ITRM970200A1 - Vettori ricombinanti utilizzabili in terapia genica - Google Patents

Vettori ricombinanti utilizzabili in terapia genica Download PDF

Info

Publication number
ITRM970200A1
ITRM970200A1 ITRM970200A ITRM970200A1 IT RM970200 A1 ITRM970200 A1 IT RM970200A1 IT RM970200 A ITRM970200 A IT RM970200A IT RM970200 A1 ITRM970200 A1 IT RM970200A1
Authority
IT
Italy
Prior art keywords
sequences
recombinant
aav
dna
gene
Prior art date
Application number
Other languages
English (en)
Inventor
Monica Nicola La
Luisa Pieroni
Elena Fattori
Gabriella Rizzuto
Fabio Palombo
Andrea Monciotti
Cristina Fipaldini
Stefano Colloca
Alessandra Recchia
Gennaro Ciliberto
Original Assignee
Angeletti P Ist Richerche Bio
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Angeletti P Ist Richerche Bio filed Critical Angeletti P Ist Richerche Bio
Priority to ITRM970200 priority Critical patent/IT1291135B1/it
Priority to AU70778/98A priority patent/AU7077898A/en
Priority to PCT/IT1998/000082 priority patent/WO1998045462A1/en
Publication of ITRM970200A1 publication Critical patent/ITRM970200A1/it
Application granted granted Critical
Publication of IT1291135B1 publication Critical patent/IT1291135B1/it

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10334—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10341—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/10344—Chimeric viral vector comprising heterologous viral elements for production of another viral vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/14011—Baculoviridae
    • C12N2710/14041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/14043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vectore
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/14011—Baculoviridae
    • C12N2710/14111—Nucleopolyhedrovirus, e.g. autographa californica nucleopolyhedrovirus
    • C12N2710/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/15011—Lentivirus, not HIV, e.g. FIV, SIV
    • C12N2740/15041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2740/15043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2750/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Description

DESCRIZIONE DELL'INVENZIONE INDUSTRIALE dal titolo: "VETTORI RICOMBINANTI UTILIZZABILI IN TERAPIA GENICA"
DESCRIZIONE
Campo dell'invenzione
La presente invenzione si riferisce al settore dei vettori utilizzabili nella terapia genica (somatica) ed alla loro preparazione.
Background dell'invenzione
L'integrazione di geni terapeutici all'interno di specifici siti del DNA di cellule non in divisione accompagnata da espressione prolungata è la strategia ottimale per la terapia genica somatica. Tuttavia, i sistemi vettoriali più comunemente disponibili non sono capaci di realizzare un'efficiente trasduzione di cellule non in divisione unitamente all'espressione a lungo termine, attraverso l'integrazione stabile del vettore all'interno di specifici siti del DNA della cellula ospite. Infatti i vettori retrovirali basati sul virus della leucemia di Moloney, mentre sono capaci di integrazione e stabile espressione a lungo termine, richiedono la divisione cellulare per un'efficiente trasduzione. Per di più, i virus si integrano casualmente all'interno del genoma ospite, il che potrebbe condurre a mutagenisi inserzionale , o a casuale attivazione dell'espressione di un protooncogene dovuta all'attività di promotore associata alle Lunghe Ripetizioni terminali (LTR = Long Terminal Repeats) retrovirali. D'altra parte, i vettori basati su adenovirus e herpes simplex virus, sono capaci di trasdurre le cellule che non sono in divisione, ma non di integrarsi con frequenza apprezzabile all'interno del DNA della cellula ospite.
Il virus associato ad adenovirus (AAV) ha la capacità unica di integrare preferenzialmente il suo DNA virale all'interno di una regione definita del genoma cellulare, riducendo così i rischi di mutagenesi inserzionale associata all'azione di altri virus, come i retrovirus, che si integrano in posizioni casuali. AAV è un parvovirus umano non patogeno il quale usualmente richiede adenovirus (Ad) o herpesvirus come helper per replicarsi efficientemente. In assenza di virus helper il genoma di AAV si integra all'interno del DNA genomico della cellula ospite ad alta frequenza. Le analisi delle sequenze fiancheggianti, estratte dalle cellule infettate in stato latente, hanno rivelato l'integrazione del genoma di AAV all'interno di specifici locus nel 60-70% dei casi.
Il locus di integrazione (aavsl) è stato sequenziato e localizzato nel cromosoma umano 19q13.3-qter. Sebbene AAV potrebbe replicarsi in misura limitata in assenza di virus helper in certe condizioni non usuali, come indicato sopra il risultato più comune è che l'infezione delle cellule con AAV in assenza di funzioni helper risulti nell'integrazione del genoma di AAV all'interno del cromosoma della cellula ospite. Il genoma di AAV integrato può essere liberato e replicato, se le cellule contenenti il provirus integrato sono sovrainfettate con un virus helper come Ad.
Il DNA genomico di AAV è una molecola di DNA lineare a singolo filamento di peso molecolare di circa 1,5 x 106 daltons, oppure lungo approssimativamente 4680 nucleotidi. Il genoma di AAV2 ha una copia delle sequenze terminali inversamente ripetute (ITR) lunghe 145 nucleotidi collocate a ciascuna estremità. Le ITR di AAV contengono sequenze palindromiche che possono ripiegarsi per formare strutture a forcina che funzionano come primer durante l'inizio della replicazione del DNA.
Inoltre, le ITRs sono necessarie per l'integrazione virale, la liberazione dal genoma ospite, e 1'incapsidazione di acidi nucleici virali all'interno di virioni maturi. Inserita in mezzo alle ITR di AAV si trova un'unica regione di circa 4470 nucleotidi che contiene due schemi di lettura aperti (ORF = Open Reading Frame) principali. L'ORF di destra codifica per tre proteine del capside VP1, VP2 e VP3. Queste tre proteine formano la particella virale e sono prodotte da trascritti controllati dal promotore P40 collocato alla posizione di mappa 40. L'ORF di sinistra del genoma di AAV codifica il gene Rep.
Due promotori collocati alle posizioni di mappa 5 e 19 (promotori P5 e P19 rispettivamente) controllano l'espressione dei quattro polipeptidi derivati da questa ORF. Le proteine "Rep" Rep 78 e Rep 68 sono prodotte dai trascritti promossi da P5, e le proteine "Rep" Rep 52 e Rep 40 sono sintetizzate da trascritti promossi da P19.
L'individuazione del sito di integrazione potrebbe coinvolgere i prodotti del gene Rep di AAV. In particolare, i polipeptidi più estesi Rep 78 e Rep 69 hanno mostrato di legare in vitro le ITR di AAV e aavsl, e di possedere attività di elicasi ed endonucleasi sito-specifica, le quali potrebbero essere richieste per la replicazione di AAV così come per la sua integrazione.
Il limite principale dell'uso di AAV nella terapia genica è costituito dal limite di impacchettamento del virione AAV, che non può eccedere le 4,5 kb. La limitazione nell'impacchettamento esclude molti geni più estesi i quali potrebbero essere considerati come potenziali candidati per programmi di terapia genica. Al fine di superare tale limitazione, la notevole abilità di integrazione sito-specifica di AAV è stata trasferita ai vettori adenovirali con una più grande capacità di impacchettamento, tramite il trasferimento dei geni virali appropriati e dei segnali cis-acting richiesti per l'integrazione sito-specifica. Per esempio, in W096/13598 viene descritto un virus ibrido Ad/AAV al quale è associata una sequenza policationica e il gene Rep di AAV ("virus ibrido coniugato" o "particella di transinfezione").
Descrizione dell'invenzione
La presente invenzione sfrutta il gene Rep di AAV e le ITRs di AAV come parte di un sistema di "somministrazione" (delivery) per raggiungere l'integrazione specifica di DNA estraneo. Tale integrazione specifica fornisce un metodo più efficiente e più sicuro di "somministrazione" del gene .
L'oggetto della presente invenzione è un vettore di DNA ricombinante, caratterizzato dal fatto di comprendere in combinazione le seguenti sequenze nucleotidiche:
a) sequenze di DNA delle sequenze terminali inversamente ripetute (ITR) dell'estremità 5' del virus adeno-associato (AAV), o sequenze corrispondenti ;
b) sequenze di DNA codificanti per almeno un gene terapeutico di interesse, legate operativamente a un promotore costitutivo o inducibile;
c) sequenze di DNA delle sequenze ITR dell'estremità 3' dell'AAV, o sequenze corrispondenti;
d) sequenza di DNA codificante per una proteina Rep di AAV, o un suo frammento o un suo derivato, sotto la regolazione di un promotore costitutivo o inducibile;
e) il gene codificante per una proteina di interesse, legato operativamente a un promotore costitutivo o inducibile di cui sopra al punto b) inserito tra le ITRs all'estremità 5' e quelle all'estremità 3' di AAV;
f) la sequenza di DNA codificante per almeno una proteina Rep di AAV, o un suo frammento o un suo derivato, sotto la regolazione di un promotore costitutivo o inducibile di cui sopra al punto d) inserita al di fuori del contesto delle ITRs di AAV.
I vettori secondo l'invenzione utilizzano la capacità delle proteine Rep di mediare la escissione del genoma di AAV da una molecola di DNA più estesa, ed in conseguenza, di dirigere l'integrazione sito-specifica del frammento di DNA ITR all'interno del sito aavsl sul cromosoma 19.
Inoltre, l'integrazione mediata dalla proteina Rep all'interno del sito aavsl, dovrebbe essere limitata al frammento di DNA rinchiuso all'interno delle estremità 5' e 3' delle ITRs di AAV, in virtù del ruolo delle ITR nell'inserimento del genoma virale all'interno del sito aavsl. Quindi, dovrebbe permettere l'integrazione selettiva del gene di interesse con la concomitante esclusione dal processo di integrazione sito-specifica della rimanente parte del DNA.
La conseguenza di questa esclusione è che il DNA integrato non può in seguito essere liberato nella forma di AAV replicanti, anche a seguito di una sovrainfezione con un virus helper come Ad.
La presente invenzione comprende l'uso di plasmidi contenenti il gene Rep e le ITRs di AAV al posto dei virioni ricombinanti AAV, il che dovrebbe permettere l'integrazione sito-specifica di frammenti di DNA più estesi di quelli che normalmente sono portati da vettori basati sul genoma di AAV.
Secondo una forma di realizzazione preferita della presente invenzione, il vettore AAV ricombinante è derivato da plasmidi pSub201 in cui il gene Cap è stato deleto e il gene Rep è sotto il controllo trascrizionale dei promotori P5 e P19. Ad ogni modo, altri promotori, come il promotore al dell'antitripsina, il promotore precoce immediato di CMV (CMV immediate early promoter), il promotore precoce di SV40 oppure il promotore per la timidina chinasi, possono essere usati per lo stesso scopo. Vettori virali costruiti secondo la presente invenzione possono essere derivati da adenovirus, herpes virus e baculovirus tramite inserzione del gene Rep e delle ITRs di AAv come sopra esposto in precedenza .
L'invenzione, inoltre, si riferisce a plasmidi ricombinanti come sopra esposto, coniugati con liposomi, peptidi, e proteine leganti il DNA, che sono usati per il trasferimento genico in vivo.
Il gene terapeutico può essere un gene umano scelto dal gruppo comprendente quelli codificanti per il fattore di coagulazione Fattore Vili umano, il fattore di coagulazione Fattore IX, il recettore-LDL umano, l'insulina umana, la distrofina umana o il CFTR umano.
L'invenzione si riferisce anche a linee cellulari di mammifero {in particolare le cellule sono cheratinociti) ottenibili tramite trasfezione e/o infezione di vettori di DNA ricombinante o particelle . virali ricombinanti secondo l'invenzione, così come a composizioni farmaceutiche che li comprendono con un veicolo farmaceuticamente compatibile.
Breve descrizione,dei-disegni
La Fig. 1 mostra il diagramma del plasmide pITR (GFP-Neo).
La Fig. 2 mostra il diagramma del plasmide p ITR(GFP-Neo)P5Rep.
Le Fig. 3A e 3B mostrano la riproduzione di Southern blots di DNA ad alto peso molecolare di cloni cellulari HeLa trasfettati, realizzata utilizzando sonde specifiche per aavsl e specifiche per Neo che rivela una integrazione casuale di pITR (GFP-Neo).
Le Fig. 4A e 4B mostrano la riproduzione di Southern blots di DNA ad alto peso molecolare di cloni cellulari HeLa trasfettati, realizzata utilizzando sonde specifiche per aavsl e specifiche per Neo, che rivela l'integrazione sito-specifica di pITR(GFP-Neo)P5Rep.
La Fig. 5 mostra la riproduzione di Southern blots di DNA ad alto peso molecolare di cloni cellulari HeLa trasfettati con il plasmide pITR (GFP-Neo)P5Rep, utilizzando una sonda specifica per Rep.
Depositi
Il ceppo di Escherichia coli K12 contenente il plasmide pITR(GFP-Neo)P5Rep secondo l'invenzione è stato depositato il 5 dicembre 1996 presso "The National Collections of Industriai and Marine Bacteria" (NCIMB), Aberdeen, Scozia, UK. Al ceppo di cui sopra è stato dato il numero di accesso NCIMB 40832.
Si è data finora della presente invenzione una descrizione di carattere generale. Con l'aiuto dei seguenti esempi, verrà ora fornita una descrizione più dettagliata di specifiche forme di realizzazione finalizzate a far meglio comprendere scopi, caratteristiche, vantaggi e modalità operative dell'invenzione. Tali esempi sono solo illustrativi, e non limitano la portata della presente invenzione, che è definita dalle rivendicazioni annesse.
Esempio 1
Costruzione dei plasmidi pITR(GFP-Neo) e pITR(GFP-Neo)P5Rep
Il plasmide pSub201 (1) è stato tagliato con Xba I, per rimuovere le sequenze codificanti per le regioni Rep e Cap del virus associato ad adenovirus (AAV) e il frammento di DNA di 4,0 kb contenente le sequenze terminali inversamente ripetute (ITR) di AAV, è stato quindi legato a un frammento di DNA di 1,7 kb contenente un sito di restrizione per Nhe I ad entrambe le estremità.
Questo frammento contiene il cDNA della proteina fluorescente Green (GFP) (1) fiancheggiata alla sua estremità 5' dal promotore immediato precoce (immediate early promoter) ed enhancer di CMV, ed a quella 3' dal segnale di poliadenilazione dell'ormone della crescita bovino (BGH). Il frammento GFP è stato ottenuto tramite amplificazione PCR con primer sequenza specifici, utilizzando come stampo un derivato del vettore pCDNA-3 (Invitrogen) nel quale il CDNA GFP è stato clonato [pCD3 (GFP)]. Il primer specifico per il segnale di poliadenilazione BGH, è stato disegnato in modo da contenere un sito Sac II posizionato vicino al sito Nhe I all'estremità 3'.
Il costrutto così ottenuto è stato denominato pITR(GFP) . Il plasmide pITR(GFP-Neo) è stato prodotto tramite l'inserzione di un frammento piatto EcoRl/BamHI da pRc/RSV (Invitrogen) il quale contiene il promotore precoce di SV40, il gene per la resistenza alla neomicina, ed il segnale di poliadenilazione di SV40 all'interno del sito Sac II piatto di pITR(GFP).
pITR(GFP-Neo)P5Rep è stato derivato dall'amplificazione per PCR dei nucleotidi 138-2234 del genoma di AAV, con primer sequenza specifici usando il plasmide pTAV-2 (3) come stampo. Il frammento di DNA amplificato è stato digerito con Cla I e clonato all'interno del sito Cla I del plasmide pITR (GFP-Neo).
Esempio 2
Trasfezione di plasmidi ricombinanti
I plasmidi pITR (GFP-Neo) (Fig. 1) e pITR (GFP-Neo) P5Rep (Fig. 2), come già detto, portano il gene per la proteina fluorescente verde (GFP) sotto il controllo trascrizionale del promotore precoce CMV, e il gene per la resistenza della neomicina sotto il controllo del promotore precoce di SV40. Questi due geni sono stati inseriti tra le sequenze terminali inversamente ripetute dell'estremità 5' e 3' di AAV.
Inoltre, il plasmide pITR (GFP-Neo)P5Rep porta il gene Rep sotto il controllo trascrizionale dei promotori P5 e P19 clonati dentro il sito Cla I del vettore plasmidico, e risulta in tal modo collocato al di fuori delle due regioni ITRs di AAV.
L'efficienza dell'integrazione sito-specifica di questi due costrutti è stata determinata tramite trasfezione con calcio fosfato delle cellule HeLa.
Trasfezione cellulare
Cellule HeLa sono state mantenute in mezzi di coltura di Dulbecco (Dulbeccos's modified Eagle's medium; DMEM) integrato con 10% di siero fetale di vitello (FCS), 2 mM di gilutammina, 100 unità/ml di penicillina, e 100 μg/ml di streptomicina. Le cellule sono state fatte crescere in piastre di 10 cm (Falcon) a 37°C in 5% CO2. Stock delle cellule HeLa sono state come di routine passate ogni tre giorni tramite trattamento con tripsina (0,05%) ed EDTA (0,53 mM) e ripiastrate a una densità cellulare appropriata per la crescita esponenziale.
16 ore prima della trasfezione, le cellule sono state fatte sedimentare a una densità di 1 x IO6 cellule in piastre di 10 cm, e incubate per 12 ore a 37°C in 5% CO2. Il mezzo è stato sostituito e le cellule sono state quindi incubate per ulteriori 4 ore a 37°C.
20 μg di DNA plasmidico (10 μg del plasmide indicato più 10 μg di DNA veicolo) sono stati precipitati in fosfato di calcio, utilizzando il kit calcio fosfato di trasfezione di cellule di mammifero (5 - 3) seguendo le istruzioni del fabbricante. Il DNA precipitato è stato aggiunto direttamente a ciascuna piastra in un volume di 1 mi .
16 ore dopo la trasfezione il mezzo è stato sostituito e le cellule sono state incubate per ulteriori 32 ore. Le cellule trasfettate sono state quindi trattate con tripsina ed EDTA, e la sospensione cellulare derivata da una singola piastra di 10 cm è stata diluita 1 a 3 in un mezzo di selezione (DMEM 10% FCS, 2 mM glutammina, 100 unità/ml pennicillina, 100 μg/ml di streptomicina, e 800 μg/ml G418) e piastrato su tre piastre di 15 cm (Falcon).
I cloni resistenti alla neomicina sono stati isolati dopo 10 giorni di selezione, amplificati (expanded), e processati per l'estrazione del DNA genomico e per l'analisi di Southern blot.
Analisi di Southern blob di cloni resistenti alla neomicina
Cloni di cellule HeLa resistenti alla neomicina sono stati fatti crescere in piastre di 10 cm, e il monostrato cellulare è stato staccato tramite raschiamento e lavato due volte con 2 mi di PBS. La sospensione cellulare è stata trasferita in tubi Eppendorf, centrifugata per 10 minuti a 3000 rpm a 4°C in una microcentrifuga Eppendorf, e il centrifugato (pellet) delle cellule è stato risospeso in 0,5 mi TEN (50 mM Tris-Cloro, pH 7.5, 150 mM NaCl, 10 mM EDTA). Sono stati aggiunti ad ogni campione SDS e proteinasi K alla concentrazione finale rispettivamente di 1% e 1 mg/ml .
Il U sato cellulare è stato incubato per 4 ore a 56°C e sottoposto a tre consecutive estrazioni con fenolo (equilibrato con 10 mM Tris-Cl pH 8.0, 1 mM EDTA), fenolo-cloroformio (rapporto 1:1), e cloroformio. La fase acquosa è stata precipitata con due volumi di etanolo dopo l'aggiunta di una soluzione di sodio acetato (pH 6.0) alla concentrazione finale di 0,3 M. Il centrifugato di DNA è stato lavato una volta con 0,5 mi di 70% etanolo, risospeso in 0,5 mi di acqua, e incubato per tutta la notte a 4°C.
10 μg di DNA cromosomale ad alto peso molecolare sono stati incubati con 40 unità dell'enzima di restrizione BamHI (New England Biolabs) in un volume di 0,1 mi per 12 ore a 37°C. Il DNA digerito è stato sottoposto ad elettroforesi in un gel di agarosio 0,8%, trasferito su una membrana di nylon (Hybond™ -N+; Amersham) come raccomandato dal fabbricante e ibridato per tutta la notte a 65°C in un tampone Church (7% SDS, 0,25 M NaPi, pH 7,2, 1 mM EDTA pH 8.0, 0,1 g/ml BSA) con sonde marcate P ottenute mediante "random priming" . In ciascuna ibridazione sono stati utilizzati approssimativamente 2 x IO6 cpm/ml. I filtri sono stati lavati in 40 mM NaPi, pH 7,2, 1 mM EDTA, pH 8,0, 1% SDS, a 65° tre volte per 20 minuti, e quindi in 0,1 x SSC, 0,1% SDS a 65°C per 20 minuti.
I filtri sono stati esposti a un film a raggi X con uno schermo intensificatore per tutta la notte. Per determinare l'integrazione sitospecifica del frammento di DNA ITR, i filtri sono stati inizialmente ibridati con una sonda specifica per il gene della neomicina, la sonda ibridata è stata quindi rimossa tramite la bollitura dei filtri in 0,2 x SSC, 1% SDS per 10 minuti, gli stessi filtri sono stati quindi ibridati con una sonda specifica per il sito aavsl.
Esempio 3
Analisi dei cloni trasfettati
I riarrangiamenti dei siti aavsl risultanti dall'integrazione dei plasmidi trasfettati sono stati determinati tramite la comparazione dello schema di ibridazione dei blot genomici, fatti· utilizzando sonde aavsl specifiche e neo-gene specifiche, con quelli di DNA da cellule di controllo (mock transfected cells). La sonda specifica per il cromosoma 19 è stata ottenuta tramite "random priming reaction" eseguita utilizzando come stampo un frammento di DNA derivato dal plasmide pRVK (K. Berna, Cornell Medicai School, New York, N.Y.) che copre i nucleotidi 1-3525 di aavsl.
La sonda neo-specifica è stata derivata da una ''random priming reaction" con un frammento di DNA di 630 bp come stampo che include la maggior parte dell'ORF del gene della resistenza alla neomicina. L'integrazione sito-specifica del plasmide trasfettato è stata raggiunta quando: i) lo schema di ibridazione del DNA genomico eseguito utilizzando la sonda aavsl è differente da quello del DNA delle cellule di controllo (mock transfected cells) per il fatto che contiene un frammento addizionale riconosciuto dalla sonda per aavsl; ii) lo stesso frammento addizionale rivelato con la sonda genomica è anche individuato con la sonda neo-specifica.
L'analisi dei cloni delle cellule HeLa derivata dalla trasfezione del plasmide ITR (GFP-Neo) è rappresentata nella Fig. 3. Il DNA genomico estratto da 11 cloni indipendenti è stato digerito con l'enzima di restrizione BamHI e il DNA è stato risolto (resolved) su un gel di agarosio. L'ibridazione tramite Southern blot di questo DNA con una sonda marcata con 32P, specifica per il sito aavsl, mostra che la sonda ha ibridato i due frammenti di dimensioni approssimativamente 3,5 e 2,3 kb. Inoltre lo schema di ibridazione del DNA dei cloni trasfettati è identico a quello del DNA delle cellule di controllo (mock transfected cells) (Fig. 3A). Per converso, l'ibridazione con sonde marcate con 32P specifiche per il gene della neomicina mostra chiaramente che tutti questi cloni sono stati trasfettati con plasmidi che portano il marker per la resistenza, dal momento che la sonda neo-specifica ibrida con una singola banda in ogni corsia, in cui sono disposti frammenti di dimensioni tra 8 e 20 kb, ma nessuna ibridazione di questa sonda è individuabile con il DNA delle cellule di controllo (mock transfected cells) (Fig. 3B).
Quindi, in tutti i casi analizzati (39 cloni individuali) l'integrazione del gene neo è avvenuta a siti diversi dal sito aavsl.
La trasfezione di plasmidi pITR(GFP-Neo)P5Rep ha dato luogo ad uno schema di ibridazione chiaramente differente. Come mostrato in Fig. 4, l'ibridazione con sonde specifiche per aavsl mostra che nel 25% dei cloni analizzati (8 cloni su 32) un frammento addizionale di dimensioni comprese tra 5 e 10 kb è ibridata con la sonda genomica. In Fig. 4 sono mostrati la maggior parte dei cloni con questo tipo di schema di ibridazione, e l'indicativo del sito di integrazione specifica è indicato con una punta di freccia.
Questo frammento non è presente nel DNA digerito di altri cloni trasfettati, né nel DNA delle cellule di controllo (mock transfected cells), in cui possono essere individuate solo le due bande di 3,5 e 2,3 kb. La cosa più importante è che lo stesso frammento viene ibridato dalla sonda specifica per il sito aavsl, il che indica che il gene per la neomicina è stato inserito all'interno del sito aavsl (Fig. 4b).
I dati qui presentati mostrano chiaramente che l'integrazione del DNA plasmidico trasfettato all'interno del sito aavsl avviene con alta efficienza ed è dipendente dall'espressione del gene Rep.
L'integrazione selettiva del frammento di DNA ITR è stata determinata eseguendo un Southern blot di DNA genomico dei cloni trasfettati con il plasmide pITR{GFP-Neo)P5Rep utilizzando una sonda specifica per il gene Rep (comprendente i nucleotidi da 138 a 2234 del genoma AAV). Come mostrato in Fig. 5, la sonda ibrida con molte bande di DNA in ciascuna corsia. Comunque, il frammento di DNA ibridato con la sonda Rep non coincide per dimensioni con il frammento rivelato da entrambe le sonde specifiche per neo e aavsl.
Quindi, è possibile concludere che, sebbene una parte del plasmide pITR(GFP-Neo)P5Rep potrebbe essersi integrato casualmente nel cromosoma ospite al di là della trasfezione all'interno delle cellule HeLa, nella maggior parte dei casi non è avvenuta alcuna inserzione della sequenza di DNA collocata al di fuori della regione ITR, all'interno del sito aavsl.
Bibliografia rilevante
1) R.J. Samulski et al., J. Virol. 61: 3096-3101, 1987
2) D.C. Prasher et al., Gene 111: 229, 1992
3) R. Heilbronn et al., J. Virol. 64: 3012-3018,

Claims (16)

  1. RIVENDICAZIONI 1. Vettore di DNA ricombinante, caratterizzato dal fatto di comprendere in combinazione le seguenti sequenze nucleotidiche: a) sequenze di DNA delle sequenze terminali inversamente ripetute dell'estremità 5' del virus associato ad adenovirus (AAV), o sequenze corrispondenti ; b) sequenze di DNA codificante per almeno un gene terapeutico di interesse operativamente collegate a un promotore costitutivo o inducibile; c) sequenze di DNA delle sequenze terminali inversamente ripetute dell'estremità 3' di AAV; d) sequenza di DNA codificante per una proteina Rep di AAV, o un suo frammento o un suo derivato, sotto la regolazione di un promotore costitutivo o inducibile; e) il gene codificante per una proteina selezionata di interesse, operativamente collegata a un promotore costitutivo o inducibile di cui sopra al punto b) inserito tra l'estremità 5' e 3' delle sequenze inversamente ripetute da AAV; f) la sequenza di DNA codificante per almeno una proteina Rep di AAV, o un suo frammento o un suo derivato, sotto la regolazione di un promotore costitutivo o inducibile, di cui sopra al punto d) inserita al di fuori del contesto delle sequenze inversamente ripetute di AAV.
  2. 2. Particella virale ricombinante, caratterizzata dal fatto di portare le sequenze del vettore DNA ricombinante secondo la rivendicazione 1.
  3. 3 . Particella virale ricombinante come da rivendicazione 2 che porta le sequenze del vettore DNA ricombinante secondo la rivendicazione 1, nella quale il vettore virale è derivato dall'adenovirus.
  4. 4 . Particella virale ricombinante come da rivendicazione 2, che porta le sequenze del vettore DNA ricombinante secondo la rivendicazione 1, in cui il vettore virale è derivato dall'herpes virus.
  5. 5. Particella virale ricombinante come da rivendicazione 2, che porta le sequenze del vettore DNA ricombinante secondo la rivendicazione 1, in cui il vettore virale è derivato da baculovirus.
  6. 6. Vettore DNA ricombinante come da rivendicazione 1, in cui il vettore è coniugato con liposomi utilizzati per il trasferimento genico in vivo.
  7. 7. Vettore DNA ricombinante secondo la rivendicazione 1, in cui il vettore è coniugato con peptidi utilizzati per il trasferimento genico in vivo .
  8. 8 . Vettore DNA ricombinante secondo la rivendicazione 1, in cui il vettore è coniugato con DNA che lega proteine utilizzate per il trasferimento genico in vivo.
  9. 9. Particelle ricombinanti secondo le rivendicazioni da 1 a 8, in cui il gene Cap è stato deleto e il gene Rep è sotto il controllo trascrizionale dei promotori AAVP5 e P19 oppure sotto il controllo trascrizionale di altri promotori come il promotore immediato precoce di CMV (CMV immediate early promoter), il promotore precoce di SV40, il promotore della timidina chinasi, e il promotore della al antitripsina.
  10. 10. Particelle ricombinanti secondo le rivendicazioni da 1 a 9, in cui il gene terapeutico è un gene umano da utilizzare per la terapia di malattie genetiche o metaboliche.
  11. 11. Particelle ricombinanti secondo la rivendicazione 10, in cui il gene terapeutico è scelto tra quelli codificanti per il fattore di coagulazione Fattore Vili umano, il fattore di coagulazione Fattore IX, il recettore-LDL umano, l'insulina umana, la distrofina umana o il CFTR umano .
  12. 12. Linee cellulari di mammifero, caratterizzate dal fatto di essere ottenibili dalla trasfezione o infezione con particelle secondo le rivendicazioni da 1 a 9.
  13. 13. Linee cellulari di mammifero, caratterizzate dal fatto di essere ottenibili tramite trasfezione o infezione con particelle secondo la rivendicazione 10, in cui le cellule sono cheratinociti.
  14. 14. Linee cellulari di mammifero, caratterizzate dal fatto di essere ottenibili tramite trasfezione o infezione con particelle secondo la rivendicazione 10 in cui le cellule sono cellule staminali ematopoietiche (hematopoietic stem cells).
  15. 15. Composizione farmaceutica, caratterizzata dal fatto di comprendere le particelle virali ricombinanti di cui alle rivendicazioni da 2 a 5 come principio attivo, e un veicolo farmaceuticamente compatibile.
  16. 16. Composizione farmaceutica, caratterizzata dal fatto di comprendere il vettore DNA ricombinante secondo le rivendicazioni da 6 a 8, come principio attivo, e un veicolo farmaceuticamente compatibile.
ITRM970200 1997-04-08 1997-04-08 Vettori ricombinanti utilizzabili in terapia genica IT1291135B1 (it)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
ITRM970200 IT1291135B1 (it) 1997-04-08 1997-04-08 Vettori ricombinanti utilizzabili in terapia genica
AU70778/98A AU7077898A (en) 1997-04-08 1998-04-08 Recombinant vectors derived from adeno-associated virus suitable for gene therapy
PCT/IT1998/000082 WO1998045462A1 (en) 1997-04-08 1998-04-08 Recombinant vectors derived from adeno-associated virus suitable for gene therapy

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
ITRM970200 IT1291135B1 (it) 1997-04-08 1997-04-08 Vettori ricombinanti utilizzabili in terapia genica

Publications (2)

Publication Number Publication Date
ITRM970200A1 true ITRM970200A1 (it) 1998-10-08
IT1291135B1 IT1291135B1 (it) 1998-12-29

Family

ID=11404951

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ITRM970200 IT1291135B1 (it) 1997-04-08 1997-04-08 Vettori ricombinanti utilizzabili in terapia genica

Country Status (3)

Country Link
AU (1) AU7077898A (it)
IT (1) IT1291135B1 (it)
WO (1) WO1998045462A1 (it)

Families Citing this family (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU4645697A (en) 1996-09-11 1998-04-02 Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services, The Aav4 vector and uses thereof
US6054312A (en) 1997-08-29 2000-04-25 Selective Genetics, Inc. Receptor-mediated gene delivery using bacteriophage vectors
CA2329060C (en) 1998-05-28 2011-09-13 John A. Chiorini Aav5 vector and uses thereof
US6984517B1 (en) 1998-05-28 2006-01-10 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services AAV5 vector and uses thereof
DE19905501B4 (de) * 1999-02-10 2005-05-19 MediGene AG, Gesellschaft für molekularbiologische Kardiologie und Onkologie Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten Adeno-assoziierten Virus, geeignete Mittel hierzu sowie Verwendung zur Herstellung eines Arzneimittels
EP1180158A1 (en) * 1999-05-27 2002-02-20 Genovo, Incorporated Compositions and methods for production of recombinant virus using a carrier vector derived from a nonmammalian virus
US6793926B1 (en) 1999-05-27 2004-09-21 Genovo, Inc. Methods for production of a recombinant adeno-associated virus
WO2001071018A2 (en) * 2000-03-22 2001-09-27 Board Of Trustees Of The University Of Arkansas Secreting products from skin by adeno-associated virus (aav) gene transfer
US6855314B1 (en) 2000-03-22 2005-02-15 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services AAV5 vector for transducing brain cells and lung cells
AU2000258017A1 (en) * 2000-07-17 2002-02-13 Jiahui Xia Human source gene leading sequence, gene vector and gene expression strategy
US7419817B2 (en) 2002-05-17 2008-09-02 The United States Of America As Represented By The Secretary Department Of Health And Human Services, Nih. Scalable purification of AAV2, AAV4 or AAV5 using ion-exchange chromatography
WO2005017101A2 (en) 2003-05-19 2005-02-24 THE GOVERNMENT OF THE UNITED STATES OF AMERICA, as represented by THE SECRETARY, DEPARTMENT OF HEALTH & HUMAN SERVICES, NATIONAL INSTITUTES OF HEALTH Avian adenoassociated virus (aaav) and uses thereof
US8137960B2 (en) 2003-12-04 2012-03-20 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Bovine adeno-associated viral (BAAV) vector and uses thereof
US20090055941A1 (en) * 2005-03-22 2009-02-26 Agency For Science, Technology And Research Novel Neural Cell Specific Promoter And Baculovirus And Method For Gene Delivery
US8283151B2 (en) 2005-04-29 2012-10-09 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Isolation, cloning and characterization of new adeno-associated virus (AAV) serotypes
WO2007084773A2 (en) * 2006-01-20 2007-07-26 University Of North Carolina At Chapel Hill Enhanced production of infectious parvovirus vectors in insect cells
EP2195439B1 (en) * 2007-09-19 2013-06-19 UniQure IP B.V. Use of aav replication machinery for improved protein production
KR101990068B1 (ko) 2010-09-02 2019-06-17 몰메드 에스피에이 렌티바이러스 벡터의 안정한 제조

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2716893B1 (fr) * 1994-03-03 1996-04-12 Rhone Poulenc Rorer Sa Virus recombinants, leur préparation et leur utilisation thérapeutique.
EP0785803A4 (en) * 1994-09-23 2000-08-02 Gen Hospital Corp Use of a non-mammalian dna virus to express an exogenous gene in a mammalian cell
US5856152A (en) * 1994-10-28 1999-01-05 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Hybrid adenovirus-AAV vector and methods of use therefor
US5843742A (en) * 1994-12-16 1998-12-01 Avigen Incorporated Adeno-associated derived vector systems for gene delivery and integration into target cells

Also Published As

Publication number Publication date
IT1291135B1 (it) 1998-12-29
AU7077898A (en) 1998-10-30
WO1998045462A1 (en) 1998-10-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20240002882A1 (en) Methods to produce chimeric adeno-associated virus/bocavirus parvovirus
ITRM970200A1 (it) Vettori ricombinanti utilizzabili in terapia genica
US6346415B1 (en) Transcriptionally-activated AAV inverted terminal repeats (ITRS) for use with recombinant AAV vectors
US11999965B2 (en) Bocaparvovirus small noncoding RNA and uses thereof
ES2235470T3 (es) Composiciones y metodos para la produccion libre de cooperadores de virus adnoasociados recombinantes.
US6521426B1 (en) Preparation of recombinant adenovirus carrying a rep gene of adeno-associated virus
US20040087026A1 (en) Host cells for packing a recombinant adeno-associated virus (raav), method for the production and use thereof
Pieroni et al. Targeted integration of adeno-associated virus-derived plasmids in transfected human cells
US20040043490A1 (en) Cells to be used in producing virus vector, process for producing the same, and process for producing virus vector with the use of the cells
EP1025243B1 (en) TRANSCRIPTIONALLY-ACTIVATED AAV INVERTED TERMINAL REPEATS (ITRs) FOR USE WITH RECOMBINANT AAV VECTORS
US5965441A (en) HSV/AAV hybrid amplicon vectors
Gonçalves et al. Stable transduction of large DNA by high-capacity adeno-associated virus/adenovirus hybrid vectors
US20040014031A1 (en) Inducible highly productive rAAV packaging cell-lines
Gonçalves et al. Generation of a high-capacity hybrid vector: packaging of recombinant adenoassociated virus replicative intermediates in adenovirus capsids overcomes the limited cloning capacity of adenoassociated virus vectors
Xiao et al. Adeno-associated virus (AAV) vectors for gene transfer
EP4112731A1 (en) System for high-level raav production
US20110166207A1 (en) Use of aav integration efficiency element for mediating site-specific integration of a transcription unit
AU752811B2 (en) Preparation of recombinant adenovirus carrying a rep gene of Adeno-Associated Virus
CA2271777A1 (en) Hsv/aav hybrid amplicon vectors
March Gene transfer in the cardiovascular system: experimental approaches and therapeutic implications
US6541012B2 (en) System for the production of AAV vectors
US20040043488A1 (en) Adeno-associated viral gene-transfer vector system
Avolio Exploiting the adenoassociated virus Rep protein to mediate site-specific integration into the human genome and optimisation of Ad/AAV vector design
Duan Molecular characterization of adeno-associated virus for the gene therapy of submucosal gland in cystic fibrosis
EA043850B1 (ru) Aav-опосредованная экспрессия с использованием синтетического промотора и энхансера

Legal Events

Date Code Title Description
0001 Granted