ITPD20090348A1

ITPD20090348A1 - METHOD FOR PRODUCING EXTRACELLULAR GLUTATION WITH HIGH YIELD

Info

Publication number: ITPD20090348A1
Application number: IT000348A
Authority: IT
Inventors: Livia Barenghi; Silvia Bradamante; Silvia Versari; Alessandro Villa
Original assignee: Silvia Bradamante
Priority date: 2009-11-21
Filing date: 2009-11-21
Publication date: 2011-05-22
Also published as: EP2501823A1; WO2011061713A1

Description

DESCRIZIONE DESCRIPTION

La presente invenzione si riferisce a un processo per produrre glutatione. In particolare, l’invenzione riguarda una fermentazione ed un trattamento chimico e/o meccanico per produrre glutatione extracellulare (chiamato nel seguito GSH per brevità) che permette di ottenere GSH con alte rese e costi relativamente bassi. The present invention relates to a process for producing glutathione. In particular, the invention relates to a fermentation and a chemical and / or mechanical treatment to produce extracellular glutathione (hereinafter referred to as GSH for brevity) which allows to obtain GSH with high yields and relatively low costs.

Il GSH, γ-L-glutammil-L-cisteinilglicina, è un noto tripeptide che, in piccole quantità, è presente all’interno di tutte le cellule degli organismi viventi. Le sue molteplici funzioni sono importanti in diversi settori biomedici, tra cui enzimologia, farmacologia, tossicologia, endocrinologia e microbiologia. GSH, γ-L-glutamyl-L-cysteinylglycine, is a known tripeptide which, in small quantities, is present within all the cells of living organisms. Its multiple functions are important in several biomedical fields, including enzymology, pharmacology, toxicology, endocrinology and microbiology.

Il GSH è uno dei più abbondanti antiossidanti presenti negli organismi viventi. E’ efficace nel ridurre i danni prodotti da radicali liberi e altri agenti ossidanti. GSH is one of the most abundant antioxidants found in living organisms. It is effective in reducing the damage produced by free radicals and other oxidizing agents.

Il GSH è anche utilizzato come detossificante (per esempio, nell’avvelenamento da paracetamolo o da metalli pesanti) e come integratore dietetico per il trattamento, tra gli altri, di diabete, infertilità, cancro, cataratta e virus da immunodeficienza umana (HIV). GSH is also used as a detoxifier (for example, in paracetamol or heavy metal poisoning) and as a dietary supplement for the treatment, among others, of diabetes, infertility, cancer, cataracts and human immunodeficiency virus (HIV).

Il GSH è prodotto industrialmente mediante processi fermentativi in cui il prodotto è estratto dalle cellule microbiche. Allo scopo di ottenere alte rese di GSH, si può lavorare A) sull’aumento del contenuto di GSH intracellulare (mediante mutagenesi o opportune strategie di coltivazione), B) sull’aumento della densità cellulare (mediante ottimizzazione del processo produttivo) e C) sull’ottimizzazione della procedura di estrazione. GSH is industrially produced by fermentation processes in which the product is extracted from microbial cells. In order to obtain high yields of GSH, it is possible to work A) on increasing the intracellular GSH content (through mutagenesis or appropriate cultivation strategies), B) on increasing cell density (by optimizing the production process) and C) on the optimization of the extraction procedure.

Metodi per aumentare la produzione di GSH da microrganismi sono descritti in diversi brevetti e/o studi scientifici. Methods for increasing GSH production by microorganisms are described in several patents and / or scientific studies.

Li Y. et al. in “Glutathione: a review on biotechnological production”, Appl Microbiol Biotechnol, 2004, vol. 66, 233-242 riassume l’avanzamento tecnologico e i risultati ottenuti nell’ambito della produzione di GSH durante gli ultimi trent’anni. In particolare descrive sia le varie strategie di coltura ed estrazione, sia le tecniche di mutagenesi adottate dai vari gruppi di ricerca. WO 2004/003217 descrive un processo per produrre GSH che prevede la coltivazione, in opportune condizioni che promuovano la produzione di GSH, di un ceppo di lievito che abbia una o più mutazioni geniche che abbiano come risultato una secrezione di GSH nel terreno di coltura significativamente aumentata rispetto al ceppo parentale non mutato. Con tale processo si ottengono fino a 20 µmoli/L di GSH extracellulare. Li Y. et al. in “Glutathione: a review on biotechnological production”, Appl Microbiol Biotechnol, 2004, vol. 66, 233-242 summarizes the technological advancement and the results obtained in the production of GSH during the last thirty years. In particular, it describes both the various culture and extraction strategies, and the mutagenesis techniques adopted by the various research groups. WO 2004/003217 describes a process for producing GSH which involves the cultivation, under suitable conditions that promote the production of GSH, of a yeast strain that has one or more gene mutations resulting in significant secretion of GSH in the culture medium. increased compared to the unchanged parental strain. With this process up to 20 µmoles / L of extracellular GSH are obtained.

Liao X.Y. et al., in “Improved glutathione production by gene expression in Escherichia coli”, Lett Appl Microbiol, 2006, vol. 43, 211-214, descrive come aumentare la produzione di GSH in Escherichia coli utilizzando diversi costrutti genetici contenenti i geni della biosintesi del GSH, gshI e gshI I , fino ad ottenere 34,8 mg/g di peso umido di cellule. Liao X.Y. et al., in “Improved glutathione production by gene expression in Escherichia coli”, Lett Appl Microbiol, 2006, vol. 43, 211-214, describes how to increase GSH production in Escherichia coli using different genetic constructs containing the GSH biosynthesis genes, gshI and gshI I, to obtain 34.8 mg / g of wet cell weight.

Lin J. et al., in “Enhancement of glutathione production in a coupled system of adenosine-deaminase-deficient recombinant Escherichia coli and Saccharom yces cerevisiae”, Enzyme and Microbiol Tecnology, 2009, 44, 269-273, descrive un sistema accoppiato ad alta efficienza per la rigenerazione dell’ATP, metabolita energetico necessario per la produzione enzimatica del GSH. Tale sistema, costruito con E. coli e S. cerevisiae ambedue deficitari del gene dell’adenosina deaminasi, consente di migliorare la resa fino a 2.94 volte quella ottenuta con il controllo. La concentrazione di GSH raggiunta dopo 6 ore è 7.82 mM. Lin J. et al., In "Enhancement of glutathione production in a coupled system of adenosine-deaminase-deficient recombinant Escherichia coli and Saccharom yces cerevisiae", Enzyme and Microbiol Technology, 2009, 44, 269-273, describes a system coupled to high efficiency for the regeneration of ATP, an energy metabolite necessary for the enzymatic production of GSH. This system, built with E. coli and S. cerevisiae both deficient in the adenosine deaminase gene, allows to improve the yield up to 2.94 times that obtained with the control. The GSH concentration reached after 6 hours is 7.82 mM.

L’utilizzo di microrganismi ingegnerizzati supera il problema delle basse rese di produzione, con lo svantaggio che spesso le mutazioni introdotte non sono stabili. The use of engineered microorganisms overcomes the problem of low production yields, with the disadvantage that often the introduced mutations are not stable.

EP1391517 descrive un metodo per ottenere GSH comprendente a) l’ottenimento di una biomassa attraverso una pre-coltura in condizioni aerobiche di un ceppo di lievito produttore di GSH in cui il contenuto di GSH per unità di biomassa sia > 1,2% w/w; b) la coltivazione in condizioni aerobiche della risultante biomassa fino a ottenere una biomassa di densità > 50 g/L; c) l’attivazione della biomassa ottenuta in modo da innescare la produzione di GSH e, infine, d) il recupero della biomassa coltivata, l’estrazione del GSH mediante rottura delle cellule e la sua purificazione. La resa di produzione di GSH ottenuta con il metodo sopra citato è bassa se confrontata alla quantità di biomassa utilizzata. Inoltre, l’estrazione del GSH avviene mediante rottura delle cellule. EP1391517 describes a method for obtaining GSH comprising a) obtaining a biomass through an aerobic pre-culture of a GSH producing yeast strain in which the GSH content per unit of biomass is> 1.2% w / w; b) the cultivation of the resulting biomass under aerobic conditions until a biomass density> 50 g / L is obtained; c) the activation of the biomass obtained in order to trigger the production of GSH and, finally, d) the recovery of the cultivated biomass, the extraction of GSH by breaking the cells and its purification. The GSH production yield obtained with the above method is low when compared to the amount of biomass used. In addition, the extraction of GSH takes place by breaking down the cells.

Zhang T. et al., in “Optimization of the medium for glutathione production in Saccharom yces cerevisiae”, Process Biochem, 2007, vol. 42, 454–458, descrive come ottimizzare il terreno di coltura per aumentare le rese di produzione di GSH. Il terreno di coltura ottimizzato dà una resa di GSH intracellulare pari a 74.6 mg/L. Zhang T. et al., In “Optimization of the medium for glutathione production in Saccharom yces cerevisiae”, Process Biochem, 2007, vol. 42, 454–458, describes how to optimize the growing medium to increase GSH production yields. The optimized culture medium gives an intracellular GSH yield of 74.6 mg / L.

Udeh K.O. et al., in ”High-glutathione containing yeast Saccharomyces cerevisiae: optimization of production”, Acta Microbiol Pol, 1997, vol. 46, 105-114, descrive come ottimizzare la composizione del terreno di coltura per la produzione di GSH utilizzando un ceppo di Saccharom yces cerevisiae ad alto contenuto di glutatione. Con il metodo descritto, si ottengono fino a 17 mg di GSH /g di peso secco di lievito. Udeh K.O. et al., in "High-glutathione containing yeast Saccharomyces cerevisiae: optimization of production", Acta Microbiol Pol, 1997, vol. 46, 105-114, describes how to optimize the culture medium composition for GSH production using a high glutathione strain of Saccharom yces cerevisiae. With the method described, up to 17 mg of GSH / g of dry weight of yeast are obtained.

Xiong Z.Q. et al., in “Efficient extraction of intracellular reduced glutathione from fermentation broth of Saccharom yces cerevisiae by ethanol”, Bioresour Technol, 2009, vol. 100, 1011-1014, descrive come estrarre GSH dal terreno di coltura, senza la rottura delle cellule, utilizzando etanolo. L’estrazione con etanolo presenta molteplici vantaggi, principalmente il minor consumo di energia, la non distruzione delle cellule e una minor concentrazione di proteine nel brodo colturale, tutti fattori che possono ridurre la complessità e i costi del processo di purificazione. Xiong Z.Q. et al., in “Efficient extraction of intracellular reduced glutathione from fermentation broth of Saccharom yces cerevisiae by ethanol”, Bioresour Technol, 2009, vol. 100, 1011-1014, describes how to extract GSH from the culture medium, without breaking the cells, using ethanol. Extraction with ethanol has multiple advantages, mainly lower energy consumption, non-destruction of cells and a lower concentration of proteins in the culture broth, all factors that can reduce the complexity and costs of the purification process.

Tale metodo comunque, se comparato alle tecniche di estrazione convenzionali (per esempio estrazione con acqua bollente), non presenta vantaggi significativi sulla resa di produzione di GSH. However, this method, if compared to conventional extraction techniques (for example extraction with boiling water), does not present significant advantages on the production yield of GSH.

Negli ultimi anni le tecniche di estrazione del GSH sono state notevolmente ottimizzate, diminuendo il consumo di solvente, accorciando i tempi di estrazione, aumentando le rese e la qualità degli estratti. In recent years, GSH extraction techniques have been significantly optimized, reducing solvent consumption, shortening extraction times, increasing yields and quality of extracts.

EP1500944 descrive come ottenere alte rese di GSH extracellulare mediante la coltivazione del lievito Saccharom yces cerevisiae in un bioreattore che simula una condizione di ridotta gravità. Con tale approccio si ottiene fino al 7% w/dw di GSH extracellulare. Il vantaggio di tale metodo consiste sia nelle alte rese di produzione, sia nel fatto che il GSH prodotto è extracellulare e quindi recuperabile dal terreno di coltura senza la rottura delle cellule. EP1500944 describes how to obtain high yields of extracellular GSH by culturing the yeast Saccharom yces cerevisiae in a bioreactor that simulates a condition of reduced severity. With this approach, up to 7% w / dw of extracellular GSH is obtained. The advantage of this method consists both in the high production yields and in the fact that the GSH produced is extracellular and therefore recoverable from the culture medium without breaking the cells.

Nonostante i metodi sopra descritti presentino un aumento della produzione di GSH e/o un’ottimizzazione del processo di estrazione e purificazione, talvolta risultano complessi, in particolare ad esempio di difficile utilizzo industriale, o consentono di ottenere rese di produzione ancora relativamente basse. Although the methods described above show an increase in the production of GSH and / or an optimization of the extraction and purification process, they are sometimes complex, in particular for example difficult to industrial use, or allow still relatively low production yields to be obtained.

Scopo della presente invenzione è quindi quello di fornire un metodo per la produzione di GSH che superi i limiti sopra esposti con riferimento alla tecnica nota citata. The aim of the present invention is therefore to provide a method for the production of GSH that exceeds the limits set out above with reference to the known art cited.

Un ulteriore scopo della presente invenzione è fornire un metodo semplice ed efficiente per ottenere alte rese di GSH extracellulare evitando l’introduzione di mutazioni geniche e/o la rottura delle cellule utilizzate per la sua produzione. A further object of the present invention is to provide a simple and efficient method for obtaining high yields of extracellular GSH avoiding the introduction of gene mutations and / or the breakdown of the cells used for its production.

Questo scopo è raggiunto da un metodo per la produzione di GSH tramite un processo di fermentazione in accordo con le rivendicazioni seguenti. This object is achieved by a method for the production of GSH by means of a fermentation process in accordance with the following claims.

In particolare il processo di produzione del GSH extracellulare secondo l’invenzione comprende le seguenti fasi: coltivare un microrganismo in un opportuno terreno, fornire alla coltura almeno un agente ossidante per indurre la produzione di GSH da parte di tale microrganismo, somministrare alla coltura almeno un agente modificatore atto a promuovere l’apertura di almeno un canale ionico cellulare in tale microrganismo in modo da favorire la fuoriuscita di GSH. In particular, the production process of extracellular GSH according to the invention comprises the following steps: cultivating a microorganism in a suitable medium, supplying the culture with at least one oxidizing agent to induce the production of GSH by this microorganism, administering at least one microorganism to the culture modifying agent able to promote the opening of at least one cellular ion channel in said microorganism so as to favor the release of GSH.

Con il processo dell’invenzione si ottengono rese elevate di GSH, la quantità rilasciata di GSH nel terreno di coltura è ≥ 8% (% di peso di GSH/peso secco di lievito). With the process of the invention, high yields of GSH are obtained, the quantity of GSH released in the culture medium is ≥ 8% (% of weight of GSH / dry weight of yeast).

Inoltre con il metodo dell’invenzione è possibile recuperare il GSH dal terreno di coltura senza dover distruggere il microrganismo produttore, né tantomeno purificare il GSH da altri composti rilasciati in seguito alla rottura del microrganismo stesso, rottura che avviene in numerosi metodi della tecnica nota per recuperare il GSH prodotto al suo interno. Furthermore, with the method of the invention it is possible to recover the GSH from the culture medium without having to destroy the producer microorganism, nor to purify the GSH from other compounds released following the breakdown of the microorganism itself, breakage that occurs in numerous methods of the known technique for recover the GSH produced inside it.

Con il processo dell’invenzione è possibile isolare il GSH dal terreno di coltura in maniera semplice ed economica. With the process of the invention it is possible to isolate the GSH from the culture medium in a simple and economical way.

Inoltre la produzione di GSH con il processo dell’invenzione può essere eseguito potenzialmente in continuo. Furthermore, the production of GSH with the process of the invention can potentially be performed continuously.

Per attuare il processo dell’invenzione possono essere utilizzati microrganismi wild type o anche mutati. Wild type or even mutated microorganisms can be used to implement the process of the invention.

In una forma preferita di attuazione, l’invenzione prevede di usare almeno un ceppo di lievito come microrganismo produttore. In a preferred embodiment, the invention provides to use at least one yeast strain as a producer microorganism.

Secondo una forma ulteriormente preferita di attuazione dell’invenzione, è previsto usare il ceppo di lievito Saccharom yces cerevisiae, identificato come L5267 (collezione privata Le Saffre). Le caratteristiche morfologiche, sessuali e nutrizionali del ceppo utilizzato sono conformi alle caratteristiche tipiche della specie di lievito utilizzata, come descritte per esempio da J.A. Barnet et al. in “YEAST: Characteristics and identification”, (Third ed. Cambridge University, 2000). According to a further preferred embodiment of the invention, it is envisaged to use the yeast strain Saccharom yces cerevisiae, identified as L5267 (private collection Le Saffre). The morphological, sexual and nutritional characteristics of the strain used conform to the typical characteristics of the yeast species used, as described for example by J.A. Barnet et al. in “YEAST: Characteristics and identification”, (Third ed. Cambridge University, 2000).

Secondo un’ulteriore preferito esempio, è previsto utilizzare ceppi di lievito Candida ut ilis. According to a further preferred example, Candida ut ilis yeast strains are used.

Per l’attuazione del processo dell’invenzione si possono utilizzare lieviti aploidi o anche poliploidi. For the implementation of the process of the invention, haploid or even polyploid yeasts can be used.

In altre versioni dell’invenzione, può essere previsto utilizzare come microrganismo produttore di GSH ceppi di alghe acquatiche (es. diatomee marine) per la decontaminazione delle acque inquinate da metalli (come quelle descritte nell’articolo di Kawakami S.K. et al. BioMetals, 2006,19,51-60). In other versions of the invention, it can be envisaged to use as microorganism producing GSH aquatic algae strains (e.g. marine diatoms) for the decontamination of water polluted by metals (such as those described in the article by Kawakami S.K. et al. BioMetals, 2006 , 19.51-60).

In altre versioni, può essere previsto utilizzare come organismo produttore cellule microbiche in forma planctonica o che si organizzano in biofilm. In other versions, it may be envisaged to use microbial cells in planktonic form or organisms that organize themselves in biofilms as the producing organism.

Secondo una differente forma di attuazione preferita, come microrganismo produttore è usato un ceppo batterico, ancora più preferibilmente comprendente Escherica Coli. E’ noto in letteratura che tale ceppo è in grado di produrre GSH. According to a different preferred embodiment, a bacterial strain is used as the producer microorganism, even more preferably comprising Escherica Coli. It is known in the literature that this strain is capable of producing GSH.

Per l’attuazione del processo dell’invenzione il terreno di coltura può essere un qualunque terreno di coltura, liquido o solido atto a garantire la vitalità cellulare. For the implementation of the process of the invention, the culture medium can be any medium, liquid or solid capable of ensuring cell viability.

Secondo l’invenzione vengono utilizzati agenti modificatori per indurre direttamente e/o indirettamente l’apertura di almeno alcuni dei canali ionici del microrganismo in modo da favorire la fuoriuscita di GSH. According to the invention, modifying agents are used to directly and / or indirectly induce the opening of at least some of the ion channels of the microorganism in order to favor the release of GSH.

Preferibilmente, nel processo dell’invenzione vengono utilizzati agenti modificatori atti a causare l’apertura dei canali del Cloro del microorganismo. Preferably, modifying agents are used in the process of the invention to cause the opening of the chlorine channels of the microorganism.

Più preferibilmente, possono essere utilizzati agenti modificatori atti a causare l’apertura dei canali Bromo, e/o Potassio, e/o Sodio, e/o Calcio. Gli agenti modificatori utilizzati nell’invenzione per aprire uno o più canali ionici delle cellule presenti nel terreno di coltura possono essere di tipo chimico e/o meccanico. More preferably, modifying agents can be used to cause the opening of the Bromine, and / or Potassium, and / or Sodium, and / or Calcium channels. The modifying agents used in the invention to open one or more ion channels of the cells present in the culture medium can be of a chemical and / or mechanical type.

In una forma preferita di attuazione dell’invenzione è fornito un agente modificatore tale da causare la disorganizzazione / depolarizzazione / depolimerizzazione di componenti del citoscheletro del microrganismo. In a preferred embodiment of the invention, a modifying agent is provided such as to cause the disorganization / depolarization / depolymerization of components of the cytoskeleton of the microorganism.

Il trattamento produce cambiamenti nel citoscheletro cellulare tali da causare direttamente e/o indirettamente l’apertura di almeno uno dei canali ionici con conseguente fuoriuscita del GSH dal microrganismo, dopo esserne stata stimolata la produzione al suo interno. The treatment produces changes in the cell cytoskeleton such as to directly and / or indirectly cause the opening of at least one of the ion channels with consequent release of GSH from the microorganism, after its production has been stimulated.

In alcuni esempi preferiti di realizzazione è previsto fornire agenti modificatori atti ad agire direttamente o indirettamente sull’actina del microrganismo. In some preferred embodiment examples it is provided to provide modifying agents capable of acting directly or indirectly on the actin of the microorganism.

L’agente modificatore può essere un composto chimico (ad esempio della classe delle citocalasine) che, agendo direttamente sull’actina, altera l’equilibrio monomero/polimero depolimerizzando le fibre di actina, determinando l’apertura di almeno alcuni dei canali ionici cellulari e conseguentemente la fuoriuscita di GSH. E’ noto infatti che le citocalasine sono anche attivatori dei canali ionici cellulari. The modifying agent can be a chemical compound (for example of the class of cytochalasins) which, acting directly on actin, alters the monomer / polymer balance by depolymerizing the actin fibers, causing the opening of at least some of the cellular ion channels and consequently the release of GSH. In fact, it is known that cytochalasins are also activators of cellular ion channels.

In una versione preferita è previsto utilizzare la diidrocitocalasina B (DHCB), un derivato saturo della citocalasina B, che accorcia i filamenti di actina col vantaggio di non interferire nel trasporto degli zuccheri. In a preferred version it is envisaged to use dihydrocitocalasin B (DHCB), a saturated derivative of cytochalasin B, which shortens the actin filaments with the advantage of not interfering in the transport of sugars.

In altre versioni dell’invenzione possono essere utilizzati agenti chimici che sono disorganizzatori/depolarizzatori/depolimerizzatori indiretti dell’actina. Tali composti, mediando un ampio spettro di risposte cellulari che coinvolgono il citoscheletro, alterano indirettamente l’equilibrio monomero/polimero dell’actina, causando quindi l’apertura dei canali ionici e, conseguentemente, la fuoriuscita di GSH dalle cellule. In other versions of the invention, chemical agents that are indirect disorganizers / depolarizers / depolymerizers of actin can be used. These compounds, mediating a wide spectrum of cellular responses involving the cytoskeleton, indirectly alter the monomer / polymer balance of actin, thus causing the opening of ion channels and, consequently, the release of GSH from the cells.

Esempi di depolarizzatori/depolimerizzatori indiretti dell’actina sono gli inibitori della Rho-Kinasi (ROCK). La Rho-kinasi, è una kinasi serina-treonina target di Rho. È un importante regolatore del citoscheletro che media gli effetti di RhoA (Ras homolog gene family, member A) sulla stabilizzazione delle fibre di actina, contrazione della muscolatura liscia, adesione cellulare, formazione di podi sulla membrana e motilità cellulare. Examples of indirect actin depolarizers / depolymerizers are Rho-Kinase inhibitors (ROCK). Rho-kinase is a Rho target serine-threonine kinase. It is an important cytoskeleton regulator that mediates the effects of RhoA (Ras homolog gene family, member A) on actin fiber stabilization, smooth muscle contraction, cell adhesion, membrane pod formation and cell motility.

Tra i vari composti del summenzionato tipo può essere utilizzato, per esempio, l’agente chimico Y-27632, (R)-(+)-t rans-4-(1-Aminoethyl)-N-(4-Pyridyl)cyclohexanecarboxamide dihydrochloride monohydrate. Among the various compounds of the aforementioned type, for example, the chemical agent Y-27632, (R) - (+) - t rans-4- (1-Aminoethyl) -N- (4-Pyridyl) cyclohexanecarboxamide dihydrochloride can be used monohydrate.

In un’ulteriore distinta forma di realizzazione preferita del processo dell’invenzione, per favorire la fuoriuscita del GSH dal microorganismo si può utilizzare un agente meccanico, come, ad esempio, l’ipergravità. In a further distinct preferred embodiment of the process of the invention, a mechanical agent, such as, for example, hyper-gravity, can be used to facilitate the release of GSH from the microorganism.

Una variazione della pressione esterna/interna cellulare tale da modificare l‘equilibrio osmotico altera, infatti, la struttura del citoscheletro provocando l’apertura di almeno alcuni dei canali ionici e favorendo la fuoriuscita di GSH. Per ottenere ipergravità si può ad esempio sottoporre il microrganismo a centrifugazione. A change in the external / internal cellular pressure such as to modify the osmotic balance alters, in fact, the structure of the cytoskeleton causing the opening of at least some of the ion channels and favoring the release of GSH. To obtain hypergravity, for example, the microorganism can be subjected to centrifugation.

Nel processo dell’invenzione, per favorire la produzione di GSH nel microorganismo produttore, è previsto fornire un agente induttore di stress, come, ad esempio, ossigeno o un altro agente ossidante. In the process of the invention, to promote the production of GSH in the producing microorganism, it is envisaged to provide a stress-inducing agent, such as, for example, oxygen or another oxidizing agent.

Preferibilmente viene fornita una quantità di ossigeno tale da generare uno stress ossidativo medio senza danneggiare le cellule. Più preferibilmente la quantità di ossigeno è ≥ 4%. Lo stress ossidativo viene generato ad esempio mediante gorgogliamento di ossigeno molecolare nel terreno di coltura o mediante scambio gassoso superficiale. Preferably, an amount of oxygen is supplied such as to generate an average oxidative stress without damaging the cells. More preferably the amount of oxygen is ≥ 4%. Oxidative stress is generated, for example, by bubbling molecular oxygen into the culture medium or by surface gas exchange.

Il processo dell’invenzione può essere attuato in batch, fed-batch o in continuo. The process of the invention can be implemented in batch, fed-batch or continuous.

Il processo dell’invenzione consente di incrementare fortemente la produzione di GSH da parte del microrganismo e la sua fuoriuscita in modo da renderlo disponibile e separabile nel terreno di coltura senza la rottura delle cellule stesse. The process of the invention allows to strongly increase the production of GSH by the microorganism and its release in order to make it available and separable in the culture medium without breaking the cells themselves.

Infine il processo dell’invenzione può comprendere, inoltre, una fase in cui è previsto estrarre e raccogliere il GSH prodotto in modo da renderlo disponibile per un uso successivo. Finally, the process of the invention may also include a phase in which the GSH produced is extracted and collected in order to make it available for later use.

La fase di estrazione del GSH dal terreno di coltura, può essere effettuata, per esempio, tramite la precipitazione del sale corrispondente in presenza di acido solforico (H2SO4) nel quale il suddetto sale, dopo salificazione dell’acido solforico, diviene insolubile. The phase of extraction of GSH from the culture medium can be carried out, for example, through the precipitation of the corresponding salt in the presence of sulfuric acid (H2SO4) in which the aforementioned salt, after salification of the sulfuric acid, becomes insoluble.

Il procedimento dell’invenzione fornisce un metodo semplice, efficiente e potenzialmente più economico per produrre GSH extracellulare, consentendo di incrementare la produzione di GSH e al tempo stesso di recuperare in maniera semplice il GSH dal terreno di coltura. The process of the invention provides a simple, efficient and potentially cheaper method to produce extracellular GSH, allowing to increase the production of GSH and at the same time to recover in a simple way the GSH from the culture medium.

I seguenti esempi illustrano le caratteristiche e i vantaggi dell’invenzione meglio descritti a titolo indicativo e non limitativo con riferimento agli uniti disegni in cui: The following examples illustrate the features and advantages of the invention better described for indicative and non-limiting purposes with reference to the accompanying drawings in which:

− la fig. 1 è un grafico riportante il GSH extracellulare prodotto mediante centrifugazione (ipergravità raggiunta pari a 10g) secondo il metodo della presente invenzione comparato con una coltura controllo ed una ulteriore coltura in cui è stato aggiunto NPPB (Esempio 1); - fig. 1 is a graph showing the extracellular GSH produced by centrifugation (hypergravity reached equal to 10g) according to the method of the present invention compared with a control culture and a further culture in which NPPB has been added (Example 1);

− la fig. 2 è un grafico riportante il GSH extracellulare prodotto mediante aggiunta di DHCB secondo il metodo della presente invenzione comparato con una coltura controllo ed una ulteriore coltura in cui è stato aggiunto NPPB (Esempio 2); - fig. 2 is a graph showing the extracellular GSH produced by adding DHCB according to the method of the present invention compared with a control culture and a further culture in which NPPB has been added (Example 2);

− la fig. 3 è un grafico riportante il GSH extracellulare prodotto mediante aggiunta di Y-27632 secondo il metodo della presente invenzione comparato con una coltura controllo ed una ulteriore coltura in cui è stato aggiunto NPPB (Esempio 3). - fig. 3 is a graph showing the extracellular GSH produced by adding Y-27632 according to the method of the present invention compared with a control culture and a further culture in which NPPB has been added (Example 3).

ESEMPIO 1 EXAMPLE 1

E’ stato utilizzato un ceppo di Saccharom yces cerevisiae, in particolare il ceppo omotallico poliploide L5267 (collezione privata Le Saffre). A Saccharom yces cerevisiae strain was used, in particular the polyploid homotallic strain L5267 (private collection Le Saffre).

Il lievito è stato sospeso a una concentrazione di 2,5% di peso secco in un terreno di coltura acquoso avente la seguente composizione: 3,5 g/L di KH2PO4, 0,37 g/L di KOH, 7 g/L di (NH4)2SO4, 0,5 g/L di MgSO4, 10 g/L di Na3C3H5O(COO)3, 4 g/L di cisteina, 4 g/L di glicina, 40 g/L di glucosio. The yeast was suspended at a concentration of 2.5% dry weight in an aqueous culture medium having the following composition: 3.5 g / L of KH2PO4, 0.37 g / L of KOH, 7 g / L of (NH4) 2SO4, 0.5 g / L of MgSO4, 10 g / L of Na3C3H5O (COO) 3, 4 g / L of cysteine, 4 g / L of glycine, 40 g / L of glucose.

Il lievito è stato coltivato per 24 ore (tempo di fermentazione) a 28 °C. The yeast was grown for 24 hours (fermentation time) at 28 ° C.

Come agente meccanico disorganizzatore/depolarizzatore/depolimerizzatore dell’actina è stata utilizzata l’ipergravità, ottenuta sottoponendo le cellule ad una centrifugazione di 10 g mediante l’utilizzo della MidiCAR (Medium Sized Centrifuge for Acceleration Research, DESC, Amsterdam, The Netherlands). Il terreno di coltura è mantenuto ossidato durante tutto il periodo della fermentazione in ambiente saturo di ossigeno. Hyper-gravity was used as a mechanical disorganizing / depolarizing / depolymerizing agent of actin, obtained by subjecting the cells to a 10 g centrifugation using MidiCAR (Medium Sized Centrifuge for Acceleration Research, DESC, Amsterdam, The Netherlands). The culture medium is kept oxidized throughout the fermentation period in an oxygen-saturated environment.

Il lievito è metabolicamente attivo durante tutto il periodo di fermentazione, come confermato dal consumo di glucosio extracellulare e dalla concomitante produzione di etanolo e glicerolo. Il contenuto di trealosio intracellulare è pressoché costante. Yeast is metabolically active throughout the fermentation period, as confirmed by the consumption of extracellular glucose and the concomitant production of ethanol and glycerol. The intracellular trehalose content is almost constant.

Alla fine della fermentazione (dopo 24 ore) le cellule di lievito vengono separate dal terreno di coltura e viene misurata la concentrazione di glutatione intra- ed extracellulare prodotto mediante cromatografia liquida ad alta prestazione (HPLC). At the end of fermentation (after 24 hours) the yeast cells are separated from the culture medium and the concentration of intra- and extracellular glutathione produced by high performance liquid chromatography (HPLC) is measured.

La concentrazione di GSH è determinata secondo il metodo riportato da Lakritz et al. Anal Biochem 1997, 247, 63-68. In particolare, i campioni sono analizzati tramite HPLC a fase inversa utilizzando una colonna cromatografica Purospher® RP-18 “endcapped” di 5 ǋm (Merck) ed un rilevatore spettrofotometrico (Ǌ=210 nm). Il solvente utilizzato contiene NaH2PO425mM. Il pH, ottenuto mediante l’utilizzo di acido trifluoroacetico 1M, è 3,5. Il flusso, ottimizzato, è 0,6 mL/min. GSH concentration is determined according to the method reported by Lakritz et al. Anal Biochem 1997, 247, 63-68. In particular, the samples are analyzed by reverse phase HPLC using a Purospher® RP-18 “endcapped” chromatographic column of 5 ǋm (Merck) and a spectrophotometric detector (Ǌ = 210 nm). The solvent used contains NaH2PO425mM. The pH, obtained by using 1M trifluoroacetic acid, is 3.5. The optimized flow is 0.6 mL / min.

L’identificazione e la misura della concentrazione di GSH sono effettuate utilizzando una soluzione standard di GSH (Sigma). The identification and measurement of the concentration of GSH are carried out using a standard solution of GSH (Sigma).

Alternativamente il GSH è identificato mediante spettroscopia NMR e la sua concentrazione determinata integrando i relativi picchi rispetto a uno standard interno a concentrazione nota (benzene d6, C6D6). Alternatively, GSH is identified by NMR spectroscopy and its concentration determined by integrating the relative peaks with respect to an internal standard of known concentration (benzene d6, C6D6).

Il processo dell’invenzione consente di ottenere alte rese di GSH extracellulare. In particolare, con il processo descritto si ottiene ≈8% di GSH extracellulare (% di peso di GSH su peso secco di lievito). La concentrazione di GSH intracellulare rimane costante nell’intervallo 1-1,4%. The process of the invention allows to obtain high yields of extracellular GSH. In particular, with the described process ≈8% of extracellular GSH is obtained (% of weight of GSH on dry weight of yeast). The intracellular GSH concentration remains constant in the 1-1.4% range.

L’aggiunta al terreno di coltura di 5-Nitro-2-(3-phenylpropylamino) benzoic acid (NPPB), inibitore dell’apertura del canale cloro, a una concentrazione di 10<-5>M, inibisce la fuoriuscita di GSH di cui sopra. La concentrazione di GSH intracellulare rimane costante nell’intervallo 1-1,4%. The addition of chlorine channel opening inhibitor 5-Nitro-2- (3-phenylpropylamino) benzoic acid (NPPB) to the culture medium at a concentration of 10 <-5> M inhibits the release of GSH by above. The intracellular GSH concentration remains constant in the 1-1.4% range.

La figura 1 allegata rappresenta un istogramma raffigurante tre diverse concentrazioni di GSH extracellulare prodotto in tre distinti esperimenti: The attached figure 1 represents a histogram depicting three different concentrations of extracellular GSH produced in three distinct experiments:

- secondo quanto descritto nell’Esempio 1 di cui sopra; - as described in Example 1 above;

- secondo quanto descritto nell’Esempio 1 senza sottoporre il microrganismo a centrifugazione; - as described in Example 1 without subjecting the microorganism to centrifugation;

- secondo quanto descritto nell’Esempio 1 ed inoltre aggiungendo NPPB al terreno di coltura come sopra descritto. - as described in Example 1 and also by adding NPPB to the culture medium as described above.

Come evidente, la centrifugazione aumenta considerevolmente la produzione di GSH extracellulare rispetto a quanto avviene in un pari processo in cui non avviene centrifugazione; mentre l’introduzione di NPPB, bloccando l’apertura dei canali ionici cellulari (in particolare del canale cloro), impedisce la fuoriuscita di GSH provocando la sostanziale assenza di GSH extracellulare anche in presenza di centrifugazione. As evident, centrifugation considerably increases the production of extracellular GSH compared to what happens in a similar process in which no centrifugation takes place; while the introduction of NPPB, by blocking the opening of cellular ion channels (in particular the chlorine channel), prevents the leakage of GSH causing the substantial absence of extracellular GSH even in the presence of centrifugation.

ESEMPIO 2 EXAMPLE 2

E’ stato utilizzato un ceppo di Saccharom yces cerevisiae, in particolare un ceppo omotallico poliploide, lo stesso ceppo utilizzato nell’Esempio 1. A Saccharom yces cerevisiae strain was used, in particular a polyploid homotallic strain, the same strain used in Example 1.

È stata generata una sospensione di lievito fino a ottenere una concentrazione pari a 2,5% di peso secco nel terreno di coltura. A yeast suspension was generated until a concentration of 2.5% dry weight was obtained in the culture medium.

Il terreno di coltura scelto ha la medesima composizione del terreno di coltura utilizzato nell’Esempio 1. The culture medium chosen has the same composition as the culture medium used in Example 1.

Il ceppo è stato coltivato per 24 ore a 28 °C. The strain was grown for 24 hours at 28 ° C.

Durante tutto il periodo della fermentazione, le cellule di lievito sono trattate con diidrocitocalasina B (DHCB), un derivato saturo della citocalasina B, che depolimerizza l’actina bloccando l’addizione monomerica all’estremità di crescita del polimero e non interferisce nel trasporto degli zuccheri. Throughout the fermentation period, yeast cells are treated with dihydrocytocalasin B (DHCB), a saturated derivative of cytochalasin B, which depolymerizes actin by blocking monomer addition at the growth end of the polymer and does not interfere in the transport of the sugars.

La diidrocitocalasina B è aggiunta al terreno di coltura a una concentrazione di 3 µM. Dihydrocytocalasin B is added to the culture medium at a concentration of 3 µM.

Il terreno di coltura è mantenuto ossidato durante tutto il periodo della fermentazione in ambiente saturo di ossigeno. The culture medium is kept oxidized throughout the fermentation period in an oxygen-saturated environment.

Il lievito è metabolicamente attivo durante tutto il periodo di fermentazione come confermato dal consumo di glucosio extracellulare e la concomitante produzione di etanolo e glicerolo. Yeast is metabolically active throughout the fermentation period as confirmed by the consumption of extracellular glucose and the concomitant production of ethanol and glycerol.

La diidrocitocalasina B provoca sia la depolimerizzazione dell’actina sia l’attivazione dei canali ionici, favorendo la fuoriuscita del GSH prodotto. Dihydrocitocalasin B causes both the depolymerization of actin and the activation of ion channels, favoring the release of the GSH produced.

Alla fine della fermentazione, il lievito viene separato dal terreno di coltura e viene misurata la concentrazione di GSH intra- ed extracellulare prodotto mediante analisi HPLC come indicato nell’Esempio 1. At the end of fermentation, the yeast is separated from the culture medium and the concentration of intra- and extracellular GSH produced by HPLC analysis is measured as indicated in Example 1.

Alternativamente il GSH è identificato mediante spettroscopia NMR e la sua concentrazione determinata come indicato nell’Esempio 1. Alternatively, the GSH is identified by NMR spectroscopy and its concentration determined as indicated in Example 1.

I risultati sono confermati utilizzando il kit “Glutathione Assay” (Sigma). Il processo dell’invenzione consente di ottenere elevate rese di GSH extracellulare. The results are confirmed using the “Glutathione Assay” (Sigma) kit. The process of the invention allows to obtain high yields of extracellular GSH.

In particolare, con il processo descritto si ottiene ≈ 8% di GSH extracellulare (% di peso di GSH su peso secco di lievito). In particular, with the described process ≈ 8% of extracellular GSH is obtained (% of weight of GSH on dry weight of yeast).

La concentrazione di GSH intracellulare rimane costante nell’intervallo 1-1,4%. The intracellular GSH concentration remains constant in the 1-1.4% range.

L’aggiunta al terreno di coltura di NPPB, inibitore dell’apertura del canale cloro, ad una concentrazione di 10<-5>M (come in Esempio 1), inibisce la fuoriuscita di GSH di cui sopra, come visualizzato in figura 2. La concentrazione di GSH intracellulare rimane costante nell’intervallo 1-1,4%. La figura 2 allegata rappresenta un istogramma raffigurante tre diverse concentrazioni di GSH extracellulare prodotto in tre distinti esperimenti: The addition to the culture medium of NPPB, inhibitor of the opening of the chlorine channel, at a concentration of 10 <-5> M (as in Example 1), inhibits the leakage of GSH above, as shown in Figure 2. The intracellular GSH concentration remains constant in the range 1-1.4%. The attached figure 2 represents a histogram depicting three different concentrations of extracellular GSH produced in three distinct experiments:

- secondo quanto descritto nell’Esempio 2 di cui sopra; - as described in Example 2 above;

- secondo quanto descritto nell’Esempio 2 senza aggiunta di DHCB; - secondo quanto descritto nell’Esempio 2 ed inoltre aggiungendo NPPB al terreno di coltura (non solo DHCB) come sopra descritto. - as described in Example 2 without adding DHCB; - as described in Example 2 and also by adding NPPB to the culture medium (not just DHCB) as described above.

Come evidente, l’aggiunta di DHCB aumenta considerevolmente la produzione di GSH extracellulare rispetto a quanto avviene in un pari processo in cui non è fatta tale aggiunta; mentre l’introduzione di NPPB, bloccando l’apertura dei canali ionici cellulari (in particolare del canale cloro), impedisce la fuoriuscita di GSH provocando la sostanziale assenza di GSH extracellulare anche in presenza di DHCB. As evident, the addition of DHCB considerably increases the production of extracellular GSH compared to what occurs in an equal process in which this addition is not made; while the introduction of NPPB, by blocking the opening of cellular ion channels (in particular the chlorine channel), prevents the leakage of GSH causing the substantial absence of extracellular GSH even in the presence of DHCB.

ESEMPIO 3 EXAMPLE 3

E’ stato utilizzato un ceppo di Saccharom yces cerevisiae, in particolare un ceppo omotallico poliploide, lo stesso ceppo utilizzato negli Esempi 1 e 2. È stata generata una sospensione di lievito fino a ottenere una concentrazione di lievito pari a 2,5% di peso secco nel terreno di coltura avente la medesima composizione di quello utilizzato negli Esempi 1 e 2. Il ceppo è stato coltivato per 24 ore a 28 °C. A strain of Saccharom yces cerevisiae was used, in particular a polyploid homotallic strain, the same strain used in Examples 1 and 2. A yeast suspension was generated until a yeast concentration equal to 2.5% by weight was obtained. dry in the culture medium having the same composition as that used in Examples 1 and 2. The strain was grown for 24 hours at 28 ° C.

Durante l’intero periodo di fermentazione le cellule di lievito sono sottoposte all’azione del composto (R)-(+)-t rans-4-(1-Aminoethyl)-N-(4-Pyridyl) cyclohexanecarboxamide dihydrochloride monohydrate (Y-27632), un inibitore di ROCK molto potente e selettivo, non tossico, in grado di permeare le cellule, che causa la depolimerizzazione dell’ actina. During the entire fermentation period the yeast cells are subjected to the action of the compound (R) - (+) - t rans-4- (1-Aminoethyl) -N- (4-Pyridyl) cyclohexanecarboxamide dihydrochloride monohydrate (Y- 27632), a very potent and selective, non-toxic ROCK inhibitor capable of permeating cells, causing actin depolymerization.

Y-27632 è aggiunto al terreno di coltura a una concentrazione di 10<-4>M. Il terreno di coltura è mantenuto ossidato per tutto il periodo della fermentazione (24 ore) in ambiente saturo di ossigeno. Y-27632 is added to the culture medium at a concentration of 10 <-4> M. The culture medium is kept oxidized throughout the fermentation period (24 hours) in an oxygen-saturated environment.

Il lievito è metabolicamente attivo durante tutto il periodo di fermentazione come confermato da consumo di glucosio extracellulare e concomitante produzione di etanolo e glicerolo. Yeast is metabolically active throughout the fermentation period as confirmed by consumption of extracellular glucose and concomitant production of ethanol and glycerol.

Alla fine della fermentazione, il lievito viene separato dal terreno di coltura e viene misurata la concentrazione di GSH intra- ed extracellulare prodotto mediante analisi HPLC, come negli Esempi 1 e 2. At the end of fermentation, the yeast is separated from the culture medium and the concentration of intra- and extracellular GSH produced by HPLC analysis is measured, as in Examples 1 and 2.

Alternativamente il GSH è identificato mediante spettroscopia NMR e la sua concentrazione determinata come indicato negli Esempi 1 e 2. Alternatively, GSH is identified by NMR spectroscopy and its concentration determined as indicated in Examples 1 and 2.

I risultati sono confermati utilizzando il kit “Glutathione Assay” (Sigma). Il processo dell’invenzione consente di ottenere elevate rese di GSH extracellulare. In particolare, con il processo descritto si ottiene ≈ 12,5% di GSH extracellulare (% di peso di GSH su peso secco di lievito). La concentrazione di GSH intracellulare rimane costante nell’intervallo 1-1,4%. L’aggiunta al terreno di coltura di NPPB, ad una concentrazione di 10<-5>M (come negli Esempi 1 e 2), inibisce la fuoriuscita di GSH di cui sopra. La concentrazione di GSH intracellulare rimane costante nell’intervallo 1-1,4%. La figura 3 allegata rappresenta un istogramma raffigurante tre diverse concentrazioni di GSH extracellulare prodotto in tre distinti esperimenti: The results are confirmed using the “Glutathione Assay” (Sigma) kit. The process of the invention allows to obtain high yields of extracellular GSH. In particular, with the described process ≈ 12.5% of extracellular GSH is obtained (% of weight of GSH on dry weight of yeast). The intracellular GSH concentration remains constant in the 1-1.4% range. The addition of NPPB to the culture medium, at a concentration of 10 <-5> M (as in Examples 1 and 2), inhibits the leakage of GSH mentioned above. The intracellular GSH concentration remains constant in the 1-1.4% range. The attached figure 3 represents a histogram depicting three different concentrations of extracellular GSH produced in three distinct experiments:

- secondo quanto descritto nell’Esempio 3 di cui sopra; - as described in Example 3 above;

- secondo quanto descritto nell’Esempio 3 senza aggiunta di Y-27632; - secondo quanto descritto nell’Esempio 3 ed inoltre aggiungendo NPPB al terreno di coltura (non solo Y-27632) come sopra descritto. - as described in Example 3 without the addition of Y-27632; - as described in Example 3 and also by adding NPPB to the culture medium (not only Y-27632) as described above.

Come evidente, l’aggiunta di Y-27632 aumenta considerevolmente la produzione di GSH extracellulare rispetto ad un pari processo in cui non è fatta tale aggiunta; mentre l’introduzione di NPPB, bloccando l’apertura dei canali ionici cellulari (in particolare del canale cloro), impedisce la fuoriuscita di GSH provocando la sostanziale assenza di GSH extracellulare anche in presenza di Y-27632. As evident, the addition of Y-27632 considerably increases the production of extracellular GSH compared to a similar process in which this addition is not made; while the introduction of NPPB, by blocking the opening of cellular ion channels (in particular the chlorine channel), prevents the leakage of GSH causing the substantial absence of extracellular GSH even in the presence of Y-27632.

I dati mostrati in tutti e tre gli esempi evidenziano che, trattando le cellule secondo il processo dell’invenzione, si ottengono rese di produzione di GSH extracellulare molto più elevate rispetto a quelle ottenibili con le tecniche già note, senza dover ricorrere a mutazioni e/o rottura delle cellule. The data shown in all three examples show that, by treating the cells according to the process of the invention, much higher extracellular GSH production yields are obtained than those obtainable with the already known techniques, without having to resort to mutations and / or cell rupture.

Inoltre, con il processo dell’invenzione è possibile ottenere GSH extracellulare senza distruzione delle cellule della coltura. Furthermore, with the process of the invention it is possible to obtain extracellular GSH without destroying the culture cells.

Claims

CLAIMS 1. Process for the production of extra cellular GSH comprising the following steps: - cultivate a microorganism or producer in a suitable culture medium, - provide the crop with at least one oxidizing agent to favor the production of GSH by the microorganism, - add at least one modifying agent to the culture to promote the opening of at least one ion channel of the microorganism, in order to favor the release of GSH.

2. Process according to the previous claim, in which said modifying agent is a modifying agent capable of causing the opening of the ion channels of the chlorine of the microorganism.

3. Process according to claim 1, or 2, in which said modifying agent is a modifying agent designed to directly cause the opening of at least one ion channel of the microorganism.

4. Process according to claim 1, or 2, in which said modifying agent is an indirect modifying agent capable of indirectly causing the opening of at least one ion channel of the microorganism.

5. Process according to one or more of the preceding claims, in which said modifying agent is a modifying agent such as to cause disorganization of the cytoskeletal system of the microorganism or of its components.

6. Process according to one or more of the preceding claims, wherein said modifying agent is a modifying agent of the actin of the microorganism.

7. Process according to the preceding claim, when dependent on claim 3, wherein said modifying agent is a compound selected from the group of cytochalasins.

8. Process according to the preceding claim, wherein said modifying agent is a saturated derivative of cytochalasin B.

9. Process according to the preceding claim, wherein said saturated derivative is dihydrocytocalasin B (DHCB).

10. Process according to claim 5, when dependent on claim 4, wherein said modifying agent is a Rho-Kinase (ROCK) inhibitor.

11. Process according to the preceding claim, wherein said Rho-Kinase inhibitor is Y-27632, (R) - (+) - trans-4- (1-Am inoethyl) -N- (4-Pyridyl) cyclohexanecarboxam ide dihydrochloride m onohydrate.

12. Process according to one or more of claims 1 to 6, wherein said modifying agent comprises mechanical stress obtained by subjecting the microorganism to hypergravity.

13. Process according to the preceding claim, in which said mechanical stress is obtained by subjecting the microorganism to centrifugation.

14. Process according to one or more of the preceding claims, in which said microorganism is changed.

15. Process according to one or more of claims 1 to 13, wherein said microorganism is wild type.

16. Process according to one or more of claims 1 to 13, wherein said microorganism or comprises at least one yeast strain.

17. Process according to the preceding claim, wherein at least one yeast strain is a Saccharom ycescerevisiae strain.

18. Process according to one or more of claims 1 to 14, wherein said microorganism or comprises at least one bacterial strain.

19. Process according to the preceding claim, wherein said microorganism comprises Escherica Coli.

20. Process according to one or more of the preceding claims, in which said oxygen-distracting inducer is suitable for generating an oxidative stress condition in said microorganism.

21. Process according to the preceding claim, in which oxygen is present in a concentration greater than or equal to 4%.

22. Process according to one or more of the preceding claims, in which said process is carried out in batch, fed-batch or continuously.