ITPD20100380A1 - Cianobatterio della famiglia delle pseudanabaenaceae (oscillatoriales, cyanophyta), genere protolyngbya, specie protolyngbya sp. ceppo itd-01 - Google Patents

Cianobatterio della famiglia delle pseudanabaenaceae (oscillatoriales, cyanophyta), genere protolyngbya, specie protolyngbya sp. ceppo itd-01 Download PDF

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ITPD20100380A1 IT000380A ITPD20100380A ITPD20100380A1 IT PD20100380 A1 ITPD20100380 A1 IT PD20100380A1 IT 000380 A IT000380 A IT 000380A IT PD20100380 A ITPD20100380 A IT PD20100380A IT PD20100380 A1 ITPD20100380 A1 IT PD20100380A1
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Isabella Moro
Nicoletta Rascio
Katia Sciuto
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Associazione Termalisti Isola D Isc Hia
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Description

Descrizione
“Cianobatterio della famiglia delle Pseudanabaenaceae (Oscillatoriales, Cyanophyta), genere Protolyngbya, specie Protolyngbya sp. ceppo ITD-01.â€
Campo dell’invenzione
L’invenzione à ̈ relativa un nuovo ceppo di cianobatterio della famiglia Pseudanabaenaceae (Oscillatoriales, Cyanophyta), identificato come Protolyngbya sp. ceppo ITD-01 , trovato nei fanghi termali del bacino ischitano ed utilmente impiegabile in campo farmaceutico, cosmeceutico ed in campo alimentare, essendo caratterizzato da un elevato contenuto in C-ficocianina.
Stato della tecnica
Il Comprensorio Termale Ischitano à ̈ noto fin dall’antichità per gli effetti curativi delle acque termali in numerose patologie. Le acque termali dell’isola di Ischia sono infatti particolarmente indicate nelle affezioni reumatiche croniche, postumi di fratture, affezioni croniche dei bronchi, dell’orecchio, del naso e della gola. Dal XVII fino alla metà del XX secolo vicino alle più importanti sorgenti termali sono sorti numerosi stabilimenti che costituiscono tutt’oggi il Distretto Termale dell’Isola di Ischia. Informazioni riguardanti il Distretto Termale di Ischia sono limitate alla storia e alia geologia dell’isola, poco invece si sa sulla biodiversità di questo ambiente. Le acque termo-minerali di Ischia, data la differente composizione chimica dei terreni del territorio dove scorrono, possono essere suddivise in acque bicarbonato-calciche, bicarbonato-alcaline, solfato-cloruro-alcaline e acque di transizione. Inoltre la temperatura dell'acqua dei diversi stabilimenti può variare da 15° C a 86° C. Data la notevole variabilità dei parametri chimico-fisici delle acque, nei differenti siti del Comprensorio di Ischia si possono ritrovare organismi diversi, tra i quali batteri, protozoi, microalghe e cianobatteri. Questi ultimi sono noti per la loro capacità di produrre diversi composti bioattivi che possono essere sfruttati in diverse applicazioni, tra le quali le terapie mediche (Singh, S. et al., 2005, Bioactìve Compounds from Cyanobacteria and Microalgae: An OverView, Crìt. Rev. Biotechnol. 25: 73-95; Eriksen N.T., 2008, Production of phycocyanin - a pigment with applications in biology, biotechnology, foods and medicine, Appi. Microbiol. Biotechnol. 1 : 1-14; Gerwick, W.H. et al., 2008, Giani Marine Cyanobacteria produce exciting potential pharmaceuticals, Microbe 3: .277-284; Sivonen, K. & Borner, T., 2008, Bioactive compounds produced by cyanobacteria, In: Herraro A. & Flores E. (eds): The cyanobacteria: Molecular Biology, Genomics and Evolution: 159-197, Caister Academic Press, Norfolk.).
Recentemente à ̈ stato dimostrato che l’efficacia terapeutica della fangoterapia non à ̈ legata semplicemente agli effetti benefici del calore e degli elettroliti ma à ̈ dovuta alla presenza di sostanze dotate di elevata attività antiinfiammatoria sintetizzate dai microrganismi, che colonizzano il fango termale durante il processo di maturazione. I fanghi utilizzati nelle cure termali sono colonizzati da un complessa comunità di microrganismi di cui, i più rappresentativi sia per ampiezza di colonizzazione sia per biomassa prodotta, sono risultati essere alcune specie di cianobatteri. Questi microorganismi sono in grado di produrre tutta una serie di metaboliti secondari (acidi grassi poiinsaturi, beta-carotene, licopene, esopolisaccaridi, C-ficocianina, etc.) che sono alla base delle caratteristiche capacità terapeutiche dei fanghi termali. Tra questi composti, la C-ficocianina risulta particolarmente importante ed utilizzabile sia in campo terapeutico che cosmeceutico.
Circa la C-ficocianina, come noto, questo à ̈ il pigmento più abbondante, potendo raggiungere circa il 15% del peso secco nelle cellule cianobatteriche. La struttura chimica dei cromofori nella ficocianina (tetrapirroli lineari) à ̈ molto simile a quella della bilirubina ed à ̈ un antiossidante fisiologico che elimina i radicali perossidi. È stato dimostrato, infatti, che sia in vitro che in vivo la C-ficocianina agisce come antiossidante eliminando i radicali liberi dell’ossigeno (Romay, C. et al., 1998, Inflammation Res., 47: 36-41; Bhat V.B. et al.; 2001, Scavenging of peroxynitrite by phycocyanin and phycocyanobilin from Spirulina platensis : protection against oxidative damage to DNA, Biochem. Bioph. Res. Comm. 285: 262^266).
Tra i vari effetti benefici della C-ficocianina à ̈ da rilevare anche quello di prevenzione dei danni al fegato dovuti a diete poco equilibrate. A questo proposito à ̈ stato dimostrato che la ficocianina riduce i radicali liberi prodotti da una somministrazione di CCL, agendo come epatoprotettivo (Vadiraja, B.B. et al., 1998, Hepatoprotective effect of C-phycocyanin: Protection for carbon tetrachloride and R-(+)-pulegnone-mediated hepatotoxicity in rats, Biochem. Biophys, Res. Comm., 249: 428-431).
Inoltre, la C-ficocianina à ̈ utilizzata nell’industria alimentare (Yoshida, A. et al., 1996, Enzyme immunoassay for phycocyanin as thà ̈ main component of S pirulina color in foods, Biosci. Biotechnol. Biochem. 60: 57-60) e nella cosmesi (Cohen Z., 1986, Products from microalgae, In: Richmond, A. (eds.), Handbook of Microalgal Mass Culture, CRC Press, Boca Raion, pp. 421-454).
Sommario
L’invenzione riguarda un nuovo ceppo di cianobatterio identificato come ITD-01 (ITD = Ischia Thermal District), appartenente all’ordine delle Oscillatoriales ed alla famiglia delle Pseudanabaenaceae (Sottofamiglia: Leptolyngbyoideae; Genere: Protolyngbya ; Specie: Protolyngbya sp.), depositato con N° CCALA 945 il 4 novembre 2010 presso la collezione Culture Collection of Autotrophic Organisms (CCALA), Institute of Botany, Academy of Sciences of thà ̈ Czech Republic, Centre of Phycology, Dukelskà 135, TREBON CZ-379 82. Il cianobatterio Protolyngbya sp. ceppo ITD-01 à ̈ caratterizzato dal fatto di comprendere per il gene 16S rDNA la sequenza rDNA IDNO 1 e per il gene plastidiale rbci. la sequenza DNA IDNO.
2.
L’invenzione riguarda inoltre suoi derivati ottenuti per mutazione o trasformazione genetica o mediante crescita in condizioni selettive. Derivati del cianobatterio Protolyngbya sp. ceppo ITD-01 sono anche considerati i prodotti ottenuti per estrazione, frazionamento subcellulare e/o lisi di colture contenenti il batterio ed i suoi composti bioattivi. Tra i principi attivi presenti nel ceppo IT.D-01 , la C-ficocianina costituisce il pigmento idrosolubile predominante, raggiungendo percentuali elevate (68%). Questi composti bioattivi vengono ottenuti per estrazione da colture cellulari massive di cianobatteri.
Secondo un aspetto principale dell’invenzione il cianobatterio ITD-01 e i suoi derivati costituiscono i principi attivi che possono essere utilizzati nell’industria farmaceutica e alimentare, oltre che nella cosmesi. In particolare, l’impiego del cianobatterio ITD-01 nel campo della cosmesi, della farmaceutica e degli integratori alimentari à ̈ da attribuire alla notevole quantità di C-ficocianina. Inoltre, la presenza nei fanghi termali del ceppo ITD-01 , esclusivo dell’ambiente termale dell’isola di Ischia, conferisce unicità a questi fanghi.
Secondo un ulteriore aspetto, quindi, l’invenzione riguarda un uso del microrganismo secondo l’invenzione o i suoi derivati per la preparazione di composizioni in campo farmaceutico, cosmetico e/o alimentare.
Breve descrizione delle figure
Figure 1-3. Ceppo ITD-01 trovato sulla superficie del fango termale. di Ischia. Fig. 1. Immagine al microscopio ottico di lunghi filamenti, molto sottili, non ramificati. Barra = 5 Î1⁄4m. Fiq. 2. Immagine al microscopio elettronico a scansione di tricomi caratterizzati da cellule cilindriche e da distinte costrizioni a livello delle pareti trasversali (freccia). Barra = 1 Î1⁄4m. Fiq. 3. Immagine al microscopio elettronico a trasmissione di un tricoma caratterizzato da cellule con tilacoidi paralleli (t), disposti alla periferia delle cellule, e circondati da una guaina mucillaginosa (g). Barra = 1 pm.
Figura 4. Percentuali delle diverse ficobiliproteine presenti nel cianobatterio ITD-01 : PC=ficocianina; APC= alloficocianina; PE= ficoeritrina.
Figura 5. Albero filogenetico basato sulle sequenze del gene 16S rRNA e costruito usando il metodo del maximum-likelihood. I numeri di accesso GenBank sono riportati tra parentesi. La barra rappresenta 0.02 sostituzioni nucleotidiche per sito.
Figura 6. Albero filogenetico basato sulle sequenze del gene rbcL e costruito usando il metodo del maximum-likelihood. I numeri di accesso GenBank sono riportati tra parentesi. La barra rappresenta 0.05 sostituzioni nucleotidiche per sito.
Descrizione dettagliata dellinvenzione
Il microorganismo ITD-01 oggetto del presente brevetto à ̈ stato isolato da un feltro blu-verde in via di formazione sulla superficie dei fanghi termali dell’hotel NH Ischia Thermal Spa Resort (Napoli, Italia) (40°44'0 "Nord, 13°36O" Est) in aprile 2009. La temperatura dell'acqua al momento del campionamento era di circa 30°C ed il pH era 7. L’organismo isolato à ̈ stato posto in un mezzo di coltura liquido BG11 (Rippka et al. 1979, Generic Assignments, Strain Histories and Properties of Pure Cultures of Cyanobacteria, J. Gerì. Microbiol. 111 : 1-61) ad una temperatura dì crescita di 30°C e ad un’intensità luminosa di 35 Î1⁄4mol fotoni m<-2>s<-1>con un fotoperiodo di 12/12 ore.
Il ceppo ITD-01 à ̈ stato caratterizzato utilizzando un approccio di tipo polifasico, comprendente analisi morfologiche, ultrastrutturali (SEM e TEM), biochimiche e molecolari. Le analisi morfologiche evidenziano che il ceppo ITD-01 à ̈ costituito da lunghi filamenti di colore blu-verde, molto sottili, non-ramificati (Fig. 1 ). I filamenti sono isopolari, strettamente appressati tra di loro in maniera tale da formare, dei feltri compatti sul substrato. Ogni filamento, definito tricoma, à ̈ composto da cellule più lunghe che larghe, con dimensioni variabili da 0.8 a 1.5 Î1⁄4m di lunghezza e da 0.7 a 0.9 Î1⁄4m di larghezza (Fig. 2). I filamenti mostrano distinte costrizioni a livello delle pareti trasversali (Fig. 2). Al microscopio elettronico a trasmissione le cellule sono caratterizzate dalla presenza di 3-4 membrane tilacoidali, disposte parallelamente alla periferia della cellula, e da alcune inclusioni. Inoltre ogni filamento risulta circondato da una guaina incolore (Fig. 3). Non sono presenti vescicole gassose. La riproduzione cellulare avviene per divisione binaria.
Le analisi spettrofotometriche, condotte per determinare la composizione delle diverse ficobiliproteine, mostrano la presenza di C-ficocianina (68%), di alloficocianina (28%) e di ficoeritrina (4%) (Fig. 4). L'elevata quantità di C-ficocianina (68%), una proteina idrosolubile, altamente fluorescente, presente nei cianobatteri ed utilizzata nell'industria alimentare (Yoshida et al., 1996), nella cosmesi (Cohen, 1986, ref. cit), ma soprattutto conosciuta per le sue proprietà farmacologiche (Romay et al. 1998, ref. cit.]. Vadiraja et al. 1998, ref. cit.]. Bhat et al. 2001 , ref. cit.), suggerisce come questo organismo possa contribuire alle proprietà terapeutiche del fango di Ischia.
Le analisi condotte all’HPLC evidenziano la presenza dei seguenti pigmenti liposolubili: myxol-2’-glycoside, nostoxantina, caloxantina, zeaxantina, clorofilla a, trans-β- e cis-β-carotene.
Oltre alla caratterizzazione morfologica, ultrastrutturale e biochimica, per una più precisa identificazione tassonomica del ceppo di cianobatterio in esame sono state condotte analisi molecolari. La caratterizzazione genetica à ̈ stata condotta secondo un approccio che prevede l’utilizzo di diversi marker molecolari. Per questo scopo sono stati utilizzati come marker il gene 16S rDNA (SEQ IDNO. 1 ) ed il gene plastidiale rbcL che codifica per la subunità grande dellenzima ribulosio-1 ,5-bifosfato carbossiiasi/ossigenasi (SEQ. IDNO. 2).
L’allineamento della sequenza del gene 16S rDNA del ceppo ITD-01 con sequenze dello stesso gene disponibili in GenBank evidenzia una . percentuale di identità del 94% tra ITD-01 e un ceppo di Leptolyngbya, strain FYG, (GenBank FJ933259), isolato da feltri presenti in sorgenti calde del Parco Nazionale di Yellowstone (USA).
La sequenza di DNA del gene rbcL di ITD-01 presenta, invece, una percentuale d’identità dell’85% con le corrispondenti sequenze di Leptolyngbya laminosa ETS-08 (un ceppo isolato dal Comprensorio termale euganeo) e di Leptolyngbya sp. PCC 73110 e dell’84% con Pseudanabaena persicina CCMP638.
La topologia ottenuta con le sequenze del gene 16S rDNA (Fig. 5) evidenzia che il ceppo ischitano ITD-01 appartiene all'ordine Oscillatoriales, famiglia Pseudanabaenaceae, e all’attuale genere Leptolyngbya. Per la sua posizione nella topologia ottenuta col gene 16S rDNA, per la sua morfologia corrispondente alla descrizione riportata per il sottogenere Protolyngbya e in assenza di altre sequenze disponibili nelle banche dati pubbliche per i membri di questo sottogenere, si ritiene che ITD-01 possa essere il primo ceppo sequenziato del sottogenere Protolyngbya. Inoltre, le analisi filogenetiche, così come le caratteristiche morfologiche, portano a proporre l’istituzione del nuovo genere Protolyngbya, un genere separato dal genere Leptolyngbya.
Anche l’albero filogenetico ottenuto con le sequenze del gene rbcL (Fig. 6), pur considerando un numero di organismi minore a causa del basso numero di sequenze disponibili in GenBank per questo gene, evidenzia l’appartenenza del ceppo ITD-01 alla famiglia delle Pseudanabaenaceae. Anche in questa topologia il ceppo in esame risulta †̃sister taxon’ di un gruppo costituito da alcune forme appartenenti alla sottofamiglia Leptolyngbyoideae.
Alla luce delle indagini eseguite, i risultati ottenuti suggeriscono che il ceppo ITD-01 potrebbe rappresentare il primo taxon descritto appartenente ad un nuovo genere, il cui nome potrebbe essere Protolyngbya.
Il ceppo ITD-01 N° CCALA 945 e i suoi derivati possono esser mantenuti in coltura liquida o solida su un opportuno mezzo di coltura, oppure conservati in forma liofilizzata, oppure congelati. Metodi di conservazione, mantenimento e crescita di batteri sono noti in letteratura e descritti ad esempio in: MacFaddin, J. F. 1985, Media for isolation, cultivation, Identification, maintenance of medicai bacteria. Williams & Wilkins, Baltimore, Md., oppure ancora in Ted R. Johnson, Christine L Case, James G. Cappuccino, Natalie Sherman, Virginia Schurman, Janet Savage, 1999. Biology 201: Microbiology Laboratory Manual. Addison-Wesley edition.
Di seguito vengono illustrate alcune procedure per l’attuazione dell’invenzione, che ne costituiscono solo degli esempi e non sono pertanto né esaustivi, né limitanti di quanto esposto in precedenza. Sono inoltre descritte le analisi eseguite che hanno portato alia caratterizzazione del ceppo ITD-01 N° CCALA 945 isolato dai fanghi del comprensorio termale di Ischia.
PARTE SPERIMENTALE
Isolamento e mantenimento in coltura del cianobatterio della famiglia Pseudanabaenaceae (Oscillatoriales, Cyanophyta) ceppo ITD-01
Il microorganismo IT.D-01 à ̈ stato isolato da un feltro blu-verde in via di formazione sulla superficie dei fanghi termali dell’hotel NH Ischia Thermal Spa Resort (Napoli, Italia) (40°44'0 "Nord, 13°36'0" Est) in aprile 2009. La temperatura dell'acqua al momento del campionamento era di circa 30°C ed il pH era 7.
Dopo aver raccolto il feltro, l’isolamento dell’organismo à ̈ stato condotto in laboratorio mediante la tecnica della piastratura su agar. Tale tecnica consiste nell’inoculare un pool di microorganismi in una piastra Petri, contenente un terreno di coltura solidificato con l’aggiunta di agar, un polisaccaride complesso che deriva dalle alghe rosse. Nel nostro caso à ̈ stato utilizzato un terreno BG1 1 agarizzato. Lo scopo di questa tecnica à ̈ quello di separare le diverse forme di microorganismi che costituiscono la popolazione. Le cellule dei differenti organismi possono riprodursi nel terreno solido e formare diversi agglomerati definiti colonie. Una di queste colonie, costituita unicamente da cellule dell’organismo in esame, à ̈ stata quindi inoculata in un mezzo di coltura liquido BG11 (Rippka et al. 1979, ref. cit.) e mantenuta a crescere ad una temperatura di 30°C e ad un’intensità luminosa di 35 Î1⁄4mol fotoni m<-2>s<-1>con un fotoperiodo di 12/12 ore.
Dopo aver ottenuto delle colture pure massive dell’organismo ITD-01 sono state condotte le diverse indagini per definire la sua esatta collocazione sistematica.
Indagini morfologiche ed ultrastrutturali
Le osservazioni al microscopio ottico sono state condotte utilizzando un microscopio ottico Leica DM5000, operante sia in luce visibile che in fluorescenza e munito di analizzatore di immagine digitale. Per le osservazioni al microscopio ottico in fluorescenza, i campioni sono stati eccitati con luce UV (340-380 nm) che permette di visualizzare la caratteristica autofluorescenza rossa della clorofilla. Per le osservazioni al microscopio elettronico a scansione (SEM), dalla coltura liquida sono state prelevate aliquote di campione. Queste sono state fissate per 24 h in glutaraldeide al 6% in tampone cacodilato 0.2 M pH 6.9, successivamente post-fissate, per tutta la notte, in tetrossido di osmio 1% in tampone cacodilato 0,2 M pH 6,9 e quindi disidratate in soluzioni acquose di alcool etilico a concentrazioni crescenti.
Successivamente, i campioni sono stati sottoposti al " critical point drying †, montati su appositi supporti, metallizzati con oro ed osservati con un microscopio elettronico a scansione Stereoscan 260-Cambridge.
Per le analisi ultrastrutturali, condotte al microscopio elettronico a trasmissione (TEM), dalla coltura liquida sono stati prelevati campioni. Questi sono stati fissati in glutaraldeide al 6%, in lampone cacodilato 0.2 M pH 6.9 per una notte a 4 °C. Il giorno successivo, dopo 3 lavaggi di 10 minuti ciascuno con il tampone cacodilato, à ̈ stata effettuata una post-fissazione in tetrossido di osmio 1% in tampone cacodilato 0.2 M pH 6.9, seguita da disidratazioni in soluzioni acquose di alcool etilico a concentrazioni crescenti. L’inclusione à ̈ stata effettuata in Araldite. I campioni inclusi in resina sono stati quindi tagliati utilizzando un ultramicrotomo (Ultracut Reichert-Jung) per ottenere delle sezioni ultrasottili di 80-90 nm di spessore. Queste sono state raccolte su retini di rame ricoperti da una pellicola di collodio e da uno strato sottile di carbonio.
I retini sono stati poi contrastati con citrato di piombo per 10 minuti al buio, accuratamente lavati mediante lavaggi con acqua distillata e fatti asciugare.
L’osservazione delle sezioni à ̈ stata effettuata con un microscopio elettronico a trasmissione Hitachi H300 operante a 75 kV.
Nelle figure 1-3 sono riportate a titolo di esempio alcune immagini ottenute al microscopio ottico (fig. 1) ed elettronico (fig. 2 e 3) a cui si à ̈ già fatto menzione in precedenza.
Analisi biochimiche
Dalla coltura sono stati prelevati campioni. Questi sono stati pesati per ottenere una stima del peso fresco e successivamente inseriti in una provetta con sabbia di quarzo e pestati con un pestello fino alla completa triturazione. Per l’estrazione delle ficobiliproteine, al campione triturato à ̈ stato aggiunto 1 mi di tampone fosfato (NaH2P040.01 M, NaCI.0.15M, pH 7). I campioni sono stati posti a 4°C per tutta a notte e successivaménte centrifugati per 2 min a 14000 g. La fase acquosa à ̈ stata prelevata e successivamente analizzata con uno spettrofotometro (Beckman DU-530). È stata rilevata l'assorbanza dei campioni alle lunghezze d'onda di 562 nm per la ficoeritrina (PE), 620 nm per la ficocianina (PC), 652 nm per la alloficocianina (APC). Le concentrazioni delle ficobiliproteine sono state calcolate utilizzando opportune formule.
I pigmenti fotosintetici liposolubili (clorofilla a e carotenoidi) sono stati estratti per essere poi analizzati all’HPLC (High Performance Liquid Chromatography).
Per tale analisi campioni di ITD-01, raccolti dalle colture cianobatteriche, sono stati posti in provette, ai quali sono stati aggiunti 500 pi di acetone al 90% e un’opportuna quantità di sabbia di quarzo. Il tutto à ̈ stato pestato con un pestello e successivamente centrifugato per 2 minuti a 14000 g. Il sumatante à ̈ stato raccolto e portato a secco con azoto gassoso e sono stati quindi aggiunti 100 pi di acetone al 100%. A questo punto il campione à ̈ stato analizzato all’HPLC utilizzando il metodo riportato in Komàrek, J. et al., 1999, Generic characters of thà ̈ simplest cyanoprokaryotes Cyanobium, Cyanobacterium and Synechococcus, Cryptogamie Algol. 20: 209-222.
Nella figura 4 sono riportati i risultati ottenuti e di cui si à ̈ già fatto menzione in precedenza.
Analisi molecolari
II DNA genomico à ̈ stato estratto e purificato mediante il Genomic DNA purification kit (FERMENTAS).
La stima della concentrazione di DNA à ̈ stata determinata attraverso un'analisi spettrofotometrica, effettuata con uno spettrofotometro Beckman DU-530 alle lunghezza d’onda di 230, 260, 280 e 320 nm, che ha permesso anche di valutare 10 stato di purezza e di contaminazione proteica del DNA.
11 primo marker molecolare testato à ̈ stato il gene 16S rDNA (SEQ. IDNO. 1 ). I prìmer scelti per l'amplificazione del frammento genomico corrispondente al 16S rDNA, denominati 16S1 (5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’) (posizione 1-+20, GenBanK accession number D83715) e 16S2 (5’-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’) (posizione 1453-+1433, GenBanK accession number D83715), sono stati sviluppati da Kobayashi (dati non pubblicati) sulla sequenza genica del 16S rDNA di Synechococcus elongatus (GenBanK accession number D83715). Per il sequenziamento sono stati, invece, utilizzati dei prìmer disegnati sull’allineamento di sequenze geniche del 16S rDNA dei seguenti cianobatteri: Phormidium ambiguum AB003167; Stanieria cyanosphaera AF1 32931 ; Anabaena cylindrìca AF091150; Nodularia sp. PCC 9350 AY038034; Trichodesmium erytraeum AF013030; Oscillatoria sancta AF1 32933 e Synechococcus elongatus D83715, presenti nella banca dati GenBank dell’NCBI (National Center for Biotechnology Information) (www.ncbi.nlm.nih.gov/).
Le sequenze dei prìmer utilizzati per il sequenziamento sono le seguenti: 16S3: 5-CTACGGGAGGCAGCAGTG-3’ (posizione 304-+321 , GenBank accession number AJ548503); 16S4: 5-CACTGCTGCCTCCCGTAG-3’ (posizione 321-+304, GenBank accession number AJ548503); 16S5: 5’-ATACCCCAGTAGTCCTAG-3’ (posizione 731 -+748, GenBank accession number AJ548503); 16S6: 5’-TAAACCACATACTCCACC-3’ (posizione 898-+881 , GenBank accession number AJ548503).
Un altro marker scelto per la caratterizzazione molecolare à ̈ stato il gene plastidiale rbcL (SEQ. IDNO. 2). Sia per l’amplificazione che per il sequenziamento del locus rbcL sono state utilizzate due coppie di prìmer (GF-AB 5’-CTACGGGAGGCAGCAGTG-3’; GR-D 5’- TGCCAIACGTGGATACCACC -3’; GF-C 5’- CTTYACYCAAGACTGGGCTTC -3’; GR-E 5’-AACTCRAACTTGATTTCYTTCC -3’).
I prodotti di amplificazione mediante POR, le cui condizioni sono riportate in Tab.1 , sono stati purificati con esonucleasi I e fosfatasi alcalina (ExoSAP-ITTM kit, Amersham Biosciences).
Temperatura Durata
(°C)
Denaturazione iniziale 95°C 5’
Denaturazione 95°C 45â€
Annealing 40†35 cicli Estensione 72°C 45â€
Estensione finale 72°C 8
Tab. 2. Parametri fisici della reazione di PCR. * temperatura di annealing per il gene 16S rDNA à ̈ 58°C; per il gene rbcL à ̈ 50°C. ;;La determinazione delle sequenze à ̈ stata effettuata presso il BMR Genomics (www.bmr-aenomics.itL mediante l’uso del kit ABI PRISM Dye Terminator Sequencing Core (Perkin Elmer). L’elettroforesi delle reazioni di sequenza à ̈ stata eseguita con il sequenziatore automatico ABI PRISM 377, versione 2. 1.1. ;Le sequenze nucleotidiche così ottenute sono state confrontate con altre mediante il programma BLAST, che consente di allineare e comparare sequenze d’interesse con sequenze disponibili nel database GenBank. Il risultato dell’analisi à ̈ un allineamento, in cui ad ogni sequenza trovata nel database viene assegnato un punteggio d’identità con la sequenza in esame. ;Utilizzando le sequenze ottenute dal sequenziamento e le altre sequenze disponibili nella banca dati GenBank, sono stati costruiti distinti dataset per i marker molecolari scelti. ;Le sequenze di ciascun dataset sono state allineate tramite il programma ClustaIW. ;A partire dai dataset costruiti, tramite il programma PHYML 2.4 sono state effettuate delle ricostruzioni filogenetiche secondo il metodo del Maximum likelihood (ML), applicando il modello GTR+I+G. La robustezza di ciascuna delle topologie ottenute à ̈ stata valutata applicando il test di Bootstrap (BT), con 1000 repliche. ;Gli alberi filogenetici così generati sono stati visualizzati con il programma NJplot (fig. 5 e 6). *

Claims (10)

  1. Rivendicazioni 1. Ceppo di cianobatterio Protolyngbya sp. ITD-01 depositato con N° CCAL.A 945, CCALA, Institute of Botany, Academy of Sciences of thà ̈- Czech Republic, Centre of Phycology, TREBON CZ-379 82 comprendente per il gene 16S la sequenza rDNA IDNO. 1 e per il gene plastidiale rbcL la sequenza DNA IDNO. 2.
  2. 2. Derivati del ceppo secondo la rivendicazione 1 ottenuti per mutazione o trasformazione genetica o mediante crescita in condizioni selettive.
  3. 3. Derivati del ceppo secondo la rivendicazione 1 ottenuti per estrazione, frazionamento subcellulare e/o lisi da colture cellulari cresciute in condizioni controllate.
  4. 4. Derivati del ceppo secondo la rivendicazione 3 consistenti nel pigmento idrosolubile C-ficocianina.
  5. 5. Composizioni comprendente quale principio attivo il ceppo di cianobatterio Protolyngbya sp. ITD-01 secondo la rivendicazione 1 o suoi derivati secondo le rivendicazioni 2-4.
  6. 6. Composizioni secondo la rivendicazione 5, in cui il principio attivo à ̈ in combinazione con uno o più altri principi attivi e/o con eccipienti, diluenti o solventi.
  7. 7. Ceppo di cianobatterio Protolyngbya sp. ITD-01 secondo la rivendicazione 1 o i suoi derivati secondo le rivendicazioni 2-4 per uso in campo cosmetico.
  8. 8. Ceppo di cianobatterio Protolyngbya sp. ITD-01 secondo la rivendicazione 1 o i suoi derivati secondo le rivendicazioni 2-4 per uso in campo farmaceutico.
  9. 9. Ceppo di cianobatterio Protolyngbya sp. ITD-01 secondo la rivendicazione 1 o i suoi derivati secondo le rivendicazioni 2-4 per uso nella preparazione di integratori alimentari.
  10. 10. Ceppo di cianobatterio Protolyngbya sp. ITD-01 secondo la rivendicazione 1 o i suoi derivati secondo le rivendicazioni 2-4 per uso nella fangoterapia.
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Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4886831A (en) * 1987-03-16 1989-12-12 The Regents Of The University Of California Medical uses for phycocyanin
EP1955706A1 (en) * 2005-10-28 2008-08-13 Centro De Ingenieria Genetica Y Biotecnologia (Cigb) Interferon-alpha and c-phycocyanin for the treatment of autoimmune diseases, allergic diseases and cancer
CN101240010B (zh) * 2008-02-28 2010-06-02 山东大学 从蓝藻中快速分离纯化c-藻蓝蛋白和异藻蓝蛋白的方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4886831A (en) * 1987-03-16 1989-12-12 The Regents Of The University Of California Medical uses for phycocyanin
EP1955706A1 (en) * 2005-10-28 2008-08-13 Centro De Ingenieria Genetica Y Biotecnologia (Cigb) Interferon-alpha and c-phycocyanin for the treatment of autoimmune diseases, allergic diseases and cancer
CN101240010B (zh) * 2008-02-28 2010-06-02 山东大学 从蓝藻中快速分离纯化c-藻蓝蛋白和异藻蓝蛋白的方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MORO ISABELLA ET AL: "Polyphasic characterization of a thermo-tolerant filamentous cyanobacterium isolated from the Euganean thermal muds (Padua, Italy)", EUROPEAN JOURNAL OF PHYCOLOGY, CAMBRIDGE UNIVERSITY PRESS, CAMBRIDGE, DE, vol. 45, no. 2, 1 January 2010 (2010-01-01), pages 143 - 154, XP008133360, ISSN: 0967-0262, DOI: DOI:10.1080/09670260903564391 *
PATEL A ET AL: "Purification and characterization of C-Phycocyanin from cyanobacterial species of marine and freshwater habitat", PROTEIN EXPRESSION AND PURIFICATION, ACADEMIC PRESS, SAN DIEGO, CA, vol. 40, no. 2, 1 April 2005 (2005-04-01), pages 248 - 255, XP004781376, ISSN: 1046-5928, DOI: DOI:10.1016/J.PEP.2004.10.028 *

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