Descrizione dell?invenzione industriale dal titolo: Description of the industrial invention entitled:

?Liposomi, composizioni che li comprendono, relativi usi? ?Liposomes, compositions comprising them, their uses?

Campo dell?invenzione Field of invention

La presente descrizione riguarda liposomi, il loro impiego quali veicoli per applicazioni mediche, procedimenti per produrli. The present description relates to liposomes, their use as vehicles for medical applications, processes for producing them.

Sfondo tecnologico Technology background

L?applicazione delle nanotecnologie in ambito terapeutico ? estremamente innovativa ed associata a numerosi vantaggi, tra i quali: 1) incremento della biodisponibilit? di numerosi farmaci; 2) possibilit? di sfruttare vie di somministrazione alternative (come la somministrazione per via inalatoria che consente il raggiungimento di elevate dosi di farmaco a livello delle cellule dell?organo bersaglio); 3) possibilit? di indirizzare il trattamento, mediante funzionalizzazione, verso una specifica popolazione cellulare (targeting). Questi aspetti innovativi rivestono particolare rilevanza nel contesto delle patologie respiratorie croniche. Molti farmaci non possono essere somministrati per via inalatoria, in quanto insolubili in acqua o tossici per le cellule epiteliali dell?apparato respiratorio. Pertanto l?utilizzo di nanovettori funzionalizzati potrebbe permettere di raggiungere adeguate concentrazioni di principio attivo nelle cellule bersaglio risparmiando l?epitelio respiratorio e contenendo significativamente gli effetti tossici sistemici. Questo approccio, spesso proposto, non ha ancora trovato una applicazione, in quanto i vettori finora sviluppati sono risultati scarsamente biocompatibili o di sintesi troppo complessa per l?applicazione clinica su larga scala. The application of nanotechnologies in the therapeutic field? extremely innovative and associated with numerous advantages, including: 1) increase in bioavailability? of numerous drugs; 2) possibility? to exploit alternative routes of administration (such as administration by inhalation which allows the achievement of high doses of drug at the level of the cells of the target organ); 3) possibility? to direct the treatment, through functionalization, towards a specific cell population (targeting). These innovative aspects are of particular relevance in the context of chronic respiratory diseases. Many drugs cannot be administered by inhalation, as they are insoluble in water or toxic to the epithelial cells of the respiratory system. Therefore, the use of functionalized nanocarriers could allow to reach adequate concentrations of active principle in the target cells, sparing the respiratory epithelium and significantly limiting the systemic toxic effects. This approach, often proposed, has not yet found an application, as the vectors developed up to now have proved to be poorly biocompatible or too complex for clinical application on a large scale.

Sintesi dell?invenzione Summary of the invention

Lo scopo della presente descrizione ? quello di fornire vettori biocompatibili di principi attivi, che siano efficaci nel trattamento di patologie per le quali vi ? urgente necessit? di una terapia risolutiva ben tollerata, che non presentino tossicit?, e che siano in grado di ottimizzare la quantit? di principio attivo a livello dell?organo bersaglio. The purpose of this description? that of supplying biocompatible vectors of active principles, which are effective in the treatment of pathologies for which there is? urgent need? of a well tolerated resolutive therapy, which do not present toxicity, and which are able to optimize the quantity? of active ingredient at the level of the target organ.

Secondo l?invenzione, lo scopo di cui sopra viene raggiunto mediante la soluzione richiamata specificamente nelle rivendicazioni allegate, che costituiscono parte integrante della presente descrizione. According to the invention, the above object is achieved by means of the solution specifically referred to in the attached claims, which form an integral part of the present description.

La presente descrizione ha per oggetto liposomi rivestiti con acido ialuronico (HA) di peso molecolare superiore a 17000 Dalton, preferibilmente compreso tra 20000 Dalton e 60000 Dalton. The present description relates to liposomes coated with hyaluronic acid (HA) having a molecular weight greater than 17,000 Daltons, preferably between 20,000 Daltons and 60,000 Daltons.

I liposomi possono contenere nel core un principio attivo, in particolare un inibitore di enzimi proteinchinasi, preferibilmente un inibitore di enzimi tirosinchinasi, pi? preferibilmente selezionato nel gruppo costituito da imatinib, nintedanib e altri derivati appartenenti alla classe degli inibitori delle tirosinchinasi. The liposomes can contain in the core an active ingredient, in particular a protein kinase enzyme inhibitor, preferably a tyrosine kinase enzyme inhibitor, plus? preferably selected from the group consisting of imatinib, nintedanib and other derivatives belonging to the class of tyrosine kinase inhibitors.

La presente descrizione fornisce anche composizioni comprendenti i liposomi e i loro usi. The present disclosure also provides compositions comprising liposomes and their uses.

In particolare, i liposomi descritti e le composizioni che li comprendono possono essere usati in medicina, per veicolare principi attivi verso specifiche cellule bersaglio. In una o pi? forme di attuazione, i liposomi descritti e le composizioni che li comprendono possono essere efficacemente impiegati nel trattamento di patologie respiratorie, preferibilmente patologie fibrotiche polmonari. Le patologie respiratorie possono essere selezionate tra fibrosi polmonare idiopatica o su base infiammatoria, in particolare le malattie associate a malattie del collagene, e bronchiolite obliterante idiopatica o secondaria a trapianto di midollo o polmone. In particular, the described liposomes and the compositions which comprise them can be used in medicine, to deliver active ingredients to specific target cells. In one or more embodiments, the described liposomes and the compositions comprising them can be effectively used in the treatment of respiratory pathologies, preferably pulmonary fibrotic pathologies. Respiratory pathologies can be selected from idiopathic or inflammatory pulmonary fibrosis, in particular diseases associated with collagen diseases, and idiopathic obliterans bronchiolitis or secondary to bone marrow or lung transplantation.

La descrizione fornisce anche un procedimento innovativo per produrre liposomi contenenti almeno un principio attivo cos? come un procedimento per produrre liposomi rivestiti con HA con peso molecolare superiore a 17000 Da. La descrizione ha per oggetto inoltre un procedimento per produrre HA legato a un fosfolipide sotto forma di coniugato (HA-f). The disclosure also provides an innovative process for producing liposomes containing at least one active ingredient so? such as a process for producing HA-coated liposomes having a molecular weight greater than 17000 Da. The disclosure further relates to a process for producing HA bound to a phospholipid in the form of a conjugate (HA-f).

Breve descrizione delle figure Brief description of the figures

Verranno descritte una o pi? forme di realizzazione, a puro titolo di esempio non limitativo con riferimento alle figure allegate, di seguito elencate. Will one or more be described? embodiments, purely by way of non-limiting example with reference to the attached figures, listed below.

Figura 1. Risultati di vitalit? cellulare dopo incubazione di linee primarie di miofibroblasti (LFs) derivate da pazienti affetti da rigetto cronico polmonare (CLAD;A), da fibrosi associata a patologia del collagene (ILD-CTD;B) o da linea cellulare immortalizzata di carcinoma umano polmonare (A549;C) con liposomi contenenti imatinib (LIPIm), liposomi rivestiti con HA contenenti imatinib (LIP-HAIm) e Imatibin (Im) da solo, a parit? di concentrazione di Imatinib (30 ?M) dopo 24, 48 e 72 h. I dati sono rappresentati come media ? deviazione standard della percentuale rispetto al controllo settato a 100%. Analisi statistica: *, p<0,01 vs. CTR; *, p<0,05 vs. CTR. Figure 1. Results of viability? after incubation of primary myofibroblast lines (LFs) derived from patients with chronic lung rejection (CLAD;A), fibrosis associated collagen disease (ILD-CTD;B) or immortalized human lung cancer cell line (A549 ;C) with imatinib-containing liposomes (LIPIm), HA-coated liposomes containing imatinib (LIP-HAIm), and Imatibin (Im) alone, equal? of imatinib concentration (30 µM) after 24, 48 and 72 h. Are the data represented as an average? standard deviation of the percentage with respect to the control set at 100%. Statistical analysis: *, p<0.01 vs. CTR; *, p<0.05 vs. CTR.

Figura 2. Risultati della quantificazione proteica al western blot effettuato sul lisato cellulare di LFs derivati da CLAD e ILD-CTD dopo trattamento per 24 h con LIPIm, LIP-HAIm e Imatinib da solo (Im). (A) Quantificazione di cAbl fosforilato normalizzando rispetto al controllo (CTR = 1) e (B) quantificazione di collagene di tipo I normalizzando rispetto al controllo (CTR = 1). Figure 2. Western blot protein quantification results performed on cell lysates of CLAD- and ILD-CTD-derived LFs after 24 h treatment with LIPIm, LIP-HAIm and Imatinib alone (Im). (A) Quantification of phosphorylated cAbl by normalizing versus control (CTR = 1) and (B) Quantification of type I collagen by normalizing versus control (CTR = 1).

Figure 3. Immagini rappresentative acquisite con il microscopio confocale di monociti derivati da sangue periferico incubati per 1 h con liposomi (LIP) e liposomi rivestiti con HA (LIP-HA) fluorescenti. I nuclei delle cellule sono stati marcati con un fluoroforo specifico (DAPI). I cerchi bianchi indicano la presenza di LIP o di LIP-HA all?interno dei monociti. Figure 3. Representative images acquired by confocal microscopy of peripheral blood-derived monocytes incubated for 1 h with liposomes (LIP) and fluorescent HA-coated liposomes (LIP-HA). The cell nuclei were labeled with a specific fluorophore (DAPI). White circles indicate the presence of LIP or LIP-HA within monocytes.

Descrizione dettagliata dell?invenzione Detailed description of the invention

Nella seguente descrizione, vengono forniti numerosi dettagli specifici per consentire una comprensione approfondita delle forme di realizzazione. Le forme di realizzazione possono essere praticate senza uno o pi? dei dettagli specifici, o con altri procedimenti, componenti, materiali, ecc. In altri casi, strutture, materiali o operazioni ben noti non sono mostrati o descritti in dettaglio per evitare di confondere aspetti delle forme di realizzazione. In the following description, a number of specific details are provided to enable a thorough understanding of the embodiments. Embodiments can be practiced without one or more? specific details, or with other processes, components, materials, etc. In other cases, well-known structures, materials, or operations are not shown or described in detail to avoid confusing aspects of the embodiments.

Il riferimento in tutta la presente descrizione a ?una sola forma di realizzazione? o ?una forma di realizzazione? indica che un/una particolare aspetto, struttura o caratteristica descritto/descritta in connessione con la forma di realizzazione ? incluso/inclusa in almeno una forma di realizzazione. Pertanto, le forme delle espressioni ?in una sola forma di realizzazione? o ?in una forma di realizzazione? in vari punti di tutta la presente descrizione non si riferiscono necessariamente tutte alla stessa forma di realizzazione. Inoltre, i/le particolari aspetti, strutture o caratteristiche possono essere combinati/combinate in qualsiasi modo adatto in una o pi? forme di realizzazione. The reference throughout this specification to ?a single embodiment? or ?an embodiment? indicates that a/a particular aspect, structure or feature described/described in connection with the embodiment ? included/included in at least one embodiment. Thus, the forms of expressions ?in only one embodiment? or ?in one embodiment? at various points throughout the present disclosure they do not necessarily all refer to the same embodiment. Furthermore, the particular aspects, structures or characteristics may be combined/combined in any suitable way in one or more? embodiments.

Le intestazioni qui fornite servono solo per comodit? e non interpretano l?ambito o lo scopo delle forme di realizzazione. The headers provided here are for convenience only. and do not interpret the scope or purpose of the embodiments.

La presente descrizione ha per oggetto un nanoveicolo liposomiale funzionalizzato sulla superficie con acido ialuronico (HA) al fine di favorire la veicolazione selettiva di un principio attivo verso cellule patologiche e macrofagi alveolari presenti in patologie respiratorie croniche e severe. The present description relates to a liposomal nanocarrier functionalized on the surface with hyaluronic acid (HA) in order to favor the selective delivery of an active principle towards pathological cells and alveolar macrophages present in chronic and severe respiratory pathologies.

I liposomi sono vescicole fosfolipidiche che presentano una membrana, la membrana liposomiale, comprendente un doppio strato lipidico, generalmente un doppio strato di fosfolipidi. I liposomi presentano dimensioni nanometriche, racchiudono un core acquoso e possono essere utilizzati in clinica per la veicolazione di principi attivi. Possono incapsulare molecole sia idrofile sia lipofile, permettendo il rilascio graduale del principio attivo, modificandone quindi il profilo farmacocinetico. Liposomes are phospholipid vesicles that have a membrane, the liposomal membrane, comprising a lipid bilayer, usually a phospholipid bilayer. Liposomes have nanometric dimensions, enclose an aqueous core and can be used in the clinic for the delivery of active ingredients. They can encapsulate both hydrophilic and lipophilic molecules, allowing the gradual release of the active ingredient, thus modifying its pharmacokinetic profile.

I liposomi oggetto della presente descrizione sono liposomi rivestiti con HA avente un peso molecolare superiore a 17000 Dalton, preferibilmente compreso tra 20000 e 60000 Dalton. L?HA ? direttamente legato alla testa di un fosfolipide del doppio strato lipidico della membrana liposomiale. In particolare, l?HA ? direttamente legato alla testa di un fosfolipide di membrana comprendente un gruppo amminico. Pi? preferibilmente, l?HA ? direttamente legato a un gruppo amminico di un fosfolipide di membrana. In una o pi? forme di attuazione, il rapporto in peso tra acido ialuronico e fosfolipidi di membrana ? compreso tra 1 e 5. The liposomes object of the present description are liposomes coated with HA having a molecular weight higher than 17,000 Dalton, preferably between 20,000 and 60,000 Dalton. IT HAS ? directly bound to the head of a phospholipid of the lipid bilayer of the liposomal membrane. In particular, the? HA ? directly bound to the head of a membrane phospholipid comprising an amino group. Pi? preferably, the? HA ? directly bound to an amino group of a membrane phospholipid. In one or more embodiments, the weight ratio between hyaluronic acid and membrane phospholipids ? between 1 and 5.

Il doppio strato fosfolipidico della membrana liposomiale pu? comprendere inoltre colesterolo. The phospholipid bilayer of the liposomal membrane can also include cholesterol.

Il fosfolipide del doppio strato fosfolipidico della membrana liposomiale pu? essere selezionato tra 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (DPPE), fosfatidilglicerolo (PG), fosfatidilcolina (PC) e relative combinazioni. In una o pi? forme di attuazione, pu? essere utilizzata PC sia di origine naturale (di soia e/o di uovo) sia sintetica. In una o pi? forme di attuazione, PC sintetiche possono comprendere PC di soia completamente idrogenata e/o PC avente le due catene lipidiche con un numero di atomi di carbonio compreso tra 12 e 18 (C12-C18). The phospholipid bilayer of the liposomal membrane can be selected from 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DPPE), phosphatidylglycerol (PG), phosphatidylcholine (PC) and combinations thereof. In one or more forms of implementation, pu? PCs of both natural (soy and/or egg) and synthetic origin can be used. In one or more embodiments, synthetic PCs may comprise fully hydrogenated soybean PC and/or PC having the two lipid chains with a number of carbon atoms ranging from 12 to 18 (C12-C18).

I liposomi rivestiti oggetto della presente descrizione possono presentare un diametro medio compreso tra 100 nm e 300 nm, preferibilmente pari a 250 nm. Il valore del diametro medio ? stato analizzato mediante la tecnica quasi-elastic light scattering (QELS) a 25?C. In una o pi? forme di attuazione, i liposomi rivestiti presentano un valore di potenziale Z compreso tra -10 mV e -50 mV, preferibilmente paria a -33 mV. The coated liposomes object of the present description can have an average diameter between 100 nm and 300 nm, preferably equal to 250 nm. The value of the mean diameter? was analyzed by the quasi-elastic light scattering (QELS) technique at 25°C. In one or more embodiments, the coated liposomes have a Z potential value between -10 mV and -50 mV, preferably equal to -33 mV.

In una o pi? forme di attuazione, i liposomi oggetto della presente descrizione possono contenere almeno un principio attivo. Dall?analisi al microscopio elettronico ? stato inoltre osservato che i liposomi presentano una forma sferica ed ? stata confermata la presenza del principio attivo precipitato al loro interno. In one or more embodiments, the liposomes object of the present description can contain at least one active principle. From the analysis to the electron microscope ? It has also been observed that liposomes have a spherical shape and ? the presence of the active ingredient precipitated inside them has been confirmed.

Gli Inventori hanno osservato che i liposomi mantengono circa il 95% del contenuto iniziale di principio attivo, in particolare imatinib, dopo la conservazione a 4?C per 3 settimane. Durante questo periodo non si osservano variazioni apprezzabili di diametro e potenziale Z, n? fenomeni di precipitazione o aggregazione. The inventors have observed that liposomes retain about 95% of the initial content of active principle, in particular imatinib, after storage at 4°C for 3 weeks. No appreciable variations in diameter and potential Z are observed during this period, n? precipitation or aggregation phenomena.

Il procedimento di incapsulazione realizzato dagli Inventori e descritto nel seguito fornisce una serie di vantaggi, tra i quali consente di ottenere formulazioni stabili: gli Inventori hanno infatti osservato che in tampone HEPES viene rilasciato il 20% di imatinib, quale principio attivo, in 24 ore e il 30% in 72 ore; in siero il rilascio ? di circa il 50% in 24 ore e 80% in 72 ore. The encapsulation process developed by the inventors and described below provides a series of advantages, among which it allows to obtain stable formulations: the inventors have in fact observed that in HEPES buffer 20% of imatinib is released, as active ingredient, in 24 hours and 30% in 72 hours; in serum the release ? approximately 50% in 24 hours and 80% in 72 hours.

I liposomi oggetto della presente descrizione cos? come le composizioni che li contengono possono essere impiegati per veicolare verso target specifici i principi attivi in essi contenuti e possono inoltre essere somministrati per via inalatoria. The liposomes object of this description are so? like the compositions containing them, they can be used to convey the active ingredients contained therein towards specific targets and can also be administered by inhalation.

In particolare, le patologie efficacemente trattabili con i liposomi oggetto della presente descrizione sono patologie respiratorie, preferibilmente patologie fibrotiche polmonari. In una o pi? forme di attuazione, le patologie trattabili possono essere selezionate tra fibrosi polmonare idiopatica, fibrosi polmonare associata a malattie del collagene e bronchiolite obliterante. La bronchiolite obliterante pu? essere conseguente a trapianto polmonare o a manifestazione cronica dopo trapianto di cellule staminali midollari allogeniche. In particular, the pathologies effectively treatable with the liposomes object of the present description are respiratory pathologies, preferably pulmonary fibrotic pathologies. In one or more embodiments, the treatable pathologies can be selected from idiopathic pulmonary fibrosis, pulmonary fibrosis associated with collagen diseases and bronchiolitis obliterans. Bronchiolitis obliterans can be a consequence of lung transplantation or a chronic manifestation after allogeneic bone marrow stem cell transplantation.

Queste condizioni cliniche ad eziologia molto diversa sono accomunate da alcune caratteristiche fondamentali: 1) sono patologie rare per le quali vi ? urgente necessit? di una terapia risolutiva ben tollerata; 2) sono caratterizzate da una proliferazione incontrollata di miofibroblasti (LFs), scatenata e sostenuta da un injury infiammatorio/autoimmune cronico. These clinical conditions with very different etiologies share some fundamental characteristics: 1) they are rare pathologies for which there is urgent need? of a well tolerated resolutive therapy; 2) are characterized by an uncontrolled proliferation of myofibroblasts (LFs), triggered and sustained by a chronic inflammatory/autoimmune injury.

Studi di caratterizzazione dei LFs, ottenuti da campioni di lavaggio bronco-alveolare di pazienti affetti da queste patologie, hanno mostrato, a livello della membrana cellulare, una sovra-espressione di CD44, una glicoproteina che ? anche il recettore specifico dell?HA. Characterization studies of LFs, obtained from broncho-alveolar lavage samples of patients affected by these pathologies, have shown, at the cell membrane level, an over-expression of CD44, a glycoprotein which ? also the specific receptor of HA.

I liposomi oggetto della presente descrizione rivestiti con HA con uno specifico peso molecolare (superiore a 17000 Dalton, preferibilmente compreso tra 20000 Dalton e 60000 Dalton) rappresentano una innovazione assoluta e un importante passo avanti nella terapia di queste gravi affezioni, con un notevole impatto economico e sociale. The liposomes object of the present description coated with HA with a specific molecular weight (above 17000 Dalton, preferably between 20000 Dalton and 60000 Dalton) represent an absolute innovation and an important step forward in the therapy of these serious diseases, with a significant economic impact and social.

La bronchiolite obliterante, che rappresenta il fallimento di un trapianto polmonare o l?espressione di graft cronica polmonare, ? associata a elevati costi per il sistema sanitario, richiedendo frequenti valutazioni e ricoveri, terapie costose e supporto complesso nella fase della progressione della malattia, mentre la fibrosi polmonare ? spesso causa di grave disabilit? e morte nei pazienti. Nella forma idiopatica non risulta associata ad altre patologie sistemiche, mentre nella forma associata a sclerosi sistemica o miopatia infiammatoria su base autoimmune risulta spesso poco responsiva alla terapia immunosoppressiva adottata per questi quadri. Bronchiolitis obliterans, which represents failed lung transplantation or chronic lung graft expression, is associated with high costs for the health system, requiring frequent evaluations and hospitalizations, expensive therapies and complex support in the phase of disease progression, while pulmonary fibrosis ? often the cause of serious disability? and death in patients. In the idiopathic form it is not associated with other systemic pathologies, while in the form associated with systemic sclerosis or autoimmune inflammatory myopathy it is often unresponsive to the immunosuppressive therapy adopted for these conditions.

Negli ultimi anni numerosi studi hanno suscitato grande interesse riguardo al ruolo di diversi fattori di crescita delle cellule mesenchimali, quali il PDGF, il TGF-beta ed il VEGF, nella patogenesi della fibrosi polmonare diffusa. L?azione di tali fattori ? mediata da diverse protein-chinasi che mediano la resistenza all?apoptosi, l?inibizione della proliferazione dei LFs e la produzione di matrice extracellulare. Tra i numerosi inibitori delle tirosin chinasi (TK) sviluppati negli ultimi anni, il primo e pi? utilizzato ? rappresentato da imatinib che, non solo inibisce BCR-ABL, ma ? egualmente potente nei confronti di altri recettori con propriet? tirosin-chinasiche, quali PDGFR? e c-KIT. In recent years, numerous studies have aroused great interest regarding the role of various growth factors of mesenchymal cells, such as PDGF, TGF-beta and VEGF, in the pathogenesis of diffuse pulmonary fibrosis. The action of these factors? mediated by several protein kinases that mediate resistance to apoptosis, inhibition of LFs proliferation and extracellular matrix production. Among the numerous tyrosine kinase (TK) inhibitors developed in recent years, the first and most? used ? represented by imatinib which not only inhibits BCR-ABL, but ? equally potent against other receptors with properties? tyrosine kinases, such as PDGFR? and c-KIT.

Un altro composto, gi? ampiamente impiegato nella terapia della fibrosi polmonare, sia idiopatica sia associata a patologie del collagene, e somministrato per via orale, ? il nintedanib, in grado di inibire le TK associate al recettore del PDGF ? e ?, del FGF 1-3 e dell?EGFR 1-3. Another compound, right? widely used in the treatment of pulmonary fibrosis, both idiopathic and associated with collagen diseases, and administered orally, ? nintedanib, able to inhibit the TKs associated with the PDGF receptor? and ?, of FGF 1-3 and of EGFR 1-3.

La somministrazione sistemica di questi inibitori comporta una significativa tossicit? che a sua volta ne limita l?utilizzo e il dosaggio, riducendo di conseguenza la quantit? di principio attivo a livello dell?organo bersaglio. Does systemic administration of these inhibitors lead to significant toxicity? which in turn limits its use and dosage, consequently reducing the quantity? of active ingredient at the level of the target organ.

In commercio sono presenti formulazioni liposomiali contenenti farmaci antifungini o antitumorali utilizzati con somministrazione per via endovenosa. Recentemente sono state prodotte due formulazioni liposomiali per uso inalatorio: amikacina liposomiale (che trova indicazione nel trattamento di micobatteriosi polmonari e refrattarie alla terapia antibiotica di prima linea) e ciclosporina liposomiale (in corso di registrazione per la bronchiolite obliterante). Le formulazioni disponibili in commercio, tuttavia, non sono funzionalizzate, non hanno quindi un target cellulare specifico. Pertanto, ad oggi, non esiste in sviluppo avanzato alcuna formulazione liposomiale con capacit? di direzionamento attivo, da poter essere somministrata anche per via inalatoria. On the market there are liposomal formulations containing antifungal or anticancer drugs used with intravenous administration. Two liposomal formulations for inhalation use have recently been produced: liposomal amikacin (which is indicated in the treatment of pulmonary mycobacteriosis and refractory to first-line antibiotic therapy) and liposomal cyclosporine (pending registration for bronchiolitis obliterans). Commercially available formulations, however, are not functionalized and therefore do not have a specific cellular target. Therefore, to date, there is no advanced development liposomal formulation with the ability to? of active direction, which can also be administered by inhalation.

Come dimostrato nel seguito, la somministrazione locale di principi attivi mediante i liposomi oggetto della presente descrizione risulta estremamente efficace in quanto consente ai principi attivi di raggiungere in modo specifico le cellule maggiormente coinvolte nel processo patogenetico, cio? le cellule che esprimono il recettore CD44 (LFs, cellule infiammatorie, cellule endoteliali attivate). As demonstrated below, the local administration of active ingredients by means of the liposomes object of the present description is extremely effective as it allows the active ingredients to reach in a specific way the cells most involved in the pathogenetic process, i.e. cells expressing the CD44 receptor (LFs, inflammatory cells, activated endothelial cells).

Dopo aver rilevato che cellule fibroblastiche primarie (LFs) isolate dal polmone di pazienti affetti da fibrosi associata a patologie del collagene (interstitial lung disease in collagen tissue disease, ILD-CTD) o da pazienti affetti da rigetto cronico polmonare (chronic lung allograft dysfunction, CLAD) esprimono CD44 in elevata percentuale (>90%), gli Inventori della presente domanda hanno impiegato tali linee cellulari primarie per testare l?internalizzazione e la funzione dei liposomi rivestiti di HA con specifico peso molecolare e contenenti imatinib quale principio attivo. I risultati descritti nel seguito dimostrano che il rivestimento superficiale con HA con specifico peso molecolare (LIP-HAIm) consente di ottenere liposomi con direzionamento attivo e con una elevata capacit? di captazione da parte delle cellule che esprimono il recettore CD44. After detecting that primary fibroblast cells (LFs) isolated from the lungs of patients affected by interstitial lung disease in collagen tissue disease (ILD-CTD) or from patients affected by chronic pulmonary rejection (chronic lung allograft dysfunction, CLAD) express CD44 in a high percentage (>90%), the inventors of the present application have used these primary cell lines to test the internalization and function of liposomes coated with specific molecular weight HA and containing imatinib as active ingredient. The results described below demonstrate that the surface coating with HA with specific molecular weight (LIP-HAIm) allows to obtain liposomes with active targeting and with a high? uptake by cells expressing the CD44 receptor.

In particolare, il vantaggio dell?utilizzo di HA con peso molecolare superiore a 17000 Dalton, preferibilmente compreso tra 20000 e 60000 Dalton consiste in una maggiore affinit? nei confronti del recettore CD44, rispetto a liposomi non funzionalizzati. Inoltre, la presenza di HA esercita un effetto crioprotettore, in grado di favorire la liofilizzazione di composizioni comprendenti i liposomi. La liofilizzazione a sua volta determina un aumento di stabilit? delle composizioni e rende possibile ottenere composizioni sotto forma di polveri somministrabili anche come aerosol. In particular, the advantage of using HA with a molecular weight higher than 17,000 Daltons, preferably between 20,000 and 60,000 Daltons, consists in a greater affinity? against the CD44 receptor, compared to non-functionalized liposomes. Furthermore, the presence of HA exerts a cryoprotective effect, capable of favoring the freeze-drying of compositions comprising liposomes. The lyophilization in turn determines an increase in stability? of the compositions and makes it possible to obtain compositions in the form of powders which can also be administered as aerosols.

In una o pi? forme di attuazione, la composizione comprendente i liposomi si pu? anche presentare sotto forma liquida o solida. In one or more embodiments, the composition comprising liposomes can be? also present in liquid or solid form.

Gli Inventori della presente domanda hanno inoltre sviluppato un procedimento per la realizzazione di liposomi, opzionalmente rivestiti con HA, comprendenti un principio attivo che ? risultato semplice e di particolare efficacia in termini di quantit? di principio attivo caricato nel core liposomiale. The inventors of the present application have also developed a process for the production of liposomes, optionally coated with HA, comprising an active principle which ? simple and particularly effective result in terms of quantity? of active ingredient loaded into the liposomal core.

Nell?invenzione qui descritta, il principio attivo ? inserito nel core acquoso dei liposomi avvalendosi della tecnica del gradiente di pH preferibilmente utilizzando tampone citrato. In the invention described here, the active ingredient is inserted into the aqueous core of the liposomes using the pH gradient technique preferably using citrate buffer.

Questa tecnica permette di ottenere la precipitazione del principio attivo nel core acquoso delle vescicole e un?elevata efficienza di incapsulazione, pari all?85% per l?imatinib, quindi superiore rispetto a quella ottenuta utilizzando, ad esempio, una soluzione di ammonio solfato (70%), gi? descritta in precedenza. This technique allows to obtain the precipitation of the active ingredient in the aqueous core of the vesicles and a high encapsulation efficiency, equal to 85% for imatinib, therefore higher than that obtained using, for example, an ammonium sulphate solution ( 70%), right? described previously.

In particolare, il procedimento per la produzione di liposomi contenenti almeno un principio attivo oggetto della presente descrizione comprende le fasi di: In particular, the process for the production of liposomes containing at least one active ingredient object of the present description comprises the steps of:

- solubilizzare almeno un fosfolipide in almeno un solvente alogenato e ottenere una prima soluzione, - solubilizing at least one phospholipid in at least one halogenated solvent and obtaining a first solution,

- far evaporare il solvente da detta prima soluzione e ottenere un film lipidico, - evaporate the solvent from said first solution and obtain a lipid film,

- idratare il film lipidico in una soluzione tampone comprendente almeno un sale, preferibilmente selezionato tra sale di sodio, sale di potassio, sale di ammonio e ottenere una seconda soluzione, - hydrating the lipid film in a buffer solution comprising at least one salt, preferably selected from sodium salt, potassium salt, ammonium salt and obtaining a second solution,

- sottoporre la seconda soluzione a estrusione e ottenere una sospensione comprendente liposomi, - subjecting the second solution to extrusion and obtaining a suspension comprising liposomes,

- aggiungere a detta sospensione comprendente liposomi almeno un principio attivo e ottenere liposomi contenenti detto principio attivo. - adding at least one active ingredient to said suspension comprising liposomes and obtaining liposomes containing said active ingredient.

Il fosfolipide impiegabile nel procedimento descritto pu? essere selezionato tra DSPC (1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfocolina), fosfatidilglicerolo (PG), fosfatidilcolina (PC), relative combinazioni. PC impiegabile nel procedimento descritto pu? essere sia di origine naturale, per esempio di soia e/o di uovo, sia sintetica. In una o pi? forme di attuazione, PC sintetica pu? comprendere PC di soia completamente idrogenata e/o PC con le due catene lipidiche aventi un numero di atomi di carbonio compreso tra 12 e 18 (C12-C18). Pu? inoltre essere utilizzato un fosfolipide modificato con polietilenglicole, 1,2-disteroil-sn-3-fosfoetanolamina-N-[metossi (polietilene glicole)] (mPEG-DSPE). The phospholipid which can be used in the described process can be selected from DSPC (1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), phosphatidylglycerol (PG), phosphatidylcholine (PC), combinations thereof. PC that can be used in the procedure described can? be both of natural origin, for example from soy and/or egg, and synthetic. In one or more embodiments, synthetic PC can? include fully hydrogenated soybean PC and/or PC with the two lipid chains having a carbon number of between 12 and 18 (C12-C18). Can? In addition, a polyethylene glycol-modified phospholipid, 1,2-dysteroyl-sn-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy (polyethylene glycol)] (mPEG-DSPE) can be used.

In una o pi? forme di attuazione, al solvente pu? essere aggiunto inoltre almeno un lipide, ad esempio appartenente alla classe degli steroli, ad esempio colesterolo. In one or more forms of implementation, the solvent can? at least one lipid, for example belonging to the class of sterols, for example cholesterol, may also be added.

Il solvente impiegabile nella fase di solubilizzazione dei fosfolipidi pu? essere selezionato nel gruppo costituito da cloroformio, diclorometano (DCM o cloruro di metilene), metanolo, etanolo e relative miscele. The solvent that can be used in the solubilization phase of the phospholipids can be selected from the group consisting of chloroform, dichloromethane (DCM or methylene chloride), methanol, ethanol and mixtures thereof.

In una o pi? forme di attuazione, la fase di evaporazione del solvente dalla prima soluzione pu? essere condotta a pressione ridotta e poi sottovuoto. Il solvente pu? essere allontanato per evaporazione, ad esempio utilizzando un evaporatore rotante sotto vuoto (Rotavapor<?>). L?evaporazione del solvente viene favorita dalla riduzione della pressione che abbassa la temperatura di ebollizione del solvente. In one or more embodiments, the phase of evaporation of the solvent from the first solution pu? be conducted under reduced pressure and then under vacuum. The solvent can be removed by evaporation, for example using a rotary vacuum evaporator (Rotavapor<?>). The evaporation of the solvent is favored by the reduction of the pressure which lowers the boiling temperature of the solvent.

Il sale contenuto nella soluzione tampone della fase di idratazione del film lipidico pu? essere selezionato tra citrato di sodio, fosfato di sodio, solfato di sodio, acetato di sodio, citrato di ammonio, fosfato di ammonio, solfato di ammonio e acetato di ammonio. Il pH della soluzione tampone comprendente un sale, preferibilmente citrato di sodio, pu? essere compreso tra 4 e 5. Gli Inventori hanno osservato che risultati ottimali in termini di resa di incapsulazione del principio attivo si ottengono quando il sale contenuto nella soluzione tampone ? citrato di sodio. Preferibilmente, il pH della soluzione tempone comprendente citrato di sodio ? pari a pH 4,38. In una o pi? forme di attuazione, in particolare quando il principio attivo ? imatinib, il procedimento non prevede l?impiego di solfato di ammonio. The salt contained in the buffer solution of the hydration phase of the lipid film can be selected from sodium citrate, sodium phosphate, sodium sulfate, sodium acetate, ammonium citrate, ammonium phosphate, ammonium sulfate and ammonium acetate. The pH of the buffer solution comprising a salt, preferably sodium citrate, can be between 4 and 5. The inventors have observed that optimal results in terms of encapsulation yield of the active ingredient are obtained when the salt contained in the buffer solution ? sodium citrate. Preferably, the pH of the temporary solution comprising sodium citrate is equal to pH 4.38. In one or more embodiments, in particular when the active principle ? imatinib, the process does not involve the use of ammonium sulphate.

La soluzione ottenuta nella fase di idratazione del film lipidico pu? essere sottoposta a sonicazione, ad esempio in bagno sonicatore, e ad agitazione, preferibilmente in un vortex fino a completo distacco del film lipidico. The solution obtained in the hydration phase of the lipid film can be subjected to sonication, for example in a sonicator bath, and to stirring, preferably in a vortex until complete detachment of the lipid film.

La soluzione pu? essere poi sottoposta a estrusione mediante l?impiego di un estrusore, preferibilmente a una temperatura compresa tra 20?C e 60?C, pi? preferibilmente pari a 40?C a ottenere la sospensione comprendente liposomi. The solution can then be subjected to extrusion using an extruder, preferably at a temperature between 20?C and 60?C, more? preferably equal to 40°C to obtain the suspension comprising liposomes.

L?estrusione pu? essere condotta sotto pressione di azoto, preferibilmente compresa tra 100 psi e 800 psi utilizzando filtri, preferibilmente di policarbonato, in cui il diametro dei pori pu? essere compreso tra 800 nm e 100 nm. The extrusion can be carried out under nitrogen pressure, preferably between 100 psi and 800 psi, using filters, preferably polycarbonate, in which the pore diameter can be be between 800 nm and 100 nm.

La sospensione comprendente liposomi pu? essere sottoposta a una fase di variazione del pH al fine di ottenere un pH della sospensione preferibilmente compreso tra 7 e 7,6. The suspension comprising liposomes can? be subjected to a pH variation step in order to obtain a pH of the suspension preferably between 7 and 7.6.

La fase di variazione del pH pu? essere condotta sottoponendo la sospensione a gel filtrazione su colonna impaccata, ad esempio con Sepharose CL-4B, eluendo con tampone, preferibilmente HEPES, pH 7,4. The pH change phase can? be carried out by subjecting the suspension to gel filtration on a packed column, for example with Sepharose CL-4B, eluting with buffer, preferably HEPES, pH 7.4.

Il principio attivo pu? essere aggiunto alla sospensione comprendente i liposomi disciolto in una soluzione tampone in una concentrazione compresa tra 0,1 mg/100 ?l e 1 mg/100 ?l, preferibilmente pari a 0,5 mg/100 ?l. La soluzione tampone pu? comprendere ad esempio HEPES e/o tampone fosfato. The active ingredient can be added to the suspension comprising the liposomes dissolved in a buffer solution in a concentration ranging from 0.1 mg/100 ?l to 1 mg/100 ?l, preferably equal to 0.5 mg/100 ?l. The buffer solution can include for example HEPES and/or phosphate buffer.

Il principio attivo pu? essere un inibitore di enzimi protein-chinasi, preferibilmente un inibitore di enzimi tirosin-chinasi, pi? preferibilmente selezionato nel gruppo costituito da imatinib, nintedanib e altri derivati appartenenti alla classe degli inibitori delle tirosinchinasi. The active ingredient can be a protein kinase enzyme inhibitor, preferably a tyrosine kinase enzyme inhibitor, more? preferably selected from the group consisting of imatinib, nintedanib and other derivatives belonging to the class of tyrosine kinase inhibitors.

La sospensione liposomiale addizionata del principio attivo pu? essere mantenuta per un periodo di tempo compreso tra 20 minuti e 60 minuti, preferibilmente pari a 30 minuti, ad una temperatura compresa tra 30?C e 40?C, preferibilmente pari a 37?C. The liposomal suspension with the addition of the active ingredient can? be maintained for a period of time comprised between 20 minutes and 60 minutes, preferably equal to 30 minutes, at a temperature comprised between 30°C and 40°C, preferably equal to 37°C.

La sospensione liposomiale pu? inoltre essere sottoposta a una fase di purificazione al fine di eliminare il principio attivo non incapsulato. The liposomal suspension can furthermore be subjected to a purification step in order to eliminate the non-encapsulated active ingredient.

La fase di purificazione pu? essere condotta mediante cromatografia per gel filtrazione o ad esclusione molecolare. The purification phase can be carried out by gel filtration or molecular exclusion chromatography.

In una o pi? forme di attuazione, il procedimento pu? consentire di produrre liposomi rivestiti con HA. A tale scopo, nella fase di idratazione del film lipidico pu? essere aggiunto HA alla soluzione tampone, preferibilmente HA con peso molecolare superiore a 17000 Dalton. In one or more forms of implementation, the procedure pu? allow to produce HA-coated liposomes. For this purpose, in the hydration phase of the lipid film it can be added HA to the buffer solution, preferably HA with a molecular weight greater than 17000 Dalton.

In particolare, l?HA viene aggiunto sotto forma di coniugato con almeno un fosfolipide (HA-f). In particular, HA is added in the form of a conjugate with at least one phospholipid (HA-f).

Con il termine coniugato si intende un prodotto ottenuto dalla reazione chimica tra due componenti che porta alla formazione di un legame covalente. The term conjugate means a product obtained from the chemical reaction between two components which leads to the formation of a covalent bond.

Tale coniugato HA-f si pu? ottenere mediante una reazione di aminazione riduttiva tra HA e un fosfolipide contenente un gruppo amminico, ad esempio fosfatidiletanolammina (PE). In questo coniugato solo una molecola di PE ? legata ad HA e il processo sintetico risulta particolarmente complesso con l?aumentare del peso molecolare di HA che nei precedenti lavori era compreso tra 4000 e 17000 Dalton. This HA-f conjugate can be obtained by a reductive amination reaction between HA and a phospholipid containing an amino group, for example phosphatidylethanolamine (PE). In this conjugate only one molecule of PE ? linked to HA and the synthetic process is particularly complex with the increase of the molecular weight of HA which in previous works was between 4000 and 17000 Dalton.

Per produrre HA-f, HA con peso molecolare superiore a 17000 Dalton, preferibilmente compreso tra 20000 e 60000 Dalton, pu? essere solubilizzato in almeno un solvente alogenato a ottenere una soluzione di HA solubilizzato. Preferibilmente, il solvente pu? comprendere DCM quale solvente alogenato. To produce HA-f, HA with a molecular weight greater than 17,000 Daltons, preferably between 20,000 and 60,000 Daltons, can be solubilized in at least one halogenated solvent to obtain a solubilized HA solution. Preferably, the solvent can include DCM as a halogenated solvent.

In una o pi? forme di attuazione, il solvente pu? comprendere DCM e dimetilsolfossido (DMSO), preferibilmente in un rapporto in peso 1:1. La fase di solubilizzazione di HA pu? essere condotta mediante sonicazione, preferibilmente in bagno sonicatore, pi? preferibilmente per un periodo compreso tra 30 minuti e 120 minuti, preferibilmente pari a 90 minuti. In one or more embodiments, the solvent can? comprising DCM and dimethyl sulfoxide (DMSO), preferably in a 1:1 weight ratio. The solubilization phase of HA can be conducted by sonication, preferably in a sonicator bath, more? preferably for a period of between 30 minutes and 120 minutes, preferably equal to 90 minutes.

HA, in particolare con peso molecolare superiore a 17000 Dalton pu? essere aggiunto al solvente in una concentrazione compresa tra 0,02 mmol e 0,1 mmol. HA, in particular with molecular weight higher than 17000 Dalton can? be added to the solvent in a concentration between 0.02 mmol and 0.1 mmol.

La soluzione comprendente HA solubilizzato pu? venire riscaldata a una temperatura compresa tra 40?C e 70?C, preferibilmente pari a 60?C. The solution comprising solubilized HA can? be heated to a temperature between 40°C and 70°C, preferably equal to 60°C.

Alla soluzione comprendente HA solubilizzato viene aggiunto il fosfolipide comprendente un gruppo amminico, preferibilmente DPPE, a ottenere una miscela comprendente HA e fosfolipide comprendente un gruppo amminico. The phospholipid comprising an amino group, preferably DPPE, is added to the solution comprising solubilized HA to obtain a mixture comprising HA and a phospholipid comprising an amino group.

In una o pi? forme di attuazione, il fosfolipide comprendente un gruppo amminico viene aggiunto solubilizzato in solvente, preferibilmente comprendente cloroformio e metanolo. Preferibilmente, la miscela pu? comprendere cloroformio e metanolo in un rapporto in peso 1:1. Il fosfolipide pu? essere aggiunto al solvente in una concentrazione compresa tra 0,02 mmol e 0,1 mmol. In one or more embodiments, the phospholipid comprising an amino group is added solubilized in solvent, preferably comprising chloroform and methanol. Preferably, the mixture can comprise chloroform and methanol in a 1:1 weight ratio. The phospholipid can be added to the solvent in a concentration between 0.02 mmol and 0.1 mmol.

La miscela comprendente HA e fosfolipide comprendente un gruppo amminico viene portata a una temperatura compresa tra 18?C e 24?C, preferibilmente pari a 20?C (temperatura ambiente). The mixture comprising HA and a phospholipid comprising an amino group is brought to a temperature ranging from 18°C to 24°C, preferably equal to 20°C (ambient temperature).

La miscela pu? essere sottoposta a variazione del pH al fine di portate il pH a un valore di 4,5. L?aggiustamento del pH pu? essere condotto mediante aggiunta di un acido, ad esempio acido acetico. The mixture can be subjected to pH variation in order to bring the pH to a value of 4.5. The pH adjustment can? be carried out by adding an acid, for example acetic acid.

La miscela pu? essere portata a una temperatura compresa tra 40?C e 70?C, preferibilmente pari a 60?C per un periodo di tempo compreso tra 1 ora e 3 ore, pi? preferibilmente pari a 2 ore. The mixture can be brought to a temperature between 40?C and 70?C, preferably equal to 60?C for a period of time between 1 hour and 3 hours, plus? preferably equal to 2 hours.

La miscela comprendente HA e fosfolipide comprendente un gruppo amminico viene addizionata di almeno un agente riducente a ottenere una soluzione comprendente il coniugato HA-f. L?agente riducente pu? essere selezionato tra boroidruri, cianoboroidruro di sodio e sodio triacetossiboroidruro (STAB). Preferibilmente, l?agente riducente ? un boroidruro, pi? preferibilmente STAB. The mixture comprising HA and phospholipid comprising an amino group is added with at least one reducing agent to obtain a solution comprising the HA-f conjugate. The reducing agent can? be selected from borohydride, sodium cyanoborohydride and sodium triacetoxyborohydride (STAB). Preferably, the reducing agent ? a borohydride, pi? preferably STAB.

La soluzione comprendente il coniugato HA-f pu? essere mantenuta a una temperatura compresa tra 50?C e 70?C, preferibilmente 60?C per un periodo di tempo compreso tra 80 ore e 120 ore, preferibilmente per un periodo di 96 ore. The solution comprising the HA-f conjugate can? be maintained at a temperature ranging from 50°C to 70°C, preferably 60°C for a period of time ranging from 80 hours to 120 hours, preferably for a period of 96 hours.

La soluzione pu? essere sottoposta a purificazione ed opzionalmente lavaggio. The solution can be subjected to purification and optionally washing.

La purificazione pu? essere condotta mediante dialisi. Il lavaggio pu? essere condotto ad esempio con DCM. La soluzione pu? successivamente essere sottoposta a una fase di liofilizzazione a ottenere il coniugato HA-f liofilizzato. The purification can be conducted by dialysis. Washing can be conducted for example with DCM. The solution can subsequently be subjected to a freeze-drying step to obtain the freeze-dried HA-f conjugate.

Il coniugato liofilizzato pu? essere solubilizzato ed aggiunto al film lipidico in fase di idratazione, in particolare nella soluzione tampone comprendente un sale, cos? da ottenere liposomi rivestiti con HA contenenti un principio attivo. In una o pi? forme di attuazione, il rapporto in peso tra acido ialuronico e fosfolipidi di membrana ? compreso tra 1 e 5. The freeze-dried conjugate can be solubilized and added to the lipid film in the hydration phase, in particular in the buffer solution comprising a salt, so? to obtain HA-coated liposomes containing an active ingredient. In one or more embodiments, the weight ratio between hyaluronic acid and membrane phospholipids ? between 1 and 5.

In una o pi? forme di attuazione, al fine di ottenere liposomi fluorescenti, nella fase di idratazione del film lipidico pu? essere aggiunto alla soluzione tampone almeno un composto in grado di emettere fluorescenza, ad esempio fluoresceina. In one or more embodiments, in order to obtain fluorescent liposomes, in the hydration phase of the lipid film can? At least one compound capable of emitting fluorescence, for example fluorescein, should be added to the buffer solution.

I liposomi ottenuti con il procedimento descritto possono presentare un diametro medio compreso tra 100 nm e 300 nm, eseguendo la determinazione con la tecnica quasielastic light scattering (QELS). The liposomes obtained with the described process can have an average diameter between 100 nm and 300 nm, by carrying out the determination with the quasielastic light scattering technique (QELS).

In caso di liposomi non rivestiti il diametro ? preferibilmente pari a circa 200 nm; nel caso di liposomi rivestiti con HA il diametro ? preferibilmente pari a circa 250 nm. La presenza di HA sulla superficie dei liposomi determina pertanto un aumento del valore del diametro medio delle particelle. Inoltre, il valore di potenziale Z pu? essere pari a circa -30 mV per i liposomi non rivestiti e leggermente pi? negativo, pari a circa -33 mV, per i liposomi rivestiti con HA, per la presenza dei gruppi carbossilici dell?HA caricati negativamente. In the case of uncoated liposomes, the diameter? preferably equal to about 200 nm; in the case of HA-coated liposomes, the diameter ? preferably equal to about 250 nm. The presence of HA on the surface of the liposomes therefore determines an increase in the value of the mean diameter of the particles. Furthermore, the potential value Z pu? be equal to about -30 mV for uncoated liposomes and slightly more? negative, equal to approximately -33 mV, for liposomes coated with HA, due to the presence of the negatively charged carboxyl groups of HA.

Esempio di preparazione e caratterizzazione di liposomi contenenti imatinib Example of preparation and characterization of imatinib-containing liposomes

Per la preparazione dei liposomi ? stata utilizza una composizione comprendente 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DSPC), colesterolo (COL) e fosfatidilglicerolo (PG) in un rapporto molare pari a 70:30:3. For the preparation of liposomes ? A composition comprising 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC), cholesterol (COL) and phosphatidylglycerol (PG) in a molar ratio of 70:30:3 was used.

I componenti sono stati solubilizzati in cloroformio e quindi si ? preparato il film lipidico per evaporazione del solvente a pressione ridotta al Rotavapor<? >e poi sotto vuoto. The components have been solubilized in chloroform and therefore yes? prepared the lipid film by evaporation of the solvent under reduced pressure on the Rotavapor<? >and then under vacuum.

Successivamente il film lipidico ? stato idratato con tampone citrato (soluzione di acido citrico e sodio citrato, pH 4,38), sonicato e agitato al vortex. I liposomi sono stati estrusi sotto pressione di azoto su filtri di policarbonato (diametro dei pori 400 e 200 nm) mediante estrusore (Extruder; Lipex, Vancouver, Canada) a una temperatura di 40?C. Poi sono stati sottoposti a gel filtrazione su colonna impaccata con Sepharose CL-4B eluendo con tampone HEPES pH 7,4 per modificare il pH della sospensione liposomiale. Alla sospensione liposomiale ? stata poi aggiunta una soluzione di imatinib mesilato in tampone HEPES (0,5 mg/100 ?l) ed ? stata mantenuta in incubazione per 30 minuti a 37?C; la preparazione liposomiale ? stata poi purificata su colonna impaccata con Sepharose CL-4B eluendo con tampone HEPES pH 7,4 eliminando il principio attivo non incapsulato per gel filtrazione. Subsequently the lipid film ? was hydrated with citrate buffer (solution of citric acid and sodium citrate, pH 4.38), sonicated and vortexed. The liposomes were extruded under nitrogen pressure on polycarbonate filters (pore diameter 400 and 200 nm) by means of an extruder (Extruder; Lipex, Vancouver, Canada) at a temperature of 40°C. Then they were subjected to gel filtration on a column packed with Sepharose CL-4B eluting with HEPES buffer pH 7.4 to modify the pH of the liposomal suspension. To liposomal suspension ? was then added a solution of imatinib mesylate in HEPES buffer (0.5 mg/100 ?l) and ? incubated for 30 minutes at 37°C; the liposomal preparation ? it was then purified on a column packed with Sepharose CL-4B eluting with HEPES buffer pH 7.4 eliminating the unencapsulated active principle by gel filtration.

Per ottenere i liposomi rivestiti con HA ? stato utilizzato lo stesso procedimento sostituendo il PG con il coniugato HA-f. Il coniugato HA-f ? stato ottenuto coniugando HA di peso molecolare 44000 Da con il fosfolipide 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (DPPE). To obtain HA-coated liposomes? The same procedure was used replacing the PG with the HA-f conjugate. The conjugate HA-f ? was obtained by conjugating HA of molecular weight 44000 Da with the phospholipid 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DPPE).

La reazione ? stata condotta seguendo la sintesi riportata nella pubblicazione scientifica Hyaluronic acidcoated liposomes for active targeting of gemcitabine. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics (2013) 85:373?380 con alcune modifiche per poter fare avvenire la reazione di coniugazione utilizzando un polimero a peso molecolare decisamente pi? elevato, come descritto nel seguito. The reaction ? was conducted following the synthesis reported in the scientific publication Hyaluronic acid coated liposomes for active targeting of gemcitabine. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics (2013) 85:373?380 with some modifications to be able to make the conjugation reaction take place using a polymer with a decidedly higher molecular weight. elevated, as described below.

Il coniugato HA-f ? stato ottenuto mediante una reazione di aminazione riduttiva tra HA e un fosfolipide contenente un gruppo aminico (PE). In questo coniugato solo una molecola di PE ? legata ad HA e il processo sintetico risulta particolarmente complesso con l?aumentare del peso molecolare di HA che nei precedenti lavori era compreso tra 4000 Da e 17000 Da. The conjugate HA-f ? was obtained by a reductive amination reaction between HA and a phospholipid containing an amino group (PE). In this conjugate only one molecule of PE ? linked to HA and the synthetic process is particularly complex with the increase of the molecular weight of HA which in previous works was between 4000 Da and 17000 Da.

HA con peso molecolare di 44000 Da ? stato solubilizzato in una miscela di DCM e DMSO (1:1) in bagno sonicatore per 90 minuti. HA with a molecular weight of 44000 Da ? was solubilized in a mixture of DCM and DMSO (1:1) in a sonicator bath for 90 minutes.

Successivamente, la soluzione ? stata riscaldata a 60?C e si ? aggiunta una quantit? equimolare di DPPE solubilizzato in una miscela 1:1 di cloroformio e metanolo. Next, the solution? been heated to 60?C and yes ? added a quantity? equimolar of DPPE solubilized in a 1:1 mixture of chloroform and methanol.

La soluzione ? stata poi portata a temperatura ambiente, acidificata a pH 4,5 con acido acetico e quindi lasciata per 2 ore a 60?C. The solution ? it was then brought to room temperature, acidified to pH 4.5 with acetic acid and then left for 2 hours at 60°C.

Infine ? stato aggiunto STAB solubilizzato nella stessa miscela di DPPE e la reazione procede per 96 ore a 60?C. In the end ? STAB solubilized in the same mixture of DPPE was added and the reaction proceeded for 96 hours at 60°C.

Al termine della reazione la miscela ? stata dializzata contro acqua e successivamente lavata pi? volte con DCM e infine liofilizzata. Il coniugato ? stato solubilizzato in tampone citrato e aggiunto al film lipidico in fase di idratazione. At the end of the reaction the mixture ? been dialyzed against water and subsequently washed pi? times with DCM and finally freeze-dried. The conjugate ? was solubilized in citrate buffer and added to the lipid film during hydration.

I liposomi fluorescenti sono stati preparati aggiungendo una soluzione di fluoresceina in tampone HEPES durante la fase di idratazione del film lipidico e quindi sottoposti a estrusione e purificazione per gel filtrazione. Le preparazioni liposomiali sono state conservate a una temperatura di 4?C. The fluorescent liposomes were prepared by adding a solution of fluorescein in HEPES buffer during the hydration step of the lipid film and then subjected to extrusion and purification by gel filtration. The liposomal preparations were stored at a temperature of 4°C.

Il diametro medio e l?indice di polidispersione dei liposomi sono stati determinati a 25?C mediante la tecnica quasi-elastic light scattering (QELS) e la carica superficiale ? stata valutata tramite determinazione del potenziale Z eseguendo le misurazioni in triplicato. La morfologia dei liposomi ? stata determinata mediante analisi cryo-TEM (cryogenic-Transmission Electron Microscopy). L?indice di polidispersione ? risultato inferiore a 0,2 per i liposomi privi di rivestimento e per i liposomi rivestiti con HA oggetto della presente descrizione. The mean diameter and the polydispersion index of the liposomes were determined at 25°C by the quasi-elastic light scattering (QELS) technique and the surface charge ? was evaluated by determination of the Z potential by performing the measurements in triplicate. The morphology of liposomes ? was determined by cryo-TEM (cryogenic-Transmission Electron Microscopy) analysis. The polydispersion index ? result lower than 0.2 for the uncoated liposomes and for the HA-coated liposomes object of the present description.

La quantit? di imatinib incapsulato nei liposomi ? stata determinata mediante RP-HPLC. A tale scopo frazioni liposomiali sono state diluite con acetonitrile (di un fattore differente a seconda della concentrazione presunta di imatinib), la miscela ? stata sonicata, agitata al vortex, centrifugata ed il surnatante ? stato filtrato (0.45 ?m PTFE) ed analizzato all?HPLC (le condizioni analitiche utilizzate sono descritte nell?articolo scientifico Imatinib assay by HPLC with photodiode-array UV detection in plasma from patients with chronic myeloid leukemia: comparison with LC-MS/MS Clinica Chimica Acta (2010) 411:140?146). La quantit? di imatinib incapsulato nei liposomi ? risultato compreso tra 0,35 mg/100 ?l e 0,40 mg/100 ?l. The quantity? of imatinib encapsulated in liposomes ? was determined by RP-HPLC. For this purpose, liposomal fractions were diluted with acetonitrile (by a different factor depending on the presumed concentration of imatinib), the mixture ? been sonicated, vortexed, centrifuged and the supernatant ? was filtered (0.45 µm PTFE) and analyzed by HPLC (the analytical conditions used are described in the scientific article Imatinib assay by HPLC with photodiode-array UV detection in plasma from patients with chronic myeloid leukemia: comparison with LC-MS/MS Clinica Chimica Acta (2010) 411:140?146). The quantity? of imatinib encapsulated in liposomes ? result between 0.35 mg/100 ?l and 0.40 mg/100 ?l.

La concentrazione lipidica ? stata determinata tramite l?analisi del fosforo, come descritto in Phosphorus assay in column chromatography J Biol Chem. (1959) 234:466-468. E? stata determinata una concentrazione lipidica mediamente pari a 3,8 mM. The lipid concentration? was determined by phosphorus analysis, as described in Phosphorus assay in column chromatography J Biol Chem. (1959) 234:466-468 . AND? an average lipid concentration of 3.8 mM was determined.

La cinetica di rilascio di imatinib ? stata valutata ponendo in incubazione formulazioni liposomiali con e senza HA a 37?C in tampone HEPES o in siero. A tempi stabiliti ? stata prelevata un?aliquota di formulazione liposomiale, purificata per gel filtrazione e la quantit? di principio attivo incapsulato ? stata determinata per HPLC, confrontandola con il valore iniziale. La stabilit? fisica dei liposomi ? stata valutata nelle condizioni di stoccaggio (4?C) monitorando a intervalli di tempo stabiliti il diametro medio, il potenziale Z e la quantit? di farmaco incapsulato. Test di efficacia in vitro The release kinetics of imatinib ? was evaluated by incubating liposomal formulations with and without HA at 37°C in HEPES buffer or in serum. At set times? an aliquot of liposomal formulation was taken, purified by gel filtration and the quantity? of encapsulated active ingredient ? was determined by HPLC, comparing it with the initial value. The stability? physics of liposomes ? been evaluated in storage conditions (4?C) by monitoring at established time intervals the mean diameter, the potential Z and the quantity? of encapsulated drug. In vitro efficacy test

I test sono stati condotti su una linea immortalizzata di human lung carcinoma (A549) e linee primarie di mio/fibroblasti (LFs) isolati dal lavaggio bronco-alveolare (BAL) di pazienti affetti da CLAD o da ILD-CTD. Tutte queste linee presentano un elevato rate di espressione del CD44. The tests were conducted on an immortalized line of human lung carcinoma (A549) and primary lines of myo/fibroblasts (LFs) isolated from the broncho-alveolar lavage (BAL) of patients affected by CLAD or ILD-CTD. All these lines show a high rate of CD44 expression.

L?isolamento dei LFs ? stato effettuato seguendo la procedura descritta nell?articolo scientifico Antibodyengineered nanoparticles selectively inhibit mesenchymal cells isolated from patients with chronic lung allograft dysfunction. Nanomedicine (Lond) (2015) 10:9-23. The isolation of the LFs ? was carried out following the procedure described in the scientific article Antibodyengineered nanoparticles selectively inhibit mesenchymal cells isolated from patients with chronic lung allograft dysfunction. Nanomedicines (Lond) (2015) 10:9-23.

In breve, i BAL di pazienti affetti da CLAD e ILD-CTD sono dapprima filtrati con garze sterili e conseguentemente centrifugati a 1800 rpm per 10 minuti. Il surnatante viene raccolto e stoccato a -20?C, mentre il pellet cellulare viene risospeso con soluzione fisiologica e centrifugato di nuovo a 1800 rpm per 10 minuti. Il pellet ottenuto viene contato per coltivare 6 x 10<6 >cellule in medium di coltura DMEM con aggiunta del 10% di siero fetale bovino (FBS) e 1% di penicillina/streptomicina e L-glutammina. Dopo circa 10-15 giorni si formano foci di LFs che vengono isolati e coltivati per gli esperimenti. Le cellule utilizzate esprimono elevati livelli della proteina CD44, come descritto nell?articolo scientifico Antibody-engineered nanoparticles selectively inhibit mesenchymal cells isolated from patients with chronic lung allograft dysfunction. Nanomedicine (Lond). (2015) 10: 9-23. Briefly, the BALs of patients affected by CLAD and ILD-CTD are first filtered with sterile gauze and subsequently centrifuged at 1800 rpm for 10 minutes. The supernatant is collected and stored at -20°C, while the cell pellet is resuspended with saline and centrifuged again at 1800 rpm for 10 minutes. The obtained pellet is counted to cultivate 6 x 10<6 > cells in DMEM culture medium with the addition of 10% fetal bovine serum (FBS) and 1% penicillin/streptomycin and L-glutamine. After about 10-15 days, foci of LFs are formed which are isolated and cultured for the experiments. The cells used express high levels of the CD44 protein, as described in the scientific article Antibody-engineered nanoparticles selectively inhibit mesenchymal cells isolated from patients with chronic lung allograft dysfunction. Nanomedicines (Lond). (2015) 10:9-23.

Al fine di testare l?efficacia di internalizzazione dei liposomi modificati con HA nelle cellule esprimenti CD44, 0,2 x 10<6 >cellule di A549 o LFs sono state piastrate e dopo 24 h di coltura per permettere l?adesione cellulare, sono state incubate con liposomi fluorescenti non rivestiti o rivestiti con HA (LIP e LIP-HA) per 4 e 24 h a 37?C. In order to test the internalization efficacy of HA-modified liposomes in CD44-expressing cells, 0.2 x 10<6>A549 cells or LFs were plated and after 24 h of culture to allow cell adhesion, were incubated with uncoated or HA-coated fluorescent liposomes (LIP and LIP-HA) for 4 and 24 h at 37°C.

Dopo il trattamento le cellule sono state analizzate mediante citofluorimetria e microscopio confocale, dimostrando che i LIP-HA entrano con maggior efficienza sia nelle A549 che nelle LFs di CLAD e ILD-CTD, rispetto ai LIP. After treatment the cells were analyzed by flow cytometry and confocal microscopy, demonstrating that LIP-HAs enter both A549 and LFs of CLAD and ILD-CTD more efficiently than LIPs.

Le analisi al microscopio confocale confermano la maggior internalizzazione dei LIP-HA rispetto ai LIP, dimostrando inoltre che i liposomi internalizzati sia dalle A549 che dai LFs colocalizzano con gli endosomi cellulari. Confocal microscopy analyzes confirmed the greater internalization of LIP-HAs compared to LIPs, further demonstrating that the liposomes internalized by both A549 and LFs colocalize with cellular endosomes.

Dimostrata la maggiore efficienza dei LIP-HA rispetto ai LIP nell?essere internalizzati da cellule esprimenti CD44, gli Inventori hanno valutato l?effetto di liposomi contenenti imatinib quale principio attivo sulla vitalit? cellulare utilizzando sia le A549 che i LFs derivati da CLAD e ILD-CTD. Il saggio di vitalit? ? stato effettuato mediante saggio MTT che d? la possibilit? di quantificare la vitalit? cellulare mediante l?attivit? mitocondriale. 3 x 10<3 >cellule di A549 o LFs sono state piastrate e incubate con LIP-HAIm, LIPIm, imatinib incubando a parit? di concentrazione di imatinib (30 uM) fino a 72 h. Having demonstrated the greater efficiency of LIP-HA compared to LIP in being internalized by CD44-expressing cells, the inventors evaluated the effect of liposomes containing imatinib as the active ingredient on the vitality cell using both A549 and CLAD- and ILD-CTD-derived LFs. The essay of vitality? ? been carried out by means of essay MTT that d? the possibility? to quantify the vitality? cell phone through the activity? mitochondrial. 3 x 10<3>A549 cells or LFs were plated and incubated with LIP-HAIm, LIPIm, imatinib incubating parity? of imatinib concentration (30 uM) up to 72 h.

Questi esperimenti hanno dimostrato che LIP-HAIm e LIPIm riducono del 30% la vitalit? dei LFs, mentre imatinib ne riduce la vitalit? dell?80%. Nel caso delle A549, dopo 72 h di trattamento si osserva un?aumentata riduzione della vitalit? cellulare da parte dei LIP-HAIm (30%) rispetto ai LIPIm (0%). Inoltre in questa linea cellulare LIP-HAIm esercitano lo stesso effetto di imatinib da solo (30%) (Figura 1). These experiments have shown that LIP-HAIm and LIPIm reduce the vitality of 30%? of the LFs, while imatinib reduces its vitality? by 80%. In the case of A549, after 72 hours of treatment is observed an increased reduction of vitality? by LIP-HAIm (30%) compared to LIPIm (0%). Furthermore, in this cell line LIP-HAIm exert the same effect as imatinib alone (30%) (Figure 1).

Sapendo che il principio attivo imatinib ha come target specifico cAbl, si ? deciso di valutare l?efficacia dei LIP-HAIm di inibire l?attivit? di cAbl solo nei LFs CLAD e ILD-CTD. Per studiare l?attivit? di cAbl si valuta il livello di fosforilazione della proteina. Knowing that the active ingredient imatinib specifically targets cAbl, yes? decided to evaluate the effectiveness of LIP-HAIm to inhibit the activity? of cAbl only in CLAD and ILD-CTD LFs. To study the activity? of cAbl the level of phosphorylation of the protein is evaluated.

Analisi western blot hanno dimostrato, per quanto riguarda i LFs derivati da pazienti affetti da CLAD, una riduzione dell?attivit? di cAbl del 50% sia con LIPIm che con LIP-HAIm, dopo 24 h di trattamento. Analizzando i LFs derivati da ILD-CTD si osserva una diversa attivit? di LIPIm e LIP-HAIm, dove LIPIm riduce del 60% l?attivit? di cAbl, mentre LIP-HAIm la riduce del 70%. Interessante ? notare come imatinib, sia per le cellule derivate da CLAD sia da ILD-CTD, non ha effetto dopo 24 h sull?attivit? di cAbl (Figura 2A). Western blot analyzes have demonstrated, as regards the LFs derived from patients affected by CLAD, a reduction of? cAbl of 50% with both LIPIm and LIP-HAIm, after 24 h of treatment. Analyzing the LFs derived from ILD-CTD we observe a different activity? of LIPIm and LIP-HAIm, where LIPIm reduces by 60% the activity? of cAbl, while LIP-HAIm reduces it by 70%. Interesting ? note how imatinib, both for cells derived from CLAD and from ILD-CTD, has no effect after 24 h on the activity? of cAbl (Figure 2A).

Infine, mediante analisi western blot ? stata valutata la produzione di collagene di tipo 1a1, fattore chiave della matrice extracellulare che compone le lesioni fibrotiche, dopo 24 h di trattamento con LIP-HAIm, LIPIm e imatinib da solo, sempre a parit? di imatinib (30 uM). Finally, by western blot analysis ? Was the production of type 1a1 collagen, a key factor of the extracellular matrix that makes up the fibrotic lesions, evaluated after 24 hours of treatment with LIP-HAIm, LIPIm and imatinib alone, always equal? of imatinib (30 uM).

Gli Inventori hanno dimostrato che nel caso dei LFs derivati da CLAD, imatinib veicolato dai LIP-HA riduce del 30% la produzione di collagene, mentre LIPIm la riduce del 20%. Riguardo ai LFs derivati da ILD-CTD si ? osservata una riduzione dell?espressione di collagene del 60% dopo trattamento con LIP-HAIm e LIPIm. Imatinib da solo ha mostrato una attivit? nel ridurre l?espressione di collagene del 50% nei LFs CLAD e del 60% nei LFs ILD-CTD (Figura 2B). Questi risultati dimostrano che l?incapsulazione del principio attivo all?interno dei liposomi non ne modifica le propriet? molecolari, ma ne mantiene l?attivit? specifica. The inventors demonstrated that in the case of CLAD-derived LFs, imatinib delivered by LIP-HA reduces collagen production by 30%, while LIPIm reduces it by 20%. Regarding LFs derived from ILD-CTD yes? observed a reduction of collagen expression by 60% after treatment with LIP-HAIm and LIPIm. Imatinib alone showed an activity? in reducing collagen expression by 50% in CLAD LFs and by 60% in ILD-CTD LFs (Figure 2B). These results demonstrate that the encapsulation of the active principle inside the liposomes does not modify its properties. molecular, but maintains the? activity? specific.

Considerato il fatto che i macrofagi sono i principali key player nel processo infiammatorio delle patologie sopra citate, ? stata valutata anche la capacit? di interazione dei LIP e dei LIP-HA con i monociti derivati da sangue periferico. Analisi al microscopio confocale hanno mostrato che i LIP-HA interagiscono maggiormente con i monociti rispetto ai LIP (Figura 3). Given the fact that macrophages are the main key players in the inflammatory process of the aforementioned pathologies, ? was also evaluated the ability? interaction of LIP and LIP-HA with monocytes derived from peripheral blood. Confocal microscopy analysis showed that LIP-HAs interact more with monocytes than LIPs (Figure 3).

Nella maggior parte dei casi viene utilizzato il metodo di idratazione del film lipidico seguito da estrusione, sia per l?incapsulazione del principio attivo nativo (come descritto in Efficacy of targeted liposomes and nanocochleates containing imatinib plus dexketoprofen against fibrosarcoma Drug Dev Res. (2019) 80:556?565; Antiproliferative activity and VEGF expression reduction in MCF7 and PC-3 cancer cells by paclitaxel and imatinib coencapsulation in folate-targeted liposomes AAPS Pharm Sci Tech. (2018) 19:201-211) sia per il coniugato con sodio desossicolato [come descritto in Hyaluronan coated liposomes as the intravenous platform for delivery of imatinib mesylate in MDR colon cancer. International Journal of Biological Macromolecules (2015) 73:222?235]. Nel procedimento in oggetto, il principio attivo viene inserito nel core acquoso dei liposomi avvalendosi della tecnica del gradiente di pH utilizzando tampone citrato. Questa tecnica permette di ottenere la precipitazione del principio attivo nel core acquoso dei liposomi con una elevata efficienza di incapsulazione, pari all?85% per l?imatinib, superiore rispetto a quella ottenuta utilizzando una soluzione di ammonio solfato (70%), gi? descritta in precedenza (Folate receptor targeted liposomes enhanced the antitumor potency of imatinib through the combination of active targeting and molecular targeting International Journal of Nanomedicine (2014) 9:2167?2177). La maggiore resa di incapsulazione ottenuta utilizzando il tampone citrato piuttosto che la soluzione di solfato di ammonio pu? derivare dalla maggiore solubilit? del principio attivo nel tampone citrato (S= 330 mg/ml, pH=4,38), rispetto a quella in solfato di ammonio (S= 280 mg/ml, pH=5,75). La solubilit? di imatinib in tampone citrato e nella soluzione di ammonio solfato ? stata determinata preparando una sospensione del principio attivo in ognuno dei due mezzi, incubandola a 25?C per 24 ore ed analizzando il filtrato via HPLC. In most cases the method of hydration of the lipid film followed by extrusion is used, both for the encapsulation of the native active substance (as described in Efficacy of targeted liposomes and nanocochleates containing imatinib plus dexketoprofen against fibrosarcoma Drug Dev Res. (2019) 80:556?565; Antiproliferative activity and VEGF expression reduction in MCF7 and PC-3 cancer cells by paclitaxel and imatinib coencapsulation in folate-targeted liposomes AAPS Pharm Sci Tech. (2018) 19:201-211) both for the sodium conjugate deoxycholate [as described in Hyaluronan coated liposomes as the intravenous platform for delivery of imatinib mesylate in MDR colon cancer. International Journal of Biological Macromolecules (2015) 73:222?235]. In the process in question, the active ingredient is inserted into the aqueous core of the liposomes using the pH gradient technique using citrate buffer. This technique allows to obtain the precipitation of the active principle in the aqueous core of the liposomes with a high encapsulation efficiency, equal to 85% for imatinib, higher than that obtained using an ammonium sulphate solution (70%), already? previously described (Folate receptor targeted liposomes enhanced the antitumor potency of imatinib through the combination of active targeting and molecular targeting International Journal of Nanomedicine (2014) 9:2167?2177 ). The higher encapsulation yield achieved by using citrate buffer rather than ammonium sulfate solution can derive from the greater solubility? of the active ingredient in citrate buffer (S= 330 mg/ml, pH=4.38), compared to that in ammonium sulphate (S= 280 mg/ml, pH=5.75). The solubility? of imatinib in citrate buffer and ammonium sulfate solution ? was determined by preparing a suspension of the active principle in each of the two media, incubating it at 25°C for 24 hours and analyzing the filtrate via HPLC.

La peculiare caratteristica dei liposomi oggetto della presente descrizione ? quella di agire preferenzialmente su fibroblasti e cellule infiammatorie (in particolare i macrofagi ed i linfociti che esprimono CD44) che sono i principali effettori (key players) delle patologie fibrosanti croniche progressive. Sui miofibroblasti, in particolare, essi agiscono inibendone la proliferazione, la migrazione e la deposizione di matrice extracellulare. The peculiar characteristic of the liposomes object of the present description? that of acting preferentially on fibroblasts and inflammatory cells (in particular macrophages and lymphocytes expressing CD44) which are the main effectors (key players) of chronic progressive fibrosing pathologies. On myofibroblasts, in particular, they act by inhibiting their proliferation, migration and deposition of extracellular matrix.

Una o pi? forme di attuazione della presente descrizione possono pertanto prevedere liposomi rivestiti con acido ialuronico (HA), in cui l?acido ialuronico presenta un peso molecolare superiore a 17000 Dalton, preferibilmente compreso tra 20000 Dalton e 60000 Dalton. One or more? embodiments of the present description can therefore provide liposomes coated with hyaluronic acid (HA), wherein the hyaluronic acid has a molecular weight greater than 17,000 Daltons, preferably between 20,000 Daltons and 60,000 Daltons.

In una o pi? forme di attuazione i liposomi possono presentare una dimensione media del diametro dei liposomi compresa tra 100 nm e 300 nm, preferibilmente pari a 250 nm. In una o pi? forme di attuazione, i liposomi possono presentare un valore di potenziale Z compreso tra -10 mV e -50 mV, preferibilmente di -33 mV. In one or more embodiments, the liposomes can have an average size of the liposome diameter between 100 nm and 300 nm, preferably equal to 250 nm. In one or more embodiments, the liposomes can have a Z potential value between -10 mV and -50 mV, preferably -33 mV.

I liposomi possono presentare HA legato covalentemente alla testa di un fosfolipide del doppio strato lipidico della membrana liposomiale. In una o pi? forme di attuazione, l?HA ? legato a un gruppo amminico della testa di un fosfolipide di membrana. Liposomes may have HA covalently bound to the head of a phospholipid of the lipid bilayer of the liposomal membrane. In one or more forms of implementation, the? HA ? bound to an amino group of the head of a membrane phospholipid.

In una o pi? forme di attuazione, i liposomi possono comprendere almeno un principio attivo, preferibilmente un inibitore di enzimi protein-chinasi, pi? preferibilmente selezionato nel gruppo costituito da imatinib, nintedanib e altri derivati appartenenti alla classe degli inibitori delle tirosin-chinasi. In one or more embodiments, the liposomes may comprise at least one active ingredient, preferably a protein kinase enzyme inhibitor, plus? preferably selected from the group consisting of imatinib, nintedanib and other derivatives belonging to the class of tyrosine kinase inhibitors.

In una o pi? forme di attuazione, la descrizione fornisce una composizione comprendente i liposomi descritti. Tale composizione pu? comprendere inoltre almeno un veicolo farmaceuticamente accettabile. La composizione pu? inoltre comprendere, in una o pi? forme di attuazione, diluenti e/o eccipienti, anche per una somministrazione inalatoria. In one or more embodiments, the disclosure provides a composition comprising the described liposomes. This composition can further comprising at least one pharmaceutically acceptable carrier. The composition can also include, in one or more? embodiments, diluents and/or excipients, also for inhalational administration.

In una o pi? forme di attuazione, i liposomi e/o la composizione che li comprendono possono essere destinati ad un uso in medicina, preferibilmente per una somministrazione inalatoria, pi? preferibilmente per l?uso nel trattamento di almeno una patologia respiratoria, ancor pi? preferibilmente almeno una patologia fibrotica polmonare, ad esempio selezionata tra fibrosi polmonare idiopatica, fibrosi polmonare associata a malattie del collagene, bronchiolite obliterante. In one or more embodiments, the liposomes and/or the composition comprising them can be intended for use in medicine, preferably for inhalational administration, more preferably for use in the treatment of at least one respiratory condition, even more? preferably at least one pulmonary fibrotic pathology, for example selected from idiopathic pulmonary fibrosis, pulmonary fibrosis associated with collagen diseases, bronchiolitis obliterans.

In una o pi? forme di attuazione, la descrizione prevede un procedimento per la produzione di liposomi per veicolare almeno un principio attivo comprendente le fasi di: In one or more embodiments, the description provides a process for the production of liposomes to deliver at least one active ingredient comprising the steps of:

- solubilizzare almeno un fosfolipide in un solvente, preferibilmente un solvente alogenato, e ottenere una prima soluzione, - solubilizing at least one phospholipid in a solvent, preferably a halogenated solvent, and obtaining a first solution,

- far evaporare il solvente da detta prima soluzione e ottenere un film lipidico, - evaporate the solvent from said first solution and obtain a lipid film,

- idratare il film lipidico in una soluzione comprendente almeno un sale, preferibilmente selezionato tra sale di sodio, sale di potassio, sale di ammonio e ottenere una seconda soluzione, - hydrating the lipid film in a solution comprising at least one salt, preferably selected from sodium salt, potassium salt, ammonium salt and obtaining a second solution,

- sottoporre la seconda soluzione a estrusione e ottenere una sospensione comprendente liposomi. - subjecting the second solution to extrusion and obtaining a suspension comprising liposomes.

In una o pi? forme di attuazione, il solvente pu? essere selezionato nel gruppo costituito da cloroformio, metanolo, etanolo, DCM, relative miscele. In one or more embodiments, the solvent can? be selected from the group consisting of chloroform, methanol, ethanol, DCM, mixtures thereof.

In una o pi? forme di attuazione, l?estrusione pu? essere condotta mediante l?impiego di un estrusore, preferibilmente a una temperatura compresa tra 20?C e 60?C, pi? preferibilmente pari a 40?C. In one or more forms of implementation, the? extrusion pu? be carried out using an extruder, preferably at a temperature between 20?C and 60?C, more? preferably equal to 40?C.

In una o pi? forme di attuazione, il procedimento di produzione dei liposomi pu? comprendere inoltre la fase di aggiungere alla sospensione comprendente liposomi almeno un principio attivo a ottenere liposomi comprendenti un principio attivo. Preferibilmente, il principio attivo pu? essere aggiunto alla sospensione comprendente i liposomi in una concentrazione compresa tra 0,1 mg/100 ?l e 1 mg/100 ?l preferibilmente pari a 0,5 mg/100 ?l. In one or more embodiments, the process of production of liposomes pu? further comprising the step of adding at least one active ingredient to the suspension comprising liposomes to obtain liposomes comprising an active ingredient. Preferably, the active ingredient can be added to the suspension comprising the liposomes in a concentration between 0.1 mg/100 ?l and 1 mg/100 ?l preferably equal to 0.5 mg/100 ?l.

In una o pi? forme di attuazione, il procedimento di produzione dei liposomi pu? prevedere che nella fase di idratare il film lipidico venga aggiunto HA, preferibilmente con peso molecolare superiore a 17000 Da, legato ad almeno un fosfolipide. Tale HA legato ad almeno un fosfolipide pu? essere ottenuto mediante le fasi di: In one or more embodiments, the process of production of liposomes pu? provide that in the step of hydrating the lipid film HA is added, preferably with a molecular weight greater than 17,000 Da, bound to at least one phospholipid. Such HA bound to at least one phospholipid can be obtained through the steps of:

- solubilizzare HA, preferibilmente con peso molecolare superiore a 17000 Da, in un solvente comprendente almeno un solvente alogenato a ottenere una soluzione di HA solubilizzato, - solubilizing HA, preferably with a molecular weight higher than 17000 Da, in a solvent comprising at least one halogenated solvent to obtain a solution of solubilized HA,

- aggiungere alla soluzione di HA solubilizzato almeno un fosfolipide, preferibilmente comprendente un gruppo amminico, pi? preferibilmente DPPE, e ottenere una miscela comprendente HA e almeno un fosfolipide, preferibilmente comprendente un gruppo amminico, - adding at least one phospholipid to the solubilized HA solution, preferably comprising an amino group, plus? preferably DPPE, and obtain a mixture comprising HA and at least one phospholipid, preferably comprising an amino group,

- aggiungere a detta miscela comprendente HA e almeno un fosfolipide almeno un agente riducente a ottenere una soluzione comprendente HA legato ad almeno un fosfolipide. - adding at least one reducing agent to said mixture comprising HA and at least one phospholipid to obtain a solution comprising HA bound to at least one phospholipid.

In una o pi? forme di attuazione, la descrizione fornisce un procedimento per ottenere HA, preferibilmente con peso molecolare superiore a 17000 Da, legato ad almeno un fosfolipide, che comprende le fasi di: - solubilizzare HA in un solvente comprendente almeno un solvente alogenato a ottenere una soluzione di HA solubilizzato, - aggiungere alla soluzione di HA solubilizzato almeno un fosfolipide, preferibilmente comprendente un gruppo amminico, preferibilmente DPPE, e ottenere una miscela comprendente HA e almeno un fosfolipide, aggiungere a detta miscela comprendente HA e almeno un fosfolipide almeno un agente riducente a ottenere una soluzione comprendente HA legato all?almeno un fosfolipide. In one or more embodiments, the description provides a process for obtaining HA, preferably with a molecular weight higher than 17000 Da, bound to at least one phospholipid, which comprises the steps of: - solubilizing HA in a solvent comprising at least one halogenated solvent to obtain a solution of solubilized HA, - adding at least one phospholipid, preferably comprising an amino group, preferably DPPE, to the solution of solubilized HA, and obtaining a mixture comprising HA and at least one phospholipid, adding at least one reducing agent to said mixture comprising HA and at least one phospholipid, to obtain a solution comprising HA bound to at least one phospholipid.

Fermo restando il principio di fondo, i particolari di realizzazione e le forme di attuazione potranno variare, anche in modo significativo, rispetto a quanto qui illustrato a puro titolo di esempio non limitativo, senza per questo uscire dall'ambito di protezione. Without prejudice to the underlying principle, the construction details and embodiments may vary, even significantly, with respect to what is illustrated here purely by way of non-limiting example, without thereby departing from the scope of protection.

Tale ambito di protezione ? definito dalle rivendicazioni annesse. This scope of protection? defined by the appended claims.