HUT74512A - Use of 2-hydroxy-5-phenylazobenzoic acid derivatives as to prepare medicaments with colon cancer chemopreventative and chemotherapeutic activity - Google Patents

Description

A találmány tárgya vastagbél rákos megbetegedés kemoterápiás megelőzése és kemoterápiája.

A vastagbél rák megbetegedés rosszindulatú formája az Amerikai Egyesült Államokban az elhalálozások 11%-kát képezi. 100,000 esetből 62 esetben elhalálozás előfordul, illetve 100,000 esetből 300 esetben betegség áll fenn és emiatt ez a betegség a harmadik legnagyobb elhalálozást okozó betegség férfiakban illetve a negyedik legnagyobb elhalálozást okozó betegség nők esetében. A vastagbél rákos megbetegedés különösen rossz, 5 év alatt kisebb mint 50% túlélési idővel rendelkezik, mivel általában ezt a betegséget csak az utolsó fázisban érzékelik. A jelenleg alkalmazott kezelések, sebészeti eljárások, amelyek kemoterápiával kombináltak és sajnos nem növelték a túlélési időtartamot. Ebből eredően szükség van biztonságos és hatásos preventív terápiára, amelyet a betegek esetében a korai fázisban alkalmazhatnak, amely betegekről ismert, hogy bennük nagyobb veszéllyel vastagbél rák fejlődhet ki.

Eikozanoid és a qasztrointesztinális sejtek megkülönböztetett működése

Az eikozanoid vegyületek a gasztrointesztinális epithelial sejtnövekedés, valamint differenciálódás és működés jelentős szabályozói. A prosztaglandin vegyületek körébe tartozó eikozanoid termékek ismerten indukálják a nyálkakiválasztást (Beckel és Kauffman (1981) Gastroenteroloqy 80:770-776) és az elektrolitok, valamint a testnedvek kiválasztását (Miller (1983) Am. J, Physiol.

« · · · • · · · · · · • · · · · · ·· · • ··· ·· · · < * - 2 245:G601-G623). Ezek a hatóanyagok továbbá indukálják az aktív transzportot (Bukhave és Rask-Madsen (1980) Gastroenteroloqy 78:32-37), valamint növelik az epithelium replikációs kapacitását (Konturek és munkatársai (1981) Gastroenteroloqy 80:1196-1201). Ezek a válaszfüggvények a differenciált védőgát rendszer fenntartásán át mutatkoznak. Ez a védőrendszer szorosan kapcsolt epithelial sejtekből áll, amelyeknek csúcsi felülete sűrű gliko-konjugátum kémiai pufferrel fedett. A gyomorban és a felső nyombélben ez a védőréteg biztosítja a savas és proteolitikus környezettel szembeni védelmet, amely környezet az emésztés során alakul ki. A vastagbélben ugyanez a védőrendszer a baktériumok és toxinok behatolásával szemben nyújt védelmet. így nem meglepő, hogy az exogén szintetikus prosztaglandinok aktív citoprotektív hatóanyagok (Whittle és Vane (1987) In: Johnson (ed.) physiology ofthegastrointestinaltract, Vol. 1, 2nd ed., New York: Raven Press, 143-180) és azt találták, hogy másodlagos fekélyellenes kezelésekben terápiásán alkalmazhatók. A gasztrointesztinális („Gl”) rendszer ebből eredően aktívan termel és tartalmaz specifikusan differenciált eikozanoid termék kiegészítőket, amelyek a lokális környezetben találhatók. Valamennyi eikozanoid azonos prekurzorból, az arachidonsavból, származtatható le, amely önmaga a foszfolipid membránokból szabadul fel, továbbá a Gl nyálkasejtek viszonylag nagy alapkoncentráció arachidonát forgalommal rendelkeznek, amely átalakulást a foszfolipáz A₂ enzim (PLA₂) iniciálja.

A Gl rendszer továbbá elsődleges védekezési mechanizmusnak számít a környezeti baktériumokkal, antigénekkel és toxinokkal szemben, ebből eredően megfelelő képességgel kell rendelkezzen, hogy igen agresszív és gyors gyulladásos választfüggvényt fejtsen ki. Ez a válaszfüggvény ugyancsak eikozanoid termékekre épül, amelyek lehetnek prosztaglandin (PG) típusú vegyületek, valamint • · · ··· ·· · ··· · · ··· • ···· · · · · · ···· · ··· ·· * · * - 3 kemotaktikus leukotrién (LTs) vegyületek. Ez a válasz azt idézi elő, hogy az aktiváló hatóanyag következtében vérben született neutrofilok, makrofágok és immunsejtek keletkeznek. Az egyes invazív sejtek, továbbá azzal a tulajdonsággal is rendelkeznek, hogy megfelelő kapacitással metabolizálják saját foszfolipidjeiket, továbbá nyálka és luminális foszfolipideket és így gyulladást kiváltó (szekréciós) PLA₂ anyagot bocsátanak ki és ezzel megsokszorozzák az arachidonsav kibocsátást, amely arachidonsav ezután PG vegyületekké és LT vegyületekké metabolizál.

A gyulladásos sejt beáramlás az ellentétes stimulust lerontja és csökkenti a gyulladásos sejtből kibocsátott termékekből eredő károsodást, mégis jelentős marad. A neutrofilok és a makrofágok szuperoxidot (O₂‘) bocsátanak ki (Kitahora és munkatársai (1988) Diq. Dis. Sci, 33:951-955), ugyanezek hidrogénperoxidot (H₂O₂) (Tauber és Babior (1985) Free Radic. Bioi. Med. 1:265-307), és proteázokat (Ohlsson és munkatársai (1977) Hoppé Seylers Z. Physiol. Chem 358:361-366) is kibocsátanak. Amennyiben az invázió kiterjedt, jelentős epithelial réteg csökkenés következik be, amely egyben azt jelenti, hogy ezt követően a védőgát funkció is romlik, ezért szükséges a gyulladásos válaszfüggvény kiküszöbölése ahhoz, hogy a végső optimális epithelial gátborítást újra visszanyerjük.

Krónikus Gl gyulladás és Gl rák indukálás

A szakirodalomban jól dokumentált, hogy a krónikus gasztrointesztinális gyulladásos betegségek, mint például a fekélyes vastagbélgyulladás (Lennard-Jones és munkatársai (1977) Gastroenteroloqy 73:1280-1285), a Crohn betegség (Farmer és munkatársai (1971) Cancer 28:289-295) és a krónikus atopiás gastritis (Sipponen és munkatársai (1983) Cancer 52:1062-1067) megnövelt rizikóját jelentik az ezt követő gasztrointesztinális rák kialakulásában. Ugyan a fo ··· ·· ··· • ···· ·· * · · ···· · · ·« ·· ·· lyamat mechanizmusa nem bizonyított feltehetően három, átfedő út jöhet létre, amely a későbbi transzformációhoz, a megnövelt proliferációhoz és rosszindulatú invázióhoz vezethet a többször előforduló akut gyulladásos epizódusok során. Ez a három mechanizmus, amelyet az alábbiakban részletesen bemutatunk: (1) megnövelt vastagbél szabadgyök és karcinogén tartalom, (2) a szövet táplálási eikozanoidok megváltozott szabályozása, és (3) olyan gén termékek indukálása, amelyek a sejt inváziót mediálják.

Megváltozott karcinogén terhelés gyulladásos epizódok következtében

A vastagbél nagy alapkoncentrációjú genotoxikus karcinogén terhelésnek és tumor promotorok terhelésének kitett, amelyek az étkezési vegyületek metabolizmusából és a vastagbél baktériumok által kifejtett endogén szekrécióból, mint például epesavakból eredhetnek. A fekália karcinogének és a vastagbél rák indukálás közötti összefüggést alátámasztják azok a vizsgálatok, amelyek során azt találták, hogy a nagy rizikófaktorral rendelkező személyek székletében megnövelt mutagén koncentráció található az alacsony rizikófaktorral rendelkező populációkkal összehasonlítva (Reddy és munkatársai (1980) Műt. Rés. 70:511-515). Ez a korreláció megfelel annak, hogy ismételten kimutatták, hogy fordítottan arányos az étkezési rostosanyag felvétel és a vastagbél rák gyakorisága (Armstrong és Dőli (1975) Int. J, Cancer 15:617-623). Ezt a fordított arányos jelenséget azzal magyarázzák, hogy a rostosanyag felvétel megnöveli a széklet térfogatát és ez azt eredményezi, hogy a székletben található karcinogének hígulnak és ezek áthaladási idejük csökken, ebből eredően gyorsabb karcinogén elimináció történik. Ez az eredmény azt a lehetőséget veti fel, ha a széklet karcinogén tartalma illetve terhelése, vagyis koncentrációja csökken és ezzel kisebb rák kialakulási rizikó jár együtt, akkor amennyiben a karcinogén terhelés növek • · · · ·· » • · · ··· ·· · ··· · · ·» • ···· · · * · · ·♦·· · ··· ·· ·» szik, ez egy megnövekedett rizikó értékhez vezet. A vastagbél karcinogének fenti koncentráció növekedése például származhat egymást követő gyulladásos eseményekből is.

Egy különösen bizonyító példa, hogy karcinogén nitrozamino gyulladásos neutrofil termelése történik az L-arginin-függö nitrogén-oxid és nitrogén (1)-oxid képződés révén (Grisham (1993) Gastroenteroloqy 104:A243). A gyulladásos sejtekből kibocsátott egyéb oxidatív termékek például a szuperoxid és a hidrogénperoxid, amely bizonyos átmeneti fémek, mint például vas (Fe) jelenlétében igen reaktív és citotoxikus hidroxil gyököt (OH.) képezhet (Grisham (1990) Biochem Pharmacol 39:2060-2063). A gyulladásos sejtek beáramlásából eredő megnövelt karcinogén vegyületeken és szabadgyök terhelésen kívül az arachidonsav kaszkád is képes mutagén metabolitok képzésére. A prosztaglandin H2 (PGH2) egy metabolitja a malondialdehid (MDA), egy in vitro módon közvetlenül ható mutagén (Mukai és Goldstein (1976) Scíence 191:868-869) és ez emlősökben karcinogén hatású (Basu és Marnett (1983) Carcinoqenesis 4:331-333). Ez a vegyület nagy mennyiségben enzimatikus úton képződhet thromboxán szintetáz segítségével olyan sejtekben, amelyek aktív ciklooxigenáz úttal rendelkeznek. Az MDA anyagról kimutatták, hogy ez a váz mutációkat okoz, hasonlókat, mint amelyeket a humán vastagbél p53 gén is képezhet (Marnett és munkatársai (1985) Mutat. Rés. 129:36-46). A PGH szintetáz önmagában hatásos peroxidáz és kimutatták, hogy ez sok policiklusos-szénhidrogén aktiválását katalizálja, amelyek ezek után mutagénné alakulnak (Marnett (1981) Life Sci. 29:531-546).

A fenti kísérleti adatok azt mutatják, hogy a krónikus és aberráns (gyulladásos sejt által vezetett) arachidonsav kaszkád aktiviálás a gasztrointesztinális traktusban az egyik útja annak, hogy megnövelt karcinogén terhelés alakuljon ki, • ···· · · ·· · ···· · ··· »» ·· > - 6 és esetlegesen DNS mutációk indukálása történjen a maximális DNS szintézis ideje alatt. A megnövelt sejt proliferáció, amelyet az epithelium elvékonyodása követ, amely elvékonyodást a beáramló gyulladásos sejtek idéznek elő, nagyobb olyan sejtszámhoz vezethet, amely sejtek érzékenyek a fenti karcinogének hatására. Más esetben a megnövekedett proliferáció megnövelheti illetve megsokszorozhatja a mutációkat (a klón expanzió révén), amelyeket korábban karcinogének indukáltak.

Megváltozott eikozanoid szabályozás gyulladásos epizódokból követően proliferációhoz vezethet

Egy további mechanizmus, amely a Gl gyulladással, illetve a Gl rákos folyamatok progressziójával is kapcsolatos lehet a normál eikozanoid szabályozás megszakadása. Mint korábban leírtuk a Gl nyálka epithelium differenciált normál funkciói igen szorosan kapcsolatosak az endogén eikozanoidok által befolyásolt különféle biológiai folyamatokkal. Mivel ezek a hatóanyagok lokálisan fejtik ki hatásukat és általában rövid felezési idejűek (igen erős metabolitikus inaktiválásuk történik) az akut gyulladásos események periódusai drámaian megváltoztathatják az eikozanoid homeostasis normál szabályozását.

A gyulladásos helyre a neutrofil és makrofág beáramlás esetében ezek a normális dinamikájú folyamatok drámaian megváltozhatnak. A gyulladásos sejtek önmagukkal bevisznek a szervezetbe sokféle további agonistákat, mint például citokineket, proteázokat és növekedési faktorokat (Adams és Hamilton (1984) Ann, Rév. Immunoi. 2:283-318, Ohlsson és munkatársai (1977) Physiol. Chem. 358:361-366, Náthán és Cohn (1980) Kelly és munkatársai (eds.), Textbook of Rheumatology, New York: W. B. Saunders, 186-215), amelyek önmagukban is krónikusan aktiválják a sejt PLA₂-t (cPLA₂) és ez arachidonsavat bocsát ki. To • · • · · · . . 7 vábbá a gyulladásos sejtek további PLA₂ formák gazdag forrásai, amely formákat szekréciós vagy sPLA₂ formáknak neveznek (Seilhamer és munkatársai (1989) J, Bioi. Chem. 264:5335-5338). Ezek aktivitását a Gl gyulladásos betegségekben nem régen igazolták (Minami és munkatársai (1992) Gut 33:914-921).

A cPLA₂-vel ellentétben a sPLA₂-t a gyulladásos sejtek (Wright és munkatársai (1990) J. Bioi. Chem. 265:6675-6681), a vérlemezek (Hayakawa és munkatársai (1988) J, Biochem. 104:767-772), a kondrociták (Lyons-Goirdano és munkatársai (1989) Biochem. Biopys. Rés. Commun. 164:488-495) és a simaizom sejtek (Nakano és munkatársai (1990) FEBS Lett. 261:171-174) bocsátják ki citokinok révén (Pfeilscifter és munkatársai (1989) Biophys. Rés. Commun. 159:385-394) és különösen endotoxin segítségével (Oka és Arita (1991) J. Bioi. Chem, 266:9956-9960). Ezen túlmenően mivel az extracelluláris közeg maximális kálcium koncentrációjú, amennyiben az sPLA₂ kibocsátása egyszer megtörtént ennek szabályozása megszűnik. Amennyiben a kibocsátás megtörtént ez a vegyület aktívan hidrolizálja az arachidonsavat és egyéb zsírsavakat, a foszfolipidek sn-2 helyzetéről, amely foszfolipidek a sejt és bakteriális membránokban találhatók, továbbá azokból a lipoprotein forrásokból, amelyek a közegben találhatók és az élelmiszer forrásokból is. Az sn-2 zsírsavak eltávolítása révén a nyert lizofoszfolipid (amely úgy keletkezik, hogy az sn-2 zsírsavat a fenti foszfoliped közül számosból eltávolították) potenciális lizogén hatást fejt ki a körülöttük levő sejtekre (Okada és Cyong (1975) Jpn. J. Exp. Med. 45:533-534). Ebből eredően a fenti reakció epithelial sejt lizishez vezethet és elvékonyítja a nem szűrt területet. Ebből eredően az ilyen területeken a gát funkció fenntartásához megnövekedett proliferációra van szükség.

« - 8 Gyulladás válaszfüqqvény és a sejt inváziót szabályozó gének aktiválása

A gyulladásos válaszfüggvény nemcsak lerontja a normál eikozanoid szabályozást, hanem egyben olyan gén termékek aktiválásához vezet, amelyek a sejt invázióhoz szükségesek. Egy ilyen termék az urokináz plazminogén aktivátor receptor (uPAR), amelyet normális esetben a bél epithelial sejtek expresszálnak. Ennek rögzítése a sejt felületre jelentős meghatározója a normál kripta (üszők) sejt migrációjának illetve a sejt felület proteolizis révén bekövetkező hámlásának (Kristensen és munkatársai (1991) J. Cell. Bioi. 115:1763-1771). A gyulladásos sejtekben a uPAR gén expresszálást a protein kináz C aktivátorok, a tumor promotorok, mint például a phorbol észter TPA indukálják (Lund és munkatársai (1991) J. Bioi. Chem. 266:5177-5181). Ugyanezt az indukciót különféle citokinok is végezhetik (Lund és munkatársai (1991) EMBO J. 10:3399-3401), ezek az anyagok invazív fenotípust indukálnak, amely a sejt beszűrődéshez szükséges (Stoppelli és munkatársai (1985) Natl. Acad. Sci. USA 82:4939-4943). Nem meglepő tehát, hogy nagymértékű uPAR expresszálást figyeltek meg számos mtasztatikus potenciállal rendelkező tumor sejtvonalban, mint például a vastagbél rákos sejtekben (Pyke és munkatársai (1991) Am. J. Pathol. 138:1059-1067). Különösen érdekesek az együtt tenyésztési kísérletek, amelyek azt mutatják, hogy az invazív potenciál mértéke nagyobb mértékben függ az uPAR expreszszálástól, mint ennek ligandum plazminogén aktivátorától (Ossowski és munkatársai (1991) J. Cell. Bioi. 115:1107-1112). Ebből eredően amennyiben gyulladásos válaszfüggvények többszörös ciklusa fordul elő, ez hozzájárulhat a túlzott uPAR expresszáláshoz a vastagbél nyálkasejtekben, amely azt eredményezi, hogy korábban jóindulatú tumorban invazív fenotípus keletkezik.

• · · · ' - 9 Emiatt a Gl nyálkasejtek különösen érzékenyek lehetnek a krónikus gyulladásos epizódokra, mivel három egymást keresztező út állhat elő: (1) az epithelial sejtek olyan környezetben vannak, amely igen magas karcinogén terhelésű és ez tovább növekedhet a gyulladásos epizódok során; (2) az endogén és a beszűrődött eikozanoid kaszkád termékei egyaránt trophikus ágensek; és (3) ezek saját differenciált válaszfüggvénye gyulladásos hatóanyagokra magában foglalja olyan gén termékek expresszálását, amelyek egy invazív típusú fenotípus kialakulásához szükségesek. Ez a három út együttesen transzformációs eseményhez vezethet és tumorindukálást, progressziót illetve inváziót eredményezhet. Ebből eredően az olyan hatóanyagok, amelyek az eikozanoid kaszkád bizonyos részeit blokkolják alkalmasak lehetnek a vastagbél rák kemoterápiás megelőzésének kezelésére.

Polipok és aberráns kripta foci szerepe a vastagbél rák prekurzoraként

A kutatások alapján széleskörben elismert, hogy az adenomatosis polipok a vastag-végbélrák prekurzorai és ezek megjelentése, mérete és multiplicitása előre jelzi a vastagbél rák kialakulásának viszonylagos rizikóját (Lotfi és munkatársai (1986) Mayo Clinic Proc. 61:337-343). Az adenomatosis polipokról kimutatták, hogy ezek a vastagbél rák sérülések prekurzorai, ugyancsak kimutatták, hogy bizonyos korai pathológiás sérülések, amelyeket aberráns kripta foci névvel neveznek, olyan sérülések prekurzorai illetve előzetes sérülések, amelyek adenomatosis polipokhoz vezetnek. Az aberráns kripta foci (ACF) meghatározható normál kinézetű humán vastagbél nyálkában, és kimutatták, hogy nagyobb számban fordul elő és nagyobb méretű olyan betegekben, amelyek vastagbél rákban szenvednek, vagy amelyek öröklött genetikus családi adenomatosis polipokkal rendel- 10 ··· · ·· · · • ·· ··· ·· · keznek (Ronucucci és munkatársai (1991) Humán Pathol 22(3):287-294: Pretlow és munkatársai (1991) Cancer Rés. 51:1564-1567).

NSAID és vastagbél rák kemo-prevenció

A kísérletek során kimutatták, hogy számos nem szteroid típusú gyulladásellenes hatóanyag (NSAID) hatásosan redukálja a tumorban szenvedő állatok számát illetve a tumor előfordulást állatokként vastagbél karcinogenesisben szenvedő patkány modellekben (Narisawa és munkatársai (1981) Cancer Rés.

41:1954-1957), (Pollard és munkatársai (1983) Cancer Lett. 21:57-61) (Moorghen és munkatársai (1988) J. Pathol 156:341-347) (Reddy és munkatársai (1993) Gastroenteroloqy 104:A443). Ez a tumor előfordulás csökkentés akár 70%-os is lehet, amennyiben a maximális tolerált dózis 80%-át alkalmazzák. Kimutatták, hogy dimetil-hidrazin-indukált vastagbél karcinogenesis esetében a sulindac a tumor előfordulást csökkentette, amelyben karcinogén adagolásával egyidőben adagolták, azonban amennyiben 17 héttel a karcinogén adagolása után adták nem fejtett ki ilyen hatást (Moorghen és munkatársai (1988) J. Pathol. 156:341-347).

Számos retrospektív vizsgálat kimutatta, hogy az asupirin fogyasztás a kialakuló vastagbél rák esetében kemopreventív terápiaként szolgált. A kísérletek eredményeit egy vastagbél rák kifejlődés rizikójára (Kuné és munkatársai (1988) Cancer Rés. 48:4399-4404) kezdődő és akár 50%-kal megnövelt vastagbél rák kialakulás rizikóra vonatkoztak (Paganini-Hill és munkatársai (1991) J. Natl, Cancer Inst. 83:1182-1183). Megjegyezendő azonban, hogy bármely humán tesztvizsgálat során, amelyben aszpirint és egyéb NSAID, azaz nem szteroid típusú gyulladásgátlót alkalmaztak, különösen retrospektív vizsgálatokban egyben a Gl vérzés frekvenciájának indukálását is jelezhette, ami lehetővé teszi a polip • · ··· ·· · · * • ···· ·· · · _Α ···· · ··· ·· ·« • - 11 vagy tumor korábbi detektálását a NSAID csoportban vér kicsapásos szkrinelés és sigmoidoszkopia segítségével.

Ugyan a retrospecktiv aszpirin vizsgálatok ugyanilyen eredményeket szolgáltattak bizonyos nem szteroid típusú gyulladásgátlók esetében állatkísérletekben, a kezdeti eredményeket is figyelembevéve (amelyeket a fentiekben adtuk meg) ezeket prospektív humán tesztvizsgálatokban is meg tudták ismételni. A nem szteroid típusú gyulladásgátlóról, a sulindacról véletlenszerű placebokontrollált kétszeres vakvizsgálattal végzett tesztvizsgálatban kimutatták, hogy kevesebb, mint 4 hónap kezelésen belül kilenc családi poliposis betegben poliregressziót okoz (Labayle és munkatársai (1991) Gastroenteroloqy 101:635-639). Ezen túlmenően, amennyiben a sulindac kezelést megszüntették a polip növekedés visszaállt. Ezek a megfigyelések jelentősek, mert hasonló vizsgálatban, amelyben indometacint használtak, az nem befolyásolta a poliregressziót (Kiéin és munkatársai (1987) Cancer 60:2863-2868). Ugyan mindkét fenti hatóanyag nem szteroid típusú származék és ezek gyulladásellenes hatása a ciklooxigenáz inhibiálásból ered, sulindac egy prodrug, amely aktív metabolittá, a sulindac-szulfiddá alakul át a vastagbél baktériumok közreműködésével (Shen és Winter (1975) Adv. Druq. Rés. 12:89-245). Ezzel szemben az indometacint aktív formában szedik a betegek és elsődlegesen a felső gasztrointesztinális traktusból abszorbeálódik és utána szisztémás úton kerül egyéb helyekre (Hucker és munkatársai (1966) J, Pharmacol. Exp. Ther. 153:237-249). Ebből eredően nagy valószínűséggel kimondhatjuk, hogy a sulindac által a vastagbélbe juttatott aktív metabolit koncentráció jelentősen magasabb, mint ugyanez az indometacin esetében. Az eredmény azt mutatja, hogy a nem szteroid típusú gyulladásgátló

- 12 kemopreventív hatásának jelentős része lokális hatású, amely hatás a nyálkahártya- és a bélüreg határfelületén történik.

Ugyan a nem szteroid típusú gyulladásgátlók által indukált vastagbél tumor gyakoriság inhibiálását állati modellekben fent leírtak bizonyították, azt feltételezik, hogy az inhibiálás mechanizmusa a tumorsejt ciklooxigenáz inhibiálásán keresztül történik, azonban ezt a mechanizmust még nem bizonyították. A nem szteroid típusú gyulladásgátlóval kezelt állatokból kimetszett tumor szövet vizsgálata azt mutatta, hogy ez a szövet igen nagymértékben csökkentett koncentrációjú PGE₂ szekrécióval rendelkezik, amely a fenti feltételezett mechanizmussal egybevág (Reddy és munkatársai (1992) Carcinoqenesis 13:1019-1023). Azonban a legtöbb vastagbél tumor heterogén természetű a benne található sejt típusok vonatkozásában és számos közleményben megállapították, hogy a vastagbél-végbél adeno karcinomákból generált epithelial sejt vonalak nem nagy termelői a PGE₂ anyagnak, vagy egyéb prosztanoidoknak (Hubbard és munkatársai (1988) Cancer Rés, 48:4770-4775). A humán vastagbél szövetből frakcionált sejtek eikozanoid termelésének vizsgála során kimutatták, hogy a tumor epithelial sejtek PGE₂ termelése hasonló, mint a nem tumoros sejteké, ugyanakkor a tumorból származó mononukleáris sejtek jelentősen magasabb eikozanoid szintézist mutattak, mint a normál sejtek (Maxwell és munkatársai (1990) Diqestion 47:160-166). A fenti eredmények alapján lehetséges, hogy a nem szteroid típusú gyulladásgátlókra érzékeny sejtek, amelyekben inhibiálás történik, nem az epithelial tumor sejtek, hanem valamely más ugyanott található sejtek lehetnek (amelyek nagy koncentrációjú PG anyagot termelnek), amelyekre ezután az epithelial sejtek válaszfüggvényt fejtenek ki.

- 13 Az előnyös kemopreventív terápia típusa

Valamennyi, nem szteroid típusú gyulladásgátló határozott mellékhatás profillal rendelkezik. A nem szteroid típusú gyulladásgátlók nem szövet specifikusak a ciklooxigenáz termékek inhibiálásában, és a renális, valamint a gasztrointesztinális rendszer is különösen érzékeny ezek hatására. A nem szteroid típusú gyulladásgátlók csökkentik a renális perfúziót és így nephrotoxicitást fejtenek ki (Clive és Stoff (1984) N. Enql. J. Med. 310:563-572), továbbá mivel a prosztaglandinokra szükség van a gasztrointesztinális epithelium normális differenciált funkcióihoz, a nem szteroid típusú gyulladásgátlók által indukált gyomor fekélyesedés jelentős tényező a megbetegedések, illetve a mortalitás kialakulásában, amely ilyen hatóanyagok adagolása esetén megtörténhet (Langman (1989) Gastroenteroloqy 96:640-646, Bjarnason és munkatársai (1992) Gastroenteroloqy 104:1832-1847). Amennyiben az alsó bél traktusban, vagyis a vékonybél traktusban krónikus, nem szteroid típusú terápiát alkalmaznak, kimutatták, hogy ez colitis kialakulását okozza, amely lehet proctitistól egészen a pancolitisig bármilyen colitis (Tanner és Raghunat (1988) Diqestion 41:116-120). Egy retrospektív vizsgálatban kimutatták, hogy becsülhetően, a nem szteroid típusú gyulladásgátló fogyasztása a betegek 25%-ában vastag- és vékonybél perforációt és vérzést okozott (Langman és munkatársai (1985) Br, Med. J. 290:347-349). A krónikus gyulladásos bélbetegségekben szenvedő betegek esetében, amelyek már nagy rizikóval vastagbél-végbélrák kialakulásában szenvedhetnek, a nem-5-ASA-tartalmú, nem szteroid típusú hatóanyagok, valamint az aszpirin adagolása kontraindikáció, mivel a fennálló betegséget ezek adagolása súlyosbíthatja (Rampton és Sladen (1981) Prostaqlandins 21:417-425). A vastagbél rák kemoprevenciójában

- 14 • ··*· · · · · · •··· · ··· ·· *· alkalmazható ideális hatóanyag a fentiekben eredően az alábbi profillal kell rendelkezzen:

1) Vastagbél specifikus - olyan prodrug, amely a felső gasztrointesztinál traktusban aktívan nem játszik szerepet, azonban a vastagbél elérésekor aktív formává alakul (sulindac-szerü);

2) Limitált abszorpcióval rendelkezik - az alap molekula és a metabolitok abszorpciója minimális legyen, különösen amikor aktív formává alakultak;

3) Szisztémás aktivitás hiánya - amennyiben abszorbeálódott a metabolitikus inaktiválás a hatóanyagot inaktív formává alakítsa és így a renális és a gasztrointesztinális rendszerben a szisztémás hatást limitálja;

4) Antioxidáns tulajdonságok - vastagbél specifikus antioxidáns aktivitás még tovább csökkenti a karcinogén veszélyt; és

5) Nem szteroid típusú gyulladásgátló mechanizmusú - az aktív metabolit inhibiálja a gyulladás által indukált eikozanoid utat, azonban az eikozanoid inhibiálás úgy történik, hogy az alap fenntartási utakat ez nem befolyásolja.

Összefoglalva, bizonyos nem szteroid típusú gyulladásgátlókról kimutatták, hogy ezek inhibiálják a vastagbél tumor gyakoriságot karcinogénnel indukált állati modellekben és inhibiálják a polip növekedést emberekben. Ugyan a nem szteroid típusú gyulladásgátlók által kifejtett tumor inhibiálás mechanizmusa nem bizonyított, ezek az anyagok megváltoztatják a gasztrointesztinális eikozanoid termelést és metabolizmust. Sajnálatos módon a nem szteroid típusú gyulladásgátlók ugyanakkor súlyos gasztrointesztinális mellékhatás profillal rendelkeznek, amely meggátolhatja ezek krónikus alkalmazását. Ebből eredően igen kívánatos lenne kifejleszteni egy olyan nem szteroid típusú gyulladásgátlót, amely hatásos kemopreventív hatóanyag, de ugyanakkor ezekkel a mellékhatásokkal nem rendelke- 15 zik. Chan, a 4,412,992 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentésben leírta a 2-hidroxi-5-fenil-azobenzoesav-származékok előállítási eljárását, illetve ezek alkalmazását fekélyes colitis kezelésében.

A találmány leírása

A találmány tárgya eljárás betegek kezelésére, amely beteg vastagbél rákban szenved vagy vastagbél rák kialakulásának valószínűsége a betegben magas, azzal jellemezve, hogy a humán betegnek valamely gyógyszerkészítmény hatásos mennyiségét adagoljuk, amely gyógyszerkészítmény az (I) általános képletű 2-hidroxi-5-fenil-azobenzoesav-származékot, vagy ennek észter formáját, vagy aktív metabolit formáját, vagy aktív metabolit formája oxidációs termékét, vagy a 2-hidroxi-5-fenil-azobenzoesav-származék nem toxikus gyógyszerészetileg elfogadható sóját, vagy észter formáját, vagy aktív metabolitját, vagy aktív metabolit oxidációs termékét tartalmazza, ahol az általános képletben

X jelentése -SO₂-csoport vagy karbonilcsoport; és

R jelentése fenilcsoport vagy karboxi-metil-fenil-csoport, vagy -(CH₂)_n-Y általános képletű csoport, ahol

Y jelentése hidroxilcsoport, aminocsoport, monoalkil- vagy dialkil-amino-csoport, ahol az alkilcsoportok maximálisan 6 szénatomot tartalmaznak, vagy karboxilcsoport vagy szulfonsavcsoport; és n jelentése 1-6 közötti egész szám, és amelyben egy vagy több hidrogénatom az alkiléncsoportban aminocsoporttal helyettesített, monoalkil- vagy dialkil-amino-csoporttal helyettesített lehet, ahol az alkilcsoportok-maximálisan 6 szénatomot tartalmaznak, vagy alkilcsoport, amelyben -(CH₂)_n-Y csoport közvetlenül a nitrogénatomhoz kapcsolódik vagy benzol- 16 gyűrűn keresztül kapcsolódik, azzal a feltétellel, hogy R-NH-X általános képletü csoport jelentése nem lehet -CO-NH-CH₂-COOH csoport.

A találmány tárgya továbbá a fenti eljárás, amelyben a gyógyszerkészítmény lényegében 2-hidroxi-5-fenil-azobenzoesav-származékot, vagy észter formáját, vagy aktív metabolit formáját, vagy aktív metabolit formájának oxidációs termékét, vagy a 2-hidroxi-5-fenil-azobenzoesav-származék sóját, vagy ennek észter formáját, vagy aktív metabolit formáját tartalmazza, szilárd vagy folyékony gyógyszerészetileg elfogadható hígító- vagy hordozóanyaggal együtt.

A találmány tárgya továbbá a fenti eljárás, amelyben 2-hidroxi-5-fenil-azobenzoesav-származékot alkalmazunk, amely balsalazid.

A találmány tárgya továbbá a fenti eljárás, amelyben aktív metabolitot alkalmazunk, amely 5-ASA.

A találmány tárgya továbbá a fenti eljárás, amelyben az aktív metabolit oxidációs termékét alkalmazzuk, amely az 5-ASA oxidációs terméke.

A találmány tárgya továbbá a fenti eljárás, amelyben az 5-ASA oxidációs termékét alkalmazzuk, amely lehet gentizin sav vagy 5-nitro-szalicilát.

A találmány tárgya továbbá a fenti eljárás, amelyben a gyógyszerkészítményt a vastagbél rákban szenvedő vagy vastagbél rák kifejlődésének rizikó faktorával rendelkező betegnek orálisan adagoljuk napi dózisban, amely lehet 1-14 g/70 kg testtömeg/nap, 2-hidroxi-5-fenil-azobenzoesav-származék, vagy észter, vagy ennek aktív metabolitja, vagy az aktív metabolit oxidációs terméke, vagy 2-hidroxi-5-fenil-azobenzoesav-származék sója, vagy ennek észter formája, vagy aktív metabolitja, vagy aktív metabolitjának oxidációs terméke.

A találmány tárgya továbbá a fenti eljárás, amelyben a vastagbél rákban szenvedő, vagy vastagbél rák kifejlődésének rizikójával rendelkező betegnek a ···· gyógyszerkészítményt rektális úton adagoljuk, napi dózisban 1-14 g/70 kg testtömeg/nap, 2-hidroxi-5-fenil-azobenzoesav-származék, vagy ennek észter, vagy aktív metabolit, vagy aktív metabolit oxidációs termék formájában, vagy 2-hidroxi-5-fenil-azobenzoesav só származék, vagy ennek észter formája, vagy aktív metabolitja, vagy aktív metabolitjának oxidációs terméke alakjában.

Az ábrák rövid ismertetése

Az 1. ábrán bemutatjuk a 2-hidroxi-5-fenil-azobenzoesav-származék kémiai szerkezetét, amely származék generikus neve balsalazid. Az 5-amino-szalicilsav (5-ASA) aminoszalicilát-csoportja azokötésen keresztül egy hordozó molekulához kötődik, amely hordozó molekula a 4-amino-benzoil-B-alanin (4-ABA),

A 2. ábrán bemutatjuk az 5-ASA hatását a HT-29 adenokarcinoma sejtvonal proliferációjára 0, 0,1, 1,0 és 10 mmol dózisban. A sejtszámokat három kísérlet átlagértékeként adjuk meg.

A 3. ábrán bemutatjuk az 5-ASA hatását az LS174T adenokarcinoma sejtvonal proliferációjára 0, 0,1, 1,0 és 10 mmol dózisban. A sejtszámokat három kísérlet átlagértékeként adjuk meg.

A 4. ábrán bemutatjuk az azoximetán karcinogén által patkányokban indukált aberráns kolóniás kripták számát a balsalazid hatóanyag jelenlétében illetve ennek alkalmazása nélkül, amely hatóanyagot ivóvízben adagoltunk.

Az 5. ábrán bemutatjuk alacsony koncentrációkban alkalmazott balsalazid és 5-ASA által létrehozott inhibitor válaszfüggvények viszonylagos értékét.

A 6A. és 6B. ábrákon bemutatjuk az aberráns kripta foci eloszlást a kontroll állatokban illetve az AOM (20 mg/kg) injektált állatokban 6 héttel a második injekció után a vastagbél mentén. Az 1, 2, 3, 4, vagy 5 vagy ennél több tartalmú foci

- 18 számot mutatjuk be (mindenegyes esetben sorrendben az alsó vagy a felső görbék).

A 7. ábrán bemutatjuk az LS174T sejt proliferálás inhibiálást különféle adott közegben oldott koncentrációjú 5-ASA esetében részben 4 nappal a kezelés kezdete előtt a sejteken (fekete) vagy az 5-ASA 10 mmol koncentrációjú közegben oldott oldatának hatását közvetlenül a sejtekre való alkalmazás előtt (fehér). A sejteket a számlálás előtt még 4 napon át tenyésztettük.

A 8A. és 8B. ábrán bemutatjuk a vastagbél rákos sejtek proliferációjának inhibiálását, az 5-ASA két oxidációs termékének különféle koncentrációja alkalmazása esetében, amely oxidációs termékek sorrendben a gentisate és az 5-nitro-szalicilát.

A találmány szerinti eljárás végrehajtása

A 2-hidroxi-5-fenil-azobenzoesav-származékokról, különösen a balsalazidról, valamint ennek aktív metabolitjáról kimutattuk, hogy hatásosak a vastagbél rákos megbetegedés kemopreventív kezelésében történő felhasználásban. Ezek a 2-hidroxi-5-fenil-azobenzoesav-származékok az (I) általános képletű vegyületek, ahol az általános képletben

X jelentése -SO₂-csoport vagy karbonilcsoport; és

R jelentése fenilcsoport vagy karboxi-metil-fenil-csoport, vagy a -(CH₂)_n-Y általános képletű csoport, ahol

Y jelentése hidroxilcsoport, aminocsoport, monoalkil- vagy dialkil-amino-csoport, ahol az alkilcsoport maximálisan 6 szénatomot tartalmazhat, vagy karboxilcsoport, vagy szulfonsavcsoport, és n jelentése 1-6 közötti egész szám, és

- 19 amely vegyületben az alkiléncsoportban egy vagy több hidrogénatom aminocsoporttal monoalkil- vagy dialkil-amino-csoporttal helyettesíthető, ahol az alkilcsoportok maximálisan 6 szénatomot tartalmaznak, vagy alkilcsoporttal helyettesített lehet, és ahol a -(CH₂)_n-Y csoport vagy közvetlenül a hidrogénatomhoz kapcsolódik, vagy benzolgyűrűn keresztül kapcsolódik a nitrogénatomhoz, azzal a feltétellel, hogy az R-NH-X általános képletű csoport jelentése nem lehet -CO-NH-CH₂-COOH csoport.

A „2-hidroxi-5-fenil-azobenzoesav-származék” elnevezésbe a leírásban beleértjük az észter-származékokat vagy aktív metabolitokat, amelyeket a vegyület gyógyszerészetileg elfogadható nem toxikus sóiból képezhetünk, vagy ezen vegyületek észter vagy aktív metabolit származékait is.

Az „aktív metabolit” elnevezés alatt a 2-hidroxi-5-fenil-azobenzoesav-származékok emberi testben végbemenő metabolizmusának termékeit értjük, amelyek például keletkezhetnek a vastagbél baktériumok hatására, és olyan vegyületek, amelyek inhibiálják a vastagbél rákos sejtek proliferációját. Például, mint az alábbiakban leírjuk ilyen aktív metabolit a balsalazid esetében lehet az 5-ASA vegyület.

Az „oxidációs termék” elnevezés alatt olyan vegyületeket értünk, amelyek úgy keletkeznek, hogy a 2-hidroxi-5-fenil-azobenzoesav-származékot aktív metabolitjait például az 5-ASA vegyületet például hipoklorittal vagy hidrogén-peroxiddal oxidációs körülmények között reagáltatjuk.

A balsalazid nátrium egy vastagbél specifikus, nem szteroid típusú gyulladásgátló, amino-szalicilát, amely alkalmas az aktív fekélyes colitis kezelésére. A balsalazid továbbá egyik elsődleges metabolitja inhibiálja a tenyésztett humán vastagbél rák sejtek növekedését, továbbá a balsalazid inhibiálja a karcinogén • ·

- 20 azoximetánnal kezelt állatokban az aberráns kripták képződését, és mint egyéb nem szteroid gyulladásgátlók a balsalazid hatásosan alkalmazható a humán vastagbél-végbél rák kemo-prevenciójában.

A balsalazid emellet három fontos biztonságos felhasználási előnnyel rendelkezik: (1) a hatóanyag kibocsátása illetve abszorpciója vastagbél specifikus; (2) alkalmazásakor nem lehetett kimutatni gyomor és vékonybél fekély kialakulását; és (3) 500 eddig az időpontig kezelt beteg esetében, amelyek közül néhányat, már 3 éve kezeltek, nem lehetett kimutatni nephrotoxicitást. A fentiekből eredően a balsalazid ideális hatásosság és biztonságos felhasználás kombinációval rendelkezik ahhoz, hogy a vastagbél rák kemoprevenciós kezelésben alkalmazzák.

Vastagbél-specifikus abszorpció

A balsalazid egy prodrug és így inaktív forma, amely hasonlóan a sulindac-hoz aktív gyulladásgátló hatóanyaggá alakul át a vastagbél baktériumok hatására. Mint az 1. ábrán bemutatjuk a balsalazid aminoszalicilát, amely 5-amino-szalicilsavból (5-ASA) alakul ki, kötést tartalmaz egy hordozó molekulához azokötésen keresztül, amely hordozó molekula a 4-amino-benzoil-ft-alanin (4-ABA). A baktérium azoreduktáz a kötést hidrolizálja és így lokálisan 5-ASA szabadul fel.

Limitált szisztémás abszorpció

A balsalazid, amennyiben orális úton adagoljuk nem hasított formában és lényegében abszorpció nélkül halad át a felső gasztrointesztinális traktuson. A plazmában vagy a vizeletben csupán 0,3% bevett dózis prodrug mennyiséget találhatunk, ugyanakkor a hatóanyag 99%-a a vastagbelet változás nélkül eléri. A vastagbélben a hatóanyag hidrolízist szenved és így 5-ASA és 4-ABA keletkezik, amely kölcsönhatásba lép a vastagbél nyálkával, és N-acetil formává alakul. Az

- 21 egyetlen dózis balsalazidból származó 5-ASA többsége 96 óra időtartamon belül N-acetil-5-ASA (Nac5ASA) vegyületté alakul, majd a vizelettel kiürül, míg a 4-ABA és ennek N-acetil metabolitja igen kismértékben abszorbeálódik. Mivel az 5-ASA N-acetil metabolitja inaktív az 5-ASA szisztémás aktivitása ugyancsak csökkentett (Chan és munkatársai (1983) Diq. Dis. Sci. 28:609-615).

Antioxidáns jellemzők

Mint korábban leírtuk egy olyan kemopreventív hatóanyag, amely hatásos antioxidáns jellemzőkkel rendelkezik, hozzájárulhat a vastagbél karcinogén terhelés csökkentéséhez, továbbá a szabad gyök kibocsátás által okozott károsodás csökkentéséhez, amely szabad gyökök a beáramló gyulladásos sejtekből szabadulnak fel. Az 5-ASA inhibiálja az arginin-függő nitrogén-oxidból származó nitrozamin képződést (Grisham (1993) Gastroenteroloqy 104:A243). Ezen túlmenően az érintetlen balsalazid, továbbá az 5-ASA hatásos szabad gyökfogó az O₂- és OH:gyökökkel szemben. A balsalazid illetve az 5-ASA, amennyiben fekélyes colitisban szenvedő betegekből nyert rektális biopsiával együtt inkubáltuk, a rektális nyálkahártya reaktív oxigén metabolit termelést több mint 90%-kal csökkentette. Mindkét hatóanyag hatásosabb antioxidáns, mint az egyéb antioxidánsok például a taurin, az aszkorbát vagy az N-acetil-cisztein, hasonló koncentrációk alkalmazása mellett (Simmonds és munkatársai (1992) Gastroenteroloqy 102:A696).

Vastagbél qyulladásellenes aktivitás a felső Gl traktusra kifejtett hatás nélkül

A balsalazid számos állati modellben gyulladásellenes hatást fejt ki a vastagbél gyulladás esetében, továbbá gyulladásellenes hatást fejt ki aktív fekélyes colitis (Green és munkatársai (1993) Gastroenteroloqy 104:A709), lappangó féké- 22 • !·?. : : : .··.

···· · ··· ..· ·,,· lyes colitis (Gaiffer és munkatársai (1992) Ailment. Pharmacol. Ther, 6:479-485) betegekben. Fontos jellemző, hogy a hatóanyag kiváló gasztrointesztinális toleranciával rendelkezik.

A balsalazid és az 5-ASA in vitro inhibiálja a vastagbél rákos sejtek proliferációját

Az 5-ASA és a balsalazid jelentős növekedést inhibiáló hatást mutat a humán vastagbél rákos sejtek növekedésével szemben.

Az 5-ASA oxidációs termékei in vitro inhibiálják a vastagbél rákos sejtek proliferációját

Az 5-ASA oxidációs termékei nem várt növekedést inhibiáló hatást mutatnak az 5-ASA hatásával összehasonlítva humán vastagbél rák sejtek növekedésével szemben.

Vastagbél rák kemoprevenciós és/vagy kemoterápiás eljárások

A fentiekből eredően a találmány szerinti 2-hidroxi-5-fenil-azobenzoesav-származékok különösen a balsalazid és ennek metabolitjai hatásosan alkalmazhatók a vastagbél rák kemoterápiájában. A vegyületeket humán betegeknek, akik vastagbél rákban szenvednek, vagy vastagbél rák kialakulása szempontjából veszélyeztetettek, gyógyszerkészítmény formában adagoljuk, amely gyógyszerkészítmény 2-hidroxi-5-fenil-azobenzoesav-származékot vagy származékokat tartalmaz. A gyógyszerkészítmény továbbá tartalmazhat egy vagy több nem toxikus, gyógyszerészetileg elfogadható hordozóanyagot, kiszerelöanyagot és/vagy hígítóanyagot. Előnyös adagolási forma az orális adagolás. A szokásos gyógyszerészeti formálási eljárásokat alkalmazzuk, mint például amelyeket leírtak a Reminqton’s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PA, szakirodalom utolsó kiadásában.

• · · · • · ·· ‘ - 23 A készítmény lehet tabletta, kapszula, por, granulátum, labdacs, folyadék vagy gél forma. A tabletta és kapszula formák orális adagolása lehet olyan alak, amely egységdózis mennyiséget tartalmaz, és szokásos kiszerelöanyagokból készül. Az alkalmazható hordozóanyagok lehetnek kötőanyagok, mint például szirup, akácia, zselatin, szorbitol, tragakant és polivinil-pirrolidon; töltőanyagok, mint például laktóz, cukor, kukoricakeményítő, kálcium-foszfát, szorbitol vagy glicin; tabletta, kenőanyagok, mint például magnézium-sztearát, szilícium-dioxid, talkum, polietilén-glikol vagy szilícium-dioxid; dezintegrálószerek, mint például burgonyakeményítő; vagy elfogadható nedvesítőszerek, mint például nátrium-lauril-szulfát. A tabletták a szokásos gyógyszerészeti gyakorlatnak megfelelően ismert módon bevonattal is elláthatók. Az orális adagolású folyadék készítmények lehetnek például vizes vagy olajos szuszpenziók, oldatok, emulziók, szirupok vagy elixírek, vagy ezek lehetnek száraz formák, amelyeket vízzel vagy egyéb alkalmas, fent leírt hordozóanyagokkal felhasználás előtt rekonstituálunk. A folyékony készítmények tartalmazhatnak szokásos adalékanyagokat, mint például szuszpendálószereket, például szorbitolt, szirupot, metil-cellulózt, glükóz szirupot, zselatint, hidrogénezett ehető zsírokat, emulzifikálószereket, mint például nem vizes hordozóanyagokat (az ehető olajokat is beleértve), mint például mogyoróolajat, frakcionált kókuszolajat, olajos-észtereket, mint például glicerint, propilén-glikolt vagy etil-alkoholt; tartósítóanyagokat, mint például metil- vagy propil-p-hidroxi-benzoátot vagy szorbinsavat, és amennyiben kívánatos szokásos ízesítőanyagokat vagy színezőanyagokat.

A gyógyszerkészítményekben a találmány szerint az aktív hatóanyag %-os mennyisége változhat, és ez mindig olyan mennyiség, hogy a kívánt terápiás hatást kifejtő alkalmas dózist nyerjük. Általában a találmány szerinti készítmények • · • · • · ·

- 24 humán betegeknek orálisan vagy rektálisan úgy adagolhatok, hogy 1-14 g aktív hatóanyag/nap dózist biztosítsunk 70 kg testtömegre vonatkoztatva.

A találmány szerinti eljárást és készítményt az alábbi példákon részletesen bemutatjuk.

Példák

1. példa

Balsalazid és 5-ASA in vitro inhibiálja a vastagbél rákos sejtek proliferációját

A balsalazid és metabolitja az 5-ASA aktivitását in vitro a humán vastagbél rákos sejtekkel szemben humán adenoma HT-29sejtek és LS174T sejtek esetében vizsgáltuk. A sejtek tenyésztését 10%-os marhaszérummal kiegészített Dulbecco módosított Eagle táptalajon végeztük 5% CO₂ tartalmú atmoszférában 37 °C hőmérsékleten. A tenyésztési kísérletekben a sejteket 24 üreges sejt tenyésztő edénybe inokuláltuk (2 cm²/üreg) 20,000 sejt/üreg mennyiségben, majd tapadásukat 12 órán át biztosítottuk. Ezt követően a táptalajt megváltoztattuk és a hatóanyagokat tartalmazó friss táptalajra cseréltük.

A tesztvizsgálati vegyületeket kívánt koncentrációban a szövet tenyészet táptalajban oldottuk, és így adagoltuk az egyes üregekbe. Az egyes üregekben található sejtszám meghatározása céljából az üregekből a táptalajt eltávolítottuk, majd a sejteket foszfát-pufferelt fiziológiás sóoldattal mostuk. Ezt követően a sejteket 15 percen át tripszin-EDTA oldattal inkubáltuk, amíg ezek tapadása megszűnt. A nem tapadó sejteket ezt követően az üregekből eltávolítottuk, majd Coulter Counter (számláló) (ZBI modell) segítségével számláltuk. Mint a 2. és 3. ábrákon bemutattuk a HT-29 humán vastagbél rák sejtvonalak és az LS174T nö- 25 • · · · • · · · · · • · · · · · · vekedése inhibiált, amennyiben az 5-ASA koncentrációkat fokozatosan növeltük. A 10 mmol 5-ASA dózis esetében a két sejt vonalra az inhibiálás 82 illetve 85% volt.

Összehasonlító vizsgálatokat is végeztünk, és meghatároztuk a balsalazid aktivitását összehasonlítva két metabolitjával az 5-ASA illetve a 4-ABA vegyietekkel, valamint acetil-szalicilsavval (aspirin), rákos sejt proliferációval kapcsolatosan. Mint az I. táblázatban bemutatott eredmények mutatják az acetil-szalicilsav, amely kovalensen inhibiálja a ciklooxigenázt, ebben a tesztvizsgálatban ugyanolyan mértékben hatásos inhibitor, mint az alaphatóanyag balsalazid. Azonban a balsalazid hordozó molekulája a 4-ABA molekula a kísérletben inaktív. Az I. táblázatban bemutatott sejtszámok három párhuzamos kísérletből nyert átlagértéket jelentenek.

• · • ·

I. táblázat

	HT-29	LS174T
Körülmények	Dózis	Sejtszám 10. napon	Kontroll sejtek %	Sejtszám 10. napon	Kontroll sejtek%
Kontroll	-	1315800	-	709750	-
Ac-salcilsav	(10 mmol)	14625	1,11	8300	2,24
Balsalazid	(10 mmol)	47500	3,60	24925	3,51
5-ASA	(10 mmol)	512825	38,97	8675	1,22
4-ABA	(10 mmol)	1316625	100,06	768700	108,30

További vizsgálatok végzetünk abból a célból, hogy meghatározzuk a balsalazid illetve az 5-ASA növekedés inhibiáló hatását dózisfüggö értékben. A kísérletekben mindkét vegyület hasonló eredményt mutatott, amennyiben HT-29 sejtekkel, akár LS174T sejtekkel szemben mértük. A dózisfüggö vizsgálatokban egy érzékeny festékkötö tesztvizsgálatot alakítottunk át, amely lehetővé teszi több hatóanyag párhuzamos vizsgálatát és különböző dózisok párhuzamos meghatározását 96 üreges lemezeken. A sejteket az üregekbe helyeztük, majd hagytuk 24 órán át tapadni mielőtt a vizsgált hatóanyagot adagoltuk. A sejt sűrűséget ezután az üregekben történő fixálás utáni 4. napon illetve a festés utáni 4. napon számláltuk, amely festést Sulforhodamin B festékkel végeztünk. A festett tenyészetek optikai sűrűségét ezután 96-üreges lemez leolvasóval 495 nm érték mellett meghatároztuk (Skehan és munkatársai (1990) J. Natl. Cancer Inst. 82:1107-1112).

Amint az 5. ábrán bemutatjuk, a balsalazid minden esetben nagyobb inhibiáló hatást mutatott kisebb koncentrációkban, mint az 5-ASA. A HT-29 sejtek esetében a vegyületekre a balsalazid illetve az 5-ASA sorrendjében az IC₅₀ érté- 27 kék 5,7 mmol illetve 11,8 mmol voltak. Amennyiben LS174T sejteket alkalmaztunk, akkor ugyanezen a sorrendben! IC₅₀ értékek 5,2 mmol illetve 11,5 mmol voltak. Az 5-ASA vizsgálatnak alávetett legkisebb koncentráció esetében (0,1-1,0 mmol az LS174T esetében és 0,1-4 mmol a HT-29 esetében) reprodukálható és statisztikusan jelentős sejtszám növekedést mértünk, amely kb. 20% mindkét sejttípusra vonatkoztatva. Ez megfelel a korábban más kutatok által közzétett eredményekkel, amelyek egyéb nem szteroid típusú gyulladásgátlók alacsony koncentrációjának alkalmazásakor a protein szintézis növekedését figyelték meg, amelyet ezután nagyobb koncentrációk alkalmazása esetében inhibiálás követett (Hial és munkatársai (1977) J. Pharm. Exp. Therap, 202:446-452).

2. példa

Balsalazid és metabolitjai hatása az aberráns kripta képződésére patkányokban

Az aberráns kripta sejteket eredetileg karcinogén-indukált vastagbél nyálkában írták le, mint „megnövekedett méretű sűrűbb epithelial borítású és megnövekedett perikriptális zónás” kripta sejteket (Bírd és munkatársai 81989) Cancer Surv. 8:189-200). A nem szteroid típusú gyulladásgátlók a leghatásosabb aberráns kripta sejt képződés inhibitorok az azoximetán (AOM) karcinogénnel indukált patkány modellekben (Wargovich és munkatársai (1992) J. Cell. Biochem. 16G:51-54). Számos ilyen hatóanyag tumorellenes aktivitását bebizonyították hosszabb időtartamú AOM állati tesztvizsgálatokban. Ebből eredően az aberráns kripta sejt modell ideális in vivő tesztvizsgálat arra, hogy a balsalazid és metabolitjai hatását meghatározzuk.

• ·

- 28 Aberráns kripta sejt indukálás inhibiálása

A balsalazid (BSZ) és metabolitjai az 5-amino-szalicilsav (5-ASA), valamint a 4-amino-benzoil^-alanin (4-ABA) hatásosságát az aberráns kripta sejt képződés inhibiálásában azoximetán (AOM) indukált vastagbél rák patkányok modellen határoztuk meg.

A kísérletekben négy csoport 5 hím F344 patkányt tartalmazó kísérleti állatot alkalmaztunk. Az állatok 6-8 hetesek voltak és a dózis adagolásának kezdetén testtömegük az átlagérték +/-20% értékén belül volt. Az AOM kezelése várt válaszfüggvény értelmében a közzétett tanulmányok alapján állatonként 100-140 aberráns kripta sejt alakult ki (Wargovich és munkatársai (1992) J. Cell. Biochem. 16G:51-54). A válaszfüggvény arányokat és chi négyzetes analízist, amelynek megbízhatósági határértéke 95%, alkalmazva a csoportonkénti 5 állat mintaméret biztosította, hogy a statisztikusan jelentős inhibiálást regisztráljuk (p<0,05 érték), a regisztrálást a tesztvizsgálati hatóanyagokkal végezhettük, amennyiben az állatokban állatonként 50-75 aberráns kripta sejtet észleltek.

Az állatokat a véletlenszerű tesztvizsgálati csoportba osztás előtt, amelyet a testtömeg értékének véletlenszerű elosztásával végeztünk, 10 napig aklimatizáltuk. A tesztvizsgálati vegyületeket ivóvízben oldottuk, olyan koncentrációban, amely biztosította az állatonként átlagos 50 ml napi vízfogyasztás esetében az állatoknak adagolandó napi dózist. Két csoportot az AOM injektálás előtt két hétig hatóanyag kezelésnek vetettünk alá. A karcinogenezist AOM 20 mg/kg szubkután injektálással indukáltuk, amely kezelést a 2. hét és a 3. hét kezdetén végeztük. A tesztvizsgálati anyag adagolását tovább az 5. hét végéig folytattuk.

A balsalazid dózisszintjét úgy választottuk ki, hogy figyelembevettük egyéb preklinikai vizsgálatok eredményeit, amelyeket colitis modelleken végeztünk. Egy

- 29 500 g patkány esetében adagolt 200 mg/kg/nap dózis megfelel egy 70 kg testtömegei ember esetében alkalmazott 14 g/nap dózisnak, amely kb. kétszerese annak a terápiás dózisnak, amit aktív fekélyes colitis esetében alkalmaznak és kb. négyszeressel több mint az a dózis, amellyel a javulást fenntartják. Ez a dózisszint eredményezi az 5-ASA vastagbélben koncentrációjának 5-20 mmol közötti értékre való beállítását. A balsalazid maximális tolerált dózisa patkányokban 12,000 mg/kg/nap.

A testtömegeket a kísérlet során heti két alkalommal mértük, és az egyes ketrecekben az állatok vízfogyasztását ugyancsak heti két alkalommal határoztuk meg. A fogyasztást átlagértékét ml/állat/ketrec szerint határoztuk meg.

Az aberráns kripta sejt analízis céljára az állatokat CO₂ euthanasia segítségével elpusztítottuk vagy a 3. hét, vagy az 5. hét dózis adagolás végén. A vastagbelet az anus és a vakbél között kimetszettük. Ezeket eltávolítottuk, majd hosszirányba felnyitottuk. A szöveteket megszabadítottuk a bennük lévő anyagokból, majd fiziológiás sóoldattal átöblítettük, és 4 °C hőmérsékleten 2 órán át 2% paraformaldehidben fixáltuk, végül 3-5 percen át 0,2% metilén-kékkel festettük. Ezután a mintákat fiziológiás sóoldattal átöblítettük, és az aberráns kripta foci számot mikroszkóp alatt 40-1 OOx nagyítással számoltuk. A vastagbél szövet hosszát ugyancsak mértük. A nagyban sérült területek reprezentatív mintáját 4 °C hőmérsékleten glikol-metakrilátba merítettük, és az egyes foci 3-4 pm részeit hematoxilinnel, eozinnal és azúré (HEA) festékkel festettük hisztológiai vizsgálat céljára.

A gasztro-duodenális sérülés analízis céljára a fundust, az antrumot és a duodenumot ugyanígy eltávolítottuk és hasonló módon a fentiek szerint vizsgáltuk. A gyomor sérülést úgy határoztuk meg, hogy a (Peskar és munkatársai • · (1986) Prostaqlandins 31: 283-287) közleményben leírt eróziós indexet mértük illetve ennek hosszát és súlyosságát határoztuk meg.

A 4. ábrán bemutatjuk az aberráns kriptasejtek átlagos számát a vastagbél szövet hosszanti centiméterére vonatkoztatva olyan állatok esetében, amelyeket 1 vagy 3 hétig kezeltük az azoximetán két szubkután injektálását követően. Mindkét időpontban az állatok, amelyeket balsalaziddal kezeltünk, igen csökkentett aberráns kriptasejt átlagszámot mutattak a kontroll állatokhoz hasonlítva. Az első héten 61,8% inhibiálást és az 5. héten 58,1% inhibiálást tapasztaltunk az aberráns kriptasejtek átlagos számában.

Az aberráns kriptasejtek progressziójának inhibiálása

A 4. ábrán bemutatott adatokat 7-8 cm-es distalis vastagbél szöveten nyertük. Valamennyi ilyen korai időpontban mért esetben ez a terület tartalmazta az összes aberráns kriptás foci több mint 80%-át. Egy további vizsgálatot végeztünk abból a célból, hogy egy hosszabb időtartam utáni esetet mérjünk, és meghatározzuk, a teljes 25 cm-es vastagbélen történő eloszlást, továbbá meghatározzuk, hogy a hatóanyag kezelést egy második AOM injektálás után is iniciálhatjuk. Ez utóbbi különösen érdekes, mivel fontos bemutatni, hogy a kemopreventív hatóanyag a karcinogénnel történő kezdeti transzformációt követően az aberráns kriptasejtek növekedésének progresszióját inhibiálja.

A második vizsgálatban 8 állat két azoximetán injekciót kapott egy hét idő eltéréssel. A balsalazid kezelést ezután egy csoportban 24 órával a második injektálás után kezdtük el. Hat hét elteltével az állatokat aberráns kripta sejt analízisnek vetettük alá. A kriptasejteket in situ festettük rektális 0,2%-os metilén-kék beültetéssel 15 perc időtartamon át érzéstelenítés alkalmazásával. Az állatokat ezután kivéreztettük, majd az anustól a vakbélig a vastagbél szövetet kimetszet- 31 • · · · • · · ·· • · · · • ♦··· · • · · · · ··· tűk, tisztítottuk és 2 órán át 2%-os paraformaldehidben fixáltuk. A kriptasejteket negyvenszeres nagyítású mikroszkópon szemmel számláltuk. Azon túlmenően, hogy a foci számot meghatároztuk ugyancsak megmértük az egyes fociban található aberráns kriptasejtek számát. Ezeket az adatokat a 6. ábrán mutatjuk be. Az ábrából kitűnik, hogy amennyiben a második AOM injektálás után 24 órával kezdődően adagoltuk a balsalazidot, az aberráns kripta foci nagyon nagymértékű inhibiálása figyelhető meg, amely összehasonlítható az előző kísérletben tapasztalt inhibiálással, amelyet a 4. ábrán mutattunk be (körülbelül 60%-os átlagos inhibiálás).

Korábbi kísérletekben Pretlow és munkatársai (lásd a Pretlow és munkatársai (1992) Carcinoqenesis 13:1509-1512 közleményt) leírták, hogy kapcsolat áll fennt az aberráns kriptasejt multiplicitás és a valódi tumor kifejlődés között és kísérleteikben azonos karcinogenezis modellt alkalmaztak. Ezekben a vizsgálatokban a szerzők kimutatták, hogy a négy vagy több aberráns kriptasejtet tartalmazó aberráns kripta foci szám nagymértékben függésbe hozható a tumor képződéssel, ami feltehetővé teszi, hogy ezek a nagyobb foci képződmények azok, amelyek legvalószínűbben tumorrá alakulnak át. A fenti kísérletből nyert adatokat analizáltuk, hogy meghatározzuk a balsalazid hatását az aberráns kriptasejtek multiplicitására. Ezeket az adatokat all. táblázatban az alábbiakban mutatjuk be, és azt jelzik, hogy a balsalazid nagyobb inhibiálást fejt ki a négy vagy több aberráns kriptasejtet tartalmazó focival szemben, mint azokra a foci képződményekre, amelyek kevesebb, mint 4 aberráns kriptasejtet tartalmaznak. Az 1-3 kriptasejtet tartalmazó foci esetében az átlagos inhibiálás 57-61% (p<0,003, Fischer tesztvizsgálat) míg a négy vagy több kriptasejtet tartalmazó foci esetében ennek redukálása átlagosan 72-76% (p<0,001). Amennyiben a négy vagy több

- 32 kriptasejtet tartalmazó foci ellen kifejtett hatást összehasonlítjuk a három vagy kevesebb kriptasejtet tartalmazó foci ellen kifejtett hatással a különbség statisztikailag jelentős, és p<0,022 értékű a Fischer tesztvizsgálat szerint.

II. táblázat

Balsalazid inhibiálás aberráns kriptasejt multiplicitásra.

A bemutatott számok a különféle méretű foci átlagszám értékek egyes 8 állatot tartalmazó csoportra vonatkoztatva, a mérést 6 héttel a második AOM injektálást követően végeztük.

Multiplicitás	1	2	3	4	5-8	Összes
BSZ	10,3	19,1	15,3	8,5	9,6	63,75
Kontroll	24	48,8	37,3	30,5	40,6	181,75
Inhibiálás %	57±23%	61 ±16%	59±17%	72±19%	76±12%	65±10%
Fischer	0,001	0,001	0,003	0,0001	0,0001	0,001

Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a legnagyobb számú aberráns kriptasejtet tartalmazó foci szám majdnem kétszeresen csökkenthető, mint a 2-3 aberráns kriptasejtet tartalmazó foci szám. Amennyiben a Pretlow és munkatársai által nyert eredménynek függvényében ezt a tényt vizsgáljuk valószínű, hogy ez az inhibiálás egyben azt is jelenti, hogy a tumor inhibiálás is megtörténik, amenynyiben az állatokat egy későbbi időpontban is megvizsgáljuk.

3. példa

5-ASA oxidációs termékeinek hatása az in vítro vastagbél rákos sejt proliferációra

Habár a balsalaziddal kifejtett inhibiálás a fenti példákban mindkét sejt tí pus esetében azonos volt az LS174T sejtek megismételhetően érzékenyebbek voltak az 5-ASA hatására, mint a HT-29 sejtek. Ezen túlmenően mindkét sejttípus

5-ASA hatására kifejtett inhibiálás válaszfüggvénye az egyes kísérletekben ma ximális 70% és minimális 10% érték között változott. Megvizsgáltuk, hogy mi az oka ennek az eltérésnek és azt tapasztaltuk, hogy a tárolt 5-ASA oldatok, melye ket legalább három nappal a sejtekhez történő adagolás előtt készítettünk meg ismételhetöen nagyobb inhibiáló hatást fejtettek ki. Ezt a különbséget a 7. ábrán mutatjuk be. Ebben a kísérletben az LS174T sejt növekedést frissen oldott 10 mmol 5-ASA oldatnak vetettük alá, és a sejtek növekedése a kontroll sejtek növe kedésének 4 napon át mért értékével 82,7%-a volt. Ezzel szemben párhuzamos tenyészetek esetében, amelyeket olyan 10 mmol 5-ASA oldattal kezeltünk, amely oldatot a táptalajban 4 nappal a kezelés kezdete előtt készítettünk, a 4 napon át mért sejtnövekedési válaszfüggvény a kezelt sejtek esetében a kontroll sejtek nö vekedésének csak 22,9%-a volt. Ez a meglepő eltérés azt a feltételezést ered ményezi, hogy állás közben az 5-ASA valamelyik táptalaj komponens jelenlét ében következtében valamely aktívabb metabolittá alakult át.

Az 5-ASA másik jelentős aktivitása az antioxidáns jellemző. Valóban, bizo nyos terápiás esetekben a bél gyulladás kezelésére valószínűleg alkalmazható, mivel képes a szabadgyökök befogására, beleértve az O₂' gyököt, amelyet gyul ladásos sejtek bocsátanak ki, és ebből eredően csökkenti az oxidatív károsító hatást. Ez feltételezi, hogy az 5-ASA inhibiáló hatásának változása amennyiben ezt szövettenyészet táptalajban előinkubáltuk, valószínűleg valamely oxidációs folyamat következtében alakul ki. Abból a célból, hogy ezt a lehetőséget megvizsgáljuk az 5-ASA vegyületet oxidációs reakcióban reagáltattuk nátrium-hipoklorit segítségével, amelyet különböző koncentrációban alkalmaztunk, majd megvizsgáltuk az oxidációt követően a sejtnövekedésre kifejtett ínhibiáló aktivitást. Az eredményeket a III. táblázatban az alábbiakban mutatjuk be, és ezek azt jelzik, hogy nagyobb mennyiségű vagy növekvő mennyiségű hipoklorit növeli az 5-ASA ínhibiáló aktivitását.

III. táblázat

5-ASA növekedési ínhibiáló aktivitás növekedése hipoklorit reakció után

5-ASA (mmol)	Na-hipoklorit te (mmol)	*Növekedés inhibiálás (%)
10	0	0
10	0,01	2
10	0,05	4
10	0,1	8
10	0,2	26
10	0,3	42
10	0,4	48

* A nem oxidált 5-ASA alap ínhibiáló aktivitása 45%.

A 0,4 mmol NaOCI háttér ínhibiáló aktivitás kisebb, mint 2%.

Más kutatók által nyert számos vizsgálat kimutatta, hogy amennyiben oxidáló körülmények közé helyezzük, amely lehet például hipoklorit vagy hidrogén• · • · · · • · · • ···· ···· · · ’ - 35 -peroxid segítségével kifejtett oxidáció, ez számos eltérő 5-ASA metabolitot eredményezhet. Két ilyen oxidáció termék a gentizinsav (Dűli és munkatársai (1987) Biochem. Pharmacol. 36:2467-2472) és az 5-nitro-szalicilát (Laffafian és munkatársai (1991) Biochem. Pharmacol. 42:1869-1874). A fenti eredmények tükrében megvizsgáltuk az 5-ASA fenti oxidációs termékeinek hatását a vastagbél rákos sejtek növekedésének inhibiálásában. Mint az alábbi IV. táblázatban bemutatjuk négy eltérő, humán vastagbél ráksejt vonal alkalmazásával mindkét metabolit inhibiálta a sejtnövekedést és az 5-nitro származék aktívabbnak bizonyult. A balsalazid viszonylagos hatása ennek első metabolitja az 5-ASA hatása és a két lehetséges 5-ASA oxidációs termék hatása a növekedés inhibiálásban valamennyi sejtvonal esetében az alábbi IV. táblázatban található.

IV. táblázat

IC₅₀ értékek a balsalazid és metabolitjai esetében a humán vastagbél ráksejtek proliferációjának inhibiálásában. A koncentrációk mmol értékek.

Sejtvonal	Balsalazid	5-ASA	5-ASAox	Gentisa	5-NSA
LS174T	5,29	11,56	6,55	5,85	2,69
HT-29	5,71	11,89	5,91	5,05	1,63
LoVo	5,00	10,21	5,44	4,42	1,38
HRT-18	3,88	10,49	6,98	2,98	1,46

Valamennyi a fenti leírásban idézett közleményt és szabadalmi bejelentést referenciaként adunk meg, valamint az ezekben idézett szakirodalmakat és szabadalmi bejelentéseket is, ugyancsak referenciaként tekintjük.

- 36 A találmány szerinti eljárást részletesen ismertettük, azonban a szakember számára nyilvánvaló, hogy a találmány tárgykörét ez nem korlátozza és bármely olyan módosítást és változtatást is beleértünk, amely alapvetően a találmány lényegét nem érinti.

Claims (9)

1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK

   1. Gyógyszerkészítmény alkalmazása, amely gyógyszerkészítmény az (I) általános képletű 2-hidroxi-5-fenil-azobenzoesav-származékot, vagy észter, vagy aktív metabolit formáját, vagy az aktív metabolit forma oxidációs termékét vagy a
2. 2-hidroxi-5-fenil-azobenzoesav gyógyszerészetileg elfogadható sóját vagy ennek észter formáját, vagy aktív metabolitját, vagy valamely aktív metabolitjának oxidációs termékét tartalmazza, ahol az általános képletben X jelentése -SO₂-csoport vagy karbonilcsoport; és

   R jelentése fenilcsoport vagy karboxi-metil-fenil-csoport, vagy -(CH₂)_n-Y általános képletű csoport, ahol

   Y jelentése hidroxilcsoport, aminocsoport, monoalkil- vagy dialkil-amino-csoport, ahol az alkilcsoportok maximálisan 6 szénatomot tartalmazhatnak, vagy karboxilcsoport, vagy szulfonsavcsoport; és n jelentése 1-6 közötti egész szám, és amelyben az alkiléncsoportban egy vagy több hidrogénatom aminocsoporttal helyettesített, monoalkil- vagy dialkil-amino-csoporttal helyettesített lehet, ahol az alkilcsoportok maximálisan 6 szénatomot tartalmaznak, vagy alkilcsoport, amelyben -(CH₂)_n-Y csoport közvetlenül a nitrogénatomhoz kapcsolódik vagy benzolgyűrűn keresztül kapcsolódik, azzal a feltétellel, hogy R-NH-X általános képletű csoport jelentése nem lehet -CO-NH-CH₂-COOH csoport; gyógyszer előállítására, amely alkalmas valamely beteg kezelésében történő felhasználásra, amely beteg vagy vastagbél rákban szenved, vagy fennáll a veszélye, hogy vastagbél rák fejlődik ki a betegben, és amely eljárás, azzal jellemezhető, hogy a humán betegnek a fenti gyógyszerkészítmény hatásos mennyiségét adagoljuk.

   ···· • · · · • · · · • · · · ·· ·»

   2. Az 1. igénypont szerinti alkalmazás, amely esetben a fenti gyógyszerkészítmény a 2-hidroxi-5-fenil-azobenzoesav-származékot, vagy észter vagy aktív metabolit formáját, vagy az aktív metabolit forma oxidációs termékét tartalmazza, vagy 2-hidroxi-5-fenil-azobenzoesav-származék sót, vagy ennek észter formáját, vagy aktív metabolit formáját, vagy valamely aktív metabolit formájának oxidációs termékét tartalmazza szilárd vagy folyékony gyógyszerészetileg elfogadható hígító- vagy hordozóanyagokkal együtt.
3. 3. Az 1. igénypont szerinti alkalmazás, amelyben az alkalmazott 2-hidroxi-5-fenil-azobenzoesav-származék balsalazid.
4. 4. Az 1. igénypont szerinti alkalmazás, amelyben az alkalmazott aktív metabolit 5-ASA.
5. 5. Az 1. igénypont szerinti alkalmazás, ahol az alkalmazott aktív metabolit oxidációs termék az 5-ASA valamely oxidációs terméke.
6. 6. Az 5. igénypont szerinti alkalmazás, ahol az alkalmazott 5-ASA oxidációs termék a gentisin sav.
7. 7. Az 5. igénypont szerinti alkalmazás, ahol az alkalmazott 5-ASA oxidációs terméke az 5-nitro-szalicilát.
8. 8. Az 1. igénypont szerinti alkalmazás, amelyben a gyógyszerkészítményt a humán betegnek, amely ilyen kezelést igényel, orálisan adagoljuk 1-14 g/70 kg testtömeg/nap dózisban a 2-hidroxi-5-fenil-azobenzoesav-származék vagy észter formában, vagy aktív metabolit formában, vagy az aktív metabolit forma oxidációs terméke formájában, vagy a 2-hidroxi-5-fenil-azobenzoesav-származék só, vagy ennek észter formájának, vagy aktív metabolit formában, vagy valamely aktív metabolit forma oxidációs termék formájában.

   ····
9. 9. Az 1. igénypont szerinti alkalmazás, ahol az ilyen kezelést igénylő humán betegnek a gyógyszerkészítményt rektálisan adagoljuk 1-14 g/70 kg testtömeg/napi dózis értékben a 2-hidroxi-5-fenil-azobenzoesav-származék, vagy ennek észter formája, vagy aktív metaboiit formája, vagy valamely aktív metabolit oxidációs termék formája alakjában, vagy a 2-hidroxi-5-fenil-azobenzoesav-származék só, vagy ennek észter formája, vagy aktív metabolit formája, vagy valamely aktív metabolit forma oxidációs termék formája alakjában.