ITMI20102235A1 - STRAINS OF PROBIOTIC BACTERIA PRODUCERS OF CONJUGATE OF LINOLEIC ACID AND THEIR USE FOR THE PREPARATION OF A FOOD, DIETHETIC OR PHARMACEUTICAL COMPOSITION. - Google Patents
STRAINS OF PROBIOTIC BACTERIA PRODUCERS OF CONJUGATE OF LINOLEIC ACID AND THEIR USE FOR THE PREPARATION OF A FOOD, DIETHETIC OR PHARMACEUTICAL COMPOSITION. Download PDFInfo
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Description
DESCRIZIONE "Ceppi di batteri probiotici produttori di Coniugati dell'Acido Linoleico e loro impiego per la preparazione di una composizione alimentare, dietetica o farmaceutica". DESCRIPTION "Strains of probiotic bacteria producing Linoleic Acid Conjugates and their use for the preparation of a food, dietetic or pharmaceutical composition".
DESCRIZIONE DESCRIPTION
La presente invenzione sì riferisce a ceppi di batteri probiotici produttori di coniugati dell'acido linoleico (CLA). In particolare, la presente invenzione si riferisce a una selezione di ceppi di batteri appartenenti al genus Bifidobacterium che sono stati selezionati per la loro abilità a produrre coniugati dell'acido linoleico (CLA), da acido linoleico (LA). Inoltre, la presente invenzione si riferisce a una composizione alimentare, dietetica o farmaceutica comprendente detti ceppi di batteri in grado di aumentare la quantità di CLA in situ, cioà ̈ all'interno del tratto gastrointestinale. The present invention refers to strains of probiotic bacteria producing linoleic acid (CLA) conjugates. In particular, the present invention relates to a selection of strains of bacteria belonging to the genus Bifidobacterium which have been selected for their ability to produce conjugates of linoleic acid (CLA), from linoleic acid (LA). Furthermore, the present invention relates to a food, dietary or pharmaceutical composition comprising said strains of bacteria capable of increasing the quantity of CLA in situ, ie inside the gastrointestinal tract.
È noto l'impiego di coniugati dell'acido linoleìco (CLA) nella preparazione di prodotti alimenti e integratori. The use of linoleic acid conjugates (CLA) in the preparation of food products and supplements is known.
Lo sviluppo di dette preparazioni e' legato agli effetti benefici espletati dai CLA all'interno dell'organismo. The development of these preparations is linked to the beneficial effects carried out by CLA within the body.
Tuttavia, negli ultimi trent'anni, l'assunzione di CLA con la dieta à ̈ diminuita drasticamente per due motivi fondamentali. However, over the past three decades, dietary CLA intake has dropped dramatically for two main reasons.
In primo luogo, il consumo di carni suine e di derivati del latte, che rappresentano le principali fonti di tali molecole, Ã ̈ molto diminuito. Firstly, the consumption of pork and milk derivatives, which are the main sources of these molecules, has greatly decreased.
In secondo luogo, le tecniche moderne di allevamento del bestiame hanno portato a sostituire l'erba dei pascoli e il foraggio con i mangimi di produzione industriale i quali non contengono molto acido linoleico naturale. Second, modern livestock farming techniques have led to the replacement of grassland and forage with industrially produced feed which does not contain much natural linoleic acid.
E' noto addizionare il CLA a un substrato alimentare per preparare alimenti ricchi/addizionati in CLA. Tuttavia, detti prodotti alimentari arricchiti/addizionati con CLA presentano alcuni inconvenienti e limiti applicativi derivanti dal fatto che la loro somministrazione per via orale non sempre rappresenta una valida ed efficace somministrazione di CLA all'interno dell'organismo, in particolare la localizzazione di CLA nel tratto gastrointestinale di interesse e' molto compromessa e limitata. Inoltre, in alcuni paesi l'aggiunta diretta dei CLA, come ingrediente attivo, nei prodotti alimentari non à ̈ sempre consentita. It is known to add CLA to a food substrate to prepare foods rich / added in CLA. However, said food products enriched / added with CLA have some drawbacks and application limits deriving from the fact that their oral administration does not always represent a valid and effective administration of CLA within the body, in particular the localization of CLA in the body. gastrointestinal tract of interest is very impaired and limited. Furthermore, in some countries the direct addition of CLA as an active ingredient in food is not always permitted.
Pertanto, si rende necessario poter disporre di una composizione in grado di superare i limiti della tecnica nota e che sia in grado rappresentare una valida ed efficace somministrazione di CLA nell'organismo. Therefore, it is necessary to have a composition capable of overcoming the limitations of the known art and that is capable of representing a valid and effective administration of CLA in the body.
L'eccesso di acido linoleico nella dieta umana moderna non à ̈ dovuto esclusivamente ad un basso consumo di pesce ma, bensì, anche ad un elevato consumo di prodotti ricchi in oli vegetali e di semi. Tale situazione non à ̈, inoltre, caratteristica solo della dieta umana ma, bensì, si estende anche alla dieta degli animali da nutrizione che sono comunemente alimentati a granaglie. The excess of linoleic acid in the modern human diet is not due exclusively to a low consumption of fish but, rather, also to a high consumption of products rich in vegetable and seed oils. Moreover, this situation is not only characteristic of the human diet but, on the contrary, it also extends to the diet of feeding animals which are commonly fed on grains.
Tutto questo si riflette in un peggiore rapporto tra acidi grassi ω6 e acidi grassi ω3 nei prodotti carnei, nei prodotti caseari e nelle uova che sono tra gli alimenti più consumati a tavola. Tuttavia, un miglioramento del rapporto ω6/ω3 solo per via dietetica presenta oggigiorno alcune difficoltà e problematiche difficilmente sormontabili in quanto dette problematiche sono legate ai sistemi di produzione e commercializzazione che sono gestiti su scala industriale e, pertanto, sono difficilmente modificabili. All this is reflected in a worse ratio between Ï ‰ 6 fatty acids and Ï ‰ 3 fatty acids in meat products, dairy products and eggs which are among the most consumed foods at the table. However, an improvement in the Ï ‰ 6 / Ï ‰ 3 ratio only by dietary means today presents some difficulties and problems that are difficult to overcome as these problems are linked to the production and marketing systems that are managed on an industrial scale and, therefore, are difficult to modify. .
Pertanto, si rende necessario poter ridurre la quantità di acido linoleico (LA), derivante dalla dieta alimentare, che si accumula in eccesso nell'organismo. Therefore, it is necessary to be able to reduce the amount of linoleic acid (LA), deriving from the diet, which accumulates in excess in the body.
Forma un oggetto della presente invenzione una selezione di ceppi di batteri probiotici capaci di convertire l'acido linoleico (LA) in coniugati dell'acido linoleico (CLA), come rivendicato nell'unita rivendicazione. An object of the present invention is a selection of strains of probiotic bacteria capable of converting linoleic acid (LA) into conjugates of linoleic acid (CLA), as claimed in the accompanying claim.
Forma un ulteriore oggetto della presente invenzione una composizione alimentare o dietetica o farmaceutica, come rivendicato nell'unita rivendicazione. A further object of the present invention is a food or dietetic or pharmaceutical composition, as claimed in the appended claim.
Forma un ulteriore oggetto della presente invenzione una composizione farmaceutica, per uso come medicamento, come rivendicato nell'unita rivendicazione. A further object of the present invention is a pharmaceutical composition, for use as a medicament, as claimed in the accompanying claim.
Forma un ulteriore oggetto della presente invenzione l'uso di almeno un ceppo di batterio capace di convertire LA in CLA per la preparazione di una composizione, come rivendicato nell'unita rivendicazione. A further object of the present invention is the use of at least one bacterium strain capable of converting LA into CLA for the preparation of a composition, as claimed in the accompanying claim.
Ulteriori realizzazioni preferite della presente invenzione saranno di seguito riportate e illustrate senza voler limitare in alcun modo la portata della presente invenzione . Further preferred embodiments of the present invention will be reported and illustrated below without wishing to limit in any way the scope of the present invention.
La tabella 1 mostra la composizione qualitativa e quantitativa di tre mezzi culturali utilizzati nella presente invenzione: TPY, MRS e LATPg. Table 1 shows the qualitative and quantitative composition of three cultural media used in the present invention: TPY, MRS and LATPg.
La tabella 2 riporta ì valori di assorbanza ottenuti in seguito alla lettura spettrofotometrica a lunghezza d'onda 233 nm rispetto alle concentrazioni di CLA. Table 2 shows the absorbance values obtained following the spectrophotometric reading at wavelength 233 nm with respect to the CLA concentrations.
La tabella 3 riporta la retta di regressione ottenuta con i valori riportati in tabella 2. Table 3 shows the regression line obtained with the values shown in table 2.
La tabella 4 riporta le conte su piastra per inclusione utilizzando i terreni TPY e MRS a diverse concentrazioni dì LA. Table 4 reports plate counts for inclusion using TPY and MRS media at different concentrations of LA.
La tabella 5 riporta i valori ottenuti di concentrazione di CLA/ml prodotti; percentuale di conversione di LA a CLA (espressa come CLA prodotti/0,50 mg/ml LA); rapporto di concentrazione CLA/OD 600 nm. Table 5 reports the obtained concentration values of CLA / ml produced; percentage of conversion of LA to CLA (expressed as CLA products / 0.50 mg / ml LA); concentration ratio CLA / OD 600 nm.
La tabella 6 riporta la quantificazione di CLA presente nel terreno TPY con e senza inoculo di LA. Table 6 reports the quantification of CLA present in TPY medium with and without LA inoculation.
La tabella 7 riporta la resistenza ai succhi gastrici, alla bile e alla secrezione pancreatica dei ceppi selezionati. Table 7 reports the resistance to gastric juices, bile and pancreatic secretion of the selected strains.
La figura 1 mostra le curve di crescita nel tempo del ceppo B. breve DSM 20213 in TPY e MRS brodo a diverse concentrazioni dì LA (0, 0,5 e 1 mg/ml). Il pH iniziale per le brodo colture in TPY à ̈ 6,11; in MRS à ̈ 5,83. I valori dei pH finali sono riportati nella figura stessa. Figure 1 shows the growth curves over time of strain B. short DSM 20213 in TPY and MRS broth at different concentrations of LA (0, 0.5 and 1 mg / ml). The initial pH for the TPY broth culture is 6.11; in MRS it is 5.83. The final pH values are shown in the figure itself.
La Richiedente, a seguito di un'intensa attività di ricerca, à ̈ giunta a selezionare specifici ceppi di batteri probiotici, appartenenti al genus Bifidobacterium. The Applicant, following an intense research activity, has come to select specific strains of probiotic bacteria, belonging to the genus Bifidobacterium.
Vantaggiosamente, detti ceppi appartengono alle specie B. longum e B. breve. Advantageously, said strains belong to the B. longum and B. short species.
In particolare, i ceppi selezionati dalla Richiedente sono scelti dal gruppo comprendente: In particular, the strains selected by the Applicant are selected from the group comprising:
Bifidobacterium longum, depositato presso il DSMZ ed avente numero di accesso DSM 23233, data di deposito 12.12.2010, titolare Probiotical S.p.A.; Bifidobacterium longum, filed with the DSMZ and having access number DSM 23233, filing date 12.12.2010, owner Probiotical S.p.A .;
Bifidobacterium breve, depositato presso il DSMZ ed avente numero di accesso DSM 16604, data di deposito 20.07.2004, titolare Probiotical S.p.A. Short Bifidobacterium, filed with the DSMZ and having access number DSM 16604, filing date 20.07.2004, owner Probiotical S.p.A.
Bifidobacterium breve, depositato presso il DSMZ ed avente numero di accesso DSM 16596 data di deposito 21.07.2004, titolare Probiotical S.p.A. Short Bifidobacterium, filed with the DSMZ and having access number DSM 16596 filing date 21.07.2004, owner Probiotical S.p.A.
Bifidobacterium breve, depositato presso il DSMZ ed avente numero di accesso DSM 20213. Bifidobacterium breve, registered with the DSMZ and having access number DSM 20213.
La Richiedente ha sorprendentemente trovato che i ceppi selezionati appartenenti al genere dei Bifidobatteri sono capaci di convertire l'acido linoleico (LA) in coniugati dell'acido linoleico (CLA), con un grado di conversione maggiore di 65%. The Applicant has surprisingly found that the selected strains belonging to the Bifidobacteria genus are capable of converting linoleic acid (LA) into conjugates of linoleic acid (CLA), with a degree of conversion greater than 65%.
Vantaggiosamente, i ceppi selezionati sono capaci di convertire l'acido linoleico (LA) in coniugati dell'acido linoleico (CLA), con un grado di conversione maggiore del 70%; ancor più vantaggiosamente maggiore del 90%. Advantageously, the selected strains are capable of converting linoleic acid (LA) into conjugates of linoleic acid (CLA), with a degree of conversion greater than 70%; even more advantageously greater than 90%.
Nel contesto della presente invenzione per LA si intende un acido grasso insaturo omega-6 denominato [acido cis, cis-9 ,12-ottadecadienoico] CAS N.° 60-33-3 (noto anche come 18 :2(n-6)). In the context of the present invention, LA means an omega-6 unsaturated fatty acid named [cis, cis-9, 12-octadecadienoic acid] CAS No. 60-33-3 (also known as 18: 2 (n-6) ).
Nel contesto della presente invenzione per CLA si intende un gruppo di almeno 28 isomeri dell'acido linoleico trovati, ad esempio, nella carne e nei prodotti caseari. Il gruppo comprende tra gli altri l'isomero [cis-9,trans-11] e l'isomero [trans-10,cis-12]. In the context of the present invention, CLA is understood to mean a group of at least 28 isomers of linoleic acid found, for example, in meat and dairy products. The group includes, among others, the isomer [cis-9, trans-11] and the isomer [trans-10, cis-12].
Nel contesto della presente invenzione per conversione di LA in CLA si riferisce all'ottenimento di una miscela comprendente l'isomero [cis-9,trans-11] e l'isomero [trans-10,cis-12], dove il primo e' presente in maggiore quantità o, alternativamente, all'ottenimento solo dell'isomero [cis-9,trans-11]. In the context of the present invention, the conversion of LA into CLA refers to obtaining a mixture comprising the isomer [cis-9, trans-11] and the isomer [trans-10, cis-12], where the former is 'present in greater quantities or, alternatively, to obtain only the isomer [cis-9, trans-11].
Tutti i ceppi testati dalla Richiedente sono di origine umana e sono stati isolati da materiale fecale. All the strains tested by the Applicant are of human origin and have been isolated from fecal material.
Inoltre, i ceppi selezionati sono stati testati anche per verificare la loro resistenza ai succhi gastrici, alla bile e alla secrezione pancreatica. In addition, the selected strains were also tested for their resistance to gastric juices, bile and pancreatic secretion.
I risultati sono riportati in tabella 7. The results are reported in table 7.
In tabella 7, (*) indica la sopravvivenza dei ceppi probiotici in due differenti tipi di succhi gastrici e in una secrezione pancreatica simulata a 37°C dopo differenti tempi di contatto (5 e 30 minuti). ;In tabella 7, (*) indica i risultati di sopravvivenza in presenza di secrezione biliare confrontando il numero di colonie cresciute in un mezzo "con" e "senza" 1 "addizione di In table 7, (*) indicates the survival of the probiotic strains in two different types of gastric juices and in a simulated pancreatic secretion at 37 ° C after different contact times (5 and 30 minutes). ; In table 7, (*) indicates the survival results in the presence of biliary secretion by comparing the number of colonies grown in a medium "with" and "without" 1 "addition of
sali biliari o bile umana. bile salts or human bile.
Da tali prove à ̈ emerso che una percentuale significativa di cellule ingerite à ̈ in grado di superare la barriera di acidità gastrica e di superare l'intestino. From these tests it emerged that a significant percentage of ingested cells is able to overcome the gastric acidity barrier and pass the intestine.
Questo aspetto à ̈ di particolare importanza in quanto garantisce che un numero sufficiente di cellule vitali à ̈ in grado di raggiungere l'intestino, dove avviene la trasformazione dell'acido linoleico (LA) nei suoi coniugati (CLA). This aspect is of particular importance as it ensures that a sufficient number of viable cells are able to reach the intestine, where the transformation of linoleic acid (LA) into its conjugates (CLA) takes place.
Vantaggiosamente, i batteri contenuti nella composizione della presente invenzione sono in grado di superare la barriera gastrica e il transito duodenale consentendo la colonizzazione del tratto gastrointestinale e la conversione di LA in CLA direttamente in situ, preferibilmente nel tratto gastrointestinale. Advantageously, the bacteria contained in the composition of the present invention are able to overcome the gastric barrier and duodenal transit, allowing colonization of the gastrointestinal tract and the conversion of LA into CLA directly in situ, preferably in the gastrointestinal tract.
Anche se il meccanismo di conversione da LA a CLA non e' al momento del tutto chiaro, sembra che i ceppi di batteri adottino una strategia di detossificazione trasformando LA nei suoi coniugati CLA sottraendo LA dall'ambiente in cui si trova in eccesso. Although the mechanism of conversion from LA to CLA is not fully understood at the moment, it seems that the strains of bacteria adopt a detoxification strategy by transforming LA into its CLA conjugates by subtracting LA from the environment in which it is found in excess.
In una realizzazione preferita, la composizione alimentare o dietetica o farmaceutica della presente invenzione comprende, o alternativamente e' costituita da, almeno un ceppo appartenente alla specie B. breve, scelto dal gruppo B. breve DSM 16604, B. breve DSM 16596 e B. breve DSM 20213. In a preferred embodiment, the food or dietetic or pharmaceutical composition of the present invention comprises, or alternatively consists of, at least one strain belonging to the species B. breve, selected from the group B. breve DSM 16604, B. breve DSM 16596 and B. short DSM 20213.
Vantaggiosamente, la composizione alimentare o dietetica o farmaceutica della presente invenzione comprende, o e' alternativamente costituita da, B. breve DSM 16604. Advantageously, the food or dietetic or pharmaceutical composition of the present invention comprises, or is alternatively constituted by, B. short DSM 16604.
In un'altra realizzazione preferita, la composizione alimentare o dietetica o farmaceutica della presente invenzione comprende o e' costituita da almeno due ceppi appartenente alla specie B. breve scelti dal gruppo B. breve DSM 16604, B. breve DSM 16596 e B. breve DSM 20213. In another preferred embodiment, the food or dietetic or pharmaceutical composition of the present invention comprises or consists of at least two strains belonging to the species B. breve selected from the group B. breve DSM 16604, B. breve DSM 16596 and B. breve DSM 20213.
Vantaggiosamente, la composizione alimentare o dietetica o farmaceutica della presente invenzione comprende, o alternativamente e' costituita da, B. breve DSM 16604 e B. breve DSM 16596. Advantageously, the food or dietetic or pharmaceutical composition of the present invention comprises, or alternatively consists of, B. short DSM 16604 and B. short DSM 16596.
Vantaggiosamente, la composizione alimentare o dietetica o farmaceutica della presente invenzione comprende, o alternativamente e" costituita da, B. breve DSM 16604 e B. breve DSM 20213. Advantageously, the food or dietetic or pharmaceutical composition of the present invention comprises, or alternatively consists of, B. short DSM 16604 and B. short DSM 20213.
Vantaggiosamente, la composizione alimentare o dietetica o farmaceutica della presente invenzione comprende, o alternativamente e' costituita da, B. breve DSM 16596 e B. breve DSM 20213. Advantageously, the food or dietetic or pharmaceutical composition of the present invention comprises, or alternatively consists of, B. short DSM 16596 and B. short DSM 20213.
In un'altra realizzazione preferita, la composizione alimentare o dietetica o farmaceutica della presente invenzione comprende, o alternativamente e' costituita da, almeno tre ceppi appartenenti alla specie B. breve scelti dal gruppo B. breve DSM 16604, B. breve DSM 16596 e B. breve DSM 20213. In another preferred embodiment, the food or dietetic or pharmaceutical composition of the present invention comprises, or alternatively consists of, at least three strains belonging to the species B. breve selected from the group B. breve DSM 16604, B. breve DSM 16596 and B. short DSM 20213.
In un'altra realizzazione preferita, la composizione alimentare o dietetica o farmaceutica della presente invenzione comprende: In another preferred embodiment, the food or dietary or pharmaceutical composition of the present invention comprises:
Bìfidobacterium breve, depositato presso il DSMZ ed avente numero di accesso DSM 16604, data di deposito 20.07.2004, titolare Probiotical S.p.A., e/o Short Bìfidobacterium, filed with the DSMZ and having access number DSM 16604, filing date 20.07.2004, owner of Probiotical S.p.A., and / or
Bìfidobacterium breve, depositato presso il DSMZ ed avente numero di accesso DSM 16596, data di deposito 21.07.2004, titolare Probiotical S.p.A., e/o Short Bìfidobacterium, filed with the DSMZ and having access number DSM 16596, filing date 21.07.2004, owner of Probiotical S.p.A., and / or
Bìfidobacterium breve, depositato presso il DSMZ ed avente numero di accesso DSM 20213. Bìfidobacterium breve, filed with the DSMZ and having access number DSM 20213.
In caso di utilizzo di due specie di B. breve, il rapporto in cellule vitali e' compreso da 1:3 a 3:1, preferibilmente 1:1. In case of use of two species of B. short, the ratio in viable cells ranges from 1: 3 to 3: 1, preferably 1: 1.
In caso di utilizzo di tre specie di B. breve, il rapporto in cellule vitali e' compreso da 3:1:1 a 1:1:1 {B. breve DSM 16604: B. breve DSM 16596: B. breve DSM 20213). In case of use of three species of B. short, the ratio in viable cells ranges from 3: 1: 1 to 1: 1: 1 {B. short DSM 16604: B. short DSM 16596: B. short DSM 20213).
In una realizzazione preferita, la composizione alimentare In a preferred embodiment, the food composition
o dietetica o farmaceutica della presente invenzione or dietary or pharmaceutical of the present invention
comprende, o alternativamente e' costituita da includes, or alternatively consists of
Bìfidobacterium longum BL04, DSM 23233. Bìfidobacterium longum BL04, DSM 23233.
In un'altra realizzazione preferita, la composizione In another preferred embodiment, the composition
alimentare o dietetica o farmaceutica della presente food or dietary or pharmaceutical of the present
invenzione comprende, o alternativamente à ̈ costituita da, invention comprises, or alternatively consists of,
il Bìfidobacterium longum BL04, DSM 23233, in associazione the Bìfidobacterium longum BL04, DSM 23233, in association
con almeno uno dei seguenti ceppi Bìfidobacterium breve DSM 16604, Bifidobacterium breve DSM 16596 o Bifidobacterium breve DSMZ 20213. with at least one of the following strains Bìfidobacterium brevis DSM 16604, Bifidobacterium brevis DSM 16596 or Bifidobacterium brevis DSMZ 20213.
Vantaggiosamente, la composizione alimentare o dietetica o farmaceutica della presente invenzione comprende, o alternativamente e'costituita da, Bifidobacterium longum BL04 DSM 23233 e Bifidobacterium breve DSM 16604. Advantageously, the food, dietary or pharmaceutical composition of the present invention comprises, or alternatively consists of, Bifidobacterium longum BL04 DSM 23233 and Bifidobacterium breve DSM 16604.
Vantaggiosamente, la composizione alimentare o dietetica o farmaceutica della presente invenzione comprende, o alternativamente e'costituita da, Bifidobacterium longum BL04 DSM 23233 e Bifidobacterium breve DSM 16596. Advantageously, the food, dietary or pharmaceutical composition of the present invention comprises, or alternatively consists of, Bifidobacterium longum BL04 DSM 23233 and Bifidobacterium breve DSM 16596.
Vantaggiosamente, la composizione alimentare o dietetica o farmaceutica della presente invenzione comprende, o alternativamente e" costituita da, Bifidobacterium longum BL04 DSM 23233 e Bifidobacterium breve DSM 20213. Advantageously, the alimentary or dietetic or pharmaceutical composition of the present invention comprises, or alternatively consists of, Bifidobacterium longum BL04 DSM 23233 and Bifidobacterium breve DSM 20213.
In un'altra realizzazione preferita, la composizione alimentare o dietetica o farmaceutica della presente invenzione comprende, o alternativamente à ̈ costituita da, il Bifidobacterium longum BL04, DSM 23233, in associazione con almeno due dei seguenti ceppi Bifidobacterium breve DSM 16604, Bifidobacterium breve DSM 16596 o Bifidobacterium breve DSMZ 20213. In another preferred embodiment, the food or dietary or pharmaceutical composition of the present invention comprises, or alternatively consists of, Bifidobacterium longum BL04, DSM 23233, in association with at least two of the following strains Bifidobacterium breve DSM 16604, Bifidobacterium breve DSM 16596 or Bifidobacterium breve DSMZ 20213.
Vantaggiosamente, la composizione alimentare o dietetica o farmaceutica della presente invenzione comprende, o alternativamente e" costituita da, Bifidobacterium longum BL04 DSM 23233, Bifidobacterium breve DSM 16604 e Bifidobacterium breve DSM 16596. Advantageously, the food, dietary or pharmaceutical composition of the present invention comprises, or alternatively consists of, Bifidobacterium longum BL04 DSM 23233, Bifidobacterium breve DSM 16604 and Bifidobacterium breve DSM 16596.
Vantaggiosamente, la composizione alimentare o dietetica o farmaceutica della presente invenzione comprende, o alternativamente e' costituita da, Bifidobacterium longum BL04 DSM 23233, Bifidobacterium breve DSM 16604 e Bifidobacterium breve DSM 20213. Advantageously, the food or dietetic or pharmaceutical composition of the present invention comprises, or alternatively consists of, Bifidobacterium longum BL04 DSM 23233, Bifidobacterium breve DSM 16604 and Bifidobacterium breve DSM 20213.
Vantaggiosamente, la composizione alimentare o dietetica o farmaceutica della presente invenzione comprende, o alternativamente e' costituita da, Bifidobacterium longum BL04 DSM 23233, Bifidobacterium breve DSM 16596 e Bifidobacterium breve DSM 20213. Advantageously, the food, dietary or pharmaceutical composition of the present invention comprises, or alternatively consists of, Bifidobacterium longum BL04 DSM 23233, Bifidobacterium breve DSM 16596 and Bifidobacterium breve DSM 20213.
In un'altra realizzazione preferita, la composizione alimentare o dietetica o farmaceutica della presente invenzione comprende, o alternativamente à ̈ costituita da, il Bifidobacterium longum BL04, DSM 23233, in associazione con almeno tre dei seguenti ceppi Bifidobacterium breve DSM 16604, Bifidobacterium breve DSM 16596 e Bifidobacterium breve DSMZ 20213. In another preferred embodiment, the food or dietary or pharmaceutical composition of the present invention comprises, or alternatively consists of, Bifidobacterium longum BL04, DSM 23233, in association with at least three of the following strains Bifidobacterium breve DSM 16604, Bifidobacterium breve DSM 16596 and Bifidobacterium brevis DSMZ 20213.
Vantaggiosamente, la composizione alimentare o dietetica o Advantageously, the food or dietary composition o
farmaceutica della presente invenzione comprende, o pharmaceuticals of the present invention comprises, or
alternativamente e' costituita da, Bifidobacterium longum alternatively it consists of, Bifidobacterium longum
BL04 DSM 23233, Bifidobacterium breve DSM 16604, BL04 DSM 23233, Bifidobacterium short DSM 16604,
Bifidobacterium breve DSM 16596 e Bifidobacterium breve DSM Bifidobacterium brevis DSM 16596 and Bifidobacterium brevis DSM
20213 . 20213.
Il rapporto in cellule vitali tra il Bifidobacterium The relationship in viable cells between the Bifidobacterium
longum, BL04 , DSM 23233 e l'insieme dei sopra citati ceppi longum, BL04, DSM 23233 and all the aforementioned strains
di Bifidocbacterium breve e' compreso da 1:3 a 3:1, of Bifidocbacterium brevis is included from 1: 3 to 3: 1,
preferibilmente 1:1. preferably 1: 1.
In una realizzazione preferita, la composizione farmaceutica contenente i ceppi di batteri come sopra specificato viene indicata per uso come medicamento, preferibilmente come anti-infiammatorio , in particolare per il trattamento preventivo e/o curativo di disordini intestinali, diarrea, infiammazione del colon, aumento della massa magra, incremento della termogenesi, prevenzione del cancro e per la protezione nei confronti dello stress ossidativo. In a preferred embodiment, the pharmaceutical composition containing the strains of bacteria as specified above is indicated for use as a medicament, preferably as an anti-inflammatory, in particular for the preventive and / or curative treatment of intestinal disorders, diarrhea, inflammation of the colon, increase lean mass, increased thermogenesis, cancer prevention and protection against oxidative stress.
La composizione della presente invenzione trova applicazione nel trattamento preventivo o curativo di una carenza di coniugati dell'acido linoleico. The composition of the present invention finds application in the preventive or curative treatment of a deficiency of linoleic acid conjugates.
La composizione della presente invenzione può essere formulata in forma solida, liofilizzata o essiccata, ad esempio in polvere o granuli. The composition of the present invention can be formulated in solid, lyophilized or dried form, for example in powder or granules.
Inoltre, una forma farmaceutica di interesse e" la compressa o la capsula di gelatina rigida o molle. Also, a pharmaceutical form of interest is the hard or soft gelatin tablet or capsule.
Per quanto concerne la compressa, questa può comprendere una parte interna comprendente i ceppi di batteri e una parte esterna di rivestimento. Il rivestimento può comprendere polimeri solubili in acqua e/o polimeri in grado di resistere alle variazioni del pH dello stomaco e consentire il passaggio nel tratto intestinale. As far as the tablet is concerned, this may comprise an internal part comprising the strains of bacteria and an external part of the coating. The lining may comprise water-soluble polymers and / or polymers capable of resisting changes in stomach pH and allowing passage into the intestinal tract.
Un altro aspetto dell'invenzione e' diretto ad un metodo per la produzione di coniugati dell'acido linoleico. Another aspect of the invention is directed to a method for the production of linoleic acid conjugates.
Il metodo prevede una fase in cui uno o più ceppi di batteri, come sopra specificato, sono coltìvati/fermentatì in presenza di acido linoleico e, successivamente, il coniugato dell'acido linoleico formato viene isolato. The method involves a phase in which one or more strains of bacteria, as specified above, are cultured / fermented in the presence of linoleic acid and, subsequently, the formed linoleic acid conjugate is isolated.
Il metodo può essere realizzato in laboratorio o in scala industriale . The method can be carried out in the laboratory or on an industrial scale.
Un altro aspetto dell'invenzione si riferisce alla conversione da LA a CLA direttamente nell'organismo una volta che l'individuo abbia assunto la composizione della presente invenzione. Another aspect of the invention relates to the conversion from LA to CLA directly in the organism once the individual has assumed the composition of the present invention.
Il coniugato dell'acido linoleico che si ottiene in maggiore quantità à ̈ l'isomero [cis-9, trans-11 acido ottadecadienoico] , rispetto all'isomero [trans-10, cis 12]. The conjugate of linoleic acid which is obtained in greater quantities is the isomer [cis-9, trans-11 octadecadienoic acid], compared to the isomer [trans-10, cis 12].
Un altro aspetto dell'invenzione e'diretto all'uso di almeno un ceppo di batterio, come sopra specificato, per la preparazione di una composizione per il trattamento di disordini o patologie connesse ad una carenza di derivati dell'acido linoleico. Another aspect of the invention is directed to the use of at least one bacterium strain, as specified above, for the preparation of a composition for the treatment of disorders or pathologies connected to a lack of linoleic acid derivatives.
La Richiedente ha svolto un'intensa attività di ricerca su un gruppo molto vasto di ceppi di batteri. Tutti i ceppi dì batteri sono stati tesati e selezionati in funzione della loro abilità /capacità di convertire LA in CLA. The Applicant has carried out an intense research activity on a very large group of bacterial strains. All strains of bacteria have been tested and selected according to their ability / ability to convert LA into CLA.
La Richiedente ha messo a punto il mezzo colturale idoneo a condurre la selezione dei ceppi, ha perfezionato le tecniche spettrofotometriche, con lettura a lunghezza d'onda di 233 nm, utilizzate per effettuare la selezione dei ceppi di batteri produttori di CLA. The Applicant has perfected the culture medium suitable for carrying out the selection of the strains, has perfected the spectrophotometric techniques, with reading at a wavelength of 233 nm, used to carry out the selection of the strains of bacteria producing CLA.
Test di tossicità dell'acido linoleico e scelta del mezzo colturale. Linoleic acid toxicity test and choice of culture medium.
Il ceppo B. breve DSMZ 20213 à ̈ stato scelto come candidato per il test di tossicità dell'acido linoleico. Tale ceppo, infatti, à ̈ in grado di crescere in presenza di LA e presenta buoni tassi di conversione in CLA. Inoltre, il B. breve DSMZ 20213 à ̈ stato utilizzato per analisi successive come controllo positivo. Pertanto, a partire dalla forma congelata di detto ceppo, à ̈ stato quindi possibile rivitalizzarlo in tre differenti mezzi culturali che sono esplicitati nella Tabella 1. Strain B. short DSMZ 20213 was selected as a candidate for the linoleic acid toxicity test. This strain, in fact, is able to grow in the presence of LA and has good conversion rates to CLA. In addition, B. short DSMZ 20213 was used for subsequent analyzes as a positive control. Therefore, starting from the frozen form of said strain, it was therefore possible to revitalize it in three different cultural means which are explained in Table 1.
Dopo la preparazione, i mezzi sono stati sterilizzati in autoclave a 121°C per 15'. Al termine della sterilizzazione i pH dei mezzi erano 6,60±0,10 a 25°C, 6,20+0,20 a 25°C e 6,5+0,5 a 25°C rispettivamente per TPY, MRS e LAPTg brodo. La rivitalizzazione à ̈ stata eseguita inoculando all'1% il B. breve DSMZ 20213 in 10 mi dei tre terreni di cultura con l'aggiunta all'1% di cisteina cloroidrato (sol. 5%) e successiva incubazione in anaerobiosi tramite Gas-Pack a 37<0>C±1°C per 24ore±lora. Tale operazione à ̈ stata eseguita da due trapianti successivi per permettere la piena riattivazione del ceppo. After preparation, the media were sterilized in an autoclave at 121 ° C for 15 '. At the end of the sterilization the pH of the media were 6.60 ± 0.10 at 25 ° C, 6.20 + 0.20 at 25 ° C and 6.5 + 0.5 at 25 ° C for TPY, MRS and LAPTg broth. Revitalization was performed by inoculating 1% B. short DSMZ 20213 in 10 ml of the three culture media with the addition of 1% cysteine hydrochloride (sol. 5%) and subsequent incubation in anaerobiosis with Gas- Pack at 37 <0> C ± 1 ° C for 24 hours ± 1 hour. This operation was performed by two successive transplants to allow the full reactivation of the strain.
Il ceppo così rivitalizzato à ̈ stato inoculato all'1% in 10 mi dei tre differenti terreni preparati come sopra con l'aggiunta di tre soluzioni a differenti concentrazioni di acido linoleico e, per la precisione, a 0, 0,5 mg/ml (Sigma-Aldrich cod.L1276) e, quindi, incubato nel Gas-Pack a 37±°C per 16 ore±l ora. The revitalized strain was inoculated at 1% in 10 ml of the three different media prepared as above with the addition of three solutions at different concentrations of linoleic acid and, to be precise, at 0.5 mg / ml (Sigma-Aldrich code L1276) and then incubated in the Gas-Pack at 37 ± ° C for 16 hours ± 1 hour.
Per semplificare l'operazione sono state prodotte tre soluzioni stock di LA a 0 mg/ml, 50 mg/ml e 100 mg/ml con aggiunta al 2% (v/v) di Tween 80 (per permettere la formazione di un'emulsione con conseguente incremento della solubilità dell'acido linoleico disciolto tramite l'impiego di un'ancoretta e di un agitatore magnetico. To simplify the operation, three stock solutions of LA were produced at 0 mg / ml, 50 mg / ml and 100 mg / ml with the addition of 2% (v / v) of Tween 80 (to allow the formation of an emulsion with consequent increase in the solubility of the dissolved linoleic acid through the use of a stir bar and a magnetic stirrer.
Alla completa dissoluzione del Tween 80, le soluzioni così ottenute sono state aliquotate e congelate a -25±1°C previa filtrazione con filtro a 0,20 pm. When the Tween 80 was completely dissolved, the solutions thus obtained were aliquoted and frozen at -25 ± 1 ° C after filtration with a filter at 0.20 pm.
La conta tramite lettura spettrofotometrica a 600 nm à ̈ stata effettuata all'inizio, a 6 ore e al termine del periodo di incubazione. Il pH à ̈ stato registrato all'inizio e alla fine del periodo di incubazione. The count by spectrophotometric reading at 600 nm was carried out at the beginning, at 6 hours and at the end of the incubation period. The pH was recorded at the beginning and at the end of the incubation period.
Preparazione della retta di regressione Preparation of the regression line
La retta di regressione costruita per concentrazioni di CLA c9/tll pari a 320, 160, 80, 40, 20 e 10 pg/ml esano, ha dimostrato che a concentrazioni da 10 a 80 pg/ml corrisponde un incremento lineare dei valori di assorbanza a 233 nm (R<2>=l). The regression line constructed for CLA c9 / tll concentrations equal to 320, 160, 80, 40, 20 and 10 pg / ml hexane, showed that a linear increase in absorbance values corresponds to concentrations from 10 to 80 pg / ml. at 233 nm (R <2> = 1).
Invece, calcolando la retta di regressione anche con il valore di assorbanza ottenuto per la concentrazione di 160 pg/ml, la retta perde l'andamento lineare e diventa polinomiale non permettendo, di fatto, una quantificazione precisa delle concentrazioni di CLA per assorbanze comprese tra 2,095 e 2,733. Alla concentrazione di 320 Î1⁄4g/ml e superiori, lo spettrofotometro ha dato assorbanza non quantificabile (> 3). On the other hand, by calculating the regression line also with the absorbance value obtained for the concentration of 160 pg / ml, the line loses the linear trend and becomes polynomial, not allowing, in fact, a precise quantification of the CLA concentrations for absorbances between 2.095 and 2.733. At the concentration of 320 Î1⁄4g / ml and higher, the spectrophotometer gave non-quantifiable absorbance (> 3).
Pertanto, la concentrazione di CLA presente nei surnatanti delle colture di assorbanza<2,095 possono essere calcolati direttamente con l'equazione y=25,311x+0,0698. Per i campioni che hanno dato letture superiori a 2,095 si à ̈ ricorso all'espediente delle diluizioni seriali 1:2. Therefore, the CLA concentration present in the culture supernatants of absorbance <2.095 can be calculated directly with the equation y = 25.311x + 0.0698. For samples that gave readings greater than 2.095, the expedient of serial dilutions 1: 2 was used.
Ricorrendo alla diluizione seriale del campione 1:2 abbiamo quindi ricondotto i valori di assorbanza nell'intervallo che garantisce la linearità e, quindi, l'applicabilità dell'equazione. I dati sono mostrati in Tabella 2. By resorting to the serial dilution of the sample 1: 2 we have therefore brought back the absorbance values in the interval that guarantees the linearity and, therefore, the applicability of the equation. The data are shown in Table 2.
Per ovviare alla difficoltà di dosaggio del CLA c9/tll (nella preparazione della prima diluizione necessaria al calcolo della retta di regressione) a causa della sua viscosità , e per garantire la massima precisione, abbiamo utilizzato una pipetta a volume fisso con capillari in vetro da 2 Î1⁄4Î . To overcome the difficulty in dosing CLA c9 / tll (in the preparation of the first dilution necessary for the calculation of the regression line) due to its viscosity, and to ensure maximum precision, we used a fixed volume pipette with glass capillaries to be 2 Î1⁄4Î.
Il campione di 2 Î1⁄4Î di CLA c9/tll così ottenuto à ̈ stato quindi diluito con 1,450 mi di esano in una provetta da 2 mi . The sample of 2 Î1⁄4Î of CLA c9 / tll thus obtained was then diluted with 1,450 ml of hexane in a 2 ml tube.
Abbiamo quindi ottenuto una concentrazione di partenza di 1280 Î1⁄4g/ml (densità c9/tll = 0,903 mg/Î1⁄4Î ). Da questa concentrazione, si sono operate diluizioni seriali 1:2 fino ad arrivare alla concentrazione di 10 pg/ml. Per limitare il più possibile l'evaporazione dell'esano, le varie diluizioni seriali sono state effettuate in microprovette da 200 Î1⁄4Î precedentemente riempite con 100 Î1⁄4Î di esano e, poi, subito richiuse. Le varie diluizioni sono state quindi ottenute serialmente aggiungendo 100 Î1⁄4Î della soluzione precedente, partendo dalla soluzione madre a 1280 pg/ml. We therefore obtained a starting concentration of 1280 Î1⁄4g / ml (density c9 / tll = 0.903 mg / Î1⁄4Î). From this concentration, serial dilutions 1: 2 were made up to a concentration of 10 pg / ml. To limit the evaporation of hexane as much as possible, the various serial dilutions were carried out in 200 Î1⁄4Î micro-tubes previously filled with 100 Î1⁄4γ of hexane and then immediately closed. The various dilutions were then obtained serially by adding 100 Î1⁄4Î of the previous solution, starting from the stock solution at 1280 pg / ml.
Al termine della preparazione delle varie diluizioni, abbiamo effettuato la lettura della densità ottica allo spettrofotometro alla lunghezza d'onda di 233 nm impiegando couvette in quarzo dalla capacità nominale di 100 Î1⁄4Î . Tale operazione à ̈ stata eseguita partendo dalla soluzione a concentrazione minore (10 Î1⁄4g/ml). At the end of the preparation of the various dilutions, we carried out the reading of the optical density with the spectrophotometer at the wavelength of 233 nm using quartz couvettes with a nominal capacity of 100 Î1⁄4Î. This operation was performed starting from the solution with the lowest concentration (10 Î1⁄4g / ml).
I valori di assorbanza così ottenuti sono stati riportati in tabella 3. The absorbance values thus obtained have been reported in table 3.
Estrazione degli acidi grassi. Extraction of fatty acids.
Dopo aver scelto il mezzo colturale idoneo e le concentrazioni di LA da utilizzare, sono stati scongelati e riattivati . After choosing the suitable culture medium and the concentrations of LA to use, they were thawed and reactivated.
II ceppo B. breve DSMZ 20213 à ̈ stato scelto come controllo positivo. È stata applicata la stessa procedura anche su un campione di terreno senza inoculo e con l'aggiunta di LA da utilizzare come bianco. Strain B. short DSMZ 20213 was selected as a positive control. The same procedure was also applied to a sample of soil without inoculation and with the addition of LA to be used as a blank.
Il brodo TPY, dopo essere stato addizionato con l'l% di cisteina cloroidrato (sol. 5%), Ã ̈ stato scelto come mezzo colturale per le fasi di riattivazione e crescita in presenza di LA a 0,5 mg/ml. TPY broth, after being added with 1% of cysteine hydrochloride (sol. 5%), was chosen as a culture medium for the reactivation and growth phases in the presence of LA at 0.5 mg / ml.
Al termine del periodo di incubazione, le brodocolture e il bianco sono state centrifugate a 5000 g per 5'e i surnatanti sono stati aliquotati in ragione di 500 Î1⁄4Î in provette da 1,5 mi per microcentrifuga. At the end of the incubation period, the broths and the blank were centrifuged at 5000 g for 5 'and the supernatants were aliquoted at the rate of 500 Î1⁄4Î in 1.5 ml microcentrifuge tubes.
A seguito quindi di una doppia estrazione con esano, in accordo alla metodologia di Yung et al., 2006 (Riferimento 1) con le modifiche di seguito riportate. L'estrazione ha riguardato l'aggiunta di 500 Î1⁄4Î di esano ai surnatanti aliquotati e al bianco. I campioni sono stati quindi mescolati per inversione per 10", facendo attenzione a non rompere l'interfaccia tra le due fasi e quindi lasciati riposare per 30 "a temperatura ambiente. Al termine della fase di riposo, i campioni sono stati centrifugati a 2000 g per 5"per facilitare le operazioni di prelievo della fase superiore in esano. Una volta prelevata la fase in esano e conservata in provetta da 2 mi, la fase inferiore à ̈ stata nuovamente trattata come sopra con 500 Î1⁄4Î di esano. La fase superiore à ̈ stata aggiunta alla precedente e mescolata per tilting . Therefore, following a double extraction with hexane, according to the methodology of Yung et al., 2006 (Reference 1) with the following modifications. The extraction involved the addition of 500 Î1⁄4Î of hexane to the aliquoted supernatants and to the blank. The samples were then mixed by inversion for 10 ", taking care not to break the interface between the two phases and then left to stand for 30" at room temperature. At the end of the resting phase, the samples were centrifuged at 2000 g for 5 "to facilitate the removal of the upper phase in hexane. Once the hexane phase was withdrawn and stored in a 2 ml tube, the lower phase is ̈ it was again treated as above with 500 Î1⁄4Î of hexane The upper phase was added to the previous one and mixed by tilting.
Analisi spettrofotometrica. Spectrophotometric analysis.
La quantificazione di CLA prodotti à ̈ stata effettuata tramite una lettura della densità ottica allo spettrofotometro utilizzando una lunghezza d'onda di 233 nm in accordo a Barrett et al., 2007 (Riferimento 2) e Xu et al., 2008 (Riferimento 3). The quantification of CLA produced was performed by a reading of the optical density at the spectrophotometer using a wavelength of 233 nm according to Barrett et al., 2007 (Reference 2) and Xu et al., 2008 (Reference 3) .
Prima di effettuare l'analisi, lo spettrofotometro à ̈ stato azzerato contro 100 Î1⁄4Î di esano utilizzando una couvetta in quarzo. Before carrying out the analysis, the spectrophotometer was zeroed against 100 Î1⁄4Î of hexane using a quartz cup.
È stata quindi effettuata la lettura per tutti i campioni a partire dal bianco, avendo cura di avvinare con esano la couvetta prima di procedere col trasferimento del campione. Per i campioni che hanno dato valori di assorbanza > 3, si sono effettuate diluizioni seriali 1:2 in esano fino a ricondursi a valori di assorbanza che, hanno permesso il calcolo delle concentrazioni di CLA per interpolazione della retta Y = 25,311 x 0,0698. The reading was then carried out for all the samples starting from the blank, taking care to sprinkle the couvette with hexane before proceeding with the transfer of the sample. For the samples that gave absorbance values> 3, serial dilutions 1: 2 were carried out in hexane up to the absorbance values which allowed the calculation of the CLA concentrations by interpolation of the straight line Y = 25.311 x 0.0698 .
Le tecniche spettrofotometriche per la quantificazione di CLA prodotto da colture batteriche sono note da Barrette et al., 2007. Questa tecnica spettrofotometrica, si basa sulla caratteristica dei dieni coniugati (in questo caso i CLA) di possedere uno spettro UV tipico di questa classe di composti, con un'assorbenza di 233 nm. Tale metodica, tuttavia, permette la quantificazione di CLA prodotti. The spectrophotometric techniques for the quantification of CLA produced by bacterial cultures are known from Barrette et al., 2007. This spectrophotometric technique is based on the characteristic of conjugated dienes (in this case CLA) to possess a UV spectrum typical of this class of compounds, with an absorbency of 233 nm. This method, however, allows the quantification of CLA produced.
Test di tossicità dell'acido linoleico e scelta del mezzo colturale . Linoleic acid toxicity test and choice of culture medium.
Al termine del periodo di incubazione (16ore+lora, 37 1°C) , nel test di tossicità condotto sul ceppo B. breve DSM 20213 utilizzando differenti concentrazioni di LA (0, 0,5 ed 1 mg/ml) in tre differenti terreni (TPY, MRS e LAPTg) ha permesso di individuare il mezzo colturale più idoneo a condurre la fase di screening successiva. Il TPY brodo à ̈ stato scelto come mezzo colturale poiché ha dettato le condizioni ambientali, in presenza di LA, più favorevoli alla crescita dei Bifidobatteri. Con il brodo TPY à ̈ stata riscontrata la minore variabilità di conta sia tramite lettura della densità ottica allo spettrofotometro con lunghezza d'onda a 600 nm che tramite conta su piastra di inclusione, figura 1 e tabella 4. At the end of the incubation period (16 hours + 1 hour, 37 1 ° C), in the toxicity test conducted on the B. short strain DSM 20213 using different concentrations of LA (0, 0.5 and 1 mg / ml) in three different media (TPY, MRS and LAPTg) made it possible to identify the most suitable culture medium to conduct the subsequent screening phase. TPY broth was chosen as a culture medium because it dictated the environmental conditions, in the presence of LA, more favorable to the growth of Bifidobacteria. With the TPY broth, the lowest count variability was found both by reading the optical density at the spectrophotometer with a wavelength at 600 nm and by counting on the inclusion plate, figure 1 and table 4.
Le differenze osservate nell'impiego di TPY, MRS e LAPTg brodo a differenti concentrazioni di LA (0, 035, 1 mg/ml) (figura 1) hanno sottolineato l'importanza del mezzo colturale in studi riguardanti il metabolismo microbico. The observed differences in the use of TPY, MRS and LAPTg broth at different concentrations of LA (0.035, 1 mg / ml) (figure 1) underlined the importance of the culture medium in studies concerning microbial metabolism.
Infatti, l'impiego del TPY brodo à ̈ risultato essere preferibile rispetto all'utilizzo di MRS e LAPTg brodo dando la minore variabilità di crescita microbica, alle differenti concentrazioni di LA, oltre che le conte maggiori, a parità di concentrazione di LA (0,5 e 1 mg/ml), rispetto a RMS e LAPTg brodo. La concentrazione iniziale scelta di LA impiegata à ̈ stata di 0,5 mg/ml. Tale concentrazione à ̈, infatti, quella preferibile per i test di conversione di LA a CLA in MRS brodo condotti in altri studi (Barrett et al., 2007 e Xu et al., 2008). La scelta à ̈ stata dettata dalla volontà di comparare, in fase preliminare, i tassi di conversione utilizzando il mezzo colturale TPY brodo e quelli presenti in letteratura che hanno riguardato l'impiego del mezzo colturale MRS brodo. In fact, the use of TPY broth was found to be preferable compared to the use of MRS and LAPTg broth, giving the lowest variability of microbial growth, at the different concentrations of LA, as well as the higher counts, with the same concentration of LA (0 , 5 and 1 mg / mL), compared to RMS and LAPTg broth. The initial chosen concentration of LA used was 0.5 mg / ml. This concentration is, in fact, the preferable one for the LA to CLA conversion tests in broth MRS conducted in other studies (Barrett et al., 2007 and Xu et al., 2008). The choice was dictated by the desire to compare, in the preliminary phase, the conversion rates using the TPY broth culture medium and those present in the literature concerning the use of the MRS broth culture medium.
Selezione dei ceppi di bifidobatteri produttori di CLA. Al termine del periodo di incubazione (16 ore ± 1 ora, 37 ± 1°C) , i ceppi di batteri sopra indicati ed il controllo negativo Lb. Reuteri DSM 20016 sono stati sottoposti alla procedura per analisi spettrofotometrica a 233 nm necessaria per la quantificazione dì CLA prodotti. In tabella 5 sono riportati i risultati ottenuti relativi alla conversione di LA a CLA da parte dei diversi ceppi di bifidobatteri selezionati. Selection of CLA producing bifidobacteria strains. At the end of the incubation period (16 hours ± 1 hour, 37 ± 1 ° C), the above bacterial strains and the negative control Lb. Reuteri DSM 20016 underwent the procedure for spectrophotometric analysis at 233 nm necessary for the quantification of CLA products. Table 5 shows the results obtained relating to the conversion of LA to CLA by the various strains of selected bifidobacteria.
Il ceppo B. longum DSM 23233 Ã ̈ risultato essere il maggior produttore di CLA evidenziando una produzione di 0,465 mg/ml pari ad un tasso di conversione da LA a CLA del 92,93%. Mentre il ceppo B. breve DSM 16604 Ã ̈ risultato essere un buon produttore di CLA evidenziando una produzione di 0,393 mg/ml pari ad un tasso di conversione da LA a CLA del 71,38%. The B. longum DSM 23233 strain was found to be the largest producer of CLA showing a production of 0.465 mg / ml equal to a conversion rate from LA to CLA of 92.93%. While the B. short DSM 16604 strain was found to be a good producer of CLA showing a production of 0.393 mg / ml equal to a conversion rate from LA to CLA of 71.38%.
Le concentrazioni di CLA prodotte sono state calcolate ipotizzando che i terreni colturali contenessero in partenza delle quantità variabili di LA e CLA dovute alla presenza di ingredienti quali estratti di carne, estratto di lievito, componenti della soia, ecc. a questo proposito, abbiamo confrontato le letture della densità ottica allo spettrofotometro alla lunghezza d'onda di 233 nm, dei differenti terreni sterili con e senza LA a 0,5 mg/ml. Dai risultati ottenuti (tabella 6) non à ̈ stato riscontrato nessuna differenza significativa tra il terreno sterile senza e con l'aggiunta di 0,5 mg/ml di LA. The concentrations of CLA produced were calculated by assuming that the culture media initially contained variable quantities of LA and CLA due to the presence of ingredients such as meat extracts, yeast extract, soy components, etc. in this regard, we compared the spectrophotometer optical density readings at a wavelength of 233 nm, of the different sterile media with and without LA at 0.5 mg / ml. From the results obtained (table 6) no significant difference was found between the sterile medium without and with the addition of 0.5 mg / ml of LA.
Quanto sopra ha confermato la capacità della tecnica utilizzata di quantificare esclusivamente la componente ad dica caratterizzata dall'avere due doppi legami coniugati come i CLA. Infine, la quantità calcolata di CLA presente nei terreni sterili à ̈ stata successivamente sottratta nel calcolo delle concentrazioni di CLA prodotti dall'attività microbica. Inoltre, la conta batterica effettuata tramite lettura della densità ottica allo spettrofotometro (lunghezza d'onda 600 nm) per il L. reuteri DSM 20016 ha evidenziato una conta superiore rispetto ai ceppi produttori suggerendo che la tossicità relativa alla presenza di LA sia ceppo specifica. The above confirmed the ability of the technique used to quantify only the ad dica component characterized by having two conjugated double bonds such as CLAs. Finally, the calculated amount of CLA present in the sterile media was subsequently subtracted in the calculation of the CLA concentrations produced by microbial activity. Furthermore, the bacterial count performed by reading the optical density on the spectrophotometer (wavelength 600 nm) for the L. reuteri DSM 20016 showed a higher count than the producing strains suggesting that the toxicity related to the presence of LA is strain specific.
In base a questi risultati si può dedurre che i microorganismi maggiormente sensibili siano anche quelli in grado di operare la maggiore conversione di LA a CLA, probabilmente quale meccanismo di difesa nei confronti dell'elemento tossico. On the basis of these results it can be deduced that the most sensitive microorganisms are also those capable of carrying out the greatest conversion of LA to CLA, probably as a defense mechanism against the toxic element.
Dalle prove sopra eseguite si evidenzia un'alta percentuale di conversione ottenuta per il B. longum DSM 23233 (92,93%) e B. breve DSM 16604 (71,38%) rispetto al controllo positivo B. breve DSM 20213 relativo a un lavoro precedentemente condotto con l'impiego di MRS brodo (Barrett et al., 2007). From the tests carried out above, a high percentage of conversion is shown for B. longum DSM 23233 (92.93%) and B. breve DSM 16604 (71.38%) compared to the positive control B. breve DSM 20213 relative to a work previously conducted with the use of MRS broth (Barrett et al., 2007).
Pertanto, l'attività di conversione da LA a CLA da parte dei Bifidobatteri , potrebbe rendere disponibile questo metabolita direttamente nel lume intestinale, per poi manifestare le sue proprietà salutistiche sia localmente che in seguito al suo assorbimento. Therefore, the conversion activity from LA to CLA by Bifidobacteria could make this metabolite available directly in the intestinal lumen, and then manifest its health properties both locally and following its absorption.
Da quanto sopra si evidenzia la capacità di alcuni ceppi di bifidobatteri (in particolare per le specie B. longum e B. breve) di convertire l'acido linoleico in coniugati dell'acido linoleico. Pertanto, l'impiego di tali ceppi in campo probiotico, potrebbe rappresentare un mezzo efficace ed innovativo per controllare il delicato equilibrio tra AGE omega-6/omega-3 assunti tramite una dieta. The above shows the ability of some strains of bifidobacteria (in particular for the B. longum and B. short species) to convert linoleic acid into linoleic acid conjugates. Therefore, the use of these strains in the probiotic field could represent an effective and innovative means to control the delicate balance between AGE omega-6 / omega-3 taken through a diet.
I ceppi di bifidobatteri in grado di operare la conversione di LA a CLA potrebbero interagire in sìtu, lungo il tratto gastrointestinale, con la componente in acidi grassi essenziali assunti tramite la dieta, contrastando potenzialmente il metabolismo pro-ìnfiammatorio della via degli acidi grassi omega-6 e producendo metaboliti (CLA) con possibile ruolo nutraceutico. Infatti, anche se la maggior parte dei grassi assunti tramite la dieta viene digerita nell'intestino tenue, all'incirca 5-8 g di lipidi arrivano nel colon ogni giorno. Inoltre, à ̈ stato stimato che l'uomo espelle tramite le feci circa 20 mg di LA. Ciò suggerisce che LA à ̈ potenzialmente utilizzabile come substrato per la produzione di CLA. In aggiunta, il recente isolamento di ceppi di bifidobatteri e lattobacilli dall'intestino tenue di neonati estende l'applicabilità dei ceppi di Bifidobatteri produttori dei CLA. Tali riscontri suggeriscono un campo dì applicabilità esteso nella quasi interezza del tratto gastrointestinale, permettendo, di fatto, un'azione potenzialmente contemporanea all'assorbimento lipidico che avviene principalmente nelle regioni superiori dell'intestino tenue. Infine, l'applicabilità dei ceppi probiotici produttori di CLA sembra promettente, anche perché l'effetto anticarcinogeno dei CLA potrebbe manifestarsi a concentrazioni molto basse. Infatti, in modelli animali sono stati osservati effetti anticarcinogeni per quantità di CLA pari allo 0,5 - 1% (p/p) della dieta giornaliera. The strains of bifidobacteria capable of converting LA to CLA could interact in yes, along the gastrointestinal tract, with the component in essential fatty acids taken through the diet, potentially counteracting the pro-inflammatory metabolism of the pathway of omega-6 fatty acids and producing metabolites (CLA) with possible nutraceutical role. In fact, although most of the fat consumed in the diet is digested in the small intestine, approximately 5-8 g of lipids arrive in the colon each day. In addition, it has been estimated that humans excrete about 20 mg of LA in their feces. This suggests that LA is potentially usable as a substrate for CLA production. In addition, the recent isolation of bifidobacteria and lactobacilli strains from the small intestine of infants extends the applicability of CLA-producing strains of Bifidobacteria. These findings suggest a field of applicability extended to almost the entire gastrointestinal tract, allowing, in fact, a potentially simultaneous action to the lipid absorption which occurs mainly in the upper regions of the small intestine. Finally, the applicability of CLA-producing probiotic strains seems promising, also because the anticarcinogenic effect of CLA could occur at very low concentrations. In fact, anticarcinogenic effects have been observed in animal models for the quantity of CLA equal to 0.5 - 1% (w / w) of the daily diet.
LISTA DELLE REFERENZE LIST OF REFERENCES
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2) E. Barrett et al., Rapid Screening Method for Analyzing thà ̈ Conjugated Linoleic Acid Production Capahilities of Bacterial Cultures, Applied and Environmental Microbiology, Apr. 2007, p. 2333 - 2337, American Society for Microbiology . 2) E. Barrett et al., Rapid Screening Method for Analyzing thà ̈ Conjugated Linoleic Acid Production Capahilities of Bacterial Cultures, Applied and Environmental Microbiology, Apr. 2007, p. 2333 - 2337, American Society for Microbiology.
3) H. Xu et al., Kinetics of microhial hydrogenation of free linoleic acid to conjucated linoleic acids, Journal of Applied Microbiology, ISSN 1364-5072. 3) H. Xu et al., Kinetics of microhial hydrogenation of free linoleic acid to conjucated linoleic acids, Journal of Applied Microbiology, ISSN 1364-5072.
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Non-Patent Citations (1)
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