCR solution capillary plate having a channel of a predetermined number, the transparent plate on both sides of the capillary plate a resilient preparing the R solution, the third step and the both surfaces exposed to a temperature cycle which is set in advance the capillary plate is sealed, PCR of target DNA derived from the the subject nucleic acid to encapsulate the PCR solution to each channel
を行わせる第4の工程と、前記両面が密閉されたキャピラリープレートを蛍光測定に供し、蛍光を発する蛍光性チャンネルの数を計数し、ここで該蛍光性チャンネルは前記PCRによって増幅された被検体核酸に由来する標的DNAを含むチャンネルである第5の工程と、を含むことを特徴とする被検体核酸の分子数の計数方法が提供される。 A fourth step of causing the, subjecting the capillary plate, wherein both sides is sealed in fluorescence measurements, the subject counts the number of fluorescent channels fluoresce, wherein the fluorescent properties channel is amplified by the PCR a fifth step of a channel containing the target DNA from the nucleic acid, molecule number counting method of the subject nucleic acid comprising a are provided.

【0014】以下、本発明を好適な実施の形態に従って、詳細に説明する。 [0014] Hereinafter, according to the preferred embodiment of the present invention will be described in detail.

【0015】 [0015]

【発明の実施の形態】本発明の主要な側面は、被検体核酸の分子数または濃度の定量方法であって、試料からの被検体核酸に由来する標的DNA、および蛍光試薬を含むPCR溶液を調製する第1の工程と、所定の数のチャンネルを備えたキャピラリープレートに前記PCR溶液を載せる第2の工程と、前記キャピラリープレートの両面を弾力性のある透明な板で密閉し、前記PCR溶液を前記各チャンネルに封入する第3の工程と、前記両面が密閉されたキャピラリープレートを予め設定した温度サイクルに曝し、前記被検体核酸に由来する標的DNAのPCRを行わせる第4の工程と、前記両面が密閉されたキャピラリープレートを蛍光測定に供し、蛍光を発する蛍光性チャンネルの数を計数し、ここで前記蛍光性チャンネルは前記PC Main aspect of the embodiment of the present invention provides a method of quantifying the number of molecules or concentration of the analyte nucleic acid, the target DNA derived from the subject the nucleic acid from the sample, and the PCR solution containing fluorescent reagent a first step of preparing, sealed a second step of placing the PCR solution capillary plate having a channel of predetermined number, both sides of the capillary plate with a transparent plate with a resilient, the PCR solution a third step of encapsulating said each channel, and a fourth step of the both surfaces exposed to a temperature cycle which is set in advance the capillary plate is sealed, perform the PCR of the target DNA from the the subject nucleic acid, subjecting the capillary plate, wherein both sides is sealed in fluorescence measurements, it counts the number of fluorescent channels fluoresce, wherein the fluorescent channels the PC によって増幅された被検体核酸に由来する標的DNAを含むチャンネルである第5の工程と、を含むことを特徴とする被検体核酸の定量方法である。 A method of quantifying analyte nucleic acids, characterized in that it comprises a fifth step is a channel containing the target DNA from the subject nucleic acid amplified by.

【0016】従って、本発明の被検体核酸の定量方法の骨子は、被検体核酸に由来する標的DNAを含むPCR [0016] Accordingly, the gist of the method of quantifying analyte nucleic acids of the present invention, PCR containing the target DNA from the subject nucleic acid
溶液をキャピラリープレートのチャンネル内に封入し、 The solution was sealed in the channel of the capillary plate,
前記標的DNAをPCRにより増幅し、増幅された標的DNAが発する蛍光を検出、解析することにより、最初に試料中に存在した被検体核酸の分子数を計数することにある。 The target DNA was amplified by PCR, detecting fluorescence amplified target DNA is emitted by analyzing is to initially counting the number of molecules of analyte nucleic acid present in the sample. そこで、以下、「本発明の定量方法」とは、本発明に従う、被検体核酸の濃度の定量方法および被検体核酸の分子数の計数方法を含み、それら両方またはいずれかの意味で用いる。 Therefore, hereinafter, the term "quantification method of the present invention", according to the present invention includes a method of counting the number of molecules of quantitative methods and analyte nucleic acid analyte concentration nucleic acid, used in their both or any meaning.

【0017】本明細書中で用いる「被検体核酸」とは、 [0017] As used herein, the term "subject nucleic acid"
DNAまたはRNA(mRNAを含む)を包含し、1本鎖または2本鎖のいずれであってもよいが、本発明の定量方法を適用するためには、被検体核酸自身、或いはそれに由来する標的DNA(後述)の塩基配列が少なくともPCR可能な程度に知られている必要がある。 Targets include DNA or RNA (including mRNA), it may be either single-stranded or double-stranded, in order to apply a quantitative method of the present invention, derived from the subject the nucleic acid itself, or it it is necessary to base sequence of DNA (described below) is known to the extent possible at least PCR. また、 Also,
被検体核酸は必ずしも純粋な形態である必要はなく、複雑な混合物のごく一部のフラクション(例えば、β−グロブリン遺伝子の一部)であってもよい。 Analyte nucleic acid is not necessarily pure form, a small portion of the fraction of a complex mixture (e.g., beta-portion of immunoglobulin genes) may be used. さらに、被検体核酸は、天然または人工的に合成されたもの等いかなる起源のものであってもよいが、本発明の応用分野を鑑みて、血液、細胞、組織、微生物またはウイルスから抽出されたDNAまたはRNAであることが好ましい。 Furthermore, the subject nucleic acids, such as those natural or artificially synthesized may be of any origin, but in view of the application field of the present invention, the extracted blood, cells, tissue, from microbial or viral it is preferably a DNA or RNA. 本明細書中で用いる「試料」とは、このような被検体核酸が含まれる試料を指し、これも特に限定はない。 A "sample" as used herein, refers to a sample which contains such subject nucleic acids, which is not particularly limited. しかし、前記と同様の理由から、生体試料(特に、臨床検体および細胞診検体)が好適に本発明の定量方法において、用いられる。 However, for the same reason as above, the biological sample (especially, clinical specimens and cytology specimens) in a quantitative way of suitably present invention, is used. 臨床検体としては、尿、糞便、喀痰、 The clinical specimens, urine, feces, sputum,
血液等が挙げられる。 Blood and the like. 細胞診検体としては、液状の胸水、腹水等の体腔液および針窄刺吸引等の生検手法で得られる腫瘍細胞等が挙げられる。 The cytology specimen liquid pleural fluid, tumor cells, and the like obtained by biopsy technique coelomic fluid and needle 窄刺 aspiration such as ascites. 通常、これらの検体から被検体核酸(DNA)を得るには、検体を前処理して、核酸を抽出する。 Usually, in order to obtain the subject nucleic acid (DNA) from these specimens, pretreated specimens, to extract the nucleic acids. 前処理方法は、検体の種類により、異なっており、各検体について、確立された処理方法を適用すればよい。 Pretreatment method, the type of specimen, different and, for each sample, may be applied to established treatment method. 核酸の抽出方法としては、フェノール・クロロホルム法およびグアニジンチオシアン酸法等が公知である。 As the method for extracting nucleic acid, phenol-chloroform method and the guanidine thiocyanate method or the like are known. 一方、被検体核酸がRNAである場合、RNA自身は、PCRの基質とはなりえない。 On the other hand, if the subject nucleic acid is RNA, RNA itself, not be a substrate for PCR. しかし、逆転写酵素によって、RNAからcDNAを合成することによりPCRをRNAの解析に応用することが可能である。 However, the reverse transcriptase is a PCR by synthesizing cDNA from RNA can be applied to the analysis of RNA. 従って、前記逆転写酵素反応をPCRと組み合わせることにより、被検体核酸がRNAであっても本発明の定量方法が適用できる。 Therefore, by combining the reverse transcriptase reaction and PCR, the subject nucleic acids can be applied quantification method of the present invention be a RNA. 特に、検体がRNAウイルス(HIV、HCV、ハンターウイルス等)を含むときがこのような場合にあたる。 In particular, when the sample contains an RNA virus (HIV, HCV, Hunter virus, etc.) corresponds to such a case. RNAウイルスは、染色体としてDNAではなく、RNAを有しているからである。 RNA viruses, not the DNA as a chromosome, because have RNA. また、被検体核酸として、DNAが解析の対象となり得るときでも、該DNAの代わりにmRNAを被検体核酸とすると、mRNAはDNAに比べて細胞あたりのコピー数が多い場合があり、感度の点でmRNAを解析するほうがDNAを解析するより有利となる。 Further, as the subject nucleic acids, even when the DNA can become a target of analysis, when the subject nucleic acid of mRNA instead of the DNA, mRNA has often copy number per cell in comparison to DNA, in terms of sensitivity in better analyzing the mRNA is advantageous than to analyze the DNA. 従って、 Therefore,
本明細書中で用いる「被検体核酸に由来する標的DN Target DN derived from "a subject nucleic acid as used herein
A」とは、PCRによって増幅されるDNAであり、被検体核酸がDNAの場合、該DNAを指し、被検体核酸をRNA(mRNA)とするとそれから得られるDNA The A "is a DNA that is amplified by PCR, if the subject nucleic acid is DNA, refers to the DNA, obtained therefrom when the subject nucleic acid and RNA (mRNA) DNA
(cDNA)を指す。 It refers to a (cDNA).

【0018】前記逆転写酵素反応は、常法にしたがい容易に実施できる。 [0018] The reverse transcriptase reaction can easily be carried out by a conventional method. 例えば、試料に対して、市販の標準的なcDNA合成キット(Amersham Pharm For example, the sample, standard commercial cDNA synthesis kit (Amersham Pharm
acia社製Time Saver cDNA Syn acia Co., Ltd. Time Saver cDNA Syn
thesis Kit)を作用させ、mRNAからcD thesis Kit) by the action of, cD from mRNA
NAを合成する。 The synthesis of NA. また、逆転写酵素反応での逆転写酵素の至適pH(8.3付近)は、PCRの緩衝液のpH Furthermore, optimum pH (around 8.3) of the reverse transcriptase enzyme in a reverse transcriptase reaction, pH of the buffer PCR
(例えば、8.4〜8.8)と近く、さらに両反応で要求されるMg 2+も共通である。 (E.g., 8.4 to 8.8) and close further Mg 2+ required in both reactions are common. そこで、逆転写酵素反応後、緩衝液を置き換えずそのままPCRで使用する緩衝液で希釈することで、PCRに適した緩衝液条件を得ることができる。 Therefore, after the reverse transcriptase reaction, by diluting with buffer solution used as it is PCR without replacing the buffer solution, it is possible to obtain the buffer conditions suitable for PCR. 従って、逆転写によって合成されたcD Therefore, cD synthesized by reverse transcription
NAを直接PCRにより増幅に供することが可能である。 By PCR NA directly it can be subjected to amplification. 尚、この場合、通常のPCRにおいて、2本鎖DN In this case, in a normal PCR, 2 stranded DN
Aを変性させて、1本鎖DNAとしてからPCRを実施するのと同様に、mRNA−cDNA2本鎖を変性させて、1本鎖cDNAとする。 Denaturing the A, as well as to perform PCR from a single-stranded DNA, the mRNA-cDNA 1 wherein cDNA 2 strand is denatured to single-stranded cDNA. この時、同時に使用した逆転写酵素も失活する。 At this time, also inactivated reverse transcriptase was used at the same time.

【0019】本発明の定量方法に含まれる第1の工程は、被検体核酸に由来する標的DNA(1本鎖)、および蛍光試薬を含むPCR溶液を調製することからなる。 The first step included in the quantification method of the present invention consists of preparing a PCR solution containing the target DNA (1 strand), and fluorescent reagent derived from a subject nucleic acid.
具体的には、前記標的DNA、PCR緩衝液(プライマー、dNTP、TaqDNAポリメラーゼ等からなる)、および蛍光試薬を混合して、PCR溶液を調製する。 Specifically, (consisting of primer, dNTPs, Taq DNA polymerase, etc.) the target DNA, PCR buffer, and fluorescent reagents were mixed to prepare a PCR solution. ここで用いるプライマーは、標的DNAの5'側と3'側での2種類のプライマーを常法に従って合成したものである。 Primers used herein are those two primers at the 5 'side and 3' side of the target DNA was synthesized by a conventional method. プライマーの設計に関しては、GENET With regard to the design of primers, GENET
YX(ソフトウェア開発)等の市販のソフトウェアを利用することができる。 It is possible to use a commercially available software such as YX (software development).

【0020】蛍光試薬は、増幅された標的DNAを検出する目的で使用するものであり、増幅されたDNA量に比例して、その蛍光強度が増加する性質を有する必要がある。 The fluorescent reagent is for use for the purpose of detecting the amplified target DNA, in proportion to the amplified DNA amount, it is required to have a property that the fluorescence intensity increases. 本発明では、好ましくは、マイナーグルーブ結合型のDNA特異的蛍光色素を蛍光試薬として使用する。 In the present invention, preferably, use a minor groove binding type DNA specific fluorescent dye as a fluorescent reagent.
この型の蛍光色素は、DNA鎖のマイナーグルーブに結合するので、増幅DNAにその量に比例して取り込まれる。 Fluorescent dyes of this type, because it binds to the minor groove of the DNA strand is incorporated in proportion to the amount of amplification DNA. DNAが存在しないとき、蛍光色素自身は弱い蛍光しか発しない。 When the DNA is not present, the fluorescent dye itself does not emit only a weak fluorescence. このようなマイナーグルーブ結合型の蛍光色素の代表的なものとして、Hoechst3325 Typical examples of such minor groove-binding fluorescent dye, Hoechst3325
8およびHoechst33342が挙げられる。 8 and Hoechst33342 and the like.

【0021】また、蛍光エネルギー移動を利用した蛍光プローブも蛍光試薬として本発明の定量方法に使用可能である。 Further, a fluorescent probe that utilizes fluorescence energy transfer can also be used for quantification method of the present invention as a fluorescent reagent. このようなプローブは、供与体色素および受容体色素として働く2種類の蛍光色素の対を、または1種類の蛍光色素とその蛍光を消光する色素の対を結合させたオリゴヌクレオチドであり、PCR進行に伴って生じる、プローブのハイブリダイゼーションや分解により蛍光エネルギー移動が解消される結果、供与体色素の蛍光強度が増加するため、蛍光測定からDNA増幅を推定することができる。 Such probes are two types of pairs of fluorochrome or one fluorescent dye and oligonucleotide obtained by binding pairs of dye to quench the fluorescence, which acts as the donor dye and acceptor dye, PCR progresses caused by the hybridization and degradation as a result of fluorescence energy transfer is eliminated probes, the fluorescence intensity of the donor dye is increased, it is possible to estimate the DNA amplified from fluorescence measurements.

【0022】本発明の定量方法に含まれる第2の工程は、所定の数のチャンネルを備えたキャピラリープレートに前記PCR溶液を載せることからなる。 The second step included in the quantification method of the present invention consists in placing the PCR solution capillary plate having a channel of predetermined number. ここで使用されるキャピラリープレートは、ガラス製またはシリコン製の材料から構成されるものが好ましい。 Capillary plate used here, those composed of glass or silicon material is preferred. 図1aおよび図1bに、本発明で使用されるキャピラリープレート1の一例を示す。 Figure 1a and 1b, the an example of a capillary plate 1 for use in the present invention. 典型的なものは、外径数〜数十mmであり、直径数〜200μm程度かつ深さ(厚さ)0.5 Typical is the outer diameter of several to several tens mm, diameter of several ~200μm and depth (thickness) 0.5
〜数mmの円筒状のカラム(チャンネル2ともいう)を所定の数(数千〜数百万で任意に選択できる)を備える。 Comprising a cylindrical column to several mm (arbitrarily be selected thousands - several Million) (also referred to as channel 2) a predetermined number. キャピラリープレート1にPCR溶液を載せるには、PCR溶液を、キャピラリープレート1の片側(底面)に接触させる。 Post a PCR solution in capillary plate 1, the PCR solution is contacted with one side of the capillary plate 1 (bottom). すると毛細管現象によりPCR溶液が、各チャンネル2に注入される。 Then PCR solution by capillarity, is injected into each channel 2. この注入段階の様子は、図3(a)(後述)に模式的に示される。 The state of the injection phase is shown schematically in FIG. 3 (a) (described below). 別法として、キャピラリプレートの上面からピペット操作によりPCR溶液をチャンネル内に注入してもよい。 Alternatively, PCR solution by pipetting from the upper surface of the capillary plate may be injected into the channel.

【0023】本発明の定量方法に含まれる第3の工程は、前記キャピラリープレートの両面を弾力性のある透明な板で密閉し、前記PCR溶液を前記各チャンネル内に封入することからなる。 The third step included in the quantification method of the present invention is to seal the both surfaces of the capillary plate with a transparent plate with a resilient, consists in sealing the PCR solution in said each channel. ここでは、図2aに示すように、前記第2の工程でキャピラリープレート1の各チャンネル2にPCR溶液が注入されたままの状態で、キャピラリープレート1の両面を弾力性のある透明な板(例えば、シリコンゴム板3)で密閉する。 Here, as shown in Figure 2a, in a state in which the PCR solution is injected into each channel 2 of the capillary plate 1 in the second step, the transparent plate on both sides of the capillary plate 1 with a resilient (e.g. , sealed with silicone rubber plate 3). キャピラリープレート1が密閉されると、PCR溶液が各チャンネル2 When capillary plate 1 is sealed, PCR solution each channel 2
内に封入され、チャンネル間でPCR溶液の移動は起こらない。 Enclosed within, the movement of the PCR solution does not occur between channels. この後、シリコンゴム板3の外側をカバーガラス4で覆う。 Thereafter, cover the outside of the silicon rubber plate 3 with a cover glass 4.

【0024】本発明の定量方法に含まれる第4の工程は、前記両面が密閉されたキャピラリープレートを予め設定した温度サイクルに曝し、前記標的DNAのPCR The fourth step included in the quantification method of the present invention, subjected to temperature cycling the both surfaces preset capillary plates sealed, PCR of the target DNA
を行わせることからなる。 It consists of to perform. この工程は、通常のPCRと同様にして実施される。 This step is carried out in the same manner as the conventional PCR. 図2aさらに図2bを参照。 Referring to FIG. 2a further Figure 2b. まず、前記第3の工程で、両面が密閉され、さらにカバーガラス4で覆われたキャピラリープレート1をPCR用に設計されたチェンバー5内に収納する。 First, in the third step, both sides are sealed, the capillary plate 1 covered further with a cover glass 4 is housed in the chamber 5 designed for PCR. チェンバー5 Chamber 5
の外枠は熱伝導性の高い材料、例えば、無酸素銅またはアルミ合金板で作られており、チェンバー5自体がヒートブロックとして、直接加熱/冷却される。 Material outer frame of the high thermal conductivity, for example, is made of oxygen-free copper or aluminum alloy plate, chamber 5 itself as a heat block, is directly heated / cooled. キャピラリープレート1をチェンバー5内に載置した後、固定ネジ6を締めてキャピラリープレート1を固定する(図2 After placing the capillary plate 1 into the chamber 5, to secure the capillary plate 1 by tightening the fixing screw 6 (Fig. 2
b)。 b). チェンバー5をそのままの状態で、市販のサーマルサイクラーのアルミブロック7上に載置する。 The chamber 5 as it is, is placed on an aluminum block 7 of commercially available thermal cycler. サーマルサイクラーでの各サイクルの温度、反応時間およびサイクル数を設定し、PCRを実施する。 Temperature of each cycle in a thermal cycler, reactions to set the time and number of cycles to perform the PCR. 本発明で採用される温度サイクルは、通常のPCRの温度サイクルと特に、異ならない。 Temperature cycle employed in the invention, particularly a conventional PCR temperature cycles, not different. 本発明の定量方法も増幅反応自体は、 Quantitative methods also amplification reaction of the invention itself,
通常のPCRとなんら異ならないので、デジタルPCR Since not any different from conventional PCR, digital PCR
法の項で説明した、交雑DNAからくる「キャリーオーバー」を出来るだけ少なくし、非特異的DNA増幅(バックグランド)を抑えることが好ましい。 Described in the section modulus, and minimize hybridization DNA coming from "carryover", it is preferable to suppress the non-specific DNA amplification (background). このための、 For this,
様々な措置、工夫については、当業者に認識されているとおりである。 Various measures, for devising, is as known to those skilled in the art. このようにして、標的DNAを鋳型としてPCRが行われ、該DNAが増幅されることとなる。 In this way, PCR is performed to the target DNA as a template, so that the DNA is amplified.

【0025】しかし、前記のPCR反応溶液をそのままキャピラリープレートのチャンネルに封入して、PCR [0025] However, by sealing the PCR reaction solution as it is to the channel of the capillary plate, PCR
を試みると、PCRが進行しないことがある。 If you try to, there is that the PCR does not proceed. これは、 this is,
チャンネルの内壁にDNAポリメラーゼが吸着されて、 DNA polymerase in the inner wall of the channel is adsorbed,
PCRに悪影響を及ぼすためである。 This is because an adverse effect on the PCR. このようなタンパク質の吸着現象は、他の反応容器を使用しても起こり得るが、キャピラリープレートの場合、反応容器の全表面積が非常に大きくなるため、特に顕著である。 Adsorption of such proteins include, but may also occur using other reaction vessel, if the capillary plate, since the total surface area of ​​the reaction container is very large, it is particularly noticeable. そこで本発明の好適な1つの実施の形態では、たんぱく質吸着阻害作用を有する物質(タンパク質吸着阻害剤という)でキャピラリープレートをPCRに先立って処理し、前記吸着現象を防止する。 Therefore, in one preferred embodiment of the present invention, the capillary plate is treated prior to PCR of a material having a protein adsorption inhibitory effect (that protein adsorption inhibitor) prevents the adsorption phenomenon. タンパク質吸着阻害剤による前処理工程は、前記第2の工程の前に実施される。 Pretreatment step by protein adsorption inhibitor is carried out prior to the second step. 別法では、タンパク質吸着阻害剤を前記PCR溶液に混入してPCRを行ってもよい。 Alternatively, PCR may be performed to protein adsorption inhibitor mixed into the PCR solution. この場合、タンパク質吸着阻害剤は、DNAポリメラーゼ濃度に対して、過剰であることが好ましい。 In this case, protein adsorption inhibitor, it is preferred for the DNA polymerase concentration is excessive. タンパク質吸着阻害剤の一例として、ウシ血清アルブミンが例示される。 An example of a protein adsorption inhibitor, bovine serum albumin and the like. その適当な濃度は、約0.01〜約0.1%である。 Its suitable concentration is from about 0.01 to about 0.1%.

【0026】本発明の定量方法に含まれる第5の工程は、両面が密閉されたキャピラリープレートを蛍光測定に供し、蛍光を発する蛍光性チャンネルの数を計数することからなる。 The fifth step included in the quantification method of the present invention, provided the capillary plate having both surfaces sealed to fluorescence measurement consists of counting the number of fluorescent channels fluoresce. ここで、前記蛍光性チャンネルは前記P Here, the fluorescent channels the P
CRによって増幅された被検体核酸に由来する標的DN Target DN derived from the subject the nucleic acid amplified by CR
Aを含むチャンネルである。 Is a channel that contains the A. 具体的には、前記第4の工程の後、チェンバー5からキャピラリープレート1を取り出し、カバーガラス4を取り付けたまま、蛍光顕微鏡下、キャピラリープレートの表面を観察する。 Specifically, after the fourth step, removed capillary plate 1 from chamber 5, without removing the cover glass 4, observed under a fluorescent microscope, the surface of the capillary plate. 本発明に使用される蛍光顕微鏡は、励起光源、励起光波長選択フイルター(Hoechst33258の場合は、紫外線透過フイルター)、蛍光波長選択フイルター等を備えた市販の製品でよい。 Fluorescence microscope for use in the present invention, the excitation light source, (in the case of Hoechst33258, ultraviolet transmission filter) excitation light wavelength selective filters may be a commercially available product with fluorescence wavelength selection filter or the like. さらに、キャピラリープレートの表面の蛍光像を高感度カメラ(II-CCDカメラ)で撮像し、得られた画像を画像処理システムで解析する。 Furthermore, the fluorescence image of the surface of the capillary plate captured by a high sensitivity camera (II-CCD camera), analyzes the image obtained by the image processing system. このようにして、蛍光試薬からの蛍光信号をキャピラリープレートの各チャンネル毎に計測することが可能である。 In this way, it is possible to measure the fluorescence signal from the fluorescent reagent for each channel of the capillary plate.
画像処理に際して、適当な閾値を設定し、それ以下のバックグランド蛍光信号をフィルターで除去する。 In image processing, to set an appropriate threshold to filter out the less background fluorescence signal. すると蛍光信号の変化した(すなわち、蛍光を発する蛍光性チャンネル)チャンネルのみが特定される。 Then the change in fluorescence signal (i.e., fluorescent channels fluoresce) only channel is identified. このような蛍光性チャンネルの数を計数するには、画像処理された蛍光画像上で輝度の高いチャンネル数を目視により計数する。 Such counting the number of fluorescent channel counts visually high number of channels of luminance on the image processed fluorescence image. 或いは、画像処理システム内で蛍光信号に基づき、 Alternatively, based on the fluorescence signal in the image processing system,
マイクロコンピューターに処理させ、自動的に計数するようにしてもよい。 Is processed to a microcomputer, it may be automatically counted. いずれにしろ、これら一連の蛍光信号のプロセシングは、公知技術の組み合わせによって、 In any case, the processing of the series of fluorescent signals, by a combination of known techniques,
実行され得る。 It may be performed.

【0027】前記蛍光性チャンネルは、PCRによって増幅された標的DNAを含む。 [0027] The fluorescent channel comprises a target DNA amplified by PCR. これは、該チャンネル内に前記第3の工程で封入されたPCR溶液が、被検体核酸に由来する標的DNA分子を含むからである。 This, PCR solution encapsulated in the third step in the channel, because containing the target DNA molecules derived from the subject nucleic acid. その標的DNA分子が前記第4の工程で増幅され、増幅されたDNAが蛍光試薬により蛍光を発するのでチャンネルの蛍光信号がPCR前と比べると変化する。 Its target DNA molecule is amplified by the fourth step, the amplified DNA so fluoresce fluorescence signal of the channel is changed as compared with the previous PCR by fluorescence reagent. 一方、チャンネル内のPCR溶液が標的DNA分子を含まないとき、 Meanwhile, when the PCR solution in the channel does not contain the target DNA molecule,
PCRによって増幅DNAは生じない。 Amplified DNA is not produced by PCR. チャンネルの蛍光信号は、PCR前と変化はなく、これは、後述の実施例における実験からも確かめられた。 The fluorescence signal of the channel, change before and after PCR is not, this was also confirmed by experiments in the Examples below. 従って、蛍光性チャンネルを特定し、キャピラリープレート上でその総数を計数することによって、標的DNA分子がPCR以前に存在したチャンネル数を決定できる。 Thus, to identify the fluorescent channels, by counting the total number on the capillary plate, you can determine the number of channels that the target DNA molecules are previously existed PCR.

【0028】キャピラリプレートを構成するチャンネルの総数に対して、PCR前の標的DNA分子の数が充分に少ない条件下において、標的DNAを含むチャンネルでは、ほとんどのチャンネル内の標的DNA分子の数は1分子であると、ポアソン分布から仮定することができる。 [0028] the total number of channels constituting the capillary plate, the number is sufficiently small under the conditions of a target DNA molecule before PCR, the channel containing the target DNA, the number of target DNA molecules in most of the channel 1 If it is the molecule, it can be assumed from the Poisson distribution. 従って、このような標的DNAの濃度が充分に低い場合、蛍光性チャンネルの数が標的DNAの分子の数に相当することになる。 Therefore, the concentration of such target DNA when sufficiently low, the number of fluorescent channels corresponds to the number of molecules of target DNA.

【0029】この仮定も、後述の実施例における実験において、実測値がポアソン分布からの期待値にほぼ一致することから支持される。 [0029] The assumptions, the experiments in the Examples below, the measured value is supported by the fact that substantially coincides with the expected value of the Poisson distribution. 以上のように、本発明の定量方法に従えば、蛍光性チャンネルの総数を計数することによって、PCR溶液中の標的DNAの分子数を計数し、さらには試料中の被検体核酸の分子数を決定することが可能になる。 As described above, according to the quantification method of the present invention, by counting the total number of fluorescent channels, counts the number of molecules of target DNA PCR solution, further the number of molecules of analyte nucleic acid in a sample it is possible to be determined. 所望ならば、このようにして決定された分子数とチャンネルの容積に基づいて標的DNA(従って、被検体核酸)の濃度を求めることもできる。 If desired, this way the target DNA (thus, subject nucleic acid) based on the number of molecules and a channel volume that is determined can be determined the concentration of.

【0030】以上詳述してきた本発明の定量方法を上記第1ないし第4の工程に相当する段階毎に、模式的に説明したものが第3図である。 [0030] The quantification method of the present invention have been described above in detail for each step corresponding to the first to fourth steps, those described schematically is the third diagram. 本発明の定量方法に従う、 According to the measuring method of the present invention,
一連の手順は、上記の説明とこの図を参照して、当業者に容易に理解されうる。 A series of steps, with reference to FIG what is described above, can be readily understood by those skilled in the art.

【0031】以下、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって制限されるものではない。 [0031] Hereinafter, the present invention will be described by way of examples more specifically, the present invention is not intended to be limited by these examples.

【0032】 [0032]

【実施例】(実施例1)下記の組成を有するPCR溶液を調製した。 Example were prepared PCR solution having a (Example 1) of the following composition. 本例で使用した標的DNA(鋳型DNAに対応)、5'プライマー、および3'プライマーは、それぞれ次の塩基配列を有する。 Target DNA used in this example (corresponding to the template DNA), 5 'primer, and 3' primers, respectively have the following base sequence. これらDNAは、受託D These DNA is entrusted D
NA合成業者(ベックス株式会社)より入手した。 It was obtained from NA synthesis of skill in the art (Beck Co., Ltd.). 標的DNA: 5'-ATGGAAACCTGTTTGTTGGATATAAATACGTCGT Target DNA: 5'-ATGGAAACCTGTTTGTTGGATATAAATACGTCGT
AGATGGGCACAGTGTG-3'(配列表の配列番号1に記載) 5'プライマー: 5'-CACACTGTGCCCATCTACGA-3'(配列表の配列番号2に記載) 3'プライマー: 5'-ATGGAAACCTGTTTGTTGGA-3'(配列表の配列番号3に記載) PCR溶液 標的DNA 100aM 5'プライマー 1μM 3'プライマー 1μM Mg 2 Cl 6mM BSA 0.1% 各dNTP 0.5mM Hoechst 33258 1μM Taq 抗体 0.056μM Taq DNA ポリメラーゼ 0.02 unit/μl Taq DNA ポリメラーゼ用緩衝液10倍溶液 25μl 蒸留水 残部 全液量 250μl 直径0.05mm、深さ1mmのチャンネル(約10万個、容積約2nl)を備える外径25mmのキャピラリープレートを用いて、上記PCR溶液を毛細管現象により各チャンネルに分注した。 AGATGGGCACAGTGTG-3 '(SEQ ID NO: 1 in the Sequence Listing) 5' primer: 5'-CACACTGTGCCCATCTACGA-3 '(SEQ ID NO: 2 in Sequence Listing) 3' primer: 5'-ATGGAAACCTGTTTGTTGGA-3 '(sequence listing SEQ forth in ID NO: 3) PCR solution target DNA 100 Am 5 'primer 1 [mu] M 3' primer 1μM Mg 2 Cl 6mM BSA 0.1% each dNTP 0.5mM Hoechst 33258 1μM Taq antibody 0.056μM Taq DNA polymerase 0.02 Unit / [mu] l Taq DNA polymerase buffer 10-fold solution 25μl distilled water balance Zen'ekiryou 250μl diameter 0.05 mm, the channel (about 100,000, volume of about 2nl) of 1mm deep by using a capillary plate of the outer diameter 25mm comprising, the the PCR solution was dispensed each channel by capillary action. キャピラリープレートの両面を透明なシリコンゴム板で密封し、さらに外側をカバーガラスで覆った[図2(a)]。 Both sides of the capillary plate was sealed with clear silicone rubber plate, further covered with a cover glass outer FIG 2 (a)]. このキャピラリープレートをチェンバー内に収納し、チェンバーをサーマルサイクラー(パーキンエルマー社、DNA Thermal Cycler The capillary plate was housed in a chamber, the chamber thermal cycler (Perkin Elmer, DNA Thermal Cycler
488)のアルミブロック上に載置した[図2(b)]。 It was placed on an aluminum block 488) FIG 2 (b)].

【0033】サーマルサイクラーでの各サイクルの温度、反応時間およびサイクル数を次のように設定し、P The temperature of each cycle in a thermal cycler, the reaction time and the number of cycles was set as follows, P
CRを実施した。 It was performed CR. すなわち、95℃3分間の前処理を1 That is, 1 pretreatment 95 ° C. 3 min
回行い、次に95℃で2分、次に45℃で2分間反応させることとし、これを40サイクル繰り返した。 Times performed, then 2 minutes at 95 ° C., then the reacted 2 minutes at 45 ° C., was repeated 40 cycles. さらに、68℃で5分間、保持し、室温まで放置しPCRを終了した。 Furthermore, 5 minutes at 68 ° C., and held to complete the PCR was allowed to room temperature.

【0034】PCR終了後、チェンバーからキャピラリープレートを取り出し、シリコンゴム板およびカバーガラスを取り付けたまま、倒立蛍光顕微鏡下(オリンパス製IX70、対物レンズ:10倍)、その表面を観察した。 [0034] After completion of the PCR, removed capillary plate from chamber, without removing the silicone rubber plate and a cover glass, under an inverted fluorescence microscope (Olympus IX70, objective lens: 10 magnifications), for observation of surface. 表面の蛍光像を高感度カメラ、II−CCDカメラ(浜松ホトニクス製 ARGUS500)で撮像し、得られた蛍光画像を画像処理システムで記録した。 The fluorescence images of the surface captured by sensitive camera, II-CCD camera (Hamamatsu ARGUS500), fluorescence images obtained were recorded by the image processing system. この画像を図4 Figure The image 4
(a)に示す。 It is shown in (a).

【0035】また、標的DNAを含ませず、それ以外は上記のPCR溶液と全く同一の組成で、新たなPCR溶液を調製し、対照試験を行った。 Further, not contain target DNA, otherwise exactly the same composition as the above PCR solution was prepared fresh PCR solution was subjected to controlled trials. 得られた画像を図4 FIG resulting image 4
(b)に示す。 It is shown in (b).

【0036】図4(a)の蛍光画像と図4(b)の蛍光画像とを比較すると、前者の画像は、明らかに輝度の高い(蛍光性)チャンネルを数十含み、これらのチャンネルが輝度の低いチャンネルの間に散在する様子を示している。 [0036] Comparing the fluorescence image of the fluorescence image and diagram of FIG. 4 (a) 4 (b), the former image is obviously includes dozens of high (fluorescence) channels brightness, these channels luminance It shows a state in which interspersed between the low channel of. 一方、後者の画像は、すべてのチャンネルにわたって、暗く、輝度の高いチャンネルは、1つも存在しないことを示している。 On the other hand, the latter image, across all channels, dark, high channel luminance indicates that even one absent. 蛍光性チャンネルは、その中で標的DNA分子が増幅されたために輝度が増したものであり、該チャンネルにPCR以前に標的DNA分子が存在していたことが分かる。 Fluorescent channel, which has increased brightness to the target DNA molecule is amplified therein, it can be seen that the target DNA molecules in PCR previously the channel was present. 上記PCR条件で採用された4 4 adopted in the above PCR conditions
0サイクルというサイクル数でも、DNA増幅が充分に起こり、検出可能であった。 Even the number of cycles of 0 cycles, occur sufficiently is DNA amplification was detectable. また、前記対照試験の結果から、このPCR条件では、非特異的DNA増幅が全く起こらないことが明らかとなった。 From the results of the control test, in this PCR conditions, it revealed that non-specific DNA amplification does not occur at all.

【0037】(実施例2)実施例1で使用したPCR溶液において、標的DNAの濃度(100aM)を種々変化させて、それ以外の組成は同一のPCR溶液を調製した。 [0037] In PCR solution used in (Example 2) Example 1, concentration of the target DNA to (100 Am) while varying the composition of the rest was prepared by the same PCR solution. これらのPCR溶液を実施例1と同様に、PCRに供し、それぞれの濃度について、蛍光画像を求め、蛍光性チャンネルを計数した。 Like these PCR solution as in Example 1 was subjected to PCR, for each concentration, we obtain a fluorescent image were counted fluorescence channel. キャピラリープレートの総チャンネル数に対する得られた蛍光性チャンネル数の割合を求め、各標的DNAの濃度に対してプロットしたのが図5である。 Obtains the ratio of the fluorescent number of channels obtained for the total number of channels of the capillary plate, it is 5 were plotted against the concentration of each target DNA. 図5中、曲線は、このようにして得られた実測値の割合(蛍光チャンネル数:総チャンネル数) In FIG. 5, the curve, the ratio of the measured values ​​obtained in this way (the number of fluorescence channels: the total number of channels)
をプロットしたものであり、曲線は、ポアソン分布からの期待値のプロットである。 Is a plot of the, the curve is a plot of the expected value from the Poisson distribution. まず、曲線は標的DN First, the curve target DN
Aの濃度に比例して、蛍光性チャンネルの数が増加することを示している。 In proportion to the concentration of A, it shows that the number of fluorescent channel is increased. また、両曲線の近似は、本例で使用したPCR溶液がポアソン分布に従うことを示唆している。 Further, the approximation of both curves, PCR solution used in this example suggest that follows a Poisson distribution. すなわち、標的DNAの濃度が低い領域では(例えば、前記期待値が0.1以下)、蛍光性チャンネルのほとんどで、標的DNAが1分子のみ存在することになる。 In other words, at low concentrations of target DNA regions (e.g., the expected value of 0.1 or less), in most fluorescent channel, the target DNA will be present only one molecule. その1分子がPCRによって増幅され、それが含まれるチャンネルが蛍光を発する。 One molecule is amplified by PCR, channel fluoresce in which it is contained. これらの事実と、実施例1の結果と合わせて、蛍光性チャンネルの数からPC And these facts, together with the results of Example 1, PC from the number of fluorescent channel
R溶液中の標的DNAの分子数が正確に推定できることが分かる。 Number of molecules of target DNA R solution is found to be able to accurately estimate. なお、図5に示したデータの基になる一部の蛍光画像は、図6に直接示される。 A part of the fluorescent image on which to base the data shown in FIG. 5 is shown directly in FIG. 図中、標的DNAの濃度が100、10、1aMのときの蛍光画像がそれぞれ(a)(b)(c)であり、左側と右側は、別個の溶液を希釈した系に属するものである。 In the figure, a each concentration of the target DNA the fluorescence image when the 100,10,1aM (a) (b) (c), the left and right are those belonging to the system diluted the separate solutions. 左右の蛍光画像からの計数結果がほぼ一致することから、本発明の定量方法での計数は、再現性があることが分かる。 Since the counting result from the right and left of the fluorescent image substantially coincide, counting a quantitative method of the present invention, seen to be reproducible.

【0038】 [0038]

【発明の効果】本発明の定量方法は、通常のPCR条件として、許容されるサイクル数でも増幅されたDNAが充分に蛍光検出できるので、デジタルPCR法と比較して、非特異的DNA増幅による計数精度の低下が改善され、信頼性のある定量結果が得られる。 Determination method of the present invention exhibits, as a normal PCR conditions, the DNA amplified in the number of cycles permitted can be sufficiently fluorescence detection, as compared to the digital PCR method, due to nonspecific DNA amplification improved reduction in the counting accuracy, reliable quantitative results.

【0039】また、本発明の定量方法は、同様の理由から、非特異的DNA増幅を抑制するための特別な手法または試薬を必要とせず、簡便な定量方法である。 Further, quantification method of the present invention, for the same reason, does not require special techniques or reagents for suppressing non-specific DNA amplification is a simple quantification method.

【0040】さらに、本発明の定量方法では、キャピラリープレートの使用によって、デジタルPCR法で採用するタイタープレートのウエルに対応するチャンネルの数が飛躍的に増大する。 [0040] Further, in the determination method of the present invention, the use of capillary plate, the number of channels increases dramatically corresponding to the wells of a titer plate employed in digital PCR method. 典型的には、タイタープレートの数百に対して、数万以上に上り、解析できるDNA濃度範囲(すなわち、定量可能な被検体核酸の分子数)が100倍以上に向上する。 Typically, for hundreds of titer plate, up tens of thousands or more, the analysis can be DNA concentration range (i.e., the number of molecules of quantifiable analyte nucleic acid) is improved to more than 100 times. しかも、この範囲は、使用するキャピラリーのサイズを小さくするか、またはキャピラリープレートの総面積を拡大する、或いはそれらの両方でさらに広げ得る。 Moreover, this range, reduce the size of the capillary used, or to enlarge the total area of ​​the capillary plate, or may further spread in both of them. これは被検体核酸を含む試料を、 Samples which comprise the analyte nucleic acid,
様々な濃度に希釈して定量を繰り返すことなく、単一の測定で定量が可能であることを意味する。 Without repeating quantitated were diluted to various concentrations, which means that it is possible to quantify a single measurement.

【0041】本発明の定量方法は、デジタルPCR法より、計数精度および操作の簡便性が優れており、試料(特に、生体試料)中の極微量の遺伝子その他核酸を検出し、その分子数を計数して、定量するのに非常に有用である。 The quantification method of the present invention, from the digital PCR method, has excellent ease of counting precision and operation, the sample (particularly, a biological sample) to detect trace amounts of genes other nucleic acids in, the number of molecules I counted to be very useful for quantification. 例えば、本発明の定量方法を用いて、特定の遺伝子の発現分子数を計数することにより、細胞が正常か或いは異常か識別可能となる。 For example, using a quantitative method of the present invention, by counting the number of expression molecules of a particular gene, the cells will be identified or successfully or abnormal.

【0042】 [0042]

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Hamamatsu Photonics KK <120> Method for quantifying nucleic acid analyte and method for counting the molecular number of nucleic acid analyte <130> P99HP-257 <140> <141> <160> 3 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR template <400> 1 atggaaacct gtttgttgga tataaatacg tcgtagatgg gcacagtgtg 50 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 2 cacactgtgc ccatctacga 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 3 atggaaacct gtttgttgga 20 gga [Sequence Listing] SEQUENCE LISTING <110> Hamamatsu Photonics KK <120> Method for quantifying nucleic acid analyte and method for counting the molecular number of nucleic acid analyte <130> P99HP-257 <140> <141> <160> 3 <170 > PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR template <400> 1 atggaaacct gtttgttgga tataaatacg tcgtagatgg gcacagtgtg 50 <210> 2 <211> 20 <212 > DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 2 cacactgtgc ccatctacga 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 3 atggaaacct gtttgttgga 20 gga

【図面の簡単な説明】 BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS

【図1】(a)は、本発明に係るキャピラリープレートの部分切除斜視図である。 1 (a) is a partial cut perspective view of a capillary plate of the present invention. (b)は、本発明に係るキャピラリープレートの模式的断面図である。 (B) is a schematic sectional view of a capillary plate of the present invention.

【図2】(a)は、本発明に係るキャピラリープレートがPCR用のチェンバーに収容された様子を模式的に示す断面図である。 2 (a) is a cross-sectional view of a state where a capillary plate of the present invention is accommodated in the chamber for PCR are shown schematically. (b)は、(a)に示したチェンバーがサーマルサイクラー上に載置され、PCRが実施される様子を模式的に示す断面図である。 (B) the chamber shown in (a) is placed on a thermal cycler, a cross-sectional view of the manner in which PCR is carried illustrated schematically.

【図3】図3は、本発明の定量方法を、段階毎に説明するための模式図である。 Figure 3 is a quantification method of the present invention, is a schematic diagram for explaining each step. 図中、(a)は、PCR溶液が本発明に係るキャピラリープレートのチャンネルに分注されつつある段階を示し、(b)は、PCR溶液をチャンネルに封入する段階を示し、(c)は、PCRによって、いくつかのチャンネルで標的DNAの増幅が起こっている段階を示し、(d)は、キャピラリープレートのチャンネルからの蛍光を観察する段階を示す。 In the figure, (a) represents, PCR solution indicates the step which is being dispensed into a channel of capillary plate according to the present invention, (b) shows a step of encapsulating the PCR solution to the channel, (c), the by PCR, show several stages of amplification of the target DNA in the channel is happening, shows a step of observing the fluorescence from (d) is a capillary plate channel.

【図4】図4は、実施例1で得られた、キャピラリープレートの蛍光画像(写真)である。 Figure 4 is obtained in Example 1 is a fluorescence image of the capillary plate (photograph). 図中、(a)は、標的DNAを含むPCR溶液のPCRから得られた蛍光画像であり、(b)は、標的DNAを含まないPCR溶液のPCRから得られた蛍光画像である。 In the figure, (a) is a fluorescence image obtained from PCR of the PCR solution containing the target DNA, (b) is a fluorescence image obtained from PCR of PCR solution containing no target DNA.

【図5】図5は、実施例2の試験結果を示し、標的DN Figure 5 shows the test results of Example 2, the target DN
Aの濃度に対して、蛍光性チャンネル数の総チャンネル数に対する割合をプロットしたグラフである。 Against the concentration of A, it is a graph plotting percentage of the total number of channels of the fluorescence number of channels. 図中、 In the figure,
は実測値のプロットであり、はポアソン分布からの期待値のプロットである。 Is a plot of the measured value, is a plot of the expected value of the Poisson distribution.

【図6】図6は、実施例2で得られた、キャピラリープレートの蛍光画像(写真)である。 Figure 6 is obtained in Example 2, a fluorescent image of the capillary plate (photograph). 図中、(a)は、濃度100aMの標的DNAを含むPCR溶液のPCRから得られた蛍光画像であり、(b)は、濃度10aMの標的DNAを含むPCR溶液のPCRから得られた蛍光画像であり、(c)は、濃度1aMの標的DNAを含むPCR溶液のPCRから得られた蛍光画像である。 In the figure, (a) is a fluorescence image obtained from PCR of PCR solution containing the target DNA concentration 100 Am, (b) is a fluorescent image obtained from the PCR of the PCR solution containing the target DNA concentration 10aM in and, (c) is a fluorescence image obtained from PCR of PCR solution containing the target DNA concentration 1 aM.

【符号の説明】 DESCRIPTION OF SYMBOLS

1・・・キャピラリープレート、2・・・チャンネル、3・・・ 1 ... capillary plate, 2 ... channel, 3 ...
シリコンゴム板、4・・・カバーグラス、5・・・チェンバー、6・・・固定ネジ、7・・・サーマルサイクラーのアルミブロック、8・・・標的DNA分子、9・・・増幅されたDN Silicone rubber plate, 4 ... cover glass, 5 ... chamber, 6 ... fixing screw, 7 ... thermal cycler aluminum block, 8 ... the target DNA molecule, 9 ... amplified DN
A分子、10・・・蛍光性チャンネル A molecule, 10 ... fluorescent channel

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Claims (7)

    【特許請求の範囲】 [The claims]
  1. 【請求項1】 被検体核酸の定量方法であって、試料からの被検体核酸に由来する標的DNA、および蛍光試薬を含むPCR溶液を調製する第1の工程と、所定の数のチャンネルを備えたキャピラリープレートに前記PCR 1. A method of quantifying analyte nucleic acid, comprising a target DNA derived from the subject the nucleic acid from the sample, and a first step of preparing a PCR solution containing the fluorescent reagent, a channel of a predetermined number of the PCR in capillary plate
    溶液を載せる第2の工程と、前記キャピラリープレートの両面を弾力性のある透明な板で密閉し、前記PCR溶液を前記各チャンネルに封入する第3の工程と、前記両面が密閉されたキャピラリープレートを予め設定した温度サイクルに曝し、前記被検体核酸に由来する標的DN A second step of placing a solution, both sides of the capillary plate was sealed with transparent plate a resilient, a third step of sealing the PCR solution to each channel, capillary plate wherein both sides is sealed exposed to preset temperature cycles, from the the subject nucleic acid target DN
    AのPCRを行わせる第4の工程と、前記両面が密閉されたキャピラリープレートを蛍光測定に供し、蛍光を発する蛍光性チャンネルの数を計数し、ここで前記蛍光性チャンネルは前記PCRによって増幅された被検体核酸に由来する標的DNAを含むチャンネルである第5の工程と、を含むことを特徴とする被検体核酸の定量方法。 A fourth step of causing the PCR of A, provided the capillary plate, wherein both sides is sealed in fluorescence measurements, counts the number of fluorescent channels fluorescing the fluorescent channel is amplified by the PCR here Determination method of the subject nucleic acid comprising a fifth step of a channel containing the target DNA from the subject nucleic acids, was.
  2. 【請求項2】 前記第5の工程に続いて、前記計数された蛍光性チャンネルの数に基づいて被検体核酸の濃度を求める工程を含むことを特徴とする、請求項1に記載の被検体核酸の定量方法。 2. Following the fifth step, characterized in that it comprises a step of determining the concentration of analyte nucleic acid based on the number of the counted fluorescent channels, subject of claim 1 quantitative methods of nucleic acid.
  3. 【請求項3】 前記キャピラリープレートをタンパク質の吸着阻害剤で前処理する工程をさらに含むことを特徴とする、請求項1に記載の被検体核酸の定量方法。 Wherein characterized in that it further comprises a step of pretreating said capillary plates adsorption inhibitor of protein quantification method of the subject nucleic acid of claim 1.
  4. 【請求項4】 前記蛍光試薬がマイナーグローブ結合型の蛍光色素からなることを特徴とする、請求項1に記載の被検体核酸の定量方法。 Wherein said fluorescent reagent is characterized in that it consists of a minor groove binding type of the fluorescent dye method of quantifying analyte nucleic acid according to claim 1.
  5. 【請求項5】 前記蛍光試薬が蛍光エネルギー移動を利用した蛍光プローブオリゴヌクレオチドからなることを特徴とする、請求項1に記載の被検体核酸の定量方法。 Wherein said fluorescent reagent is characterized in that it consists of a fluorescent probe oligonucleotide using fluorescence energy transfer method of quantifying analyte nucleic acid according to claim 1.
  6. 【請求項6】 前記弾力性のある透明な板がシリコンゴム製であることを特徴とする、請求項1に記載の被検体核酸の定量方法。 6. characterized in that the resilient transparent plate is made of silicone rubber, quantification method of the subject nucleic acid of claim 1.
  7. 【請求項7】 被検体核酸の分子数の計数方法であって、試料からの被検体核酸に由来する標的DNA、および蛍光試薬を含むPCR溶液を調製する第1の工程と、 7. A counting method of the number of molecules of the subject nucleic acid, the first step of preparing a PCR solution containing the target DNA, and fluorescent reagent derived from the subject the nucleic acid from the sample,
    所定の数のチャンネルを備えたキャピラリープレートに前記PCR溶液を載せる第2の工程と、前記キャピラリープレートの両面を弾力性のある透明な板で密閉し、前記PCR溶液を前記各チャンネルに封入する第3の工程と、前記両面が密閉されたキャピラリープレートを予め設定した温度サイクルに曝し、前記被検体核酸に由来する標的DNAのPCRを行わせる第4の工程と、前記両面が密閉されたキャピラリープレートを蛍光測定に供し、蛍光を発する蛍光性チャンネルの数を計数し、ここで該蛍光性チャンネルは前記PCRによって増幅された被検体核酸に由来する標的DNAを含むチャンネルである第5の工程と、を含むことを特徴とする被検体核酸の分子数の計数方法。 A second step of placing the PCR solution capillary plate having a channel of a predetermined number, seals the both sides of the capillary plate with a transparent plate with a resilient, first sealing the PCR solution to each channel a third step, the exposed sided capillary plate which is sealed within preset temperature cycle, the fourth step of causing the PCR of the target DNA from the subject nucleic acid, capillary plate wherein both sides is sealed was subjected to fluorescence measurement, counting the number of fluorescent channels that fluoresces, and a fifth step which is where the channel fluorescent properties channel containing the target DNA from the subject nucleic acid amplified by the PCR, molecular number counting method of the subject nucleic acids, which comprises a.
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