JP2001069972A - 合成触媒オリゴヌクレオチド - Google Patents
合成触媒オリゴヌクレオチドInfo
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- C12N2310/30—Chemical structure
- C12N2310/33—Chemical structure of the base
Abstract
(57)【要約】
【課題】 核酸の目標配列を切断するのに適した合成触
媒オリゴヌクレオチド構造を提供すること。 【解決手段】 一般構造式（Ｉ）： 【化１】 で示されるヌクレオチドを有する合成触媒オリゴヌクレ
オチド構造であって、少なくとも１個のヌクレオチドに
おいて式（Ｉ）のＲ基が水素以外のものであり、Ｒが水
素である触媒活性中心が存在し、オリゴヌクレオチドの
触媒活性中心がハンマーヘッド又はヘアピン構造を示
し、かつオリゴヌクレオチド構造は、核酸目標配列との
ハイブリダイゼーションを担う領域を含むことを特徴と
する合成触媒オリゴヌクレオチド構造。
媒オリゴヌクレオチド構造を提供すること。 【解決手段】 一般構造式（Ｉ）： 【化１】 で示されるヌクレオチドを有する合成触媒オリゴヌクレ
オチド構造であって、少なくとも１個のヌクレオチドに
おいて式（Ｉ）のＲ基が水素以外のものであり、Ｒが水
素である触媒活性中心が存在し、オリゴヌクレオチドの
触媒活性中心がハンマーヘッド又はヘアピン構造を示
し、かつオリゴヌクレオチド構造は、核酸目標配列との
ハイブリダイゼーションを担う領域を含むことを特徴と
する合成触媒オリゴヌクレオチド構造。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、核酸の目標配列の切断
に適していて、修飾されたヌクレオチドを含む合成触媒
オリゴヌクレオチド構造に関する。また本発明は修飾さ
れた合成触媒オリゴヌクレオチド構造を使用して核酸の
目標配列を切断する方法に関する。
に適していて、修飾されたヌクレオチドを含む合成触媒
オリゴヌクレオチド構造に関する。また本発明は修飾さ
れた合成触媒オリゴヌクレオチド構造を使用して核酸の
目標配列を切断する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】ＲＮＡによって媒介される触媒作用の発
見後に、特異的ＲＮＡ分子の不活性化の種々の実験が試
験管内及び生体内で行われた。ハンマーヘッド−リボザ
イムが、少なくとも試験管内では所与の特異的ＲＮＡを
認識し、切断することができる（Ｈａｓｅｌｏｆｆ 及
び Ｇｅｒｌａｙ，１９８８）多目的酵素の生成に役立
ちうる、という発見は、極めて有益であると判明した。
このようなリボザイムの多くの使用例は、所定の混合物
内で特異的ＲＮＡを有効に認識して切断するというリボ
ザイムの能力に基づいている。ＲＮＡ酵素の使用方法は
ＲＮＡ制限酵素の生成から細胞中の遺伝子の特異的不活
性化にまで及ぶ。特別な生物医学的関心は、多数の形の
腫瘍を含む多くの疾病が特異的遺伝子の発現に相関して
生じているという事実に基づいている。このような遺伝
子を所属するｍＲＮＡの切断によって不活性化すること
は、前記のような疾病の制御及び最終的治癒の可能な方
法となるであろう。さらに、抗ウイルス性薬剤の開発に
対する大きな要求もあるが、ＲＮＡ酵素がおそらくこの
ような薬剤になりうるであろう、それというのもウイル
ス性の発現はウイルスＲＮＡ分子の切断によって選択的
に阻止されうるからである。
見後に、特異的ＲＮＡ分子の不活性化の種々の実験が試
験管内及び生体内で行われた。ハンマーヘッド−リボザ
イムが、少なくとも試験管内では所与の特異的ＲＮＡを
認識し、切断することができる（Ｈａｓｅｌｏｆｆ 及
び Ｇｅｒｌａｙ，１９８８）多目的酵素の生成に役立
ちうる、という発見は、極めて有益であると判明した。
このようなリボザイムの多くの使用例は、所定の混合物
内で特異的ＲＮＡを有効に認識して切断するというリボ
ザイムの能力に基づいている。ＲＮＡ酵素の使用方法は
ＲＮＡ制限酵素の生成から細胞中の遺伝子の特異的不活
性化にまで及ぶ。特別な生物医学的関心は、多数の形の
腫瘍を含む多くの疾病が特異的遺伝子の発現に相関して
生じているという事実に基づいている。このような遺伝
子を所属するｍＲＮＡの切断によって不活性化すること
は、前記のような疾病の制御及び最終的治癒の可能な方
法となるであろう。さらに、抗ウイルス性薬剤の開発に
対する大きな要求もあるが、ＲＮＡ酵素がおそらくこの
ような薬剤になりうるであろう、それというのもウイル
ス性の発現はウイルスＲＮＡ分子の切断によって選択的
に阻止されうるからである。
【０００３】適当な遺伝子を細胞に移入することによっ
て細胞内でリボザイムを発現させるための従来の実験
は、あまり有効でないことが判明した、それというのも
特異的ＲＮＡを不活性化するためには、極めて高い発現
が必要であったからである。またＲＮＡ分子の直接投与
も、ＲＮａｓｅによる分解に対するＲＮＡの感受性及び
ＲＮＡ分子とタンパク質との相互作用のために、おそら
く不可能であろう。
て細胞内でリボザイムを発現させるための従来の実験
は、あまり有効でないことが判明した、それというのも
特異的ＲＮＡを不活性化するためには、極めて高い発現
が必要であったからである。またＲＮＡ分子の直接投与
も、ＲＮａｓｅによる分解に対するＲＮＡの感受性及び
ＲＮＡ分子とタンパク質との相互作用のために、おそら
く不可能であろう。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】従って、従来の技術の
欠点が少なくとも部分的に除去されているＲＮＡ酵素を
開発するという極めて大きな要求が生じた。
欠点が少なくとも部分的に除去されているＲＮＡ酵素を
開発するという極めて大きな要求が生じた。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明の基礎になってい
る課題は、ＲＮＡ分子の代りに２′−アルコキシ−置換
基を有する人工ヌクレオチドを基礎とする新規の型の核
酸を使用することによって解決される。このような分子
は自然のＲＮＡ分子よりも著しく安定である。それとい
うのも該分子はＲＮａｓｅによってもＤＮａｓｅによっ
ても切断されず、またＲＮＡ又はＤＮＡ結合タンパク質
との相互作用が少なくなるからである。該分子は細胞環
境において相応の自然ＲＮＡ分子よりも大きな効果を約
束する。しかしこのような修飾された核酸は通常は触媒
として作用しない。しかし意外にも、分子の特定位置で
極めて小数のヒドロキシル基を導入すると、該修飾核酸
の活性が保存されていることが確認された。しかもまた
意外にも特徴的な性質、特に安定性及びタンパク質との
減少された相互作用が保存されている。
る課題は、ＲＮＡ分子の代りに２′−アルコキシ−置換
基を有する人工ヌクレオチドを基礎とする新規の型の核
酸を使用することによって解決される。このような分子
は自然のＲＮＡ分子よりも著しく安定である。それとい
うのも該分子はＲＮａｓｅによってもＤＮａｓｅによっ
ても切断されず、またＲＮＡ又はＤＮＡ結合タンパク質
との相互作用が少なくなるからである。該分子は細胞環
境において相応の自然ＲＮＡ分子よりも大きな効果を約
束する。しかしこのような修飾された核酸は通常は触媒
として作用しない。しかし意外にも、分子の特定位置で
極めて小数のヒドロキシル基を導入すると、該修飾核酸
の活性が保存されていることが確認された。しかもまた
意外にも特徴的な性質、特に安定性及びタンパク質との
減少された相互作用が保存されている。
【０００６】従って本発明の対象は、核酸の目標配列を
切断するために適していて、次の一般構造式（Ｉ）：
切断するために適していて、次の一般構造式（Ｉ）：
【０００７】
【化２】
【０００８】［式中Ｂは、特に、アデニン−９−イル
（Ａ）、シトシン−１−イル（Ｃ）、グアニン−９−イ
ル（Ｇ）、ウラシル−１−イル（Ｕ）、ウラシル−５−
イル（ψ）、ヒポキサンチン−９−イル（Ｉ）、チミン
−１−イル（Ｔ）及び２−アミノアデニン−９−イルか
ら成る群から選択されたヌクレオシド塩基を表わし、Ｖ
は各ヌクレオチドの場合独立的にＯ原子又はＣＨ2基で
あり、Ｘ及びＷはそれぞれヌクレオチドにおいて同じか
又は異なっていてもよく、相互に独立的にＯ，Ｓ，ＮＨ
2基、炭素原子１〜１０個、好ましくは１〜４個のアル
キル基又はアルコキシ基であり、Ｒは水素又は炭素原子
１〜１０個を有し、場合によりハロゲン、シアノ基、イ
ソシアノ基、アミノ基、カルボキシル基、ヒドロキシル
基又は／及びメルカプト基で置換された直鎖又は枝分れ
アルキル基、アルケニル基又はアルキニル基である］で
示されるヌクレオチドを有する合成触媒オリゴヌクレオ
チド構造であって、その特徴とするところは、少なくと
も１個のヌクレオチドで式（Ｉ）のＲ基が水素以外のも
のであることである。
（Ａ）、シトシン−１−イル（Ｃ）、グアニン−９−イ
ル（Ｇ）、ウラシル−１−イル（Ｕ）、ウラシル−５−
イル（ψ）、ヒポキサンチン−９−イル（Ｉ）、チミン
−１−イル（Ｔ）及び２−アミノアデニン−９−イルか
ら成る群から選択されたヌクレオシド塩基を表わし、Ｖ
は各ヌクレオチドの場合独立的にＯ原子又はＣＨ2基で
あり、Ｘ及びＷはそれぞれヌクレオチドにおいて同じか
又は異なっていてもよく、相互に独立的にＯ，Ｓ，ＮＨ
2基、炭素原子１〜１０個、好ましくは１〜４個のアル
キル基又はアルコキシ基であり、Ｒは水素又は炭素原子
１〜１０個を有し、場合によりハロゲン、シアノ基、イ
ソシアノ基、アミノ基、カルボキシル基、ヒドロキシル
基又は／及びメルカプト基で置換された直鎖又は枝分れ
アルキル基、アルケニル基又はアルキニル基である］で
示されるヌクレオチドを有する合成触媒オリゴヌクレオ
チド構造であって、その特徴とするところは、少なくと
も１個のヌクレオチドで式（Ｉ）のＲ基が水素以外のも
のであることである。
【０００９】Ｂは任意のプリン−又はピリミジンヌクレ
オシド塩基であってよい。適当なプリンヌクレオシド塩
基の例は、例えばアデニン−９−イル、グアニン−９−
イル、ピポキサンチン−９−イル及び２−アミノアデニ
ン−９−イルである。ピリミジンヌクレオシド塩基の例
は例えばシトシン−１−イル、ウラシル−１−イル、ウ
ラシル−５−イル及びチミン−１−イルである。
オシド塩基であってよい。適当なプリンヌクレオシド塩
基の例は、例えばアデニン−９−イル、グアニン−９−
イル、ピポキサンチン−９−イル及び２−アミノアデニ
ン−９−イルである。ピリミジンヌクレオシド塩基の例
は例えばシトシン−１−イル、ウラシル−１−イル、ウ
ラシル−５−イル及びチミン−１−イルである。
【００１０】Ｖは各ヌクレオチドにおいて独立的にＯ又
はＣＨ2基であり、好ましくはＯである。Ｘ及びＷは一
つのヌクレオチドにおいて同じか又は異なっていて、相
互に独立的にＯ，Ｓ，ＮＨ2基、炭素原子１〜１０個、
好ましくは１〜４個を有するアルキル基又はアルコキシ
基を表わすことができる。Ｘ及びＷは特に好ましくはそ
れぞれＯである（この場合には１個のＯ原子は二重結合
を介して燐に結合されており、他のＯ原子は単結合を介
して結合されていて、負電荷を有するであろう）。
はＣＨ2基であり、好ましくはＯである。Ｘ及びＷは一
つのヌクレオチドにおいて同じか又は異なっていて、相
互に独立的にＯ，Ｓ，ＮＨ2基、炭素原子１〜１０個、
好ましくは１〜４個を有するアルキル基又はアルコキシ
基を表わすことができる。Ｘ及びＷは特に好ましくはそ
れぞれＯである（この場合には１個のＯ原子は二重結合
を介して燐に結合されており、他のＯ原子は単結合を介
して結合されていて、負電荷を有するであろう）。
【００１１】Ｒは水素又は炭素原子１〜１０個を有し、
場合によりハロゲン（弗素、塩素、臭素、沃素）、シア
ノ基、イソシアノ基、ニトロ基、アミノ基、カルボキシ
ル基、ヒドロキシル基又は／及びメルカプト基によって
置換された直鎖又は枝分れアルキル基、アルケニル基又
はアルキニル基である。水素以外のＲ基は、好ましくは
１〜６個の炭素原子を有する。好ましいＲ基の例は、メ
チル基、エチル基、プロピル基、アリル基、ジメチルア
リル基、ブチル基又はシアノメチル基である。特に好ま
しくはＲは炭素原子１〜４個を有するアルケニル基、例
えばアリル基である。
場合によりハロゲン（弗素、塩素、臭素、沃素）、シア
ノ基、イソシアノ基、ニトロ基、アミノ基、カルボキシ
ル基、ヒドロキシル基又は／及びメルカプト基によって
置換された直鎖又は枝分れアルキル基、アルケニル基又
はアルキニル基である。水素以外のＲ基は、好ましくは
１〜６個の炭素原子を有する。好ましいＲ基の例は、メ
チル基、エチル基、プロピル基、アリル基、ジメチルア
リル基、ブチル基又はシアノメチル基である。特に好ま
しくはＲは炭素原子１〜４個を有するアルケニル基、例
えばアリル基である。
【００１２】本発明による触媒オリゴヌクレオチド構造
物は、少なくとも１個のヌクレオチドで式（Ｉ）のＲ基
が水素とは別のものであることを特徴としている。この
場合、オリゴヌクレオチド構造物が、Ｒが水素を表わす
ヌクレオチドをできるだけ少数含む場合が有利である。
このようなオリゴヌクレオチドはヌクレアーゼに対する
高い抵抗性を有していて、核酸が結合するタンパク質と
の小さい相互作用を示す。また、すべてのヌクレオチド
においてＲ基は水素以外のものであってはならない、そ
れというのもさもなければオリゴヌクレオチドはもはや
触媒活性を有しないからである。特に本発明によるオリ
ゴヌクレオチドの触媒活性中心内には、Ｒ基が水素原子
である個々のヌクレオチドが存在している。本発明によ
るオリゴヌクレオチド構造の触媒活性中心は好ましくは
ハンマーヘッド又はヘアピン構造を有する。
物は、少なくとも１個のヌクレオチドで式（Ｉ）のＲ基
が水素とは別のものであることを特徴としている。この
場合、オリゴヌクレオチド構造物が、Ｒが水素を表わす
ヌクレオチドをできるだけ少数含む場合が有利である。
このようなオリゴヌクレオチドはヌクレアーゼに対する
高い抵抗性を有していて、核酸が結合するタンパク質と
の小さい相互作用を示す。また、すべてのヌクレオチド
においてＲ基は水素以外のものであってはならない、そ
れというのもさもなければオリゴヌクレオチドはもはや
触媒活性を有しないからである。特に本発明によるオリ
ゴヌクレオチドの触媒活性中心内には、Ｒ基が水素原子
である個々のヌクレオチドが存在している。本発明によ
るオリゴヌクレオチド構造の触媒活性中心は好ましくは
ハンマーヘッド又はヘアピン構造を有する。
【００１３】触媒ヘアピン構造は、例えばトリツ（Ｔｒ
ｉｔｚ）及びハンペル（Ｈａｍｐｅｌ）［Ｂｉｏｃｈｅ
ｍｉｓｔｒｙ ２８（１９８９），４９２９頁］及びハ
ンペル等［Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１８
（１９９０），２９９〜３０４頁］の論文に記載されて
いる。このようなヘアピン構造は４個のヘリックスを有
していて、そのうち２個は基質と触媒ＲＮＡとの間に形
成されている。次に、タバコリングスポットウイルス
（Ｔｏｂａｃｃｏ−Ｒｉｎｇｓｐｏｔ−Ｖｉｒｕｓ）由
来のＲＮＡヘアピン構造の形の触媒中心の例を示してあ
る：
ｉｔｚ）及びハンペル（Ｈａｍｐｅｌ）［Ｂｉｏｃｈｅ
ｍｉｓｔｒｙ ２８（１９８９），４９２９頁］及びハ
ンペル等［Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１８
（１９９０），２９９〜３０４頁］の論文に記載されて
いる。このようなヘアピン構造は４個のヘリックスを有
していて、そのうち２個は基質と触媒ＲＮＡとの間に形
成されている。次に、タバコリングスポットウイルス
（Ｔｏｂａｃｃｏ−Ｒｉｎｇｓｐｏｔ−Ｖｉｒｕｓ）由
来のＲＮＡヘアピン構造の形の触媒中心の例を示してあ
る：
【００１４】
【化３】
【００１５】また触媒ＲＮＡの活性中心は所謂ハンマー
ヘッド構造を有していてもよい［Ｈｏｔｃｈｉｎｓ等：
Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１４（１９８
６），３６２７頁；Ｋｉｅｓｅ 及び Ｓｙｍｏｎｓ：Ｖ
ｉｒｏｉｄｓ ａｎｄ ｖｉｒｏｉｄ−ｌｉｋｅ ｐａｔ
ｈｏｇｅｎｓ，Ｊ．Ｓ．Ｓｅｍａｎｃｉｋ 編集（ＣＲ
Ｃ−Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａｒａｔａｎ，Ｆｌｏｒｉｄａ
（１９８７），１〜４７頁］。ハンマーヘッド構造の触
媒中心は３個のステムを有し、ＲＮＡの隣接配列部分に
よって又は多数のヌクレオチドによって相互に分離され
ている部分によって形成されていてもよい。
ヘッド構造を有していてもよい［Ｈｏｔｃｈｉｎｓ等：
Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１４（１９８
６），３６２７頁；Ｋｉｅｓｅ 及び Ｓｙｍｏｎｓ：Ｖ
ｉｒｏｉｄｓ ａｎｄ ｖｉｒｏｉｄ−ｌｉｋｅ ｐａｔ
ｈｏｇｅｎｓ，Ｊ．Ｓ．Ｓｅｍａｎｃｉｋ 編集（ＣＲ
Ｃ−Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａｒａｔａｎ，Ｆｌｏｒｉｄａ
（１９８７），１〜４７頁］。ハンマーヘッド構造の触
媒中心は３個のステムを有し、ＲＮＡの隣接配列部分に
よって又は多数のヌクレオチドによって相互に分離され
ている部分によって形成されていてもよい。
【００１６】従って本発明の対象は、一般構造式（Ｉ
Ｉ）：
Ｉ）：
【００１７】
【化４】
【００１８】［式中Ｎはそれぞれ一般構造式（Ｉ）によ
るヌクレオチドを表わし、ｘ及びｙは同じか又は異なっ
ていてよもく、ｘ≧１及びｙ≧２であり、Ｎ5及びＮ6は
相互に相補的なヌクレオチドであり、＊は塩基対を表わ
し、Ｎ′及びＮ″は、少なくとも部分的に相互に相補的
なヌクレオチドを有する２個のヌクレオチド配列を表わ
し（この場合両ヌクレオチド配列の間に安定な塩基対が
形成可能である）、又はＮ′及びＮ″は一緒に単一のヌ
クレオチド配列を表わし（この場合該配列の少なくとも
一部分が相補的ヌクレオチドの間の塩基対によって二本
鎖ステムを形成してもよい）、場合により１個以上の付
加的ヌクレオチドＮがＮ7又は／及びＮ9の後に挿入され
うる］を有するハンマーヘッドオリゴヌクレオチド構造
であって、その特徴とするところは、式（ＩＩ）中の少
なくとも１個のヌクレオチドＮ2，Ｎ3，Ｎ5，Ｎ6，
Ｎ7，Ｎ9，Ｎ10，Ｎ12，Ｎ13及びＮ14において式（Ｉ）
のＲ基が水素以外のものであることである。
るヌクレオチドを表わし、ｘ及びｙは同じか又は異なっ
ていてよもく、ｘ≧１及びｙ≧２であり、Ｎ5及びＮ6は
相互に相補的なヌクレオチドであり、＊は塩基対を表わ
し、Ｎ′及びＮ″は、少なくとも部分的に相互に相補的
なヌクレオチドを有する２個のヌクレオチド配列を表わ
し（この場合両ヌクレオチド配列の間に安定な塩基対が
形成可能である）、又はＮ′及びＮ″は一緒に単一のヌ
クレオチド配列を表わし（この場合該配列の少なくとも
一部分が相補的ヌクレオチドの間の塩基対によって二本
鎖ステムを形成してもよい）、場合により１個以上の付
加的ヌクレオチドＮがＮ7又は／及びＮ9の後に挿入され
うる］を有するハンマーヘッドオリゴヌクレオチド構造
であって、その特徴とするところは、式（ＩＩ）中の少
なくとも１個のヌクレオチドＮ2，Ｎ3，Ｎ5，Ｎ6，
Ｎ7，Ｎ9，Ｎ10，Ｎ12，Ｎ13及びＮ14において式（Ｉ）
のＲ基が水素以外のものであることである。
【００１９】Ｎ1〜Ｎ14の部分がオリゴヌクレオチド構
造（ＩＩ）の触媒中心を含む。（Ｎ）x及び（Ｎ）yで表
示したヌクレオチドは、活性中心の外に存在しかつ核酸
の特異的目標配列との対合を惹起する部分を有する。こ
の部分の長さは、ｘ≧１，ｙ≧２でなければならないよ
うな長さである。好ましくはｘ及びｙ≦２０であって、
ｘ又は／及びｙのより大きい値は特別な利点をもたらさ
ず、オリゴヌクレオチドの合成を困難にする。オリゴヌ
クレオチド（ＩＩ）は１個のつながっている分子である
か又は２個の異なる分子から成っていてもよい、つまり
Ｎ′およびＮ″は一緒に単一のヌクレオチド配列か又は
２個の異なるヌクレオチド配列を表わす。本発明の構造
については、ヌクレオチド配列Ｎ′及びＮ″が、少なく
とも部分的に相互に相補的であり、両ヌクレオチド配列
の間に安定な塩基対を形成しうる部分を含むことが重要
である。ここで安定な塩基対という概念は、オリゴヌク
レオチド構造が生理学的条件下で室温、好ましくは最高
４０℃までの温度で二本鎖として存在することを意味す
る。
造（ＩＩ）の触媒中心を含む。（Ｎ）x及び（Ｎ）yで表
示したヌクレオチドは、活性中心の外に存在しかつ核酸
の特異的目標配列との対合を惹起する部分を有する。こ
の部分の長さは、ｘ≧１，ｙ≧２でなければならないよ
うな長さである。好ましくはｘ及びｙ≦２０であって、
ｘ又は／及びｙのより大きい値は特別な利点をもたらさ
ず、オリゴヌクレオチドの合成を困難にする。オリゴヌ
クレオチド（ＩＩ）は１個のつながっている分子である
か又は２個の異なる分子から成っていてもよい、つまり
Ｎ′およびＮ″は一緒に単一のヌクレオチド配列か又は
２個の異なるヌクレオチド配列を表わす。本発明の構造
については、ヌクレオチド配列Ｎ′及びＮ″が、少なく
とも部分的に相互に相補的であり、両ヌクレオチド配列
の間に安定な塩基対を形成しうる部分を含むことが重要
である。ここで安定な塩基対という概念は、オリゴヌク
レオチド構造が生理学的条件下で室温、好ましくは最高
４０℃までの温度で二本鎖として存在することを意味す
る。
【００２０】本発明によるオリゴヌクレオチドは、ヌク
レオチドＮ2，Ｎ3，Ｎ5，Ｎ6，Ｎ7，Ｎ9，Ｎ10，Ｎ12，
Ｎ13及びＮ14の少なくとも１個、好ましくは数個におい
て式（Ｉ）のＲ基が水素以外のものである点によって優
れている。これに対してヌクレオチドＮ1，Ｎ4，Ｎ8及
びＮ11においては式（Ｉ）のＲ基は好ましくは水素であ
る。さらに、Ｎ1におけるヌクレオシド塩基がアデニン
−１−イル又は２−アミノアデニン−９−イルであり、
ヌクレオチドＮ4，Ｎ8及びＮ11におけるヌクレオシド塩
基がそれぞれグアニン−１−イル（又はヒポキサンチン
−９−イル）である場合が有利である。
レオチドＮ2，Ｎ3，Ｎ5，Ｎ6，Ｎ7，Ｎ9，Ｎ10，Ｎ12，
Ｎ13及びＮ14の少なくとも１個、好ましくは数個におい
て式（Ｉ）のＲ基が水素以外のものである点によって優
れている。これに対してヌクレオチドＮ1，Ｎ4，Ｎ8及
びＮ11においては式（Ｉ）のＲ基は好ましくは水素であ
る。さらに、Ｎ1におけるヌクレオシド塩基がアデニン
−１−イル又は２−アミノアデニン−９−イルであり、
ヌクレオチドＮ4，Ｎ8及びＮ11におけるヌクレオシド塩
基がそれぞれグアニン−１−イル（又はヒポキサンチン
−９−イル）である場合が有利である。
【００２１】本発明の特に好ましい対象は、一般構造式
（ＩＩＩ）：
（ＩＩＩ）：
【００２２】
【化５】
【００２３】［式中Ｎ，ｘ及びｙは式（ＩＩ）に関して
定義したものを表わし、Ｍは化学結合又はヌクレオチド
配列（Ｎ）aを表わし、ここでａ≧１であり、ｍ及びｎ
は同じか又は異なっていて、場合により１個以上の付加
的ヌクレオチドがＮ7又は／及びＮ9の後に挿入されても
よい］で示されるオリゴヌクレオチド構造である。
定義したものを表わし、Ｍは化学結合又はヌクレオチド
配列（Ｎ）aを表わし、ここでａ≧１であり、ｍ及びｎ
は同じか又は異なっていて、場合により１個以上の付加
的ヌクレオチドがＮ7又は／及びＮ9の後に挿入されても
よい］で示されるオリゴヌクレオチド構造である。
【００２４】式（ＩＩＩ）のヌクレオチドＮ1，Ｎ4，Ｎ
8，Ｎ10，Ｎ11及びＮ12におけるＲ基は好ましくは水素
である。式（ＩＩＩ）のＮ1，Ｎ4，Ｎ8，Ｎ10，Ｎ11及
びＮ1 2以外のすべてのヌクレオチドにおけるＲ基は好ま
しくは水素以外のものである。
8，Ｎ10，Ｎ11及びＮ12におけるＲ基は好ましくは水素
である。式（ＩＩＩ）のＮ1，Ｎ4，Ｎ8，Ｎ10，Ｎ11及
びＮ1 2以外のすべてのヌクレオチドにおけるＲ基は好ま
しくは水素以外のものである。
【００２５】触媒中心としてのハンマーヘッド構造を有
する本発明のオリゴヌクレオチドの好ましい具体的な例
は式（ＩＩ）又は（ＩＩＩ）による構造を有し、その特
徴とするところは、式（Ｉ）のＶ，Ｗ及びＸ基がＯであ
りかつ式（Ｉ）又は式（ＩＩＩ）のヌクレオチドＮ1〜
Ｎ14においてＢ及びＲ基が次の条件： Ｎ1 ：Ｂ＝Ａ 及び Ｒ＝Ｈ Ｎ2 ：Ｂ＝Ａ 及び Ｒ＝アリル Ｎ3 ：Ｂ＝Ａ 及び Ｒ＝アリル Ｎ4 ：Ｂ＝Ｇ 及び Ｒ＝Ｈ Ｎ5 ：Ｂ＝Ｃ 及び Ｒ＝アリル Ｎ6 ：Ｂ＝Ｇ 及び Ｒ＝アリル Ｎ7 ：Ｂ＝Ａ 及び Ｒ＝アリル Ｎ8 ：Ｂ＝Ｇ 及び Ｒ＝Ｈ Ｎ9 ：Ｂ＝Ｕ 及び Ｒ＝アリル Ｎ10：Ｂ＝Ａ 及び Ｒ＝Ｈ Ｎ11：Ｂ＝Ａ 及び Ｒ＝Ｈ Ｎ12：Ｂ＝Ｕ 及び Ｒ＝Ｈ Ｎ13：Ｂ＝Ｃ 及び Ｒ＝アリル Ｎ14：Ｂ＝Ｕ 及び Ｒ＝アリル を有することである。
する本発明のオリゴヌクレオチドの好ましい具体的な例
は式（ＩＩ）又は（ＩＩＩ）による構造を有し、その特
徴とするところは、式（Ｉ）のＶ，Ｗ及びＸ基がＯであ
りかつ式（Ｉ）又は式（ＩＩＩ）のヌクレオチドＮ1〜
Ｎ14においてＢ及びＲ基が次の条件： Ｎ1 ：Ｂ＝Ａ 及び Ｒ＝Ｈ Ｎ2 ：Ｂ＝Ａ 及び Ｒ＝アリル Ｎ3 ：Ｂ＝Ａ 及び Ｒ＝アリル Ｎ4 ：Ｂ＝Ｇ 及び Ｒ＝Ｈ Ｎ5 ：Ｂ＝Ｃ 及び Ｒ＝アリル Ｎ6 ：Ｂ＝Ｇ 及び Ｒ＝アリル Ｎ7 ：Ｂ＝Ａ 及び Ｒ＝アリル Ｎ8 ：Ｂ＝Ｇ 及び Ｒ＝Ｈ Ｎ9 ：Ｂ＝Ｕ 及び Ｒ＝アリル Ｎ10：Ｂ＝Ａ 及び Ｒ＝Ｈ Ｎ11：Ｂ＝Ａ 及び Ｒ＝Ｈ Ｎ12：Ｂ＝Ｕ 及び Ｒ＝Ｈ Ｎ13：Ｂ＝Ｃ 及び Ｒ＝アリル Ｎ14：Ｂ＝Ｕ 及び Ｒ＝アリル を有することである。
【００２６】触媒中心としてのハンマーヘッド構造を有
するオリゴヌクレオチドの他の好ましい具体的な例は、
式（Ｉ）のＶ，Ｗ及びＸ基が、Ｎ11とＮ12との間の結合
が燐チオエート基（Ｘ＝Ｏ及びＷ＝Ｓ）であることを除
いてＯであり、かつ式（Ｉ）又は（ＩＩＩ）中のヌクレ
オチドＮ1〜Ｎ14においてＢ及びＲ基が上記のものを表
わすことを特徴としている。
するオリゴヌクレオチドの他の好ましい具体的な例は、
式（Ｉ）のＶ，Ｗ及びＸ基が、Ｎ11とＮ12との間の結合
が燐チオエート基（Ｘ＝Ｏ及びＷ＝Ｓ）であることを除
いてＯであり、かつ式（Ｉ）又は（ＩＩＩ）中のヌクレ
オチドＮ1〜Ｎ14においてＢ及びＲ基が上記のものを表
わすことを特徴としている。
【００２７】また他のオリゴヌクレオチドの例は、式
（Ｉ）のＶ，Ｗ及びＸがＯであり、式（Ｉ）又は（ＩＩ
Ｉ）のヌクレオチドＮ1〜Ｎ14においてＢ基が上記のも
のを表わし、かつＮ1，Ｎ4，Ｎ8，Ｎ10，Ｎ11及びＮ12
に関してはＲ＝Ｈであり、Ｎ9に関してはＲ＝３，３−
ジメチルアリルであり、Ｎ2，Ｎ3，Ｎ5，Ｎ6，Ｎ7，Ｎ
13及びＮ14に関してはＲ＝アリルであることを特徴とし
ている。また他のオリゴヌクレオチドは、Ｎ3に関して
はＲ＝３，３−ジメチルアリルであり、Ｎ9に関しては
Ｒ＝アリルであることによってのみ、前記構造とは異な
っている。
（Ｉ）のＶ，Ｗ及びＸがＯであり、式（Ｉ）又は（ＩＩ
Ｉ）のヌクレオチドＮ1〜Ｎ14においてＢ基が上記のも
のを表わし、かつＮ1，Ｎ4，Ｎ8，Ｎ10，Ｎ11及びＮ12
に関してはＲ＝Ｈであり、Ｎ9に関してはＲ＝３，３−
ジメチルアリルであり、Ｎ2，Ｎ3，Ｎ5，Ｎ6，Ｎ7，Ｎ
13及びＮ14に関してはＲ＝アリルであることを特徴とし
ている。また他のオリゴヌクレオチドは、Ｎ3に関して
はＲ＝３，３−ジメチルアリルであり、Ｎ9に関しては
Ｒ＝アリルであることによってのみ、前記構造とは異な
っている。
【００２８】さらに他の構造の場合には、Ｎ1，Ｎ4，Ｎ
8，Ｎ10，Ｎ11及びＮ12に関してはＲ＝Ｈであり、Ｎ2，
Ｎ3，Ｎ7，Ｎ9及びＮ13に関してはＲ＝シアノメチルで
あり、Ｎ5、Ｎ6及びＮ14に関してはＲ＝アリルであり、
Ｂ基は上記に記載したものを表わす。
8，Ｎ10，Ｎ11及びＮ12に関してはＲ＝Ｈであり、Ｎ2，
Ｎ3，Ｎ7，Ｎ9及びＮ13に関してはＲ＝シアノメチルで
あり、Ｎ5、Ｎ6及びＮ14に関してはＲ＝アリルであり、
Ｂ基は上記に記載したものを表わす。
【００２９】さらにまた、本発明によるオリゴヌクレオ
チド構造において、細胞による触媒構造の組込みを改善
するためには１個以上のＲ基＝ブチルであることが好ま
しい場合もある。この場合の具体的例は、Ｎ1，Ｎ4，Ｎ
8，Ｎ10，Ｎ11及びＮ12に関してはＲ＝Ｈであり、Ｎ5及
びＮ6に関してはＲ＝ブチルであり、Ｎ2，Ｎ3，Ｎ7，Ｎ
9，Ｎ13及びＮ14に関してはＲ＝アリルであり、場合に
よっては式（ＩＩＩ）において塩基対の形（星印によっ
て示す）で存在するＮ基の１個、１個以上又はすべてに
関してＲが同様にブチルであってもよい構造のオリゴヌ
クレオチドである。
チド構造において、細胞による触媒構造の組込みを改善
するためには１個以上のＲ基＝ブチルであることが好ま
しい場合もある。この場合の具体的例は、Ｎ1，Ｎ4，Ｎ
8，Ｎ10，Ｎ11及びＮ12に関してはＲ＝Ｈであり、Ｎ5及
びＮ6に関してはＲ＝ブチルであり、Ｎ2，Ｎ3，Ｎ7，Ｎ
9，Ｎ13及びＮ14に関してはＲ＝アリルであり、場合に
よっては式（ＩＩＩ）において塩基対の形（星印によっ
て示す）で存在するＮ基の１個、１個以上又はすべてに
関してＲが同様にブチルであってもよい構造のオリゴヌ
クレオチドである。
【００３０】本発明によるオリゴヌクレオチド構造をさ
らに安定化するために、その遊離の３′末端に３′−デ
オキシリボヌクレオチド又は／及び３′−Ｏ−アルキル
リボヌクレオチドが存在していてもよい。このようにし
て本発明によるオリゴヌクレオチドは、３′−エキソヌ
クレアーゼ分解から防止される。
らに安定化するために、その遊離の３′末端に３′−デ
オキシリボヌクレオチド又は／及び３′−Ｏ−アルキル
リボヌクレオチドが存在していてもよい。このようにし
て本発明によるオリゴヌクレオチドは、３′−エキソヌ
クレアーゼ分解から防止される。
【００３１】さらに本発明によるオリゴヌクレオチド
は、その空間的配置を安定化するために、交差結合剤に
よって修飾されたヌクレオシド塩基をもつヌクレオチド
を有していてもよい。このような交差結合剤の例はプソ
ラーレン（Ｐｓｏｒａｌｅｎ）又はプソラーレン誘導体
である。このようにして２本鎖オリゴヌクレオチド構造
は共有交差結合によって修飾されうる。交差結合剤を用
いて修飾されたヌクレオチドの製造はＤＥ−Ａ３９２８
９００に詳述されている。
は、その空間的配置を安定化するために、交差結合剤に
よって修飾されたヌクレオシド塩基をもつヌクレオチド
を有していてもよい。このような交差結合剤の例はプソ
ラーレン（Ｐｓｏｒａｌｅｎ）又はプソラーレン誘導体
である。このようにして２本鎖オリゴヌクレオチド構造
は共有交差結合によって修飾されうる。交差結合剤を用
いて修飾されたヌクレオチドの製造はＤＥ−Ａ３９２８
９００に詳述されている。
【００３２】また本発明によるオリゴヌクレオチド構造
は、細胞における組込み又は／及びオリゴヌクレオチド
構造の特異的細胞局在化を改善するために補欠分子族に
結合されていてもよい。このような補欠分子族の例はポ
リアミノ酸（例えばポリリシン）、脂質、ホルモン又は
ペプチドである。このような補欠分子族の結合は通常本
発明のオリゴヌクレオチド構造の遊離５′末端及び３′
末端を介して行われ、同結合は直接又はリンカーを介し
て行われてもよい。リンカーの例は、例えば末端５′−
燐酸に存在していて、アミノ又は燐酸官能基を有するか
又はメルカプトアルコキシ基を有するジエステルであ
る。
は、細胞における組込み又は／及びオリゴヌクレオチド
構造の特異的細胞局在化を改善するために補欠分子族に
結合されていてもよい。このような補欠分子族の例はポ
リアミノ酸（例えばポリリシン）、脂質、ホルモン又は
ペプチドである。このような補欠分子族の結合は通常本
発明のオリゴヌクレオチド構造の遊離５′末端及び３′
末端を介して行われ、同結合は直接又はリンカーを介し
て行われてもよい。リンカーの例は、例えば末端５′−
燐酸に存在していて、アミノ又は燐酸官能基を有するか
又はメルカプトアルコキシ基を有するジエステルであ
る。
【００３３】本発明のオリゴヌクレオチド構造の合成は
モノマー単位から公知のようにして行われる。このよう
なモノマー単位は通常一般式（Ｖ）：
モノマー単位から公知のようにして行われる。このよう
なモノマー単位は通常一般式（Ｖ）：
【００３４】
【化６】
【００３５】［式中Ｖ，Ｂ及びＲは式（Ｉ）で定義した
ものを表わし、Ｄ及びＥは３′〜５′の中間ヌクレオチ
ド結合を形成することのできる反応性基を表わす］で示
される。このようなモノマー単位の群は当業者には周知
であり、例えばＢ．Ｓｐｒｏａｔ等：Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１８（１９９０）、４１−４９な
らびに要約的にはＥ．Ｌ．Ｗｉｎｎａｃｋｅｒ：Ｇｅｎ
ｅ ｕｎｄ Ｋｌｏｎｅ，ＶＣＨ−Ｖｅｒｌａｇｓｇｅｓ
ｅｌｌｓｃｈａｆｔ ｍｂＨ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ（ドイ
ツ国）（１９８５）、特に４４−４９頁及びＦｒｏｅｈ
ｌｅｒ及びＭａｔｔｅｕｃｃｉ：Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏ
ｎ Ｌｅｔ．（１９８６），４６９−４７２頁に記載さ
れている。式（Ｖ）の反応性モノヌクレオチドを用いて
本発明のオリゴヌクレオチド構造が公知法で、特に固相
により製造することができる。
ものを表わし、Ｄ及びＥは３′〜５′の中間ヌクレオチ
ド結合を形成することのできる反応性基を表わす］で示
される。このようなモノマー単位の群は当業者には周知
であり、例えばＢ．Ｓｐｒｏａｔ等：Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１８（１９９０）、４１−４９な
らびに要約的にはＥ．Ｌ．Ｗｉｎｎａｃｋｅｒ：Ｇｅｎ
ｅ ｕｎｄ Ｋｌｏｎｅ，ＶＣＨ−Ｖｅｒｌａｇｓｇｅｓ
ｅｌｌｓｃｈａｆｔ ｍｂＨ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ（ドイ
ツ国）（１９８５）、特に４４−４９頁及びＦｒｏｅｈ
ｌｅｒ及びＭａｔｔｅｕｃｃｉ：Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏ
ｎ Ｌｅｔ．（１９８６），４６９−４７２頁に記載さ
れている。式（Ｖ）の反応性モノヌクレオチドを用いて
本発明のオリゴヌクレオチド構造が公知法で、特に固相
により製造することができる。
【００３６】本発明の他の対象は、本発明による合成触
媒オリゴヌクレオチド構造を使用して核酸の目標配列を
切断する方法である。この場合該核酸の目標配列は合成
触媒オリゴヌクレオチド構造自体の一部分であってもよ
いし、あるいは該目標配列は合成触媒オリゴヌクレオチ
ド構造とは異なる分子であってもよい。
媒オリゴヌクレオチド構造を使用して核酸の目標配列を
切断する方法である。この場合該核酸の目標配列は合成
触媒オリゴヌクレオチド構造自体の一部分であってもよ
いし、あるいは該目標配列は合成触媒オリゴヌクレオチ
ド構造とは異なる分子であってもよい。
【００３７】核酸の目標配列を切断するために、一般式
（ＩＩ）で示されるハンマーヘッド構造を有する本発明
のオリゴヌクレオチドを使用する場合には、次式：
（ＩＩ）で示されるハンマーヘッド構造を有する本発明
のオリゴヌクレオチドを使用する場合には、次式：
【００３８】
【化７】
【００３９】で示される構造を有する中間段階が形成さ
れる。
れる。
【００４０】上記式中Ｎ，Ｎ′，Ｎ″，ｘ，ｙ及び＊は
式（ＩＩ）で定義したものを表わし、Ｋ，Ｙ，Ｕ及びＺ
は核酸の目標配列のヌクレオチドであり、Ｕはウリジン
であり；Ｚはアデノシン、シチジン又はウリジンから成
る群から選択された未修飾リボヌクレオチドであり；Ｋ
及びＹは任意のヌクレオチドであり、ａ≧１、ｂ≧３で
あり、核酸の目標配列の切断はヌクレオチド配列ＹＵＺ
の３′側で行われ、場合によっては核酸目標配列（Ｉ
Ｖ）の５′末端と（Ｎ）xにおけるオリゴヌクレオチド
（ＩＩ）の３′末端との間に化学結合が存在するか又は
核酸の目標配列（ＩＶ）の３′末端と（Ｎ）yにおける
オリゴヌクレオチド（ＩＩ）の５′末端との間に化学結
合が存在する。
式（ＩＩ）で定義したものを表わし、Ｋ，Ｙ，Ｕ及びＺ
は核酸の目標配列のヌクレオチドであり、Ｕはウリジン
であり；Ｚはアデノシン、シチジン又はウリジンから成
る群から選択された未修飾リボヌクレオチドであり；Ｋ
及びＹは任意のヌクレオチドであり、ａ≧１、ｂ≧３で
あり、核酸の目標配列の切断はヌクレオチド配列ＹＵＺ
の３′側で行われ、場合によっては核酸目標配列（Ｉ
Ｖ）の５′末端と（Ｎ）xにおけるオリゴヌクレオチド
（ＩＩ）の３′末端との間に化学結合が存在するか又は
核酸の目標配列（ＩＶ）の３′末端と（Ｎ）yにおける
オリゴヌクレオチド（ＩＩ）の５′末端との間に化学結
合が存在する。
【００４１】核酸の目標配列中のヌクレオチドＹは好ま
しくはグアノシン基であり、Ｚは好ましくはアデノシン
又はシチジンを表わす。核酸の目標配列は、Ｚが未修飾
リボヌクレオチドであるならば、任意のオリゴ−又はポ
リヌクレオチドであってよい。目標配列の基は例えばＤ
ＮＡ、２′−Ｏ−アルキル−ＲＮＡ又は混合構造であっ
てよい。しかし核酸の目標配列は好ましくはＲＮＡであ
る。特定の核酸の目標配列に対する本発明のオリゴヌク
レオチドの切断特異性は、触媒成分（Ｎｏ（Ｎ）x及び
（Ｎ）yＮ14）の対合腕の配列が、同配列が所望の目標
配列の切断位置に隣接する配列に対して相補的であるよ
うに変えられることによって得られる。
しくはグアノシン基であり、Ｚは好ましくはアデノシン
又はシチジンを表わす。核酸の目標配列は、Ｚが未修飾
リボヌクレオチドであるならば、任意のオリゴ−又はポ
リヌクレオチドであってよい。目標配列の基は例えばＤ
ＮＡ、２′−Ｏ−アルキル−ＲＮＡ又は混合構造であっ
てよい。しかし核酸の目標配列は好ましくはＲＮＡであ
る。特定の核酸の目標配列に対する本発明のオリゴヌク
レオチドの切断特異性は、触媒成分（Ｎｏ（Ｎ）x及び
（Ｎ）yＮ14）の対合腕の配列が、同配列が所望の目標
配列の切断位置に隣接する配列に対して相補的であるよ
うに変えられることによって得られる。
【００４２】本発明方法は、生細胞内及び試験管内で実
施することができる。切断は好ましくは２価陽イオン、
特にＭｇ2+の存在で、ｐＨ約７〜９、特に好ましくは約
８で実施される。
施することができる。切断は好ましくは２価陽イオン、
特にＭｇ2+の存在で、ｐＨ約７〜９、特に好ましくは約
８で実施される。
【００４３】また本発明は、作用物質として本発明のオ
リゴヌクレオチド構造を、場合により常用の薬剤学的賦
形剤、助剤、増量剤又は／及び希釈剤と一緒に含有す
る、抗ウイルス性薬剤に関する。また本発明は、ヒト、
動物及び植物における抗ウイルス療法の薬剤の製造方法
に関し、この場合作用物質として本発明のオリゴヌクレ
オチド構造を使用する。このような抗ウイルス療法の例
は本発明のオリゴヌクレオチドを用いるエイズの撲滅で
あろう（参照：例えばＳａｒｖｅｒ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ
２４７（１９９０），１２２２−１２２５）。
リゴヌクレオチド構造を、場合により常用の薬剤学的賦
形剤、助剤、増量剤又は／及び希釈剤と一緒に含有す
る、抗ウイルス性薬剤に関する。また本発明は、ヒト、
動物及び植物における抗ウイルス療法の薬剤の製造方法
に関し、この場合作用物質として本発明のオリゴヌクレ
オチド構造を使用する。このような抗ウイルス療法の例
は本発明のオリゴヌクレオチドを用いるエイズの撲滅で
あろう（参照：例えばＳａｒｖｅｒ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ
２４７（１９９０），１２２２−１２２５）。
【００４４】また本発明は、成分として本発明のオリゴ
ヌクレオチド構造を含有する診断試薬及びこのような診
断試薬の製造方法に関する。該診断試薬は例えば遺伝的
検査処理のために使用することができる。
ヌクレオチド構造を含有する診断試薬及びこのような診
断試薬の製造方法に関する。該診断試薬は例えば遺伝的
検査処理のために使用することができる。
【００４５】本発明をさらに、次の実施例及び配列実験
記録ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１及びＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２に
よって説明する。
記録ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１及びＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２に
よって説明する。
【００４６】ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１：基質−ＲＮＡのヌ
クレオチド配列ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２：触媒活性リボザ
イム−ＲＮＡのヌクレオチド配列
クレオチド配列ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２：触媒活性リボザ
イム−ＲＮＡのヌクレオチド配列
【００４７】
【実施例】例１ オリゴヌクレオチド合成、脱遮断及び精製 ２′−Ｏ−メチルリボヌクレオシド−３′−Ｏ−ホスホ
ラミジット−構成要素の合成は、Ｓｐｒｏａｔ等（Ｎｕ
ｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１８（１９９０），４
１−４９）の方法により行った。２′−Ｏ−アリルリボ
ヌクレオシド−３′−Ｏ−ホスホラミジット−構成要素
は、Ｓｐｒｏａｔ等（ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ Ｒｅ
ｓ．１８（１９９０），５１４３−５１５１）の方法に
より合成した。
ラミジット−構成要素の合成は、Ｓｐｒｏａｔ等（Ｎｕ
ｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１８（１９９０），４
１−４９）の方法により行った。２′−Ｏ−アリルリボ
ヌクレオシド−３′−Ｏ−ホスホラミジット−構成要素
は、Ｓｐｒｏａｔ等（ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ Ｒｅ
ｓ．１８（１９９０），５１４３−５１５１）の方法に
より合成した。
【００４８】２′−Ｏ−［１−（２−フルオルフェニ
ル）−４−メトキシピペリジン−４−イル］リボヌクレ
オチド−３′−Ｏ−ホスホラミジット−構成要素は、Ｂ
ｅｉｊｅｒ等（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１
８（１９９０），５１４３−５１５１）の方法により合
成した。
ル）−４−メトキシピペリジン−４−イル］リボヌクレ
オチド−３′−Ｏ−ホスホラミジット−構成要素は、Ｂ
ｅｉｊｅｒ等（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１
８（１９９０），５１４３−５１５１）の方法により合
成した。
【００４９】これらのオリゴヌクレオチドを、β−シア
ノエチル ホスホラミジット法により調節細孔ガラス
（Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｐｏｒｅ Ｇｌａｓｓ）上で修
飾ＤＮＡ−合成サイクルを用いて応用生体系合成装置で
合成した。縮合段階の活用剤としてテトラゾールの代り
に５−（４−ニトロフェニル）−１Ｈ−テトラゾールを
使用し、縮合の反応時間を１２分に高めた（参照：Ｎｕ
ｃｌｅｉｃ ＡｃｉｄｓＲｅｓ．１８（１９９０），４
１−４９及び５１４１−５１５１）。
ノエチル ホスホラミジット法により調節細孔ガラス
（Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｐｏｒｅ Ｇｌａｓｓ）上で修
飾ＤＮＡ−合成サイクルを用いて応用生体系合成装置で
合成した。縮合段階の活用剤としてテトラゾールの代り
に５−（４−ニトロフェニル）−１Ｈ−テトラゾールを
使用し、縮合の反応時間を１２分に高めた（参照：Ｎｕ
ｃｌｅｉｃ ＡｃｉｄｓＲｅｓ．１８（１９９０），４
１−４９及び５１４１−５１５１）。
【００５０】脱遮断及び精製を次のように行った。先ず
十分に遮断されたオリゴヌクレオチドが結合された担体
を密閉無菌容器中で２５％水性アンモニア溶液で６０℃
で１０分間処理した。次に冷却した溶液を無菌容器で真
空で蒸発乾固した。次に５′−末端５′−Ｏ−ジメトキ
シトリチル−保護基及び若干の２′−Ｏ−Ｆｐｍｐ−保
護基を有するオリゴヌクレオチドの粗生成物を、溶離剤
として水性０．１ｍｏｌ／ｌトリエチルアンモニウムア
セテート（ｐＨ７．０）中のアセトニトリル勾配を用
い、逆相ＨＰＬＣによってμ−Ｂｏｎｄａｐａｋ Ｃ18
−カラムで精製した。生成物を集めて、溶剤を真空で除
去した。残留物を水中の１０％グリセリン１ｍｌ中で再
懸濁し、この溶液を１０分間遠心分離した。上澄みをＧ
１５セファデックスカラム（３０ｍｌ）上に注ぎ、この
カラムに無菌蒸留水で溶離を施した。カラムのボイドボ
リューム（約９ｍｌ）を棄て、３ｍｌ−画分を集めた。
同画分は部分的に遮断されたオリゴヌクレオチドを含有
する。次に無菌水性塩酸（２７０μｌ、０．１ｍｏｌ／
ｌ）を加えた、これによってｐＨは２〜２．５の範囲に
保たれた。同溶液を２０〜２５℃で２０時間保ち、酸に
不安定なＤＭＴｒ−及びＦｐｍｐ−保護基を除去する。
次に溶液を２０００ｒ．ｐ．ｍで１０分間遠心分離し
た。上澄みをトリス酢酸２ｍｏｌ／ｌ（７５μｌ，ｐＨ
７．９）を加えて中和させた。１−ブタノールを用いる
抽出の反復によって水性溶液から完全に脱遮断された純
オリゴヌクレオチドが得られた（Ｃａｔｈａｌａ及びＢ
ｒｕｎｎｅｌ：Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１
８（１９９０），２０１）。オリゴヌクレオチドペレッ
トを乾燥し、トリス緩衝液（１０ｍｍｏｌ／ｌ，ｐＨ
７．５，１ｍｍｏｌ／ｌ ＥＤＴＡ）１００μｌ中に溶
かした。
十分に遮断されたオリゴヌクレオチドが結合された担体
を密閉無菌容器中で２５％水性アンモニア溶液で６０℃
で１０分間処理した。次に冷却した溶液を無菌容器で真
空で蒸発乾固した。次に５′−末端５′−Ｏ−ジメトキ
シトリチル−保護基及び若干の２′−Ｏ−Ｆｐｍｐ−保
護基を有するオリゴヌクレオチドの粗生成物を、溶離剤
として水性０．１ｍｏｌ／ｌトリエチルアンモニウムア
セテート（ｐＨ７．０）中のアセトニトリル勾配を用
い、逆相ＨＰＬＣによってμ−Ｂｏｎｄａｐａｋ Ｃ18
−カラムで精製した。生成物を集めて、溶剤を真空で除
去した。残留物を水中の１０％グリセリン１ｍｌ中で再
懸濁し、この溶液を１０分間遠心分離した。上澄みをＧ
１５セファデックスカラム（３０ｍｌ）上に注ぎ、この
カラムに無菌蒸留水で溶離を施した。カラムのボイドボ
リューム（約９ｍｌ）を棄て、３ｍｌ−画分を集めた。
同画分は部分的に遮断されたオリゴヌクレオチドを含有
する。次に無菌水性塩酸（２７０μｌ、０．１ｍｏｌ／
ｌ）を加えた、これによってｐＨは２〜２．５の範囲に
保たれた。同溶液を２０〜２５℃で２０時間保ち、酸に
不安定なＤＭＴｒ−及びＦｐｍｐ−保護基を除去する。
次に溶液を２０００ｒ．ｐ．ｍで１０分間遠心分離し
た。上澄みをトリス酢酸２ｍｏｌ／ｌ（７５μｌ，ｐＨ
７．９）を加えて中和させた。１−ブタノールを用いる
抽出の反復によって水性溶液から完全に脱遮断された純
オリゴヌクレオチドが得られた（Ｃａｔｈａｌａ及びＢ
ｒｕｎｎｅｌ：Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１
８（１９９０），２０１）。オリゴヌクレオチドペレッ
トを乾燥し、トリス緩衝液（１０ｍｍｏｌ／ｌ，ｐＨ
７．５，１ｍｍｏｌ／ｌ ＥＤＴＡ）１００μｌ中に溶
かした。
【００５１】例２基質ＲＮＡの製造及び標識化学的に合
成した基質オリゴヌクレオチドを、γ−32Ｐ−ＡＴＰ及
びキナーゼ又はＲＮＡ−リガーゼ及び32Ｐ−ｐＣｐを用
いて、その都度の酵素のメーカーによって提案された標
準操作により標識した。
成した基質オリゴヌクレオチドを、γ−32Ｐ−ＡＴＰ及
びキナーゼ又はＲＮＡ−リガーゼ及び32Ｐ−ｐＣｐを用
いて、その都度の酵素のメーカーによって提案された標
準操作により標識した。
【００５２】さらにまた、ＲＮＡをその都度の鋳型を適
当な制限酵素で切断した後ＳＰ６−ＲＮＡポリメラーゼ
を用いる転写によって合成した。転写物中にα−32Ｐ−
ＵＴＰを導入することによってＲＮＡ分子を標識した。
転写条件は次のとおりであった： トリス（ｐ７．５） ４０ ｍｍｏｌ／ｌ ＭｇＣｌ2 ６ ｍｍｏｌ／ｌ スペルミジン ２ ｍｍｏｌ／ｌ ジチオトレイトール １０ ｍｍｏｌ／ｌ ヌクレオシドトリホスフェート（Ａ，Ｃ，Ｇ） ５００ｍｍｏｌ／ｌ ＵＴＰ １００ μｍｏｌ／ｌ α−32Ｐ−ＵＴＰ １０ μＣｉ ＳＰ６−ポリメラーゼ １０Ｕ／μｌ ＲＮａｓｅ阻害剤（ヒト胎盤） ２０Ｕ／μｌ ３７℃で２時間インキュベーションした後、鋳型として
使用したＤＮＡをＲＮａｓｅを含まないＤＮａｓｅで分
解した。ＲＮＡをゲル電気泳動によって尿素７ｍｍｏｌ
／ｌの存在で６％ポリアクリルアミドゲル（アクリルア
ミド：ビスアクリルアミド＝１：３０）上で分離した。
ＲＮＡのバンドを拡散によって溶離し、ＲＮＡをエタノ
ール沈殿によって得た。活性測定は、基質ＲＮＡ（１０
ｎＭ〜１μＭ）、トリス（ｐＨ７．５）５０ｍＭ、Ｍｇ
Ｃｌ2 ２０ｍＭ、リボザイム０．０１〜１０ｐＭｏｌを
含有する反応混合物１０μｌ中で行った。この混合物を
５０℃で６０分間インキュベートした。切断生成物を尿
素７Ｍの存在で７％ポリアクリルアミドゲル上で分離し
た。
当な制限酵素で切断した後ＳＰ６−ＲＮＡポリメラーゼ
を用いる転写によって合成した。転写物中にα−32Ｐ−
ＵＴＰを導入することによってＲＮＡ分子を標識した。
転写条件は次のとおりであった： トリス（ｐ７．５） ４０ ｍｍｏｌ／ｌ ＭｇＣｌ2 ６ ｍｍｏｌ／ｌ スペルミジン ２ ｍｍｏｌ／ｌ ジチオトレイトール １０ ｍｍｏｌ／ｌ ヌクレオシドトリホスフェート（Ａ，Ｃ，Ｇ） ５００ｍｍｏｌ／ｌ ＵＴＰ １００ μｍｏｌ／ｌ α−32Ｐ−ＵＴＰ １０ μＣｉ ＳＰ６−ポリメラーゼ １０Ｕ／μｌ ＲＮａｓｅ阻害剤（ヒト胎盤） ２０Ｕ／μｌ ３７℃で２時間インキュベーションした後、鋳型として
使用したＤＮＡをＲＮａｓｅを含まないＤＮａｓｅで分
解した。ＲＮＡをゲル電気泳動によって尿素７ｍｍｏｌ
／ｌの存在で６％ポリアクリルアミドゲル（アクリルア
ミド：ビスアクリルアミド＝１：３０）上で分離した。
ＲＮＡのバンドを拡散によって溶離し、ＲＮＡをエタノ
ール沈殿によって得た。活性測定は、基質ＲＮＡ（１０
ｎＭ〜１μＭ）、トリス（ｐＨ７．５）５０ｍＭ、Ｍｇ
Ｃｌ2 ２０ｍＭ、リボザイム０．０１〜１０ｐＭｏｌを
含有する反応混合物１０μｌ中で行った。この混合物を
５０℃で６０分間インキュベートした。切断生成物を尿
素７Ｍの存在で７％ポリアクリルアミドゲル上で分離し
た。
【００５３】例３ 種々の修飾触媒オリゴヌクレオチドの活性の測定目標配
列としては、ヒトのフィブロネクチン−ｍＲＮＡのＥＤ
Ｂエキソンをベースとする、化学的に合成されたヌクレ
オチド１７個の長さのオリゴヌクレオチドを使用した。
配列（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１）は次のとおりであった： ５′−ｒ［ＵＡＣＡＣＡＧＵＣＡＣＡＧＧＧＣＵ］ この配列を切断するために使用したリボザイムは次に示
すヌクレオチド配列（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２）を有して
いた： ５′−ｒ［ＧＣＣＣＵＧＵＣＵＧＡＵＧＡＧＵＣＣＧＵ
ＧＡＧＧＡＣＧＡＡＡＣＵＧＵＧＵ］ 上記配列はＥ０と呼ぶ。下線を施した部分は、式（ＩＩ
Ｉ）のヌクレオチドＮ14〜Ｎ6及びＮ5〜Ｎ0を表わす。
また次のようなＥ０の類似配列（同一塩基構成を有す
る）も合成した： Ｅ１：Ｎ1，Ｎ4，Ｎ8，Ｎ10，Ｎ11及びＮ12に関しては
Ｒ＝Ｈ；他のすべてのＮに関してはＲ＝アリル。
列としては、ヒトのフィブロネクチン−ｍＲＮＡのＥＤ
Ｂエキソンをベースとする、化学的に合成されたヌクレ
オチド１７個の長さのオリゴヌクレオチドを使用した。
配列（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１）は次のとおりであった： ５′−ｒ［ＵＡＣＡＣＡＧＵＣＡＣＡＧＧＧＣＵ］ この配列を切断するために使用したリボザイムは次に示
すヌクレオチド配列（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２）を有して
いた： ５′−ｒ［ＧＣＣＣＵＧＵＣＵＧＡＵＧＡＧＵＣＣＧＵ
ＧＡＧＧＡＣＧＡＡＡＣＵＧＵＧＵ］ 上記配列はＥ０と呼ぶ。下線を施した部分は、式（ＩＩ
Ｉ）のヌクレオチドＮ14〜Ｎ6及びＮ5〜Ｎ0を表わす。
また次のようなＥ０の類似配列（同一塩基構成を有す
る）も合成した： Ｅ１：Ｎ1，Ｎ4，Ｎ8，Ｎ10，Ｎ11及びＮ12に関しては
Ｒ＝Ｈ；他のすべてのＮに関してはＲ＝アリル。
【００５４】Ｅ２：Ｎ1，Ｎ4，Ｎ8，Ｎ10及びＮ11に関
してはＲ＝Ｈ；他のすべてのＮに関してはＲ＝アリル。
してはＲ＝Ｈ；他のすべてのＮに関してはＲ＝アリル。
【００５５】Ｅ３：Ｎ1，Ｎ4，Ｎ8，Ｎ10，Ｎ11及びＮ
12に関してはＲ＝Ｈ；Ｎ11とＮ12との間の結合はリンチ
オエート基であり（すなわち式（Ｉ）によりＸ＝Ｏ及び
Ｗ＝Ｓである）；他のすべてのＮに関してはＲ＝アリ
ル。
12に関してはＲ＝Ｈ；Ｎ11とＮ12との間の結合はリンチ
オエート基であり（すなわち式（Ｉ）によりＸ＝Ｏ及び
Ｗ＝Ｓである）；他のすべてのＮに関してはＲ＝アリ
ル。
【００５６】Ｅ４：Ｎ1，Ｎ4，Ｎ8，Ｎ10，Ｎ11及びＮ
12に関してはＲ＝Ｈ；Ｎ9に関してはＲ＝３，３−ジメ
チルアリル；他のすべてのＮに関してはＲ＝アリル。
12に関してはＲ＝Ｈ；Ｎ9に関してはＲ＝３，３−ジメ
チルアリル；他のすべてのＮに関してはＲ＝アリル。
【００５７】Ｅ５：Ｎ1，Ｎ4，Ｎ8，Ｎ10，Ｎ11及びＮ
12に関してはＲ＝Ｈ；Ｎ3に関してはＲ＝３，３−ジメ
チルアリル；他のすべてのＮに関してはＲ＝アリル。
12に関してはＲ＝Ｈ；Ｎ3に関してはＲ＝３，３−ジメ
チルアリル；他のすべてのＮに関してはＲ＝アリル。
【００５８】Ｅ６：Ｎ1，Ｎ4，Ｎ8，Ｎ10，Ｎ11及びＮ
12に関してはＲ＝Ｈ；Ｎ5及びＮ6ならびに塩基対部分を
形成する他の６Ｎ（ＵＣＣ及びＧＧＡ）に関してはＲ＝
ブチル；他のすべてのＮに関してはＲ＝アリル。
12に関してはＲ＝Ｈ；Ｎ5及びＮ6ならびに塩基対部分を
形成する他の６Ｎ（ＵＣＣ及びＧＧＡ）に関してはＲ＝
ブチル；他のすべてのＮに関してはＲ＝アリル。
【００５９】Ｅ７：Ｎ1，Ｎ4，Ｎ8，Ｎ10，Ｎ11及びＮ
12に関してはＲ＝Ｈ；Ｎ2，Ｎ3，Ｎ7，Ｎ9及びＮ13に関
してはＲ＝シアノメチル；他のすべてのＮに関してはＲ
＝アリル。
12に関してはＲ＝Ｈ；Ｎ2，Ｎ3，Ｎ7，Ｎ9及びＮ13に関
してはＲ＝シアノメチル；他のすべてのＮに関してはＲ
＝アリル。
【００６０】切断活性を測定するためのテストは、基質
ＲＮＡ（１０ｎｍｏｌ／ｌ〜１μｍｏｌ／ｌ）、トリス
（ｐＨ７．５）５０ｍｍｏｌ／ｌ、ＭｇＣｌ2 ２０ｍｍ
ｏｌ／ｌ及びリボザイム０．０１〜１０ｐｍｏｌを含有
する、１０μｌの反応体積で行った。反応混合物を５０
℃で６０分間インキュベートした。切断生成物は尿素７
ｍｏｌ／ｌの存在でポリアクリルアミド−ゲル電気泳動
法によって分離した。
ＲＮＡ（１０ｎｍｏｌ／ｌ〜１μｍｏｌ／ｌ）、トリス
（ｐＨ７．５）５０ｍｍｏｌ／ｌ、ＭｇＣｌ2 ２０ｍｍ
ｏｌ／ｌ及びリボザイム０．０１〜１０ｐｍｏｌを含有
する、１０μｌの反応体積で行った。反応混合物を５０
℃で６０分間インキュベートした。切断生成物は尿素７
ｍｏｌ／ｌの存在でポリアクリルアミド−ゲル電気泳動
法によって分離した。
【００６１】反応速度は、５０℃で切断時間１．５分、
１０分及び１５分に32Ｐで放射性標識した基質の量を測
定することによって決定した。基質濃度は２５、５０、
１００、２５０ｎｍｏｌ／ｌであった；リボザイム濃度
は４ｎｍｏｌ／ｌ〜２０ｎｍｏｌ／ｌであった。試料は
予熱し、反応はリボザイムを加えて開始させた。所定の
反応時間後にＥＤＴＡ２０ｍｍｏｌ／ｌを２容加えるこ
とによって反応を停止した。生成物をポリアクリルアミ
ド−尿素−ゲル電気泳動法によって分離し、分子動的燐
画像装置（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ Ｐｈ
ｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｅｒ）で定量的に分析した。
１０分及び１５分に32Ｐで放射性標識した基質の量を測
定することによって決定した。基質濃度は２５、５０、
１００、２５０ｎｍｏｌ／ｌであった；リボザイム濃度
は４ｎｍｏｌ／ｌ〜２０ｎｍｏｌ／ｌであった。試料は
予熱し、反応はリボザイムを加えて開始させた。所定の
反応時間後にＥＤＴＡ２０ｍｍｏｌ／ｌを２容加えるこ
とによって反応を停止した。生成物をポリアクリルアミ
ド−尿素−ゲル電気泳動法によって分離し、分子動的燐
画像装置（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ Ｐｈ
ｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｅｒ）で定量的に分析した。
【００６２】表１には上記の触媒オリゴヌクレオチドＥ
０，Ｅ１，Ｅ２，Ｅ３，Ｅ４，Ｅ５，Ｅ６及びＥ７の相
対活性及びＲＮａｓｅの感受性を記載してある。
０，Ｅ１，Ｅ２，Ｅ３，Ｅ４，Ｅ５，Ｅ６及びＥ７の相
対活性及びＲＮａｓｅの感受性を記載してある。
【００６３】
【表１】 表１ 触媒構造 相対活性 ＲＮａｓｅ Ａの感受性 Ｅ０ １ １ Ｅ１ ０．２ ０．０１ Ｅ２ ＜０．０５ 安定 Ｅ３ ０．１ ０．００１ Ｅ４ 約 ０．２ ０．０１ Ｅ５ 約 ０．２ ０．０１ Ｅ６ 約 ０．２ ０．０１ Ｅ７ 約 ０．２ ０．０１
【００６４】
【配列表】 <110> Europoaisches Laboratorium fur Molekularbiologie <120> Synthetic catalytic oligonucleotide <130> 001893 <150> JP 4-160564 <151> 1992-6-19 <150> DE P4120406.9 <151> 1991-6-20 <150> DE P4216134.7 <151> 1992-5-15 <160> 2 <210> 1 <211> 17 <212> RNA <213> <400> 1 uacacaguca cagggcu 17 <210> 2 <211> 36 <212> RNA <213> <400> 2 gcccugucug augaguccgu gaggacgaaa cugugu 36
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成１２年８月３０日（２０００．８．３
０）
０）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正内容】
【特許請求の範囲】
【化１】 ［式中、Ｂは、アデニン−９−イル（Ａ）、シトシン−
１−イル（Ｃ）、グアニン−９−イル（Ｇ）、ウラシル
−１−イル（Ｕ）、ウラシル−５−イル（ψ）、ヒポキ
サンチン−９−イル（Ｉ）、チミン−１−イル（Ｔ）及
び２−アミノアデニン−９−イルから成る群から選択さ
れるヌクレオシド塩基を表わし、Ｖは各ヌクレオチドに
おいて独立的にＯ又はＣＨ2基であり、Ｘ及びＷはそれ
ぞれヌクレオチドにおいて同じか又は異なっていてもよ
くかつ相互に独立的にＯ、Ｓ、ＮＨ2基、炭素原子１〜
１０個、好ましくは１〜４個を有するアルキル基又はア
ルコキシ基であり、Ｒは水素又は炭素原子１〜１０個を
有する直鎖又は枝分れアルキル基、アルケニル基又はア
ルキニル基であって、ハロゲン、シアノ基、イソシアノ
基、ニトロ基、アミノ基、カルボキシル基、ヒドロキシ
ル基又は／及びメルカプト基で置換されていてもよい］
で示されるヌクレオチドを含む合成触媒オリゴヌクレオ
チド構造であって、少なくとも１個のヌクレオチドにお
いて式（Ｉ）のＲ基が水素以外のものであり、触媒活性
中心においてＲが水素であるヌクレオチドが存在し、オ
リゴヌクレオチド構造の触媒活性中心はハンマーヘッド
またはヘアピン構造を示し、かつオリゴヌクレオチド構
造は、核酸の目標配列とのハイブリダイゼーションを担
う領域を含む、ことを特徴とする、合成触媒オリゴヌク
レオチド構造。
１−イル（Ｃ）、グアニン−９−イル（Ｇ）、ウラシル
−１−イル（Ｕ）、ウラシル−５−イル（ψ）、ヒポキ
サンチン−９−イル（Ｉ）、チミン−１−イル（Ｔ）及
び２−アミノアデニン−９−イルから成る群から選択さ
れるヌクレオシド塩基を表わし、Ｖは各ヌクレオチドに
おいて独立的にＯ又はＣＨ2基であり、Ｘ及びＷはそれ
ぞれヌクレオチドにおいて同じか又は異なっていてもよ
くかつ相互に独立的にＯ、Ｓ、ＮＨ2基、炭素原子１〜
１０個、好ましくは１〜４個を有するアルキル基又はア
ルコキシ基であり、Ｒは水素又は炭素原子１〜１０個を
有する直鎖又は枝分れアルキル基、アルケニル基又はア
ルキニル基であって、ハロゲン、シアノ基、イソシアノ
基、ニトロ基、アミノ基、カルボキシル基、ヒドロキシ
ル基又は／及びメルカプト基で置換されていてもよい］
で示されるヌクレオチドを含む合成触媒オリゴヌクレオ
チド構造であって、少なくとも１個のヌクレオチドにお
いて式（Ｉ）のＲ基が水素以外のものであり、触媒活性
中心においてＲが水素であるヌクレオチドが存在し、オ
リゴヌクレオチド構造の触媒活性中心はハンマーヘッド
またはヘアピン構造を示し、かつオリゴヌクレオチド構
造は、核酸の目標配列とのハイブリダイゼーションを担
う領域を含む、ことを特徴とする、合成触媒オリゴヌク
レオチド構造。
【化２】 ［式中、Ｂは、アデニン−９−イル（Ａ）、シトシン−
１−イル（Ｃ）、グアニン−９−イル（Ｇ）、ウラシル
−１−イル（Ｕ）、ウラシル−５−イル（ψ）、ヒポキ
サンチン−９−イル（Ｉ）、チミン−１−イル（Ｔ）及
び２−アミノアデニン−９−イルから成る群から選択さ
れるヌクレオシド塩基を表わし、Ｖは各ヌクレオチドに
おいて独立的にＯ又はＣＨ2基であり、Ｘ及びＷはそれ
ぞれヌクレオチドにおいて同じか又は異なっていてもよ
くかつ相互に独立的にＯ、Ｓ、ＮＨ2基、炭素原子１〜
１０個、好ましくは１〜４個を有するアルキル基又はア
ルコキシ基であり、Ｒは水素又は炭素原子１〜１０個を
有する直鎖又は枝分れアルキル基である］で示される少
なくとも１つのヌクレオチドを含む合成触媒オリゴヌク
レオチド構造であって、触媒活性中心においてＲが水素
であるヌクレオチドが存在することを特徴とする合成触
媒オリゴヌクレオチド構造。
１−イル（Ｃ）、グアニン−９−イル（Ｇ）、ウラシル
−１−イル（Ｕ）、ウラシル−５−イル（ψ）、ヒポキ
サンチン−９−イル（Ｉ）、チミン−１−イル（Ｔ）及
び２−アミノアデニン−９−イルから成る群から選択さ
れるヌクレオシド塩基を表わし、Ｖは各ヌクレオチドに
おいて独立的にＯ又はＣＨ2基であり、Ｘ及びＷはそれ
ぞれヌクレオチドにおいて同じか又は異なっていてもよ
くかつ相互に独立的にＯ、Ｓ、ＮＨ2基、炭素原子１〜
１０個、好ましくは１〜４個を有するアルキル基又はア
ルコキシ基であり、Ｒは水素又は炭素原子１〜１０個を
有する直鎖又は枝分れアルキル基である］で示される少
なくとも１つのヌクレオチドを含む合成触媒オリゴヌク
レオチド構造であって、触媒活性中心においてＲが水素
であるヌクレオチドが存在することを特徴とする合成触
媒オリゴヌクレオチド構造。
【化３】 ［式中、それぞれの各Ｎは請求項９−１７のいずれかに
記載の一般構造式Ｉのヌクレオチドであり；Ｎ１、Ｎ
４、Ｎ８、Ｎ１０、およびＮ１１中のＲはＨであり；Ｎ
２、Ｎ３、Ｎ５、Ｎ６、Ｎ７、Ｎ９、Ｎ１２、Ｎ１３、
およびＮ１４中のＲはＨ以外のものであり；ｘおよびｙ
は、同じかまたは異なっていてもよく、かつｘ≧１およ
びｙ≧２であり；Ｎ５およびＮ６は、それぞれの場合、
互いに相補的なヌクレオチドであり、そして＊は塩基対
を表し；およびＮ′およびＮ″は、２つのヌクレオチド
配列の間の安定な塩基対を可能とするように少なくとも
部分的に互いに相補的であるヌクレオチドを含有する２
つのヌクレオチド配列を表すか、またはＮ′およびＮ″
は、一緒になって、配列の少なくとも一部が相補的ヌク
レオチド間の塩基対により二本鎖ステムを形成しうる単
一のヌクレオチド配列を表す］の構造を有するハンマー
ヘッド触媒オリゴヌクレオチド。
記載の一般構造式Ｉのヌクレオチドであり；Ｎ１、Ｎ
４、Ｎ８、Ｎ１０、およびＮ１１中のＲはＨであり；Ｎ
２、Ｎ３、Ｎ５、Ｎ６、Ｎ７、Ｎ９、Ｎ１２、Ｎ１３、
およびＮ１４中のＲはＨ以外のものであり；ｘおよびｙ
は、同じかまたは異なっていてもよく、かつｘ≧１およ
びｙ≧２であり；Ｎ５およびＮ６は、それぞれの場合、
互いに相補的なヌクレオチドであり、そして＊は塩基対
を表し；およびＮ′およびＮ″は、２つのヌクレオチド
配列の間の安定な塩基対を可能とするように少なくとも
部分的に互いに相補的であるヌクレオチドを含有する２
つのヌクレオチド配列を表すか、またはＮ′およびＮ″
は、一緒になって、配列の少なくとも一部が相補的ヌク
レオチド間の塩基対により二本鎖ステムを形成しうる単
一のヌクレオチド配列を表す］の構造を有するハンマー
ヘッド触媒オリゴヌクレオチド。
【化４】 ［式中、Ｎ、ｘおよびｙは、請求項２３において定義し
たとおりであり；Ｍは、化学結合またはヌクレオチド配
列（Ｎ）aを表し、ここでａ≧１であり、ｍおよびｎ
は、同じかまたは異なっていてもよく、所望の場合に
は、１またはいくつかの追加のヌクレオチドがＮ７また
は／およびＮ９の後に付加されていてもよい］の構造を
有するハンマーヘッド触媒オリゴヌクレオチド。
たとおりであり；Ｍは、化学結合またはヌクレオチド配
列（Ｎ）aを表し、ここでａ≧１であり、ｍおよびｎ
は、同じかまたは異なっていてもよく、所望の場合に
は、１またはいくつかの追加のヌクレオチドがＮ７また
は／およびＮ９の後に付加されていてもよい］の構造を
有するハンマーヘッド触媒オリゴヌクレオチド。
【化５】 ［式中、Ｎ、Ｎ′、Ｎ″、ｘ、ｙおよび＊は、請求項２
３において定義したとおりであり；およびＫ、Ｙ、Ｕお
よびＺは、核酸の目標配列のヌクレオチドを表し、ここ
で、Ｕはウリジンであり；Ｚは、アデノシン、シチジン
またはウリジンを含む群より選択される非修飾リボヌク
レオチドであり；ＫおよびＹはヌクレオチドであり；ａ
≧１かつｂ≧３である］の核酸の目標配列を切断するた
めの使用であって、核酸の目標配列の切断は、ヌクレオ
チド配列ＹＵＺの３’側において生じ、このことによ
り、所望の場合には、核酸の目標配列（ＩＶ）の５′−
末端とオリゴヌクレオチド（ＩＩ）の３′−末端の
（Ｎ）ｘ、または核酸の目標配列（ＩＶ）の３′−末端
とオリゴヌクレオチド（ＩＩ）の５′−末端の（Ｎ）y
との間に化学結合が存在する、ことを特徴とする使用。
３において定義したとおりであり；およびＫ、Ｙ、Ｕお
よびＺは、核酸の目標配列のヌクレオチドを表し、ここ
で、Ｕはウリジンであり；Ｚは、アデノシン、シチジン
またはウリジンを含む群より選択される非修飾リボヌク
レオチドであり；ＫおよびＹはヌクレオチドであり；ａ
≧１かつｂ≧３である］の核酸の目標配列を切断するた
めの使用であって、核酸の目標配列の切断は、ヌクレオ
チド配列ＹＵＺの３’側において生じ、このことによ
り、所望の場合には、核酸の目標配列（ＩＶ）の５′−
末端とオリゴヌクレオチド（ＩＩ）の３′−末端の
（Ｎ）ｘ、または核酸の目標配列（ＩＶ）の３′−末端
とオリゴヌクレオチド（ＩＩ）の５′−末端の（Ｎ）y
との間に化学結合が存在する、ことを特徴とする使用。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 アンガス レイモンド ドイツ連邦共和国 ヴィーゼンバッハ シ ラーシュトラーセ 36 (72)発明者 ジョヴァンニ パオレッラ ドイツ連邦共和国 ガイベルク レルヒェ ンシュトラーセ １
Claims (1)
- 【請求項１】 核酸の目標配列を切断するために適して
おりかつ次の一般構造式（Ｉ）： 【化１】 ［式中Ｂは、特にアデニン−９−イル（Ａ）、シトシン
−１−イル（Ｃ）、グアニン−９−イル（Ｇ）、ウラシ
ル−１−イル（Ｕ）、ウラシル−５−イル（ψ）、ヒポ
キサンチン−９−イル（Ｉ）、チミン−１−イル（Ｔ）
及び２−アミノアデニン−９−イルから成る群から選択
されるヌクレオシド塩基を表わし、Ｖは各ヌクレオチド
において独立的にＯ又はＣＨ2基であり、Ｘ及びＷはそ
れぞれヌクレオチドにおいて同じか又は異なっていても
よくかつ相互に独立的にＯ，Ｓ，ＮＨ2基、炭素原子１
〜１０個、好ましくは１〜４個を有するアルキル基又は
アルコキシ基であり、Ｒは水素又は炭素原子１〜１０個
を有する、場合によりハロゲン、シアノ基、イソシアノ
基、ニトロ基、アミノ基、カルボキシル基、ヒドロキシ
ル基又は／及びメルカプト基で置換された直鎖又は枝分
れアルキル基、アルケニル基又はアルキニル基である］
で示されるヌクレオチドを含む合成触媒オリゴヌクレオ
チド構造において、少なくとも１個のヌクレオチドにお
いて式（Ｉ）のＲ基が水素以外のものであり、Ｒが水素
である触媒活性中心が存在し、オリゴヌクレオチドの触
媒活性中心がハンマーヘッド又はヘアピン構造を示し、
かつオリゴヌクレオチド構造は、核酸目標配列とのハイ
ブリダイゼーションを担う領域を含む、ことを特徴とす
る合成触媒オリゴヌクレオチド構造。
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