JP2000514281A - Human b cell antigens; Related Reagents - Google Patents

Human b cell antigens; Related Reagents

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Abstract

(57)【要約】 ヒトB細胞抗原をコードする遺伝子の精製および単離。 (57) Abstract: Purification and isolation of the gene encoding the human B cell antigen. (例えば、リンパ球系の)細胞の発達を調節する際に有用な核酸、タンパク質、抗体、および他の試薬が、それらの使用のための方法とともに提供される。 (E.g., lymphoid) nucleic acids useful in regulating the development of cells, proteins, antibodies, and other reagents are provided along with methods for their use.

Description

【発明の詳細な説明】 ヒトB細胞抗原;関連する試薬発明の分野本発明は、ヒトの免疫反応を調節する際に有用である様々な生物学的試薬に関する。 DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION Human B cell antigen; Field of the Invention The related reagents invention relates to various biological reagents useful in modulating human immune responses. より詳細には、本発明は、例えばB細胞とT細胞との相互作用において有用な組成物および方法に関する。 More particularly, the present invention relates to, for example, compositions and methods useful in the interaction with B cells and T cells. 発明の背景白血病、リンパ腫、ガン腫、および他の悪性腫瘍が、例えば、Wilsonら編Harr ison's Principles of Internal Medicine ,McGraw-Hill,New York,1599〜161 2頁に記載されている。 BACKGROUND OF THE INVENTION Leukemia, lymphoma, carcinoma, and other malignant tumors, for example, Wilson et al., Eds Harr ison's Principles of Internal Medicine, McGraw-Hill, New York, is described in 1599-161 2 pages. そのような疾患の1つの例としての悪性リンパ腫は、主にリンパ系組織に存在する新生物性形質転換細胞である。 Malignant lymphoma as one example of such diseases are neoplastic transformed cells present primarily in lymphoid tissues. (例えば、Nadler,LM Harrison'sを参照のこと)。 (For example, Nadler, see LM Harrison's). 非ホジキンリンパ腫の90%は、B細胞リンパ腫である。 90% of non-Hodgkin's lymphoma is a B cell lymphoma. 約30,000の非ホジキンリンパ腫の新しい症例が米国で毎年生じている。 New cases of about 30,000 non-Hodgkin's lymphoma has occurred in the United States each year. これらの症例の内、25%未満が治癒している。 Of these cases, and healing less than 25%. 別の例は、白血病である。 Another example is a leukemia. 約30,000の白血病の新しい症例が米国で毎年生じている。 New cases of about 30,000 of leukemia has occurred each year in the United States. 従って、B細胞およびT細胞リンパ腫、白血病、ガン腫、および他の悪性疾患に対するより効果的な処置の必要性が存在する。 Accordingly, B cells and T cell lymphomas, leukemias, the need for effective treatment than for carcinomas, and other malignancies are present. 正常な休止B細胞(「Bリンパ球」とも言われる)の増殖は2つの異なる工程を含む。 Proliferation of normal resting B cells (also referred to as "B lymphocytes") involves two distinct steps. まず、休止細胞は活性化されて細胞周期のG 0期からG 1期に移行する。 First, resting cells to migrate is activated G 1 phase from G 0 phase of the cell cycle. 例えば、Albertsら(1989年編) Molecular Biology of the Cell Garland Publ. ,NY;およびDarnellら(1990) Molecular Cell Biology Freeman,NYを参照のこと。 For example, Alberts et al. (1989 ed.) Molecular Biology of the Cell Garland Publ , NY;. And Darnell et al. (1990) Molecular Cell Biology Freeman, a reference that NY. 次に、活性化された細胞は誘導されて増殖する。 Next, the activated cells grow is induced. 例えば、Paul編(1989) Fu ndamental Immunology ,第2版,Raven Press,NY;および第3版を参照のこと。 For example, Paul ed. (1989) Fu ndamental Immunology, 2nd ed., Raven Press, NY; and see Third Edition. インターロイキン-1(IL-1)、IL-2、IL-4、IL-10、およびIL-13を含む、B細胞の増殖を誘導するいくつかの因子が同定されている。 Interleukin -1 (IL-1), IL-2, IL-4, IL-10, and the IL-13, several factors to induce proliferation of B cells has been identified. さらに、特定のB細胞表面分子に対する抗体がB細胞増殖を促進することが証明されている。 Furthermore, antibodies to specific B cell surface molecule promotes B cell proliferation has been demonstrated. T細胞(「T リンパ球」とも言われる)もまた、特定の因子によって増殖するように誘導される。 T cells (also referred to as "T lymphocytes") are also induced to proliferate by certain factors. その因子には、植物性血球凝集素、抗T細胞レセプターモノクローナル抗体、抗CD3モノクローナル抗体、および他の薬剤が含まれる。 Its factors include phytohemagglutinin, anti-T cell receptor monoclonal antibody, anti-CD3 monoclonal antibodies, and other agents. 多くの研究は、ヒトB細胞の増殖および発達の増殖因子レセプターおよび重要なレギュレーターとしてのCD40分子に関係する。 Many studies, related to the CD40 molecule as a growth factor receptor and an important regulator of human B cell growth and development. Bリンパ球は、Bリンパ球の表面上のCD40分子と、活性化ヘルパーT細胞上に一時的に発現されるリガンドとの相互作用によって活性化される。 B lymphocytes, and CD40 molecules on the surface of B lymphocytes and activated by the interaction with a ligand that is transiently expressed in activated helper T cells. CD40は、正常なBリンパ球およびB細胞悪性疾患、鉗合細胞(interdigitating cell)、濾胞性樹状細胞、胸腺上皮細胞、およびいくつかのガン腫上に発現される膜結合型糖タンパク質である。 CD40 is a normal B lymphocytes and B cell malignancies, interdigitated cells (interdigitating cell), follicular dendritic cells, thymic epithelial cells, and some membrane-bound glycoprotein that is expressed on cancer on carcinoma . ヒトCD40は、ほぼ排他的にBリンパ球上に発現される、モノクローナル抗体のエピトープとして1985年に初めて同定された。 Human CD40 is expressed almost exclusively on B lymphocytes, it was first identified in 1985 as the epitope of monoclonal antibody. それゆえ、B細胞の有用なマーカーである。 Therefore, a useful marker for B cells. ヒトCD40抗原は45〜50Kdの糖タンパク質である。 Human CD40 antigen is a glycoprotein 45~50Kd. 抗CD40抗体は、ホルボールミリスチンアセテート(PMA)、抗CD20抗体、または抗免疫グロブリン抗体のいずれかによって誘導されるB細胞増殖の強力な共同刺激性シグナルを提供する。 Anti-CD40 antibody provides a potent co-stimulatory signal for B cell proliferation induced by either phorbol myristic acetate (PMA), anti-CD20 antibody or an anti-immunoglobulin antibody. 抗ヒトCD40抗体およびIL-4を活性化B細胞に添加するとまた、短期の複製、IgE合成の誘導、およびCD32でトランスフェクトされたL 細胞が培養物にさらに補充される場合は長期の増殖を含む多くの効果が生じる。 The addition of anti-human CD40 antibody and IL-4 to activated B cells also short replication, induction of IgE synthesis, and long-term proliferation when the L cells transfected with CD32 is further supplemented to the culture many effects, including occurs. B7(CD80)およびB70(CD86)は、B細胞とT細胞との相互作用を強く媒介する2 番目の「グループ」の分子である。 B7 (CD80) and B70 (CD86) is a molecule of a "group" second mediating strong interaction between B cells and T cells. B細胞上のこれらの分子は、T細胞上のそれらのリガンドであるCD28およびCTLA-4と相互作用する。 These molecules on B cells, interact with CD28 and CTLA-4 as their ligands on T cells. これらの相互作用は、B 細胞およびT細胞の両方の活性化のための主要な共剌激シグナルである。 These interactions are major co-stimulus signals for activation of both B cells and T cells. ここ15年間の間に、これら2対の表面分子がT細胞およびB細胞の活性化の際に基本的な機能を担うことが明らかになってきている。 Over the past 15 years, that the surface molecules of these two pairs play a fundamental function in the activation of T cells and B cells have become apparent. インビトロおよびインビボでの数多くの実験により、これら2対の分子が免疫抑制の重要な標的を提示することが実証されている。 Numerous experiments in vitro and in vivo, molecules of these two pairs is demonstrated to provide an important target for immunosuppression. 例えば、Banchereauら(1994) Ann For example, Banchereau et al. (1994) Ann. Rev. Rev. Immunol. l 2:881〜922;van Kootenら(1996) Adv . Immunol l 2: 881~922; van Kooten et al. (1996) Adv. Immunol. 61:1〜77;LinsleyおよびLedbe tter(1993) Ann Immunol 61:. 1~77; Linsley and Ledbe tter (1993) Ann. Rev. Rev. Immunol. 11:191〜212を参照のこと。 Immunol 11:. 191~212 see. 免疫抑制は、自己免疫疾患および移植中の移植片拒絶を予防および治療するのに非常に重要な免疫学的介入を示す。 Immunosuppression, a very important immunological intervention to prevent and treat transplant rejection autoimmune diseases and in transplantation. 免疫抑制は以下のものによって達成され得る:a)抗増殖剤(シクロホスファミド、15-デオキシスペルグアリン(15-deoxy spergualin)など);b)副腎皮質ステロイド;c)細胞内シグナル伝達プロセスのインヒビター(例えば、シクロスポリン);d)免疫抑制サイトカイン(例えば、TGF-β、IL-10);e)抗原による特異的寛容性誘導;ならびにf)Tリンパ球およびBリンパ球の活性化に関連する細胞表面分子の阻害(例えば、CD40 /CD40リガンド、およびCD28/CTLA-4とB7/B70)。 Immunosuppression may be achieved by what follows: a) anti-proliferative agents such as (cyclophosphamide, 15-deoxyspergualin (15-deoxy spergualin)); b) corticosteroids; c) intracellular signaling process inhibitors (eg, cyclosporine); d) immunosuppressive cytokines (e.g., TGF-β, IL-10); associated with activation of and f) T lymphocytes and B lymphocytes; e) specific tolerance induction by antigens inhibition of cell surface molecules (e.g., CD40 / CD40 ligand and CD28 / CTLA-4 and B7 / B70). 1995年には、RP105と呼ばれる別の分子がマウスの脾細胞からクローン化された。 In 1995, another molecule called RP105 was cloned from spleen cells of mice. Miyakeら(1995)「RP105,anovel B cell surface molecule implicated i n Bcell activation,is a member of the leucine-rich repeat protein famil y」 J Miyake et al. (1995) "RP105, anovel B cell surface molecule implicated i n Bcell activation, is a member of the leucine-rich repeat protein famil y " J. Immunol. 154:3333〜3340を参照のこと。 Immunol 154:. 3333~3340 see. RP105に対するモノクローナル抗体は、マウスB細胞の激しい増殖を誘導し、そして抗CD40抗体またはCD40リガンドと類似の様式でマウスB細胞を照射誘導アポトーシスから保護する。 Monoclonal antibody against RP105 induces vigorous proliferation of mouse B cells and protects mouse B cells from irradiation-induced apoptosis in a manner similar to the anti-CD40 antibody or CD40 ligand. Miyakeら(1994)「Murine B cell proliferation and protection from apoptosis with an antibody against a 105kDa molecule:Unresponsiveness of X-linked immu nodeficient B cells」 J Miyake et al. (1994) "Murine B cell proliferation and protection from apoptosis with an antibody against a 105kDa molecule: Unresponsiveness of X-linked immu nodeficient B cells " J. Exp. Exp. Med. 180:1217〜1224を参照のこと。 Med 180:. 1217~1224 see. RP105とその推定リガンドとは、T細胞およびB細胞の活性化において重要な役割を担っている3番目の分子対であり得る。 And its putative ligand RP105, may be the third pair of molecules that play an important role in the activation of T cells and B cells. しかし、これまでヒトの配列は入手不可能であり、そしてその構造および活性は未確認であった。 However, the sequence of the human so far are not available, and its structure and activity was unidentified. 本発明は、これらおよび他の多くの有用な進歩を提供する。 The present invention provides these and many other useful advances. 発明の要旨本発明は、以下からなる群より選択される組成物を提供する:ヒトBAS-1タンパク質またはそのフラグメントをコードする、単離された核酸または組換え核酸;実質的に純粋なBAS-1タンパク質またはそのペプチド;BAS-1タンパク質の配列を含む融合タンパク質;および組換え霊長類BAS-1タンパク質または精製された霊長類BAS-1タンパク質に対して惹起される抗体。 SUMMARY OF THE INVENTION The present invention provides a composition selected from the group consisting of: encoding human BAS-1 protein or fragments thereof, isolated or recombinant nucleic acid; substantially pure BAS- 1 protein or peptide; antibodies raised against and recombinant primate BAS-1 protein or purified primate BAS-1 protein; fusion protein comprising the sequence of BAS-1 protein. 単離された核酸または組換え核酸の実施態様において、核酸は配列番号1に規定される配列を含み得る。 In embodiments of the isolated or recombinant nucleic acid, the nucleic acid may comprise a sequence defined in SEQ ID NO: 1. タンパク質の実施態様では、タンパク質は実質的に純粋なBAS-1タンパク質もしくはそのペプチドであり得るか、または以下からなる群より選択され得る:ヒトを含む霊長類由来のタンパク質またはペプチド;配列番号2で規定される少なくとも1つのポリペプチドセグメントを含む、タンパク質またはペプチド;天然のBAS-1タンパク質と異なる翻訳後の修飾パターンを示す、タンパク質またはペプチド;BAS-1の細胞内ドメインを欠いているタンパク質。 In embodiments of the protein, the protein may be selected from the group consisting of or may be a substantially pure BAS-1 protein or peptide thereof, or the following: a protein or peptide from a primate, including a human; SEQ ID NO: 2 natural BAS-1 protein and exhibits different post-translational modification patterns, protein or peptide; protein lacking the intracellular domain of BAS-1 in which at least one comprises a polypeptide segment, a protein or peptide as defined. そして、タンパク質は、タンパク質ならびに薬学的に受容可能なキャリアを含む組成物であり得る。 The protein may be a composition comprising a protein and a pharmaceutically acceptable carrier. 抗体の実施態様は、BAS-1タンパク質が、ヒト由来のタンパク質を含む霊長類タンパク質であるもの;抗体が配列番号2に規定されるペプチド配列に対して惹起されるもの;抗体が少なくとも約10μMのKdを示すもの;抗体がモノクローナル抗体であるもの;または抗体が標識されているものを含む。 Embodiments of the antibodies, BAS-1 protein, as a primate protein, including proteins derived from human; those antibodies are raised against a peptide sequence defined in SEQ ID NO: 2; antibodies of at least about 10μM indicate a kd; what antibody is a monoclonal antibody; or antibody including those labeled. さらなる実施態様は、抗体が、B細胞の激しい増殖を誘導するもの;および/またはB細胞を照射誘導アポトーシスまたはステロイドホルモン誘導アポトーシスから保護するものを含む。 Additional embodiments include antibodies, intended to induce vigorous proliferation of B cells; and / or include protects B cells from irradiation-induced apoptosis or steroid hormone-induced apoptosis. 本発明はまた、例えば以下のものを含むキットを包含する:例えば、BAS-1タンパク質もしくはペプチドをコードする核酸;実質的に純粋なBAS-1タンパク質もしくはフラグメント;または、BAS-1タンパク質を特異的に結合する抗体もしくはレセプター。 The present invention also encompasses, for example, a kit including the following: For example, a nucleic acid encoding a BAS-1 protein or peptide; substantially pure BAS-1 protein or fragment; or, specifically BAS-1 protein antibody or receptor binds to. 核酸を含むキットは、配列番号1に規定されるコード配列を含み得る。 Kit comprising a nucleic acid may comprise a coding sequence defined in SEQ ID NO: 1. タンパク質またはフラグメントを含むキットについては、しばしばポリペプチドは以下からなる群より選択される:ヒトを含む霊長類由来のタンパク質またはペプチド;配列番号2に規定される少なくとも1つのポリペプチドセグメントを含む、タンパク質またはペプチド;および天然のBAS-1タンパク質と異なる翻訳後の修飾パターンを示す、タンパク質またはペプチド。 The kit comprising the protein or fragments, often the polypeptide is selected from the group consisting of: a protein or peptide from a primate, including a human; comprises at least one polypeptide segment defined in SEQ ID NO: 2, a protein or peptide; and showing the natural modification pattern after BAS-1 protein and different translations, protein or peptide. 別のキットは、抗体またはレセプターを含み得る。 Another kit can include an antibody or receptor. ここで、BAS-1タンパク質は、ヒト由来のタンパク質を含む霊長類のタンパク質であるか;抗体は配列番号2に規定されるペプチド配列に対して惹起されるか;抗体は少なくとも約10μM のKdを示すか;抗体はモノクローナル抗体であるか;または抗体は標識されている。 Here, BAS-1 protein, or a protein of primates, including proteins of human origin; the Kd of the antibody is at least about 10 [mu] M; or antibodies raised against a peptide sequence defined in SEQ ID NO: 2 or shows; antibody or a monoclonal antibody; or antibody is labeled. 本発明はまた、BAS-1の結合パートナーについてサンプルをスクリーニングする方法であって、精製されたBAS-1タンパク質または組換えBAS-1タンパク質を産生する工程、およびBAS-1タンパク質に対する結合パートナーの特異的結合についてサンプルにおいてスクリーニングする工程を包含する方法を提供する。 The present invention also provides a method of screening a sample for a binding partner of BAS-1, purified BAS-1 protein or recombinant BAS-1 protein producing process, and BAS-1 specific binding partner for the protein It provides a method comprising screening the sample for binding. 特定の実施態様では、サンプルは、T細胞、濾胞性樹状細胞を含む樹状細胞、または線維芽細胞、内皮細胞、および上皮細胞を含む支質細胞に由来するタンパク質を含む。 In certain embodiments, the sample comprises T cells, dendritic cells, including follicular dendritic cells or fibroblasts, and proteins from stroma cells, including endothelial cells and epithelial cells. 他の実施態様では、結合パートナーは抗体であり、そしてサンプルはハイブリドーマ上精である。 In other embodiments, the binding partner is an antibody and the sample is a hybridoma fine. 本発明の他の局面は、細胞をBAS-1タンパク質のアゴニストまたはアンタゴニストと接触させる工程を包含する、細胞の生理機能または発達を調節する方法を含む。 Another aspect of the present invention, comprising contacting the cells with an agonist or antagonist of BAS-1 proteins, including methods of modulating physiology or development of a cell. 代表的には、生理機能は以下から選択される:免疫抑制;細胞傷害性殺傷の活性化;サイトカイン産生の調節;またはリンパ腫の増殖。 Typically, physiology is selected from: immunosuppression; activation of cytotoxic killing; modulation of cytokine production; or proliferation of lymphoma. アンタゴニストはしばしば、霊長類のBAS-1タンパク質に対する抗体である。 Antagonist is often an antibody against BAS-1 protein primate. そして方法は、このようなものを、抗原レセプター、CD40:CD40リガンド経路、またはCD28/CTLA-4:B 7/B70経路を通してのシグナルのメディエーター(例えば、抗CD3、抗CD40、抗CD 40リガンド、抗CD28、抗CTLA-4、抗B7、抗B70、または適切な表面シグナル伝達分子の可溶性部分)とともに含み得る。 The method such as, antigen receptor, CD40: CD40 ligand pathway, or CD28 / CTLA-4,: mediators of signaling through B 7 / B70 pathway (e.g., anti-CD3, anti-CD40, anti-CD 40 ligand, anti CD28, anti-CTLA-4, anti-B7, may comprise with soluble portion) of the anti-B70 or appropriate surface signaling molecule. 発明の詳細な説明 I. Detailed Description I. of invention 総論 本発明は、活性化抗原の特性を示すヒトのタンパク質のアミノ酸配列およびDN A配列を提供する。 General The present invention provides amino acid sequences and DN A sequence of the human protein showing the characteristics of activation antigens. このタンパク質は、B細胞活性化および生存抗原-1(B cell Activation and Survival antigen-1)(BAS-1)と命名される。 This protein, B cell activation and survival antigen -1 (B cell Activation and Survival antigen-1) is designated as (BAS-1). 本明細中に記載される霊長類の配列は、マウス遺伝子が初めに記載された後に得られた。 Sequences of primate described herein was obtained after a mouse gene was originally described. Miyakeら(1995) J Miyake et al (1995) J. Immunol. 154:3333〜3340を参照のこと。 Immunol 154:. 3333~3340 see. 他の霊長類種のタンパク質についての同様の配列もまた利用可能であるはずである。 Similar sequences for other primate species of proteins should also be available. 以下の記載は、例示の目的で記載したヒトBAS-1の天然の対立遺伝子に関するが、例えば他の個体からの対立遺伝子改変体および/または多型改変体、ならびに例えば天然型のスプライシング改変体にも同様に適用可能である。 The following description is directed to the allele of the human BAS-1 natural described for illustrative purposes, for example, allelic variants and / or polymorphic variants from other individuals, as well as for example, splice variants of the native it is also equally applicable. これらの遺伝子は、さらに記載した特定の実施態様を越えてファミリーを拡張する、これに関連するタンパク質をコードする他の霊長類遺伝子の単離を可能にする。 These genes, extends the family beyond the specific embodiments further described, to enable the isolation of other primate genes encoding related proteins thereto. その手順を下記におおまかに示す。 Roughly shows the procedure below. ヒトB細胞活性化および生存Ag-1(Human B cell Activation and Survival A g-1)(BAS-1)は、その生物学的活性によりそう命名された。 Human B cell activation and survival Ag-1 (Human B cell Activation and Survival A g-1) (BAS-1), it was so named by its biological activity. マウスホモログであるRP105に対するモノクローナル抗体は、マウスB細胞の激しい増殖を誘導し、 そしてマウスB細胞を抗CD40抗体またはCD40リガンドと同様の様式で照射誘導アポトーシスから保護する。 Monoclonal antibody against a mouse homolog RP105 induces vigorous proliferation of mouse B cells and protects mouse B cells from irradiation-induced apoptosis in a manner similar to the anti-CD40 antibody or CD40 ligand. ヒトBAS-1cDNAを、マウスRP105由来の配列に基づく核酸配列を用いて単離した。 Human BAS-1 cDNA, was isolated using nucleic acid sequences based on sequences from the mouse RP105. 対応するコードされたタンパク質の分析によって、ヒトBAS-1が、ロイシンリッチモチーフを含有するタンパク質のファミリーのメンバーであることが示される。 Analysis of the corresponding encoded proteins, human BAS-1 is shown to be a member of a family of proteins containing leucine-rich motifs. このファミリーの他のメンバーには、CD14-LPSレセプター、FSH/LH/TSHレセプター、およびニューロトロフィン(neurotropin)レセプターが含まれる。 Other members of this family include the CD14-LPS receptor, FSH / LH / TSH receptors, and neurotrophin (neurotropin) receptor. これらのレセプターはシグナル伝達に関与するようである。 These receptors appear to be involved in signal transduction. ヒトBAS-1cDNAは、マウスRP105の種々の領域からの配列を用いて推定された。 Human BAS-1 cDNA was estimated using sequences from various regions of mouse RP105. マウスBAS-1オープンリーディングフレームとヒトBAS-1オープンリーディングフレームとの間の相同性比較は、マウスRP105との約67%のDNA配列同一性および約73%のアミノ酸配列同一性を示す。 Homology comparison between mouse BAS-1 open reading frame with human BAS-1 open reading frame represents about 67% of the DNA sequence identity and about 73% amino acid sequence identity with the murine RP105. ヒトBAS-1はまた、免疫系以外、例えば、他の細胞型における発達調節に機能的役割を有し得る。 Human BAS-1 may also, except the immune system, for example, may have a functional role in the development regulation in other cell types. 例えば、Gilbert(1991) Developmental Biology (第3版),S inauer Associates,Sunderland,MA;Browderら(1991) Developmental Biology (第3版),Saunders,Philadelphia,PA.;Russoら(1992) Development:The Mol ecular Genetic Approach ,Springer-Verlag,New York,NY;およびWilkins( 1993) Genetic Analysis of Animal Development (第2版)Wiley-Liss,New York ,NY. For example, Gilbert (1991) Developmental Biology (3rd edition), S inauer Associates, Sunderland, MA; Browder et al. (1991) Developmental Biology (3rd Edition), Saunders, Philadelphia, PA; Russo et al. (1992) Development:. The Mol ecular Genetic Approach, Springer-Verlag , New York, NY; and Wilkins (1993) Genetic Analysis of Animal Development ( second edition) Wiley-Liss, New York, NY. を参照のこと。 checking ... ヒトBAS-1のリガンドを同定することはこれらの知見から生じるいくつかの疑問と取り組むのに役立ち得る。 Identifying a ligand of the human BAS-1 may help to address the some of the questions that arise from these findings. 11. 11. 精製ヒトBAS-1 配列番号1は、cDNAのヌクレオチド配列および対応するアミノ酸配列を開示する。 Purified human BAS-1 SEQ ID NO: 1 discloses the nucleotide and corresponding amino acid sequence of the cDNA. アミノ酸配列は、配列番号2にも示す。 The amino acid sequence is also shown in SEQ ID NO: 2. シグナル配列はmet(1)からval(2 0)におよぶようであり;アミノ隣接領域はcys(28)からleu(58)におよび、それはアスパラギン(残基34、53)における2つの潜在的なN結合型グリコシル部位を含み;ロイシンリッチモチーフのタンデム反復はthr(55)からtyr(592)におよび、 それはアスパラギン(残基70、78、201、234、244、394、402、451、および573) におけるN結合型グリコシル化の9つの潜在的部位を含み;カルボキシ隣接領域はleu(574)からcys(625)におよび;膜貫通領域はala(629)からval(650)におよび;細胞内領域はlys(651)からphe(661)におよび、それはtyr(652および658)における2つの潜在的リン酸化部位を含む。 The signal sequence is like spans val (2 0) from the met (1); amino flanking region from and cys (28) to leu (58), which is two potential in asparagine (residues 34,53) N-linked include glycosylation site; tandem repeats of leucine-rich motifs from and thr (55) to tyr (592), which is asparagine (residues 70,78,201,234,244,394,402,451, and 573 includes nine potential sites of N-linked glycosylation in); the carboxy flanking region and the cys (625) from leu (574); a and val (650) transmembrane region from ala (629); intracellular region spans from lys (651) to phe (661), which includes two potential phosphorylation sites in tyr (652 and 658). 以下の表は、配列番号2に示されるヒトBAS-1タンパク質のロイシンリッチ反復のアラインメントを示す。 The following table shows the alignment of the leucine-rich repeats of the human BAS-1 protein shown in SEQ ID NO: 2. 表1 Table 1 本明細書中で用いる用語「ヒトBAS-1」は、タンパク質の文脈で用いる場合は、配列番号2に示すアミノ酸配列を有するタンパク質をいう。 As used herein, the term "human BAS-1" when used in the context of a protein refers to a protein having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2. 本発明はまた、その実質的フラグメント(例えば、変異体および多型改変体)を、ヒトBAS-1特異的結合成分と同じ生物学的機能または生物学的相互作用を示すヒト由来ポリペプチドとともに含むタンパク質を包含する。 The present invention also provides a substantial fragment (e.g., mutants and polymorphic variants), and together with human-derived polypeptide exhibiting the same biological function or interacts with human BAS-1 specific binding It encompasses proteins. これらの結合成分は代表的には、ヒトBAS-1に高親和性(例えば、少なくとも約100nM、通常約30nMより良好、好ましくは約10nMより良好、そしてより好ましくは約3nMより良好)で結合する。 These binding components typically bind with high affinity to human BAS-1 (e.g., at least about 100 nM, usually better than about 30 nM, preferably better than about 10 nM, and more preferably better than about 3 nM) . 相同タンパク質は、ヒトとは異なる種、例えば霊長類で見い出される。 Homologous proteins are found in different species, for example, primate and human. 本明細書中で用いる用語「ポリペプチド」は、フラグメントまたはセグメントを含み、そして以下の長さのアミノ酸残基を含む:少なくとも約8アミノ酸、一般的に少なくとも10アミノ酸、より一般的には少なくとも12アミノ酸、しばしば少なくとも14アミノ酸、より頻繁には少なくとも16アミノ酸、代表的には少なくとも約18アミノ酸、より代表的には少なくとも約20アミノ酸、通常少なくとも約22アミノ酸、より通常には少なくとも約24アミノ酸、好ましくは少なくとも約26 アミノ酸、より好ましくは少なくとも約28アミノ酸、そして特に好ましい実施態様では少なくとも約30以上(例えば、33、37、41、45、49、53、57など)のアミノ酸。 The term "polypeptide" as used herein includes a fragment or segment, and includes the following length amino acid residues: at least about 8 amino acids, generally at least 10 amino acids, more generally at least 12 amino, often at least 14 amino acids, more often at least 16 amino acids, at least about 18 amino acids typically, more typically at least about 20 amino acids, usually at least about 22 amino acids, more usually at least about 24 amino acids, preferably amino acids, at least about 26 amino acids, more preferably at least about 28 amino acids, and at least about 30 or more in a particularly preferred embodiment (e.g., 33,37,41,45,49,53,57). 用語「リガンド」または「結合組成物」は、例えば抗体-抗原型様式でBAS-1に特異的に結合する分子をいう。 The term "ligand" or "binding composition" such as an antibody - refers to a molecule that specifically binds to BAS-1 antigen type fashion. 他の相互作用としては、例えば、リガンド-レセプター型、またはBAS-1と会合する化合物については、例えば、共有結合性もしくは非共有結合性のいずれかでのタンパク質-タンパク質相互作用が含まれる。 Other interactions, such as ligand - for receptor types, or BAS-1 and associated compounds, e.g., proteins with either covalent or non-covalent - include protein interactions. 分子は、ポリマーまたは化学試薬であり得る。 Molecule may be a polymer, or chemical reagent. BAS-1がリガンド-レセプター相互作用のリガンドまたはレセプターのいずれであるかについての暗示は示されず、 その相互作用以外には特異的な親和性を示す。 BAS-1 ligand - implication for whether it is a ligand or receptor receptor interaction is not shown, showing the specific affinity to than its interaction. 機能的なアナログは、構造的改変を有するリガンドであり得るか、または適当なリガンド結合決定基と相互作用する分子形状を有する全く無関係の分子であり得る。 Functional analog may be a completely unrelated molecule which has a molecular shape which interacts with possible or appropriate ligand binding determinants in a ligand with structural modifications. リガンドはアゴニストまたはアンタゴニストとして作用し得る。 Ligands may act as agonists or antagonists. 例えば、Goodmanら(編)(1990) Goodman For example, Goodman et al. (Eds.) (1990) Goodman & Gilman's:The Pharmacological Bases of Therapeutics (第8版),Pergamon Pressを参照のこと。 & Gilman's: The Pharmacological Bases of Therapeutics ( 8th ed.), See the Pergamon Press. ポリペプチドまたはフラグメントの溶解度は、環境およびポリペプチドに依存する。 Solubility of a polypeptide or fragment depends upon the environment and the polypeptide. 温度、電解質環境、ポリペプチドの大きさおよび分子的特徴、ならびに溶媒の性質を含む多くのパラメーターがポリペプチドの溶解度に影響をおよぼす。 Temperature, on the electrolyte environment, the polypeptides of the size and molecular characteristics, as well as an effect on the solubility of many parameters polypeptides comprising nature of the solvent. 代表的には、ポリペプチドが用いられる温度は約4℃〜約65℃の範囲である。 Typically, the temperature at which the polypeptide is used ranges from about 4 ° C. ~ about 65 ° C.. 通常、使用時の温度は約18℃より高く、より通常には約22℃より高い。 Normally, the temperature at the time of use is higher than about 18 ° C., more usually above about 22 ° C.. 診断目的のためには、温度は通常ほぼ室温以上であるが、アッセイにおける成分の変性温度以下である。 For diagnostic purposes, the temperature will usually although about room temperature or more, components of the denaturation temperature below in the assay. 治療目的のためには、温度は通常体温、代表的にはヒトについては約37℃であるが、特定の状況では、温度は、インサイチュまたはインビトロで上昇または下降され得る。 For therapeutic purposes, the temperature will usually body temperature, typically about 37 ° C. for humans, in certain circumstances, the temperature may be raised or lowered in situ or in vitro. 電解質は、通常、ほぼインサイチュの生理条件であるが、より高いかまたはより低い、都合のよいイオン強度に改変され得る。 The electrolyte is usually a substantially situ physiological conditions, higher or lower, may be modified in good ionic strength convenient. 実際のイオンは、生理学的または分析的状況で用いられる標準緩衝液を満たすように改変され得る。 The actual ions may be modified to meet the standard buffer used in physiological or analytical contexts. ポリペプチドの大きさおよび構造は、一般的に実質的に安定な状態にあり、そして通常は変性状態ではない。 The size and structure of polypeptides is typically located in a substantially stable state, and usually not in a denatured state. ポリペプチドは、例えば溶解性を与えるために4 次構造で他のポリペプチドと会合し得るか、または天然の脂質二重層相互作用に近い様式で脂質もしくは界面活性剤と会合し得る。 Polypeptide associated with lipids or detergents in other polypeptides or may be associated, or style approximates natural lipid bilayer interactions quaternary structure to provide solubility for example. 特に、天然のタンパク質はしばしばPI結合を通じて脂質に連結すると考えられる。 In particular, native protein are often considered to be coupled to the lipid through PI binding. 溶媒は通常、生物学的活性を保護するために用いられるタイプの生物学的に適合性の緩衝液であり得、そして通常生理学的溶媒に近づく。 The solvent is typically closer to it to obtain and usually physiological solvents, the type of biologically compatible buffer used to protect biological activity. 通常、溶媒は、中性のpH、代表的には約5と10との間、そして好ましくは約7.5を有する。 Normally, the solvent will have a neutral pH, between typically about 5 to 10 and preferably about 7.5. いくつかの場合において、界面活性剤が添加される。 In some cases, a surfactant is added. その界面活性剤は、代表的には穏和な非変性界面活性剤(例えばCHS(コレステリルヘミスクシネート)もしくはCHAPS( 3-([3-コラミドプロピル]ジメチルアンモニオ)-1-プロパンスルホン酸)であるか、またはタンパク質の3次構造を破壊しないのに十分に低い界面活性剤濃度である。 溶解度は、特定の条件下での分子の沈降速度の尺度である、Svedberg単位によって測定される沈降に反映される。沈降速度の決定は、古典的には分析用超遠心分離機で実施されたが、現在では代表的には標準的超遠心分離機で実施される。 Freifelder(1982) Physical Biochemistry (第2版),WH.Freeman;ならびにCantorおよびSchimmel(1980) Biophysical Chemistry ,第1〜3部,WH.Freem an & Co.,San Franciscoを参照のこと。大雑把な決定法としては、おそらく可溶性のポリペプチドを含有するサン The surfactant is typically a mild non-denaturing detergent (e.g. CHS (cholesteryl hemisuccinate) or CHAPS (3 - ([3- cholamidopropyl] dimethylammonio) -1-propanesulfonic acid) or it is, or is sufficiently low surfactant concentrations to not disrupt the tertiary structure of the protein. solubility is a measure of the sedimentation velocity of a molecule under particular conditions, sedimentation measured by Svedberg units is reflected in. the determination of the sedimentation velocity is classically been carried out in an analytical ultracentrifuge, the current typically is carried out in a standard ultracentrifuge. Freifelder (1982) Physical Biochemistry (second edition), WH.Freeman;. and Cantor and Schimmel (1980) Biophysical Chemistry, first to third parts, WH.Freem an & Co., see San Francisco as rough determination method is probably soluble San containing the polypeptide of プルを、標準的な普通の大きさの超遠心分離機において約10分間で約50Krpmで回転させると、可溶性分子は上清に残る。可溶性粒子またはポリペプチドは、代表的には約30S未満、より代表的には約15S未満、通常約10S未満、より通常には約6S未満、そして特定の実施態様では、好ましくは約4S未満、そしてより好ましくは約3S未満である。 III.物理的改変体 本発明はまた、ヒトBAS-1のアミノ酸配列に実質的なアミノ酸配列同一性を有する、タンパク質またはペプチドを包含する。これは、例えば、1倍、2倍、および3倍の保存的置換を包含する。好ましくは、置換は、保存されたシステインから離れており、そしてしばしば、ヘリックス構造ドメインから離れた領域に存在する。このような改変体は、特異的抗体を産生するために有用であり得、 A pull, is rotated at about 50Krpm in ultracentrifuge standard normal size in about 10 minutes, the soluble molecules will remain in the supernatant. A soluble particle or polypeptide will typically less than about 30S, more typically less than about 15S, usually less than about 10S, more usually less than about 6S, and in certain embodiments, preferably less than about 4S, and more preferably less than about 3S. III. physical modifications body invention also have substantial amino acid sequence identity to the amino acid sequence of the human BAS-1, including a protein or peptide. This includes, for example, 1-fold, 2-fold, and 3-fold conservative substitutions encompasses. preferably, substitution is spaced from a conserved cysteine, and often are present in the region away from the helical structural domains. such variants are useful to produce specific antibodies obtained, してしばしば多くまたは全ての生物学的特性を共有する。 アミノ酸配列同一性は、残基の適合を最適化することにより決定される。これは、保存的置換を適合として考慮する場合、変化する。保存的置換は、代表的には、以下のグループ内の置換を含む:グリシン、アラニン;バリン、イソロイシン、ロイシン;アスパラギン酸、グルタミン酸;アスパラギン、グルタミン;セリン、スレオニン;リジン、アルギニン;およびフェニルアラニン、チロシン。 同様のアミノ酸配列は、各それぞれのタンパク質配列における天然の対立遺伝子変異を含むことが意図される。 And often more or share all biological properties. Amino acid sequence identity is determined by optimizing the fit of residues. This when considering conservative substitutions as adaptation, changes . conservative substitutions typically include substitutions within the following groups: glycine, alanine; valine, isoleucine, leucine; aspartic acid, glutamic acid; asparagine, glutamine; serine, threonine; lysine, arginine; and phenylalanine, tyrosine. similar amino acid sequences are intended to include natural allelic variations in each respective protein sequence. 代表的な相同性タンパク質またはペプチドは、ヒトBAS-1のアミノ酸配列と、85〜100%同一性(ギャップが導入され得る場合)から90〜100%同一性(保存的置換が含まれる場合)までを有する。 Typical homologous proteins or peptides, the amino acid sequence of the human BAS-1, up to 90% to 100% identity from 85-100% identity (if gaps can be introduced) (if conservative substitutions are included) having. 同一性の尺度は、少なくとも約85%、一般に少なくとも約87%、しばしば少なくとも約89%、 代表的には少なくとも約91%、通常は少なくとも約93%、より通常は少なくとも約95%、好ましくは少なくとも約97%、そしてより好ましくは少なくとも約98% 、そして特に好ましい実施態様では、少なくとも約99%以上である。 Identity measures will be at least about 85%, generally at least about 87%, often at least about 89%, typically at least about 91%, usually at least about 93%, more usually at least about 95%, preferably at least about 97%, and more preferably at least about 98%, and in particularly preferred embodiments, at least about 99%. Needleham ら(1970) J Needleham et al (1970) J. Mol. Mol. Biol. 48:443-453;Sankoffら(1983) Time Warps ,String Edi ts ,and Macromolecules:The Theory and Practice of Sequence Comparison第1章Addison-Wesley,Reading,MA;およびIntelliGenetics,Mountain View,C Aソフトウエアパッケージ;ならびにUniversity of Wisconsin Genetics Comput er Group,Madison,WIもまた参照のこと。 Biol 48:. 443-453; Sankoff et al. (1983) Time Warps, String Edi ts, and Macromolecules: The Theory and Practice of Sequence Comparison Chapter 1 Addison-Wesley, Reading, MA; and IntelliGenetics, Mountain View, CA software package; as well as the University of Wisconsin Genetics Comput er Group, Madison, WI see also. 単離されたヒトBAS-1 DNAは、ヌクレオチド置換、ヌクレオチド欠失、ヌクレオチド挿入、およびヌクレオチドストレッチの逆位により容易に改変され得る。 Isolated human BAS-1 DNA nucleotide substitutions, nucleotide deletions, nucleotide insertions, and can be readily modified by inversion of nucleotide stretches. これらの改変は、有用な抗原、それらの誘導体、または類似もしくはアンタゴニスト活性を有するタンパク質をコードする新規なDNA配列をもたらす。 These modifications result in novel DNA sequences which encode useful antigens, their derivatives, or proteins having similar or antagonist activity. これらの改変された配列を用いて、変異体抗原を産生し得るかまたは発現を増強し得る。 Using these modified sequences may enhance or expression capable of producing mutant antigen. 増強された配列は、遺伝子増幅、増加した転写、増加した翻訳、および他の機構に関与し得る。 Enhanced sequence, gene amplification, increased transcription, may involve increased translation, and other mechanisms. このような変異体BAS-1誘導体は、それぞれのタンパク質またはそのフラグメントの予め決定されたかまたは部位特異的な変異を含む。 Such variants BAS-1 derivatives include predetermined or site-specific mutations of the respective protein or its fragments. 「変異体BAS-1」は、その他の点では上記で示したようなヒトBAS-1の重要な特徴を共有するが、欠失、置換、または挿入のいずれかにより、天然に見出されるようなBAS- 1のアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドを包含する。 "Mutant BAS-1", such as but is otherwise share the human BAS-1 of the key features as indicated above, deletion, substitution, or by any insertion, are found in nature BAS- encompasses polypeptides having an amino acid sequence different from the first amino acid sequence. 特に、「部位特異的変異体BAS-1」は、配列番号2に規定される抗原に相同性を有し、そしてこれらの抗原と種々の生物学的活性を共有すると定義される。 In particular, "site specific mutant BAS-1" has a homology to the antigen defined in SEQ ID NO: 2, and is defined to share these antigens with various biological activities. 同様の概念が、異なるBAS-1タンパク質、特に、種々の他の霊長類に見出されるBAS-1タンパク質にも適用される。 Similar concepts, different BAS-1 protein, in particular, applies to BAS-1 protein found in a variety of other primates. 以前に言及したように、説明は一般に、特に議論されたヒトの実施態様のみに限定されず、さらなるBAS-1タンパク質を包含することを意味することが強調される。 As mentioned previously, described generally, without being limited only to the particular embodiment of human discussed, it is meant to encompass additional BAS-1 protein is highlighted. 部位特異的変異部位が予め決定されていても、変異体は部位特異的である必要はない。 Even if site-specific mutation sites are predetermined, mutants need not be site specific. ヒトBAS-1変異誘発は、アミノ酸の挿入または欠失を作製することにより実施され得る。 Human BAS-1 mutagenesis can be conducted by making amino acid insertions or deletions. 置換、欠失、挿入、または任意の組合せは、最終構築物で達成されるように作製され得る。 Substitutions, deletions, insertions, or any combination may fabricated to be achieved in the final construct. 挿入は、アミノ末端またはカルボキシ末端での融合を含む。 Insertions include fusion at the amino or carboxy terminus. ランダム変異誘発は標的コドンで実施され得、次いで発現された変異体は、所望の活性についてスクリーニングされ得る。 Random mutagenesis obtained is conducted at the target codon and then the expressed mutants can be screened for the desired activity. 公知の配列を有するDNAにおいて予め決定された部位での置換変異を作製するための方法は、当該分野で周知であり、例えば、M13プライマー変異誘発による。 Methods for making substitution mutations at predetermined sites in DNA having a known sequence are well known in the art, e.g., by M13 primer mutagenesis. Sambrookら(1989)およびAus ubelら(1987および補遺)もまた参照のこと。 Sambrook et al. (1989) and Aus Ubel et al. (1987 and Supplements) See also. DNAにおける変異は、通常、コード配列をリーディングフレームの外側に配置するべきではなく、そして好ましくは、ハイブリダイズしてループまたはヘアピンのような二次RNA構造を生じ得る相補鎖を生じない。 Mutations in DNA is normally should not place the coding sequence to the outside of the reading frame and preferably no complementary strand may result in secondary RNA structures, such as loops or hairpins hybridize. 本発明はまた、組換えタンパク質(例えば、これらのタンパク質由来のセグメントを用いた非相同融合タンパク質)を提供する。 The present invention also provides recombinant proteins (e.g., heterologous fusion proteins using segments from these proteins) provides. 非相同融合タンパク質は、天然では通常は同じ様式では融合しないタンパク質またはセグメントの融合体である。 Heterologous fusion protein is a natural usually a fusion of proteins or segments which are not fused in the same manner. 従って、免疫グロブリンとBAS-1ポリペプチドとの融合産物は、代表的には単一の翻訳産物として作製され、そして各供給源ペプチドに由来する特性を示す、代表的なペプチド結合で融合された配列を有する、連続するタンパク質分子である。 Thus, the fusion product of an immunoglobulin with BAS-1 polypeptide, typically is made as a single translation product and exhibiting properties derived from each source peptide fused in a typical peptide bond having the sequence, a protein molecule successively. 同様の概念は、非相同核酸配列に適用される。 A similar concept applies to heterologous nucleic acid sequences. さらに、新規な構築物は、他のタンパク質由来の同様の機能的ドメインを組み合わせることにより作製され得る。 Furthermore, the novel constructs may be made by combining similar functional domains from other proteins. 例えば、リガンド結合セグメントまたは他のセグメントは、異なる新規な融合ポリペプチドまたはフラグメント間で「交換( swap)」され得る。 For example, ligand-binding or other segments may be "swapped (swap)" between different new fusion polypeptides or fragments. 例えば、Cunninghamら(1989) Science 243:1330-1336;およびO'Dowdら(1988) J For example, Cunningham et al. (1989) Science 243: 1330-1336; and O'Dowd, et al. (1988) J. Biol. Biol. Chem. 263:15985-15992を参照のこと。 Chem 263:. 15985-15992 see. 従って、特異性の新規な組合せを示す新規なキメラポリペプチドは、リガンド結合特異性および他の機能的ドメインの機能的連結から生じる。 Accordingly, novel chimeric polypeptides exhibiting new combinations of specificities will result from the functional linkage of ligand-binding specificities and other functional domains. BeaucageおよびCarruthers(1981) Tetra Beaucage and Carruthers (1981) Tetra. Letts. 22:1859-1862により記載されたホスホルアミデート法は、適切な合成DNAフラグメントを生じる。 Letts 22:. Phosphoramidate method described by 1859-1862 produces a suitable synthetic DNA fragments. 2本鎖フラグメントは、しばしば、相補鎖を合成し、そしてこの鎖を適切な条件下で一緒にアニールさせること、または適切なプライマー配列とともにDNAポリメラーゼを用いて相補鎖を付加することのいずれかにより得られる。 Double-stranded fragments are often synthesized complementary strand, and by either adding the complementary strand using DNA polymerase with together be annealed to, or appropriate primer sequence of this strand under appropriate conditions can get. IV. IV. 機能的改変体 BAS-1抗原に対する生理学的応答のブロッキングは、おそらく、競合的阻害を通してのBAS-1へのリガンドの結合の阻害から生じ得る。 Blocking of physiological response to functional variant BAS-1 antigen, probably may result from the inhibition of binding of a ligand to BAS-1 through competitive inhibition. 従って、本発明のインビトロアッセイは、しばしば、単離されたタンパク質、組換え体BAS-1を発現する細胞由来の膜、これらの抗原のリガンド結合セグメントを含む可溶性フラグメント、または固相基体に結合されたフラグメントを使用する。 Thus, in vitro assays of the present invention will often use isolated protein, membranes from cells expressing a recombinant BAS-1, coupled to a soluble fragment or solid substrate, comprising the ligand binding segments of these antigens using the fragment. これらのアッセイはまた、結合セグメントの変異および改変、またはリガンドの変異および改変( 例えば、リガンドアナログ)のいずれかの影響の診断的決定を可能にする。 These assays will also mutations and modifications mutations and modifications, or ligand binding segments (e.g., ligand analog) to enable diagnostic determination of any of the effects of. 本発明はまた、競合的薬物スクリーニングアッセイ(例えば、ここで抗原または抗原フラグメントに対する中和抗体が、このタンパク質への結合について試験化合物と競合する)の使用を意図する。 The present invention also provides competitive drug screening assays (e.g., where neutralizing antibodies to antigen or antigen fragment, the binding will compete with a test compound to the protein) contemplates the use of. このようにして、抗体を用いて、抗原の1つ以上の結合部位を共有する任意のポリペプチドの存在を検出し得、そしてまたこれを用いて、そうでなければリガンドにより占有され得る、タンパク質上の結合部位を占有し得る。 In this way, using an antibody, any of the detected resulting the presence of a polypeptide which shares one or more binding sites of the antigen, and also with this, may be occupied by a ligand Otherwise, protein It may occupy binding sites on. さらに、BAS-1に対する中和抗体および高親和性リガンド結合部位を含むBAS-1 の可溶性フラグメントを用いて、組織(例えば、異常な生理現象を経験した組織)におけるリガンド機能を阻害し得る。 Further, by using a soluble fragment of BAS-1, including neutralizing antibodies and high affinity ligand binding site for BAS-1, tissue (e.g., experiencing abnormal physiology tissue) can inhibit ligand function in. BAS-1抗原の「誘導体」は、アミノ酸配列変異体、グリコシル化改変体、および他の化学的部分との共有結合体または集合性結合体を含む。 "Derivatives" of BAS-1 antigens include amino acid sequence mutants, glycosylation variants, and covalent or aggregate of conjugates with other chemical moieties. 共有結合誘導体は、当該分野で周知である手段による、BAS-1抗原アミノ酸側鎖に見出される基、 またはN末端もしくはC末端への機能性の結合により調製され得る。 Covalent derivatives, by means well known in the art, may be prepared by coupling of the functionality of the group or the N-terminus or C-terminus is found to BAS-1 antigen amino acid side chains. これらの誘導体は、カルボキシル末端またはカルボキシル側鎖を含む残基の脂肪族エステルまたはアミド、水酸基含有残基のO-アシル誘導体、およびアミノ末端アミノ酸またはアミノ基含有残基(例えば、リジンまたはアルギニン)のN-アシル誘導体を含み得るがこれらに限定されない。 These derivatives include aliphatic esters or amides of residues containing carboxyl terminus or carboxyl side chains, O- acyl derivatives of hydroxyl group-containing residues and an amino terminal amino acid or amino-group containing residues, (e.g., lysine or arginine) It may include N- acyl derivatives without limitation. アシル基は、C3〜C18の直鎖状アルキルを含み、それゆえアルカノイルアロイル種を形成するアルキル部分の群から選択される。 Acyl groups include linear alkyl C3~C18, is selected from the group of alkyl moieties forming the thus alkanoyl aroyl species. 特に、例えば、ポリペプチドの合成およびプロセシングの間のそのグリコシル化パターンを改変することにより、またはさらなるプロセシング工程において作製されたグリコシル化の変更が含まれる。 In particular, for example, it includes the by modifying the glycosylation patterns, or change the created glycosylation in further processing steps during the synthesis and processing of the polypeptide. 特に好ましい、これを達成するための手段は、ポリペプチドを、通常そのようなプロセシングを提供する細胞由来のグリコシル化酵素(例えば、ヒトグリコシル化酵素)に曝露することによる。 Particularly preferred, the means of achieving this, the polypeptide, typically by exposure to glycosylating enzymes derived from cells that provide such processing (e.g., human glycosylation enzymes). 脱グリコシル化酵素もまた意図される。 Deglycosylation enzymes are also contemplated. リン酸化アミノ酸残基(例えば、ホスホチロシン、ホスホセリン、またはホスホスレオニン)を含む他のマイナーな改変を有する、同じ一次アミノ酸配列のバージョンもまた包含される。 Phosphorylated amino acid residues (e.g., phosphotyrosine, phosphoserine, or phosphothreonine,) have other minor modifications, including a version of the same primary amino acid sequence are also encompassed. 誘導体の主要な群は、BAS-1抗原またはそのフラグメントと他のタンパク質またはポリペプチドとの共有結合体である。 Major group of derivatives are covalent conjugates of the BAS-1 antigen or fragments with other proteins or polypeptides thereof. これらの融合体は、組換え培養において(例えば、N末端融合体またはC末端融合体)、または反応性側鎖基を通してタンパク質を架橋する際のそれらの有用性について当該分野で公知である薬剤の使用により合成され得る。 These fusions in recombinant culture (e.g., N-terminal fusions or C-terminal fusions), or for their utility in cross-linking proteins through reactive side chain groups of agents known in the art It may be synthesized by use. 架橋剤を有する好ましいリガンド誘導体化部位は、遊離のアミノ基、炭水化物部分、およびシステイン残基においてである。 Preferred ligands derivatization sites with cross-linking agents are at free amino groups, carbohydrate moieties, and is in the cysteine ​​residues. BAS-1抗原と他の相同または非相同タンパク質との間の融合ポリペプチドもまた提供される。 Fusion polypeptides between the BAS-1 antigens and other homologous or heterologous proteins are also provided. 相同ポリペプチドは、例えば、1つ以上のマーカータンパク質のリガンド特異性を示すハイブリッドタンパク質となる、異なる表面マーカー間の融合体であり得る。 Homologous polypeptides may, for example, a hybrid protein that indicates the ligand specificity of one or more marker proteins may be fusions between different surface markers. 同様に、誘導体タンパク質の特性または活性の組合せを示す非相同融合体が構築され得る。 Likewise, heterologous fusions exhibit a combination of properties or activities of the derivative proteins can be constructed. 代表例は、レポーターポリペプチド(例えば、ルシフェラーゼ)と、抗原のセグメントまたはドメイン(例えば、リガンド結合セグメント)との融合体であり、その結果、所望のリガンドの存在または位置が容易に決定され得る。 Representative examples are a reporter polypeptide (e.g., luciferase), segment or domain of an antigen (e.g., ligand-binding segment) is a fusion with, so that the presence or location of a desired ligand may be easily determined. 例えば、Dullら,米国特許第4,859,609号(これは、これによって本明細書中に参考として援用される)を参照のこと。 , Eg, Dull, et al., U.S. Patent No. 4,859,609 (which is hereby incorporated by reference herein) to see. 他の遺伝子融合パートナーは、細菌性β-ガラクトシダーゼ、trpE、プロテインA、β-ラクタマーゼ、αアミラーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、および酵母α接合因子を含む。 Other gene fusion partners include bacterial beta-galactosidase, trpE, Protein A, beta-lactamase, alpha amylase, alcohol dehydrogenase, and yeast alpha mating factor. 例えば、Godowskiら(1988) Science 241:812-816を参照のこと。 For example, Godowski et al. (1988) Science 241: 812-816 see. BeaucageおよびCarruthers(1981) Tetra Beaucage and Carruthers (1981) Tetra. Letts. 22:1859-1862により記載されたホスホルアミダイト法は、適切な合成DNAフラグメントを生成する。 Letts 22:. Phosphoramidite method described by 1859-1862, will produce suitable synthetic DNA fragments. 2本鎖フラグメントは、相補鎖を合成し、そして鎖を適切な条件下で一緒にアニールすること、または適切なプライマー配列とともにDNAポリメラーゼを用いて相補鎖を付加することのいずれかにより、しばしば得られる。 Double-stranded fragments, synthesizing the complementary strand and strand to anneal together under appropriate conditions, or by either adding the complementary strand using DNA polymerase with an appropriate primer sequence, often resulting It is. このようなポリペプチドはまた、リン酸化、スルホン化、ビオチン化、または他の部分の付加もしくは除去により化学的に改変されたアミノ酸残基、特にリン酸基と同様の分子形状を有するアミノ酸残基を有し得る。 Such polypeptides may also phosphorylated, sulfonated, chemically modified amino acid residues by the addition or removal of a biotinylated or other portion, the amino acid residues in particular having the same molecular shape and phosphate groups the may have. いくつかの実施態様では、改変は、有用な標識試薬であるか、または精製標的(例えば、アフィニティーリガンド)として役立つ。 In some embodiments, the modification serve as either useful labeling reagents, or purified target (e.g., affinity ligands). 融合タンパク質は、代表的には、組換え核酸方法または合成ポリペプチド方法のいずれかにより作製される。 Fusion proteins will typically be made by either recombinant nucleic acid methods or synthetic polypeptide methods. 核酸操作および発現のための技術は、例えば、Sa mbrookら(1989) Molecular Cloning:A Laboratory Manual (第2版),第1〜 3巻,Cold Spring Harbor Laboratoryにおいて一般的に記載される。 Techniques for nucleic acid manipulation and expression are, for example, Sa Mbrook et (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual ( second edition), first to Volume 3, are generally described in Cold Spring Harbor Laboratory. ポリペプチドの合成のための技術は、例えば、Merrifield(1963) J Techniques for synthesis of polypeptides are described, for example, Merrifield (1963) J. Amer. Amer. Chem. Chem. Soc. 85:2149-2156;Merrifield(1986) Science 232:341-347;およびAthertonら(198 9) Solid Phase Peptide Synthesis:A Practical Approach ,IRL Press,Oxford において記載される。 Soc 85:. 2149-2156; Merrifield ( 1986) Science 232: 341-347; and Atherton et al. (198 9) Solid Phase Peptide Synthesis : A Practical Approach, IRL Press, described in Oxford. 本発明はまた、アミノ酸配列における変異またはグリコシル化以外のBAS-1抗原の誘導体の使用を意図する。 The present invention also contemplates the use of BAS-1 antigens derivatives other than mutations in amino acid sequence or glycosylation. このような誘導体は、化学的部分との共有結合または集合性結合を含み得る。 Such derivatives may involve covalent or aggregate binding to the chemical moiety. これらの誘導体は、一般に以下の3つの分類に入る:(1)塩、(2)側鎖および末端残基の共有結合改変体、および(3)例えば細胞膜との、吸着複合体。 These derivatives generally fall into three categories: (1) salts, (2) covalent modifications of the side chain and terminal residue, and (3) for example with cell membranes, adsorption complex. このような共有結合または集合性誘導体は、免疫原として、免疫アッセイにおける試薬として、または精製方法(例えば、リガンドまたは他の結合リガンドのアフィニティー精製)において有用である。 Such covalent or aggregate derivatives can be used as immunogens are useful in as reagents in immunoassays or purification methods (e.g., affinity purification of ligands or other binding ligands). 例えば、BAS-1抗原は、抗BAS-1抗体またはそのリガンドのアッセイまたは精製における使用のために、当該分野で周知である方法による固体支持体(例えば、臭化シアン活性化Se pharose)への共有結合により固定化され得るか、あるいはグルタルアルデヒド架橋によるかまたはよらずにポリオレフィン表面へ吸着され得る。 For example, BAS-1 antigens, for use in the assay or purification of anti-BAS-1 antibodies or its ligand, the solid support according to methods well known in the art (e.g., cyanogen bromide-activated Se pharose) to covalently linked by either may be immobilized, or Kamada glutaraldehyde crosslinking may be adsorbed to polyolefin surfaces regardless. BAS-1抗原はまた、診断アッセイにおける使用のために、検出可能な基を用いて、例えば、クロラミンT手順による放射性ヨウ素化、希土類キレートへの共有結合、または別の蛍光部分への結合により、標識され得る。 BAS-1 antigens can also for use in diagnostic assays, with a detectable group, e.g., radioiodinated by the chloramine T procedure, by binding to covalently bond, or another fluorescent moiety to rare earth chelates, It can be labeled. 本発明の可溶化BAS-1抗原は、この抗原またはその任意のフラグメントに特異的な抗血清または抗体の産生のための免疫原として使用され得る。 Solubilized BAS-1 antigens of the present invention can be used as an immunogen for the production of antisera or antibodies specific for the antigen or any fragments thereof. 精製された抗原を用いて、このタンパク質を含有する種々の形態の不純な調製物での免疫により調製されたモノクローナル抗体または抗原結合フラグメントをスクリーニングし得る。 Using purified antigen may be screened immune monoclonal antibody or antigen-binding fragments prepared by the impure preparations of various forms containing this protein. 特に、用語「抗体」はまた、天然の抗体の抗原結合フラグメントを包含する。 In particular, also the term "antibody" encompasses antigen binding fragments of natural antibodies. 精製BAS-1はまた、上昇したレベルのBAS-1またはこの抗原を含む細胞フラグメントの存在に応答して生成された抗体を検出するための試薬として使用され得る。 Purification BAS-1 may also be used as a reagent to detect antibodies generated in response to the presence of cell fragments containing elevated levels BAS-1 or the antigen. これらの両方は、異常なまたは特定の生理学的状態または疾患状態の診断であり得る。 Both of these abnormal or may be a diagnostic of particular physiological states or disease state. さらに、BAS-1フラグメントはまた、直後に記載されるように、本発明の抗体を産生するための免疫原として役立ち得る。 Additionally, BAS-1 fragments are also as described immediately may serve as immunogens to produce the antibodies of the present invention. 例えば、本発明は、配列番号1の核酸配列、またはそれに示すヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列またはそのフラグメントに対して惹起された抗体を意図する。 For example, this invention contemplates antibodies raised against amino acid sequences or fragments thereof encoded by the nucleotide sequence shown in the nucleic acid sequence, or in SEQ ID NO: 1. 特に、本発明は、脂質二重層の外側に存在すると推定される特定のフラグメントに対して結合親和性を有するか、またはそれに対して惹起された抗体を意図する。 In particular, the present invention may either have a binding affinity for a particular fragment that is estimated to be present in the outer lipid bilayers, or intended to raised antibodies against it. さらに、種々の構築物が、そうでなければ細胞外に露出した分子部分に対する膜結合セグメントの融合から産生され得る。 Additionally, various constructs may be produced from the fusion of the membrane-bound segments for exposed moiety to the extracellular otherwise. 本発明は、さらなる密接に関連する改変体の単離を意図する。 The present invention contemplates the isolation of additional closely related variants. 対立遺伝子変異が、本明細書中に記載される実施態様に、例えば、90〜97%よりも良好な同一性を示す異なる個体において存在する可能性が高い。 Allelic mutations, the embodiments described herein, for example, is likely to be present in different individuals exhibiting good identity than 90-97%. 本発明はまた、構造、発現、および機能に独自性および類似性を提示する、関連する抗原の群を単離するための手段を提供する。 The present invention is also the structure, expression, and presents a unique and similarity in function, the group of related antigens to provide a means to isolate. 抗原の多くの生理学的効果の解明は、この抗原の別個の種の対応物の単離および特徴付けにより大いに加速される。 Elucidation of many of the physiological effects of the antigen is greatly accelerated by the isolation and characterization of distinct species counterparts of the antigens. 特に、本発明は、異なる種におけるさらなる相同遺伝子の存在を同定するための有用なプローブを提供する。 In particular, the present invention provides useful probes for identifying the presence of additional homologous genes in different species. 単離された遺伝子は、BAS-1の発現を欠く細胞(例えば、対応する抗原を欠き、そしてネガティブなバックグラウンド活性を示す、種型または細胞のいずれか)の形質転換を可能にする。 Isolated genes will allow transformation of cells lacking expression of BAS-1 (e.g., lacks the corresponding antigens and exhibit negative background activity, either species types or cells) permitting transformation of. 形質転換された遺伝子の発現は、規定されたまたは単一の種改変体を有する、抗原的に純粋な細胞株の単離を可能にする。 Expression of the transformed gene has a defined or single species variants, will allow isolation of antigenically pure cell lines. このアプローチは、任意のリガンドの生理学的効果のより敏感な検出および識別を可能にする。 This approach allows for more sensitive detection and discrimination of the physiological effects of any ligands. 亜細胞フラグメント(例えば、サイトプラストまたは膜フラグメント)は、単離および使用され得る。 Subcellular fragments (e.g., cytoplasts or membrane fragments) can be isolated and used. リガンドにより提供される種々の分化機能をもたらす重要な構造的エレメントの分析は、現在の分子生物学の(特に、関連するクラスのメンバーの比較における)標準的技術を用いて可能である。 Analysis of key structural elements that effect various differentiation functions provided by ligands of current molecular biology (particularly in comparison to members of the related class) is possible using standard techniques. 例えば、Cunninghamら(1989) Science 24 3:1339-1336において記載されるホモログスキャニング変異誘発技術;ならびにO 'Dowdら(1988) J For example, Cunningham et al. (1989) Science 24 3: homolog-scanning mutagenesis technique described in 1339-1336; and O 'Dowd et al (1988) J. Biol. Biol. Chem. 263:15985-15992;およびLechleiterら(1990) EMBO J. 9:4381-4390において用いられたアプローチを参照のこと。 Chem 263:. 15985-15992; and Lechleiter et al (1990) EMBO J. 9: See the approach used in 4381-4390. 特に、リガンド結合セグメントは、種改変体の間で置換されてどの構造的特徴がリガンド結合の親和性および特異性の両方において重要であるかを決定し得る。 In particular, ligand binding segments, which structural features are substituted between species variants may determine whether important in both affinity and specificity of ligand binding. 異なるBAS-1改変体のアレイを用いて、異なる種特異的改変体との相互作用の組み合わされた特性を示すリガンドについてスクリーニングする。 Using an array of different BAS-1 variants are screened for ligands that indicates the combined properties of interaction with different species-specific variants. 細胞内機能は、好ましくは、サイトゾルに通常接近可能である抗原のセグメントに関与する。 Intracellular functions are preferably involved in the segments of the antigen which is normally accessible to the cytosol. しかし、抗原の内在化は特定の環境下で生じ得、そして細胞内成分と指定された「細胞外」セグメントとの間の相互作用が生じ得る。 However, internalization of antigen may occur under certain circumstances, and may cause interaction between the specified and intracellular components "extracellular" segments. BAS-1と他の細胞内成分との相互作用の特定のセグメントは、変異誘発または直接的生化学的手段(例えば、架橋方法または親和性方法)により同定され得る。 Particular segment of interaction of BAS-1 with other intracellular components may be identified by mutagenesis or direct biochemical means (for example, crosslinking method or affinity methods). 結晶学的または他の物理的方法による構造分析もまた適用可能である。 Structural analysis by crystallographic or other physical methods will also be applicable. シグナル伝達の機構のさらなる調査は、親和性方法により単離可能であり得る会合成分の研究を含む。 Further investigation of the mechanism of signal transduction will include study of associated components which may be isolatable by affinity methods. BAS-1抗原の発現および制御のさらなる研究が遂行される。 Further study of the expression and control of BAS-1 antigen is performed. 抗原に会合する制御エレメントは、差別的な、発生性の、組織特異的な、または他の発現パターンを示す。 Control elements associated antigen shows discriminatory, the generation of tissue-specific or other expression patterns. 上流または下流の遺伝子領域(例えば、制御エレメント)が目的である。 Upstream or downstream genetic regions, eg, control elements, is an object. BAS-1抗原の構造研究は、新規のリガンド、特にアゴニスト特性またはアンタゴニスト特性を示すアナログの設計を導く。 Structural studies of the BAS-1 antigens will lead to analog design showing new ligands, particularly agonist or antagonist properties. これは、以前に記載されたスクリーニング方法と組み合わされて、所望の活性スペクトルを示すリガンドを単離し得る。 This, combined with been screening methods described previously, may isolate ligands exhibiting desired activity spectrum. 他の細胞型における発現は、しばしば、特定の抗原におけるグリコシル化の相違となる。 Expression in other cell types will often be differences in glycosylation in a particular antigen. 種々の種改変体は、アミノ酸配列以外の構造的相違に基づく異なる機能を示し得る。 Various species variants may exhibit distinct functions based upon structural differences other than amino acid sequence. 差別的改変は、差別的機能の原因であり得、そして効果の解明は、ここで可能となる。 Discriminatory modification, may be the cause of the discriminatory function, and elucidation of the effect is made possible here. 従って、本発明は、重要な開発性抗原およびそれらから開発された試薬を提供する。 Accordingly, the present invention provides reagents developed from significant development antigens and their. 先の記載は主としてヒトBAS-1に焦点をおいてきたが、当業者は、本発明が他のBAS-1抗原(例えば、霊長類および他の哺乳動物種改変体)を包含することをすぐに認識する。 Although the foregoing description has been primarily focused on human BAS-1, those skilled in the art, the present invention other BAS-1 antigens (e.g., primates and other mammalian species variants) to encompass immediately recognized in. V. V. 抗体 抗体は、天然に存在する形態およびそれらの組換え形態の両方のBAS-1抗原およびそのフラグメントの種々の対立遺伝子に対して惹起され得る。 Antibodies Antibodies can be raised to various allelic forms and both BAS-1 antigens and fragments thereof of their recombinant forms naturally occurring. さらに、抗体は、それらの活性形態またはそれらの不活性形態のいずれかのBAS-1に対して惹起され得る。 Additionally, antibodies can be raised to any of the BAS-1 in their active forms or their inactive forms. 抗イディオタイプ抗体もまた、意図される。 Anti-idiotypic antibodies are also contemplated. BAS-1の予め決定されたフラグメントに対する抗体(結合フラグメントおよび単鎖バージョンを含む)は、免疫原性タンパク質とのフラグメントの結合体での動物の免疫により惹起され得る。 (Including binding fragments and single chain versions) Antibodies against predetermined fragments of BAS-1 can be raised by immunization of animals with conjugates of fragments with immunogenic proteins. モノクローナル抗体は、所望の抗体を分泌する細胞から調製される。 Monoclonal antibodies are prepared from cells secreting the desired antibody. これらの抗体は、正常または欠損のBAS-1に対する結合についてスクリーニングされ得るか、または作動性もしくは拮抗性のリガンド活性についてスクリーニングされ得る。 These antibodies can be screened for normal or for binding to BAS-1 deficient can be screened or agonistic or antagonistic ligand activity. これらのモノクローナル抗体は、通常、少なくとも約1mMよりも良好な、より通常は約300μMよりも良好な、代表的には約10 μMよりも良好な、より代表的には約30μMよりも良好な、好ましくは約10μMよりも良好な、そしてより好ましくは約3μMよりは良好な(例えば、1μM、300n M、100nM、30nM、10nM、3nM、1nM、300pM、100pM、30pMなど)のK Dで結合する。 These monoclonal antibodies are usually better than at least about 1 mM, more usually better than about 300 [mu] M, typically better than about 10 [mu] M, more typically better than about 30 [mu] M, preferably better than about 10 [mu] M, and more preferably better than about 3 [mu] M (e.g., 1μM, 300n M, 100nM, 30nM, 10nM, 3nM, 1nM, 300pM, 100pM, 30pM , etc.) to bind with a K D of . 本発明の抗体(抗原結合フラグメントを含む)は、有意な診断的または治療的価値を有し得る。 Antibodies of the present invention, including antigen binding fragments, can have significant diagnostic or therapeutic value. これらは、BAS-1に結合し、そしてリガンド結合を阻害するかまたは免疫学的応答を惹起するリガンドの能力を阻害する、強力なアンタゴニストであり得る。 It binds to BAS-1, and inhibit the ability of the ligand to elicit or immunological response inhibiting ligand binding can be potent antagonists. これらはまた、非中和抗体として有用であり得、そしてトキシンまたは放射性核種に結合してその結果、抗体が抗原に結合した場合に、細胞自体が殺傷され得る。 It also results bind to can be useful as non-neutralizing antibodies and toxin or radionuclide, in the case where the antibody is bound to the antigen, the cell itself can be killed. さらに、これらの抗体は、直接的またはリンカーにより間接的のいずれかで、薬物または他の治療剤に結合され得る。 Furthermore, these antibodies, either indirectly by direct or linkers may be attached to a drug or other therapeutic agent. 本発明の抗体はまた、診断適用において有用であり得る。 Antibodies of the invention may also be useful in diagnostic applications. 捕獲抗体または非中和抗体として、これらはリガンド結合を阻害することなく、BAS-1に結合し得る。 As capture or non-neutralizing antibodies, it without inhibiting ligand binding, may bind to BAS-1. 中和抗体として、これらは、競合結合アッセイにおいて有用であり得る。 As neutralizing antibodies, it can be useful in competitive binding assays. これらはまた、BAS-1またはそのリガンドを検出または定量する際に有用である。 They are also useful in detecting or quantifying BAS-1 or its ligand. BAS-1フラグメントは、免疫原として使用されるポリペプチドに融合または共有結合されるように、他の物質(特にポリペプチド)に結合され得る。 BAS-1およびそのフラグメントは、種々の免疫原(例えば、キーホールリンペットヘモシアニン、ウシ血清アルブミン、破傷風毒素など)に融合または共有結合され得る。ポリクローナル抗血清を調製する方法の記載については、 Microbiology ,Hoeb er Medical Division,Harper and Row,1969;Landsteiner(1962) Specificit y of Serological Reactions ,Dover Publications,New York,およびWilliams ら(1967) Methods in Immunology and Immunochemistry ,第1巻,Academic Pr ess,New Yorkを参照のこと。代表的な方法は、抗原による動物の過免疫を包含する。次いで、反復的な免疫のすぐ後に動物の血液が収集され、そしてγグロブリンが単離される。あるいは、細胞が、ハイブリドーマの産生のために採集され得る。いくつかの例において、種々の哺乳動物宿主(例えば、マウス、齧歯類、霊長類、ヒトなど)から、モノクローナル抗体を調製することが望ましい。このようなモノクローナル抗体を調製する技術の記載は、以下に見出される:例えば、St itesら(編) Basic and Clinical Immunology (第4版),Lange Medical Publi cations,Los Altos,CA、およびそこで引用される参考文献;HarlowおよびLane (1988) Antibodies:A Laboratory Manual ,CSH Press;Goding(1986) Monoclo nal Antibodies:Principles and Practice (第2版)Academic Press,New York ;ならびに詳細にはKohlerおよびMilstein(1975) Nature 256:495-497(これはモノクローナル抗体を生成する1つの方法を論述する)。簡潔に要約すると、この方法は、動物に免疫原を注射することを包含する。次いで動物は屠殺され、そしてその脾臓から細胞が採集され、次いでこの細胞は骨髄腫細胞と融合される。その結果、インビトロで増殖し得るハイブリッド細胞、すなわち「ハイブリドーマ」が得られる。次いで、ハイブリドーマの集団は個々のクローンを単離するためにスクリーニングされ、各クローンは免疫原に対して単一の抗体種を分泌する。この方法では、得られた個々の抗体種は、免疫動物由来の不死化およびクローン化された単一のB細胞(免疫原性物質上で認識される特異的部位への応答において生成された)の産物である。他の適切な技術は、抗原性ポリペプチドへの、あるいはファージまたは類似のベクターにおける抗体のライブラリーの選択への、リンパ球のインビトロ曝露を包含する。 Huseら(1989)「Generation of a Large Combinatorial Library of t he Immunoglobul in Repertoire in Phage Lambda」, Science 246:1275-1281; およびWardら(1989) Nature 341:544-546を参照のこと。本発明のポリペプチドおよび抗体は、キメラ抗体またはヒト化抗体を含む改変を伴って、または伴わずに使用され得る。しばしば、ポリペプチドおよび抗体は、検出可能シグナルを提供する物質との結合(共有または非共有)によって標識される。多様な標識および結合技術が公知であり、そして科学文献および特許文献の両方において広範に報告されている。適切な標識には、放射性核種、酵素、基質、コファクター、インヒビター、蛍光部分、化学発光部分、磁気粒子などが含まれる。このような標識の使用を教示する特許には、米国特許第3,817,837号;同3,850,752号;同3,93 9,350号;同3,996,345号;同4,277,437号;同4,275,149号;および同4,366,241 号が含まれる。また、組換え免疫グロブリンが産生され得る。 Cabilly、米国特許第4,816,567号を参照のこと。本発明の抗体はまた、タンパク質の単離においてアフィニティークロマトグラフィーのために使用され得る。カラムは、抗体が固体支持体(例えば、アガロース、SEPHADEXなどのような粒子)に連結されるように調製され得る。ここで細胞溶解物がカラムを通過させられ得、カラムは洗浄され、次いで漸増濃度の緩和な変性剤により、精製BAS-1タンパク質が溶出される。抗体はまた、特定の発現産物について発現ライブラリーをスクリーニングするために使用され得る。通常、このような手順において使用される抗体は、抗体結合による抗原の存在の容易な検出を可能にする部分で標識される。 BAS-1抗原に対して惹起された抗体はまた、抗イディオタイプ抗体を惹起するために使用される。これらは、それぞれの抗原の発現に関連した種々の免疫学的状態の検出または診断において有用である。 VI.核酸 ヒトBAS-1プローブまたはそのフラグメントは、他の種からの相同タンパク質をコードする核酸または同一もしくは別の種における他の関連タンパク質をコードする核酸を同定または単離するために使用される。本発明は、生物学的に活性な対応するBAS-1ポリペプチドをコードする、単離されたDNAまたはフラグメントの使用を意図する。さらに、本発明は、本明細書中に記載されるDNA配列と適切な条件下でハイブリダイズし得る生物学的に活性なタンパク質またはポリペプチドをコードする、単離されたかまたは組換えのDN Aを包含する。この生物学的に活性なタンパク質またはポリペプチドは、インタクトなBAS-1またはフラグメントであり得、そして配列番号1に示される核酸によってコードされるアミノ酸配列を有する。さらに、本発明は、BAS-1に相同であるタンパク質をコードするか、またはプローブとしてヒトBAS-1をコードするD NAを使用して単離された、単離されたかもしくは組換えのDNAまたはそのフラグメントの使用を包含する。単離されたDNAは、5'および3'隣接においてそれぞれの調節配列(例えば、プロモーター、エンハンサー、ポリA付加シグナルなど) を有する。 「単離された」核酸は、天然配列に自然に付随する他の成分(リボゾーム、ポリメラーゼ、および起源である種由来の隣接ゲノム配列)から実質的に分離された核酸(例えば、RNA、DNA、または混合ポリマー)である。本発明は、その天然に存在する環境から取り除かれた核酸配列を包含し、そして組換えまたはクローン化DNA単離物、および化学的に合成されたアナログまたは非相同な系によって生物学的に合成されたアナログを含む。実質的に純粋な分子は、分子の単離された形態を含む。単離された核酸は、一般に、分子の均一な組成物であるが、いくつかの実施態様においては、少しの不均一性を含む。この不均一性は、代表的には、ポリマー末端、または所望の生物学的機能もしくは活性に重要でない部分において見出される。 「組換え」核酸は、その生成方法またはその構造のいずれかによって定義される。その生成方法との関連において、例えば、あるプロセスによって作製された産物では、プロセスは、組換え核酸技術(例えば、ヌクレオチド配列におけるヒト介入を含む)の使用である。あるいは、それは天然では互いに隣接しない2つのフラグメントの融合を含む配列の生成によって作製された核酸であり得るが、 天然の産物(例えば、天然に存在する変異体)を除外することが意味される。従って、例えば、任意の天然に存在しないベクターでの細胞の形質転換によって作製された産物が包含され、同様に任意の合成オリゴヌクレオチドプロセスを使用して得られた配列を含む核酸が包含される。しばしば行われるのは、例えば制限認識部位または配列認識部位を代表的には導入または除去しながら、コドンを縮退コドン(同じアミノ酸または保存的アミノ酸をコードする)で置換することである。あるいは、所望の機能の核酸セグメントを共に結合して、一般に入手可能な天然の形態において見出されない所望の機能の組合せを含む単一の遺伝体(gen etic entity)を生成することが行われる。制限酵素認識部位は、しばしばこのような人為的操作の標的であるが、他の部位特異的標的(例えば、プロモーター、 DNA複製部位、調節配列、制御配列、または他の有用な特徴)が、設計によって取り込まれ得る。類似の概念が、組換え(例えば、融合)ポリペプチドについて意図される。特異的に含まれるのは、これらの抗原のフラグメントに類似のポリペプチドをコードする遺伝暗号重複による合成核酸、および種々の異なる種改変体由来の配列の融合物である。核酸の文脈における「フラグメント」は、少なくとも約17ヌクレオチド、一般的に少なくとも約20ヌクレオチド、より一般的に少なくとも約23ヌクレオチド、 普通は少なくとも約26ヌクレオチド、より普通は少なくとも約29ヌクレオチド、 しばしば少なくとも約32ヌクレオチド、より頻繁には少なくとも約35ヌクレオチド、代表的には少なくとも約38ヌクレオチド、より代表的には少なくとも約41ヌクレオチド、通常は少なくとも約44ヌクレオチド、より通常は少なくとも約47ヌクレオチド、好ましくは少なくとも約50ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも約53ヌクレオチドの連続的なセグメントであり、そして特に好ましい実施態様においては少なくとも約56以上のヌクレオチド(例えば、60、75、100、150、20 0、250、300など)である。 BAS-1タンパク質をコードするDNAは、関連するかまたは相同の抗原をコードする遺伝子、mRNA、およびcDNA、ならびに異なる種由来の相同タンパク質をコードするDNAを同定するために、特に有用である。種々のBAS-1タンパク質は配列において類似しているべきであり、そして本明細書中に包含される。しかし、BAS-1 とのより遠い進化的関連性を有するタンパク質でさえも、それらが十分な類似性を示す場合、これらの配列を使用して容易に単離され得る。霊長類BAS-1タンパク質は、特に興味深い。本発明はさらに、本明細書中に示される単離されたDNAと同一であるか高度に相同であるDNA配列を有する、組換えDNA分子およびフラグメントを包含する。詳細には、配列はしばしば、転写、翻訳、およびDNA複製を制御するDNAセグメントに作動可能に連結される。あるいは、ゲノム配列に由来する組換えクローン(例えば、イントロンを含む)は、トランスジェニック研究(例えば、トランスジェニック細胞または生物を含む)のために、および遺伝子治療のために有用である。例えば、Goodnow(1992)「Transgenic Animals」Roitt(編) Encyclopedia o f Immunology Academic Press,San Diego,1502-1504頁;Travis(1992) Scien ce 256:1392-1394;Kuhnら(1991) Science 254:707-710;Capecchi(1989) Sci ence 244:1288;Robertson(1987)(編) Teratocarcinomas and Embryonic Ste m Cells:A Practical Approach IRL Press,Oxford;およびRosenberg(1992) J .Clinical Oncology 10:180-199を参照のこと。 相同な核酸配列は、比較した場合、有意の配列類似性を示す。核酸における相同性の基準は、配列比較によるかまたはハイブリダイゼーション条件に基づくかのいずれかの、当該分野で一般に使用される相同性についての測定である。ハイブリダイゼーション条件は、以下により詳細に記載される。 核酸配列比較の文脈における実質的な同一性は、セグメントまたはそれらの相補鎖のいずれかが、適切なヌクレオチド挿入または欠失によって最適に整列させて比較した場合、少なくともヌクレオチドの約50%、一般的に少なくとも約56% 、より一般的に少なくとも約59%、普通は少なくとも約62%、より普通は少なくとも約65%、しばしば少なくとも約68%、より頻繁には少なくとも約71%、代表的には少なくとも約74%、より代表的には少なくとも約77%、通常は少なくとも約80%、より通常は少なくとも約85%、好ましくは少なくとも約90%、より好ましくは少なくとも約95〜98%以上で同一であることを意味し、そして特定の実施態様においてはヌクレオチドの約99%ほどに高い。あるいは、実質的な相同性は、代表的には配列番号1に由来する配列を使用して、セグメントが選択的なハイブリダイゼーション条件下で鎖またはその相補体にハイブリダイズする場合に存在する。代表的には、選択的なハイブリダイゼーションは、少なくとも約14ヌクレオチドの範囲にわたって少なくとも約55%の相同性、好ましくは少なくとも約65 %の相同性、より好ましくは少なくとも約75%の相同性、そして最も好ましくは少なくとも約90%の相同性が存在する場合に生じる。Kanehisa(1984) Nuc .Aci ds Res. 12:203-213を参照のこと。相同性比較の長さは、記載されるように、より長い範囲にわたり得、そして特定の実施態様においては、少なくとも約17ヌクレオチド、通常は少なくとも約20ヌクレオチド、より通常は少なくとも約24ヌクレオチド、代表的には少なくとも約28ヌクレオチド、より代表的には少なくとも約40ヌクレオチド、好ましくは少なくとも約50ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも約75〜100以上のヌクレオチド(例えば、125、150、200、250、300など)の範囲にわたる。 ハイブリダイゼーションの文脈における同一性に関連して、ストリンジェントな条件は、塩、温度、有機溶媒、およびハイブリダイゼーション反応において代表的に制御される他のパラメータの、ストリンジェントに組み合わされた条件である。ストリンジェントな温度条件は、通常は約30℃以上、より通常は約37℃以上、代表的には約45℃以上、より代表的には約55℃以上、好ましくは約65℃以上、より好ましくは約70℃以上の温度を含む。ストリンジェントな塩条件は、普通は約500mM未満、通常は約350mM未満、より通常は約200mM未満、代表的には約150 mM未満、好ましくは約100mM未満、より好ましくは約50mM未満である。しかし、 パラメータの組合せが、任意の単一のパラメータの測定よりもさらにより重要である。例えば、WetmurおよびDavidson(1968) J .Mol.Biol. 31:349-370を参照のこと。 他のヒト被検体由来のBAS-1は、ハイブリダイゼーションまたはPCRによってクローン化または単離され得る。あるいは、対立遺伝子特異性をより示さない抗体調製物の調製が、発現クローニングアプローチにおいて有用であり得る。対立遺伝子改変体は、例えば、重複PCRと配列分析(例えば、規定のプライマーを使用する)との組合せを使用して特徴付けられ得、それによってヒト集団における対立遺伝子改変の情報を提供する。 VII.BAS-1の作製;模倣 BAS-1抗原またはそのフラグメントをコードするDNAは、化学合成によって、cD NAライブラリーのスクリーニングによって、または多様な細胞株または組織サンプルから調製されたゲノムライブラリーのスクリーニングによって得られ得る。 このDNAは、全長の抗原またはフラグメントの合成のための多様な宿主細胞において発現され得、次にその細胞は、例えばポリクローナルまたはモノクローナル抗体を生成するために;結合研究のために;改変された分子の構築または発現のために;および構造/機能研究のために、使用され得る。各抗原またはそのフラグメントは、適切な発現ベクターで形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞において発現され得る。これらの分子は、タンパク質または細胞混入物( 例えば、組換え宿主に由来する混入物)を含まないように実質的に精製され、そして従って薬学的に受容可能なキャリアおよび/または希釈剤と組み合わされた場合、薬学的組成物において特に有用である。抗原またはその一部は、他のタンパク質との融合物として発現され得る。 発現ベクターは、代表的には、所望の抗原遺伝子またはそのフラグメントを含む自己複製DNAまたはRNA構築物であり、通常、適切な遺伝制御エレメント(適切な宿主細胞において認識される)に作動可能に連結される。これらの制御エレメントは、適切な宿主内で発現をもたらし得る。発現をもたらすために必要な特定の型の制御配列エレメントは、使用される最終的な宿主細胞に依存する。一般に、遺伝制御エレメントは、原核生物プロモーター系または真核生物プロモーター発現制御系を含み得、そして代表的には、転写プロモーター、転写の開始を制御する任意のオペレーター、mRNA発現のレベルを上昇させるための転写エンハンサー、適切なリボゾーム結合部位をコードする配列、ならびに転写および翻訳を終結させる配列を含み得る。発現ベクターはまた、通常、宿主細胞に関係なくベクターの複製を可能にする複製起点を含む。 本発明のベクターは、ヒトBAS-1抗原をコードするDNA、または生物学的に活性なポリペプチドをコードするそのフラグメントを含む。DNAは、ウイルスプロモーターの制御下にあり得、そして選択マーカーをコードし得る。本発明はさらに、原核生物または真核生物宿主においてヒトBAS-1抗原をコードする真核生物cDN A を発現し得るような発現ベクターの使用を意図し、ここで、ベクターは宿主に適合し得、そして抗原をコードする真核生物cDNAは、ベクターを含む宿主の増殖が問題のcDNAを発現するように、ベクター中に挿入される。通常、発現ベクターは、それらの宿主細胞における安定な複製について、または細胞当たりの所望の遺伝子の総コピー数を大幅に増加させるための増幅について設計される。発現ベクターが宿主細胞において複製することは、常に必要とされるわけではなく、例えば、宿主細胞によって認識される複製起点を含まないベクターを使用して、種々の宿主において抗原またはそのフラグメントの一過性の発現をもたらすことが可能である。組換えによるヒトBSA-1遺伝子またはそのフラグメントの宿主DNA内への組込みを引き起こすベクターを使用することも、また可能である。 本明細書中で使用される場合、ベクターは、プラスミド、ウイルス、バクテリオファージ、組込み可能なDNAフラグメント、およびDNAフラグメントの宿主のゲノム内への組込みを可能にする他のビヒクルを含む。発現ベクターは、作動可能に連結された遺伝子の発現をもたらす遺伝子制御エレメントを含む、特殊化したベクターである。プラスミドは、ベクターの最も一般に使用される形態であるが、同等の機能を担い、そして当業者に公知である(または公知となる)ベクターの全ての他の形態が、本明細書中の使用に適切である。例えば、Pouwelら(1985 および補遺) Cloning Vectors:A Laboratory Manual, Elsevier,NY、およびR odriquezら(1988)(編) Vectors:A Survey of Molecular Cloning Vectors an d Their Uses, Buttersworth,Boston,MAを参照のこと。 形質転換された細胞は、組換えDNA技術を使用して構築されたヒトBAS-1ベクターで形質転換またはトランスフェクトされている細胞(好ましくは哺乳動物の) である。形質転換された宿主細胞は、通常、抗原またはそのフラグメントを発現するが、そのDNAのクローン化、増幅、および操作のためには、タンパク質を発現する必要はない。本発明はさらに、形質転換された細胞を栄養培地において培養し、従ってタンパク質の培養物中での蓄積を可能にすることを意図する。タンパク質は、培養物または培養培地のいずれかから回収され得る。 本発明の目的のために、DNA配列は、それらが互いに機能的に関連する場合、 作動可能に連結される。例えば、プレ配列または分泌リーダーについてのDNAは、 それがプレタンパク質として発現されるかまたはポリペプチドの細胞膜への指向もしくはポリペプチドの分泌に関与する場合、ポリペプチドに作動可能に連結される。プロモーターは、それがポリペプチドの転写を制御する場合、コード配列に作動可能に連結される;リボゾーム結合部位は、それが翻訳を可能にするように位置する場合、コード配列に作動可能に連結される。通常、作動可能に連結されるとは、連続的でありそしてリーディングフレーム中にあることを意味するが、しかし、特定の遺伝子エレメント(例えば、リプレッサー遺伝子)は、連続的に連結されておらず、次に発現を制御するオペレーター配列になお結合している。 適切な宿主細胞は、原核生物、下等真核生物、および高等真核生物を含む。原核生物は、グラム陰性およびグラム陽性生物の両方(例えば、E.coliおよびB. subtilis)を含む。下等真核生物は、酵母(例えば、S.cerevisiaeおよびPichi a)、およびDictyostelium属の種を含む。高等真核生物は、非哺乳動物起源(例えば、昆虫細胞および鳥類)ならびに哺乳動物起源(例えば、ヒト、霊長類、および齧歯類)の両方の、動物細胞由来の樹立された組織培養細胞株を含む。 原核生物宿主ベクター系は、多数の異なる種についての多様なベクターを含む。本明細書中で使用される場合、E.coliおよびそのベクターは、他の原核生物において使用される同等のベクターを含むように、総称的に使用される。DNAを増幅するための代表的なベクターは、pBR322または多数のその誘導体である。ヒトBAS-1抗原またはそのフラグメントを発現するために使用され得るベクターは、以下を含むようなベクターを含むが、これらに限定されない:lacプロモーター(pUCシリーズ);trpプロモーター(pBR322-trp);Ippプロモーター(pINシリーズ);λpPもしくはpRプロモーター(pOTS);またはハイブリッドプロモーター(例えば、ptac(pDR540))。Brosiusら(1988)「Expression Vectors Em ploying Lambda-,trp-,lac-,and Ipp-derived Promoters」,RodriguezおよびDenhardt(編) Vectors:A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses, Buttersworth,Boston,第10章,205-236頁を参照のこと。 下等真核生物(例えば、酵母およびDictyostelium)は、ベクターを含むヒトB AS-1抗原配列で形質転換され得る。本発明の目的のための、最も一般的な下等真核生物宿主は、パン酵母(Saccharomyces cerevisiae)である。これは下等真核生物を包括的に代表するために使用されるが、多数の他の株および種もまた利用可能である。酵母ベクターは、代表的には、複製起点(組み込み型でない場合) 、選択遺伝子、プロモーター、所望のタンパク質をコードするDNAまたはそのフラグメント、ならびに翻訳終結、ポリアデニル化、および転写終結のための配列からなる。酵母にとって適切な発現ベクターは、3-ホスホグリセレートキナーゼおよび種々の他の解糖酵素遺伝子プロモーターのような構成プロモーター、またはアルコールデヒドロゲナーゼ2プロモーターもしくはメタロチオニンプロモーターのような誘導可能プロモーターを含む。適切なベクターは以下の型の誘導体を含む:自己複製低コピー数(例えば、YRp-シリーズ)、自己複製高コピー数( 例えば、YEp-シリーズ)、組み込み型(例えば、YIp-シリーズ)、またはミニ染色体(例えば、YCp-シリーズ)。 高等真核生物の組織培養細胞は、機能的に活性なヒトBAS-1抗原タンパク質の発現に好ましい宿主細胞である。原則的には、多くの高等真核生物の組織培養細胞株は、無脊椎動物供給源または脊椎動物供給源のいずれかからでも使用可能である(例えば、昆虫バキュロウイルス発現系)。しかし、同時翻訳および翻訳後の両方のプロセシングの点で、哺乳動物が好ましい。このような細胞の形質転換またはトランスフェクションおよび増殖は、日常的な手順になっている。有用な細胞株の例としては、HeLa細胞、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞株、 ベビーラット腎臓(BRK)細胞株、昆虫細胞株、トリ細胞株、およびサル(COS) 細胞株が挙げられる。このような細胞株のための発現ベクターは、通常、複製起点、プロモーター、翻訳開始部位、RNAスプライス部位(ゲノムDNAが使用される場合)、ポリアデニル化部位、および転写終結部位を含む。これらのベクターはまた、通常、選択遺伝子または増幅遺伝子を含む。適切な発現ベクターは、例えば、アデノウイルス、SV40、パルボウイルス、ワクチンウイルス、またはサイトメガロウイルスのような供給源由来のプロモーターを有するプラスミド、ウイルス、またはレトロウイルスであり得る。適切な発現ベクターの代表的な例としては、pCDNA1;pCD(Okayamaら、(1985) Mol .Cell Blol. 5:1136-1142を参照のこと);pMC1neo Poly-A(Thomasら、(1987) Cell 51:503-512を参照のこと) ;およびpAC 373またはpAC 610のようなバキュロウイルスベクターが挙げられる。 しばしば、特定のまたは規定されたグリコシル化パターンを提供する系においてヒトBAS-1抗原ポリペプチドを発現することが所望される。この場合には、通常のパターンは、発現系によって天然に提供されるパターンである。しかし、このパターンは、ポリペプチド(例えば、非グリコシル化形態)を、異種発現系に導入された適切なグリコシル化タンパク質に曝露することによって改善可能である。例えば、BAS-1抗原は、哺乳動物または他のグリコシル化酵素をコードする1つ以上の遺伝子とともに同時形質転換され得る。このアプローチを使用して、 特定の哺乳動物のグリコシル化パターンは、達成可能であるかまたは原核生物もしくは他の細胞において近似する。 BAS-1抗原はまた、ホスファチジルイノシトール(PI)が連結された形態で産生され得るが、ホスファチジルイノシトール切断酵素(例えば、ホスファチジルイノシトールホスホリパーゼ-C)での処理によって膜から取り出され得る。これは、生物学的に活性な形態で抗原を放出し、そしてタンパク質化学の標準的な手順によって精製可能である。例えば、Low(1989) Biochim .Biophys.Acta 988: 427-454;Tseら、(1985) Science 230:1003-1008;およびBrunnerら、(1991) J .Cell Biol. 114:1275-1283を参照のこと。あるいは、精製セグメントは、タンパク質産物の精製または検出を補助するために、配列(例えば、N-末端またはC-末端)中に操作され得る。このようなセグメントを取り出す手段はまた、例えば、プロテアーゼ切断部位を操作され得る。 現在、全体の配列が公知である、ヒトBAS-1抗原、フラグメント、またはその誘導体は、ペプチドを合成するための通常のプロセスによって調製され得る。これらの例としては、例えば、StewartおよびYoung(1984) Solid Phase Peptlde Synthesis ,Pierce Chemical Co.,Rockford,IL;BordanszkyおよびBodanszky (1984) The Practice of Peptide Synthesis ,Springer-Verlag,New York;ならびにBordanszky(1984) The Principles of Peptide Synthesis ,Springer-Verl ag,New Yorkに記載のようなプロセスが挙げられる。例えば、アジドプロセス、 酸塩化物プロセス、酸無水物プロセス、混合無水物プロセス、活性エステルプロセス(例えば、p-ニトロフェニルエステル、N-ヒドロキシスクシンイミドエステル、またはシアノメチルエステル)、カルボジイミダゾールプロセス、酸化還元プロセス、あるいはジシクロヘキシルカルボジイミド(DCCD)/添加物プロセスが使用され得る。固相および水相での合成は両方とも、前述のプロセスに適用可能である。 ヒトBAS-1抗原、フラグメント、またはその誘導体は、ペプチド合成において代表的に用いられるような上記のプロセスに従って、一般的には、配列において1つずつ末端アミノ酸にアミノ酸を縮合させることを含むいわゆる段階プロセス、または末端アミノ酸にペプチドフラグメントをカップリングさせることのいずれかによって適切に調製され得る。カップリング反応に使用されていないアミノ基は、不正確な位置でのカップリングを防ぐために保護されなければならない。 固相合成が採用される場合、C-末端アミノ酸は、不溶性キャリアまたは支持体にそのカルボキシル基を介して結合される。不溶性キャリアは、反応性カルボキシル基に結合する能力を有する限り、特に制限されない。このような不溶性キャリアの例としては、ハロメチル樹脂(例えば、クロロメチル樹脂またはブロモメチル樹脂)、ヒドロキシメチル樹脂、フェノール樹脂、tert-アルキルオキシカルボニル-ヒドラジド化樹脂などが挙げられる。 アミノ基保護アミノ酸が、その活性化カルボキシル基と予め形成されたペプチドまたは鎖の反応性アミノ基との縮合を介して配列に結合され、少しづつペプチドが合成される。完全な配列が合成された後、ペプチドを不溶性キャリアから分離させ、ペプチドを産生する。この固相アプローチは、一般的に、Merrifieldら、(1963) J .Am.Chem.Soc .85:2149-2156に記載される。 調製された抗原およびそのフラグメントは、ペプチド分離の手段(例えば、抽出、沈殿、電気泳動、および種々の形態のクロマトグラフィーなど)によって、 反応混合物から単離および精製され得る。本発明のヒトBAS-1抗原は、その所望される使用に応じて種々の程度の純度で得られ得る。精製は、本明細書中に開示されたタンパク質精製技術の使用または免疫吸着アフィニティクロマトグラフィーにおいて本明細書中に記載される抗体の使用によって達成され得る。この免疫吸着アフィニティクロマトグラフィーは、抗体を固体支持体に最初に連結させ、 次いで連結した抗体を、小細胞肺ガン細胞の可溶化溶解物、BAS-1抗原を発現する他の細胞の溶解物、またはDNA技術(以下を参照のこと)の結果としてのBAS-1 抗原を産生する細胞の溶解物もしくは上清と接触させることによって行われる。 VIII.使用 本発明は、本明細書中の他の場所(例えば、発生的もしくは生理学的な異常に関する一般的な説明、または以下の診断用キットの説明において)に記載される診断適用において使用を見出す試薬を提供する。 本発明はまた、有意な治療的価値を有する試薬を提供する。ヒトBAS-1(天然に存在するかまたは組換え体)、そのフラグメント、およびそれに対する抗体は、ヒトBAS-1に対して結合親和性を有することが同定された化合物とともに、異常なB細胞応答に関連する状態(例えば、ガン性状態のような異常増殖を含む) または変性状態の処置において有用であるべきである。異常増殖、再生、変性、 および萎縮症は、本明細書中に提供される組成物を使用する適切な治療処置によって調節され得る。例えば、BAS-1の異常発現または異常誘因に関連する疾患または障害は、抗原のアゴニストまたはアンタゴニストの可能性の高い標的であるはずである。BAS-1は、B細胞の活性化または調節における役割を果たすようであり、これは、免疫学的応答(例えば、自己免疫疾患またはアレルギー性応答) に影響する。 さらに、BAS-1:BAS-1結合パートナー相互作用は、高IgM症候群において観察されるようなナイーブなB細胞の活性化、増殖、および/または分化を許容するT:B細胞相互作用に関与し得る。そのような場合、処置は、BAS-1:BAS-1結合パートナーシグナル形質導入で妨害される形態を生じる。シグナルのブロックは、例えば、可溶性BAS-1またはBAS-1に対する抗体によってもたらされ得る。 BAS-1:BAS-1結合パートナー相互作用はまた、胚中心のダークゾーンにおけるB細胞芽および中心芽(centroblast)の大量な増殖の開始および/または調節に関与し得る。例えば、BanchereauおよびRosset(1992) Adv .Immunol .125:86 8-877を参照のこと。Ig体細胞変異プロセスを開始および/または調節するためのシグナルに関与する細胞表面相互作用はまた、BAS-1を含み得、そしてアゴニストまたはアンタゴニスト介入によって調節され得る。 他の異常発生状態は、BAS-1mRNAを有することがノーザンブロット分析によって示された各細胞型において知られている。Berkow(編) The Merck Manual of Diagnosis and Therapy ,Merck & Co.,Rahway,NJ;およびThornら、 Harriso n's Principles of Internal Medicine ,McGraw-Hill,NYを参照のこと。例えば、治療的免疫抑制は、この分子を介するTリンパ球およびBリンパ球相互作用をブロックすることによって達成され得る。これは移植の間の自己免疫疾患および移植片拒絶を調節するための重要な治療を示す。あるいは、抗B細胞腫瘍治療は、B細胞上のBAS-1の増殖および生存効果をブロックすることによって達成され得る。ブロックは、結合組成物(例えば、中和抗体)をブロックすることによって、またはBSA-1とそのカウンターレセプター(counterreceptor)との相互作用を干渉する分子によってもたらされ得る。可溶性BAS-1は、カウンターレセプター相互作用をブロックし得る。 組換えBAS-1またはBAS-1抗体は、精製され得、次いで患者に投与され得る。これらの試薬は、例えば、通常の薬学的に受容可能なキャリアまたは希釈物(例えば、免疫原性アジュバント)中で、生理学的に無害な安定剤および賦形剤とともに、さらなる活性成分との治療的使用のために組み合わされ得る。これらの組合せは、濾過滅菌され得、そして投薬バイアルにおける凍結乾燥または安定化水性調製物における保存によるように投薬形態に配置され得る。本発明はまた、完全には結合しない抗体またはそのフラグメントの使用を意図する。 BAS-1またはそのフラグメントを使用する薬物スクリーニングは、BSA-1に対する結合親和性を有する化合物を同定するために実施され得る。これは、会合した成分の単離を含む。次いで、続く生物学的アッセイは、化合物が内因性刺激活性を有するかどうか、そしてそれゆえリガンドの活性をブロックするブロッカーまたはアンタゴニストであるかどうかを決定するのに有用であり得る。同様に、内因性刺激活性を有する化合物は、抗原を活性化し得、従ってBSA-1の活性を刺激するアゴニストであり得る。本発明はさらに、アンタゴニストとしてのBAS-1に対する抗体の治療的使用を意図する。このアプローチは、他のBAS-1種改変体で特に有用であるはずである。 有効な治療に必要な試薬の質は、多くの要因(投与の手段、標的部位、患者の生理的状態、および投与される他の薬剤を含む)に依存する。従って、投薬量は、 安全性および有効性を最適化するように滴定されるべきである。代表的には、インビトロで使用される投薬量は、これらの試薬のインサイチュ投与のための有用な量における有用なガイダンスを提供し得る。特定の障害の処置のための有効投薬量の動物試験は、ヒト投薬量のさらなる予測的な示唆を提供する。種々の考慮は、例えば、Gilmanら、(編)(1990) Goodman and Gilman's:The Pharmacologic al Bases of Therapeutics, 第8版 、Pergamon Press;およびRemington's Pharm aceutical Sciences ,第17版、(1990),Mack Publishing Co.,Easton,Pennに記載される。投与のための方法(例えば、経口、静脈内、腹腔内、または筋肉内投与、経皮拡散など)は、それらおよび以下に記載される。薬学的に受容可能なキャリアとしては、水、生理食塩水、緩衝液、および、例えば、 Merck Index ,M erck & Co.,Rahway,New Jerseyに記載される他の化合物を含む。投薬量範囲は、本来は1mM濃度より低い量、代表的には約10μM濃度未満、通常は約100nM未満、好ましくは約10pM(ピコモル)未満、そして最も好ましくは、約1fM(フェムトモル)未満で、適切なキャリアを有することが意図される。徐放処方物、または徐放装置は、しばしば持続性投与に有用である。 ヒトBAS-1、そのフラグメント、およびBAS-1またはそのフラグメントに対する抗体、アンタゴニスト、およびアゴニストは、処置されるべき宿主に直接投与され得るか、または化合物の大きさに依存して投与の前にオボアルブミンまたは血清アルブミンのようなキャリアタンパク質にそれらを結合させることが所望され得る。治療用処方物は、多くの通常の投薬処方物で投与され得る。活性成分が単独で投与されることが可能であるが、薬学的処方物として存在することが好ましい。処方物は、代表的には、1つ以上のその受容可能なキャリアとともに、上記で規定された少なくとも1つの活性成分を含む。各キャリアは、他の成分と適合性であり、そして患者に対して有害ではないという意味において、薬学的に受容可能および生理学的に受容可能の両方であるべきである。処方物は、局所、経口、経直腸、経鼻、または非経口(皮下、筋肉内、静脈内、および経皮内を含む) 投与に適切なものを含む。処方物は、単位投薬量形態で便利に提示され得、そして薬学の分野で周知の任意の方法によって調製され得る。例えば、Gilmanら、( 編)(1990) Goodman and Gilman's:The Pharmacological Bases of Therapeut ics ,第8版、Pergamon Press;およびRemington's Pharmaceutical Sciences ,第17版、(1990),Mack Publishing Co.,Easton Pennを参照のこと。本発明の治療は、他の化学治療剤または化学予防剤と組み合わせであり得るかまたは共同して使用され得る。 本発明のBAS-1抗原の天然に存在する形態および組換え形態の両方が、化合物をタンパク質への結合活性についてスクリーニングし得るキットおよびアッセイ方法において特に有用である。自動アッセイのいくつかの方法が、近年開発され、その結果、短期間で何万もの化合物のスクリーニングが可能になった。例えば、Fodorら、(1991) Science 251:767-773を参照のこと。これは、固体基質上で合成された複数個の定義されたポリマーによる結合親和性の試験のための手段を記載する。適切なアッセイの開発は、本発明によって提供されるような多量の精製された可溶化BAS-1の有効性によって非常に促進され得る。 例えば、一旦BAS-1が構造的に規定されるとアンタゴニストが、通常見出され得る。潜在的なリガンドアンタゴニストの試験は、現在、精製BAS-1を使用する高度な自動アッセイ法の開発において可能である。特に、新規アゴニストおよびアンタゴニストは、本明細書中の利用可能なスクリーニング技術を使用することによって発見される。特に重要な化合物は、複数のBAS-1タンパク質(例えば、B AS-1の対立遺伝子改変体についてのアンタゴニストとして役立ち得る化合物)についての組み合わされた結合親和性を有することが見出される化合物である。 さらに、BAS-1:BAS-1結合パートナーを介するシグナル伝達は、他のシグナル(例えば、CD28/CTLA-4:B7/B70および/またはCD40:CD40リガンド経路)と共同して機能し得るので、そのような経路との組み合わせ組成物または組み合わせ治療もまた考慮される。従って、複数のシグナル経路の拮抗作用、または複数の経路を用いた刺激が有用であり得る。 本発明は、種々の薬物スクリーニング技術のいずれかにおいて組換え抗原を用いることにより化合物をスクリーニングすることに特に有用である。特定のリガンドをスクリーニングすることにおいて、組換えタンパク質を使用することの利点としては:(a)特定の供給源由来のBAS-1の改善された継続的な供給源;(b)アッセイにおける、より良好なシグナル対ノイズ比を与える細胞あたりの潜在的により大きな数の抗原分子;および(c)種改変体特異性(理論的には、より大きな生物学的および疾患的特異性を示す)が挙げられる。 薬物スクリーニングの1つの方法は、BAS-1を発現する組換えDNA分子で安定に形質転換されている真核生物または原核生物の宿主細胞を利用することである。 BAS-1を単独で発現する細胞が、他のものから単離され得る。このような細胞は、生存形態または固定形態のいずれかで標準的な抗原/リガンド結合アッセイに使用され得る。Parceら、(1989) Science 246:243-247;およびOwickiら、(199 0) Proc .Nat'l Acad.Sci.USA 87:4007-4011をまた参照のこと。これらは細胞の応答を検出するための高感度の方法を記載している。競合アッセイは、細胞( BAS-1の供給源)が、抗原への既知の結合親和性を有する標識されたリガンド( 例えば、 125 I-リガンド)、およびBAS-1への結合親和性が測定されるべき試験化合物と接触され、そしてインキュベートされる場合に、特に有用である。次いで、結合リガンドおよび遊離リガンドは分離されて、リガンド結合の程度が評価される。結合した試験化合物の量は、測定される標識されたリガンド結合の量と反比例する。多数の技術のいずれか1つが使用されて結合リガンドと遊離リガンドとが分離されて、リガンド結合の程度が評価される。この分離工程は、代表的には、フィルターへの付着、それに続く洗浄、プラスチックへの付着、それに続く洗浄、または細胞膜の遠心分離のような手順を含む。生存細胞はまた、BAS-1媒介機能における薬物の効果(例えば、二次メッセンジャーレベル、すなわち、Ca ++ ;細胞増殖;イノシトールリン酸プールの変化など)についてスクリーニングするために使用され得る。いくつかの検出方法により、分離工程(例えば、近接感受性検出系)の削除が可能になる。カルシウム感受性色素は、蛍光定量装置または蛍光細胞分取装置を用いて、Ca ++レベルを検出するのに有用である。 別の方法は、ヒトBAS-1の供給源として形質転換された真核生物または原核生物の宿主細胞由来の膜を利用する。これらの細胞は、ヒトBAS-1抗原の発現を指向するDNAベクターで安定に形質転換される。基本的に、膜は細胞から調製され、そして上記の競合アッセイのような任意のレセプター/リガンド結合アッセイに使用される。 さらに別のアプローチは、形質転換された真核生物または原核生物の宿主細胞由来の可溶化された未精製BAS-1、または可溶化された精製BSA-1を利用することである。これは、増大した特異性、自動化するための能力、および高度な薬物試験の処理能力を有する「分子」結合アッセイを可能にする。 薬物スクリーニングのための別の技術は、ヒトBAS-1に対して適切な結合親和性を有する化合物の高処理能力スクリーニングを提供し、そして1984年9月13日に公開されたGeysen、欧州特許出願84/03564に詳細に記載されている。最初に、 多数の異なる小さなペプチド試験化合物が、固相基板(例えば、プラスチックピンまたはいくつかの他の適切な表面)上で合成される。Fodorら(1991)を参照のこと。次いで、全てのピンが、可溶化された未精製BAS-1、または可溶化された精製BAS-1と反応され、そして洗浄される。次の工程は、結合BAS-1を検出することを含む。 合理的な薬物設計はまた、BAS-1および他のエフェクターまたはリガンドの分子形状の構造的研究に基づき得る。エフェクターは、リガンド結合に応答して他の機能を媒介する他のタンパク質、または抗原と正常に相互作用する他のタンパク質であり得る。どの部位が特定の他のタンパク質と相互作用するかを決定するための1つの手段は、物理的な構造決定である(例えば、X線結晶構造解析または2次元NMR技術)。これらは、どのアミノ酸残基が分子接触領域を形成するかに関するガイダンスを提供する。タンパク質構造決定の詳細な記載については、 例えば、BlundellおよびJohnson(1976) Protein Crystallography ,Academic P ress,New Yorkを参照のこと。 精製されたBAS-1は、前述の薬物スクリーニング技術における使用のためにプレート上に直接コーティングされ得る。しかし、これらの抗原に対する非中和抗体は、固相に各々のBAS-1を固定化するための捕捉抗体として用いられ得る。 IX.キット 本発明はまた、BAS-1またはリガンドの存在を検出するための種々の診断キットおよび方法における、BAS-1タンパク質、そのフラグメント、ペプチド、およびそれらの融合産物の使用を意図する。代表的には、キットは、規定されたBAS- 1ペプチドもしくは遺伝子セグメントまたは一方もしくは他方を認識する試薬のいずれかを含有するコンパートメントを有する。 BAS-1に対する試験化合物の結合親和性を決定するためのキットは、代表的には、試験化合物;標識化合物、例えば、BAS-1に対する既知の結合親和性を有するリガンドまたは抗体;BAS-1の供給源(天然に存在するかまたは組換え体); および結合標識化合物と遊離標識化合物とを分離するための手段(例えば、BAS- 1を固定化するための固相)を含む。一旦化合物がスクリーニングされれば、BAS -1への適切な結合親和性を有する化合物は、それらがアゴニストまたはアンタゴニストとして作用するかどうかを決定するために、当該分野で周知であるような、適切な生物学的アッセイにおいて評価され得る。組換えBAS-1ポリペプチドの有用性はまた、そのようなアッセイを較正するための十分に規定されたスタンダードを提供する。 例えば、サンプル中のBAS-1の濃度を決定するための好ましいキットは、代表的には、BAS-1に対する既知の結合親和性を有する標識された化合物(例えば、B AS-1に対する既知の親和性を有するリガンドまたは抗体)、BAS-1の供給源(天然に存在するかまたは組換え体)および結合標識化合物と遊離標識化合物とを分離するための手段(例えば、BAS-1を固定化するための固相)を含む。試薬を含むコンパートメントおよび使用説明書が、通常、提供される。 サンプル中のBAS-1の濃度を決定するための1つの方法は、代表的には以下の工程を含む:(1)BAS-1供給源からなるサンプルから膜を調製する工程;(2)膜を洗浄し、そして緩衝液中でそれらを懸濁する工程;(3)適切な界面活性剤が添加された培養培地中で膜をインキュベートすることによりBAS-1を可溶化する工程;(4)可溶化されたBAS-1の界面活性剤濃度を調整する工程;(5)複合体を形成させるために、上記の希釈物と放射標識リガンドとを接触させ、そしてインキュベートする工程;(6)ポリエチレンイミン処理フィルターを通す濾過によるような複合体を回収する工程;および(7)回収された複合体の放射活性を測定する工程。 ヒトBAS-1またはBAS-1フラグメントに特異的な抗体(抗原結合フラグメントを含む)は、診断的適用(例えば、上昇したレベルのBAS-1および/またはそのフラグメントの存在を検出するため)に有用である。このような診断的アッセイは、 溶解物、生細胞、固定化細胞、免疫蛍光、細胞培養物、体液を使用し得、さらに血清中のBAS-1に関連した抗原の検出などを含み得る。診断的アッセイは、同種性(遊離試薬と抗原-リガンド複合体との間の分離工程を有さない)であるか、 または異種性(分離工程を有する)であり得る。種々の商業用アッセイが存在する。例えば、放射免疫アッセイ(RIA)、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)、 酵素免疫アッセイ(EIA)、酵素多様性免疫アッセイ技術(EMIT)、基質-標識蛍光免疫アッセイ(SLFIA)など。例えば、非標識抗体は、標識され、そしてBAS-1 に対する抗体またはその特定のフラグメントを認識する二次抗体を用いることにより使用され得る。これらのアッセイはまた、文献に広範に考察されている。例えば、HarlowおよびLane(1988) Antibodies:A Laboratory Manual ,CSHを参照のこと。 抗-イディオタイプ抗体は、ヒトBAS-1に対する抗体の存在(これは種々の異常な状態の診断であり得る)を診断するための同様の使用を有し得る。例えば、BA S-1の過剰生産は、異常な生理学的状態(特に、ガンまたは異常な分化のような増殖性の細胞状態における)の診断であり得る種々の免疫学的反応の産生を生じ得る。 頻繁に、診断的アッセイのための試薬は、アッセイの感度を至適化するために、キットにおいて供給される。本発明に関して、アッセイの性質に応じて、プロトコル、および標識(標識抗体または非標識抗体のいずれか)、または標識BAS- 1が提供される。これは、通常、他の添加物(例えば、緩衝液、安定剤、酵素に対する基質のようなシグナル産生に必要な物質など)と組み合わされる。好ましくは、キットはまた、適切な使用および使用後の内容物の処分に関する使用説明書を含む。代表的には、キットは、それぞれの有用な試薬のためのコンパートメントを有する。望ましくは、試薬は、凍結乾燥粉体として提供される。ここで、 試薬は、水性媒体において再構成されて、アッセイを行うための適切な濃度の試薬が提供され得る。 任意の薬物スクリーニングおよび診断アッセイの前述の成分は、改変なしで用いられてもよいし、種々の方法で改変されてもよい。例えば、標識は、検出可能シグナルを直接的または間接的に提供する部分を共有結合的または非共有結合的に結合させることにより達成され得る。これらのアッセイのいずれかにおいて、 リガンド、試験化合物、BAS-1、またはそれに対する抗体が、直接的または間接的に標識され得る。直接的な標識について考えられるものとしては、以下の標識群が挙げられる: 125 Iのような放射標識、ペルオキシダーゼおよびアルカリホスファターゼのような酵素(米国特許第3,645,090号)、および蛍光強度、波長シフト、または蛍光偏光における変化をモニターし得る蛍光標識(米国特許第3,940 ,475号)(両特許は、本明細書中に参考として援用される)。間接的な標識について考えられるものとしては、ある成分のビオチン標識、およびそれに続く上記標識群のいずれかにカップリングしたアビジンへの結合が挙げられる。 結合リガンドと遊離リガンドとを、または代替的には結合試験化合物と遊離試験化合物とを分離する多数の方法もまた存在する。BAS-1は、種々のマトリックス上に固定化され得、それに続いて洗浄され得る。適切なマトリックスとしては、ELISAプレート、フィルター、およびビーズのようなプラスチックが挙げられる。BAS-1をマトリックスに固定化する方法としては、プラスチックへの直接的な付着、捕捉抗体の使用、化学的カップリング、およびビオチン-アビジンが挙げられるが、これらに限定されない。このアプローチにおける最終工程は、例えば、ポリエチレングリコールのような有機溶媒または硫酸アンモニウムのような塩を利用する方法を含むいくつかの方法のいずれかによる抗原/リガンド複合体の沈殿を含む。他の適切な分離技術としては、Rattleら(1984) Clin .Chem. 30:1 457-1461に記載されているフルオレセイン抗体磁化粒子法、および米国特許第4, 659,678号に記載されている二重抗体磁性粒子分離が挙げられるが、これらに限定されない。 タンパク質またはそれらのフラグメントを種々の標識に連結するための方法は、文献に広範に報告されている。それらの技術の多くは、カルボジイミドまたはペプチド結合を形成するための活性エステルのいずれかの使用を介した活性化カルボキシル基、クロロアセチルのような活性化ハロゲンとのメルカプト基の反応によるチオエーテルの形成、またはマレイミドのような活性化オレフィンなどの連結のための使用を含む。融合タンパク質はまた、これらの適用における使用を見出す。 本発明の別の診断的局面は、BAS-1の配列から得られるポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの配列の使用を含む。これらの配列は、異常な状態(例えば、ガンまたは発生的な問題)を有すると推測される患者由来のサンプル中の抗原のレベルを検出するためのプローブとして使用され得る。RNAおよびDNAのヌクレオチド配列の両方の調製、配列の標識、および配列の好ましい大きさは、文献の十分な記載および考察を受け入れている。通常、オリゴヌクレオチドプローブは、少なくとも約14ヌクレオチド、通常は少なくとも18ヌクレオチドを有するべきであり、そしてポリヌクレオチドプローブは、数キロベースまでであり得る。 種々の標識が用いられ得、ほとんどの一般的な放射性核種、特に32 Pが用いられ得る。しかし、他の技術(例えば、ポリヌクレオチドへの導入のためのビオチン改変ヌクレオチドを用いる技術)もまた使用され得る。次いで、ビオチンは、アビジンまたは抗体に結合するための部位として働く。これらは、広範な種々の標識(例えば、放射性核種、蛍光剤、酵素など)で標識され得る。あるいは、特定の二重鎖(DNA二重鎖、RNA二重鎖、DNA-RNAハイブリッド二重鎖、またはDNA-タンパク質二重鎖を含む)を認識し得る抗体が用いられ得る。次いで、抗体は標識され得、そして二重鎖が表面に結合し得るアッセイが行われ得る。その結果、表面における二重鎖の形成により、二重鎖に結合した抗体の存在が検出され得る。 新規のアンチセンスRNAに対するプローブの使用は、任意の従来の技術(例えば、核酸ハイブリダイゼーション、プラスおよびマイナスのスクリーニング、組換え性のプロービング、ハイブリッド放出トランスレーション(HRT)、およびハイブリッド拘束トランスレーション(HART))において行われ得る。これはまた、 ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)のような増幅技術を含む。 他のマーカーの質的存在または量的存在についてもまた試験する診断キットもまた意図される。診断または予後は、マーカーとして用いられる複数の指標の組み合わせに依存し得る。従って、キットは、マーカーの組み合わせについて試験し得る。例えば、Vialletら、(1989) Progress in Growth Factor Res. 1:89-9 7を参照のこと。 X.リガンドまたはカウンターレセプター 本明細書中のBAS-1タンパク質の記載は、カウンターレセプターまたはリガンドを同定する手段を提供する。そのようなリガンドまたはカウンターレセプターは、適度な高親和性でBAS-1に特異的に結合するはずである。BAS-1のパートナーを検出するためのBAS-1の標識のいずれかを可能にする種々の構築物が利用可能である。例えば、BAS-1の直接的な標識、二次的標識のためのマーカー(例えば、FLAGまたは他のエピトープタグ)をBAS-1に融合させること、Igドメイン融合などは、結合パートナーの検出を可能にする。これは、生化学的精製のための親和的方法のように組織学的であるか、または発現クローニングアプローチにおける標識もしくは選択であり得る。ツーハイブリッド選択系もまた、入手可能なBA S-1配列を用いて適切な構築物を作製することに適用され得る。例えば、Fields およびSong(1989) Nature 340:245-246を参照のこと。 本発明の広範な範囲は、以下の実施例を参照することにより最も良好に理解される。それらは、特定の実施態様に本発明を限定することを意図しない。 実施例 I.一般的な方法 いくつかの標準的な方法は、例えばManiatisら(1982) Molecular Cloning ,A Laboratory Manual ,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor Pr ess;Sambrookら(1989) Molecular Cloning ,A Laboratory Manual ,(第2版)、 1〜3巻、CSH Press,NY;Ausubelら、 Biology ,Greene Publishing Associates ,Brooklyn,NY;またはAusubelら(1987および補遺) Current Protocols in Mol ecular Biology ,Greene/Wiley,New Yorkに記載または引用されている。タンパク質精製の方法としては、硫安沈殿法、カラムクロマトグラフィー、電気泳動、 遠心分離、結晶化、およびその他の方法が挙げられる。例えば、Ausubelら(198 7および定期補遺);Deutscher(1990)「Guide to Protein Purification」 Met hods in Enzymology 、182巻、およびこのシリーズのその他の巻;およびタンパク質精製産物の使用に関する製造者の文献、例えば、Pharmacia,Piscataway,N . J.、またはBio-Rad,Richmond,CAを参照のこと。組換え技術との組み合わせは、適切なセグメント、例えば、FLAG配列またはプロテアーゼ除去可能な配列を介して融合され得る等価物への融合を可能にする。例えば、Hochuli(1989) Chemi sche Industrie 12:69-70;Hochuli(1990)「Purification of Recombinant Pr oteins with Metal Chelate Absorbent」Setlow(編) Genetic Engineering ,Pr inciple and Methods 12:87-98,Plenum Press,NY;およびCroweら(1992) QI Aexpress:The High Level Expression & Protein Purification System QUIAGEN ,Inc.,Chatsworth,CAを参照のこと。 例えば、GCG(U.Wisconsin)およびGenbankのソースからのソフトウェアプログラムを含む、入手可能なソフトウェアプログラムを使用して、コンピューター配列分析を実施する。公共配列データベースもまた、例えば、Genbankおよびその他から使用した。 II.PCRによるヒトBAS-1フラグメントの増幅 マウスRP105配列に従って、2つのプライマーを設計した。Miyakeら(1995) J .Immunol. 154:3333-3340を参照のこと。ヌクレオチドの指定は、この文献中のCTT配列に帰する。5'プライマーA(TTG…)は162位から185位の24ヌクレオチドに対応し、また3'プライマーF(…TTC)は1462位から1485位の24ヌクレオチドに対応する。ヒト扁桃B細胞からPCR産物は得られなかった。 3個の5'プライマーを作製した:321〜344ヌクレオチド位を包含するプライマーB(ACA…)、568〜591ヌクレオチド位を包含するプライマーC(AAG…)、 および859〜882ヌクレオチド位を包含するプライマーD(TCT…)。3個の他の3'プライマーもまた作製した:1765〜1788ヌクレオチド位を包含するプライマーG(…TTA)、2024〜2047ヌクレオチド位を包含するプライマーH(…GAA)、 および1164〜1187ヌクレオチド位を包含するプライマーE(…TGG)。 ヒト扁桃B細胞からPCR産物を得る機会を増加させるために、1個の5'プライマーを4個の3'プライマーと組み合わせて使用することによってPCR反応を実施した。これら4グループのPCR反応から、たった1つの明らかな300bp産物が得られ、それは5'プライマーDから3'プライマーEに及んだ。この産物を精製し、pCR TMベクター(Invitrogen,San Diego CA)にサブクローン化し、そして次いで配列決定した。配列番号1を参照のこと。 300bpのヒト配列に従って、3個のプライマーを設計した:5'プライマーK ;3'プライマーIおよびL。同様のPCR法を使用して、プライマーCとIの組み合わせで別の300bpヒトフラグメントを得た(配列番号1を参照のこと)。 III.ヒトBAS-1の組織分布 プライマー対D−Eによって増幅されたPCR産物(配列番号1を参照のこと) をプローブ(D−Eプローブ)として使用し、ヒト組織におけるBAS-1の組織分布を研究した。2.6kbのmRNAが、ノーザンブロットによって、ヒト脾臓において、およびそれより低レベルでヒト心臓において検出された。これは、ヒト脳、胸腺、肺、肝臓、骨格筋、腎臓、前立腺、精巣、卵巣、小腸、結腸、および末梢血白血球においては、容易に検出されなかった。さらに、2.6kbのメッセージが、 ノーザンブロットによって、sIgD+リンパ腫細胞株B104において、およびそれより低いレベルでバーキットリンパ腫細胞株BL2において検出されたが、腎臓上皮癌細胞株CHA、肺上皮癌細胞株MRC-5、EBV細胞株JY、または単核細胞株U937においては検出されなかった。 PCRによって、以下の細胞において、ヒトBAS-1メッセージRNAが見出された:s IgD + CD38 -ナイーブB細胞、sIgD + CD38 +胚中心B細胞、sIgD - CD38 +胚中心B細胞、sIgD - CD38 -記憶B細胞、sCD38 ++ CD20 low血漿細胞、GM-CSFとIL-4で培養したCD 14+単核細胞から生じた樹状細胞、およびGM-CSFとTNF−αで培養したCD34+臍帯血細胞から生じた樹状細胞。このメッセージは、ヒトT細胞株MT9においては、P CRによって検出されなかった。 IV.ヒトsIgD+リンパ腫細胞株B104由来のプラスミドcDNAライブラリーのスクリーニング ノーザンブロット分析の結果から、B104細胞株の6μgのポリA mRNAにおいてB AS-1の発現が検出された。従って、B104 cDNAライブラリーを、pSPORT1プラスミド(Gibco Life Technologies,Cergy Pontoise,France)に構築した。150,000 の細菌コロニーのスクリーニング後、D−Eプローブの使用によって、陽性のクローンは得られなかった。これは、ヒト細胞においてBAS-1の発現が非常に低いものであり得ることを反映し得る。 V.ヒト脾臓のλgt10バクテリオファージライブラリーのスクリーニング さらに多くのクローンをスクリーニングするため、ヒト脾臓のλgt10バクテリオファージライブラリー(Clontech)を使用した。2.4×10 6クローンをスクリーニングした後、8個の陽性クローンを同定した。これらのクローンを単離し、精製し、そしてpME18Sプラスミド(DNAX,Palo Alto,CA)にサブクローン化した。配列決定の後、2クローンS2およびL1が全長ヒトBAS-1を表すことが見出された(配列番号1を参照のこと)。単離された全長ヒトBAS-1 cDNAは、約2635bpを含み、そして約661アミノ酸のタンパク質をコードする。このタンパク質産物は、約11のグリコシル化可能部位および約22のロイシンに富む反復モチーフを含む。このヒトBAS-1 cDNAのコード領域はマウスRP105配列のコード領域と約72%の相同性を共有し、そしてこの完全BAS-1 cDNAは完全マウスcDNA配列と約67%の相同性を共有する。ヒトBAS-1とマウスRP105との間のアミノ酸の相同性は、約73.5 %である。 VI.ヒトBAS-1タンパク質の発現 5'および3'非コード領域の欠失およびMarylin Kozak(参照:J.Biol.Ch em.266:19867,1991)コンセンサス配列(ACCATGG;配列番号3)の付加によって、翻訳レベルを増強させるように、全ての構築を行った。 可溶性BAS-1-FLAGタンパク質を以下の通りに、Cos-7細胞において一時的に発現させた。カルボキシ末端にあるFLAGペプチドを提示するBAS-1の組換え型(Hop peら(1988) Biotechnology 6:1205-1210)を発現ベクターpME18Sに導入し、そして引き続き、電気穿孔法(エレクトロポレーション)によってCos-7細胞にトランスフェクトさせた。電気穿孔させた細胞を、1%のNutridoma HU(Boehringe r Mannheim,Mannheim,Germany)を添加したDMEM培地、もしくはDMEM培地のみで5日間生育させた。 VII.可溶性BAS-1 FLAGタンパク質の精製 代表的には、Chelating Sepharose Fast Flow matrix(Pharmacia,Upsalla, Sweden)にCu ++イオンを結合させた20mlのカラムに、可溶性BAS-1FLAGを含む280 mlの上清を通過させた。16容量の結合緩衝液(His-Bind Buffer kit,Novagen, Madison,WI)で洗浄の後、金属イオンによって保持されたタンパク質を20〜100 mMイミダゾールの濃度勾配を用いて溶出した。溶出画分中のヒトBAS-1 FLAG含量を、抗FLAGモノクローナル抗体M2(Eastman Kodak,New Haven,CT)を用いてドットブロットによって、そして還元SDS-PAGEのCoomassie blue染色および銀染色によって決定した。次いで、BAS-1 FLAGタンパク質含有画分をプールし、そしてPBSに対して透析した。ウェスタンブロットによると、濃縮ヒトBAS-1は約95kdおよび97kdのタンパク質に相当した。これは、アミノ酸配列から推定された通りであった。 VIII.NIH-3T3細胞における膜BAS-1の安定発現 ネイティブな膜型を、発現ベクターpMAMneo(Clontech,Palo Alto,Californ ia)(これは、デキサメタゾン誘導性MMTV-LTRプロモーターに連結したRSV-LTR エンハンサーを含む)にサブクローン化した。この構築物を、次いでエレクトロポレーションによってNIH-3T3細胞にトランスフェクトした。10%胎児子牛血清を添加した選択的0.5mg/mlGeneticin(G418)(Boehringer-Mannheim,Mannheim ,Germany)DMEMに、トランスフェクトされたNIH-3T3細胞を播種した。 これらの安定なトランスフェクトされたNIH-3T3細胞における膜BAS-1タンパク質の生化学的な特徴付けを、代謝標識で行った。細胞を、次いで10%胎児子牛血清および1μM最終濃度のデキサメタゾン(Sigma,Saint Quentin Fallavier,F rance)を添加したDMEM培地で24時間培養した。次いで、細胞タンパク質を標識するために、最後の12時間の間、細胞を35 S-Metおよび35 S-Cysと共にインキュベートした。SDS-PAGEにおける還元条件下でのタンパク質の分析は、トランスフェクトされたNIH-3T3細胞の溶解物中に推定110kDaタンパク質を示したが、非トランスフエクトNIH-3T3細胞の溶解物中には示さなかった。 IX.BAS-1に特異的な抗体の調製 同系交配Balb/cマウスを、ヒトタンパク質の組換え型で腹腔内免疫した。最初のマウスには、精製した可溶性BAS−1FLAGを受容させ、そして第2のマウスには、安定にトランスフェクトされたNIH-3T3細胞を受容させた。動物を、適切な時点で、付加的なアジュバントと共にまたはこれを伴わずにタンパク質で追加抗原剌激し、抗体産生をさらに刺激させる。血清を収集するか、または採取した脾臓を用いてハイブリドーマを作製する。 あるいは、Balb/cマウスを、遺伝子またはそのフラグメントで形質転換された細胞(内生細胞または外来性細胞のいずれか)、または抗原の発現のために増加させた単離した膜で免疫する。血清を、適切な時間に、代表的には非常に多くのさらなる投与の後に収集する。種々の遺伝子治療技術は、免疫応答を起こすために、例えば、インサイチュでタンパク質を産生するに際して、有用であり得る。 モノクローナル抗体を作製し得る。例えば、脾細胞を適切な融合相手と融合し、そしてハイブリドーマを標準的な手順によって生育培地において選択する。ハイブリドーマ上清を、ヒトBAS-1に結合する抗体の存在について、例えば、ELISA または他のアッセイによってスクリーニングする。ヒトBAS-1を特異的に認識するが、種改変体を認識しない抗体をもまた、選択または調製し得る。 別の方法では、免疫系に合成ペプチドまたは精製タンパク質を与え、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体を生成させる。例えば、Collgan(1991) C urrent Protocols in Immunology Wiley/Greene;およびHarlowおよびLane(198 9) Antibodies:A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Pressを参照のこと。 適切な状況において、結合試薬を、上記の通りに、例えば蛍光もしくはその他で標識するか、またはパンニング法のために基質に固定化する。核酸もまた、抗原産生のために、動物における細胞に導入し得る。この抗原が、免疫応答を惹起するように供せられる。例えば、Wangら(1993) Proc .Nat'l.Acad.Sci. 90:415 6-4160;Barryら(1994) BioTechniques 16:616-619;およびXiangら(1995) Im munity 2:129-135を参照のこと。 X.NSO細胞におけるBAS-1の大量生産 例えば、Celltech(Slough,Berkshire,UK;国際特許出願WO86/05807、W87/04 462、WO89/01036およびWO89/10404)によって開発された方法論に従って調製したNSO細胞の安定な形質転換体から、大量の可溶性BAS-1および可溶性BAS-1FLAG を生成し得る。BAS-1およびBAS-1-FLAGの両方を、pEE12中にサブクローン化し、 そして引き続いてエレクトロポレーションによって、NSO細胞にトランスフェクトさせた。Celltechのプロトコルに記載の通り、トランスフェクトされたNSO細胞を、10%胎児子牛血清を添加した選択的グルタミン非含有DMEMに播種した。最良の生産株からの上清を、生物学的アッセイおよび可溶性BAS-1および可溶性BAS -1FLAGの精製において用いた。 その他の発現系は、大量の組換えタンパク質を生産するために使用され得る。 XI.BAS-1を用いる融合タンパク質の生産 種々の融合構築物を、BAS-1細胞外ドメインを用いて作製する。遺伝子のこの部分を、別のタンパク質(例えば、FLAGエピトープタグ、Igドメイン)、または2ハイブリッド系構築物に融合する。例えば、FieldsおよびSong(1989) Nature 340:245-246を参照のこと。 エピトープタグは、結合相手(例えば、BAS-1のリガンド)を検出するために、抗FLAG抗体を用いる検出を伴う発現クローン化手順において使用され得る。あるいは、Igドメインが、リガンドの抗原様アフィニティーを用いて精製するために使用され得る。2ハイブリッド系もまた、BAS-1に特異的に結合するタンパク質を単離するために使用され得る。 XII.インサイチュでのハイブリダイゼーションによるヒトBAS-1のマッピング 染色体展開物を調製した。フィトヘマグルチニンによって刺激された、72時間培養したヒトリンパ球から得られた染色体調製物について、インサイチュでのハイブリダイゼーションを実施した。培養の最後の7時間、5-ブロモデオキシウリジンを添加し(培地当たり60μg/ml)、良質のポストハイブリダイゼーション染色体バンディングを確実にした。 全B細胞cDNA鋳型においてプライマー(例えば、ヌクレオチド395〜411および1027〜1050に相当する)の助けを借りて増幅された、655bpのPCRフラグメントを、適切なベクターにクローン化した。ベクターを、 3 Hを用いるニックトランスレーションによって標識した。放射性標識したプローブを、Matteiら(1985) Hum .Genet. 69:327-331に記載の通りに、ハイブリダイゼーション溶液の200ng/ml の最終濃度で中期展開物にハイブリダイズさせた。 核追跡乳剤(nuclear track emulsion)(KODAK NTB 2 )でコーティング後、スライドを4℃で18日間照射した。バンディング手順の間に銀粒子が滑り落ちるのを避けるために、染色体展開物をまず緩衝化ギムザ溶液で染色し、そして中期を写真に撮った。次いで、蛍光色素光分解ギムザ(FPG)法によってR-バンディングを実施し、そして分析の前に中期を再び写真に撮った。 インサイチュでのハイブリダイゼーション後に調査した100個の中期細胞において、20%の銀粒子が第5染色体に位置した。粒子の分布はランダムでなく、そのうち67%が第5染色体長腕のq11.2〜q13.1領域にマッピングされた。これは、 ヒトBAS-1を、ヒトゲノムの5q11.2〜q13.1領域にマッピングする。 XIII.ヒトBAS-1のレセプターの単離 ヒトBAS-1は、特異的結合試薬としてその結合相手を同定するために使用され得る。これは、抗体が使用されることと非常に似通っており、その結合特異性を利用することによる。結合試薬は、上記の通りに例えば蛍光もしくはその他で標識するか、またはパンニング法のために基質に固定化する。 結合組成物が、結合相手(すなわち、レセプター)を発現する細胞株から作製される発現ライブラリーをスクリーニングするために用いられる。標準的な染色技術が、細胞内または細胞表面で発現されるレセプターを検出またはソーティングするために用いられるか、あるいは細胞表面で発現する形質転換された細胞がパンニングによってスクリーニングされる。種々の染色または免疫蛍光手順によって、細胞内発現のスクリーニングを実施する。McMahanら(1991) EMBO J. 10: 2821-2832もまた、参照のこと。 例えば0日目には、チャンバー当たり1mlのフィブロネクチン(PBS中に10ng/m l)で、室温で30分間、2チャンバーパーマノックススライドをプレコートする。PBSで一回リンスする。次いで、チャンバー当たり2〜3×10 5細胞のCOS細胞を、1.5mlの生育培地にプレートする。37℃で一晩インキュベートする。 各サンプルについて1日目に、血清非含有DMEに66μg/mlのDEAEデキストラン、66μMクロロキン、および4μgDNAを含む0.5mlの溶液を調製する。各セットについて、(例えば、1および1/200倍希釈でのヒトBAS−1-FLAG cDNAの)ポジティブコントロールおよびネガティブモックを調製する。血清非含有DMEで細胞をリンスする。DNA溶液を添加し、37℃で5時間インキュベートする。培地を除去し、そしてDME中の10%DMSOを0.5ml、2.5分間添加する。除去し、そしてDMEで1回洗浄する。1.5mlの生育培地を添加し、そして一晩インキュベートする。 2日目に、培地を変える。3日目または4日目に、細胞を固定および染色する。ハンクス平衡塩溶液(HBSS)で細胞を2回リンスし、そして5分間4%パラホルムアルデヒド(PFA)/グルコース中に固定する。HBSSで3回洗浄する。全液体を除去した後、スライドを-80℃で保存し得る。各チャンバーにつき、以下の通りに0.5mlのインキュベーションを実施する。32μl/mlの1M NaN 3と共にHBSS /サポニン(0.1%)を20分間添加する。次いで、HBSS/サポニンで細胞を1回洗浄する。細胞にヒトBAS-1またはBAS-1/抗体複合体を添加し、そして30分間インキュベートする。HBSS/サポニンで細胞を2回洗浄する。適切な場合には、第1抗体(first antibody)を30分間添加する。第2抗体(second antibody)(例えば、ベクター抗マウス抗体)を1/200倍希釈で添加し、そして30分間インキュベートする。ELISA溶液(例えば、Vector Ellte ABCセイヨウワサビペルオキシダーゼ溶液)を調製し、そして30分間プレインキュベートする。例えば、2.5mlのH BSS/サポニン当たり溶液A(アビジン)1滴および溶液B(ビオチン)1滴を使用する。HBSS/サポニンで細胞を2回洗浄する。ABC HRP溶液を添加し、そして3 0分間インキュベートする。HBSSで細胞を2回洗浄し、2回目の洗浄を2分間行って細胞を密閉する。次いで、5〜10分間、ベクターにジアミノ安息香酸(DAB) を添加する。5mlのガラス蒸留水当たり2滴の緩衝液および4滴のDABおよび2滴のH 2 O 2を使用する。注意深くチャンバーを除去し、スライドを水中でリンスする。2〜3分間風乾し、次いでCrystal Mountを1滴添加し、そしてカバーガラスをのせる。85〜90℃で5分間焼成する。 プールのポジティブ染色を評価し、そして結合を担う単一遺伝子を単離するまで漸進的にサブクローン化する。 あるいは、BAS-1試薬を使用して、レセプターを発現する細胞をアフィニティー精製または選別する。例えば、Sambrookら、またはAusubelらを参照のこと。 別の戦略は、パンニングによって膜結合レセプターをスクリーニングすることである。上記の通りに、レセプターcDNAを構築する。リガンドは固定化され得、 そして発現細胞を固定化するために使用され得る。固定化は、例えば、BAS-1融合構築物のFLAG配列を認識する適切な抗体の使用によるか、もしくは第1抗体に対して生じさせた抗体の使用によって達成され得る。選択および増幅の循環的なサイクルによって、適切なクローンが増加し、そしてその結果レセプター発現クローンが単離される。 ヒトBAS-1によって、ファージ発現ライブラリーをスクリーニングし得る。適切な標識技術(例えば、抗FLAG抗体)は、適切なクローンの特異的な標識を可能にする。 本明細書中の全引用文献は、各刊行物または特許出願が詳細におよび個々に参考としての援用を指摘した範囲と同じ範囲で、本明細書中で参考として援用する。 本発明は、当業者に明らかなように、その精神および範囲から逸脱することなく、それに対して多くの修飾および変化を加え得る。本明細書中に記載される特定の実施態様は例示のためにのみ提供され、本発明は、添付の請求の範囲、ならびにこのような請求を享受する等価物の全範囲によって制限されるべきものである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl. 7識別記号 FI テーマコート゛(参考) A61K 39/395 A61K 39/395 N 45/00 45/00 C07K 14/705 C07K 14/705 16/28 16/28 19/00 19/00 C12N 1/15 C12N 1/15 1/19 1/19 1/21 1/21 C12P 21/08 5/10 C12Q 1/68 A 15/02 C12N 15/00 C C12P 21/08 5/00 B C12Q 1/68 A A61K 37/02 (81)指定国 EP(AT,BE,CH,DE, DK,ES,FI,FR,GB,GR,IE,IT,L U,MC,NL,PT,SE),OA(BF,BJ,CF ,CG,CI,CM,GA,GN,ML,MR,NE, SN,TD,TG),AP(GH,KE,LS,MW,S D,SZ,UG),EA(AM,AZ,BY,K ────────────────────────────────────────────────── ─── of the front page continued (51) Int.Cl. 7 identification mark FI theme Court Bu (reference) A61K 39/395 A61K 39/395 N 45/00 45/00 C07K 14/705 C07K 14/705 16/28 16 / 28 19/00 19/00 C12N 1/15 C12N 1/15 1/19 1/19 1/21 1/21 C12P 21/08 5/10 C12Q 1/68 A 15/02 C12N 15/00 C C12P 21 / 08 5/00 B C12Q 1/68 A A61K 37/02 (81) designated States EP (AT, BE, CH, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, L U, MC , NL, PT, SE), OA (BF, BJ, CF, CG, CI, CM, GA, GN, ML, MR, NE, SN, TD, TG), AP (GH, KE, LS, MW, S D, SZ, UG), EA (AM, AZ, BY, K ,KZ ,MD,RU,TJ,TM),AL,AM,AU,AZ ,BA,BB,BG,BR,BY,CA,CN,CZ, EE,GE,HU,IL,IS,JP,KG,KR,K Z,LC,LK,LR,LT,LV,MD,MG,MK ,MN,MX,NO,NZ,PL,RO,RU,SG, SI,SK,TJ,TM,TR,TT,UA,UZ,V N,YU (72)発明者 バンシュロ,ジャック フランス国 エフ―69130 エキュイー, アブニュー ポール サンティ,25 , KZ, MD, RU, TJ, TM), AL, AM, AU, AZ, BA, BB, BG, BR, BY, CA, CN, CZ, EE, GE, HU, IL, IS, JP, KG, KR, K Z, LC, LK, LR, LT, LV, MD, MG, MK, MN, MX, NO, NZ, PL, RO, RU, SG, SI, SK, TJ, TM, TR, TT, UA , UZ, V N, YU (72) inventor Banshuro, Jack France F -69130 Ekyui, Abunyu Paul Santi, 25

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 1. [Claims] 1. ヒトのBAS-1タンパク質またはそのフラグメントをコードする、単離された核酸または組換え核酸。 Encoding BAS-1 protein or fragment thereof of a human, isolated or recombinant nucleic acid. 2. 2. 前記核酸が、配列番号1に規定される配列を含む、請求項1に記載の単離された核酸または組換え核酸。 It said nucleic acid comprises a sequence defined in SEQ ID NO: 1, isolated or recombinant nucleic acid of claim 1. 3. 3. 前記核酸が、前記セグメントをコードする天然のcDNAに少なくとも約80%同一性を示す、請求項2に記載の核酸。 Said nucleic acid exhibits at least about 80% identity to the native cDNA encoding said segment, the nucleic acid of claim 2. 4. 4. 配列番号2の少なくとも8個の連続した残基をコードする、請求項2に記載の単離された核酸または組換え核酸。 Encoding at least 8 contiguous residues of SEQ ID NO: 2, isolated or recombinant nucleic acid of claim 2. 5. 5. 少なくとも12個の連続した残基をコードする、請求項4に記載の核酸。 Encoding at least 12 contiguous residues, nucleic acid according to claim 4. 6. 6. 前記核酸が、前記セグメントをコードする天然のcDNAに少なくとも約80%同一性を示す、請求項4に記載の核酸。 Said nucleic acid exhibits at least about 80% identity to the native cDNA encoding said segment, the nucleic acid of claim 4. 7. 7. 実質的に純粋なBAS-1タンパク質またはそのペプチド。 Substantially pure BAS-1 protein or a peptide. 8. 8. 以下: a)ヒトを含む霊長類由来のタンパク質またはペプチド; b)配列番号2に規定される少なくとも1つのポリペプチドセグメントを含む 、タンパク質またはペプチド; c)天然のBAS-1タンパク質と異なる翻訳後の修飾パターンを示す、タンパク 質またはペプチド;および d)BAS-1の細胞内ドメインを欠くタンパク質からなる群より選択される、請求項7に記載のタンパク質またはペプチド。 : A) a primate-derived, including humans protein or peptide; b) at least one defined in SEQ ID NO: 2 comprising a polypeptide segment, protein or peptide; c) after different from the native BAS-1 protein translation It shows a modification pattern, protein or peptide; and d) is selected from the group consisting of protein lacking the intracellular domain of BAS-1, a protein or peptide of claim 7. 9. 9. ヒトBAS-1に対応する部分に対して配列相同性を示すセグメントを含み、ここで、 a)該相同性が少なくとも約90%の同一性であり、そして該部分が少なくとも 約9個のアミノ酸である; b)該相同性が少なくとも約80%の同一性であり、そして該部分が少なくとも 約17個のアミノ酸である;または c)該相同性が少なくとも約70%の同一性であり、そして該部分が少なくとも 約25個のアミノ酸である、 請求項8に記載のタンパク質またはペプチド。 Includes a segment that indicates the sequence homology to the part corresponding to the human BAS-1, wherein, a) the homology is at least about 90% identity, and the moiety is at least about 9 amino acids there; b) the homology is at least about 80% identity, and the moiety is at least about 17 amino acids; or c) the homology is at least about 70% identity, and the moiety is at least about 25 amino acids, a protein or peptide of claim 8. 10. 10. 請求項7に記載のBAS-1ペプチドを含む、融合タンパク質。 To claim 7 comprising a BAS-1 peptide according fusion protein. 11. 11. 請求項7に記載のタンパク質および薬学的に受容可能なキャリアを含む、 組成物。 To claim 7 comprising a protein and a pharmaceutically acceptable carrier, wherein the composition. 12. 12. 組換えもしくは精製した霊長類BAS-1タンパク質またはそのフラグメントを特異的に結合する、抗体または抗体結合フラグメント。 That specifically binds a recombinant or purified primate BAS-1 protein or fragment thereof, an antibody or antibody binding fragment. 13. 13. 前記BAS-1タンパク質が、ヒト由来のタンパク質を含む霊長類タンパク質である、請求項12に記載の抗体。 The BAS-1 protein is a primate protein comprising a protein derived from a human antibody of claim 12. 14. 14. 前記抗体が、配列番号2に規定されるペプチド配列に対して惹起される、 請求項12に記載の抗体。 Wherein said antibody is raised against a peptide sequence defined in SEQ ID NO: 2 The antibody of claim 12. 15. 15. 前記抗体が少なくとも約10μMのKdを示す、請求項12に記載の抗体。 The antibody exhibit Kd of at least about 10 [mu] M, antibody of claim 12. 16. 16. 前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項12に記載の抗体。 Wherein said antibody is a monoclonal antibody, antibody of claim 12. 17. 17. 前記抗体が標識されている、請求項12に記載の抗体。 The antibody is labeled, the antibody of claim 12. 18. 18. a)B細胞の激しい増殖を誘導する;および/または b)照射誘導アポトーシスからB細胞を保護する、 請求項12に記載の抗体。 Induces intense growth of a) B cells; and / or b) protects B cells from irradiation-induced apoptosis, antibody of claim 12. 19. 19. 請求項1に記載の核酸を含む、発現ベクター。 Comprising the nucleic acid of claim 1, the expression vector. 20. 20. 請求項19に記載のベクターを含む、宿主細胞。 Comprising the vector of claim 19, a host cell. 21. 21. BAS-1の結合パートナーについてサンプルをスクリーニングする方法であって、精製したBAS-1タンパク質または組換えBAS-1タンパク質を産生する工程、 および該BAS-1タンパク質に対する該結合パートナーの特異的結合について該サンプルにおいてスクリーニングする工程を包含する、方法。 A method of screening a sample for BAS-1 binding partner, the step of producing the BAS-1 protein or recombinant BAS-1 protein was purified, and the specific binding of said binding partner to said BAS-1 protein wherein comprising the step of screening the sample. 22. 22. 前記サンプルが、T細胞、濾胞性樹状細胞を含む樹状細胞、または線維芽細胞、内皮細胞、および上皮細胞を含む支質細胞に由来するタンパク質を含む、 請求項21に記載の方法。 Wherein the sample comprises T cells, dendritic cells, including follicular dendritic cells or fibroblasts, and proteins from stroma cells, including endothelial cells and epithelial cells, The method of claim 21. 23. 23. 前記結合パートナーが抗体であり、前記サンプルがハイブリドーマ上清である、請求項21に記載の方法。 It said binding partner is an antibody, the sample is a hybridoma supernatant The method according to claim 21. 24. 24. 細胞の生理機能または発達を調節する方法であって、該細胞をBAS-1タンパク質のアゴニストまたはアンタゴニストと接触させる工程を包含する、方法。 A method of modulating physiology or development of a cell comprising contacting the cell with an agonist or antagonist of BAS-1 proteins, methods. 25. 25. 前記アンタゴニストが、霊長類BAS-1タンパク質に対する抗体である、請求項24に記載の方法。 Wherein the antagonist is an antibody against a primate BAS-1 protein, The method of claim 24. 26. 26. 前記接触工程が、前記抗原レセプター、CD40:CD40リガンド経路、またはC D28/CTLA-4:B7/B70経路を通してのシグナルのメディエーターと組み合わせて行われる、請求項24に記載の方法。 Said contacting step, said antigen receptor, CD40: CD40 ligand pathway, or C D28 / CTLA-4,: B7 / B70 is performed in combination with mediators of signaling through pathways The method of claim 24.
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Families Citing this family (45)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU7434996A (en) * 1995-10-19 1997-05-07 Smithkline Beecham Corporation A novel human b cell surface molecule
BRPI0416028B1 (en) 2003-11-06 2019-02-12 Seattle Genetics, Inc. Compound, compound conjugates, pharmaceutical composition and conjugate uses
BRPI0510883A (en) 2004-06-01 2007-12-26 Genentech Inc conjugated compound of drug and antibody, pharmaceutical composition, inhibition of cell proliferation methods of treating cancer, inhibiting the growth of tumor cells and treating susceptible to dysfunction human patient screening test of cancer cells, fabricated article and method compound of manufacture and antibody drug conjugate
SI1791565T1 (en) 2004-09-23 2016-08-31 Genentech, Inc. Cysteine engineered antibodies and conjugates
US20100111856A1 (en) 2004-09-23 2010-05-06 Herman Gill Zirconium-radiolabeled, cysteine engineered antibody conjugates
CA2809819A1 (en) 2009-09-09 2011-03-17 Centrose, Llc Extracellular targeted drug conjugates
EP2662095A1 (en) 2010-04-15 2013-11-13 Spirogen Sàrl Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
US9000130B2 (en) 2010-06-08 2015-04-07 Genentech, Inc. Cysteine engineered antibodies and conjugates
CA2816426A1 (en) 2010-11-17 2012-06-07 Genentech, Inc. Alaninyl maytansinol antibody conjugates
US8679767B2 (en) 2011-05-12 2014-03-25 Genentech, Inc. Multiple reaction monitoring LC-MS/MS method to detect therapeutic antibodies in animal samples using framework signature peptides
WO2013130093A1 (en) 2012-03-02 2013-09-06 Genentech, Inc. Biomarkers for treatment with anti-tubulin chemotherapeutic compounds
LT2839860T (en) 2012-10-12 2019-07-10 Medimmune Limited Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
LT2906251T (en) 2012-10-12 2017-12-11 Adc Therapeutics Sa Pyrrolobenzodiazepine-anti-cd22 antibody conjugates
ES2703151T3 (en) 2012-10-12 2019-03-07 Adc Therapeutics Sa Pyrrolobenzodiazepine antibody conjugates
PL2906296T3 (en) 2012-10-12 2018-09-28 Adc Therapeutics Sa Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates
EA031585B1 (en) 2012-12-21 2019-01-31 Медимьюн Лимитед Pirrolobenzodiazepiny and their conjugates
CN105246894A (en) 2012-12-21 2016-01-13 斯皮罗根有限公司 Unsymmetrical pyrrolobenzodiazepines-dimers for use in the treatment of proliferative and autoimmune diseases
ES2687439T3 (en) 2013-03-13 2018-10-25 Medimmune Limited Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
JP6340019B2 (en) 2013-03-13 2018-06-06 メドイミューン・リミテッドMedImmune Limited Pyrrolobenzodiazepine and its conjugates
TW201532615A (en) 2013-03-13 2015-09-01 Spirogen Sarl Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
CA2918139A1 (en) 2013-08-12 2015-02-19 Genentech, Inc. 1-(chloromethyl)-2,3-dihydro-1h-benzo[e]indole dimer antibody-drug conjugate compounds, and methods of use and treatment
CN105828840A (en) 2013-12-16 2016-08-03 基因泰克公司 1-(chloromethyl)-2,3-dihydro-1h-benzo[e]indole dimer antibody-drug conjugate compounds, and methods of use and treatment
EP3054983B1 (en) 2013-10-11 2019-03-20 Medimmune Limited Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates
EP3054986B1 (en) 2013-10-11 2019-03-20 Medimmune Limited Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates
GB201317982D0 (en) 2013-10-11 2013-11-27 Spirogen Sarl Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
EP3054985B1 (en) 2013-10-11 2018-12-26 Medimmune Limited Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates
CN105873614A (en) 2013-12-16 2016-08-17 基因泰克公司 Peptidomimetic compounds and antibody-drug conjugates thereof
EP3082875A2 (en) 2013-12-16 2016-10-26 Genentech, Inc. Peptidomimetic compounds and antibody-drug conjugates thereof
CN106687141A (en) 2014-09-10 2017-05-17 麦迪穆有限责任公司 Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
GB201416112D0 (en) 2014-09-12 2014-10-29 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
CN106714844A (en) 2014-09-12 2017-05-24 基因泰克公司 Anthracycline disulfide intermediates, antibody-drug conjugates and methods
EP3388449A3 (en) 2014-09-12 2018-10-24 F. Hoffmann-La Roche AG Cysteine engineered antibodies and conjugates
CR20170099A (en) 2014-09-17 2017-07-19 Genentech Inc Pirrolobenzodiazepinas and antibody-disulfide conjugates thereof
JP2018507168A (en) 2014-12-03 2018-03-15 ジェネンテック, インコーポレイテッド Quaternary amine compounds and antibody-drug conjugates thereof
KR20180054849A (en) 2015-10-02 2018-05-24 제넨테크, 인크. Pyrrolobenzodiazepine antibody drug conjugates and methods for their use
CN108472384A (en) 2015-10-16 2018-08-31 基因泰克公司 Be obstructed disulphide drug conjugate
EP3365025A1 (en) 2015-10-20 2018-08-29 Genentech, Inc. Calicheamicin-antibody-drug conjugates and methods of use
GB201601431D0 (en) 2016-01-26 2016-03-09 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepines
WO2017165734A1 (en) 2016-03-25 2017-09-28 Genentech, Inc. Multiplexed total antibody and antibody-conjugated drug quantification assay
CN109152843A (en) 2016-05-20 2019-01-04 豪夫迈·罗氏有限公司 PROTAC antibody conjugates and its application method
CN109313200A (en) 2016-05-27 2019-02-05 豪夫迈·罗氏有限公司 For characterizing site-specific antibodie-drug conjugate bioanalytical method
CN109476648A (en) 2016-06-06 2019-03-15 豪夫迈·罗氏有限公司 Si Weisi groups of antibody-drug conjugates and application method
CN109689111A (en) 2016-08-11 2019-04-26 基因泰克公司 Pyrrolobenzodiazepines * prodrug and its antibody conjugates
CN110139674A (en) 2016-10-05 2019-08-16 豪夫迈·罗氏有限公司 The method for preparing antibody drug conjugate
US10301319B2 (en) 2017-09-20 2019-05-28 Ph Pharma Co., Ltd. Thailanstatin analogs

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5707829A (en) * 1995-08-11 1998-01-13 Genetics Institute, Inc. DNA sequences and secreted proteins encoded thereby

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Publication number Publication date
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CA2254843A1 (en) 1997-11-27
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