HUT69606A - Method for the selection of genetically transformed cells and compounds for use in the method - Google Patents

Method for the selection of genetically transformed cells and compounds for use in the method Download PDF

Info

Publication number
HUT69606A
HUT69606A HU9400570A HU9400570A HUT69606A HU T69606 A HUT69606 A HU T69606A HU 9400570 A HU9400570 A HU 9400570A HU 9400570 A HU9400570 A HU 9400570A HU T69606 A HUT69606 A HU T69606A
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
compound
cells
glucuronidase
transformed cells
nucleotide sequence
Prior art date
Application number
HU9400570A
Other languages
English (en)
Other versions
HU9400570D0 (en
HU227979B1 (en
Inventor
Robert J Whenham
Finn T Okkels
Original Assignee
Sandoz Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=8105710&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=HUT69606(A) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Sandoz Ltd filed Critical Sandoz Ltd
Publication of HU9400570D0 publication Critical patent/HU9400570D0/hu
Publication of HUT69606A publication Critical patent/HUT69606A/hu
Publication of HU227979B1 publication Critical patent/HU227979B1/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H15/00—Compounds containing hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals directly attached to hetero atoms of saccharide radicals
    • C07H15/20—Carbocyclic rings
    • C07H15/203—Monocyclic carbocyclic rings other than cyclohexane rings; Bicyclic carbocyclic ring systems
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H15/00—Compounds containing hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals directly attached to hetero atoms of saccharide radicals
    • C07H15/26—Acyclic or carbocyclic radicals, substituted by hetero rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H17/00—Compounds containing heterocyclic radicals directly attached to hetero atoms of saccharide radicals
    • C07H17/02—Heterocyclic radicals containing only nitrogen as ring hetero atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
    • C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
    • C07H19/04—Heterocyclic radicals containing only nitrogen atoms as ring hetero atom
    • C07H19/16—Purine radicals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
    • C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
    • C07H19/04—Heterocyclic radicals containing only nitrogen atoms as ring hetero atom
    • C07H19/16—Purine radicals
    • C07H19/20—Purine radicals with the saccharide radical esterified by phosphoric or polyphosphoric acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/65—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression using markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C12N15/8209—Selection, visualisation of transformants, reporter constructs, e.g. antibiotic resistance markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
    • C12N15/8245—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine involving modified carbohydrate or sugar alcohol metabolism, e.g. starch biosynthesis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0018—Culture media for cell or tissue culture
    • C12N5/0025—Culture media for plant cell or plant tissue culture
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2434—Glucanases acting on beta-1,4-glucosidic bonds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/90—Isomerases (5.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/90—Isomerases (5.)
    • C12N9/92—Glucose isomerase (5.3.1.5; 5.3.1.9; 5.3.1.18)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01031—Beta-glucuronidase (3.2.1.31)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Transition And Organic Metals Composition Catalysts For Addition Polymerization (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Heterocyclic Carbon Compounds Containing A Hetero Ring Having Oxygen Or Sulfur (AREA)

Description

A találmány tárgya eljárás genetikailag transzformált növényi sejtek szelektálására, amelyekbe egy kiválasztott nukleotid-szekvenciát építettünk be, oly módon hogy a transzformált sejteknek szelektív előnyt biztosítunk, anélkül, hogy a nem-transzformált sejteket elpusztítanánk, illetve a találmány tárgyát képezik az eljárás során alkalmazott új vegyületek.
Jól ismert tény, hogy ha egy új genetikai anyagot kell bejuttatni egy sejtpopulációba transzformációval, akkor a sejteknek csak egy bizonyos számát sikerül transzformálni, azaz csak ezek kapják meg az új genetikai anyagot. Azután azonosítani kell a genetikai transzformált sejteket, hogy ezek elkülöníthetők legyenek a populációban maradt nemtranszformált sejtektől. A transzformált sejtek azonosítása és elválasztása hagyományosan a negatív szelekció elvén alapul, másszóval egy olyan módszer alkalmazásán, amelyben csak a transzformált sejtek képesek életben maradni és szaporodni, míg a nem-transzformált sejtek szaporodása gátolt, vagy éppen el is pusztulnak egy olyan anyag hatására, amelyet a transzformált sejtek el tudnak viselni.
Például, ha egy növényi sejtpopulációt genetikai transzformációnak vetünk alá, akkor a transzformált sejtek szelekciója tipikusan olyan szelekciós gén alapján történik, amely egy antibiotikum vagy herbicid rezisztenciát kódol. A szelekciós gént - amelynek önmagában nincs hasznos funkciója a genetikailag transzformált növényben és esetleg éppen káros hatással van a növényre - egy olyan génhez kapcsoljuk, illetve azzal ko-transzformáljuk a kérdéses növénybe úgy, hogy mindkét gén beépüljön a sejtpopulációba, illetve inkább a populáció egyes sejtjeibe, mivel a gyakorlatban nincs lehetőség arra, hogy az összes sejtet, vagy legalább a legtöbb sejtet transzforrnáÍjuk. A sejteket azután egy olyan táptalajon vagy táptalajban tenyésztjük, amely azt az antibiotikumot vagy herbicidet tartalmazza, amelyre a genetikailag transzformált sejtek a szelekciós gén hatására rezisztensek, ezzel lehetővé válik a transzformált sejtek azonosítása, mivel a nem-transzformált sejtek - amelyek nem tartalmazzák a kérdéses antibiotikum vagy herbicid rezisztencia gént növekedése gátlódik, illetve elpusztulnak.
Ezen negatív szelekciós módszereknek azonban megvan a hátrányuk is. Először is, a nem-transzformált sejtek elpusztulhatnak a szelekciós ágens, például az antibiotikum jelenléte miatt a táptalajban. Ennek következtében ha a sejtpopuláció egy egybefüggő szövet, akkor megvan annak a kockázata, hogy nemcsak a nem-transzformált sejtek, hanem a transzformált sejtek is elpusztulnak, annak következtében, hogy a nem-transzformált sejtek pusztulása elvághatja a tápanyag-utánpótlást a transzformált sejtekhez, illetve a roncsolt vagy pusztuló sejtek toxikus vegyületeket választhatnak ki.
A negatív szelekció egy másik hátránya, hogy egy szükségtelen gén, például egy antibiotikum rezisztencia van jelen, amely esetleg nem kívánatos. Például a környezetvédő csoportok és kormányhatóságok azon gondolkodnak, hogy vajon biztonságos-e antibiotikum-rezisztenciát kódoló géneket beépíteni növényekbe és mikroorganizmusokba. Ennek a megfonto lásnak különösen az élelmiszer-növények és olyan mikroorganizmusok esetében van jelentősége, amelyeket nem egy zárt környezetben való felhasználás céljára terveztek (például a mezőgazdaságban használatos növények), valamint olyan mikroorganizmusoknál, amelyeket zárt környezetben való felhasználás céljára terveztek, de amelyek véletlenszerűen kiszabadulhatnak a zárt környezetből. Jóllehet ezek a megfontolások lehetnek alaptalanok, mégis vezethetnek ahhoz, hogy a kormányzat korlátozza az antibiotikum-rezisztencia gének felhasználását például növényekben, és ennek következtében kívánatos lehet új módszerek kifejlesztése genetikailag transzformált sejtek szelektálására, amelyek nem függenek az ilyen génektől.
A negatív szelekció hátránya továbbá, hogy a toxikus anyagokkal kezelt növényi szövetek vagy sejtek sokkal érzékenyebbekké válnak a baktérium-fertőzésre. Ez például akkor probléma, amikor az Agrobacteriumot használjuk transzformáló vektorként, mivel a kezelt szöveteket vagy sejteket néha túlnövik a baktériumok még akkor is, ha a baktériumok szaporodásának gátlására antibiotikumokat használunk.
Emellett a sejtek vagy szövetek szelektálására negatív szelekció alkalmazása megköveteli, hogy a bevitt gén expresszióját nagyon pontosan időzítsük a szelekciós eljáráshoz. Ha a transzgenikus sejteket egy toxikus vegyülettel kezeljük, mielőtt a detoxikáló gén expresszálódik, illetve mielőtt elegendő géntermék keletkezik a toxikus vegyület hatásának antagonizálására, a transzgenikus sejtek a nemtranszgenikus sejtekkel együtt pusztulnak el. Ha a szelekci5 ót túl későn végezzük, akkor a transzgenikus sejtek vagy szövetek szelekciója gátlódhat, például azáltal, hogy a nemtranszgenikus sejtek vagy szövetek hajtást növesztenek.
A fenti hátrányokat ki lehet küszöbölni a jelen találmány szerinti módszer alkalmazásával (a pozitív szelekció alkalmazásával), amely először teszi lehetővé, hogy genetikailag transzformált sejteket azonosítsunk és izoláljunk, anélkül, hogy a nem-transzformált sejteket károsítanánk vagy elpusztítanánk a populációban, és anélkül, hogy antibiotikum vagy herbicid rezisztencia gént juttatnánk be a növénybe. Amellett, hogy nincs szükség antibiotikum vagy herbicid rezisztencia gén alkalmazására, azt is igazoljuk, hogy a jelen találmány szerinti pozitív szelekciós módszer gyakran sokkal hatékonyabb mint a tradicionális negatív szelekció. Amint azt az alábbi példákban ismertetjük, a dohány levélkorongokból szelektált transzgenikus hajtások száma pozitív szelekció alkalmazásával például harmincszor nagyobb, mint a szokásos kanamicin alapú negatív szelekciós rendszer alkalmazásánál, és a transzgenikus hajtásoknál a pozitív, valamint a negatív szelekció kombinációjával tízszer nagyobb szelekciós frekvenciát lehet elérni, mint ha csak a negatív szelekciót alkalmazzuk (lásd 11. példa). Emellett a pozitív szelekció használatának megvan az az előnye is, hogy egyetlen gén használható riporter génként és szelekciós génként is, ezzel leegyszerűsödik a vektor konstrukciója, sokkal stabilabbak a konstrukciók, és 100 %-os a korreláció a riporter gén és a szelekciós gén expressziója között. A pozitív szelekció eliminálja az előzőkben említett, az időzi téssel kapcsolatos problémákat is, mivel a szelekciót eredményező vegyületek mindig a gén expressziója következtében keletkeznek. Tehát a szelektív hatóanyag akkor halmozódik fel, ha a szelekciós gén expresszálódik, a szelekció akkor lép fel, ha már elegendő mennyiségű szelektív hatóanyag termelődött.
A találmány tárgya tehát eljárás genetikailag transzformált sejtek szelektálására egy sejtpopulációból, úgy, hogy a transzformált sejtekbe egy kiválasztott nukleotid szekvenciát juttattunk be, miközben a transzformált sejtekben a kiválasztott nukleotid-szekvencia vagy egy azzal együtt bejuttatott nukleotid-szekvencia egy, a sejtpopuláció tápanyagához adagolt vegyület vagy tápanyag pozitív hatását fokozza, és ezzel lehetővé teszi, hogy a transzformált sejtek azonosíthatók, illetve szelektálhatok legyenek a nemtranszformált sejtek közül.
Az egyik megvalósítási mód szerint az eljárást úgy hajtjuk végre, hogy a sejtpopulációt egy olyan táptalajon vagy táptalajban tenyésztjük, amely legalább egy olyan inaktív vegyületet vagy tápanyagot tartalmaz, amely közvetlenül vagy közvetve aktiválódik azokban a sejtekben, amelyek a kiválasztott nukleotid-szekvenciát, illetve az azzal együtt bejuttatott szekvenciát tartalmazzák, de a vegyület vagy tápanyag inaktív marad a nem-transzformált sejtekben, illetve kevésbé aktív a nem-transzformált sejtekben mint a transzformált sejtekben, így a transzformált sejtek szelektív előnyre tesznek szert, és ezáltal a sejtpopulációból kiválaszthatók .
Egy másik megvalósítási mód szerint az eljárást úgy hajtjuk végre, hogy a sejtpopulációt egy olyan táptalajon vagy táptalajban tenyésztjük, amely legalább egy olyan vegyületet vagy tápanyagot tartalmaz, amely akkor hozzáférhető a transzformált sejt számára, ha a kiválasztott nukleotid-szekvencia, illetve a vele együtt bejuttatott nukleotid-szekvencia expresszálódik vagy átíródik, a vegyület vagy tápanyag nem hozzáférhető a nem-transzformált sejtek számára, illetve kevésbé hozzáférhető a nem-transzformált sejtek számára, mint a transzformált sejtek számára, így a transzformált sejtek szelektív előnyre tesznek szert, és ezáltal a sejtpopulációból kiválaszthatók.
Egy másik megvalósítási mód szerint a kiválasztott nukleotid-szekvenciával együtt bejuttatott szekvencia expressziója fokozza egy olyan enzimnek az aktivitását, amely endogén módon megtalálható a sejtpopulációban, oly módon, hogy a transzformált sejtekben az enzim aktivitása nagyobb mint a nem-transzformált sejtekben levő enzim aktivitása.
Egy további megvalósítási mód szerint a kiválasztott nukleotid-szekvencia, vagy a kiválasztott nukleotid szekvenciával együtt bejuttatott nukleotid-szekvencia expressziója azt eredményezi, hogy egy, a sejtpopulációhoz adagolt vegyület metabolizmusa blokkolódik, illetve egy vegyület szintézise blokkolódik a transzformált sejtekben, és ezáltal a transzformált sejtek megkülönböztethetőek vagy szelektálhatok a nem-transzformált sejtek közül.
A találmány tárgyát képezik továbbá olyan új hatóanyagok, amelyek alkalmazhatók az említett eljárásban.
E hatóanyagokat az (I) általános képlet szemlélteti, ahol
R2 jelentése hidrogénatom, -CH3, -S-CH3, -SO2-CH3, -SCH2-fenil, -SH, -OH, képletű csoport, klóratom vagy -S-R10, -NH-R10 vagy -0-R10 általános képletű csoport, ahol rIO jelentése egy B-D-glükopiranuronozil-csoport (ennek szerkezetét a példákban szemléltetjük), illetve ennek sója vagy a karbonsav-funkciónál kialakított észter- vagy amid-származéka/ R6 jelentése benzilcsoport, amely a fenilcsoporton hidroxil-, 1-6 szénatomos alkoxicsoporttal, halogénatommal, 1-4 szénatomos alkilcsoporttal, -NH2 vagy -CF3 csoporttal vagy -0-R10, -S-R10 vagy -NH-R10 általános képletű csoporttal lehet helyettesítve;
1-8 szénatomos alkil- vagy 2-8 szénatomos alkenilcsoport, amely egy-három hidroxil-, glükózil-oxivagy 1-6 szénatomos alkoxi-, fenil- és/vagy -0-R10, -S-R10 vagy -NH-R10 általános képletű csoporttal lehet helyettesítve; észterezett 1-6 szénatomos alkil- vagy 2-6 szénatomos alkenil-, furfuril- vagy ciklohexil-ureido-, fenil-ureido- vagy toluilureído-csoport; és vagy i) R7 és Y együttesen egy kötést képeznek;
ii) R3 és R9 közül az egyik hidrogénatom vagy egy R10 általános képletű csoport, a másik pedig az X helyettesítővel együtt egy kötést képez, vagy R9 jelentése ribozil-, 5'-foszforibozil-, glükozil vagy -CH2CH(NH2)COOH csoport, és R3 az X helyettesítővei együtt egy kötést képez, és iii) R8 jelentése hidrogénatom, -CH3, -S-CH3,
-SO2-CH3, -S-CH2-fenil, -SH, -OH, Cl vagy -S-R10,
-NH-R10 vagy -O-R10 általános képletű csoport;
vagy ív) R7 jelentése ribozil-, 5'-foszforibozil vagy glükózilesöpört, R8 jelentése hidrogénatom, R9 és Y együttesen egy kötést képeznek, és R3 és X együttesen egy kötést képez;
azzal a feltétellel, hogy R2, R3, R6, R8 és R9 közül az egyik egy β-D-glükopiranuronozil-csoportot, illetve annak sóját vagy a karbonsavfunkciónál kialakított észter- vagy amid-származékát képviseli vagy tartalmazza.
A találmány tárgykörébe tartoznak továbbá olyan vegyületek, amelyek a fenti eljárásban használhatók. Ilyenek a (II) általános képletű vegyület, ahol
RÍ jelentése cisz-CH=CH-COOH csoport, annak sója, illetve a karbonsavcsoporton kialakított észterszármazéka, illetve a cisz- és/vagy transz-CH=CH-COOH csoporton kialakított amidszármazéka, és rIO jelentése a fenti.
Emellett a találmány tárgyát képezik genetikailag transzformált sejtek, amelyeket az előzőkben ismertetett módszer alapján szelektálunk, különösen növényi sejtek valamint növények, azok utódai és magvak, amelyek az ilyen genetikailag transzformált sejtekből származnak.
- 10 A sejt kifejezésen bármely olyan sejttípust értünk, amelyből egyedi, genetikailag transzformált sejtek azonosíthatók és izolálhatok a találmány szerinti módszer alkalmazásával, beleértve a növényi sejteket, állati sejteket és mikroorganizmusokat, azaz a baktériumokat, gombákat, élesztőket stb. A sejt kifejezés emellett protoplasztokra is vonatkozik, azaz a sejtek membránnal határolt plazmájára, amelynek nincs sejtfala. Jóllehet nyilvánvaló, hogy a találmány szerinti általános elvek bármely sejttípusra használhatók, a módszert különösen alkalmasnak találtuk arra, hogy genetikailag transzformált sejteket szelektáljunk vele.
A sejtpopuláció kifejezés bármely olyan sejtcsoportra vonatkozik, amelyet genetikai transzformációnak vetettek alá, és amelyből olyan sejteket szeretnénk azonosítani, amelyek genetikailag transzformálva vannak, és a genetikailag transzformált sejteket szeretnénk elválasztani a genetikailag nem-transzformált sejtektől. A populáció lehet például egy szövet, egy szerv vagy azok egy része, különálló sejtek populációja egy szubsztráton vagy szubsztrátban, azaz például mikroorganizmus sejtek tenyészete vagy egy egész szervezet, például egy egész növény.
A szelektálás kifejezés egy olyan eljárásra vonatkozik, amellyel a genetikailag transzformált sejteket azonosítani és/vagy izolálni lehet a genetikailag nem-transzformált sejtek közül, az alábbiakban ismertetett módszer alkalmazásával.
A kiválasztott nukleotid-szekvencia szakkifejezés jelenthet bármely nukleotid-szekvenciát, amelyet a kérdéses sejtbe be akarunk juttatni, hogy ezáltal genetikailag transzformált sejteket hozzunk létre. A nukleotid szekvenciák növényekbe, mikroorganizmusokba és állatokba való bejuttatását széles körben gyakorolják, és nincs korlátozás azokra a nukleotid-szekvenciákra nézve, amelyeknek a jelenlétét ki lehet mutatni a pozitív szelekciós módszer segítségével, amelyet az alábbiakban ismertetünk. Ennek a módszernek az alkalmazásával a kiválasztott szekvencia jelenléte a genetikailag transzformált sejtekben meghatározható anélkül, hogy az előzőkben említett, a tradicionális negatív szelekciós rendszerekhez kötődő hátrányok előfordulnának.
Az az állítás, hogy egy nukleotid-szekvenciát együtt bejuttatunk a kiválasztott nukleotid-szekvenciával, arra a tényre utal, hogy a két nukleotid-szekvenciát egymáshoz kapcsoljuk, illetve más módon együtt juttatjuk be őket oly módon, hogy az együtt bejuttatott nukleotid-szekvencia a sejtben jelzi, hogy a kiválasztott nukleotid-szekvenciát is bejuttattuk a sejtbe, azaz, ha az egyik nukleotid-szekvenciáról kimutattuk, hogy sikerült bevinni, akkor annak valószínűsége, hogy a másikat is sikerült bejuttatni, jelentősen megnő. Tehát a két nukleotid-szekvencia általában, de nem szükségszerűen ugyanannak a genetikai konstrukciónak a részét képezi, és így ugyanazzal a vektorra lehet bejuttatni.
Az alábbiakban ismertetett módszerek akkor is használhatók, ha az együtt bejuttatott nukleotid-szekvenciát és a kiválasztott nukleotid-szekvenciát egymástól függetlenül visszük be egy sejtbe. Ezt például úgy hajthatjuk végre, hogy ugyanazt a baktériumot használjuk mindkét gén bevitelére, és a kiválasztott nukleotid szekvenciából viszonylag nagyszámú molekulát építünk be a sejtekbe, és ennek következtében annak valószínűsége viszonylag nagy, hogy azok a sejtek, amelyekről ki lehet mutatni, hogy az együtt bejuttatott nukleotid-szekvenciát expresszálják, tartalmazzák és expresszálják a kiválasztott nukleotid-szekvenciát is. Két vagy több gén egymástól független bejuttatása, amely a géneknek ugyanabban a sejtben való együtt expressziójával végződik, várhatóan alacsony valószínűséggel játszódik le, és a pozitív szelekciós módszerrel kapott magasabb szelekciós frekvenciák ennélfogva várhatóan különösen előnyösek az ilyen rendszerekben.
Mivel szükséges, hogy a bejuttatott nukleotid-szekvenciák expresszálódjanak a transzformált sejtekben, egy konstrukció, amely a két nukleotid-szekvenciát tartalmazza, általában, de nem szükségszerűen tartalmaz szabályozó szekvenciákat is, amelyek lehetővé teszik, hogy a nukleotid-szekvenciák expresszálódjanak; ilyenek például az ismert promoterek és transzkripciós terminátorok. Tehát az együtt bejuttatott nukleotid-szekvencia általában egy promoterhez kapcsolódik, amely lehet konstitutív vagy szabályozható promoter, és a kiválasztott nukleotid-szekvencia általában szintén egy konstitutív vagy szabályozható promoterhez kapcsolódik.
Amint az előzőkben említettük, a módszer különösen alkalmas genetikailag transzformált növényi sejtek szelektálására, ezzel lehetővé téve az ilyen sejtek azonosítását és izolálását, anélkül, hogy szelekciós géneket használnánk, amelyek antibiotikum vagy herbicid rezisztenciát kódolnak. Tűni a hagyományos negatív szelekciós módszereket illeti, az itt ismertetett pozitív szelekciós módszer használható sejtek in vitro történő szelektálására. De a pozitív szelekciós módszer használható in vivő is. A pozitív szelekciós módszer in vivő történő alkalmazása különösen fontos az egész növényekkel vagy növényi részekkel végzett genetikai transzformáció esetében, amikor a növények vagy növényi részek mind transzformált és nemtranszformált növényi részeket tartalmaznak, mivel a transzformált sejtek szelekcióját anélkül érhetjük el, hogy közvetlenül károsítanánk a szomszédos nemtranszformált sejteket. így tehát a transzformált sejtek szelektív előnnyel rendelkeznek a nemtranszformált sejtekkel szemben (például képesek hajtásokat hozni), de a nem transzformált sejtek nem szenvednek semmilyen súlyos hátrányt abból a szempontból, hogy károsodnak vagy elpusztulnak, amint az az antibiotikumokat vagy herbicideket alkalmazó negatív szelekció esetében történik.
Az inaktív vegyület vagy tápanyag kifejezés jelenthet bármely olyan vegyületet vagy tápanyagot inaktív vagy prekurzor formában, azaz olyan formában, hogy az együtt bejuttatott nukleotid-szekvencia expressziójának hiányában egy olyan formában létezik, amely biológiailag lényegében inaktív a kérdéses sejtek szempontjából, de amely az együtt bejuttatott nukleotid-szekvencia expresszálása vagy transzkripciója esetében hidrolizál vagy más módon aktiválódik, illetve metabolizálódik, és így olyan, genetikailag transz formált sejtek jönnek létre, amelyek tartalmazzák a kiválasztott nukleotid-szekvenciát, és ennek következtében szelektív előnnyel rendelkeznek, és lehetővé válik, hogy azonosítsuk és izoláljuk őket. Az inaktív vegyület vagy tápanyag lehet tehát egy inaktív növényi növekedés-szabályozó, például egy inaktivált citokinin, auxin vagy gibberellin, egy vitamin, például inaktivált tiamin, egy szénhidrát (például mannóz, ha az együtt bejuttatott nukleotid-szekvencia mannóz-6-foszfát-izomerázt tartalmaz, vagy galaktóz, vagy egy galaktózt tartalmazó vegyület, ha az együtt bejuttatott szekvencia UDP-galaktóz-4-epimerázt kódol), egy nitrogéntartalmú vegyület (például egy opin, ha az együtt bejuttatott nukleotid-szekvencia egy opin-metabolizmus vagy -transzport enzimet kódol), keményítő, fehérje vagy bármely más tápanyag inaktív formában, vagy egy olyan vegyület, amelynek lényeges szerepe van a sejtek és szövetek differenciálódásában és dedifferenciálódásában. A sejtek és szövetek vegyületekkel való kezelése, beleértve az esszenciális vegyületek kiegészítő hozzáadásától való függőség indukálását, használható a megfelelő inaktív vegyületekkel. Ez a megközelítés használható például akkor is, ha a szterin- vagy szaponin-szintézist gátoljuk és inaktív szterineket vagy szaponinokat adunk hozzá. Az inaktív vegyület lehet továbbá például egy ásványi anyag, amely kelátot képez, és ezáltal elérhető a genetikailag transzformált sejtek számára.
A hagyományos negatív szelekcióval ellentétben, amelyben a nemtranszformált sejtek károsodnak vagy elpusztulnak egy antibiotikum, herbicid vagy toxin táptalajban való jelenlétének következtében, a pozitív szelekció során alkalmazott inaktív vegyületek vagy tápanyagok nem rendelkeznek káros hatással a nemtranszformált sejtekre nézve. Ezzel ellentétben, a transzformált sejtek rendelkeznek azzal a fiziológiai előnnyel, amely lehetővé teszi, hogy azonosítsuk és izoláljuk őket, míg a nemtranszformált sejteket nem érinti, illetve sokkal kevésbé érinti a szelekciós célokkal alkalmazott inaktív vegyület vagy tápanyag jelenléte.
A hagyományos negatív szelekciós módszereket tehát az jellemzi, hogy egy olyan szelekciós gént használnak, amely csökkenti egy hozzáadott vegyületnek a transzformált sejtekre gyakorolt negatív hatását. Ezzel szemben a pozitív szelekció kifejezés egy olyan szelekciós gén alkalmazására utal, amely egy hozzáadott vegyületnek a transzformált sejtekre gyakorolt pozitív hatását idézi elő vagy fokozza.
Egy szelekciós eljárásban alkalmazott vegyület emellett rendelkezhet mind pozitív, mind negatív hatással. Például a mannóz a legtöbb növényi sejtre toxikus, de a mannóz-6-foszfát-izomerázt tartalmazó sejtekben a negatív hatás eliminálódik és a sejtek emellett azzal az előnnyel is rendelkeznek, hogy képesek a mannózt szénhidrátforrásként alkalmazni. Ebben az esetben egy adott vegyület és egy adott gén egy kombinált pozitív és negatív szelekciós rendszer komponensei, jóllehet egy ilyen kombinált pozitív és negatív rendszer úgy is létrehozható, hogy két vagy több gént alkalmazunk, amelyek együttesen felelnek a vegyület negatív hatásainak gátlásáért és a vegyület pozitív hatásainak megnyilvánulásáért a transzformált sejtekben.
• Λ
- 16 A pozitív szelekcióban alkalmazott inaktív vegyület vagy tápanyag nem feltétlenül olyan, hogy közvetlenül aktiválja az együtt bejuttatott nukleotid-szekvencia által kódolt polipeptid. Lehet olyan is, amely közvetve aktiválódik, azaz az együtt bejuttatott nukleotid-szekvenciának van egy indirekt hatása az indirekt vegyületre vagy tápanyagra a genetikailag transzformált sejtekben, de nincs meg ez a hatás a nemtranszformált sejtekben. Tehát az együtt bejuttatott nukleotid-szekvencia lehet olyan, amely a transzformált sejtben való expresszió hatására például közvetve fokozza egy olyan enzim hatását, amely az adott sejtpopulációban természetesen megtalálható, ennélfogva egy magasabb enzimaktivitást eredményez, és a kérdéses inaktív vegyület vagy tápanyag aktiválását a genetikailag transzformált sejtekben.
Az együtt bejuttatott nukleotid-szekvencia lehet például olyan, amely egy permeázt vagy egyéb transzport faktort kódol, amely lehetővé teszi, hogy a kérdéses vegyület vagy tápanyag átlépje a sejtmembránt és belépjen a transzformált sejtbe, illetve átlépjen egy másik (sejtszerv) membránt, azaz az inaktív vegyület vagy tápanyag aktiválása ebben az esetben azt jelenti, hogy a vegyületet vagy tápanyagot szelektíven felveszik a transzformált sejtek, míg a nem-transzformált sejtek nem képesek felvenni a vegyületet vagy tápanyagot, illetve sokkal kisebb sebességgel veszik fel. Ahelyett, hogy egy vegyület felvételét megkönnyítené a sejtbe, az együtt bejuttatott szekvencia a termékét egy olyan sejtrészecskébe irányíthatja, ahol az inaktív vegyület található, azaz például a plazma membránon kívülre, vagy a vakuólumba vagy az endoplazmatikus retikulumba.
Ennek a megközelítésnek az alkalmazásával elért szelekció tehát azon alapul, hogy egy vegyületet hozzáférhetővé teszünk a transzformált sejtek számára, míg a vegyület nem hozzáférhető vagy kevésbé hozzáférhető a nemtranszformált sejtek számára. A kérdéses vegyület vagy tápanyag, amelynek ebben az esetben nem kell inaktívnak’' lennie (azaz a vegyület vagy tápanyag olyan tulajdonságú lehet, hogy aktivitását a transzformált sejtbe lépve fejti ki, anélkül, hogy szükségszerűen alá lenne vetve például hidrolízisnek a sejten belül), ugyanolyan típusú lehet, mint az előzőkben említett vegyületek, a különbség annyi, hogy a vegyületet vagy tápanyagot ebben az esetben a transzformált sejtekbe transzportáljuk, ahelyett (vagy amellett), hogy aktiválódna a transzformált sejtekben.
Azok a vegyületek, amelyek fiziológiai hatást fejthetnek ki a sejtbe lépve, de amelyek nem jutnak be könnyen a sejtbe vagy a sejtszervekbe, erősen hidrofil vagy hidrofób vegyületek, főleg töltött vegyületek, nagy molekulák vagy polimerek, különösen fehérjék, peptidek, oligoszacharidok és poliszacharidok, beleértve a növényi hormonokat, foszforilezett metabolitokat, azaz a főszfórilezett szénhidrátokat, foszforilezett vitaminokat, foszforilezett nukleozidokat, beleértve a citokineket, és az olyan vegyületeket, amelyek karbonsavtartalmú szénhidrátokhoz vagy aminosavakhoz vannak konjugálva, beleértve a növényi hormon konjugátumokat.
A találmány szerinti alapmódszer módosítható, oly
módon, hogy ahelyett, hogy aktiválnánk egy inaktív vegyületet vagy tápanyagot a transzformált sejtekben, a szelekciót úgy végezhetjük, hogy ezekben a sejtekben blokkoljuk egy vegyületnek a métábólikus szintézisét. Például, a szubsztráthoz adott citokinin métábólizmusa blokkolható a transzformált sejtekben, egy antiszensz mechanizmus alkalmazásával. Úgy találtuk, hogy ha a zeatin glikozilezését gátoljuk, akkor az optimális hajtás-indukáló koncentráció egyötöd-egyszázad részére csökken. A zeatin metabolizmus gátlásával tehát hajtás-képződést lehet kapni dohány levélkorongokból olyan zeatin koncentráció mellett, amely nem képes hajtást indukálni a nemtranszformált levélkorongokban, amelyek normál zeatin metabolizmussal rendelkeznek. Az is kiderült, hogy az indolecetsav (IAA) hatásai fokozhatok, ha ennek a vegyületnek a métábólizmusát gátoljuk. Tehát, ha az IAA métábólizmusát részlegesen gátoljuk, akkor kiderül, hogy az IAA hatása a kallusz növekedésére 5-100-szorosára fokozódik. Hasonlóképpen, a szénhidrát- és poliszacharid-metabolizmus gátlása befolyásolhatja egy hozzáadott szénhidrát felhasználását, és további lehetőségeket biztosít az így elvégezhető pozitív szelekcióhoz.
A transzformált sejtek szelektív előnye lehet bármely különbség vagy előny a nemtranszformált sejtekkel szemben, amely lehetővé teszi, hogy a transzformált sejtek könynyen azonosíthatók és izolálhatok legyenek a nemtranszformált sejtek közül. Ez tipikusan egy olyan különbség vagy előny, amely lehetővé teszi, hogy az azonosítandó transzformált sejteket egyszerű vizuális módszerrel különböztessük ··· meg, azaz anélkül, hogy egy külön vizsgálatot alkalmaznánk egy marker gén jelenlétének meghatározására.
Ha egy polipeptid, amelyet az együtt bejuttatott nukleotid-szekvencia vagy a kiválasztott nukleotid-szekvencia kódol, közvetlenül aktivál egy inaktív vegyületet vagy tápanyagot a transzformált sejtekben, a nemtranszformált sejtek bizonyos esetekben tartalmazhatnak vagy termelhetnek bizonyos mennyiségű kérdéses polipeptidet. Például, ha az aktiváló polipeptid egy enzim, akkor a nemtranszformált sejtek tartalmazhatnak bizonyos természetes enzimaktivitást, és a natív enzim ugyanolyan típusú lehet, mint az, amelyet aktiváló enzimként bejuttattunk. Az ilyen esetekben az inaktív vegyület vagy tápanyag nem szükségszerűen kell, hogy teljesen inaktív legyen a nemtranszformált sejtekben, mivel az is elegendő, ha a vegyület vagy a tápanyag egyszerűen lényegesen kevésbé aktív a nemtranszformált sejtekben mint a transzformált sejtekben. Más szóval, a transzformált sejtek és a nemtranszformált sejtek közötti kvalitatív különbség az eredetileg inaktív vegyület vagy tápanyag aktiválása szempontjából bizonyos esetekben elegendő lehet a szelekciós folyamatokhoz. Ilyen esetekben a natív enzimekkel versengő inhibitorokat vagy szubsztrátokat adhatunk a rendszerhez. Különösen alkalmasak azok az inhibitorok, amelyeket a natív enzim aktivál, és így az aktív inhibitor önkatalítikus termelődését eredményezi egy olyan szinten, amelyen a természetes enzim lényegében teljesen gátolva van.
Az együtt bejuttatott vagy kiválasztott nukleotid
-szekvencia által kódolt aktiváló polipeptid nem korlátozódik egyetlen polipeptidre sem, és természetesen lehet egy olyan polipeptid, amely aktív - akár közvetve, akár közvetlenül - egy adott vegyülettel vagy tápanyaggal szemben, amelyet a genetikailag transzformált sejtekben aktiválni kell. A polipeptid gyakran egy enzim.
A genetikailag transzformált növényi sejtek szelekciójára különösen alkalmasnak talált enzim a B-l,3-glükuronidáz (GUS) , és a szelekciót úgy végezzük, hogy egy növényi növekedés-szabályozó glükuronid vegyületet használunk, amelyet a B-glükuronidáz elhasít; ilyen például egy citokinin-glükuronid (ennek a jelentése világos lesz az alábbi példákból). Meglepő, hogy a genetikailag transzformált növényi sejtek szelekciója egy GUS gén alkalmazásával elérhető, mivel a találmánnyal kapcsolatban kiderült, hogy a magasabbrendű növények natív GUS aktivitással rendelkeznek. Ez a felfedezés ellentétben áll azzal, amit korábban leírtak. Tehát a GB 2 197,653-A szabadalmi bejelentésben azt állítják, hogy a magasabbrendű növényekben nincs kimutatható B1,3-glükuronidáz aktivitás, és ebből következik, hogy mivel a GUS aktivitás nem található meg a magasabbrendű növényekben, viszonylag egyszerű dolog egy számunkra érdekes génkonstrukció expresszióját követni a GUS gén alkalmazásával. Azonban, amint azt az alábbiakban megvilágítjuk (lásd példák) , ez nem igaz, és a GUS gén alkalmazása egy számunkra érdekes gén jelenlétének követésére egyáltalán nem egyszerű, annak a ténynek a következtében, hogy a magasabbrendű növények valójában igenis tartalmaznak jelentős mennyiségű saját (háttér) β-glükuronidáz aktivitást.
Tehát a genetikailag transzformált növények szelektálásához a sejtpopulációt egy olyan táptalajon vagy táptalajban növesztjük, amely egy citokinin-glükuronidot tartalmaz, ezt a transzformált sejtekben a B-glükuronidáz elhasítja, felszabadítja a citokinint, és ezáltal hajtás és/vagy kallusz indukciót eredményez a transzformált sejtekben.
Számos újszerű citokinin-glükuronid vegyületet fejlesztettünk ki a találmány céljára. Ezeknek a vegyületeknek a készítését, valamint alkalmazásukat a genetikailag transzformált sejtek pozitív szelekciójára az alábbiakban részletesen közöljük.
Bizonyos esetekben kívánatos lehet az alábbiakban ismertetett alapmódszerek módosítása, azaz például egy hatékonyabb szelekció kidolgozása vagy a szelekciós módszer egyszerűsítése. Ha a pozitív szelekciós eljárásban alkalmazott inaktív vegyületet a B-glükuronidáz hasítja, akkor az alapmódszert különbözőképpen módosíthatjuk jobb eredmény elérése céljából. Az egyik ilyen módosítás lehet bizonyos szterin-glükuronid vegyületek alkalmazása, azaz például a koleszteril-B-D-glükuronid vagy a B-szitoszteril-B-D-glükuronid alkalmazása egy szterin-szintézist gátló vegyülettel együtt azaz például a tridemorph-fal (4-tridecil-2,6-dimetil-morfolin) . Az 5. és 6. példákban ismertetjük ezeknek a vegyületeknek az alkalmazását. Az a véleményünk, hogy ha egy szterin-szintézis-inhibitort együtt használunk szterin-glükuronidokkal, amelyek a szterin-szintézis-inhibitor hatása ellen dolgoznak a β-glükuronidáz által kifejtett hidrolízis követ keztében, akkor az úgynevezett cross-feeding (azaz az aktivált vegyület diffúziója abból a sejtből, amelyben aktiválódott, egy másik sejtbe) megakadályozható a szelekciós eljárás során, mivel a szterinvegyületek nem diffundálnak az egyik sejtből a másikba, ha a hidrofil glükuronidrész le van hasítva róluk. így tehát egy sokkal lokalizáltabb hatást lehet elérni. Hasonló eredmények kaphatók nagyszámú egyéb glükuroniddal, amelyek egy hidrofób aglikont tartalmaznak.
Amint azt az előzőkben elmagyaráztuk, ez ellentétben van azzal a korábbi közléssel, hogy a magasabbrendű növények nem tartalmaznak természetes GUS aktivitást. Ezért ha csak a GUS gént juttatjuk be a növénybe, ez nem szükségszerűen elegendő ahhoz, hogy a genetikailag transzformált sejtek kívánatos szelekcióját elérjük, és szükséges vagy kívánatos lehet bármely natív B-glükuronidáz aktivitás csökkentése a sejtpopulációban. Mivel egy bejuttatott B-glükuronidáz a természetes B-glükuronidázétól eltérő tulajdonságokkal rendelkezhet, ezért bármely természetes B-glükuronidáz aktivitás csökkentését különböző módokon érhetjük el, azaz például úgy, hogy a táptalajhoz egy B-glükuronidázt gátló vegyületet adunk, amelynek erősebb a gátló hatása a természetes B-glükuronidázra mint arra a B-glükuronidázra, amelyet a nukleotid-szekvencia vagy annak alszekvenciája kódol. Az egyik ilyen vegyülettípus az ammóniumsók.
A natív β-glükuronidáz aktivitás a sejtpopulációban jelentősen csökkenthető még oly módon is, hogy a táptalajhoz egy olyan vegyületet adunk, amely a hidrolízis következtében egy olyan terméket eredményez, amely gátolja a természetes β-glükuronidáz aktivitását, és amely jobban gátolja a természetes β-glükuronidáz aktivitását, mint a bevitt β-glükuronidáz aktivitását. Ez autoregulált vagy lokalizált módon érhető el, azaz ügy, ha specifikus sejtszervekre lokalizáldik, ahol a bevitt GUS gén elhelyezkedik, illetve nem helyezkedik el. A hidrolízis-termékre az egyik példa, amely gátolja a természetes β-glükuronidázt, a glükuronsav, amely például a glicirrizinsav vagy steril glükuronidok hidrolíziséből származik.
A sejtpopulációban a természetes β-glükuronidáz aktivitás tovább csökkenthető, ha a táptalajhoz egy β-glükuronidáz inhibitort adunk, főleg egy β-glükuronidot, amely azokban a sejtekben, amelyekben nincs kívülről bevitt β-glükuronidáz gén, jobban gátolja a a β-glükuronidáz aktivitást, mint azokban a sejtekben, amelyekben van kívülről bevitt Bglükuronidáz gén. Ez lehet például egy rossz β-glükuronidáz szubsztrát (egy glükuronid), amelynek nagyobb affinitása van a természetes β-glükuronidázhoz mint a kívülről bevitt β-glükuronidázhoz.
A bevitt β-glükuronidáz gén által kódolt, a találmány céljaira használt β-glükuronidáz viszonylag széles pHtartományban aktív, míg a számos különböző növényben talált természetes β-glükuronidáz csak egy viszonylag szűk pH-tartományban, tipikusan körülbelül 4-5-ös pH tartományban aktív (lásd az alábbi 3. példát). A természetes β-glükuronidáz aktivitás ennélfogva ebben az esetben csökkenthető, ha a táptalajhoz egy olyan glükuronidot adunk, amelyet a természetes β-glükuronidáz képes hidrolizálni, és amely hidrolízis a pH emelkedését eredményezi, ilyen például az o-kumaril-glükuronid.
Mivel kiderült, hogy a növényekben a természetes figlükuronidáz általában 4-5-ös pH-η aktív, a természetes B-glükuronidáz aktivitását ezért úgy is csökkenteni lehet, ha a táptalajhoz egy pH-szabályozó vegyületet adunk, amely a táptalajban 5,5 és 8,5 közötti pH-t biztosít, előnyösen 6,0 és 8,0 közötti, például 6,5-7,5-ös pH-t, vagy egy olyan pHszabályozó vegyületet, amely megemeli a sejteken vagy a sejtszerveken belüli pH értékét az említett pH-tartományon belül. Ezeknél a pH-értékeknél a kívülről bevitt GUS gén által kódolt B-glükuronidáz aktív, de a természetes fi-glükuronidáz lényegében inaktív. A használható pH-szabályozó vegyületekre egy példa egy ammónium-só vagy ammónia-felszabadító anyag, például az ammónium-nitrát.
Végezetül, a természetes B-glükuronidáz aktivitás csökkenthető vagy lényegében eliminálható fizikai kezeléssel is, például hőkezeléssel, például az 50-65 °C-os hőmérséklettartományban rövid, impulzusszerű kezeléseket alkalmazva körülbelül 1-2 nappal a szelekciós közegre való átvitel előtt és/vagy 30-45 °C-os hőmérsékletet alkalmazva a szelekció során (lásd 10. példa).
A növényi sejtek genetikai transzformálását gyakran Agrobacterium törzsekkel, főleg az Agrobacterium tumefaciens törzsekkel végezzük. Kiderült, hogy bizonyos ártalmatlanná tett Agrobacterium törzsek hajtásképződést indukálnak, hajtásképződést indukáló anyagok termelése miatt az együtttenyésztés ideje alatt, és az ilyen törzseket általában el kell kerülni, ha a citokinin-glükuronidok GUS hidrolízisét kell alkalmaznunk a genetikailag transzformált sejtek szelektálására. Tehát ha citokinin-glükuronidot alkalmazunk inaktív vegyületként, akkor a sejtek genetikai transzformálását előnyösen egy olyan Agrobacterium törzzsel kell végezni, amely nem termel citokinineket, illetve egyéb hajtás (növekedés) indukáló vegyületeket, illetve amely csak lényegtelen mennyiségeket termel ezekből a vegyületekből, ezzel eliminálva, vagy lényegesen lecsökkentve a hajtás növekedését az élő baktériumok jelenléte miatt a sejteken vagy a sejtekben.
Bizonyos esetekben, például ha jobb szelekciós frekvenciára van szükség, akkor előnyös lehet, ha a kiválasztott nukleotid-szekvenciat legalább két különböző szelekciós génnel együtt juttatjuk be. A további szelekciós gén lehet például egy további gén, amely egy olyan enzimet (vagy más fehérjét illetve polipeptidet) kódol, amely alkalmas a találmány szerinti pozitív szelekcióra, illetve lehet egy olyan gén, amely egy olyan enzimet (illetve más fehérjét vagy polipeptidet) kódol, amely alkalmas a hagyományos negatív szelekcióra, például egy toxin, antibiotikum vagy herbicid elleni rezisztenciát kódol. Tehát a genetikailag transzformált sejtek szelektálhatok a pozitív szelekció és a negatív szelekció kombinációjával, a kiválasztott nukleotid-szekvenciát a genetikailag transzformált sejtekbe olyan alszekvenciával együtt juttathatjuk be, amely legalább egy toxin, antibiotikum vagy herbicid elleni rezisztenciát kódol, és a táptalaj, amelyre a transzformált sejteket átvisszük, legalább egy toxint, antibiotikumot vagy herbicidet tartalmaz, amelyre a transzformált sejtek rezisztensek.
Amint az előzőkben említettük, a találmány egyik tárgyát olyan genetikailag transzformált sejtek képezik, amelyeket az előzőkben említett módszerrel szelektáltunk, főleg növényi sejtek, valamint az ilyen genetikailag transzformált sejtekből származó növények, utódok vagy magvak. Gyakran előny, hogy ezek a sejtek, amelyeknek a genomja szelekciós markerként nem tartalmaz egy kívülről bevitt (azaz nem természetes) nukleotid szekvenciát, amely toxin, antibiotikum vagy herbicid rezisztenciát kódol. Amint azt az előzőkben említettük, kérdés, hogy vajon biztonságos-e olyan géneket bejuttatni, amelyek például antibiotikum rezisztenciát kódolnak mondjuk élelmiszernövényekben. A genetikailag transzformált növényi sejteket a találmány szerinti módszerrel szelektáljuk, amelyek nem tartalmaznak szelekciós géneket például antibiotikum rezisztenciára, valamint az ilyen sejtekből származó növényeket, utódokat és magvakat, és ez az említett szempontból előnyös.
A találmány szerinti (I) általános képletű vegyületek szintézise
Az (I) általános képlettel leírható citokinin-glükuronidok szintézisére különböző, többé kevésbé általános módszerek ismertek, és ezek közül kettőt, amelyekről az az általános vélemény, hogy ezek a legjobbak, az alábbiakban ismertetünk.
A) A megfelelő citokinin-D-glükozid oxidációja
Ebben a megközelítésben a glükuronidnak megfelelő B-D-glükozid piranóz gyűrűjéhez kapcsolódó -CH2OH csoportot a megfelelő körülmények között karboxilcsoporttá oxidáljuk. Ennek az oxidációnak ez elvégzéséhez valószínűleg a legjobb módszere egy közvetlen, nagyon szelektív, oxigénnel végzett katalitikus oxidáció, katalizátorként fekete platinát vagy csontszenes platinát alkalmazva, valamint gyengén lúgos (pH=8-10) vizes vagy vizes alkoholos (azaz vizes etanolos) reakcióközeget alkalmazva; a reakciót megfelelő módon 60-100 ’C-on hajthatjuk végre 2-24 óra alatt. A szokásos, oxigéntől eltérő oxidáló szerekkel végzett oxidáció (általában nem katalitikus) is használható, de várható, hogy a végbemenő oxidációs reakció általában alacsonyabb termelési hozamot és kisebb specifitást mutat (azaz oxidációs termékek keverékét eredményezi, hacsak nem védjük meg előzőleg az egyéb, oxidálható funkciós csoportokat a glükozid kiindulási anyagon, megfelelő védőcsoportok bevitelével).
A katalitikus oxidációs megközelítésre egy példát a találmány IC példájának 1-es módszerében adunk, amelyben az N6-benziladenin-9-B-D-glükopiranuronozidot (BA9G) N6benziladenin-9-B-D-glükopiranuronsawá oxidáljuk (amelyet azután nátriumsója formájában izolálunk) oxigénnel, fekete platina jelenlétében.
Ez a módszer elég széles körben alkalmazható citokinin-9-glükuronidok szintézisére, a megfelelő 9-glükozidokból kiindulva. Ez a módszer megfelelőnek bizonyult például zeatin-O-glükuronid szintézisére is (lásd például az 1G pél dát) , a megfelelő zeatin-O-glükozidból kiindulva; a zeatinO-glükuronid egy olyan, találmány szerinti (I) általános képletű vegyület, amelyben a glükuronid egység egy C2-8-al“ kenil-típusú R6 egység szubsztituense - amint azt az alábbiakban meghatározzuk. A kérdéses módszer általánosan használható más, a találmány szerinti citokinin-glükuronidokhoz is, amelyekben egy O-glükuronid egység szubsztituensként található meg egy R6 csoporton, amely lehet benzilcsoport,
1- 8 szénatomos alkil- vagy helyettesített 1-8 szénatomos alkilcsoport; 2-8 szénatomos alkenil- vagy helyettesített
2- 8 szénatomos alkenilcsoport.
Ez a módszer azonban nem használható széles körben, például a citokinin-3-glükuronidok szintézisére.
Amint azt már jeleztük, világos, hogy ha egy olyan megközelítést alkalmazunk, amely egy citokinin-glükozid oxidációját is magában foglalja, bármely más, az adott oxidációs körülmények között oxidálható funkciós csoportot, amely a kiindulási citokinin-glükozid molekulán jelen lehet, és amelyet változatlanul át kell vinni az (I) általános képletű végleges glükuronidba, megfelelő védőcsoportokkal meg kell védeni. A potenciálisan oxidálható csoportok, amelyek jelen lehetnek az (I) általános képletű vegyületeken, lehetnek például -SH csoport az R2 és/vagy egy R8 csoport helyén; hidroxil- vagy glükozil-oxi-csoportok, amelyek szubsztituensként lehetnek jelen az R6 csoportokon (ezek típusa helyettesített 1-8 szénatomos alkil- vagy helyettesített 2-8 szénatomos alkenilcsoport); valamint ribozil-, 5’foszforibozil- vagy glükózil-csoportok, amelyek R9 vagy R7 ♦ ·
- 29 csoportokként lehetnek jelen. Ha például arra van szükség, hogy alifás (alkoholos) hidroxilcsoportokat védjünk meg, azaz a ribozil-, 5'-foszforibozil- vagy glükozilcsoportok szekunder szénatomján levő hidroxilcsoportokat, akkor megfelelő védőcsoportok lehetnek például az acetilesöpörtök, amelyeket a szakterületen jártas szakember számára ismert módszerekkel lehet bevinni, és amelyeket az oxidációs eljárás után lúgos hidrolízissel el lehet távolítani.
Ha azonban az előzőkben leírt enyhe katalitikus oxidációs eljárást alkalmazzuk, akkor általában a primer alifás szénatomokon levő hidroxilesöpörtök oxidálódnak, miközben a szekunder (és tercier) szénatomokon levő hidroxilesöpörtök általában nem; tehát, ha a citokinin-B-D-glükozid glükopiranóz gyűrűjének 5-ös pozíciójában levő -CH2OH csoportot oxidáljuk ily módon, akkor a glükopiranóz gyűrű 2-es, 3-as és 4-es pozíciójában levő hidroxilcsoportok általában nem oxidálódnak, és ezért nem kell megvédeni őket. Azonban egy SH csoportot, amely egy R2 vagy R8 csoport formájában van jelen, általában meg kell védeni egy ilyen katalitikus eljárás során, éspedig például benzilszármazék formájában (lásd az alábbiakban ismertetett B módszert).
Számos megfelelő citokinin-glükozid, ehhez az eljáráshoz használható kiindulási anyag van kereskedelmi forgalomban; például ezek közül számos különböző vegyületet árul az Apex Organics Ltd., Leicester, Anglia, néhány citokinin9-glükozidot pedig a Sigma Chemical Company árul (P.O. Box 14508, St. Louis, MO, 63178, USA). A citokinin-glükozidokat úgy is elő lehet állítani, ha a szakirodalomban ismertetett
módszert alkalmazzuk. Például számos különböző megfelelő citokinin-9-glükózidőt, amely az R6 a találmányban való alkalmazás céljára megfelelő csoportot tartalmaz, szintetizálhatunk a Cowley és munkatársai által közölt módszer közvetlen kiterjesztésével [Aust. J. Chem., 31, 1095 (1978)] a zeatin és az N6-benziladenin-9-B-D-glükopiranuronozidjainak szintézisére.
B) Koeniqs-Knorr típusú szintézisek
Ez a módszer, amely W. Koenigs és E. Knorr eredeti módszerén alapul [Chem. Bér., 34, 957 (1901)] magában foglalja a metil-(2,3,4-tri-O-acetil-a-D-glükopiranozilbromid) -uronát [rövidítése MBTG; az előállítására alkalmas módszert Bollenback és munkatársai írták le Journal of the American Chemical Society, 77, 3310 (1955)] reakcióját egy alkoholos vagy fenolos hidroxilcsoporttal, egy merkaptocsoporttal (-SH) vagy egy aromás vagy telítetlen heterociklusos gyűrűben levő nitrogénatommal.
Ez a megközelítés szolgáltatja valószínűleg a legáltalánosabban alkalmazható módszer a találmány szerinti citokinin-glükuronidok szintézisére (vagy a prekurzorok glükuronidjainak szintézisére, amelyeket azután könnyen át lehet alakítani a kiválasztott citokinin-glükuronidokká), kiindulva a megfelelő citokininekből [vagy a citokinin prekurzorokból], és az a vélemény alakult ki, hogy nagyon széles körben alkalmazható az (I) általános képletű vegyületek előállítására.
Az általános eljárás az alábbi: A megfelelő citoki
nint vagy citokinin prekurzort oldószerben, azaz például dimetil-formamidban, kinolinban, propilén-karbonátban, metanolban vagy dietil-éterben oldjuk, majd hagyjuk, hogy reagáljon 1,25 mólekvivalens MBTG-vel 25 és 100 °C közötti hőmérsékleten 3-96 óra hosszat, előnyösen hozzáadott halogenid-megkötőszer (bromid-megkötőszer), például ezüst-oxid vagy ezüst-karbonát jelenlétében (ha például dimetil-formamidot használunk oldószerként, akkor gyakran maga az oldószer is képes megkötni a halogénatomokat, amely esetben további megkötőszer hozzáadására nincs szükség). Ez a reakció eredményezi az intermedier peracetilezett glükuronid metilészterét, amit általában izolálunk és tisztítunk; ezt általában az alábbiak szerint hajtjuk végre:
(i) az oldószert bepároljuk, majd az oldószer maradékát egy másik oldószerrel, például kloroformmal extraháljuk, ezt az oldószert eltávolítjuk az extraktumból, majd a keletkező nyers köztiterméket átkristályosítással és/vagy szokásos oszlopkromatográfiás technikával tisztítjuk; vagy (ii) a reakcióelegyből származó köztiterméket szokásos oszlopkromatográfiás módszerrel választjuk el, amelyben közvetlenül a reakcióelegyet visszük fel az oszlopra, majd az eluálószert eltávolítjuk a számunkra érdekes eluált frakciókból, és a nyers terméket átkristályosítjuk.
Azokban az esetekben, amikor az (I) általános képletű vegyület kiválasztott végtermékében a glükuronid egységnek amid (glükuronamid) formában kell lennie, akkor a glükuronid egység peracetilezett metilészter formájának amid formára való alakítását ebben a lépésben célszerű elvégezni, és ezt általában úgy hajtjuk végre, hogy a peracetilezett metilésztert (előnyösen tisztítva, például az előzőkben leírt módon) vízmentes ammónia vízmentes metanolban készített oldatával kezeljük alacsony hőmérsékleten, azaz például 0 °C és -10 °C közötti hőmérsékleten, illetve egy másik lehetőség az, hogy tömény (megfelelően telített) vizes ammónia-oldattal kezeljük hozzávetőlegesen szobahőmérsékleten, 0,5-4 óra hosszat. A glükuronamidot azután úgy izolálhatjuk, hogy az ammónia-oldatot lepároljuk, például csökkentett nyomáson, majd egy megfelelő oldószerből vagy oldószer-elegyből, például 90%-os etanolból átkristályosítjuk. Erre a konverzióra példát az 1B. példában adunk meg, amelyben az N6-benziladenin-3-glükuronamidot (BA3GNamid) állítjuk elő a megfelelő metilészterből.
Emellett bizonyos típusú citokinin prekurzorokkal kezdődő eljárások esetében kémiai transzformáció is szükséges a citokinin prekurzor egység megfelelő citokinin egységgé való átalakításához, ezt gyakran a metilészterrel végezzük el, mielőtt a szabad glükuronidot felszabadítanánk. Erre egy példa a citokinin-9-glükuronidok szintézise (amelyek szintézisére a katalitikus megközelítési módot máshol már
leírtuk), amelyet általában kielégítően végre lehet hajtani, egy helyettesített vagy helyettesítetlen purinból kiindulva, amelyben a 6-os pozícióban klóratom van; az utóbbi 6-klór vegyületet lehet általában a megfelelő peracetilezett 9-glükuronid metilészterévé alakítani, az előzőkben leírt módon MBTG felhasználásával, majd a 6-klór csoportot ezután a kiválasztott -NH-R6 csoporttá lehet alakítani, oly módon, hogy az utóbbi reakcióból származó terméket a megfelelő aminnal (R6-NH2) reagáltatjuk, amelyet általában in situ a megfelelő amin-hidrokloridból (R6-NH2 x HC1) és feleslegben levő (célszerűen 2-4-szeres mólfelesleg) megfelelő bázis, például tercier alifás amin, azaz trietilamin alkalmazásával, egy megfelelő poláros oldószerben, például 1-4-szénatomos alifás alkoholban, 65-120 ’C közötti hőmérsékleten. Ezt az IC példa 2-es módszerében mutatjuk be, amelyben az N6-benziladenin-9glükuronid (BA9GN) (nátriumsója formájában) történő szintézisét írjuk le.
A glükuronid egységen levő acetilesöpörtokát ezután lúgos hidrolízissel eltávolítjuk egy bázis, például vizes nátrium-hidroxid, vizes-metanolos vagy etanolos nátrium-hidroxid alkalmazásával, illetve metanolos ammónia alkalmazásával 0-25 °C közötti hőmérsékleten, 0,5-6 óra hosszat. Egy bázis, például az előzőkben leírt vizes vagy etanolos nátrium-hidroxid oldatok alkalmazásával ez az eljárás - a feleslegben levő bázis semlegesítése után - a megfelelő citokinin-glükuronid sóformáját adja, míg egy reagens alkalmazása, például metanolos ammónia, majd a feleslegben levő ammónia bepárlással való eltávolítása a glükuronid amid-formáját eredményezi. Az utóbbit szokásos módszerekkel tisztítjuk, például kromatográfiával, főleg fordított fázisú kromatográfiával, és/vagy megfelelő oldószerből, például vizes szerves oldószerből, előnyösen 80-90 %-os etanolból való átkristályosítással.
Világos, hogy ha a kiindulási citokinin vagy citokinin prekurzor egy vagy több olyan funkciós csoportot tartalmaz, amely képes az MBTG-vel reagálni a kérdéses reakciókörülmények között, és amelyeknek változatlanul meg kell maradniuk a végső, (I) általános képletű glükuronidban, akkor az ilyen funkciós csoportokat meg kell védeni a megfelelő védőcsoportok időben való bevitelével; az ilyen reaktív funkciós csoportok, amelyek jelen lehetnek a kiindulási citokinineken és az (I) általános képletű vegyületnek megfelelő vegyületeket eredményezhetnek, az alábbiak lehetnek (pozíciójukat az (I) általános képletnek megfelelően adjuk meg) : -OH vagy -SH csoport, amely R2 csoportként lehet jelen, -OH vagy -SH csoport, amely R® csoport lehet; -OH vagy -NH2 csoport, amely a fenilgyűrű szubsztituense lehet egy R6 csoporton, amely helyettesített benzil típusú; hidroxil vagy glükóziloxi-csoport, amely szubsztituensként lehet jelen az R6 csoporton (ezek típusa 1-8 szénatomos helyettesített alkilcsoport vagy 2-8 szénatomos helyettesített alkenilcsoport); valamint ribozil-, 5 ·-foszforibozil- vagy glükózilesöpörtök, amelyek R9 vagy R7 csoportokként lehetnek jelen; és -NH2 csoport egy -CH2CH(NH2)COOH csoportban,amely R9 csoportként van jelen.
Ami az előzőkben említett példáknál a kiindulási
·
citokinekben előfordulható reaktív funkciós csoportjainak védelmére alkalmas védőcsoportokat illeti, az -OH csoport általában megfelelően védhető egy acetilcsoport bevitelével (lásd az (I) általános képletű vegyületek készítésének oxidatív módszerével kapcsolatban), a megfelelő -OOCCH3 csoport kialakításával. Az -SH csoport általában nagyon megfelelő módon védhető benziltioéter (-SCH2C6H5) származék formájában, egy benzilcsoport bevitelével [azaz benzil-kloriddal való reakcióval, hasonló módon, mint amit részletesebben közlünk az alábbiakban azokkal a citokinin prekurzorokkal kapcsolatban, amelyek, legalábbis formálisan oxo (=0) vagy tioxo (=S) csoportokat tartalmaznak a 2-es pozícióban, és egy oxocsoportot a 6-os pozícióban]. Egy -NH2 csoport általában megfelelő módon védhető egy ftálimidocsoporttá való átalakítással, az alábbiak szerint: a citokinint vagy a citokinin prekurzort feleslegben levő ftálsavanhidriddel melegítjük egy viszonylag semleges oldószerben, például kloroformban vagy 1,2-dimetoxi-etánban, 70-100 ’C körüli hőmérsékleten egy óra hosszat, gyakran 4 óra hosszat. Az -NH2 csoportot a Koenigs-Knorr típusú reakció végrehajtása után vizes alkoholos (azaz vizes etanolos) hidrazinoldattal lehet regenerálni.
A citokinin prekurzoroknak egy csoportja, amely különösen jól alkalmazható a találmány szerinti citokinin glükuronidok szintézisére, amelyek a glükuronid egységet (ami megfelel az R10 csoportnak az (I) általános képletben) -0-R10 vagy -S-R10 csoportként kapcsolva tartalmazzák a purin gyűrűrendszer 2-es pozíciójában, olyan citokinin pre-
kurzorok, amelyek, legalábbis formálisan, oxo (=0) vagy tioxo (=S) csoportokat tartalmaznak a 2-es pozícióban és egy oxo csoportot a 6-os pozícióban; itt kell megemlíteni, hogy a kérdéses típusú vegyületek, amelyek 2-oxo- és 2-tioxo-csoportokat tartalmaznak, legalábbis oldatban tautomer egyensúlyban vannak a megfelelő 2-hidroxi- és 2-merkapto-vegyületekkel (a 6-oxo csoport ezután 6-hidroxilcsoport formájában van jelen), és az utóbbi tautomer formák általában jelentős mennyiségben fordulnak elő.
Az utóbb említett hidroxil- vagy merkaptocsoport a
2-es pozícióban konvertálódik, a szintézis végső fázisában, a Koenigs-Knorr típusú eljárással, a megfelelő -0-R10 vagy —S—R10 csoporttá; azonban a Koenigs-Knorr típusú reakciósorozat végrehajtása előtt a 6-hidroxilcsoportot megfelelően át kell alakítani az ideiglenes 6-halogén- (előnyösen 6-klór) származékká való átalakításán keresztül az (I) általános képletben bemutatott -NH-R6 egységgé, és ehhez általában arra van szükség, hogy a 2-es pozícióban levő hidroxil vagy merkaptocsoportot megfelelő védőcsoporttal védjük az átalakítás lépései során. Mindkét csoportnál a választható védőcsoport a benzilcsoport, amelyet általában egyenesen be lehet vinni egy olyan reakcióval, amely enyhe feleslegben levő benzilklorid fokozatos hozzáadását jelenti a kérdéses citokinin prekurzor kevertetett oldatához vagy szuszpenziójához vizes lúgban (a pH tipikusan 12-13), azaz például vizes nátrium-hidroxid- vagy vizes kálium-hidroxid-oldatban, körülbelül szobahőmérsékleten.
Egy általában 1-2 órás folyamatos kevertetés után a reakcióelegyet semlegesítjük, például jégecet hozzáadásával, majd az oldhatatlan, benzilcsoporttal védett terméket szűréssel izoláljuk.
A keletkező 2-benzil-oxi- vagy 2-benzil-tio-6-purinol-származék 6-hidroxilcsoportját ezután 6-kloriddá alakítjuk, megfelelően alkalmazva feleslegben levő klórozó reagenst, azaz például foszfor-oxi-kloridot (foszforil-kloridot) szerves bázis, azaz például Ν,Ν-dietil-anilin jelenlétében; az utóbbi reakciót általában refluxálási körülmények között lehet végrehajtani körülbelül 10 perc és körülbelül 3 óra időtartam alatt.
A 6-kloridot azután megfelelő módon át lehet alakítani a kiválasztott -NH-R6 egységgé, oly módon hogy az előző reakcióból származó terméket hagyjuk a megfelelő aminnal (R6-NH2> reagálni, amit általában megfelelő módon in situ állítunk elő amin-hidrokloridból (R6-NH2 x HC1) és feleslegben levő (célszerűen 2-4-szeres mólfelesleg) megfelelő bázis, például tercier alifás amin, azaz trietil-amin alkalmazásával egy megfelelő poláros oldószerben, például 1-4 szénatomos alifás alkoholban (azaz 1-butanolban), 65 és 120 °C közötti hőmérsékleten.
A termék izolálása után a védőcsoportot eltávolítjuk, ezzel regeneráljuk a szabad 2-hidroxil- vagy 2-merkaptocsoportot; a benzil védőcsoport esetében ezt megfelelően úgy végezhetjük, hogy a terméket feleslegben levő nátrium folyékony ammóniás oldatával kezeljük.
Az olyan termékek esetében, amelyek 2-merkaptocsoporttal rendelkeznek ebben a stádiumban, az a véleményünk, hogy a 2-merkaptocsoportot általában előnyös a megfelelő sóformává alakítani (-S“), azaz a nátriumsó formájára, mielőtt továbbmennénk a glükuronid egység bevitelével, a Koenig-Knorr típusú reakció alkalmazásával. Az ilyen célokra alkalmazható eljárásra megfelelő példát a munkapéldák 4. 1E. pontjában írunk le, és az ott ismertetett körülményekről az a véleményünk, hogy meglehetősen széles körben alkalmazhatók. Néhány esetben azonban lehetséges, hogy a Koenigs-Knorr típusú reakciót közvetlenül MBTG-vel végezzük el (lásd alább) anélkül, hogy a 2-merkaptocsoportot sóformává alakítanánk .
Végezetül a glükuronid egységet a fentiekben leírt módon MBTG-vel végzett reakcióval juttatjuk be, a KoenigsKnorr típusú reakció végrehajtásával.
Az előzőkben ismertetett szintézislépések sorozatát az 1E. példában mutatjuk be az N6-(2’-izopentil)-adenin-2-tioglükuronid (IP2SGN) nátriumsójának szintézisére, amely 2-tioxantinból indul ki. A legtöbb, itt megadott információ, amely az átkristályosító és extrakciós oldószerekre, a reagensek koncentrációjának és mennyiségének megválasztására vonatkozik, szélesebb körben alkalmazható az előzőkben ismertetett reakciók végrehajtásában, egy citokinin prekurzorból kiindulva, amely egy 2-tioxo csoportot (azaz 2-merkaptocsoportot) és egy 6-oxo-csoportot (azaz 6-hidroxilcsoportot) tartalmaz.
Hasonlóképpen, a citokinin prekurzoroknak az a csoportja, amelyek különösen alkalmasak a találmány szerinti citokinin glükuronidok szintézisére, és rendelkeznek a glü kuronid egységgel (ami megfelel az (I) általános képlet R10 csoportjának) -0-R10 vagy -S-R10 formában a purin gyűrűrendszer 8-as pozíciójához kapcsolva, olyan citokinin prekurzorokat tartalmaz, amelyek, legalábbis formálisan (hasonló okokból, mint amit az előzőkben ismertettünk azokkal a citokinin prekurzorokkal kapcsolatban, amelyek formális 2-oxovagy 2-tioxo-csoporttal és formális 6-oxo-csoporttal rendelkeznek) egy oxo- (=0) vagy tioxo- (=S) csoportot tartalmaznak a 8-as pozícióban, és amelyek emellett hidroxilcsoportot is tartalmaznak a 6-os pozícióban. Ezeket általában a kiválasztott (I) általános képletű végtermékké lehet alakítani, a megfelelő reakciólépések alkalmazásával (védőcsoport bevitele, 6-klór bevitele, az -N-R6 egység bevitele, védőcsoport eltávolítása és végül az MBTG-vel való reakció), analóg módon ahhoz, amit az előzőkben az olyan citokininglükuronidokkal kapcsolatban vázoltunk, amelyek tartalmazzák a glükuronid egységet a purin gyűrűrendszer 2-es pozíciójához -0-R10 vagy -S-R10 csoportként hozzákapcsolva. Erre példaként megemlítjük az 1F. példát, amelyben az N6-(2'-izopentenil)-adenin-8-tioglükuronid szintézisét írjuk le (nátriumsója formájában).
Az (I) általános képletű vegyületeket, amelyekben a glükuronid rész karbonsav formában található, általában előállíthatjuk a megfelelő sóformából, azaz például a nátriumsóból (az előzőkben más ismertetett módszer szerint lehet előállítani), oly módon, hogy a sóforma megfelelő oldószerben (például vizes alkoholban, azaz vizes etanolban) készített kevertetett oldatát vagy szuszpenzióját megsava nyitjuk, előnyösen 25 °C alatt, ásványi savval, például sósavval; a pH körülbelül 2,5. Néhány perces kevertetés után az oldószert csökkentett nyomáson eltávolítjuk. A nyers maradékot előnyösen kromatográfiás kezelésnek vethetjük alá a szervetlen sók eltávolítása céljából (lásd az II példát, az ilyen célú tipikus eljárás és megfelelő kromatográfiás szubsztrát részleteit illetően), ami után a terméket a megfelelő oldószerből, tipikusan egy poláros oldószerből, azaz metanolból vagy etanolból, átkristályosíthatjuk.
Az (I) általános képletű vegyületeket, amelyekben a glükuronid rész metilészter vagy etilészter formában található, általában egyszerűen előállíthatjuk, jó kitermeléssel, oly módon hogy a citokinin glükuronid megfelelő karbonsav formáját (amelyet például az előzőkben leírt módon állíthatunk elő) diazometánnal vagy diazoetánnal reagáltatjuk, olyan reakciókörülmények között, amelyek szokásosak az ilyen típusú reakcióban, és amelyek a szakterületen jártas szakember számára jól ismertek.
Számos, a B) módszernél kiindulási anyagként használható citokinin prekurzor kereskedelmi forgalomban van, míg másokat az irodalomban leírt módszerekkel állíthatunk elő. Például számos különböző, megfelelő N6-helyettesített adenin, amely a találmány szerinti R8 csoportot tartalmaz, szintézise elérhető a szakirodalomban közölt módszerrel [Iwamura et al., Phytochemistry, 19, 1309 (1980)], valamint számos 2-, 8- és 2,8-helyettesített N6-(2·-izopentenil)adenin, amely a találmány szerinti R2 és/vagy R8 csoportot tartalmaz, előállítható Damman és munkatársai leírása sze rint [Phytochemistry, 13., 329 (1974)].
Előnyös (I) általános képletű vegyületek az alábbiak:
az (I) általános képletű vegyület, amelyben R2 jelentése hidrogénatom, R3 jelentése B-D-glükopiranuronozil csoport, illetve annak sója a karbonsav funkciónál, R9 és X jelentése együttesen egy kötés, R6 jelentése benzilcsoport, R7 és Y jelentése együttesen egy kötés, és R8 jelentése hidrogénatom;
az (I) általános képletű vegyület, amelyben R2 jelentése hidrogénatom, R3 jelentése B-D-glükopiranuronozalcsoport amid származéka a karbonsav funkciónál, R9 és X jelentése együttesen egy kötés, R6 jelentése benzilcsoport, R7 és Y jelentése együttesen egy kötés, és R8 jelentése hidrogénatom;
az (I) általános képletű vegyület, amelyben R2 jelentése hidrogénatom, R3 és X jelentése együttesen egy kötés, R9 jelentése β-D-glükopiranuronozil-csoport, illetve annak sója a karbonsav funkciónál, R6 jelentése benzilcsoport, R7 és Y jelentése együttesen egy kötés, és R8 jelentése hidrogénatom;
az (I) általános képletű vegyület, amelyben R2 jelentése hidrogénatom, R3 jelentése β-D-glükopiranuronozilcsoport, illetve annak sója a karbonsav funkciónál, R9 és X jelentése együttesen egy kötés, R6 jelentése 2-izopentenilcsoport, R7 és Y jelentése együttesen egy kötés, és R8 jelentése hidrogénatom;
az (I) általános képletű vegyület, amelyben R2 jelentése β-D-glükopiranuronozil-csoport, illetve annak sója a karbonsav funkciónál, R9 jelentése hidrogénatom, R3 és X jelentése együttesen egy kötés, R6 jelentése 2-izopentenil-csoport, R7 és Y jelentése együttesen egy kötés, és R8 jelentése hidrogénatom;
az (I) általános képletű vegyület, amelyben R2 jelentése hidrogénatom, R9 jelentése hidrogénatom, R3 és X jelentése együttesen egy kötés, R6 jelentése 2-izopentenilcsoport, R7 és Y jelentése együttesen egy kötés, és R8 jelentése β-D-glükopiranuronozil-csoport, illetve annak sója a karbonsav funkciónál; és az (I) általános képletű vegyület, amelyben R2 jelentése hidrogénatom, R3 és X jelentése együttesen egy kötés, R9 jelentése hidrogénatom, R6 jelentése a (III) általános képletű csoport, vagy annak sója, amelyben R7 és Y jelentése együttesen egy kötés hoznak létre, R8 jelentése hidrogénatom.
A (II) általános képletű vegyületek találmány szerinti szintézise
A találmány szerinti (II) általános képletű vegyületeket közvetlenül elő lehet állítani, a könnyen előállítható o-kumarinsav metileszterének (azaz a 3-(2-hidroxi-fenil)-2-propénsav) mint kiindulási anyagnak a felhasználásával. Az utóbbi észtert úgy állíthatjuk elő, hogy a szabad savat (amely például az Aldrich Chemical Company-tól szerezhető be, Gillingham, Dorset, Anglia, H2,280-9 katalógusszám alatt) metanolban refluxáltatjuk kénsav jelenlétében. Meg kell jegyeznünk, hogy a cisz és transz formák keveréke (az etilén kettőskötés szempontjából) állítható így elő. Az a véleményünk, hogy a transz forma, függetlenül az előállítás módszerétől, általában jóval nagyobb arányban fordul elő kezdetben. Ez azonban nem lényeges, mert mivel azt találtuk, hogy mind a cisz (kumaril), mind a transz (kumaril) glükuronidok végezetül kumarinná alakulnak, a GUS-sal végzett hidrolízis hatására, annak következtében, hogy a kumarinsav lassan (nem-enzimátikusan, feltételezhetően fénykatalízis hatására) kumarinná alakul néhány nap alatt.
Az olyan (II) általános képletű vegyületek szintézisének hatásos módszereit, amely vegyületekben (a) R1 és R10 karbonsav-formában találhatók, és (b) R1 és R10 amid-formában találhatók, részletesen ismertetjük az IH és 11 példákban. Az olyan (II) általános képletű vegyület(ek), amelyekben mind az R1 mind az R10 csoport nátriumsó formájában található, könnyen előállíthatok a peracetilezett glükuronid metilészterének lúgos hidrolízisével [előállítása (metil-o-kumarátból) és szintézise úgy játszódik le, mint az 11 példában közölt szintézis első részében], metanolos nátrium-hidroxidot használva az II példában közölt szintézis második részének elején közölt módszer szerint; ahelyett, hogy a hidrolizátum pH-ját 2,5-re állítanánk sósavval az II példában leírtak alapján, az elegyet egyszerűen csak semlegesítjük (körülbelül pH=7 értékre) sósavval. A nátriumsó formát a keverékből kromatográfiával izolálhatjuk, például Amberlite XAD nem-ionos gyantán, az oszlopot vízzel mossuk a szervetlen sók eltávolítása céljából, majd eluáljuk, általában metanollal. A nyers glükuronid nátriumsó formáját, amelyet a metanol eltávolítása után kapunk, átkristályosíthatjuk, például abszolút metanolból. A káliumsó alak is előállítható nagyon hasonló eljárással, például metanolos kálium-hidroxiddal a hidrolízis részben.
Az olyan (II) általános képletű vegyületeket, amelyekben mind R1 mind R2 metilészter formában, illetve etilészter formában vannak jelen, megfelelően előállíthatjuk diazometánnal vagy diazoetánnal végzett reakcióval olyan (II) általános képletű vegyületekből, amelyekben mind az R1 és R10 karbonsav formában találhatók. A reakciókörülmények lényegében azonosak, az előzőkben a citokinin-glükuronidok metilészter vagy etilészter formáinak készítésénél leírtakkal.
Előnyös (II) általános képletű vegyületek az alábbiak:
a (II) általános képletű vegyület, amelyben R1 jelentése cisz- és/vagy transz-2-amidoetenil [cisz- és/vagy transz-CH=CHCONH2]-csoport, és R10 a B-d-glükopiranuronozilcsoport amidszármazéka a karbonsav funkción (2-hidroxi-cinnamil-B-D-glükopiranuronamid);
a (II) általános képletű vegyület, amelyben R1 jelentése cisz-2-amidoetenil- [cisz-CH=CHC0NH2] csoport, és R10 a β-d-glükopiranuronozil csoport (2-hidroxi-cinnamil-fi-D-glükopiranuronsav).
Az alábbi példákban a találmány általános elveit
illusztráljuk növényekben, főleg egy β-D-glükuronidáz gént használva szelekciós markerként, és új glükuronid szubsztrátokat alkalmazva, amelyeket ezzel a géntermékkel lehet hidrolizálni. Feltételezhető, hogy gének, például a B-glükuronidáz gén használható számos rokon célra is. Tehát a B-glükuronidáz gén használható egy olyan módszerben, amellyel lokalizált vagy szövetspecifikus növény-növekedési hatást akarunk elérni egy növényi részben vagy növényi szövetben, amely egy bejuttatott β-glükuronidáz gént sokkal magasabb szinten expresszál, mint az ugyanabban a növényben levő egyéb növényi részek vagy szövetek, a módszer abban áll, hogy a növényt egy olyan vegyület hatásának teszünk ki, amely elhidrolizálható a bejuttatott β-glükuronidáz génnel, oly módon hogy a vegyület hidrolizál abban a részben, amely a bejuttatott β-glükuronidáz gént tartalmazza, ezáltal egy növényi növekedést szabályozó vegyületet szabadít fel a szövetben, és növekedést szabályozó hatást fejt ki, kizárólag ebben a szövetben vagy növényi részben, illetve ebben a részben vagy szövetben olyan szövetszabályozási hatást fejt ki, amely nagyobb mint a növény más részeiben vagy szöveteiben kapott hatás. Az is meggondolandó, hogy előnyös lehet növényi növekedésszabályozók, azaz citokininek alkalmazása glükuronidok vagy glükuronidszármazékok formájában a szabad citokininek helyett, például azért, hogy kihasználjuk azt a tényt, hogy feltehetően másképpen transzportálódnak és oszlanak meg a növényekben, mondjuk a megfelelő szabad vagy ribozilezett citokininekhez viszonyítva.
Hasonlóképpen, az alábbi példák a β-glükuronidok bi zonyos más felhasználási lehetőségeire is rámutatnak· Ezek közül az egyik egy in vitro módszer citokinin glükuronid vegyületek screenelésére és azonosítására (illetve más növényi növekedésszabályozó glükuronidokkal való munkára), amelyek képesek in vivő hidrolizálódni egy bevitt B-glükuronidáz gén hatására. A β-glükuronidáz használható szelekcióra egy olyan rendszerben, amellyel olyan vegyületeket screenelünk, amelyek az alábbiakban ismertetett pozitív szelekciós módszerben szelekciós ágensként használhatók (lásd 2. példa). A 3. és 12. példában olyan rendszereket írunk le, amelyek használhatók olyan vegyületek szelektálására, amelyek szelektíven gátolnak egy natív β-glükuronidáz enzimet növényi sejtekben, anélkül, hogy lényegesen érintenék a kívülről bevitt β-glükuronidáz gén által kódolt enzim aktivitását.
1. példa
Glükuronid vegyületek szintézise
Az alábbiakban számos új glükuronid vegyület szintézisét írjuk le. Az egyes szintetizált vegyületekhez megadott rövidítések mellett az alábbi rövidítéseket használjuk:
BA N^-benz iladenin
AcOH ecetsav
DMF Ν,Ν,-dimetil-formamid
IP N6-(2-izopentenil)-adenin
MBTG metil-(2,3,4-tri-O-acetil-a-D-glükopira-
nozil-bromid)-uronát
·* • ··* · · · i · • · · · « '·· »· ··· ··
- 47 1A. példa
3-B-D-Glükopiranuronozil-6-benzilaminopurin nátriumsója [(IV) képletű vegyület]
Szinonimák: N^-benziladenin-N-^-B-D-glükopiranuronsav-nátriumsó N6-benziladenin-3-glükuronid-nátriumsó Rövidítés: BA3GN-nátriumsó
Az N6-benziladenin (BA) és a metil-(2,3,4-tri-0acetil-a-D-glükopiranozil-bromid)-uronát (MBTG) kondenzációja
12,6 mmol BA-t és 15,1 mmol MBTG-t [Bollenback et al., Journal of the American Chemical Society, 77, 3310-3315 (1955)] szuszpendálunk 50 ml vízmentes dimetil-formamidban, majd körülbelül 10 óra hosszat 100 °C-on tartjuk. A dimetil-formamid legnagyobb részét csökkentett nyomáson eltávolítjuk, és a nyers terméket 300 ml kloroformban oldjuk, majd 3x300 ml vízzel kirázzuk. Vízmentes magnézium-szulfáton végzett szárítás után a kloroformos extraktumot csökkentett nyomáson bepároljuk, és a kapott sötét szirupot etanolból átkristályosítjuk. A nyers terméket (BA, BA9GN és BA3GN peracetilezett metilésztereinek keveréke) 100 g, kloroformmal oszlopba töltött szilikagélen tisztítjuk, majd 0-4 %-os kloroformban készített etanolgradienssel eluáljuk. A nyers peracetil-BA3GN-metilésztert etanolból kristályosítjuk át. Kitermelés: 280 mg színtelen, amorf szilárd anyag.
A peracetil BA3GN metilésztert hidrolizáljuk, 5 %-os nátrium-hidroxid 50 %-os vizes etanolban készített oldatá ··· · * • · · val, szobahőmérsékleten. Öt perccel azután, hogy a szilárd anyag feloldódott, a reakcióelegyet óvatosan semlegesítjük sósav hozzáadásával, miközben jégen tartjuk. Csökkentett nyomáson való szárítás után a nyers BA3GN-nátriumsót fordított fázisú kromatográfiával tisztítjuk (100 g oktadecilszilikagélen), 1 liter vízzel eluáljuk, majd 20 %-os vizes metanollal, végül pedig etanolból átkristályosítjuk. A tiszta BA3GN-nátriumsót (150 mg) színtelen, mikrokristályos szilárd anyag formájában kapjuk, amelyet kalcium-kloridon szárítunk tömegállandóságig.
Elemzés
UV
Etanol A max 297 nm
Etanol/ecetsav A max 291 nm
Etanol/ammónia A max 297 nm
Ezek az értékek azonosak azokkal az szakirodalomban közölt értékekkel, amelyeket a BA-3-B-D-glükopiranuronozidra és az N3,N6-diszubsztituált adeninre leírnak [N.J. Leonard,
K.L. Carraway and J.P. Helgeson, J. Heterocyclic Chem., 2, 291-297 (1965)].
HPLC
A HPLC vizsgálatokat egy 10x0,46 cm-es, oktadecilszilikagéllel töltött oszlopon végezzük, izokratikusan eluáljuk 10 % ecetsavat tartalmazó 60 %-os metanollal 1 ml/perc sebességgel, UV követés 290 nm-en.
• ·· · « · * · · · ·· ·· ··
A BA3GN-nátriumsó tisztasága 95+%, a szabad BA tartalmát 0,05 %-nál kevesebbre becsüljük.
Hidrolízis B-qlükuronidázzal (GUS)
500 pg BA3GN nátriumsó 500 pl 50 mmol/l-es nátrium-foszfát pufferben (pH=7,0) készített oldatát B-glükuronidázzal inkubáljuk (GUS, Sigma Type G7896) , 2500 Sigma Fishman egységgel 18 óra hosszat 37°C-on. A HPLC vizsgálatok (a körülményeket az előzőkben megadtuk) a BA3GN csúcs szinte teljes eltűnését mutatják, egy olyan csúcs keletkezése közben, amely együtt kromatografálódik az autentikus BA-val, ha 1:1 arányú keveréket készítünk belőlük. Ez megerősíti, hogy a termék BA és β-D-glükuronsav konjugátum.
Az alábbi elemzést az előzőkben készített BA3GN-nátriumsó egy másik részletével végeztük el:
uv
Etanol A max 297 nm
HPLC
15x0,46 cm-es oktadecil-szilikagél oszlop, eluálás
20-60 %-os metanol/10%-os ecetsav gradienssel 30 perc alatt ml/perc sebességgel. Tisztaság HPLC alapján 99,5 %. A szabad BA tartalom <0,05 %.
Vékonyréteg kromatográfia
Szilikagél, amelyet 1-butanol/ecetsav/víz (12/3/5) eleggyel fejlesztünk ki. Tisztaság vékonyréteg kromatográfia ♦ « * * 4 « • · · « • · ♦ · ·· alapján 99,5 %. Szabad BA tartalom <0,05 %.
Hidrolízis β-qlükuronidázzal (GUS)
500 ug BA3GN-nátriumsó 500 μΐ 50 mmol/l-es nátrium-foszfát pufferben (pH=7,0) készített oldatát β-glükuronidázzal inkubáljuk (GUS, Sigma Type G7896), 2500 Sigma
Fishrnan egységgel 12 óra hosszat 37 °C-on. A HPLC és vékonyréteg kromatográfiás vizsgálatok a BA3GN csúcs szinte teljes eltűnését mutatják, egy olyan csúcs keletkezése közben, amely együtt kromatográfálódik az autentikus BA-val, ha 1:1 arányú keveréket készítünk belőlük.
1B. példa
3-B-D-Glükopiranuramido-6-benzilaminopurin [ (V) képletű vegyület]
Szinonimák: N®-benziladenin-N3-B-D-glükopiranuramid N6-benziladenin-3-glükuronamid
Rövidítés: BA3GNamid
Szintézis
1,5 g, az 1A példában leírtak alapján készített, átkristályosított peracetil-BA3GN-metilésztert szuszpendálunk 200 ml vízmentes metanolban, majd 0 °C-ra hűtjük. További 400 ml vízmentes metanolt adunk hozzá, amely -10 °C-on vízmentes ammóniával van telítve, majd az elegyet jeges vízfürdőben kevertetjük. További jéghideg vízmentes metanolt adunk hozzá, addig, ameddig a szilárd anyag teljesen feloldódik. A reakcióelegyet jeges vízfürdőben további 3 óra »
- 51 hosszat kevertetjük. A feleslegben levő ammóniát és metanolt csökkentett nyomáson eltávolítjuk, majd a terméket trituráljuk forró etanollal, így kapunk 1,3 g színtelen szilárd anyagot.
A BA3GNamid, csakúgy mint más adenin-3-glikozidok, csak gyengén oldódik vízben vagy alkoholban, de feloldódik
2,4 mg/ml koncentrációban 50 %-os metanolban, amely 25 % ecetsavat tartalmaz.
Elemzés
Vékonyréteg kromatográf ia
Szilikagél-kloroform/metanol/jégecet, 50/50/5
Egyetlen UV pozitív folt látható (Rf=0,36), és nem mutathatók ki szennyeződések 50Mg anyag felvitele mellett. A tisztaság 98+%. Nincs kimutatható (<1%) peracetil-BA3GNmetilészter (Rf=0,89) vagy BA3GN (Rf=0,02).
Szilikagél-kloroform/metanol, 9/1
A BA-tartalom vizsgálatára használjuk. 192 pg
BA3GNamid felvitelekor nincs kimutatható 6-benziladenin mennyiség. A BA-tartalom ennélfogva <0,2%.
IC. példa
9-β-D-Glükop iranurono zil-6-benzilaminopur in nátriumsója [(VI) képletű vegyület]
Szinonimák: N6-benziladenin-N9-B-D-glükopiranursav-nátriumsó
N6-benziladenin-9-glükuronid-nátriumsó
Rövidítés: BA9GN nátriumsó
Szintézis
1. módszer
Az N6-benziladenin-9-fi-D-glükopiranuronozid (BA9G) katalitikus oxidációja mg Ba9G-t szuszpendálunk 25 ml 50 mmol/1 koncentrációjú nátrium-hidrogén-karbonát oldatban, 200 mg fekete platinával. A keveréket 80 °C-ra melegítjük vízfürdőben, miközben intenzíven oxigént áramoltatunk át rajta. 4 óra elteltével újabb 100 mg platinakatalizátort adunk a keverékhez. A BA9G-nek körülbelül 95+%-a a megfelelő 9-B-D-glükopiranursavvá, valamint valamennyi BA-vá oxidálódik húszórás kezelés után. A keveréket semlegesítjük, majd a terméket, a BA9GN nátriumsót fordított fázisú kromatográfiával tisztítjuk (20 g oktadecil-szilikagélen), 200 ml vízzel, majd 20 %-os metanollal eluálva.
A tiszta BA9GN-nátriumsót, amely mentes a glükózidtól és a BA-tól, színtelen szilárd anyaggá szárítjuk kalcium-kloridon, csökkentett nyomáson.
2. módszer
A 6-klór-purin és a metil-(2,3,4-tri-O-acetil-a-D-glükopiranozil-bromid)-uronát (MBTG) kondenzációja
1,13 g, foszfor-pentoxidon szárított 6-klór-purint,
3,87 g MBTG-t és 1,5 g frissen szárított kálium-karbonátot ml vízmentes propilén-karbonátban kevertetünk szobahőmér-
sékleten 24 óra hosszat. A sötét keveréket megszűrjük, majd őszlopkromatográfiával tisztítjuk 100 g szilikagélen, majd 0-80%-os, kloroformban készített etil-acetát gradienssel eluáljuk. A fő frakciót (mást, mint a reagálatlan 6-klórpurin) megszárítjuk, majd forró etanolból átkristályosítjuk, így kapunk 450 mg metil-6-klór-purin-9-(2 *,31,4'-tri-O-acetil)-B-D-glükopiranuronátot világossárga szilárd anyag formájában, amelyet azután foszfor-pentoxidon csökkentett nyomáson szárítunk. A HPLC vizsgálat alapján a tisztasága 95+%.
312 mg metil-6-klór-purin-9-(2',3',4'-tri-O-acetil)-β-D-glükopiranuronátot és 171 μΐ benzilamint melegítünk együtt 13,5 ml 1-butanollal 1 óra hosszat 100 °C-on. A szilárd anyag könnyen feloldódik, így egy világossárga oldatot kapunk. A butanol legnagyobb részét csökkentett nyomáson eltávolítjuk, így fehér szilárd anyagot, amelyet 25 ml 5 %os, 50 %-os vizes etanolban készített nátrium-hidroxiddal rázatunk 1-2 óra hosszat szobahőmérsékleten. Semlegesítés után a terméket csökkentett nyomáson megszárítjuk, a butanol-nyomokat eltávolítjuk, és a nyers BA9GN nátriumsót fordított fázisú kromatográfiával tisztítjuk, az 1. módszerben leírtak alapján.
A tiszta terméket csökkentett nyomáson kalcium-kloridon és foszfor-pentoxidon szárítjuk, így 210 mg színtelen szilárd anyagot kapunk, amely együtt kromatografálódik a katalitikus oxidációval előállított BA9GN-nel.
A 2. módszer szerinti kondenzációs reakcióval előállított BA9GN-nátriumső elemzése
UV
95 %-os etanol A max 270 nm (17400)
95 %-os etanol/0,1 mol/1 HC1 A max 270 nm (16200)
95 %-os etanol/0,1 mol/1 NaOH A max 270 nm (17400)
Ezek az eredmények összhangban vannak az N6,N9-diszubsztituált adeninszerkezettel. Az extinkciós koefficiensek lényegében ugyanazok, mint a tiszta BA9G-jé, jelezve, hogy mentes az UV-t nem abszorbeáló szennyeződésektől. Tisztaság UV szerint 95+%.
HPLC
10x0,46 cm-es oktadecil-szilikagél oszlop, UV követés 270 nm-en. Izokratikus (50 %-os metanol/0,2 mol/1 ecetsav, 2 ml/perc) és gradiens HPLC vizsgálatok (0-60 %-os metanol/0,2 mol/1 ecetsav, 2 ml/perc) éles, szimmetrikus csúcsot mutatnak a BA9GN-re, amely közvetlenül a megfelelő glükozid előtt eluálódik. A kondenzációs reakcióval előállított BA9GN együtt kromatografálódik 1:1 arányú keverék formájában a HPLC oszlopon (izokratikus és gradiens elúcióval) a katalitikus oxidációval előállított BA9GN-nel. Ez megerősíti, hogy a kondenzációs reakcióval előállított BA9GN a BD-glükopiranuronozil-izomer. A BA9GN nem tartalmaz kimutatható (<2%) a-anomert vagy más szennyezést, beleértve a BA-t. A BA9GN tisztasága HPLC alapján 98+%.
»<
• «
V·· · ' · ·· ··· 4 • ·
Vékonyréteg kromatográfia
Szilikagél-kloroform/metanol, 9/1
A BA9GN termék BA szennyeződésének mérésére használjuk. A BA9GN nem mozdul ki a felviteli pontból ebben a rendszerben. A BA minimális kimutatási határértéke 200 ng. Ha 200 pg BA9GN-t visszük fel, nem mutatható ki BA vagy egyéb szennyeződés. A vékonyréteg kromatográfiás tisztaság 98+%. BA-tartalom <0,1%.
Savas hidrolízis
Az ásványi sav a citokinin glükózidokat a megfelelő citokinin bázisokká alakítja át. A BA9GN-nátriumsót (1 mg/ml) 1 mol/1 sósavval kezelve 100 ’C-on éjszakán át, egyetlen foltot kapunk vékonyréteg kromatográfiával, ha a megfelelő autentikus BA-val együtt kromatografáljuk a reakcióterméket. Ez a vizsgálat megerősíti, hogy a BA9GN a BA savra érzékeny konjugátuma.
Enzimatikus hidrolízis
500 pg BA9GN-nátriumsó 500 pl 50 mmol/l-es nátrium-foszfát- pufferben (pH=7,0) készített oldatát B-glükuronidázzal inkubáljuk (GUS, Sigma Type G7896), 2500 Sigma Fishman egységgel 12 óra hosszat 37 °C-on. A HPLC és vékonyréteg kromatográfiás vizsgálatok szerint nincs kimutatható mennyiségű BA. Szobahőmérsékleten végzett további háromnapos inkubálással nem figyelhető meg hidrolízis. A BA9GN ennélfogva nem érzékeny a β-glükuronidázos hidrolízisre.
« « ··« · • · ·* *1
1D. példa
3-8-D-Glükopiranuronozil-6-(3-metil-but-2-enilamino)-purin nátriumsó [(VII) képletű vegyület]
Szinonimák: N6- (21-izopentenil)-adenin-N3-B-D-glükopiranuronsav-nátriumsó
N6-(2'-izopentenil)-adenin-3-glükuronid-nátriumsó
Rövidítés: IP3GN nátriumsó
Szintézis
9,48 g N6-(2-izopentenil)-adenint és 22,1 g MBTG-t
170 ml vízmentes dimetil-formamidban 100 °C-on 12 óra hosszat melegítünk. A DMF legnagyobb részét csökkentett nyomáson, forrásban levő vízfürdőn eltávolítjuk, majd a lehűtött szirupot 500 ml kloroformban vesszük fel. A kloroformos oldatot 3x500 ml vízzel extraháljuk, majd a szerves extraktumot vízmentes nátrium-szulfáton szárítjuk. A kloroform legnagyobb részét csökkentett nyomáson eltávolítjuk, majd a szirupot szilikagélen kromatográfiásan tisztítjuk, a kromatogrammot 0-3,75 %-os metanol kloroformban készített oldatával fejlesztjük ki. A nyers peracetil-IP3GN-metilésztert metanolból átkristályosítjuk, aktív szénnel végzett színtelenítés közben, így 3,2 g tiszta színtelen peracetilIP3GN-metilésztert kapunk, amelyet azután csökkentett nyomáson kalcium-kloridon szárítunk. A peracetil-IP3GN-metilészter egy részét (1,2 g) hidrolizáljuk, oly módon, hogy körülbelül 1 liter 75 %-os vizes metanolban oldjuk, amely 5 % nátrium-hidroxidot tartalmaz, és az elegyet 10 percig szó♦ ·
- ~ w T w · ·· · ··· ·· ··· ··* ·®
- 57 bahőmérséklétén kevertetjük. Az elegyet jégbehűtjük, óvatosan semlegesítjük sósavval, majd csökkentett nyomáson szirup formára bepároljuk. A nyers terméket több egymást követő kromatográfiás lépésben, XAD-2 gyantán és oktadecil-szilikagélen tisztítjuk, így 820 mg IP3GN-nátriumsót kapunk színtelen, mikrokristályos szilárd anyag formájában, amelyet kalcium-kloridon szárítunk.
Az lP3GN-nátriumsó 2 mg/ml koncentrációban oldódik vízben.
Analízis
Vékonyréteg kromatográfia
Szilikagél-1-butanol/j égecet/ví z, 12/3/5
Az IP3GN-nátriumsó egyetlen éles foltot ad (Rf=0,32), ha 100 gg-ot viszünk fel, az N6-(20izopentenil)adenin (IP) (Rf=0,66) vagy egyéb szennyeződés nem mutatható ki. Tisztaság 99+%.
Hidrolízis β-glükuronidázzal (GUS)
500 gg IP3GN-nátriumsó 500 gl 50 mmol/l-es nátrium-foszfát pufferben (pH=7,0) készített oldatát β-glükuronidázzal inkubáljuk (GUS, Sigma Type G7896), 2500 Sigma Fishman egységgel 12 óra hosszat 37 °C-on. A vékonyréteg kromatográfiával kimutatható az IP3GN-nek megfelelő UV folt eltűnése, egy új UV pozitív folt keletkezése közben, amely együtt kromatográfálódik az autentikus IP-vel.
- 58 1Ε. példa
6-(3-Metil-but-2-enil-amino)-purin-2-il-l-tio-B-D-glükopiranuronsav nátriumsó [(VIII) képletű vegyület]
Szinonimák: N2 * * * 6-(2'-izopentenil)-adenin-2tioglikopiranursav-nátriumsó N6- (2'-izopentení1)-adenin-2tioglükuronid-nátriumsó
Rövidítés: IP2SGN nátriumsó
Szintézis
1. 2-Benzil-tio-6-purinol
1,4 ml benzil-kloridot adunk cseppenként, erős kevertetés közben 2 g tioxantin 12 ml 1 mol/l-es nátrium-hidroxidban készült oldatához, majd vízzel 140 ml-re hígítjuk. Miután az adagolást befejeztük, krémszínű csapadék keletkezik. A reakcióelegyet további egy óra hosszat kevertetjük szobahőmérsékleten, majd megszűrjük. A szilárd anyagot alaposan mossuk vízzel, majd egy éjszakán át csökkentett nyomáson szárítjuk kalcium-kloridon, majd tömegállandóságig foszfor-pentoxidon. A kapott 2 g nyers terméket használjuk közvetlenül a következő lépésben, anélkül, hogy átkristályosítanánk.
2. 2-Benzil-tio-6-klór-purin g 2-benzil-tio-6-purinolt lefedünk 20 ml foszfor-oxi-klorid és 2 ml dietilanilin keverékével. A keveréket kevertetés közben 1 óra hosszat refluxáltatjuk, lehűtjük, majd jégre öntjük (100 g). Sárga csapadék keletkezik, amit kiszűrünk, alaposan mosunk vízzel, majd csökkentett nyomáson szárítunk. A nyers terméket átkristályosítva kapunk egy világos krémszínű szilárd anyagot (1,2 g), amelyet foszforpentoxidon tömegállandóságig szárítunk.
3. 2-Benzil-tio-N6-(2-izopentenil)-adenin
1,2 g 2-benziltio-6-klór-purin és 1,04 g izopentenil-amin-hidroklorid 25 ml, 2,2 ml trietilamint tartalmazó 1-butanolban készített elegyét lezárt csőben 110 °C-on 2 óra hosszat melegítjük. A butanolt csökkentett nyomáson eltávolítjuk, majd az elegyet jeges vízzel (100 ml) rázatjuk. A terméket kiszűrjük, etanolból kristályosítjuk aktívszenes színtelenítés közben, majd csökkentett nyomáson szárítjuk foszfor-pentoxidon. Kitermelés 0,64 g. A kitermelés 1,3 g 2-benzil-tio-N6-(2-izopentenil)-adenin színtelen szilárd anyag formájában. A nyers terméket közvetlenül használjuk a következő lépésben.
4. 2-Tio-N6-(2-izopentenil)-adenin
0,64 g 2-benzil-tio-N6-(21-izopentenil)-adenint oldunk 62,5 ml folyékony ammóniában, így kapunk egy tiszta sárga oldatot. Körülbelül 200 mg nátriumot adunk hozzá kis adagokban, ameddig a kék szín tíz percig fennmarad. Kismennyiségű szilárd ammónium-kloridot adunk hozzá a feleslegben levő nátrium eltávolítására, majd hagyjuk hogy az ammónia kis térfogatra bepárlódjon. 65,5 ml dietil-étert adunk hozzá, majd az éteres extraktumot 62,5 ml vízzel extraháljuk. A vizes extraktum pH-ját 4 és 5 közé állítjuk ecetsavval, ekkor krémszerű szilárd csapadékot kapunk. Hűtés után a terméket kiszűrjük, majd csökkentett nyomáson foszfor-pentoxidon szárítjuk. Kitermelés 340 mg.
Nyers 2-tio-N6-(2-izopentenil)-adenint nátriumsóvá alakítunk oly módon, hogy vízben szuszpendáljuk, majd ekvimoláris mennyiségű kálium-hidroxidot adunk hozzá és annyi alkoholt, amennyi az oldódáshoz szükséges. Az oldatot csökkentett nyomáson szárítjuk foszfor-pentoxidon.
5. N6-(2-Izopentenil)-adenin-2-tioglükopiranuronid
2,89 mmol 2-tio-N6-(2-izopentenil)-adenint oldunk vízmentes metanolban, és 5 mmol MBTG-t adunk hozzá. A keveréket 24 óra hosszat kevertetjük szobahőmérsékleten, ami alatt krémes fehér anyag válik ki. A reakcióelegyet csökkentett nyomáson szárítjuk, majd szobahőmérsékleten hidrolizáljuk 50 ml 5 %-os vizes nátrium-hidroxid hozzáadásával, így kapjuk a szabad glükopiranuronidot nátriumsó formájában. A keveréket semlegesítjük, tömény sósav óvatos hozzáadásával, külső hűtés mellett, így kapunk egy színtelen csapadékot, ez az IP2SGN nátriumsója.
A nyers terméket fordított fázisú kromatográfiával tisztítjuk, majd etanolból átkristályosítjuk és csökkentett nyomáson kalcium-kloridon szárítjuk, így színtelen, amorf szilárd anyagot (150 mg) kapunk. A termék gyengén oldódik 50 %-os vizes alkoholban.
Analízis
UV víz, pH=l víz, pH=7 víz, pH=14
A max 284, 241, 206 nm
278, 230 (váll)
283, 227
Az IP2SGN nátriumsója a 2-tio-szubsztituált citokininek jellemző UV spektrumát mutatja, és a spektrum nagyon hasonló az autentikus 2-metil-tio-N6-(2-izopentenil)-adeninéhez. Az UV elemzés megerősítette, hogy a termék a 2-N6szubsztituált adenin.
HPLC
A HPLC vizsgálathoz egy 15x0,46 cm-es oktadecilszilikagél oszlopot használunk, amelyet 0-60 %-os metanol gradienssel eluálunk, amely 0,2 mol/1 ecetsavat tartalmaz (30 perc, 1 ml/perc, UV követés 270 nm-en).
Az IP2SGN nátriumsójának tisztasága 98+%, és nem tartalmaz kimutatható szabad 2-tio-N6-(2-izopentenil)-adenint (<0,1%).
Hidrolízis β-glükuronidázzal
500 pg IP2SGN-nátriumsót inkubálunk 500 μΐ 50 mmol/l-es nátrium-foszfát-pufferben (pH=7,0) 2500 Sigma '•Fishman” egység β-glükuronidázzal (GUS, Sigma Type G7896) 48 órán át 37 °C-on. Az előzőkben leírt HPLC körülmények között kimutatható az IP2SGN részleges eltávolítása (65 %), így jön létre egy olyan csúcs, amely 1:1 arányban keverve együtt kromatografálódik a 2-tio-N1 * * * * 6-(2-izopentenil)-adeninnel. Ez a vizsgálat megerősíti, hogy az IP2SGN-nátriumsó a 2-tio-N6-(2-izopentenil) -adenin és a β-D-glükuronsav konjugátuma, amely részlegesen érzékeny a GUS hidrolízisre.
1F. példa
6-(3-Metil-but-2-enilamino)-purin-8-il-l-tio-8-Dglükopiranursav nátriumsó [(IX) képletű vegyület]
Szinonimák: N6-(2’-izopentenil)-adenin-8-tioglükopiranursav nátriumsó N6-(2'-izopentenil)-adenin-8-tioglükuronid-nátriumsó
Rövidítés: IP8SGN-nátriumsó
1. reakció
6-Hidroxi-8-tiopurin g 4,5-diamino-6-hidroxi-pirimidin-szulfátot és
100 g tiokarbamidot összeőrlünk, majd olajfürdőben 30 percig
200 °C-on tartjuk. A lehűtött megszilárdult terméket 500 ml mol/l-es forró nátrium-hidroxidban oldjuk, aktívszénnel forraljuk, majd megszűrjük. A forró szűrletet tömény sósavval savanyítjuk, majd a forró oldatot megszűrjük, így vörösszínű szilárd anyagot kapunk, amely forró lúgos oldatból újra kicsapódik, majd alaposan mossuk vízzel és csökkentett nyomáson 80 ’C-on szárítjuk. Kitermelés 5,28 g.
Analízis
UV
A max, pH=l 235,292 nm (Írod.:234,290 nm) pH=ll 234,291 nm (írod.:234,290 nm)
2. reakció
6-Hidroxi-8-benzi1-tiopurin
5,28 g 6-hidroxi-8-tiopurint szuszpendálunk 78,5 ml mol/l-es nátrium-hidroxidban, majd 400 ml-re hígítjuk vízzel. 3,7 ml benzil-kloridot adunk hozzá, majd a reakcióelegyet erősen kevertetjűk 3 óra hosszat szobahőmérsékleten, pH-ját 5-re állítjuk jégecettel, majd megszűrjük. A terméket vízzel alaposan mossuk, majd egy éjszakán át csökkentett nyomáson 80 ’C-on szárítjuk, így 7,33 g lazacrózsaszín szilárd anyagot, amelyet további tisztítás nélkül felhasználunk.
3. reakció
6-Klór-8-benzil-tiopurin
7,33 g 6-hidroxi-8-benzil-tiopurint adunk 70 ml foszfor-oxi-klorid és 7,5 ml Ν,Ν-dietil-anilin elegyéhez, majd az elegyet 2 óra hosszat refluxáltatjuk, így egy sötétvörös terméket. A keveréket csökkentett nyomáson betöményítjük, majd a kapott szirupot lassan, kevertetés közben 400 g jégre öntjük. A keveréket 15 percig hagyjuk állni, majd hideg tömény KOH-dal erősen meglúgosítjuk. A keveréket alaposan trituráljuk, hogy a szirup legnagyobb részét feloldjuk, majd 1-es pH-ra savanyítjuk hideg tömény sósav hozzáadása64 val, jégfelesleg jelenlétében.
Miután szobahőmérsékleten hagytuk állni egy óra hosszat, a terméket kiszűrjük, alaposan mossuk vízzel, és csökkentett nyomáson 80 °C-on 2 óra hosszat szárítjuk, így
7,8 g terméket kapunk.
4. reakció
8-Benzil-tio-N6-(2·-izopentenil)-adenin
3,9 g 6-klór-8-benzil-tiopurin és 3,42 g izopentenil-amin-hidroklorid 100 ml, 7,5 ml trietil-amint tartalmazó 1-butanolos oldatban készített elegyét 2 óra hosszat refluxáltatjuk. Az 1-butanol legnagyobb részét csökkentett nyomáson eltávolítjuk, majd a reakcióelegyet jégbehűtjük és 400 ml vízzel rázatjuk.
Egy éjszakán át történő hűtés után a keveréket megszűrjük, így nyers terméket kapunk, amelyet 100 g szilikagélen végzett kromatográfiával tisztítunk, 0-2,5% MeOH kloroformos oldatával eluálva. A kromatográfiásan tiszta terméket metanolból átkristályosítjuk, így kapunk 1,18 g színtelen, amorf szilárd anyagot.
Analízis
Vékonyréteg kromatográf ia
Szilikagél-2,5%-os metanol/kloroform
98+%-os tisztaság; kimutatható szennyeződés nincs
UV
95 % Etanol/HCl 307 nm
95 % Etanol 291 nm
95 % Etanol/ammónia 298 nm
5. reakció
8-Tio-N6-(2’-izopentenil)-adenin
1,18 g 8-benzil-tio-N6-(2’-izopentenil)-adenint oldunk 125 ml folyékony ammóniában, így tiszta sárga oldatot kapunk. Nátriumot adunk hozzá kis részletekben, ameddig a kék szín 15 percig fennmarad. Kismennyiségű szilárd ammónium-kloridot adunk hozzá a feleslegben levő nátrium eltávolítására. Az ammóniát egy forró lapon kis térfogatra bepároljuk, majd 125 ml étert adunk hozzá.
Miután az összes megmaradt ammónia eltávozott, az éteres extraktumot 2x65 ml vízzel extraháljuk. A vizes extraktumot (pH=12-13) jégbehűtjük, majd pH-ját jégecet hozzáadásával 5-re állítjuk be. Egy krémes fehér szilárd anyag csapódik ki, amelyet kiszűrünk, alaposan mosunk vízzel, majd egy éjszakán át kalcium-kloridon szárítunk, így látszólag fehér, nagyon könnyű port kapunk. Kitermelés 760 mg.
Megjegyzés: a 8-tio-N^-(2'-izopentenil)-adenin könnyen oxidálódik lúgos oldatban.
Analízis
HPLC cm hosszú oktadecil-szilikagél oszlop, 0-80 %-os metanol/0,2 mol/1 jégecet, 30 perc, 1 ml/perc, UV követés
300 nm-en
Éles, szimmetrikus csúcs, szennyeződés nem mutatható
Tisztaság 98+%.
UV
95 % Etanol/HCl 245, 307 (éles),
95 % Etanol 241, 305, 313 nm
6. reakció
IP8SGN-nátriumsó
600 mg 8-tio-N6-(2'-izopentenil)-adenint szuszpendálunk 102 ml 50 mmol/l-es kálium-hidroxidban, amely 1 % β-merkapto-etanolt tartalmaz antioxidánsként. Elegendő etanolt adunk hozzá, hogy a szilárd anyag feloldódjon. Az oldatot csökkentett nyomáson szárítjuk kalcium-kloridon, majd foszfor-pentoxidon. A száraz terméket 100 ml vízmentes metanolban oldjuk, amely 50 pl β-merkapto-etanolt tartalmaz, és 2 g MBTG-t adunk hozzá. A keveréket 24 óra hosszat kevertetjük szobahőmérsékleten, majd csökkentett nyomáson szárítjuk kalcium-kloridon és foszfor-pentoxidon. A védett észtert 1 óra hosszat szobahőmérsékleten hidrolizáljuk 50 ml 5 %-os nátrium-hidroxidban.
Tömény sósavval végzett semlegesítés után a nyers terméket fordított fázisú és normál fázisú kromatográfiával tisztítjuk, így színtelen szilárd anyagot kapunk, amelyet tömegállandóságig szárítunk kalcium-kloridon. Kitermelés 190 mg.
Az IP8SGN-nátriumsó analízise
UV
A max Etanol/pH=l 300 nm
Etanol/semleges 285 (erős váll), 291, 301 nm Etanol/pH=12 283 (váll), 290, 300 nm
Vékonyréteg kromatográfia
Szilikagél-kloroform/metanol, 1/1
34, 68, 102 és 134 pg IP8SGN-nátriumsót felvive egyetlen éles foltot kapunk, szennyeződés nem mutatható ki. Tisztaság 99,5+%. Szabad citokinin bázis (8-tio-N6-(2 izopentenil)-adenin tartalma <0,1%.
HPLC cm-es oktadecil-szilikagél oszlop, 0-80 %-os metanol/0,2 mol/1 jégecet,30 perc, 1 ml, 300 nm
Egyetlen széles csúcs, TRIS-HC1 pH—18,2 perc. Szennyeződés nem mutatható ki. Tisztaság 99,5+%.
GUS hidrolízis mg/ml koncentrációjú IP8SGN-nátriumsót inkubálunk 2500 egység GUS enzimmel (Sigma) 50 mmol/l-es foszfát pufferben (pH=7) 37°C-on 24 óra hosszat. Vékonyréteg kromatográfiával (1/1 metanol/kloroform) az IP8SGN-nátriumsó teljes konverziója (>95%) mutatható ki egy olyan vegyületté, amely együtt kromatografálódik a 8-tio-(2·-izopentenil)-adeninnel. Az IP8SGN-nátriumsó ennélfogva érzékeny a GUS hidrolízisre.
1G. példa
Ο-β-D-Glükopiranurozil-zeatin-nátriumsó [(X) képletü vegyület]
Szinonimák: zeatin-O-B-D-glükuronsav-nátriumsó, zeatin-O-glükuronid-nátriumsó
Rövidítés: ZOGN-nátriumsó
Szintézis
Transz-2-metil-4-ftálimidobut-2-enil-(2',3',4’-tri-O-acetil-B-D-glükopiranursav-metil-észter
1,87 g transz-l-hidroxi-2-metil-4-ftálimido-but-2-ént [Corse & Kuhnle, Synthesis, 618-619 (1972)] és 9 g frissen aktivált ezüst-karbonátot szuszpendálunk 300 ml vízmentes éterben, amely 9 g molekulaszitát tartalmaz. 30 percig kevertetjük szobahőmérsékleten, majd 3,24 g MBTG-t adunk hozzá, és a keveréket sötétben kevertetjük 2 napig szobahőmérsékleten. További 1,62 g MBTG-t adunk a reakcióelegyhez, majd újabb 2 napig kevertetjük. A reakcióelegyet megszűrjük, csökkentett nyomáson szárítjuk, így színtelen szirupot kapunk, amelyet tovább szárítunk csökkentett nyomáson kalcium-kloridon, így színtelen, porítható habot kapunk. A nyers terméket megszabadítjuk a cukorszennyeződésektől
200 g szilikagélen végzett kromatográfiával, majd kloroformmal eluáljuk. A tiszta termékből 2,45 g-ot kapunk (kitermelés 55,4 %).
- 69 Transz-2-metil-4-amino-but-2-enil-B-D-glükopiranozil-uronamid
2,45 g metil-transz-2-metil-4-ftálimidobut-2-enil-(2 ',3 1,4'-tri-O-acetil)-β-D-glükopiranuronátot oldunk 150 ml vízmentes metanolban, jégbehűtjük, majd hat óra hosszat ammóniát bocsátunk át a jéghideg oldaton. Miután a metanolt csökkentett nyomáson eltávolítottuk, a nyers terméket cellulóz -kromatográf iával (200 g) tisztítjuk, és a kromatogrammot butanol-etanol-ecetsav-víz (8:2:1:3 térf/térf) eleggyel fejlesztjük ki. Az eluátumot csökkentett nyomáson szárítjuk, így barna szirupot kapunk, amelyet további tisztítás nélkül használunk a kondenzációs lépésben.
Zeatin-O-B-D-glükuronsav-nátriumsó
Az előző lépésben kapott szirupot lezárt csőben
0,8 g 6-klór-purinnal és 1,5 ml trietil-aminnal 25 ml metanolban melegítünk 90°C-on 4 óra hosszat, így kapjuk az amidot. Ahhoz, hogy az amidot savvá alakítsuk, a metanolt csökkentett nyomáson eltávolítjuk, majd 25 ml 5 %-os vizes nátrium-hidroxidot adunk hozzá. Miután szobahőmérsékleten 6 óra hosszat kevertettük, az elegyet óvatosan semlegesítjük 2 mol/1 sósavval, majd fordított fázisú kromatográfiával tisztítjuk 100 g oktadecil-szilikagélen, majd vízzel eluáljuk. A nyers ZOGN-nátriumsót, amely reagálatlan 6-klór-purint tartalmaz, csökkentett nyomáson szárítjuk, majd kromatográfiával tisztítjuk 50 g szilikagélen, az eluálást 0-100 %-os metanol kloroformos oldatával végezzük. Az oldószert csökkentett nyomáson eltávolítjuk, így a terméket amorf szilárd
anyag formájában kapjuk, amelyet csökkentett nyomáson kalcium-kloridon szárítunk. Kitermelés: 158 mg.
Analízis
UV
A max vizes etanol 276 nm, 270 nm (váll),
283 nm (váll)
vizes etanol/HCl 279 nm
vizes etanol/ammónia 276 nm. 270 nm (váll),
283 nm (váll)
Vékonyréteg kromatográf ia
Sz ilikagél-l-butanol/jégecet/víz, 12/3/5 pg ZOGN-nátriumsót felvitelénél egyetlen foltot kapunk (Rf=0,16), szennyeződések nem mutathatók ki. Zeatin (Rf=0,66) vagy 6-klór-purin (Rf=0,70) nem mutatható ki. A tisztaság 98+%.
HPLC
15x0,46 cm oktadecil-szilikagél oszlop, UV követés
270 nm-en
Gradiens-elúció
0-100 % metanol 30 percig 1 ml/perc sebességgel
A ZOGN-nátriumsó meglehetősen széles csúcs formájában eluálódik (tR=10,0 perc), az oldószercsúcsban kismenynyiségű szervetlen szennyezés van jelen. Tisztaság 97+%.
Izokratikus elúciő %-os metanol, 1 ml/perc
Az izokratikus eluálást a zeatin-tartalom mérésére használjuk. A ZOGN-nátriumsó retenciós ideje, tR=l,l perc, míg az autentikus transz-zeatin tR értéke 2,2 perc. Egészen 96 Mg ZOGN-nátriumsót felvive nem mutatható ki zeatin. A zeatin-tartalom ennélfogva kisebb mint 0,1 %. Ezt szilikagél vékonyréteg kromatográfiával is igazoljuk, kloroform/metanol 9/1 elegyet használva. A ZOGN-nátriumsó nem mozdul ki a felvitel helyéről ebben a rendszerben, de a szennyező zeatin világosan elválik Rf=0,39 értéknél. Nem mutatható ki zeatin, ha 200 pg ZOGN-nátriumsót futtatunk. A transz-zeatin kimutatási határa vékonyréteg kromatográfiával 200 ng; tehát a transz-zeatin szennyezés mértéke kisebb mint 0,1 %.
Enzimatikus hidrolízis
Egy ZOGN-nátriumsó mintát inkubálunk B-glükuronidázzal (Sigma G9387) 50 mmol/1 nátrium-foszfát-pufferben (pH=7,0) 37 °C-on. A HPLC mérés (50 %-os izokratikus metanol) azt mutatja, hogy az anyag lényegében teljesen transzzeatinná alakult. Az enzimes hidrolizátumban levő anyag transz-zeatinnal való azonosságát úgy igazoljuk, hogy a hidrolizátum és autentikus transz-zeatin 1:1 arányú keverékét 3 különböző kromatográfiás rendszerben futtatjuk.
IH példa
2-Hidroxi-cinnamil-B-D-glükopiranuronamid [(XI) képletű vegyület]
Szinonimák: o-kumaril-B-D-glükopiranuronamid o-kumaril-glükuronamid
Rövidítés: CouGNamid
Szintézis g metil-o-kumarátot és 16,8 g MBTG-t 25 ml kinolinnal eldörzsölünk, így homogén pasztát kapunk. 10,7 g ezüst(I)-oxidot adunk hozzá részletekben, alapos kevertetés közben, miközben a keveréket jégbehűtjük. Miután a hozzáadás teljes, a reakcióelegyet 3 óra hosszat szobahőmérsékleten tartjuk. Az elegyet 1 liter éterrel extraháljuk, majd az éteres extraktot 1 liter vízzel mossuk. Az éteres extraktumot vízmentes nátrium-szulfáton szárítjuk, majd csökkentett nyomáson szárítva vörös szirupot kapunk. A nyers szirupot 300 ml petroléterrel extraháljuk, a reagálatlan metil-okumarát eltávolítása érdekében, majd csökkentett nyomáson szárítjuk, hogy a petroléter nyomait eltávolítsuk. A nyers terméket etanolból átkristályosítjuk aktívszenes színtelenítés közben, így a tiszta peracetilezett metil-2-hidroxicinnamil-O-fi-D-glükopiranuronátot (3,5 g) kapjuk.
A peracetil-metil-észtert (3,5 g) 250 ml vízmentes metanolban oldjuk, majd hidrolizáljuk, oly módon, hogy 0 °Con kevertetjük 3 óra hosszat újabb 250 ml vízmentes metanollal, amelyet -10 °C-on száraz ammóniával telítettünk. Az ammóniát és a metanolt csökkentett nyomáson eltávolítjuk, *1
- 73 majd a nyers terméket etanolból átkristályosítjuk, így 1,7 g tiszta CouGNamidot kapunk színtelen szilárd anyag formájában.
Analízis
Vékonyréteg kromatográfia
Szilikagél-kloroform/metanol, 1/1
Egyetlen éles folt, Rf értéke 0,63. Szennyeződés nem mutatható ki egészen 50 gg felvitt anyagmennyiségig. Tisztaság 98+%. Szennyeződések: <0,5%-ban metil-o-kumarát vagy kumarin.
Vékonyréteg kromatográfia
Szilikagél-kloroform/metanol/jégecet, 50/50/5
Egyetlen éles folt Rf=0,68-nál. Tisztaság 98+%. 0kumarinsav nem mutatható ki (<0,5%, Rf=0,80).
II példa
2-Hidroxi-cinnamil-B-D-glükopiranursav [(XII) képletű vegyület]
Szinonimák: o-kumaril-B-D-glükopiranursav o-kumaril-glükuronid
Rövidítés: CouGN
Szintézis
17,8 g metil-o-kumarátot és 20 g MBTG-t 20 ml kinolinnal eldörzsölünk, amíg homogén pasztát nem kapunk. 13 g ezüst(I)-oxidot adunk hozzá részletekben, alapos kevertetés ♦ « ·· » ·
közben, miközben a keveréket jégbehűtjük. Miután az adagolást befejeztük, a reakcióelegyet hagyjuk szobahőmérsékleten állni 3 óra hosszat. A keveréket 1 liter éterrel extraháljuk, majd az éteres extraktumot 1 liter vízzel mossuk. Az éteres extraktumot vízmentes nátrium-szulfáton szárítjuk, majd csökkentett nyomáson szárítva vörös szirupot kapunk. A nyers szirupot 300 ml petroléterrel extraháljuk a reagálatlan metil-o-kumarát eltávolítása céljából, majd csökkentett nyomáson szárítjuk a petroléter nyomainak eltávolítása céljából. A nyers terméket etanolból átkristályosítjuk aktívszenes színtelenítés közben, így 2,9 g tiszta peracetilezett metil-CouGN-t kapunk.
A 2,9 g peracetil-metil-észtert 250 ml metanolban szuszpendáljuk, majd 250 ml 2 mol/1 nátrium-hidroxidot adunk hozzá kevertetés közben, míg a reakcióelegyet jégen tartjuk. Az elegyet szobahőmérsékleten 1,5 óra hosszat kevertetjük, majd a pH-ját sósavval 2,5-re állítjuk. A metanolt csökkentett nyomáson eltávolítjuk, majd a nyers terméket XAD-2 kromatográfiával tisztítjuk. A kromatográfiás gyantát először vízzel mossuk a szervetlen sók eltávolítása céljából, majd a terméket metanollal eluáljuk. Csökkentett nyomáson való szárítás után a terméket etanolból átkristályosítjuk és csökkentett nyomáson kalcium-kloridon szárítjuk, így 1,5 g tiszta CouGN-t kapunk színtelen amorf szilárd anyag formájában.
A CouGN 5 mg/ml koncentrációban oldódik vizes pufferben (pH=7) és 50%-os vizes alkoholban, így egy tiszta színtelen oldatot kapunk.
Analízis
Vékonyréteg kromatográfia
Szilikagél-kloroform/metanol/jégecet, 50/50/1
Fő folt Rf=0,12, kis szennyezéssel Rf=0,24-nél.
Tisztaság 90+%. Nincs kimutatható (<1 %) kumarin (Rf=0,90), metil-o-kumarát (Rf=0,91) vagy o-kumarinsav (Rf=0,80). A főtermék együtt kromatográfálódik az autentikus CouGN-nel, amelyet a 2-hidroxicinnamoil-O-D-glükopiranozid katalitikus oxidációjával állítunk elő.
GUS hidrolízis mg CouGN-t oldunk 1 ml 50 mmol/1-es nátrium-foszfát-pufferben (pH=7,0), majd GUS-szal inkubáljuk (1000 egység Sigma Type G5897) 12 óra hosszat 37 °C-on. Vékonyréteg kromatográfiával 93,4 %-os konverzió mutatható ki egy olyan vegyületté, amely együtt kromatográfálódik az o-kumarinsawal. Az o-kumarinsav lassan (nem enzimatikusan) kumarinná alakul néhány nap alatt.
2. példa
A citokinin-glükuronidokat a β-glükuronidáz hidrolizálja, módosítatlan citokininek felszabadulása közben
Vizsgálati módszert fejlesztettünk ki azoknak a citokinineknek az azonosítására, amelyek az Escherichia coli-ból származó B-glükuronidázzal hidrolizálhatók. [A B-glükuronidáz enzim különböző tulajdonságait többek között az alábbi cikkekben ismertetik: Blanco & Nemoz, Biochimie, 69, 157-161 (1987), Jefferson et al., Proceedings of the
National Academy of Sciences, USA, 83., 8447-8451 (1986) , Lewy & Marsh, Adván. Carbohydrate Chem., 14, 381-428;
721 671 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalom).
A vizsgálandó vegyületet 50 mmol/l-es nátrium-foszfát-pufferben (pH=7,0) inkubáljuk (általában 500 /jg vegyületet 500 gl pufferben) B-glükuronidázzal (általában Sigma Type G7986, 2500 Sigma Fishman egység) 12-24 óra hosszat 37 °C-on. A hidrolízistermékek jelenlétét azután HPLC-vel vagy vékonyréteg kromatográfiával határozzuk meg.
Az alábbi táblázatban az előzőkben ismertetett vizsgálati módszer eredményei láthatók számos citokinin-B-D-glükuronidon és egy citokinin-B-D-glükuronamidon.
1. táblázat
Citokinin-B-D-glükuronidok (és egy citokinin-B-D-glükuronamid) mint az Escherichia coli-ból származó B-glükuronidáz szubsztrátjai
Hidrolízis Vegyület
+ BA3GN-nátriumsó
- BA3GNamid
- BA9GN-nátriumsó
+ ZOGN-nátriumsó
+ IP3GN-nátriumsó
+ IP2SGN-nátriumsó
+ IP8SGN-nátriumsó
Mivel az Escherichia coli-ból származó GUS vizsgálatához transzgenikus szervezetekben kizárólag az O-glükuronidokat használtuk, és mivel korábban már leírták [Jefferson,
- 77 The GUS reporter gene system, Natúré, 342, 837-838 (1989)], hogy a B-glükuronidáz szubsztrátjai a D-glükuronsavak, amelyek egy β-Ο-glikozidos kötésen keresztül kapcsolódnak egy aglikonhoz, meglepő volt, hogy bizonyos N-glükuronidok és S-glükuronidok szintén jó szubsztrátjai ennek az enzimnek. Ennélfogva az a feltételezésünk, hogy az ilyen Nés S-glükuronid vegyületek használhatók az Escherichia coliból és növényekből származó B-glükuronidáz enzim vizsgálatánál, hasonlóképpen a későbbiekben ismertetendő X-glük vizsgálathoz .
A GB-2 1197 635-A számú szabadalmi leírásban közlik, hogy a β-glükuronidáz rendszer és új szubsztrátok alkalmazásával a GUS aktivitás alapján pozitív és negatív szelekció a lehetséges. Ezt a feltételezést azonban soha nem vizsgálták, és az ilyen vegyületek enzimatikus hidrolízise soha nem bizonyult valószínűnek, még az elméleti megfontolások alapján sem, figyelembe véve az Escherichia coli-ból származó B-glükuronidáz szubsztrátjainak kémiai jellemzőit. Amint az alábbiakban igazoljuk, nem mindegyik glükuronid szubsztrátja az Escherichia coli-ból származó B-glükuronidáz enzimnek, és várható, hogy a legtöbb glükuronid szubsztrátja a GUS enz imnek.
Az Escherichia coli β-glükuronidáz génjét expreszszáló növényi szövetek válaszát használjuk olyan módszerként, amellyel kiértékelhető, hogy vajon bizonyos glükuronidok (beleértve a növényi hormon prekurzorokat) hidrolizálhatók-e az enzimmel in vivő [Jefferson, The GUS gene fusion system as a versatile tool fór agricultural molecular • *
biology”, Absztrakt, International Congress on Génétic Manipulation in Plánt Breeding, Esinore, Dánia, 1988. szeptember 11-16]. Ez a megközelítés sajnos nem alkalmazható, mivel a növényi szövetekben erős endogén B-glükuronidáz aktivitás található [lásd például az alábbi, 3. példát, valamint Hodal et al., Detection, expression and specific elimination of endogenous B-glucuronidase activity in transgenic and non-transgenic plants, Plánt Science; megjelenés előtt]. Ennek az endogén B-glükuronidáz aktivitásnak a megjelenése azt is jelenti, hogy a Jeffersen által közölt eljárással lehetetlen meghatározni, hogy a glükuronid által okozott hatások a vegyület hidrolízisének következményei, vagy megmagyarázhatók azzal a ténnyel, hogy a glükuronid maga is aktív. Ahhoz, hogy a szelekciós folyamatban alkalmazható legyen, a vegyületnek a GUS enzimmel kell aktiválhatónak lennie, és a glükuronid formának nem szabad jelentős aktivitással rendelkeznie.
Az előzőkben ismertetett vizsgáló módszer használható olyan citokinin glükuronidok átvizsgálására, amelyeket az adott B-glükuronidáz enzim képes hidrolizálni, ilyen például a mi esetünkben például az Escherichia coli-ból származó B-glükuronidáz enzim.
Azt is meghatároztuk HPLC és vékonyréteg kromatográfia alkalmazásával, hogy a módosítatlan aktív citokininek a GUS hidrolízis termékei (lásd a fenti példákat, amelyek az új citokinin-glükuronid vegyületek készítésére és analizálására vonatkoznak). Tehát például azt találtuk, hogy a BA3GN-nátriumsó hidrolízise Escherichia coli B-glükuronidázzal a
BA3GN-nátriumsó lényegében teljes (>99%) eltávolítását jelenti, egy olyan vegyület keletkezése közben, amely autentikus BA-val képzett 1:1 arányú keverékben együtt kromatograf álódik az autentikus BA-val. Hasonlóképpen, ha a ZOGN nátriumsót Escherichia coli B-glükuronidázzal inkubáljuk, akkor HPLC-vel igazolható (50 %-os izokratikus metanol), hogy majdnem teljesen transz-zeatinná alakul át; az IP8SGN-nátriumsó B-glükuronidázzal való 24-órás inkubálása után vékonyréteg kromatografiával (1:1 metanol/kloroform) igazolható, hogy az IP8SGN majdnem teljesen (>95%) egy olyan vegyületté alakul át, amely együtt kromatografálódik a 8tio-(2-izopentenil)-adeninnel.
Hasonlóképpen, más típusú glükuronidokat is vizsgálhatunk abból a szempontból, hogy egy adott β-glükuronidázzal hidrolizálhatók-e. Például, az o-kumaril-B-D-glükuronidot (5 mg 1 ml pufferben) 12 óra hosszat B-glükuronidázzal (Sigma Type G5897, 1000 egység) inkubálva vékonyréteg kromatográfiával igazolható, hogy a kiindulási anyag 94,3 %-ban egy olyan vegyületté alakult, amely együtt kromatografálódik az o-kumarinsawal. Más, az 1. táblázatban felsorolt vegyületeket inkubálva (annak a két vegyületnek a kivételével, amelyek nem voltak az Escherichia coli B-glükuronidáz szubsztrátjai) hasonló eredményeket kaptunk, azaz olyan hidrolízis termékeket eredményeztek, amelyek azoknak felelnek meg, amelyeket a B-glükuronidázzal végzett hidrolízis után várunk (lásd az előző példákat, amelyek a különböző glükuronid vegyületekre vonatkoznak). Másrészről, a BA9GN, amely, mint az az 1. táblázatból kiderül, nem szubsztrátja az
Escherichia coli β-glükuronidáznak, és amelyből nem keletkezik kimutatható mennyiségű (<1%) BA, ha 18 óra hosszat 37 °C-on β-glükuronidázzal inkubáljuk, nem indukál hajtásképződést dohánylevél korongokból (2. táblázat, a későbbiekben) .
3. példa
Hajtásképződés indukciója kívülről bevitt B-glükuronidáz génnel vagy anélkül, citokinin-glükuronidokkal
Kísérleteket végeztünk annak meghatározására, hogy a citokinin-glükuronidok (valamint a citokinin-glükuronamidok) képesek-e in vivő hajtást indukálni növényi anyagban, kívülről bevitt β-glükuronidáz génnel, illetve anélkül.
Egy GUS-negatív és egy GUS-pozitív dohánynövényből (Nicotiana tabacum 'Wisconsin 38') származó magvakat csíráztatunk MSO táptalajon [Murashige & Skoog szubsztrát hormonok nélkül; Murashige & Skoog, Physiol. Plánt., 15, 473-497 (1962); Sigma, USA]. A GUS-pozitív növényi anyag egy kívülről bevitt Escherichia coli β-glükuronidáz gént tartalmaz (uidA), amelyet karfiol-mozaikvírusból származó 35S promoter hajt meg [Jefferson et al., The EMBO Journal, 6(13), 3901-3907 (1987)]. Az eredeti transzgenikus GUS-pozitív növényeket a hagyományos kanamicin alapú negatív szelekciós rendszerrel [Burow et al., Plánt Molecular Biology Reporter, 8(2), 124-139 (1990)] állítottuk elő. A GUS pozitív palántákat az X-glük vizsgálattal azonosítottuk, amint azt a későbbiekben, ebben a példában leírjuk.
4-5 hét elteltével a növények vagy hajtások felső részét új MSO szubsztrátra vittük át, és ezt az eljárást szükség esetén megismételtük. Ilymódon a növényi anyagot (mind a GUS-pozitív, mind a GUS-negatív) steril hajtástenyészet formájában tartottuk fenn [Burow et al., Plánt Molecular Biology Reporter, 8(2), 124-139 (1990)]. A korongokat a legnagyobb levelekből vágtuk ki (3-5 hetesek), és az alábbiakban ismertetendő (2. táblázat) szubsztrátokra vittük át. A használt alaptáptalaj az MSO volt, a különböző vizsgált vegyületeket különböző koncentrációkban adtuk hozzá, egészen 250 gmol/l-ig. Kis Petri-csészéket (átmérő = 5 cm) használtunk, amelyek körülbelül 6 ml szubsztrátot tartalmaztak, ezekre 3-3 levélkorongot tettünk. Mindegyik kezelést legalább négyszer megismételtük.
Azt találtuk, hogy számos citokinin-glükuronid indukál hajtásképződést β-glükuronidáz enzimet tartalmazó növényi szövetekben. Az eredmények az alábbi táblázatban láthatók:
2. táblázat
Citokinin-B-D-glükuronidok (és egy citokinin-glükuronamid) által indukált hajtásképződés dohány levélkorongokon GUS+ (azaz bevitt β-glükuronidáz gént tartalmazó) vagy GUS- (azaz bevitt β-glükuronidáz gént nem tartalmazó) dohánylevél korongokon
-··♦
GUS- GUS+ Vegyület
- - Semmi (kontroll kezelés)
+ + BA (kontroll kezelés)
+ + Zeatin (kontroll kezelés)
— - Glükuronsav (kontroll kezelés)
+ + BA3GN nátriumsó
+ + BA3GNamid
- - BA9GN nátriumsó
+ + ZOGN nátriumsó
+ + IP3GN nátriumsó
+ + IP2SGN nátriumsó
+ + IP8SGN nátriumsó
+ jelentése hajtásképződés 250 gmol/l koncentráció alatt jelentése az, hogy nincs hajtásképződés 250 Mmol/l koncentráció alatt (a 250 μιηοΐ/ΐ megfelel körülbelül 100 mg/ml-nek.
A fenti táblázatból látható, hogy mindegyik citokinin-glükuronid, amelyik hajtásképződést indukál 250 μπιοί/ΐ koncentrációban, vagy az alatt, olyan dohánylevél korongokban, amelyek tartalmaznak kívülről bevitt β-glükuronidáz gént, képes hajtásképződést indukálni hasonló koncentrációban olyan levélkorongokban, amelyek nem tartalmaznak kívülről bevitt β-glükuronidáz gént. Másrészt a BA9GN citoki83
• tf w • «0 • tf ··· • •tf • • ·· • 1* · ·♦* tf
··· ·· ··· • « • tf
nin glükuronid, amelyről kimutattuk, hogy nem szubsztrátja az Escherichia coli β-glükuronidáz enzimnek (lásd 2. példa), nem eredményez hajtásképződést levélkorongokban sem a kívülről bevitt β-glükuronidáz gén jelenlétében, sem anélkül. A BA3GNamid citokinin-glükuronamid azonban, amely a 2. példában látható eredmények szerint nem szubsztrátja az Escherichia coli β-glükuronidáz enzimnek, megfigyeléseink szerint hajtásképződést indukál mind GUS-pozitív mind GÜSnegatív levélkorongokban, jelezve, hogy a citokinin-glükuronamidok a megfelelő citokinin-glükuronsawá alakulnak a növényi szövetben. Tehát úgy tűnik, hogy a citokinin glükuronidok prekurzorai in vivő ugyanúgy tudnak működni, mint a citokinin glükuronidok maguk.
Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a magasabbrendű növények, ebben az esetben a dohány, endogén β-glükuronidáz aktivitással rendelkezik. Ez a megfigyelés összhangban van azzal, amit újabban Hu és munkatársai közöltek [Plánt Cell Reports, 9, 1-5 (1990)], akik a GUS-szerű aktivitás előfordulását vizsgálták 52 növényfajban, valamint Hodal és munkatársai megfigyeléseivel, (Plánt Science, megjelenés előtt). Hu és munkatársai azt találták, hogy a pozitív GUSszerű aktivitást expresszáló fajták a zárvatermők minden kulcs-csoportjában megtalálhatók, valamint néhány zárvatermőben is. (Hu és munkatársai nem tudtak GUS aktivitást kimutatni dohányban, ez az eredmény azzal magyarázható, hogy vizsgálataikat in vitro, pH=7 értéknél végezték. Amint azt az alábbiakban bemutatjuk, a dohányban található természetes GUS aktivitásért felelős enzim nem aktív pH=7 értéknél, vi
szont aktív pH=4-5 értéknél.)
Ezek a megfigyelések ellentétben vannak a
GB—2—197 643-A szabadalmi bejelentésben leírtakkal, amelyben azt állítják, hogy a magasabbrendű növények, beleértve a dohányt is, nem tartalmaznak kimutatható B-glükuronidáz aktivitást. A GB-2 197 643-A számú szabadalmi leírás szerint, amely egyebek között egy olyan módszert ismertet, amellyel egy számunkra érdekes gén expresszióját lehet követni a GUS gén segítségével, a GUS aktivitás jelenléte a fontos gén expresszióját jelzi, és ebből az is következik, hogy mivel GUS aktivitás nem található a magasabbrendű növényekben, viszonylag jó módszer, ha a számunkra érdekes gén expresszióját a GUS génnel követjük. A fenti eredmények azonban azt mutatják, hogy nem ez a helyzet, és a GUS gén használata egy számunkra érdekes gén jelenlétének követésére egyáltalán nem egyszerű, közvetlen dolog, annak a ténynek a következtében, hogy a magasabbrendű növények jelentős menynyiségű belső (háttér) β-glükuronidáz aktivitással rendelkeznek.
Abból a célból, hogy a megfigyelt GUS aktivitás természetét vizsgáljuk növényi anyagban, amely vagy tartalmaz kívülről bevitt β-glükuronidáz gént, vagy nem, a GUS aktivitás pH-függését standard hisztokémmiai módszerrel határozzuk meg, X-glük (5-bróm-4-klór-3-indolil-B-glükuronid) alkalmazásával .
Az X-glük vizsgálatot úgy végezhetjük el, hogy először egy vizsgáló közeget készítünk, 50 mg X-glük-öt oldva egy oldatban, melynek összetétele: 25 ml NaPC>4 puffer, tipi kusan pH=7,0, 24 ml desztillált víz, 0,25 ml 0,1 mol/1 K3(Fe(CN)6), 0,25 ml 0,1 K4 (Fe(CN) 6) és 0,5 ml 1 mol/1 Na2EDTA, majd addig kevertetjük, ameddig feloldódik (körülbelül 30 perc). Frissen vágott, vagy formaldehiddel rögzített szekciókat (0,5 mm-nél vékonyabbak), vagy szöveteket 37 °C-on inkubálunk az X-glük közegben, néhány perctől 24 óráig terjedő ideig. Inkubálás után a szekciókat nátriumfoszfát pufferrel vagy vízzel öblítjük, majd mikroszkóppal vizsgáljuk. A GUS aktivitást a kezelt növényi anyag kék festődéseként látjuk az enzimaktivitás helyén [Jefferson, Plánt Molecular Biology Reporter, 5(4), 387-405 (1987)]. A találmány szempontjából általában a húszórás vizsgálati idő az alkalmas. Inkubálás után a korongokat 96 %-os etanollal kezeljük a klorofill eltávolítására.
Az eredményeket az alábbi táblázatban mutatjuk be:
3. táblázat
A GUS-aktivitás pH függése dohánylevél korongokban, kívülről bevitt GUS génekkel (+) vagy anélkül (-)
PH 3 4 5 6 7 8
GUS(-) 0 + + 0 0 0
GUS(+) 0 + + + + +
0: nincs reakció az X-glük vizsgálatban +: kék reakció az X-glük vizsgálatban
Látható, hogy az az enzim, amely a kívülről bevitt β-glükuronidáz gént nem tartalmazó dohánylevél korongokban a háttér β-glükuronidáz aktivitásért felelős, csak egy keskeny pH-tartományban aktív, amely megfelel a növények belső pHjának (körülbelül pH=5), míg a bevitt gén által expresszált β-glükuronidáz széles pH-tartományban (4-8) aktív. Ez a pHfüggés lehet a magyarázat arra, hogy a korábbi próbálkozások a növényekben levő GUS aktivitás kimutatására miért voltak sikertelenek, és vezettek ahhoz a rossz következtetéshez (például a GB-2 197 653 sz. szabadalmi leírásban), hogy a növények nem tartalmaznak belső GUS aktivitást.
Azt a tényt, hogy a fentiekben igazolt β-glükuronidáz aktivitás olyan növényi anyag esetében, amely nem tartalmaz kívülről bevitt GUS gént, valójában a citokinin-glükuronid szubsztrát β-glükuronidázzal való hidrolízisének következménye, és nem egy aspecifikus, a szubsztrátot hasító reakció eredménye (például a glükuronidok nem enzimatikus savas hidrolízise, a glükuronidokról ugyanis ismert, hogy alacsony pH-értéken elhasadnak), úgy igazoltuk, hogy különböző enzimek inhibitorainak hatását vizsgáltuk pH=5 értéknél, genetikailag nem transzformált növények esetében (azaz olyan növényeknél, amelyek csak natív GUS aktivitással rendelkeznek) . A vizsgálatot az előzőkben ismertetett X-glük módszerrel hajtottuk végre pH=5 érték mellett, 20 óra alatt.
4. táblázat
Inhibitorok vizsgálata pH=5 mellett. Nem-transzformait anyag
Koncentráció (mmol/1)
0 0,1 1 10 50
Szacharo-1,4-lakton + + 0 0 0
Glükonolakton + + + 4- +
UDP-glükuronid + + + + +
Glükuronsav + + + + +
Galaktóz + + + + +
Metil-umbelliferil-glükuronid + + + 4- 0
EDTA + + + + +
= nincs reakció, azaz teljesen fehér levélkorong + = kék festődés X-glük-kel
A hat vizsgált inhibitor a következő hatásokkal rendelkezik:
A szacharo-1,4-lakton egy olyan inhibitor, amely a β-glükuronidáz enzimekre specifikus (másszóval, csak a βglükuronidázokat, éspedig mindegyik β-glükuronidázt gátolja) . Általánosan elfogadott, hogy az ezzel a vegyülettel gátolható GUS aktivitás β-glükuronidáz enzimtől származik.
A glükonolakton a β-glükozidázok inhibitora. Megfelel a szacharo-1,4-laktonnak, azzal a különbséggel, hogy a β-glükozidázokra specifikus.
Az UDP-glükuronid az UDP-glükuronid-transzferáz enzimre specifikus.
Glükuronsav a terméke mindegyik β-glükuronidáz reakciónak, és ennélfogva egy termék-inhibitora a β-glükuronidá zoknak és egyéb, glükuronsav-képző enzimeknek.
A galaktóz az UDP-gltikuronid-transzferáz dependens reakciók inhibitora.
A metil-umbelliferil-glükuronid az eddig vizsgált összes β-glükuronidáz szubsztrátja, és így a GUS enzimek kompetitív inhibitora.
Úgy találtuk, hogy az EDTA-nak (amely gátolja az UDP-glükuronid-transzferázokat) nincs hatása, ezért valószínűtlen, hogy az ilyen transzferázok szerepet játszanak a megfigyelt GUS aktivitásban. Az előző táblázat azt mutatja, hogy azoknak a vegyületeknek, amelyeknek gátolniuk kellene egy transzferáz enzimet, nagyon magas koncentrációban nincs hatásuk. Az is látható továbbá, hogy a glükonolaktónnak nincs gátló hatása, és ennélfogva valószínűtlen, hogy a GUS aktivitás a β-glükozidáz aktivitáshoz kapcsolódik.
Az is látható továbbá, hogy a GUS specifikus inhibitor, a szacharo-l,4-lakton egy erős inhibitor, a glükuronsav (a β-glükuronidáz termék-gátlása) egy közepes erősségű inhibitor, és a metil-umbelliferil-glükuronid (gyenge inhibitor, (amely egy GUS szubsztrát, és ennélfogva kompetitív szubsztrátja az X-glük-nek, ha az X-glük hidrolíziséért egy β-glükuronidáz enzim felelős). A dohányban megfigyelt GUS aktivitás tehát minden szükséges feltételnek megfelel, és ezért mondhatjuk, hogy egy β-glükuronidáz enzimtől származik. Tehát le lehet vonni azt a következtetést, hogy a növények egy β-glükuronidáz enzimet tartalmaznak.
Egy hasonló kísérletsorozatot végeztünk annak eldöntésére, hogy az inhibitorok hatása elég gyors-e ahhoz, hogy az enzimet gátolják. Ebben a sorozatban a növényi anyagot a vizsgált vegyülettel 24 óra hosszat előinkubáljuk (inhibitorok), mielőtt az X-glük vizsgálatot elvégezzük ugyanazzal a vizsgált vegyülettel. A kapott eredmények azonosak azokkal, amelyeket az előinkubálás nélkül kaptunk, ami azt mutatja, hogy az inhibitorok elég gyorsan behatolnak a növényi szövetbe ahhoz, hogy gátolják az X-glük vizsgálatot, mielőtt a kék festődés megtörténik.
A fentiekben ismertetett eredményekhez hasonló eredményeket kaptunk más vizsgálatokkal, amelyek a GUS aktivitás előfordulását elemezték növényekben. Ebben az esetben a hisztológiai GUS reakció pH-függését számos növényfajban elemeztük 3 és 8 közötti pH értéktartományban, a GUS-specifikus inhibitor, a szacharo-1,4-lakton jelenlétében és anélkül is.
A használt vizsgálati módszer az előzőekben ismertetett X-glük módszer. A vizsgálatot 37 °C-on végezzük 20 óra hosszat. A leveleket darabokra vágjuk (steril borotvapengével) , így mindegyik levelet számos különböző pH-értéken lehet vizsgálni.
Amint az alábbi táblázatból látható, ez a vizsgálat megerősíti, hogy a növények valóban rendelkeznek természetes GUS aktivitással, ez az aktivitás egy enzimatikus reakció eredménye (nincs reakció a GUS-specifikus inhibitor jelenlétében) , és az enzim elsődlegesen pH=4-5 között aktív.
5. táblázat
Hisztológiai GUS reakció különböző pH-értékeknél
pH a vizsgálat során Szacharo-1,4-lakton (mmol/1) 3 0 4 0 5 0 6 0 7 0 8 0 3-8 10
Növénytan
Cukorrépa, vad típus + + + + (+) 0 0
Cukorrépa, transzgenikus 1) + + + + + + (+)
Cukorrépa, transzgenikus 2) + + + + (+) 0 0
Búza 0 + + + 0 0 0
Búza, albínó 0 + + + 0 0 0
Olajrepce mag + + + (+) (+) 0 0
Dohány 0 + + 0 0 0 0
Dohány, transzgenikus 1) 0 + + + + + 0
Dohány, transzgenikus 2) 0 + + 0 0 0 0
Fenyő 4) 0 + + 0 0 0 0
Rebarbara 3) n n + + + + 0
Borsó 3) 0 + + 0 0 0 0
Madársóska 3) n n n n (+) n 0
Chenopodium n n n 0 + n n
1) Az Escherichia coli GUS génjét expresszáló levélszövet
2) Transzgenikus levélszövet, amely csak kanamicin rezisztencia gént (NPT) tartalmaz, kívülről bevitt GUS gént nem
3) Levélnyél vagy őssejt szövet
4) Embriogén kallusz-szövet + Kék reakció (+) A GUS aktivitás kis gyakorisága (világoskék reakció)
Nincs reakció n Nincs meghatározva
Az a tény, hogy a növények általában rendelkeznek saját GUS aktivitással, lehetővé teszi, hogy a glükuronid-permeázt kódoló gént használjuk pozitív szelekciós génként, anélkül, hogy bármi más szelekciós gént használnánk, kihasználva azt, hogy a transzformált sejtek sokkal jobban vesznek fel egy glükuronid vegyületet. Kiderült például, hogy a glükuronidok nem könnyen jutnak be a növényi sejtbe a plazmamembránon keresztül. Ha egy glükuronid-permeáz gént juttatunk be egy sejtbe, akkor azonban a glükuronidok sokkal könnyebben át tudnak hatolni a plazma-membránon és belépnek a sejtekbe. A glükuronidok azután hasíthatok a transzformált sejtekben levő GUS enzimekkel. Ezzel szemben a kérdéses glükuronid nem hozzáférhető a nem-transzformált sejtek számára, és ezzel pozitív szelekciós hatás érhető el. Hasonlóképpen, pozitív szelekció elérhető más permeázok és más típusú vegyületek alkalmazásával, amelyek vagy aktiválódnak a transzformált sejtekben egy belső enzim révén, vagy amelyek egyéb módon fejtik ki biológiai hatásukat a transzformált sejtekben, amelyekbe bejutottak.
4. példa
A citokinin-glükuronidok stabilak és inaktívak
A BA3GN-nátriumsó citokinin glükuronid hatása blokkolódik, ha az ezt a citokinin glükuronidot tartalmazó növényi szövetben a GUS aktivitást gátoljuk. Más szóval, a citokinin-glükuronid önmagában inaktív. Emellett, a citokinin glükuronidról igazolták, hogy a szaporító táptalajban stabil, és stabil a növényi szövetben is, ha B-glükuronidáz enzim nincs jelen, amit az a tény is mutat, hogy a specifikus GUS inhibitor, a szacharo-l,4-lakton (SL), erősen gátolja a BA3GN-nátriumsó citokinin glükuronid által indukált, de csak gyengén gátolja a szabad citokinin, a BA által indukált hajtásképződést (a 3. példában ismertetett alapmódszer alkalmazásával):
6. táblázat
A BA (0,5 mg/1) és a BA3GN nátriumsó (15 mg/1) által indukált hajtásképződés gátlása szacharo-1,4-laktonnal (SL)
Kezelés A levélkorongonként regenerált hajtások száma és relatív száma
SL (mmol/1) BA BA3GN-nátriumsó
4,3 100 % 5,6 100 %
3,6 84 % 1,4 25 %
A fenti táblázat eredményeit a 2. táblázat eredményeivel összehasonlítva látható, hogy a BA3GN-nátriumsó, amely hajtásképződést indukál mind a GUS-pozitív, mind a GUS-negatív dohány levélkorongokban, nem indukál hajtásképződést a megfelelő levélkorongokban a B-glükuronidáz specifikus inhibitor szacharo-1,4-lakton jelenlétében.
A szacharo-1,4-lakton (SL) nem egy stabil vegyület az ebben a példában alkalmazott pH-η. Egyensúly áll fenn az SL és a szacharinsav (SA) között. Ezt az egyensúlyt csak lassan lehet elérni, és az SL SA-vá való konverzióját a pH esése kíséri. A pH-t ezért számos alkalommal állítani kell egy egyhetes periódus során, mielőtt az SL-t használjuk, ameddig a pH stabilizálódik az SL-t tartalmazó szubsztrátban.
Az a tény, hogy a citokinin glükuronidok stabilak és inaktívak, ha nincs mellettük jelen β-glükuronidáz, az a tény is igazolja, hogy a BA9GN, amely nem hidrolizálható a B-glükuronidázzal, nem képes hajtásképződést indukálni β-glükuronidáz aktivitással rendelkező növényi anyagban (lásd 2. és 3. példa).
Fontos, hogy a citokinin glükuronid vegyületek inaktívak és stabilak olyan szubsztrátokban, amelyek nem tartalmaznak β-glükuronidáz enzimet, mivel ez a stabilitás az előfeltétele az őket alkalmazó pozitív szelekciós rendszer megfelelő működésének.
Azonban nem mindegyik glükuronsav származéktól várható el, hogy stabil legyen. Például a glükuronid-észterek nem stabilak olyan növényi szövetekben, amelyek aspecifikus észterázokat tartalmaznak. Ez azt jelenti, hogy a találmány szerint készített és használt citokinin-glükuronid vegyületek (β-D-glükuronidok az aglikonhoz kapcsolva a glikozidos 0, S és N atomokon keresztül) kielégítik a stabilitás körülményeit. Másrészről, a más típusú glükuronid kötéseket tartalmazó vegyületek, azaz például az amidok vagy az észter-βD-glükuronidok nem várható, hogy szelektíven hidrolizálódjanak a β-glükuronidázok hatására, a növényekben található aspecifikus észterázok és amidázok következtében.
Az előző, 3. példában tehát igazoltuk, hogy a vizsgált citokinin glükuronidok, amelyek, mint ebből a példából látható, önmagukban nem rendelkeznek citokinin aktivitással, in vivő elhasadnak a β-glükuronidáz hatására, amely lehet endogén, háttér β-glükuronidáz, vagy kívülről bevitt B-glükuronidáz gén, és ezáltal szabad citokinin keletkezik.
5. példa
Hajtásképződés indukálása kívülről bevitt βglükuronidáz gént tartalmazó növényi szövetből, szteringlükuronidok alkalmazásával
Más glükuronidokról, beleértve a szterin-, glicirrizinsav- és hidroxikinolin-glükuronidokat, igazoltuk, hogy hidrolizálhatók β-glükuronidáz enzimmel, és ennek eredménye hajtásképződés módosított szubsztrátokon, amelyekben a hidrolízis termékei lényegesek a hajtásképződéshez. Ezt az 5. és 6. példában mutatjuk be.
Kísérleteket végeztünk két szterin-glükuronid, a βszitoszteril-B-D-glükuronid (SG) és a koleszteril-B-D-glükuronid (CG) hajtás-indukáló hatásának meghatározására, ha a szterin-szintézis gátolva van a szövetekben. Az alkalmazott alapmódszer lényegében megfelel az előző, 3. példában leírtnak. Amellett azonban, hogy egyet, vagy mindkét említett szterin-glükuronidot hozzáadtuk, a szubsztrát 0,1 mmol/1 tridemorf-ot és 5 mg/1 BA3GN-nátriumsót tartalmaz. A hajtások számát 30 nap elteltével határozzuk meg.
A tridemorf (4-tridecil-2,6-dimetil-morfolin) egy fungicid, amely gátolja a szterinok és hasonló vegyületek szintézisét. A tridemorfnak gátló hatása van a hajtások regenerálódására (jóllehet nem végzetes a kivágott növénydarabokra) , ha a növényi szövetet nem látjuk el szterinekkel.
Tehát szabad szterinek távollétében a hajtásképződés hatásosan megelőzhető.
A CG-t a Sigma-tól (USA) vásároltuk, a CG-t az Ando és munkatársai által közölt módszerrel szintetizáltuk [J. Antibiotics, 73, 408 (1970)].
A kapott eredményeket az alábbi táblázatban mutatjuk be:
7. táblázat
Regenerált hajtások dohány levélkorongonként 0,1 mmol/1 tridemorffal és 5 mmol/1 BA3GN-nátriumsóval kiegészített szubsztrátokon
Vegyület Koncentráció mg/1
Szitoszteril-B-D-glükuronid 0 0 12,5 12,5
Koleszteril-B-D-glükuronid 0 50 0 50
Hajtás per levélkorong 0,3 0,3 2,8 4,0
A fenti táblázat adatai azt mutatják, hogy a szitoszteril-B-D-glükuronid képes leküzdeni a tridemorf gátló hatását, és a szitoszteril-fi-D-glükuronid és a koleszterilβ-D-glükuronid kombinációja eredményezi a legjobb hajtásképződést. Tehát a találmány szerinti pozitív szelekció, bevitt β-glükuronidáz gén alkalmazásával, lehetséges, ha az előzőkben említett szterin-glükuronid vegyületeket együtt alkalmazzuk egy hajtás-gátló vegyülettel, például tridemorffal. Ezek az eredmények azt mutatják, hogy más szterinek és szte• · *· ·
- 96 rinszerű vegyületek is használhatók a pozitív szelekciós eljárásban, ha olyan szövetre alkalmazzuk, amely kívülről bevitt β-glükuronidáz gént tartalmaz.
Ezeknek a nagyon gyengén oldódó vegyületeknek a használatakor a pozitív szelekció előnye, hogy hatásuk feltehetőleg lokális, mivel a vegyületek nem diffundálódnak sejtről sejtre, ha a hidrofil glükuronid egység egy β-glükuronidáz enzim révén lehasad. Más szóval, ezek a vegyületek használhatók a kereszttáplálás megelőzésére a szelekciós eljárás során.
Ezek a kísérletek azt is mutatják, hogy a tridemorf, valamint egyéb, a szterin-szintézist gátló vegyületek hajtás-gátló hatását ki lehet védeni, ha szterineket és szterinszármazékokat adunk a szubsztráthoz, és így egy olyan szelekciós rendszer hozható létre, amely azon alapul, hogy a transzgenikus sejteket szterinekkel és szterinszerű vegyületekkel látjuk el, és az előzőkben leírt előnyökkel rendelkezik.
6. példa
Hajtás-képződés indukciója szitoszteril-B-D-glükuronid felhasználásával olyan növényi szövetekből, amelyek vagy tartalmaznak, vagy nem tartalmaznak kívülről bevitt &-glükuronidáz gént
Az 5. példában leírthoz hasonló kísérletet hajtunk végre mind transzformált, mind nem transzformált dohánylevél szöveteken, szitoszteril-B-D-glükuronidot, illetve vagy BA vagy BA3GN-nátriumsót alkalmazva.
A használt módszerek lényegében azok, amelyeket az
5. példában ismertettünk. Ebben a kísérletben a tridemorfot 0,1 mmol/1 koncentrációban adjuk a szubsztráthoz, a szitoszteril-B-D-glükuronidot pedig 121 mg/1 koncentrációban. A szubsztrát emellett vagy 1,88 mg/1 BA3GN-nátriumsót, vagy 0,1 mg/1 BA-t tartalmaz. A hajtások számát 40 nap elteltével regisztráljuk.
A kapott hajtások száma az alábbi:
Regenerált hajtások levélkorongonként
BA BA3GN-nátriumsó
Vegyület gus+ gus- gus+ gusSzitoszteril-B-D-glükuronid 2,4 1,9 2,4 0,1
Látható, hogy csakúgy, mint az előző, 5. példában, a szitoszteril-B-D-glükuronid jelenléte képes kivédeni a tridemorf hajtásgátló hatását. Emellett, ha szitoszteril-B-D-glükuronidot és tridemorfot együtt alkalmazunk a BA3GN-nátriumsóval, akkor szelektív hajtásképződést kapunk a GUS-pozitív levélkorongokban, míg a GUS-negatív levélkorongok a BA3GN-nátriumsót tartalmazó szubsztráton lényegében nem növesztenek hajtásokat.
Ezek az eredmények azt is mutatják, hogy a különböző glükuronidok kombinációjának alkalmazása (itt a BA3GN és SG, a BA és SG helyett) javíthatja a transzgenikus szövetek szelektív válaszát.
- 98 Mivel a szterinek és szteroidok az állati sejtekben is fontos növekedés-szabályozó szerepet játszanak, a megfelelő szelekciós eljárások használhatók olyan állati sejtek szelektálására, amelyek β-glükuronidázt expresszálnak.
7. példa
Az ártalmatlanított Agrobacterium törzsek citokinineket termelnek
Úgy találtuk, hogy bizonyos Agrobacterium törzsek hajtásképződést indukálnak hajtás-indukáló hatású anyagoknak az együtt-tenyésztés során való termelése révén. Az ilyen törzseket általában el kell kerülni, ha a citokinin glükuronidok GUS hidrolízisét kell használni a genetikailag transzformált sejtek szelektálására, mivel ezek a törzsek egyedül is képesek hajtás-képződést indukálni, és így zavarják a szelekciós eljárást.
Az alábbi táblázatban bemutatjuk egy olyan kísérletnek az eredményeit, amelyben két különböző Agrobacterium törzset alkalmaztunk, ezek közül az egyik hajtásképződést indukál dohány levélkorongokon együtt-tenyésztés után.
Az alkalmazott módszerek lényegében azonosak azokkal, amelyeket a 13. példában írunk le, de az együtt-tenyésztés után a levélkorongokat olyan MSO szubsztrátra visszük át, amely nem tartalmaz hormonokat, de tartalmaz 300 mg/1 kefotaximot és 300 mg/1 karbenicillint.
A regenerált hajtások számát az együtt-tenyésztés után négy héttel jegyeztük fel.
* ·
8. táblázat
Hajtásképződés indukciója dohány levélkorongokon hormonmentes szubsztráton, ártalmatlanított Agrobacterium-mal való együtt tenyésztés után
Agrobacterium Hajtások száma
törzs Plazmid Gének a T-DNS-ben levélkorongonként
1. C58X T37 GUS és NPT 9,3
2. LBA4404X PAL4404 GUS és NPT 0
3. C58Y T37 Semmi 4,8
4. LBA4404Y PAL4404 Semmi 0
5. Semmi - - 0
Látható, hogy néhány Agrobacterium törzs hajtás-indukáló tulajdonsága nem függ a T-DNS-en található génektől. Ez azt jelenti, hogy a T-DNS régión kívül található gének a felelősek a hajtás-indukcióért.
Egy, a T-DNS régión kívül található gént, amely a citokinin termelésért felelős, tzs jelzéssel láttak el [Morris, R.O., Ann. Rév. Plánt Physiol., 32, 509-538 (1986)]. A C58 törzs tartalmazza a tzs gént, egy nem-transzferálódó gént, amely a zeatin szintézisét kódolja az együtttenyésztés során. Az LBA4404 törzs nem tartalmazza a tzs gént. Az a tény, hogy a hajtás-indukcióra képes törzsek egy olyan plazmidot tartalmaznak, amely a tzs gént hordozza, azt mutatja, hogy ez a gén lehet felelős az ezekben a kísérletekben megfigyelt hajtás-indukáló tulajdonságokért, és a tzs gént tartalmazó Agrobacterium törzseket el kell kerülni a citokinin-alapú szelekciós rendszerekben. Bármely egyéb
100 * ·· · • · · « « • ·♦ 4 « • · · ·*· ·· ·
Agrobacterium törzset, amely hajtásképződést indukál, általában szintén el kell kerülni.
8. példa
Transzgenikus hajtások pozitív szelekciója a BA3GNnátriumsó citokinin-glükuronid alkalmazásával
Kísérletsorozatot végeztünk, hogy meghatározzuk a pozitív szelekciós rendszer hatékonyságát, a BA3GN-nátriumsó citokinin-glükuronid 7,5 és 15 mg/1 koncentrációban való alkalmazásával. A kísérleteket vad típusú dohánykorongokon végeztük, 2 különböző Agrobacterium törzset, valamint különböző együtt-tenyésztő szubsztrátot használva. A 13. példában ismertetett transzformációs módszert alkalmaztuk, azzal az eltéréssel, hogy az MSO helyett Gamborg B5 szubsztrátot használtunk [Gamborg et al., Exp. Cell Rés., 50, 151-158 (1968); beszerezhető a Sigma-tól, USA]. Az alábbiakban megadott eredmények két független kísérlet átlagából származnak, és ezek közül mindegyiket 27 levélkorongon végeztük kezelésenként.
101
9. táblázat
Genetikailag transzformált hajtások szelekciója a BA3GN-nátriumsó citokinin-glükuronidot alkalmazva
7,5 mg/1 BA3GN-nátriumsó
Agrobacterium Együtt-tenyész- GUS+ hajtások GUS+ hajtások %-a az összes hajtás között
törzsek tő szubsztrát levélkorongonként
BS10 B5 0,1 6,6
BS10 B5+ammónia 0,02 0,7
BS10 B5+ammónia+SL 0,3 6,1
BS10 átlag 0,1 4,4
LDH1 B5 0,2 7,8
LDH1 B5+ammónia 0,2 5,3
LDH1 B5+ammónia+SL 0,2 4,7
LDH1 átlag 0,2 5,9
Mindkettő átlag 0,2 5,1
mg/1 BA3GN~nátriumsó
Agrobacterium törzsek Együtt-tenyésztő szubsztrát GUS+ hajtások levélkorongonként GUS+ hajtások %-a az összes hajtás között
BS10 B5 0,3 6,0
BS10 B5+ammónia 0,4 8,7
BS10 B5+ammónia+SL 0,3 5,5
BS10 átlag 0,3 6,7
LDH1 B5 0,4 9,0
LDH1 B5+ammónia 0,3 7,6
LDH1 B5+ammónia+SL 0,3 7,7
LDH1 átlag 0,3 8,1
Mindkettő átlag 0,3 7,4
- 102 Β5: Gamborg B5 szubsztrát, pH=5,4
Ammónia: Együtt-tenyésztő táptalaj 75 mmol/1 ammónium-nitráttal
SL: Együtt-tenyésztő táptalaj 25 mmol/1 szacharinsav + 25 mmol/1 szacharo-1,4-lakton egy stabilizált oldatból
GUS+: GUS aktivitást expresszáló hajtások, pH=7-en vizsgálva, a 3. példában leírtak alapján
A BS10 törzs egy Agrobacterium-ban inaktív, módosított 35S promoterrel meghajtott GUS gént visz be [Janssen & Gardner, Plánt Molecular Biology, 14, 61-72 (1989)]. Az LDH1 törzse egy módosítatlan 35S promoterrel meghajtott GUS gént visz be.
A 9. táblázatban látható eredmények azt mutatják, hogy a kívülről bevitt β-glükuronidáz gént expresszáló transzgenikus hajtások pozitív szelekciója lehetséges, BA3GN-nátriumsó alkalmazásával. Ezek az eredmények nagyon jelentősek és váratlanok, mivel amint azt a 3. példában leírtuk, a citokinin glükuronidok képesek hajtásképződést indukálni olyan levélkorongokban, amelyek nem tartalmaznak kívülről bevitt β-glükuronidáz gént. Az együtt-tenyésztés során alkalmazott különböző kezeléseknek láthatóan nincs jelentős hatásuk a szelekcióra.
A fentiekben ismertetett eredmények azt is mutatják, hogy egy aktív β-glükuronidáz gént tartalmazó Agrobacterium törzs alkalmazása (az LDH1 expresszálja a GUS aktivitást baktériumokban) nem érinti a transzformációs rendszert, egy olyan törzzsel összehasonlítva, amelynek nincs aktív β-glüF· kuronidáz génje (a BS10 törzs nem expresszál GUS aktivitást baktériumokban)
9. példa
Genetikailag transzformált hajtások szelekciója, a zeatin-O-B-glükuronsav citokinin-glükuronid alkalmazásával
Lényegében a 13. példában ismertetett eljárás alkalmazásával transzgenikus dohánynövényeket készítünk és szelektálunk, a zeatin-O-B-glükuronsav (ZOGN) mint pozitív szelekciós ágens alkalmazásával.
Az együtt-tenyésztést 3 napig végezzük, az oltóanyag sűrűsége 00550=1,5. Az együtt-tenyésztés után használt szubsztrát MSO, amely 300 mg/1 karbenicillint, 300 mg/1 kefotaximot és 0,1 mg/1 indolecetsavat (IAA) tartalmaz. 3 hét elteltével az átoltást ugyanerre a táptalajra végezzük, azzal a különbséggel, hogy ez nem tartalmaz IAA-t. Az ebben a példában használt mindegyik szubsztrát pH-ja 8,0. Az egyes kezelésekhez 18 levélkorongot használunk.
Az együtt-tenyésztés után öt héttel a hajtásokat MSO táptalajra visszük át, amely 200 mg/1 kanamicin-szulfátot, 32 mmol/1 szacharinsavat, 300 mg/1 kefotaximot és 300 mg/1 karbenicillint tartalmaz, pH=8,0. A szacharinsavat, amely a β-glükuronidáz enzimek gátlószere azért adjuk hozzá, hogy leállítsuk a zeatin-glükuronid további zeatinná alakulását. A B-glükuronidáz génnel együtt egy NPT gént is bejuttatunk, amely kanamicin-rezisztenciát biztosít. A nem-transzformált hajtások (negatív kontroll) túlélték az eljárást, de ezeknek a hajtásoknak a növekedése késett ezen a táptalajon, míg az
104 összes transzformált hajtás (pozitív kontroll), amely aktív
NPT gént tartalmaz, szintén túlélte az eljárást, de a növekedésükben semmi késleltetés nem volt.
A hajtások számát meghatároztuk, valamint meghatároztuk a GUS-pozitív hajtások számát az összes hajtás között az X-glük vizsgálati módszer alkalmazásával (3. példa), 3 héttel az utolsó átoltás után (8 héttel az együtt-tenyésztés után). Az eredményeket az alábbiakban mutatjuk be:
10. táblázat
A genetikailag transzformált hajtások pozitív szelekciója ZOGN nátriumsó alkalmazásával
ZOGN mg/1 GUS-pozitív hajtások 1évélkorongonként GUS-pozitív hajtások %-a az összes hajtás között
0,07 0,3 18,5
1,0 2,6 40,3
15,0 0,2 5,1
0,07+SL* 0 0
* SL: 2 mmol/1 szacharo-1,4-lakton
A fenti táblázatban megadott eredmények azt mutatják, hogy a genetikailag transzformált hajtások sikeres pozitív szelekcióját sikerült elérni ZOGN alkalmazásával. A transzgenikus hajtások indukcióját gátoltuk, amikor a 8-glükuronidáz specifikus inhibitor szacharo-1,4-laktont adtuk a szubsztráthoz, ami azt mutatja, hogy a transzgenikus hajtások növekedése, és így a pozitív szelekció sikere függ
- 105 a ZOGN β-glükuronidázzal katalizált konverziójától.
10. példa
Genetikailag transzformált hajtások szelekciója zeatin-O-B-glükuronsavat használva különböző hőmérsékleteken
A citokinin-glükuronidot alkalmazó pozitív szelekciós rendszer hőmérséklet-függését vizsgáljuk zeatin-O-glükuronsav (ZOGN), mint pozitív szelekciós ágens felhasználásával 25 °C-on, 30 °C-on és 35 °C-on.
Transzgenikus dohányhajfásokat készítünk lényegében ugyanazzal az eljárással, mint amelyet az alábbi, 13. példában ismertetünk. Az együtt-tenyésztést 3 napig végezzük, az oltóanyag sűrűsége megfelel 1,5 ODg^Q-nak. Az együtt-tenyésztés után használt szubsztrát MSO, amely 10 mg/1 2-(2-hidroxi-etil-amino)-6-benzil-amino-9-metil-purint (9-met), 350 mg/1 karbenicillint, 350 mg/1 kefotaximot és 0,1 mg/1 indolecetsavat (IAA) tartalmaz, valamint a jelzett mennyiségű ZOGN nátriumsót. A 9-met-et (Apex Organics Ltd., Anglia) használjuk a zeatin és zeatin származékok glikozilezésének gátlására. Az egyes kezelésekben 18 levélkorongot alkalmazunk.
Hét héttel az együtt-tenyésztés után a hajtásokat MSO táptalajra visszük, amely 300 mg/1 kanamicin-szulfátot, 350 mg/1 kefotaximot, 350 mg/1 karbenicillint, 0,1 mg/1 IAAt és 10 mg/1 6-(m-hidroxi-benzil-amino)-purint (OH-BA) tartalmaz, majd 25 °C-ra tesszük. Az 0H-BA-t Kaminek és munkatársai leírása alapján lehet előállítani [Plánt Growth Reg., 6, 113-120 (1987)].
106
Hat hét elteltével a kanamicint tartalmazó táptalajon kifejlődött zöld hajtásokat megszámláljuk. A kanamicinrezisztencia azt mutatja, hogy a hajtás transzgenikus, mivel a β-glükuronidáz génnel együtt egy NPT gént is átvittünk (amely kanamicin rezisztenciát biztosít). Transzformálatlan hajtások (negatív kontroll) nem éltek meg ezen a táptalajon, míg az összes transzformált hajtás (pozitív kontroll), amely aktív NPT gént tartalmaz, megélt ezen a táptalajon.
A kanamicin rezisztens hajtások százalékát az öszszes regenerált hajtás között úgy számítjuk ki, hogy a kanamicin-tartalmú táptalajon megélő zöld hajtások számát elosztjuk a kanamicin-tartalmú táptalajra átvitt hajtások számával. Az eredményeket az alábbi táblázatban adjuk meg:
11. táblázat
Genetikailag transzformált hajtások pozitív szelekciója zeatin-O-B-glükuronsavat használva különböző hőmérsékleteken
T °c ZOGN mg/1 Kanamicin-rezisztens hajtások levélkorongonként Kanamicin-rez isztens hajtások százaléka az összes hajtás között
25 1 0,3 4,3
30 1 1,3 14,8
35 1 0,2 26,7
25 15 0 0
30 15 2,4 26,2
35 15 0,2 18,2
107
Az ebben a példában ismertetett biológiai vizsgálatot egy kapcsolt, együtt transzformált génnel végeztük. Ez azt jelenti, hogy a B-glükuronidáz gént használtuk szelekcióra, míg az együtt bevitt NPT (kanamicin rezisztencia) génből származó rezisztenciát vizsgáltuk.
A fenti eredmények azt mutatják, hogy a B-glükuronidáz gén mellett egy együtt átvitt gén is expresszálódik, ha a szelekciót a B-glükuronidáz gén használatával végezzük. Emellett az is látható, hogy az emelt hőmérsékleten végzett szelekció (azaz körülbelül 30-35 °C-on) javítja a hajtások szelekcióját levélkorongonként, valamint a transzgenikus hajtások százalékát az összes regenerálódott hajtás között.
Az X-glük vizsgálatot különböző hőmérsékleteken elvégezve azt figyeltük meg a találmánnyal kapcsolatban, hogy a növényekben előforduló belső B-glükuronidáz aktivitást a magas hőmérséklet gátolja, míg a bevitt B-glükuronidáz aktivitást nem befolyásolja. Azt találtuk tehát, hogy a belső B-glükuronidáz aktivitás lassan csökken a növekvő hőmérséklettel, egészen 60 ®C-ig, amely hőmérsékleten már lényegében nincs belső B-glükuronidáz aktivitás (az Xglük vizsgálattal meghatározva). Ez megmagyarázhatja a szelekciós eljárás javulását a magasabb hőmérsékleteken.
11. példa
A pozitív szelekció a negatív szelekcióval összehasonlítva és kombinálva
Kimutattuk, hogy az ismertetett pozitív szelekciós rendszer nagyon hatékony és előnyös a hagyományos kanamicin- 108 -alapú negatív szelekcióval összehasonlítva. Akkor is jó eredményeket kapunk azonban, ha a pozitív szelekciós rendszert a hagyományos negatív szelekcióval kombinálva alkalmazzuk.
Az alábbi táblázatban láthatók az eredmények a lévé lkorongonként megszámlált GUS-pozitív dohány-hajtások számában és a GUS-pozitív hajtásoknak az összes hajtásokra vonatkoztatott számában kifejezve, a pozitív szelekcióra a BA3GN-nátriumsót, a hagyományos negatív szelekcióra a kanamicint és BA-t használva, valamint a pozitív és negatív szelekciót kombinálva. Emellett a kísérletekhez tartozik a BA3GN-nátriumsóval és a szacharo-1,4-laktonnal (SL, a bevitt β-glükuronidáz erős, specifikus inhibitora) együtt végzett szelekció.
A 13. példában ismertetett módszereket alkalmaztuk közlünk, azzal a különbséggel, hogy Gamborg B5 szubsztrátot használtunk az MSO helyett.
* · ·«· • ··
109
12. táblázat
Pozitív szelekció negatív szelekcióval kombinálva
Szelekciós szubsztrát Kanamicin GUS + hajtások levélkorongonként GUS + hajtások az összes hajtás között
Szám -k-k BA+kanamicinhez hasonlítva
% BA+kanamicinhez hasonlítva
Konc.** Konc.
BA 1 300 0,01 lx 4,3 lx
BA3GN* 15 300 0,1 10X 47,1 11X
BA3GN* 15 100 0,2 20X 3,2 0,7x
BA3GN* 15 33 0,4 40X 4,7 1, lx
BA3GN* 0 0 0,3 30X 7,4 1,7X
BA3GN* 15 0
+ SL (10 rnmol/1) 0,02 2X 0,9 0,2x
*: nátriumsó **: koncentráció mg/1-ben
A BA-t és kanamicint együtt alkalmazó kísérletet, amely megfelel a hagyományos negatív szelekciós rendszernek, két különböző kísérlet formájában ismételtük meg, kísérletenként 54 levélkorongot használva. Egyetlen GUS pozitív hajtást mutattunk ki a 23 kiválasztott hajtás között. A BA3GN-nátriumsóval kapott eredményeket 324 levélkorong felhasználásával végeztük. Az SL-lel (szacharo-1,4-lakton) végzett kísérleteket egyszer végeztük el összesen 162 levélkorong felhasználásával.
A fenti táblázat azt mutatja, hogy a pozitív szelekció, 15 mg/1 BA3GN-nátriumsót alkalmazva (kanamicin nélkül) harmincszor annyi GUS-pozitív hajtást eredményez levélkorongonként mint a hagyományos negatív szelekciós rendszer, 1 mg/1 BA és 300 mg/1 kanamicin-szulfát felhasználásával.
110
Emellett az összes hajtásnak sokkal nagyobb száma volt GUSpozitív, ha pozitív szelekciót használtunk (7,4 %), mint amikor negatív szelekciót használtunk (4,3 %).
Jó eredményeket kaptunk a pozitív és negatív szelekció kombinációjával is, azaz akkor, ha a hagyományos kanamicin-alapú negatív szelekciós rendszerben a citokinint egy citokinin glükuroniddal (BA3GN-nátriumsó) helyettesítettük. Tehát, amikor 15 mg/1 BA3GN-nátriumsót kombináltunk 300 mg/1 kanamicin-szulfáttal, akkor a GUS-pozitív hajtások százaléka 11-szer magasabb mint akkor, amikor a BA-t és a kanamicint kombináltuk, és ha a BA3GN-nátriumsót kombináltuk 33 mg/1 kanamicin-szulfáttal, akkor a GUS-pozitív hajtások száma negyvenszer magasabb volt, mint amikor a BA-t és a kanamicint használtuk.
Ha 15 mg/1 BA3GN-nátriumsót kombináltunk 10 mmol/1 GUS inhibitorral (SL), akkor mind a GUS-pozitív hajtások levélkorongonkénti száma, mind a GUS-pozitív hajtások százaléka drasztikusan lecsökkent, ahhoz hasonlítva, amikor csak a 15 mg/1 BA3GN-nátriumsót használtuk. Ez azt mutatja, hogy a kívülről bevitt GUS gén a felelős a pozitív szelekciós módszerrel kapott jó eredményekért, mivel az SL-t hozzáadva a növesztő táptalajhoz erősen gátolni lehet az inaktív citokinin glükuronid (BA3GN-nátriumsó) β-glükuronidázzal katalizált konverzióját aktív citokininné az ezen a táptalajon növekvő sejtekben, ezzel az indukált hajtások számának megfigyelt csökkenését eredményezve. Tehát a pozitív szelekciós rendszer a szándékaink szerint működik, azaz egy kívülről bevitt β-glükuronidáz enzimet használunk egy citokinin-glü
111 kuronid elhasítására genetikailag transzformált sejtekben, ezzel szabad citokinint szabadítva fel ezekben a sejtekben és hajtás indukcióját eredményezve.
12. példa
A pozitív szelekciós rendszer módosítása a citokinin-glükuronid szelektív hatásának javítására
Ismertetés (lásd 3. táblázat, 3. példa), hogy a természetben előforduló β-glükuronidáz a növényben inaktív viszonylag magas pH-értékeken, azaz pH=6 vagy magasabb értékeken, míg a kívülről bevitt β-glükuronidáz egészen pH=8 értékig aktív. Azzal, hogy a táptalajhoz egy olyan anyagot adunk, amely megnövelheti a sejtek belső pH-ját (például ilyen az ammónium-nitrát), a GUS-pozitív sejtekből a szelektív hajtásképződés tovább fokozható, mivel ezáltal lehetségessé válik, hogy a nem-transzformált sejtekben a természetes β-glükuronidázból származó minden háttér β-glükuronidáz aktivitást blokkoljunk.
Az alábbi táblázat a GUS-pozitív és GUS-negatív dohánylevél korongokból kapott hajtások számát mutatja, különböző koncentrációjú BA3GN-nátriumsót és ammónium-nitrátot alkalmazva. Az alkalmazott módszer ugyanaz, mint amit a 3. példában leírtunk, azzal a különbséggel, hogy az MSO szubsztrát helyett Gamborg B5 szubsztrátot használunk.
112
13. táblázat
Az ammónium-nitrát hatása a szelektív hajtásképződésre BA3GN nátriumsóval kezelt levélkorongokból (pH=7)
Hajtás-képződés (szám és szelektivitási faktor *) GUS+- és GUS-1évélkorongokban
7,5 mg/1 BA3GN** 15 mg/1 BA3GN** 30 mg/1 BA3GN**
Ammónium-nitrát szel.* szel.* szel.*
konc. GUS+ GUS (mmol/1) - faktor GUS+ GUS· - faktor GUS+ GUS- faktor
25 4 0 >4x 33 2 17x 73 36 2x
35 6 1 6x 50 7 7x 73 39 2x
45 0 0 - 20 6 3x 57 27 2x
55 14 0 >14x 34 0 >34x 37 11 3x
65 2 0 >2x 8 2 4x 25 45 lx
Átlag 26 1 26x 145 17 9X 265 158 2x
* A szelektivitási faktor jelentése az a szám, amelyet úgy kapunk meg, hogy a GUS-pozitív hajtások számát osztjuk a GUS-negatív hajtások számával, és ezzel egy adott kezelés szelektivitására kapunk adatot.
** nátriumsó
Látható, hogy mind a BA3GN-nátriumsó mind az ammónium-nitrát alkalmazása megfelelő koncentrációban szelektív hajtásképződéshez vezet a GUS-pozitív levélkorongokban. Például 15 mg/1 BA3GN-nátriumsó és 55 mmol/1 ammónium-nitrát kombinációja 34 hajtást eredményez a GUS-pozitív levélkorongokból, míg nem keletkeznek hajtások a megfelelő GUS-negatív levélkorongokon, amelyeket ugyanannak a kezelésnek vetettünk
113 alá.
Egy másik lehetőség a pozitív szelekciós rendszer szelektivitásának javítására citokinin-glükuronidok alkalmazásával, ha a növesztő táptalajhoz egy olyan szubsztrátot adunk hozzá, amely β-glükuronidázzal való hasítás után a pH növekedését eredményezi, és ezzel gátolja a citokinin-glükuronidok hidrolízisét a nem-transzformált sejtekben, anélkül, hogy gátolná a szabad citokinin hatását.
Ezt az elvet illusztráljuk egy kísérletben, amely a különböző koncentrációjú o-kumaril-B-D-glükopiranursav (CouGN) hatását vizsgálja BA3GN-nátriumsóval vagy BA-val indukált GUS-negatív dohány levélkorongokból. Ha az o-kumaril-B-D-glükopiranursavat B-glükuronidázzal hasítjuk, akkor o-kumarinsav szabadul fel. Amint az előzőkben említettük (lásd II példa), az o-kumarinsav spontán kumarinná alakul. Ez magában foglalja egy savcsoport eliminálódását (lásd az A reakcióegyenletet), és ezzel megnöveli a pH-t egy olyan szintre, amelynél a természetes növényi B-glükuronidáz aktivitása feltehetően redukálódik.
A kísérletet 0,5 mg/1 BA koncentrációval és 10,0 mg/1 BA3GN-nátriumsó koncentrációval végeztük. Kezelésenként 12 korong volt, és a hajtások számát 19 nap elteltével regisztráltuk. Az eredményeket az alábbiakban mutatjuk be.
114
14. táblázat
Az o-kumaril-B-D-glükopiranuronsav (CouGN) hatása a BA vagy BA3GN-nátriumsóval indukált hajtásképződésre
CouGN A regenerált hajtások száma Relatív % BA/BA3GN*
konc. (mmol/1) BA relatív% BA3GN relatív%
0 71 100 77 100 1,0
0,0625 66 93 78 101 0,9
0,125 71 100 63 82 1,2
0,25 56 79 79 103 0,8
0,5 71 100 56 73 1,4
1,0 70 99 4 5 19,8
2,0 65 92 6 8 11,5
3,0 37 49 0 0 >49
4,0 36 47 0 0 >47
5,0 16 21 0 0 >21
6,0 12 16 0 0 >16
7,0 13 17 0 0 >17
* nátriumsó
A fenti táblázat azt mutatja, hogy az o-kumaril-B-D-glükopiranursav jelenléte a növesztő táptalajban gátolja a BA3GN-nátriumsóval indukált regenerálást, de nem gátolja a BA-val indukált regenerálást. A legjobb eredményeket ebben a kísérletben akkor kaptuk, ha az o-kumaril-B-D-glükopiranursavat körülbelül 3-4 mmol/1 koncentrációban használtuk. Számos mechanizmus vehet részt a BA3GN által indukált hajtásképződés csökkentésében, beleértve az alábbiakat:
1) megnövekedett pH az o-kumarinsav felszabadulása következtében, lásd az előzőket,
115
2) szubsztrát kompétíció a CouGN és a BA3GN között, ezzel a BA3GN alacsonyabb gyakoriságú hidrolízisét eredményezve, és
3) a BA3GN csökkent transzportja a sejtekbe.
Jóllehet a hajtásképződés gyakoriságában CouGN jelenlétében megfigyelt csökkenésében szerepet játszó pontos mechanizmust nem határoztuk meg, az a véleményünk, hogy a megnövekedett pH valószínűleg legalábbis részben felelős a jelenségért. Akárhogy is van, ez a kísérlet azt mutatja, hogy a pozitív szelekciós rendszer szelektivitása fokozható a kívülről bevitt B-glükuronidáz gén felhasználásával, hogy ezzel olyan önszabályozó mechanizmust hozzunk létre, amely jelentősen csökkenteni képes bármely háttérenzim hatását.
13. példa
Genetikailag transzformált növények készítése
Az alábbiakban egy általános módszert adunk meg, amely genetikailag transzformált növények készítésére használható.
Növényi anyag
A leveleket (Nicotiana tabacum 'Wisconsin 38') in vitro vagy in vivő növesztett növényekről nyerjük. Az utóbbi esetben a leveleket a transzformálás előtt sterilezzük. A sterilezést úgy végezhetjük, hogy a leveleket 20 percre 5 %-os kalcium-hipoklorit oldatba tesszük, amely 0,1 ml Tween 80-at tartalmaz literenként, majd ötször mossuk steril desztillált vízzel. Az in vitro növesztett növényeket 1/2
116
MSO-t tartalmazó edényekben növesztjük. (A 1/2 MSO ugyanaz a táptalaj mint az MSO 50 %-os koncentrációban, azzal az eltéréssel, hogy az agar, a cukor és a vitaminok más koncentrációban vannak).
A leveleket egyenként 14 cm-es Petri-csészékbe teszszük. Kilyukasztjuk vagy körülbelül 1 cm2-es darabokra vágjuk, amelyek nem tartalmaznak fő ereket, a darabok szélei vágott szövetből vannak. Minden olyan vágott szövetet eltávolítunk, amelyet előzőleg hipokloritos sterilezésnek vetettünk alá.
A baktériumok tenyésztése
Egy nappal a transzformáció előtt egy baktériumtenyészetet indítunk oly módon, hogy 2-3 ml baktériumot adunk 200 ml LB táptalajhoz (Erlenmeyer lombikban). A baktériumokat 28 °C-on növesztjük kevertetve (300/perc).
Transzformáció
A baktérium tenyészetet közvetlenül a transzformáció előtt 50-szeresre, vagy OD=0,l-re hígítjuk (660 nm-en mérve) 1/2 MSO-val. A hígított baktérium-szuszpenzióból körülbelül 10 ml-t egy 9 cm-es Petri-csészébe öntjük, majd a levéldarabokat ebbe a szuszpenzióba merítjük körülbelül 15 percre. A levéldarabokat azután eltávolítjuk és a fölösleges baktérium-szuszpenziót steril szűrőpapírral itatjuk fel.
117
Együtt-tenvésztés
A transzformálás előtti napon egy steril szűrőpapírdarabot teszünk az együtt-tenyésztő Petri-csészékre (amelyek általában MSO szubsztrátot tartalmaznak), és a levéldarabokat, amelyeket a baktérium-szuszpenzióba merítettünk, fejjel lefelé a szűrőpapírra helyezzük. A levéldarabokat növesztő kamrában inkubáljuk 12 órás megvilágítási ciklussal 2 napig.
Szelekció/regenerálás
A levéldarabokat olyan Petri-csészékre visszük át, amelyek citokinin glükuronidokat tartalmaznak a jelzett mennyiségben, valamint vagy 350 mg/1 karbenicillint + 350 mg/1 kefotaximot, vagy csak 800 mg/1 karbenicillint, bizonyos esetekben kanamicin-szulfáttal kombinálva. A levéldarabokat 3 hét elteltével ugyanilyen friss táptalajra tesszük át, de ez már nem tartalmaz glükuronidokat.
Vizsgálati módszer
A regenerált hajtásokat 1/2 MSO-t tartalmazó edényzetbe tesszük át. Körülbelül 2 hét elteltével az X-glük vizsgálatot elvégezzük a zöld hajtásokkal. A hajtásokat szükség szerint átültetjük.
Kiültetés
A genetikailag transzformált hajtásokat, amelyek gyökereket növesztettek (és amelyek GUS-pozitívak) kiültetjük egy nővesztő-kamrába, egy alkalmas növesztő táptalajba, például tőzegmohába· Azután műanyag zacskóval lefedjük, és }
- 118 körülbelül 1 hétig növesztjük, ami után a műanyag zacskók két sarkát kivágjuk. Még egy hét elteltével a műanyag zacskókat eltávolítjuk.
14. példa
Hajtásképződés indukálása szterineket és egy di-B-glükuronidot alkalmazva növényi szövetből, amely vagy tartalmaz kívülről bevitt B-glükuronidáz gént vagy nem
Az 5. és 6. példákban leírtakhoz hasonló vizsgálatokat végzünk GUS-pozitív és GUS-negatív dohány levélkorongokon, 100 mg/1 B-szitoszterint, 100 mg/1 koleszterint, 10 mg/1 kampeszterint, 1,88 mg/1 BA3GN-nátriumsót és a di-B-D-glükuronidból, a glicirrizinsavból diammónium-só formájában különböző mennyiséget tartalmazó szubsztrátokon. Emellett a szubsztrátok fele 0,1 mmol/1 tridemorfot tartalmaz. A hajtások számát 17 nap elteltével regisztráljuk. Az eredményeket az alábbi táblázatban mutatjuk be.
15. táblázat
Regenerált hajtások levélkorongonként
Glicirrizin sav* Tridemorf nélkül Tridemorffal (0,1 mmol/1)
Konc, (mmol/1) GUS+ GUS- GUS+ GUS-
0,00125 1,6 0 0,4 0
0,0125 1,1 0 2,3 0
0,125 1,3 0,1 7,7 0,4
1,25 0 0 0 0
6,25 0 0 0 0
* diammóniumsó
119
Látható, hogy a szterinek és a glicirrizinsav kombinációja szelektív hajtás-képződéshez vezet kívülről bevitt β-glükuronidáz gént tartalmazó levélkorongokon. (Amint az előzőekben említettük (5. példa), a tridemorf gátolja a szterinek szintézisét, és így gátló hatást fejt ki a hajtásregenerálásra, ha a növényi szövet nem kap szterint.) Míg a szelektív hajtásindukáló hatás látható, mind tridemorfot tartalmazó, mind tridemorfot nem tartalmazó szubsztrátokkal, a legnagyobb számban akkor kapjuk a hajtásokat, ha a szubsztrát tartalmaz tridemorfot, különösen 0,125 mmol/1 glicirrizinsav diammóniumsó koncentráció mellett.
15. példa
A BA3GN-nel indukált hajtásképződés szelektív gátlása vad típusú (GUS-) dohány levélkorongokban
A kísérleteket a 3. példában leírtak alapján végezzük, azzal az eltéréssel, hogy a 'Burley' dohányvariánst használjuk a ’Wisconsin 38' helyett, metil-D-glükuronidot (MG), amely metanolra és glükuronsavra hidrolizál, adunk a szubsztráthoz különböző koncentrációban, vagy 1 mg/1 BA-nátriumsóval vagy 15 mg/1 BA3GN-nátriumsóval együtt. A metanolról igazolták, hogy gátolja a natív GUS enzimet, anélkül, hogy a kívülről bevitt Escherichia coli enzimet túlzottan gátolná [Kosugi et al., Plánt Sci., 133-120 (1990], míg a metil-B-D-glükuronidból felszabaduló glükuronsav a GUS enzimek termék-inhibitora. Ha MG-t adunk hozzá, ahelyett, hogy a két vegyületet függetlenül adnánk hozzá, akkor a hidrolízis termékek lokálisan képződnek és abban a
120 sejtrészben koncentrálódnak, ahol az enzim található. A kapott eredmények az alábbi, 16. táblázatban láthatók.
16. táblázat
Vegyület Konc. mg/1 Hajtás per levélkorong Arány BA/BA3GN
BA BA3GN
Meti1-B-glükuronid 0 1,00 0,50 2,0
1000 1,91 1,00 1,9
3300 2,25 0 —
Glükuronsav 0 1,00 0,50 2,0
1000 0,33 0,08 4,1
3300 0,83 0 -
10000 0,42 0 —
BA: lmg/1
BA3GN: 15 mg/1
A fenti eredmények azt mutatják, hogy ha vagy MG-t vagy glükuronsavat adunk a rendszerhez, akkor annak az az eredménye, hogy a BA3GN szubsztráttal kapott hajtások száma csökken a BA szubsztráttal kapott hajtások számához viszonyítva. Ha a szövetet MG-vel kezeljük mielőtt a kívülről bevitt GUS enzim expresszálódik, akkor lehet szelektíven eliminálni vagy csökkenteni a natív GUS enzim aktivitását vagy hatását a szelekciós eljárás során. A bevitt és a natív GUS enzimek közötti különbségek a szubsztrát kompetíció következtében létrejövő inhibíciót, a szubsztrát inhibícióra való érzékenységet, az enzim mennyiségét (aktivitás) és a termék inhibícióra való érzékenységét illetően az MG és egyéb ha
121 sonló hatással rendelkező vegyületeknek a glükuronidokkal kezelt vad típusú szövetre gyakorolt hatásának tudhatók be.
Az is lehetséges, hogy az MG úgy működik, hogy más glükuronidokkal, például a BA3GN-nel verseng a bejutásért. Ha ez az eset, akkor az MG csökkenteni tudja vagy meg tudja akadályozni más glükuronidok bejutását a vad típusú sejtekbe. Ha egy szekretálódó GUS enzimet kódoló gént vagy egy glükuronid-permeázt kódoló gént juttatunk be, ez arra használható, hogy transzgenikus sejteket szelektáljunk, ha a bejutás gátolt, például MG-nek a szubsztráthoz való adásának következtében. A glükuronid-permeáz esetében csak a transzgenikus sejtek veszik fel a glükuronidot (azaz a BA3GN-t), és a természetes enzimek növényekben való általános előfordulása következtében (lásd például a 3. példát), a vegyület a permeázt (vagy egyéb fehérjét, amely megkönnyíti a glükuronidok felvételét) expresszáló sejt belsejében aktiválódik.
Az is érdekes, hogy a glükuronsav önmagában is képes szelektíven gátolni a BA3GN hatását, feltehetően oly módon, hogy blokkolja a BA3GN GUS hatására való hasadásának termékeként keletkező BA hatását.
16. példa
A pozitív szelekció, illetve a pozitív és negatív szelekció kombinációjának alkalmazása a transzgenikus sejtek, szövetek vagy hajtások ellenálló fajokból való szelekciója hatékonyságának fokozására
A cukorrépa egy nagyon nehezen kezelhető növényfaj a transzgenikus növények előállítását illetően. Számos nem
122 transzformált hajtást lehet szelektálni olyan körülmények között, amelyek egy normális transzformációs rendszerben transzgenikus hajtásokat eredményeznek. Ugyanezt találtuk abban az esetben is, amelyben pozitív szelekciós kísérleteket (hozzáadott kanamicin nélkül) végeztünk, 5-15 mg/1 BA3GN-nátriumső alkalmazásával, az alábbiakban ismertetett körülmények között.
A 11. példában (lásd 12. táblázat), a pozitív és negatív szelekció kombinációjáról azt találtuk, hogy csökkenti a szelektált nem-transzformált hajtások számát. Ennek következtében a pozitív és negatív szelekció hatását vizsgáltuk cukorrépán, és erről kiderült, hogy előnyös eredményeket ad.
A magvakat négy napig sötétben csíráztatjuk 0,7 g/1 agarózt és 2 g/1 szacharózt tartalmazó táptalajon. A palántákat egy Nunc tartóba tesszük át, amely 1/2 MSO szubsztrátot tartalmaz, majd 3 napig világosban tartjuk. A szikleveleket eltávolítjuk a palántákról, majd a sziklevél explantátumok levélnyelére egy kis kefével Agrobacterium-szuszpenziót viszünk fel, az Agrobacterium pedig 35S-NPTII és 35S-GUS (ODggO0/1) tartalmú. A szikleveleket 4 napig együtt tenyésztjük egy olyan szubsztráton, amely 1/10 MSO szubsztrátot és 200 μιηοΐ/ΐ acetosyringont tartalmaz. A transzformált explantátumokat egy MSO szubsztrátra visszük át, amelyet 0,25 mg/1 BA-val vagy 15 mg/1 BA3GN-nátriumsóval (BAP helyett), 0,025 mg/1 naftilecetsawal, 400 mg/1 kanamicinnel, 800 mg/1 karbenicillinnel és 25 mg/1 vankomicinnel egészítettük ki, majd az explantumokat 21 napig inkubáljuk ezen a
123 szubsztráton. A regenerált hajtásokat azután ugyanezt a szubsztrátot tartalmazó tartókba visszük át. 52 nap eltelte után ezen a szubsztráton az összes hajtást MSO szubsztrátra visszük át, amelyet 800 mg/1 karbenicillinnel, 25 mg/1 karbenicillinnel, 25 mg/1 vankomicinnel és 0,1 mg/1 BA-val egészítettünk ki. 14 nap elteltével a 3. példában ismertetett GUS vizsgálatokat hajtjuk végre a kiválasztott növényi anyagon.
Az eredményeket az alábbi táblázatban mutatjuk be.
17. táblázat
Cukorrépa transzformáció
A pozitív és a negatív szelekció kombinációja
Az explantátumok GUS+ GUS-
száma hajtások (%) hajtások (%)
Negatív szelekció 100 0 0
Pozitív és negatív 177 4 2,3
szelekció
Negatív szelekció: 400 mg/1 kanamicin-szulfát + 1 mg/1 BAP
Pozitív és negatív szelekció: 400 mg/1 kanamicin-szulfát + 15 mg/1 BA3GN
Látható, hogy a pozitív és negatív szelekció kombinációjával transzgenikus hajtásokat lehet előállítani olyan körülmények között, amely körülmények között ilyenek keletkeznek a hagyományos negatív szelekciós rendszer alkalmazásával. Ez azt mutatja, hogy a pozitív szelekciós rendszer alkalmazása nagyon előnyös cukorrépában, a tiszta negatív
124 szelekciós rendszerrel összehasonlítva.
Ez egyben azt is mutatja, hogy a pozitív szelekciós rendszer alkalmazása (egyedül a negatív szelekcióval kombinálva) lehetővé teheti a transzgenikus növények előállítását más nehezen kezelhető fajokból is, amelyeknél csak alacsony transzformációs gyakoriság érhető el, illetve amelyeknél egyáltalán nem szelektálhatók transzgenikus növények a negatív szelekciós módszer alkalmazásával.
17. példa
Pozitív szelekciós rendszerek, amelyek azon alapulnak, hogy inaktív N-forrásokat teszünk hozzáférhetővé metabolizáló gének bejuttatásával
A kísérleteket a 3. példában leírtak alapján végeztük azzal az eltéréssel, hogy az MSO szubsztrát normál nitrogéntartalmát nullára csökkentettük. Ehelyett a 18. táblázatban jelzett nitrogénvegyületeket adtuk hozzá. A szubsztrát 1 mg/1 BA-t tartalmazott. Az ammónium-nitrátot tartalmazó szubsztrátokat használtuk pozitív kontrollként.
Ezeket a kísérleteket azért végeztük el, hogy megvizsgáljuk, vajon az opinok inaktívak-e, vagy pedig a növényi sejtek használhatják-e nitrogénforrásként olyan szubsztrátokon, amelyek egyéb nitrogénforrást nem tartalmaznak. Mivel jól ismertek azok a gének, amelyek az opinok metabolizálásához szükséges enzimeket kódolják, a fő feltétele az opinok alkalmazásának egy pozitív szelekciós rendszerben az, hogy azonosítsuk azokat az opinokat, amelyeket nitrogénforrásként nem használhatják olyan növényi sejtek és szövetek,
125 amelyek nem tartalmaznak kívülről bevitt géneket, amelyek alkalmassá teszik a növényi sejteket, hogy a kérdéses opinokat hasznosítsák. Az eredményeket az alábbbiakban adjuk meg.
18. táblázat
Az opinok hatása hajtások dohány levélkorongokból való képződésére nitrogént nem tartalmazó szubsztrátokon (a hajtások száma 9 levélkorongonként)
Vegyület 0 Koncentráció (mmol/1) 40 80
10 20
Oktopin 13 11 15 15 6
Mannopin 13 >50 >50 >50 >50
Nopalin 13 18 19 11 8
Ammónium-nitrát 13 >50 >50 >50 >50
A vizsgált, nitrogént nem tartalmazó szubsztrátokon néhány hajtás regenerálódott. Ez azért lehetséges, mivel a nitrogén mobilizálható az explantátum szöveteiből. Ahhoz, hogy elkerüljük a hajtásképződést a kezelések során minden nitrogén nélkül, az explantátumokat a nitrogénre ki kell éheztetni, oly módon,hogy a kiindulási tenyészeteket nitrogénmentes szubsztrátokon növesztjük a felhasználás előtt, vagy úgy, hogy az explantátumokat egy nitrogénmentes szubsztráton előkezeljük, például hajtásindukáló hormonok nélkül.
Meglepő módon azt találtuk, hogy az oktopin és a nopalin nem támogatja a hajtásképződést, míg a mannopin jó nitrogénforrásként működhet, és támogatja a hajtásképződést
126 < w· * ·· • 4 «. · ** C 9 9 9 • ·· · · * ír ·9 • · W « «· · · 9 9 ··· ««· <
a levélkorongokról.
Hogy a nopalin és az oktopin nem képes nitrogénforrásként működni valószínűleg az az, hogy ezek a vegyületek nem jutnak be, nem metabolizálódnak, illetve hidrolizálódnak használható vegyü1etekké. Jól ismert, hogy az opinok transzportjában és métábólizmusában szerepet játszó géneket tartalmazó szervezetek, például az Agrobacterium-ok képesek az opinokat nitrogénforrásként alkalmazni, míg azok az Agrobacterium vagy egyéb baktérium törzsek, amelyek nem tartalmaznak opin métábólizmusban szereplő enzimeket kódoló géneket, nem képesek olyan szubsztráton növekedni, amelyek nitrogénforrásként csak opinokat tartalmaznak.
Ezeknek az eredményeknek az alapján pozitív szelekciós rendszer állítható fel, oly módon,hogy egy vagy több opin métábólizmus vagy transzport gént juttatunk be a transzgenikus növényi sejtekbe, szelekciós szubsztrátként olyan szubsztrátokat használva, amelyek mondjuk nopalinon vagy oktopinon kívül nem vagy csak csökkent szinten tartalmaznak más nitrogénforrást. Azoknak a géneknek vagy genetikai anyagnak az azonosítását vagy izolálását, amelyek a befogadót azzal a képességgel látják el, hogy az oktopint és a nopalint hasznosítsa, az irodalomban már leírták [C. Beaulieu et al., Can. J. Microbiol., 38, 843-49 (1988), P.M. Klapwijk et al., Journal of Generál Microbiology, 96, 155163 (1976); C.L. Schardl and C.I.Kado, Molecular and Generál Genetics, 191, 10-16 (1983); H. Wabiko et al., Journal of Generál Microbiology, 136, 97-103 (1990)]. Az opin metabolizmust kódoló genetikai anyag izolálásával az eukarióta
I « «« « · * « ··· « ·*# 9 4 * « · * ♦ ·* ··· ·· ··
- 127 szervezetek az irodalomban közölt standard eljárásokkal transzforrnálhatók olyan szekvenciákkal, amelyek az opin metabolizmus génjeinek működéséhez szükségesek.
A fenti eredmények alapján valószínű, hogy más nők és a megfelelő katabolizáló gének hasonló módon használhatók, továbbá az is valószínűnek tűnik, hogy más, hasonlóképpen azonosított inaktív nitrogénforrások és a nekik megfelelő gének hasonlóképpen használhatók, például amidok amidázokkal kombinálva, peptidek specifikus peptidázokkal kombinálva, stb.
18. példa
Transzgenikus kallusz készítése nehezen kezelhető fajokból, pozitív és negatív szelekció kombinációjának alkalmazásával
A kísérleteket a 11. példában leírtak alapján végezzük, bizonyos módosításokkal. A használt növényfaj a nagyon nehezen kezelhető téli olajrepce V486” tenyészvonala és a nyári olajrepce S487 tenyészvonala. A magvakat sterilezzük és a 16. példában leírtak alapján csíráztatjuk. A szár alatti részeket használjuk explantátumként, oltjuk és együtt-tenyésztjük a 11. példában leírtak alapján. Az együtt-tenyésztés után az explantátumokat MSO szubsztrátra visszük át, amely 0,1 mg/1 naftilecetsavat, 0,01 mg/1 gibberellinsavat (GA3), 500 mg/1 karbenicillint, 50 mg/1 kanamicin-szulfátot és 6,0 g/1 agarózt tartalmaz. A szubsztrát emellett vagy 1 mg/1 BA-t vagy 3,75, 7,5 vagy 15 mg/1 BA3GN nátriumsót tartalmaz. A pH-t 5,8-ra állítjuk be. Az
«♦ ♦» • « · · ♦ *· * 4 * ♦ ·
128 alkalmazott Agrobacterium a T-DNS-ében egy GUS gént tartalmaz, valamint 35S promoterek által meghajtott neomicin-foszfotranszferáz II gént. A GUS vizsgálatokat 8 hét elteltével végezzük, és a legtöbb kallusz-sejtben intenzív kék festődést mutató kalluszt GUS+-ként regisztráljuk.
19. táblázat
Transzgenikus kallusz készítése olajrepcéből, pozitív és negatív szelekció kombinációjával
Olajrepce, téli típusú V486
BA3GN (mg/1) BA (mg/1) 1
3,75 7,5 15,0
Explantumok kallusszal 19,0% 23,0% 30,6% 0%
GUS+ kallusz
explantúrnőnként 1,4% 1,4% 2,3% 0%
GUS+ kallusz
per kallusz 7,1% 5,9% 7,5% 0%
Olajrepce, nyári típusú S486”
BA3GN (mg/1) BA (mg/1)
3,75 7,5 15,0 1
Explantumok kallusszal 5,2% 9,2% 6,3% 0%
GUS+ kallusz
explantumonként 1,7% 2,3% 0,9% 0%
GUS+ kallusz
per kallusz 33,3% 25,0% 14,2% 0%
129
ÍV4 ♦ *··» « · ·4 ♦ · ·* t »·· t ··· · · • h «· · * *« · »y · *· »·*·
Ezek a kísérletek azt mutatják, hogy ezekkel a nehezen kezelhető olajrepce típusokkal csak akkor lehet transzgenikus kalluszt szelektálni, ha a pozitív és a negatív szelekciót kombináljuk, míg a hagyományos negatív szelekciós eljárással nem kapunk GUS pozitív kalluszt (BA3GN-nátriumsó helyett BA-nátriumsót tartalmazó szubsztrátok).
Ez azt mutatja, hogy a pozitív szelekciós rendszer bevezetése nagyon előnyös, a tiszta negatív szelekciós rendszerekkel összehasonlítva, a kallusz rendszerben is. Azt is mutatja, hogy a pozitív szelekció alkalmazása (egyedül, vagy negatív szelekcióval kombinálva) lehetővé teszi transzgenikus növények előállítását más nehezen kezelhető fajokból is, amelyekkel csak alacsony transzformációs/szelekciós frekvenciát lehetett elérni, illetve amelyekből egyáltalán nem lehetett transzgenikus növényeket kapni negatív szelekciós rendszerek alkalmazásával.
Miután a transzgenikus kalluszt szelektáltuk, transzgenikus hajtásokká regenerálhatók, például citokinint alacsony koncentrációjú auxinokkal kombinálva tartalmazó szubsztráton. Ebben az eljárásban nincs szükség szelekcióra.

Claims (44)

  1. Szabadalmi igénypontok
    1. Eljárás genetikailag transzformált olyan sejtek izolálására egy sejtpopulációból, amelyekbe nukleotid-szekvenciát vittünk be, azzal jellemezve, hogy a transzformált sejtekben a kiválasztott nukleotid-szekvencia vagy egy együtt bevitt nukleotid-szekvencia egy, a sejtpopulációhoz adott vegyület vagy tápanyag-komponens pozitív hatásának indukálásával vagy fokozásával a transzformált sejteket azonosítjuk vagy szelektáljuk a nem-transzformait sejtek közül.
  2. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy növényi sejteket alkalmazunk.
  3. 3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a sejtpopulációt egy olyan táptalajban vagy táptalajon tartjuk, amely legalább egy olyan inaktív vegyületet vagy tápanyag-komponenst tartalmaz, amely közvetve vagy közvetlenül aktiválódik azokban a sejtekben, amelyek az együtt bevitt nukleotid-szekvenciát vagy a kiválasztott nukleotidszekvenciát tartalmazzák, a vegyület vagy tápanyag komponens inaktív vagy sokkal kevésbé aktív a nem-transzformált sejtekben, mint a transzformált sejtekben, ezzel a transzformált sejteket egy olyan szelekciós előnyhöz juttatjuk, amely lehetővé teszi, hogy a sejtpopulációból szelektáljuk őket.
  4. 4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy egy enzimet expresszáló együtt bevitt nukleotid-szekvenciát vagy a kiválasztott nukleotid-szekvenciát alkalmazunk.
    Í«M ·· ·· • · ·« · » · • ··· 4 ··· · · • 4 4 4 4 · ··« ·· t·· ·· 44
    - 131 -
  5. 5. Az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy in vitro hajtjuk végre.
  6. 6. Az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy in vivő hajtjuk végre.
  7. 7. A 3-6. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a transzformált sejtekben aktiválódó vegyületet vagy tápanyag-komponenst egy olyan csoportból választjuk ki, amelyben találhatók citokininek és egyéb növényi növekedés-szabályozók, tiaminok és más vitaminok, szénhidrátok, nitrogéntartalmú vegyületek, valamint olyan vegyületek, előnyösen szterinek, szaponinok és egyéb szteroidok, amelyek lényeges funkciókkal rendelkeznek a sejtek vagy szövetek differenciálódása vagy dedifferenciálódása során.
  8. 8. A 3-6. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy egy ásványi anyagot kelátformába viszünk, és ezáltal az ásványi anyagot hozzáférhetővé teszszük a transzformált sejtek számára.
  9. 9. A 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy enzimként β-glükuronidázt alkalmazunk.
  10. 10. A 9. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemez- ve, hogy a sejtpopulációt egy olyan táptalajon vagy táptalajban szaporítjuk, amely egy citokinin glükuronidot tartalmaz, amelyet a transzformált sejtek a β-glükuronidáz segítségével elhasítanak, ezáltal szabaddá teszik a citokinint és a transzformált sejtekben hajtásképződést indukálnak.
  11. 11. A 10. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy citokinin-glükuronidként egy a 35. igénypont szerinti (I) általános képletű vegyületet alkalmazunk.
    132 • ·4 · *··· «· · ·· · « «· • ·· · »·· ·· • · · · ·· • •β ·· ·»· ····
  12. 12. Α 11. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a citokinin-glükuronidot az alábbi csoportból választjuk:
    3-B-D-glükopiranuronozil-6-benzil-amino-purin, illetve a karbonsav funkciónál kialakított sója,
    3-B-D-glükopiranuronamido-6-benzil-amino-purin,
    9-B-D-glükopiranuronozil-6-benzil-amino-purin, illetve a karbonsav funkciónál kialakított sója,
    3-B-D-glükopiranuronozil-6-(3-metil-but-2-enil-amino)-purin, illetve a karbonsav funkciónál kialakított sója,
    6-(3-metil-but-2-enil-amino)-purin-2-il-l-tio-B-D-glükopiranuronsav, illetve a karbonsav funkciónál kialakított sója,
    6-(3-metil-but-2-enil-amino)-purin-8-il-l-tio-B-D-glükopiranuronsav, illetve a karbonsav funkciónál kialakított sója, és
    O-B-D-glükopiranuronozil-zeatin, illetve a karbonsav funkciónál kialakított sója.
  13. 13. A 9-12. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a sejtpopulációt egy olyan táptalajon vagy táptalajban tenyésztjük, amely egy szaponin-glükuronidot vagy egy szterin-glükuronidot tartalmaz, amelyet a transzformált sejtek a B-glükuronidáz segítségével elhasítanak.
  14. 14. A 9-12. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a sejtpopulációban a természetes B-glükuronidáz aktivitást tovább csökkentjük úgy, hogy a
    133 táptalajhoz egy β-glükuronidáz inhibitort, előnyösen egy β-glükuronidot adunk, amely azokban a sejtekben, amelyekben nincs kívülről bevitt β-glükuronidáz gén, jobban gátolja a β-glükuronidáz aktivitást, mint azokban a sejtekben, amelyekben van kívülről bevitt β-glükuronidáz gén, vagy úgy, hogy a táptalajhoz egy olyan vegyületet adunk, amely a hidrolízis során egy olyan vegyületet eredményez, amely közvetlenül vagy közvetve jobban gátolja a természetes β-glükuronidáz gén aktivitását, mint a kívülről bevitt β-glükuronidáz gén aktivitását.
  15. 15. A 14. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a β-glükuronidázt gátló hidrolízis-termék a glükuronsav.
  16. 16. A 15. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a vegyületet, amelynek a hidrolízis-terméke a glükuronsav, az alábbi csoportból választjuk: glicirrizinsav, szteril-glükuronidok és metil-B-D-glükuronid.
  17. 17. A 9-12. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy minden természetes β-glükuronidáz aktivitást csökkentünk oly módon, hogy a tenyésztő táptalajhoz egy olyan glükuronidot, előnyösen 2-hidroxicinnamil-fí-D-glükopiranuronsavat vagy 2-hidroxicinnamil-B-D-glükopiranuronamidot adunk, amelyet a természetes β-glükuronidázok el tudnak hidrolizálni, és amelyeknek a hidrolízise következtében megnő a pH.
  18. 18. A 9-12. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a természetes β-glükuronidáz aktivitást azáltal csökkentjük, hogy a tenyésztő táptalajhoz egy
    134
    PH -szabályozó vegyületet adunk, amely a tenyésztő táptalajnak, a sejteknek vagy a sejtszerveknek 5,5-8,5 közötti pH-t, előnyösen 6,0 és 8,0 közötti pH-t, például 6,5 és 7,5 közötti pH-t biztosít.
  19. 19. A 18. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a pH-szabályozó vegyület egy ammóniumsó vagy ammóniát felszabadító vegyület, például ammónium-nitrát.
  20. 20. A 9-12. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a természetes β-glükuronidáz aktivitást hőkezeléssel csökkentjük vagy elimináljuk, 50-65 °C közötti hőmérsékletet alkalmazva rövid impulzusok formájában, mielőtt a szelekciós szubsztrátra vinnénk a sejteket és/vagy a szelekció során 30-45 °C közötti hőmérsékletet alkalmazunk.
  21. 21. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a sejtpopulációt egy olyan táptalajon vagy táptalajban tenyésztjük, amely legalább egy olyan vegyületet vagy tápanyagot tartalmaz, amely akkor hozzáférhető a transzformált sejt számára, ha a kiválasztott nukleotid-szekvencia, illetve a vele együtt bejuttatott nukleotid-szekvencia expresszálódik vagy átíródik, a vegyület vagy tápanyag nem hozzáférhető a nem-transzformált sejtek számára, illetve kevésbé hozzáférhető a nem-transzformált sejtek számára, mint a transzformált sejtek számára, így a transzformált sejtek szelektív előnyre tesznek szert, és ezáltal a sejtpopulációból kiválaszthatók.
  22. 22. A 21. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az együtt bejuttatott nukleotid-szekvencia vagy
    135 a kiválasztott nukleotid-szekvencia egy permeázt, előnyösen például glükuronid-permeázt expresszál.
  23. 23. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy mind a szelekciós funkció, mind a riporter funkció egyetlen enzimaktivitásban található meg, amelyet egyetlen gén kódol.
  24. 24. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az inaktív vegyület mannóz, ha az együtt bejuttatott nukleotid-szekvencia mannóz-6-foszfát izomerázt tartalmaz vagy galaktóz vagy egy galaktózt tartalmazó vegyület, ha az együtt bejuttatott szekvencia UDP-galaktóz-4-epimerázt kódol.
  25. 25. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az inaktív vegyület egy opin, amely a nemtranszformált sejtekben nitrogén- és/vagy szénhidrátforrásként nem vagy csak elégtelenül működik, előnyösen nopalin vagy oktopin, az együtt bejuttatott szekvencia vagy a kiválasztott nukleotid-szekvencia egy opin-metabolizmus vagy -transzport gént tartalmaz, amely expressziója révén lehetővé teszi, hogy az opin nitrogén- és/vagy szénhidrátforrásként működjön a transzformált sejtekben.
  26. 26. Az előző igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a kiválasztott nukleotid-szekvenciát legalább két különböző szelekciós génnel együtt juttatjuk be.
  27. 27. A 26. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a genetikailag transzformált sejteket a pozitív és negatív szelekció kombinációjával szelektáljuk, a kivá
    136 lasztott nukleotid-szekvenciát a genetikailag transzformált sejtekbe egy olyan nukleotid-szekvenciával együtt juttatjuk be, amely legalább egy toxin, antibiotikum vagy herbicid elleni rezisztenciát kódol, és a táptalaj legalább egy toxint, antibiotikumot vagy herbicidet tartalmaz, amelyre a transzformált sejtek rezisztensek.
  28. 28. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy egyetlen vegyületet adunk a tenyésztő táptalajhoz, és a transzformált sejtekben legalább egy nukleotidszekvencia egy kombinált pozitív és negatív szelekciós rendszer egy eleme, a vegyület negatív hatással rendelkezik a nem-transzformált sejtekre, és pozitív hatása van a transzformált sejtekre.
  29. 29. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az együtt bejuttatott szekvencia vagy a kiválasztott nukleotid-szekvencia expressziőja vagy transzkripciója egy olyan enzim aktivitásának a fokozódásához vezet, amely a populáció sejtjeiben természetesen megtalálható, azzal az eredménnyel, hogy a transzformált sejtekben levő enzim aktivitása nagyobb mint a nem transzformált sejtekben .
  30. 30. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a kiválasztott nukleotid-szekvencia vagy a kiválasztott nukleotid-szekvenciával együtt bejuttatott nukleotid-szekvencia expressziója azt eredményezi, hogy egy, a sejtpopulációhoz adagolt vegyület métábólizmusa blokkolódik, illetve egy vegyület szintézise blokkolódik a transzformált sejtekben, és ezáltal a transzformált sejtek megkü137 lönböztethetőek vagy szelektálhatok a nem-transzformált sejtek közül.
  31. 31. Genetikailag transzformált sejtek, azzal jellemezve, hogy az előző igénypontok bármelyike szerinti eljárással szelektáljuk őket.
  32. 32. A 31. igénypont szerinti genetikailag transzformált sejtek, azzal jellemezve, hogy lehetnek növényi sejtek, valamint az ilyen sejtekből származó növények, utódok vagy magvak.
  33. 33. Genetikailag transzformált sejtek, azzal jellemezve, hogy genomjuk szelekciós markerként nem tartalmaz egy nem-natív, toxint, antibiotikum vagy herbicid rezisztenciát kódoló nukleotid-szekvenciát.
  34. 34. A 33. igénypont szerinti genetikailag transzformált sejtek, azzal jellemezve, hogy lehetnek növényi sejtek, valamint az ilyen sejtekből származó növények, utódok vagy magvak.
  35. 35. (I) általános képletű vegyületek, ahol
    R2 jelentése hidrogénatom, -CH3, -S-CH3, -SO2-CH3,
    -SCH2-fenil, -SH, -OH, képletű csoport, klóratom vagy -S-R10, -NH-R10 vagy -0-R10 általános képletű csoport, ahol rIO jelentése egy B-D-glükopiranuronozil-csoport (ennek szerkezetét a példákban szemléltetjük) , illetve ennek sója vagy a karbonsav-funkciónál kialakított észter- vagy amid-származéka ···
    - 138 R6 jelentése benzilcsoport, amely a fenilcsoporton hidroxil-, 1-6 szénatomos alkoxicsoporttal, halogénatommal, 1-4 szénatomos alkilcsoporttal, -NH2 vagy -CF3 csoporttal vagy -O-R10, -S-R10 vagy -NH-R10 általános képletű csoporttal lehet helyettesítve;
    1-8 szénatomos alkil- vagy 2-8 szénatomos alkenilcsoport, amely egy-három hidroxil-, glükozil-oxivagy 1-6 szénatomos alkoxi-, fenil- és/vagy -0-R10, -S-R10 vagy -NH-R10 általános képletű csoporttal lehet helyettesítve; észterezett 1-6 szénatomos alkil- vagy 2-6 szénatomos alkenil-, furfuril- vagy ciklohexil-ureido-, fenil-ureido- vagy toluilureido-csoport; és vagy i) R7 és Y együttesen egy kötést képeznek;
    ii) R3 és R9 közül az egyik hidrogénatom vagy egy R10 általános képletű csoport, a másik pedig az X helyettesítővel együtt egy kötést képez, vagy R9 jelentése ribozil-, 5'-foszforibozil-, glükozilvagy -CH2CH (NH2) COOH csoport, és R3 az X helyettesítővei együtt egy kötést képez, és iii) R8 jelentése hidrogénatom, -CH3, -S-CH3, -SO2-CH3, -S-CH2-fenil, -SH, -OH, Cl vagy -S-R10, -NH-R10 vagy -0-R10 általános képletű csoport;
    vagy iv) R7 jelentése ribozil-, 5'-foszforibozil vagy glükózilcsoport, R8 jelentése hidrogénatom, R9 és Y együttesen egy kötést képeznek, és R3 és X együttesen egy kötést képez;
    139 azzal a feltétellel, hogy R2, R3, R8, R8 és R9 közül az egyik egy B-D-glükopiranuronozil-csoportot, illetve annak sóját vagy a karbonsavfunkciónál kialakított észter- vagy amid-származékát képviseli vagy tartalmazza.
  36. 36. A 35. igénypont szerinti (I) általános képletű vegyületek, ahol R2 jelentése hidrogénatom, R3 jelentése B-D-glükopiranuronozil-csoport, illetve annak sója a karbonsav funkciónál, R9 és X jelentése együttesen egy kötés, R6 jelentése benzilesöpört, R7 és Y jelentése együttesen egy kötés, és R8 jelentése hidrogénatom.
  37. 37. A 35. igénypont szerinti (I) általános képletű vegyületek, ahol R2 jelentése hidrogénatom, R3 jelentése B-D-glükopiranuronozil-csoport amid származéka a karbonsav funkciónál, R9 és X jelentése együttesen egy kötés, R6 jelentése benzilcsoport, R7 és Y jelentése együttesen egy kötés, és R8 jelentése hidrogénatom.
  38. 38. A 35. igénypont szerinti (I) általános képletű vegyületek, ahol R2 jelentése hidrogénatom, R3 és X jelentése együttesen egy kötés, R9 jelentése B-D-glükopiranuronozil-csoport, illetve annak sója a karbonsav funkciónál, R6 jelentése benzilcsoport, R7 és Y jelentése együttesen egy kötés, és R8 jelentése hidrogénatom.
  39. 39. A 35. igénypont szerinti (I) általános képletű vegyületek, ahol R2 jelentése hidrogénatom, R3 jelentése B-D-glükopiranuronozil-csoport, illetve annak sója a karbonsav funkciónál, R9 és X jelentése együttesen egy kötés, R6 jelentése 2-izopentenil csoport, R7 és Y jelentése együttesen egy kötés, és R8 jelentése hidrogénatom.
    140
  40. 40. A 35. igénypont szerinti (I) általános képletű vegyületek, ahol R2 jelentése -S-fi-D-glükopiranuronozil-csoport, illetve annak sója a karbonsav funkciónál, R9 jelentése hidrogénatom, R3 és X jelentése együttesen egy kötés, R6 jelentése 2-izopentenil csoport, R7 és Y jelentése együttesen egy kötés, és R8 jelentése hidrogénatom.
  41. 41. A 35. igénypont szerinti (I) általános képletű vegyületek, ahol R2 jelentése hidrogénatom, R9 jelentése hidrogénatom, R3 és X jelentése együttesen egy kötés, R8 jelentése 2-izopentenil csoport, R7 és Y jelentése együttesen egy kötés, és R8 jelentése -S-B-D-glükopiranuronozil-csoport, illetve annak sója a karbonsav funkciónál.
  42. 42. A 35. igénypont szerinti (I) általános képletű vegyületek, ahol R2 jelentése hidrogénatom, R3 és X jelentése együttesen egy kötés, R9 jelentése hidrogénatom, R6 jelentése (III) általános képletű csoport vagy annak sója, amelyben R7 és Y jelentése együttesen egy kötés, R8 jelentése hidrogénatom.
  43. 43. (II) általános képletű vegyületek, ahol
    R1 jelentése cisz-CH=CH~COOH csoport, annak sója, illetve észter-származéka a karbonsav funkciós csoporton, illetve a cisz- vagy transz-CH=CH-COOH csoport amidszármazéka, és r!° jelentése a 35. igénypontban meghatározott.
  44. 44. A 43. igénypont szerinti (II) általános képletű vegyületek, ahol
    141
    R1 jelentése cisz és/vagy transz-2-amido-etenil-
    -csoport, illetve cisz-2-karboxi-etenil-csoport.
HU9400570A 1991-08-28 1992-08-27 Method for the selection of genetically transformed cells HU227979B1 (en)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DK911522A DK152291D0 (da) 1991-08-28 1991-08-28 Fremgangsmaade og kemiske forbindelser
PCT/DK1992/000252 WO1993005163A1 (en) 1991-08-28 1992-08-27 Method for the selection of genetically transformed cells and compounds for use in the method

Publications (3)

Publication Number Publication Date
HU9400570D0 HU9400570D0 (en) 1994-05-30
HUT69606A true HUT69606A (en) 1995-09-28
HU227979B1 HU227979B1 (en) 2012-07-30

Family

ID=8105710

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU9400570A HU227979B1 (en) 1991-08-28 1992-08-27 Method for the selection of genetically transformed cells

Country Status (16)

Country Link
EP (3) EP0601092B2 (hu)
JP (1) JPH06511146A (hu)
AT (2) ATE443771T1 (hu)
AU (1) AU664200B2 (hu)
CA (1) CA2110401C (hu)
CY (1) CY2217B1 (hu)
CZ (2) CZ284828B6 (hu)
DE (2) DE69233771D1 (hu)
DK (2) DK152291D0 (hu)
ES (1) ES2135415T5 (hu)
GR (1) GR3031279T3 (hu)
HU (1) HU227979B1 (hu)
NZ (1) NZ244135A (hu)
RU (1) RU2126834C1 (hu)
SK (1) SK280639B6 (hu)
WO (1) WO1993005163A1 (hu)

Families Citing this family (64)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB9304200D0 (en) * 1993-03-02 1993-04-21 Sandoz Ltd Improvements in or relating to organic compounds
US5994629A (en) * 1991-08-28 1999-11-30 Novartis Ag Positive selection
DE4305295B4 (de) * 1992-03-04 2006-05-18 Volkswagen Ag Kraftfahrzeug mit einem Sitz, der zumindest eine zwischen einer Ruhestellung und einer Betriebsstellung bewegbare Seitenwange besitzt
US5608147A (en) * 1994-01-11 1997-03-04 Kaphammer; Bryan J. tfdA gene selectable markers in plants and the use thereof
MX9707666A (es) * 1995-04-06 1997-11-29 Seminis Vegetables Proceso de seleccion de celulas de planta transgenica.
GB9702592D0 (en) * 1997-02-07 1997-03-26 Danisco Selection method
WO1999002703A1 (en) * 1997-07-07 1999-01-21 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Fumonisin detoxification compositions and methods
US6641996B1 (en) 1997-09-09 2003-11-04 Cambia Microbial β-glucuronidase genes, gene products and uses thereof
US7087420B1 (en) 1997-07-17 2006-08-08 Cambia Microbial β-glucuronidase genes, gene products and uses thereof
US6586658B1 (en) 1998-03-06 2003-07-01 Metabolix, Inc. Modification of fatty acid metabolism in plants
GB9817465D0 (en) * 1998-08-11 1998-10-07 Danisco Selection method
ATE454456T1 (de) 2000-02-11 2010-01-15 Metabolix Inc Intein enthaltende multigen-expressionskonstrukte
JP2004500839A (ja) 2000-04-21 2004-01-15 マーテック・バイオサイエンシーズ・コーポレーション 代謝性遺伝子操作を通しての絶対光栄養藻類の栄養変換
EP1780283A1 (en) * 2000-04-21 2007-05-02 Martek Biosciences Corporation Trophic conversion of obligate photographic algae through metabolic engineering
US7256050B2 (en) 2000-06-16 2007-08-14 Martek Biosciences Corp. High fluorescent intensity cross-linked allophycocyanin
WO2002040690A2 (en) 2000-11-17 2002-05-23 Metabolix, Inc. Production of medium chain length polyhydroxyalkanoates from fatty acid biosynthetic pathways
EP1379659A2 (en) 2001-04-06 2004-01-14 Syngenta Participations AG Oryza sativa nuclear cap binding protein 80
US8022272B2 (en) 2001-07-13 2011-09-20 Sungene Gmbh & Co. Kgaa Expression cassettes for transgenic expression of nucleic acids
NL1019308C2 (nl) 2001-11-06 2003-05-07 Stichting Tech Wetenschapp Werkwijze voor het selecteren van genetisch getransformeerde cellen.
ATE405658T1 (de) 2002-07-26 2008-09-15 Basf Plant Science Gmbh Neue selektionsverfahren
WO2004061122A2 (en) 2002-12-26 2004-07-22 Syngenta Participations Ag Cell proliferation-related polypeptides and uses therefor
CN101001951B (zh) 2004-08-02 2011-06-15 巴斯福植物科学有限公司 分离转录终止序列的方法
EP2166098B1 (en) 2004-10-05 2013-11-06 SunGene GmbH Constitutive expression cassettes for regulation of plant expression
EP1655364A3 (en) 2004-11-05 2006-08-02 BASF Plant Science GmbH Expression cassettes for seed-preferential expression in plants
EP1662000B1 (en) 2004-11-25 2011-03-30 SunGene GmbH Expression cassettes for guard cell-preferential expression in plants
EP1666599A3 (en) 2004-12-04 2006-07-12 SunGene GmbH Expression cassettes for mesophyll- and/or epidermis-preferential expression in plants
EP2072620B1 (en) 2004-12-08 2013-05-08 SunGene GmbH Expression casstettes for vascular tissue-preferential expression in plants
EP1669456A3 (en) 2004-12-11 2006-07-12 SunGene GmbH Expression cassettes for meristem-preferential expression in plants
CA2596600A1 (en) 2005-02-09 2006-08-17 Basf Plant Science Gmbh Expression cassettes for regulation of expression in monocotyledonous plants
CN101128591B (zh) 2005-02-26 2013-02-13 巴斯福植物科学有限公司 用于植物中种子偏好性表达的表达盒
EP2166101B1 (en) 2005-03-08 2012-12-19 BASF Plant Science GmbH Expression enhancing intron sequences
CA2800359A1 (en) 2005-03-16 2006-09-28 Metabolix, Inc. Chemically inducible expression of biosynthetic pathways
WO2006111512A1 (en) 2005-04-19 2006-10-26 Basf Plant Science Gmbh Improved methods controlling gene expression
EP1874938B1 (en) 2005-04-19 2012-04-04 BASF Plant Science GmbH Starchy-endosperm and/or germinating embryo-specific expression in mono-cotyledonous plants
BRPI0614070A2 (pt) 2005-05-10 2018-07-31 Basf Plant Science Gmbh cassetes de expressão, sequência de nucleotídeos isolada, seqüência sintética reguladora de transcrição, métodos para proporcionar uma seqüência sintética de nucleotídeos reguladora de transcrição, e um cassete de expressão, vetor, organismo não-humano ou célula hospedeira transgênico(a), e, célula de planta ou planta transgênica
WO2006136596A2 (en) 2005-06-23 2006-12-28 Basf Plant Science Gmbh Improved methods for the production of stably transformed, fertile zea mays plants
EP1931789B1 (en) 2005-09-20 2016-05-04 BASF Plant Science GmbH Methods for controlling gene expression using ta-siran
CN101631868B (zh) 2007-02-16 2016-02-10 巴斯福植物科学有限公司 用于在单子叶植物中调节胚特异性表达的核酸序列
WO2010102293A1 (en) 2009-03-06 2010-09-10 Metabolix, Inc. Method of positive plant selection using sorbitol dehydrogenase
AU2010270309A1 (en) 2009-07-10 2012-02-02 Basf Plant Science Company Gmbh Expression cassettes for endosperm-specific expression in plants
EP2275564A1 (en) 2009-07-17 2011-01-19 Freie Universität Berlin Means and method for the production of transgenic plants that are resistant to clubroot
US20120174253A1 (en) 2009-09-15 2012-07-05 Nii Patterson Generation of high polyhydroxybutrate producing oilseeds
US20120324603A1 (en) 2009-11-27 2012-12-20 BASF Plant Sceience Company GmbH Chimeric Endonucleases and Uses Thereof
US9404099B2 (en) 2009-11-27 2016-08-02 Basf Plant Science Company Gmbh Optimized endonucleases and uses thereof
WO2011064750A1 (en) 2009-11-27 2011-06-03 Basf Plant Science Company Gmbh Chimeric endonucleases and uses thereof
BR112012013156A2 (pt) 2009-12-03 2017-06-13 Basf Plant Science Co Gmbh cassete de expressão, vetor, célula horpedeira, tecido de planta transgênica e método para a produção de um tecido de planta transgênica
WO2012169893A1 (en) 2011-06-10 2012-12-13 Stichting Technologisch Topinstituut Groene Genetica (Foundation Technological Top Institute Green Genetics) Transcription factor modulating terpene biosynthesis
WO2013014585A1 (en) 2011-07-22 2013-01-31 Basf Plant Science Company Gmbh Plant transformation method
EP2768955A1 (en) 2011-10-19 2014-08-27 Keygene N.V. Methods and compositions for producing drimenol
US20140182011A1 (en) 2011-11-03 2014-06-26 The University Of Hong Kong Methods Using Acyl-Coenzyme A-Binding Proteins to Enchance Drought Tolerance in Genetically Modified Plants
WO2013184768A1 (en) 2012-06-05 2013-12-12 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Compositions and methods of gene silencing in plants
US20150211019A1 (en) 2012-08-13 2015-07-30 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Compositions and Methods for Increasing Pest Resistance in Plants
CN104531656B (zh) * 2015-01-05 2018-02-09 安徽省农业科学院水稻研究所 一种来自小球藻的磷酸甘露糖异构酶基因及其应用
US11174467B2 (en) 2015-04-08 2021-11-16 Yield10 Bioscience, Inc. Plants with enhanced yield and methods of construction
US20190338302A1 (en) 2016-02-04 2019-11-07 Yield10 Bioscience, Inc. Transgenic land plants comprising a putative transporter protein of an edible eukaryotic algae
AU2018224065B2 (en) 2017-02-22 2021-11-11 Yield10 Bioscience, Inc. Transgenic land plants comprising enhanced levels of mitochondrial transporter protein
AU2019335193B2 (en) 2018-09-04 2023-04-20 Yield10 Bioscience, Inc. Genetically engineered land plants that express an increased seed yield protein and/or an increased seed yield RNA
CA3161254A1 (en) 2019-12-16 2021-06-24 Katelijn D'HALLUIN Improved genome editing using paired nickases
CN114846144A (zh) 2019-12-16 2022-08-02 巴斯夫农业种子解决方案美国有限责任公司 将dna或突变精确引入小麦基因组
JP2023525047A (ja) 2020-05-06 2023-06-14 エイジャックス セラピューティクス， インコーポレイテッド Ｊａｋ２阻害薬としての６－ヘテロアリールオキシベンゾイミダゾール及びアザベンゾイミダゾール
EP4267574A1 (en) 2020-12-23 2023-11-01 Ajax Therapeutics, Inc. 6-heteroaryloxy benzimidazoles and azabenzimidazoles as jak2 inhibitors
AU2022388555A1 (en) 2021-11-09 2024-05-02 Ajax Therapeutics, Inc. 6-he tero aryloxy benzimidazoles and azabenzimidazoles as jak2 inhibitors
WO2024158934A1 (en) 2023-01-24 2024-08-02 Yale University Compositions and methods for controlling t-dna copy number in transformed plants
WO2024166076A1 (en) 2023-02-10 2024-08-15 King Abdullah University Of Science And Technology Recombinant production of antimicrobial peptides in planta

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4857467A (en) * 1986-07-23 1989-08-15 Phillips Petroleum Company Carbon and energy source markers for transformation of strains of the genes Pichia
GB8725402D0 (en) * 1987-10-29 1987-12-02 Jefferson R A Gene fusion
GB8626862D0 (en) 1986-11-11 1986-12-10 Jefferson R A Gene fusion
DE3719053A1 (de) * 1987-06-06 1988-12-15 Hoechst Ag Verbesserte nutzung von pflanzenverwertbarem stickstoff durch kulturpflanzen mit ueberexpression der glutaminsynthetase

Also Published As

Publication number Publication date
DK152291D0 (da) 1991-08-28
HU9400570D0 (en) 1994-05-30
RU2126834C1 (ru) 1999-02-27
EP0530129A1 (en) 1993-03-03
CA2110401A1 (en) 1993-03-18
EP0601092A1 (en) 1994-06-15
DK0601092T4 (da) 2007-02-26
EP0601092B1 (en) 1999-07-07
ES2135415T5 (es) 2007-06-01
DE69229556T2 (de) 1999-11-11
GR3031279T3 (en) 1999-12-31
NZ244135A (en) 1995-04-27
SK22294A3 (en) 1994-07-06
AU2556792A (en) 1993-04-05
DE69229556T3 (de) 2007-09-20
ATE443771T1 (de) 2009-10-15
CA2110401C (en) 2006-02-21
CZ292882B6 (cs) 2003-12-17
ATE181963T1 (de) 1999-07-15
DE69229556D1 (de) 1999-08-12
EP0896063B1 (en) 2009-09-23
CZ44494A3 (en) 1994-06-15
DK0601092T3 (da) 2000-02-07
EP0896063A3 (en) 2000-02-09
ES2135415T3 (es) 1999-11-01
EP0601092B2 (en) 2006-11-15
DE69233771D1 (de) 2009-11-05
CZ284828B6 (cs) 1999-03-17
EP0896063B9 (en) 2010-05-26
SK280639B6 (sk) 2000-05-16
HU227979B1 (en) 2012-07-30
EP0896063A2 (en) 1999-02-10
WO1993005163A1 (en) 1993-03-18
JPH06511146A (ja) 1994-12-15
CY2217B1 (en) 2003-04-18
AU664200B2 (en) 1995-11-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP0896063B9 (en) Method for the selection of genetically transformed cells and compounds for use in the method
US5994629A (en) Positive selection
Nehra et al. Genetic transformation of strawberry by Agrobacterium tumefaciens using a leaf disk regeneration system
Nehra et al. Agrobacterium-mediated transformation of strawberry calli and recovery of transgenic plants
RU2170255C2 (ru) Полинуклеотид, способы получения растений, геном растения, клетки, плоды, семена, способы получения семян, применения олигонуклеотида, плазмида, микроорганизм
Kriete et al. Male sterility in transgenic tobacco plants induced by tapetum‐specific deacetylation of the externally applied non‐toxic compound N‐acetyl‐l‐phosphinothricin
Faiss et al. Chemically induced expression of the rolC‐encoded β‐glucosidase in transgenic tobacco plants and analysis of cytokinin metabolism: rolC does not hydrolyze endogenous cytokinin glucosides in planta
Jayashree et al. Genetic transformation and regeneration of rubber tree (Hevea brasiliensis Muell. Arg) transgenic plants with a constitutive version of an anti-oxidative stress superoxide dismutase gene
WO1994020627A1 (en) Mannose or xylose based positive selection
WO2008137985A2 (en) Methods for inducing cotton embryogenic callus
JPH11511116A (ja) 新規な植物ホルモンである５−ブロモインドール−３−酢酸を用いる植物組織およびトランスジェニック植物組織の両方の再生
Momčilović et al. Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation and plant regeneration of four Gentiana species
DE4013099A1 (de) Verfahren zur transformation somatischer embryonen von nutzpflanzen
US6255559B1 (en) Methods for producing genetically modified plants, genetically modified plants, plant materials and plant products produced thereby
JP2001506857A (ja) 単為結実または雌性不稔トランスジェニック植物の生産方法
Mathis et al. Agrobacterium inoculation techniques for plant tissues
Azmi et al. Bud regeneration from Eucalyptus globulus clones and seedlings through hormonal imbalances induced by Agrobacterium tumefaciens strain 82.139
CN1318579C (zh) 一种提高植物有用次生物质含量的基因工程方法
CN113957079B (zh) MtBGLU17基因在调控植物类黄酮合成中的应用
US5840557A (en) Method for producing seeds and plants thereof involving an in vitro step
US8148606B2 (en) Plant body with modified program related to accumulation of storage material and the use thereof
Molina et al. Optimizing the Genetic Transformation of Coffea arabica Using Agrobacterium tumefaciens
Chanprame Modification of vegetable soybean sugar content via gene transformation
Abrie Regeneration and biotransformation of some members of the Cucurbitaceae.
JENN et al. DNA Mediated Gene Tagging Arabidopsis

Legal Events

Date Code Title Description
DGB9 Succession in title of applicant

Owner name: NOVARTIS AG., CH