HU0300369A2 - Multivalent antibodies and uses therefor - Google Patents

Multivalent antibodies and uses therefor Download PDF


Publication number
HU0300369A2 HU0300369A HU0300369A HU0300369A2 HU 0300369 A2 HU0300369 A2 HU 0300369A2 HU 0300369 A HU0300369 A HU 0300369A HU 0300369 A HU0300369 A HU 0300369A HU 0300369 A2 HU0300369 A2 HU 0300369A2
Prior art keywords
Prior art date
Application number
Other languages
Hungarian (hu)
Kathy L. Miller
Leonard G. Presta
Original Assignee
Genentech, Inc.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority to US19581900P priority Critical
Application filed by Genentech, Inc. filed Critical Genentech, Inc.
Priority to PCT/US2001/008928 priority patent/WO2001077342A1/en
Publication of HU0300369A2 publication Critical patent/HU0300369A2/en



    • C07K16/00Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46Hybrid immunoglobulins
    • C07K16/468Immunoglobulins having two or more different antigen binding sites, e.g. multifunctional antibodies
    • A61K39/00Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • A61K45/00Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A61K47/00Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6875Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody being a hybrid immunoglobulin
    • A61K47/6879Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody being a hybrid immunoglobulin the immunoglobulin having two or more different antigen-binding sites, e.g. bispecific or multispecific immunoglobulin
    • C07K16/00Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/00Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2878Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
    • C07K16/00Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2896Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against molecules with a "CD"-designation, not provided for elsewhere
    • C07K16/00Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/32Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against translation products of oncogenes
    • A61K39/00Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C07K2317/00Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55Fab or Fab'
    • C07K2317/00Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/64Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising a combination of variable region and constant region components
    • C07K2317/00Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/00Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/77Internalization into the cell
    • C07K2319/00Fusion polypeptide


A találmány tárgyát génsebészeti módszerekkel létrehozott antitestekképezik, amelyek három vagy több funkcionális antigénkötő helyettartalmaznak. The present invention relates to genetically engineered antibodies are created that are three or more functional antigen binding sites are content. A találmány tárgyát képezik továbbá a találmány szerintiantitesteket kódoló nukleinsavak, az ilyen nukleinsavakat tartalmazóvektorok és gazdasejtek. The invention also relates to nucleic acids encoding szerintiantitesteket the invention, such nucleic acids and host cells tartalmazóvektorok. Szintén a találmány tárgyát képezik atalálmány szerinti antitestek előállítási eljárásai, továbbá eljárásokrendellenesség (például rák) emlősben történő kezelésére, valaminteljárások rákos sejtek elpusztítására. The invention also relates to treatment methods for producing antibodies in this invention tend, to methods disorder (e.g., cancer) in a mammal, and methods of killing cancer cells. Ó HE


• « · • · · • '• · · ·

Ρ03 00369 f Ρ03 00 369 f

Többértékű antitestek és alkalmazásuk A találmány tárgyát génsebészeti módszerekkel létreho-zott antitestek képezik, amelyek három vagy több funkcioná-lis antigénkötő helyet tartalmaznak.'A találmány tárgyátképezik továbbá a találmány szerinti antitestek - pl. Multivalent antibodies and their use The present invention relates to genetically engineered antibodies are estab-in which three or more functional antigen binding sites, epidural tartalmaznak.'A invention also relates to the antibodies of the present invention - eg. terá-piás célú - alkalmazásai. therapeutically-boozer for - applications. A természetben előforduló antitestek (immunglobulinok)két - diszulfid-kötésekkel egymáshoz kapcsolt - nehéz <H)láncból és két könnyű (L) láncból állnak. The naturally occurring antibodies (immunoglobulins) in two - are difficult to <H) chains and two light (L) chains - disulfide linkages coupled to each other. A könnyű láncokciszulfid-kötéssel kapcsolódnak a nehéz láncokhoz. The light láncokciszulfid bonds in heavy chains. Mindkétnehéz lánc egyik végén található egy variábilis dómén (VH),amelyet konstans domének (az antitest-osztálytól függőenhárom vagy négy konstans dómén: CH1, CH2, CH3 és CH4) kö-vetnek. Mindkétnehéz chain at one end a variable domain (V H) which is constant domains (in antibody class depending on the three or four constant domains: CH1, CH2, CH3 and CH4) be traced. Mindkét könnyű lánc egyik végén tartalmaz egy vari-ábilis domént,(VL), másik végén pedig egy konstans domént(CL) . Each light chain has at one end a vari-ABILIS domain (VL) at one end and a constant domain (CL). A könnyű lánc konstans dóménje a nehéz lánc elsőkonstans doménjével (CH1) párban, a könnyű lánc variábilisdoménje pedig a nehéz lánc variábilis doménjével párban he-lyezkedik el (ld. 1. ábra). The light chain constant domain of the heavy chain first constant domain (CH1) pair, the light chain variable domain of the heavy variábilisdoménje while he chain-lyezkedik a pair (see Fig. 1). A könnyű és nehéz lánc variábi-lis dóménjei között bizonyos aminosavak határfelületet ké-peznek [ld. Between the light and heavy chains VARIABEL-lis domains of certain amino acids boundary [see Sa-agreement constitute. pl. eg. Chothia és mtsai.: J. Mól. Chothia et al .: J. Mol. Bioi. Biol. 186, 651(1985); 186, 651 (1985); Ntovotny és Haber: Proc. Ntovotny and Haber, Proc. Natl. Natl. Acad. Acad. Sci. USA 82, 4592 (1985)]. Sci. USA 82: 4592 (1985)].

16075 KB - 2 - A konstans domének közvetlenül nem játszanak szerepetaz antitest antigénhez történő kötődésében, azonban külön-féle effektor-funkciókat töltenek be - pl. 16075 KB - 2 - The constant domains are not involved directly in binding szerepetaz antibody to an antigen, but exhibit separate's effector function - eg. az antitestrészvétele az antitest-dependens celluláris citotoxicitás-ban (ADCC) vagy komplement-dependens citotoxicitásban(CDC). participation of the antibody in antibody dependent cellular cytotoxicity (ADCC) or complement dependent cytotoxicity (CDC). Az egyes könnyű és nehéz láncokból álló párok variá-bilis doménjei közvetlenül szerepet játszanak az antitestantigénhez történő kötődésében. consisting of individual light and heavy chains pair variations are contemplated bilis domains directly involved in binding to the antitestantigénhez. A természetben előfordulókönnyű és nehéz láncok variábilis doménjei általános szer-kezete megegyezik: mindegyik négy vázrégiót (FR) tartalmaz,melyek szekvenciái bizonyos mértékben konzerváltak. The naturally occurring light and heavy chain variable domains of agent cowling identical: each comprise four framework regions (FR) for which sequences are conserved to some extent. A négyvázrégiót három komplementaritást meghatározó régió (CDR)kapcsolja össze [ld. The négyvázrégiót determining region (CDR) connected by three complementarity [see. Kábát és mtsai.: "Sequences ofProteins of Immunological Interest", National Institutes ofHealth, Bethesda, MD (1991)]. Kabat et al .: "Sequences ofProteins of Immunological Interest," National Institutes ofHealth, Bethesda, MD (1991)]. A négy vázrégió β-redős kon-formációt vesz fel, és a komplementaritást meghatározó ré-giók a β-redős szerkezethez kapcsolódó - bizonyos esetekbenannak részét képező - hurkokat alkotnak. The four framework assumes β-sheet formation concentrates and particle giók associated complementarity determining the β-sheet structure - form loops - in some cases forming part thereof. Az egyes láncokbana komplementaritást meghatározó régiókat az FR-régiók tart-ják szoros közelségben, és - a másik lánc komplementaritástmeghatározó régióval - hozzájárulnak az antigénkötő hely kialakulásához. determining the individual chains bana CDRs, the FR-holds-Jak regions in close proximity, and - the other chain komplementaritástmeghatározó region - contribute to the formation of the antigen binding site. A 2/A-2/E ábrákon a természetben előforduló öt fő im- munglobulin-izotípus szerkezetét mutatjuk be. A 2 / A-2 / E drawings shows a structure of the naturally occurring immune munglobulin five major isotypes. Az IgG-, IgD-és IgS-immunglobulin csak két antigénkötó helyet tartalmaz,míg az IgA és IgM nagyobb kötőértékű polimer struktúráklétrehozására képes. Values ​​for IgG, IgD and IGS immunoglobulin contains only two antigen binding sites, while IgA and IgM higher bonding ability of the polymer to create structures.

Az IgM-et a plazmasejtek pentamer alakban • · · - 3 - szekretálják, melyben öt monomer-egységet - C-terminális(Cg4/Cp4) doménjeiket és Cp3/Cp3-doménjeiket egymáshoz kap-csolva - diszulfid-hidak tartanak össze. The IgM plasma cells in a pentameric form • · - 3 - secreted in which five monomeric units - together get csolva C-terminal (Cg4 / CP4) domains thereof and CP3 / CP3 domains thereof - disulfide bridges held together. A pentamerben azöt monomer úgy rendeződik el, hogy Fc-régióik a pentamerközepén, a tíz antigénkötő hely pedig a molekula perifériá-lis részén helyezkedik el. The pentameric monomer Since then they settled in to Fc regions, the ten antigen binding sites are located in the periphery of the molecule pentamerközepén lis. Mindegyik pentamer tartalmaz egytovábbi, Fc-régióhoz kapcsolódó polipeptidet is, melyet J("joining"; kapcsoló) láncnak is nevezünk. Pentamer each comprising a further related Fc region polypeptide that J ( "joining"; switch) is also called chain. Ez a J-lánc atíz μ-lánc közül kettő C-terminális ciszteinjéhezdiszulfid-kötéssel kapcsolódik. This chain J-μ-chain of linked atíz two C-terminal ciszteinjéhezdiszulfid bond. Úgy tűnik, a J-lánc az IgM-monomerek pentamerré történő polimerázicójához szükséges; It seems necessary polimerázicójához the J chain of IgM pentamer monomers; amolekulához közvetlenül a pentamer szekréciója előtt kap-csolódik. amolekulához are attached directly to the front pentamer secretion. Egy IgM-molekula tíz kisméretű haptén-molekulátképes megkötni, azonban - térbeli gátoltság miatt egyidejű-leg csak öt nagyobb méretű antigénhez kötődhet. An IgM molecule ten small hapten molecule can bind, but - at the same time, most bind only five large antigen due to steric hindrance. A pentamerIgM nagyobb értékűsége növeli az olyan sokdimenziós antigé-nekhez való kötődési képességét, mint pl. The higher value of pentamerIgM increases its ability to bind to a multidimensional antigens benzazepines like. a vírusrészecskékvagy a vörösvértestek. the virus particles and the red blood cells.

Az IgA főként monomerként létezik, de polimer alakjai{pl. IgA exists mainly as monomers but polymeric forms thereof {eg. dimerek, Primerek, ritkábban tetramerek) is ismerete-sek. dimers, Primers, rarely tetramers) is knowledge-shek. A kiválasztott IgA dimer vagy tezramer, amely J-láncpolipeptidet és - szekréciós komponensnek nevezettpolipeptid-láncot is tartalmaz. The selected dimeric IgA or tezramer which J láncpolipeptidet and - contains secretory component nevezettpolipeptid-chain. A monoklonális antitestek (különösen a rágcsálókból,pl. egerekből származó antiteste) alkalmazása széles körbenelterjedt, annak ellenére, hogy emberekben gyakranantigénhatásűak. The use of monoclonal antibodies (particularly rodents, eg. antibodies from mice) are widely spread, despite the fact that humans gyakranantigénhatásűak. Például, a rágcsálóeredetű monoklonálisantitestek klinikai alkalmazásának egyik fő korlátja a te- • · · · · · • I ♦ ····· • · ··· ··· · ··· • ·»· · ,ί,, · . For example, the murine monoclonal antibody to the clinical use of one of the main limitations of TE • · · · · · · • • I ♦ ····· ··· ··· ··· • · · »· · · ί ,,. * - 4 - rápia során jelentkező anti-globulin reakció [Miller ésmtsai.: Blood 62, 988 (1983); * - 4 - Rapid occur during anti-globulin response [Miller ésmtsai .: Blood 62, 988 (1983); Schroff és mtsai.: Cancer Rés. Schroff et al .: Cancer Res. 45, 879 (1985)]. 45, 879 (1985)]. E problémát korábban "kimérikus" antitestek létrehozá-sával kisérleték meg leküzdeni. This problem has been overcome by a pilot "chimeric" antibodies estab-Saval. Az ilyen kimérikus antites-tekben egy humán antitest konstans doménjéhez állati erede-tű antitest antigénkötő variábilis doménje van kapcsolva[4 816 567 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírás(Cabilly és mtsai.); Such chimeric your mind the antibodies, a human antibody constant domain of animal origin needle antibody antigen-binding variable domain is coupled [U.S. Patent No. 4,816,567 (Cabilly et al.); Morrison és mtsai.: Proc. Morrison et al .: Proc. Natl. Natl. Acad.Sci. Acad. USA 81, 6851 (1984); USA 81: 6851 (1984); Boulianne és mtsai.: Natúré 312,643 (1984); Boulianne et al, Nature 312.643 (1984) .:; Neuberger és mtsai.: Natúré 314, 268 (1985)]. Neuberger et al .: Nature 314, 268 (1985)]. Ahumán konstans régió izotípusa úgy választható meg, hogy a kimérikus antitestet ADCC és CDC reakcióban történő részvé-telhez lehessen kialakítani [ld. Ahumán isotype constant region may be chosen so that the chimeric antibody may be constructed participation in CDC and ADCC-telhez reaction [see Fig. pl. eg. Brüggermann és mtsai.:J. Bruggemann and mtsai.:J. Exp. Med. 166, 1351 (1987); Exp. Med. 166: 1351 (1987); Riechmann és mtsai.: Natúré332, 323 (1988); Riechmann et al .: Natúré332 (1988) 323; Lőve és mtsai.: Methods in Enzymology 178,515 (1989); Love et al .: Methods in Enzymology, 178.515 (1989); és Bindon és mtsai.: J. Exp. Med. 168, 127 (1988)]. and Bindon et al .: J. Exp. Med. (1988)], 168, 127th Jellemző miódon, az ilyen kimérikus antitestek kb.egvharmad részben tartalmaznak rágcsálóeredetű (vagy más,nem emberből származó) szekvenciát, így emberekben jelentősmértékű anti-globulin reakciót képesek kiváltani, például,az OST3 egéreredetű anti-CD3 antitest esetében, a jelentke-ző anti-globulin reakciók többsége a variábilis régió el-len, s nem a konstans régió ellen irányul [Jaffers ésmtsai. Typical what old, such chimeric antibodies kb.egvharmad partially contain rodent (or another from a non-human) sequence, and thus are capable of a significant human anti-globulin response eliciting such as, for OST3 murine anti-CD3 antibody, the jelentke-forming anti- globulin majority of reactions against the variable region, and not directed against the constant region [Jaffers ésmtsai. : Tramsplantation 41, 572 (1986)]. : Tramsplantation 41, 572 (1986)].

Az antitestek antigénkötő funkcióinak megoldása és azidegen eredetű (heterológ) szekvenciák humán antitestekbentörténő alkalmazásának minimálisra csökkentése céljából • · • · · « · · · · • a > · · · · ·« ··« ··· · • · · · · ·· · ·«·«·*····*· - 5 - order to resolve the antigen binding functions of antibodies and to minimize the (heterologous) sequences azidegen derived human antibodies and hints for the application of • · • · «· · • a> · · · · ·" ·· "··· · • · · · · · · · · «·« · * * · ···· - 5 -

Winter és mtsai. Winter et al. [Jones és mtsai.: Natúré 321, 522 (1986); [Jones et al .: Nature 321, 522 (1986);

Riechmann és mtsai.: Natúré 332, 323 (1988); Riechmann et al .: Nature 332, (1988) 323; és Verhoeyenés mtsai.: Science 239, 1534 (1988)] humán antitest megfe-lelő szakaszait rágcsálóeredetű komplementaritást meghatá-rozó régiókkal vagy CDR-szekvenciákkal helyettesítették. Verhoeyenés and al .: Science 239, 1534 (1988)], human antibody-priate replaced corresponded phases murine complementarity decisive set-regions or CDR sequences. E megközelítési mód gyógyászati lehetőségeit aCAMPATH-1 antigénre specifikus humanizált antitest két nem-Hodgkin-limfomás páciens esetében tapasztalt klinikai haté-konysága támasztja alá, mely páciensek egyikében korábban akiindulási patkányeredetű antitest ellen anti-globulin re-akció alakult ki [Riechmann és mtsai.: Natúré 332, 323 (1988); therapeutic possibilities of this approach is supported by aCAMPATH-1 antigen-specific humanized antibody, two seen in non-Hodgkin's lymphoma patient clinical efficacy of that anti-globulin re-action was formed in one of the patient against previously The starting rat antibody [Riechmann et al .: Nature 332, 323 (1988); Halé és mtsai.: Láncét [L, 1394 (1988)]. If juice and al .: Chain Of [L, (1988) 1394].

Bizonyos esetekben a nagy antigénkötő affinitás bizto-sításához elegendő, ha a humán vázrégiók (FR-régiók) közöt-ti elhelyezkedő humán komplementaritást meghatározó régió-kat (CBR-régiókat) rágcsálóeredetű antitestekből származókomplementaritást meghatározó régiókkal helyettesítjük[Jones és mtsai.: Natúré 321, 522 (1986); In some cases, the high antigen binding affinity sufficient to provide, chopping, when the human framework regions (FRs) square five-ti situated human complementarity replaced determining regions (CBR regions) murine antibodies származókomplementaritást determining regions [Jones et al .: Nature 321 522 (1986); Verhoeyen és mtsai.: Science 239, 1534 (1988)], más esetekben azonban egy FR-régió [Riechmann és mtsai.: Natúré 332, 323 (1988)]vagy több FR-régió helyettesítésére is szükség volt [Queenés mtsai.: ?roc. Verhoeyen et al .: Science 239, 1534 (1988)], but in other cases it may be substituted for the FR-region [Riechmann et al .: Nature 332, 323 (1988)] or more FRs were necessary [Queenés al .:? roc. Natl. Natl. Acad. Acad. Sci. USA 86, 10029 (1989); Sci. USA 86: 10029 (1989); ld. ld. még Co és mtsai.: Proc. also Co et al .: Proc. Natl. Natl. Acad. Acad. Sci. USA 88, 2869 (1991); Sci. USA 88, 2869 (1991); 5 821 337 számú egyesült államokbeli szabadalmi le-írás (Carter és mtsai.); U.S. Patent off-specification No. 5,821,337 (Carter et al.); és 5 530 101 számú egyesültállamokbeli szabadalmi leírás (Queen és mtsai.)]. and U.S. Patent No. 5,530,101 (Queen et al.)]. Az anti-testek humanizálására vonatkozó további leírásokat illetően ld. Further descriptions of the anti-bodies regarding the humanization see. Germán és mtsai.: Proc. Gorman et al .: Proc. Natl. Natl. Acad. Acad. Sci. USA 88, 4181 - 6 - (1991);Daugherty és mtsai.: Nucleic Acids Research 19(9), Sci. USA 88, 4181-6 - (1991); Daugherty et al .: Nucleic Acids Research 19 (9);

2471 (1991); 2471 (1991); Brown és mtsai.: Proc. Brown et al .: Proc. Natl. Natl. Acad. Acad. Sci. USA 88, 2663 (1991); Sci. USA 88, 2663 (1991); és Junghans és mtsai.: Cancer Research 50, 1495 (1990)]. and Junghans et al .: Cancer Research 50 (1990) 1495]. A HAMA-reakciók (egéreredetű antitestek elleni humánantitestek okozta reakciók) elkerülése érdekében a betege-ket - a kimérikus/humanizált antitestek helyett - humán an-titesttel is kezelhetjük. To prevent HAMA response (human antibodies against mouse antibody reactions caused by) the patient-s - may be treated with anti-human titesttel can - instead of a chimeric / humanized antibodies. A humán antitestek létrehozásánakszámos technikája ismeretes. The technique of creating a number of human antibodies are known. A humán antitestek tágon való megjelenítési (fág-"displav") technika alkalmazásával szelektálhatok. using a display (phage "displav") technique in human antibodies Tago be selected. Afégfelületen való megjelenítési technikát humán antitestekimmunizálatlan donorból történő szelektálásához adaptálták[Marks és mtsai.: J. Mól. visualization technique Afégfelületen adapted to select for a human donor antitestekimmunizálatlan [Marks et al .: J. Mol. Bioi. Biol. 222, 581 (1991)]. 222, 581 (1991)]. E megkö-zelítési mód szerint humán perifériás vér limfocitáibólszármazó mRNS-ből polimeráz-láncreakcióval amplifikálják avariábilis domének génjeit. According to this method that approaches, human peripheral blood zelítési limfocitáibólszármazó mRNA avariábilis domain genes amplified by PCR. A polimeráz-láncreakciót olyanláncindító oligonukieotidok alkalmazásával kell végezni,amelyek lehetővé teszik, hogy mind az IgG, mind az IgM ne-héz láncából, illetve mind a κ-, mind a λ-láncbólamplifikálódjon DNS. The polymerase chain reaction must be carried out using oligonucleotides as primers which make it possible to both IgG and IgM do not offer chain of κ- or both, and the λ-DNA láncbólamplifikálódjon. Ezeket a géneket azután véletlenszerű-en kombinálják, és az M13-fág III. These genes are then combined via random, and M13 phage III. gén kódolta burokprote-injéhez fuzionálva egyláncú Fv-fragmensként (scFvjexpresszáltatják. Egy adott antigén elleni humán antitestekszaporítási és - az adott antigénhez (pl. immobilizált an-tigénhez) történő kötődés alapján végzett - szelektálás!lépésekkel azonosíthatók [ld. Griffiths és mtsai.: EMBO J. 12, 725 (1993)]. 7 • ···· ·« · * ·*• · ····«<·· ··· ·«· · · ·'• · · · · · · • · ·« ·« ···· · · gene encoded fused burokprote-injection of a single chain Fv fragment (scFvjexpresszáltatják against a particular antigen of human antibodies propagation and -. performed by binding to the specific antigen (eg immobilized antigen) -.!. grading identifiable steps [see Griffiths et al .: EMBO J. 12, 725 (1993)]. • ···· 7 · «* · · · * • ····" <··· ·· · «· · '• · · · · · · • · «· '···· · ·

Klónozott humán VH-génszakaszokból "szintetikus" fág-antitest gyűjteményeket is létrehoztak. Cloned human VH génszakaszokból "synthetic" phage antibody created collections. Először mind a 49szegmenssel egy rövid, öt vagy nyolc random aminosavat tar-talmazó H3-hurok alkalmazásával egy 2 x 107 kiónt tartalma-zó gyűjteményt hoztak létre, és ezt egy fix könnyű lánccalegyesítették [Hoogenboom és mtsai.: J. Mól. First of all 49szegmenssel a short, eight or five random amino acid residues in a content of 2 x 107 clones were generated using a single-punch collection tar talmazó H3 loop, and that a fixed light lánccalegyesítették [Hoogenboom et al .: J. Mol. Bioi. Biol. 227, 381(1992)]. 227, 381 (1992)]. A különböző (legfeljebb 12 aminosavas) hosszúságúH3-hurkok sorozatának alkalmazásával olyan könyvtárat hoz-tak létre, amelyből több, mint húsz kötőspecifitásból állósorozat szelektálható [Winter és mtsai.: Tűin. The use of various (up to 12 amino acid) sequence of a library hosszúságúH3 loops to-tak created, of which more than twenty kötőspecifitásból resistant selectable series [Winter et al .: TUINEN. Rév. Port. Immuno.12, 433 (1994)]. Immuno.12, 433 (1994)]. A humán antitest komplementaritást megha-tározó régióinak randomizálásával egyetlen antitest vázré-giójéból egyéb szintetikus könyvtárakat is létrehoztak [ld.Garrard és Henner: Gene 128, 103 (1993)]. The human antibody-reservoir complementarity defined regions of randomized single synthetic antibody libraries have also developed other frame-giójéból [ld.Garrard and Henner, Gene 128, 103 (1993)]. Az ilyen szinte-tikus fág-antitest gyűjteményekből származó antitesteketszintén "humán" antitesteknek tekintjük. Such-synthetic phage antibody collections from antitesteketszintén considered "human" antibodies. A kis affinitású "elsődleges" fág-antitestek affinitá-sa fégon való megjelenítési technika alkalmazásával javít-ható. The low affinity "primary" phage antibodies may be improved, using a technique to display affinities sa fégon. Az egyik lehetőség a lánc-kombinálási ("chain-shuffling") stratégia alkalmazása, melynek során a VH-doménr állandóként tartjuk, majd a VL-gének eredeti könyv-tárával rekombináljuk, és immobilizált antigénhez történőkötődés alapján kiszelektáljuk a szorosan kötődőket. One possibility is the chain combining ( "chain shuffling") strategy application, keeping the VH doménr constant whereby and VL genes are recombined original book storage of and immobilized antigen are selected by the closely kötődőket basis történőkötődés. Ezt aciklust az új VL-domén fixálásával megismételjük, és ezt azeredeti VH-könyvtárral rekombináljuk [Marks és mtsai.:Bio/Technology .10, 779 (1992)]. This aciklust repeated by fixing the new VL domain, and this azeredeti VH library recombined [Marks et mtsai.:Bio/Technology .10, 779 (1992)]. Más módon, az elsődleges antitestbe "error-prone" polimeráz-Iáncreakcióval pont-mutéciók iktathatok be, és a nagyobb affinitású kötőmoleku- • ·· · • « • · ······ ·· ··· ··· · ······· · · · · * t · ··· ·· ···· ·· - 8 - Iák fágon való megjelenítési technikával szelektálhatok[Gram és mtsai.: Proc. Alternatively, the primary antibody "error-prone" polymerase chain reaction-point mutéciók may be included in, and the greater affinity kötőmoleku- ·· • · • '• · · · · · · · · · ·· ······ ······ · · · · · t * ···· ··· ·· ·· - 8 - phage-display techniques are contemplated to be selected [Gram et al .: Proc. Natl. Natl. Acad. Acad. Sci. USA 89, 3576 (1992) ] . Sci. USA 89: 3576 (1992)].

Humán antitesteket előállíthatunk oly módon is, hogyhumán antitestek termeltetése céljából genetikailag manipu-lált egereket immunizálunk. Human antibodies are produced by, with a view to production of human antibodies genetically manipulate busy-immunized mice. Súlyos kombinált immunhiányos(SCID) egerek a rekombináz-gén defektusa miatt nem képeseksaját immunglobulinjaik termelésére. Severe combined immunodeficient (SCID) mice, the recombinase gene is not capable of producing immunoglobulins due to its defect. Ilyen egerekben humánperifériás vér limfocitáinak (PBL) átültetésével több kuta-tócsoportnak is sikerült működőképes humorális immunrend-szert regenerálnia. Such mice could regenerálnia functional humoral immune system agent, several wells tócsoportnak in human peripheral blood lymphocytes (PBL) transposition. Az ilyen hu-PBL-SCID-egerek antigénnelvégzett immunizálást követően humán antitestek termelteté-sére alkalmazhatók [Duchosal és mtsai.: Natúré 355, 258 (1992)]. Following such hu-PBL-SCID mice immunized antigénnelvégzett useful human antibodies are produced in-THEM [Duchosal et al .: Nature 355, 258 (1992)]. Egy másik megközelítési mód szerint az egerekben akönnyű és nehéz láncokat kódoló géneket kiiktatják, majd -humán nehéz és könnyű lánc géneket tartalmazó, nagy méretűDNS-szekvenciékkal manipulált - mesterséges élesztőkromo-szómákat (YAC) juttatnak beléjük. In another approach, the genes encoding eliminate akönnyű and heavy chains in mice, then -human containing heavy and light chain genes manipulated high-méretűDNS szekvenciékkal - élesztőkromo emulsions, liposomes, artificial (YACs) allocated to them. Az így létrehozott "xeno-egerek" adott antigénnel végzett immunizálás hatására képe-sek humán antitesteket termelni (ld. 5 434 340; 5 591 699;5 569 625; 5 545 8C6 és 5 545 807 számú egyesült államok-beli szabadalmi leírások). upon immunization with the "xeno-mice" given antigen thus produced image-sek-human antibodies are produced (see 5,434,340;. 5,591,699; 5,569,625; 5,545 8C6 and 5 No. 545,807 U. S. Patents).

Humán raonoklonáiis antitestek a kívánt antitestet ter-melő humán B-limfociták immortalizélásával is létrehozha-tók. Raonoklonáiis human antibodies of the desired antibody is ter-lactam producing human B-lymphocytes immortalizélásával létrehozha-frame. Az emberek - aktivált humán B-limfociták előállításacéljából végzett - immunizálásával kapcsolatos etikai kifo-gások a humán limfoeiték in vitro immunizálásával küszöböl-hetek ki. People - with activated human B lymphocytes producing steel Approximately - ethical objections-related serious risk to the immunization of human lymphoid vitro immunization eliminates out-I. In -.ítro sikerrel immunizáltak humán perifériás • ·· · ·· - 9 - •·* * ··• · ·« «·«· ·· vérből származó limfocitákat [Borrebaeck és mtsai.: Proc.Natl. In -.ítro successfully immunized human peripheral • · ·· ·· - 9 - * • * · · · ·· • «« · «· ·· lymphocytes from blood [Borrebaeck et al .: Proc. Acad. Acad. Sci. USA 85, 3995 (1998)], illetve humán lép-sejteket [Boerner és mtsai.: J. Immunoi. Sci. USA 85: 3995 (1998)] or human spleen cells [Boerner et al .: J. Immunol. 147, 86 (1991)].Fúziós partnerként egér-humán heterohibrid alkalmazásávalsikerült javítani a humán hibridóma-technológiát (Boerner és mtsai., ld. fentebb). 147, 86 (1991)]. A fusion partner for mouse-human hetero-hybrid applications could be improved by the human hybridoma technology (Boerner et al.., Supra).

Antitest-változatok Antibody Variants

Az antitestek antigénkötő értékűségük javítása érdeké-ben módosításoknak vethetők alá. Improving the value of their antigen-binding antibodies can be subjected to modifications in our interest. Például, Ghetie és mtsai. For example, Ghetie et al. tumor-reaktív monoklonális (anti-CD19, anti-CD20, anti-CD21, anti-CD22 és anti-HER2) antitestek homodimereit hoz-ták létre oly módon, hogy IgG-párok közé - kémiai úton, kétheterodifunkciós keresztkötő reagens alkalmazásával - tioéter-kötéseket iktattak be [Ghetie és mtsai.: Proc. tumor-reactive monoclonal (anti-CD19, anti-CD20, anti-CD21, anti-CD22 and anti-HER2 antibodies) homodimereit to resins set such that IgG pairs include - chemically using kétheterodifunkciós crosslinker - thioether They were inserted bonds [Ghetie et al .: Proc.

Natl. Natl. Acad. Acad. Sci. USA 94, 7509 (1997); Sci. USA 94: 7509 (1997); WO 99/02567 számú nemzetközi közzétételi irat]. WO 99/02567 international patent discloses]. Wolff és mtsai. Wolff et al. [CancerResearach 53, 2560 (1993)] szintén kémiai kapcsolással, heterodifunkciós keresztkötők alkalmazásával IgGmonoklonális antitest (CHÍBR96) homodimerét hozták létre,amely csupasz egerekben javított tumcrellenes aktivitást mutatott. [CancerResearach 53, 2560 (1993)] also by chemical coupling, created IgGmonoklonális Antibody (ChiBR96) using heterobifunctional cross-linkers homodimer that showed improved activity tumcrellenes nude mice.

Shopes és mtsai. Shopes et al. egy humán IgGl nehéz lánca C-terminélisénak közelében elhelyezkedő szerint (Ser444) cisz-teinnel helyettesítettek. near a human IgGl heavy chain C terminélisénak located by (Ser444) substituted cysteine. A Cys444-gyökök között kialakult,molekulán belüli diszulfid-hidak az immunglobulin-párokat"farok-farokhoz" pozícióban egymáshoz kapcsolva kovalens • «« · • · · · ♦ - 10 - • ··· ·· ·«·· ·· dimereket eredményeztek (H2L2) . formed between Cys444 residues, intramolecular disulfide bonds of the immunoglobulin pairs are connected to each other "tail-tail" position covalent • «« • · · · · ♦ - 10 - • ··· ·· · «·· ·· dimers They resulted (H2L2). Az anti-dansyl dimerek ahaptént hordozó vörösvértestek antitest-dependens komple-ment-közvetítette citolízisében hatékonyabbnak bizonyultak,mint a monomer humán IgGl [Shopes és mtsai.: J. Immunoi.148(9), 2918 (1992); The anti-dansyl dimers ahaptént carrier erythrocytes were more effective antibody dependent comple-ment-mediated cytolysis, such as the monomeric human IgGl [Shopes et al .: J. Immunoi.148 (9), 2918 (1992); és WO 91/19515 számú nemzetközi közzé-tételi irat]. and WO 91/19515, PCT International Publication, discloses]. Ezt a - ciszteinek beiktatását magában fogla-ló - megoldást használták a CAMPATH-lH-antitest homodimeralakjának létrehozásához is. This - includes enactment of cysteines horse - a solution used in the H-antibody CAMPATH-homodimeralakjának create. A homodimer CAMPATH-1H-antitest az antigént kis mennyiségben termelő célsejtek al-kalmazása esetén javított lízist mutatott, az antigént nagymennyiségben termelő sejtek lízisénél azonban nem tapasz-taltak javulást [Greenwood és mtsai.: Ther. The homodimeric CAMPATH-1H antibody producing target cells associated with the sub-biotics showed improved lysis small amounts of antigen, however lízisénél of producing large quantities of cells in an antigen non-oriented patch improvement [Greenwood et al .: Ther. Immunoi. Immunol. _1, 247(1994)]. _1, 247 (1994)]. Cáron és mtsai. See Caron et al. [J. [J. Exp. Med. 17 6, 1191 (1992)]genetikailag manipulált CD33-antitestet írtak le, amelyneknehéz lánca 444. pozíciójában lévő szerint ciszteinnel he-lyettesítették, miáltal az IgG C-terminálisánál láncközidiszulfid-híd kialakulását tették lehetővé. Exp. Med. 17 6: 1191 (1992)] Genetically engineered CD33 antibodies have been described by in amelyneknehéz chain 444th position of cysteine ​​he-lyettesítették whereby the IgG C-terminal of enabled formation láncközidiszulfid bridge. A homodimer IgGaz eredeti TgG-hez hasonló aviditásúnak bizonyult, de aleukózis célsejtek vonatkozásában javított internalizációsképességűnek és radioaktív izotópot megtartó képességűnektűnt, és hatékonyabb volt a leukózis sejtek komplement-közvetítette elpusztításában és az antitest-dependenscelluláris citotoxicitásban (humán effekforok alkalmazásá- val ) . The homodimeric IgGaz original TGG With proved comparable avidity, but improved internalizációsképességűnek and radioisotope retention képességűnektűnt and was more effective in leukemia cells, complement-mediated killing and antibody-dependenscelluláris cytotoxicity (human effekforok alkalmazásá- val) aleukózis target concerned.

Coloraa és Marxison [Natúré Biotech. Colorao and marxist [Nature Biotech. .15, 159 (1997)]négyértékű, bispecifikus antitestet írtak le, amelyet egy-láncú anti-dansyl Εν-antitestet (scFv) kódoló DNS-nek azanti-oansyl IgG3 antitest C-terminálisa vagy csukló-régiója - 11 - ·« ·« ** » · · · · ··« · ·»· • · · «· ··*· «Ί ("hinge") után történő fuzionáltatásával hoztak létre (CH3-scFv, illetve Hinge-scFv; ld. még WO 95/09917 számú nemzet-közi közzétételi irat). .15, 159 (1997)] tetravalent, bispecific antibodies have been described, that single chain anti-dansyl Εν antibody (scFv) encoding DNA azanti-oansyl IgG3 antibody C-terminus or hinge region of - 11 - · «· «**» · · ·· «·» · · · • «* · ·· ·« after Ί ( "hinge") has been developed by fusing (CH3 scFv or scFv-hinge;. see also WO No. 95/09917 discloses inter-nation). Smith és Morrison génmanipulációsmódszerekkel, (1) egy IgM nehéz lánca 414. ciszteinjének; Smith and Morrison génmanipulációsmódszerekkel (1), an IgM heavy chain cysteine ​​414; (2) egy IgM nehéz lánca 575. ciszteinjének vagy (3) mind a 414., mind az 575. cisztein IgG3 nehéz lánc génbe történőbeiktatásával - mu-szerű IgG3 három változatát hozták lét-re. (2) IgM heavy chain gene történőbeiktatásával a 575th cysteine ​​or (3) both the 414th and 575th cysteine ​​of the heavy chain IgG3 - were three variants of mu-like existence IgG3 away. Mindhárom mutáns konstrukciót Sp2/0-sejtekbenexpresszáltatták, és legfeljebb hat H2L2-alegységet tartal-mazó polimerekké alakították. All three mutant constructs of Sp2 / 0 cells has been expressed, and at most six H2L2 subunit formed comprise using polymers. Az így létrehozott "IgM-szerű" IgG-polimerek az IgG Fc-gamma-receptort kötő tulaj-donságéval és az IgM hatékonyabb komplement-aktivitásávalegyaránt rendelkeznek [ld. The "IgM-like" polymers thus produced have IgG IgG Fc-gamma-receptor binding owner donságéval and IgM effective complement activity of a Arano [ld. Smith és Morrison:3io/Technology 12, 683 (1994)]. Smith and Morrison 3io / Technology 12, 683 (1994)].

Shuford és mtsai. Shuford et al. transzfektált myeloma-sejtvonalbólStreptococcus B-csoport elleni humán IgGl antitest-oligomert izoláltak [Shuford és mtsai.: Science 252, 724(1991)]. against transfected human IgGl myeloma sejtvonalbólStreptococcus Group B oligomer isolated antibody [Shuford et al .: Science 252 (1991) 724]. Immunkémiai analízissel és DNS-szekvenálással ki-mutatták, hogy a sejtvonal egyaránt term.elte a normál kappakönnyű láncot és egy 37 kD-os VVC könnyű lánc változatot(L37). Immunochemistry and DNA sequencing analysis, it showed that the normal term.elte kappakönnyű chain and a 37 kDa light chain VVC version (L37) in both cell lines. A nehéz láncot és az L37-láncot kódoló vektorokkalvégzett együttes transzfekció oligomer IgG termelődéséteredményezte. carried out in co-transfection vectors encoding the heavy chain of the oligomer chain L37-IgG termelődéséteredményezte.

Az 5 641 870 számú egyesült államokbeli szabadalmi le-írásban (Rinderknecht és mtsai.) kétértékű, lineárisF(ab' ) 2-fragmenst írtak le, amelyek - könnyű lánccal együttszekretélódó - nehéz lánc fragmens tandem ismétlődéseit(VK-CH1-VH-CH1) tartalmazzák. No. 5,641,870 U.S. Pat-writing (. Rinderknecht et al) divalent lineárisF (ab ') 2 fragments have been described - együttszekretélódó light chain - heavy chain fragment tandem repeats (VK-CH1-VH-CH1) They included. A CHl-régió C-terminálisa 1»^· ·< ·*· • « · » « · · • » ··· ··· · ···« · · · • ··· ·'ί ··-· ·· - 12 - kapcsolószekvencia nélkül, közvetlenül a VH-régióhoz kap-csolódik. The CHI-region C-terminus of one »^ · · <· · • *« · »« • · »· ··· ··· ···" · · · · · · · • '··· ί ·· - 12 - without switching sequence of the VH region directly it is attached.

Az antitest-változatokkal kapcsolatos további publiká-ciók a következők: WO 00/06605 számú nemzetközi közzétételi irat; further publishing-tions regarding the antibody variants include: WO 00/06605 international patent publication pamphlet; 5 591 828, 5 959 083 és 6 027 725 számú egyesült No. 5,591,828, 5,959,083 and 6,027,725 United

államokbeli szabadalmi leírások; U.S. patents; WO 98/58965 számú nemzet-közi közzétételi irat; No. WO 98/58965 discloses inter-nations; WO 94/13804 számú nemzetközi közzé-tételi irat; WO 94/13804, PCT International Publication, discloses, Tutt és mtsai.: J. Immunoi. Tutt et al .: J. Immunol. 147, 60 (1991); 147, 60 (1991); WO 99/37791 számú nemzetközi közzétételi irat; No. WO 99/37791 International Publication pamphlet; 5 989 830 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírás; U.S. Patent No. 5,989,830; WO 94/13804 számúnemzetközi közzétételi irat; No. WO 94/13804 International Publication pamphlet; EP 628 078B1 számú európai szabadalmi leírás; EP 628 078B1 European patent; WO 97/14719 számú nemzetközi közzétételi irat és Stevenson és mtsai.: Anti-Cancer Drug Design 3, 219 (1989) . WO 97/14719 international patent discloses and Stevenson et al .: Anti-Cancer Drug Design 3: 219 (1989).

Az ErbB receptor tirozin kinázok a sejtszaporodás, The ErbB receptor tyrosine kinases in cellular proliferation,

-differenciáció és -túlélés fontos mediátorai. differentiation and survival are important mediators. A receptorcsalád négy tagból áll, melyek a következők:epidermélís növekedési faktor receptor (EGFR vagy ErbBl);EER2 (Erb82 vagy pl85neu) ; The receptor family includes four distinct members including: epidermélís growth factor receptor (EGFR or erbbl) EER2 (Erb82 or pl85neu); HER3 (ErbB3); HER3 (ErbB3) és HER4 (Erb4 vagytyrc2). and HER4 (ErbB4 vagytyrc2).

Az erbBl-gén által kódolt EGFR jelenlétét időnként hu-mán malignéns betegségek esetében mutatták ki. , encoded by the EGFR gene erbbl hu-man demonstrated for sometimes it malignéns diseases. Valójában azEGFR fokozott mértékű termelődését emlő, húgyhólyag, tüdő,fej, nyak és gyomor rákos megbetegedésénél, illetveglioblasztomákban figyelték meg. In particular, increased azEGFR observed in breast, bladder, lung, head, neck and stomach cancer, illetveglioblasztomákban. Az EGFR-receptor fokozottmértékű termelődése gyakran az EGFR-ligandum, a transzfor-máló növekedési faktor-α (TGF-a) ugyanazon tumorsejtek ál-tali megnövekedett szintű termelésével függ össze, ami « * «»· ··· * »*·«··· · * · * Increased EGFR receptor expression increased production often the EGFR ligand, the transformant mill growth factor-α (TGF-a) is associated with the same tumor cells, increased levels of production of the pseudo-carriages, which «*« »· ··· *» * · " · · · · · * *

5 ··* · > ·· · · * J - 13 - autokrin stimulációs reakcióút révén eredményezi a receptoraktiválását [Baselga és Mendelsohn: Pharmac. ·· · 5 *> ·· · * J - 13 - resulting in receptor activation by an autocrine stimulatory pathway [Baselga and Mendelsohn Pharmac. Ther. Ther. 64, 127(1994)]. 64, 127 (1994)]. Az EGFR vagy ligandumai (TGF-α és EGF) ellenimonoklonális antitesteket az ilyen malignáns betegségek ke-zelésére szolgáló terápiás hatóanyagokként tanulmányozták[ld. ellenimonoklonális antibodies to EGFR or its ligands (EGF and TGF-α) has been studied as therapeutic agents in the cross-zelésére such malignancies [see Fig. Baselga és Mendelsohn: Pharmac. Baselga and Mendelsohn Pharmac. Ther. Ther. 64, 127 (1994); 64, 127 (1994);

Masui és mtsai. Masui et al. : Cancer Research 44, 1002 (1984); Cancer Research 44, 1002 (1984); Wu és mtsai.: J. Clin. Wu et al .: J. Clin. Invest. Invest. 95, 1897 (1995)]. 95, 1897 (1995)].

Az ErbB-család második tagját, a pl85neu-t, eredetilegvegyszerrel kezelt patkányok neuroblasztomáiból származótranszformáló gének termékeként azonosították. the second member of the ErbB family, pl85neu is, originally identified as the product of chemically treated rats from neuroblastomas of transforming genes. A neu proto-onkogén aktivált alakja a kódolót protein transzmembrán-régiójában bekövetkezett pontmutáció (valin—>glutaminsav)eredménye. The activated neu proto-oncogene results from a point mutation in the shape of the encoded protein transmembrane region (valine> glutamic acid). A neu humán homológjának sokszorozódását megfi-gyelték emlőrákokban és petefészekrákokban, és ez rosszprognózissal volt összefüggésben [Slamon és mtsai.: Science235, 177 (1987); Amplification of the human homolog of neu observers were monitored breast cancer and ovarian cancer, and this was related rosszprognózissal [Slamon et al .: Science235, 177 (1987); Slamon és mtsai.: Science 244, 707 (1989);és 4 968 603 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírás].Mindezidáig humán tumorokban a neu proto-onkogénben lévőhözhasonló pcntmutációról nem számoltak be. Slamon et al .: Science 244, 707 (1989) and No. 4,968,603 U.S. Pat] .Mindezidáig human tumors of the neu proto-oncogene has been reported in lévőhözhasonló pcntmutációról. A HER2 túlzottmértékű termelődését (amely gyakran, de nem egységesen,génamplifikáció eredménye) más karcinomák esetében is meg-figyelték, többek között a gyomor, endometrium, nyálmirigy,tüdő, vese, vastagbél, pajzsmirigy, hasnyálmirigy és húgy-hólyag karcinomáiban. The Overexpression of HER2 (frequently but not uniformly due to gene amplification) have-been observed in other cancers, including gastric, endometrial, salivary gland, lung, kidney, colon, thyroid, pancreas and urinary bladder carcinomas.

Korábban patkányeredetű pl85neu és humán ErbB2-proteinek elleni antitesteket is feltártak. Previously disclosed pl85neu rat and human anti-ErbB2 antibodies-proteins. Drebin ésmtsai. Drebin ésmtsai. a patkányeredetű neu-géntermék, a pl85neu elleni an- * > ··»* *· *< • , » » <* * · 4- • · *·-'«· ?·« *·· »··« · · · * # »·· »w ·*^,· «* 14 titesteket hoztak létre [ló. the rat neu gene product, the anti-an- pl85neu *> ·· "* * * · <•,» »<* * * · · · • 4 - '" · "* ··" ·· "·? · * # »··» * ^ w · · "* 14 titesteket been established [horse. pl. eg. Drebin és mtsai.: Cell 41,695 (1985); Drebin et al .: Cell 41.695 (1985); Myers és mtsai.; Myers et al .; Meth. Meth. Enzym. Enzym. 198, 277 (1991);és WO 94/22478 számú nemzetközi közzétételi irat]. 198, 277 (1991) and WO 94/22478 international patent application, publication]. Drebinés mtsai. Drebinés al. [Oncogene 2, 273 (1988)] beszámoltak arról, hogya pl85neu két külön régiójával reaktív antitestek elegyeszinergikus tumorellenes hatást fejtett ki a csupasz ege-rekbe ültetett - neu-génnel transzformált - NIH-3T3-sejtekre [ld. [Oncogene 2: 273 (1988)] reported that pl85neu reactive with two distinct regions of antibodies exerted elegyeszinergikus antitumor effect implanted into nude mice-mix revealed - neu gene was transformed - NIH-3T3 cells [see. még az 5 824 311 számú egyesült államokbeliszabadalmi leírást], also U.S. 5,824,311 U.S. Pat]

Hudziak és mtsai. Hudziak et al. [Mól. [Mol. Cell. Cell. Bioi. Biol. 9(3), 1165 (1989)]anti-HER2 antitestek sorozatának létrehozását írták le, mely antitesteket az SKBR3 humán emlőtumor-sejtvonal alkal-mazásával karakterizálták. describe the generation of 9 (3), 1165 (1989)], anti-HER2 antibody sequence, which antibodies are characterized as a breast tumor cell line SKBR3 alkali tion of the human. Az SKBR3-sejtek - antitestekkeltörténő érintkeztetés utáni - relatív proliferációját azegyrétegű sejttenyészetek 72 óra elteltével végzett kris-tályibolya festésével határozták meg. The SKBR3 cells - after contacting antibodies and hints - azegyrétegű Relative cell proliferation of the cell cultures was determined with crystal violet staining after 72 hours. E vizsgálati eljárás-ban a maximális gátlást a 4D5-antitesttel kapták, amely asejtek proliferációját 56 %-ban gátolta. This test method was the maximum inhibition was obtained with the antibody called 4D5 which inhibited asejtek proliferation by 56%. A szóban forgó an-titest-sorozat egyéb tagjai e vizsgálati eljárásban kisebbmiértékben gátolták a sejtproliferációt. Other members of the question, an antibody directed cellular proliferation series of smaller value what this assay. Megállapították to-vábbá, hogy a 4D5-antitest a HER2-t túlzott mértékben ter-melő emlőtumor-sejtvonalakat szenzitizálja a TNFcitotoxikus hatásaira (ld. még az 5 677 171 számú egyesültállamokbeli szabadalmi leírást). It was found to is further that the 4D5 antibody to HER2-overexpressing breast tumor ter-lactam producing cell lines sensitizes TNFcitotoxikus effects (see. Also U.S. 5,677,171 U.S. patent specification). A Hudziak és mtsai. The Hudziak et al. által leírt anti-HER2 antitestek további karakterizálását illető-en ld. anti-HER2 antibodies are described in further characterization see respective via. Fendly és mtsai.; Fendly et al .; Cancer Research 50, 1550 (1990);Kotts és mtsai.; Cancer Research 50, 1550 (1990); Kotts et al .; In Vitro 26(3), 59A (1990); In Vitro 26 (3): 59A (1990); Sarup ésmtsai.: Growth Regulation 1, 72 (1991); Sarup ésmtsai .: Growth Regulation, 1: 72 (1991); Shepard és mtsai.: 15 J. Clin. Shepard et al .: J. Clin 15. Immunoi. Immunol. 11(3), 117 (1991); 11 (3) (1991) 117; Kumar és mtsai. Kumar et al. : Mól. Mol.

Cell. Cell. Bioi. Biol. 11(2), 979 (1991); 11 (2) (1991) 979; Lewis és mtsai.: Cancer Lewis et al .: Cancer

Immunoi. Immunol. Immunother. Other immune. 37, 255 (1993); 37, 255 (1993); Pietras és mtsai.: Pietras et al .:

Oncogene 9, 1829 (1994); Oncogene 9: 1829 (1994); Vitetta és mtsai.: Cancer Research 54, 5301 (1994); Vitetta et al .: Cancer Research 54, 5301 (1994); Sliwkowski és mtsai.: J. Bioi. Sliwkowski et al .: J. Biol. Chem. 269(20), 14661 (1994); Chem., 269 (20), 14661 (1994); Scott és mtsai.: J. Bioi. Scott et al .: J. Biol. Chem. 2 66,14300 (1991); Chem. 2 66.14300 (1991); D'Souza és mtsai.: Proc. D'Souza et al .: Proc. Natl. Natl. Acad. Acad. Sci. 91, 7202 (1994); Sci., 91: 7202 (1994); Lewis és mtsai.: Cancer Research 56, 1457 (1996); Lewis et al .: Cancer Research 56, 1457 (1996); Schaefer és mtsai.: Oncogene 15, 1385 (1997). Schaefer et al .: Oncogene 15: 1385 (1997). A HER2 elleni egéreredetű 4D5-antitest rekombináns hu-manizált IgGl-változatát [rhuMAb HER2 vagy HERCEPTIN*;amely a Genentech Inc.-tői (Dél San Francisco) kereskedelmi forgalomban beszerezhető] klinikai tesztekben aktívnak bi-zonyult olyan metasztázisos emlőrákos betegekben, akikben a HER2 túlzott mértékben termelődött, és akiket korábban rák-ellenes terápiával kezeltek [Baselga és mtsai.: J. Clin.Oncol. The murine 4D5 recombinant hu humanized IgGl version HER2 [rhuMAb HER2 or HERCEPTIN *, which is available from Genentech, Inc. The (South San Francisco) commercially available] clinically active bi-zonyult a metastatic breast cancer patient in whom the HER2 overexpressing formed, and who had previously been treated with an anti-cancer therapy [Baselga et al .: J. Clin.Oncol. 14, 737 (1996)]. 14, 737 (1996)]. A HERCEPTIN® kereskedelmi forgalma-zását a "Food and Drug Administration" 1998. szeptember 25-én engedélyezte olyan metasztázisos emlőrákban szenvedő pá-ciensek kezelésére, akik emlőtumora túlzott mértékben ter-meli a HSR2-proteint. The HERCEPTIN®-commercialization of the "Food and Drug Administration" on the 25th September 1998 approved for the treatment of metastatic breast cancer bye-deficient people who over-ter-meli HSR2 a breast tumor protein.

Egyéb, különböző tulajdonságú anti-HER2 antitesteketis feltártak [ld. Other various properties have anti-HER2 antibodies disclosed [see Fig. pl. eg. Tagliabue és mtsai.: J. Cancer 47,933 (1991); Tagliabue et al .: J. Cancer 47.933 (1991); McKenzie és mtsai.: Oncogene 4, 543 (1989); McKenzie et al .: Oncogene 4, 543 (1989);

Maier és mtsai.: Cancer Rés. Maier et al .: Cancer Res. 51, 5361 (1991); 51, 5361 (1991); Bacus és mtsai.: Molecular Carcinogenesis 3, 350 (1990); Bacus et al .: Molecular Carcinogenesis 3: 350 (1990); Stancovskiés mtsai.: PNAS (USA) 88, 8691 (1991); Stancovskiés al .: PNAS (USA) 88 (1991) 8691; Bacus és mtsai.: Bacus et al .:

Cancer Research 52, 2580 (1992); Cancer Research 52: 2580 (1992); Xu és mtsai.: Int. J. • ···· · · ·· ·· « · · · · · · • · ··· ·«· · ·· • · · · · · · 16 Xu et al .: Int. J. • ···· · ·· ·· "· · · · · · · · · · · •« • ·· · · · · · · · · 16

Cancer 53, 401 (1993); Cancer 53: 401 (1993); WO 94/00136 számú nemzetközi közzé-tételi irat; WO 94/00136, PCT International Publication, discloses, Kasprzyk és mtsai.: Cancer Research 52, 2771(1992); Kasprzyk et al .: Cancer Research 52, 2771 (1992); Hancock és mtsai.: Cancer Research 51, 4575 (1991);Shawver és mtsai.: Cancer Research 54, 1367 (1994); Hancock et al .: Cancer Research 51, 4575 (1991); Shawver et al .: Cancer Research 54, 1367 (1994); Arteaga és mtsai.: Cancer Research 54, 3758 (1994); Arteaga et al .: Cancer Research 54, 3758 (1994); Harwerth ésmtsai.: J. Bioi. Harwerth ésmtsai .: J. Biol. Chem. 267, 15160 (1992); Chem., 267, 15160 (1992); 5 783 186 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírás; U.S. Patent No. 5,783,186; Klapper és mtsai.:Oncogene 14, 2099 (1997)]. Klapper mtsai.:Oncogene 14, 2099 (1997)]. Homológia-szűréssel az ErbB-receptorcsalád két másik tagját is azonosították: ezek aHER3 [5 183 884 és 5 480 968 számú egyesült államokbeliszabadalmi leírás; Homology screening of two other ErbB receptor members have been identified: they aHER3 [5183884 and No. 5 480 968 U.S. patent; valamint Kraus és mtsai.: PNAS (USA) 86,9193 (1989)] és a HER4 [599 274 számú európai szabadalmibejelentés; and Kraus et al .: PNAS (USA), 86.9193 (1989)], and HER4 [No. 599,274 European patent application; Plowman és mtsai.: Proc. Plowman et al .: Proc. Nati. Natl. Acad. Acad. Sci. USA90, 1746 (1993); Sci. USA90, 1746 (1993); és Plowman és mtsai.: Natúré 366, 473(1993)]. and Plowman et al .: Nature 366, 473 (1993)]. E két receptor - legalább néhány emlőrák-sejtvonalban - fokozott mértékű termelődést mutat. Both of these receptors - at least some breast cancer cell lines - show increased expression.

Az ErbB-receptorok a sejtekben rendszerint különfélekombinációkban találhatók meg, és a heterodimerizáció vél-hetően fokozza a különböző ErbB-iigandumokra adottcelluléris reakciók diverzitását [Earp és mtsai.: Breast The ErbB receptors are generally found in cells in various combinations, and heterodimerization attaches to increase the diversity, to use a variety of ErbB ligands adottcelluléris reactions [Earp et al .: Breast

Cancer Research and Treatment 35, 115 (1995)]. Cancer Research and Treatment 35: 115 (1995)]. Az EGFR-that különböző ligandum köti meg, melyek a következők:epidermélis növekedési faktor (EGF), transzformáló növeke-dési faktor-alfa (TGF-α), amphiregulin, heparinkötőepidermális faktor (HB-SGF), betacelluiin és epiregulin[Groenen és mtsai.: Growth Factors 11, 235 (1994)]. EGFR ligand binds harm different, which are as follows: epidermélis growth factor (EGF), transforming growth factor alpha (TGF-α), amphiregulin, heparinkötőepidermális factor (HB-SGF), betacellulin and epiregulin [Groenen et ., Growth Factors 11, 235 (1994)]. Azegyetlen gén alternatív "splicing" folyamatai eredményekéntlétrejött heregulin-proteinek az ErbB3 és ErbB4 • · · · ·· · • · · • · · • · · · · ·»·· · · · ·• «·· ·« ···· ·· - 17 - ligandumaiként funkcionálnak. Alternative Azegyetlen "gene splicing" processes result in the creation of heregulin-ErbB3 and ErbB4 protein in the • ·· · · · · · · • • • · · · · · · · »· · · · • ··" ·· · «· · · · ·· - 17 - function as ligands. A heregulin-családba a követ-kező proteinek tartoznak: α-, β- és γ-heregulin [Holmes ésmtsai.: Science 256, 1205 (1992); The heregulin family includes the-next-following proteins: α-, β- and γ-heregulin [Holmes ésmtsai .: Science 256, 1205 (1992); 5 641 869 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírás; U.S. Patent No. 5,641,869; és Schaefer és mtsai.: and Schaefer et al .:

Oncogene 15, 1385 (1997)]; Oncogene 15: 1385 (1997)]; neu-differenciációs faktorok (NDF-ek), gliasejt növekedési faktorok (GGF-ek); neu differentiation factors (NDFs), glial growth factors (GGFs); acetilkolin-receptor indukáló aktivitás (ARIA); acetylcholine receptor inducing activity (ARIA); és szenzo-ros és motoros neuron-eredetű faktor (SMDF). and sense-ros and motor neuron derived factor (SMDF). E proteinek áttekintését illetően ld. For a review of regarding see. Groenen és mtsai.: Growth Factors 11, 235 (1994); Groenen et al .: Growth Factors 11, 235 (1994); Lemke: Molec. Lemke Molec. &amp; & Amp; Cell. Cell. Neurosci. Neurosci. 7_, 247 (1996); 7_, 247 (1996); Lee és mtsai.: Pharm. Lee et al .: Pharm. Rév. Port. 47, 51 (1995)]. 47, 51 (1995)]. Újabbankét további ErbB-ligandumot azonosítottak, melyek a követ-kezők: neuregulin-2 (NRG-2), amely HER3-hoz és HER4-hezegyaránt kötődik [ld. Újabbankét additional ErbB ligands were identified for which the stone-holders: neuregulin-2 (NRG-2) which HER3 and HER4 hezegyaránt binds [ld. Chang és mtsai.: Natúré 387, 509 Chang et al .: Nature 387, 509

(1997); (1997); Carraway és mtsai.: Natúré 387, 512 (1997)]; Carraway et al .: Nature 387, 512 (1997)]; ésneuregulin-3 (NRG-3), amely a HER4-hez kötődik [ld. ésneuregulin-3 (NRG-3), which binds HER4 [ld. Zhangés mtsai.: Proc. Zhangés al .: Proc. Natl. Natl. Acad. Acad. Sci. 94(18), 9562 (1997)]. Sci., 94 (18), 9562 (1997)]. A H3-EGF, a betacellulin és az epiregulin szintén a HER4-hez kötődik. The H3-EGF, betacellulin and epiregulin also binds to the HER4.

Bér az EGF és a TGFa nem kötődik a HER2-höz, az EGF serkenti az EGER és a HER2 heterodimer-képzését, ami akti-válja az EGFR-t, és a heterodimerben a HER2 transz-foszforilációjához vezet. Letting EGF and TGF-alpha do not bind HER2, EGF stimulates mouse and HER2 form a heterodimer, which are reinforced activating EGFR and results in transphosphorylation of HER2 in the heterodimer phosphorylation. Úgy tűnik, hogy a dimerizációés/vagy transzfoszforiláció aktiválja a HER2 tirozin kinázt[Sarp és mtsai., ld. It seems that the dimerizációés / or HER2 tyrosine kinase transphosphorylation activates the [Sarp et al., Supra. fentebb]. above]. Hasonlóan, ha a HER3 a HER2-vel együtt termelődik, aktív jelátviteli komplex jön létre,és a HER2 elleni antitestek képesek e komplex felbontására[Sliwkowski és mtsai.: J. Bioi. Likewise, when HER3 is co-expressed with HER2, an active signaling complex is formed and antibodies directed against HER2 are capable of terminating this complex [Sliwkowski et al .: J. Biol. Chem. 269(20), 14661 • · · · · · • · »······· ··· »·· · · · ··«·· · ·· ·• ··· · · · · ·· ·· - 18 - (1994)]. Chem. 269 (20) 14661 • • · · · · · · »· · · ·······» ·· · · ·· "·· ·· · · · · · · · · · • ·· ·· - 18 - (1994)]. Ezen túlmenően, a HER3 heregulinra (HRG) vonatkozóaffinitása fokozódik, ha a HER2-vel együtt expresszálódik[ld. In addition, HER3 for heregulin (HRG) is increased vonatkozóaffinitása when co-expressed with HER2 [ld. Levi és mtsai.: Journal of Neuroscience 15, 1329(1995); Levi et al .: Journal of Neuroscience, 15, 1329 (1995); Morrissey és mtsai.: Proc. Morrissey et al .: Proc. Natl. Natl. Acad. Acad. Sci. USA 92, 1431 (1995); Sci. USA 92: 1431 (1995); és Lewis és mtsai.: Cancer Rés. and Lewis et al .: Cancer Res. 56, 1457 (1996), a HER2-HER3 proteinkomplex vonatkozásában]. 56, 1457 (1996), HER2-HER3 protein complex respect]. A HER4- a HER3-hoz hasonlóan - aktív jelátviteli komplexet képeza HER2-vel [ld. The HER4- HER3 similarly - an active signaling complex with HER2 with [ld. Carraway és Cantley: Cell 78, 5 (1994)]. Carraway and Cantley, Cell 78, 5 (1994)]. TNF-receptor főcsalád TNF receptor superfamily

Számos különféle molekulát azonosítottak a citokinek tumornekrózis-faktor (TNF) családjának tagjaként, melyekpéldái a következők: tumornekrózis-faktor-α (TNF-a), tumcrnekrőzis-faktor-β (TNF-β), limfotoxin-a (LT-a), CD30-ligandum, CD27-ligandum, CD40-ligandum, ΟΧ-40-ligandum, 4-13B-Iigandum, Apo-1 ligandum (más néven Fas-ligandum vagyCD95-ligandum), Αρο-2-ligandum (más néven TRAIL) , Apo-3-ligandun (más néven TWEAK), osteoprotegerin (OPG), APRIL,RÁNK-ligandum (más néven TRANCE) és TALL-1 (más néven BlyS,3AFF vagy TEÁNK) [ld. Several types of molecules have been identified as cytokines as a member of the tumor necrosis factor (TNF) family of which examples include: tumor necrosis factor-α (TNF-a), tumcrnekrőzis factor-β (TNF-β), lymphotoxin-a (LT-a), CD30 ligand, CD27 ligand, CD40 ligand, ΟΧ-40 ligand, 4-13B ligand, Apo-1 ligand (also referred to as Fas ligand vagyCD95 ligand) Αρο-2 ligand (also referred to as TRAIL); Apo-3 ligand (also known as TWEAK), osteoprotegerin (OPG), APRIL, RANK ligand (also known as TRANCE), and TALL-1 (also known as BlyS, 3AFF or tea) [see Fig. pl. eg. Gruss és Dower: Blood 85, 3378 (1995); Gruss and Dower, Blood, 85: 3378 (1995); Fizni és mtsai.: J. Bioi. Fizni et al .: J. Biol. Chem. 271, 12687 (1996);Wiley és mtsai.: Immunity 3, 673 (1995); Chem 271, 12687 (1996). Wiley et al .: Immunity 3, 673 (1995); Browning és mtsai.: Ceii 72, 647 (1993); Browning et al .: Cell 72, 647 (1993); Armizage és mtsai.: Natúré 357, 80 (1992); Armizage et al .: Nature 357, 80 (1992); WO 97/01633 számú nemzetközi közzétételi irat; No. WO 97/01633 International Publication pamphlet; Karsters és mtsai.: Curr. Karsters et al .: Curr. Bioi. Biol. <8, 525 (1998); <8, 525 (1998);

Simonét és mtsai.: Cell 89, 309 (1997); Simonet et al .: Cell 89, 309 (1997); Chicheportiche ésmtsai.: Bioi. Chicheportiche ésmtsai .: Biol. Chem. 272, 32401 (1997); Chem., 272, 32401 (1997); Hahne és mtsai.: J. • · · - 19 - Hahne et al .: J. • · · - 19 -

Exp. Med. 188, 1185 (1998); Exp. Med. 188 (1998) 1185; WO 98/28426 számú nemzetköziközzétételi irat; No. WO 98/28426 International Publication pamphlet; Moore és mtsai.: Science 285, 260 (1999);Shu és mtsai.: J. Leukocyte Bioi. Moore et al .: Science 285 (1999) 260; Shu et al .: J. Leukocyte Biol. 65, 680 (1999); 65, 680 (1999); Schneiderés mtsai.: J. Exp. Med. 189, 1747 (1999); Schneider and al .: J. Exp Med 189 (1999) 1747th.; és Mukhopadhyay és mtsai.: J. Bioi. and Mukhopadhyay et al .: J. Biol. Chem. 274, 15978 (1999)]. Chem., 274, 15978 (1999)]. E molekulákközül a TNF-a-ról, ΤΝΕ-β-ról, CD30-ligandumról, 4-1BB-ligandumról, Apol-ligandumról, Apo2-ligandumról(Apo2L/TRAIL) és Αρο-3-ligandumról (TWEAK) írták le, hogyszerepet játszanak az apoptózisos sejthalálban. These molecules are described for TNF-a has, ΤΝΕ-β-from, CD30 ligand, 4-1BB ligand, Apo-ligand, Apo-2 ligand (Apo2L / TRAIL) and Αρο-3 ligand (TWEAK) that in play of apoptotic cell death. Az TNF-α ésTNF-β érzékeny tumorsejtekben apoptózisos sejthalált indu-kál [Schmid és mtsai.: Proc. The TNF-α-β ésTNF tumor cells sensitive to apoptotic cell death induction, respectively [Schmid et al .: Proc. Natl. Natl. Acad. Acad. Sci. 83, 1881(1986); Sci., 83 1881 (1986); Dealtry és mtsai.: Eur. J. Immunoi. Dealtry et al .: Eur. J. Immunol. 17, 689 (1987). 17, 689 (1987). A TNF-családba tartozó különböző molekulákról leírták,hogy szerepet játszanak az immunrendszer működésében vagykifejlődésében [Gruss és mtsai.: Blood 8J5, 3378 (1995)].Zheng és mtsai. described different molecules in the TNF family that play a role in the immune system vagykifejlődésében [Gruss et al .: Blood 8J5, 3378 (1995)]. Zheng et al. [Natúré 377, 348 (1995)] beszámoltak arról,hogy a TNF-α közreműködik a CD8-pozitív T-sejtek stimulációuzáni apoptózisában. [Nature 377, 348 (1995)] have reported that TNF-α participates in the CD8-positive T cells stimulációuzáni apoptosis. Más kutatók leírták, hogy a CD30-ligandum szerepet játszhat a thymusban a saját-reaktív T-sejtek eliminálásában [Amakawa és mtsai.: Cold SpringEarbor Laboratory Symposium on Programmed Cell Death, 10.számú kivonat (1995)]. Other investigators have reported that CD30 ligand may be involved in the elimination of their thymus-reactive T cells [Amakawa et al .: Cold SpringEarbor Laboratory Symposium on Programmed Cell Death, 10.számú extract (1995)]. A CD40-ligandum a B-sejtek számosfunkcióját aktiválja, ideértve azok proliferációját, immun-globulin-szekrécióját és túlélését [Renshaw' és mtsai.: J.Exp. CD40 ligand activates many functions of B cells, including their proliferation, immunoglobulin secretion, and survival [Renshaw 'et al .: J. Exp. Med. 180, 1889 (1994)]. Med., 180, 1889 (1994)]. A TNF-család egy nemrégibenazonosított tagja a TALL-1 (BlyS), amely bizonyos feltéte-lek mellett képes a 3-sejtek proliferációjának és immunglo-bulin-szekréciójának indukálására [Moore és mtsai., id. The TNF family member nemrégibenazonosított a TALL-1 (BlyS), which is capable of proliferation and immunoglobulin secretion-immunoglobulin-3 inducing the cells [Moore et al., Id., Under certain conditions, Ick • · ······ ·· «·· ··· · ·*····· · ·· · • ··· ·· · ·«· ·« - 20 - fentebb; • · ······ ·· "·· ····· · · · · · · * ·· ·· · • · · · · ·« · «- 20 - above; Schneider és mtsai., ld. Schneider et al., Supra. fentebb; above; Mackay ésmtsai., J. Exp. Med. 190, 1697 (1999)]. Mackay ésmtsai., J. Exp. Med. 190, 1697 (1999)].

Az egéreredetű Fas/Apo-1 receptor- vagy ligandum-gének(lpr-, illetve gld-gén) mutációiról kimutatták, hogy bizo-nyos autoimmun betegségekkel állnak összefüggésben, ami ar-ra utal, hogy az Apo-l-ligandum szerepet játszhat a perifé-riás vérben a saját-reaktív limfociták klonálisdeléciójának szabályozásában [Krammer és mtsai.: Curr. The mouse Fas / Apo-1 receptor have been shown Mutations or ligand genes (LPR or gld gene) that are associated with confidence, certain autoimmune diseases, suggesting ar onto that play Apo-l ligand in the perifé spectrometry own blood-reactive lymphocytes in the regulation of klonálisdeléciójának [Krammer et al .: Curr. Op.Immunoi. Op.Immunoi. 6, 279 (1994); 6, 279 (1994); Nagata és mtsai.: Science 267, 1449(1995)]. Nagata et al .: Science 267, 1449 (1995)]. Az Apo-l-ligandumról szintén leírták, hogy stimu-láció utáni apopotózist indukál a CD4-pozitív T-limfocitákban és B-limfocitákban, és szerepet játszhat az aktivált limfociták eliminálásában, mikor azok működésére már nincs szükség [Krammer és mtsai., ld. Apo-l ligand is also reported to induce post-stimulation or fibrillation apopotózist CD4-positive T lymphocytes and in B lymphocytes, and may play a role in activated lymphocytes eliminating, when their operation is no longer needed [Krammer et al., Supra. fentebb; above; Nagataés mtsai., ld. Nagataés al., Supra. fentebb]. above]. Az Apo-l-receptorhoz specifikusankötődő, egéreredetű agonista monoklonális antitestekről le-írták, hogy a TNF-a-éhoz hasonló sejtpusztító aktivitástfejtenek ki [Yonehara és mtsai.: J. Exp. Med. 169, 1747 (1989)]. Apo-I receptor specifikusankötődő murine agonist monoclonal antibodies have been described, that is similar to those of TNF-cell killing by aktivitástfejtenek [Yonehara et al .: J. Exp. Med. 169: 1747 (1989)]. A TNF-családba tartozó citokinek által közvetített kü-lönféle celluláris reakciókat feltehetően a citokinek spe-cifikus sejtreceptorokhoz történő kötődése indukálja. mediated cellular responses in connection with various cytokines in the TNF family of cytokines believed to bind to the SPE-specific cellular receptors induces. Ko-rábban azonosítottak két különböző TNF-receptort; Ko-rabbi identified two distinct TNF receptors; az egyik55 kD-os (TNFR1), a másik 75 kD-os (TNFR2) [ld. the egyik55 kDa (TNFR1) and the other 75 kDa (TNFR2) [see Fig. Hohman ésmtsai.: J. Bioi. Hohman ésmtsai .: J. Biol. Chem. 264, 14927 (1989); Chem., 264, 14927 (1989); Brockhaus és mtsai.: Proc. Brockhaus et al .: Proc. Natl. Natl. Acad. Acad. Sci. 87, 3127 (1990); Sci., 87 (1990) 3127; EP 417563 számú európai szabadalmi leírás; EP 417 563 European patent; Loetscher és mtsai.: Cell61, 351 (1990); Loetscher et al .: Cell61, (1990) 351; Scíiall és mtsai.: Cell 61, 361 (1990); Scíiall et al .: Cell 61 (1990) 361; • · · « • · ·« ··• · · · • * · · · ·• ·· · · · · • · · · · · · ·« · · · - 21 - • · «· • · '·· • · · · · · · · * • • • ·· · · · · · · · · · · ·« · · · - 21 -

Smith és mtsai.: Science 248, 1019 (1990); Smith et al .: Science 248, 1019 (1990); Lewis és mtsai.:Proc. Lewis and mtsai.:Proc. Natl. Natl. Acad. Acad. Sci. 88, 2830 (1991); Sci., 88: 2830 (1991); Goodwin és mtsai.:Mól. Goodwin and mtsai.:Mól. Cell. Cell. Bioi. Biol. 11, 3020 (1991)]. 11, 3020 (1991)]. E TNF-receptorok az - extracelluláris, transzmembrán és intracelluláris régiókatmagukban foglaló - felületi receptorokra jellemző szerkeze-tűek voltak. These TNF receptors - were characterized by surface receptor structure-Tuek - extracellular, transmembrane and intracellular régiókatmagukban reservation. Mind a TNFRl, mind a TNFR2 extracellulárisrészlete természetes állapotban szolubilis TNF-kötő prote-inként található [Nophar és mtsai.: EMBO J. 9, 3269 (1990);Kohno és mtsai.: Proc. Both TNFRl and TNFR2 extracellulárisrészlete the natural state in soluble TNF-binding prot inként [Nophar et al .: (1990) EMBO J. 9, 3269; Kohno et al .: Proc. Natl. Natl. Acad. Acad. Sci. USA 87, 8331 (1990); Sci. USA 87 (1990) 8331; Halé és mtsai.: J. Cell. If juices et al .: J. Cell. Biochem. Biochem. Supplement 15F, 113. old. Supplement 15F, 113 pp. (1991) (P424)]. (1991), (P424)]. A TNFRl és TNFR2 extracelluláris részlete az N- terminálistól kiindulva négy ciszteinben gazdag doménből(CRD1...4) álló, ismétlődéses aminosav-szekvenciát tartal-maz [Schall és mtsai., ld. The TNFRl and TNFR2 extracellular detail starting from the N- terminus of four cysteine ​​rich domains (CRD1 ... 4) consisting of, amino acid sequences comprise the iterative maz [Schall et al., Supra. fentebb; above; Loetscher és mtsai., Loetscher et al.,

Id. fentebb; Id. Supra; Smith és mtsai., ld. Smith et al., Supra. fentebb; above; Nophar és mtsai., ld. Nophar et al., Supra. fentebb; above; Kohno és mtsai., ld. Kohno et al., Supra. fentebb; above; Bannerés mtsai.: Cell 73, 431 (1993)]. Banner al .: Cell 73, 431 (1993)]. A CRD-domének hasonló is-métlődése több sejtfelületi proteinre is jellemző, ideértvepl. The CRD domains similar characteristics, métlődése several cell surface protein, ideértvepl. a p75 idegsejt növekedési faktor receptort [NGFR; p75 nerve growth factor receptor [NGFR; ld.Johnson és mtsai.: Cell 42, 545 (1986); ld.Johnson et al .: Cell 42, 545 (1986); Radeke és mtsai.:Natúré 325, 593 (1987)]; RADEKO mtsai.:Natúré and 325, 593 (1987)]; a CD40 B-sejt-antigént [Stamenkovic és mtsai.: EMBO J. 8_' 1403 (1989)]; CD40 B-cell antigen [Stamenkovic et al .: EMBO J. 8: "1403 (1989)]; az 0X40 T-sejt-antigént [Mailét és mtsai.: EMBO J. 9, 1063 (199)3 ésa Fas-antigént [Yonehara és mtsai., ld. 0x40 the T cell antigen [Mail and al .: EMBO J. 9, 1063 (199) 3 andthe Fas antigen [Yonehara et al., supra. fentebb; above; Itoh ésmtsai.: Cell 66, 233 (1991)]. Itoh ésmtsai .: Cell 66 (1991) 233]. A CRD-domének a Shope és myxoma himlővirusok szolubilis TNFR-szerű (sTNFR-szerű) T2-proteinjelben is megtalálhatók [Upton és mtsai.: Virology • · « • ·· ·* ·· • · · * · ···« « ··· • · · ··« ···· · · - 22 - 16Q, 20 (1987); CRD domains found in the Shope and myxoma poxvirus soluble TNFR-like (sTNFR-like) protein signal T2 is [Upton et al .: Virology · • «* • · ·· ·· • · · · · · · *« « • · ··· · ·· "···· · - 22 - 16Q, 20 (1987); Smith és mtsai.: Biochem. Smith et al .: Biochem. Biophys. Biophys. Rés. Gap.

Comun. Comun. 176, 335 (1991); 176, 335 (1991); Upton és mtsai.: Virology 184, 370(1991)]. Upton et al .: Virology, 184: 370 (1991)]. E szekvenciák optimális egymás alá rendezéssel("alignment") végzett összehasonlítása azt mutatta, hogy aciszteinek pozíciói állandók (konzerváltak). comparing with one another under optimum planning ( "alignment") These sequences showed that aciszteinek positions constants (conserved). E receptorokatnéha a TNF/NGF-receptor főcsalád tagjainak nevezik. E receptorokatnéha called members of the TNF / NGF receptor superfamily.

Az eddig azonosított, TNF-családba tartozó ligandumok- a limfotoxin-α kivételével - II. Previously identified TNF family ligandumok- exception of lymphotoxin-α - II. típusú transzmembrán-proteinek, melye C-terminálisa extracelluláris elhelyezke-désű. type transmembrane proteins, whose C-terminus of the extracellular-desu be located. Ezzel szemben, a TNF-receptor (TNFR) család legtöbbtagját I. típusú transzmembrán-proteinként azonosították,azonban mind a TNF-ligandum család, mind a TNF-receptorcsalád tagjai közötti homológiát többnyire az extracelluláris doménben (ECD) azonosították. In contrast, the TNF receptor (TNFR) family identified in most members of Type I transmembrane protein, however, the homology between both the TNF ligand family, both TNF receptor family members are usually identified in the extracellular domain (ECD). A TNF-családba tartozó cinokinek közül több (pl. TNF-α, Apo-1-iigandum és CD40-ligandum) proteolízissel a sejtfelületenhasítódik. Among cinokinek belonging to the TNF family more (e. TNF-α, Apo-1 ligand and CD40 ligand) sejtfelületenhasítódik the proteolysis. A létrejött protein minden esetben homotrimermolekulát képez, amely szolubilis citokinként funkcionál. The resulting protein in each case forms a homotrimer molecule that functions as a soluble cytokine. ATNF-receptor családba tartozó proteinek rendszerint szinténproteolízissel hasítődnak, miáltal szolubilis extra-celluláris bőmének képződnek, melyek a közös származású citokinek inhibitoraiként funkcionálnak. usually proteins of TNFs receptor family szinténproteolízissel cleaved, whereby a soluble extracellular bomet are formed, which function as inhibitors of cytokines in joint origin.

Az utóbbi években a TNF-receptor család újabb tagjaitazonosították. In recent years, the TNF receptor family tagjaitazonosították another. Bulow és mtsai. Bulow et al. [Science 278, 138 (1997)] plazmamembrán-receptorr írtak le, melyet transzmembrán-aktivátor és CAML-inneraktornak (TACI) neveztek el. [Science 278, 138 (1997)], the plasma membrane receptors nose have been described, named transmembrane activator and Camlik-inneraktornak (TACI). A TACI- The TACI-

receptor a TNFR-csalétíra jellemző ciszteinben gazdag motí-vumon tartalmaz. receptor comprises the TNFR csalétíra characteristic cysteine ​​rich motifs, VUMO. Fgy in vitro tesztben a TACI * ···· · · ·· « · · · · • · ··· ··· · ······· · · · · - 23 - transzfektált Jurkat-sejtek felületén - TACI-specifikus an-titestekkel végzett keresztkötése az NF-KB aktiválásáteredményezte (ld. WO 98/39361 számú nemzetközi közzétételiirat) . Dram vitro assay TACI * ···· · ·· "• · · · · · · · · · · · · · · · · ······· - 23 - transfected Jurkat cells surface - TACI -specific anti-titestekkel with crosslinking aktiválásáteredményezte NF-? B (see Fig. WO 98/39361 international Patent közzétételiirat).

Laabi és mtsai. Laabi et al. [EMBO J. 11, 3897 (1992)] egy új gén(BCM) azonosításáról számoltak be, melynek expressziója aB-sejt végső érésével esett egybe. [EMBO J. 11, 3897 (1992)] is a novel gene (BCM) reported the identification, the expression of which coincide in B cell terminal maturation. A normális BCM-cDNS nyi-tott leolvasási fázisa alapján egy 184 aminosavaspolipeptidet jósoltak, amely egyetlen transzmembrán-doménttartalmaz. Based on the BCM normal cDNA predicted reading frames of all the to-one aminosavaspolipeptidet 184 having a single transmembrane doménttartalmaz. Laabi és mtsai. Laabi et al. ezt a gént később BCMA-nak ne-vezték el [Nucleic Acids Rés. Later this gene does not BCMA-fed into a [Nucleic Acids Res. 22, 1147 (1994)]. 22, 1147 (1994)]. A BCMA-mRNS expressziója - pro-3-limfocita stádiumot reprezentáló - hu-mán malignáns B-sejrvonalakban hiányzik, ezért úgy vélik,hogy a limfociták differenciációs stádiumával van összefüg-gésben [Gras és mtsai.: Int. Immunology 2' 1093 (1995)].Madry és mtsai. BCMA mRNA expression of - representing the pro-lymphocyte stage 3 - absent hu-man malignant B sejrvonalakban therefore believe that there is differentiation state of the lymphocytes összefüg-gésben [Gras et al .: Int Immunol 2 '1093 (1995th )]. MADRYN et al. [Int. [Int. Immunology 10, 1693 (1998)] egérere-detű BCMA-cDNS klónozását ismertették. Immunology 10, 1693 (1998)] disclosed egérere BCMA-derived cDNA cloning. Leírásuk szerint az egéreredetű BCMA-cDNS 185 aminosav hosszúságú polipeptidetkódol, amely 62 %-ban azonos a humán BCMA-polipeptiddel. They specified to murine BCMA cDNA polipeptidetkódol 185 amino acids in length which is 62% identical to the human BCMA polypeptide. Azegéreredetű és humán BCMA-protein aminosav-szekvenciájánakegymás alá rendezésével az N-terminális régióban hat cisz- teinből álló konzervált motívumot mutattak ki, ami arrautal, hogy a BCMA-protein a TNFR-főcsaládba tartozik [Madryés mtsai., ld. Azegéreredetű and human BCMA protein is directed by the N-terminal region were detected six cis-conserved motif consisting of the amino acid szekvenciájánakegymás teinből below, suggesting that the BCMA protein belongs to the TNFR superfamily [Madryés al., Ld. fentebb]. above].

Marsters és mtsai. Marsters et al. [Curr. [Curr. Bioi. Biol. 6, 750 (1996)] teljeshosszúságú, natív szekvenciájú humán polipeptidet (Apo-3)írtak le, amely extracelluláris ciszteinben gazdag ismétlő-dései révén hasonlóságot mutat a TNFR-családdal, és annyi- - 24 - bán emlékeztet a TFNRl-re és CD95-re, hogy citoplazmikus„sejthalál"-domén szekvenciát tartalmaz [ld. még Marstersés mtsai.: Curr. Bioi. 6, 1669 (1996)]. Az Αρο-3-at más ku-tatók DR3, wsl-1 TRAMP és LARD néven említik [Chinnaiyan ésmtsai.: Science 274, 990 (1996); Kitson és mtsai.: Natúré384, 372 (1996); Bodmer és mtsai.: Immunity 6, 79 (1997);Screaton és mtsai.: Proc. Natl. Acad. Sci. 94, 4615 (1997)]. 6, 750 full-length (1996)], the native sequence human polypeptide (Apo-3) have been characterized, which has similarities with the extracellular cysteine-through rich repeat-emanations of the TNFR family, and can definitely be - recalls the TFNRl from Ban and CD95 - 24 to that cytoplasmic "cell death" -domain containing sequence [see. also Marstersés al .: Curr. Biol. 6: 1669 (1996)]. The Αρο-3-ku other providers DR3, WSL-1 TRAMP and LARD referred to as [Chinnaiyan ésmtsai .: Science 274, 990 (1996); Kitson et al .: Natúré384, 372 (1996); Bodmer et al .: Immunity, 6: 79 (1997); Screaton et al .: Proc Natl Acad.. . Sci. 94, 4615 (1997)].

Pan és mtsai. Pan et al. [Science 276, 111 (1997)] a TNF-receptorcsalád újabb tagját (DR4) tárták fel (ld. még a WO98/32856 számú nemzetközi közzétételi iratot). [Science 276, 111 (1997)], another member of the TNF receptor family (DR4) detected (see. Also WO98 / 32856 published as WO document). Leírták,hogy a DR4 önpusztító apparátus lekötésére képescitoplazmikus „sejthaiál"-domént tartalmaz. Pan és mtsai.szerint a DR4 az Apo2L/TRAIL néven ismert ligandum recepto-ra . It has been reported that the self-destruction apparatus DR4 lash contains képescitoplazmikus "cell killing" -domént. Pan et mtsai.szerint to DR4 receptors known as Apo2L / TRAIL ligand.

Sheridan és mtsai. Sheridan et al. [Science 277, 818 (1997)] és Pan ésmtsai.: Science 277, 815 (1997)] leírtak egy másik - szin-tén az Apo2L/TRAIL receptorának tartott - molekulát is [ld.még a WO 98/51793 és WO 98/41629 számú nemzetközi közzété-teli iratokat]. [Science 277, 818 (1997)], and Pan ésmtsai .: Science 277, 815 (1997)] as described in another - syn Ten of Apo2L / TRAIL with receptor - molecule [ld.még WO 98/51793 and WO 98 / 41629 international patent publication-filled papers]. Ezt a molekulát DR5-nek nevezték el [más forrásokban Apo-2, TRAIL-R, TR6, Tangc63, hAP08, TRICK2vagy KILLER; This molecule is called DR5 in [other sources Apo-2; TRAIL-R, TR6, Tangc63, hAP08, TRICK2vagy KILLER; ld. ld. Screaton és mtsai.: Curr. Screaton et al .: Curr. BIol. Biol. Ί_, 693 (1997); Ί_, 693 (1997); Walczak és mtsai.: EMBO J. 16, 5386 (1997); Walczak et al .: EMBO J. 16, 5386 (1997); Wu ésmtsai.: Natúré Genetics 17, 141 (1997); Wu ésmtsai .: Nature Genetics 17, 141 (1997); WO 98/35986; WO 98/35986;

SP870827; SP870827; WO 98/46643; WO 98/46643; WO 99/02653; WO 99/02653; WO 99/09165; WO 99/09165; és WO 99/11781. and WO 99/11781. Hasonlóan a DR4-hez, a DR5 is tartalmaz citoplazmikus sejthaiál-domént, és képes az apoptózis jel-átvitelére. Like DR4, DR5 is reported to contain a cytoplasmic cell killing domain and be capable of transmitting apoptosis signals. Az Apo2L/TRAIL és a DR5 alkotta komplex kris- >· «· ·* • · ····»·• · ··« ··« · ······· · · · ·• ··· ·* ···* ·« - 25 - tályszerkezetét Hymowitz és mtsai. Apo2L / TRAIL and DR5 complex made crystal-balling> · «· • · · * ····» · • · ·· "··" ······· · · · · · · · · · • * ··· * · «- 25 - effect structure Hymowitz et al. [Molecular Cell 4, 563 (1999)] írták le. [Molecular Cell 4: 563 (1999)] have been described.

Nemrégiben azonosítottak egy újabb, "sejthalál"-doménttartalmazó receptort, a DR6-ot [Pan és mtsai.: FEBS Letters431, 351 (1998)]. Recently identified a new "cell death" receptor -doménttartalmazó, the DR6 Art [Pan et al .: FEBS Letters431 (1998) 351]. A DR6 - amellett, hogy négy feltételezettextracelluláris ciszteinben gazdag domént és egycitoplazmikus "se jt halál''-domént tartalmaz - a citoplazmikus régióban lévő prolinban gazdag motívummal át-fedő, feltételezett leucin-zipzár szekvenciát is tartalmaz. A prolinban gazdag motívum az src-homológia-3 doménekhezkötődő szekvenciákra emlékeztet, amelyek számosszignáltranszdukciós molekulában megtalálhatók. The DR6 - in addition to four feltételezettextracelluláris cysteine-rich domains and egycitoplazmikus "not jt death '' - contains proline in the cytoplasmic region rich motif for cover, putative leucine zipper sequence of proline-rich motif in the src homology - domains. -3 recalls doménekhezkötődő sequences that are common számosszignáltranszdukciós molecule.

Az utóbbi években azonosított receptorok egy továbbicsoportja az ún. receptors identified in recent years, a further group of so-called. csali ("decoy") receptorok, melyek a jel-átvitel inhibitoraiként, semmint transzdukátoraiként funk-cionálnak. bait ( "decoy") receptors, which are the signal-transfer inhibitors, rather than transzdukátoraiként funk-conditioning. E csoportba tartozik a DcRl [más néven TRID, LITvagy TRAIL-R3, ld. This group includes DcRl [also known as TRID, LITvagy TRAIL-R3, see Fig. Pan és mtsai.: Science 276, 111 (1997);Sheridan és mtsai.: Science 277, 818 (1997); Pan et al .: Science 276, 111 (1997); Sheridan et al .: Science 277, 818 (1997); McFarlane és mtsai.: J. Bioi. McFarlane et al .: J. Biol. Chem. 272, 25417 (1997); Chem., 272, 25417 (1997); Schneider és mtsai.: FEBS Letters 416, 329 (1997); Schneider et al .: FEBS Letters 416, 329 (1997); Degli-Esposti és mtsai.: J. Exp. Med. 186, 1165 (1997); Degli-Esposti et al .: J. Exp Med 186, 1165 (1997)..; Mongkolsapaya és mtsai.: J. Immunoi. Mongkolsapaya et al .: J. Immunol. 160, 3 (1998)] és a DcR2 [más néven TRUNBD vagy TRAIL-R1, ld. 160, 3 (1998)], and DcR2 [TRUNBD or TRAIL-R1 is also known, see. Marsters és mtsai.: Curr. Marsters et al .: Curr. Bioi. Biol. 7, 1003 (1997); 7, 1003 (1997); Pan és mtsai.: FEBS Letters 424, 41 (1998);Degli-Esposti és mtsai.: Immunity 7, 813 (1997)], melyek mindegyike sejtfelületi molekula; Pan et al .: FEBS Letters, 424, (1998) 41; Degli-Esposti et al .: Immunity 7, 813 (1997)], each of which is a cell surface molecule; továbbá az OPG [Simonétés mtsai., ld. Furthermore, OPG [Simonétés al., supra. fentebb; above; Emery és mtsai., ld. Emery et al., Supra. fentebb] és aDcR3 [Pitti és mtsai.: Natúré 396, 699 (1998)], melyek • ··<·· #* • · · • · · ·· ·· - 26 - szekretált, szolubilis proteinek. supra] and aDcR3 [Pitti et al .: Nature 396, 699 (1998)], which are • ·· <·· # * • • · · · · ·· ·· - 26 - secreted, soluble proteins. A TNFR-család egyéb, újonnan azonosított tagjai közé tartoznak a következők: CÁRI, HVEM, GITR, ZTNFR-5, NTR-1 ésTNFL1 [Brojatsch és mtsai.: Cell 87, 845 (1996); The TNFR family include other newly identified members include: CARIN, HVEM, GITR, ZTNFR-5, NTR-1 ésTNFL1 [Brojatsch et al .: Cell 87, 845 (1996); Mongomeryés mtsai.: Cell 87, 427 (1996); Mongomeryés al .: Cell 87, 427 (1996); Marsters és mtsai.: J. Marsters et al .: J.

Bioi. Biol. Chem. 272, 14029 (1997); Chem., 272, 14029 (1997); Nocentini és mtsai.: Proc. Nocentini et al .: Proc.

Natl. Natl. Acad. Acad. Sci. USA 94, 6216 (1997); Sci. USA 94: 6216 (1997); Emery és mtsai.: J. Emery et al .: J.

Bioi. Biol. Chem. 273, 14363 (1998); Chem., 273: 14363 (1998); valamint a WO 99/04001, WO 99/07738 és WO 99/33980 számú nemzetközi közzétételi ira-tok] . and WO 99/04001, WO 99/07738 and WO International Publication No. 99/33980 pouch ira].

Tewari és mtsai. Tewari et al. [Curr. [Curr. Op. Génét Develop. Mp. Gene Develop. 6, 39 (1996)] áttekintő írása szerint a TNFR1, TNFR2 és CD40 az NF-κΒ transzkripciós faktor aktiválásán keresztül módosítjaa gyulladás előtti és ko-stimulátor citokinek, citokin-receptorok és sejtadhéziós molekulák expresszióját. According 6, 39 (1996)] Overview writing TNFR1, TNFR2 and CD40 via the activation of transcription factor NF-κΒ módosítjaa before cytokines and costimulatory inflammation, cytokine receptors and cell adhesion molecules expression. Az NF-k3 az olyan dimer transzkripciós faktorok prototípusa, me-lyek alegységei konzervált Rel-régiókat tartalmaznak [Vermaés mtsai.: Genes Develop. NF-k3 containing the dimeric transcription factors prototype Me ulcers subunits conserved Rel regions [Vermaés al .: Genes Develop. 9, 2723 (1996); 9, 2723 (1996); Baldwin: Ann. Baldwin, Ann. Rév. Port. Immuncl. Immuncl. 14, 649 (1996)]. 14, 649 (1996)]. Látens alakjában az NF-κΒ azI-κΒ inhibitor-család tagjaival komplexálódik; Latent form, NF-κΒ azide κΒ inhibitor is complexed with members of the family; az I-κΒ bi-zonyos stimulusok hatására bekövetkező inaktiválása után afelszabadult NF-κΒ a sejtmagba helyeződik át, ahol specifi-kus DNS-szekvenciákhoz kötődik, és aktiválja a géntransz-kripciót. After inactivation of the effect of I-bi-κΒ zonyos stimuli afelszabadult NF κΒ it will move to the nucleus where it binds specificity-specific DNA sequences and activates géntransz-kripciót. Ahogy fentebb említettük, a TNFR-család napjain-kig azonosított tagjai tartalmaznak intracelluláris„sejthalál"-domén régiót vagy ez a régió hiányzik belőlük.A „sejthalál"-dc>mént nem tartalmazó egyes TNFR-molekulák(pl. TNFR2, CD40, HVEM és GITR) képesek az NF-κΒ aktivitá- a * « - 27 - a ·· • aa sának módosítására [ld. As mentioned above, the TNFR family members identified kig-days contain an intracellular "death cell" -domain region or the region lacks belőlük.A "cell death" -dc each TNFR molecules lacking> stallion (eg. TNFR2, CD40, HVEM and GITR) capable of NF-κΒ aktivitá- * "- 27 - changing ·· • aa Misa [see. pl. eg. Lotz és mtsai.: J. LeukocyteBioi. Lotz et al .: J. LeukocyteBioi. 60, 1 (1996)]. 60, 1 (1996)]. A citokinek és receptoraik TNF-családjának áttekinté-sét illetően ld. The cytokines and their receptors TNF family of thumbnail-set regarding see. Ashkenazi és Dixit: Science 281, 1305(1998); Ashkenazi and Dixit, Science, 281 (1998) 1305; Golstein; Golstein; Curr. Curr. Bioi. Biol. Ί_, 750 (1997); Ί_, 750 (1997); Gruss ésDower, ld. Gruss ésDower, see. fentebb; above; és Nagata: Cell 88, 355 (1997). and Nagata, Cell, 88: 355 (1997). B-sejt A limfociták a csontvelőben a hematopoiesis során ter-melődő fehérvérsejtek számos típusának egyikét képviselik.A limfociták két fő populációja létezik: a B-limfociták (B-sejtek) és a T-limfociták (T-sejtek). B-cell lymphocytes in the bone marrow in hematopoiesis ter-MELODA one of many types of white blood cells, there are two major populations képviselik.A lymphocytes: B lymphocytes (B cells) and T lymphocytes (T cells). A találmány szerintimegoldás szempontjából jelentős limfociták a B-sejtek. szerintimegoldás the invention in terms of significant B cell lymphocytes. A B-sejtek érése a csontvelőben játszódik le, és acsontvelőt elhagyva sejtfelületükön antigénkötő antitestettermelnek. B cell maturation takes place in the bone marrow, and leaving acsontvelőt antigen on their cell surface antibodies they produce. Amikor egy natív B-sejt először találkozik azzalaz antigénnel, amelyre a membrénkötött antitest specifikus,a sejt gyors osztódásba kezd, és utódsejtjei memória B-sejtekké és effektor-sejtekké (melyeket "plazmasejteknek"neveznek) differenciálódnak. When a naive B cell first encounters azzalaz antigen for which the antibody begins membrénkötött specific cells to divide rapidly and (which are "plasma cells") are its progeny differentiate into memory B cells and effector cells differentiate. A memória B-sejtek hosszabb The extended memory B cells

élettartamnak, és tovább termelik a membránkötött antites-tet (ugyanolyan specifitással, mint a szülői sejten). service life, and continue to express membrane-bound-tet the antibodies (of the same specificity as the original parent cell). Aplazmasejtek nem termelnek membránkötött antitestet; Aplazmasejtek do not produce membrane-bound antibody; ehe-lyett az antitestet szekretálható alakban temelik. Ehe-TEMEL instead of antibody secreted form. A szekretált antitestek a humorális immunitás fő effektor mo-lekulái. Secreted antibodies are the major effector of the humoral immunity-mo send down. A CD20-antigén (melyet humán 3-limfocita-korlátozottdifferenciálódási antigénnek, Bp35-nek is neveznek) egy kb. The CD20 antigen (also called human korlátozottdifferenciálódási 3-lymphocyte antigen, Bp35) is approx. « »«· - 28 - • » ·*· ·«· « ···«··· · ·· ·• ««V « J · » J · ·- 35 kD molekulatömegű hidrofób transzmembrán protein, amelypre-B-sejteken és érett B-limfocitákon található [Valentinéés mtsai.: J. Bioi. «» «· - 28 - •» * · · · "·" ··· "··· ·· · · •« «V« J · »J · - 35 kDa hydrophobic transmembrane protein with amelypre-B- on cells and mature B lymphocytes [Valentinéés al .: J. Biol. Chem. 264(19), 11282 (1989); Chem 264 (19), 11282 (1989).; Einfeld ésmtsai.: EMBO J. 2^)/ 711 (1988)]. Einfeld ésmtsai .: EMBO J. 2 ^) / 711 (1988)]. Az antigén a nemHodgkin-limfomás (NHL) B-sejtek több, mint 90 %-án is ter-melődik [Anderson és mtsai.: Blood 63(6), 1424 (1984)], de megtalálható a vérképzési őssejteken, a pro-B-sejteken,normál plazmasejteken, illetve egyéb, normál szöveteken is[Tedder és mtsai.: J. Immunoi. The antigen is non-Hodgkin lymphoma (NHL), B cells even more than 90% of the ter-MELODA [Anderson et al .: Blood 63 (6), 1424 (1984)], but can be found on hematopoietic stem cells, the pro B cells, normal plasma cells or other normal tissues may also [Tedder et al .: J. Immunol. 135(2), 973 (1985)]. 135 (2), 973 (1985)]. A CD20a sejtciklus-iniciálás és a differenciálódás aktiválási fo-lyamatának korai lépését (lépéseit) vezérli [Tedder ésmtsai., ld. CD20 is a cell-cycle initiation and differentiation, activation fo lyamatának early step (s) controls [Tedder ésmtsai., Ld. fentebb], és valószínűleg kalciumion- csatornaként funkcionál [Tedder és mtsai.: J. Cell.Biochem. supra], calcium ions and possibly functions as a channel [Tedder et al .: J. Cell.Biochem. 14D, 195 (1990)]. 14D, 195 (1990)].

Mivel a CD2C termelődése kimutatható a B-sejtlimfomákban, ez az antigén potenciális eszköze lehet azilyen limfomák megcélzásának. Since CD2C production can be detected in the B-sejtlimfomákban, this antigen may be a potential tool for targeting azilyen lymphomas. Az ilyen megcélzás(célbajuttatás, "targeting") folyamatának általános lépéseia következők: a páciensnek a B-sejtek CD20 felületi anti-génjére specifikus antitestet adagolunk; Such targeting (targeting, "targeting") steps of the process are as follows: the patient is added to the CD20 surface antigen gene specific antibodies by B cells; ezek az anti-CD20antitestek specifikusan kötődnek (látszólag) mind a normál,mind a malignáns 3-sejtek CD20-antigénjeihez; these anti-CD20antitestek specifically bind (ostensibly) both normal and malignant cells 3 CD20 antigens; és a CD20 fe-lületi antigénhez kötődött antitest a neopláziás B-sejtekelpusztításét és számuk megfogyatkozását eredményezheti.Ezenfelül, az anti-CD20 antitesthez a tumor elpusztításáraképes kémiai hatóanyagok vagy radioaktív jelölők konjugál-hatók, miáltal a hatóanyag specifikusan a neopláziás B-sejtekhez szállítódik. and the bound CD20 phenyl lületi antigen antibody is the neoplastic B cells Ekel destruction and number megfogyatkozását eredményezheti.Ezenfelül, the anti-CD20 antibody to tumor elpusztításáraképes chemical agents or radioactive labels conjugates are such that the agent is specifically delivered to the neoplastic B cells. Az elsődleges cél - a kivitelezés ««· *·« - 29 - módjától függetlenül - a tumor elpusztítása; regardless of the method - - the primary goal - to design '' · · * "- 29 destruction of the tumor; a konkrét mód-szer az alkalmazott anti-CD20 antitestnek megfelelően vá-lasztható ki, ilyenformán, a CD20-antigén megcélzására ren-delkezésre álló módszerek igen változatosak. the specific mode vacuum deferred times in accordance with the anti-CD20 antibody which is utilized, thus, the available methods for targeting the CD20 antigen ren-ticularly quite varied. A CD19 a B-sejtek felületén expresszálódó antigénekegy további típusa, amely - hasonlóan a CD20-hoz - a sejt-vonal differenciálódásának valamennyi stádiumában megtalál-ható, kezdve az őssejt állapottól egészen a plazmasejtekkétörténő végső differenciálódást közvetlenül megelőző pontig[Nadler: Lymphocyte Typing II 2, 3 és Függelék, szerk.:Renling és mtsai. CD19 is another type expressed on the surface of B cell antigens a, which - like the CD20 - are, in all stages of the cell line of differentiation, from the point until immediately prior to plazmasejtekkétörténő terminal differentiation of the stem cell state [Nadler: Lymphocyte Typing II 2 3 and Appendix szerk.:Renling et al. (1986), Springer Verlag]. (1986) Springer Verlag]. A CD19-hez kö-tődő antitest - eltérően a CD20-tól - a CD19-antigéninternalizációját eredményezi. The CD19 antibody is co-todo - unlike CD20 - CD19 results in antigéninternalizációját. A CD19-antigént, többek kö-zött, a HD237-CD19 antitesttel (más néven B4-antitest) azo-nosították [Kiesel és mtsai.: Leukémia Research II 12, 1119 (1987)]. CD19 antigen, including co-guarded, the HD237-CD19 antibody (also called B4 antibody) were identified azo [Kiesel et al .: Leukemia Research II, 12: 1119 (1987)]. A CD19-antigén a perifériás vér egymagvú sejtjei-nek 4-6 %-án van jelen, míg a perifériás vérből, lépből,nyirokcsomókból és mandulából izolált 3-sejtek több, mint90 %-án megtalálható, de a perifériás vér T-sejtjein,monocitéin és granulocitáin nem detektálható. The CD19 antigen's mononuclear cells in peripheral blood is 4-6% of the present, while the peripheral blood, spleen, lymph node or tonsil cells isolated from three more mint90% of can be found, but in peripheral blood T cells, monocitéin undetectable and granulocytes. Gyakorlatilagvalamennyi nem T-sejtes akut limfoblasztikus leukémia(ALL), B-sejtes krónikus limfocitikus leukémia (CLL) és B-sejt-limfőm.a termei 34-antitesttel kimutatható CD19-antigént [Nadler és mtsai.: J. Immunoi. Virtually all non-T cell acute lymphoblastic leukemia (ALL), B cell chronic lymphocytic leukemia (CLL) and B cell limfőm.a 34 restaurants detectable antibody-antigen CD19 [Nadler et al .: J. Immunol. 131, 244 (1983);Nadler és mtsai. 131, 244 (1983); and Nadler et al. a "Progress in Hematology XII. kötet 187-206. oldalain (szerk.: Brown, 1986, Grune &amp; Stratton, .. In "Progress in Hematology, Vol XII, pages 187-206 (Ed .: Brown, 1986, Grune & amp; Stratton,

Inc.)]. Inc.)].

Azonosítottak egyéb olyan antitesteket is, amelyek a ··· • ·44« «« <» • Ο « « - · • · 4·· 4·· * <··« "· * · »** ··<· 30 B-sejtvonalba tartozó sejtek által termelt, differenciáló-dási stádiumra specifikus antigéneket ismernek fel. Ezekközül említhető a CD21-antigénre specifikus B2-antitest; aCD22-antigénre specifikus B3-antitest; és a CDlO-antigénre(CALLA) specifikus J5-antitest (ld. 5 595 721 számú egye-sült államokbeli szabadalmi leírás). A rituximab (RITUXAN®) antitest génsebészeti módsze-rekkel manipulált kimérikus egér/humán monoklonális anti-test, amely a CD20-antigén ellen irányul. A Rituximab az5 736 137 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírásban(Andersen és mtsai., 1998. április 7.) "C2B8" néven feltártantitest. A RITUXAN^-t kiújuló vagy nehezen kezelhető, nemsúlyos vagy tüszős, CD20-pozitív, B-sejtes nem-Hodginlimfomában szenvedő páciensek kezelésére javallják. Az invitro hatásmechan Also identified other antibodies which · · · · • 44 «« «<» • Ο «« - · • · 4 ·· ·· 4 * <·· ' "· · *» ** ·· <30 · recognize produced by cells of B-cell lines, differentiation of contraction specific stage-antigens including but the CD21 antigen is specific for B 2 antibody;. specific aCD22 antigen B3 antibody, and is specific for the CDlO antigen (CALLA) J5 antibody (see . U.S. patent No. 5,595,721). the engineered rituximab (RITUXAN®) antibody is engineered METHOD = homomultimers chimeric murine / human monoclonal antibody directed against the CD20 antigen. rituximab AZ5 No. 736,137 U.S. patent (Andersen et al., on April 7, 1998) under the name "C2B8" feltártantitest. The .alpha RITUXAN is indicated for the treatment of relapsed or refractory non-serious or follicular, CD20 positive, B cell non-patients suffering Hodginlimfomában. The invitro hatásmechan izmus vizsgálatával kimutatták, hogy aRITUXANÚ humán komplementhez kötődik, és komplement-dependens citotoxicitéson (CDC) keresztül lizálja a limfoid 3-sejtvcnalakat [Reff és mtsai.: Blood 83(2), 435 (1994)].Bzenfelül, ez az antitest az antitest-dependens cellulériscitotoxicitási (ADCC; shown ism examining whether aRITUXANÚ binds human complement and lyses lymphoid 3 sejtvcnalakat through complement dependent citotoxicitéson (CDC) [Reff et al .: Blood 83 (2), 435 (1994)]. Bzenfelül, this antibody is an antibody -dependent cellulériscitotoxicitási (ADCC; tesztekben jelentős mértékű aktivi-tást mutat. It shows significant activity in the tests. Újabban a RITUXAN®-ról bebizonyosodott, hogy"Ξ-timicin beépülési tesztben anti-proliferatív hatású, ésközvetlenül apoptózist indukál, más anti-CD20 antitestekazonban nem [Maloney és mtsai.: Blood 88(10), 637a (1996)].Kísérletileg a RITUXAN® és kemoterápiák vagy toxinok közöt-ti szinergikus műkötést figyeltek meg. Közelebbről, aRITUXAN© a drog-rezisztens humán B-sejtes limfoma sejtvona-lakat szenzitizélja a doxorubicin, CDDB, VP-16, diphteria- 31 • ···· ·· · · ·· • · ······ ·· · ·· ··· · ······· · ·· · • *·· · · ·«·· ·· toxin és ricin citotoxikus hatásaira [Demidem és mtsai.:Cancer Chemotherapy &amp; Radiopharmaceuticals 12(3), 177 (1997)]. In vivő pre-klinikai vizsgálatokban kimutatták,hogy a RITUXAN® Cynomolgus majmok perifériás vérében, nyi-rokcsomóiban és csontvelőjében csökkenti a B-sejtek számát[feltehetően komplement- és sejt-közvetitette folyamatok révén; ld. Reff és mts More recently, RITUXAN® has been shown to induce apoptosis in about that the anti-proliferative effect, ésközvetlenül "Ξ timicin-incorporation assay, of an anti-CD20 antitestekazonban not [Maloney et al .: Blood 88 (10): 637a (1996)]. Experimentally RITUXAN and chemotherapy or toxins known among you, they observed a synergistic bond it. in particular, aRITUXAN © drug resistant human B cell lymphoma cell line-lock szenzitizélja doxorubicin, CDDB, VP-16, 31 diphteria- • ···· ·· • · · · ·· ······ ·· ·· · · · · · · ······· ·· • · · · · * ·· "·· ·· toxin ricin and cytotoxic effects [ Demidem mtsai.:Cancer Chemotherapy & amp;. Radiopharmaceuticals 12 (3), 177 (1997)] demonstrated in vivo preclinical studies have shown that RITUXAN® cynomolgus monkey peripheral blood, and bone marrow of shear rokcsomóiban reduces the number of B cells [ presumably through complement and cell-mediated processes;. see Reff et al ai.: Blood 83(2), 435 (1994)]. A találmány értelmében többértékű (pl. négyértékű) an- titesteket tárunk fel, melyek három vagy több antigénkötőhelyet tartalmaznak, és amelyek az antitest polipeptid-láncait kódoló nukleinsav rekombináns expresszáltatásávalkönnyen előállithatők. It relates to al .: Blood 83 (2), 435 (1994)]. polyvalent According to the invention (eg. tetravalent) an- titesteket containing three or more antigen binding sites, and which nucleic acid is a recombinant sequence encoding the antibody polypeptide chains expresszáltatásávalkönnyen be prepared. A találmány egyik megvalósítási mód-ja szerint a többértékű antitest dimerizációs domént és há-rom vagy több antigénkötő helyet tartalmaz. The invention according to one embodiment, the multivalent ja antibody dimerization domain and three or more antigen binding sites rom. A dimerizációsdómén előnyösen Fc-régiót vagy csukló-régiót tartalmaz(vagy abból áll). The dimerizációsdómén preferably comprises an Fc region or a hinge region (or consists of). A találmány egyik megvalósítási módja ér-telmében izolált antitestet tárunk fel, amely egydimerizációs domént és - attól N-terminális irányban - há-rom vagy több antigénkötő helyet tartalmaz. One embodiment of the invention provides an isolated vascular telmében antibody which egydimerizációs domain and - comprising three or more antigen binding sites rom - from the N-terminal direction. Feltárunk to-vábbá egy izolált antitestet, amely egy Fc-régiót és - at-tól N-terminális irányban - három vagy több antigénkötő he-lyet tartalmaz. The invention provides is further to an isolated antibody comprising an Fc region, and - containing three or more antigen binding He-LYET - starting at the N-terminal direction. A találmány szerinti előnyös, többértékűantitest három és kb. Preferred according to the invention, the multivalent antibody to about three. nyolc közötti számú, de előnyösennégy antigénkötő helyet tartalmaz (vagy azokból áll), me-lyek mindegyike "működőképes" (meghatározását ld. később). includes but No. előnyösennégy between eight antigen binding sites (or consists of), methyl ulcers each of "functional" (see definition. later).

Az egyik megvalósítási mód szerint a többértékű antitest ötvagy több (pl. legfeljebb kb. nyolc) antigénkötő helyettartalmaz. In one embodiment, the multivalent antibody is five or more (eg. up to approx. eight) antigen binding sites comprise. A többértékű antitest előnyösen nem natív szék- • · ······ *· ··· ··· · ······· · ·· · • ·«· ·· ··«· ·· - 32 - venciájú IgA vagy IgM, és hiányozhat belőle az Fc-régió(vagy mindössze egy Fc-régiót tartalmaz). The multivalent antibody preferably non-native chair- • · · · · · · · · · ······ * ······· · · • · ·· "·· · ··" ·· · - 32 - of sequence IgM or IgA, and it may lack an Fc region (or contains only an Fc region). A találmány előnyös megvalósítási módja szerint atöbbértékű antitest legalább egy (előnyösen két)polipeptid-láncot tartalmaz, mely polipeptid-lánc(ok) kétvagy több variábilis domént tartalmaz(nak). In a preferred embodiment, the antibody comprises atöbbértékű least one (preferably two) polypeptide chain, which polypeptide chain (s) comprise a two or more variable domain (s). Például, apolipeptid-lánc (ok) a VDl-(XI) n-VD2-(X2) n-Fc általános kép-lettel írható(k) le, amelyben VDl jelentése: első variábi-lis dómén; For example, apolipeptid chain (s) can be the VDl- (XI) n-VD2- (X2) n-Fc formula doublets (s) from which VDL is first variabel-lis domain; VD2 jelentése: második variábilis dómén; VD2 is a second variable domain; Fc je-lentése: egy Fc-régió polipeptid-lánca; Lentes je-Fc: Fc region of a polypeptide chain; XI és X2 jelentése:aminosav vagy polipeptid; XI and X2 represent an amino acid or a polypeptide; és "n" értéke 0 vagy 1. Például,a polipeptid-lánc(ok) a következők lehet(nek): VH-CH1-(flexibilis kapcsolószekvencia)-VH-CHl-Fc-régió; and "n" is 0 or 1. For instance, the polypeptide chain (s) may include (s): VH-CH1 (flexible linker) -VH-CHl-Fc region chain; VH-CH1-VH-CKl-Fc-régió; VH-CH1-VH-CKL-Fc region; VL-CL-(flexibilis kapcsolószekvencia)-VL-CL-Fc-régió; VL-CL (flexible linker) VL-CL-Fc region; vagy VL-CL-VL-CL-Fc-régió. CL-VL or VL-CL-Fc region. Amennyiben apolipeptid-lánc(ok) Fd-(flexibilis kapcsolószekvencia)-Fdláncból áll(nak), a flexibilis kapcsolószekvencia Gly-Ser,Gly-Ser-Gly-Ser (10. azonosítószámú szekvencia), Ala-Servagy Gly-Glv-Gly-Ser (11. azonosítószámú szekvencia) amino-sav-szekvetciájú peptid lehet. If apolipeptid chain (s) FD (flexible linker) -Fdláncból is (are), the flexible linker Gly-Ser, Gly-Ser-Gly-Ser (SEQ ID NO: 10), Ala-Gly-Gly-Gly Servagy Ser (SEQ ID NO: 11) may be amino-acid peptide szekvetciájú. A találmány szerinti többértékű antitest előnyösentartalmaz még legalább két (előnyösen négy) könnyű lánc va-riábilis dómén polipeptidet is. The multivalent antibody according to the invention has előnyösentartalmaz va riábilis domains at least two (and preferably four) light chain polypeptide. A találmány szerinti több-értékű antitest, például, kb. multi-valent antibody of the present invention, for example, approx. 2-8 könnyű lánc variábilisdómén polipeptidet tartalmaz. light chain polypeptide contains 2-8 variábilisdómén. A könnyű lánc variábilisdómén polipeptidek könnyű lánc variábilis domént és, adottesetben, CL-domént is tartalmaz. The light chain polypeptides variábilisdómén light chain variable domain and, where appropriate, CL domain. A találmány szerinri többértékű antitestek, többek kö- - 33 - zött, gyógyászati szempontból kívánatos tulajdonságokkalbírnak. The invention szerinri multivalent antibodies, including MID - 33 - secured desirable pharmaceutically tulajdonságokkalbírnak. Például, a többértékű antitest tulajdonságai a kö-vetkezők: (1) egy antigént (amelyhez az antitest kötődniképes) termelő sejt gyorsabban ínternalizálja (és/vagykatabolizálja), mint egy kétértékű antitestet; For example, the multivalent antibody properties of the co-sin (1) an antigen (to which the antibody kötődniképes) producing cells rapidly internalized (and / vagykatabolizálja) than a bivalent antibody; (2) agonistatulajdonságú antitest; (2) agonistatulajdonságú antibody; és/vagy (3) a többértékű antitestáltal megköthető antigént termelő sejt sejthalálát és/vagyapoptózisát képes indukálni. capable of inducing and / or (3) cell death and / vagyapoptózisát producing multivalent antibody bindable to the antigen by the cell. A többértékű antitest legalábbegy antigénkötő specifitását adó "kiindulási" antitestolyan antitest, amelyet az antitest által megköthető anti-gént termelő sejt internalizálni (és/vagy katabolizálni)képes; The multivalent antibody is capable of at least one antigen binding specificity of tax "parent" antibody is an antibody producing cell which is internalized bindable by the antibody-antigen antibody (and / or catabolized); és vagy agonista, sejthalált indukáló és/vagyapoptózist indukáló tulajdonságú, és a találmány szerintitöbbértékű antitest e tulajdonságok közül egy vagy több te-kintetében javulást mutat. and either agonist, cell death-inducing, and / vagyapoptózist inducing properties, and the present invention is an improvement in one or more TE kintetében szerintitöbbértékű antibody of those properties. Ezen túlmenően, előfordulhat,hogy a kiindulási antitestre a felsorolt tulajdonságok kö-zül egy vagy több nem jellemző, de többértékű antitestkéntlétrehozva e tulajdonságokkal felruházható. In addition, there may be the parent antibody with the attributes KO zul one or more characteristic but multivalent antibody created endowed with these characteristics. A találmány szerinzi többértékű antitestek három vagytöbb antigénkötő helye azonos antigénhez vagy két vagy több(pl. kettő vagy kb. három) különböző antigénhez kötődhet. szerinzi multivalent antibodies of the present invention, three or more antigen binding sites may bind to the same antigen or two or more (eg. two or approx. three) different antigens. A többértékű antitest a következő antigénekhez kötőd-het: (1) tumorsejtek által termelt (vagy túltermelt) sejt-felületi protein, pl. The multivalent antibody comprises the antigen binding het following: produced by (1) tumor cells (or overexpressed) cell surface protein, e. epidermális növekedési faktor recep-tor (EGFR), HER2-receptor, HER3-receptor, HER4-receptorvagy RcR3; epidermal growth factor receptor (EGFR), HER2 receptor, HER3 receptor, HER4 receptorvagy RcR3; (2) a tumornekrózis-faktor (TNF) receptor- főcsaládba tartozó receptor, pl. (2) tumor necrosis factor (TNF) receptor superfamily belonging receptor, e. Apo2L-receptor (pl. DR4,DR5, DcRl vagy DcR2); Apo2L receptor (e.g. DR4, DR5, DcRl or DcR2.); és/vagy (3) B-sejt-felületi antigén • ·· · - 34 - (pl. CD19, CD20, CD22 vagy CD40). and / or (3) B-cell surface antigen • · ·· - 34 - (. e.g. CD19, CD20, CD22 or CD40). A találmány előnyös meg-valósítási módja szerint a többértékű antitest valamennyiműködőképes antigénkötő helye ugyanazon antigénhez kötődik(pl. egy négyértékű antitest mind a négy antigénkötő helyeaz (1), (2) vagy (3) pontban megadott antigénhez kötődik. A találmány szerinti megoldás értelmében feltárunk to-vábbá olyan immunkonjugátumokát is, amelyek a többértékűantitestet citotoxikus hatóanyaghoz konjugálva tartalmaz-zák. Az ilyen immunkonjugátumok citotoxikus hatóanyagkéntolyat tartalmazhatnak, amely internalizációt követően fejtiki sejtölő aktivitását. A találmány tárgyát képezi továbbá egy polipeptid-lánc, amely VD1-(XI) n-VD2-(X2) n-Fc általános képlettel ír-ható le, amelyben VD1 jelentése: első variábilis dómén; VD2jelentése: második variábilis dómén; Fc jelentése: egy Fc-régió polipeptid-lánca; XI és X2 jelentése: aminosav vagypolipeptid; és "n" értéke 0 vagy 1. Például, a polipeptid-l In a preferred in-to cleavage of the invention, the multivalent antibody may all functional antigen binding site binds to the same antigen (eg. a tetravalent antibody to all four antigen binding helyeaz bound given in (1), (2) or (3) antigen. There is described According to the invention, EXTRA immunoconjugates which contains FCL the multivalent antibody conjugated with a cytotoxic drug. such immunoconjugates cytotoxic agent as one that may include that after internalization fejtiki cytocidal activity. the invention also provides a polypeptide chain comprising VD1- (XI) n-VD2 - (X2) n-Fc formula Irish be described, wherein VD1 is a first variable domain; VD2jelentése: second variable domain, Fc is an Fc region of the polypeptide chain; XI and X2 represent an amino acid vagypolipeptid; and "n 'is 0 or 1. For instance, the polypeptide l énc a következők egyike lehet: VH-CH1-(flexibiliskapcsolószekvencia)-VH-CHl-Fc-régió; VH-CHl-VH-CHl-Fc-régiő; ENC may be one of the following: VH-CH1 (flexibiliskapcsolószekvencia) -VH-CHl-Fc region; VH-CHl-VH-CHl-Fc region chain; VL-CL-(flexibilis kapcsolószekvencia)-VL-CL-Fc-régiő; VL-CL (flexible linker) VL-CL-Fc region; vagy VL-CL-VL-CL-Fc-régió. CL-VL or VL-CL-Fc region. Fgy másik megvalósításimód szerint a polipeptid-lánc a következők egyikét tartal-mazza: VH-CHi-(flexibilis kapcsolószekvencia)-VH-CH1- íöimerizácós dómén); According to another dram megvalósításimód the polypeptide chain may comprise one of the following Mazza VH-Chi (flexible linker) -VH-CH1 íöimerizácós domain); VH-CH1-VH-CH1-(dimerizácós dómén); VH-CH1-VH-CH1 (dimerizácós domain); VL-CL- (flexibilis kapcsolószekvencia)-VL-CL-(dimerizácósdómén); VL-CL (flexible linker) linker-VL-CL (dimerizácósdómén); vagy VL-CL-VL-CL-(dimerizációs dómén). or VL-CL-VL-CL (dimerization domain). Például, apolipeptid-lánc VH-CH1-(flexibilis kapcsolószekvencia)-VH-CHl-csuklő-régió vagy VH-CHl-VH-CHl-csukló-régió szekvenci- 9 · • · ······ ·· ··· «*· · ·*····· · ·· · • ··· ·· ···· ·· - 35 - át tartalmaz. For example, VH-CH1 chain apolipeptid (flexible linker) -VH wrist-CHI-CHI-region or VH-CHI-VH-hinge region szekvenci- • 9 · · · · · ·· ······ "* * ····· · · · · · · · • · ·· ·· ·· ···· - 35 - it includes over. A találmány tárgyát képezi továbbá egy anti-test, amely egy vagy több (előnyösen két) ilyen polipeptid-láncot tartalmaz. The invention also relates to an anti-body, which comprises one or more (preferably two) of these polypeptide chains. Az antitest előnyösen tartalmaz még leg-alább két (és előnyösen négy) könnyű lánc vagy nehéz láncvariábilis dómén polipeptidet (például, amelyben a könnyűlánc variábilis dómén polipeptidek VL-CL-láncot, a nehézlánc variábilis dómén polipeptidek pedig VH-CHl-láncot tar-talmaznak) . The antibody preferably comprises at most-least two (and preferably four) light chain or heavy chain variable domain polypeptide (e.g., having a light chain variable domain polypeptides VL-CL chain in the light chain variable domain polypeptides is a VH-CHI chain sugars content are ). A találmány szerinti megoldás értelmében feltárunk to-vábbá egy polipeptid-láncot, amely három vagy több nehézvagy könnyű lánc variábilis domént tartalmaz, melyek mind-egyike három vagy több könnyű vagy nehéz lánc variábilisdómén polipeptiddel képes kombinálódni, ezáltal három vagytöbb antigénkötő helyet létrehozva, melyek mindegyikeugyanazon antigénhez képes kötődni. According to the present invention is disclosed to-PHI a polypeptide chain comprising a variable domain of three or more heavy or light chain which is capable of combining a polypeptide each-one of the three or more light or heavy chain variábilisdómén, to form three or more antigen binding sites, all with the same ability to bind to antigen. Feltárunk továbbá egyizolált antitestet, amely találmány szerinti polipeptid-láncot tartalmaz. egyizolált invention further provides an antibody comprising a polypeptide chain of the invention. A találmány előnyös megvalósítási módjaszerint, amennyiben a polipeptid-lánc három vagy több nehézlánc variábilis domént tartalmaz, az antitest előnyösen há-rom vagy több könnyű lánc variábilis dómén polipeptidet istartalmaz., amelyek a nehéz lánc variábilis doraénekkel kom-binálódva három vagy több antigénkötő helyet hoznak létre. preferred embodiment of the invention, where the polypeptide chain comprises three or more heavy chain variable domains, the antibody can include variable domain polypeptide, preferably three or more light chain. which comm binálódva produce three or more antigen binding sites of the heavy chain variable dora individuals created.

Az ilyen antitestek példáit a 23/D ábrán (három antigénkötőhely) és 23/E ábrán (négy antigénkötő hely) mutatjuk be.Ezen túlmenően, feltárunk egy polipeptid-láncot, amely akövetkező általános képletekkel írhatók le: (a) VL-CL-{flexibilis kapcsolószekvencia)-VL-CL-(flexibilis kapcsoló-szekvencia) -VL-CL; Examples of these antibodies are shown in Figure 23 A / D (three antigen binding sites) and 23 / E shows (four antigen binding sites) in addition BE.EZ, the invention provides a polypeptide chain, which can be described by the general formulas akövetkező: (a) VL-CL { flexible linker) linker-VL-CL (flexible linker) linker-VL-CL; (b) VH-CH1-(flexibilis kapcsoló- • ·· • · - 36 - szekvencia)-VH-CHl-(flexibilis kapcsolószekvencia)-VH-CH1;(c) (VL-CL)n (ahol "n” értéke: 3 vagy több); vagy (d) (VH-CHl )n, ahol ”n” értéke: 3 vagy több. (B) VH-CH1 (flexible connecting • • · ·· - 36 - sequence) -VH-Chl (flexible linker) -VH-CH1, (c) (VL-CL) n (where "n" is : 3 or more), or (d) (VH-CHI) n, wherein the value "n" is 3 or more.

Szintén a találmány tárgyát képezik a következők: izo-lált nukleinsav, amely a találmány szerinti többértékű an-titestet vagy polipeptid-láncot kódolja; The invention also relates to the following: iso-occupied nucleic acid encoding the multivalent anti-titestet or polypeptide chain of the invention; vektor, amely amultimer antitestet vagy polipeptid-láncot kódoló nuklein-savat tartalmaz, amely - adott esetben - működőképesen (avektorral transzformált gazdasejt által felismert) szabá-lyozószekvenciákhoz van kapcsolva; vector comprising a coding amultimer antibody or polypeptide chain nucleic acid which is - optionally - is switched control sequences operably (recognized by a host cell transformed avektorral); gazdasejt, amely talál-mány szerinti multimer antitestet vagy polipeptid-láncotkódoló nukleinsavat tartalmaz (pl. ilyen nukleinsavval vantranszformálva); A host cell comprising a multimeric antibody or polypeptide nucleic acid of about láncotkódoló detection ranges (e.g. vantranszformálva such a nucleic acid.); eljárás többértékű antitest vagypolipeptid-lánc előállítására, melynek során a gazdasejteta nnkleinsav expresszáltatása céljából tenyésztjük, és -adott esetben - a gazdasejt tenyészetéből (pl. a gazdasejttenyésztő tápközegéből) kinyerjük a többértékű antitestetvagy polipeptid-láncot. The multivalent antibody method vagypolipeptid chain preparing cultured to gazdasejteta nnkleinsav Expression during which, and -optionally - the host cell culture (e.g., the host cell culture medium) recovering the multivalent antibody or polypeptide chain. A többértékű antitest nehéz láncvariábilis doménjeit kódoló nukleinsavat és könnyű lánc va-riábilis dóménjeit kódoló nukleinsavat előnyösen a kétfélenukleinsavval transzformált gazdasejttel együttesenexpresszáltatjuk. The multivalent antibody heavy chain variable domains with nucleic acid encoding and light chain v-domains with nucleic acid encoding preferably riábilis együttesenexpresszáltatjuk kétfélenukleinsavval the transformed host cell. A nehéz lánc, illetve könnyű láncvariéiblis doméneket kódoló nukleinsavak azonos vagy külön-böző vektorokban helyezkedhetnek el. The heavy chain and nucleic acids encoding the light láncvariéiblis be located in the same or separate domains, various vectors.

Szintén a találmány tárgyát képezik a többértékű anti-testek diagnosztikai és terápiás célú alkalmazásai. The invention also relates to multivalent anti-antibodies for diagnostic and therapeutic purposes. Azegyik diagnosztikai célú alkalmazást illetően, eljárást tá-runk fel egy kérdéses antigén jelenlétének meghatározására, 37 unless one diagnostic application regarding the method aspire for MS-up question to determine the presence of an antigen, 37

melynek során egy - feltételezhetően antigént tartalmazó -mintát többértékű antitesttel érintkeztetünk, és meghatá-rozzuk a többértékű antitest mintához történő kötődését. whereby a - -mintát suspected antigen is contacted with the multivalent antibody and the particles is determined multivalent antibody binding to the sample. A találmány tárgyához tartoznak az in vitro és in vivő diag-nosztikai eljárások egyaránt. The present invention includes in vitro and in vivo diag-nostic both procedures.

Egy terápiás célú alkalmazást illetően feltárunk egyeljárást egy betegségtől vagy rendellenességtől szenvedő(vagy ilyen betegség vagy rendellenesség kialakulásával ve-szélyeztetett) emlős kezelésére, melynek során az emlősnekegy találmány szerinti többértékű antitest (vagy a többér-tékű antitestet és gyógyászati szempontból elfogadható hor-dozón tartalmazó készítmény) terápiás szempontból hatásosmennyiségét adagoljuk. In a therapeutic application as regards the invention provides one space weather treating a mammal suffering from a disease or disorder (or the formation of such a disease or disorder ve-endangered) in which the multivalent antibody (or multivalent antibody and compositions pharmaceutically acceptable containing carriers for on a carrier according to the mammal to the invention ) therapeutically effective amount. A találmány szerinti eljárással ke-zelhető rendellenesség, például, rák, mely esetben az em-lősnek egy citotoxikus hatóanyag terápiás szempontból hatá-sos mennyiségét is adagoljuk. according to the invention cross-be managed disorder, e.g., cancer, in which case a cytotoxic agent is administered therapeutically effective amount of a decision-sos em-Losne well. Szintén a találmány tárgyátképezi egy eljárás ráksejt apoptózisának indukálására,melynek során a sejtet zalálmány szerinti - tumornekrózis-faktor (TNF) receptor-főcsaládba tartozó receptorhoz kötődő- többértékű antitesztel érintkeztetjük. The invention also provides a method for inducing apoptosis of cancer cells, comprising exposing the cell of zalálmány - contacting kötődő- multivalent antibody test a receptor in the tumor necrosis factor (TNF) receptor superfamily. Az eljárás B-sejtelpusztításét is magában foglalhatja, melynek sorén a B-sejtet 3-sejt-felüieti antigénhez kötődő többértékű anti-testtel érintkeztetjük. The method may include B sejtelpusztításét also having bonded Sören contacting the B cells of 3 cell surface area of ​​polyvalent anti-antigen antibody. Ezen túlmenően, az eljárás ErbB-recepfort termelő (vagy túlzott mértékben termelő) sejt el-pusztítására is alkalmazható, melynek során a sejtet ErbB-receptorhoz kötődő antitesttel érintkeztetjük. Furthermore, the method, ErbB recepfort producer (or overexpressing) cell may be used in well-killing, comprising contacting the cell with bound ErbB receptor antibody. A következőkben az ábrák rövid leírását ismertetjük. A BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS.

Az 1. ábrán a natív IgG-t és annak (1) két Fab- ···· ·· ·· ·· • ···«····· ·· · · ··· • · · ·• · · ·· ··*· «« 38 frargmenst és egy Fc-régiót eredményező papainos emésztésé-vel, illetve (2) egy F(ab')2-fragmenst és több kisméretűfragmenst eredményező pepszines emésztésével kapottfragmenseit mutatjuk be. In Figure 1, native IgG and its (1) ·· ·· ·· two Fab ···· ··· • «• ····· ·· · · · · · · · · · • · ·· ·· · * «« resulting frargmenst 38 and an Fc region papain, and (2) yields an F (ab ') 2 fragments and a plurality kisméretűfragmenst pepsin digestion of kapottfragmenseit shown. Az ábrán a diszulfid-kötéseket a CH1- és CL-domének közötti, illetve a két CH2-domén közötti vonalakkal jelöljük; The figure shows the disulfide bonds are shown as lines between CH1 and CL domains and between the two CH2 domains; V jelentése: variábilis dómén; V is: variable domain; C je-lentése: konstans dómén; C-je Lentes constant domain; L jelentése: könnyű lánc; L represents a light chain; és H je-lentése: nehéz lánc. and H-je Lentes heavy chain. A 2/A-2/E ábrákon a természetben előforduló öt fő im-munglobulin-izotípus szerkezetét mutatjuk be: IgG (2/A áb-ra); A 2 / A-2 / E drawings shows a structure of the naturally occurring five main microns munglobulin isotypes: IgG (2 / Ab-RA); IgD (2/B ábra); IgD (Figure 2 / B); IgE (2/C ábra); IgE (Figure 2 / C); IgA-dimer (2/D ábra) ,-és IgM-pentamer (2/E ábra). Dimeric IgA (Figure 2 / D) -and pentameric IgM (Figure 2 / E). A 3. ábrán a natív szekvenciéjú IgG-Fc-régiók [humánIgG-Fc-régiók: humlgGl (nem-A és A-allotípus; 1., illetve 2. azonosítószámú szekvencia); In Figure 3, the native szekvenciéjú IgG Fc regions [humánIgG Fc regions: humlgGl (non-A and A allotypes; 1 or SEQ ID NO 2); hum.IgG2 (3. azonosítószámúszekvencia); hum.IgG2 (SEQ ID No. 3); humlgGo [4. humlgGo [4th azonosítószámú szekvencia) éshumIgG4 (5. azonosítószámú szekvencia)] egymás alá rende-zéssel végzett összehasonlítását mutatjuk be. are shown in SEQ ID NO:) éshumIgG4 (SEQ ID NO: 5)] under a comparison with other-regulation works. A humán igGl-szekvencia nem-A aliotípusú; The human IgGl sequence is the non-aliotípusú; az e szekvencia és az A-allotípus közötti különbségeket (az Eü számozási rendszerszerinti 356. és 358. pozícióban) a humán IgGl szekvenciájaalatt tüntetjük fel. differences between this sequence and the A allotype (the EU numbering scheme of position 356 and 358) are shown below the human IgGl sequence. Az ábrán összehasonlításul bemutatjuka natív szekvenciája egéreredetű IgG-Fc-régiókat is[murlgGl (6. azonosítószámú szekvencia), murIgG2A (7.azonosítószámú szekvencia), murIgG2B (8. azonosítószámúszekvencia) és murlgGS (3. azonosítószámú szekvencia). In Figure bemutatjuka comparison of native sequence murine IgG Fc regions [murlgGl (SEQ ID NO: 6), murIgG2A (7.azonosítószámú sequence) murIgG2B (SEQ ID NO: 8) and murlgGS (SEQ ID No. 3). A 4/A és 4/B ábrán a találmány szerinti négyértékű an-titestek sematikus rajzát mutatjuk be. Figure 4 / A, 4 / B are shown in tetravalent anti-titestek schematic diagram of the invention. A 4/A ábrán a négy • ···· ·· »· • · ····«··· ··« ··« * ·*»• · · · · · · · • ··· ·· ··«« ·· - 39 - antigénkötő Fab-fragmenst számozással (mindkét karon 1, il-letve 2), míg a dimerizációs domént X-szel jelöljük. 4 / FIG four • ···· ·· »· · • ····" ··· ·· "··" * · * »• · · · · · · · • ··· ·· ·· «« ·· - 39 - antigen binding Fab fragments numbered (one on each arm, letve 2-yl) and the dimerization domain are marked with a cross. A 4/Bábrán a négyértékű antitest dimerizációs doménje egy Fc-régió. 4 / Babri tetravalent antibody dimerization domain of an Fc region. A 5. ábrán a négyértékű anti-HER2 antitest (OctHER2) 1. példában leírtak szerint végzett expresszáltatására al-kalmazott konstrukciót mutatjuk be. Figure 5 is a tetravalent anti-HER2 antibody are shown in the sub-expression construct kalmazott performed as described (OctHER2) Example 1. A 6/A-6/C ábrákon az 0ctHER2-antitest (6/A ábra); 6 / A-6 / C-0ctHER2 Figures antibody (Fig 6 / A); a293-as sejtek által termelt, kétértékű rhuMab 4D5-8 IgGl-antitest (6/B ábra); produced by A293 cells as divalent rhuMAb 4D5-8 IgGl antibody (Fig 6 / B); és a fiolázott (CHO-sejtekben termel-tetett) HERCEPTIN® (6/C ábra) HER2 extracelluláris doménhez(ECD) történő kötődését szemléltetjük, melyet enzimkötöttimmünstorbens vizsgálati eljárással (ELISA) határoztunk meg. and it is illustrated by the binding of HERCEPTIN (Figure 6 / C) of the HER2 extracellular domain (ECD) (produced, shall be made in CHO cells) in vials, as determined enzimkötöttimmünstorbens assay (ELISA). A 7. ábrán az OctHER2-antitest HER2-ECD-hez történő kötődésének ultracentrifugálási analízisének eredményétszemléltetjük. Figure 7 eredményétszemléltetjük OctHER2 binding of antibody to HER2 ECD With ultracentrifugation analysis of. A grafikonon az (elméleti, illetve kísérletiúton meghatározott) átlagos molekulatömeget az 0ctHER2-anzitesz:HER2-ECD X-tengelyen feltüntetett mólaránya függ-vényében ábrázoljuk. The graph (theoretical or experimentally determined), number average molecular weight of 0ctHER2-anzitesz: HER2-ECD shown plotted x-axis the molar ratio depends on the prescription. A négy teljesen működőképes kötőhelyettartalmazó négyértékű antitestet feltételező elméleti átla-gos molekulatömegeket körökkel; The four fully functional kötőhelyettartalmazó tetravalent antibody assuming a theoretical molecular weights averaged gos circles; a három teljesen működőké-pes kötőhelyet tartalmazó négyértékű antitestet feltételezőelméleti átlagos molekulatömegeket négyzetekkel; tetravalent antibodies comprising three completely efficient ones pes-binding site feltételezőelméleti average molecular weights squares; míg a kí-sérletileg meghatározott molekulatömegeket háromszögekkeljelöljük. while the experimentally ki-defined molecular masses háromszögekkeljelöljük. AS/A-8/D ábrákon a HERCEPTIN® és az 0ctHER2 sejtsza-porodést gátló aktivitását hasonlítjuk össze. Figures AS / A-8 / D compared inhibitor and HERCEPTIN 0ctHER2 sejtsza-porodést activity. A kísérlete- • ··· • · ·<···»·« «·· ··» * ······· · ·· ·• ·«« ·· ··♦· ·« - 40 - két a következő sejtvonalak alkalmazásával végeztük: HER2-t3+ mértékben túltermelő SKBR3-sejtvonal (8/A ábra); Experiments • • · · · · · <· · · »·« «·· ··» * ······· ·· · · • · «« ·· ·· · · ♦ "- 40 - two were performed using the following cell lines: t3 + HER2 overexpressing cell line SKBR3 (Figure 8 / A); HER2-t2+ mértékben túltermelő MDA-361-sejtvonal (8/B ábra); T2 + HER2 overexpressing MDA-361 cell line (Figure 8 A / B); HER2-t 3+ mértékben túltermelő BT474-sejtvonal (8/C ábra); 3+ HER2 overexpressing BT474 cell line (Figure 8 / C); és 0+HER2-termelődést mutató MCF7-sejtvonal (8/D ábra). and 0 + HER-2 production in indicator cell line MCF7 (Figure 8 / D). A 9. ábrán a flexibilis kapcsolószekvenciák négyértékűanti-HER2 antitestek - MDA-231-sejtekre (1+ HER2-túltermelés) és SKBR3-sejtekre (3+ HER2-túltermelésj vonat-kozó - sejtszaporodás-gátló aktivitására gyakorolt hatásátszemléltetjük. A 10. ábrán az 0ctHER2 (10/A ábra) és a HERCEPTIN®(10/3 ábra) internalizációjának és katabolizmusának össze-hasonlítását mutatjuk be az MDA-453-sejtvonal (2+ HER2-túltermelés) és SKBR3-sejtvonal (3+ HER2-túltermelés) vo-nat. kozasaban. A lí/A-ll/I ábrákon az OctHER2 internalizációját szem-léltető elektronmikroszkópos felvételeket mutatunk be. A116A-11/F ábrákon a 125I-OctHER2 SKBR3-sejtekben megfigyel-hető szubcelluláris lokalizációját mutatjuk be. Az apikálissejtmembrán bolyháival asszociálva autoradiográfiás ezüst-szemcséket figyeltünk meg (11/A ábra), közvetlen közelébenegy kialakuló, bevonattal ellátott üreget találtunk (11/Bábra, nyíl), sima citoszol vezikulákkal (11/C é Figure 9 shows the flexible linker tetravalent anti-HER2 antibodies - MDA-231 cells (1+ HER2 overexpressing), and SKBR3 cells (3+ HER2 túltermelésj train relevant - anti-proliferative activity on hatásátszemléltetjük Figure 10. 0ctHER2 (Fig 10 / A) and HERCEPTIN (Figure 3.10) internalization and catabolism together, a comparison is shown in the MDA-453 cell line (2+ HER2 overexpressing) cell line and SKBR3 (3+ HER2 overexpressing) vo 's -nat. kozasaban. the lysis / A-II / I illustrate in the OctHER2 internalization eye illustrate electron micrographs. A116-11 / M Figs 125I-OctHER2 SKBR3 cells shown observed-with subcellular localization. associating the apikálissejtmembrán pile of autoradiographic silver grains was observed (Fig 11 / a) found in the immediate vicinity of a formed, coated wells (11 / Mook, arrow), smooth cytosolic vesicles (11 / C, an s 11/D ábra)és endoszómákkal (li/E és 11/F ábra) . A méret jelző vonalak0,25 μη hosszúságúak. s 11 / D figure) and endosomes (Figure li / 11 and E / F). The marker vonalak0,25 μη length. A 11/G-ll/I ábrákon a 0. órában(11/G) és az 5. órában (11/H és 11/1 ábra) megfigyelhetőinternál!zéciót szemléltetjük. 11 / G-II / I Figures megfigyelhetőinternál! Illustrated zéciót 0 hr (11 / G) and 5 hours (11 / H and Figure 1.11). A 12/A-12/E ábrákon a DR5 elleni négyértékű antitest • *··· ·« *4 « 4 ·#···* • · ·»· ··· t* ····»·· · « » · • ·«· ·* ··.>· « - 41 - (16E2 Octopus), egy DR5 elleni kétértékű IgG-antitest (16E2IgG) és Apo2L/TRAIL (Apo2L) által különböző rákos sejtvona-lak vonatkozásában indukált apoptózist szemléltetjük. 12 / A-12 / E figures tetravalent anti-DR5 antibody • · · · · * "* 4" # 4 · · · · · · • * »* t · · · · ····» · ·· " »· • ·« · * ··> · «-. 41 - (16E2 Octopus), an anti-DR5 bivalent IgG antibody (16E2IgG) and induced by Apo2L / TRAIL (Apo2L) various cancer cell lines lak respect apoptosis illustrated. Asejtvonalak a következők voltak: COLO-205 (12/A ábra); Asejtvonalak were: COLO-205 (Fig 12 / A); SK-MES-1 (12/B ábra); SK-MES-1 (Fig 12 / B); HCT116 (12/C ábra); HCT116 (Figure 12 / C); HOP-92 (12/D ábra);és a nem rákos kontroll HUMEC-sejtvonal (12/E ábra). HOP-92 (Figure 12 / D) and the non-cancerous control HUMEC cell line (Figure 12 / E). A 13/A-13/D ábrákon az apoptózisos sejtek kimutatásáraalkalmazott szövettani metszeteket mutatjuk be. A 13 / A 13 / D illustrate an kimutatásáraalkalmazott tissue sections were apoptotic cells. A 16E2-Octopus antitesttel és az Apo2L/TRAIL-ligandummal kezeltegerekből származó tumorszöveteket 10 %-os formaiinban fi-xáltuk, majd parafilmbe ágyaztuk, metszeteket készítettünk,és azokat tárgylemezekre helyeztük. Tumor tissues from 16E2 Octopus antibody and the Apo2L / TRAIL ligand treated mice a 10% formalin-fi xáltuk and embedded in parafilm, sectioned, and were mounted on slides. Hematoxilinnel és eo-zinnal végzett festést követően a metszeteket 400-szorosnagyítással vizsgáltuk. After staining with hematoxylin and eo-Zinn-400 the sections were examined szorosnagyítással. A 16E2-Octopus 6. és 24 órában meg-figyelt hatását a 13/A, illetve 13/B ábrán; The 16E2 Octopus 6 and 24 hours, monitored by the impact of Figure 13 / A or 13 / B; a kontrollalkezelt sejteket a 13/C ábrán; kontrollalkezelt the cells in Figure 13 / C; az Apo2L/TRAIL-ligandummalkezelt sejteket pedig a 13/D ábrán mutatjuk be. Apo2L / TRAIL ligandummalkezelt cells are shown in Figure 13 / D. A 14. ábrán az Apo2L/TRAIL (60 mg/kg dózissal, hetenteörszöri adagolás); In Figure 14, the Apo2L / TRAIL (60 mg / kg, hetenteörszöri dosing); kétértékű 3H3-IgG (5 mg/kg dózisban a0., 3., 5. és 9. napon adagolva); bivalent 3H3-IgG (5 mg / kg administered, a0 3, 5 and 9 days.); kétértékű 16E2-IgG (16E2; 5 mg/kg dózisban 0., 3., 5. és 9. napon adagolva); divalent 16E2 IgG (16E2; a dose of 5 mg / kg administered 0, 3, 5 and 9 days); és 16E2-Gctopus (5 mg/kg dózisban a 0., 3., 5. és 9. napon adagol-va) thymushiányos csupasz egerekben lévő COLO-205 tumorokragyakorolt in vivő aktivitását mutatjuk be. and shown Gctopus-16E2 (a dose of 5 mg / kg on days 0, 3, 5 and 9 days of dosing-va) tumorokragyakorolt ​​COLO-205 in athymic nude mice in vivo activity. A 15. ábrán az egértesztekben alkalmazott Apo2L/TRAIL-ligandum és 16E2-Octopus-antitest apoptózisos aktivitásátszemléltető in vitro alamarBlue-teszt eredményét mutatjukbe (Apo2L-standard pozitív kontrolihoz viszonyítva). In Figure 15, the Apo2L / TRAIL ligand and 16E2 Octopus antibody apoptotic activity in vitro alamarBlue illustrative test result used in the mouse studies mutatjukbe (compared to an Apo2L standard positive control). A ne- 42 • ·*«· «4 4» ·»' • * ··· ··· » ····«·» · « · » * ·«« ··)« »χ gatív kontrollként alkalmazott anti-IgE antitest (E25) azegértesztekben nem bizonyult apoptózisos aktivitásúnak. The NE 42 • · * "·" 4 4 "·» '• * ··· ··· "····« · »·« · »· *« «··)« »χ gatív antibody used as a control -Yes antibody (E25) has not proved azegértesztekben apoptotic activity. A 16. ábrán a DR5 elleni 3H3-Octopus-antitest és a DR5elleni 16E2-Octopus-antitest különböző tételei kristályibo-lya apoptózis-tesztben végzett összehasonlítását szemlél-tetjük. Figure 16 shows the anti-DR5 3H3 Octopus antibody and DR5elleni 16E2 Octopus antibody comparison in apoptosis assay with various items illustrated kristályibo-Lya-bet. A 17/A és 17/B ábrán az Apo2L/TRAIL-ligandum (ld. WO97/25428 számú nemzetközi közzétételi irat}; anti-DR5 3H3-Octopus-antitest; anti-DR5 16E2-Octopus-antitest és - anti-FLAG antitesttel keresztkötött FLAG epitóp-toldalékot tar-talmazó - Apo2L/TRAIL-ligandum (ld. WO 97/25428 számú nem-zetközi közzétételi irat) alamarBlue apoptózis-tesztben, 5% magzati borjúszérum (FBS) jelenlétében SK-MES-l-sejtekre(17/A ábra) és Jurkat-sejtekre (17/B ábra) gyakorolt hatá-sát szemlélőétjük. A 18/A-18/C ábrákon az anti-DR5 16S2-Octopus-antitest(felső grafikonok) és az Apo2L/TRAIL-ligandum (alsó grafi-konok) leukémia, nem kissejtes tüdőrák, vastagbélrák, köz-ponti idegrendszeri rák, melanoma, petefészekrák, veserák,prosztatarák és emlőrák humán tumorsejtvonalak szaporodásá-ra (a 2. napon) gyakorolt hatását szemléltető dózis-reakciógörbéket mutatunk be. Az eredmények a Nemzeti Rákkutató In-tézet Gyógyászati Fejlesztési Programjából Figure 17 / A and 17 / B of Apo2L / TRAIL ligand (see WO97 / 25428 Appl}; anti-DR5 3H3 Octopus antibody; anti-DR5 16E2 Octopus antibody, and - anti-FLAG antibody. crosslinked FLAG epitope tag tar talmazó - Apo2L / TRAIL ligand (. see WO 97/25428 number of non-zetközi discloses) alamarBlue apoptosis assay, 5% fetal bovine serum (FBS) in SK-MES-I cells (17 / in the Figure) and szemlélőétjük on Jurkat cells (Fig 17 / B) decision-SAT. 18 / A-18 / C drawings, the anti-DR5 16S2 Octopus antibody (upper graphs) and Apo2L / TRAIL ligand ( shown illustrating the effect of the lower graft silicones) leukemia, non-small cell lung cancer, colon cancer, square, central nervous system cancer, melanoma, ovarian cancer, renal cancer, prostate cancer and breast cancer human tumor cell proliferation to (on day 2) dose-response. the results the National Cancer institute in-Therapeutic Development Program származnak. Va-lamennyi mintát öt koncentrációval teszteltük (a törzsoldat1 %-os hígításával kezdve (16E2-Octopus 0,2 mg/ml koncent-rációjú törzsoldat), és annak 4 x 0,51og hígításával). derived. Va Accordingly, each sample was tested five concentrations (from aqueous dilution törzsoldat1% (16E2 Octopus 0.2 mg / ml concentration of the carbanion stock solution), and the 4 x 0,51og dilution). A 19/A-19/C ábrákon az anti-DR5 16E2-Octopus-antitest(felső grafikonok) és az Apo2L/TRAIL-ligandum (alsó grafi- • · «V ·· * «·«· • · • * ··»«··· « * 9 4 « ··· 43 konok) leukémia, nem kissejtes tüdőrák, vastagbélrák, köz-ponti idegrendszeri rák, melanoma, petefészekrák, veserák,prosztatarák és emlőrák humán tumorsejtvonalak szaporodásá-ra (a 6. napon) gyakorolt hatását szemléltető dózis-reakciógörbéket mutatunk be. 19 / A-19 / C, the anti-DR5 16E2 Figs Octopus antibody (upper graphs) and Apo2L / TRAIL ligand (lower graphically • · «V ·· *« · «· • * • · ·· »« ··· «* 9 4 '··· 43 silicones) leukemia, non-small cell lung cancer, colon cancer, square, central nervous system cancer, melanoma, ovarian cancer, renal cancer, prostate cancer and breast cancer human tumor cell proliferation to (day 6) It shows an example dose-response effect. Az eredmények a Nemzeti Rákkutató In-tézet Gyógyászati Fejlesztési Programjából származnak. The results come from the National Cancer Therapeutic Development Program, In-institute. Va-lamennyi mintát öt koncentrációval teszteltük (a törzsoldat1 %-os hígításával kezdve (16E2-Octopus 0,2 mg/ml koncent-rációjú törzsoldat), és annak 4 x 0,51og hígításával). Va Accordingly, each sample was tested five concentrations (from aqueous dilution törzsoldat1% (16E2 Octopus 0.2 mg / ml concentration of the carbanion stock solution), and the 4 x 0,51og dilution). A 20/A és 20/B ábrán a Nemzeti Rákkutató IntézetGyógyászati Fejlesztési Programból származó 2 napos invitro eredmények kvantitatív összefoglalását mutatjuk be aszaporodás-gátlás (GI50), stasis (TGI) és toxicitás (LC50)vonatkozásában, az anti-DR5 16E2-Octopus (20/A ábra) és azApo2L/TRAIL (20/B ábra) összehasonlításéval. Figure 20 / A and 20 / B shows the quantitative summary of two days invitro results from the National Cancer Institute Developmental Therapeutics Program at aszaporodás inhibition (Gi 50), stasis (TGI) and toxicity (LC50) in respect of the anti-DR5 16E2 Octopus ( 20 / in the Figure) and azApo2L / TRAIL (Fig 20 / B) are compared with those. A 21/A és 21/3 ábrán a Nemzeti Rákkutató Intézet Figure 21 / A and 21/3 of the National Cancer Institute

Gyógyászati Fejlesztési Programból származó 6 napos invitro eredmények kvantitatív összefoglalását mutatjuk be aszaporodás-gátlás (GI50), stasis (TGI) és toxicitás (LC50)vonatkozásában, az anti-DR5 16E2-Octopus (21/A ábra) és azApo2L/TRAIL (21/B ábra) összehasonlításával. shows quantitative summary 6 days invitro results from the Developmental Therapeutics Program at aszaporodás inhibition (Gi 50), stasis (TGI) and toxicity (LC50) in respect of the anti-DR5 16E2 Octopus (Fig 21 / A) and azApo2L / TRAIL (21 / B) comparing. A 22. ábrán Wii-2-sejtek CD20 elleni RITUXAN©-antitest, anti-humén IgG-vel keresztkötött RITUXAN®(RIT'JXAN®-IgG) és egy négyértékű anti-CD20 antitest(OctCD20) által kiváltott apoptózisát szemléltetjük. Figure 22 shows anti-CD20 RITUXAN Wii-2 cells is illustrated © antibody is cross-linked anti-IgG Hume induced RITUXAN (RIT'JXAN® IgG) and a tetravalent anti-CD20 antibody (OctCD20) apoptosis. A 23/A-23/E ábrákon a teljes hosszúságú, négyértékűOctopus-antitest (23/B ábra), az Octopus-F(ab)'2 (23/C áb-ra) , PQPoct-3 Fab (23/3 ábra) és POPoct-4 Fab (23/E ábra) • · ·· ·· · · ·« • · · · · · • · · · · ······· · · · · • · · · ·· ···· ·· - 44 - sematikus rajzát mutatjuk be (a natív IgG-vel összehason-lítva; 23/A ábra). A 23 / A 23 / E figures, the full length négyértékűOctopus antibody (Fig 23 / B) of the Octopus F (ab ') 2 (Figure 23 / C), PQPoct-3 Fab (Figure 3.23 ) and POPoct-4 Fab (Figure 23 / E) • ·· ·· · · · · «• • · · · · · · · · · · · · · ······· • · · · ·· shows a schematic drawing (with similarity Lithuanian native IgG; 23 / Figure) - ···· ·· - 44th Az anti-CD20 (C2B8) Octopus-proteinekreprezentatív, Coomassie-színezékkel festett Tris-Glicingéljén a teljes antitestek méretét nem redukáló feltételekmellett hasonlíthatjuk össze (23/F ábra), a nehéz láncokméretét pedig redukáló feltételek mellett (melyek hatásáraa diszulfid-hidak felszakadnak, elválasztva ezáltal a nehézés könnyű láncokat) hasonlítjuk össze (23/G ábra). The anti-CD20 (C2B8) Octopus proteinekreprezentatív, stained with Coomassie dye Tris Glicingéljén whole antibodies size non-reducing conditions in addition to be compared (Figure 23 / F), the heavy chains of size has (which hatásáraa disulfide bridges are disrupted under reducing conditions, separated nehézés thereby the light chains) are compared (Figure 23 / G). A 24. ábrán az Octopus-F(ab')2-gerincváz létrehozásá-nak menetét mutatjuk be. Figure 24 is a summary of the Octopus F (ab ') 2 backbone has to be created. Az F(ab')2-gerincbe BamHI-, Nhel-és BspEI-felismerési helyeknél bármely VH/CHl-régió behe-lyettesíthető. The F (ab ') 2 backbone BamHI, NheI and BspEI sites of any recognition VH / CHl region is insertable can be replaced. A 25. ábrán a POPoct-3 nehéz lánc létrehozásának mene-tét mutatjuk be. Figure 25 shows the POPoct-3 heavy-creating escape bid. A 26. ábrán a POPoct-4 nehéz lánc létrehozásának mene-tét mutatjuk be. Figure 26 shows the POPoct-4 heavy-creating escape bid. A 27. ábrán a többértékű anti-HER2 antitestek BT474- sejtek alkalmazásával végzett citostasis-tesztekkel megha-tározott aktivitását szemléltetjük. Figure 27 illustrates the activity specified storage plated cytostasis assays using multivalent anti-HER2 antibodies BT474- cells. A 28/A és 28/B ébrén a többértékű anti-HER2 antitestek SKBR3-sejtek alkalmazásával végzett citostasis-tesztekbenmeghatározott aktivitását szemléltetjük. 28 / A and 28 / B awake illustrated cytostasis assays using the specified activity of multivalent anti-HER2 antibodies SKBR3 cells. Az ábrák n=4citostasis-tesztek görbéire reprezentatívak. The figures are representative curves n = 4citostasis tests. A 29/A és 29/B ábrán a többértékű anti-HER2 antitestekSKBR3-sejtekben (29/A) és BT474-sejtekben (29/B) megfigyel-hető internalizéciós képességét szemléltetjük. Figure 29 / A and 29 / B illustrate-by internalizéciós observed ability of multivalent anti-HER2 antitestekSKBR3 cells (29 / A) and BT474 cells (29 / B). A 30/A és 30/B ábrán a COLO205-sejtek többértékű anti-DR5 antitestek által kiváltott apoptózisát mutatjuk be. Figure 30 / A and 30 / B shown induced COLO205 cells multivalent anti-DR5 antibodies apoptosis. • · · ·· ···· «* 45 - A 31/A és 31/B ábrán a többértékű anti-DR5 antitestek kaszpáz-reakcióúton keresztül megvalósuló jelátvitelétszemléltetjük. • · ·· ···· "* 45 - Figure 31 / A and 31 / B multivalent anti-DR5 antibodies jelátvitelétszemléltetjük through caspase pathway. A 32. ábrán az IgG-vel keresztkötött RITUXAN®(RITUXAN®-IgG) és az IgG-vel keresztkötött OctCD20(OctCD20-IgG) által indukált apoptózist hasonlítjuk össze. Figure 32 is compared to the induced cross-linked IgG RITUXAN (RITUXAN-IgG) and the cross-linked IgG OctCD20 (OctCD20 IgG) apoptosis. A 33. ábrán többértékű anti-CD20 antitestek [IF5; polyhydric Figure 33 shows anti-CD20 antibodies [IF5; ld. ld.

Clark és mtsai.: Proc. Clark et al .: Proc. Natl. Natl. Acad. Acad. Sci. USA 82, 1766 (1985) és IgG-vel keresztkötött IF5 (IF5+IgG-X) WIL2-sejtekre gya-korolt apoptózisos hatását szemléltetjük. Sci. USA 82: 1766 (1985) and cross-linked IgG IF5 (+ IF5 IgG X) illustrated apoptotic effect cottonseed stone WIL2 cells. A 34. ábrán a CD20 elleni IF5-antitest; Figure 34 shows the anti-CD20 IF5 antibody; IgG-vel ke-resztkötött IF5-antitest; IgG cross-linked IF5 antibody; és P0Poct-3-CD20 által WIL2S- sejtekben indukált homotípusos sejtadhéziót szemléltetjük. induced P0Poct-3 and CD20 cells WIL2S- homotypic cell adhesion is illustrated. A 35. ábrán a RITUXAN® és az OctCD20-antitest DB- sejtekben, WIL2-sejtekben és Ramos B-sejt-limfoma sejtvo-nalban megfigyelhető internalizációját és katabolizmusátszemléltetjük. Figure 35 RITUXAN® and OctCD20 antibody DB cells, WIL2 cells and Ramos B cell lymphoma cell line nalban observable internalization and katabolizmusátszemléltetjük. A következőkben a találmány előnyös megvalósítási mód-fait ismertetjük részletesen. The following describes a preferred embodiment, fait detail. I) Definíciók A leírásban és a szabadalmi igénypontokban az immun-globulinok nehéz lánca aminosavainak számozását a Kábát ésmtsai. I) Definitions As used herein and in the claims the immune-globulin heavy chain of amino acid residues in the Kabat numbering ésmtsai. ("Sequences cf Proteins of Immunological Interest", 5. kiadás, Public Health Service, National Institutes of ( "Sequences cf Proteins of Immunological Interest," 5th Edition, Public Health Service, National Institutes of

Health, Bethesda, MC (1991), mely forrást teljes terjedel-mében a kitanítás részének tekintjük] által leírt EU- • « ·· ··« ··· · ··· • · · · · ·· · • ··· · * ···· ·· - 46 - indexnek megfelelően adjuk meg. described by Health, Bethesda, MC (1991), which is complete source of up-mében incorporated herein by reference] EU • "·· ··" · · · · · · · · · · · • ·· • · · · · · * ···· ·· - enter properly index - 46th A "Kábát-féle EU-index" ki-fejezés a humán EU IgGl-antitest aminosav-számozására vo-natkozik. The "EU index Kabat" off-expression of the human IgGl EU antibody amino acid numbering vo-natkozik.

Az "ErbB-receptor” vagy "ErbB" kifejezésen olyantirozin kináz receptor-proteint értünk, amely az ErbB-receptorcsaládba tartozik. Az ErbB-receptorok közé tartoz-nak a következők: EGFR, HER2, ErbB3 és ErbB4, valamint a TEGFR (ld. 5 708 156 számú egyesült államokbeli szabadalmileírás), és e család még azonosításra váró tagjai. Az ErbB-receptor általában a következő komponensekből áll:extracelluláris dómén, amely ErbB-ligandumhoz kötődhet;lipofil transzmembrán dómén; konzervált intracelluláristirozin kináz dómén; és C-terminális szignáldomén, amelytöbb fcszforilálható tirozint tartalmaz. Az ErbB-receptor"natív szekvenciájú" ErbB-receptor vagy annak funkcionálisszármazéka (pl. aminosav-szekvencia-változata) egyaránt le-het. Az ErbB-receptor előnyösen natív szekvenciájú humánErbB-receptor. The term "ErbB receptor" or "erbB" refers olyantirozin kinase receptor protein, which belongs to the ErbB receptor family ErbB receptors include, does the following:. EGFR, HER2, ErbB3 and ErbB4 receptors and TEGFR (see Fig. . No. 5,708,156, U.S. patent specification), and those members of the family to be more identifiable the ErbB receptor will generally comprise the following components: an extracellular domain, which may bind an ErbB ligand; a lipophilic transmembrane domain; conserved intracelluláristirozin kinase domain, and C-terminal signaling which contains more fcszforilálható tyrosine. The ErbB receptor may be a "native sequence" ErbB receptor or an funkcionálisszármazéka (eg. amino acid sequence variant) both down-het. The ErbB receptor is native sequence humánErbB receptor.

Az "ErbB-ligandum" kifejezésen olyan polipeptidet ér-tünk, amely ErbB-receptorhoz kötődik és/vagy aktiválja azt.A találmány szerinti megoldás szempontjából különösen je-lentős SrbB-ligandumok a natív szekvenciájú humán ErbB-1 igantíumok, mint pl. The term "ErbB ligand" is meant a polypeptide vascular were bound ErbB receptors and / or activates polyfructose azt.A invention can be particularly below stem SrbB ligands of native sequence human ErbB-1 igantíumok like. az epidermális növekedési faktor [EGE;Savage és mtsai.: J. Bioi. epidermal growth factor [EGE; Savage et al .: J. Biol. Chem. 247, 7612 (1972)]; Chem 247, 7612 (1972)].; transz-formáló növekedési faktor-α [TNF-a; trans-forming growth factor-α [TNF-; Marquardt és mtsai.:Science 223, 1079 (1984)]; Marquardt and mtsai.:Science 223, 1079 (1984)]; amphiregulin, más néven scwanomavagy keratinocita aufokrin növekedési faktor [Shoyab ésmtsai.: Science 243, 1074 (1989)]; amphiregulin also known as scwanomavagy aufokrin keratinocyte growth factor [Shoyab ésmtsai .: Science 243, 1074 (1989)]; Kimura és mtsai.: Natúré • · » - 47 - 348, 257 (1990); Kimura et al .: Nature · • »- 47 to 348, (1990) 257; Cook és mtsai.: Mól. Cook et al .: Mol. Cell. Cell. Bioi. Biol. 11, 2547(1991)]; 11, 2547 (1991)]; betacellulin [Shing és mtsai.: Science 259, 1604(1993); betacellulin [Shing et al .: Science 259, 1604 (1993); Sasada és mtsai.: Biochem. Sasada et al .: Biochem. Biophys. Biophys. Rés. Gap. Commun. Commun. 190, tor 1173 (1993)]; 190, tor 1173 (1993)]; heparinkötő epidermális növekedési f ak- 936 [HB-EGF; heparin-binding epidermal growth f AK- 936 [HB-EGF; Higashiyama és mtsai.: Science 251, (1991)]; Higashiyama et al .: Science 251 (1991)]; epiregulin [Toyoda és mtsai.: J. Bioi. epiregulin [Toyoda et al .: J. Biol. Chem. 270, 7495 (1995); Chem., 270, 7495 (1995); Komurasaki és mtsai.: Oncogene 15, 2841 (1997)]; Komurasaki et al .: Oncogene 15: 2841 (1997)]; heregulin (Id. lentebb); heregulin (Id below.); neuregulin-2 [NRG-2;Carrawav és mtsai.: Natúré 387, 512 (1997)]; neuregulin-2 [NRG-2 Carrawav et al .: Nature 387, 512 (1997)]; neuregulin-3[NRG-3; neuregulin-3 [NRG-3; Zhang és mtsai.: Proc. Zhang et al .: Proc. Natl. Natl. Acad. Acad. Sci. 94, 9562(1997)] vagy cripto [CR-1; Sci., 94: 9562 (1997)] or Cripto [CR 1; Kannan és mtsai.: J. Bioi. Kannan et al .: J. Biol. Chem.272(6), 3330 (1997)]. Chem.272 (6), 3330 (1997)]. Az EGFR-t megkötő ErbB-ligandumok kö-zé tartozik az EGF, TGF-α, amphiregulin, betacellulin, HB-EGF és epiregulin; EGFR ErbB ligands which bind co-zé includes EGF, TGF-α, amphiregulin, betacellulin, HB-EGF and epiregulin a HER3-hoz kötődő ErbB-ligandumok aheregulinok; HER3 ErbB ligands which bind aheregulinok; míg a HER4 megkötésére képes ErbB-ligandumok akövetkezők: betacellulin, epiregulin, H3-EGF, NRG-2, NRG-3és a heregulinok. while able to bind to HER4 ErbB ligands akövetkezők: betacellulin, epiregulin, H3-EGF, NRG-2, NRG-3 and heregulins.

Ahogy itt használjuk, a "heregulin" (HRG) kifejezés aheregulin-géntermék által kódolt aminosav-szekvenciát tar-talmazó poiipeptidre [Id. As used herein, the amino acid sequence encoded by the "Heregulin" (HRG) gene product expression aheregulin tar talmazó polypeptide [Id. 5 641 869 számú egyesültállamokbeli szabadalmi leírás vagy Marchionni és mtsai.:Natúré 362, 312 (1993)], valamint annak biológiailag aktívváltozataira vonatkozik. U.S. patent or Marchionni mtsai.:Natúré 362, 312 (1993)], and to apply a biologically active variants No. 5,641,869. A heregulinok jellemző példái közétartoznak a következők: heregulin-alfa, heregulin-βΐ,heregulin-p2 és heregu!in~P3 [Holmes és mtsai.: Science256, 1205 (1992); Examples of heregulins include heregulin-alpha, heregulin-βΐ, heregulin-p2 and P3 heregu in ~ [Holmes et al .: Science256, 1205 (1992)! és 5 641 869 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírás], név differenciációs faktor [NDF; and U.S. Patent No. 5,641,869], name differentiation factor [NDF; ld. ld.

Feles és mtsai.: Cell 69, 205 (1992)]; Half et al .: Cell 69, 205 (1992)]; acetilkolin- • · · · · · • · ······ * ···········« • · · · · ·· · • ·· · ·« ···· ·· - 48 - receptor-indukáló aktivitás [ARIA, ld. • acetylcholine · · · · · · ······ • * ··········· «·· • · · · · · · · • ·· '···· ·· - 48 - receptor-inducing activity [ARIA, supra. Falls és mtsai.:Celi 72, 801 (1993)]; Falls and mtsai.:Celi 72, 801 (1993)]; szenzoros és motoros neuron-eredetű faktor [SMDF; sensory and motor neuron derived factor [SMDF; ld. ld. Ho és mtsai.: J. Bioi. Ho et al .: J. Biol. Chem. 270, 14523(1995); Chem., 270, 14523 (1995); gamma-heregulin [ld. gamma-heregulin [see. Schaefer és mtsai.: Oncogene15, 1385 (1997)]. Schaefer et al .: Oncogene15, 1385 (1997)]. Egy natív szekvenciájú HRG-polipeptid bi-ológiailag aktív fragmensei és/vagy aminosav-szekvenciaváltozatai egyik példája az EGF-szerű dómén fragmens (pl. HRG3li7?-244 ) · Of a native sequence HRG polypeptide bi-ológiailag active fragments and / or amino acid sequence variant is an example of the EGF-like domain fragment (e. HRG3li7? -244) ·

Az "ErbB hetero-oligomer" kifejezés egy nem kovalenskötéssel kapcsolt oligomer, amely legalább két különbözőErbB-receptort tartalmaz. The term "ErbB hetero-oligomer" in a non kovalenskötéssel associated oligomer comprising at least two különbözőErbB receptor. Az ilyen komplexek akkor jönneklétre, ha két vagy több ErbB-receptort termelő sejtet ErbB-ligandummal érintkeztetünk, majd immunprecipitációval izo-lálhatok és SDS-PAGE vizsgálati eljárással analizálhatók[ld. Such complexes may form when two or more ErbB receptors ErbB ligand is contacted with cells and then be isolated by immunoprecipitation and analyzed by SDS-PAGE assay [see. pl. eg. Sliwkowski és mtsai.: J. Bioi. Sliwkowski et al .: J. Biol. Chem. 269(20),14661 (1994)]. Chem., 269 (20), 14661 (1994)]. Az ilyen ErbB hetero-oligomerek példái a kö-vetkezők: EGFR-HER2, HER2-HER3 és HER3-HER4. Examples of such ErbB hetero-oligomers of co-sin EGFR-HER2, HER2-HER3 and HER3-HER4 complexes. Ezen túlmenő-en, az ErbB hetero-oligomer két vagy több HER2-receptort istartalmazhat, melyek különböző ErbB-receptorokkal (HER3,EER4 vagy EGFR) lehetnek kombinálva. Beyond this, it may comprise-en, the ErbB hetero-oligomer of two or more HER2 receptors, which may be combined with a different ErbB receptors (HER3, EGFR or EER4). A hetero-oligomerbenmás protein, például, citokin-receptor alegység (pl. gpl30)is jelen lehet. Heteroaryl oligomerbenmás protein, e.g., a cytokine receptor subunit (e. Gpl30) may be present.

Az "ErbBl", "epidermális növekedési faktor receptor"és "EGER" kifejezések - melyek egymás szinonimáiként alkal-mazhatók - az EGFR-re vonatkoznak [melynek leírását ld. The "erbbl", "epidermal growth factor receptor" and "mouse" expressions - are interchangeably herein can be employed - refer to EGFR [see a description. pl.Carpenter és mtsai.: Ann. pl.Carpenter et al .: Ann. Rév. Port. Biochem. Biochem. 56, 881 (1987)], ideértve ezek természetben előforduló mutáns alakjait [pl.deléciós EGFR-mutáns; 56, 881 (1987)], these mutant forms, including naturally occurring [pl.deléciós mutant EGFR; ld. ld. Humphrey és mtsai.: PNAS (USA) » · 87, 4207 (1990)]. Humphrey et al .: PNAS (USA) "· 87 (1990) 4207]. Az erbBl kifejezés az EGFR-proteint kódo-ló gént jelenti. The term is erbbl EGFR protein-coding gene horse. Az EGFR-hez kötődő antitestek példái közétartoznak a következők MAb 579 (579-es monoklonális anti-test; ld. ATCC CRL HB 8506); Examples of binding to EGFR antibodies include MAb 579 (579, monoclonal antibodies;. See ATCC CRL HB 8506); MAb455 (ATCC CRL HB8507); MAb 455 (ATCC CRL HB8507); MAb255 (ATCC CRL 8508); MAb255 (ATCC CRL 8508); MAb528 (ATCC CRL 8509; ld. 4 943 533 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírás);valamint ezek változatai, pl. MAb 528 (ATCC CRL 8509; U.S. Patent Nos 4,943,533.), And variants thereof, such. a kimérikus 225-ösmonoklonális antitest (C225) és az újjáalakított humán 225- ös monoklonális antitest (H225; ld. WO 96/40210 számú nem-zetközi közzétételi irat). ösmonoklonális as chimerized 225 antibody (C225) and reshaped human 225 Series monoclonal antibody (H225. Nos WO 96/40210 non-zetközi discloses).

Az "ErbB2" és "HER2" kifejezések - melyeket egymásszinonimáiként alkalmazunk - humán HER2-proteinre vonatkoz-nak [melynek leírását ld. The expressions "ErbB2" and "HER2" - which may be used interchangeably herein - has relevant human HER2 protein [see a description. pl. eg. Semba és mtsai.: PNAS (USA)82, 6497 (1985) és Yamamoto és mtsai.: Natúré 319, 230 (1986); Semba et al .: PNAS (USA) 82: 6497 (1985) and Yamamoto et al .: Nature 319, 230 (1986); GenBank nyilvántartási szám: XO3363]. GenBank Accession No. XO3363]. Az "erbB2"kifejezés a humán HER2-t kódoló gént jelenti, míg a "neu"kifejezés a patkányeredetű pl85neu-t kódoló génre vonatko-zik. The term "erbB2" refers to human HER2 gene encoding, while the term "neu" in the rat pl85neu is the gene encoding vonatko-ing. A találmány szerinti megoldás szempontjából előnyösESR2 a natív szekvenciájú humán HER2. An essential part of the invention előnyösESR2 native sequence human HER2. A HER2-t megkötő an-titestek példái közé tartoznak a következő monoklonális an-titestek: 4D5 (ATCC CRL 10463); The HER2-binding anti-titestek examples include the following monoclonal anti-titestek 4D5 (ATCC CRL 10463); 2C4 (ATCC HB-12697); 2C4 (ATCC HB-12697); 7F3 (ATCC H3-12216); 7F3 (ATCC No. H3-12216); és 7C2 (ATCC HB-12215; ld. 5 772 997 számúegyesült államokbeli szabadalmi leírás; WO 98/77797 számúnemzetközi közzétételi irat és 5 840 525 számú egyesültállamokbeli szabadalmi leírás, melyet teljes terjedelmében a kitanírés részének tekintünk). and 7C2 (ATCC HB-12215; U.S. Patent No. 5,772,997, see;. WO 98/77797 international patent discloses and U.S. Patent No. 5,840,525, which is considered to be part kitanírés entirety). A humanizált anti-HER2 an-titestek jellemző példái a következők: huMAb4D5-l, huMAb4D5-2, huMAb4D5-3, huMAb4D5-4, huKAb4D5-5, huMAb4D5-6, • · • · ····«· • · ··· ·«· · ««····· · ·· · • · · · ·· ···· ·· - 50 - huMAb4D5-7 és huMAb4D5-8 (HERCEPTIN®) ld. The anti-anti-HER2 humanized titestek Specific examples are: huMAb4D5-l, huMAb4D5-2, huMAb4D5-3, huMAb4D5-4, huKAb4D5-5, huMAb4D5-6, • • · · ···· "• · · · ·· · «·« «····· ·· · · · · · • ·· ···· ·· - 50 - huMAb4D5-7 and huMAb4D5-8 (HERCEPTIN®) see. az 5 821 337 szá-mú egyesült államokbeli szabadalmi leírás 3. táblázatában,melyet teljes terjedelmében a kitanítás részének tekintünk;valamint a humanizált 52OC9-antitest (WO 93/21319 számú nemzetközi közzétételi irat). U.S. Patent No. 5,821,337, Table 3, which is incorporated herein by reference in its entirety; and 52OC9 humanized antibody (WO 93/21319 international patent discloses). A humán anti-HER2 antiteste-ket az 5 772 997 számú egyesült államokbeli szabadalmi le-írásban és a WO 97/00271 számú nemzetközi közzétételi irat-ban tárták fel. Human anti-HER2 antibodies were revealed in U.S. 5,772,997 U.S. Patent down in writing and International Publication WO 97/00271 discloses in number.

Az "ErbB3" és "HER3" kifejezés receptor-polipeptidre[ld. "ErbB3" and "HER3" receptor polypeptide [see Fig. 5 183 884 és 5 480 968 számú egyesült államokbeli sza-badalmi leírás, valamint Kraus és mtsai.: PNAS (USA) 86,9193 (1989)], illetve ezek változataira vonatkozik. No. 5,183,884 and 5,480,968 U.S. fron-badalmi description as well as Kraus et al .: PNAS (USA), 86.9193 (1989)] and variations of these concerns. A HER3-hoz kötődő antitestek példáinak leírását illetően ld. The HER3 antibodies that bind to describe the examples see. az5 968 511 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírást(pl. 8D8-antitest, ATCC HB 12070; illetve humanizált válto-zatai) - AZ5 No. 968 511 U.S. patent specification (e.g. 8D8 antibody, ATCC HB 12070, or variants of humanized.) -

Az ”ErbB4" és ”HER4" kifejezés receptor-polipeptidre[amelynek leírásán ld. The term "ErbB4" and "HER4" receptor polypeptide [see a description. pl. eg. az 599 274 számú európai szaba-dalmi bejelentést; the socio-European patent application number 599 274; valamint Plowman és mtsai.: Proc. and Plowman et al .: Proc. Natl.Acad. Natl. Sci. USA 90, 1746 (1993); Sci. USA 90, 1746 (1993); Plowman és mtsai.: Natúré366, 473 (1993)], valamint izoalakjaira vonatkozik (pl. aWO 99/19488 számú nemzetközi közzétételi iratban feltárt HER4-Ízcalakok). Plowman et al .: Natúré366, 473 (1993)], and relates izoalakjaira (eg. International detected AWO No. 99/19488 discloses Ízcalakok HER4). A találmány leírásában a "B-sejt-felületi marker" ki-fejezésen B-sejtek felületén termelődő antigént értünk,amely a hozzá kötődni képes antitestekkel célozható meg. In the present specification refers to the surface of the "B cell surface marker" off-fejezésen B cells, an antigen that can be targeted binds thereto antibodies. AB-sejt-felületi markerek jellemző példái a következők:CD10, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD24, CD37, CD53, CD72, • · - 51 - CD73, CD74, CDw75, CDw76, CD77, CDw78, CD79a, CD79b, CD80, CD81, CD82, CD83, CDw84, CD85 és CD86 leukocita-felületimarkerek. Exemplary B-cell surface markers include: CD10, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD24, CD37, CD53, CD72, • · - 51 - CD73, CD74, CDw75, CDw76, CD77, CDw78, CD79a, CD79b, CD80, CD81, CD82, CD83, CDw84, CD85 and CD86 leukocyte felületimarkerek. A találmány szerinti megoldás szempontjából lé-nyeges B-sejt-felületi marker elsősorban emlősök B-sejtjeinexpresszálódik (szemben a nem B-sejtes szövetekkel), ésprekurzor B-sejteken vagy érett B-sejteken egyaránt terme-lődik. An essential part of the invention, juice nyeges B cell surface marker of particular mammals sejtjeinexpresszálódik B (compared to non-B-cell tissues) production-Lodi ésprekurzor both B cells and mature B cells. A találmány egyik megvalósítási módja szerint a szó-ban forgó marker olyan marker (mint pl. a CD20 vagy CD19),amely az őssejt-stádiumtól egészen a plazmasejtekké történővégső differenciálódás előtti stádiumig megtalálható a B-sejteken. In one embodiment, the marker of the word in question is a marker (eg. CD20 or CD19) that is found in the stem cell stage up to stage before the final hints specific differentiation into plasma B cells. A találmány szerinti megoldás szempontjából elő-nyös B-sejt-felületi marker a CD19, CD20, CD22 és CD40. An essential part of the invention, preferred B-cell surface marker is CD19, CD20, CD22 and CD40. A "CD20-antigén" egy kb. The "CD20" antigen is a approx. 35 kD-os, nem glikoziláltfoszfoprotein, amely a perifériás vérből és nyirokszervek-ből származó B-sejtek több, mint 90 %-ának felületén megta-lálható. 35 kDa, not glikoziláltfoszfoprotein that the surface is more than 90% of B cells from peripheral blood or lymphoid organs out of the savings-lálható. A CD20 a korai pre-B-sejt fejlődési stádiumbantermelődik, és termelődése egészen a plazmasejtté történődifferenciálódásig megmarad. CD20 is expressed during early pre-B cell development stádiumbantermelődik and maintained until the production of a plasma történődifferenciálódásig. A CD20 normál és malignáns B-sejteker, egyaránt jelen van. CD20 is normal and malignant B-sejteker, they are both present. A CD20 szakirodalomban hasz-nált egyéb elnevezései között említhető a "B-limfocita-korlátozott antigén" és a "Bp35". CD20 in the literature include signal-use Other names "B-lymphocyte-restricted antigen" and "Bp35". A CD20-antigén leírásátló. The description of the horse CD20 antigen. pl. eg. Clark és mtsai.: Proc. Clark et al .: Proc. Natl. Natl. Acad. Acad. Sci. USA 82,1766 (1985)]. Sci. USA 82.1766 (1985)]. A CD20-antigént megkötő antitestek példái akövetkezők: "C238", melyet "rituximab"-nak nevezünk(RITUXAK®; lei. 5 736 137 számú egyesült államokbeli szaba-dalmi leírás, melyet teljes terjedelmében a kitanítás ré-szének tekintünk); Examples of binding CD20 antigen antibodies akövetkezők "C238", which is called "rituximab" (RITUXAK®; SEQ lei 5,736,137 U.S. Pat with our description we take to be the disclosure portion of carbon in its entirety.); S0Y-izotóppal jelzett 2B8 egéreredetűantitest (Y2B8; 5 736 137 számú egyesült államokbeli szaöa- ··· - 52 - dalmi leírás, melyet teljes terjedelmében a kitanítás ré-szének tekintünk) egéreredetű IgG2a "Bl", amely adott eset-ben 131I-izotóppal jelölhető, miáltal a 131I-B1 antitest jönlétre (BEXXAR™; 5 595 721 számú egyesült államokbeli szaba-dalmi leírás, melyet teljes terjedelmében a kitanítás ré-szének tekintünk); S0Y-isotopically labeled 2B8 murine antibody (Y2B8; No. 5,736,137 U.S. szaöa- ··· - 52 - with our description we take to be the disclosure portion of carbon in its entirety), murine IgG2a "Bl", optionally in 131I-labeled may be designated, whereby the 131I-B1 antibody jönlétre (Bexxar ™, No. 5,595,721 U.S. Pat with our description we take to be the disclosure portion of carbon in its entirety); egéreredetű "1F5" monoklonális antitest[Press és mtsai.: Blood 69(2), 584 (1987); murine "1F5" monoclonal antibody [Press et al .: Blood 69 (2), 584 (1987); "kimérikus 2H7" antitest (5 667 180 számú egyesült államokbeli szabadalmileírás, melyet teljes terjedelmében a kitanítás részénektekintünk); "Chimeric 2H7" antibody (No. 5,667,180 U.S. Patent, which is incorporated herein by reference in its entirety is considered part); valamint az L27, G28-2, 93-1B3, B-Cl és Nu-B2 monoklonális antitestek, melyek az "International LeukocyteTyping Workshop"-nál férhetők hozzá [Valentiné és mtsai.: a "Leukocyte Typing" III. and L27, G28-2, 93-1B3, B-Cl or NU-B2 monoclonal antibodies which are accessible in the "International Workshop LeukocyteTyping" than [Valentine et al .: in "Leukocyte Typing" III. kötetének 440. oldalán (szerk.:XcMichael, Oxford University Press, 1987)]. Volume 440 page (szerk.:XcMichael, Oxford University Press, 1987)]. A "CD19-antigén" egy kb. The "CD19" antigen is a approx. 90 kD-os antigén, amelyet,például, a HD237-CD19- és B4-antitest ismer fel [Kiesel ésmasai. 90 kDa antigen, which, for example, the HD237-CD19 or B4 antibody recognizes [Kiesel ésmasai. : Leukémia Research II 12, 1119 (1987)]. Leukemia Research II, 12: 1119 (1987)]. A CD19 - ha-sonlóan a CD20-hoz - az őssejt-stádiumtól egészen a plazma-sejtzé történő végső differenciálódást megelőző pontig meg-található a B-sejzeken. The CD19 - if sonlóan-CD20 - point just prior to terminal differentiation of the stem cell stage up to the plasma sejtzé-in at the B sejzeken. Az antagonista vegyületek CD19-heztörténő kötődése a CD19-antigén internalizálódását eredmé-nyezheti. The antagonist compounds heztörténő CD19 binding to CD19 antigen internalization result, it tends to cause distortion. A CD19-et megkötő antitestek példái közé tartoz-nak a Hekman és mtsai. The CD19 binding antibodies include, but has in Hekman et al. [Cancer Immunoi. [Cancer Immunol. Immunother. Other immune. 32, 364 (1991)] és Vlasveld és mtsai. 32, 364 (1991)] and Vlasveld et al. [Cancer Immunoi. [Cancer Immunol. Immunother. Other immune. 40, 37 (1995)] által leírt anti-CD19 antitestek, valamint a anti-CD19 antibodies described in 40, 37 (1995)] and

Kiesel és mtsai. Kiesel et al. [Leukémia Research II 12, 1119 (1987)] ál-tal leírt 34-antitest. [Leukemia Research II, 12: 1119 (1987)] described pseudo-tal 34 antibody. A "CD22-antigén" molekulatömege kb. The "CD22" antigen is a molecular weight of approx. 140 000 kD. 140,000 kD. A CD22 • ·· · • ♦ «····· • · «·· ··· · ······· · ·· · • ··· ·* ···· ·· - 53 - a korai pre-B-sejtek és őssejtek citoplazmájában termelő-dik, és csak az érett B-sejtek és a nem-Hodgkin limfoma(NHL) sejtek többségének felületén jelenik meg, majd aplazmasejt-stádium előtti végső differenciáció során mind asejtfelületről, mind a citoplazmából eltűnik. The CD22 ·· • · • ♦ «• · ·····" ·· ·· · · · · · · ······· • · · · · * ·· ···· - 53 - the cytoplasm early pre-B cells and stem cells producing ith and only the majority of cells and mature B cells and non-Hodgkin's lymphoma (NHL) surface appears and then disappears as asejtfelületről and the cytoplasm during the final differentiation before aplazmasejt stage . A CD22 elleniantitestek egyik példájaként említhető a Juweid és mtsai.[Cancer Research 55, 5899 (1995)] által leírt LL2-antitest(ideértve annak kimérikus/humanizált változatait is). described can be mentioned as an example of the CD22 elleniantitestek Juweid et al. [Cancer Research 55, 5899 (1995)], LL2 antibody (including a chimeric / humanized variants). A "CD40-antigén" egy foszforilált sejtfelületiglikoprotein, amely különféle sejttípusokon (B-sejteken,malignáns B-sejteken, follicularis dendritikus sejteken,bazális epithelseteken és karcinomákon) termelődik. The "CD40" antigen is a phosphorylated sejtfelületiglikoprotein, which is produced in various cell types (B cells and malignant B cells, follicular dendritic cells, basal cell carcinomas and epithelseteken). A CD40a CD40-ligandumboz (CD40L) kötődik. Ligandumboz CD40 CD40 (CD40L) binds. A CD40 - amellett, hogyB-sejt-felületi antigén - a TNF receptor-főcsalád egyiktagja. CD40 - besides hogyB cell surface antigen - TNF receptor superfamily member of one. A CD40-t megkötő antitestek példái azok, amelyek (1)CD40/CD40L interakciót blokkoló és anti-neopláziás tulaj-donságokkal bírnak (5 674 492 számú egyesült államokbeliszabadalmi leírás); CD40 was examples are antibodies which bind to (1) CD40 / CD40L interaction and blocking anti-neoplastic owner are hydrofluoric acid (No. 5,674,492 U.S. Patent); (2) a CD40-en keresztüli jelátvitelantagonistáiként funkcionálnak (5 677 165 számú egyesültállamokbeli szabadalmi leírás); (2) function as the via CD40 jelátvitelantagonistáiként (U.S. Patent No. 5,677,165); (3) a CD40-en keresztülstimuláló szignált továbbítanak, de nem serkentik a CD40 ésC340L közötti interakciót (ld. 5 182 368 számú egyesültállamokbeli szabadalmi leírás); (3) CD40 keresztülstimuláló signal though, but does not stimulate the interaction between CD40 ésC340L (U.S. Patent No. 5,182,368 see.); (4) serkentik a CD40 ésCD40L közötti interakciót; (4) stimulate the interaction between CD40 ésCD40L; pl. eg. CD40.4 (5C3; PharMingen, SanDiego, Kalifornia) és S2C6 [az ATCC-nél (Manassass, Virgi-nia) 1999. május 25-én, PTA-110 nyilvántartási számon le- tétbe helyezve]. CD40.4 (5C3; PharMingen, San Diego, CA) and S2C6 [the ATCC (Manassass, virgifera nia) 1999 May 25 th, accession number PTA-110 is placed down unlike]. A "tumornekrózis-faktor-receptor főcsalád" vagy "TNF- • · ·· · • · * • » · · · • · · · · • ··· ·« • · · • ·· · - 54 - receptor főcsalád'' kifejezések olyan receptor-polipeptidekre vonatkoznak, amelyeket a TNF-családba tarto-zó citokinek kötnek meg. Általában ezek a receptorok I. tí-pusú transzmembrán-receptorok, amelyek extracellulárisdóménjükben egy vagy több, ciszteinben gazdag ismétlődőszekvenciát tartalmaznak. A TNF-receptor főcsalád továbbicsoportokra osztható: (1) sejthalál-receptorok; (2) csali("decoy") receptorok; és (3) jelátviteli receptorok, me-lyekből hiányoznak a sejthalál-domének. A "sejthalál-receptorok" citoplazmikus vagy intracelluláris régiójukban"sejthalál-domént" tartalmaznak, vagyis olyan régiót vagyszekvenciát, amelynek funkciója a sejtekben olyan szignál-transzdukció, amely apoptózist vagy bizonyos gének indukci-óját eredményezi. A "csali-receptorok" nem tartalmaznak mű-köd The "tumor necrosis factor receptor superfamily" or "TNF • ·· · · · • * •» • · · · · · · · · · · · • «• • · · · ·· - 54 - receptor superfamily ' 'refer to a receptor polypeptides that bind relative gents cytokines in the TNF family. in general, these receptors I Ti-Pušų transmembrane receptors containing one or more cysteine ​​rich ismétlődőszekvenciát which extracellulárisdóménjükben. the TNF receptor superfamily further groups can be divided into: (1) cell death receptors receptors (2) bait ( "decoy"), and (3) signaling receptors, methylprednisolone lyekből lacking the death domains "cell death receptors" cytoplasmic or intracellular respective regions "cell death domain. "comprise, i.e., a region or sequence which has the function of cells, signal transduction, apoptosis, or which results in induction of certain genes, óját. the term" decoy receptors, "does not contain artificial fog képes sejthalál-comént", és nem képesek apoptózist oko-zó szignál-transzdukcióra. coment-capable cell death, "apoptosis was not able oko gents signal transduction. A TNF-géncsaládba tartozócitokinek példái a következők: tumornekrózis-faktor-a (TNF-σ' , tumornekrózis-faktor-β (TNF-β vagy limfotoxin), CD30-ligandum, CD27-ligandum, CD40-ligandum, ΟΧ-40-ligandum, 4-13B-ligandum, Apc-1 ligandum (más néven Fas-ligandum vagyCD95-ligandum), Αρο-2-ligandum (más néven TRAIL), Apo-3-ligandum (más néven TWEAK), osteoprotegerin (OPG), APRIL,RANK-ligancum (más néven TRANCE) és TALL-1 (más néven BlyS,RAFF vagy THANK). A TNF-receptor főcsaládba tartozó recep-torok példái a következők: 1. típusú tumornekrózis-faktor-receptor (TNFR1), 2. típusú tumornekrózis-faktor-receptor(TNFR2), p75 idegsejt növekedési faktor receptor (NGFR),CD40 3-sejt-antigén, 0X40 T-sejt-anfigén, Apo-l-receptor • ·· · • · ·»«··· • · · · · · ·4 « «*« ··«· « ·· · • ··· ·· ·»*· ·« - 55 - (más néven Fás vagy CD95), Apo-3-receptor (más néven DR3,swl-1, TRAMP és LARD), a "transzmembrén-aktivátor és C Examples of the TNF gene family tartozócitokinek include: tumor necrosis factor alpha (TNF-σ ', tumor necrosis factor-β (TNF-β or lymphotoxin), CD30 ligand, CD27 ligand, CD40 ligand, ΟΧ-40 ligand , 4-13B ligand, Apc-1 ligand (also referred to as Fas ligand vagyCD95 ligand) Αρο-2 ligand (also referred to as TRAIL), Apo-3 ligand (also known as TWEAK), osteoprotegerin (OPG), APRIL , RANK ligancum (also called TRANCE), and TALL-1 (also known as BlyS, Raff or THANK) examples receptor throat in the TNF receptor superfamily include:. type 1 tumor necrosis factor receptor (TNFR1), the second type of Tumor necrosis factor receptor (TNFR2), p75 nerve growth factor receptor (NGFR), 3-cell CD40 antigen, 0x40 T cell anfigén Apo-I receptor • • ·· · · · »« ··· • · · · · · · 4 «« * «··" · "·· ·· · ··· · •» * · «- 55 - (also referred to as Fas or CD95), Apo-3 receptor (also called DR3, swl-1, TRAMP and LARD), the "transmembrane activator and C AML-interaktor" vagy "TACI" néven ismert receptor, BCMA-protein, DR4, DR5 (más néven Apo-2, TRAIL-R, TR6, Tango-63, hAP08, TRICK2 vagy KILLER), DR6, DcRl (más néven TRID, LITvagy TRAIL-R3), DcR2 (más néven TRUNDD vagy TRAIL-R4), OPG,DcR3 (más néven TR6 vagy M68), CÁRI, HVEM (más néven ATARvagy TR2), GITR, ZTNFR-5, NTR-1, TNFL1, CD30, limfotoxin-β-receptor (LTBr), 4-1BB-receptor és TR9 (EP988, 371A1). known as AML interactor "or" TACI "receptor, BCMA protein, DR4, DR5 (also known as Apo-2; TRAIL-R, TR6, Tango-63, hAP08, TRICK2 or KILLER), DR6, DcRl (also known as TRID , LITvagy TRAIL-R3), DcR2 (also called TRUNDD or TRAIL-R4), OPG, DcR3 (also called TR6 or M68), CARIN, HVEM (also called ATARvagy TR2), GITR, ZTNFR-5, NTR-1, TNFL1 , CD30, lymphotoxin-β receptor (LTBR), 4-1BB receptor and TR9 (EP988, 371A1).

Az "Αρο-2-ligandum" vagy "Apo2L" kifejezésen a WO97/25428 számú nemzetközi közzétételi iratban (melyet tel-jes terjedelmében a kitanitás részének tekintünk) leirtApo2L-pclipeptideket értjük. The "Αρο-2 ligand" or "Apo2L" as used in WO97 / 25428 international patent publication (which is hereby incorporated in Tel jes extent) leirtApo2L-pclipeptideket understood. A találmány leírásában e kife-jezések a WO 97/01633 számú nemzetközi közzétételi iratban(melyet teljes terjedelmében a kitanítás részének tekin-tünk) TRAIL-ligandunként feltárt polipeptidekre egyaránt vonatkoznak. The description of this invention apply equally jezések-expressed polypeptides of the WO 97/01633 international patent discloses (which is incorporated herein by reference, were having their entirety) disclosed ligandunként TRAIL.

Az "Apo2L-receptor" kifejezés olyan polipeptidre vo-natkozik, amelyhez az Apo2L specifikusan kötődni képes.Ahogy a leírásban használjuk, az ''Apo2L-receptor" kifejezésjelentése a natív szekvenciájú Apo2L-receptorokra és válto-zataikra egyaránt kiterjed; így például, ide tartoznak akülönböző emlősökből (köztük az emberből) származó Apo2L-receptorok. Az Apo2L-receptor különböző forrásokból(például, emberi szövetekből és egyéb forrásokból) izolál-ható, illetve rekombináns vagy szintetikus módszerekkel ál-lítható elő. A "natív szekvenciájú" Apo2L-receptorok közétartoznak a következők: Apo-2-polipepíití vagy DR5 (ld. WO - 56 - • ·«·· ·· < • · · · . • « ··· ··· Μ • ·· · · · « • · ·« . · J · ·«. 98/51793 számú nemzetközi közzétételi irat, melyet teljesterjedelmében a kitanítás részének tekintünk); natív szek-venciájú csalireceptor-1 vagy DcRl [ld. Sheridan és mtsai.:Science 277 The term "Apo2L receptor" means a polypeptide vo-natkozik which Apo2L binding specifically képes.Ahogy used herein, '' Apo2L receptor "include both the native sequence Apo2L receptors and variants of eggs, for example, to includes Apo2L receptors. Apo2L receptor from different sources (e.g., human tissues, and other sources) are isolated on or recombinant or synthetic means have an adjustable prepared. A "native sequence" Apo2L receptors from akülönböző mammals (including humans) They include the following:. Apo-2-polipepíití or DR5 (see WO - 56 - • · «·· ·· <• · · · •« ··· ··· ·· · · · Μ • "• · ·. «· · · J« 98/51793 international patent discloses which is hereby incorporated in teljesterjedelmében);.. native sequence A decoy receptor 1 or DcRl [see Sheridan mtsai.:Science 277th , 818 (1997)]; natív szekvenciájú csalireceptor-2 vagy DcR2 [ld. Marsters és mtsai.; Curr. Bioi. Ί_, 1003 (1997)]; natív szekvenciájú osteoprotegerin [ld. , 818 (1997)]; native sequence decoy receptor 2 or DcR2 [Marsters et al .; see Curr Biol Ί_, 1003 (1997)];... Native sequence osteoprotegerin [see Fig. Simonét ésmtsai.: Cell 8 9, 309 (1997) és Emery és mtsai.: J. Interfe-ron and Cytokine Research 18(5), A47 Kivonat 2.17 (1998)].A DR5 elleni antitestek példáiként említhetők a következők;3F11.39.7 (ATCC HB-12456), 3H3.14.5 (ATCC HB-12534), 3D5.1.10 (KB-12536) és 3H1.18.10 (HB-12535), 16E2 és 20E6 (ld. WC 98/51793 számú nemzetközi közzétételi irat, melyetteljes terjedelmében a kitanítás részének tekintünk). . Simonet ésmtsai .: Cell, 8, 9, 309 (1997) and Emery et al .: J. Interferon-ron and Cytokine Research 18 (5): A47 Abstract 2.17 (1998)] include the antibodies to DR5 Examples are as follows; 3F11. 39.7 (ATCC HB-12456), 3H3.14.5 (ATCC HB-12534), 3D5.1.10 (KB-12536) and 3H1.18.10 (HB-12535), 16E2 and 20E6 (see Fig. WC 98/51793 international patent discloses , melyetteljes extent incorporated herein by reference). A DR4elleni antitestek példáiként a következőket említjük:4Ξ7.24.3 (ATCC H3-12454), és 4H6.17.8 (ATCC HB-12455; ld. WO 99/3^684 számú nemzetközi közzétételi írat, melyet tel-jes terjedelmében a kitanítás részének tekintünk). The antibodies DR4elleni Examples include: 4Ξ7.24.3 (ATCC No. H3-12454), and 4H6.17.8 (ATCC HB-12455; see WO 99/3 ^ 684 WO document, incorporated by reference herein Tel jes extent. ). A "natív szekvenciájú DcR3"-at a WO 99/14330 számúnemzetközi közzétételi iratban (melyet teljes terjedelmébena kitanítás részének tekintünk) tárták fel. A "native sequence DcR3" -at revealed in WO 99/14330 international patent discloses (terjedelmébena disclosure of which is full). Az említett közzétételi iratban a következő, DcR3 elleni monoklonális antitesteket írták le: 4C4.1.4 (ATCC HB-12573), 5C4.14.7 The patent publication referred to is described in the following monoclonal antibodies against DcR3: 4C4.1.4 (ATCC HB-12573), 5C4.14.7

(ATCC H3-12574), 11C5.2.8 (ATCC HB-12572), 8D3.1.5 (ATCC H8-12571), és 4B7.1.1 (ATCC HB-12575). (ATCC No. H3-12574), 11C5.2.8 (ATCC HB-12572), 8D3.1.5 (ATCC No. H8-12571), and 4B7.1.1 (ATCC HB-12575). A "natív szekvenciájú"megtalálható polipeptidévelpolipeptidek. A "native sequence" can be found polipeptidévelpolipeptidek. Ilyenformán,polipertid bármely emlősből polipeptidek a természetbenazonos aminosav-szekvenciájúegy natív szekvenciájúszármazó, természetben előfor- • '·«· · *« ·« • « ··· V.«· w ·«··«·« « «· · ·» · «5 * J ··«· «·3 - 57 - dúló polipeptid aminosav-szekvenciáját tartalmazhatja. Thus, any mammal polipertid polypeptides in nature identical amino acid szekvenciájúegy szekvenciájúszármazó native, naturally occurrence • '· «· *" · "•" ··· V «w · ·" ·· "·« «« · · · » · «* 5 J ··" · "· 3-57 - waged polypeptide may comprise the amino acid sequence. Azilyen natív szekvenciájú polipeptidek természetes források-ból izolálhatok vagy rekombináns vagy szintetikus eljárá-sokkal állíthatók elő. natural resources from Azilyen native sequence polypeptides can be isolated or recombinant or synthetic procedures, much can be obtained. A "natív szekvenciájú" polipeptidkifejezés jelentése kiterjed a polipeptid természetben elő-forduló, rövidített vagy szekretált alakjaira (pl.extracelluláris dómén szekvencia), a polipeptid természet-ben előforduló változataira (pl. alternatív splicing ered-ményeként létrejött változatok), valamint a polipeptid ter-mészetben előforduló allél-változataira. A "native sequence" polipeptidkifejezés encompasses occurring occurring polypeptide naturally occurring truncated or secreted forms (pl.extracelluláris domain sequence), the polypeptide is naturally occurring variants (created eg. Alternative splicing originates-initiated as variants), as well as polypeptide ter -mészetben occurring allelic variants. A "polipeptid-változat" kifejezésen biológiailag aktívpolipeptidet értünk, amely a natív szekvenciájú polipeptidaminosav-szekvenciájavai legalább 80 %-os azonosságot mu-tat. The term "polypeptide variant" means a biologically aktívpolipeptidet which the native sequence polipeptidaminosav-szekvenciájavai least 80% identity mu tat. Az ilyen változatok közé tartoznak, például, azok apolipeptidek, melyek N- vagy C-terminálisán egy vagy többaminosav van addícionálva vagy deletálva. Such variants include, for example, those apolipeptidek which N- or C-terminus of one or more amino acid is added on or deleted. Általában apolipeptid-változatck a natív szekvenciájú polipeptid ami-nosav-szekvenciá jával legalább kb. Generally apolipeptid-változatck the native sequence polypeptide, that sequence of amino acids occurs, at least approximately. 80 %-ban, előnyösebbenlegalább kb. 80%, more preferably at least about. 90 %-ban, még előnyösebben legalább kb. 90%, more preferably at least approx. 95 %- bán azonos aminosav-szekvenciát tartalmaznak. Ban contain identical amino acid sequence - 95%.

Az "apoptózis" kifejezésen programozott sejthalált ér-tünk. "Apoptosis" refers to programmed cell death were vascular. Az apoptózis bekövetkezésére utaló fiziológiai esemé-nyek közé tartozik a DNS-fragmentáció, sejtzsugorodás,endoplazmatikus reticuium tágulása, sejtfeldarabolódásés/vagy membránvezikulák (ún. apoptózisos testek) képződé-se. Indicating the occurrence of apoptosis physiological incidents-ones include DNA fragmentation, cell shrinkage, dilation of endoplasmic reticuium, sejtfeldarabolódásés / or formation of membrane vesicles (called. Apoptotic bodies) formation-se. Az apoptózissal kapcsolatos celluláris események érté-kelésére különféle eljárások állnak rendelkezésre. Various methods are available cellular events associated with apoptosis-ence value. Például,a foszfatidil-szerin (PS) transzlokáció annexin-V-kötódés • • · For example, phosphatidyl serine (PS) translocation annexin V binding • • ·

Vb «·· ···· » #·* < « * » -·· 58 alapján mérhető; World Cup «·· ····" # * · < «*» - a measure of ·· 58; a DNS-fragmentáció DNS-létrázás vagypropídium-jodidos festés alapján határozható meg; It is determined on the basis of DNA fragmentation DNA laddering vagypropídium iodide staining; a DNS-fragmentációval együttes sejtmagi kromatin-kondenzáció ahipodiploid sejtek számának növekedése alapján mérhető. measured by the increase in the number of combined DNA fragmentation nuclear chromatin condensation ahipodiploid cells. A találmány leírásában az "antitest" kifejezést legtá-gabb értelmében használjuk, s jelentése kiterjed amonoklonális antitestekre (teljes hosszúságú vagy épmonoklonális antitestekre), poliklonális antitestekre,többértékű antitestekre, multispecifikus antitestekre (pl.bispecifikus antitestekre), valamint az antitest-fragmensekre (ld. lentebb), feltéve, hogy azok rendelkezneka kívánt biológiai aktivitással. In the present specification, the term "antibody" is used in the meaning of bleed-Gabb and encompasses amonoklonális antibodies (full length or épmonoklonális antibodies), polyclonal antibodies, multivalent antibodies, multispecific antibodies (pl.bispecifikus antibodies), and antibody fragments (see Fig. below), provided they rendelkezneka desired biological activity.

Hacsak másképpen nem jelezzük, a "többértékű antitest"kifejezésen három vagy több antigénkötő helyet tartalmazóantitestet értünk. Unless otherwise indicated, a "multivalent antibody" is meant three or more antigen binding sites tartalmazóantitestet. A többértékű antitest előnyösen úgy vankialakítva, hogy három vagy több antigénkötő helyet tartal-mazzunk, és általában ne natív szekvenciájú IgM vagy IgAlegyen. The multivalent antibody is preferably vankialakítva that three or more antigen binding sites comprise Mazza and is generally not a native sequence IgM or IgAlegyen.

Az "antitest-fragmensek" csupán egy teljes antitest(általában annak egy antigénkötő helyet magában foglaló)részletét tartalmazzák, és megtartják az eredeti antitestazt. "Antibody fragments" comprise only a complete antibody (typically an antigen-binding site comprising) portion, and retain the original antitestazt. igét kötő képességét. spell-binding ability. Az antitest-fragmensek példáikéntemlíthetők a következők: (i) Fab-fragmens, amely VL-, CL-,VE- és CHl-doméneket tartalmaz; Antibody fragments példáikéntemlíthetők follows: (i) the Fab fragment, having VL, CL, VE- and CHl domains; (ii) Fab'-fragmens, amely aCHl-domén C-terminálisán egy vagy több ciszteint tartalmazóFab-fragmens; (Ii) the Fab 'fragment that aCHl domain C-terminus by one or more cysteines tartalmazóFab fragment; (iii) Fd-fragmens, amely VH- és CHl-doménttartalmaz; (Iii) a Fd fragment having VH and CHl-doménttartalmaz; (iv) Fd'-fragmens, amely VH- és CHl-domént, va-lamint a CHl-domén C-terminálisán egy vagy több ciszteint • · • · · « • · - 59 - tartalmaz; (Iv) Fd' fragment having VH and CHl domains va laminate the CHl domain C-terminus of one or more cysteine ​​• • · · · «• · - 59 - include; (v) Fv-fragmens, amely egy antitest egyik karjá-nak VL- és VH-doménjeit tartalmazza; (V) the Fv fragment consisting of an arm of an antibody has the VL and VH domains; (vi) dAb-fragmens[Ward és mtsai.: Natúré 341, 544 (1989)], amely egy VH-doménből áll; (Vi) the dAb fragment [Ward et al .: Nature 341, 544 (1989)], which consists of a VH domain; (vii) izolált CDR-régiók; (Vii) isolated CDR regions; (viii) F(ab')2-fragmens, amely két - egymáshoz a csukló-régiónáldiszulfid-híddal kötődő - Fab'-fragmensből áll; (Viii) F (ab ') 2 fragment that has two - consists of Fab' fragments - connected by a bridge at the hinge régiónáldiszulfid; (ix) egy-láncú antitest-molekulák (pl. egyláncú Fv; scFv, ld. Bírdés mtsai.: Science 242, 423 (1988); Huston és mtsai.: Proc.Natl. Acad. Sci. USA 85, 5879 (1988)]; (x) két antigénkötőhelyet tartalmazó "diatestek", amelyek egyazon polipeptid-láncon nehéz lánc variábilis domént (VH) és könnyű lánc va-riábilis domént (VL) tartalmaznak [ld. EP 404 097 számú európai szabadalmi leírás; WO 93/11161 számú nemzetköziközzétételi irat; Hollinger és mtsai.: Proc. Natl. Acad. (Ix) single chain antibody molecules (e.g. single chain Fv;.. ScFv, see Bírdés al .: Science 242 (1988), 423; Huston et al .: Proc Acad Sci USA 85: 5879 (1988... )], containing the (x) two antigen binding "diabodies", which comprise a heavy chain variable domain of the polypeptide chain (VH) and light chain variable domain (VL) specification [see European patent No. EP 404,097;. WO 93 / No. 11161 Appl; Hollinger et al .: Proc Natl Acad...

Sci. USA 90, 6444 (1993)]; Sci. USA 90, 6444 (1993)]; (xi) "lineáris antitestek", ame-lyek tandem Fd-szegmensekből (VH-CH1-CH-CH1) álló párt tar-talmaznak, amely - komplementer könnyű lánc polipeptidekkelegyütt - antigénkötő régiókból álló párt alkot [ld. (Xi) "linear antibodies", consisting of those in which tandem Fd segments (VH-CH1-CH1-CH) party tar content was used, which - complementary light chain polipeptidekkelegyütt - consisting of antigen binding regions pair to form [see Fig. Zapataés mtsai. Zapataés al. Protein Eng. 8/10), 1057 (1995); Protein Eng. 8.10), 1057 (1995); és 5 641 870számú egyesült államokbeli szabadalmi leírás]. and U. S. Patent 5,641 870számú].

Ahogy a leírásban használjuk, a "monoklonális anti-test" kifejezésen lényegében homogén antitest-populációbólszármazó antitestet értünk, vagyis a populációt alkotóegyes antitestek - az esetlegesen kis mennyiségben előfor-duló természetes mutációktól eltekintve - azonosak. As used herein, the term "monoclonal antibody" refers to a homogeneous antibody populációbólszármazó antibody substantially, i.e. the individual antibodies constituting population - apart from minor amounts of potentially vineyard occurrence of natural mutations - are identical. A monoklonális antitestek rendkívül specifikusak: egyetlenantigén ellen irányulnak. Monoclonal antibodies are highly specific, being directed against egyetlenantigén. Ezen túlmenően, ellentétben apoliklonális antitestek készítményeivel, amelyek különböző • · · · - 60 - determinánsok (epitópok) elleni különböző antitesteket tar-talmaznak, minden egyes monoklonális antitest az antigénegyetlen determinánsa ellen irányul. Furthermore, unlike apoliklonális antibody preparations of which are different • · · · - 60 - different antibodies directed against determinants (epitopes), tar content was used, each monoclonal antibody is directed against the determinant antigénegyetlen. A monoklonális anti-testek - spécititásukon túlmenően - azért is előnyösek,mert hibridóma-tenyészetben, más immunglobulinoktól mente-sen szintetizálhatok. The monoclonal anti-bodies - spécititásukon addition - are advantageous because the hybridoma culture, other immunoglobulins synthesized discharge-sen. A "monoklonális" jelző az antitestazon sajátságára utal, hogy antitestek lényegében homogénpopulációjából nyerhető, és nem utal arra, hogy az antitestbármilyen konkrét eljárással lenne előállítható. The modifier "monoclonal" indicates the character of the antibody in that they are obtained substantially homogénpopulációjából antibodies and does not refer to the antibody of any kind could be prepared by a specific procedure. Például, atalálmány szerinti megoldás értelmében alkalmazandó monoklonális antitestek az elsőként Kohler és mtsai. For example, this invention tend solution is applicable under the first monoclonal antibodies by Kohler et al.

[Natúré 256, 495 (1975)] által leírt hibridóma-eljárássalvagy rekombináns DNS-technikák (ld. pl. 4 816 567 számúegyesült államokbeli szabadalmi leírás) alkalmazásával ál-líthatók elő. using hybridoma methods or by recombinant DNA techniques as described in [Nature 256, 495 (1975)] by (see. eg. 4,816,567 U.S. Patent) have an adjustable prepared. A monoklonális antitestek fág antitest-könyvtárakból is izolálhatok, például, a Clackson és mtsai.[Natúré 352, 624 (1991)] és Marks és mtsai. may also be isolated monoclonal antibodies from phage antibody libraries, for example, Clackson et al. [Nature 352, 624 (1991)] and Marks et al. [J. [J. Mól. Mole. Bioi.222, 581 (1991)] által leírt technikák alkalmazásával. Bioi.222, using the techniques described by 581 (1991)]. A monoklonális antitestek közé tartoznak a "kimérikus" antitestek is, amelyekben a nehéz és/vagy könnyű lánc egyrésze azonos vagy homológ egy adott fajból származó - vagyegy adott antitest-osztályhoz vagy -alosztályhoz tartozó -antitestek megfelelő szekvenciáival, míg a lánc(ok) többirésze azonos vagy homológ egy másik fajból származó - vagyegy másik antitest-osztályba vagy -alosztályba tartozó -antitestek megfelelő szekvenciáival. The monoclonal antibodies herein include "chimeric" antibodies in which the same or the heavy and / or light chain of a portion homologous derived from a particular species - the corresponding sequences of the antibody forms a falling or a particular antibody class or subclass, while the chain (s) rest identical or homologous to another species - or the corresponding sequences of the antibody forms belonging to another antibody class or subclass. A monoklonális anti-testek közé tartoznak az ilyen kiméra antitestekzragm.ensei, feltéve, hogy képesek a kívánt biológiai akti- • · • · · · » · The monoclonal antibodies include chimeric antitestekzragm.ensei such, so long as they exhibit the desired biological activation • • · · · · »·

- 61 - vitás kifejtésére [4 816 567 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírás; - 61 - dispute exerting U.S. Patent [No. 4,816,567; Morrison és mtsai.: Proc. Morrison et al .: Proc. Natl. Natl. Acad. Acad.

Sci. USA 81, 6851 (1984)]. Sci. USA 81: 6851 (1984)]. A nem humán (pl. rágcsálóeredetű) antitestek"humanizált" alakjai olyan kimérikus antitestek, amelyekbena nem humán immunglobulinból származó szekvenciák arányaminimális. The non-human (eg., Rodent) antibodies are "humanized" forms of such chimeric antibodies, sequences derived from non-human immunoglobulin amelyekbena ratio is minimal. A humanizált antitestek többnyire olyan humánimmunglobulinok (recipiens antitest), amelyekben arecipiens antitest hipervariábilis régiójának aminosavaiegy nem humán fajból (pl. egérből, patkányból, nyálból vagynem humán főemlősből) származó antitest (donor antitest)kívánt specifitású, affinitású és kapacitású hiper-variábilis régiójának aminosavaival vannak helyettesítve.Néhány esetben a humán immunglobulin vázrégiójának (FR)aminosavai nem humán immunglobulin megfelelő aminosavaivalvannak helyettesítve. Humanized antibodies generally are humánimmunglobulinok (recipient antibody) in which arecipiens antibody hypervariable region aminosavaiegy desired antibody from a nonhuman species (eg. Mouse, rat, saliva or non-human primate) (donor antibody) specificity, affinity, and capacity of the hypervariable region are amino acids helyettesítve.Néhány case the human immunoglobulin framework region (FR) residues replaced by corresponding non-human immunoglobulin aminosavaivalvannak. Ezenfelül, a humanizált antitestekolyan aminosavakat is tartalmazhatnak, amelyek nem találha-tók meg sem a recipiens, sem a donor antitestben. In addition, the humanized antibodies contain amino acids that are not found when ye shall neither in the recipient, or the donor antibody. Ezek amódosítások az antitest további finomítása céljából hajtha-tók végre. These amódosítások to further refine antibody may Case where performed. A humanizált antitest általában egy - jellemzőenkér - variábilis dómén lényegében egészét tartalmazza,mely(ek)ben a hipervariábilis régiók mindegyike vagy lénye-gében mindegyike megfelel egy nem humán immunglobulinhipervariábilis régióinak, és a vázrégiók mindegyike vagylényegében mindegyike megfelel egy humán immunglobulin-szekvencia vázrégiójának. The humanized antibody is typically a - comprise substantially all of a variable domain, which (s) all or substantially all of the hypervariable regions each corresponding to a non-human immunglobulinhipervariábilis regions and the framework regions, either the substance of each of which corresponds to a human immunoglobulin sequence framework region - jellemzőenkér. A humanizált antitest, adottesetben, egy immunglobulin (jellemzően egy humán immunglo-bulin) konstans régiójának (Fc) legalább egy részét is tar- • · · · • · · · · · • · · · · · ·· ··· ··· · ······· · ·· · • ··· ·· ···· ·· - 62 - talmazza. The humanized antibody optionally, an immunoglobulin (typically a human immunoglobulin) constant region (Fc) further contains at least part • • · · · · · · · · · · · · · • ··· ·· ·· ······· · · · · · · • · ·· ·· ·· ···· - 62 - effective ingredients. További részleteket illetően ld. For details, see. Jones és mtsai.: Jones et al .:

Natúré 321, 522 (1986); Nature 321, 522 (1986); Riechmann és mtsai.: Natúré 332, 323 (1988); Riechmann et al .: Nature 332, (1988) 323; Presta: Curr. Presta, Curr. Op. Struct. Op. Struct. Bioi. Biol. 2, 593 (1992). 2, 593 (1992). A "humán antitest" olyan antitest, amelynek aminosav-szekvenciája megfelel az emberi szervezetben termelődőés/vagy a humán antitestek előállítására szolgáló technikákbármelyikének alkalmazásával előállított antitestek amino-sav-szekvenciájának. A "human antibody" is an antibody having an amino acid sequence corresponding to the human body termelődőés / or antibodies produced using any of the techniques for making human antibodies as described amino acid sequence. A humán antitestek e definíciójába nemtartoznak bele a nem humán antigénkötő gyököket tartalmazóhumanizált antitestek. Human antibodies are not included in the non-human antigen-binding residues tartalmazóhumanizált definition of these antibodies. A humán antitestek különféle, szak-ember számára jól ismert eljárások alkalmazásával állítha-tók elő. using well known human antibodies Various methods for man-art adjustable-case's live. Az egyik megvalósítási mód szerint a humán anti-testek - humán antitesteket expresszáló - fágkönyvtárbólszelektálhatok [Vaughan és mtsai.: Natúré Biotechnology 14, In one embodiment, the human anti-antibodies - expressing human antibodies - fágkönyvtárbólszelektálhatok [Vaughan et al .: Nature Biotechnology 14

309 (1996); 309 (1996); Sheets és mtsai.: Proc. Sheets et al .: Proc. Kati. Kati. Acad. Acad. Sci. USA 95, 6157 (1998); Sci. USA 95: 6157 (1998); Hoogenboom és Winter: J. Mól. Hoogenboom and Winter, J. Mol. Bioi. Biol. 227, 3-81 (1991); 227, 3-81 (1991); Marks és mtsai.: J. Mól. Marks et al .: J. Mol. Bioi. Biol. 222, 581 (1991)]. 222, 581 (1991)]. A humán antitestek humán immunglobulin-lokuszoktranszgenikus állatokba (pl. olyan egerekbe, amelyekben azendogén immunglobulin-gének részlegesen vagy teljeseninaktivélva vannak) történő bejuttatásával is előállítha-tok. also introducing of human antibodies in human immunoglobulin lokuszoktranszgenikus animals (eg. mice in which azendogén immunoglobulin genes are partially or teljeseninaktivélva) generates ha pouch. Immunpróba hatáséra az ilyen transzgenikus állatokbanhumán antitest-termelődés figyelhető meg, ami minden vonat-kozásban (gén-újraátrendeződés, összeállítás és antitest-repertoár) emlékeztet az emberekben lejátszódó antitest-termelődésre. Immune test causes release of such transgenic animals, human antibody production is observed, which is reminiscent occurring in humans antibody-Pep each train-relation (gene rearrangements, assembly and antibody repertoire). [ld. [Ld. pl. eg. az 5 545 807; in 5,545,807; 5 545 806; 5,545,806; 5 569 825;5 625 126; 5,569,825; 5,625,126; 5 633 425; 5,633,425; és 5 661 016 számú egyesült államok- beli szabadalmi leírásokat; No. 5,661,016 and United States of Patents; valamint Marks és mtsai.: t · - 63 - and Marks et al .: · t - 63 -

Bio/Technology 10, 779 (1992); Bio / Technology 10, 779 (1992); Lonberg és mtsai.: Natúré368, 856 (1994); Lonberg et al .: Natúré368, 856 (1994); Morrison: Natúré 368, 812 (1994); Morrison, Nature 368, 812 (1994); Fishwildés mtsai.: Natúré Biotechnology 14, 845 (1996); Fishwildés al .: Nature Biotechnology 14: 845 (1996); Neuberger:Natúré Biotechnology 14, 826 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology 14, 826 (1996); Lonberg és Huszár: In-tern. Lonberg and Huszar: In-tern. Rév. Port. Immunoi. Immunol. 13, 65 (1995)]. 13, 65 (1995)]. Más módon, a humán an-titest egy célantigén elleni antitestet termelő humán B-limfociták immortalizálásával is előállítható (az ilyen B-limfociták kinyerhetők az egyénből vagy in vivő immunizál-hatok) ; Alternatively, the human antibody is an antibody directed against a target antigen, it can also be prepared by immortalizing producing human B lymphocytes (such B lymphocytes may be recovered from an individual or in-vivo immunized I); ld. ld. pl. eg. Colé és mtsai.: "Monoclonal Antibodies andCancer Therapy", Alán R. Liss, 77. old. Cole et al .: "Monoclonal Antibodies andCancer Therapy", Alan R. Liss, p.77. (1985); (1985); Boerner és mtsai.: J. Immunoi. Boerner et al .: J. Immunol. 147 (1) , 86 (1991); 147 (1), 86 (1991); és 5 750 373 számúegyesült államokbeli szabadalmi leírás. and U.S. Patent 5,750,373.

Az antitestekkel összefüggésben használt "variábilis"kifejezés arra vonatkozik, hogy a variábilis dómén bizonyosrészeinek aminosav-szekvenciája az egyes antitestekbennagymértékben eltér egymástól, és ezek a szakaszok felelő-sek az adott antitest adott antigénre vonatkozó specifi-tásáért. The term "variable" is used in conjunction with antibodies refers to the amino acid sequence of the variable domain of some parts are different for each antibody in a large extent and that these sections comply-sek specificity tásáért for the particular antibody for its particular antigen. Mindazonáltal, a variabilitás az antitest variábi-lis doménjeiben nem egyenletesen oszlik meg, hanem háromszakaszra koncentrálódik: ezek az úgynevezett hiper-variébilis régiók, amelyek a könnyű lánc és a nehéz láncvariábilis doménjeiben egyaránt megtalálhatók. However, the variability VARIABEL-lis domains is not evenly distributed in the antibodies, but is concentrated in three segments called hyper-variébilis regions, which are found in both the light chain and heavy chain variable domains of. A variábilisdómén állandóbb (nagyobb konzerváltságú) szakaszait vázré-gióknak (FR) nevezzük. The variábilisdómén constant (greater konzerváltságú) gióknak-frame sections (FR) called. A natív antitestek nehéz és könnyűláncainak variábilis doménjei egyenként négy vázrégiót tar-talmaznak (melyek többnyire β-redős konfigurációt vesznekfel), és ezeket három komplementaritást meghatározó régió(CDR) köti össze, melyek hurkokat képeznek, és ezek a húr- ··· • · ······ • · ··· ··· · ··· ···· · · * < --· • ··· ·· ···· ·· - 64 - kok kötik össze a β-redős struktúrát (és néhány esetben an-nak részét is képezik). The native heavy and light chain variable domains of each of the four FRs tar content was used (mostly β-sheet configuration vesznekfel), and these three complementarity connects determining regions (CDRs) which form loops, and these húr- · · · • · · · · · · · · · • ······ ···· · · · · · * <- · · · · • ·· ···· ·· - 64 - derivatives are linked by a β- sheet structure (and in some cases forming part also has an). Az egyes láncokban a vázrégiók szo-rosan összetartják a komplementaritást meghatározó régió-kat, melyek - a másik láncban lévő komplementaritást megha-tározó régiókkal együtt - az antitest antigénkötő helyeineklétrehozásában játszanak szerepet [ld. The framework regions of each chain are held together in fold in the complementarity determining region-cat, which - together with the complementarity determining regions from the other chain - of the antibody are involved in antigen binding sites production [see Fig. Kábát és mtsai.:"Sequences of Proteins of Immunological Interest", 5. ki-adás, Public Health Service, National Institutes of Health, Coat and mtsai.:"Sequences of Proteins of Immunological Interest ", a 5-reception, Public Health Service, National Institutes of Health,

Bethesda, MD (1991)]. Bethesda, MD (1991)]. A konstans domének közvetlenül nemjátszanak közre az antitest antigénhez történő kötődésében,azonban különféle effektor-funkciókat töltenek be - pl. The constant domains are not involved directly involved in binding the antibody to an antigen, but exhibit various effector functions - for example. azantitest részvétele az antitest-dependens celluláris citotoxicitásban (ADCC). azantitest participation of the antibody dependent cellular cytotoxicity (ADCC).

Ahogy a találmány leírásában használjuk, a "hiper-variábilis régió" kifejezésen egy antitest antigén-kötésértfelelős aminosavaiból álló régiót értünk. As used herein, a "hypervariable region" refers to an antibody consisting of amino kötésértfelelős antigenic region. A hipervariábilisrégió általában "komplementaritást meghatározó régióból"(CDR) származó amincsavakat tartalmaz -pl. The hipervariábilisrégió generally contain from amincsavakat "complementarity determining region" (CDR) -pl. a könnyű láncvariábilis doménjének 24-34. the light chain variable domain of 24-34. aminosavait (Ll), 50-56. amino acids of (Ll), 50-56. ami- nosavait (L2) és 89-97. amino nosavait (L2) and 89-97. aminosavait (L3), valamint a nehézlánc variábilis doménjének 31-35. amino acids (L 3) and the heavy chain variable domain and 31-35. aminosavait (Hl), 50-65. amino (Hl), 50-65. aminosavait (H2) és 95-102. amino (H2) and 95-102. aminosavait (H3) [ld. amino acids (H-3) [see Fig. Kábát ésmtsai.: "Sequences of Proteins of Immunological Interest", 5. kiadás, Public Health Service, National Institutes ofHealth, Bethesda, MB (1991)] -, és/vagy "hipervariábilis hurokból" származó aminosavakat [pl. Coat ésmtsai .: "Sequences of Proteins of Immunological Interest," 5th Edition, Public Health Service, National Institutes ofHealth, Bethesda (1991) MB] - and / or those residues from a "hypervariable loop" [ie. a könnyű lánc variábi-lis doménjének 26-32. the light chain domain VARIABEL-lis 26-32. aminosavait (Ll), 50-52. amino acids of (Ll), 50-52. aminosavait(L2) és 91-96. amino acids (L2) and 91-96. aminosavait (L3), valamint a nehéz lánc va- 65 riábilis doménjének 26-32. amino acids (L 3) and the heavy chain domain va- 65 riábilis 26-32. aminosavait (Hl), 53-55. amino (Hl), 53-55. amino-savait (H2) és 96-101. amino acids of (H2) and 96-101. aminosavait (H3); amino acid (H3); Chothia és Lesk: J. Mól. Chothia and Lesk J. Mol. Bioi. Biol. 196, 901 (1987)] tartalmaz. 196: 901 (1987)] contains. A vázrégiót (FR) alkotó aminosavak a variábilis dómén azon aminosavai, ame-lyek nem a hipervariábilis régió részét képezik. The framework region (FR) amino acids constituting the amino acids, those in which does not form part of the hypervariable region of the variable domain. A teljes antitestek - nehéz láncaik konstansdoménjének aminosav-szekvenciájától függően - különböző"osztályokba" sorolhatók. Depending on the amino acid sequence of heavy chains konstansdoménjének - - Total antibodies can be assigned to different "classes". A teljes antitestek öt fő osztá-lya létezik: IgA, IgD, IgE, IgG és IgM, melyek közül többtovábbi "alosztályokra" (izotípusokra) osztható, pl. There whole antibodies, five-year rich major classes: IgA, IgD, IgE, IgG, and IgM, and several additional "subclasses" (isotypes) which can be divided, e. IgGl(nem-A és A-allotípus), IgG2, IgG3, IgG4, IgA és IgA2. IgGl (non-A and A allotypes), IgG2, IgG3, IgG4, IgA, and IgA2. Akülönböző antitest-osztályoknak megfelelő nehéz lánc kons-tans domének elnevezése a következő: α, δ, ε, γ, illetve μ.A különféle Ig-osztélyok alegység-szerkezete és háromdimen-ziós konfigurációja szakember számára jól ismert. Names corresponding Akülönböző antibody heavy chain classes kons tans-domains that are well known α, δ, ε, γ, and μ.A various Ig CLASS subunit structure and háromdimen-dimensional configuration of the art. xA gerinces fajokból származó antitestek könnyű láncai- konstans doménjeik aminosav-szekvenciája alapján - a kételtérő zipus (k és λ) valamelyikébe sorolhatók. antibodies derived from vertebrate species xA láncai- light constant domains Depending on the amino acid sequence - belonging to any one of kételtérő ZipUSA (k and λ).

Az "Fc-régió" kifejezésen egy immunglobulin nehéz lán-ca C-terminális régióját értjük, amely a teljes antitestpapainos emésztésével hozható létre. The term "Fc region" is meant an immunoglobulin heavy-dioxolan ca C-terminal region that can be created by digestion of the whole antitestpapainos. Az Fc-régió natívszekvenciát vagy módosított szekvencia-változatot tartal-mazhat. natívszekvenciát sequence or a modified version of the Fc region comprise mazhat. 3ár egy immunglobulin nehéz lánca Fc-régiójának ha-tárai változóak lehetnek, a humán IgG nehéz lánc Fc-régiójarendszerint a kb. 3a is an immunoglobulin heavy chain Fc region of hectares archives may vary, the human IgG heavy chain Fc régiójarendszerint the app. 226. pozíciótól (Cys) vagy a kb. Position 226 (Cys) or approx. 230. po-zíciótól (Pro) a Fc-régió C-terminálisáig terjedő szakasz-ként definiálható. Polyethylene zíciótól 230 (Pro) may be defined as a period up to the c-terminus of the Fc region. Egy immunglobulin Fc-régiója általábankét konstans tíomént (CH2 és CH3) tartalmaz, adott esetben ♦··· ·· - 66 - azonban tartalmazhat egy harmadik (CH4) domént is. The Fc region of the bank generally contains tíomént constant (CH2 and CH3) of an immunoglobulin, optionally ♦ ··· ·· - 66 - which however may have a third (CH4) domain as well.

Az "Fc-régió-lánc" kifejezésen egy Fc-régió kétpolipeptid-láncának egyikét értjük. The "Fc region chain" refers to either an Fc region kétpolipeptid chain.

Egy humán IgG Fc-régiójának "CH2-dóménje" (más néven"Cy2-domén") rendszerint a kb. A human IgG Fc region "CH2 domain" (also known as "C? 2 domain") of usually about. 231. pozícióban lévő amino-savtól a kb. at position 231 the amino acid used approx. 340. pozícióban lévő aminosavig terjed. The amino acid at position 340 extends. A CH2-domén egyedülálló abból a szempontból, hogy másik doménnelnem alkot szoros párt, sőt, egy teljes natív IgG-molekulakét CH2-doménje között két N-kötött, elágazó láncú szénhid-rát-lánc helyezkedik el. The CH2 domain is unique in that other doménnelnem form a close pair, in fact, a complete native IgG molecules are two N-linked branched carbohydrate chains Rat located between CH2 domains. Burton [Molec. Burton [Molec. Immunoi. Immunol. 22, 161 (1985)] úgy vélte, hogy a szénhidrát-lánc a domén-domén pá-rosodás helyettesítőjeként szolgál, és elősegíti a CH2-tíomén stabilizálását. 22, 161 (1985)], considered that the carbohydrate chain serves bye-low cloud as a substitute for the domain-domain, and helps to stabilize the CH2-thiomethyl. A CH2-domén natív szekvenciájú CH2-domén vagy módosított szekvenciájú CH2-domén-változat le-het . The CH2 domain of native sequence CH2 domain or a modified sequence CH2 domain-het-down version. A "CH3-domén" egy Fc-régió CH2-doménjétől C-terminálisirányban elhelyezkedő aminosavakból álló (pl. egy IgG kb.341. pozíciójában lévő aminosavtól kb. 447. pozíciójábanlévő aminosavig terjedő) szakasz. The "CH3 domain" of an Fc region located CH2 domain of the C-terminal direction of amino acids sections (eg. Amino acids in an IgG kb.341. Position to approx. 447 amino acids in position). A CH3-régió natív szek-venciája CH3-domén vagy módosított szekvenciájú CH3-domén-véltozat lehet (pl. egyik láncában beiktatott"kidudorodást", másik láncában pedig beiktatott"bemélyedést" tartalmazó CH3-domén;. ld. 5 821 333 számúegyesült államokbeli szabadalmi leírás, melyet teljes ter-jedelmében a kitanítás részének tekintünk). The CH3 region native sequence in CH3 domain, or a modified sequence CH3 domain véltozat can (eg. Inserted in a chain of "bulging" CH3 domain and containing the inserted "recess" another chain ;. ld. 5,821,333 U.S. patent, which is hereby incorporated in full jedelmében-ter). Az ilyen CH3-domén-változatok felhasználhatók a találmány szerinti több-értékű (pl. bispecifikus) antitestek előállítására. Such CH3 domain variants useful multi-valent (e. Bispecific) Antibodies of the present invention. A "csukló- ("hinge") régió" kifejezésen a humán IgGl ··« · - 67 - kb. The "wrist (" hinge ") region" of human IgG ·· «· - 67 - approx. 216. pozíciójában lévő glutaminsavtól vagy kb. glutamic acid or approx. 216 in position 226. po-zíciójában lévő ciszteintől a kb. 226 zíciójában po-cysteine ​​in the app. 230. pozíciójában lévőprolinig terjedő szakaszt értünk [ld. Position 230 refers to lévőprolinig section [see Fig. Burton: Molec.Immunoi. Burton: Molec.Immunoi. 22, 161 (1985)]. 22, 161 (1985)]. Más IgG-izotípusok csukló-régióioly módon hasonlíthatók össze az IgGl csukló-régiójával,hogy a láncközi SS kötéseket képező első és utolsó ciszte-ineket azonos pozícióba helyezzük. On the other IgG isotypes may be compared hinge régióioly manner with the IgGl hinge region of the first and last cysteine ​​ins forming the interchain SS bonds are placed in the same position. A csukló-régió natívszekvenciát vagy módosított szekvenciát tartalmazhat. The hinge region may comprise natívszekvenciát or modified sequence. A mó-dosított csukló-régió változat két polipeptid-lánca általá-ban lánconként legalább egy ciszteint tartalmaz, ezáltal akét polipeptid-lánc között diszulfid-kötés jöhet létre. Mo dosított variant hinge region comprises at least one cysteine ​​per chain generally in two polypeptide chains, thereby Hatake disulfide bonds can occur between polypeptide chains. Acsukló-régió a találmány szerinti megoldás szempontjábólelőnyösen natív szekvenciájú humán csukló-régió (pl. natívszekvenciájú humán IgGl csukló-régió. A "funkcionális Fc-régió" egy natív szekvenciájú Fc-régió legalább egy "effektor-funkciójának" kifejtésére ké-pes. Az effektor-funkciók jellemző példái közé tartoznak akövetkezők: Clq-kötés; komplement-dependens citotoxicitás(CDC); Fc-receptor megkötése; antitest-dependens sejt-közvetírétté citoxicitás (ADCC); fagocizózis; sejtfelületireceptorok (pl. B-sejt-receptor, 3CR) gátlása, stb. Azilyen effektor-funkciókhoz általában arra van szükség, hogyaz Fc-régió egy kötődoménnel (pl. egy antitest variábilisdoménjével) kombinálódjon. Az effektor-funkciók szakemberszámára jól ismert vizsgálati eljárások alkalmazásával tesztelhetek. A "natív szekvenciájú Fc-régió" egy természetben elő-forduló Fc-régió aminosav-szekvenciájával azonos aminosav- ··· Acsukló region the solution according to the invention szempontjábólelőnyösen native sequence human hinge region (eg. Natívszekvenciájú human IgGl hinge region. A "functional Fc region" of a native sequence Fc region by at least one "effector function" exerting Cortical pes. The examples of effector functions characteristic include akövetkezők: Clq binding, complement dependent cytotoxicity (CDC), concluding an Fc receptor antibody-dependent cell-közvetírétté cytotoxicity (ADCC); fagocizózis; sejtfelületireceptorok (e.g. B cell receptor, 3CR. ) inhibition, etc Azilyen effector functions generally are needed hogyaz Fc region of a binding domain (eg. an antibody variábilisdoménjével) applying to be combined. well known to those skilled in the effector functions assays may be tested. a "native sequence Fc region" is a naturally occurring Fc region, for the same amino acid sequence of amino acids · · · * ·«·· ·· *· ♦··> • ·»···· ··« ··· * ·»· • * * ·* - 68 - szekvenciát tartalmaz. A 3. ábrán bemutatjuk a natív szek-venciájú humán és egéreredetű IgG Fc-régiók aminosav- szekvenciáit. * · "·· ·· ·· ♦ · *> • ·» ···· ·· "··· * ·» · · • * * * - 68 -. Contain the native sequence shown in Figure 3, sec- of sequence human and mouse IgG Fc region amino acid sequences.

Egy "módosított Fc-régió-változat” olyan aminosav-szekvenciát tartalmaz, amely a natív szekvenciájú Fc-régióaminosav-szekvenciájától legalább egy aminosav- szubsztitúcióban eltér. A módosított Fc-régió-változat egy natív szekvenciájú Fc-régióval vagy egy kiindulásipolipeptid Fc-régiójával Összehasonlítva legalább egy {pl.kb. 1-10, előnyösen kb. 1-5) aminosav-szubsztitúciót tar-talmaz. Az Fc-régió-változat egy natív szekvenciájú Fc-régió és/vagy egy kiindulási polipeptid Fc-régiója amino-sav-szekvenciáj ával legalább kb. 80 %-ban, előnyösen leg-alább kb. 90 %-ban, még előnyösebben legalább 95 %-ban azo-nos aminosav-szekvenciát tartalmaz. A "modified Fc region variant" comprises an amino acid sequence which differs at least one amino acid substitutions in a native sequence Fc region amino acid sequence. The modified Fc region variant of a native sequence Fc region or a kiindulásipolipeptid Fc region of compared with at least one {pl.kb. 1-10, preferably approx. 1 to 5) amino acid substitution tar talmaz. The Fc region variant of a native sequence Fc region and / or a parent polypeptide Fc region amino acid sequence coding of at least approx. 80%, preferably at least approx. 90%, at least 95% amino acid sequence nos azo more preferred.

Az "antitest-dependens sejtközvetítette citotoxicitás"és "ADCC" kifejezés olyan sejtközvetítette reakciót jelent,amelynek során Fc-recepzorokat (FcR) termelő, nem specifi-kus citotoxikus sejzek [pl. "Antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity" and the term "ADCC" refer to a cell-mediated reaction in which the Fc recepzorokat (FcRs), non-specific cytotoxic specificity sejzek [eg. természetes "killer"-sejtek{XK-sejzek), r.eutrofilek vagy makrofágok] egy célsejten lé-vő, közönt antitesten ismernek fel, és ezt követően a cél-sejt líziséz okozzák. natural "killer" T-cells {XK sejzek) or macrophages r.eutrofilek] to recognize a target cell juice cf., control panel has antibody, and then the target cell líziséz caused. Az ADCC-t közvetítő elsődleges sej-tek, az RK-sejtek, csak FcyRIII-at termelnek, míg amonocizák az FcyRI-et, FcyRII-t és FcyRIII-at egyaránt ter-melik. The primary cells for mediating ADCC, RK-cells produce only Fc? RIII, whereas amonocizák of FcyRI, FcyRII and FcyRIII both ter-melik. A vérképzési sejtek FcR-termelését illetően ld.Rávetet és Kinet cikkének [Annu. The production of hematopoietic cells FcR regarding Article ld.Rávetet and Kinet [Annu. Rév. Port. Immunoi. Immunol. 9_, 457 (1991)3 3. táblázatát. 9_, 457 (1991) 3 3. Table. Egy adott molekula ADCC- aktivitásénak értékelésére in vitro ADCC-teszt alkalmazható ♦ ·«· *· • · -i » · »«· * ··· • · * ·# ·»« *- - 69 - (ld. pl. 5 500 362 és 5 821 337 számú egyesült államokbeliszabadalmi leírás). evaluating a molecule aktivitásénak ADCC in vitro ADCC assay, ♦ · «* · · · • -i» · »« * ··· • · · · · # * »« * - - 69 - (see, e.g.,.. No. 5,500,362 and 5,821,337, U.S. patent specification). Az ilyen vizsgálati eljárásokban alkal-mazható effektor sejtek közé tartoznak a perifériás véregymagvú sejtjei (PBMC) és a természetes killer-sejtek. Such assays can be employed effector cells include peripheral blood mononuclear cells (PBMC) and natural killer cells. Másmódon - vagy ezen túlmenően - egy adott molekula ADCC-aktivitása in vivő is tesztelhető, például állatmodell al-kalmazásával [ld. Alternatively - or in addition - in vivo ADCC activity of the molecule may be tested, for example, animal models of sub-application offers [ld. Clynes és mtsai.: Proc. Clynes et al .: Proc. Natl. Natl. Acad. Acad. Sci. (USA) 95, 652 (1998)]. Sci. (USA) 95 (1998) 652]. A "humán effektor sejtek" olyan leukociták, amelyekegy vagy több Fc-receptort termelnek és effektor-funkcióttöltenek be. "Human effector cells" are leukocytes Fc receptor produce amelyekegy or more effector functions and occupy. A sejtek előnyösen legalább az FcyRIII-at ter-melik, és ADCC effektor-funkciót töltenek be. The cells are preferably at least Fc? RIII ter-Melia and perform ADCC effector function. Az ADCC-t közvetítő humán leukociták példái közé tartoznak a perifé-riás vér egymagvú sejtjei (PBMC), a természetes "killer"-sejtek, a monociták, a citotoxikus T-sejtek és aneutrofilek, melyek közül a találmány szerinti megoldásszempontjából a PBMC-k és az NK-sejtek előnyösek. The mediating ADCC Examples of human leukocytes include perifé spectrometry blood mononuclear cells (PBMC), natural "killer" T-cells, monocytes, cytotoxic T cells and aneutrofilek, solutions in terms of the invention of which the PBMCs and NK cells being preferred. Azeffektor-sejtek természetes forrásukból (pl. vérből vagyperifériás vér egymagvú sejtjei közül) izolálhatok. Azeffektor cells isolated from a native source (e.g. from. Blood or peripheral blood mononuclear cells).

Az "Fc-receptor" vagy "FcR" kifejezésen olyan recep-tort értünk, amely egy antitest Fc-régiójéhoz képes kötőd-ni. The term "Fc receptor" or "FcR" refers to a receptor cake, which is an antibody capable of binding Fc régiójéhoz ni. Az Fc-receptor előnyösen natív szekvenciájú humán FcR.Ezenfelül, a találmány szerinti megoldás szempontjából elő-nyös Fc-receptor IgG-antitest megkötésére képes (vagyis γ-receptor), mint pl. The Fc receptor is native sequence human FcR.Ezenfelül capable terms, the present invention is advantageous IgG Fc receptor antibodies bind (i.e., γ receptor), for example. az FcyRI, FcyRII és FcyRIII alosztályoktagjai, ideértve ezek allélváltozatait és alternatív "splicing" események következtében létrejött alakjait. ? RI, RII and RIII alosztályoktagjai, including allelic variants and they are created as a result of alternative "splicing" Events figures. AzFcyRII-receptorok közé tartozik az FcyRIIA ("aktiváló re- ·»*·* «· • ·» *··· - 70 ceptor"), és az FcyRIIB ("gátló receptor"), melyek hasonló aminosav-szekvenciát tartalmaznak - elsősorban cito- plazmikus doménjükben térnek el egymástól. AzFcyRII receptors include FcyRIIA (an "activating re- ·» · * * «· · •» * ··· - 70 receptor ") and FcyRIIB (an" inhibiting receptor "), which have similar amino acid sequence - especially cytotoxic plasmic domains thereof differ. Az aktiválóFcyRIIA-receptor citoplazmikus doménjében immunreceptortirozin-alapú aktiváló motívumot (ITAM), míg a gátlóFcyRIIB-receptor citoplazmikus doménjében immunreceptortirozin-alapú gátló motívumot (ITIM) tartalmaz [áttekintést The aktiválóFcyRIIA immunreceptortirozin receptor-based activation motif (ITAM) while gátlóFcyRIIB immunreceptortirozin receptor-based inhibition motif (ITIM) comprises [overview of the cytoplasmic domain of the cytoplasmic domain of

Id. Daéron: Annu. Id. Daeron, Annu. Rév. Port. Immunoi. Immunol. 15, 203 (1997)]. 15, 203 (1997)]. Az Fc- receptorok áttekintő leírását illetően Id. Ravetch ésKinet: Annu. . An overview of Fc receptors regarding Id Ravetch ésKinet Annu. Rév. Port. Immunoi. Immunol. 9, 457 (1991); 9, 457 (1991); Capel és mtsai.:Immunomethods _4, 25 (1994); Capel mtsai.:Immunomethods _4, 25 (1994); és de Haas és mtsai.: J. Láb.Clin. and de Haas et al .: J. Láb.Clin. Med. 126, 330 (1995)]. Med., 126: 330 (1995)]. Az Fc-receptor kifejezés magá-ban foglalja az egyéb Fc-receptorokat (ideértve a még azo-nosításra váró Fc-receptorokat), valamint az újszülöttkoriFc-receptort [FcRn, amely az anyai IgG-molekulák magzatbatörténő átviteléért felelős; The term Fc receptor itself in representing other Fc receptors (including waiting for more azo nosításra Fc receptors) and receptor újszülöttkoriFc [FcRn, which is responsible for the transmission of maternal IgG molecules magzatbatörténő; ld. ld. Guyer és mtsai.: J.Immunoi. Guyer et al .: J.Immunoi. 117, 587 (1976); 117, 587 (1976); és Kim és mtsai.: J. Immunoi. and Kim et al .: J. Immunol. 24, 249 (1994)]. 24, 249 (1994)]. A "komplement-dependens citotoxicitás" vagy "CDC" ki-fejezés egy molekula célsejtet - komplement jelenlétében -lizáló képességére vonatkozik. "Complement dependent cytotoxicity" or "CDC" off-target cell expression of a molecule - refers to the ability -lizáló presence of complement. A komplement-aktiválásireakcióutat a komplementrendszer első komponensének (Clo)egy közös eredetű antigénnel komplexált molekulához (pl.antitesthez) történő kötődése indítja be. The complement aktiválásireakcióutat binding of the first component of the complement system (Clo) complexed with a cognate antigen molecule (pl.antitesthez) triggers. A komplement-aktiválás vizsgálatára CDC-tesztet [ld. To assess complement activation, a CDC test [see. Gazzano-Santoro ésmtsai.: J. Immunoi. Gazzano-Santoro ésmtsai .: J. Immunol. Methods 202, 163 (1996)] végezhetünk. Methods 202: 163 (1996)] can be performed.

Az "affinitás-fejlesztéssel javított" antitest olyanantitest, amely egy vagy több komplementaritást meghatározó • · - 71 - The "improved affinity development" antibody is an antibody comprising one or more complementarity determining • · - 71 -

régiójában egy vagy több módosítást tartalmaz, amely(ek) azantitest antigénre vonatkozó affinitását - a nem módosítottkiindulási antitestéhez viszonyítva - javítják. region comprises one or more modifications, which affinity for the antigen (s) azantitest - improving - as compared to non módosítottkiindulási antibody. Az affini-tás-fej lesztett antitestek előnyösen nM vagy pM tartománybaeső affinitással kötődnek a célantigénhez. In an affinity head developed antibodies preferably bind nM or pM affinity for the range of the target antigen. Az affinitás-fejlesztett antitestek szakember számára jól ismert eljárá-sokkal állíthatók elő. well-known procedures, much can be prepared by the affinity-matured antibodies artisan. Marks és mtsai. Marks et al. [Bio/Technology 10,779 (1992)] a VH- és VL-domének kombinálásával végzett af-finitás-fejlesztési eljárást írtak le. [Bio / Technology, 10.779 (1992)] af-finitás development process on combinations of VH and VL domains have been described. A komplementaritástmeghatározó régió és/vagy vázrégió aminosavainak randommutagenezisét Barbas és mtsai. The komplementaritástmeghatározó region and / or framework region randommutagenezisét Barbas et al. [Proc. [Proc. Natl. Natl. Acad. Acad. Sci. USA 91, 3809 (1994)]; Sci. USA 91: 3809 (1994)]; Schier és mtsai. Schier et al. [Gene 169, 147 (1995)], [Gene, 169: 147 (1995)],

Yelton és mtsai. Yelton et al. [J. [J. Immunoi. Immunol. 155, 1994 (1995)], Jackson ésmtsai. 155, 1994 (1995)], Jackson ésmtsai. [J. [J. Immunoi. Immunol. 154(7), 3310 (1995)] és Hawkins és mtsai. 154 (7), 3310 (1995)] and Hawkins et al. ÍJ. BOW. Mól. Mole. Bioi. Biol. 226, 889 (1992)] írták le. 226, 889 (1992)] have been described.

Ahogy a leírásban használjuk, a "százalékos aminosav- szekvencia azonosság" kifejezésen a kiszemelt szekvenciábanlévő azcn aminosavak százalékos arányát értjük, amelyek - aszekvenciák egymás alá rendezése ("alignment"), és kívántesetben, a teljes szekvenciára kiterjedő maximális egyezésérdekében, kihagyások beiktatása után - azonosak a vonat-koztatási szekvencia aminosavaival (figyelmen kívül hagyvaa konzervatív szubsztitúciókat). As used herein, the "percent amino acid sequence identity" refers to the candidate szekvenciábanlévő azcn ratio of amino acids percent thereof, that - identical - aszekvenciák Alignment ( "alignment"), and, if desired, the maximum matching interests of covering the entire sequence after insertion omissions the train-mers sequence of amino acids (ignored hagyvaa conservative substitutions). A szekvenciák egymás alárendezésére alkalmazható eljárások és számítógépes progra-mok - pl. The sequences themselves can be used alárendezésére procedures and computer programs oximes - eg. BLAST, BLAST-2, ALIGN, ALIGN-2 vagy Megalign(DNASTAR) - jól ismertek. BLAST, BLAST-2, ALIGN, ALIGN-2 or Megalign (DNASTAR) - are well known. Az illeszkedés ("alignment") mé-réséhez szükséges paraméterek - ideértve az összehasonlíta-ni kívánt szekvenciák teljes hossza mentén maximális il- • · Parameters necessary for the fit ( "alignment"), digit-Reset - including over the entire length of the desired sequences comparative ni-yl maximum • ·

- 72 - leszkedés eléréséhez szükséges algoritmusok - kiválasztásaszakember számára nem okoz gondot. - no problem for the selection of personnel - 72 - are placed to achieve the necessary algorithms. Mindazonáltal, a talál-mány céljaira a százalékos aminosav-szekvencia azonosságotaz alábbiakban leírtak szerint, ALIGN-2 szekvencia-összehasonlító szoftver alkalmazásával határozzuk meg. However, the present document, for the purposes described below azonosságotaz the percent amino acid sequence according to, is determined using the ALIGN-2 sequence comparison software. AzALIGN-2 szekvencia-összehasonlítási program a Genentechterméke, melyet felhasználói dokumentációval együtt azEgyesült Államok Szerzői Jogvédő Hivatalánál (WashingtonD.C., 20559). AzALIGN-2 sequence comparison program Genentechterméke, with which user documentation azEgyesült States Copyright Office of the (WashingtonD.C., 20559). TXU510087 regisztrációs számon jegyeztek be.Az ALIGN-2 kereskedelmi forgalomban a Genentech, Inc-től(Dél San Francisco, Kalifornia) szerezhető be. TXU510087 recorded registration number be.Az ALIGN-2 is commercially available from Genentech, Inc. can be obtained (South San Francisco, California). Az ALIGN-2programot UNIX operációs rendszerben (előnyösen digitálisUNIX V4.0D rendszerben) történő felhasználáshoz fordítanikell. The ALIGN-2programot be given for use on a UNIX operating system (preferably digital UNIX V4.0D system). Valamennyi szekvencia-összehasonlítási paramétert azALIGN-2 programmal állítottuk fel és nem variáltuk. All sequence comparison parameters are set up our azALIGN-2 program and do not varied. A találmány céljaira egy adott "A" aminosav-szekvenciaadott "B" aminosav-szekvenciához viszonyított százalékosaminosav-szekvencia azonossága (amely más szavakkal úgy fe-jezhető ki, mint egy adott "A" aminosav-szekvencia, amelybizonyos százalékban azonos aminosav-szekvenciát tartalmazegy adott "3" aminosawal) a következek szerint számítható ki: X/Y-100 ahol X értéke: az ALIGN-2 programmal egymás alá rendezett"A" és "3" aminosav-szekvencia azonosnak bizonyult aminosa- vainak száma; For purposes of the present invention relative to a particular "A" amino acid sequence given amino acid sequence "B" Percent amino acid sequence identity (which is phenyl jezhető to other terms such as a particular "A" amino acid sequence identical to a certain percent amino acid sequence contains a specific "3" amino acid of) can be calculated by the coherent X / Y 100 where X is: aligned side by the ALIGN-2 program code for producing amino Vain "a" and "3" is the amino acid sequence proved to be identical; és Y értéke: a "B" szekvenciában lévő amino- savak összes száma. and Y is the total number of amino acids in the sequence "B". Szakember számára kézenfekvő, hogyamennyiben az "A" szekvencia hosszúsága nem azonos a "B" • · · · • · ······ • * ··· ··· · ··· ···· · · · _ * • «· · ·· ···· ·· - 73 - szekvenciáéval, az "A" szekvencia ”B" szekvenciához viszo-nyított százalékos azonossága nem lesz azonos a "B" szek-vencia "A" szekvenciához viszonyított százalékos azonossá-gával . A "polipeptid-lánc" kifejezésen olyan polipeptidet ér-tünk, amelynek valamennyi dóménje peptidkötéssel kapcsoló-dik a többi doménhoz (szemben a nem kovalens kölcsönhatá-sokkal vagy diszulfid-hidakkal). It will be appreciated, hogyamennyiben "A" is not equal to the sequence length • "B" · · · · ······ • * • ···· ··· ··· ··· · · · · _ * • "· ···· ·· ·· - 73 - szekvenciáéval, the" a "percentage of sequence" B "sequence identity will not be the same percentage of" a "sequence identical to the sequence-gával" B " . A "polypeptide chain" refers to vascular was a polypeptide having all domains of the peptide bond connecting ith more domains (as opposed to non-covalent conferring interactive much or disulfide).

Ahogy a leírásban használjuk, a "flexibilis kapcsoló-szekvencia" vagy "flexibilis kapcsolópeptid" kifejezésenolyan pepiidet értünk, amely - egymáshoz peptidkötésselkapcsolódó - két vagy több aminosavat tartalmaz, és amelyaz egymáshoz kapcsolt két polipeptid - (pl. két Fd-régió)számára nagyobb rotációs szabadságot biztosít. As used herein, refers kifejezésenolyan peptide is a "flexible linker sequence" or a "flexible linker", which - comprises two or more amino acids, and amelyaz linked together two polypeptides - - together peptidkötésselkapcsolódó larger for (. Eg two Fd regions) on a rotary It ensures freedom. Az ilyen ro-tációs szabadság a flexibilis kapcsolószekvencia által egy-máshoz kapcsolt két vagy több antigénkötő hely számára le-hetővé teszi, hogy hatékonyabban kötődjenek acélantigén(ek)hez. Such ro-tation of freedom allows for off-hetővé connected by the flexible linker to one another two or more antigen binding sites that efficiently bind acélantigén (s). Az alkalmas flexibilis kapcsolópeptidekpéldáiként említhetek a következők: Gly-Ser, Gly-Ser-Gly-Ser (IC. azonosítószámú szekvencia), Ala-Ser vagy Gly-Gly-Gly-Ser (11. azonosítószámú szekvencia). Suitable flexible kapcsolópeptidekpéldáiként it includes the following: Gly-Ser, Gly-Ser-Gly-Ser (SEQ ID NO: IC.), Ala-Ser or Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID NO: 11). A flexibiliskapcsolópeptid előnyösen kb. The flexibiliskapcsolópeptid preferably approx. 2-10 aminosavat, legelőnyöseb-ben négy vagy kevesebb aminosavat tartalmaz. 2-10, most preferably comprising amino acids in four or fewer amino acids. A "dimerizációs dómén" legalább két aminosav(általában cisztein) vagy legalább két (azonos vagy külön-böző aminosav-szekvenciát tartalmazó) peptid vagypolipeptid összekapcsolódásával jön létre. A "dimerization domain" is at least two amino acid residues (generally cysteine ​​residues) or of at least two peptides vagypolipeptid (containing the same or separate various amino-acid sequence) is created by joining. A peptidek vagypolipeptidek egymással kovalens és/vagy nem kovalens köté- • · · · • · · * · · • · ······ ·· ··· ··· · *·· - 74 - sekkel kapcsolódhatnak egymáshoz. Peptides vagypolipeptidek each other by covalent and / or noncovalent obligations • • · · · · · · · * • · ······ ··· ··· ·· ·· · * - 74 - linked to each other SEKKEN. A dimerizációs doménekjellemző példái a következők: Fc-régió, csukló-régió, CH3-domén, CH4-domén, CH1-CL pár, mesterségesen kialakított"kidudorodást" és/vagy "kiemelkedést" tartalmazó határtfelület (ld. 5 821 333 számú egyesült államokbeliszabadalmi leírás, melyet teljes terjedelmében a kitanításrészének tekintünk), leucin-zipzár [pl. The dimerization doménekjellemző Examples include: U.S. Patent Fc region, hinge region, CH3 domain, CH4 domain, CH1-CL pair artificial "bulge" and / or number of boundary surfaces containing "projection" (see 5,821,333 united. description we take to be the kitanításrészének entirety), leucine zipper [for example. jun/fos leucin-zipzár, ld. jun / fos leucine zipper, see. Kostelney és mtsai.: J. Immunoi. Kostelney et al .: J. Immunol. 148, 1547 (1992) vagy élesztőeredetű GCN4 leucin-zipzár), izoleucinzipzár, receptor dimer-pár [pl. 148, 1547 (1992) or a yeast GCN4 leucine zipper), izoleucinzipzár receptor dimer pair [eg. interleukin-8-receptor (IL-8R) , és integrin-heterodimerek, pl. Interleukin-8 receptor (IL-8R) and integrin heterodimers, e. LFA-1 és GPIIIb/IIIa]vagy ezek dimerizációs régió(i); LFA-1 and GPIIIb / IIIa] or a dimerization region (s); dimer ligandum-polipeptidek [pl. dimeric ligand polypeptides [e. idegsejt-eredetű növekedési faktor (NGF),neurotrophin-3 (NT-3), interleukin-8 (IL-8), vascularisendothelialis növekedési faktor (VÉG?) és agyeredetűneurotroph faktor (BQNF); neuron-derived growth factor (NGF), neurotrophin-3 (NT-3), Interleukin-8 (IL-8) and growth factor vascularisendothelialis agyeredetűneurotroph factor (BQNF) (END?); ld. ld. Arakawa és mtsai.: J. Bioi.Chem. Arakawa et al .: J. Bioi.Chem. 269(45), 27S33 (1994); 269 ​​(45) 27S33 (1994); Radziejewski és mtsai.:Biochem. Radziejewski and mtsai.:Biochem. 32 (48) , 1350 (1993)], valaminz ezek dimerizációsrégiója (régiói); 32 (48), 1350 (1993)], these valaminz dimerizációsrégiója (regions); diszulfid-kötések létrehozására képesciszteir.-pár; the creation of disulfide bonds képesciszteir. pair; legalább egy-egy (pl. kb. 1-, 2- vagy 3-10) ciszteint tartalmazó - s ezáltal diszulfid-kötés(ek) létre-hozáséra képes - peptidekből vagy polipeptidekből álló pár(a továbbiakban "szintetikus csukló"); containing at least one (for example, about 1, 2 or 3-10..) cysteine ​​- pair of peptides or polypeptides (hereinafter "a synthetic hinge") - and thus a disulfide bond (s) capable of up-hozáséra; és antitest variábi-lis domének. and antibody-lis variabel domains. A találmány szerinti megoldás szempontjából alegelőnyösebb dimerizációs dómén az Fc-régió vagy a csukló-régió . An essential part of the invention alegelőnyösebb dimerization domain of the Fc region or a hinge region. A "természetben előforduló aminosavak" - vagyis a ge-netikai kód által kódolt aminosavak - a következők: alanin • · · · • · • · · • · · · · • · · · « • · · · - 75 - (Alá), arginin (Arg), aszparagin (Asn), aszparaginsav(Asp), ciszteint (Cys), glutamin (Gin), glutaminsav (Glu)glicin (Gly), hisztidin (His), izoleucin (Ile), lizin (Lys), metionin (Met), fenilalanin (Phe), prolin (Pro),szerin (Ser), treonin (Thr), triptofán (Trp), tirozin (Tyr)és valin (Val). The term "naturally occurring amino acid" - that is encoded by the ge kinetic code of amino acids - the alanine • · · · • · • · • · · • · · · «• · · · - 75 - (Ala) , arginine (Arg), asparagine (Asn), aspartic acid (Asp), cysteine ​​(Cys), glutamine (Gln), glutamic acid (Glu), glycine (Gly), histidine (His), isoleucine (Ile), lysine (Lys), methionine (Met), phenylalanine (Phe), proline (Pro), serine (Ser), threonine (Thr), tryptophan (Trp), tyrosine (Tyr) and valine (Val). A "természetben nem előforduló aminosav"kifejezés a felsorolt természetes aminosavaktól eltérő ami-nosavra vonatkozik, amely a polipeptid-láncban a szomszédosaminosav(ak)hoz kovalens kötéssel képes kapcsolódni. The term "non-naturally occurring amino acid" refers to natural amino acids other than the listed amino acids occurs, which is capable of binding to the szomszédosaminosav one (s) covalently bonded to the polypeptide chain. A ter-mészetben nem előforduló aminosavak példái közé tartozik anorleucin, ornitin, norvalin, homoszerin és egyéb aminosav-analógok [ld. Examples not occurring and the wilderness of the ter-amino acids include anorleucin, ornithine, norvaline, homoserine and other amino acid analogues [see Fig. pl. eg. Ellman és mtsai.: Meth. Ellman et al .: Meth. Enzym. Enzym. 202, 301 (1991)]. 202, 301 (1991)]. A természetben nem előforduló aminosavak előállí-tására a Noren és mtsai. It does not occur in naturally occurring amino acids produced in the pouch-Noren et al. [Science 24 4, 182 (1989)] és azEllman és mtsai. [Science 24: 4, 182 (1989)] and azEllman et al. (ld. fentebb) által leírt eljárások alkal-mazhatók. procedures described by (., supra) can be employed. Az ilyen eljárások során egy szupresszor tRNS-tkémiailag egy természetben nem előforduló aminosawal akti-válunk, majd in vitro transzkripciót követően végrehajtjukaz RNS transzlációján. In such processes, a suppressor tRNA tkémiailag a naturally occurring amino acid of not become activated, and then after végrehajtjukaz RNA translation in vitro transcription.

Az "izolált" polipeptid kifejezés egy - természeteskörnyezetében megtalálható - komponenstől elválasztottés/vagy elkülönített polipeptidre vonatkozik. The term polypeptide is "isolated" one - of its natural environment - component refers elválasztottés / or isolated polypeptide. A természeteskörnyezetben megtalálható szennyező komponensek apolipeptid diagnosztikai vagy gyógyászati felhasználásátakadályoznák; Of its natural environment Contaminant components of diagnostic or therapeutic apolipeptid felhasználásátakadályoznák; az ilyen komponensek közé tartoznak az enzi-mek, hormonok és egyéb - proteinszerű vagy nem proteinszerű- oldott anyagok. such components include enzymes, metals, hormones, and other - or non-proteinaceous solutes proteinszerű-. A találmány előnyös megvalósítási módjaiértelmében a polipeptid tisztításának mértéke a következő: - 76 - (1) a Lowry-eljárással végzett meghatározás szerint 95m/m%-nál nagyobb, legelőnyösebben 99 m/m%-nál nagyobb tisz-taság; módjaiértelmében preferred embodiment of the invention, the degree of purification of the polypeptide are: - 76 - greater than (1) determined by the Lowry method according to 95m / m%, more preferably 99 w / w% greater than purity of the cleaning step; (2) forgócsészés ("spinning cup") szekvenátor alkal-mazásával legalább 15 aminosavas N-terminális vagy belsőarainosav-szekvencia kinyeréséhez szükséges tisztaság; (2) rotating bowl ( "spinning cup") sequencer alkali tion of at least 15 amino acid N-terminal sequence by or required belsőarainosav-purity; vagy (3) redukáló vagy nem redukáló feltételekkel végzett SDS-PAGE-analízissel (Coomassie-kék vagy, előnyösen, ezüst fes-tés alkalmazásával) homogenitásnak megfelelő tisztaság. or SDS-PAGE analysis (Coomassie blue or, preferably, silver staining heating) to homogeneity purity under reducing conditions (3) or non-reducing. Azizolált polipeptid kifejezés jelentése kiterjed arekombináns sejtekben in situ megtalálható polipeptidekre,mivel az ilyen sejtekben a polipeptid természetes környeze-tének legalább egy komponense hiányzik. Azizolált term encompasses the techniques of recombinant polypeptide in situ in cells found in the polypeptides, since such cells with at least one component of the polypeptide natural environment-Esselte becomes absent. Mindazonáltal, azizolált polipeptideket általában legalább egy tisztításilépést követően kapjuk. However, azizolált polypeptides are prepared by at least one tisztításilépést.

Egy antitest "funkcionális antigénkötő helye" kifeje-zésen célantigént megkötni képes antigénkötő helyet értünk,melynek antigénkötő affinitása nem szükségszerűen azonos azeredeti antitest (amelyből az antigénkötő hely származik)affinitásával, de antigénkötő képességének az antitestekantigénkötésének mérésére alkalmas eljárások valamelyikévelElérhetőnek kell lennie. We refer to an antibody capable of binding "functional antigen binding site" of swollen express target antigen with antigen-binding sites, which are not necessarily the same antigen-binding affinity azeredeti antibody (from which the antigen binding site is derived) but the ability to measure the antigen binding antitestekantigénkötésének valamelyikévelElérhetőnek affinity procedures should be. Ezen túlmenően, egy többértékű an-titest antigénkötő helyei antigénkötési affinitásának nemkell kvantitatívan azonosnak lennie. In addition, a multivalent antigen binding sites of an antigen-antibody directed affinity should not be the same quantitatively. A találmány szerintimultimer antitestek illetően, a 2. példában leírt ultra-centrlfugás analízis alkalmazásával számos funkcionálisantigénkötő hely értékelhető. The invention regards szerintimultimer antibodies using ultra-centrlfugás analysis described in Example 2 several funkcionálisantigénkötő site assessed. E vizsgálati eljárás acélanfigént és a multimer antitestet különböző arányokbanelegyítjük, és a komplexek átlagos molekulatömegét különbö- • ·· · - 77 - ző számú funkcionális kötőhelyet feltételezve számítjuk ki.Az így kapott elméleti értékeket a tényleges kísérleti ér-tékekhez viszonyítva határozzuk meg a funkcionális kötőhe-lyek számát. This test procedure különbö- • ·· · acélanfigént and multimeric antibody arányokbanelegyítjük different, and the weight average molecular complexes - 77 - assuming Zo numbers of functional binding sites ki.Az calculated theoretical values ​​thus obtained are compared to the actual experimental vascular low polydispersity values ​​determined by the functional binding site -lyek number. A "receptor ligandum általi aktiválása" kifejezésen aligandum receptorhoz (vagy a kérdéses receptort tartalmazóreceptor-komplexhez) történő kötődése által közvetítettszignál-transzdukciót értünk (például, amelyet - tirozin-kináz receptor esetében - egy tirozin-kináz receptorintracelluláris kináz-doménje (amely a receptorban vagy egyszubsztrát-polipeptidben lévő tirozinok foszforilációjáteredményezi) okoz. Egy ErbB-receptor esetében e folyamatmagában foglalja egy ErbB-ligandum ErbB hetero-oligomerheztörténő kötődését, ami aktiválja a hetero-oligomerben lévőegy vagy7 több ErbB-receptor kináz-doménjét, ezáltal egyvagy több ErbB-receptor tirozinjának foszforilációjátés/vagy további szubsztrét-polipeptid(ek)ben lévő tirozinokfoszforilációját eredményezi. A receptor ligandum általi aktiválását "blokkoló" an-titest olyan antitest, amely csökkenti vagy gátolja azilyen aktiválást. A blokkolás többféle módon megvalós The "activation of receptor ligand" as used by the binding of aligandum receptor (or receptor in question tartalmazóreceptor-complex) közvetítettszignál transduction means (for example, which - for a tyrosine kinase receptor - a tyrosine kinase receptorintracelluláris kinase domain (either the receptor tyrosines on egyszubsztrát polypeptide foszforilációjáteredményezi) causes. in an ErbB receptor include an ErbB ligand ErbB hetero-oligomerheztörténő binding of this process includes that activates the hetero-oligomer in a vagy7 ErbB receptor kinase domain more, thereby one or more ErbB receptor Tyrosine foszforilációjátés / or additional substrate polypeptide (s) results in tirozinokfoszforilációját in. The activation of receptor ligand "blocking" antibody is an antibody that reduces or inhibits azilyen activation. blocking several ways be managed ulhat;például, a ligandum receptorhoz történő kötődésének, a re-ceptor-komplex kialakulásának, a receptor-komplexben lévőtirozin-kináz receptor tirozin-kináz aktivitásának és/vagya receptorban lévő tirozin(ok) foszforílációjának gátlásá-val. may be based, for example, binding of the ligand to the receptor, receptor complex formation, tyrosine (s) in lévőtirozin kinase receptor tyrosine kinase activity and / or receptor-receptor complex with the inhibition of phosphorylation. Az ErbB-receptorok ligandum általi aktiválását gátlóantitestek példái közé tartoznak a következők; activation of the ErbB receptors by ligand blocking antibodies examples include; 2C4 és 7F3monoklonélis antitest (melyek a HER2/HER3 és HER2/HER4 2C4 and 7F3monoklonélis antibody (which HER2 / HER3 and HER2 / HER4

78 hetero-oligomerek HRG általi aktiválását, valamint azEGFR/HER2 hetero-oligomer EGF, TGF-β vagy amphiregulin ál-tali aktiválását blokkolják); 78 HRG activation of hetero-oligomers, and azEGFR / HER2 hetero-oligomer EGF, TGF-β or amphiregulin activation by blocking); továbbá az L26-, L96- ésL288-antitest [Klapper és mtsai.; and L26, L96 ésL288 antibody [Klapper et al .; Oncogene 14, 2099(1997)], melyek az EGF és MDF - EGFR-t, HER2-t, HER3-at ésHER4-et termelő - T47D-sejtekhez történő kötődését gátol-ják. Oncogene 14, 2099 (1997)], which block EGF and MDF - EGFR, HER2, HER3 ésHER4 was produced - from binding to T47D cells is inhibited Jas. A szóban forgó kifejezés jelentése kiterjed a felso-rolt és egyéb antitestek humanizált és/vagy affinitás-fejlesztett változataira is. The word in question encompasses the upper-styrene and other antibodies, humanized and / or affinity-matured variants thereof also.

Egy adott antitest "biológiai tulajdonságaival" bíróantitest olyan antitest, amely az adott antitest egy vagy több olyan biológiai tulajdonságával bír, amely megkülön-bözteti azt az ugyanazon antigénhez kötődő egyéb antites-tektől . An antibody "biological characteristics" with antibody is an antibody having the antibody specific to one or more of the biological properties of which it sends to the other-bözteti-tektől the antibodies bind to the same antigen.

Ahogy itt használjuk, a "sejtszaporodást gátló ható-anyag" kifejezés olyan vegyületre vagy készítményre vonat-kozik, amely in vitro vagy in vivő gátolja egy sejt szapo-rodásét. As used herein, the term "growth inhibitory substance" refers to a compound or composition, to which in vitro or in vivo to inhibit a cell propagating Rodas. Ilyenformán, a sejtszaporodást gátló hatóanyag je-lentős mértékben csökkentheti az S-fézisban lévő sejtekszázalékos arányát. Thus, the growth inhibitory agent je-down considerably reduce its percentage of cells in S fézisban. A szaporodást gátló hatóanyagok jellem-ző példái közé tartoznak a sejtciklus előrehaladását (az S-fázistól eltérő ponton) blokkoló hatóanyagok, például, aGl-fázisban vagy az M-fázisban történő megrekedést indukálóhatóanyagok. Examples of growth inhibitory agents include character-forming cell cycle progression (at a place other than S phase point) blocking agents, for example, stasis of Agl-phase or M-phase indukálóhatóanyagok. A klasszikus M-fázis blokkolók közé tartoznaka vinca-vegyületek {pl. Classical M-phase blockers include vincas tartoznaka {eg. vincristin és vinblastin), a TAXOL®és a topo-II-inhibitorok (pl. doxorubicin, epirubicin,caurcrubicin, etopcsid és bleomycin). vincristine and vinblastine), the TAXOL®és topo II inhibitors (eg., doxorubicin, epirubicin, caurcrubicin, etopcsid and bleomycin). A Gl-fázist feltar-tóztató hatóanyagok S-fázisban történő blokkolásba is át- • · ·· - 79 - nyúlhatnak, mint pl. The Gl also spill retraining phase of exploratory agents tóztató S phase • · ·· - 79 - protrude like. a DNS-alkilező szerek (pl. tamoxifen,prednison, dacarbazin, mechlorethamin, cisplatin,methotrexat, 5-fluoruracil és ara-C. További részleteket illetően ld. "The Molecular Basis of Cancer", szerk.: DNA-alkylating agents (eg., tamoxifen, prednisone, dacarbazine, mechlorethamine, cisplatin, methotrexate, 5-fluorouracil, and ara-C. For further details, see. "The Molecular Basis of Cancer", ed .:

Mendesohn és Israel, 1. fejezet, Murakami és mtsai.: "Cellcycle regulation, oncogenes, and antineoplastic drugs" (WBSaunders; Philadelphia, 1995), különös tekintettel a 13. oldalra. Mendesohn and Israel, Chapter 1, Murakami et al .: "Cellcycle regulation, oncogenes, and antineoplastic drugs" (WBSaunders; Philadelphia, 1995), especially page 13. A "sejtszaporodást gátló" anti-HER2 antitestek jellem-ző példái azok, amelyek kötődnek a HER2-höz, és képesek gá-tolni a HER2-t túlzott mértékben termelő ráksejtek szaporo-dását. A "growth inhibitory" anti-HER2 antibodies are characterized in forming the Examples are those which bind to HER2 and are able to penetrate inhibited HER2-overexpressing cancer cells rapidly, dimerization. A találmány szerinti megoldás szempontjából előnyös,sejtszaporodást gátló anti-HER2 antitestek sejttenyészet-ben, kb. It preferred in the present invention, growth inhibitory anti-HER2 antibodies in cell culture, approx. 0,5-30 gg/ml koncentrációban 20 %-nál nagyobb mér-tékben, előnyösen 50 %-nál nagyobb mértékben (kb. 50-100 %-bán) gátolják az SKBR3 emlőtumor-sejtek szaporodását (asejtszaporcdás-gátlást az SKBR3-sejtek antitesttel történőérintkeztetése után hat nappal meghatározva; ld. 5 677 171számú egyesült államokbeli szabadalmi leírás). Concentration of 0.5 to 30 gg / ml, greater than 20%, preferably more than 50% degree (approx. 50 to 100%) in inhibiting the proliferation of SKBR3 breast tumor cells (asejtszaporcdás inhibition in SKBR3 cells is determined six days after antibody történőérintkeztetése;. 5677, see U.S. patent 171számú). A "sejthalált" indukáló antitest olyan antitest, amelyegy életképes sejtet életképtelenné tesz. The term "cell death" to induce antibody is an antibody that is a viable cell to become nonviable. A szóban forgósejt általában olyan sejt, amely az antitest által megköt-hető antigént termel (előnyösen túltermeli azt). It said cell generally is a cell that produces the antibody binds with an antigen-(preferably overexpresses it). A szóbanforgó sejt előnyösen ráksejt, pl. Said cell is preferably a cancer cell, e. emlőrák, petefészekrák,gyomorrák, endometriumrák, nyálmirigyrák, tüdőrák, veserák,vastagbélrák, pajzsmirigyrák, hasnyálmirigyrák, prosztata-rák vagy húgyhólyagrák sejt. breast cancer, ovarian cancer, stomach cancer, endometrial cancer, salivary gland cancer, lung cancer, kidney cancer, colon cancer, thyroid cancer, pancreatic cancer, prostate cancer or bladder cancer cell. In vitro a sejt SKBR3, BT474,Calu3, MDA-MB-453, MDA-MB-361 vagy SKOV3-sejt lehet. In vitro, the cell SKBR3, BT474, Calu 3, MDA-MB-453, MDA-MB-361 or SKOV3 cell can. In - 80 - vitro a sejthalál - az antitest-dependens sejtközvetítettecitotoxicitás (ADCC) és a komplement-dependens cito-toxicitás (CDC) által indukált sejthalál megkülönböztetéseérdekében - komplement és immun-effektor sejtek hiányábanhatározható meg. In - 80 - vitro cell death - induced by antibody-dependent sejtközvetítettecitotoxicitás (ADCC) and complement dependent cytotoxicity (CDC) cell death megkülönböztetéseérdekében - complement and immune effector cells in the absence determinable. Ilyenformán, a sejthalál kimutatási teszt-je hővel inaktivált szérum alkalmazásával (vagyis komple-ment hiányában) és immun-effektor sejtek hiányában hajthatóvégre. Thus, the cell death detection assay je using heat inactivated serum (i.e. in the absence of complementation saved) and the absence of immune effector cells can be performed. Annak megállapítása céljából, hogy a molekula képes-e sejthalált indukálni, a sejtmembrán épségénekpropidium-jodid (Pl), trypan-kék [ld. In order to determine whether the antibody is able to induce cell death, cell membrane épségénekpropidium iodide (PI), trypan blue [see. Moore és mtsai.:Cytotechnology 17, 1 (1995)] vagy 7AAD felvétele alapján meghatározott - károsodása a kezeletlen sejtekéhez viszo-nyítva értékelhető. defined by Moore and mtsai.:Cytotechnology 17, 1 (1995)] or 7AAD uptake - Damage to open relative to untreated cells assessed.

Az "apoptózist indukáló" antitest olyan antitest,amely programozott sejthalált indukál, amely standardapoptózis-tesztekkel - pl. The term "apoptosis-inducing" antibody is an antibody which induce programmed cell death, which standardapoptózis-assays - eg. annexin-V megkötése, DNSfragmentáció, sejtzsugorodás, endoplazmatikus retikulum tá-gulása, sejt-feldarabolódás és/vagy membránvezikulák (ún.apoptózisos testek) képződése alapján - határozható meg. binding of annexin V, DNSfragmentáció, cell shrinkage, endoplasmic reticulum-MS Gulas or by membrane vesicles (ún.apoptózisos antibody) formation of cell fragmentation, and / - can be determined. Aszóban forgó sejt előnyösen ráksejt, pl. cell rotational aces preferably a cancer cell, e. emlőrák, petefé-szekrák, gyomorrák, entíometriumrák, nyálmirigyrák, tüdőrák, veserák, vastagbélrák, pajzsmirigyrák, hasnyálmirigyrák,prosztatarák vagy húgyhólyagrák-sejt. breast cancer, ovarian cancer, stomach cancer, entíometriumrák, salivary gland cancer, lung cancer, kidney cancer, colon cancer, thyroid cancer, pancreatic cancer, prostate cancer or bladder cancer cell. In vitro a sejt SK-BR-3, BT474, Calu3, MDA-MB-453, MDA-MB-361 vagy SKOV3 sejtlehet. In vitro, the cells SK-BR-3, BT474, Calu 3, MDA-MB-453, MDA-MB-361 or SKOV3 cell. Az apoptózissal kapcsolatos celluláris események ér-tékelésére különféle eljárások állnak rendelkezésre. Various methods are available cellular events associated with apoptosis vascular tékelésére. Példá-ul, annexin-kötés alapján foszfatidil-szerin (PS) transzlo-káció mérhető; Example-l, phosphatidyl serine (PS) translocation replication measured by annexin binding; DNS-létrézás alapján a DNS-fragmentáció ér- ··*· ·»· - 81 - « · • « ·*· ·*>·· ·• ··« tékelhető (ld. a kísérleti példákban); Based on DNA létrézás DNA fragmentation vascular ·· * · »· - 81 -« · • «* · · · *> • ·· · ··" tékelhető (see experimental examples.); és hipodiploid sej-tek számának növekedése alapján DNS-fragmentációval együt-tes sejtmag/kromatin kondenzáció analizálható. DNA fragmentation and eat-free nuclear / chromatin condensation analyzed by any increase in hypodiploid cells-tek. Azapoptózist indukáló antitest előnyösen olyan antitest,amely az antitest által megköthető antigént termelő sejtekalkalmazásával végzett annexin-kötési tesztben - a kezelet-len sejtekhez viszonyítva - kb. Azapoptózist inducing antibody is preferably an antibody which is bindable with the antibody antigen-producing cells, the application of annexin binding assay - as compared to untreated cells - approx. 2-50-szeres, előnyösen kb. From 2 to 50 times, preferably approx. 5-50-szeres, legelőnyösebben kb. From 5 to 50 times, preferably approx. 10-50-szeres annexin-indukciót eredményez. 10 to 50-fold induction of annexin result.

Az apoptózist indukáló antitestek példái közé tartoz-nak a következők: HER2 elleni 7F3- és 7C2-antitest (ATCC The antibodies which induce apoptosis include, but does include: HER2 7F3- and 7C2 (ATCC

HB-12216, illetve ATCC HB-12215), ideértve ezek humanizáltés/vagy affinitás-fejlesztett változatait; HB-12216 and ATCC HB-12215) including humanizáltés / or affinity-matured variants; a DR5 elleni3F11.39.7-antitest (ATCC HB-12456), 3H3.14.5-antitest (ATCC E3-12534), 3D5.1.10-antitest (ATCC HB-12536) és 3H3.14.5- antitesz (ATCC HB-12534), ideértve ezek humanizált és/vagyaffinitás-fejlesztett változatait; elleni3F11.39.7 DR5 antibody (ATCC HB-12456), antibodies 3H3.14.5 (ATCC E3-12534) antibody 3D5.1.10 (ATCC HB 12536) and antibodies made 3H3.14.5- (ATCC HB-12534); including humanized and / vagyaffinitás-enhanced versions; a DR5-receptor ellenihumán 16E2- és 20E6-antitest, ideértve ezek humanizáltés/vagy affinitás-fejlesztett változatait is (ld. WO98/51793 számú nemzetközi közzétételi irat, melyet teljesterjedelmében a kitanítás részének tekintünk); DR5 receptor ellenihumán 16E2- and 20E6 antibodies, including their humanizáltés / or affinity-matured variants (see WO98 / 51793 publication No. WO document, incorporated by reference herein teljesterjedelmében.); a DR4 elleni 4E7.24.3-antitest (ATCC HB-12454), és 4H6.17.8-antitest (ATCC HB-12455), 1H5.25.9-antitest (ATCC HB-12695), 4G7.18.8-antitest (ATCC PTA-99) és 5G11.17.1-antitest (ATCCHS-12694), ideértve ezek humanizál és/vagy affinitás-fejlesztett változatait is. the anti-DR4 4E7.24.3 antibody (ATCC HB-12454), and 4H6.17.8 antibody (ATCC HB-12455), antibodies 1H5.25.9 (ATCC HB-12695), 4G7.18.8 antibody (ATCC PTA-99 ) and 5G11.17.1 antibody (ATCCHS-12694) including humanized and / or affinity-matured variants.

Egy kérdéses antitest által megkötött antigénen lévőepitópot megkötő antitestek szkrínelése céljából rutinszerű • ··*· ** , « · ♦ · * ' Λ. routine for the purpose of antigen bound by an antibody for binding antibodies lévőepitópot Screening • ·· * · ** «· ♦ · * 'Λ. ' « V ··» ·*» * ···· .ζ .!>>♦ · - 82 - kereszt-blokkolási tesztet végezhetünk [ld. '' V ·· »· *» * · ···· .ζ >> ♦ -.! 82 - you may cross-blocking assay [see. pl.:"Antibodies, A Laboratory Manual", Cold Spring HarborLaboratory, Ed Harlow és Dávid Lane (1988)]. pl.:"Antibodies, A Laboratory Manual ", Cold Spring HarborLaboratory, Ed Harlow and David Lane (1988)].

Az "agonista antitest" kifejezésen olyan antitestetértünk, amely egy receptorhoz kötődik és aktiválja azt. The term "agonist antibody" is meant an antibody which binds to a receptor and activates it. Azagonista antitest receptor-aktiválási képessége általábanlegalább kvalitative hasonló (és lényegében kvantitativehasonló) a receptor egy natív agonista-ligandumának aktivá-lási képességéhez. Azagonista antibody receptor activation ability is generally at least qualitatively similar (and essentially kvantitativehasonló) receptor is a native agonist ligand of activation ability. Az agonista antitestek egyik példájakéntemlíthető az olyan antitest, amely kötődik a TNF-receptorfőcsaládba tartozó receptorhoz, és e TNF-receptort termelő Agonist antibodies may be mentioned as an example of an antibody that binds to a receptor in the TNF receptor superfamily, and producing this TNF receptor

sejtek apoptózisát indukálja. It induces apoptosis of cells. Az apoptózis indukálásánakmeghatározására alkalmas teszteket a WO 98/51793 és WO 99/37684 számú nemzetközi közzétételi iratban tárták fel (melyeket teljes terjedelmükben a kitanítás részének tekin-tünk) . Suitable apoptosis indukálásánakmeghatározására tests revealed in WO 98/51793 and WO 99/37684 international patent publication (which are in their entirety incorporated herein by reference, having shown). A "rendellenesség" kifejezés olyan állapotot jelent,amelyre a találmány szerinti antitestnél végzett kezelésjótékony hatású. The term "disorder" is any condition that would impact kezelésjótékony with the antibody of the invention. Az ilyen rendellenességek közé krónikus ésakut rendellenességek vagy betegségek tartoznak, ideértveazon kóros állapotokat is, amelyek az emlőst hajlamossá te-szik a szóban forgó rendellenesség kialakulására. Such disorders include chronic ésakut include disorders or diseases, including checks pathological conditions which predispose the mammal to the disorder in te-based question. A talál-mány szerinti megoldás értelmében kezelhető rendellenessé-gek példái közé tartoznak, többek között, a következők: jó-indulatú és malignéns tumorok; abnormal use acid units include, but according to the embodiment of the detection ranges are, inter alia, as follows: good-natured and malignéns tumors; leukózisok és malignánslymphoid betegségek; leukemias and malignánslymphoid diseases; valamint egyéb rendellenességek, mintpl. and other disorders, mintpl. idegsejt-, gliasejt-, asztrocita-, hipotalamusz-, mi-rigy-, makrofág-, epithelsejt-, stroma-, blasztocöl-, gyűl- 83 ladásos, angiogén és immunológiai rendellenességek A "terápiás szempontból hatásos mennyiség" kifejezésenegy hatóanyag azon mennyiségét értjük, amely hatásos egyadott betegség vagy rendellenesség emlősben történő kezelé-sére. refers neuronal, glial, astrocytal, hypothalamic, rigy- mL, macrophagal, epithelial, stromal, blastocoelic 83 ladásos-inflammatory, angiogenic and immunologic disorders of the amount of "therapeutically effective amount" four active , treatment of a mammal which THEM-effective in a particular disease or disorder. Rákos betegség esetén a hatóanyag terápiás szempont-ból hatásos mennyisége: csökkenti a rákos sejtek számát;csökkentheti a tumor méretét; In case of cancer a therapeutically effective amount of active ingredient from consideration: reduce the number of cancer cells; reduce the tumor size; gátolja (azaz bizonyos mér-tékben lassítja, előnyösen blokkolja) a rákos sejt perifé-riás szervekbe történő infiltrációját; inhibition (i.e., slowing to some meter-your mind and preferably stop) cancer cell infiltration into organs perifé spectrometry; gátolja (azaz bizo-nyos mértékben lassítja, előnyösen blokkolja) a tumormetasztázisát; inhibit (i.e., slow commission-some extent and preferably stop) tumor metastasis; gátolja (bizonyos mértékben) a tumor növeke-dését; inhibit (to some extent) of the tumor growth-Deseő; és/vagy bizonyos mértékben enyhíti a rákkal össze-függő egy vagy több tünetet. and / or relieve to some extent dependent cancer with one or more symptoms. A hatóanyagnak a létező rák-sejtek szaporodásának gátlására és/vagy pusztítására kifej-tett hatásénak mértéke citosztatikus és/vagy citotoxikuslehet. The rate of active agent causes release-expressed in the growth of existing cancer cells, inhibiting and / or killing of cytostatic and / or citotoxikuslehet. Rákterápia esetében a hatékonyság, például, a beteg-ség progressziós idejének (TTP) mérésével és/vagy a reakcióráta (RR) mérésével határozható meg. For cancer therapy, efficacy can, for example, can be determined by measurement and / or the response rate (RR) of the patient-ness time progression (TTP). A "kezelés" kifejezésen terápiás célú, illetve megelő-zési célú (profilaktikus) kezelést értünk. We are meant therapeutic or prophylaxis life for (prophylactic) treatment The term "treatment". A kezelésre szo-ruló páciensek közé tartoznak azok, akikben már kialakult arendellenesség, valamint azok, akikben a rendellenesség ki-alakulásának megelőzésére van szükség. The treatment Sat-Rulon patients include those already formed in whom arendellenesség and those in whom the disorder is to prevent the onset is required. A "rák" és "rákos" kifejezések emlősök olyan fizioló-giai állapotára vonatkoznak, amely szabályozatlan sejtsza-porodéssal jellemezhetők. The terms "cancer" and "cancerous" refer to mammals such Fiziol Giai-state, is typically characterized by unregulated sejtsza-porodéssal. A rákok példái közé tartoznak,többek között, a carcinomák, limfomák, blastomák, sarcomák,leukémiák, valamint a leukózisok és a limfoid malignáns be- • ·· · - 84 - tegségek. The cancers include, among others, cancers, lymphoma, blastoma, sarcomas, leukemias, as well as leukemias and lymphoid malignancies input • · ·· - 84 - diseases. A rákok konkrét példái közé tartozik a pikkely-sejtes rák, kissejtes tüdőrák, nem kissejtes tüdőrák, tüdő-adenokarcinoma, a tüdő pikkelyes karcinomája, hashártyarák,máj sejt-rák, gyomor-bélrendszeri rák, hasnyálmirigy-rák,glioblastoma, méhnyakrák, méhrák, máj rák, hólyagrák,hepatoma, emlőrák, vastagbélrák, vastag- és végbélrák,méhbelhám- vagy méhrák, nyálmirigy-karcinoma, veserák, máj-rák, prosztatarák, szeméremtest-rák, pajzsmirigyrák,májkarcinoma és különböző típusú fej- és nyakrákok. particular examples of such cancers include squamous cell cancer, small-cell lung cancer, non-small cell lung cancer, lung adenocarcinoma, lung squamous carcinoma, cancer of the peritoneum, liver cell cancer, gastrointestinal cancer, pancreatic cancer, glioblastoma, cervical cancer, uterine cancer, May cancer, bladder cancer, hepatoma, breast cancer, colon cancer, colorectal cancer, méhbelhám- or endometrial cancer, salivary gland carcinoma, kidney cancer, liver cancer, prostate cancer, vulval cancer, thyroid cancer, hepatic carcinoma and various types of head and neck cancer.

Ahogy a leírásban használjuk, az "autoimmun betegség"kifejezésen olyan, nem malignáns betegséget vagy rendelle-nességen értünk, amely a páciens saját szövetei ellen irá-nyul. As used herein, a non-malignant disease or abnormality irregularity "autoimmune disease" refers to that against the patient's own tissues is directed rabbit. Az autoimmun betegségek vagy rendellenességek példáiközé tartoznak, többek között, a következők: gyulladásosreakciók, pl. Autoimmune diseases or disorder include, inter alia, the following: gyulladásosreakciók, e. gyulladásos bőrbetegségek, ideértve apsoriasist és a dermatitist (pl. atopiás dermatitis);szisztémás scleroderma és sclerosis; inflammatory skin diseases including of psoriasis and dermatitis (e.g. atopic dermatitis.), systemic scleroderma and sclerosis; gyulladásos bélbeteg-séggel Összefüggő reakciók (pl. Crohn-kór és fekélyes vas-tagbélgyulladás); Connected with inflammatory bowel disease (such as Crohn's disease and ulcerative colitis iron member.); légzési fájdalom tünetegyüttes (pl.felnőtzkori légzési fájdalom szindróma, ARDS); respiratory distress syndrome (pl.felnőtzkori respiratory distress syndrome, ARDS); dermatitis;meningizis; dermatitis; meningizis; encephalitis; encephalitis; uveitis; uveitis; colitis; colitis; glomerulo-nephritis; glomerulonephritis; allergiás állapotok, pl. allergic conditions, e. ekcéma és asthma, vala-mint egyéb, T-sejtek infiltrációjával és krónikus gyulladá-sos reakciókkal jellemezhető állapotok; eczema and asthma, all as-other, and chronic infiltration of an inflammatory condition characterized by reactions with T cells; atherosclerosis; atherosclerosis; leukociza adhézió deficiencia; leukociza adhesion deficiency; rheumatoid arthritis; rheumatoid arthritis; szisz-témás iupus erythemazosus (SLE); systemic lupus-Temasek erythemazosus (SLE); diabetes mellitus (pl. I.típusú diabetes mellitus vagy inzulinfüggő diabetesmellitus); diabetes (e.g. type I diabetes mellitus or insulin-dependent diabetesmellitus.); sclerosis multiplex; multiple sclerosis; Reynaud-szindróma; Reynaud's syndrome; multiplex; multiplex; • · • · · • · ··· • · · · * 85 autoimmun thyroiditis; • · • · • · · · · · · · · * • 85 autoimmune thyroiditis; allergiás encephalomyelitis;Sjorgen-szindróma; allergic encephalomyelitis; Sjogren's syndrome; fiatalkori diabetes; juvenile diabetes; akut és késlelte-tett - citokinek és T-limfociták által közvetített - hiper-szenzitivitással összefüggő immunreakciók, jellemzőentuberculosis, sarcoidosis, polymyositis, granulomatosis ésvasculitis esetében; For related hypersensitivity immune responses jellemzőentuberculosis, sarcoidosis, polymyositis, granulomatosis ésvasculitis acute and delayed-action - - mediated by cytokines and T-lymphocytes; vészes vérszegénység (Addison-kór) ;leukocita diapedesis-szel járó betegségek; pernicious anemia (Addison's disease), diseases involving leukocyte diapedesis; központi ideg-rendszert érintő gyulladásos rendellenesség; inflammatory disorder affecting the central nervous system; több szervetérintő sérülés szindróma; involving multiple organ injury syndrome; hemolitikus anaemia (ideértve,többek között, a cryoglobinaemiát vagy Coombs-pozitívanaemiát); hemolytic anemia (including, inter alia, the cryoglobinemia or Coombs pozitívanaemiát); myasthenia gravis; myasthenia gravis; antigén-antitest komplex köz-vetítette betegségek; antigen-antibody complex square-foreshadowed diseases; anti-glomerularis alapmembrán beteg-ség; anti-glomerular basement membrane disease-ness; anti-foszfolipid szindróma; antiphospholipid syndrome; allergiás neuritis;Graves-kór; allergic neuritis; Graves' disease; Lambert-Eaton myastheniás szindróma; Lambert-Eaton myasthenic syndrome; pemphigoidbullous; pemphigoidbullous; pemphigus; pemphigus; autoimmun poliendocrinopathiák; autoimmune polyendocrinopathies; Reuter-kor; Reuter pm; stiff-man szindróma; stiff-man syndrome; Behcet-kór; Behcet's disease; óriássejtesarteritis; óriássejtesarteritis; immunkomplex nephritis; immune complex nephritis; IgA nephropathia; IgA nephropathy; IgMpolineuropathiák; IgMpolineuropathiák; immun trombocytopeniás purpura (ITP) vagyautoimmun trombocytopenia, stb. immune thrombocytopenic purpura (ITP) or autoimmune thrombocytopenia etc..

Az "idegen antigén" kifejezésen olyan molekulá(ka)tértünk, amely a vele (velük) találkozó emlős számára nemendogén vagy natív. The "foreign antigen" is a molecule (s) we got a non-endogenous or native to the meeting with him (them) mammal. Az idegen antigén az emlősben immunre-akciót (pl. humorális és/vagy T-sejt-közvetítette) reakciótválthat ki. The foreign antigen immuno-action (e. Humoral and / or T-cell mediated) response may induce in the mammal. Az idegen antigén rendszerint ellene irányulóantitestek termelődését váltja ki. The foreign antigen usually induces against irányulóantitestek production. A találmány szerintimegoldás szempontjából jelentőséggel bíró idegen antigénekközé tartoznak az immunogén terápiás hatóanyagok, pl. szerintimegoldás the invention in terms of relevance of foreign antigens include immunogenic therapeutic agents, e. pro-teinek, mint pl. pro-tein, for example. az antitestek, különösen a nem humán ami- • ·· · ·» ·* ·· • · · · · ....... • · · • · · ·· · · · - 86 - nosavakat tartalmazó antitestek, például, rágcsálóeredetű,kimérikus/humanizált és primatizált {"főemlősített") anti-testek; antibodies, especially in non-human amino • ·· · »· ·· • * · · · · · · ....... • • · · · · · ·· - 86 - nosavakat containing antibodies, e.g. rodent, chimeric / humanized, and primatized { "all primate") anti-antibody; toxinok (adott esetben célbajuttató molekulához,pl. antitesthez konjugálva, mely célbajuttató molekula magais immunogén hatású lehet); toxins (optionally a targeting molecule such as an antibody conjugated to a targeting molecule which itself may be immunogenic.); génterápiás vírusvektorok, pl.retrovírusok és adenovírusok; gene therapy viral vectors, adenoviruses and pl.retrovírusok; transzplantált idegen szöve-tek; transplanted foreign tissue-tek; fertőző anyagok (pl. baktériumok és vírusok);alloantigének (vagyis olyan antigének, amelyek egy adottfaj néhány egyedében megtalálhatók, a többiből azonban hiá-nyoznak) , pl. infectious agents (such as bacteria and viruses.); alloantigens (i.e., antigens which are found in a few individuals adottfaj of all others but nyoznak HIA), for example. vércsoport-antigének, humán limfocita antigé-nek (HLA), trombocita-antigének, transzplantált szervekentermelődő antigének, vérkomponensek, terhességi (Rh) ésvéralvadási faktorok (pl. VIII. és IX. faktor). blood group antigens, human lymphocyte antigens (HLA), platelet antigens, antigens produced transplanted organs, blood components, pregnancy (Rh) ésvéralvadási factors (e. VIII. and IX. factor).

Az idegen antigénre irányuló "immunreakció blokkolása"kifejezésen az idegen antigén hatására bekövetkező legalábbegy immunológiai reakció enyhítését vagy gátlását értjük.Például, egy idegen antigén elleni humorális reakció az an-tigén elleni antitestek termelődésének gátlásával vagy mér-séklésével fojtharó el. Generally, the foreign antigen "blocking an immune response" refers to alleviation of at least one immunological reaction in response to foreign antigen or inhibition fojtharó értjük.Például away, against a foreign antigen humoral antibody response against the antigen blocking the production or measuring-séklésével. Más módon, vagy ezen túlmenően,szuppresszálhatjuk az idiotípust; Alternatively, or additionally, suppressed by the idiotype; felszabadíthatjuk azalloantizeszzel bevont sejteket; liberated coated azalloantizeszzel cells; és/vagy az antigén-prezentáló sejtek számának csökkentésével befolyásolhatjukaz alloantigén-prezentációt. and / or by reducing the number of antigen-presenting cells befolyásolhatjukaz alloantigen presentation.

Ahogy a leírásban használjuk, a "craft" kifejezés egydonorból származó, recipiensbe történő átültetésre alkalmastranszplantátumot jelent. As used herein, the term "craft" is transposed from alkalmastranszplantátumot egydonorból, into a recipient. A gráftok igen különböző anyagoklehetnek, melyek példái a következők: izolált sejtek (pl.szigetsejtek}; szövetek, pl. újszülözt-eredetű amnion- • ·« · - 87 - membrán, csontvelő, vérképzési prekurzor-sejtek és ocularisszövet, pl. szaruhártya-szövet; szervek, pl. bőr, szív,máj, lép, hasnyálmirigy, pajzsmirigy-lebeny, tüdő, vese,csőszerű szervek (pl. vékonybél, vérerek, nyelőcső), stb. Acsőszerű szervek a nyelőcső, vérerek vagy epevezeték káro-sodott szakaszainak helyettesítésére alkalmazhatók. A bőr-graftok nemcsak égési sérülések esetében, de sérült bél kö-tözésére vagy bizonyos defektusok (pl. rekeszsérv) lezárá-sára is alkalmazhatók. A graft bármilyen emlős forrásbólszármazhat (ideértve az embert is), akár élő, akár halottdonorokból. A graft előnyösen csontvelő vagy szerv (pl.szív), és a donor és a recipiens (gazda) HLA II. osztályúantigénekre egyeztetve van. The graft anyagoklehetnek wide variety of which are exemplified as follows: The isolated cells (pl.szigetsejtek}; tissue such as the amniotic-derived újszülözt • · «· - 87 - membranes, bone marrow, hematopoietic precursor cells, and ocularisszövet such as cornea.. fabric;. bodies such as skin, heart, liver, spleen, pancreas, thyroid lobe, lung, kidney, tubular organs (eg, small intestine, blood vessels, the esophagus.), etc. Acsőszerű bodies of esophagus, blood vessels, or bile duct damage has Interbank phases. useful substitute. the skin grafts not only for burns, but damaged intestine useful co-tözésére or certain defects (eg. diaphragmatic) LEZA-mud. the graft of any mammalian forrásbólszármazhat (including humans), either alive or dead donors. the graft is preferably bone marrow or organ (pl.szív), and the donor and the recipient (host) osztályúantigénekre HLA class II..

Ahogy a leírásban használjuk, az "emlős gazda" tetsző-leges kompatibilis transzplantátum-recipienst jelent. As used herein, "mammalian host" refers to any compatible transplant recipient-negative. A"kompatibilis" azt jelenni, hogy az emlős gazda alkalmas adonorról származó graft elfogadására. The term "compatible", appear to graft from a suitable mammalian host adonorról adoption. A gazda előnyösen em-ber. The host is preferably em ber. Ha mind a donor, mind a gazda ember, ahiszrckomparibilitás javírása céljából előnyösen mindkettenegyeztetve vannak HLA II. If both the donor and the host is human ahiszrckomparibilitás purpose javírása preferably both are in agreement with HLA class II. osztályú antigénekre. Class antigens.

Ahogy itt használjuk, a "donor" kifejezésen olyan -élő vagy halott - emlőst értünk, amelyből a graft szárma-zik. As used herein the term "donor" refers to a -Live or dead - we mammal from which the graft is derived from. A humán donorok előnyösen önkéntes - a recipiensselvér szerinti rokonságban álló - donorok, akikre normálisfizikai vizsgálati eredmények jellemzők, és azonos ABO vér-csoportba tartoznak, mivel a fő vércsoportok be nem tartásaáltalában veszélyezteti az allograft életben maradását.Mindazonáltal, például, egy 0 vércsoportú donor veséjét át- • ·« · • · · 88 ültethetjük egy A, B vagy AB vércsoportú recipiensbe. Human donors are preferably volunteer - unrelated under recipiensselvér - donors who are normal on physical examination and of the same ABO blood group contains, as the major blood group non possibly prejudices allograft life maradását.Mindazonáltal, for example, a group 0 donor kidney • retraining · «· • · · 88 implanted an a, B or AB recipient. A "transzplantátum" kifejezés és szinonimái egy graftgazdába történő beültetésére vonatkoznak, függetlenül at-tól, hogy a transzplantáció szingén (mely esetben a donorés a recipiens genetikailag azonos); And synonyms The term "transplant" to the insertion of a graftgazdába, at independently from the transplantation is syngeneic (where the donorés recipient are genetically identical); allogén (a donor és arecipiens eltérő genetikai eredetű, de ugyanazon fajbólszármazik) vagy xenogén (a donor és a recipiens két külön-böző fajból származik). allogeneic (where the donor and arecipiens of different genetic origins but of the same fajbólszármazik) or xenogeneic (where the donor and recipient are from various species-specific). Ilyenformán, jellemző módon, a gaz-da ember, és graft izograft, vagyis azonos vagy eltérő ge-netikai eredetű emberből származik. Thus, typically, the gas-da man and isograft graft, i.e., the same or different kinetic ge-human origin is derived. Egy másik lehetségesforgatókönyv szerint a graft a recipienstől eltérő fajbólszármazik, pl. In another scenario, the graft potentiality fajbólszármazik not the recipient, e. humán recipiens esetén, filogenetikailagigen elzérő fajokból származó graft, pl. In case of a human recipient, graft from ELZER filogenetikailagigen species, eg. páviánból származószív, sertéseredetű szívbillentyűk, állati béta-szigetsejtek vagy idegsejtek. from baboon heart, porcine heart valve, or animal beta islet cells or neuronal cells. A "transzplantációra váró emlős deszenzitizálása" ki-fejezésen az emlős transzplantátummal szenbeni allergiásérzékenységének vagy reaktivitásának - transzplantációtmegelőző - csökkentését vagy megszüntetését értjük. The term "mammal awaiting transplantation desensitization" off-fejezésen the mammalian transplant sen kind allergic sensitivity or reactivity to - refers to the reduction or elimination - transzplantációtmegelőző. Ez tet-szőleges módon hajtható végre, például, a deszenzitizáltemlősben lévő donoreilenes antitestek mennyiségének csök-kentésével (pl., ha az ilyen anti-donor antitestek humánlimfocita antigén (HLA) ellen irányulnak). This can be accomplished tet szőleges manner, for example, antibodies in the donoreilenes deszenzitizáltemlősben amount of chocolate kentésével (eg. Where such anti-donor antibodies are directed against immortalizing human lymphocytes antigen (HLA)).

Ahogy a leírásban használjuk, a "citotoxikus ható-anyag" kifejezésen olyan anyagot értünk, amely gátolja asejtek működését és/vagy azok elpusztítását eredményezi. As used herein, the term "cytotoxic active substance" refers to a substance that inhibits asejtek function and / or causes destruction result. Acitotoxikus hatóanyagok közé tartoznak a radioaktív izotó-pok {pl. Of cytotoxic agents include radioactive isotopes {eg. Az211, I13i, I125, Y90, Re186, Relss, Sm153, Bi212, P32, ♦ · · • · · • · • ··♦· • «« · ·* • · • ··· ·· » · ♦ • · · · 89 és a Lu radioaktív izotópjai); Az211, I13i, I 125, Y 90, Re 186, Relss, Sm 153, Bi 212, P 32, ♦ · · · • · • · • · • ·· ♦ «« * • · · · · · · ·· • »♦ • · · · 89 and radioactive isotopes of Lu); a kemoterápiás hatóanyagok;valamint a toxinok, pl. chemotherapeutic agents, and toxins, for example. a kis molekulájú toxinok és azenzimatikusan aktív toxinok, melyek bakteriális, gomba-,növényi vagy állati eredetűek lehetnek (ideértve az ilyentoxinok fragmenseit és/vagy változatait). small molecule toxins or azenzimatikusan active toxins of bacterial, fungal, plant or animal origin may be (ilyentoxinok including fragments and / or variants thereof). A "kemoterápiás hatóanyag" kifejezésen rák kezelésérealkalmas vegyületet értünk. A "chemotherapeutic agent" is a compound suitable for treating cancer. A kemoterápiás hatóanyagok pél-dái közé tartoznak a következők: alkilezőszerek, pl.thiotepa és ciklofoszfamid (CYTOXAN™); Chemotherapeutic agents Dai examples include alkylating agents pl.thiotepa and cyclophosphamide (CYTOXAN ™); alkilszulfonátok,pl. alkylsulfonates, for example. buszulfán, improszulfán és piposzulfán; busulfan, and improsulfan piposulfan; aziridinek, pl.benzodopa, carboquon, meturedopa és uredopa; aziridines pl.benzodopa, carboquone, meturedopa and uredopa; etiléniminekés metilamelaminok, pl. etiléniminekés methylamelamines example. altretamin, trietilénmelamin,trietilénfoszforamid, trietilén-tiofoszforamid éstrimetilolomelamin; altretamine, triethylenemelamine, triethylenephosphoramide, triethylene thiophosphoramide éstrimetilolomelamin; acetogeninek (különösen a bullatacin ésbuilatacinon); acetogenins (especially bullatacin ésbuilatacinon); camptothecin (ideértve a topotecan nevűszintetikus analógot); camptothecin (including the synthetic analog topotecan names); bryostatin; bryostatin; callystatin; callystatin; CC-1065(ideértve szintetikus adozelesin-, carzelesin- ésbizelesin-analógját); CC-1065 (including synthetic adozelesin-, carzelesin- ésbizelesin analog); cryptophycinek (különösen acryptophycin-1 és -8); cryptophycin (especially acryptophycin -1 and -8); dolastatin; dolastatin; duocarmycin (ideértveszintetikus analógjait, a KW-2189-ez és CBI-TMI-t);eleutherobin; duocarmycin (ideértveszintetikus analogs, KW-2189 and CBI-TMI it is); eleutherobin; pancranistatin; pancranistatin; sarcodictyin; sarcodictyin; spongistatin;r.izrogén-mustárok, pl. spongistatin; r.izrogén mustards, e. klórambucii, klórnafazin,choiofoszfamid, estramustin, ifoszfamid, mechloretamin,mechloretamin-oxid-hiűroklorid, melphalan, novembichin,phenesferin, prednimusztin, trofoszfaraid, uracil-mustár;nitrosureák, pl. chlorambucil, chlornaphazine, choiofoszfamid, estramustine, ifosfamide, mechlorethamine, mechlorethamine oxide hiűroklorid, melphalan, novembichin, phenesferin, prednimustine, trofoszfaraid, uracil mustard; nitrosureák, e. carmustin, chlorozotocin, fotemustin,lomustin, nimustin, ranimustin; carmustine, chlorozotocin, fotemustine, lomustine, nimustine, ranimustine; antibiotikumok, pl.enediyne-antibiotikumok [pl. antibiotics, antibiotics pl.enediyne [eg. calicheamicin, elsősorban a •·Λ· *· - 90 • · · · ····« « • ··* • · * · ··· · · Λ• * · ·· ·**· ·· esorubicin, rr.iko fenolsav, potfiromicin,streptonigrin, idarubicin, nogaiamicin, puromicin, peplomicin, rodorubicin, ubenimex, calicheamicin-γι1 és calicheamicin-θχ1; calicheamicin, especially Λ • · · * · - · · · ···· 90 • «« • • * ·· * · · · · · · · · * ·· Λ • · · ·· ** esorubicin, rr .iko phenolic, potfiromycin, streptonigrin, idarubicin, nogalamycin, puromycin, peplomycin, rodorubicin, ubenimex, calicheamicin γι1 and calicheamicin θχ1; ld. ld. pl. eg. Agnew: Chem.Inti. Agnew: Chem.Inti. Ed. Engl. Ed. Engl. 33, 183 (1994); 33, 183 (1994); dynemicin-A; dynemicin A; esperamicin; esperamicin; neocarzinostatin kromofór és az ezzel rokon kromoprotein-enediyne antibiotikum kromofórok]; neocarzinostatin chromophore and related chromoprotein enediyne antibiotic chromophores-]; aclacinomysinek,actinomicin, authramicin, azaszerin, bleomicinek, cactinomicin, calicheamicin, carabicin, carminomicin, carzinofilin, ehromomicinek, dactionimicin, daunorubicin, detorubicin, 6-diazo-5-oxo-L-norleucin, doxorubicin (morfolino-doxorubicin, cianomorfolino-doxorubicin, 2-pirrolino-doxorubicin és dezoxidoxorubicin); aclacinomysins, actinomycin, authramycin, azaserine, bleomycins, cactinomicin, calicheamicin, carabicin, carminomicin, carzinofilin, ehromomicinek, dactionimicin, daunorubicin, detorubicin, 6-diazo-5-oxo-L-norleucine, doxorubicin (morpholino-doxorubicin, cianomorfolino-doxorubicin, 2-pyrrolino-doxorubicin and dezoxidoxorubicin); epirubicin,marcellomicin, mitomicinek, olivomicinek, quelamicin, streptozocin, tubercidin, zinostatin, zorubicin; epirubicin, marcellomycin, mitomycins, olivomycins, quelamicin, streptozocin, tubercidin, zinostatin, zorubicin; anti-metabolitok, pl. anti-metabolites such as. methotrexát és 5-fluoruracil (5-FU); methotrexate and 5-fluorouracil (5-FU); fólsav-analógok, pl. folic acid analogues such. denopterin,methotrexát, pteropterin, trimetrexát; denopterin, methotrexate, pteropterin, trimetrexate; purin-analógok, pl.fludarabin, 6-merkaptopurin, tiamiprin, tioguanin;pirimidin-analógek, pl. purine analogs pl.fludarabin, 6-mercaptopurine, thiamiprine, thioguanine; pyrimidine analogs such. ancitabin, azacitidin, 6-azauridin,earmofur, cytarabir., didezoxiuridin, doxifluridin,erocitabin, floxuridin, 5-FU; ancitabine, azacitidine, 6-azauridine, earmofur, cytarabir, dideoxyuridine, doxifluridine, erocitabin, floxuridine, 5-FU.; androgének, pl. androgens such. calusteron,dromostanolon-propicnát, epitiostanol, mepitiostán, eestolakton; calusterone, dromostanolone propicnát, epitiostanol, mepitiostane, eestolakton; mellékvese-hormon elleni hatóanyagok, pl.aminoglutatimid, mitotan, trilostan; active anti-adrenals, pl.aminoglutatimid, mitotane, trilostane; fólsav-kiegészítók,pl. folic acid supplements, for example. frolinsav; frolinic acid; aceglaton; aceglatone; aldofoszfamid-glikozid; aldophosphamide glycoside; -minőiével insav; -minőiével acid; amsacrin; amsacrine; bestrabucil; bestrabucil; bisantren; bisantrene; edatraxát; edatraxate; defofamin; defofamine; demecolcin; demecolcine; diaziquon; diaziquone; elfornitin;elliptinum-acetát; elfornithine; elliptinium acetate; etoglucid; etoglucid; gallium-nitrát; gallium nitrate; hidroxi- - 91 - 2 ς ♦ ♦ - * · • . hydroxy - 91-2 ς ♦ ♦ - * • ·. ;·· «<· . ; ·· "<·. ««·· · · · . «« ·· · · ·. ·♦ ·«· · <i ·*-.* · '» karbamid; ♦ · · «· · <i · * - * · '.» Urea; leninan; lentinan; lonidamin; lonidamine; mitoguazon; mitoguazone; mitoxantron;mopidamol; mitoxantrone; mopidamol; nitracrin; nitracrine; pentostatin; pentostatin; phenamet; phenamet; pirarubicin;podofillinsav; pirarubicin; podophyllinic acid; 2-etilhidrazid; 2-ethylhydrazide; prokarbazin; procarbazine; PSK®; PSK®; razoxán;rhizoxin; razoxane; rhizoxin; sizofiran; sizofiran; spirogermánium; spirogermanium; 2,2' , 2''-triklór-trietilamin; 2,2 ', 2' '- trichloro-triethylamine; tenuazonsav; spirogermanium; trichotecének triaziquon; trichothecenes triaziquone; (különösen a Τ-2-toxin, verracurin-A, roridin-A ésanguidin); (Especially Τ-2 toxin, verracurin A, roridin A ésanguidin); uretán; urethane; vindezin; vindesine; dacarbazin; dacarbazine; mannomustin;mitobronitol; mannomustine; mitobronitol; mitolactol; mitolactol; pipobromán; pipobroman; gacitozin; gacytosine; arabinozid(Ara-C); arabinoside (Ara-C); ciklofoszfamid; cyclophosphamide; tiotepa; thiotepa; taxoidok, pl. taxoids, eg. paclitaxel(TAXOL®, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ, USA)és doxataxel (TAXOTERE®, Rhone-Poulenc Rorer, Antony, Fran-ciaország) ; paclitaxel (TAXOL ®, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ, USA) and doxataxel (TAXOTERE®, Rhone-Poulenc Rorer, Antony, Fran ciaország); chlorambucil; chlorambucil; gemcitabin; gemcitabine; 6-tioguanin;markaptopurin; 6-thioguanine; mercaptopurine; merhotrexát; merhotrexát; platina-analógok, pl. platinum analogs such. cisplatinés carboplatin; cisplatinés carboplatin; vinblasztin; vinblastine; platina; platinum; etoposid (VP-16); etoposide (VP-16); izoszfamid; izoszfamid; mitomicin-C; mitomycin C; mitoxantron; mitoxantrone; vincristin; vincristine; vinorelbin; vinorelbine; navelbin; navelbine; novantron; teniposide; teniposid; teniposide; daunomicin;aminopterin; daunorubicin, aminopterin; xeloda; Xeloda; ibandronát; ibandronate; CPT-11; CPT-11; RFS 2000topoizomeráz inhibitor; 2000topoizomeráz inhibitor RFS; difluor-metilornitin (DMFO); difluoromethyl metilornitin (DMFO); reti-nasav; retinoic nasav; esperamicinek; esperamicins; capecitabin; capecitabine; valamint a felsorolt ve-gyületek gyógyászati szempontból elfogadható sói, savai ésszármazékai. and listed compound that pharmaceutically acceptable salts, acids ésszármazékai. A kemoterápiás hatóanyagok közé tartoznak azanti-hormonális hatóanyagok, amelyek a hormonok tumorokrakifejtett hatásét szabályozzák vagy gátolják; Chemotherapeutic agents include azanti-hormonal agents that act to regulate or inhibit the effects of hormones tumorokrakifejtett; ilyenek anti-ösztrogének, pl. such antiestrogens, e. a tamoxifen, raloxifen, aromatéz-gátló 4(5)-imidazolok, 4-hidroxitamoxifen, trioxifén, keoxifén, LY117018, onapriston és toremifén (Fareston); tamoxifen, raloxifene, aromatéz inhibiting 4 (5) -imidazoles, 4-hydroxytamoxifen, trioxifene, keoxifene, LY117018, onapristone, and toremifene (Fareston); ésanti-androgének, pl. ésanti-androgens such. flutamid, nilutamid, bicalutamid,leuprolid és goserelin; flutamide, nilutamide, bicalutamide, leuprolide and goserelin; valamint a felsoroltak gyógyászati * * ·- • * • » ·*· «••*9 * 1* ·*· 92 szempontból elfogadható sói, savai és származékai. and listed pharmaceutical * · * - • * • »* · ·« * 9 * •• * 1 * · 92 · acceptable salts, acids or derivatives thereof. A "citokin" kifejezés egy adott sejtpopuláció által kiválasztott - intercelluláris mediátorként más sejtekreható - proteinek általános elnevezése. a general term for proteins - The term "cytokine" is secreted by one cell population - intercellular mediators in other cells. Az ilyen citokinekjellemző képviselői a limfokinek, monokinek és a szokványospolipeptid hormonok. Such citokinekjellemző representatives of lymphokines, monokines, and szokványospolipeptid hormones. A citokinek közé tartoznak a növekedé-si hormonok, mint pl. The cytokines include increasing the si-hormones, for example. a humán növekedési hormon, a humán növekedési hormon N-metionil-származéka, és a szarvasmarhanövekedési hormon; human growth hormone, N-methionyl human growth hormone derivative, and bovine growth hormone; parathyroid hormon; parathyroid hormone; tiroxin; thyroxine; inzulin;proinzulin; insulin, proinsulin; relaxin; relaxin; prorelaxin; prorelaxin; glikoprotein hormonok, pl.follikulusz-stimuláló hormon (FSH), pajzsmirígy-stimulálóhormon (TSK) és luzeinizéló hormon (LH); glycoprotein hormones pl.follikulusz-stimulating hormone (FSH), thyroid-stimulálóhormon (TSK) and luzeinizéló hormone (LH); májeredetű növeke-dési faktor; hepatic growth factor-Dés; fibroblaszt növekedési faktor; fibroblast growth factor; prolaktin; prolactin; méh-lepény-eredetű laktogén; lactogen uterine placenta-derived; tumornekrózis faktor-α és -β;müllerianosist gátló szubsztancia; tumor necrosis factor-α and -β, mullerian-inhibiting substance; egéreredetű gonado-tropin-asszociált peptid; murine gonado-tropine-associated peptide; inhibin; inhibin; aktivin; activin; vascularisendothelialis növekedési faktor; vascularisendothelialis growth factor; integrin; integrin; trombopoietinf-'FO); trombopoietinf-'FO); idegsejt .növekedési faktorok, pl. .növekedési nerve cell factors, for example. NGF-α; NGF-α; vérlemezke-eredetű növekedési faktor; platelet-derived growth factor; transzformáló növekedési fakto-rok (TGF-ek), pl. transforming growth factors receptors (TGFs) such as. TGF-α és TGF-β; TGF-α and TGF-β; inzulinszerű növekedésifaktor-I és -II; insulin-like growth factor-I and -II; eritropoietin (EPO); erythropoietin (EPO); oszteoinduktív fakto-rok; osteoinductive factoring inhibitors; interferonok, pi. interferons pi. interferon-α, -β és -γ; interferon-α, -β and -γ; kolonizációtstimuláló faktorok (CSF-ek), pl. kolonizációtstimuláló factors (CSFs), e. makrofág-eredetű CSF (M-CSF), granulocita-makrofág-eredetű CSF (GM-CSF), ésgrarulocita-eredeto CSF (G-CSF); macrophage-CSF (M-CSF), granulocyte-macrophage-derived CSF (GM-CSF), ésgrarulocita original-CSF (G-CSF); interleukinek (IL-ek), pl.IL-1, IL-Ια, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-11, IL-12; interleukins (IL's) pl.IL-1, IL-Ια, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL -11, IL-12; továbbá egyéb polipeptid-faktorok, pl. and other polypeptide factors such. LIFés kit-iigandum (KL). Lifes-kit ligand (KL). Ahogy a leírásban használjuk, a • · - 93 - "citokinek" kifejezés jelentése természetes forrásokbólvagy rekombináns sejttenyészetből származó proteinekre(illetve a natív szekvenciájú citokinek biológiai aktivitá-sú ekvivalenseire) egyaránt kiterjed. As used herein, the • · - includes proteins (or the native sequence cytokines Aktivität-release biological equivalents) from "cytokine" refers to natural sources or from recombinant cell culture - 93rd

Ahogy a találmány leírásában használjuk, a "pro-drog"kifejezésen egy gyógyászatilag aktív vegyület prekurzorátvagy származékát értjük, amely a tumorsejtekre az eredetihatóanyagnál (drognál) kevésbé citotoxikus, és enzimati-kusan a nagyobb aktivitású eredeti alakká aktiválható, il-letve alakítható [ld. As used herein, the "pro-drug" means a pharmacologically active compound refers to a derivative prekurzorátvagy which the tumor cells are less of eredetihatóanyagnál (capable of being) cytotoxic and enzymatically activated the more active parent form yl letve formed [see Fig. pl. eg. Wilman: Biochemical SocietyTransactions 14, 375 (1986); Wilman Biochemical SocietyTransactions 14, 375 (1986); és Stella és mtsai.: "Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery",a "Directed Drug Delivery" című kiadvány (szerk.: Borchardt és mtsai., Humana Press) 247-267. and Stella et al .: "Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery", in the publication "Directed Drug Delivery," in (ed Borchardt et al .: Humana Press.) 247-267. oldalain (1985)]. pages (1985)]. A ta-lálmány szerinti prc-drogok közé tartoznak, többek között,a kövezkezők: foszfáttartalmú pro-drogok, tiofoszfát-tartalmű pro-drogok, szulfáttartalmú pro-drogok,peptidtartalmú pro-drogok, D-aminosawal modifikált pro-drogok, glikozilált pro-drogok, β-laktám-tartalmú pro-drogok, adott esetben szubsztituált fenoxi-acetamid-tartalmű pro-drogok, adott esetben szubsztituált fenil-acetamid-tartalmú pro-drogok, 5-fluorcitozin és egyéb 5-fluoruridin pro-drogok, amelyek nagyobb aktivitású, szabadcitotoxikus drogokká alakíthatók. prc drugs according to the ta-with the invention include, inter alia, the kövezkezők: phosphate-containing prodrugs, thiophosphate-containing prodrugs, sulfate-containing prodrugs, peptide-containing prodrugs, modified D-amino acid prodrugs, glycosylated pro drugs, β-lactam-containing prodrugs, optionally substituted phenoxyacetamide-containing prodrugs, optionally substituted phenylacetamide-containing prodrugs, 5-fluorocytosine and other 5-fluorouridine prodrugs substituted, are more active They can be converted into szabadcitotoxikus drug. A találmány szerinti fel-használás céljából pro-drog alakká derivatizálhatócitotoxikus drogok példái közé tartoznak, többek között, afentebb említett kemoterápiás hatóanyagok. Examples of drugs include derivatizálhatócitotoxikus into a prodrug form for-purpose utilization of the invention, inter alia, chemotherapeutic agents afentebb mentioned.

Az "angiogén faktor" kifejezés a vérerek fejlődését • ···· ·· ·· ·· • · ····♦♦• · ··· ··· * ······· * · * • ··· ·· ···· ·· - 94 - stimuláló növekedési faktorra vonatkozik. The term "angiogenic factor" development of blood vessels • ···· ·· ·· ·· · • ···· ··· ··· · ♦♦ • ······· * * * • · ·· · ·· ·· ···· - 94 - refers to stimulating growth factors. A találmány sze-rinti megoldás szempontjából előnyös angiogén faktor avascularis endothelialis növekedési faktor (VEGF). The patent Rint solution in terms of preferred angiogenic factor avascular endothelial growth factor (VEGF).

Ahogy a leírásban használjuk, a "jelölő" kifejezésendetektálható vegyületet vagy készítményt értünk, amely köz-vetve vagy közvetlenül a polipeptidhez kapcsolható. As used herein, "label" refers kifejezésendetektálható compound or composition that is an intermediate comparison or indirectly to the polypeptide. A jelö-lő lehet önmaga detektálható (pl. radioaktív izotópok vagyfluoreszcens jelölők), illetve - enzimatikus jelölők eseté-ben - szubsztrát (vegyület vagy készítmény) detektálhatókémiai megváltozását katalizálhatja. The marking can shoot itself be detectable (e.g. radioisotope labels vagyfluoreszcens.), Or - a change detektálhatókémiai catalyze substrate (compound or composition) - an enzymatic label, in cases.

Az "izolált" nukleinsav-molekula olyan nukleinsav-molekula, amely azonosítva van és - a polipeptid-nukleinsavtermészetes forráséban rendszerint vele együtt jelenlévő -legalább egy szennyező nukleinsav-molekulától el van vá-lasztva. An "isolated" nucleic acid molecule is a nucleic acid molecule that is identified and - the polypeptide nukleinsavtermészetes forráséban usually present along with -legalább is vacuum lated one contaminant nucleic acid molecule. Az izolált nukleinsav-molekula a természetben ta-lálható alakjától eltérő; The isolated nucleic acid molecule is other than t-lálható shape in nature; ennek megfelelően, megkülönböz-tethető a természetes sejtekben létező nukleinsav-molekulától. accordingly, distinctive-cells can distinguish the existing natural nucleic acid molecule. Mindazonáltal, az izolált nukleinsav kifejezésjelentése magában foglalja a polipeptidet általában termelősejtekben lévő nukleinsav-molekulát is, amely, például, atermészetes sejtekben megfigyelhetőtől eltérő helyen talál-ható . However, the isolated nucleic acid refers to a nucleic acid molecule includes polypeptide in cells that normally prepared, for example, atermészetes cells different from that location, can be found. A "szabályozószekvencia" kifejezésen olyan DNS-szekvenciát értünk, amely a hozzá működőképesen kapcsoltkódolószekvencia adott gazdaszervezetben történőexpresszáItatásához szükséges. The term "regulatory sequence" is a DNA sequence which is optionally linked coding sequence in a host operably történőexpresszáItatásához necessary. A prokarióta gazdasejtekszámiéra megfelelő szabályozószekvencia, például, apromóter, adott eserben az operátor-szekvencia, valamint a - 95 - riboszóma-kötőhely. gazdasejtekszámiéra appropriate prokaryotic regulatory sequences, e.g., apromóter, Eser optionally an operator sequence, and - 95 - ribosome-binding site. Eukarióta sejtekről ismeretes, hogypromótereket, poliadenilációs szignálokat és erősítőszek-venciákat alkalmaznak. Eukaryotic cells are known to be promoters, polyadenylation signals, and enhancers acid sequence is used.

Egy nukleinsav akkor van "működőképesen kapcsolva" egy másik nukleinsavhoz, ha a másik nukleinsav-szekvenciával funkcionális kapcsolatban van. Nucleic acid is "operably linked" to another nucleic acid if they have a functional relationship with another nucleic acid sequence. Például, egy pre-szekvenciavagy szekréciós vezetőszekvencia DNS-e akkor van működőké-pesen egy polipeptidet kódoló DNS-hez kapcsolva, ha olyanpre-proteinként expresszálódik, amely részt vesz apolipeptid szekréciójában. For example, a secretory leader sequence or the pre-sequence DNA can have efficient ones Pesek-linked to the coding DNA for a polypeptide if it is expressed olyanpre-protein that participates in the secretion apolipeptid. Egy promóter vagy egyerősítőszekvencia akkor van működőképesen egy kódoló-szekvenciához kapcsolva, ha hatással van a szekvenciatranszkripciójára. A promoter or enhancer sequence is operably linked to a coding sequence if it affects the szekvenciatranszkripciójára. Egy riboszóma-kötőhely akkor van működő-képesen egy kódolószekvenciához kapcsolva, ha elősegíti atranszlációt. A ribosome binding site is working, then linked to a coding sequence if it helps atranszlációt. A "működőképesen kapcsolt" kifejezés általá-ban azt jelenti, hogy az összekapcsolt ENS-szekvenciák egy-mással összefüggőek, és - szekréciós vezetőszekvencia ese-tében - egymással összefüggőek és azonos leolvasási fázis-ban vannak, ugyanakkor, az erősítőszekvenciák esetében nemkövetelmény, hogy csszeérőek legyenek. The term "operably linked" means generally in that the interconnected ENS sequences are contiguous with each other, and - there are phases in each other are contiguous and in the same reading frame, however, for the amplifier sequence is no requirement that csszeérőek - in the case of a secretory leader sequence be. Az összekapcsolásszokványos restrikciós helyeknél ligálással valósulhat meg.Ha ilyen helyek nem léteznek, az általános gyakorlatnakmegfelelően szintetikus oligonukleotid-adapterek vagy kap-csolószekvenciák alkalmazhatók. The restriction sites összekapcsolásszokványos ligation achieved meg.Ha such sites do not exist, the synthetic oligonucleotide adapters general gyakorlatnakmegfelelően or get csolószekvenciák used. A leírásban a "sejt", "sejtvonal" és "sejttenyészet"kifejezéseket egymás szinonimáiként alkalmazzuk, és vala-mennyi ilyen megjelölés magában foglalja az utódokat.Ilyenformán, a "transzformáns" és "transzformált sejt" ki- • »··· ·· ·· ·· . As used herein, the expressions "cell," "cell line," and "cell culture" are used interchangeably and all such designations include amount-of utódokat.Ilyenformán, the words "transformants" and "transformed cells" off • »··· ·· ·· ··. · ··♦···» · ··· ··♦ · ······· · · · - * • ··· ·« ···· ·· - 96 - fejezések jelentése kiterjed az elsődleges, eredeti sejtreés a belőle származó tenyészetekre (függetlenül az átoltá-sok számától). · ··· ·· ♦ »· ··· ·· ♦ ······· · · · · - · ··· • *« ···· ·· - 96 --expressions include the primary, initial sejtreés cultures derived therefrom (regardless of the number of transfers). Természetesen az utódok DNS-tartalmukban nempontosan egyformák, ami a szándékos vagy véletlenszerű mu-tációk következménye. Of course, not exactly the same offspring in DNA content, due to deliberate or accidental TACI-mu. A funkciójuk és biológiai aktivitásuktekintetében azonos mutáns utódok szintén e kifejezés je-lentéskörébe tartoznak. Same biological function or aktivitásuktekintetében Mutant progeny are also included in this term je lentéskörébe. A következőkben a találmány kiviteli módjait ismertet-jük. In the following, embodiments of the invention disclosed, Juk. A) Többértékű antitestek A találmány értelmében eljárást tárunk fel többértékűantitest előállítására. A) polyvalent antibodies provides a method for preparing multivalent antibody according to the invention. Az "eredeti" vagy "kiindulási" an-titest (amelyből a többértékű antitest variábilisdóménje(i) származik (származnak)) előállítására alkalmaskülönféle technikáit a későbbiekben ismertetjük. The "original" or "parent" antibody (from which the multivalent antibody is derived variábilisdóménje (i) (derived)) for the manufacture of the various techniques described below. A találmány szerinti többértékű antitest legalább há-rom (és előnyösen négy vagy több, pl. négy vagy öt vagyakár kb. nyolc) antigénkötő helyet tartalmaz. The multivalent antibody of the invention comprises at least three-ROM (and preferably four or more, eg. four or five or even approx. eight) antigen binding sites. Általában azantigénkötő hely mindegyike "működőképes" (meghatározásátId. fentebb). Generally azantigénkötő each location "workable" (meghatározásátId. Above). A többértékű antitest a természetben nem for-dul elé, és nem natív szekvenciája IgM vagy IgA antitest. The multivalent antibody in nature are not for-dul front and not a native sequence IgM or IgA antibody. Atalálmány szerinti többértékű antitest előnyösen nem anti-test-pár in vitro kémiai keresztkötésével van létrehozva -ellentétben pl-, Ghetie és mtsai. The multivalent antibody is preferably not invention tend antibody pair is created in -ellentétben vitro chemical cross-linking of PL, Ghetie et al. [Proc. [Proc. Natl. Natl. Acad. Acad. Sci.USA 94, 7509 (1997)] és Wolff és mtsai. Sci.USA 94, 7509 (1997)], and Wolff et al. [Cancer Researach 53, 2560 (1993)3 leírásával. [Researach Cancer 53: 2560 (1993) 3 description. Ezen túlmenően, olyan többér- - 97 - tékű antitesteket tárunk fel, amelyek létrehozásához a ki-indulási antitestben nem szükséges bejuttatott ciszte-in(ek)nek jelen lennie ahhoz, hogy Fc-régiók párja közöttdiszulfid-híd (hidak) kialakításával többértékű antiteste-ket hozzunk létre [ellentétben pl. In addition, a többér- - provides a palette of antibodies that create not required for out-departure antibody introduced cysteine-in (s) to be present in order to provide more value Fc regions pair közöttdiszulfid Bridge (bridges) the development of A antibodies - 97 create two [unlike e. Shopes és mtsai. Shopes et al. (1992) és Cáron és mtsai. (1992) and Caron et al. (1992) leírásával; (1992) describing; ld. ld. fentebb]. above]. A találmány egyik megvalósítási módja szerint a több-értékű antitest egy - legalább két nehéz lánc (vagy könnyűlánc) variábilis domént tartalmazó - első polipeptid-láncból és - legalább két nehéz lánc (vagy könnyű lánc) va-riábilis domént tartalmazó - második polipeptid-láncbóláll. In one embodiment, the multivalent antibody is a - first polypeptide chains and - - comprising a variable domain at least two heavy chain (or light chain) a second polypeptide láncbóláll - having a variable domain at least two heavy chain (or light chain) . Az első polipeptid-lánc előnyösen két nehéz lánc vari-ábilis domént, míg a második polipeptid-lánc szintén kétnehéz lánc variábilis domént tartalmaz, melyek a megfelelőkönnyű lánc variábilis doménekkel (mindkét polipeptid-láncon legalább kettő) kombinálódva négy (vagy több)antigénkötő helyet hoznak létre. The first polypeptide chain preferably two heavy chain variable domain and the second polypeptide chain comprises a variable domain also kétnehéz chains which combine to produce four (or more) antigen-binding site with the appropriate light chain variable domains (at least two on each polypeptide chain) created.

A találmány egyik előnyös megvalósítási módja értelmé-ben a többértékű antitest tartalmaz egy dimerizációsdomént, amely (1) két (vagy több) antigénkötő helyet (2)egy, kettő (vagy több) antigénkötő hellyel kombinál. In a preferred embodiment, the sense in the multivalent antibody is a dimerizációsdomént which (2) combining (1) two (or more) antigen binding sites, one, two (or more) antigen binding sites. A többértékű antitestek különféle dimerizációs doméneket tar-talmazhatnak, melyek közül az Fc-régió és a csukló-régióelőnyös. The variety of multivalent antibodies dimerization domains tar talmazhatnak, from which the Fc region and the hinge region is preferred. Amennyiben a többértékű antitest Fc-régiót (pl.natív szekvenciajú vagy módosított Fc-régiót) tartalmaz, azFc-régió előnyösen "működőképes", ezáltal képes az antitestegy vagy több effektor-funkciójának (pl. ADCC vagy CDC) ki-fejtésére. Where the multivalent antibody Fc region (pl.natív sequence or a modified Fc region), azFc region is preferably "functional", thus capable of the antibody with one or more effector functions (e. ADCC or CDC) out decrypt. A többértékű antitest előnyösen csak egy Fc- The multivalent antibody is preferably a Fc

• · ·····'·· ··· ··· · · · J ··;· ...· ·ί·· ·· - 98 - régiót tartalmaz vagy Fc-régiót egyáltalán nem tartalmaz. • · ····· '·· · · · · · · · · · ·· J; ... · · · ·· ·· ί - contains or does not contain an Fc region Region - 98th

Amennyiben a többértékű antitest Fc-régiót tartalmaz,a három vagy több antigénkötő helyet az Fc-régió N-terminálisán helyezzük el [s nem az Fc-régió C-terminálisán, ahogy az Coloma és Morrison (1997, ld. fen-tebb) leírásában szerepel]. Where the multivalent antibody comprises an Fc region and three or more antigen binding sites placed in the Fc region of the N-terminus [and not the Fc region is the C-terminus, as in Coloma and Morrison (1997, supra. Phen-below appears) specification It included]. Ennek megvalósítása érdekébenVD1-Xl-VD2-X2-Fc képletű első polipeptid-láncot hozunk lét-re, amelyben (1) VD1 jelentése: első nehéz vagy könnyű láncvariábilis dómén (előnyösen nehéz lánc variábilis dómén); Achieving this we first polypeptide chain érdekébenVD1 formula-Xl-X2-VD2-Fc being away, in which (1) VD1 is a first heavy chain variable domain or a light (preferably a heavy chain variable domain); (2) VD2 jelentése: második nehéz vagy könnyű lánc variábi-lis dómén (előnyösen nehéz lánc variábilis dómén); (2) VD2 is: second variable domain heavy or light chain (variable domain is preferably a heavy chain); (3) Fcjelentése: egy Fc-régió egyik lánca; (3) Fcjelentése: one chain of an Fc region; és (4) XI és X2 jelen-tése: adotz esetben közbeékelődő aminosav vagy polipeptid.XI és X2 előnyösen CHl-domént (ahol VD1 vagy VD2 egy nehézlánc variábilis dómén) vagy CL-domént (ahol VD1 vagy VD2egy könnyű lánc variábilis dómén) tartalmaz (vagy abbóláll). and (4) XI and X2 presence of: adotz case intervening amino acid or preferably polipeptid.XI and X2 (where VD1 or VD2 is a heavy chain variable domain) or a CL domain comprises CHl domain (where VD1 or VD2egy variable domain light chain) (or abbóláll). Az XI, adott esetben, flexibilis kapcsolószekvenciátis tartalmaz, amely a VQl-től (vagy, ha jelen van, a CH1-doméntől vagy CL-doméntől) általában C-terminális iránybanhelyezkedik el. The XI, optionally, the flexible linker also contains a generally C-terminal direction positioned in VQl to (or, if present, or the CH1 domain by the CL domain by). A flexibilis kapcsolószekvencia Gly-Ser,Gly-Ser-Glv-Ser (10. azonosítószámú szekvencia), Ala-Servagy Gly-Giy-Gly-Ser (11. azonosítószámú szekvencia) amino-sav-szekvenciájú pépeidét tartalmazhat. The flexible linker can comprise the sequence Gly-Ser, Gly-Ser-Gly-Ser (SEQ ID NO: 10), Ala-Servagy Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID NO: 11) amino acid sequence pépeidét. A találmány szerinti megoldás szempontjából előnyöstöbbértékű antitest három vagy több (pl. négy, öt vagy akárkb. nyolc) Fab-polipeptidet tartalmazhat, melyek mindegyikeképes antigént megkötni. An essential part of the invention, preferred multivalent antibody comprises three or more (eg. four, five or akárkb. eight) Fab polypeptide can contain, which are capable of binding both antigens. A Fab-fragmensek előnyösen az Fc-régió X-zerm.iná 1 isán helyezkednek el (ha a többértékű anti- • « - 99 - test tartalmaz Fc-régiót) . The Fab fragments are preferably positioned at the Fc region, X 1 zerm.iná ISAN (if multivalent anti- • «- 99 - body comprises an Fc region). Például, két egy Fc-régió egyiklánca N-terminálisához vagy több Fd-fragmens fuzionálható.Az igy kialakított polipeptid-lánc kombinálható: (1) egymásik polipeptid-lánccal (amely az Fc-régió másik láncánakN-terminálisához fuzionált két vagy több Fd-fragmensbőláll); For example, two of an Fc region one chain of N-terminus or more Fd fragments fuzionálható.Az thus constituted polypeptide chain may be combined: (1) to another polypeptide chain (fused to another láncánakN-terminus of the Fc region is two or more Fd fragmensbőláll ); és (2) komplementer VL-doménekkel (pl. négy vagy többVL-doménnel, melyek mindegyike, adott esetben, CL-doménhezvan fuzionálva). and (2) complementary VL domains (eg. four or többVL domains, each of which, optionally, fused doménhezvan CL). Az antitest, adott esetben, a két vagytöbb Fd-fragmens között flexibilis kapcsolószekvenciát tar-talmaz. The antibody, optionally, between the two or more Fd fragments flexible linker tar talmaz. A többértékű antitest, például, az képletű (1) VH-CH1-(flexibilis kapcsolószekvencia)-VH-CHl-Fc polipeptid-láncokból álló párt vagy a (2) képletű VH-CHl-VH-CHl-Fcpclipeptid-láncokból (amelyekben a két Fd-fragmens közöttnincs flexibilis kapcsolószekvencia) álló párt tartalmaz. The multivalent antibody, for example, (1) (flexible linker) party formula VH-CH1 -VH-CHl-Fc consisting of the polypeptide chains or VH-CHl-VH-CHl-Fcpclipeptid-chains of formula (2) (in which Fd fragment between two flexible linker contains no) consisting of pairs. A találmány szerinti többértékű antitest három vagytöbb funkcionális antigénkötő helye közül előnyösen mind-egyik nehéz és könnyű lánc variábilis doménből áll. The multivalent antibody of the invention preferably all, one heavy and light chain variable domain consists of three or more functional antigen binding sites. Ilyen-formán, ha két vagy több nehéz lánc variábilis dómén vanegymáshoz fuzionálva (adott esetben közbeékelődő aminosav-val vagy aminosavakkal, ld. fentebb), a nehéz lánc variábi-lis doménekkel két vagy több komplementer könnyű lánc vari-ábilis domént tartalmazó polipeptidet kombinálunk (például,a fúziós protein és a könnyű lánc variábilis domént tartal-mazó polipeptid(ek) ugyanazon gazdasejtben végzett együttesexpresszáltatásával). -Uniformly such that two or more heavy chain variable domain fused to vanegymáshoz (optionally with intervening amino acid or amino acids., Supra), the variable domains of the heavy chain variable domain light chain polypeptide comprising two or more complementary combining ( e.g., együttesexpresszáltatásával variable domain comprise performed using the polypeptide (s) in the same host cell, the fusion protein and light chain). Az antitest előnyösen négy (vagy ötvagy több, pl. legfeljebb nyolc) könnyű lánc variábilisdonién polipeptidet tartalmaz, melyek mindegyike - adott esetben - CL-domént uartalmaz. Preferably, the antibody comprises a polypeptide of four (or five or more, eg up to eight.) Variábilisdonién light chain, each of which is - optionally - uartalmaz CL domain. • « • "

- 100 - A találmány egyik megvalósítási módja szerint a háromvagy több (pl. kb. 3-10, előnyösen 3 vagy 4) antigénkötőhelyet tartalmazó antitest három vagy több (pl. kb. 3-10,előnyösen 3 vagy 4) nehéz lánc vagy könnyű lánc variábilisdomént tartalmazó polipeptid-láncot foglalhat magában, melyvariábilis domének mindegyike három vagy több (pl. kb. 3-10, előnyösen 3 vagy 4) könnyű lánc vagy nehéz lánc variá-bilis dómén polipeptiddel van kombinálva vagy asszociálva,oly módon, hogy antigénkötő helyeket alkossanak. - 100 - One embodiment of the invention, the antibody comprising three or more (such as about 3-10, preferably 3 or the fourth.) Three or more antigen binding sites (e.g. about 3-10, preferably 3 or the fourth.) Heavy chain or light comprise a polypeptide chain comprising a chain variábilisdomént, melyvariábilis domains each of three or more (eg. approx. 3-10, preferably three or four) light chain or heavy chain variations are contemplated bilis domain polypeptide in association or in combination, so that antigen binding sites form. Ilyenfor-mán, amennyiben a polipeptid-lánc három vagy több nehézlánc variábilis domént tartalmaz, három vagy több megfelelőkönnyű lánc variábilis dómén polipeptiddel (pl. VL-CL-polipepridekkel) van kombinálva vagy asszociálva. Ilyenfor-Man, where the polypeptide chain comprises three or more heavy chain variable domains, three or more of the appropriate light chain are combined or associated variable domain polypeptides (e. Polipepridekkel VL-CL). Más mó-don, ha a polipeptid-lánc három vagy több könnyű lánc vari-ábilis domént tartalmaz, három vagy több megfelelő nehézlánc variábilis dómén polipeptiddel (pl. VH-CH1-polipeptidekkel) van kombinálva vagy asszociálódva. Else adding a base where the polypeptide chain comprises three or more light chain variable domains, three or more of the respective heavy chain variable domain is in combination or association with polypeptide (e. VH-CH1 polypeptides). A háromvagy több antigénkötő hely előnyösen ugyanazon antigén el-len irányul. The three or more antigen binding site is preferably at the same antigen-directed flax. Az ilyen antitestek által megkötött antigénekpéldái közé tartoznak a következők: (1) tumornekrózis fak-tor (T\F) receptor főcsaládba tartozó receptor (melyek"trimer receptorok" lehetnek, így az antitestnek csak háromantigénkötő helyet kell tartalmaznia), pl. antigens EXAMPLE bound by such antibodies include the following: (1) tumor necrosis factor receptor associated factor for a thorax (T \ M) receptor superfamily (which may be "trimeric receptor", so the antibody must contain only háromantigénkötő place), for example. DR4 és DR5; DR4 and DR5; (2) 3-sejt-felületi antigén, pl. (2) 3-cell surface antigen, e. CD20; CD20; (3) ErbB-receptor, pl.HSR2-receptor; (3) ErbB receptor, pl.HSR2 receptor; vagy (4) tumorsejtek által termelt sejtfelü-leti protein. sejtfelü-lations or protein produced by (4) tumor cells. Például, a polipeptid-lánc három (vagy négy)nehéz lánc variábilis domént tartalmazhat, melyek három(vagy négy) könnyű lánc variábilis dómén polipeptiddel • ·· · · * 101 (előnyösen VL-CL-polipeptidekkel) képesek kombinálódni, sezáltal három (vagy négy) antigénkötő helyet létrehozni,melyek mindegyike ugyanazon antigén ellen irányul. For instance, the polypeptide chain comprises three (or four) heavy chain may contain a variable domain, which polypeptide • variable domain of three (or four) light chain ·· · * 101 (preferably VL-CL polypeptides) can combine, sezáltal three (or create four) antigen binding sites, each directed against the same antigen. Az ilyenantitestek példái a 23/D ábrán látható antitest (háromantigénkötő hellyel) és a 23/E ábrán bemutatott antitest(négy antigénkötő hellyel). Such antibodies are examples of Figure 23 / D antibody (háromantigénkötő site) and introduced 23 / E shows antibody (four antigen binding sites). A többértékű antitest következőképletű polipeptid-láncot is tartalmazhat: (a) VL-CL-(flexibilis kapcsolószekvencia)-VL-CL-(flexibilis kapcsoló-szekvencia) -VL-CL (e megvalósítási mód szerint a polipeptidhárom és kb. nyolc közötti - egymáshoz flexibilis kapcsoló-szekvenciákkal kapcsolt - VL-CL-polipeptidet tartalmazhat);(b) VH-CH1-(flexibilis kapcsolószekvencia)-VH-CH1-(flexi-bilis kapcsolószekvencia)-VH-CH1 (e megvalósítási mód sze-rint a polipeptid három és kb. nyolc közötti - egymáshozflexibilis kapcsolószekvenciákkal kapcsolt - VH-CH1-polipepcidet tartalmazhat); may contain the multivalent antibody következőképletű polypeptide chain of: (a) VL-CL (flexible linker) linker-VL-CL (flexible linker) linker-VL-CL (in this embodiment the polipeptidhárom about between eight - one another. linked to a flexible linker sequences - may comprise VL-CL polypeptides), (b) VH-CH1 (flexible linker) -VH-CH1 (flexible linker) -VH-CH 1 (this embodiment, the valve Rint three polypeptide .; - linked egymáshozflexibilis linkers - VH-CH1 polipepcidet contain) from about eight and (c) (VL-CL)n, ahol ''n” értéke:3 vagy több (pl. kb. 3-8, előnyösen 3 vagy 4); (C) (VL-CL) n, where 'n' is 3 or more (.. For example, about 3-8, preferably 3 or 4); vagy (d)(VH-CHl)n, ahol "n" értéke: 3 vagy több (pl. kb. 3-8, elő-nyösen 3 vagy 4). or (d) (VH-CHI) n, where "n" is 3 or more (eg about 3-8, preferably 3 or pre-fourth.). A polipeptid-lánc előnyösen a következőképlettel írható le: (a) VH-CH1-(flexibilis kapcso-lószekvencia) -VH-CH1-(flexibilis kapcsolószekvencia)-VH-CHl; The polypeptide chain preferably can be described by következőképlettel: (a) a VH-CH1 (flexible linker) -VH-CH1 (flexible linker) -VH-CHl; (b) VH-CH1-(flexibilis kapcsolószekvencia)-VH-CH1-(flexibilis kapcsolószekvencia)-VH-CH1-(flexibilis kapcso-lószekvencia) -VH-CH1; (B) VH-CH1 (flexible linker) -VH-CH1 (flexible linker) -VH-CH1 (flexible linker) -VH-CH1; vagy (c) (VH-CHl)n, ahol ”n" értéke:3 vagy 4. A találmány szerinti többértékű antitestek különösenaz in vivő gyógykezelés és diagnosztizálás szempontjábólkívánatos tulajdonságokkal bírnak. Például, a többértékű ··♦ • ·· · ·· - 102 - antitestet - az antitest által megköthető antigént termelő- sejt gyorsabban internalizálja és katabolizálja, mint egykétértékű antitestet. Ennek megfelelően, feltárunk egyimmunkonjugátumot, amely citotoxikus hatóanyaghoz (pl.internalizációt követően a sejtek elpusztítását okozó ható-anyaghoz) konjugált többértékű antitestet tartalmaz. Azimmunkonjugátumok előállítására különböző citotoxikus ható-anyagok alkalmazását ismertetjük, melyek közül radioaktívizotóp, maytansinoid és calecheamicin alkalmazható előnyö-sen . A találmány szerinti többértékű antitest - és/vagy akiindulási antitest, amelyből a többértékű antitest leg-alább egy antigénkötő specifi or (c) (VH-CHI) n, where "n" value. 3 or 4 of the multivalent antibodies of the present invention különösenaz in vivo treatment and diagnosis are desirable for properties For example, the multivalent ·· ♦ • ·· · ·· - 102 - antibody - bindable by the antibody antigen productive cell rapidly internalized and catabolized than egykétértékű antibody accordingly, the invention egyimmunkonjugátumot comprising a conjugated multivalent antibody to a cytotoxic agent (after pl.internalizációt causing killing of the cell active substance) Azimmunkonjugátumok preparation.. illustrates the use of various cytotoxic agents, radioaktívizotóp, maytansinoid and used calecheamicin which considerably preferred multivalent antibody of the present invention. - from which the multivalent antibody-most least one antigen binding specificity and / or the starting antibody tása származik - különféle tu-lajdonságokkal bír, például, a következők közül: agonistahatás (pl·., ha az antitest által megkötött antigén a TNF-receptor családba tartozó receptor vagy egy B-sejt-felületiantigén); advan- tage of - has various tumor lajdonságokkal, for example, from (. · example, if receptor or a B cell felületiantigén antigen bound by the antibody to the TNF receptor family) effecting agonist; (2) apoptózis indukálása (pl., ha az antitest ál-tal megkötött antigén egy ErbB-receptor vagy a TNF-receptorfőcsaládba tartozó receptor); (2) induction of apoptosis (e.g., if the antigen bound to the antibody-tal at an ErbB receptor or receptor in the TNF receptor superfamily.); (3) tumorsejteken termelődősejtfelületi protein (pl. B-sejt-felületi antigén vagyErbB-receptor) megkötése; Conclusion produced cell surface (3) tumor proteins (e.g. B-cell surface antigen receptor vagyErbB.); (4) tumorsejtek által túlzottmértékben termelt sejtfelületi protein [pl. cell surface protein produced by (4) tumor cells overexpressing [eg. epidermális nö-vekedési faktor receptor (EGFR) HER2-receptor, ErbB3-receptor, Erb34-receptor vagy DcR3-receptorl megkötése;és/vagv sejtszaporodást gátló hatás. epidermal growth by female-factor receptor (EGFR), HER2 receptor, ErbB3 receptor, or DcR3 Erb34 receptor-receptorl conclusion; inhibiting and / cut cell proliferation effect. A találmány szerinti többértékű antitest egyetlen an-tigénre vagy egynél több (pl. kettő vagy kb. három) anti-génre lehez specifikus. The multivalent antibody according to the invention an-tigénre one or more than one (eg. two or approx. three) anti-gene-specific juice. A találmány egyik megvalósítási • «« · · · - 103 - módja értelmében a többértékű antitest három vagy több mű-ködőképes antigénkötő helyének mindegyike ugyanazon anti-génhez kötődik (előnyösen az antigén ugyanazon epitópjához,mely esetben a többértékű antitest monospecifikusnak te-kinthető) . One embodiment • the invention «« · · · - 103 - under way, the multivalent antibody binds to three or more are viable antigen binding sites are all the same anti-gene (preferably the antigen same epitope, in which case the multivalent antibody monospecific te-out yet). A találmány értelmében "multispecifikus" anti-testeket is feltárunk. According to the present invention provides "multi-specific 'antibodies was also. A három vagy több működőképesantigénkötő hely két vagy több (pl. kettő vagy kb. három)különböző antigénhez vagy epitóphoz kötődhet. The three or more működőképesantigénkötő site can bind two or more (eg. Two or approx. Three) different antigens or epitopes. A találmány leírásában bemutatjuk, hogy létrehozhatóegy receptor-antigén elleni többértékű antitest, amelynekagonista aktivitása és/vagy apoptózist indukáló képessége,meglepő módon, kvantitatíve hasonló a natív liganduméhoz. It will also be appreciated that the multivalent antibody to create a receptor-antigen amelynekagonista activity and / apoptosis-inducing ability, surprisingly, quantitatively similar to the native or liganduméhoz. A"kvantitatíve hasonló" kifejezésen azt értjük, hogy a több-értékű antitest agonista és/vagy apoptózis-indukáló aktivi-tást vizsgáló tesztben mért aktivitása a natív ligandumagonista és/vagy apoptózis-indukáló aktivitásának kb. The "quantitatively similar" is meant that the multivalent antibody agonist and / or activity is measured by examining the apoptosis-inducing activity in the assay of native ligandumagonista and / or apoptosis inducing activity of approx. tíz-szeresén, előnyösen kb. ten times, preferably approx. ötszörösén belüli érték. five times in value. E megvaló-sítási mód szerint az agonista és/vagy apoptózis-indukálóaktivitású antitest olyan antitest lehet, amely a TNF-receptor főcsaládba tartozó receptorra, pl. According to this diaper embodiment mode, the agonist and / or apoptosis indukálóaktivitású antibody may be an antibody, a receptor in the TNF receptor superfamily, for example. Apo2L-receptorra (pl. DR4, DR5, DcRl és DcR2, előnyösen DR4 vagyDR5) specifikus, mely esetben az antitest apoptózis-tesztben (ld. pl. 3. példa) meghatározott aktivitása azApo2L ugyanezen teszttel meghatározott aktivitásának kb.tízszeresén, pl. Apo2L receptor (e. DR4, DR5, DcRl and DcR2, preferably DR4 vagyDR5) specific activity azApo2L same test in which case the antibody defined apoptosis assay (eg. Example 3 ld.) Activity defined kb.tízszeresén, e. kb. approx. ötszörösén belüli érték. five times in value.

Az egyik megvalósítási mód szerint a találmány szerin-ti többértékű antitest B-sejt-felületi antigénhez kötődik.Az előnyösen B-sejt-felületi antigének a következők: CD19, • ·« · · · • 9 ·· • · · · • * ·* • ···«· ·· - 104 - CD20, CD22 és CD4O, legelőnyösebben a CD20. In one embodiment, the present serine-ti multivalent antibody B-cell surface antigen kötődik.Az preferably B-cell surface antigens are the following: CD19, • · «· · · • 9 ·· • · · · • * · * • · · · «· ·· - 104 - CD20, CD22 and CD4O, most of CD20. A találmány értelmében a többértékű antitestek külön- féle alkalmazási területeit tárjuk fel, melyeket az alábbi-akban ismertetünk részletesen. The invention relates to extra types of application fields, the multivalent antibodies, which are described in greater detail below, hereinafter. Amennyiben a többértékű an-titest egy vagy több működőképes Fc-régiót tartalmaz, való-színűleg képes effektor-funkciókat (pl. ADCC és CDC) közve-títeni, illetve felezési ideje hosszabb, mint az Fc-régiónélküli többértékű antitesteké. Where the multivalent anti-antibody directed to one or more functional Fc region, in-likely able to effector functions (e. ADCC and CDC) indirect-títeni or longer half-life than the Fc region without multivalent antibodies. Az ilyen többértékű anti-testek olyan esetekben alkalmazhatók, amikor sejtek (pl.tumor- vagy ráksejtek) elpusztítására van szükség. Such multivalent anti-antibodies are useful in situations where cells (pl.tumor- or cancer cells) are needed for killing. A talál-mány szerinti többértékű antitestek egyéb, Fc-régió nélkülialakjai olyan esetekben alkalmasak, ha rövidebb felezésiidőre van szükség (pl. cardiovascularis vagy gyulladásosbetegségek vagy rendellenességek kezelése esetén, vagy haaz antitestet citotcxikus hatóanyaggal konjugéljuk); The multivalent antibodies of the detection ranges are other suitable shapes without the Fc region, in cases where a shorter half-life time is required (eg in the treatment of cardiovascular disorders or gyulladásosbetegségek or or or when it citotcxikus antibody drug konjugéljuk.); ha azantitest internalizációjára van szükség (pl. antitestet éscitotoxikus hatóanyagot tartalmazó immunkonjugátummal vég-zett terápiához); azantitest if internalization is required (for example, an immunoconjugate comprising an antibody of the active ingredient éscitotoxikus end in therapy.); ha kemény tumor jobb áthatolására vanszükség; If hard tumor vanszükség better penetration; ha a többértékű antitest nem emlőseredetű gazda-sejtben (pl. prokarióta gazdasejtben, mint pl. az E. coli}történő termeltetésére van szükség; ha nem onkológiai be-tegségek vagy rendellenességek kezelésére van szükség;és/vagy ha el kívánjuk kerülni a bizonyos - effektor-funkciő(ka)t kifejtő - antitesteknél tapasztalható "elsődózis hatást". A szóban forgó antitest-alakok a következők lehetnek: dimerizációs domént tartalmazó többértékű anti-testek, amelyek dimerizációs doménje egy antitest csukló-régióját egy ieucin-zipzár doménhez fuzionálva tartalmazza • ·· (a leucin-zipzár dómén elősegíti a dimerizációs domént al-kotó polipeptidek kapcsolódását, a páciensnek történő be-adást megelőzően azonban proteolízissel lebontható) {ld.23/C ábra); If the production of the multivalent antibody non-mammalian host cell (e.g. a prokaryotic host cell, such as E. coli} to need, when treating non-oncological adjusted diseases or disorders are needed;.. and / or if it is desired to avoid certain - . effector function (s) exerting - antibodies or experiencing "first dose effect" said antibody formats may include: polyvalent anti-bodies comprising a dimerization domain to a dimerization domain of an antibody comprises the hinge region fused to a leucine zipper domain • ·· (the leucine zipper domain promotes dimerization domain sub-binding polypeptides attachment but prior to administration to a patient degradable by proteolysis) {Figure ld.23 / C); három antigénkötő helyet tartalmazó többértékűantitest (pl. a 23/D ábrán bemutatott antitest); polyvalent antibody comprising three antigen binding sites (e.g. antibody shown in FIG 23 / D.); vagy négyantigénkötő helyet tartalmazó többértékű antitest (pl. a 23/E ábrán látható antitest). or polyvalent antibody comprising négyantigénkötő location (eg. as shown in 23 / E shows antibody). B) Antigénkötő specifitás A találmány szerinti többértékű antitest egy vagy többcélantigén ellen irányul (vagy specifikusan egy vagy többcélantigénhez kötődik). B) Antigen Specificity The multivalent antibody of the invention directed against one or többcélantigén (or specifically binds to one or többcélantigénhez). A találmány szerinti többértékű an-titest által megkötött antigének előnyösen legalább egyikebiológiailag fontos pclipeptid, és az antitest betegségtőlvagy rendellenességtől szenvedő emlősnek történő adagolásaaz emlősben jótékony gyógyászati hatást eredményez. antigens bound by the multivalent antibody of the present invention is preferably at least one biologically important pclipeptid, and the antibody results in disease or adagolásaaz beneficial therapeutic effect in a mammal suffering from disorder in a mammal. Mind-azonáltal, nem polipeptid jellegű antigének (pl.tumcrasszociált glikolipid-antigének, ld. 5 091 118 számúegyesült államokbeli szabadalmi leírás) elleni antitestekis a találmány tárgyét képezik. Both the by-, antibodies against some type of non-polypeptide antigens (pl.tumcrasszociált glycolipid antigens, supra. 5,091,118 U.S. Patent) are also part of the invention.

Ha az antigén polipeptid, úgy az transzmembrán-molekula (pl. receptor) vagy ligandum (pl. növekedési fak-tor) lehet. If the antigen is a polypeptide, it may be a transmembrane molecule (e. Receptor) or ligand (e. Growth factor-tor) can. A jellemző antigének közé tartoznak a követke-zők: renin; Exemplary antigens include enhancers It follows renin; növekedési hormonok, köztük a humán növekedési hormon és a szarvasmarha-eredetű növekedési hormon; growth hormones, including human growth hormone and bovine growth hormone; növeke-dési hormont felszabadító hormon; terms and growth-hormone releasing hormone; mellékpajzsmirigy-hormon;pajzsmirigy-stimuláló hormon; parathyroid hormone; thyroid stimulating hormone; lipoproteinek; lipoproteins; a-1- Β ···* ** · * ·> B * » · ► · * B » 9·» 9·· * ·*·« * * * „ .· 106 - antitripszin; the 1- Β * ** ··· · · *> B * »► · · * B» · 9 »9 * · ·· · *« * '· 106 - antitrypsin.; inzulin A-lánc; A chain of insulin; inzulin B-lánc; insulin B-chain; proinzulin; proinsulin; folliculus-stimuláló hormon; follicle stimulating hormone; kalcitonin; calcitonin; luteinizáló hor-mon; luteinizing hor-mon; glukagon; glucagon; véralvadási faktorok, pl. blood clotting factors, for example. VlIIC-faktor, IX. VlIIC-Factor IX. faktor, szöveti faktor (TF) és von Willebrand faktor; , tissue factor (TF), and von Willebrand factor; vér-alvadás-gátló faktorok (pl- protein-C); blood-clotting inhibitory factors (PL protein C); atrialisnatriuretikus faktor; atrialisnatriuretikus factor; tüdő-szörfaktáns; lung surfactant is; plazminogén-aktivátor, pl. plasminogen activator, eg. urokináz vagy humán vizelet- vagy szövet-típusú plazminogén-aktivátor (tPA); urokinase or human urine or tissue-type plasminogen activator (t-PA); bombezin; bombesin; trombin; thrombin; vér-képzési növekedési faktor; training blood growth factor; tumornekrózis-faktor-α és -β;encephalináz; tumor necrosis factor-α and -β; encephalináz; RANTES; RANTES; humán makrofág-eredetű gyulladásiprotein (ΜΤΡ-1-α); human macrophage-derived gyulladásiprotein (ΜΤΡ 1-α); szérumalbumin, pl. serum albumin, for example. humán szérumalbimun;müllerianosis-t gátló szubsztancia; human serum albumin, mullerian-inhibiting substance; relaxin A-lánc; relaxin A-chain; relaxinB-lánc; relaxinB chain; prorelaxin; prorelaxin; egéreredetű gonadotropin-asszociáltpeptid; mouse gonadotropin asszociáltpeptid; mikrobiális protein, pl. a microbial protein, e. β-laktamáz; β-lactamase; DN-áz; DNase; IgE;citotoxikus T-linfocita-asszociált antigén (CTLA), pl. IgE, a cytotoxic T linfocita associated antigen (CTLA), such as. CTLA-4; CTLA-4; inhibin; inhibin; aktivin; activin; érfali endotheliális növekedésifaktorok (VEGE); vascular endothelial növekedésifaktorok (END); hormonok vagy növekedési faktorok recepto-rai; receptors for hormones or growth factors rai; prctein-A vagy -D; prctein A or D; rheumatoid-faktorok; rheumatoid factors; neurotróp fak-torok, mint pl. neurotrophic trees throat like. a csonteredetű neurotróp faktor (BDNF),r.eurotropin-3, -4, -5 vagy -6 (NT-3, NT-4, NT-5, ill. NT-6}; idegeredetű növekedési faktor (NGF-β); vérlemezke-eredetű növekedési faktor (PDGF); fibroblaszt-eredetű növe-kedési faktorok, pl. α-FGF és β-FGF; epidermális növekedésifaktor (EGE); transzformáló növekedési faktor (TFG), pl.TGF-α és TGF-β {köztük a TGF-βΙ, Τ6Ε-β2, TGF^3, TGF-p4vagy TGF-p5i; inzulinszerű növekedési faktor-I és -II (IGF-I és 1GF-II); dez(1-3)-IGF-I (agyi eredetű IGF-I); inzulin-szerű növekedési faktort kötő protein; CD-proteinek, pl. • ··«· *· *♦ • · * · w » · · • «V· » »·· ···· * · · —* ·«« -« »«w· ·· 107 CD3, CD4, CD8, CDi9, CD20 és CD25 (az IL-2-receptor Tac-alegysége); eritropoietln; csontképződést indukáló fakto-rok; immuntoxinok; csont-morfogenikus protein (BMP); inter-feronok (IFN-ek), pl. IFN-α, -β és -γ; kolonizációt stimu-láló faktorok (CSF-ek), pl. M-CSF, GM-CSF bone-derived neurotrophic factor (BDNF), r.eurotropin-3, -4, -5, or -6 (NT-3, NT-4, NT-5, or NT-6};. nerve-derived growth factor (β-NGF) ; platelet-derived growth factor (PDGF); fibroblast growth factors such as FGF and α-β-FGF. epidermal growth factor (EGE), transforming growth factors (TFG), pl.TGF-α and TGF-β {including TGF-βΙ, Τ6Ε-β2, TGF ^ 3, TGF-p4vagy p5i TGF-; insulin-like growth factor-I and -II (IGF-I and 1GF-II); des (1-3) -IGF-I (brain-derived IGF-I), insulin-like growth factor binding proteins;. CD proteins such ·· • «* · · · * · * ♦ • w» · • «V ·» »··· ·· · * · - * · «« - «» «w · ·· 107 CD3, CD4, CD8, CDi9, CD20 and CD25 (the IL-2 receptor Tac subunit); eritropoietln; osteoinductive factoring inhibitors; immunotoxins ; bone morphogenetic protein (BMP), inter-Ferone (IFN) such as IFN-α, -β and -γ;. long colony stimulating factors (CSFs) such as M-CSF, GM-CSF. és G-CSF;interleukinek (IL-ek), pl. IL-1...IL-10; szuperoxid-dizmutáz; T-sejt-receptorok; felületi membrán-proteinek;bomlást gyorsító faktor; and G-CSF; interleukins (IL) such as IL-1, IL-10 ...;. superoxide dismutase; T-cell receptors; surface membrane proteins; decay accelerating factor; virális antigének, pl. viral antigens, for example. a HÍV"envelope"-proteinjének részlete; of HIV "envelope" proteins of the details; transzport proteinek;"homing"-receptorok; transport proteins; "homing" receptors; adresszinek; addressins; szabályozóproteinek;integrinek (pl. CDlla, CDllb, CDllc, CD18 és ICÁM, VLA-4 ésVCAM); regulatory proteins; integrins (e.g. CDlla, CDllb, CDllc, CD18, and ICAM, VLA-4 ésVCAM.); tumor-asszociált antigén, pl. tumor-associated antigen, e. HER2-, HER3- vagyHER4-receptor; HER2, HER3 receptor vagyHER4; valamint a felsorolt peptidek fragmensei. as well as fragments of peptides. A találmány szerinti antitestek előnyös célmolekulái közé tartoznak a következők: leukocita felületi markerek vagy CD-proteinek, pl. The antibodies of the present invention, preferred target molecules include: leukocyte surface markers or CD proteins, e. CDla-c, CD2, CD2R, CD3, CD4, CDS,CD6, CDI, CD8, CD9, CD10, CDlla, CDllb, CDllc, CDwl2, CD13,CD14, CD15, CD15s, CD16, CD16b, CDwl7, CD18, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD24, CD25, CD26, CD27, CD28, CD29, CD30, CD31, CC32, CD33, CD34, CD35, CD36, CD37, CD38, CD39, CD40,CD41, CD42a-d, CD43, CD44, CD44R, CD45, CD45A, CD45B, CD45O, CD46-CD48, CD49a-f, CD50, CD51, CD52, CD53-CD59, CDwőO, CD61, CD62E, CD62L, CD63, CD64, CDw65, CD66a-e, CD68-CD74, CDw75, CDw76, CD77, CDw78, CD79a-b, CD80-CD83,CDw84, CD85-CD89, CDw90, CD91, CDw92, CD93-CD98, CD99, CD99R, CD100, CDwIOl, CD102-CD106, CD107a-b, CDwlOS, CDwlO9, CD115, CDwll6, CD117, CD119, CD120a-b, CD121a-b, CD122, CDwl24, CD126-129 és CD130; CDla-c, CD2, CD2R, CD3, CD4, CDS, CD6, CDI, CD8, CD9, CD10, CDlla, CDllb, CDllc, CDwl2, CD13, CD14, CD15, CD15s, CD16, CD16b, CDwl7, CD18, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD24, CD25, CD26, CD27, CD28, CD29, CD30, CD31, cc32, CD33, CD34, CD35, CD36, CD37, CD38, CD39, CD40, CD41, CD42a-d, CD43, CD44, CD44R, CD45, CD45, CD45B, CD45, CD46, CD48, CD49d-f, CD50, CD51, CD52, CD53, CD59, CDwőO, CD61, CD62, CD62L, CD63, CD64, CDw65, CD66a-e, CD68- CD74, CDw75, CDw76, CD77, CDw78, CD79a, b, CD80, CD83, CDw84, CD85-CD89, CDw90, CD91, CDw92, CD93, CD98, CD99, CD99R, CD100, CDwIOl, CD102, CD106, CD107a-b, CDwlOS, CDwlO9, CD115, CDwll6, CD117, CD119, CD120a-b, CD121a-b, CD122, CDwl24, CD130 and CD126-129; az ErbB-receptor család - 108 - tagjai, pl. the ErbB family of receptors - 108 - members, for example. EGF-receptor, HER2-receptor, HER3-receptor vagyHER4-receptor; EGF receptor, HER2 receptor, HER3 receptor vagyHER4 receptor; prosztata-specifikus antigén(ek); prostate specific antigen (s); sejtadhé-ziós molekulák, pl. dimensional cell adhesion molecules, for example. Ilb/IIIa, LFA-1, Maci, pl50.95, VLA-4,ICAM-1, VCAM, a4/p7-integrin és av/p3-integrin, ideértveannak a- vagy β-alegységét (pl. anti-CDlla, anti-CD18 vagyanti-CDllb antitestek); IIb / IIIa, LFA-1, Bear, pl50.95, VLA-4, ICAM-1, VCAM, a4 / p7 integrin, and av / p3 integrin ideértveannak a- or β-subunit (eg. Anti-CDlla, anti-CD18 or anti-CDl lb antibodies); növekedési faktorok, pl. growth factors, e. VEGF, szö-veti faktor (TF) ; VEGF, any tissue factor (TF); alfa-interferon (α-IFN); alpha interferon (α-IFN); interleukin, pl.IL-8; interleukin-8 pl.IL; IgE; Verb; vércsoport antigének; blood group antigens; fIk2/flk3-receptor;obezitás (OB) receptor; fIk2 / flk3 receptor; obesity (OB) receptor; c-mpl receptor; c-mpl receptor; CTLA-4; CTLA-4; protein-C, stb. protein C, etc..

Az antitestek létrehozására immunogénként szolubilisantigének vagy antigén-fragmensek (adott esetben más mole-kulákhoz konjugálva) alkalmazhatók. The antibodies can be used to create szolubilisantigének or antigenic fragments (optionally conjugated to other molecular kulaks) immunogen. Transzmembrán-molekulák(pl. receptor) esetében immunogénként azok fragmensei (pl. a receptor extracelluláris doménje) alkalmazhatók. For transmembrane molecules (eg. receptor), fragments of these (eg. the extracellular domain of a receptor) can be used. Más mó-don, immunogénként a transzmembrán-molekulát termelő sejtekis alkalmazhatók; Else adding a base immunogen transmembrane molecule-producing cells may be employed; az ilyen sejtek természetes forrásból(pl. rákos sejtvonalakből) származhatnak vagy a transzmemb- rén-molekula termeltetése érdekében rekombináns technikák alkalmazásával transzformált sejtek lehetnek. such cells may be derived from or transzmemb- cells transformed by recombinant techniques to polybrene molecule production of natural source (eg. cancer cell lines). Az antitestekelőállításéra alkalmas egyéb antigének és antigén-alakokszakember számára jói ismertek. They are well known for other antigens and antigen forms suitable antitestekelőállításéra art. A találmány szerinti többértékű antitestek számáraelőnyös célantigének közé tartoznak a következők: (1) ErbB-receptorok, pl. multivalent antibodies of the present invention for preferred target antigens include the following: (1) an ErbB receptor, e. EGER, HER2, HER3 és HER4; EGER, HER2, HER3 and HER4; (2) TNF-receptorfőcsaládba tartozó receptorok, pl. receptors (2) TNF-receptor superfamily, e. Apo2L-receptorok (DR4,DR5, DcRl és DcR2); Apo2L receptors (DR4, DR5, DcRl and DcR2); (3) B-sejt-felületi antigének, elsősor-ban a CD19, CD2G, CD22 és CD40; (3) B-cell surface antigens, Elsősor in CD19, CD2G, CD22 and CD40; (4) tumorsejtek által tér- ··· ··· · · · ·• · · ·• ··· ·· ···· ·· ► - 109 - melt antigének; by (4) tumor spatial ··· ··· · · · · · · · • • ···· ··· ·· ·· ► - 109 - melt antigens; (5) tumorsejtek által túltermelt antigének(pl. ErbB-receptorok, DcR3-receptorok); overproduced by (5) tumor antigen (e.g., ErbB receptors, DcR3 receptors.); (6) multimer (pl. dimer vagy trimer) ligandumok által aktivált receptorok(pl. a TNF-receptor főcsaládba tartozó receptorok, VEGF-receptorok, stb.). Activated (6) multimeric (e. dimer or trimer) receptor ligands (e. receptors in the TNF receptor superfamily, VEGF receptors, etc). A találmány egyik megvalósítási módjaértelmében a többértékű antitest három vagy több (pl. négyvagy akár kb. nyolc) antigénkötő helyének mindegyike a fen-ti antigének egyike ugyanazon antigén-determinánsa vagyepitópja ellen irányul. Under one embodiment of the invention, the multivalent antibody comprises three or more (eg. four or even approx. eight) antigen binding sites of each of the fen-ti antigens is one directed against the same antigenic determinant vagyepitópja. A találmány értelmében multispecifikus antitesteket isfeltárunk, vagyis olyan antitesteket, amelyek legalább kétkülönböző epitópra vagy antigén-determinánsra irányulókötőspecifitással bír. also the invention provides multispecific antibodies according to the invention, i.e., antibodies which have at least an epitope or antigenic determinant kétkülönböző irányulókötőspecifitással. A multispecifikus antitestek (pl.bispecifikus antitestek, BsAb-k) célbajuttató hatóanyagkéntkülönféle klinikai alkalmazási területeken nagy jelentősé-gűek, így például, in vitro és in vivő immundiagnosztika,gyógykezelés, illetve diagnosztikai immuntesztek céljára. Multispecific antibodies (pl.bispecifikus antibodies, BsAbs), targeting is very significantly extend transversely, e.g., in vitro and in vivo immune diagnosis, therapy, or diagnostic immunoassays as an active ingredient for a variety of clinical applications. A bispecifikus antitestek hasznosnak bizonyultak asejtfelületi molekulák funkcionális tulajdonságainak tesz-zelésére, illetve a különböző Fc-receptorok citotoxicitástközvetítő képességének meghatározására [ld. Bispecific antibodies have proven useful in the functional properties of the molecules asejtfelületi Of zelésére and to determine the different Fc receptors citotoxicitástközvetítő capacity [see Fig. Fanger ésmzsai.: Crit. Ésmzsai .: Fanger, Crit. Rév. Port. Immunoi. Immunol. 12, 101 (1992)]. 12, 101 (1992)]. Nolan és mtsai. Nolan et al. (Biochem. Biophys. Acta 1040, 1 (1990)] a bispeci- fikus antitestek egyéb diagnosztikai alkalmazásait írtákle. Például, enzimek immuntésztekben történő alkalmazáscéljára történő immobilizálásához bispecifikus antitestekhozhatók létre. Ennek érdekében a bispecifikus antitest úgyalakítható ki, hogy egyik karja az enzimen lévő egyik spe- • « · • · · · - 110 - cifikus epitóphoz kötődjön (anélkül, hogy ez a kötődés gá-tolná az enzim aktivitását), a másik karja pedig azimmobilizáló közeghez kötődjön, biztosítva ezáltal, hogy akívánt helyen nagy enzimsűrűség legyen. Az ilyen diagnosz-tikai célú bispecifikus antitestek példái közé tartozik aHammerling és mtsai. [J. Exp. Med. 128, 1461 (1968)] általleírt nyúleredetű anti-IgG/anti-ferritin bispecifikus anti-test, amelyet felületi antigének lokalizálására alkalmaz-tak. Kifejlesztettek olyan bispecifikus antitesteket is,amelyek tormaperoxidáz (HRP) és hormon megköt (Biochem. Biophys. Acta 1040, 1 (1990)], the bispecific antibodies other diagnostic applications írtákle. For example, to immobilize enzymes in immuntésztekben in alkalmazáscéljára bispecific antibodies can be generated. For this purpose úgyalakítható the bispecific antibody that one of the arms in the enzyme one SPE • «· • · · · - 110 - bind-specific epitope (without this binding inhibited would guarantee the activity of the enzyme), the other arm and bind azimmobilizáló medium, thereby ensuring that Desired location be high enzyme density of such. bispecific antibodies diagnosz-tikai purpose are exemplified aHammerling et al. általleírt rabbit anti-IgG / anti-ferritin, bispecific antibodies [J. Exp. Med. 128, 1461 (1968)], which locating surface antigens are tock. developed bispecific antibodies, which horseradish peroxidase (HRP) and hormones, binds sére alkalmasspecifitásúak. A bispecifikus antitestek egy másik lehetsé-ges immunkémiai alkalmazása a két helyes immuntesztekbentörténő felhasználás, például, két bispecifikus antitestetállítunk elő, amelyek az analizálni kívánt protein két kü-lön epitópjához kötődnek: az egyik antitest a komplexet egyoldhatatlan közeghez köti, míg a másik egy indikátor enzi-met köt meg [Nolan és mtsai.: Biochem. alkalmasspecifitásúak THEM Another possible in-ges immunochemical use of bispecific antibodies, the two correct immunoassays hints specific application, for example, two bispecific antibodies are prepared that bind to two dif-one epitope of the protein to be analyzed. one antibody complex bound egyoldhatatlan medium, while the other an indicator enzymatically meth binds [Nolan et al .: Biochem. Biophys. Biophys. Acta 1040,1 (1990)]. Acta 1040.1 (1990)]. A multispecifikus antitestek különböző betegségek (pl.rák) in vitro vagy in vivő immundiagnosztizálására is fel-használhatók [ld. Multispecific antibodies of various diseases (pl.rák) in vitro or in vivo, can also be used immundiagnosztizálására [ld. Songsivilai és mtsai.: Clin. Songsivilai et al .: Clin. Exp.Immunoi. Exp.Immunoi. 7 9, 315 (1990)]. (1990)] 7 9, 315th A bispecifikus antitestek e diag-nosztikai alkalmazásénak elősegíti, hogy az antitest egyikkarja tumorasszociáit antigént, másik karja pedig - detek-tálható markerhez, például, egy radionuklidhoz szorosan kö-tődő - kelátort köt meg. Bispecific antibodies promotes such diag-nostic alkalmazásénak that one arm of the antibody is tumor associated antigen and the other arm is - detecting guaranteed from a marker, for example, a radionuclide in close co-todo - chelator binds. E megközelítési mód alkalmazásávalLe Doussal és mtsai. This approach alkalmazásávalLe Doussi et al. vastag- és végbél-karcinomák, illetvepajzsmirigy-karcinomák radioimmun-detektálására alkalmas - 111 - ··«· bispecifikus antitesteket állítottak elő, melyek egyik kar-ja karcinoembrionális antigénhez (CEA), másik karja pedigdietilén-triamin-pentaecetsavhoz (DPTA) kötődik [ld. colorectal carcinomas, carcinomas illetvepajzsmirigy suitable radioimmunoassay detection - 111 - ·· «· bispecific antibodies have been produced which one arm binds to carcinoembryonic antigen (CEA) and the other arm pedigdietilén pentaacetic acid (DTPA) [cf. . LeDoussal és mtsai.: Int. J. Cancer (Suppl.) Ί_, 58 (1992); LeDoussal et al .: Int J. Cancer Ί_, 58 (1992). (Suppl.); ésLe Doussal és mtsai.: J. Nucl. ésLe Doussi et al .: J. Nucl. Med. 34, 1662 (1993)]. Med., 34, 1662 (1993)].

Stickney és mtsai. Stickney et al. [Cancer Rés. [Cancer Res. 51, 6650 (1991)] CEA-termeléssel jellemezhető vastag- és végbélrákok radioimmun-detektálással végzett kimutatási módszerét írták le. represented by 51, 6650 (1991)], CEA yield colorectal cancers described detection method with detection radioimmunoassay. Az ál-taluk leírt bispecifikus antitest CEA-hoz, illetve hidroxi-etil-tio-karbamid-benzil-EDTA-hoz (EOTUBE) kötődik. The false TALU bispecific antibody described binds CEA and hydroxyethyl-thio-urea-benzyl-EDTA (EOTUBE). A multispecifikus antitestek emberek gyógykezelésecéljából irányított citotoxicitás biztosítására is alkal-mazhatók, oly módon, hogy az antitest egyik karja, például,patogénhez vagy tumorsejthez, másik karja pedig citotoxikustrigger-molekulához (pl. T-sejt-receptorhoz vagy Fc-gamma-receptorhoz) kötődik. Multispecific antibodies may also provide directional people gyógykezelésecéljából cytotoxicity can be employed, such that the antibody is an arm, for example, pathogen or tumor cell and the other arm being bound citotoxikustrigger molecule (eg. T cell receptor or the Fc gamma receptor) . Ennek megfelelően, a multispecifikusantitesnek felhasználhatók a páciens celluláris védekezőmechanizmusának specifikusan tumorsejt vagy fertőző ágenselleni irányítására. Accordingly, the patient can be used to multispecifikusantitesnek cellular defense mechanisms specifically to the tumor cell or infectious ágenselleni management. Ξ stratégia alkalmazásával kimutatták,hogy az Fc-gamma-RIII-hoz (vagyis CD16-hoz) kötődőbispecifikus antitestek természetes ölősejtek (NK-sejtek)/nagy granuláris limfocita (LGL) sejtek általi invitro tumorsejt-pusztítást közvetíthetnek, és hatásosak atumornővekedés in vivő gátlására [Segal és mtsai.: Chem.Immunoi. It demonstrated using Ξ strategy to invitro killing of tumor cells to the Fc gamma RIII to (i.e. CD16 RF) kötődőbispecifikus antibodies Natural Killer (NK) cells / large granular lymphocyte (LGL) cells in the appearance and in vivo inhibiting effective atumornővekedés [Segal et al .: Chem.Immunoi. 47, 179 (1989); 47, 179 (1989); Segal és mtsai.: Biologic Therapyof Cancer 2(4), 1 (1992)]. Segal et al .: Biologic Therapyof Cancer 2 (4), 1 (1992)]. Hasonlóan, HER2-antigént túlzottmértékben termelő petefészek- és emlőtumorok kezeléséreolyan bispecifikus antitesteket fejlesztettek ki, amelyek • · · · · ·· ·»· ··« · ······· · · · ·• · · · *« ··*· ·· - 112 - egyik karja Fc-gamma-RIII-hoz, másik karja pedig HER2-receptorhoz kötődik [Hseih-Ma és mtsai.: Cancer Research52, 6832 (1992); Similarly, the HER2 antigen-overexpressing ovarian and breast tumors developed for the treatment of bispecific antibodies which ·· • · · · · · »· ··" ······· · · · · · · · · • * «· * · · ·· - 112 - one arm of Fc gamma RIII-RF, while the other arm binds to HER2 receptor [Hseih-Ma et al .: Cancer Research52, 6832 (1992); Weiner és mtsai.: Cancer Research 53, 94 (1993)]. Weiner et al .: Cancer Research 53, 94 (1993)]. A bispecifikus antitestek T-sejtek általi sejt-pusztítást is közvetíthetnek. Bispecific antibodies may mediate cell killing by T cells as well. Shalaby és mtsai. Shalaby et al. [J. [J. Exp.Med. Exp.Med. 175(1), 217 (1992)] T-sejtek - HER2-receptort túlter- melő tumorsejtekhez történő - irányítására teljesen humani-zált F(ab')2 bispecifikus antitestet alkalmaztak, amelyanti-CD3 és anti-pl85HER2 karokból állt, A bispecifikus an-titesteket több korai fázisú klinikai kísérletben is tesz-telték, s bíztató eredmények születtek. 175 (1), 217 (1992)] T cells - fully humanized, immobilized F (ab ') 2 bispecific antibodies were used in control, consisted of an anti-CD3 and anti-pl85HER2 arms of the bispecific - HER2 receptors overloading of lactam producing tumor cells an-titesteket several early phase clinical trials make-passed, and encouraging results. Az egyik kísérlet-ben 12 - tüdő-, petefészek- vagy emlőrákban szenvedő - pá-cienst anti-CD3/anti-tumor (M0C31) bispecifikus antitesttelirányított, aktivált T-limfociták infúziójával kezeltek[deLeij és mtsai.: "Bispecific Ar.tibcdies and TargetedCellular Cytotoxicity", szerk.: Romet-Lemonne, Fanger ésSegal, Lienhart, 249. old. The experiment was a 12 - lung, ovarian or breast cancer - bye-deficient anti-CD3 / anti-tumor (M0C31) bispecific antibody directed, activated T lymphocytes were treated with infusion of [deLeij et al .: "Bispecific and Ar.tibcdies TargetedCellular Cytotoxicity ", ed .: Romeo Lemonne, Fanger Essegi, Lienhart, 249 pp. (1991)]. (1991)]. Az irányított sejtek atumorsejtek jelentős mértékű lokális lízisét és enyhe gyul-ladásos reakciót indukáltak, toxikus mellékhatások vagyegérantitest elleni reakciók azonban nem jelentkeztek. Angled atumorsejtek cells induced considerable local lysis and mild inflammation-ladásos reaction, however, side effects or toxic reactions mouse antibody were not present. Egyarti-CD3/anti-CDl9 bispecifikus antitesttel végzett előze-tes kísérletben egy 3-sejt-malignanciábar szenvedő páciens-nél a perifériás tumorsejtek számának jelentős mértékűcsökkenését érték el [Clark és mtsai.: "BispecificAntibodies and Targeted Cellular Cytotoxicity", szerk.:Romet-Lemonne, Fanger és Segal, Lienhart, 243. old.(1991)]. Egyarti-CD3 / anti-CDl9-free previous experiment with the bispecific antibody in a patient at three cell malignanciábar patients achieved a significant reduction in peripheral tumor cells [Clark et al .: "Targeted Cellular Cytotoxicity BispecificAntibodies and" szerk.:Romet -Lemonne, Fanger and Segal, Lienhart, 243 pp. (1991)]. A multispecifikus antitestek gyógyászati felhasz-nálását illetően 1-d. Use is pharmaceutical Multispecific antibodies regards 1-d. még: Kroesen és mtsai.: Cancer ··· - 113 - also Kroesen et al .: Cancer ··· - 113 -

Immunoi. Immunol. Immunother. Other immune. 37, 400 (1993); 37, 400 (1993); Kroesen és mtsai.: Br.J. Kroesen et al .: Br Cancer 70, 652 (1994); Cancer 70, 652 (1994); és Weiner és mtsai.: J. Immunoi.152, 2385 (1994). and Weiner et al .: J. Immunoi.152, 2385 (1994). A multispecifikus antitestek fibrinolitikus hatóanyag-ként és vakcina-adjuvánsként is felhasználhatók. Multispecific antibodies can be used as fibrinolytic agents, and as a vaccine adjuvant is well. Ezenfelül,ezek az antitestek fertőző betegségek kezelésére is alkal-mazhatók; Moreover, these antibodies in the treatment of infectious diseases can be employed; például, az effektor-sejtek vírusokkal (pl. Hív-vel vagy influenzavírussal) vagy protozoákkal (pl.Toxoplasma gondii-vel) fertőzött sejtekhez történő irányí-tására; for example, infected with viruses (such as HIV or influenza virus.) or protozoa (pl.Toxoplasma with gondii) cells direction pouch of effector cells; immunotoxinok tumorsejtekhez történő célba-juttatására, vagy immunkomplexek sejtfelületi receptorokhoztörténő irányítására (Fanger és mtsai., ld. fentebb). immunotoxins targeted to the tumor cells, delivering, or directing immune complexes to cell surface receptorokhoztörténő (Fanger et al., supra. above). A találmány értelmében különféle multispecifikus anti-testeket tárunk fel. We provide a variety of multispecific antibodies were according to the invention. Például, a multispecifikus antitestkét vagy több különböző epitóphoz vagy antigénhez kötődhet.Más módon, a multispecifikus antitest specifikus lehet: (1)egy célsejt által termelt antigénre (például, ha a célsejtzumorsejt) és (2) egy leukocitán lévő trigger-molekulára,pl. For example, kötődhet.Más multispecific to antibody or more different epitope or antigen manner to the multispecific antibody is specific: (1) an antigen (e.g., if the célsejtzumorsejt) and (2) a triggering molecule on a leukocyte such as produced by the target cell. 7-sejt-receptor molekulára (pl. CD2 vagy CD3), vagy IgGreceptoraként szolgáló Fc-receptorra (Fc-gamma-R), mint Fc-gamma-RI (CD64), Fc-gamma-RII (CD32) és Fc-gamma-RíII(CD16), melynek eredményeként a ceiluláris védekező-mechanizmust az antigéntermelő sejtre irányítja. for seven-cell receptor molecule (e. CD2 or CD3), or IgGreceptoraként Fc receptor (Fc gamma R), such Fc gamma RI (CD64), Fc gamma RII (CD32) and Fc gamma RIII (CD16), and as a result are cellular defense mechanism managed by the antigen-presenting cell. Amultispecifikus antitestek a citotoxikus hatóanyagokcélantigént termelő sejthez történő lokalizálására is al-kalmasak. Amultispecifikus also localize cytotoxic antibodies from production cell sub-hatóanyagokcélantigént immensely. Az ilyen antitestek egy célantigént megkötő kartés egv citotoxikus hatóanyagot (pl. szaporint, a-interferint, vinca-alkaloidot, ricin-A-láncot, metotrexátot • » ·»· ·»· - »·····« · F · » • · «Μ * - ·» - ♦ « ) - 114 - vagy radioaktív izotópot, haptént) megkötő kart tartalmaz-nak. . Such antibodies can bind a target antigen kartés EGV cytotoxic agent (e.g. saporin, a-interferint, vinca alkaloid, ricin A chain, methotrexate • »·» · · »· -" ····· «· M ·» • · «Μ * - ·» - ♦ ") - 114 - or radioactive isotope hapten) does contain binding arm. A WO 96/16613 számú nemzetközi közzétételi iratbanbispecifikus anti-HER2/anti-Fc-gamma-RIII antitestet; WO 96/16613 PCT Publication No. WO iratbanbispecifikus anti-HER2 / anti-Fc gamma RIII antibody; az5 837 234 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírásbananti-HER2/anti-Fc-gamma-RI antitestet; AZ5 No. 837,234 U.S. Patent anti-HER2 / anti-Fc-gamma RI antibody; a WO 98/02463 számúnemzetközi közzétételi iratban bispecifikus anti-HER2/Fc-alfa antitestet; WO 98/02463 international patent discloses a bispecific anti-HER2 / Fc-alpha antibody; az 5 821 337 számú egyesült államokbeliszabadalmi leírásban bispecifikus anti-HER2/anti-CD3 anti-testet tártak fel. No. 5,821,337 U.S. Pat revealed a bispecific anti-HER2 / anti-CD3 anti-bodies. C) Kiindulási antitest előállítása A többértékű antitestek előállítása céljából megfelelőantigének elleni variábilis doméneket tartalmazó "eredeti" vagy "kiindulási" antitesteket állíthatunk elő. Starting Antibody Preparation C) was obtained by the "original" or "parent" antibodies comprising variable domains against corresponding antigens to generate multivalent antibodies. A kiindulá-si antitest variábilis doménjeinek szekvenciája a találmányszerinti többértékű antitest megtervezésére használható. The base-sequence si antibody variable domains used according to the invention, the multivalent antibody design. (i) Poliklonális antitestek A poliklonális antitesteket előnyösen állatokban, amegfelelő antigén és adjuváns többszöri szubkután (se) vagyinrraperítoneális (ip) injektálásával termeltetjük. (I) Polyclonal antibodies Polyclonal antibodies are preferably raised in animals by the corresponding adjuvant and antigen by multiple subcutaneous (sc) produced in vagyinrraperítoneális (i.p.) injection. A rele-váns antigént előnyös lehet olyan proteinhez konjugálni,amely az immunizálni kívánt fajban immunogén hatású. The relay Vanson be useful to conjugate the antigen to a protein that is immunogenic in the species to be immunized. Azilyen proteinek példái a "keyhole limpet" hemocianin, aszérumalbumin, a szarvasmarha-eredetű thyroglobulin és aszójabab tripszin-inhibitor. Examples Azilyen proteins "keyhole limpet" hemocyanin, aszérumalbumin, thyroglobulin and aszójabab trypsin inhibitor of bovine origin. A konjugálás bifunkciós vagy 9 t 9 « -- ·«· • · · ··*· - 115 - derivatizáló ágens alkalmazásával történhet, például,maleimidobenzoil-szulfoszukcinimid-észter (konjugálás cisz-teineken keresztül), N-hidroxiszukcinimid (konjugáláslizineken keresztül), glutáraldehid, borostyánkősav-anhidrid, SOCI2 vagy R1N=C=NR (amelyben R és R1 jelentéseegymástól eltérő alkilcsoport) alkalmazásával. 9 is a bifunctional or 9 '- · «• · · · · ·· * - place using a derivatizing agent, e.g., maleimidobenzoyl sulfosuccinimide ester (conjugation through cysteine ​​residues), N-hydroxysuccinimide (through konjugáláslizineken) - 115 using glutaraldehyde, succinic anhydride, SOCl2, or R1N = C = NR (wherein R and R1 jelentéseegymástól different alkyl groups).

Az állatokat az antigén, az immunogén konjugátumokvagy származékok ellen úgy immunizáljuk, hogy a proteinvagy a konjugátum, például, 100 gg-ját (nyulak esetében),illetve 5 gg-ját (egerek esetében) háromszoros térfogatúFreund-féle komplett adjuvánssal elegyítjük, és az oldatotintradermálisan az állat testének több pontjába injektál-juk. Animals are immunized against the antigen, immunogenic konjugátumokvagy derivatives of the protein or conjugate, for example, 100 gg adjusted (for rabbits) or 5 gg adjusted (in mice) treated three times térfogatúFreund's complete adjuvant and oldatotintradermálisan the animal's body at multiple injectable Juk. Egy hónap elteltével az állatoknak - több helyre adottszubkután injekcióval - a peptid vagy konjugátum eredetimennyiségének 1/5-1/10-ével (Freund-féle komplettadjuvánsban) emlékeztetőoltást adunk. One month later the animals - adottszubkután multiple sites by injection - the peptide or conjugate of the original amount of 1 / 5-1 / 10 of (Freund komplettadjuvánsban) booster added. 7-14 nappal később azállatoktól vért veszünk, és a vérsavóban meghatározzuk azantizesz-ritert. 7-14 days later azállatoktól bled and the serum was determined azantizesz-Riter. Az emlékeztetőoltásokat addig ismételjük,míg az aztitest-titer platót nem ér el. The booster doses repeated until the aztitest titer plateaus. Az állatoknak azemlékeztetőoltást előnyösen azonos antigén (de eltérő pro-teinnel és/'vagy eltérő keresztkötő reagenssel képzett)konjagáturnával végezzük. The animals azemlékeztetőoltást performed konjagáturnával preferably identical antigen (different from pro-teinnel and / 'or with different crosslinking reagent). A konjugátumok rekombináns sejtte-nyészetben, fúziós proteinekként is előállíthatok. The conjugates may be recombinantly in cell culture growth, protein fusions. Az im-munreakció serkentésére aggregációt elősegítő hatóanyagok is alkalmazhatók. stimulating microns munreakció proaggregatory substances may be used. 116 • ······ ··· ··· · ··· • · · · • · · ·« ···· a>» (ii) Monoklonális antitestek A monoklonális antitestek lényegében homogén antites-tek populációjából származnak, vagyis a populációt alkotóegyes antitestek egymással azonosak (a minimális mennyiség-ben esetlegesen előforduló természetes mutációktól elte-kintve) . 116 • • ······ ··· ··· ··· · · · · · · · • «···· a>» (ii) Monoclonal antibodies Monoclonal antibodies are derived from a substantially homogeneous population of antibodies, i.e. the individual antibodies constituting population are identical (that may occur in the minimum amount of natural mutations kintve-operated). Ilyenformán, a "monoklonális" jelző az antitestekazon tulajdonságára vonatkozik, hogy nem különböző antites-tek elegveként léteznek. Thus, the modifier "monoclonal" indicates relates to antibodies to the property of the antibodies to various non-tek elegveként exist. A monoklonális antitestek az elsőként Kohler és mtsai. Monoclonal antibodies are the first Kohler et al.

[Natúré 256, 495 (1975)] által leirt hibridóma-eljárással,valamint rekombináns DNS-technikák (4 816 567 számú egye-sült államokbeli szabadalmi leírás) alkalmazásával állítha-tók elő. described by [Nature 256, 495 (1975)] the hybridoma methods and recombinant DNA techniques (match-fried U.S. Patent No. 4,816,567) adjustable Case prepared. A hibridóma-eljárás során egeret vagy egyéb alkalmasgazdaállatot (pl. hörcsögöt) a fentebb leírtak szerint im-munizálunk, hogy olyan limfociták termelődését váltsuk ki,amelyek az immunizálásra alkalmazott proteinhez specifikusan kötődő antitesteket termelnek (illetve azok termelésére képesek). In the hybridoma method, a mouse or other appropriate host animal (eg. a hamster) as described above to immunize to elicit lymphocytes that produce specifically binds to antibodies to the protein used for immunization (or are capable of producing). Más módon, a limfocitákat in vitroimmunizálhatjuk. Alternatively, the lymphocytes in vitroimmunizálhatjuk. Szt követően a limfocitákat megfelelő fu-zionáltatő ágens (pl. polietilén-glikol) alkalmazásávalmyelomssejbekhez fuzionáljuk, miáltal hibridómasejteket ka-punk [Goding: "Monoclonal Antibcdies: Principles and After St. fused with lymphocytes are fused suitable agent (e.g. polyethylene glycol). alkalmazásávalmyelomssejbekhez, a hybridoma ka-punk [Goding, "Monoclonal Antibcdies: Principles and

Practice", 59-103. old., Academic Press (1986)]. Practice ", 59-103., Pp. Academic Press (1986)].

Az így létrehozott hibridómasejteket megfelelő - elő-nyösen a fűzionálatlan kiindulási myelomasejtek szaporodá-sét és túlélését gátló egy vagy több anyagot tartalmazó - • · · • · · · • · · · · • ·« · a • · · »·· ·· a · a· a 117 tenyésztő tápközegben szaporítjuk. The hybridoma cells thus created corresponding - to the inhibitor-containing preferably unfused multiply-set and survival of one or more substances - • • · · · · · · · · · • • · «in • · · ·» ·· ·· · · grown in a culture medium 117. Például, ha a kiindulási myelomasejtekből hiányzik hipoxanthin guanin foszforibozil transzferáz enzim (HGPRT vagy HPRT), a tenyésztésére hibridómák rendszerint hipoxanthint, aminopterint és timidint tartalmazó tápközeget (HAT-tápközeg) alkalmazunk, amely gátolja a HGPRT-deficiens sej-tek szaporodását. For example, if the parental myeloma cells lack the enzyme hypoxanthine guanine phosphoribosyl transferase (HGPRT or HPRT), the culture of the hybridomas typically hypoxanthine, aminopterin, and thymidine containing medium (HAT medium), which substances prevent the growth of HGPRT-deficient cells-tek. A fuzionáltatásra előnyösen olyan myelomasejteket al-kalmazunk, amelyek hatékonyan fuzionálhatok; The fusion of myeloma cells is preferably a sub-be employed for those that fuse efficiently; elősegítik akiválasztott antitest-termelő sejtek stabil és nagymértékűantitesz-termelését; akiválasztott promote antibody-producing cells, stable high-level production of antibody do; és valamely tápközegre (pl. HAT-tápközegre) érzékenyek. and a medium (eg. as HAT medium) are sensitive. Ezek közül előnyösen egéreredetűmyelomasejteket alkalmazunk; Among them, preferably used egéreredetűmyelomasejteket; ilyenek például a MOPC-21 ésMPC-11 egértumorokból származó sejtvonalak (Salk InstituteCell Diszribution Center, San Diego, Kalifornia, USA) és azSP-2 vagy X63-Ag8-653 sejtek (American Type CultureCollection, Rockville, Maryland, USA). such as cell lines derived from MOPC-21 ésMPC-11 mouse tumors (Salk InstituteCell Diszribution Center, San Diego, California, USA) and azSP-2 or X63-Ag8-653 cells (American Type CultureCollection, Rockville, Maryland, USA). Humán monoklonálisantitestek termelésére humán myelomasejtek és egér/humánheteromyelcmasejtek alkalmazását is leírták [ld. It described the use of human myeloma and mouse / human monoclonal antibody to produce humánheteromyelcmasejtek well [see Fig. Kozbor: J.Immunoi. Kozbor J.Immunoi. 133, 3001 (1984); 133, 3001 (1984); Brodeur és mtsai.; Brodeur et al .; MonoclonalAntibocy Production Techniques and Applications", 51-63.old., Karcéi Dekker, Inc., New York (1987)]. A zenyésztő tápközeget (amelyben a hibridómasejteketszaporítottuk) az antigén elleni monoklonális antitestektermelődésére vizsgáljuk. A hibridómasejtek által termeltmonokiorális antitestek kötési specifitását előnyösenimmunpreeipitécióval vagy in vitro kötődési teszttel - pl.radioimmun-teszttel (RIA) vagy enzimkötött immunszorbens - 118 - • ·« · • · · • · · vizsgálati eljárással (ELISA) - határozzuk meg. A monoklonális antitest kötési affinitása, például, aMunson és mtsai. [Anal. Biochem. 107, 220 (1980)] által le-irt Scatchard-analizissel határozható meg. A kívánt specifitású, affinitású és/vagy aktivitásúantitesteket termelő hibridómasejtek azonosítása után akiónokat limitáló hígítással szubklónozhatjuk és szokványoseljárásokkal szaporíthatjuk [ld. Goding: "MonoclonalAntibodies: Principles and MonoclonalAntibocy Production Techniques and Applications ", 51-63.old. Scratch Dekker, Inc., New York (1987)]. The zenyésztő medium (wherein the hibridómasejteketszaporítottuk) monoclonal antitestektermelődésére tested against the antigen. Termeltmonokiorális by hybridoma antibodies binding specificity előnyösenimmunpreeipitécióval or an in vitro binding assay - pl.radioimmun-assay (RIA) or enzyme-linked immunosorbent - 118 - • · «· • · • · assay (ELISA) - is determined by the monoclonal antibody has a binding affinity, e.g., aMunson et al. . define [Anal Biochem 107: 220. (1980).] by down-written Scatchard analysis of the desired specificity, affinity, and / or activity of antibodies after identifying generating hybridoma akiónokat be subcloned by limiting dilution and grown by szokványoseljárásokkal [Goding.. "MonoclonalAntibodies : Principles and Practice", 59-103. old.(Academic Press, 1986)]. Az e célra alkalmas tenyésztő táp-közegek példái közé tartozik a D-MEM és az RPMI-1640 tápkö-zeg. Practice ", pp. 59-103. (Academic Press, 1986)]. Examples of suitable culture media for this purpose include D-MEM or RPMI-1640 TAPKEN peat. Más módon, a hibridómasejtek hasűri tumorokként álla-tokban in vivő is szaporíthatok. Alternatively, the hybridoma ascites tumors grown in vivo can state claims. A szubklónok által kiválasztott monoklonális antites-teken előnyösen hagyományos immunglobulin-tisztítási tech-nikák (pl. protein-A Sepharose, hidroxilapatit-kromatográfia, gélelektroforézis, dialízis vagy affinitásikromatográfiai alkalmazásával választjuk el a tenyésztőtápkczegtől, hasűri folyadéktól vagy vérsavótól. A monoklonális antitesteket kódoló DNS-ek szokványoseljárásokkal egyszerűen izolálhatok és szekvenálhatók (pl.specifikusan az egéreredetű antitestek nehéz, ill. könnyűláncán kódoló génekhez hibridizáló oligonukleotid-próbákalkalmazásával). Az ilyen DNS-ek előnyös forrásáulhibridómasejtek szolgálnak. Izolálás után a DNS-texpressziős vektorokba inszertálhatjuk, és a vektorokkalgazdase'teken - pl. E. coli sejteket, majomeredetű COS-sejteken, kínai hörcsög petefészek (CHO) sejteket vagy • · · · - 119 - myelomasejteket (melyek egyébként immunglobulin-proteintnem termelnek) - transzferálhatunk, mi selected using secreted by the subclones monoclonal the antibodies bowling preferably conventional immunoglobulin purification tech NIKA (eg. a protein A-Sepharose, hydroxylapatite chromatography, gel electrophoresis, dialysis, or affinitásikromatográfiai the tenyésztőtápkczegtől, ascites fluid, or vérsavótól. DNA encoding the monoclonal antibodies s szokványoseljárásokkal readily isolated and sequenced (pl.specifikusan murine antibody heavy hybridizing to genes encoding or light chain oligonucleotide probe application of.) such DNAs preferred forrásáulhibridómasejtek serve Once isolated, the DNA texpressziős vectors and vektorokkalgazdase'teken.. - . eg, E. coli cells, simian COS cells, Chinese hamster ovary (CHO) cells, or • · · · - 119 - myeloma cells (which would otherwise produce immunoglobulin protein tnem) - transfected into what ltal a rekombinánsgazdasejtekben monoklonális antitestek termelődnek. Az an-titestet kódoló DNS baktériumokban rekombináns módszerek-kel történő előállítását illetően ld. rekombinánsgazdasejtekben usually drive the monoclonal antibodies are produced. The anti-titestet regarding its preparation by recombinant methods, see cabbage bacteria of DNA encoding. pl. eg. Skerra és mtsai.:Curr. Skerra and mtsai.:Curr. Opinion in Immunoi. Opinion in Immunol. _5, 256 (1993); _5, 256 (1993); Plückthun:Immunoi. Pluckthun: Immunol. Revs. Revs. 130, 151 (1992). 130, 151 (1992). Az antitestek rekombináns expresszáltatását az alábbiakban ismertetjük részletesen. The recombinant expression of antibodies are described in detail below. Más megvalósítási módokban az antitestek vagy anti-test-fragmensek a McCafferty és mtsai. In other embodiments, the antibodies or antibody fragments, fragments in McCafferty et al. [Natúré 348, 552(1990)3 által leírt technikák alkalmazásával létrehozottantitest-fágkönyvtárakból izolálhatok. using the techniques described [Nature 348, 552 (1990) 3 taken up by isolated from antibody phage libraries. Clarkson és mtsai.[Natúré 352, 624 (1991)] és Marks és mtsai. Clarkson et al. [Nature 352, 624 (1991)] and Marks et al. [J. [J. Mól. Mole. Bioi.222, 581 (1991)] egéreredetű, illetve humán antitestekfágkönyvtárak alkalmazásával történő izolálását írták le.Később ismertették a nagy (nM nagyságrendű) affinitású hu-mán antitestek lánc-kombinálással ("chain-shuffling") tör-ténő előállítását [ld. Isolation using Bioi.222, 581 (1991)], mouse and human antitestekfágkönyvtárak le.Később been disclosed the production of high affinity (nM range) affinity human antibodies by chain by combination ( "chain shuffling") [see Fig. Marks és mtsai.: Bio/Technology 10,779' (1992)]. Marks et al .: Bio / Technology 10.779 '(1992)]. Ezen túlmenően, a kombinatorikus infekciót ésin vivő rekombinációt, mint a nagyon nagyméretűiáqkönyvtárak előállításának stratégiáját írták le[Waterhouse és mtsai.: Nucl. Furthermore, combinatorial infection Esin vivo recombination as a strategy for the production of very nagyméretűiáqkönyvtárak described [Waterhouse et al .: Nucl. Acids Rés. Acids Res. 21, 2265 (1993)].Ilyenformán, ezek a technikák a monoklonális antitestekizolálásénak hagyományos hibridóma-technikáinak működőképes alternatívái. (1993)] 21, 2265th Thus, these techniques are monoclonal antitestekizolálásénak conventional hybridoma techniques are viable alternatives.

Az antitestet kódoló DNS, például, úgy módosítható,hogy a humán nehéz és könnyű lánc konstans dóménjeinekkódolőszekvenciájéval egéreredetű antitestek homológ szék- • ·« · - 120 - venciáit helyettesítjük [4 816 567 számú egyesült államok-beli szabadalmi leírás; DNA encoding the antibody, for example, be modified to murine constant dóménjeinekkódolőszekvenciájéval the human heavy and light chain is homologous to antibodies chair- • · «· - replacing sequences of states S. Patent [No. 4,816,567 united - 120; Morrison és mtsai.: Proc. Morrison et al .: Proc. Natl. Natl.

Acad. Acad. Sci. USA 81, 6851 (1984)], vagy az immunglobulin kódolószekvenciájához kovalens kötéssel egy nem immunglobu-lin-polipeptid kódolszekvenciájának egészét vagy részétkapcsoljuk. Sci. USA 81: 6851 (1984)], or to the immunoglobulin coding sequence covalently attached to a non-immunoglobulin polypeptide kódolszekvenciájának all or part coupled.

Az ilyen nem immunglobulin-polipeptidekkel rendszerintaz antitestek konstans doménjeit helyettesítjük, vagy másmódon, egy antitest egy antigén-kombinálódási helyének va-riábilis doménjeit helyettesítjük velük, hogy olyan biva-lens kiméra antitestet hozzunk létre, amely egy bizonyosantigénre specifikus antigén-kombinálódási helyet, valamintegy másik antigénre specifikus antigén-kombinálódási helyet tartalmaz. Typically such non-immunoglobulin polypeptides rendszerintaz antibody constant domains is replaced, or otherwise, an antibody, an antigen-combining site of v-riábilis domains they are substituted to generate antibodies are chimeric bivalent, a specific bizonyosantigénre antigen-combining site and another antigen containing specific antigen-combining site. (Ili; Humán antitestek A humán mohoklonális antitestek az elsőként Kohler és (III; Human antibodies Human antibodies mohoklonális the first and Kohler

Milstein által leírt hibridóma-eljérés adaptálásával, fúzi-ós partnerként humán 3-limfociták alkalmazásával állíthatókelő. described by Milstein hybridoma eljérés adaptation, fusions scintillation partner can be produced using three human lymphocytes. A kívánt antitestet termelő humán 3-limfociták, példá-ul - megfelelő tájékoztatás utáni beleegyező nyilatkozatmegszerzését követően - emberekből izolálhatok. The desired antibody-producing human lymphocytes with 3 Example-l - after obtaining informed consent after adequate information - isolated from humans. Például, akiválasztott személy autoantigén elleni antitesteket ter-melhet, ami bizonyos rendellenességek - például, szisztémáserythemás lupus [Shoenfeld és mtsai.: J. Clin. For example, antibodies against passenger akiválasztott autoantigen ter-Melheim that certain disorders - e.g., lupus szisztémáserythemás [Shoenfeld et al .: J. Clin. Invest. Invest. 70,205 (1932)j, immunközvetített trombocitopeniás purpura (!'??· [Xugent és mtsai.: Blood 70 (1), 16 (1987)] vagy rák - 121 .... . ” .· -·· • ··· ·» ··«· «· esetében tapasztalható. Más módon (vagy ezen túlmenően) , alimfociták in vitro immunizálására is lehetőség van. példá-ul, izolált humán perifériás vér limfocitákat in vitrolizomotrof hatóanyaggal (pl. L-leucin-O-metilészter, L-glutaminsav-dimetilészter vagy L-leucil-L-leucin-O- metilészter, ld. 5 567 610 számú egyesült államokbeli sza-badalmi leírás) érintkeztethetünk és/'vagy lecsökkentettszámú T-sejtet tartalmazó humán perifériás vér limfocitákatin vitro adjuvánsokkal, pl. 8-merkaptoguanozinnal éscitokinekkel kezelhetünk (5 229 275 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírás). 70.205 (1932) j, immune-mediated thrombocytopenic purpura ( '?? · [Xugent et al .: Blood 70 (1), 16 (1987)] or cancer - 121 .... "· -.. • ·· ·· · "··" · "· observed in the case. Alternatively (or additionally), alimfociták vitro immunization is also possible. Example-l, isolated from human peripheral blood lymphocytes in vitrolizomotrof agent (eg. L-leucine-O-methyl ester L-glutamic acid dimethyl ester or L-leucyl-L-leucine-O-methyl ester, Nos. 5,567,610 U.S. fron-badalmi description) contacted with and / 'or human peripheral blood containing a reduced number of T-cells limfocitákatin vitro with adjuvants, e.g. . 8 can be treated merkaptoguanozinnal éscitokinekkel (U.S. patent No. 5,229,275 U.S.).

Ezz követően a páciensből kinyert vagy in vitro immu-nizált 3-limfociták humán monoklonális antitest termelése céljából immortalizálhatók. Ezz recovered after the patient or in vitro immunized lymphocytes immortalized 3 for the production of human monoclonal antibodies. A B-limfociták immorta- lizálására alkalmas eljárások közé tartoznak, többek kö-zött, a következők: (a) humán B-limfocita humán, egérerede-tű myelomasejtekkel vagy egér-humán heteromyelomasejtekkelvégzett f uzionáltatása; B lymphocytes are those suitable immorta- lysing methods include, inter co-secured, the following: (a) human B-lymphocytes human egérerede needle myeloma or mouse-human heteromyelomasejtekkelvégzett f uzionáltatása; (b) virális transzformáció [pl.Zpstein-Barr vírussal; (B) viral transformation [pl.Zpstein-Barr virus; ld. ld. pl. eg. Nugent és mtsai.: Blood7C(1), 16 (1987)]; Nugent et al .: Blood7C (1), 16 (1987)]; (c) limfoblasztoid sejtvonallal végzett fuzionélzazás; (C) fuzionélzazás with lymphoblastoid cell line; és (c) limfomasejtekkel végzett fuzionálta- A limfociták - megfelelő fuzionáltató ágens (pl. poli-etílén-glikol) alkalmazásával - fuzionáltathatók amyelomasejtekhez, miáltal hibridómasejteket kapunk [Goding:"Monodénál Antibocies: Principles and Practice", 59-103.old., Academic Press (1986)]. and with (c) lymphoma cells fuzionálta- Lymphocytes - using a suitable fusing agent (such as polyethylene glycol.) - fused amyelomasejtekhez, a hybridoma was obtained [Goding, "Monodénál Antibocies: Principles and Practice", 59-103.old. Academic Press (1986)]. Az így létrehozotthibridómasejteket megfelelő - előnyösen a fuzionálatlan ki- ··«· «« - 122 - The létrehozotthibridómasejteket appropriate - preferably the unfused off ·· «·« «- 122 -

indulási myelomasejtek szaporodását és túlélését gátló egyvagy több anyagot tartalmazó - tenyésztő tápközegben szapo-rítjuk. comprising inhibiting the growth and survival of myeloma cells with one or more starting substance - culture medium propagating dehydrate. Például, ha a kiindulási myelomasejtekből hiányzika hipoxanthin guanin foszforibozil transzferáz enzim (HGPRT vagy HPRT), a hibridómák tenyésztésére rendszerinthipoxanthint, aminopterint és timidint tartalmazó tápköze-get (HAT-tápközeg) alkalmazunk, amely gátolja a HGPRT-deficiens sejtek szaporodását. For example, if the parental myeloma cells hiányzika hypoxanthine guanine phosphoribosyl transferase (HGPRT or HPRT), the rendszerinthipoxanthint culturing hybridomas, aminopterin, and thymidine containing tápköze-get (HAT medium), which substances prevent the growth of HGPRT-deficient cells. Az alkalmas humánmyelomasejtek és egér-humán heteromyeioma-sejtvonalak le-írását illetően ld. The write-down for humánmyelomasejtek heteromyeioma human and mouse cell lines regarding see. Kozbor; Kozbor; J. Immunoi. J. Immunol. 133, 3001 (1984); 133, 3001 (1984);

Brodeur és mtsai.: Monoclonal Antibody ProductionTechniques and Applications", 51-63. old., Marcel Dekker,Inc., New York (1987)]. A tenyésztő tápközeget (amelyben ahibridómasejteket szaporítottuk) az antigén ellenimonoklonális antitestek termelődésére vizsgáljuk. Ahibridómasejtek által termelt monoklonális antitestek köté-si specifizását előnyösen immunprecipitációval vagy ínvízre kötődési teszttel - pl. radieinmun-teszttel (RIA)vagy enzimkötött imir.unszorbens vizsgálati eljárással(PLISA) - határozzuk meg. A kívánt speciíitású, affinitást és/vagy aktivitásúantitesteket termelő hibridómasejtek azonosítása után aklórokat limitáló hígítással szubklónozhatjuk és szokványoseljárásokkal szaporíthatjuk [ld. Goding: "MonoclonalAntibodies: Prineiples and Practice", 59-103. old.{Aeadeir.ic Press, 1986·]. Az e célra alkalmas tenyésztő táp-közegek példái közé tartozik a D-MEM és az RPMI-1640 tápkö- zea. A szubklónok által Brodeur et al .: Monoclonal Antibody ProductionTechniques and Applications ", 51-63. P., Marcel Dekker, Inc., New York (1987)]. The culture medium (which ahibridómasejteket grown) ellenimonoklonális assayed for production of antibodies of the antigen. Produced by Ahibridómasejtek monoclonal antibodies Volume si specifizását preferably binding immunoprecipitation or ínvízre test. - such radieinmun-assay (RIA) or enzyme-linked imir.unszorbens assay (pLIS) - is determined by the desired speciíitású, affinity and / or identification activity antibody-producing hybridoma aklórokat limiting. subcloned by dilution and grown by szokványoseljárásokkal [Goding., "MonoclonalAntibodies: Prineiples and Practice".., pp 59-103 {Aeadeir.ic Press, 1986 ·]. examples of suitable culture media for this purpose include D-MEM and by RPMI-1640 tápkö- zea. the subclones kiválasztott monoklonális antites- ··«· antites- selected monoclonal ·· "·

- 123 - teket előnyösen hagyományos immunglobulin-tisztítási tech-nikák (pl. protein-A kromatográfia, gélelektroforézis, dia-lízis vagy affinitási kromatográfia) alkalmazásával vá-lasztjuk el a tenyésztő tápközegtől, hasűri folyadéktólvagy vérsavótól. - 123 - you preferably using conventional immunoglobulin purification tech NIKA (. For example, protein A chromatography, gel electrophoresis, affinity chromatography, or slide-lysis) vacuum separator in the culture medium, ascites folyadéktólvagy vérsavótól.

Humán antitestek nem humán gazda (pl. egér) alkalmazá-sával is létrehozhatók. Human antibodies can be generated in non-human host (eg. Mouse) application-track shape. Ahogy fentebb említettük, olyantranszgenikus állatok (pl. egerek) állnak rendelkezésre,amelyek immunizálást követően - endogén immunglobulin-termelődés nélkül - képesek a humán antitestek teljes re-pertoárjának termelésére. As mentioned above, olyantranszgenikus animals (. E.g., mice) are available that following immunization - are capable of producing human antibodies to full-repertoire - the absence of endogenous immunoglobulin production. Például, leírták, hogy kimérikusés esiravonal-mutáns egerekben az antitest nehéz lánc kap-csolódási régiójának (JH) génjében bekövetkezett homozigótadelécié az endogén antitest-termelődés teljes gátlásáteredményezi. For example, it has reported that homozigótadelécié kimérikusés esiravonal gene in mutant mice, the antibody heavy chain gets fracturing region (JH) of endogenous antibody production gátlásáteredményezi complete. A humán csíravonal-eredetű immunglobulin-génekilyen esiravonal-mutáns egerekbe történő bejuttatása - an-tigén-stimulus hatására - humán antitestek termelődéséteredményezi [Id. The human germline immunoglobulin genes introduced into such esiravonal mutant mice - an-donee-stimulus - human antibodies termelődéséteredményezi [Id. pl. eg. Jakobovits és mtsai.: Proc. Jakobovits et al .: Proc. Natl.Acac. Natl.Acac. Sói. Salts. USA 90, 2551 (1993); USA 90: 2551 (1993); Jakobovits és mtsai.: Jakobovits et al .:

Natúré 362, 255 (1993); Nature 362, 255 (1993); Bruggermann és mtsai.: Year inImmuno. Bruggermann et al .: Year inImmuno. 2' 33 (1993); 2 '33 (1993); és 5 591 669; and 5,591,669; 5 589 369 és 5 545 807számú egyesült államokbeli szabadalmi leírás]. U.S. Patent No. 5,589,369 and 5,545 807számú]. Humán anti-testeken SCID-hu egerek alkalmazásával is előállítottak[Duchosal és mtsai.: Natúré 355, 258 (1992)]. Human antibodies obtained also on using SCID-hu mice [Duchosal et al .: Nature 355, 258 (1992)].

Egy másik megvalósítási mód szerint a humán antitesthumán antitest fág-"display" könyvtárból szelektálható. In another embodiment, the human antibody is a human antibody selectable phage "display" libraries. Azantitestek vagy tragmensek könyvtárainak előállítása szak-ember számára jól ismert, és bármely ismert eljárás fel- - 124 - ···· használható a gazdasejtekbe bejuttatható transzformációsvektorok létrehozására. Preparation Azantitestek tragmensek or libraries of up to art-known people, and any known method - 124 - ···· introduced into suitable host cells transzformációsvektorok creation. A könnyű és nehéz antitest-láncokfágfelületen megjelenített könyvtárai [Huse és mtsai.:Science 246, 1275 (1989)] vagy fágban vagy fágemidben a fú- ziós proteinek könyvtárai jól ismert eljárások alkalmazásá-val állíthatók elő [ld. The light and heavy antibody láncokfágfelületen display libraries [Huse et mtsai.:Science 246, 1275 (1989)] or phage or phagemid libraries grass dimensional proteins well known application methods can be prepared with [ld. pl. eg. Vaughan és mtsai.: NatúréBiotechnology 14, 309 (1996); Vaughan et al .: NatúréBiotechnology 14, 309 (1996); Barbas és mtsai.: Proc. Barbas et al .: Proc. Natl. Natl.

Acad. Acad. Sci. USA 88, 7978 (1991); Sci. USA 88, 7978 (1991); Marks és mtsai.: J. Mól. Marks et al .: J. Mol.

Bioi. Biol. 222, 581 (1991); 222, 581 (1991); Hoogenboom és Winter: J. Mól. Hoogenboom and Winter, J. Mol. Bioi. Biol. 227, 381 (1992); 227, 381 (1992); Barbas és mtsai.: Proc. Barbas et al .: Proc. Natl. Natl. Acad. Acad. Sci. USA 89, 4457 (1992); Sci. USA 89, 4457 (1992); Griffiths és mtsai.: EMBO J. 13, 3245 (1994); Griffiths et al .: EMBO J. 13, 3245 (1994); de Kruif és mtsai.: J. Mól. de Kruif et al .: J. Mol. Bioi. Biol. 248, 97 (1995); 248: 97 (1995);

WO 98/05344, WO 98/15833, WO 97/47314, WO 97/44491, WO97/35196, WO 95/34648, WO 92/06176, WO 99/06587 és WO 97/08320 számú nemzetközi közzétételi iratok; WO 98/05344, WO 98/15833, WO 97/47314, WO 97/44491, WO97 / 35196, WO 95/34648, WO 92/06176, WO 99/06587 and WO 97/08320 WO documents; és 5 712 089,5 702 692, 5 427 908, 5 403 484, 5 432 018, 5 270 170, 5514 546 és 5 702 892 számú egyesült államokbeli szabadalmileírások. and U.S. Patent No. 5 712 089,5 702 692, 5,427,908, 5,403,484, 5,432,018, 5,270,170, 5,514 546 and 5,702,892. A célar.tigénhez kötődő fág-antitestek szelektálá-sa céljából a fág-könyvtárat a kérdéses antigén alkalmazá-séval· "panring''-szelekciónak vetjük alá. (Ív) Humanizált antitestek A nem humán antitestek humanizálás! eljárásainak le-írása az idevonatkozó szakirodalomban megtalálható. A huma-nizált antitest előnyösen egy vagy több, nem humán forrás-ból származó ami nosavat tartalmaz. Ezeket a nem humán ami- nosavakaz gyakran "import" aminosavaknak nevezzük, melyek 125 rendszerint egy "import" variábilis doménből származnak. Azantitestek humanizálását lényegében Winter és mtsai. eljá-rásával hajtjuk végre [Jones és mtsai.: Natúré 321, 522(1986); Riechmann és mtsai.: Natúré 332, 323 (1988); purpose of binding the célar.tigénhez phage antibodies selected, and the phage library was the antigen of interest is the application-Seval · "panring '' - is subjected to selection (iv) Humanized antibodies of non-human antibodies Methods for humanizing down-writing the relevant art.! can be found. the huma-gelatinised antibody is preferably derived from one or more non-human source from which contain amino acids occurs. These non-human amino nosavakaz often referred to as "import" residues, which are 125 typically taken from an "import" variable domain. Azantitestek humanization substantially Winter et al procedure is carried out, standard deviation [Jones et al .: Nature 321, 522 (1986). Riechmann et al .: Nature 332, (1988) 323;

Verhoyen és mtsai.: Science 239, 1534 (1988)], oly módon,hogy egy humán antitest megfelelő szekvenciáithipervariábilis szekvenciákkal helyettesítjük. Verhoeyen et al .: Science 239, 1534 (1988)], such that a human antibody are replaced by corresponding sequences szekvenciáithipervariábilis. Ennek megfe-lelően, az ilyen "humanizált" antitestek kiméra antitestek(ld. 4 816 567 számú egyesült államokbeli szabadalmi le-írás), amelyekben az antitest - teljes humán variábilisdoménnél lényegesen kisebb - része van helyettesítve egynem humán fajból származó, megfelelő szekvenciával. It corresponded, accordingly, such "humanized" antibodies are chimeric antibodies (U.S. Patent off-specification Nos 4,816,567.) Wherein the antibody - A human variábilisdoménnél substantially lower - portion is substituted by the corresponding sequence from the human species is a non. A gya-korlatban a humanizált antitestek rendszerint olyan humánantitestek, amelyekben a hipervariábilis régió néhány ami-r.osava - és esetleg a vázrégió (FR) néhány aminosava - rág-csálóeredetű antitestek analóg pozícióiból származó amino-savakkal van helyettesítve. In prac-tical, humanized antibodies are typically human antibodies in which the hypervariable regions some what-r.osava - and possibly in the framework region (FR) for some amino acids - is substituted by amino acids from chewing-csálóeredetű antibodies analogous positions within.

Az antigenitás csökkentése szempontjából nagy jelentő-sége van a humanizáló antitestek létrehozására alkalmazandó(nehéz és könnyű láncból származó) humán variábilis doménekkiválasztásénak. The reduction of antigenicity in terms of great importance are applicable to the humanization of antibodies to create (from heavy and light chain) human variable doménekkiválasztásénak. Az úgynevezett "legjobb egyezés" módszerszerint egy rágcsálóei'edetű antitest variábilis doménjénekszekvenciáját ismert humán variábilis domének szekvenciáittartalmazó teljes könyvtárral hasonlítjuk össze. The so-called "best-fit" method, according to an antibody variable rágcsálóei'edetű doménjénekszekvenciáját known human variable domains are screened against the entire library szekvenciáittartalmazó. A rágcsá-lóeredetű szekvenciával legközelebbi egyezést mutató humánszekvenciát a humanizált antitest humán vázénak fogadjuk el[Sims és mtsai.: J. Immunoi. human sequences closest to the murine equine sequence match indicator for the humanized antibody accepted as the human petrolatum [Sims et al .: J. Immunol. 151, 2296 (1993); 151, 2296 (1993); Chothia és mzsei.: J. Mól. Chothia mzsei .: J. Mol. 3iol. 3iol. 196, 901 (1987)]. 196: 901 (1987)]. Egy másik módszer - 126 - szerint az összes - egy bizonyos alcsoportba tartozó könnyű és nehéz láncot tartalmazó - humán antitest konszenzus-szekvenciájából származó vázrégiót alkalmazunk. Another method - 126 - by all - using human antibody FRs from the consensus sequence - light or heavy chain of a particular subgroup. Különbözőhumanizált antitestek esetében ugyanaz a vázrégió használ-ható [Carter és mtsai.: Proc. For Különbözőhumanizált antibodies same framework may be used, [Carter et al .: Proc. Natl. Natl. Acad. Acad. Sci. USA 89, 4285 (1992); Sci. USA 89: 4285 (1992); Presta és mtsai.: J. Immunoi. Presta et al .: J. Immunol. 151, 2623 (1993)]. 151, 2623 (1993)]. Lényeges továbbá, hogy az antitestek a humanizálástkövetően is megtartsák az antigénre vonatkozó affinitásukatés egyéb kedvező biológiai tulajdonságaikat. It is further important that antibodies against the antigen affinitásukatés maintain other favorable biological properties of humanizálástkövetően well. Ennek érdeké-ben, az egyik előnyös eljárás szerint, a humanizált anti-testeken a kiindulási szekvenciák és a különböző lehetséges humanizált termékek - háromdimenziós modellek felhasználá-sával végzett - analizálását követően állítjuk elő. As interested in, according to a preferred method, humanized antibodies on the parental sequences and various conceptual humanized products - is a process of analysis - with three-dimensional model used SAVAL. Az im-munglobulinok háromdimenziós modelljei széles körűen hozzá-férhetek és szakember számára jól ismertek. three dimensional models of the im-munglobulinok widely known to the art and to-get access. Számítógépesprogramok állnak rendelkezésre a kiválasztott lehetségesimmunglobulin-szekvenciák valószínű háromdimenziós konfor-mációs struktúráinak illusztrálására és megjelenítésére. Computer programs are available to selected sequences lehetségesimmunglobulin probable three-dimensional conformational structures illustrate and display. Azígy megjelenített struktúrák tanulmányozása elősegíti azegyes aminosavaknak a lehetséges immunglobulin-szekvenciaműködésében betöltött szerepének vizsgálatát, azaz a lehet-séges immunglobulin antigénhez kötődő képességét befolyáso-ló aminosavak vizsgálatát. Studying precipitate which is thus facilitates analysis of structures displayed azegyes amino acids in the potential role of immunoglobulin sequences in the operation, ie the ability of the candidate immunoglobulin antigen-binding amino acids have influenced horse-examination. Ezen a módon kiválaszthatók avázrégió aminosavai, és a recipiens és import szekvenciák-ból ügy kombinálhatok, hogy a kívánt antitest-tulajdonságokat (pl. a célantigén(ek)re vonatkozó fokozottaffinitás) kapjuk. In this manner you can be selected avázrégió residues and sequences from the recipient and import can be combined to produce the desired antibody characteristics (eg. Fokozottaffinitás for the target antigen (s)) is obtained. A hipervariábilis régió aminosavai álta-lában közvetlenül és jelentős mértékben játszanak szerepet • · · • «· ·* ··• · · · · • · · · · · • · · • · ···· ·· - 127 - az antigénkötés befolyásolásában. The hypervariable region residues normally offers, directly and substantially involved · • · • «* ·· • · · · · · · · · · · · • · • · • · ···· ·· - 127 - antigen binding influencing. (v) Antitest-fragmensek (V) Antibody fragments

Az antitest-fragmensek előállítására különféle techni-kákat fejlesztettek ki. The production of antibody fragments various techniques have been developed. Ezek a fragmensek hagyományosan in-takt antitestek proteolitikus emésztésével hozhatók létre[ld. Traditionally, these fragments can be generated in-takt proteolytic digestion of antibodies [see Fig. Morimoto és mtsai.: Journal of Biochemical and Morimoto et al .: Journal of Biochemical and

Biophysical Methods 24, 107 (1992); Biophysical Methods 24: 107 (1992); és Brennan és mtsai.:Science 229, 81 (1985)], azonban ezek a fragmensek rekombináns gazdasejtek alkalmazásával közvetlenül is elő-állíthatok. and Brennan mtsai.:Science 229, 81 (1985)], however, these fragments adjuster can be produced directly by recombinant host cells. Például, az antitest-fragmensek a fentebb leírtantitest fág-könyvtárakból izolálhatok. For example, the antibody fragments can be leírtantitest above be isolated from phage libraries. Más módon, a Fab'-SH fragmensek E. coli-ból közvetlenül kinyerhetők, és kémi-ai kapcsolással F (ab' ) 2-fragmensekké alakíthatók [Carter ésmtsai.: 3ic,/Technology 10, 163 (1992)]. Alternatively, Fab'-SH fragments can be directly recovered, and chemical-i coupling can be converted to E. coli F (ab ') 2 fragments [Carter ésmtsai .: 3ic, / Technology 10: 163 (1992)]. Egy másik lehetőség szerint az F (ab')2-fragmensek közvetlenül rekombináns gaz-dasejt-tenvészetből izolálhatok. Alternatively, F (ab ') 2 fragments can be isolated directly from recombinant host cell-tenvészetből. Az antitest-fragmensekelőállításénak egyéb technikái szakember számára jól ismer-tek. The antibody fragmensekelőállításénak other techniques well are known in the art. Más megvalósítási módokban a kiválasztott antitestegyláncú Fv-fragmens (scFv); In other embodiments, the antibody of choice is a single chain Fv fragment (scFv); ld. ld. WO 93/16185 számú nemzet-közi közzétételi irat; No. WO 93/16185 discloses inter-nations; valamint 5 571 894 és 5 587 458 szá-mú egyesült államokbeli szabadalmi leírás. and U.S. Patent No. 587,458 Ref-containing 5,571,894 and fifth Az antitest-fragmens lehet "lineáris antitest" is (ld. pl. 5 641 870számú egyesült államokbeli szabadalmi leírás). The antibody fragment may also be a "linear antibody", (eg. U.S. Patent No. 5,641 870számú ld.). A lineárisantitest-fragmensek monospecifikusak vagy bispecifikusak lehetnek. Such linear antibody fragments may be monospecific or bispecific. 128 (vi) Módosított aminosav-szekvenciájú antitest- változatok A találmány tárgyához tartoznak a találmány szerintiantitestek módosított aminosav-szekvenciájú változatai is.Például, kívánatos lehet az antitest kötési affinitásánakés/vagy egyéb biológiai tulajdonságainak javítása. 128 (vi) the amino acid sequence of antibody variants within the scope of the invention szerintiantitestek amino acid sequence variants is.Például modified, it may be desirable for the antibody binding affinitásánakés / or other biological properties of repair. A talál-mány szerinti antitest aminosav-szekvencia változatait úgyhozhatjuk létre, hogy az antitestet kódoló nukleinsavbamegfelelő nukleotid-módosításokat iktatunk be, vagy más mó-don, peotidszintézist hajtunk végre. úgyhozhatjuk an antibody of the detection ranges are amino acid sequence variants by inserting nukleinsavbamegfelelő nucleotide changes coding for the antibody, or by adding a base peotidszintézist performed. Az ilyen módosításokközé tartoznak az antitest aminosav-szekvencíáját érintődeléciók és/vagy inszerciók és/vagy szubsztitúciók. Such modifications include the antibody amino acid sequence érintődeléciók and / or insertions and / or substitutions. A végsőkonstrukció létrehozása céljából a deléciók, inszerciók ésszubsztitúciók bármely kombinációja alkalmazható, feltéve,hogy a végtermék a kívánt tulajdonságokkal bír. to form the final construction of deletions, insertions ésszubsztitúciók any combination can be used provided that the final construct possesses the desired characteristics. Az amino-sav-változtatások módosíthatják az antitest poszt-transzlációs érési folyamatait is (pl. a glikozilációs he-lyek számának vagy pozíciójának változtatásával) . The amino acid changes also may alter the antibody post-translational maturation processes (eg. Glycosylation he ulcers of varying the number or position). Az ilyenmódosítások a kiindulási antitestben és/vagy többértékű an-titestben hajthatók végre, és/vagy a többértékű antitestam.inosav-szekvenciájába a szekvencia előállításakor iktat- Such modifications in the parent antibody and / or multivalent antibodies can be made and / or polyhydric antitestam.inosav-sequence of the sequence production of iktat-

Az antitest - mutagenezis helyszíneként előnyös - ami-ncsavai vagy régiói azonosításának egyik hasznos eljárásaaz "aisrin-pásztázési mutagenezis" néven ismert technikaild. Antibody - preferred locations for mutagenesis - which ncsavai-regions or identifying a useful eljárásaaz known as "aisrin-pásztázési mutagenesis" technikaild. Cttnningham és Wells: Science 244, 1081 (1989) ] . Cttnningham and Wells, Science 244, 1081 (1989)]. Ezeneljárás szerint azonosítunk egy aminosavat vagy ···· · · ·» · · identified a single amino acid or ···· According to this Procedure · · · »· ·

129 célaminosavak csoportját (pl. töltéssel bíró aminosavak,pl. Arg, Asp, His, Lys és Glu), és ez (eke) t semleges vagynegatív töltésű aminosavval (legelőnyösebben alaninnal vagypolialaninnal) helyettesítjük, abból a célból, hogy befo-lyásoljuk az aminosavak és az antigén közötti kölcsönha-tást. 129 group of target (ie. Amino acids, charged e. Arg, Asp, His, Lys, and Glu) and that (s) replaced by a neutral or negatively charged amino acid (most preferably alanine vagypolialaninnal), in order to before-lyásoljuk amino acids and the interaction between antigen-Taste. A szubsztitúcióra funkcionális érzékenységet mutatóaminosav-pozíciók meghatározását ezután úgy finomíthatjuk,hogy a szubsztitúció helyén vagy annak közelében újabb vagyegyéb mutációkat hozunk létre. The substitution determination showing functional sensitivity to the amino acid positions are then are refined by introducing further or other mutations at or near the point of substitution. Ilyenformán, bár az amino-sav-módosítások helye előre meghatározott, a mutáció termé-szete önmagában nem előre meghatározott. Thus, while the site for amino acid sequence variation is predetermined, the mutation-section through this alone is not predetermined. Például, az adotthelyen végrehajtott mutáció eredményének vizsgálata céljá-ból a célkodonnál vagy célrégióban alanin-pásztázást vagyráncom mutagenezist végzünk, és az expresszált többértékűanzitesteket a kívánz aktivitásra szelektáljuk. For example, the purpose from the examination carried out at the site of mutation performed vagyráncom ala scanning mutagenesis the target codon or region and the expressed többértékűanzitesteket kívánz the selected activity.

Az aminosav-szekvencia inszerciói lehetnek N- és/vagyC-termir.ális fúziók, amelyek egy aminosavtól száz vagy mégtöbb aminosav hosszúságig terjedő polipeptid aminosav-szekvenciéhoz történő hozzákapcsolását jelentik, illetveegy vagy tcbb aminosavas, szekvencián belüli inszerciók le-hetnek. Amino acid sequence insertions include amino and / or C-termir.ális fusions, which are the coupling of the polypeptide to a length of one amino acid from amino acid szekvenciéhoz More hundred or amino acid, or illetveegy tcbb amino acid, insertions within the sequence may be. A terminális inszerciók példái közé tartoznak az N-termináiis metionint tartalmazó antitestek, a citotoxikuspolipeptidhez fuzionált antitestek, továbbá az antitest N-vagy C-terminálisának enzimhez (pl. ADEPT) vagy olyanpolipeptidhez törzénő fuzionáltatása, amely fokozza az an-titest vérsavóban mérhető felezési idejét. The terminal insertions include antibody with an N-terminus methionine fused to the citotoxikuspolipeptidhez antibodies, and the antibody is N-or C-terminus of the enzyme (e. For ADEPT) or olyanpolipeptidhez törzénő fusing to enhance the antibody serum half-life.

Az aminosav-szekvencia változatok egy másik típusátrcrrozerzil-ák az aminosav-szubsztirúciós változatok, ame- - 130 - lyekben az antitest-molekula legalább egy aminosava egy má-sik aminosavval van helyettesítve. Amino acid sequence variants of another típusátrcrrozerzil-Inde szubsztirúciós amino acid variants TSI - 130 - monographs one amino acid residue is substituted with another amino acid for at least the antibody molecule. Az antitest szubsztitú-ciós mutagenezisének legnagyobb jelentőségű pontjai ahipervariábilis régiók, de a vázrégióban végrehajtottszubsztitúciók is jelentős hatásúak lehetnek. tion of greatest interest for substitution mutagenesis of the antibody ahipervariábilis regions, but framework region végrehajtottszubsztitúciók are also contemplated. A konzervatívszubsztitúciókat az 1. táblázat "előnyös szubsztitúciók"oszlopában mutatjuk be. The konzervatívszubsztitúciókat are shown in Table 1. "preferred substitutions". Ha ezek a helyettesítések a bioló-giai aktivitás megváltozását eredményezik, úgy további, je-lentősebb szubsztitúciós módosításokat végezhetünk, melye-ket az 1. táblázat "lehetséges szubsztitúciók" oszlopában(illetve, később, az aminosavak csoportosítása kapcsán) mu-tatunk be, és az így létrehozott változatokat szkríneljük. If such substitutions result in a change in Biola, Giai activity, then it can further je-lentősebb substitution amendments which discs are shown in Table 1. "exemplary substitutions" in column (and, later, in connection with the grouping of amino acids) mu-Tatum in and We screened for variants thus generated. • · · - 131 - 1. táblázat • · · - 131 - Table 1

Eredeti aminosav Lehetséges szubsztitúciók Előnyös szubsztitúciók Alá (A) Val, Leu, Ile Val Arg (R) Lys, Gin, Asn Lys Asn (N) Gin, His, Asp, Lys, Arg Gin Asp (D) Glu, Asn Glu Cys <C) Ser, Alá Ser Gin ÍQ) Asn, Glu Asn Glu IP) Asp, Gin Asp Gly () Alá Alá His 1 -- / Asn, Gin, Lys, Arg Arg Ile - \ \ t Leu, Val, Met, Alá, Phe, norleucin Leu Lee Norleucin, Ile, Val, Met, Alá, Phe Ile Lys ÍK) Arg, Gin, Asn Arg Met / V \ Leu, Phe, Ile Leu Phe Leu, Val, Ile, Alá, Tyr Tyr Pro - k Alá Alá Ser / - 1 k »- í Thr Thr Thr Ser Ser Trp k "ti í Tyr, Phe Tyr Tyr V 1 \ Trp, Phe, Thr, Ser Phe Val / VT t \ *· ΐ; Ile, Leu, Met, Phe, Alá, norleucin Leu « « ······ ·· ··· ··· · ······· · ·· · • ··· · * ··«· ·« - 132 - Original amino acid Possible Substitutions Preferred Substitutions Ala (A) Val, Leu, Ile Val Arg (R) Lys, Gln, Asn Lys Asn (N) Gln, His, Asp, Lys, Arg Gln Asp (D) Glu, Asn Glu Cys < C) Ser, Ala Ser Gln ∫ Q) Asn, Glu Asn Glu IP) Asp, Gln Asp Gly () falling His 1 - / Asn, Gln, Lys, Arg Arg Ile - \ \ t Leu, Val, Met, Ala , Phe, norleucine Leu Lee norleucine, Ile, Val, Met, Ala, Phe Ile Lys Ik) Arg, Gln, Asn Arg Met / V \ Leu, Phe, Ile Leu Phe Leu, Val, Ile, Ala, Tyr Tyr Pro - k Falling Ser / - 1 k »- t Thr Thr Thr Ser Ser Trp k 'ti t Tyr, Phe Tyr Tyr V1 \ Trp, Phe, Thr, Ser Phe Val / VT t \ * · ΐ, Ile, Leu, Met, Phe, Ala, Leu, norleucine «« ······ ··· ··· ·· ·· · · · ······· • ··· ·· · * "·" - 132 -

Az antitestek biológiai tulajdonságai szempontjábóllényeges módosítások úgy valósíthatók meg, hogy kiválaszt-juk azokat a szubsztitúciókat, amelyek a következők tekin-tetében jelentős mértékben különböznek az eredeti aminosav-tól: (a) a szubsztitúció közelében a polipeptid-váz szerke-zetének fenntartásában (pl. redős vagy helikális konformá-ció) ; Biological properties of antibodies relevant to the changes may be implemented to select-coat them by the substitutions that differ significantly from the following view, the top of the original amino acid from: (a) the area of ​​the substitution in the polypeptide backbone structures of maintaining (eg. sheet or helical conformation tion); (b) a molekula célhelyén a töltés és hidrofóbitás fenntartásában; (B) the target site of the molecule in the charge and hydrophobicity maintaining; vagy (c) az oldallánc fizikai kiterjedésé-nek fenntartásában. or (c) the physical dimension has the side chain maintaining. A természetben előforduló aminosavakat - oldalláncaik tulajdonságai alapján - a következő csopor-tokba soroljuk: (1) hidrofób: norleucin, Met, Alá, Val, Leu, Ile; The naturally occurring amino acids - are listed in the following group holster - based side-chain properties: (1) hydrophobic: norleucine, Met, Ala, Val, Leu, Ile; (2) semleges, hidrofil: Cys, Ser, Thr; (2) neutral hydrophilic: Cys, Ser, Thr; (3) savas: Asp, Glu; (3) acidic: Asp, Glu; (4) bázisos: Asn, Gin, His, Lys, Arg; (4) basic: Asn, Gln, His, Lys, Arg; (5) láncorientációt befolyásoló aminosavak: Gly, Pro; influencing (5) láncorientációt amino acids: Gly, Pro; (6) aromás: Trp, Tyr, Phe. (6) aromatic: Trp, Tyr, Phe. A nem konzervatív szubsztitúció azt jelenti, hogy az egyik csoportba tartozó aminosav egy másik csoportba tarto-zó amincsawal van helyettesítve. Non-conservative substitutions means that the amino acid of one class is replaced with amincsawal belonging to another group.

Az antitest pontos konformációjának fenntartásábanszerepet nem játszó ciszteinek szintén helyettesíthetők(általában szerinnel), ami növeli a molekula oxidatív sta-bilitását, és megakadályozza a rendellenes keresztkötés-képzést. The non-involved in maintaining the proper conformation of the antibody also may be substituted cysteines (typically serine), which increases the molecular oxidative stabilizing potty bag and prevent aberrant crosslinking formation. Ezzel szemben, az antitest stabilitásának növelése érdekében cisztein-kötések iktathatok be. Conversely, to increase the stability of the antibody may be introduces cysteine ​​bonds. A szubsztitúciós változatok egy különösen előnyös tí-pusa az eredeti antitest (pl. humanizált vagy humán anti- • ·· · » « ······ • · ··· ··· · ····«·· · · · ·• ··· ·« ···· ·* - 133 - test) hipervariábilis régiója egy vagy több aminosavánakszubsztitúcióját foglalja magában. Substitutional variants of a particularly preferred type of marker of the original antibody (e. A humanized or human anti • ·· · »« • ······ · · ··· ··· ···· "·· · · · · · · · • · '···· · * - 133 - body) hypervariable region comprises one or more aminosavánakszubsztitúcióját itself. A további javításra ki-választott változat(ok) az eredeti antitesthez képest javí-tott biológiai tulajdonságú(ak) lesz(nek). A further improvement out selected version (s) to promoters to enhance biological properties (k) is compared to the original antibody (s). Az ilyen szubsz-titúciós változatok létrehozásának egyik alkalmas módja afágfelületen történő megjelenítéssel végzett affinitás-fejlesztés. Such substituents acid substitution variants of creating a suitable way out display affinity to afágfelületen development. Röviden összefoglalva; Briefly a hipervariábilis régiótöbb helyén (pl. 6-7 helyen) mutagenézist végzünk, hogymindegyik helyen valamennyi lehetséges aminosav-szubsztitúciót létrehozzuk. the several hypervariable region sites (eg. 6-7 sites) are mutated to each location generate all possible amino acid substitutions. Az így kapott többértékű anti-testeken külön-külön, fonalas fágrészecskéken az M13fágrészecskékbe csomagolt - III. The resulting multivalent anti-bodies separate from filamentous phage particles in the packaged M13fágrészecskékbe - III. géntermékével képzett fú-ziós proteinekként jelenítjük meg. lists qualified gene product blow-dimensional protein as such. A fágon megjelenítettváltozatokat biológiai aktivitásukra (pl. kötési affinitá-sukra) teszteljük. displayed variants are tested for their biological activity (eg. binding affinities-Sukran) The phage. A hipervariábilis régió módosításra al-kalmas helyeinek azonosítása céljából alanin-pásztázásimutagenezist végezhetünk, amellyel meghatározható, hogy ahipervariábilis régió mely aminosavai járulnak hozzá jelen-tős mértékben az antigénkötéshez. alanine can be performed to identify pásztázásimutagenezist immensely modified sub-sites in the hypervariable regions, for determining whether ahipervariábilis region residues which contribute to antigen binding present -Tos extent. Más módon, vagy e mel-lett, at antitest és az antigén közötti érintkezési pontokazonosítása céljából előnyös lehet az antigén-antitestkomplex kristályszerkezetének vizsgálata. Alternatively, or e-mel was, at an antibody and may be advantageous to examine the antigen-antibody complex to identify contact points between the purpose of the antigen. Az ilyen érintke-zési (kontakt) aminosavak és az ezekkel szomszédos aminosa-vak a szóban forgó technikával végzett szubsztitúcióra ki-szemelt aminosavakat reprezentálják. Such contact of-life (contact) amino acids, and neighboring amino acids represent substitution made out of amino acids-picked the technique in question. Az ilyen változatok létrehozása után a változatok sorozatát az itt ismertetett módon szkrineljük, és további fejlesztésre az egy vagy többreleváns tesztben kimagasló tulajdonságúnak bizonyuló anti- - 134 - testeket választjuk ki. After making such variants panel of variants is subjected to screening as described herein, and further improvement of one or többreleváns tests an excellent properties in anti - is selected from the antibodies - 134th

Az aminosav-szubsztitúciók egy másik típusa a antitest eredeti glikozilációs módjának módosítására szolgál. The amino acid substitutions is another type of antibody is used to modify the original glycosylation pattern. Ez az antitest egy vagy több szénhidrát-gyökének deletálásával, és/vagy egy vagy több - a polipeptidben eredetileg nem lévő - glikozilációs hely hozzáadásával érhető el. This antibody is a carbohydrate moiety or more of deleting and / or one or more - can be achieved by adding glycosylation sites - not present in the polypeptide.

Az antitestek glikozilációja jellemzően N- vagy 0-kötésű. Glycosylation of antibodies is typically N-or 0-linked. Az "N-kötésű" azt jelenti, hogy a szénhidrát-gyökaszparaginsav oldalláncához kapcsolódik. The term "N-linked" means that the carbohydrate gyökaszparaginsav linked side chain. A szénhidrát-gyökaszparagin-oldallánchoz történő enzimatikus kapcsolásánakfelismerési helyéül az aszparagin-X-szerin és aszparagin-X-treonin rripeptid-szekvenciák (amelyekben "X" jelentése - aprolin kivételével - tetszőleges amínosav) szolgálnak.Ilyenformán, az antitestekben az ilyen tripeptid-szekvenciák jelenléte potenciális glikozilációs helyet te-remt. Enzymatic on the carbohydrate gyökaszparagin side chain attachment of a recognition site for asparagine-X-serine and asparagine-X-threonine rripeptid sequences (where "X" is - aprolin exception - any amino acid) szolgálnak.Ilyenformán, the presence of either of these tripeptide sequences in antibodies potential glycosylation sites, you will be financed. Az "O-kötésű" glikoziláció azt jelenti, hogy az N-acetil-galaktózamin, galaktóz vagy xilóz valamelyikehidroxi-aminosavhoz (többnyire szerinhez vagy treoninhoz)kötődik, bér 5-hidroxiprolin vagy 5-hitíroxilizin is alkal-mazható . "O-linked" glycosylation means that the N-acetylgalactosamine, galactose or xylose valamelyikehidroxi-amino acid (most commonly serine or threonine) is bound to pay 5-hydroxyproline or 5-hitíroxilizin also can be employed.

Ezenfelül, a glikozilációs helyek úgy is létrehozha-tók, hogy - N-kötésű glikoziláció esetén - a polipeptid afenti tripeptid-szekvenciák közül egyet vagy többet tartal-mazzon, illetve - O-kötésű glikoziláció esetén - aglikozilációs helyek egy vagy több szerín vagy treonin ad-díciójával vagy behelyettesítésével hozhatók létre. In addition, the glycosylation sites may also létrehozha improver, and that - in case of N-linked glycosylation - one or more of the polypeptide by subjecting the above tripeptide sequences comprise glaze or - in case of O-linked glycosylation - aglikozilációs places one or more serine or threonine gives -díciójával create or substitution.

Az antitest aminosav-szekvencia változatait kódoló nukleinsav-molekulák különféle, szakember számára jól is- • ·· · - 135 - mert eljárásokkal állítható elő. encoding the antibody amino acid sequence variants of the nucleic acid molecules are different, the skilled person are well documented • · ·· - 135 - as can be produced by methods. Az ilyen módszerek közétartozik, többek között, a természetes forrásból történő izolálás (természetben előforduló aminosav-szekvencia vál-tozatok esetében), valamint az antitest korábban előállí-tott, variáns vagy nem variáns változatának oligonukleotid-közvetítette (vagy helyspecifikus) mutagenezise, PCR-mutagenezise vagy kazetta-mutagenezise. Such methods include, inter alia, isolation from a natural sources (naturally occurring amino acid sequence for Rep-tozatok) and the antibodies previously produced, to, variant or non-variant version of oligonucleotide-mediated (or site-directed) mutagenesis, PCR mutagenesis or cassette mutagenesis. A találmány szerinti antitestet effektor-funkciója vo-natkozásában is módosíthatjuk, pl. The antibody of the invention to change the effector function of vo-natkozásában, e. antigén-dependenssejtközvetítette citotoxicitásának (ADCC) és/vagy komple-ment-dependens citotoxicitásának (CDC) növelése céljából.Ez úgy hajtható végre, hogy az antitest Fc-régiójába egyvagy több aminosav-módosítást iktatunk be, ezáltal módosí-tott Ec-régiót létrehozva. Increasing antigen dependenssejtközvetítette cytotoxicity (ADCC) and / or complexes did dependent cytotoxicity (CDC) céljából.Ez may be accomplished by inserting the antibody Fc region of one or more amino acid modifications, thereby creating a modified-to Ec region. A módosított Fc-régió humán Fc-régió szekvenciájú lehet (pl. humán IgGl, IgG2, IgG3 vagylgG4 Fc-régió), amely egy vagy több aminosav-pozícióbanaminosav-módosítást (pl. szubsztitúciót) tartalmaz. The Fc region may be a modified human Fc region sequence (eg. A human IgGl, IgG2, IgG3 vagylgG4 Fc region) comprising one or more amino acid position the amino acid alteration (eg. Substitutions). A találmány egyik megvalósítási módja szerint a módo-sított Fc-régió humán effektor-sejtek jelenlétében hatáso-sabban közvetít antitest-dependens sejtközvetítettecizotoxicitást (ADCC-t), vagy nagyobb affinitással kötődikFc-gamma-receptorhoz (FcyR), mint egy natív szekvenciájúFc-régió. In one embodiment of the invention, the modified-linked Fc region the presence of human effector cells effect precisely, mediates antibody-dependent sejtközvetítettecizotoxicitást (ADCC) or greater affinity kötődikFc-gamma receptor (FcyR), such as a native szekvenciájúFc region . Az ilyen Fc-régió-változatok az Fc-régió 256., 230., 238., 312., 326., 33Ő., 333., 334., 360., 378. és 430. aminosav-pozíciói bármelyikében egy vagy több amino-sav-mócosífást tartalmazhatnak (az Fc-régió aminosavainak számozása a Rabat féle Eü-index szerint). Such Fc region variants of the Fc region 256, 230, 238, 312, 326, 33o. 333, 334, 360, 378 and 430th amino acid positions in any of one or more amino acid mócosífást may contain (as an Fc region, wherein the numbering of Rabat kinds EU index).

Az Fcy-receptorhoz csökkent affinitással kötődő Fc- • · - 136 - • «· · « ··· ··· • · · · · · • ·· · ·· ···· régió-változat az Fc-régió következő pozíciói közül egynélvagy többnél tartalmaz aminosav-módosítást: 238., 239., 248 ., 249. , 252., 254., 265., 268., 269., 270., 272., 278 • ! The Fc receptor binds reduced affinity for Fc • · - 136 - • «·" · · · · · · · · · · • · • · ·· ·· ···· region positions for the next version of the Fc region among egynélvagy comprises amino acid modifications count is:. 238, 239, 248, 249, 252, 254, 265, 268, 269, 270, 272, 278 •! 289., 292. , 293., 294., 295. , 296., 298., 301., 303., 322 • r 324 ., 327. , 329., 333., 335., 338. , 340., 373., 376., 382 • t 388 ., 389. , 414., 416. , 419. , 434 . 289, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 301, 303, 322 • 324 r., 327, 329, 333, 335, 338, 340th , 373, 376, 382 • t 388,. 389, 414, 416, 419, 434th , 435 ., 437., 438. és 439. (az Fc-régió aminosavainak számozása a Kábát féle EU- index szerint). , 435,. 437, 438 and 439 (the Fc region, wherein the numbering according to the EU index of Kabat). Például, az Fc-régió-változat az FcyRI-hez csökkentmértékben kötődhet, és az Fc-régió 238., 265., 269., 270.,327. For example, the Fc variants can bind to reduced levels of FcyRI and Fc region of 238, 265, 269, 270, 327th és 329. aminosav-pozíciói bármelyikében egy vagy többaminosav-módosítást tartalmazhatnak (az Fc-régió aminosava-inak számozása a Kábát féle EU-index szerint). and 329 amino acid positions can contain one or more amino acid modifications in any of (According to the Fc region of amino acid-numbering of Kabat EU index).

Az Fc-régió-változat csökkent mértékben kötődhet azFcyRII-höz, és az Fc-régió 238., 265., 269., 270., 292., 294., 295., 298., 303., 324., 327., 329., 333., 335., 338., 373., 376., 414., 416., 419., 435., 438. vagy 439. pozíció-iban lévő aminosavak közül egyet vagy többet érintő módosí-tás (oka) t hordozhat (az Fc-régió aminosavainak számozása a Kábát féle EU-index szerint). The Fc region variant have reduced azFcyRII bind to, and the Fc region of 238, 265, 269, 270, 292, 294, 295, 298, 303, 324, 327th , modified-Tas of the amino acid residues 329, 333, 335, 338, 373, 376, 414, 416, 419, 435, 438 or 439 positions, affecting one or more of the time ( s) may have (according to the Fc region, wherein the numbering of Kabat EU index).

Az FeyRIII-h ez csökkent mértékben kötődő Fc- régió- változat az Fc-ré tiő 238., 2 39., 248., 249., 252., 254. , 265., 268., 269., 2"0., 272., 278., 289., 293., 294., 295., 296., 301., 303., 322., 327., 329., 338., 340., 373., 376., 382., 388., 389., 416., 434., 435. és 437 . pozícióiban lévő aminosavak közül egyet vagy többet érintő módosítás(oka)t hordozhat (az Fc-régió aminosavainak számozása a Kábát féle EU-index szerint). «<·· ···« «« ·· »· ····♦···· ·«· · ···• · · ·• ··· *· ··«· ·* - 137 - The FeyRIII-h is reduced the binding to Fc-region- variant of Fc is via 238, 2 39, 248, 249, 252, 254, 265, 268, 269, 2 "0th , 272, 278, 289, 293, 294, 295, 296, 301, 303, 322, 327, 329, 338, 340, 373, 376, 382 ., from amino acids in the 388, 389, 416, 434, 435 and 437th positions of change involving one or more (s) you may have (according to the Fc region, wherein the numbering of Kabat EU index). " <··· ·· «« «··» · · ···· ···· ♦ "· · · · · · · · • · · · • · * ··« · * - 137 -

Egy további megvalósítási mód szerint az Fc-régió- változat javított kötődést mutat az FcyR-hez, és az Fc- régió következő aminosav-pozícióiban lévő aminosavak közül egyet vagy többet érintő módosítás(oka) t hordoz: 255., 256. , 258. , 267. , 268., 272., 276., 280., 283., 285., 286., 290. , 298. , 301. , 305., 307., 309., 312., 315., 320., 322., 326. , 330., 331., 333., 334., 337., 340., 360., 378., 398. és 430. (az Fc-régió aminosavainak számozása a Kábát féle EU-index szerint). In another embodiment, the Fc region-variant exhibits improved binding to the FcyR and modification at any one or more of the amino acids of the following amino acid positions of the Fc region (s) of carrier: 255, 256th, 258th , 267, 268, 272, 276, 280, 283, 285, 286, 290, 298, 301, 305, 307, 309, 312, 315, 320 ., 322, 326, 330, 331, 333, 334, 337, 340, 360, 378, 398 and 430 (the Fc region, wherein the numbering of Kabat EU index according to). Például, az FcyR-kötődési aktivitásában javított vál-tozat fokozott mértékben kötődhet az FcyRIII-hoz, és ezen-felül - adott esetben - csökkent mértékben kötődhet az For example, improved Fc? R binding activity vál-A version of the increasingly bind FcyRIII, and this overrides - if appropriate - can bind to reduced levels of

FcyRII-höz. FcyRII. Például, az ilyen polipeptid-változat az Fc-régió 298. és/vagy 333. pozíciójában hordoz aminosav-módosítést (az Fc-régió aminosavainak számozása a Kábát fé-le Eü-ir.dex szerint). For example, such a variant módosítést substituted amino acid of the Fc region 298 and / or position 333 (the Fc region, wherein the numbering according to the Kabat EU-le fer ir.dex).

Az FcyRII-receptorhoz fokozott mértékben kötődő Fc-régió-változatok az Fc-régió következő aminosav-pozícióiban lévő aminosavak közül egyet vagy többet érintő módosí- tás(oka't hordozh attak: 255., 256., 258., 267., 268 ., 272., 276., 280., 283., 285., 286., 290., 301., 305., 307 ., 309., 312., 315., 320., 322., 326., 330., 331., 337., 340 ., 378., 398. és 430. (az Fc-régió aminosavainak számozása a Kábátféle EU-index szerint). Az ilyen - FcyRII-höz fokozott af-finitással kötődő - Fc-régió-változatok csökkent mértékbenkötődhetnek az FcyRIII-hoz, és, például, az Fc-régió 268., 272., 298., 301., 322. és 340. aminosav-pozícióiban lévőaminosavak közül egyet vagy többet érintő módosítás(oka)t « ··«· ·· · · »· • * »·««··• * ··· ··· · ···• ··« · · · · • · · · ·· ··«· ·»* - 138 - hordozhatnak (az Fc-régió aminosavainak számozása a Rabat féle EU-index szerint) . Más módon (v increased binding to Fc receptor Fc region variants the modifications of the amino acids in the amino acid position in the Fc region at any one or more (oka't hordozh were: 255, 256, 258, 267, 268 ., 272, 276, 280, 283, 285, 286, 290, 301, 305, 307,. 309, 312, 315, 320, 322, 326, . 330, 331, 337, 340, 378, 398 and 430 (the Fc region, wherein the numbering according to Kabat EU index) of such. - related to increased FcyRII af-finitással - Fc Versions of the RIII mértékbenkötődhetnek reduced to, for example, modifications in the Fc region of amino acids 268, 272, 298, 301, 322 and 340 amino acid positions in one or more of concern (s) and t «· · '·· · · · »· • *» · «« ·· · · · · · · · · · · * • • ·· "· · · · · · · • ·· ··« · »* - 138 - carry (the Fc region, wherein the numbering according to EU index kinds of Rabat) Alternatively (v. agy a fentiek mellett), az Fc-régió-változat újszülöttkori Fc-receptorhoz (FcRn) is módosítottaffinitással kötődhet. Az ilyen Fc-régió-változatok közétartoznak az Fc-régió következő aminosav-pozíciói közülegyet vagy többet érintő amínosav-módosítás(oka)t tartalma-zó változatok: 238., 252., 253., 254., 255., 256., 265., 272., 286., 288., 303., 305., 307., 309., 311., 312., 317., 340., 356., 360., 362., 376., 378., 380., 382., 386., 388., 400., 413., 415., 424., 433., 434., 435., 436., 439. és 447. (az Fc-régió aminosavainak számozása a Rabat féle EU-index szerint). Brain addition to the above), bind módosítottaffinitással the Fc region variant neonatal Fc receptor (FcRn) also. Such Fc region variants include amino acid change affecting the amino acid positions in the Fc region of one or more of (s) content gents versions: 238, 252, 253, 254, 255, 256, 265, 272, 286, 288, 303, 305, 307, 309, 311, 312th, 317th, 340th, 356th, 360th, 362nd, 376th, 378th, 380th, 382nd, 386th, 388th, 400th, 413th, 415th, 424th, 433rd , 434, 435, 436, 439 and 447 (the Fc region, wherein the numbering according to EU index kinds of Rabat). Azok az Fc-régió-változatok, amelyek azFcRn-receptorhoz csökkent affinitással kötődnek, az Fc-régió következő aminosav-pozíciói közül egyet vagy többetérintő aminosav-módosítás(oka)t tartalmazhatnak: 252., 253., 254., 255., 288., 309., 386., 388., 400., 415., 433., 435., 436., 439. és 447. (az Fc-régió aminosavainak számo-zása a Rabat féle EU-index szerint). Those of Fc region variants with reduced azFcRn receptor binding affinity to one or more amino acid modification affecting (s) from the amino acid positions of the Fc region may include: 252, 253, 254, 255, 288 ., 309, 386, 388, 400, 415, 433, 435, 436, 439 and 447 (the Fc region of an amino acid number of types of Rabat, according to EU index). Azok az Fc-régió-véltozatck, amelyek az FcRn-receptorhoz fokozott affinitás-sal közödnek, az Fc-régió következő aminosav-pozíciói közülegyet vagy többet érintő amínosav-módosítás(oka)t tartal-mazhatnak: 238., 256., 265., 272., 286., 303., 305., 3C7., 311., 312., 317., 342., 356., 360., 362., 376., 378., 380., 382., 413., 424. és 434. (az Fc-régió aminosavainak számo-zása a Rabat féle EU-index szerint). Those Fc region véltozatck which közödnek sal increased affinity for the FcRn of the following amino acid positions in the Fc region amino acid modification affecting one or more of (s) comprise composed of: 238, 256, 265th , 272, 286, 303, 305, 3C7. 311, 312, 317, 342, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, ​​413 ., 424 and 434 (the Fc region of an amino acid number of types of Rabat, according to EU index). A módosított {vagyis javított vagy csökkentett) Clq-kötodész és/vagy komplement-dependens citotoxicitású Fc- «« « - 139 - régió-változatokat a WO 99/51642 számú nemzetközi közzété-teli iratban tárták fel. Modified {i.e., enhanced or reduced) kötodész Clq and / or complement dependent cytotoxicity Fc «« «- 139 - region variants revealed in WO 99/51642 international patent publication discloses saturation. Az ilyen változatok az Fc-régió 270., 322., 326., 327., 329., 331. és 334. pozíciója közülegyet vagy többet érintő aminosav-módosítás(oka) t tartal-maznak [ld. Such variants of the Fc region of 270, 322, 326, 327, 329, 331 and 334 concerning the position of one or more amino acid modification (s) comprise maznak [see. még: Duncan és Winter: Natúré 322, 738 (1988);5 648 260 és 5 624 821 számú egyesült államokbeli szabadal-mi leírás; also Duncan and Winter, Nature 322: 738 (1988); 5,648,260 and No. 5 624 821 US-patent specification describes; valamint WO 94/29351 számú nemzetközi közzététe-li irat] . WO 94/29351 and international patent publication of file-li].

Az antitest vérsavóban mérhető felezési idejének növe-lése céljából az antitestbe (elsősorban antitest-fragmensbe) ún. For the purpose of antibody serum half-life of Nove-called reasoning into the antibody (especially an antibody fragment). "mentőreceptor-kötő epitópot" ("salvage re-ceptor binding epitcpe") építhetünk be. "Salvage receptor binding epitope" ( "salvage receptor binding to epitcpe") can be incorporated. Ahogy itt használ-juk, a "mentőreceptor-kötő epitóp" kifejezésen egy IgG-molekula (pl. IgGi, IgG2, IgG3 vagy IgGa) Fc-régió j ánakepitópját értjük, amely az IgG-molekula in vivő felezésiidejének növeléséért felelős. As-Juk used herein the term "salvage receptor binding epitope" refers to an IgG molecule (eg. IgGl, IgG2, IgG3 or IgGa) Fc j ánakepitópját which is responsible for the in vivo half-life of the IgG molecule improvement. (vli) immunkonjagátumok A találmány tárgyához tartoznak az olyanimmunkor, jugétumok is, amelyekben a találmány szerinti anti-test citotoxikus hatóanyaghoz, például, kemoterápiás ható-anyaghoz, toxinhoz (pl. kis molekulájú toxinhoz vagy bakte-riális, gomba-, növényi vagy állati eredetű, enzimatikusaktivitású toxinhoz vagy toxin-fraamensekhez) vagy radioak-tív izotóphoz van konjugálva (mely utóbbiakat radiokon-jngátumoknak nevezzük). (VLI) immunkonjagátumok object of the present invention include an immune when jugétumok in which antibodies of the invention is a cytotoxic agent such as a chemotherapeutic agent, toxin (e. A small molecule toxin or bactericides mycobacterial, fungal, plant or animal origin , it is conjugated to a toxin or toxin enzimatikusaktivitású fraamensekhez) or radioactivity tive isotope (the latter being called in radio jngátumoknak). xAz ilyen iramunkonjugátumok előállítására alkalmas ke- - 140 - moterápiás hatóanyagokat fentebb ismertettük. Such suitable • = ke- iramunkonjugátumok preparation - 140 - chemotherapeutic agents described above. A találmány szerinti antitest és egy vagy több kis mo-lekulájú toxin, például, calicheamicin, maytansin (ld.5 208 020 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírás),trichotén vagy CC1065 alkotta konjugátumok szintén a talál-mány oltalmi körébe tartoznak. antibody and one or more low-mo lekulájú toxin, e.g., calicheamicin, maytansine (U.S. Patent No. 208,020 ld.5) trichotén CC1065 or conjugates of the invention are made are also encompassed by the invention.

A találmány egyik előnyös megvalósítási módja értelmé-ben az antitestet egy vagy több calicheamicin-molekuláhozkonjugáijuk. In a preferred embodiment, the sense in the antibody to one or more calicheamicin molekuláhozkonjugáijuk. Az antibiotikumok calicheamicin-családja pM alatti koncentrációkban a kettős szálú DNS törését okozhat-ja. The calicheamicin family of antibiotics at concentrations below pM of double-stranded DNA breakage can cause ja. A calicheamicin - találmány céljaira alkalmas - struk-turális analógjai közé tartozik, többek között, aγό,α^Ααο, ,N-acetil-yit, PSAG és θι1, [Hinman és mtsai.:Cancer Research 53, 3336 (1993); The calicheamicin - structuring tural analogues belongs, among others, aγό, α ^ Ααο, N-acetyl-yit, PSAG and θι1 [Hinman mtsai.:Cancer Research 53: 3336 (1993) - For the purposes of the present invention; és Lode és mtsai.: CancerResearch 56, 2925 (1998); and Lode et al .: CancerResearch 56: 2925 (1998); ld. ld. még az 5 714 586, 5 712 374,5 261 586 és 5 773 001 számú egyesül" államokbeli szabadal-mi leírásokat, melyeket teljes terjedelmükben a kitanításrészének tekintünk]. A raláimány céljaira alkalmas, enzimatikus aktivitásútoxinok és fragmenseik közé tartozik a diftéria-toxin A-lánca és nemkenő aktív fragmensei; a Pseudomonasaerugircsa-ból származó exotoxin A-Iánca; ricin A-lánc; abrin A-lánc; modeccin A-lánc; α-szakrin; Aleurites fordiiproteinek; dianthin-proteinek; Phytolaca americana protei-nek (PAPI, PAPII és PAP-S); Momordica charantia inhibitor;kurcin; krotin; Sapoaaria officinalis inhibitor; gelonin;mitogellin; restrictotin; fenomicin; enomicin; és atricothecének (ld. cl. WO 93/21232 számú nemzetközi közzé- * ο ·« « ·0 j* *»♦ « · ««·«·« • · ·»» ·*· Μ «··«··· · · · · « «*1 »* ··»♦ «4 141 .211 ς131 J-125 γ60 Κθ1θ6 βθΐθθ Sí!?53, 212 Ρ'2 és a lutécium radioaktív izotópjai. tételi irat also U.S. 5,714,586, 5,712 374.5 261 586 and 5773001 are united "States patent, our descriptions, which entirety is considered the kitanításrészének]. are useful in the raláimány enzymatic aktivitásútoxinok and fragments thereof include diphtheria toxin -chain and no lubricating active fragments, exotoxin A chain from Pseudomonasaerugircsa from, ricin A chain, abrin A chain, modeccin A chain, α-szakrin; Aleurites fordiiproteinek; dianthin proteins, Phytolaca americana proteins (PAPI , PAPII, and PAP-S), momordica charantia inhibitor, curcin, crotin; Sapoaaria officinalis inhibitor, gelonin, mitogellin; restrictotin; phenomycin, enomycin;.. and atricothecének (see WO 93/21232 international publication cl * ο · «« 0 · j * »♦" · "" · "·« · • »» * · · Μ "··" ··· · · · · «« * 1 »* ··» ♦ «4141 .211 J-125 ς131 γ60 Κθ1θ6 βθΐθθ Si? 53, Ρ'2 212 and radioactive isotopes of lutetium. discloses ). A találmány tárgyához tartoznak az antitest és egynukleolitikus aktivitású vegyület (pl. ribonukleáz vagyDNS-endonukleáz, pl. ). The invention includes the antibodies and egynukleolitikus active compounds (eg. A ribonuclease vagyDNS endonuclease, eg. dezoxiribonukleáz; DNase; DN-áz) alkottaimmunkonj ugátumok. DNase) alkottaimmunkonj ugátumok. A rádiókonjugált antitestek előállítására különféleradioaktív izotópok alkalmasak, melyek példáiként a követ-kezők említhetők: Art A variety of radioactive isotopes radioconjugated antibodies are suitable which are exemplified by those mentioned follow-Art

Bi: Bi:

Az antitest és a citotoxikus hatóanyag konjugátumaikülönféle difunkciós proteinkapcsoló vegyületek alkalmazá-sával állíthatók elő; Of the antibody and cytotoxic agent konjugátumaikülönféle bifunctional protein-coupling compounds may be prepared SAVAL; ilyenek, például, az N-szukcinimidíl- 3-(2-piridil-ditiol)-propionát (SPDP), szukcinimidil-4-(N-maleimido-metil)-ciklohexán-l-karboxilát, iminotiolán (IT), imicoészterek difunkciós származékai (pl. dimetil-adipimidát-HCl), aktív észterek (pl. diszukcinimidil-szuberét), aldehidek (pl. gluzáraldehid), diazido-vegyületek [pl. such, for example, N-succinimidyl 3- (2-pyridyldithiol) propionate (SPDP), succinimidyl-4- (N-maleimidomethyl) cyclohexane-l-carboxylate, iminothiolane (IT), bifunctional derivatives imicoészterek (eg. dimethyl adipimidate HCl), active esters (e. disuccinimidyl suberate), aldehydes (eg. gluzáraldehid), diazido compounds [e. di-(p-azidobenzioi)-hexándiamin], bisz-diazónium-származékck [pl. di- (p-azidobenzioi) hexanediamine], bis-diazonium származékck [eg. bisz-(p-diazónium-benzoil)-ezilér.diamin], diizccianátok (pl. zcluol-2,6-diizocianát) ,és a kéz aktív fluoratomot tartalmazó vegyületek (pl. 1,5-diflucr-2,í-dinitrc-benzcl). bis (p-diazonium-benzoyl) -ezilér.diamin] diizccianátok (eg. zcluol 2,6-diisocyanate), and hands compounds containing active fluorine (eg. 1,5-diflucr-2, t-dinitrc- benzcl). Vitette és mtsai. Vitetta et al. [Science238, 1C98 (1987)] ricin-immuntoxin előállítási eljárásétírták le. [Science238, 1C98 (1987)] ricin immunotoxin production method of described. A radicnukleotidok antitesthez történő konjugálá-séra alkalmas kelétképző szerek egyik példájaként a 14C-izotőppai jelzett 1-(izotio-ciano-benzil)-3-(metil-dietilér)-triamin-pentaecetsav (MX-DTPA) említhető (ld. WO94./11C26 számú nemzetközi közzétételi irat). suitable for conjugation to an antibody Séra The radicnukleotidok kelétképző agents as an example of the 14C-isotope labeled 1- (isothiocyanate-cyanobenzyl) -3- (methylamino dietilér) triamine pentaacetic acid (MX-DTPA) may be mentioned (see Fig. WO94./ No. 11C26 Appl). Kapcsolóként • · ·»» »·» Λ **· «»·« · * · · * ·»· *· »«4· ·-> - 142 - "hasítható kapcsolókomponenst" is alkalmazhatunk, amely asejtben elősegíti a citotoxikus hatóanyag felszabadulását.Ilyen célra, például, dimetil- vagy diszulfid-tartalmú kap-csolómolekula [ld. Switch as • · »» »·» Λ ** · "" · "· * · * ·» · * · »« 4 · - used "cleavable linker" which asejtben facilitate the cytotoxic drug -> - 142 felszabadulását.Ilyen purposes, for example, dimethyl or disulfide-containing receives csolómolekula [ld. Chari és mtsai.: Cancer Research 52, 127 (1992)] alkalmazható. Chari et al .: Cancer Research 52, 127 (1992)] can be used. Más módon, rekombináns technikák vagy peptidszintézis alkalmazásával, antitestet és citotoxikus hatóanyagot tar-talmazó fúziós proteinek állíthatók elő. Alternatively, peptide synthesis or recombinant techniques, the antibody and cytotoxic agent may be prepared tar talmazó fusion proteins. A találmány egy másik megvalósítási módja értelmébenaz antitestet - tumor környezetébe történő előzetescélbajuttatás érdekében - "receptorhoz" (pl. sztrepta-vidinhez) konjugáljuk, s az antitest-receptor konjugátumotbeadjuk a páciensnek, majd a tumorhoz nem kötődöttkonjugátumon "clearing" hatóanyag alkalmazásával eltávolít-juk a vérkeringésből, végül a páciensnek citotoxikus ható-anyaghoz (pl. radionukleotidhoz) konjugélt ligandumot (pl. avidint) adunk be. In another embodiment értelmébenaz antibody - conjugated "receptor" (such streptavidin Vidiná.), And the antibody-receptor konjugátumotbeadjuk the patient and the tumor does not kötődöttkonjugátumon using a "clearing" agent removed to the barrier - for preliminary delivery, through tumor environment circulation, ultimately to the patient, a cytotoxic agent (eg. radionucleotide) konjugélt ligand (eg. radionucleotide) was administered. (vili) Antitest-függő, enzim-aktiváita pro-drog terá- pia (ADEPT) A találmány szerinti antitest ADEPT-terápiában is al-kalmazható, oly módon, hogy az antitestet pro-drog-aktiválóenzimmel konjugáljuk, mely enzim a pro-drogot (pl. kemote-rápiás pepzidil-hatóanyagot, ld. WO 81/01145 számú nemzet-közi közzézételi irat) aktív rákellenes hatóanyaggá alakít-ja ér (ld. pl. WO 88/07378 számú nemzetközi közzétételiirat és 4 975 278 számú Egyesült Államok-beli szabadalmileírás). (Viii) Antibody dependent enzyme aktiváita antibody prodrug therapies pia (ADEPT) according to the invention sub-epoxidation also ADEPT therapy, such that the antibody is conjugated to a prodrug-aktiválóenzimmel which enzyme pro-drug (e. chemotaxis pepzidil ​​therapeutic active ingredient, supra. WO 81/01145 international filing közzézételi) active anti-cancer drug-converted ja vessel (see. eg. WO 88/07378 international közzétételiirat No. 4,975,278 and United-States patent). • Μ~· • · » • · ·<·«·· · • Μ ~ · • · »· • · <· '·· ·

143 143

Az ADEPT-terápiában alkalmazható immunkonjugátűm en-zimkomponenseként bármely olyan enzim felhasználható, amelyegy pro-drogot aktív citotoxikus alakjává képes alakítani. The immunoconjugate useful for ADEPT therapy en-zimkomponenseként any enzyme can be used which is able to transform a prodrug in an active, cytotoxic form. A találmány szerinti eljárásban alkalmazható enzimekközé tartoznak, többek között, a foszfát-tartalmú pro-drogokat szabad hatóanyaggá alakító alkalikus foszfatázok;a szulfát-tartalmú pro-drogokat szabad hatóanyaggá alakító aril-szulfatázok; include enzymes useful in the present invention include, without limitation, phosphate-containing prodrugs forming free drug form of alkaline phosphatase, the sulfate-containing prodrugs forming free drug form arylsulfatase; a nem toxikus 5-fluorcitozin rákellenes hatóanyaggá (5-fluoruracillá) történő átalakífására képescitozin dezamináz; átalakífására non-toxic 5-fluorocytosine into the anticancer drug, (5-fluorouracil) képescitozin deaminase; a peptidtartalmú pro-drogok szabad ható-anyaggá történő átalakítására képes proteázok [pl.Serratis-eredetű proteáz, termolizin, szubtilizin,karboxipeptidázok és cathepinek (cathepin-B és -L)]; converting the peptide-containing prodrugs into free active substance protease [protease, thermolysin, subtilisin, carboxypeptidases and cathepinek (cathepin B and L) pl.Serratis-derived]; a D-aminosav-szubsztituenseket tartalmazó pro-drogok átalakítá-sára képes D-alanil-karboxipeptidázok; capable prodrugs containing D-amino acid substituents Transforms attention D-alanylcarboxypeptidases; a glikozilált pro-drogok szabad hatóanyaggá történő átalakítására képes szén-hidrát-hasi tó enzimek, mint pl. converting glycosylated prodrugs into free drugs carbon hydrate abdominal lake enzymes like. a β-galaktozidáz és at cl β — id ktámmal derivatizált hatóanyagok szabadhatóanyaggá történő átalakítására képes β-laktamáz; the β-galactosidase and β t cl - convert time ktámmal derivatized drugs into free drugs capable of β-lactamase; vala-mint az amin-nitrogénatomjukon fenoxi-acetil- vagy fenil-acetil-csoporttal derivatizált hatóanyagok szabad ható-anyaggá történő átalakítására képes penicillin-amidézok(pl. penicillin-V-air.idéz, illetve penicillin-G-amidáz) . converting every sample of the amine nitrogen atom phenoxyacetyl or phenylacetyl groups into free drugs derivatized active material capable amidézok penicillin (e. air.idéz penicillin V or penicillin G amidase). Másmódon, az enzimatikus aktivitású antitestek ("abzimek”)szintén felhasználhatók a találmány szerinti pro-drogok ak-tív hatóanyaggá történő átalakítására [Massey: Natúré 328,457 (1987)). Az antitest-abzim konjugátumok a leírásban az"abzimek” tumorsejtekhez történő célbajuttatésával kapcso- • · ····»··· · · · · · · · ······· · ·· ·• ··· ·· ···· ·· - 144 - latban ismertetett módon állíthatók elő. Alternatively, antibodies with enzymatic activity ( "abzymes") can also be used to convert to prodrugs of the present invention the k-proliferative drug, [Massey. Nature 328.457 (1987)) Antibody-abzyme conjugates célbajuttatésával herein with "abzymes" tumor switch - • ···· · »· · · · · · · · · · · ·· · ······· • ···· ··· ·· ·· - 144 - prepared as described animal. A találmány szerinti enzimek jól ismert eljárásokkal(pl. a fentebb említett, heterodifunkciós kereszkötés-képzőreagensek alkalmazásával), kovalens kötéssel kapcsolhatókaz antitest-mutánsokhoz. The enzymes of the invention by well known methods (eg. using the above-mentioned heterobifunctional crosslinking képzőreagensek) kapcsolhatókaz covalently bound antibody mutants. Más lehetőség szerint, az olyanfúziós proteinek, amelyek a találmány szerinti antitestneklegalább az antigénkötő régióját egy találmány szerinti en-zim legalább egy funkcionálisan aktív részéhez kapcsolvatartalmazzák, jól ismert rekombinációs DNS-technikák alkal-mazásával állíthatók elő [Neuberger és mtsai.: Natúré 312,6C4 (1984)]. Alternatively, the productivity of fusion proteins comprising the antigen binding region of the invention-converting Enzyme linked comprises at least a functionally active portion of an antibody, at least according to the invention can be prepared by well-known recombinant DNA techniques alkali tion of [Neuberger et al .: Nature 312,6C4 (1984)]. (ix) Az antitestek egyéb módosításai A találmány értelmében a találmány szerinti antitestekegyéb módosításoknak is alávethetők. (Ix) Other modifications of antibodies The antibodies may be subjected to other modifications of the invention are also encompassed herein. Például, az antitestetprotein-jellegű polimerhez, pl.polipropilénglikolhoz, polioxi- polietilénglikol és polipropilénglikol különféle, nem coliétiiénglikolhoz, alkilénhez vagy kopolimereihez kapcsolhatjuk. For example, the antibody nonproteinaceous polymer pl.polipropilénglikolhoz, polyoxyethylene polyethyleneglycol of various non-coupled coliétiiénglikolhoz, or copolymers of alkylene is. Az antitest - például, koa-cerválási technikákkal vagy határfelületi polimerizációvalelőállított - mikrokapszulákba [pl. Antibody - e.g., coagulase cerválási techniques or by interfacial polimerizációvalelőállított - microcapsules [eg. hidroxi-metil-cellulózvagy zselatin, illetve poli (metil-metakrilát) mikro-kapszulákbaj, továbbá kolloidális hatóanyag-bejuttató rend- szerekbe {pl. hydroxymethyl cellulose or gelatin and poly (methyl methacrylate) micro-kapszulákbaj, and colloidal drug delivery systems {e.g. detergents. iiposzómákba, albumin-mikrogömbökbe,mikroemuiziókba, nanorészecskékbe és nanokapszulákba) vagym.akroemuÍziókba is foglalható. ) Can be reserved vagym.akroemuÍziókba liposomes, albumin microspheres, microemulsions, nano-particles and nanocapsules. Az ilyen technikák leírásátilletően Id. Remington's Pharmaceutical Sciences", 16. ki- • « · · « · • · · · · ·· ·• ··· »· ···· ·· - 145 - adás, szerk.: A. Osol (1980). A találmány szerinti antitestek immunliposzómákba isfoglalhatók. Az antitestet tartalmazó liposzómák ismert el-járások alkalmazásával állíthatók elő [ld. pl. Epstein ésmtsai.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 3688 (1985); Hwang és mtsai.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 4030 (1980); 4 485 045 és 4 544 545 számú Egyesült Államok-beli szaba-dalmi leírás; és WO 97/38731 számú nemzetközi közzétételi irat]. Az 5 013 556 számú egyesült államokbeli szabadalmileírásban olyan liposzómákat tártak fel, amelyek a kerin-gésben fokozott felezési időt mutatnak. A különösen hasznos liposzómák - foszfatidil-kolint,koleszterint és PEG-gel derivatizált foszfatidil-etanol-amint (PEG-PE) tartalmazó - lipidkészírmény alkalmazásávalvégzett reverz fázisú . Such techniques are disclosed regarding Id Remington's Pharmaceutical Sciences, "16th check •« · «· • · · · · · · · • · ··» · ···· ·· - 145 - broadcast, ed .: The . Osol (1980) can be prepared using the antibodies of the invention immunoliposomes can be booked liposomes containing the antibody are known in-districts [see, e.g., Epstein ésmtsai .: Proc Natl Acad Sci USA 82: 3688 (1985);........ Hwang et al .: Proc Natl Acad Sci USA 77: 4030 (1980);.... 4485045 and No. 4 544 545, U.S. patent specification what song; and WO 97/38731 international patent discloses] The fifth No. 013,556 U.S. patent revealed liposomes with an increased half-life in the circulatory-gésben particularly useful liposomes. - phosphatidylcholine, cholesterol and PEG-derivatized with phosphatidyl ethanolamine (PEG-PE) - lipidkészírmény application of finished reverse phase bepárlási eljárással állíthatók elő. It can be prepared by the evaporation method.

A liposzómákat meghatározott pórusméretű szűrőn átpasszí-rozva kívánt átmérőjű liposzómákat hozhatunk létre. átpasszí-rozva create diameter liposomes with the desired pore size of the liposomes were determined. A ta-lálmány szerinti antitest Fab'-fragmer.sei diszulfid-cserésreakcióval, Martin és mtsai. antibody according to the ta-lálmány Fab fragmer.sei disulfide cserésreakcióval, Martin et al. leírása szerint [J. as described in [J. Bioi.Chem. Bioi.Chem. 257, 286 (1982)] konjugálhatók a 1iposzómákhoz. 257, 286 (1982)] conjugated to 1iposzómákhoz. A liposzómák adott esetben kemoterápiás hatóanyagot is tar-talmazhatnak [ld. The liposomes optionally also chemotherapeutic agent tar talmazhatnak [ld. Gabizon és mtsai.: J. National Cancer Gabizon et al .: J. National Cancer

Inst. Inst. 81(19), 1484 (1989)]. 81 (19), 1484 (1989)]. D) Vektorok, gazdasejtek és rekombináns eljárások D) Vectors, Host Cells and Recombinant Methods

Szintén a találmány tárgyát képezik a találmány sze-rinti antitest-mutánst kódoló izolált nukleinsavak, az - 146 - • « ·· ilyen nukleinsavakat hordozó vektorok és gazdasejtek, vala-mint rekombináns eljárások az antitest előállítására. The invention also provides isolated nucleic acids encoding the present valve Rint antibody mutant, the - 146 - • «·· carrying such nucleic acids, vectors and host cells, such as recombinant methods, some of the antibody preparation. A találmány szerinti antitest rekombináns módszerekkeltörténő előállítása céljából izoláljuk az antitestet kódolónukleinsavat, majd - további klónozás (DNS-amplifikálás)vagy expresszáltatás érdekében - replikádéra képes vektor-ba inszertáljuk. isolating antibody encoding nucleic acid to produce the antibody of the invention by recombinant techniques and hints, then - further cloning (amplification of the DNA) or for expression - inserted into replication competent vector. A monoklonális antitestet kódoló DNS egy-szerűen izolálható és szekvenálható (pl. az antitest nehézés könnyű láncait kódoló génekhez specifikusan kötődőoligonukleotid-próbák alkalmazásával). DNA encoding the monoclonal antibody is isolated and sequenced a manner (eg. Nehézés genes encoding the light chains of the antibody specifically using kötődőoligonukleotid probes). Az inszertálásraszámos vektor alkalmas; The inszertálásraszámos suitable vector; az ilyen vektorok általában, többekközött, szignálszekvenciát, replikáciős kezdőhelyet, egyvagy több markergént, erősítőszekver.ciát, promótert éstranszkripciós terminációs szekvenciát tartalmaznak. Such vectors generally, inter alia, a signal sequence, an origin of replication, one or more marker genes, erősítőszekver.ciát, termination sequences include promoter éstranszkripciós. (i) Szignálszekvencia komponens A találmány szerinti többértékű antitest rekombinánsmódszerekkel nem csupán közvetlenül, hanem más, heterológpolipeptiddel (amely előnyösen egy szignálszekvencia vagyegyéb, olyan polipeptid, amely az érett protein vagypolipeptid X-terminélisán specifikus hasítási helyet tar-talmaz) képzett fúziós polipeptidkénz is előállítható.Heterológ szignálszekvenciaként előnyösen olyan szekvenciátalkalmazunk, amelyet a gazdasejt képes felismerni és fel-dolgozni (azaz szignál-peptidázzal lehasítani). (I) Signal sequence component The multivalent antibody of the present invention not only directly, but also other heterológpolipeptiddel (which is preferably a signal sequence or other polypeptide that specific cleavage site tar talmaz the mature protein vagypolipeptid X terminélisán) in fusion polipeptidkénz also be prepared rekombinánsmódszerekkel. the heterologous signal sequence is preferably used which is able to recognize and work-up (i.e., cleaved by a signal peptidase) by the host cell. Prokariótagazdasejtek esetében a természetes antitest szignálszekven-ciéját (mivel azt a prokarióta sejtek nem képesek felismer-ni és feldolgozni) prokarióta szignálszekvenciával helyet- • · ······ ·· ··· ··· · ······· · ·· · • ··· ·· ···· ·· - 147 - tesítjük. For Prokariótagazdasejtek natural antibody-szignálszekven ciéját (since the prokaryotic cells are unable to recognize and process-ni) a prokaryotic signal substitute • · ······ ··· ··· ·· · ······· • · · · · · ·· ·· ···· ·· - 147 - substituent. Az alkalmas prokarióta szignálszekvenciák közétartozik az alkalikus foszfatáz, penicillináz, lpp vagy ahőstabil enterotoxin-II vezetőszekvenciája. Suitable prokaryotic signal sequences include the alkaline phosphatase, penicillinase, Ipp or ahőstabil enterotoxin II leaders. Élesztő-gazdasejt alkalmazása esetén a természetes szignálszekven-ciát, például, az élesztőeredetű invertáz vezetőszekvenciá-jával, az α-faktor vezetőszekvenciéjával (ideértve aSaccharomyces és Kluyveromyces α-faktor vezetőszekvenciá-ját), savas foszfatáz vezetőszekvenciájával, C. albicansglükoamiláz vezetőszekvenciájával vagy a WO 90/13646 számúnemzetközi közzétételi iratban leírt szignálszekvenciávalhelyettesítjük. In case the yeast host cell is the use of natural szignálszekven vivo concentrations, e.g., the yeast invertase leader, the α-factor vezetőszekvenciéjával (including Saccharomyces and Kluyveromyces α-factor vezetőszekvenciá adjusted), or acid phosphatase leader, the C. albicansglükoamiláz leader, or in WO 90 / szignálszekvenciávalhelyettesítjük described in international publication No. 13646 discloses. Emlőssejtekben végzett expresszáltatáshozemlőseredetű szignálszekvenciák, illetve virális szekréciósvezetőszekvenciák (pl. a herpes simplex gD szignál-szekvencia) alkalmazhatók. expresszáltatáshozemlőseredetű signal sequences in mammalian cells or viral szekréciósvezetőszekvenciák (eg. the herpes simplex gD signal sequence) can be used.

Az ilyen prekurzor-régiókat kódoló DNS-t a többértékűanriteszet kódoló DNS-hez (azzal azonos leolvasási fázis-ban) ligáljuk. encoding such precursor region is ligated to the DNA encoding többértékűanriteszet DNA (equivalent in reading frame). (11; Replikációs kezdőhely komponens (11; Origin of replication component

Az expressziős és klónozóvektorok egyaránt tartalmaz-nak olyan nukleinsav-szekvenciát, amely lehetővé teszi avektor egy vagy több kiválasztott gazdasejtben történőreplikációját. Both expression and cloning vectors contain a nucleic acid has a sequence which allows történőreplikációját avektor one or more selected host cells. A kiónczóvektorokban ilyen szekvenciakéntolyat kell alkalmazni, amely a vektor replikációját a gazdakromoszómáiis DNS-étól függetlenül biztosítja (replikációskezdőhely és autonóm replikációra képes szekvencia). The kiónczóvektorokban this sequence is one that should be used that enables the vector to replicate independently of the host chromosomal DNA from those (replikációskezdőhely and capable of autonomous replication sequence). Azilven szekvenciák különféle baktériumok, élesztők és víru- • ···· ·· ·« • · ······ ·· ··· ··· · ······· · ·· · • · · · ·· ···· ·· - 148 - sok esetében jól ismertek. Azilven sequences in a variety of bacteria, yeast and viruses • · ···· ·· "·· ······ · · · · · · · • · · ······· ·· • · · · · ·· ···· ·· - 148 - for many well known. A pBR322-plazmid replikációskezdőhelye a legtöbb Gram-negatív baktériumban, a 2μ-plazmid replikációs kezdőhelye élesztőkben, mig a különbözővirális (SV40, polioma, adenovírus, VSV vagy BPV) kezdőhe-lyek emlőssejtekben alkalmazható vektorokban hasznosak. The replikációskezdőhelye pBR322 suitable for most Gram-negative bacteria, the 2μ plasmid replication origin of yeast, while the különbözővirális (SV40, polyoma, adenovirus, VSV or BPV) kezdőhe ulcers useful vectors for mammalian cells. Azemlőssejtekben alkalmazható expressziós vektorokbanreplikációs kezdőhelyre általában nincs szükség (az SV40- eredetű kezdőhelyet csak azért alkalmazzuk, mert korai promótert tartalmaz). Useful expression Azemlőssejtekben vektorokbanreplikációs starting location is not usually necessary (starting location of the SV40 origin is used only because it contains the early promoter). (Ili) Szelekciós gén komponens (III) Selection gene component

Az expressziós és klónozóvektorok tartalmazhatnak sze-lekciós gént (más néven szelektálható markert) is. Expression and cloning vectors may contain valve deflective gene (also termed a selectable marker) as well. A jel-lemző szelekciós gének olyan proteineket kódolnak, amelyek(a) antibiotikumokkal vagy egyéb toxinokkal (pl.ampicillin, neomicin, methotrexát vagy tetraciklin) szembe-ni rezisztenciát biztosítanak; The signal ascendant selection genes encode proteins that (a) the antibiotic or other toxins (pl.ampicillin, neomycin, methotrexate, or tetracycline) ni-face resistance provided; (b) auxotróf deficienciékategészínenek ki; (B) an auxotrophic deficienciékategészínenek out; vagy (c) a komplex tápközegben nem találha-tó, kulcsfontosságú tápanyagokat biztosítanak (pl. or (c) in the complex media not find Lake, provide key nutrients (e.

Bacillvs-ok esetében a D-alanin racemáz). For Bacillvs s-D-alanine racemase). A szelekciós rendszerek egyik példája a gazdasejt sza-porodásén gátló hatóanyag alkalmazásán alapul. One example of a selection system based on the use of anti-host cell fron porodásén drug. A heterológgénnel sikeresen transzformált sejtek olyan proteint ter-melnek, amely drogrezisztenciát biztosít, s ezáltal ezek asejtek a szelekciót követően életben maradnak. heterológgénnel cells successfully transformed with a protein-ter Melnik, which confers drug resistance, and thus they asejtek survive the selection regimen. Az ilyen do-mináns szelekció példáiként a neomicin, mikofenolsav éshigromicin alkalmazása említhető. Such do-Gaussian elimination as an example of selection of neomycin, mycophenolic acid éshigromicin application is named.

Az emlőssejtek esetében alkalmas szelektálható • · - 149 - markerek közé tartoznak az olyan sejtek azonosítását lehe-tővé tevő markerek, amelyek képesek az antitestet kódolónukleinsav felvételére; suitable for mammalian cell selectable • · - 149 - markers include markers for the identification of cells could be at the base, which are able to absorb the antibody encoding nucleic acid; az ilyen markerek közé tartozik aDHFR, timidin-kináz, metalloprotein-I és -II génje, előnyö-sen a főemlőseredetű metallotionein-gének, adenozindezamináz gén, ornithin dekarboxiláz gén, stb. aDHFR such markers include, thymidine kinase, metallo-I and -II gene sen preferred primate metallothionein genes, adenosine deaminase gene, ornithine decarboxylase gene, etc. Például, a DHFR szelekciós génnel transzformált sejte-ket először valamennyi transzformáns - methotrexátot (Mtx,a DHFR kompetitív agonistája) tartalmazó - tenyésztő tápkö-zegben végzett tenyésztésével azonosítjuk. For example, all the transformant transformed with the DHFR selection gene were first cell - identified by culturing culture TAPKEN-aliphatic acids - containing methotrexate (Mtx, competitive antagonist of DHFR). Vad típusú DHFR-gén alkalmazása esetén gazdasejtként - DHFR-aktivitásukbanceficiens - Kínai hörcsög petefészek-sejtek (CHO-sejtvonal) használhatók. When using wild-type DHFR gene as a host cell - aktivitásukbanceficiens DHFR - Chinese hamster ovary cells (CHO cell line) can be used. Más módon, az antitestet, vad típusú DHFR-proteint ésegy másik szelektálható markert (pl. amino-glikozid 3' -foszfotranszferázt; APH) kódoló DNS-szekvenciákkal együtte-sen transzformált gazdasejtek a szelektálható marker számá-ra megfelelő szelekciós hatóanyagot (pl. amino-glikozidosantibiotikumot, így kanamicint, neomicint vagy G418-at)tartalmazó tápközegben végzett szaporítással szelektálhatók(ic. 4 965 199 számú Egyesült Államok-beli szabadalmi le- Alternatively, the antibody, wild-type DHFR protein, anda second selectable marker (such as aminoglycoside 3 '-foszfotranszferázt;. APH) DNA coding sequences, taken together, considerably transformed host cell number to the selectable marker appropriate selection agent (for example, amino. selected by growth in the medium -glikozidosantibiotikumot such as kanamycin, neomycin, or G418) containing (SEQ ic. 4,965,199 U.S. patent landing

Az élesztőkben alkalmazható egyik hatásos szelekciósgén az YRp7 élesztőplazmidban található trpl-gén[Stinchcomb és mtsai.: Natúré 282, 39 (1979)]. One effective szelekciósgén used in yeast is YRp7, the yeast trpl gene [Stinchcomb et al .: Nature 282, 39 (1979)]. A trpl-génolyan mutáns élesztőtörzs szelekciós markereként alkalmaz-ható, amely triptofánt tartalmazó tápközegben szaporodás-képtelen (pl. ATCC 44076 vagy PEP4-1) [ld. The trpl-génolyan mutant strain of yeast-selectable marker can be used that is incapable of growth by (eg. ATCC 44076 or PEP4-1) [see in media containing tryptophan. Jones: Genetics 150 85, 12 (1977)]. Jones, Genetics, 150, 85, 12 (1977)]. Az élesztő gazdasejt genomjában a trpl-lézió jelenléte hatásos környezetet biztosít a transzformá-ció - triptofán hiányában végzett szaporítással végrehaj-tott - detektálásához. The presence of the yeast host cell genome provides an effective environment trpl lesion in the transforming concentration is - growth in the absence of tryptophan implementation-to - detect. Hasonlóan, a Leu2-deficiens élesztő-törzsek (ATCC 20622 vagy ATCC 38626) a Leu2-gént hordozó,ismert plazmidok alkalmazásával komplementálhatók. Similarly, Leu2-deficient yeast strains (ATCC 20,622 or 38,626) are complemented by the use of bearing the Leu2 gene, known as plasmids.

Az 1,6 μιη-es, gyűrűs pKDl-plazmidból származó vektorokalkalmasak a KI uyveromyces-nemzetségbe tartozó élesztőktranszformálására. vektorokalkalmasak from 1.6 μιη's cyclic plasmid pKDl élesztőktranszformálására belonging to the genus Kluyveromyces OFF. Más módon, a K. lactis esetébenrekombináns borjúeredetű chymosin nagy mennyiségben történőtermelésére alkalmas expressziós rendszert írtak le (Vanden Berg: Bio/Technology É), 135 (1990)]. Alternatively, esetébenrekombináns K.lactis bovine chymosin provided in large quantities and hints for the production of an expression system is described (Vanden Berg, Bio / Technology, S), 135 (1990)]. Fleer és mtsai.[Bio/Technology 9, 968 (1991)] érett, rekombináns humánszérumalbumin ipari AJuyveromyces-törzsekkel végzett ter-meltetésére alkalmas stabil, sok kópiás expressziós vekto-rokat írtak le. Fleer et al. [Bio / Technology 9 (1991) 968] Suitable stable ter-meltetésére an industrial mature recombinant humánszérumalbumin AJuyveromyces strains, many multicopy expression VEKTRA-fox described. (iv) Promóter komponens (Iv) Promoter component

Az expressziős és klónozóvektorok rendszerintpromótert is tartalmaznak, amelyet a gazdasejt felismer, ésamely az antitestet kódoló nukleinsavhcz működőképesen kap-csolódik. and cloning vectors containing the expression system according promoter that is recognized by the host cell and whose encoding the antibody is operably nukleinsavhcz are attached. A prokarióta gazdasejtekben alkalmazhatópromóterek közé tartoznak a következők: phoA-promóter, β-laktamáz és laktóz promóter-rendszerek, az alkalikusfoszfafáz promótere, a triptofán (trp) promóter-rendszer,valamint hibrid promóterek (pl. a tac-promóter), azonbanegyéb bakteriális promóterek is alkalmazhatók. Prokaryotic host cells applicability promoters include: the phoA promoter, β-lactamase and lactose promoter systems, alkalikusfoszfafáz promoter, the tryptophan (trp) promoter system, and hybrid promoters (such as the tac promoter.) Azonbanegyéb bacterial promoters They can be used. A bakteriá-lis rendszerekben alkalmazható promóterek - az antitestet • · - 151 - kódoló DNS-hez működőképesen kapcsolva - Shine-Dalgarno(SD) szekvenciát is tartalmazhatnak. useful in the bacterin-lis systems promoters - the antibody • · - 151 - encoding DNA operably linked to - contain a Shine-Dalgarno (SD) sequence.

Eukarióta gazdasejtekben alkalmazható promóter-szekvenciák is ismertek. Eukaryotic host cells used promoter sequences are also known. Gyakorlatilag valamennyi eukariótagén tartalmaz egy adeninben és timinben gazdag régiót,amely a transzkripciós kezdőhelytől 5'-irányban, kb. Practically, adenine and thymine rich comprises a region all eukariótagén that the transcription start site in the 5'-direction, approx. 25-30bázis távolságban helyezkedik el. 25-30bázis situated in the distance. Sok génben a transzkrip-ciós kezdőhelytől 5'-irányban, 70-80 bázis távolságbanCNCAAT-régió található (ahol N tetszőleges nukleotidot je-löl). Many gene 5'to 70-80 base távolságbanCNCAAT region contained the transcription initiation site scintillation (where N is any nucleotide je-lol). A legtöbb eukarióta gén 3'-végén AATAAA-szekvenciahelyezkedik el, amely a kódolószekvencia 3'-végén lévőpoli-A farok addiciójának szignálja lehet. In most eukaryotic genes is an AATAAA sequence positioned so that the coding sequence of the 3'-end signal in the addition of poly-A tail to the 3 'end. A felsoroltszekvenciák mindegyike, alkalmas módon, eukariótaexpressziós vektorokba inszertálható. The sequences listed in each of suitably inserted into eukaryotic expression vectors.

Az élesztősejtekben alkalmazható promóterszekvenciákközé tartoznak a 3-foszfoglicerát kináz és egyébglikolitikus enzimek (pl. enoláz, gliceraldehid-3-foszfátdehidrogenáz, hexckináz, piruvát dekarboxiláz, foszfo-fruktokináz, glükóz-6-foszfát izomeráz, 3-foszfoglicerátmutáz, piruvát kináz, foszfoglükóz izomeráz és glükokináz) rromóterei. used in the yeast cells promóterszekvenciákközé include 3-phosphoglycerate kinase and egyébglikolitikus enzymes (eg. enolase, glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, hexckináz, pyruvate decarboxylase, phosphofructokinase, glucose-6-phosphate isomerase, 3-foszfoglicerátmutáz, pyruvate kinase, phosphoglucose isomerase, and glucokinase) rromóterei.

Az élesztősejtekben alkalmazható promóterek egyéb tí-pusai közé tartoznak az indukálható promóterek, melyek to-vábbi előnye, hogy szaporítási feltételek által szabályo-zott transzkripciót biztosítanak. for use in yeast cells Promoters other type of marker include inducible promoters, which to advantage is further that by the propagation conditions in transcription regulation are provided. Az ilyen promóterek pél-dáiként említhetők a következő enzimek promóterrégiói: al-kohol dehidrogenáz-2, izocitokróm-C, savas foszfatáz, anitrogén-anyagcserével kapcsolatos lebontóenzimek, a • » » - 152 - metallothionein, gliceraldehid-3-foszfát dehidrogenáz és amaltóz- és galaktózfelhasználásért felelős enzimek. Such promoters examples dáiként include the following enzymes promoter regions for sub-alcohol dehydrogenase 2, isocytochrome C, acid phosphatase, degradative enzymes associated anitrogén metabolism, the • »» - 152 - metallothionein, glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, and amaltóz- and enzymes responsible for galaktózfelhasználásért. Azélesztősejtekben végzett expresszáltatás céljára alkalmasvektorok és promóterek részletesebb leírását illetően EP 73657 számú európai szabadalmi leírást. For expression with Azélesztősejtekben more detailed description of suitable vectors and promoters regarding EP Patent No. 73,657th Az élesztő-promóterekkel együtt élesztőeredetű erősítőszekvenciák iselőnyösen alkalmazhatók. Yeast enhancers useful iselőnyösen with yeast promoters.

Emlőseredetű gazdasejtekben a vektorokban kódolt több-értékű antitest transzkripciója, például, vírusokgenomjából származó promóterekkel vezérelhető. Mammalian host cells multivalent antibody encoded transcription of the vectors, for example, be controlled by promoters derived vírusokgenomjából. Az ilyenpromóterek polioma-vírusból, baromfihimlő-vírusból,ader.oví rusból (pl. adenovírus-2) , szarvasmarha papilloma-vírusból, madárszarkóma-vírusból, citomegalovírusból,rétrovírusból, hepatitis-B vírusból, s legelőnyösebbenSV4C--vírusból származnak. Such promoters from polyoma virus, fowlpox virus, ader.oví rusból (eg adenovirus second), bovine papilloma virus, avian sarcoma virus, cytomegalovirus, a retrovirus, hepatitis-B virus and legelőnyösebbenSV4C - derived virus. Az emlőseredetű sejtekben végzetttranszkripcióhoz heterológ emlőseredetű promóterek (pl.aktin-promóter, immunglobulin-promóter, nősokk-promóter) isalkalmazhatók, feltéve, hogy kompatibilisek a gazdasejttel. Mammalian cells végzetttranszkripcióhoz heterologous mammalian promoters (pl.aktin promoter, immunoglobulin promoter, female shock promoter) may be used, provided that they are compatible with the host cell.

Az SV40-vírus korai és kései promóterei SV40 restrik-ciós fragmensként (amely SV40 replikációs kezdőhelyet istartalmaz) könnyen eiőáilíthatók. The SV40 early and late promoters of SV40 tion endonuclease fragment (which contains the SV40 origin of replication) eiőáilíthatók easily. A humán citomegalovírusazonnali promótere HindlIIE restrikciós fragmensként nyer-hető. Human citomegalovírusazonnali promoter HindIII restriction fragment win-use. A 4 419 446 számú Egyesült Áilamok-beii szabadalmileírásban DNS emloseredetű gazdasejtekben történőexpresszáltatására alkalmas rendszert tártak fel, amelybenvektorként szarvasmarha papillomavírust alkalmaznak. No. 4,419,446 discloses mixtures of PGM United Áilamok revealed történőexpresszáltatására system for DNA in mammalian host cells, using the bovine papilloma virus amelybenvektorként. Erendszer módosított változatát a 4 601 978 számú Egyesült Államok-beli szabadalmi leírásban írták le. Erendszer described a modified version of the No 4 601 978, US Pat. Más módon, a ·♦ ···« 153 humán β-interferon cDNS-ét egérsejtekben, herpes simplexvírusból származó timidin kináz promóter szabályozása alattexpresszáltatták. Alternatively, ♦ ··· · «153 human β-interferon cDNA in mouse cells, a thymidine kinase promoter from herpes simplexvírusból control during been expressed. Promóterként alkalmazható a Rous-szarkómavírus hosszú terminális ismétlődő szekvenciája is. The promoter of the Rous sarcoma virus long terminal repeat can be used. (v) Erősítőszekvencia komponens (V) Enhancer Component

Magasabbrendű eukariótákban a találmány szerinti anti-testet kódoló DNS transzkripcióját gyakran úgy fokozzuk,hogy a vektorba erősítőszekvenciát inszertálunk. In higher eukaryotes, transcription of the DNA encoding the anti-body of the present invention is often increased by inserting an enhancer sequence into the vector. Számos,emlősgénből (globin, elasztáz, albumin, α-fetoprotein ésinzulin génjeiből) származó erősítőszekvencia ismert, azon-ban többnyire eukarióta sejteket megtámadó vírusból szárma-zó erősítőszekvenciát alkalmazunk. Many from mammalian gene (globin, elastase, albumin, α-fetoprotein genes ésinzulin) enhancer sequences are known in the mostly used eukaryotic cell virus enhancer. Ezek közé tartozik az SV40 - replikációs kezdőhely kései oldalán (100-270. bp)elhelyezkedő - erősízőszekvenciája, a citomegalovírus koraipromóterének erősítőszekvenciája, a poliomavírusreplikációs kezelőhely kései oldalán elhelyezkedő - erősítő-szekvenciája, valamint az adenovírus-eredetű erősítőszek-venciák. These include the SV40 - the late side of the replication origin (bp 100-270). - erősízőszekvenciája, koraipromóterének cytomegalovirus enhancer, the late side of the treatment units poliomavírusreplikációs - enhancers, as well as the amplifier sequence is the adenovirus. Az eukarióta promóterek aktiválására alkalmas erő-sítőszekver.ciékat illetően ld. The eukaryotic promoters capable of activating force regarding sítőszekver.ciékat see. még: Yaniv: Natúré 297, 17 (1982). also Yaniv, Nature 297: 17 (1982). Az erősítőszekvencia az antitestet kódoló szekven-ciától 5'- vagy 3'-irányban - de előnyösen a promóterzől5'-irányban - inszerzálható a vektorba. The enhancer sequence 5 'or 3' direction ciától encoding the antibody - preferably in the direction promóterzől5' - inszerzálható the vector. (vl) Transzkripciós terminációs komponens (V) Transcription termination component

Az eukarióta gazdasejtekben (élesztők, gombák, rova-rok, növények, állatok, emberek vagy egyéb, soksejtű orga- »·· • · · · · « · » · ··· ·«* » ·««· · ·· ·W ««« ·· ··«« - 154 - nizmus sejtmagvas sejtjeiben) alkalmazható expressziós vek-torok a transzkripció lezárásáért és az mRNS stabilizálásá-ért felelős szekvenciákat is tartalmaznak. The eukaryotic host cells (yeast, fungi, Rova-rok, plants, animals, humans and other multicellular orga- »·· • · · · ·« · »· · · · ·« * »·« «·· · · · W «« «·· ··« «- 154 - organism nucleated cells) useful expression vehicles throat contain sequences necessary for the termination of transcription and for stabilizing the mRNA-made as well. Az ilyen szek-venciák általában eukarióta vagy virális DNS-ek vagy cDNS-ek 5'-végi (esetenként 3'-végi) nem transzlálódó régióibólnyerhetők. Such sequences generally sec eukaryotic or viral untranslated régióibólnyerhetők DNAs or cDNAs, 5 '(and occasionally 3'). Ezek a régiók olyan nukleotidszekvenciákat tar-talmaznak, amelyek az antitestet módoló mRNS nemtranszlálódó szakaszában poliadenilációs fragmensekkéntíródnak át. These regions are nucleotide sugars content are used, which for the polyadenylation of the mRNA in untranslated antibody Modolo fragmensekkéntíródnak stage. Az egyik hasznos transzkripciós terminációskomponens a szarvasmarha növekedési hormon poliadenilációsrégiója (ld. WO 94/11026 számú nemzetközi közzétételi irat,és az abban leirt expressziós vektort). One useful transcription terminációskomponens poliadenilációsrégiója the bovine growth hormone (see Fig. WO 94/11026 international patent discloses and described in the expression vector). (vii) A gazdasejtek szelektálása és transzformálása A vektorokba foglalt DNS klónozására vagyexpresszáltatására alkalmas gazdasejtek a fentebb leírtprokarióta, élesztő- és magasabb rendű eukarióta sejtek. (Vii) Selection and transformation of host cells Suitable vagyexpresszáltatására DNA cloning vectors contained in the host cells above leírtprokarióta, yeast and higher eukaryotic cells. Aze célra alkalmas prokarióta sejtek közé Gram-negatív ésGram-pczitív baktériumok tartoznak, mint pl. Aze suitable for prokaryotic cells include Gram-negative bacteria include pczitív ésGram-like. az bélbaktéri-trtok (Enterobacteriaceae), pl. the bélbaktéri-TRTO (Enterobacteriaceae), for example. E. coli, Enterobacter,Erwiaia, Kiebslella, Proteus, Salmonella (pl. Salmonellatyphinrarius) , Serratia (pl. Serratia marcescens), Shigella,valamint a Bacillus fajok (pl. Bacillvs subtilis és B.licbeniformás) [a B. licheniforrnis 41?-törzs leírását ld. E. coli, Enterobacter, Erwiaia, Kiebslella, Proteus, Salmonella (e. Salmonellatyphinrarius), Serratia (eg., Serratia marcescens), Shigella, and Bacillus species (eg. Bacillvs subtilis and B.licbeniformás) [the licheniforrnis B 41? see description of strain. DD 266 710 számú (1989. április 12-én közzétett) szabadalmileírás], Pseudomonas fajok (pl. P. aeruginosa) ésStreptcmyces fajok. DD 266 710 (published April 12, 1989) Patent], Pseudomonas species (eg., P. aeruginosa) ésStreptcmyces species. A találmány szerinti megoldás szempontj ···« ·· • · »*· ··· · ····«·« · * · a • ·«· »♦ ··«« ·· - 155 - jából előnyös E. coli klónozótörzs az E. coli 294-es törzs(ATCC 31446), de egyéb E. coli törzsek is alkalmazhatók,így pl. For purposes of the present invention ··· "·· · •» * · · ··· ···· «·« * · · · • the «·» ♦ ·· «« ·· - 155 - preferably approximately E. klónozótörzs coli, E. coli 294 (ATCC 31,446), although other strains of E. coli may be used, e. az E. coli B-törzs, E. coli Z1776-törzs (ATCC31537) és E. coli W3110-törzs (ATCC 27325). the E. coli B strain, E. coli strain Z1776 (ATCC31537) and E. coli W3110 (ATCC 27325). A felsoroltakon kívül természetesen egyéb, egyenértékű törzsek is alkalmaz-hatók. In addition to the above, other equivalent strains may also be used, of course. A többértékű antitestet kódoló DNS-t hordozó vektorok encoding the multivalent antibody vectors containing DNA

klónozó vagy expressziós gazdasejtjeiként - a prokariótákonkívül - eukarióta mikroorganizmusok, így pl. cloning or expression gazdasejtjeiként - the prokariótákonkívül - eukaryotic microbes such as. fonalas gombákés élesztők is alkalmasak. gombákés filamentous yeasts also suitable. Az alacsonyabb rendű mikroorga-nizmusok közül a Saccharorayces cerevisiae (sütőélesztő) alegáltalánosabban alkalmazott gazdasejt, a találmány sze-rinti megoldás gyakorlati kivitelezésére azonban számosegyéb faj, nemzetség és törzs is alkalmas, melyek példái akövetkezők: Schizosaccharomyces pombe; among lower eukaryotic organism, the underlying mechanisms Saccharorayces cerevisiae (baker's yeast) host cell used alegáltalánosabban, the present valve Rint solution commonly available but a number of other genera, species, and strains are suitable, which are exemplified akövetkezők Schizosaccharomyces pombe; Xluyveromyces fajok,pl. Xluyveromyces species eg. K. lactis, X. fragilis (ATCC 12424), X. bulgaricus(ATCC 16045), X. víckaramii (ATCC 24173), K. waltii (ATCC5650C); Lactis, X. fragilis (ATCC 12424), X. bulgaricus (ATCC 16045), X. víckaramii (ATCC 24,173), K. waltii (ATCC5650C); λ. λ. drosophilarum (ATCC 36906), X. thermotolerans ésK. drosophilarum (ATCC 36,906), X and K thermotolerans. marxianus; marxianus; Yarrowia (EP 4 02 22 6); Yarrowia (EP 4 02 22 6); Pichia pás toris (EP 163 C70); Pichia pas Toris (EP 163 C70); Candida; Candida; Tríchoderma reesia (EP 244 234); Trichoderma reesia (EP 244,234);

Neurospora arassa; Reap rewards Neurospora; Schwanniomyces fajok, pl. Schwanniomyces such. Schwanniomycesoccidentalis; Schwanniomycesoccidentalis; és fonalas gombák, pl. and filamentous fungi, for example. Neurospora,Penicillium, Tolypocladium és Aspergíilus fajok, pl. Neurospora, Penicillium, Tolypocladium and Aspergillus species, eg. A.nidulans és A. niger. A.nidulans and A. niger. A glikozilált többértékű antitestek expresszáltatásárasoksejtű organizmusokból származó gazdasejtek alkalmasak. Host cells derived from glycosylated multivalent antibodies expresszáltatásárasoksejtű organisms suitable. Agerinctelenekből származó sejtek példáiként növényi sejtek és rovarse'tek em.lithetők. Examples of plant cells and cells from Agerinctelenekből rovarse'tek em.lithetők. Számos baculovírus törzset és 4 ··«· ·· ·· ·· • · ···«·«a ο ··* ··· « ··« ···· · · · « • ««« ·« ««4« «< - 156 - változatot (illetve ezekkel fertőzhető rovarsejteket) azo-nosítottak; Numerous baculoviral strains and 4 ·· "·· ·· ·· • · · · · ·« · «ο the * ··· ··" ·· '···· · · · «•« «« · «« "4" "<- 156 - version (or any infectable insect cells) were identified azo; ilyen pl. eg. a Spodoptera frugiperda, Aedesaegypti, Aedes albopictus, Drosophila melanogaster és Spodoptera frugiperda, Aedesaegypti, Aedes albopictus, Drosophila melanogaster and

Bombix móri. Bombix Mór. Számos transzfekcióra alkalmas vírustörzs is-meretes, mint pl. A number of viral strains for transfection are well-dimensioned like. az Autpographa californica NPV Ll-változata és a Bombyx móri NPV Bm-5-törzse. the Autpographa californica NPV LI Bombyx mori NPV version and the Bm-5 strain of. Az ilyen víru-sok a találmány gyakorlati kivitelezésében, elsősorbanSpodoptera frugiperda sejtek transzfektálására alkalmazha-tók . Such Viru and lots of practice of the invention, when used to transfect cells elsősorbanSpodoptera frugiperda Case.

Gazdasejtként növényi (pl. gyapot, kukorica, burgonya,szójabab, petúnia, paradicsom és dohány) sejtek tenyészetei is alkalmazhatók. Plant host cells (eg. Cotton, corn, potato, soybean, petunia, tomato, and tobacco) cells in culture may be used.

Mindazonáltal, legnagyobb érdeklődés a gerincesekbőlszármazó sejtekre irányult. However, most interest focused on vertebrates from cells. A gerinceseredetű sejtek tenyé-szetben történő szaporítása rutinszerű eljárássá vált [ld."Tissue Culture", Academic Press, szerk.; Propagation of vertebrate cells in a cell-cultures become a routine procedure [see. "Tissue Culture", Academic Press, eds .; Kruse ésPstterson (1973)]. ÉsPstterson Kruse (1973)]. Az emlőseredetű gazdasejt-vonalak példá-iként a következők említhetők: SV40-vírussal transzformált majomvese-eredetű CVl-vonal (COS-7, ATCC CRL 1651); Mammalian host cell lines, their examples are mentioned: SV40 virus transformed monkey kidney-derived CVL line (COS-7, ATCC CRL 1651); humánembrionális vesesejtek [293-as sejtek vagy szuszpenzió-tenyészetben végzett szaporításhoz szubklónozott 293-assejtek; human embryonic kidney cells [subcloned propagation on 293 cells or suspension culture in 293 assejtek; Graham és mtsai.: J. Gén. Graham et al .: J. Gene. Virol. Virol. 36, 59 (1977)]; 36, 59 (1977)]; kölyökhörcsög vesesejtek (BHK; ATCC CCL 10) ; baby hamster kidney cells (BHK, ATCC CCL 10); Kínai hörcsögoeze£észek-sejtek/-DHFR [CHO; Chinese hörcsögoeze £ EPC cells / -DHFR [CHO; Urlaub és mtsai.: Proc. Urlaub et al .: Proc. Natl.Acad. Natl. Sci. USA 77, 4216 (1980)]; Sci. USA 77: 4216 (1980)]; egéreredetű Sertoli-sejtekíT>!4; mouse sertoli sejtekíT> 4; Mather: Bioi. Mather, Biol. Repród. Reprod. 23, 243 (1980)]; 23, 243 (1980)]; majomvese- sejtek (CV1; ATCC CCL 70); majomvese- cells (CV1 ATCC CCL 70); Afrikai zöldmajom sejtek (VERO-76; ATCC CRL-1587;; humán méhnyakrék-carcinoma sejtek • · · ·» » # · · # ·«· . ··· • · * 157 (HELA; ATCC CCL 2); kutyavese-sejtek (MDCK; ATCC CCL 34);Buffalo-patkány májsejtek (BRL 3A; ATCC CRL 1442); humántüdősejtek (W138; ATCC CCL 75); humán májsejtek (Hep G2; HB8065); egér-emlőtumor (MMT 060562; ATCC CCL51); TRI-sejtek[Mather és mtsai.: Annals NY Acad. Sci. 383, 44 (1982)].MRC-5-sejtek; FS4-sejtek; humán hepatoma-sejtvonal (HepG2); valamint myeloma- és lymphoma-sejtek (pl Y0, J558L, P3és NSO; ld. 5 807 715 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírás). A gazdasejteket a fentebb leírt expressziós ésklónozóvektorokkal transzformáljuk, és hagyományos (apromóterek indukálásához, a transzformánsok szelektálásá-hoz, illetve a kívánt szekvenciákat kódoló gének amplifi-kálásáhcz megfelelően módosított) tápközegben tenyésztjük. (vili) A gazdasejtek tenyésztése A találmány szerinti töb »» # · · · # «;; ATCC CRL-1587 human cervical carcinoma cells • · · · · · · · · • * 157 (HELA,; African green monkey cells (VERO-76th ATCC CCL 2); kutyavese- cells (MDCK, ATCC CCL 34); buffalo rat liver cells (BRL 3A, ATCC CRL 1442); human lung cells (W138, ATCC CCL 75); human liver cells (Hep G2, HB8065); mouse mammary tumor (MMT 060562, ATCC CCL51) ; TRI cells [Mather et al .: Annals NY Acad Sci 383, 44 (1982)..] MRC-5 cells;. FS4 cells; human hepatoma cell line (HepG2), and myeloma- and lymphoma cells ( e.g. Y0, J558L, P3és NSO;.. No. 5,807,715 U.S. patent ld) the host cells are the expression ésklónozóvektorokkal above-described transformed and conventional (apromóterek induce the selection of transformants to or genes encoding the desired sequences amplified kálásáhcz culturing appropriately modified) medium. (viii) culturing the host cells of the invention, SSC bértékű antitestek előállítá-séra alkalmazott gazdasejteket számos különböző tápközegbentenyészthetjük. bértékű antibodies adjusted Sera used in many different host cells tápközegbentenyészthetjük. A gazdasejtek tenyésztésére alkalmazhatunkkereskedelmi forgalomban beszerezhető tápközegeket; The host cells can be obtained from commercial culture media used for culturing traffic; ilyenpl. ilyenpl. a Ham-féle FlO-tápközeg (Sigma), a Minimál EsszenciálisTépközec (MÉM, Sigma), az RPMI1640-tápközeg (Sigma) és aDulbeccc-féle módosított Eagle-tápközeg (DMEM, Sigma). Ham's FLO-medium (Sigma), Minimal the EsszenciálisTépközec (MEM, Sigma), in RPMI 1640 medium (Sigma) and aDulbeccc's Modified Eagle's Medium (DMEM, Sigma). Eze-ken kívül a következő forrásokban leírt tenyésztő tápköze-gek is alkalmazhatók: Ham és mtsai.: Meth. Eze outside-ken culture tápköze acid units described in the following references can be used: Ham et al .: Meth. Enzymol. Enzymol. 58, 44(1979); 58, 44 (1979); Barnes és mtsai.: Anal. Barnes et al .: Anal. Biochem. Biochem. 102, 255 (1980); 102, 255 (1980); Λ r 4 657 866, 4 927 762, 4 560 655 és 5 122 469 767 «»« »·* ·* • »·«* ··-« - 158 - számú Egyesült Államok-beli szabadalmi leírások, WO90/03430 és WO 87/00195 számú nemzetközi szabadalmi beje-lentés, valamint US Patent Re. Λ r 4657866, 4927762, 4560655 and 5122469767 «» «» * · · * • »·« * ·· - «- 158 - number of U.S. patents WO90 / 03430 and WO 87/00195, international patent No. Beje-Lentes and U.S. patent Re. 30 985. A felsorolt tápkö-zegek bármelyike szükség szerint kiegészíthető, pl. any one of 30 to 985 listed TAPKEN-medium was supplemented as needed, eg. hormo-nokkal és/vagy egyéb növekedési faktorokkal (pl. inzulin-nal, transzferrinnel vagy epidermális növekedési faktor-ral) , sókkal (pl. nátrium-, kalcium- és magnézium-kloriddalés foszfátokkal), pufferekkel (pl. HEPES-pufferrel),nukleotidokkal (pl. adenozinnal és timidinnel), antibioti-kumokkal (pl. gentamicinnel), nyomelemekkel (rendszerint μΜtartományba tartozó végkoncentrációban jelen lévő szervet-len vegyületek), valamint glükózzal vagy más, egyenértékűenergiaforrással. hormone-ions and / or other growth factors (eg. insulin-oxazolidinone, transferrin, or epidermal growth factor-ral), salts (eg. sodium, calcium and magnesium kloriddalés phosphates), buffers (eg. HEPES buffer); nucleotides (eg. adenosine and thymidine), antibiotics-kumokkal (eg. gentamicin), trace elements (inorganic compounds usually present at final concentrations for μΜtartományba), and glucose or an equivalent energy source. A tápközeg - a fentieken kívül - egyébszükséges anyagokkal is kiegészíthető, megfelelő koncentrá-cióban. The medium may - in addition to the above - be supplemented with other substances necessary, appropriate concentrations MLR. A tenyésztési feltételek (hőmérséklet, pH, stb.)kiválasztása szakember számára nem okoz gondot. Selecting culture conditions (temperature, pH, etc) is not a problem in the art. (ix) Az antitestek tisztítása (Ix) Purification of antibodies

Rekombináns technikák alkalmazása esetén a többértékű antitest intracellulárisan, a periplazmikus térben vagyközvetlenül· a tápközegbe kiválasztva állítható elő. When using recombinant techniques, the multivalent antibody is produced intracellularly, in the periplasmic space vagyközvetlenül · secreted into the medium can be obtained. Ameny-r.yiben az antitest-mutáns intracellulárisan termelődik, atisztítás első lépéseként a sejttörmeléket - pl. R.yiben correlated, the antibody mutant is produced intracellularly, as a first step atisztítás debris - eg. centrifu-gélással vagy ultraszűréssel - eltávolítjuk. centrifugation or ultrafiltration gélással - removed. Carter ésmtsai. Carter ésmtsai. E. coli periplazmikus terébe kiválasztott antitestekizolálására írtak le eljárást [Carter és mtsai.:3io/Technorogy 10, 163 (1992)]. E. coli has been described a method selected antitestekizolálására the periplasmic space [Carter et mtsai.:3io/Technorogy 10, 163 (1992)]. Röviden összefoglalva: a sejtmasszát nátrium-acetát (pH = 3,5), EDTA és fenil-metil- 159 szulfonil-fluorid (PMSF) jelenlétében kb. Briefly, cell paste is thawed sodium acetate (pH 3.5), EDTA, and 159 of phenylmethyl sulfonyl fluoride (PMSF) in the presence of approx. 30 perc alattfelolvasztjuk, majd a sejttörmeléket centrifugálással eltá-volítjuk. alattfelolvasztjuk 30 minutes, and cell debris by centrifugation for r-hydrazones. Amennyiben a többértékű antitest a tápközegbeszekretálódott, az ilyen expressziós rendszerek felülúszó-ját először kereskedelmi forgalomban beszerezhető protein-töményítő szűrő (pl. Amicon vagy Míllipore Pellicon ultra-szűrő egység) alkalmazásával töményítik be. Where the multivalent antibody tápközegbeszekretálódott the supernatant was adjusted from such expression systems are generally first concentrated by using a commercially available protein by the use of filter concentrator (eg., An Amicon or Millipore Pellicon ultra filtration unit). A proteolízismegakadályozása céljából a tisztítás bármelyik lépésébenproteáz-inhibitor (pl. PMSF-et) alkalmazható, illetve, aszennyező mikroorganizmusok szaporodásának gátlása céljábólantibiotikumok adagolhatok. For the purpose of inhibiting any proteolízismegakadályozása cleaning lépésébenproteáz inhibitor (eg. PMSF) may be used, or, aszennyező growth of microorganisms céljábólantibiotikumok administered. A sejtekből nyert antitest-készítmény, például,hidroxii-aparitos kromatográfiával, gélelektroforézissel,dialízissel vagy affinitás-kromatográfiával tisztítható,melyek közül az affinitás-kromatográfia előnyös. antibody composition prepared from the cells can be, for example, hydroxyl aparitos chromatography, gel electrophoresis, dialysis, and purified by affinity chromatography, with affinity chromatography being preferred. Az affini-tási iigardumot a többértékű antitestben lévő immunglobu-iin-Fc-domén fajtájától és izotípusától függően választjukki. választjukki the affinity-iigardumot depending on the IIN immunoglobulin Fc domain in the multivalent antibody species and isotype. A protein-Α a humán yl, y2 vagy y4 nehéz láncokon ala-puló antitestek tisztítására alkalmazható [Lindmark ésmtsai.: J. Immunéi. Protein A can be used to purify Α ala-pullover antibodies in human yl, y2, or? 4 heavy chains [Lindmark ésmtsai .: J. Immuno. Meth. Meth. 62, 1-13 (1963)], míg a protein-Gaz összes egérimm.unglobulin-izotípus és a humán y3 eseténalkalmas ÍGuss és mtsai.: EMBO J. 5, 1567 (1986)]. 62: 1-13 (1963)], while the total protein Gaz egérimm.unglobulin isotypes and for human? 3 in case ÍGuss et al .: EMBO J. 5: 1567 (1986)]. Az affi-nitás! The affinity-ices! lieandumot leggyakrabban agarózhoz kapcsoljuk, deegyéb közegek is rendelkezésre állnak. lieandumot most often connected to agarose, deegyéb media are also available. A mechanikailag sta-bil közegek - pl. The mechanically sta-bil media - eg. a szabályozott pórusméretű üveg vagypoli(sztirel-divinil)-benzol - az agarózzal elérhetőnél na-gyobb átfolyési sebességet és rövidebb feldolgozási időttesznek lehetővé. controlled pore glass or poly (styrenedivinyl) benzene - the agarose reached are n-átfolyési are greater speed and shorter processing times allow. Amennyiben az antitest-mutáns CH3-domént Where the antibody mutant CH3 domain

Itt» • · · · · · • · · · · · • · · · · · ·• · · • · ···· ·· - 160 - tartalmaz, a tisztításra "Bakerbond ABXTM" gyanta (JT Ba-ker, Philipsburg, NJ) alkalmazható. Here »• • · · · · · · · · · · · · · · · • · • · • · ···· ·· - 160 - it includes the cleaning" Bakerbond ABXTM "resin (JT Baker,, Phillipsburg, NJ) is useful. Az adott többértékű an-titesttől függően egyéb proteintisztítási technikák is al-kalmazhatók, mint pl. Depending on the particular polyvalent anti-titesttől Other techniques for protein purification sub-epoxidation like. az ioncserélő oszlopon végzett frak-cionálás, az etanolos precipitáció, a reverz fázisú, nagy-teljesítményű folyadékkromatográfia (RP-HPLC), szilikagélenvégzett kromatografálás, heparin-Sepharose™ oszlopon vég-zett kromatografálás, anion- vagy kationcserélő oszlopon(pl. poliaszparaginsav-oszlopon) végzett kromatográfia,kromatofókuszálás, SDS-PAGE és ammónium-szulfátos precipi-táció . with the ion-exchange column fractionation, ethanol precipitation, reverse-phase high-performance liquid chromatography (RP-HPLC) szilikagélenvégzett chromatography on heparin SEPHAROSE ™ column chromatography, anion or cation exchange column (eg. polyaspartic acid column ) chromatography, chromatofocusing, SDS-PAGE, and ammonium sulfate precipitation mentation. Ο Gyógyászati készítmények A zalálmány szerinti többértékű antitestek tárolásraalkalmas gyógyászati készítményeinek előállítása céljából akívánt zisztaságú többértékű antitestet megfelelő, fizioló-giai szempontból elfogadható hordozóval, kötőanyaggal vagystabilizélóanyaggal [Id. Ο medication to generate multivalent antibodies of the zalálmány stored in suitable pharmaceutical compositions of zisztaságú Desired multivalent antibody corresponding Fiziol Giai-acceptable carrier, excipient vagystabilizélóanyaggal [Id. "Remington' s PharmaceuticalSciences'', 16. kiadás, szerk. : A. Osoi (1980)] elegyítjük(vizes oldat, liofilizátum vagy más szárított készítményalakjában). Az erre a célra alkalmas hordozók, kötőanyagok és stabilizélószerek az alkalmazott dózisokban és koncent-rációkban nem lehetnek toxikusak a páciensre. Az ilyenanyagok jellemző példái a következők: pufferek (pl. fosz-fát, cizréz és egyéb szerves savak); antioxidánsok (pl.aszkorbinsav és metionin); tartósítószerek [pl. oktadecil-dimet i 1 -benzi l-ammónium-k lórid, hsxamet hon ium- klór id; - 161 - benzalkonium-klorid, benzethonium-klorid, fenol, butil-vagy benzilalkohol, alkilparabének (pl. metil- vagypropilparabén), catechol, rezorcinol, ciklohexanol, 3- pentanol, és m-krezol]; kis molekulatömegű (legfeljebb kb.10 aminosavas) polipeptidek; proteinek (pl. szérumalbumin,zselatin vagy immunglobulinok); hidrofil polimerek (pl.polivinilpirrolidon); aminosavak (pl. glicin, glutamin,aszparagin, "Remington's PharmaceuticalSciences '', 16th Edition, ed. A. Osol (1980)] is treated with (aqueous solution, a lyophilizate or other dried formulations form) suitable for this purpose carriers, excipients and stabilizélószerek the dosages and concentrations employed. concentrations were non-toxic to the patient Specific examples of such materials are: buffers (e.g. phosphate, cizréz and other organic acids.), antioxidants (pl.aszkorbinsav and methionine), preservatives [eg octadecyl dimethyl i 1 -benzyl.. ammonium k Loria hsxamet hon ium chloro id - 161 - benzalkonium chloride, benzethonium chloride; phenol, butyl or benzyl alcohol (e.g. methyl vagypropilparabén.), catechol, resorcinol, cyclohexanol, 3-pentanol, and m-cresol]; low molecular weight (less than about 10 residues) polypeptides, proteins (such as serum albumin, gelatin or immunoglobulins.), hydrophilic polymers (pl.polivinilpirrolidon); amino acids (such as glycine, glutamine, asparagine. hisztidin, arginin vagy lizin); mono-szacharidok, diszacharidok és egyéb szénhidrátok (pl. histidine, lysine or arginine), monosaccharides, disaccharides, and other carbohydrates (e. glü-kóz, mannóz vagy dextrinek); glucose is glucose, mannose or dextrins); kelátképzők (pl. EDTA); chelators (e.g. EDTA.); cukrok(pl. szacharóz, mannitol, trehalóz vagy szorbitol); sugars (e.g. sucrose, mannitol, trehalose or sorbitol.); sóképzőellenionok (pl. nátrium); sóképzőellenionok (e.g. sodium.); fémkomplexek (pl. Zn-proteinkomplexek); metal complexes (e.g. Zn-protein complexes.); és/vagy nemionos felületaktív anyagok [pl.Tween®, Pluronics™ vagy polietilénglikol (PEG)]. and / or nonionic surfactants [pl.Tween®, PLURONICS ™ or polyethylene glycol (PEG)]. A találmány szerinti gyógyászati készítmény - az adottindikációtól függően - egynél több (előnyösen egymás hatá-sát károsan nem befolyásoló) aktív hatóanyagot is tartal-mazhat. The pharmaceutical composition according to the invention - depending on adottindikációtól - more than one (preferably one other decision-SAT has no adverse effect) of active ingredient-containing mazhat. Az aktív vegyületek kombinációinak példáit a "G"szakaszban ("A többértékű antitestek in vivő alkalmazásai”)ismertetjük. Az ilyen molekulákat előnyösen az elérni kí-vánt célnak megfelelő kombinációban alkalmazzuk. Examples of combinations of active compounds can be found in the "G" phase ( "The multivalent antibodies used in vivo"). Such molecules preferably achieve into a desired purpose, an appropriate combination.

Az aktív összetevők mikrokapszulába is foglalhatók,amely, például, koacervációs technikával (hidroxi-metileéllulóz vagy zselatin mikrokapszula) vagy határfelü-leti polimerirációval állítható elő (poli(metil-metakrilát)-mikrokapszula]. Más módon, az aktív összetevőkkolloidális eélbajuttató-rendszerekbe (pl. liposzómák, al-btm: n-z'ó krcgöm.bök, mikroemulziók, nanoszemcsék és ···· ·· · · · • «·*······ ·· · · · · ·• · · ···· ♦« ··*· ·· - 162 - nanokapszulák) vagy makroemulziókba foglalhatók. Az ilyentechnikák leírását ld.: Remington's Pharmaceutical The active ingredients in microcapsules is prepared, for example, be prepared by coacervation techniques (hydroxymethyl metileéllulóz or gelatin microcapsules) or határfelü-lations polimerirációval (poly (methyl methacrylate) -mikrokapszula]. Alternatively, the active ingredients colloidal eélbajuttató-systems (e.g. . liposomes, al-BTM: n z'ó krcgöm.bök, microemulsion, nanoparticles and ···· ·· · · · • "······ ·· * · · · · · · · · · • ♦ · · · «· * ·· ·· - 162 - nanocapsules) or in macroemulsions such techniques are described .: Remington's Pharmaceutical.

Sciences, 16. kiadás, szerk.: Osol (1980)]. Sciences, 16th edition, Eds .: Osol (1980)].

Az ín vivő adagolásra szánt készítményeknek sterilek-nek kell lenniük, ami steril szűrőmembránok alkalmazásávalvégzett szűréssel egyszerűen biztosítható. compositions intended for in vivo administration must be sterile's, is readily accomplished by sterile filtration membranes by application by means of filtration. A találmány szerinti megoldás értelmében tartós ható-anyag-kibocsátású készítmények is előállíthatok. sustained-release formulations of active compound also can be prepared pursuant to the present invention. Az ilyenkészítmények jellemző példái közé tartoznak a többértékűantitestet tartalmazó, szilárd hidrofób polimerekből készí-tett féligáteresztő ágyazóanyagok, amelyek pl. Exemplary compositions include semipermeable matrices draw-in of solid hydrophobic multivalent antibody containing polymers which can be e. filmek vagymikrokapszulák formájában állíthatók elő. It can be prepared as a film or microcapsules. A tartós ható-anyag-felszabadulást biztosító ágyazóanyagok példái a kö-vetkezek: poliészterek; matrices examples of sustained-release material may be co-sin polyesters; hidrogélek [pl. hydrogels [e. poli(2-hidroxietil-metakriiét) vagy polivinilalkohol]; poly (2-hydroxyethyl-methacrylate), or polyvinyl alcohol]; polilaktidok (3 773 919számú egyesült államokbeli szabadalmi leírás); polylactides (U. S. Patent 3,773 919számú); L-glutaminsav és γ-etii-L-glutamát kopolimerei; L-glutamic acid and γ ethyl-L-glutamate; lebonthatat-lan etilén-vinilacetát kopolimerek; lan-degradable ethylene-vinyl acetate copolymers; lebontható tejsav-glikolsav kopolimerek (pl. LUPRON DEPOT™, amely tejsav-glikolsav kopolimerból és leuprolid-acezátból álló, injek-tálható mikrogömb készítmény); degradable lactic acid-glycolic acid copolymers (such as the LUPRON DEPOT ™, which is composed of lactic acid-glycolic acid copolymer and leuprolide acezátból, injectable microsphere formulation.); és poli-D-(-)-3-hidroxivajsav. and poly-D - (-) - 3-hydroxybutyric acid. Míg az olyan polimerek, mint az etilén-vinilacetát és a tejsav-glikolsav kopolimer, a beléjükágyazott molekulák felszabadulását 100 napnál hosszabb ide-ig biztosítják, bizonyos hidrogélek a proteineket rövidebbidő alatt bocsátják ki. While polymers such as ethylene-vinyl acetate and lactic acid-glycolic acid copolymer, beléjükágyazott release of molecules for over 100 days to provide fins, certain hydrogels release proteins for shorter time periods. Ha az ágyazóanyagba foglalt anti-testek hosszú ideig maradnak a testben, a nedvesség és a 37°C-os hőmérséklet együttes hatásának következtében denatu- - 163 - rálódhatnak vagy aggregálódhatnak, ami biológiai aktivitá-suk csökkenését és immunogenitásuk esetleges változásáteredményezi. If anti-bodies encapsulated remain in the body for a long time, due to the combined effect of humidity and temperature of 37 ° C in denatured - 163 - rálódhatnak or aggregate, which is a loss of biological változásáteredményezi Aktivität-suk and potential immunogenicity. Az adott mechanizmustól függően stabilizációsstratégiák tervezhetők. Depending on the mechanism stabilizációsstratégiák planned. Például, ha az aggregáció tio- diszulfid átalakulás következtében kialakult inter- molekuláris SS kötéssel következik be, a stabilizáció aszulfhidril-gyökök módosításával, savas oldatokból végzettliofilizálással, a nedvességtartalom szabályozásával(megfelelő adalékanyagok alkalmazásával), és specifikus po-limer ágyazóanyag-készítmények kifejlesztésével valósítható mea. For example, when formed as a result of aggregation thio- disulfide interchange inter- occurs molecular SS bond, stabilization can be achieved aszulfhidril radicals modifying acidic solutions végzettliofilizálással, controlling moisture content (using appropriate additives), and a specific polyethylene copolymer matrix compositions developing mea . í) A többértékű antitest nem gyógyászati célú alkalmazásai A találmány szerinti többértékű antitest affinitás-tisztítási ágensként alkalmazható. f) The use of multivalent antibody non-therapeutic multivalent antibody of the invention can be used for affinity purification agent. Ennek során a többértékűantitestet szilárd fázison (pl. Sephadex-gyanta vagy szűrő-papír) , jói ismert módszerekkel immobilizáljuk, majd az immobilizált többértékű antitestet a tisztítani kívánt an-tigént tartalmazó mintával érintkeztetjük, és ezután a hor-dozót megfelelő oldószerrel mossuk, amely - a tisztítanikívánt, és az immobilizéit antitesthez kötődő antigén kivé-telével - a mintában lévő valamennyi anyagot eltávolítja.Végül a hordozót egy másik alkalmas oldószerrel, pl.glicin-pufferrel (pH = 5,0) mossuk, amely a többértékű an-titestről leválasztja az antigént. In doing so, the multivalent antibody solid phase (e.g., Sephadex resin or filter paper), well-known methods is immobilized and then the immobilized multivalent antibody is contacted with a sample containing the to be purified anti-tigént, and then the carrier-Fm washed with a suitable solvent that - the tisztítanikívánt and immobilizéit binding antibody antigen-Ground exception - all the material in the sample eltávolítja.Végül the carrier with another suitable solvent, washed pl.glicin buffer (pH 5.0), which is a polyvalent anti-disconnect the titestről antigen. A találmány szerinti többértékű antitest diagnosztikaitesztekben - például, egy vizsgált antigén specifikus sej- ···· ·· ·· · · • ······ ··· «·· · ···• « · ···» ·· ···· · · - 164 - tekben, szövetekben vagy vérsavóban bekövetkező termelődé-sének detektálására - is alkalmazható. The multivalent antibody of the invention in diagnostic tests - for example, of an antigen specific sej- ···· ·· ·· · ······ ··· • «··· ·· · •« ··· · »· · · · ···· - detecting Sene-produced in your mind, tissues, or serum - - 164 may be used.

Diagnosztikai célú felhasználás esetén a többértékűantitestet rendszerint detektálható jelölőanyaggal jelöl-jük. For diagnostic applications, the multivalent antibody is typically marked with a detectable moiety-Juk. Számos jelölőanyag ismeretes, melyek általánosan a kö-vetkező csoportokba sorolhatók: (a) Radioaktív izotópok (pl. 35S, 14C, 125I, 3H vagy lolI) . Many tracer is known, which generally fall into the stone, sin groups: (a) Radioisotopes (such as 35S, 14C, 125I, or 3H LOLIN.). A polipeptid-változat radioaktív izotópos jelölése,például, a következő forrásban leírtak szerint hajthatóvégre: "Current Protocols in Immunology", 1. és 2. kötet,szerk.: Coligen, Wiley-Interscience, New York, New YorkPubs. The polypeptide variant is labeled with radioisotopes, such as described in the following may be carried out by boiling, "Current Protocols in Immunology", Volumes 1 and 2, Eds .: Coligan, Wiley-Interscience, New York, New YorkPubs. (1991), és a radioaktivitás szcintillációs számlálás-sal mérhető. (1991), and the radioactivity was measured by scintillation counting sal. (b) Fluoreszcens jelölők, pl. (B) Fluorescent labels such. ritkaföldfém-kelátok(európium-kelátok vagy fluoreszcein és származékai,rodamir. és származékai, dansyl, Lissamine, fikoeritrin ésTexas-vörös. A fluoreszcens jelölők többértékű antitestheztörténő konjugálását illetően ld. pl. a fentebb idézett forrást. A fluoreszcencia fluoriméter alkalmazásával mérhe- uC . rare earth chelates (europium chelates or fluorescein and its derivatives, rodamir. and its derivatives, dansyl, Lissamine, phycoerythrin ésTexas-red. The fluorescent labels multivalent antibody and hints Conjugation regard see. e. the cited source above. The use of fluorescence fluorimeter measurable uC.

{C; {C; Enzim-szubsztrát jelölők; Enzyme substrate labels néhányuk leírását ille-tően ld. As regards some description-see. a 4 275 149 számú egyesült államokbeli szabadalmileírást. U.S. Patent No. 4,275,149. Az enzim rendszerint egy kromogén szubsztrát kémi-ai átalakulását katalizálja, ami különféle technikák alkal-mazáséval mérhető. The enzyme generally catalyzes a chemical alteration of the chromogenic substrate ai, measured various techniques alkali mazáséval. Például, az enzim a szubsztrátban szín-változást katalizál, ami spektrofotometriai módszerrel mér-hető. For example, the substrate of the enzyme catalyzes a color change that can be measured-spectrophotometric method. Más módon, az enzim megváltoztatja a szubsztrátfluoreszcenciáját vagy kemilumineszcenciáját. Alternatively, the enzyme may alter the szubsztrátfluoreszcenciáját or chemiluminescence. A 165 fluoreszcencia-változás kvantitatív meghatározási módszere-it fentebb ismertettük. 165 The change in fluorescence quantitative determination method, it is described above. A kemilumineszcens szubsztrát kémi-ai reakció következtében elektromosan gerjesztődik, ésfényt emittál, ami, például, kemiluminométerrel mérhető,vagy egy fluoreszcens fogadómolekulának energiát ad át. The chemiluminescent substrate is electrically excited by a chemical and ai reaction, emits ésfényt, which, for example, transmits measured kemiluminométerrel or a fluorescent acceptor energy. Azenzimatikus jelölők példái közé tartoznak a lucíferázok(pl. szentjánosbogár-luciferáz és bakteriális luciferáz;4 737 456 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírás);luciferin, 2,3-dihidro-ftalazin-dionok, malát dehidrogenáz,ureáz, peroxidáz (pl. tormaperoxidáz; HRPO), alkalikusfoszfatáz, β-galaktozidáz, glükoamiláz, lizozim, cukoroxidázok (pl. glükóz oxidáz, galaktóz oxidáz és glükóz-6-foszfát dehidrogenáz), heterociklikus oxidázok (pl. urikázés xantin oxidáz), laktoperoxidáz, mikroperoxidáz és hason-lók. Azenzimatikus labels include luciferases (e.g., firefly luciferase and bacterial luciferase;. No. 4,737,456, U.S. Patent specification), luciferin, 2,3-dihydro-phthalazine diones, malate dehydrogenase, urease, peroxidase (such as horseradish peroxidase.; HRPO), alkaline phosphatase, β-galactosidase, glucoamylase, lysozyme, cukoroxidázok (eg. glucose oxidase, galactose oxidase, and glucose-6-phosphate dehydrogenase), heterocyclic oxidases (e. urikázés xanthine oxidase), lactoperoxidase, microperoxidase and the like glycols. Az enzimek antitestekhez történő konjugálásának mód-szereit illetően ld.: O'Sullivan és mtsai.: Methods in conjugating enzymes to antibodies mode-mounted regards .: see O'Sullivan et al .: Methods in

Snzym. Snzym. 7 3, 147 (1981). 7 3, 147 (1981).

Az enzim-szubsztrát kombinációk jellemző példáiként említhetők a következők: (i) Tormaperoxidáz (HRPO) és hidrogén-peroxidázszubsztrát; Suitable examples of enzyme-substrate combinations are characterized as follows: (i) Horseradish peroxidase (HRPO) with hydrogen peroxidase; a hidrogén-peroxidáz színezék-prekurzort oxidál(pl. ortofenilén-diamin (OPD) vagy 3,3',5,5'-tetrametil- benzidin-hidroklorid (TM3)] (ii) alkalikus foszfatáz (AP) és para-nitro-fenil-foszfét (kromogén szubsztrát); és (iii) β-D-galaktozidáz (β-D-Gal) és kromogénszubsztrát (pl. p-nitro-fenil-3-D-galaktozidáz) vagyfluorogén szubsztrát (4-metii-umbelliferil^-D-galaktozi- « ·· - 166 - dáz) . wherein the hydrogen peroxidase oxidize a dye precursor (e. orthophenylene diamine (OPD) or 3,3 ', 5,5'-tetramethyl benzidine hydrochloride (TM3)] (ii) alkaline phosphatase (AP) with para-nitro phenyl phosphate (chromogenic substrate); and (iii) β-D-galactosidase (β-D-Gal) and chromogenic substrate (e.g., p-nitrophenyl-3-D-galactosidase) vagyfluorogén substrate (4-methyl-umbellipheryl ^ D-galaktozi- «·· - 166 - peroxidase).

Szakember számára számos egyéb enzim-szubsztrát kombi-náció ismeretes. skilled in the art many other enzyme-substrate combi nation known. Ezek összefoglaló áttekintését illetőenld. These illetőenld summary overview. a 4 275 149 és 4 318 980 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírásokat. of 4,275,149 and No. 4 318 980 US patents.

Bizonyos esetekben a jelölőt közvetve kapcsoljuk a többértékű antitesthez; In some cases, the label is indirectly connected to the multivalent antibody; ennek technikái szakember számára jól ismertek. Techniques for this are well known. Például, az antitestet biotinhoz konjugálhat-juk, és a jelölőanyagok fentebb felsorolt három csoportjábatartozók bármelyike avidinhez konjugálható (és fordítva). For example, the antibody-biotin konjugálhat sulfate and conjugated to the tracers three avidin belonging to any group listed above (and vice versa). Abiotin szelektíven kötődik az avidinhez, és így a jelölőindirekt módon konjugálható a többértékű antitesthez. Biotin binds selectively to avidin and thus, the manner jelölőindirekt conjugated multivalent antibody. Másmódon, a jelölő röbbértékű antitesthez történő közvetettkonjugálása érdekében a többértékű antitestet kisméretűhapténhez (pl. digoxin) kapcsoljuk, és a jelölők fentebbemlített valamely másik típusát anti-haptén polipeptid-változattal (pl. anti-digoxin antitesttel) konjugáljuk. Alternatively, to achieve közvetettkonjugálása röbbértékű of the label antibody to the multivalent antibody coupled kisméretűhapténhez (eg. Digoxin) and markers fentebbemlített another type of conjugated polypeptide variants (eg. Anti-digoxin antibody) of anti-hapten. Ez-zel a módszerrel a jelölőanyag közvetett módon konjugálható a többértékű antitesthez. This zel-way, the label can be conjugated indirectly to the multivalent antibody. A találmány egy következő megvalósítási módja értelmé-ben a többértékű antitestet nem szükséges jelölővel ellát-ni; The invention is another embodiment of a pin in the sense multivalent antibody need not tend ni; a többértékű antitest jelenléte a hozzá kötődni képes,jelölt antitest alkalmazásával detektálható. the presence of the multivalent antibody binds thereto can be detected using a labeled antibody. A találmány szerinti többértékű antitest bármely is-mert vizsgálati eljárásban felhasználható, így például kom-petitív kötődési tesztekben, direkt és indirekt szendvics-tesztekben és immunprecipitációs tesztekben [Zola:"Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques", 147-158. The multivalent antibody can be used for any well-assay, such as comm petitív binding assays, direct and indirect sandwich assays, and immunoprecipitation assays [Zola of the invention "Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques": 147-158. • · · · • · - 167 - old., CRC Press, Inc. (1987)]. • · · · • · - 167 - old, CRC Press, Inc. (1987)].. A többértékű antitest in vivő diagnosztikai tesztekbenis alkalmazható; The multivalent antibody can also be used for in vivo diagnostic assays; az antitestet általában radionukliddal(pl. 113·1η, 90Tc, i4C, 131I, 125I, 3H, 32P vagy 35S) jelöljük, oly módon, hogy az antigén (vagy az antigént termelő sej-tek) immunszcintiográfiás módszerrel lokalizálható(k) le-gyen (ek) . the antibody is labeled generally radionuclide (eg. 113 · 1η, 90Tc, i4C, 131I, 125I, 3H, 32P or 35S) so that the antigen (or antigen-producing cells-tek) immunoscintiography localized (k) removing mark (s). G) A többértékű antitestek in vivő alkalmazásai A találmány szerinti megoldás értelmében a találmányszerinti többértékű antitest betegségtől vagy rendellenes-ségtől szenvedő (vagy annak kialakulásával veszélyeztetett)emlősök kezelésére alkalmazható (például, olyan páciens ke-zelésére, akinek állapotában a többértékű antitest adagolá-sának hatására javulás várható). G) The multivalent antibodies in vivo applications for the treatment of the invention the multivalent antibody is suffering from a disease or disorder, ségtől (or at risk of the development) of mammals According to the present invention (e.g., treatment of a patient upon whom the state of the multivalent antibody dosing Misa improvements are expected).

Amennyiben az antitest ErbB2-receptorhoz (pl. HER2-höz) kötődik, az antitesttel kezelhető állapotok jellemzőpéldái közé tartoznak a következők: jóindulatú és malignánstumorok; Where the antibody binds to ErbB2 (. E.g. HER2) antibody suitable for treatment using the conditions specific examples include: benign and malignánstumorok; leukózisok és limfoid malignáns betegségek; leukemias and lymphoid malignancies; vala-mint egyéb rendellenességek, mint pl. somehow, like other disorders, such as. idegsejt-, gliasejt-,asztroeita-, hipotalamusz-, mirigy-, makrofág-, epithelsejt-, strema-, blasztocöl-, gyulladásos, angiogénés immunológiai rendellenességek. neuronal, glial, asztroeita-, hypothalamic, glandular, macrophagal, epithelial, strema-, blastocoelic, inflammatory, angiogenic immunological disorders. Az ERbB-receptorhoz kötő-dő antitesttel kezelhető betegség vagy rendellenesség jel-lemzően rákos betegség. DO-curable binding antibody of the ErbB receptor signal disease or disorder is cancer of their profiles. A találmány szerinti megoldás érteimében kezelhető rá-kos betegségek példái közé tartozik, többek között, a • ···· ·· ·« ·· * · ······ ·· ··· «·« · ··· ···· · ·· · 168 karcinoma, limfoma, blastoma, sarcoma, leukózis és amalignáns limfoid rendellenességek. The use According to the solution according to the invention onto rams diseases are exemplified, among others, • ···· ·· · «* · ·· ·· ······ ···" · "· · · · · · · · · · ·· 168 carcinoma, lymphoma, blastoma, sarcoma, and leukemia or lymphoid disorders amalignáns. A rákbetegségek konkrétpéldái közé tartoznak a következők: pikkelysejtes rák, tü-dőrák (kis sejtes és nem kis sejtes tüdőrák), tüdő-adenokarcinoma és pikkelysejtes tüdő-karcinoma, hashártya-rák, hepatocelluláris rák, gyomor vagy hasi rákok, pl.gastrointestinalis rák, hasnyálmirigy-rák, glioblastoma,méhnyakrák, petefészekrák, máj rák, húgyhólyagrák, hepatoma,emlőrák, vastagbélrák, végbélrák, vastag-végbélrák,endometrium vagy méh karcinoma, nyálmirigyrák, veserák,prosztatarák, szeméremtest-rák, pajzsmirigyrák, máj-karcinoma, valamint fej- és nyakrák. The cancer specific examples include squamous cell cancer, lung cancer (small cell and non-small cell lung cancer), lung adenocarcinoma and squamous cell lung carcinoma, peritoneal cancer, hepatocellular cancer, gastric or stomach cancer pl.gastrointestinalis cancer, pancreatic cancer, glioblastoma, cervical cancer, ovarian cancer, liver cancer, bladder cancer, hepatoma, breast cancer, colon cancer, rectal cancer, colorectal cancer, endometrial or uterine carcinoma, salivary gland cancer, kidney cancer, prostate cancer, vulval cancer, thyroid cancer, hepatic carcinoma, and head - and neck cancer. A szóban forgó rákok általában olyan sejtekkel jelle-mezhetők, amelyek az antitest által megköthető antigénttermelik, így az antitestek képesek a tumorhoz kötődni. Cancers are generally said to cells can be characterized which are bindable by the antibody produced by antigen, such antibodies are capable of binding to the tumor. Atalálmány egyik megvalósítási módja szerint a rák az anti-gén (pl. ErbB2-receptor) túltermelésével jellemezhető. In one embodiment Atalálmány cancer characterized by overexpression of anti-gene (eg. ErbB2). Azantigén ráksejtek általi termelésének meghatározására kü-lönféle diagnosztikai és prognosztizáló tesztek állnak ren-delkezésre. Azantigén by determining the production of cancer cells in connection with various diagnostic and prognostic tests are ren-ticularly. Az egyik megvalósítási mód értelmében az anti-gén tűlnermelődését immunhisztokémiai vizsgálattal (IHC),például - HER2-antigén esetében - HERCEPTEST® (Dako) alkal-mazáséval teszteljük. In one embodiment tűlnermelődését such as immunohistochemistry (IHC), antigen - for HER2 antigen - are tested HERCEPTEST® (Dako) alkali mazáséval. AH£R2-IHC-tesztben tumor-biopsziábólszármazó, paraffinba ágyazott szövetmetszeteket vizsgálunk,és a szöveteket a ErbB2-protein festődési intenzitása alap-ján értékeljük, a következők szerint: 0 = festődés nem tapasztalható, vagy a tumorsejtek keve-sebb, mint 10 %-éban figyelhető meg meiröránfestődés; H £ R2 IHC assay tested tumor biopsziábólszármazó, paraffin-embedded tissue sections, and the tissue of the ErbB2 protein evaluated staining intensity basic-Jan, as follows: 0 = staining can be observed, or the tumor cells mixing more than 10% meiröránfestődés -éban observed; • ** · • · « 169 1+ = a tumorsejtek több, mint 10 %-ában gyenge, alig észre-vehető membránfestődés detektálható, a sejtek csak membrán-juk egy részén festődnek; ** • · • · «= 169 1 + tumor cells in a part of more than 10% of the poor, barely-perceptible membrane staining is detected, the cell membrane only Juk stained; 2+ - a tumorsejtek több, mint 10 %-ában enyhén/mérsékeltenteljes membránfestődés figyelhető meg; 2+ - the tumor cells more than 10% of mild / mérsékeltenteljes membrane staining is observed; 3+ = a tumorsejtek több, mint 10 %-ában mérsékelten/erősenteljes membránfestődés figyelhető meg. 3+ = tumor more than 10% of moderate / erősenteljes membrane staining is observed. A "0" vagy "1+" HER2-túltermelődési pontszámmal érté-kelt tumorok az HER2-t nem túltermelő tumorként jellemezhe-tők, míg a "2+" és ”3+" pontszámú tumorok az HER2-t túlter- melőkéuz azonosíthatók. Más módon, vagy ezen túlmenően, formalinnal fixált,paraffinba ágyazott tumorszövet felhasználásával, a tumorEER2-túitermelése mértékének (ha kimutatható egyáltalán)meghatározására FISH-teszteket - például, INFORM™ (Ventana,Arizona' - vagy PATHVISION34-tesztet (Vysis, Illinois) vé-gezhetünk. A nalálmány egyik megvalósítási módja szerint a rákErbB-reoeptor (pl. EGER, ErbB3 vagy ErbB4) termelésével(vagy túlzott mértékű termelésével) jellemezhető. Az EGFR-t, Erb33-at vagy Erb34-et termelő (túlzott mértékben terme-lő) rákok példái közé tartoznak a következők: pikkelysejtesrák, tüdőrák (kis sejtes tüdőrák, nem kis sejtes tüdőrák,tüdő-adenokarcinoma és pikkelysejtes tüdő-karcinoma), has-hértyarék, hepatocellu tumors of the score "0" or "1 +" HER2 overexpression in agreement with the HER2-overexpressing not be characterized, needles, and "2+" and "3+" point tumors with HER2 over- melőkéuz identified. Alternatively, or additionally, formalin-fixed, using paraffin-embedded tumor tissue (if detectable at all) to determine the extent of the tumorEER2-túitermelése FISH tests - for example, INFORM ™ (Ventana, Arizona '- or PATHVISION34 test (Vysis, Illinois) it possible -gezhetünk. in one embodiment of the nalálmány characterized by rákErbB-reoeptor (eg. a mouse, ErbB3 or ErbB4) production (or excessive production). EGFR, Erb33 at or Erb34 was producer (overexpressing ) cancers include the following: pikkelysejtesrák, lung cancer (small cell lung cancer, non-small cell lung cancer, lung adenocarcinoma and squamous cell lung carcinoma), stomach-hértyarék, hepatocellu láris rák, gyomor vagy hasi rákok,pl. gastrointestinalis rák, hasnyálmirigy-rák,glioblastoma, méhnyakrák, petefészekrák, máj rák, húgyhó-lyagrák, hepatoma, emlőrák, vastagbélrák, vastag- és vég- - 170 • *« «« bélrák, endometrium- vagy méh-karcinoma, nyálmirigy-karcinoma, veserák, prosztatarák, szeméremtest-rák, pajzs-mirigyrák, má jkarcinoma, valamint fej- és nyakrák ésglioblastoma. molar cancer, gastric or stomach cancer including gastrointestinal cancer, pancreatic cancer, glioblastoma, cervical cancer, ovarian cancer, liver cancer, húgyhó-lyagrák, hepatoma, breast cancer, colon cancer, colorectal compensating -. 170 • * «« «bowel cancer, endometrial or uterine carcinoma, salivary gland carcinoma, kidney cancer, prostate cancer, vulval cancer, thyroid gland cancer, jkarcinoma sec, and head and neck cancer ésglioblastoma. A találmány szerinti megoldás értelmében kezelhető rákegy ErbB-receptor (pl. EGFR) túlzott aktiválásával jelle-mezhető. be treated by the present invention a cancer, ErbB receptors (eg. EGFR) can be characterized by excessive activation. A túlzott aktiválás az ErbB-receptor vagy egyErbB-ligandum túltermelődésének tudható be. Excessive activation due to the receptor or ErbB ligand overexpression-egyErbB. A találmányegyik megvalósítási módja szerint diagnosztikai vagy prog-nosztikai tesztet végzünk annak megállapítására, hogy a pá-cienst sújtó rákra jellemző-e egy ErbB-receptor túlzott ak-tiválása. According to one embodiment of the invention, a diagnostic or prog-nostic tests were run to determine whether an excessive ErbB receptor ak tiválása any characteristic affecting the bye-deficient cancer. Például, a rákban meghatározható az ErbB-génamplifikációja és/vagy az ErbB-receptor túltermelődése. For example, the cancer can be determined ErbB gene amplification and / or overexpression of an ErbB receptor. Azamplifikáció/túltermelődés meghatározására különféle tesz-tek állnak rendelkezésére (pl. IHC, FISH és "shed" antigén-teszt) . determining Azamplifikáció / overproduction of various-tek will be available (eg. IHC, FISH and "shed" antigen test). Más módon, vagy ezen túlmenően, a tumorral össze-függő ErbB-ligandum (pl. TGF-α) mennyisége is jól ismertvizsgálati eljárásokkal határozható meg. Alternatively, or additionally, the amount of tumor ErbB ligand (eg. TGF-α) can also be dependent determined by well known assays. Az ilyen tesztek-kel a vizsgálandó mintában lévő proteint és/vagy az azt kó-doló nukleinsavat detektálhatjuk. Such tests, cabbage protein and / or its coding sequence, from coding nucleic acid in the sample to be tested can be detected. A találmány egyik megva-lósítási módja szerint a tumorban lévő ErbB-ligandum meny-nyiségét immunhiszfokémiai vizsgálattal (IHC) határozzukmeg ~ld. According to an embodiments of the method of the invention is an ErbB ligand quantity contained in the tumor immunhiszfokémiai assay (IHC) határozzukmeg ~ ld. pl. eg. Scher és mtsai.: Clin. Scher et al .: Clin. Cancer Research 1, 545(1995)]. Cancer Research 1, 545 (1995)]. Más módon, vagy ezen túlmenően, a vizsgálandó min-tában az BrbB-ligandumot kódoló nukleinsav mennyiségét,például, fluoreszcens in situ hibridizációval vagy FISH-teszttel, Southern-blot analízissel vagy polimeráz- Iáncreakcics technikával tesztelhettük. Alternatively, or additionally, the amount of nucleic acid encoding the ligand to be tested BrbB min parotid, for example, fluorescence in situ hybridization or FISH test oven tested by Southern blot analysis or polymerase Iáncreakcics technique.

- 171 - - 171 -

Az ErbB-receptor vagy ErbB-ligandum túltermelődésevagy amplifikációja in vivő diagnosztikai tesztekkel ismeghatározható, például, oly módon, hogy a páciensnek a de-tektálni kívánt molekulához kötődni képes - detektálhatójelölővel (pl. radioaktív izotóppal jelzett) - molekulát(pl. antitestet) adtunk be, és a pácienst a jelölő lokali-zálása céljából külsőleg pásztázzuk át. Moreover, ErbB receptor or ErbB ligand túltermelődésevagy amplification ismeghatározható in vivo diagnostic assays, e.g., so as to bind the molecule to the patient to be the de-tektálni able - molecule (i. Eg antibody) were administered - detektálhatójelölővel (labeled eg radiolabelled). and a patient externally scanned in order to ensure the phasing marker localization.

Amennyiben az antitest B-sejt-felületi antigénhez kö-tődik, az antitest a következő rendellenességek kezelésérealkalmazható: 3-sejt-limfomák (pl. alacsony fo-kú/follicularis nem-Hodgkin limfoma (NHL), kis limfocitás(SL) HNL, közepes fokú/follicularis NHL, közepes fokú dif-fúz NHL, magas fokú immunoblasztikus NHL, magas -fokúlimfoblasztikus NHL, magas fokú, kisméretű nem hasadt sej-tes NHL, tajtékos sejtes NHL, AIDS-szel összefüggő limfomaés Waldenstrom-féle makroglobulinémia) / krónikus limfocitásleukémia (CLL), akut limfoblasztos leukémia (ALL), szőrössejtes leukémia, krónikus mieloblasztcs leukémia és transz-plantáció utáni limfoproliferatív rendellenesség (PTLD). Where the antibody B-cell surface antigen co-toluidine, the antibody, the following disorders may be applied: 3-cell lymphomas (such as low-fo-kú / follicular non-Hodgkin's lymphoma (NHL), small lymphocytic (SL) HNL medium. grade / follicular NHL, intermediate grade difluoro-willow NHL, high grade immunoblastic NHL, high -fokúlimfoblasztikus NHL, high grade small non-cleaved cell NHL, foamy cell NHL, AIDS-related limfomaés Waldenstrom's macroglobulinemia) / chronic limfocitásleukémia (CLL), post-acute lymphoblastic leukemia (ALL), hairy cell leukemia, chronic leukemia and trans mieloblasztcs transplantation in lymphoproliferative disorder (PTLD).

Az antitest (pl. B-sejt-felületi antigén elleni anti-test) autoimmun betegségek kezelésére is alkalmazható. Antibody (eg. An antibody directed against B-cell surface antigen) may also be used to treat autoimmune diseases. Azautoimmun betegségek vagy rendellenességek példái közé tar-toznak, többek között, a következők: gyulladásos reakciók,pl. Azautoimmun diseases or disorders include, but are held unchanged tar, inter alia, the inflammatory responses, eg. gyulladásos bőrbetegségek, ideértve a psoriasist és adermatitist (pl. atopiás dermatitis); inflammatory skin diseases including psoriasis and adermatitist (e.g. atopic dermatitis.); szisztémásscleroderma és sclerosis; szisztémásscleroderma and sclerosis; gyulladásos bélbetegséggel össze-függő reakciók (pl. Crohn-kór és fekélyes vastagbélgyulla-dés) ; inflammatory bowel disease are dependent (such as Crohn's disease and ulcerative colitis, Des.,); légzési fájdalom tünetegyüttes (pl. felnőttkori lég- • «« · *· ·* ·· • · ···«··• · ··· ··· β ··· ««·· · ·· ·« ··· ·V «·*· ·» - 172 zési fájdalom szindróma, ARDS); respiratory distress syndrome (eg. adult air • «« * · · · · · · · * • ·· "·· · · · · · · · • · · · β« «·· · · ··" ·· · V '· · · * »- 172-life distress syndrome, ARDS); dermatitis; dermatitis; meningitis;encephalitis; meningitis, encephalitis; uveitis; uveitis; colitis; colitis; glomerulonephritis; glomerulonephritis; aller-giás állapotok, pl. aller-adrenergic conditions ie. ekcéma és asztma, valamint egyéb, T-sejtek infiltrációjával és krónikus gyulladásos reakciókkaljellemezhető állapotok; eczema and asthma, and other T cells infiltration and chronic inflammatory responses can be characterized by conditions; atherosclerosis; atherosclerosis; leukocita adhéziódeficiencia; leukocyte adhéziódeficiencia; rheumatoid arthritis; rheumatoid arthritis; szisztémás lupuserythematosus (SLE); systemic lupuserythematosus (SLE); diabetes mellitus (pl. I. típusúdiabetes mellitus vagy inzulinfüggő diabetes mellitus);sclerosis multiplex; diabetes mellitus (e.g. Type I diabetes mellitus or insulin-dependent diabetes mellitus.); multiple sclerosis; Reynaud-szindróma; Reynaud's syndrome; autoimmunthyroiditis; autoimmunthyroiditis; allergiás encephalomyelitis; allergic encephalomyelitis; Sjorgen- szindróma; Sjorgen- syndrome; fiatalkori diabetes; juvenile diabetes; akut és késleltetett citokinek és T-limfociták által közvetített - hiper-szenzitivitással összefüggő immunreakciók, jellemzőentuberculosis, sarooidosis, polymyositis, granulomatosis ésvasculitis esetében; acute and delayed and cytokines mediated by T lymphocytes - associated immune hypersensitivity reactions, jellemzőentuberculosis, sarooidosis, polymyositis, granulomatosis ésvasculitis case; vészes vérszegénység (Addison-kór);leukocita diapedesis-szel járó betegségek; pernicious anemia (Addison's disease), diseases involving leukocyte diapedesis; központi ideg-rendszere érintő gyulladásos rendellenesség; central nervous system involving an inflammatory disorder; több szervetérintő sérülés szindróma; involving multiple organ injury syndrome; hemolitikus anaemia (ideértve, többek között, a crvoglobinaemiát vagy Coombs-pozitívanaemiét); hemolytic anemia (including, inter alia, the crvoglobinaemiát or Coombs pozitívanaemiét); myasthenia gravis; myasthenia gravis; antigén-antitest komplex köz-vetítetne betegségek; antigen-antibody complex square-vetítetne diseases; anti-glomerularis alapmembrán beteg-ség; anti-glomerular basement membrane disease-ness; anti-foszfoiipid szindróma; anti-phospholipid syndrome; allergiás neuritis;Graves-kőr; allergic neuritis; Graves disease; Lambert-Saton myastheniás szindróma; Sato Lambert myasthenic syndrome; pemphigoidbullous; pemphigoidbullous; pemphigus; pemphigus; autoimmun poliendocrinopathiák; autoimmune polyendocrinopathies; Reiter-kór; Reiter's disease; stiff-man szindróma; stiff-man syndrome; Behcet-kór; Behcet's disease; óriássejtesarteritis; óriássejtesarteritis; immunkomplex nephritis; immune complex nephritis; IgA nephropathia; IgA nephropathy; IgMpolineuropathiák; IgMpolineuropathiák; immun trombocytopeniás purpura (ITP) vagyautoimmun trcmbccytcpenia, stb. immune thrombocytopenic purpura (ITP) or autoimmune trcmbccytcpenia etc. • «« * ·7 - 173 - «» «· « « · β · ··· · ···♦ · ··« *··· «* A B-sejt-felületi antigének idegen antigénre irányulóimmunreakció blokkolására is alkalmazhatók. • «« * · 7-173 - «» «·« «β · · · · · · · · · · ·· ♦ '··· *« * irányulóimmunreakció may also be used to block B cell-surface antigens foreign antigen. Az "idegen an-tigén" kifejezésen olyan molekulá(ka)t értünk, amely a vele(velük) találkozó emlős számára nem endogén vagy natív. A "foreign-donee an" refers to a molecule (s) is meant, which is not endogenous or native. Is exposed to it (them) in mammalian Azidegen antigén az emlősben immunreakciót (pl- humorálisés/vagy T-sejt-közvetítette) reakciót válthat ki. Azidegen antigen may elicit an immune response (PL humorálisés / or T-cell-mediated) can induce reaction. Az idegenantigén rendszerint ellene irányuló antitestek termelődésétváltja ki. The antibodies are usually directed against idegenantigén termelődésétváltja out. A találmány szerinti megoldás szempontjából je-lentőséggel bíró idegen antigének közé tartoznak azimmunogén terápiás hatóanyagok, pl. An essential part of the present invention having bottom-je stem foreign antigens include azimmunogén therapeutic agents, e. proteinek, mint pl. proteins, for example. azantitestek, különösen a nem humán aminosavakat tartalmazóantitestek, például, rágcsálóeredetű, kimérikus/humanizáltés primatizált ("főemlősített") antitestek; azantitestek especially tartalmazóantitestek non-human amino acid residues, for example, rodent, chimeric / humanizáltés primatized ( "all primate") antibodies; toxinok (adottesetben célbajuttató molekulához, pl. antitesthez konjugál-va, mely célbajuttató molekula maga is immunogén hatású le-het); toxins (va-conjugated targeting molecule such as an antibody, optionally, a targeting molecule which is itself immunogenic off-het.); génterápiás vírusvektorok, pl. gene therapy viral vectors, e. retrovírusok ésadenovírusok; retroviruses ésadenovírusok; transzplantált idegen szövetek; transplanted foreign tissues; fertőző anya-gok (pl. baktériumok és vírusok); Infectious mother liquors (such as bacteria and viruses.); alloantigének (vagyisolyan antigének, amelyek egy adott faj néhány egyedébenmegtalálhatók, a többiből azonban hiányoznak), pl. alloantigens (or even antigens which a particular individual of a species can be found, but all others are missing) e. vércso-port-antigének, humán limfocita antigének (HLA),trombocita-antigének, transzplantált szerveken termelődőantigének, vérkompor.ensek, terhességi (Rh) és véralvadásifaktorok (pl. VIII. és IX. faktor). Vércse group antigens, human lymphocyte antigens (HLA), platelet antigens, antigens produced transplanted organs, vérkompor.ensek, pregnancy (Rh), and clotting factor (eg. VIII. and IX. factor). A B-sejt-felüieti antigén elleni antitestek transz-plantációra váró emlős deszenzitizálására is alkalmazhatók. Antibodies to a B cell surface area of ​​the antigen may also be used to desensitize a mammal awaiting trans plantációra. A TNF-receptor főcsaládba tartozó receptor elleni an-titestek ráksejtek apoptózisának aktiválására vagy stimulá- ·«*· ·· - 174 - ** ·· « · »*···»* « *·· »»· w ·»· ••«9 « 9 · · ♦ «·· ·4 ··!· ·- lására alkalmazhatók. an anti-titestek receptor in the TNF receptor superfamily cancer cell activation or stimulation of apoptosis · «* · ·· - 174 - ** ··" · "··· *» * «* ··» »w · ·» · •• "9" 9 · ♦ '·· ·· · · · 4 - useful LASA. A találmány bizonyos megvalósítási módjaiban a páci-ensnek citotoxikus hatóanyaggal konjugált antitestet tar-talmazó immunkonjugátumot adagolunk. In some embodiments of the invention, the PacI ensnek cytotoxic agent conjugated antibody tar talmazó added immunoconjugate. Az immunkonjugátumotés/vagy azt az antigént, amelyhez az immunkonjugátum kötő-dik, a sejt internalizálja, ami az immun kon jugátum általmegkötött ráksejtek elpusztításában fokozott terápiás haté-konyságot biztosít. The immunkonjugátumotés / or antigen to which it binds to the immunoconjugate, internalized by the cell, which provides an enhanced therapeutic effectiveness with Hate jugátum bound cancer cells by the destruction of the immune kon. Az egyik előnyös megvalósítási mód sze-rint a citotoxikus hatóanyag a ráksejtben lévő nukleinsavatcélozza meg, illetve azt gátolja. In a preferred embodiment, valve Rint the cytotoxic drug in the cancer cell nukleinsavatcélozza, or it inhibits. Az ilyen citotoxikus ha-tóanyagok közé tartoznak a fentebb felsorolt kemoterápiáshatóanyagok {pl. Such cytotoxic ha propellant include chemotherapeutic agents listed above {e. maytansinoid és calecheamicin), a radioak-tív izotópok, valamint a ribonukleázok és DNS-endonukleázok. maytansinoid and calecheamicin), radio-isotopes proliferative and ribonucleases and DNA endonucleases. Ahogy fentebb említettük, a találmány sze-rinti többértékű antitest ADEPT-terápiában is alkalmazható. As noted above, valve Rint multivalent antibody of the invention is also applicable ADEPT therapy. A találmány szerinti megoldás értelmében a többértékűantitest (vagy az azt tartalmazó immunkonjugátum) egy vagytöbb - előnyösen rák kezelésére alkalmas - terápiás ható-anyaggal kombinálható. According to the invention, the multivalent antibody (or immunoconjugate thereof) with one or more - can be combined with therapeutic-agent - preferably for the treatment of cancer. Például, a többértékű antitest egymásik többértékű antitesttel (vagy antitestekkel), egyérté-kű vagy kétértékű antitesttel (vagy antitestekkel), kemote-rápiás hatóanyaggal (vagy hatóanyagokkal, ideértve a kemo-terápiás hatóanyagok keverékét), egyéb citotoxikus ható-anyaggal (hatóanyagokkal), angiogenezist gátló hatóanyaggal(hatóanyagokkal), citokinekkel és/vagy sejtszaporodást gát-ló hatóanyaggal (hatóanyagokkal) együttesen adagolható. For example, the multivalent antibody of another multivalent antibody (or antibodies), monovalent or divalent antibody (or antibodies), chemotaxis therapeutic agent (or agents, including chemo-therapeutic agents in a mixture of), other cytotoxic agent (s), angiogenesis inhibitor active agent (s), cytokines and / or growth inhibitory agent (s) coadministered. Haa többértékű antitest apoptózist indukál, különösen előnyö-sen kombinálható szintén apoptózist indukáló egy vagy több • «< «* <· * • * ι . HGH induces apoptosis multivalent antibodies, particularly preferred sen also be combined with one or more apoptosis-inducing • «<« * <* • · * ι. ο ·»> » • · ·«« *«· » ····« ' · · ♦ ««· 4» ··»»* ·« - 175 - egyéb terápiás hatóanyaggal. ο · ">» • · · «« * «·» ···· '' · ♦ «« · 4 »··» »* ·« - 175 - other therapeutic agents. Például, a B-sejt-felületi an-tigének elleni pro-apoptózisos antitestek (pl. két vagytöbbértékű antitestek, mint pl. a RITUXAN®, ZEVALIN® vagyBEXXAR® anti-CD20 antitestek) (1) pro-apoptózisos antites-tekkel (pl. a TNF-receptor főcsaládba tartozó receptor el-leni két- vagy többértékű antitesttel, pl. anti-DR4 vagyanti-DR5 antitesttel); For example, anti-B cell surface anti-donee pro-apoptotic antibodies (e. Two or more multivalent antibodies, eg. Of RITUXAN, ZEVALIN vagyBEXXAR® anti-CD20 antibodies) (1) pro-apoptotic the antibodies cells but (e.g. . receptor in the TNF receptor superfamily in-leni bi- or multivalent antibodies such as anti-DR4 or anti-DR5 antibody).; vagy (2) a TNF-családba tartozócitokinekkel (pl. Apo2L) kombinálhatok. or (2) (e. Apo2L) in one of the TNF family tartozócitokinekkel. Hasonlóan, az anti-ErbB antitestek (pl. HERCEPTIN® anti-HER2 antitest) a fenti(1) és/vagy (2) pontban említett hatóanyagokkal kombinálha-tok . Similarly, the anti-ErbB antibodies (e. HERCEPTIN® anti-HER2 antibody) drugs for combining the above-mentioned casing (1) and / or (2) above. Más módon, vagy ezen túlmenően, a páciensek kombináltsugárterápiával is kezelhetők, például, külső sugárkezelés-sel vagy radioaktív izotóppal jelölt hatóanyaggal (pl. an-titesttel) végzett terápiával. Alternatively, or additionally, manage, also combined with radiation therapy to patients, such as therapy, with a drug is external radiation treatment with PBS or with radioactively labeled (eg. Anti-titesttel). Az ilyen kombinált terápiákkombinált adagolással (a két vagy több hatóanyagot azonosvagy külön készítményben, de egyidejűleg beadva) és elkülö-nített adagolással hajthatók végre, mely esetben a többér-tékű antitestet a másik hatóanyag(ok) beadása előtt és/vagyazt követően adagoljuk. It can be performed by such combination therapy combined administration (the two or more agents of the same or separate formulations, but simultaneously administered) and send-dis- play administration, in which case the polyhydric antibody was added after, before and / orthe administration of other agent (s). A találmány szerinti többértékű antitestet (és a ki-egészítő terápiás hatóanyagot) bármely alkalmas módon ada-golhatjuk, így például, parenterálisan, szubkután,intraperitoneálisan, intrapulmonárisan, intranazálisan, és- helyi immunszupresszív kezelés esetén - lokálisan. multivalent antibodies (and adds out-therapeutic agent) of the invention in any suitable manner ada tute, for example, parenteral, subcutaneous, intraperitoneal, intrapulmonary, intranasal, and- case local immunosuppressive treatment - locally. Aparenterális infúzióval történő adagolás történhet infcra-muszkulérisan, intravénásán, intraarteriálisan, intra-peritoneálisan vagy szubkután. administration to Aparenterális infusions INFCE muszkulérisan, intravenous, intraarterial, intraperitoneal or subcutaneous. Ezenfelül, a többértékű an-titest, alkalmas módon, impulzusos infúzióval is adagolható i * '·*· 176 (folyamatosan csökkenő dózisokkal). Moreover, the polyvalent anti-antibody directed, suitably, also pulse infusion, administered i * '* · · 176 (particularly with declining doses). Az adagolást előnyöseninjektálással, legelőnyösebben intravénás vagy szubkutáninjektálással hajtjuk végre, részben attól függően, hogy azadagolást rövid ideig vagy tartósan végezzük. The addition was carried out előnyöseninjektálással, most preferably intravenous or szubkutáninjektálással, partly depending on azadagolást carried out in a short time or permanently. A találmány szerinti többértékű antitest adagolásamellett a találmány tárgyát képezi az antitest génterápiásalkalmazása is. The multivalent antibody of the invention in addition to administration of the invention relates to the antibody génterápiásalkalmazása well. Az antitestet kódoló nukleinsav adagolásaaz "antitest terápiás szempontból hatásos mennyiségénekadagolása" kifejezés jelentésébe tartozik (a génterápia an-titestek intracelluláris előállítása céljából történő al-kalmazását illetően pl. a WO 96/07321 számú nemzetközi köz-zétételi iratot). nucleic adagolásaaz term "antibody administration of a therapeutically effective amount of 'encoding the antibody belongs report (al is employed, the gene for the production of an intracellular-titestek regarding eg. WO 96/07321 international public zétételi document). A nukleinsav (adott esetben vektorba foglalt nuklein-sav) páciens sejtjeibe történő bejuttatásának két fő módjaaz ex vivő és az in vivő. Nucleic acid (optionally contained in a nucleic acid vector) into the patient's cells for introducing two main módjaaz ex vivo and in vivo. In vivő bejuttatás alkalmazásakora nukleinsavat közvetlenül a páciensbe injektáljuk(rendszerint a páciens testének olyan pontján, ahol az an-titest hatására szükség van). For in vivo delivery the nucleic acid Use of age are injected directly into the patient (typically the patient's body to a point where there is a need for an antibody directed-effect). Ex vivő kezeléshez a pácienssejtjeit eltávolítjuk, az így izolált sejtekbe bejuttatjuka nukleinsavat, majd a módosított sejteket közvetlenül vagypl. Ex vivo treatment, the patient's cells are removed, the nucleic acid thus isolated bejuttatjuka cells and the modified cells vagypl directly. porózus membránba csomagolva visszajuttatjuk a pácienstestébe (ló. pl. 4 592 538 és 5 283 187 számú egyesültállamokbeli szabadalmi leírás). encapsulated within porous membranes returned to the pácienstestébe (U.S. Patent No. 283,187 horse. e. 4,592,538 and 5). A nukleinsavak életképessejtekbe történő bejuttatására számos technika áll rendel-kezésre, melyeket attól függően választhatunk ki, hogy anukleinsavat in vitro tenyésztett sejtekbe vagy in vivő, atervezett gazda sejtjeibe kívánjuk bejuttatni. introducing nucleic acids into viable cells by a number of techniques are available meal-which are selected depending on the carrier to be introduced into anukleinsavat in vitro or in cultured cells, the host cells of proposed. A nukleinsa-vak emlőseredetű sejtekbe in vitro történő bejuttatására 177 alkalmas eljárások közé tartozik a liposzómák alkalmazása,az elektroporáció, mikroinjektálás, sejtfuzionáltatás,DEAE-dextrán alkalmazása, kalcium-foszfátos precipitáció,stb. The nucleic acids into mammalian cells in vitro delivery of TOP 177 suitable methods include the use of liposomes, electroporation, microinjection, cell fusion, DEAE-dextran, the calcium phosphate precipitation method, etc. A gén ex vivő bejuttatására vektorként gyakran alkal-mazzák a retrovírusokat. The ex vivo gene delivery vector as often alkaline glaze retroviruses. A jelenleg előnyös in vivő nukle-insav-bejuttatási technikák közé tartozik a virusvektorok(pl. adenovirus, herpes simplex I vírus vagy adeno-asszociált vírus) vagy lipidalapú rendszerek alkalmazásávalvégzett transzfekció. The currently preferred in vivo nucleic acid transfer techniques include ynoic the viral vectors (eg. Adenovirus, Herpes simplex I virus, or adeno-associated virus) and lipid-based systems with application of transfection. A gének lipidalapú bejuttatására al-kalmas lipidek példái közé tartozik a DOTMA, DOPE és DC-Chol. Exemplary lipid-based delivery of the gene sub-immensely lipids include DOTMA, DOPE and DC-Chol. Bizonyos esetekben a nukleinsav-forrást előnyös lehetcélsejtekre irányuló hatóanyaggal ellátni; In some cases to provide the nucleic acid source for beneficial agent lehetcélsejtekre; például, a cél-sejten lévő sejtfelületi membránproteinre specifikus anti-testtel vagy a célsejten lévő receptor ligandumával, stb.Liposzómák alkalmazása esetén a célbajuttatásra és/vagy afelvétel elősegítésére endocitózissal összefüggő sejtfelü-leti membránproteinhez kötődő proteinek alkalmazhatók (pl.kapszidproteinek vagy fragmenseik, a sejtciklus soráninternalizáción áteső proteinekre irányuló antitestek, ésintracelluláris lokalizációt megcélzó és intracellulárisfelezési időt növelő proteinek). for example, cell surface membrane protein on the target cell-specific anti-antibody or receptor on the target cell ligand, when using stb.Liposzómák of drug delivery and / or used in binding to a cell surface membrane protein associated with endocytosis afelvétel promoting proteins (pl.kapszidproteinek or fragments thereof, the cell cycle antibodies directed undergoing soráninternalizáción protein or targeting and localization ésintracelluláris increasing time intracellulárisfelezési proteins). A receptor-közvetítetteendocitózis technikáját, például, Wu és mtsai. Receptor közvetítetteendocitózis technique, e.g., Wu et al. (J. Bioi.Chem. 262, 4429 (1967)] és Wagner és mtsai. [Proc. Natl.Acatí. Sci. USA 87, 3410 (1990)] írták le. A jelenleg ismertgénterápiás eljárások áttekintését illetően ld. Anderson ésmtsai.: Science 256, 806 (1992) (ld. még a WO 93/25673 szá-mú nemzetközi közzétételi iratot és az abban felsorolt hi- vatkozásokat) . ·· ··· ··· · · · ····· · ·· · • ··· · · ···· · · - 178 - A találmány szerinti többértékű antitest betegség meg-előzésére vagy kezelésére alkalmas dózisait több tényezőtőlfüggően határozzuk meg; ilyenek, például, a kezelni kívántbetegség típusa, súlyossága és időbeli lefutása; az adago-lás megelőzésszerű vagy terápiás jellege; a korábbi gyógy-kezelések; a páciens kortörténete és a többértékű antitest-re adott reakciója; illetve a kezelőorvos szubjektív meg-ítélése. A többértékű antitestet egyszeri alkalommal vagyegymás után többször adagolhatjuk a páciensne (J. Bioi.Chem. 262, 4429 (1967)] and Wagner et al. [Proc. Natl.Acatí. Sci. USA 87 (1990) 3410] reported. Review of the currently ismertgénterápiás procedures regarding ld. Ésmtsai Anderson. Science 256: 806 (1992) ··· ··· ·· · · · · · ····· (see also WO 93/25673 Ref-containing and WO documents listed in the credit vatkozásokat.). · • ··· · · ···· · - 178 - multivalent antibody of the present invention diseases for a precursor for, or treatment doses more tényezőtőlfüggően determined, such, for example, the type, severity and time course of the handle desired disease, the administration are LAS prophylactic or therapeutic character, the previous medication treatments, where the patient's medical history and the multivalent antibody to the reaction;. or doctor subjectively by-award a multivalent antibody is repeatedly administered in a single dose or in succession with the patient k. A kezelni kívánt betegség típusától és súlyosságátólfüggően a találmány szerinti többértékű antitest kezdő dó-zisa - egy vagy több alkalommal végzett beadás vagy folya-matos infúzió esezén - kb. k the type of disease to be treated and súlyosságátólfüggően multivalent antibody of the invention starting dosage metastasis of malignant tumors. - or by continuous infusion administration of one or more times esezén - approx. 1 gg/kg-tói 15 mg/kg-ig terjed(pl. 0,1-2C mg/kg). 1 gg / kg to spread (e. 0,1-2C mg / kg) 15 mg / kg. A szokásos napi dózis - a fentebb emlí-tett tényezőktől függően - 1 gg/kg-tól 100 mg/kg-ig vagymég tovább terjedhet. The usual daily dose - depending on the factors mentioned above-described - 1 gg / kg to 100 / kg mg vagymég may spread. A több napon keresztül végzett, ismé-telt adagolások esetében, a kezelt állapottól függően, akezelés a betegség tüneteinek kívánt mértékű mérséklődésé-nek eléréséig folytatható. with the number of days for the case again with full dosages, depending on the condition being treated Thus, treatment may be continued to the desired degree of suppression of disease symptoms has been reached. Mindazonáltal, egyéb adagolásirendszerek is hasznosak lehetnek. However, other adagolásirendszerek also be useful. A kezelés hatása hagyomá-nyos technikák és vizsgálati eljárások alkalmazásával köny-nven nyomon követhető. The effect of treatment is monitored by convention in certain techniques and assays follow-nven book. A találmány szerinti többértékű antitestet tartalmazókészítmény előállítása, dozírozása és adagolása a beváltgyógyászati gyakorlatnak megfelelően hajtható végre. multivalent antibody of the invention are formulated, dosed and administered in tartalmazókészítmény be performed in accordance with good medical practice. Az etekintetben figyelembe veendő tényezők közé tartozik a ke-zelni kívánt rendellenesség, a kezelni kívánt emlős, a pá-ciens klinikai állapota, a betegség oka, a hatóanyag • · · • « ···· · ·· ·• · · · ·* ···· ·· - 179 - célbajuttatási helye, az adagolás módja, az adagolás időbe-li rendje, valamint egyéb, a kezelőorvos számára ismert té-nyezők. Factors to be considered in this respect include the disorder to be treated, the mammal being treated, the clinical condition of the bye-deficient, cause of the disease, the drug • · • · '···· ·· · · • · · · · * ···· ·· - 179 - location targeting, the administration route, administration time-LI, and others known to a physician té milieu. Az adagolni kívánt többértékű antitest "gyógyászatiszempontból hatásos" mennyisége a fenti megfontolások alap-ján határozható meg, s azt a minimális mennyiséget jelenti,amely a betegség vagy rendellenesség megelőzéséhez, enyhí-téséhez vagy kezeléséhez szükséges. The amount of the multivalent antibody to be administered "effective gyógyászatiszempontból 'is defined as above considerations, the main-Jan, and is the minimum amount necessary to prevent the disease or disorder, or treating mild to Notify. A találmány szerintitöbbértékű antitest, adott esetben (de nem szükségszerűen),egy vagy több - a kérdéses betegség megelőzésére vagy keze-lésére jelenleg használatos - hatóanyaggal kombinálva fog-lalható a gyógyászati készítménybe. The invention szerintitöbbértékű antibody, optionally (but not necessarily) with one or more - currently used for the prevention or treatment, shall be as disease in question - in combination with active ingredients in the pharmaceutical composition will, lalható. Az ilyen egyéb ható-anyagok hatásos mennyisége a többértékű antitest készít-ményben lévő mennyiségétől, a rendellenesség és a kezeléstípusától és egyéb, fentebb felsorolt tényezőktől függ, ál-talában azonban az előzőkben leírt dózisokban és adagolásimódokon alkalmazhatók (vagy körülbelül a korábban alkalma-zott dózisok 1-99 %-énak megfelelő dózisokban). The effective amount of such other active materials on the amount of composition at in the multivalent antibody, the disorder and the type of treatment and other factors listed above will depend on, but can be used (or about the earlier application, in dosages dosages and adagolásimódokon described above pseudo-ranges usually 1-99% -énak appropriate doses). H) Termékek A találmány egy további megvalósítási módja értelmébena fentebb felsorolt rendellenességek kezelésére alkalmasanyagokat tartalmazó terméket tárunk fel, amely egy tároló-edényt és címkét vagy termékismertetet tartalmaz. H) Products A further embodiment of the invention provides a product containing értelmébena suitable materials for treating disorders listed above, comprising a storage container and a label or the product has been obtained. Az alkal-mas tárolőedények közé tartoznak a palackok, fiolák, fecs-kendők és kémcsövek, melyek különféle anyagokból (pl. üveg-ből vagy műanyagból) készülhetnek. The user-mas container include bottles, vials, and test tubes FECS-wipes, are made of different materials (eg. From glass or plastic). A tárolóedény a kezelnikívánt állapot kezelésére hatásos készítményt tartalmaz, és • ···· ·· ·· ·· • * ······ • · ··· ··· · ······· · ·· · • «·· ·· ··»· ·· - 180 - steril hozzáférési ponttal van ellátva (például, a tartályegy intravénás műanyagzsák vagy fiola, amely injekciós tű-vel átszúrható dugóval van lezárva. A készítmény legalábbegy aktív hatóanyaga találmány szerinti többértékű anti-test. A tárolóedényen lévő (vagy ahhoz mellékelt) címkénvagy termékismertetőn fel van tüntetve, hogy a készítmény-nyel milyen állapot (pl. rák) kezelésére alkalmas. A terméktöbb tartályt is tartalmazhat; ilyen esetben (a) az elsőtartály többértékű antitestet tartalmazó készítményt; (b) amásodik tartályt pedig egy további citotoxikus hatóanyagottartalmazó készítményt tartalmaz. A találmány e megvalósí-tási módja szerinti termék tartalmazhat egy termékismerte-t The container holds a composition effective to treat the desired condition treated, and • ···· ·· ·· ·· • * • ······ ··· ··· · · · ·· · ······· • «·· ·· ··» · ·· - is provided with a sterile access port (for example, a container of intravenous solution bag or a vial having a stopper pierceable by hypodermic needle stopper with at least one active agent in the composition of polyvalent anti invention - 180th body marked címkénvagy product Description in the container (or associated with) the composition sinks suitable for treating the condition (eg cancer). this product may contain multiple reservoirs;.. such appropriate preparation containing the first container multivalent antibody (a), ( b) amásodik container contains an additional cytotoxic active principle formulation. The product of this invention is realized-alkylester of a product may contain t-described őt, amelyen fel van tüntetve, hogy az első és a másodikantitest-készítmény rák kezelésére alkalmazható. Más módon(vagy ezen túlmenően), a találmány szerinti termék tartal-mazhat egy második (vagy harmadik) tartályt is, amelygyógyászati szempontból elfogadható puffért, például, in-jekcióhoz való bakteriosztatikus vizet, foszfátpuffereltsóoldatot, Ringer-eldatct vagy dextrózcidatot tartalmaz. now, which indicates that for the treatment of the first and second antibody compositions cancer. Alternatively (or in addition), products of the invention comprise mazhat a second (or third) container comprising a pharmaceutically acceptable buffer, for example, bacteriostatic water for in-by injection, foszfátpuffereltsóoldatot, Ringer eldatct or dextrózcidatot contains. Atermék tartalmazhat kereskedelmi és felhasználói szempont-ból kívánatos egyéb anyagokat is, például, további puffere-ket, oldószereket, szűröket, tűket és fecskendőket. The product containing include other materials from a commercial and user considerations it is desirable, for example, additional buffering agents, diluents, filters, needles, and syringes. I) Letétbe helyezett anyagok I) Deposited materials

Az alábbi hibzidcma-sejtvonalakaz az American Type The following hibzidcma-sejtvonalakaz the American Type

Culture Collection-nél (ATCC; 108C1 University Boulevard,Manassas, VA 2011C-2209, USA) helyeztük letétbe: • ·· · - 181 - deposited, at Culture Collection (108C1 University Boulevard, Manassas, VA 2011C-2209, ATCC US) · • ·· - 181 -

Antitest elnevezése ATCC nyilv. Naming public-antibody ATCC. szám Letétbe helyezés dátuma 7C2 (anti-HER2) ATCC HB-12215 1996. okt. No. Deposit Date 7C2-up (anti-HER2) ATCC HB-12215 1996 Oct. 17. 7F3 (anti-HER2) ATCC HB-12216 1996. okt. 17 7F3 (anti-HER2) ATCC HB-12216 1996 Oct. 17. 4D5 (anti-HER2) ATCC CRL 10463 1990. május 24. 2C4 (anti-HER2) ATCC HB-12697 1999 . 17. 4D5 (anti-HER2) ATCC CRL 10463 May 24, 1990 2C4 (anti-HER2) ATCC HB-12697 1999th ápr. Apr. 8. 3F11.39.7 <anti-DR5) HB-12456 1999. január 13. 3H3.14.5 (anti-DR5) HB-12534 1998. június 2. 3D5.1.10 (anti-DR5) HB-12536 1998. június 2. 3H1.18.10 (anti-DR5) HB-12535 1998. június 2. 4Ξ7.24.3 <anti-DR4) HB-12454 1998 . 8. 3F11.39.7 <anti-DR5) Jan. 13, 1999 3H3.14.5 HB-12456 (anti-DR5) on June 2, 1998 3D5.1.10 HB-12534 (anti-DR5) 1998 HB 12536 June 2 3H1.18.10 (anti-DR5) HB-12535 June 2, 1998 4Ξ7.24.3 <anti-DR4) HB 12454 1998th január 13. 4 26.17.8 {an t i-DR4) HB-12455 1998. január 13. A találmányt a következőkben kísérleti példákon ke-resztül szemléltetjük, melyeket a találmány szerinti megol-dás jobb megértése, s nem tárgyának korlátozása céljábólmutatunk be. January 13 4 26.17.8 13 January {n t i-DR4) 1998 HB 12455 The present invention is illustrated by the experimental examples below ke coupled via which the invention kills spreading may be better understood, and not limiting on the subject matter céljábólmutatunk. A leírásban említett valamennyi irodalmi hi-vatkozást és szabadalmi iratot teljes terjedelmében a kita-nítás részének tekintjük. All literature and high vatkozást patents mentioned in this specification in its entirety considered as part of this disclosure. 1. példa Többértékű antitestek A négyértékű anti-HER2 antitest [melyet "Octopus-antitestnek {0ctH£R2} nevezünk] előállításának menetét az5. ábrán mutatjuk be. Ezen Octopus-antitest vázát a humani-zált 4D5 monoklonélis antitest 8. változata (rhuMAb 4D5-8; le. 5 821 33? számú eavesült államokbeli szabadalmi leírás, « * • · · « - 182 - melyet teljes terjedelmében a kitanítás részének tekintünk)alkotja. Az rhuMAb 4D5-8 antitest nehéz láncát pRK5-vektorba (EP 307247 számú európai szabadalmi leírás)klónoztuk. A nehéz lánc VH-CHl-régióját mutagenezissel el-távolítottuk, és három egyedüli restrikciós endonukleázosfelismerési helyet (BamHI, Bhel és Bspl) inszertáltunk.Ezeket a felismerési helyeket a különféle antitestekbőlszármazó VH-CHl-régió amplifikálására alkalmazott PCR-láncindítókba foglaltuk. A kapott fragmenseket a vektorbaszubklőnozva az Octopus-antitest nehéz láncát kaptuk. AzOctopus-antitest nehéz l Example 1 polyvalent antibodies tetravalent anti-HER2 antibody [called "called Octopus antibody {0ctH £ R2}] course of production is shown in Figure AZ5.. In Octopus antibody backbone Humana-immobilized 4D5 monoklonélis antibody version 8 (rhuMAb 4D5 -8;.?. No. 5821 33 compares eavesült patent, «* • ·« - 182 - which is formed is hereby incorporated in its entirety) of rhuMAb 4D5-8 antibody heavy chain vector pRK5 (EP 307,247 European patent) were cloned. the heavy chain VH-CHl region mutagenesis on-removed, and three unique restriction endonukleázosfelismerési site (BamHI BHEL and Bspl) inszertáltunk.Ezeket the recognition sites used to amplify a variety of antibody derived from the VH-CHl region PCR primers are set. the resulting fragments vektorbaszubklőnozva the Octopus antibody heavy chain was obtained. AzOctopus antibody heavy l áncát a pRK5-vektorralzranszfektált emlőseredetű sejtekben, megfelelő könnyűlánccal együttesen expresszáltatva, a teljes Octopus-antiteszet kaptuk (4. ANCA-vektorralzranszfektált pRK5 mammalian cells collectively expressed in appropriate light chain, the complete Octopus antiteszet obtained (4th ábra). figure). Létrehoztunk olyan Octopus-konstrukciókat is, amelyeka tandem Fc-régiók közé inszertálva flexibilis kapcsoló-szekvenciákat tartalmaznak. We created an Octopus constructs also contained a flexible linker sequences inserted between tandem Fc regions. Mutagenezis alkalmazásával anehéz lánc VH-CHl-récióit kódoló DNS közé "Gly-Ser (flex-1kapcsolószekvencia) vagy "Gly-Ser-Gly-Ser" (flex-2kapcsolészekvencia; 10. azonosítószámú szekvencia) kódoló DXS-z inszertáltunk. 2. példa anehéz mutagenesis chain CHl-VH-encoding DNA include récióit "Gly-Ser (flex 1kapcsolószekvencia) or" Gly-Ser-Gly-Ser "(flex 2kapcsolészekvencia; SEQ ID NO: 10) encoding a DXS Example 2-z was inserted.

Az anti-HER2 Octopus-antitestek értékelése The anti-HER2 Octopus antibodies Evaluation

Az OczHer2-antizeszet átmenetileg transzfektált 293-as sejzek ÍGraham és m.zsai.: J. Gén. The OczHer2-antizeszet transiently transfected 293 sejzek ÍGraham and m.zsai .: J. Gene. Virci. VIRCA. 36, 59 (1977)] termelteztük, majd Protein-A Sepharose oszlopon tisztítót- • ···· ·· ·· ·· • · ····*·• · ··· ··· · ······· · · · · • «·· ·« ···· «· - 183 - tűk. 36, 59 (1977)] termelteztük and Protein A Sepharose tisztítót- • ···· ···· ·· ·· ·· · • * • · · · · · · · · · ····· ·· • · · · · «· ·· '····« · - 183 - needles. A teljes antitest molekulatömege hozzávetőleg 245 kD,szemben a kiindulási antitest 150 kD-os molekulatömegével.Az Octopus-antitest nehéz lánca 75 kD-os (szénhidrát nél-kül), míg könnyű lánca 30 kD-os. The whole antibody has a molecular weight of approximately 245 kDa, compared to the starting antibody 150 kD molekulatömegével.Az Octopus antibody heavy chain of 75 kDa (less than carbohydrate-Foreign), while the light chain of 30 kDa.

Antigénkötés antigen binding

Az OctHER-antitest antigénhez - HER2 extracellulárisdoménhez (HER2-ECD) - történő kötődését HER2-ELISA-teszt [Sias és mtsai.: J. Immunoi. The antibody-antigen OctHER - extracellulárisdoménhez HER2 (HER2-ECD) - binding of HER2 ELISA [Sias et al .: J. Immunol. Methods 132, 73 (1990)] alkal-mazásával vizsgáltuk. tested Methods 132: 73 (1990)] tion of alkali. 96 üregű mikrotiter-tálcákat a HER2extracelluláris doménjével (ECD; WO 90/14357 számú nemzet-közi közzétételi irat) vontunk be, és az üregeket anti-HER2antitestek különböző hígításaival inkubáltuk. 96 well microtiter plates in HER2extracelluláris domain (ECD; WO 90/14357 number of inter-nation discloses) were coated, and the wells were incubated with various dilutions of anti-HER2antitestek. A nem kötő-dött antitestek eltávolítása céljából végzett mosást köve-tően az üregekhez - az ECD-hez kötődött anti-HER2 antitestkimutatása céljából - peroxidázhoz konjugált második anti-testet adtunk. washing to remove unbound antibodies, followed regards the wells - added peroxidase conjugated second antibody from - for the purpose of the ECD bound to offer an anti-HER2 antibody detection. A megfelelő szubsztrát hozzáadása után azüregekben mikrctiter-tálcához kifejlesztett leolvasókészü-lék alkalmazáséval, 562 nm hullámhossznál mértük az abszorbanciát. After addition of the appropriate substrate azüregekben developed mikrctiter-tray leolvasókészü-leak those applications, a wavelength of 562 nm and the absorbance measured.

Az OctHERz-antitest, a kétértékű humán IgGl anti-HER2rhuMAb 4D5-8 antitest (293-as sejtekben termeltetve) és akétértékű EERCEFTIN© anti-HER2 antitest (amely kereskedelmiforgalomban beszerezhenő a Genentech, Inc.-tői (Dél SanFrancisco, USA); SLISA-teszt eredményein a 6/A-6/C ábrákonmutatjuk be. Az OctEER2 ELISA-tesztben hasonló mértékbenkötődik a HER2-ECD-hez, mint a HERCEPTIN®. A 293-as sejtek • ·· · ·· • · ··«««··· · · · ··· · · · ····· · · · ·« ··· ·· ··*· ·· - 184 - által termelt 4D5-8 rekombináns humanizált monoklonális an-titest a fiolában kiszerelt - CHO-sejtekben termeltetett - HERCEPTIN®-antitesttel azonos mértékű kötődést mutat, amiazt jelzi, hogy a 293-as sejtek nem befolyásolják jelentősmértékben az antitestek antigénkötő képességét. The OctHERz antibodies, bivalent human IgGl anti-HER2rhuMAb 4D5-8 antibody (produced in 293 cells) and Hatake value EERCEFTIN © anti-HER2 antibody (which is commercially beszerezhenő from Genentech, Inc. The (South SanFrancisco, USA); slist -test results of the 6 / A-6 / C in ábrákonmutatjuk. OctEER2 similar to ELISA protein binding to HER2-ECD With than HERCEPTIN®. the 293 cells • · ·· ·· ·· · • «« «··· · · · · · · · · · · · · · ·····" ··· ·· ·· ·· · * - 184 - 4D5-8 produced by recombinant humanized monoclonal antibody directed to the anti-vial packaged - produced in CHO cells - HERCEPTIN® antibody showed the same level of binding amiazt it shows that 293 cells do not significantly affect the antigen binding ability of the antibodies.

Annak megállapítása érdekében, hogy az 0ctHER2-antitest a célantigént mind a négy anticénkötő helyével ké-pes-e megkötni, ultracentrifugálási analízist végeztünk. To determine whether the antibody of the target antigen 0ctHER2 all four anticénkötő location Sa-pes to bind, ultracentrifugation analysis was performed. AzOctopus-antitesttel a HER2 extracelluláris doménjének (ECD;WO 90/14357) különböző mennyiségeit Lilráltuk, és ezen ará-nyok alapján - feltételezve, hogy az Octopus-antitest négyteljesen funkcionális kötőhelyet vagy három funkcionáliskötőhelyet tartalmaz - kiszámítottuk a komplexek átlagosmolekulatömegét. AzOctopus antibody to HER2 extracellular domain (ECD; WO 90/14357) Lilráltuk varying amounts, and based on these ratios were subjected - assuming that contains the Octopus antibody four fully functional binding sites, or three functional binding site for - calculating the complexes átlagosmolekulatömegét. Ezeket az elméleti értékeket (az OctHER2négy működőképes kötőhelyének feltételezése esetén körök-kel, három működőképes kötőhely feltételezése esetén négy-zetekkel jelölve) a tényleges kísérleti értékekhez(háromszögekkel jelölve) hasonlítottuk. These theoretical values ​​(for OctHER2négy functional binding sites assumptions circles, comes when there are three functional binding sites assumptions marked with four-nation) compared to the actual experimental values ​​(triangles). A 7. ábrán láthatókísérleti értékek a négy kötőhelyet reprezentáló görbéhezközelítetek, azonban a tapasztalható eltolódás arra utal,hogy a négy kötőhely valószínűleg nem azonos affinitással kötődik. shown in Figure 7. The experimental values ​​of the four representative görbéhezközelítetek binding site, however, the shift is observed indicating that the four binding sites probably does not bind with the same affinity.

Bioioai runkcio Bioioai runkcio

Pro11feráció-gátlási tesztek: A HER2-t túlzott mértékben termelő turaorsejtvonalak>rooésénak gátlása vonatkozásában az OctHER2-antitestet • ·« · 185 a HERCEPTIN®-nel hasonlítottuk össze. Pro11feráció inhibition tests: HER2-overexpressing turaorsejtvonalak> rooésénak inhibition with respect to the antibody OctHER2 • · «· 185 compared to HERCEPTIN®. A vizsgálathoz aLewis és mtsai. The test aLewis et al. [Cancer Immuno. [Cancer Immunology. Immunother. Other immune. 37, 255 (1993)]által leírt sejtszaporodás-gátlási tesztet alkalmaztuk. cell growth-inhibition test described by 37, 255 (1993)] was used. Rö-viden összefoglalva: az 0ctHER2- és HERCEPTIN®-antitest so-rozathígításait csészére szélesztett sejtek tápközegéhezadtuk, majd a sejteket öt napig hagytuk tovább szaporodni.Ezt követően a tápközeget eltávolítottuk, a sejteket kris-tályibolyával megfestettük és spektrofotometriás analízis-sel mennyiségi meghatározást végeztünk. RO-Video summary, the 0ctHER2- and HERCEPTIN® antibody so-rozathígításait plated cells tápközegéhezadtuk dish, and cells allowed to continue for five days after szaporodni.Ezt the medium was removed, the cells were stained with crystal tályibolyával and quantitation was performed by spectrophotometric analysis PBS . A kristályibolya asejteker színezésére képes kolorimetriás festék, s így akezelés után lehetővé teszi a sejtszaporodás mérését. The crystal violet coloring asejteker capable of colorimetric ink, thus allowing the measurement of cell proliferation After Thus, treatment. A HER2-t 3+ mértékben túltermelő sejteket illetően(melyek esetében a HERCEPTIN® nagyon hatásos volt) azSX3R3-sejtek szaporodásának gátlásában az OctHER2-antitesthasonló vagy valamivel hatásosabb volt (ld. 8/A ábra), a37474-sejtek szaporodásának gátlásában azonban nem bizo-nyult ugyanolyan hatékonynak (ld. 6/3 ábra). The 3+ HER2 overexpressing cells regards (which HERCEPTIN® was very effective) azSX3R3-cell growth inhibition was OctHER2 antibody similar or slightly more effective (see Fig. 8 / A), but the growth of a37474 cells inhibiting not commission -nyult as effective (see Fig. 3.6). Érdekes módon,az OctHERz a HER2-t 2+ mértékben túltermelő MDA361-sejtekethatásosabban gátolta, mint a HERCEPTIN® (8/B ábra). Interestingly, the OctHERz 2+ inhibited HER2 overexpressing MDA361 cells more effectively than HERCEPTIN (Figure 8 A / B).

Ahogy a 9. ábrán látható, a flexibilis kapcsolószek-venoiát tartalmazó Octopus-konstrukciók (OctHER2flexl,CctEZR2flex2) a sejzszapcrodást hatékonyabban gátolta, mint ,nterna1izáclcs tesztek As shown in Figure 9, Octopus constructs containing the flexible linker sec-venoiát (OctHER2flexl, CctEZR2flex2) effectively inhibited sejzszapcrodást like, nterna1izáclcs tests

Az Octcpus-antitest immuntoxin-terápiában történő al-kalmazhatóságának vizsgálata céljából internalizációs ké-pességét értékeltük. To test the antibody sub-Octcpus kalmazhatóságának to immunotoxin therapy evaluated by internalization Cortical tiveness. Imuntoxin-terápia céljából az anti- 186 testhez citotoxikus hatóanyagot konjugálunk vagy fuzionál-tatunk, az így kapott immuntoxin specifikusan kötődik cél-sejtjéhez; anti- conjugated or fused Tatum, the resulting immunotoxin specifically binds to a target cell of cytotoxic active ingredient in body 186 for the purpose Imuntoxin therapy; a megkötött sejt internalizálja az antitestet éskatabolizálja, illetve lebontja azt, miáltal az antitestrőlfelszabadul a toxin, amely elpusztítja a sejtet. éskatabolizálja cell internalizes bound antibody or degrade it, whereby the antitestrőlfelszabadul toxin that kills the cell.

Az általunk végzett internalizációs tesztekben az an-titestet radioaktív jóddal jelöltük és a sejtekkel különbö-ző ideig inkubáltuk. Internalization in tests we have carried out an in-titestet labeled with radioiodinated and incubated with the cells for use various kinds of time zo. Ezt követően mértük a felülúszóban lé-vő ép, kötetlen antitestek mennyiségét; Subsequently, we measured the amount juice cf. intact unbound antibody in the supernatant; a sejtfelülethezkötődött antitestek mennyiségét; sejtfelülethezkötődött quantity of antibodies; az internalizálódott anti-testek mennyiségét; the amount of internalized anti-antibodies; végül a katabolizálr és lebontott anti-testek mennyiségét. Finally, the quantity of degraded katabolizálr and anti-antibodies. A HER2-t 3+ mértékben túltermelő sejtek (SKBR3) és 2+mértékben túltermelő sejtek (MDA453) vonatkozásában végzettinternalizációs tesztek eredményeit a 10/A és 10/B ábránmutatjuk be (a folytonos vonalak 2+ mértékben túltermelősejtekkel, a szaggatott vonalak 3+ mértékben túltermelősejtekkel kapott eredményeket reprezentálják). végzettinternalizációs results in respect of the extent 3+ HER2 overexpressing cells (SKBR3) and + 2 overexpressing cells (MDA453) tests of 10 / A and 10 / B ábránmutatjuk on (the solid lines 2+ túltermelősejtekkel extent, the extent of the dotted lines 3+ The results represent túltermelősejtekkel). Ezek azeredmények azt mutatják, hogy az 0ctHER2-antitest, meglepőmódon, mindkét sejtben kétszer olyan gyorsan internaiizélódik és katabolizálódik, mint a HERCEPTIN®. These azeredmények show that the 0ctHER2 antibody, surprisingly, both cell and twice as fast internaiizélódik catabolized than HERCEPTIN®. Az The

Cc; cc; opus-antitest esetében tapasztalt gyors internalizációés katabolizmus egy karos antitest szempontjából ideális. For experienced opus antibody catabolism it is ideal for a quick internalizációés armed antibody terms. Ameg nem kötődött HERCE?TIN®-antitesttel összehasonlítva, aEER2-t 2+ mértékben túltermelő sejtben nagyon kis mennyi-ségben található szabad Octopus-antitesa. Amega unbound compared Herc? TIN® antibody, was aEER2 2+ overexpressing cell-free Octopus the antibodies found in very small amounts majority. Még egyszer; One more time; ezeneredmények arra utalnak, hogy az Octopus-antitest acitotoxikus hatóanyagokkal történő konjugálás kiváló alanya • · · · · · - 187 - • · ··· ·«· · ···• · * · · ·· · • ··· ·· ···· ·· lehet. these results suggest that the Octopus antibody conjugation of cytotoxic drugs subject to high • · · · · · - 187 - • · · · · · «· · · · · • · * · · · · · • · ·· ·· ···· ·· may.

Elektronmikroszkópos autoradiográfia electron microscopy autoradiography

Annak igazolása céljából, hogy az Octopus-antitestspecifikusan a megfelelő vezikulákban internalizálódott ésbomlott le, elektronmikroszkópos (EM) autoradiográfiásvizsgálatot végeztünk. To confirm that the Octopus antitestspecifikusan appropriate internalized vesicles ésbomlott down conducted electron microscopy (EM) autoradiográfiásvizsgálatot. Az Octopus-antitest radioaktív jód-dal történő jelölését és sejtekkel történő inkubálását azinternalizációs teszteknél leírtak szerint hajtottuk végre.Az eredmények (melyeket a 11/A-ll/C ábrákon mutatunk be)azt igazolják, hogy az Octopus-antitest a megfelelővezikulákban - korai endoszómában (ld. ll/'B ábra) éslizeszómában (ld. 11/C ábra) - internalizálódik. was végre.Az results (also shown in 11 / A-ll / C figures) confirm that the Octopus antibody megfelelővezikulákban labeling and incubation of cells of the Octopus antibody is radioactive iodine-song, as described azinternalizációs tests by - early endosome (see Figure II / B). éslizeszómában (see Figure 11 / C.) - internalized. Ezen túl-menően, az OctHER2-antitest és HERCEPTIN® esetében megfi-gyel;; These too-cool, the OctHER2 antibody HERCEPTIN for observers and digested ;; internalizáció százalékos aránya összhangban van azinternalizációs tesztekben kapott eredményekkel. Percentage internalization consistent with findings azinternalizációs tests. 3. példa DR5 elleni Octopus-antitestek értékelése EXAMPLE 3 Anti-DR5 Octopus antibodies Evaluation

A DR5 a TNF-receptor főcsalád tagja, amely trimerApo2L/7RAIL liganaumhoz (Apo2L) kötődik. DR5 member of the TNF receptor superfamily, that binds trimerApo2L / 7RAIL liganaumhoz (Apo2L). Miután az Apo2L-receptorok hozzákotednek az Apo2L-hez és klasztereződnek, areceptorok citoszólcs régiójában lévő sejthaiál-domének akaszpézckat celluláris apoptózis kiváltására indukálják. After Apo2L receptors hozzákotednek the Apo2L and clustered, cell killing domains in citoszólcs region areceptorok akaszpézckat induce inducing cellular apoptosis. A3R5 elleni Octopus-konstrukciót két változatát állítottukelő: az egyiket a I6E2-antitestből, amely egyláncú humánFv-fáckönvvtérból klónozott anti-3R5 antitest (ld. WO • · · - 188 - • · · · · • · · ···« · • · · • « «··· 98/51793 számú nemzetközi közzétételi irat, melyet teljesterjedelmében a kitanitás részének tekintünk); two versions of Octopus construct against A3R5 prepared. one of the I6E2-antibody, which is a chain humánFv-fáckönvvtérból cloned anti-3R5 antibody (see WO • · · - 188 - • · · • · · · · · «· • · • · «« ··· 98/51793 discloses a number of international, which is hereby incorporated in teljesterjedelmében); a másikatpedig a 3H3.14.5 monoklonális antitestből (3H3-antitest,ATCC HB-12534, ld. WO 99/64461 számú nemzetközi közzétételiirat), amely egy egéreredetű anti-DR5 monoklonális anti-test, mely keresztkötést követően apoptózist indukál. the other by inducing apoptosis downstream of a murine anti-DR5 monoclonal antibody that cross-linking of the 3H3.14.5 monoclonal antibody (3H3 antibody, ATCC HB-12534, supra. WO 99/64461 international közzétételiirat). Mivela sejthalál-receptor elleni monoklonális antitestek azapoptózis kiváltásához keresztkötést igényelhetnek, azOctopus-antitest konstrukciók létrehozásának jelöltjeikénttarthatók számon. Monoclonal antibodies against cell death receptor Vela We require crosslinking azapoptózis elicit azOctopus antibody constructs creating jelöltjeikénttarthatók number. Az anti-DR5 Octopus-antitestek létrehozá-sa céljából a fentebb leírt 0ctHER2-konstrukciók variábilisdoménjeit a 16E2-, illetve 3H3-antitest VL- és VH-doménjeivel helyettesítettük. For the purpose of anti-DR5 Octopus antibodies estab-sa variábilisdoménjeit 0ctHER2 the above-described constructs the 16E2- or 3H3 antibody was replaced with the VL and VH domains. A DR5 elleni Octopus-antitesteket kristályibolya vagyalamarBlue festés alkalmazásával végzett apoptózis- tesztekben vizsgáltuk. The anti-DR5 Octopus antibodies were assayed by crystal violet apoptosis assays using vagyalamarBlue staining. Röviden összefoglalva: az Octopus-antitest vagy az Apo2L-ligandum sorozathígításait lemezreszélesztett sejtek tépközegéhez adtuk, majd a sejteket 24óra hosszat hagytuk szaporodni. Briefly, the Octopus antibody or ligand Serial dilutions of Apo2L tépközegéhez lemezreszélesztett added to cells and cells were allowed to grow for 24hours. Ezt követően a tápközegeteltávolítottak és a sejteket kristályibolyávai festettük,vagy a tápközeghez alamarBlue festéket adtunk, és rövidideig tovább inkubáltuk a sejtekkel. Subsequently tápközegeteltávolítottak and the cells were stained kristályibolyávai or alamarBlue dye was added to the medium and briefly incubated on the cells. A kristályibolya meg-festi a sejteket, míg az alamarBlue a tenyésztő tápközegbendetektálja a metabclikus aktivitást, így ezek a színezékeklehetővé teszik a kezelést túlélő sejtek mérését. In a crystal violet staining the cells while the culture alamarBlue tápközegbendetektálja the metabclikus activity, so they allow measurement of the surviving cells in the treatment színezékeklehetővé. A kris-télyibolvával és alaxarBlue-val történő festődés mennyiségimeghatározásét spektrofotometriával hajtottuk végre. staining on the crystal with alaxarBlue télyibolvával and quantitative determination was performed by spectrophotometry.

Ahogy a 12/A-12/E ábrákon látható a 16E2-Octopus- • ·««· ·· «· *· • · ··*··.·· · ·· ··· · ······· · ♦ · · • ·*· ·· «·4« ·· - 189 - antitest, meglepő módon, tüdőtumor (SK-MES-1; HP92) és vastagbéltumor (HCT116; COLO205) sejtvonalakban hasonló mértékben indukál apoptózist, mint az Apo2L, azonban normál kontroll sejtvonalban (HUMEC) nem okoz apoptózist. As shown in 12 / A-12 / E-Octopus Figures 16E2 • · «« ·· · «· • · · * ·· * ··. ·· · · · · · ·· ······ · ♦ · • · * · ·· "· 4" ·· - 189 - antibody, surprisingly, lung (SK-MES-1; HP92) and colon (HCT-116, COLO 205) similar cell lines extent induces apoptosis such as Apo2L, but (HUMEC) does not cause apoptosis in normal control cell line. A 16E2- The 16E2-

Octopus által indukált apoptózis kaszpáz-dependens. Octopus-induced apoptosis is caspase-dependent. A DR5 elleni 16E2-Octopus-antitest thymushiányos csu-pasz egerekben in vívó szintén hatásosnak bizonyult a humánCOLO205 tumorsejt-vonal apoptózisának és zsugorodásának in-dukélásában. The anti-DR5 16E2 Octopus antibody CSU passive athymic mice in vivo was also efficacious in humánCOLO205 tumor shrinkage and apoptosis in-line dukélásában. Ahogy a 13/A-13/D ábrákon látható, a 16E2-Octcpus-antitesttel vagy Apo2L-ligandummal kezelt egerekbőlszármazó, hematoxilinnal és eozinnal festett tumorszövet-metszetekben az apopotózisos sejtek hasonló mennyiségbenvolzak jelen. As the 13 / A-13 / D depict the treated Octcpus-16E2 antibody or Apo2L from mice, hematoxylin and eosin stained tumor tissue sections similar mennyiségbenvolzak apopotózisos the cells present. A l6E2-Octopus-antitesttel kezelt egerekben atumortérfogat jelentős mértékű csökkenését is megfigyelhet-tük, amely hasonló volt az Apo2L-ligandummal, illetve akétértékű 16E2 és 3H3 anti-DR5 antitesttel kezelt egerekben megfigyelt csökkenéshez (ld. 14. ábra). treated l6E2 Octopus antibody mice, a significant decrease atumortérfogat also observed-needles, which was similar to that observed treated with Apo2L or Hatake monovalent 16E2 and 3H3 anti-DR5 antibody in mice reduction (see Fig. 14). A sem anti-DR5 an-titesttel, sem Apc2L-ligandummal nem kezelt egerekben(hordozó kontroll) a tum.crtérfogat - a szabályozatlan sejt-szaporodás következtében - rendkívüli mértékben megnőtt. Uncontrolled, not an anti-DR5-titesttel nor Apc2L ligand mice (vehicle control) the tum.crtérfogat - dramatically increased - due to unregulated cell proliferation.

Az egértesztekben alkalmazott anyag apoptózisos akti-vitását in '.mim apoptózisos teszttel igazoltuk (ld. 15.ábra). apoptotic activation thus a remarkable material used in the mouse studies was confirmed in '.mim apoptotic assay (see. Figure 15). A vizsgálatra alkalmazott DR5 elleni 16E2-Octopus-anzizesret és az Apo2L-ligandumot alamarBlue apoptózis-tesztben Apo2L standard pozitív kontrolihoz és anti-IgEmonoklonélis antitest (E25) negatív kontrolihoz hasonlítót- ~ ” k. anti-DR5 16E2 Octopus and Apo2L ligand anzizesret used for testing apoptosis alamarBlue assay Apo2L standard positive control, and anti-IgEmonoklonélis antibody (E25) a negative control we compared ~ 'k. «··· ·· • · ··*··»·· ··· ··· * ·«····« · ·· ·» ··· ·« ··«· ·« - 190 - A 16. ábrán azt szemléltetjük, hogy egy másik anti-DR5Octopus-antitest, a 3H3-Octopus is képes a 16E2-Octopus ál-tal indukálthoz hasonló apoptózist indukálni. "· · · · • ·· ·· * ··" ·· · · · · · · · * "····" ·· · · »· · · ·« ·· "·" - 190 - A Figure 16 illustrated the ability to induce the similar 16E2 Octopus induced pseudo-tal another anti-apoptosis DR5Octopus antibody and 3H3 Octopus well. Ezenfelül, a 16. ábrán látható, hogy az Octopus-antitest apoptózisos ak-tivitása nem tételfüggő, mivel a különböző időpontokbanelőállított 16E2-Octopus antitestek hasonló funkciójúak. Furthermore, as shown in Figure 16 that the Octopus antibody apoptotic s hyperactivity not lot dependent, since the various time points pre-set 16E2 Octopus antibodies similar. A 17/A és 17/B ábrán azt szemléltetjük, hogy a 16E2-és 3H3-Octopus-antitest apoptózisos aktivitása az SK-MES-1tüdőtumor-sejtvonal (17/A ábra) és a Jurkat T-sejttumorvonal (17/B ábra) vonatkozásában jobb, mint az Apo2L-ligandumé. Figure 17 / A and 17 / B is illustrated to the 16E2 and 3H3 Octopus antibody apoptotic activity in SK-MES-1tüdőtumor cell line (Fig 17 / A) and the Jurkat T sejttumorvonal (Fig 17 / B) right in respect of such Apo2L ligand. A DR5 elleni Octopus-antitestek hatékonyabbaklehetnek a DR5 tumorsejtek felületén történő klasztere-zésében, mint az Apo2L. The anti-DR5 Octopus antibodies hatékonyabbaklehetnek OF cluster-DR5 on the surface of tumor cells, such as Apo2L. A 16E2-Octopus-antitestet a National Cancer Institute(NCI) humán tumorsejtvonal sorozatával szemben két és hatnapos szkríneiéssel analizáltuk (az Apo2L-ligandummal ösz-szehascnlífva). The 16E2 Octopus antibody against the National Cancer Institute (NCI) human tumor cell lines and a series of two to six days szkríneiéssel analyzed (the Apo2L szehascnlífva OT). A 18/A-18/C ábrákon a 16E2-Octopus és azApo2L - különféle humán leukémia, nem kis sejtes tüdőrák,vastagbélrák, központi idegrendszeri (ONS) rák, melanoma,petefészekrák, veserék, prosztatarák és emlőráktumorsejtvcnalakra gyakorolt - hatásait bemutató két naposdózis-reakció görbe látható, míg a 19/A-19/'C -ábrákon a hatnapos szkrineiésből származó dózis-reakció görbéket mutat-juk be. 18 / A-18 / C in Figures 16E2 Octopus and azApo2L - various human leukemia, non-small cell lung cancer, colon cancer, central nervous system (ONS) cancer, melanoma, ovarian cancer, Veser, prostate cancer and on emlőráktumorsejtvcnalakra - presenting the effects of two naposdózis- visible reaction curve while -ábrákon 19 / A-19 / 'C derived from screening a six-day dose-response curves shown in Juk. A 16E2-Octopus-antitesttel és az Apo2L-ligandummala legtöbb tumorsejtvonal esetében hasonló eredményeket kap-tunk, ami azt jelzi, hogy a DR5 elleni Octopus-antitest ha-sonló módon működik, mint az Apo2L. The antibody 16E2 Octopus and Apo2L ligandummala similar for most of the tumor cell can get, which indicates that the anti-DR5 Octopus antibody works in a similar way as Apo2L. A tüdő- és vastagbélráksejtvonalak hasonló mértékű gátlása igazolta a 16E2- w · · 4 « * » · 4 > • · » 4 C 4 · v • « ··· ·«· « 44* «··« * · * · • » · 4 9 1 ·« 4· ·9 - 191 - A similar degree of inhibition of lung and colon cancer cell lines confirmed the 16E2- w · 4 · «*» · 4> · • »v • 4 · C 4" ··· · «·« 44 * "··" * * · · • »1 · 9 · 4« 4 · 9-191 -

Octopus-antitest és Apo2L tüdő- és vastagbélrák sejtvona-lakra gyakorolt hatását összehasonlító korábbi in vitro ésin vivő apoptózisos tesztek eredményeit A 16E2-Octopus bi-zonyos tumorsejtvonalakat [pl. The results of the comparative carrier Octopus antibody, and the effect of Apo2L lung and colon cancer cell lines LAKRON on previous in vitro tests Esin apoptotic The 16E2 Octopus bi-zonyos tumor cell lines [e. SF-295 központi idegrendsze-ri ráksejtvonal (19/B ábra) és két veserák-sejtvonal (ACHNés RXF393, ld. 19/C ábra)] elpusztító képessége váratlan volt. capability of destroying the SF-295-ri central idegrendsze cancer cell line (Fig 19 / B) and two renal cancer cell line (ACHNés RXF393, see Fig. 19 / FIG C)] was unexpected.

Az NCI tumorsejt sorozatának szkrínelésével kapotteredményeket mennyiségileg a 20/A és 20/B ábrán (két naposeredmények), illetve a 21/A és 21/B ábrán (hat napos ered-mények) mutatjuk be, melyeken a 16E2-Octopus-antitestet ésaz Apo2L-ligandumot hasonlítjuk össze a kezelttumorsejtvonalak szaporodás-gátlása (GI50) stasisa (TGI) éstoxicitása (LC5C) vonatkozásában. NCI tumor screening a series of results obtained quantitatively shown at 20 / A and 20 / B figure (two-day results), and Figure 21 / A and 21 / B (six-day comes, posters) on which the 16E2 Octopus antibody andthe Apo2L Ligand kezelttumorsejtvonalak compared with the reproduction-inhibition (Gi 50) stasis (TGI) éstoxicitása (LC5C) concerned. Még egyszer; One more time; ezek az eredmények azt sugallják, hogy a 16E2-Octopus-antitest többráktípus ellen lehet hatékony, mint ahogy azt korábban ta-ta s utaltuk. These results suggest that the 16E2 Octopus antibody may be effective against several types of cancer, as previously ta-ta and hated it. 4. példa CD20 elleni Octopus-antitest értékelése A kinérikus C23S anti-CD20 antitest (RITUXAN®, ld. 5 736 137 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírás, me-lyet teljes terjedelmében a kitanítás részének tekintünk)hatékonyságénak javítására tett egyik kísérlet során az an- titest tumorsejtek apoptózisát kiváltó képességét a Koopmanés mtsai. Example 4 Preparation of anti-CD20 Octopus antibody evaluation in an attempt to improve the kinérikus C23S anti-CD20 antibody (RITUXAN®, Nos. 5,736,137 U.S. Patent, methylprednisolone LYET incorporated herein by reference in its entirety) hatékonyságénak the an- apoptosis inducing ability of the tumor antibody directed Koopmanés al. íBlooc ői, 1415 (1994)] által leírt apoptózis- }D20 elleni Octopus-antitestet « 44 · • · .j • · « · · ·»· « · t » «··· « « · » 4 ·*» ««·..« »- - 192 - (OctCD20) a C2B8-antitest VL- és VH-doménjei alkalmazásávalállítottuk elő. apoptosis} described íBlooc Oi, 1415 (1994)] by anti-D20 Octopus antibody «44 • · · · .J •« · · · »·« t · »« ··· «« · »· 4 *» « «· ..« »- - 192 - (OctCD20) of C2B8 antibody VL and VH domains of application are prepared. Az OctCD20-antitestet az előző példákbanleírtak szerint, 293-as sejtekben termeltettük és Protein-ASepharose kromatográfiával tisztítottuk. OctCD20 the antibody according to the preceding példákbanleírtak, was produced in 293 cells and purified by Protein ASepharose chromatography.

Ahogy a 22. ábrán látható, a RITUXAN® önmagában a nem-Hodgkin limfomás B-sejtek (Wil-2) apoptózisát nem nagy mér-tékben váltja ki, hacsak nem képez keresztkötést az anti-humán IgG-vel (RITUXAN®-IgG). As shown in Figure 22, RITUXAN® itself non-Hodgkin's lymphoma B cells (Wil-2) does not trigger apoptosis in large measure-your mind unless crosslinked with anti-human IgG (RITUXAN IgG) . Ezzel szemben, az OctCD20-antitesz a keresztkötés-képzéstől függetlenül képes a Wil-2-sejtek apoptózisát indukálni. In contrast, the anti-OctCD20 makes the ability to induce the Wil-2 cells apoptosis regardless of the training to crosslinking. Mindazonáltal, az OctCD20-antitesz által indukált apoptózis mértéke kisebb, mint akeresztkötéses RITUXAN® által kiváltott apoptózisé, ami ar-ra utal, hogy az OctCD20-antitest apoptózisos aktivitásajavíthaző 'feltehetően flexibilis kapcsolószekvenciák al-kalmazása révén). However, the degree induced by an anti-OctCD20 makes apoptosis induced less than akeresztkötéses RITUXAN apoptosis, suggesting ar to that OctCD20 antibody apoptotic aktivitásajavíthaző 'presumably flexible linker through sub-biotics). 5. példa Example 5

További többértékű antitestek létrehozása Génsebészeti módszerek alkalmazásával a 2., 3. és 4. példában leírt Oczopus antitestek (anti-HER2, anti-DR5, il-letve snti-CD20) csukló-régió dimerizáciős doménnel létre-hozott változatait ("Octopus-F(ab')2") állítottuk elő. Creating Additional multivalent antibodies using genetic engineering methods 2, 3 and described in Example 4. Oczopus antibodies (anti-HER2, anti-DR5 yl letve snti-CD20), hinge region variants dimerization domains created judgment ( "Octopus F (ab ') 2 ") was prepared. AHFR2 elleni Octopus-F(ab')2-konstrukcic létrehozása céljá-ból a nehéz láncot kódoló cDNS Fc-régiőját leucin-zipzármotívumot kódoló szekvenciával helyettesítettük, amely - aprotein expresszáltatását követően - dimerizálódik, s ezál-tal hatásosan kapcsolja egymáshoz az Octopus Fab-karjait * >· .> • · 9 • » ··· ··· - 5·· ··(>· · · · fc i ·<*· ·» «<;· «. 193 (23/C ábra). Az Octopus-F(ab' ) 2-konstrukcióban megmaradhata leucin-zipzár motívum vagy az (pl. proteolízissel) eltá-volítható. Ahogy a 24. ábrán látható, a dupla VH/CH1-domének amplifikálására és az Octopus nehéz láncot kódolócDNS végére Notl-felismerési hely inszertélására [ami lehe-tővé teszi a konstrukció leucin-zipzár motívumot tartalmazóvektorba (VG15), azonos leolvasási fázisba történőszubklónozását] polimeráz-láncreakciót alkalmaztunk. A ne-héz lánc terminációs kodonjától 3'-irányban egy újabb rest-rikciós felismerés PURPOSE from creating against AHFR2 Octopus F (ab ') 2 konstrukcic encoding the heavy chain cDNA Fc region was replaced with the sequence encoding leucine zipzármotívumot which - dimerize and placed underneath-tal effectively connects together the Octopus Fab - after the protein is the expression of arms *> ·> 9 · • • »··· ··· - ·· ·· 5 (> · · · · i · fc <* ·» «<;. · '(Figure 23 / C) 193rd . the Octopus F (ab ') 2 construct retained Hata leucine zipper motif or (eg. proteolysis) could be removed. As shown in Figure 24, the duplicate VH / CH1 domains amplify and the Octopus heavy chain kódolócDNS end NotI recognition site inszertélására [which makes it possible at the foot of the construction leucine zipper motif tartalmazóvektorba (VG15), the same reading frame történőszubklónozását] was used to PCR. the not offer a chain termination codon to 3 'direction an additional rest-rikciós recognition i hely (Xhol) beiktatása céljából ismétpolimeráz-láncreakciót végeztünk. Az Xhol-felismerési helylehetővé teszi az emlőseredetű sejtekben történőexpresszált-fásra alkalmas pRK-vektorba történő szubklónozást. the purpose of the insertion site (Xhol) was performed ismétpolimeráz Chain Reactions. The restriction enzyme XhoI recognition allows subcloning into pRK vector suitable and hints fásra-expressed in mammalian cells helylehetővé. A DR5 elleni 16E2 monoklonális antitest és a CD2C elleni C238 monoklonális antitest VH/CHl-doménjeit -az ecy-egy példányban jelenlévő BamKI, Nhel és BspEI rest-rikciós helyek felhasználásával - az Oct-F(ab')2 nehéz láncvázba helyettesítettük. The anti-DR5 16E2 monoclonal antibody and anti CD2C C238 monoclonal antibody V H / CHl domains of using -the present ecy in duplicate BamKI, NheI and BspEI rest-rikciós places - substituting 2 heavy backbone chain of the Oct-F (ab ').

Az Fab-domének tandem ismétlődést! The Fab domains tandem repeat! egymáshoz kapcsolá-séval ;lineáris Fab-rr.ultimereket létrehozva) "POPoctopus"-antitesteket állítcttunk elő. Interlocking-Seval, creating linear rr.ultimereket Fab) 'POPoctopus "állítcttunk pre-antibodies. A "PO?oct-3" három összekap-csolt Fab-dómént {23/D ábra), míg a "POPoct-4" négy Fab- dcmént tartalmaz (iá. 23/E ábra). The "PO? Oct-3" Join three-switched domain of Fab {Figure 23 / D), while 'POPoct-4' comprises four Fab dcmént iA (Fig. 23 / E). Létrehoztunk HER2 elleni (rhuálsb 4Γ5), DR5 elleni (16E2) és CD20 elleni (C2B8) PCPcct-3-konstrukciókat, valamint HER2 elleni (rhuMab 4D5), ?-R5 elleni (16S2) és CD20 elleni (C2B8) POPoct-4-kcnstrukcickat. We generated against HER2 (rhuálsb 4Γ5), anti-DR5 (16E2) and anti-CD20 (C2B8) PCPcct-3 constructs as well as anti-HER2 (rhuMAb 4D5)? -R5 against (16S2) and anti-CD20 (C2B8) POPoct-4- kcnstrukcickat. A ?O?cct-3-antitesteket flex-1 kapcsoló- szekvetciéval vacv anélkül is előállítottuk. The? O? Cct-3 antibodies flex one switching szekvetciéval VACV without also prepared. • ···· ·· ·· ·· • · ······ • · ··· ··· · ···• · · · · ·· · • · · · · · ···· ·· - 194 - A 25. ábrán a POPoct-3 nehéz lánc cDNS létrehozását szemléltetjük. • ···· ·· ·· ·· • · · · · · · · · · ······ • • · · · · · · · · ·· • · · · · · · ···· · - 194 - Figure 25 illustrates the creation of the POPoct-3 heavy chain cDNA. A VH/CHl-domén amplifikálására - 5'- The VH / CHl domain for amplification - 5 '

BspEI-hely és 3'-NotI-hely beiktatásával - polimeráz-láncreakciót alkalmaztunk. BspEI site and 3 'NotI site by inserting - in using Polymerase Chain Reactions. A kapott szekvenciát emésztet-tük, és a BamHI-gyel és BspEI-gyel emésztett Octopus nehézlánccal együtt pRK-vektorba ligáltuk, miáltal három VH/CHl-domén szekvenciáját tartalmazó Octopus nehéz láncot kap-tunk. The resulting sequence digestive needles, and with BamHI and digested with BspEI Octopus heavy chain pRK ligated whereby Octopus containing VH / CHl domain sequence, we get three heavy chain. A BspEI-hely szerint és glicint kódol. The BspEI site and encoding glycine. A POPoct-4-antitest létrehozására (Id. 26. ábra) - né-ma mutáció beiktatása céljából - helyspecifikus oligo-mutagenezist alkalmaztunk, miáltal eltávolitottuk azOctopus nehéz lánc cDNS-ben lévő dupla VH/CHl-domének kö-zötti Nhel-felismerési helyet. view to including NE-m mutation - - used for site-specific oligonucleotide mutagenesis was thereby removed duplicate VH / CHl domains co-Zotti NheI recognition site on cDNA azOctopus heavy chain of the POPoct-4 to generate antibodies (Id Figure 26). . A második VH/CH1-szekvenciától közvetlenül 3'-irányban Nhel-restrikciós helybeiktatása céljából ismét oligomutagenezist alkalmaztunk. The second VH / CH1 sequence was again applied directly oligomutagenezist 3 'direction for the purpose NheI restriction site insertion. EclXS-t - a P0?oct-3-kor.strukcióval együtt - BamHI-gyel ésNhel-gyel emésztettük, és a pRK-vektorral ligáivá nehézlánc cDNS-t kaptunk, amely négy VH/CHl-domént kódoló szek-venciát tartalmaz. EclXS is - together with the P0 oct-3-kor.strukcióval - and NH-gel digested with BamHI and ligated with the heavy chain cDNA was obtained from the pRK vector containing four encoding VH / CHl domain sequence was. A különböző Octopus nehéz láncokat - a megfelelő köny-nyu lánc cONS-ekkel együtt - átmenetileg emlőseredetű 293-as sejtekbe cranszzektáltuk, miáltal három Fab-doménti?0?cct-3-Fab) vagy négy Fab-domént tartalmazó (teljeshosszúságú Octopus; Octopus-F(ab)'2; POPoct-4-Fab) antites-teket kaptunk. Different Octopus heavy chains - with their respective light chains Cons with - temporarily cranszzektáltuk mammalian 293 cells, whereby three Fab doménti 0 cct-3-Fab) or (full-length Octopus containing four Fab domains; Octopus? F (ab) '2; POPoct-4 Fab), we've the antibodies. A natív IgG monoklonális antitesteket és ateljes hosszúságú Octopus-antitesteket Protein-A Sepharoseoszlopon, az Octopus-F(ab') 2-t és a PO?oct-3-at és -4-et Native IgG monoclonal antibodies and population total length Octopus antibodies Protein A Sepharoseoszlopon, the Octopus F (ab ') 2, and PO? Oct-3 and -4, et

Pzctein-G Seoharose oszlopon tisztítottuk. Pzctein Seoharose purified G column. • · · · · ·· ·· • · · · · ·· ··· ··· · ···♦ · · · · ·· ·• ··· ·· ···· ·· - 195 - • · · • ·· ·· ·· · · · · · · · · · · · · · · · · · · ♦ · • ·· ·· ··· ···· ·· - 195 -

Az Octopus-F(ab')2 molekulatömege hozzávetőleg 200 kD (23/F ábra, 4. sáv), ami kisebb a teljes hosszúságú The Octopus F (ab ') 2 has a molecular weight of approximately 200 kDa (Figure 23 / M, lane 4), which is smaller than the full-length

Octopus-anLitest 240 kD-os molekulatömegénél (23/F ábra, 3. sáv) , de nagyobb, mint a natív IgG monoklonális antitest AnLitest Octopus 240 kDa molecular weight that (Figure 23 / M, lane 3), but larger than the native IgG monoclonal antibody

150 kD-os molekulatömege (23/F ábra, 1. és 2. sáv). 150 kDa molecular weight (Figure 23 / M, lanes 1 and 2). A POPoct-3 140 kD-os (23/F ábra, 5. sáv), azaz valamivel ki-sebb, mint a natív IgG monoklonális antitest, míg a POPoct-4 molekulatömege valamivel nagyobb (190 kD). The POPoct-3 140 kDa (Figure 23 / M, lane 5), that is slightly out more than the native IgG monoclonal antibody, while the POPoct-4 slightly greater molecular mass (190 kDa). Az Octopus-F(ab')2 nehéz lánca (23/G ábra, 4. sáv) hozzávetőleg azonosméretű (55 kD) a natív IgG monoklonális antitest nehéz lán-cával (23/G ábra, 1. és 2. sáv). The Octopus F (ab ') 2 heavy chain (Figure 23 / G, lane 4) is approximately the same size (55 kD) of the native IgG monoclonal antibody heavy dioxolan rod to (Figure 23 / G, lanes 1 and 2). A POPoct-3 nehéz lánc(23/G ábra, 5. sáv) molekulatömege hasonló a teljes hosszú-ságú Oczopus nehéz láncéval (23/G ábra, 3. sáv), míg a leg-nagyobb nehéz lánc a ?OPoct-4 (kb. 97 kD). The POPoct-3 heavy chain (Figure 23 / G, lane 5) has a molecular weight similar to the full lengths of Oczopus heavy chain with those (Figure 23 / G, lane 3), while the most-more heavy chain? OPOCE 4 ( approx. 97 kD). 6. példa BER2 elleni többértékű antitestek értékelése Example 6. Evaluation of polyvalent antibodies BER2

Anziprciizerációs teszt Anziprciizerációs test

Az OctKER-E(ab>' ;-t, POPoct-3-HER2-t, OctHER2-t, 0czEER2-zlexl-et és a rekombináns humán 4D5 monoklonális anzizeszez (EERCEPTIX®) azonos koncentrációkban a HER2-t 3+ mértékben rűlzermelő BI474-tumorsejtekhez adtuk, és kris-zélyibclya festéssel meghatároztuk sejtszaporodást gátlóképességűhez. E zeszzek eredményeiz a 27. ébrén mutatjukbe. Bér a BT474-sejbekben valamennyi antitest indukált va-lamilyen mértékű citostasist, a POPoct-3-HER2 és arekombináns humán. 4D5 monoklonális antitest bizonyult lég- • · · - 196 - hatékonyabbnak (és azonos mértékben gátolták a sejtszaporo-dást), míg az OctHER2-F(ab)'2 koncentrációja csökkenésévelgyorsan elvesztette hatékonyságát. Az 0ctHER2-flexl azOctHEr2-höz képest csekély mértékű, de valamennyi vizsgáltkoncentrációnál nagyjából azonos javulást mutatott (n=6),ami arra utal, hogy a nagyobb flexibilitás az Fab számárajobb hozzáférést biztosít a HER2-höz. The OctKER-E (b> '; -t, POPoct-3-HER2 OctHER2 t-0czEER2 zlexl was the recombinant human monoclonal 4D5 anzizeszez (EERCEPTIX®) concentrations similar to 3+ HER2 extent rűlzermelő was BI474-tumor cells and crystal zélyibclya staining was determined cell growth gátlóképességűhez. E zeszzek eredményeiz the awake 27. mutatjukbe. Letting the BT474 sejbekben all antibodies induced va lamilyen degree of cytostasis, POPoct-3-HER2, and the techniques of recombinant human. monoclonal antibody 4D5 was air- • · - 196 -. be more efficient (and equally inhibited cell proliferation concentration), while '2 concentration OctHER2 F (ab) decreases rapidly lost its effectiveness is small compared to 0ctHER2-Flexlm azOctHEr2 to scale, but all vizsgáltkoncentrációnál showed roughly the same improvement (n = 6), suggesting that the increased flexibility of the Fab for better access to HER2.

Az OctHER2-t, 0ctHER2-flexl-et, POPoct-3HER2-t, POPoct-3HER2-flexl-et és a rekombináns humán 4D5 monoklonális antitestet (HERCEPTIN©) azonos koncentrációk-ban egy másik, KER2-t 3+ mértékben túltermelő sejtvonal(SKBR3) alkalmazásával, kristályibolya festéssel végzettcitostasis-zesztben sejtszaporodás-gátlási képességükrevizsgáltuk. concentrations in the OctHER2 t, 0ctHER2-FLEXlm, POPoct-3HER2 is, POPoct-3HER2-FLEXlm and recombinant human monoclonal antibody 4D5 (HERCEPTIN ©) identical to another, KER2 3+ overexpressing cell line (SKBR3) using crystal violet staining végzettcitostasis-zesztben képességükrevizsgáltuk cell growth inhibition. Az eredményeket a 28. ábrán mutatjuk be. The results are shown in Figure 28. AzSKBR3-sejtvonal szaporodását valamennyi tesztelt Octopus- konstrukcic azonos - és a rekombináns humán 4D5 monoklonális antitesthez képest nagyobb - mértékben gátolta<n=4). AzSKBR3 cell line proliferation konstrukcic same in all tested Octopus - and greater than the recombinant human monoclonal antibody 4D5 - fully inhibited <n = 4). A hatékonyság - OctHER2 vagy POPcct-3 Fab-karjai kö-zötti - flexibilis kapcsolószekvenciának tulajdonítható ja-vulása e sejtvonal esetében kevésbé volt nyilvánvaló. Efficiency - OctHER2 or POPcct-3 Fab arms co-Zotti - attributable flexible linker-ja vulása was less evident in this cell line. interna_zzációs teszt A ?O?czt-3HER2-anti.testet - incnuntcxin terápiában valóalkalmazhatóságának értékelése céljából - két 3+ mértékbenHER2-tűleemelő tumorsejtvonal (SKBR3 és BT474) alkalmazá-sával végzett internalizációs tesztekben az OctHER- és HERCE?TIX©-antitesttel hasonlítottuk össze. interna_zzációs test the O-CZT 3HER2 anti.testet -? incnuntcxin purpose of therapy, evaluation of applicability - internalization assays with two application-SAVAL 3+ mértékbenHER2-tűleemelő tumor cell lines (BT474 and SKBR3) compared to OctHER- and Herz TIX -antitesttel ©? . A POPoct-3HER2- t - bér strukturálisan eltér a teljes hosszúságú 0ctHER2- • · · · • · ·«· •··· ·· - 197 - antitesttől - mindkét sejtvonal az 0ctHER2-vel azonos módon(ld. 29/A és 29/B ábra), a HERCEPTIN®-hez képest pedig két-szeres sebességgel internalizálja és katabolizálja. The POPoct t-3HER2- - custom structurally different from the full-length 0ctHER2- • • · · · · · «· · · · • ·· - 197 - antibody -. Both cell lines with 0ctHER2 the same way (see 29 / A and Figure 29A / B), compared to HERCEPTIN® offer is internalized and catabolized rate two-fold. 7. példa DR5 elleni többértékű antitestek értékelése Example 7. Evaluation of polyvalent antibodies to DR5

Apoptózís-teszt Apoptosis test

Ebben a példában a DR5 elleni 16E2 monoklonális anti-test többértékű változatait teszteltük. In this example we tested multivalent versions 16E2 monoclonal antibodies against DR5. Az 0ctlDR5, The 0ctlDR5,

OctDRSfiex-1, OctDRS? OctDRSfiex-1, OctDRS? (ab') ?, POPoct-3DR5, POPoct-3DR5flex-1és PO?oct-4DR5 azonos koncentrációit COLO205 vastagbéltumorsejtvonalboz adtuk, és kristályibolya festéses apoptózis- teszzekben a 16E2 monoklonális antitesttel hasonlítottuk össze (n=4). (Ab ')?, POPoct-3DR5, POPoct-3DR5flex-1and PO? Oct-4DR5 same concentrations was vastagbéltumorsejtvonalboz COLO 205 and crystal violet staining teszzekben apoptosis compared to 16E2 monoclonal antibody (n = 4). Az eredményeket a 30/A és 30/B ábrán mutatjukbe. The results in Figure 30 / A and 30 / B mutatjukbe. Valamennyi Oczocus-antitest nagyobb mértékű apoptózistindukált, mint a 16?2-antizest; All Oczocus antibody apoptózistindukált greater than 16 2 antizest?; a hatékonysági sorrend a következő volt*. the order of potency was as follows *. OctDRSflex-1 > OctDRS = POPoct-4DR5 = PO?cct-3flex-lDR5 = ?C?oct3DR5 > OctDRS?(ab')2 > 16E2. OctDRSflex-1> = POPoct-OctDRS 4DR5 = PO? Cct-3flex-lDR5 =? C? Oct3DR5> OctDRS? (Ab ') 2> 16E2. AzOczDRSilex-1 az 0ctDR5-höz képest fokozott hatékonyságúvolt (különösen kisebb koncentrációkban; ld. 30/A ábra), ami azt jelzi, hogy az Eab-karok közötti flexibilitás növe-li a hatékonyságot. AzOczDRSilex-1 increased with respect to the Efficiency was 0ctDR5 (especially at lower concentrations;. See 30 / Figure), indicating that flexibility between the arms Eab-Nove-li efficiency. A ?0Pcct-3flex-lDRS ugyanolyan mértékűapoptózist indukált, mint az OctHER (30/A ábra), és hason-n'.ta ?0?octl6-3 és ?0?octl6-4 (ld. 30/B ábra). The? 0Pcct-3flex lDRS-induced mértékűapoptózist same as OctHER (Fig 30 / A), and the like in n'.ta? 0? Octl6-3 and? 0? Octl6-4 (see Fig. 30 A / B). löt, 198 Lot 198

Celluláris jelátvitel Cellular signal transduction

Az Apo2L sejthalál-receptorokhoz kötődik, és a kaszpázjelátviteli reakcióúton keresztül celluláris apoptózistvált ki. Apo2L cell death receptors and cellular pathway through the kaszpázjelátviteli apoptózistvált out. Ahogy a 31/A és 31/B ábrán látható, az anti-DR5Octopus-antitestek ugyanazon reakcióúton keresztül indukál-nak apoptózist, mint az Apo2L. As shown in Figure 31 / A and 31 / B, the anti-DR5Octopus antibodies through the same pathway induces apoptosis does, as Apo2L. Az Octl6E2 az SK-MES-1tüdőtumor-sejtvonalban hasonló mértékű apoptózist váltottki, mint az Apo2L (31/A ábra, szaggatott vonalak), de ZVAD(amely a kaszpáz-3 és kaszpáz-9 inhibitora) hozzáadása utánaz Apo2L, illetve Octl6E2 által kiváltott cellulárisapoptőzis gátlás alá került (31/A ábra, folytonos vonalak).A DR5 elleni Octopus-antitestek Apo2L-ligandummal azonosreakcióúton keresztüli jelátvitelének további bizonyítékátDISC-ar.alí zisekkel (DISC = Death jEnduceó Signaling Complex)kaptuk (ld. 31/B ábra) . The Octl6E2 SK-MES-1tüdőtumor cell line váltottki similar apoptosis as Apo2L (31 / Figure, broken lines), but ZVAD (which caspase-3 and caspase-9 inhibitor) induced by the addition utánaz Apo2L or Octl6E2 cellulárisapoptőzis was inhibited (31 / Figure, solid lines) .This gave anti-DR5 Octopus antibodies through the same pathway Apo2L signal transmission further bizonyítékátDISC-ar.alí zisekkel (DISC = Death jEnduceó signaling Complex) (see Fig. 31 A / B) . DR5-öt termelő B-sejt-limfoma sej-teket (3JA3) két anti-DR5 Octopus-antitest (Octl6E2 ésOct3H3) két különböző koncentrációjával különböző időtarta-mokban inkubáltuk. DR5-producing B-cell lymphoma cell-you (3JA3) two anti-DR5 Octopus antibodies (Octl6E2 ésOct3H3) were incubated with two different concentrations of different duration homogenates. Az antitest-DR5 komplexek tisztításaután western-blot analízist végeztünk, hogy azonosíthassuka tisztítás során a komplexekkel együtt kinyert jelátvivőmolekulákat. Antibody Purification DR5 complexes after western blot analysis was performed to obtained jelátvivőmolekulákat with complexes azonosíthassuka during purification. Hasonlóan az Apo2L esetében tapasztaltakhoz, akaszpáz-8 és EADD jelétvivő molekulák asszociélódtak a DR5-tei, mintán a receptort az Octl6E2 vagy Oct3H3 megkötötte(31/3 ábra). Similarly for Apo2L those seen, akaszpáz-8 and the signal EADD carrier molecules asszociélódtak DR5 uptake, samples of the receptor or Octl6E2 Oct3H3 concluded (Figure 3.31). ···· · · ·· ·» • ···«··• ··· ··· · ···»·* · · · ·* ··· ·· ··«« ·« - 199 - 8. példa CD20 elleni Octopus-antitest értékelése ···· ·· · · · »· · · •« · · · · · · · · · · • ·· »* · · · · · · · · * ·· ··« «·« - 199 - Example 8 Preparation of anti-CD20 Octopus antibody evaluation

Apoptózis-tesztek Apoptosis assays

Ahogy a 33. ábrán látható, a RITUXAN® WIL-2 B-sejt-limfoma sejtvonalban in vitro csak abban az esetbenindukál hatékonyan apoptózist, ha először anti-IgG anti-testtel keresztkötésbe lép. As shown in Figure 33, RITUXAN® WIL-2 B cell lymphoma cell lines in vitro only in the apoptotic esetbenindukál efficiently if the first appearance of anti-anti-IgG antibody was crosslinked. Az OctCD20 keresztkötéstől füg-getlenül képes volt a WIL-2-sejtek apoptózisának indukálá-sára (nagyobb mértékben, mint a RITUXAN© önmagában, de va-lamivel kisebb mértékben, mint az anti-IgG antitesttel ke-resztkötött RITUXAN©; ld. 32. ábra). The OctCD20 cross linking was dependency of getlenül able to WIL-2 cells apoptosis inducing (to a greater extent than Rituxan © alone, but less va lamin extent than anti-IgG antibody cross-linked RITUXAN ©;. Ld 32 . figure). Mivel a RITUXAN® invivő hatékonyságának egyik lehetséges magyarázata az, hogyaz antitest komplementet vagy FcyR-t hordozó sejtekkel lépkeresztkötésbe, ez a megfigyelés azt sugallja, hogy azCctCD2C in vivő még nagyobb hatékonyságú. As one possible explanation for the effectiveness of RITUXAN InVivo is hogyaz antibody complement or cells bearing FcyR lépkeresztkötésbe, this observation suggests that in vivo azCctCD2C even greater efficiency.

Az OctCD20-F(ab·' 2-, POPoct-3CD20- és POPoct- ?CD20flex-l-arzitestez különböző koncentrációkban WIL-2- sejtek alkalmazásával végzett apoptózis-tesztekben vizsgál-tak (az optimális dózisokat a 33. ábrán a maximális reak-ció-görbéken tüntetjük fel). Az Octopus-antitesteket a CD20elleni iFS-antitesrhez (Clark és mtsai., ld. fentebb) ha-sonlítottuk, amely a RI?UXAN©-hoz hasonlóan működik, ameny-nyiben csak anti-IgG antitesttel történő keresztkötést kö-vetően indukál apoptózist. Mindkét tesztelt Octopus-antitest legalább hasonló [OctCD20-F (ab)' 2] vagy nagyobbí?OPoct-3CD2C, PO?cct-3CD20flex-1) mértékű apoptózist indu- '.int a keresttkötéses anti-CD2C IF5-antitest. The OctCD20 F (ab · '2-, POPoct-3CD20- and POPoct-? CD20flex arzitestez-l at various concentrations apoptosis assays using WIL-2 cells tested tock (optimum doses in Figure 33, the maximum reaction shown -CO-curves). the Octopus antibodies to CD20elleni IFS antitesrhez (Clark et al.,., supra) ha sonlítottuk, which operates similarly to RI? UXAN © to if they gave only anti-IgG antibody crosslinking with a following induces apoptosis. Both tested Octopus antibody is at least comparable to [OctCD20 F (ab) '2] or larger? OPOCE 3CD2C PO? cct-3CD20flex-1) levels of apoptosis induce' .int the keresttkötéses anti -CD2C IF5 antibody. Ezen - 200 - • ·· túlmenően, az Octopus-antitestek lényegesen kisebb koncent-rációkban voltak hatásosak, mint a keresztkötéses anti-CD20 antitest. In - 200 - • ·· addition, the Octopus antibodies were efficacious concentrations were significantly lower concentration than the cross-linked anti-CD20 antibody.

Ha a WIL-2S B-sejt-limfoma sejtvonalhoz keresztkötésesanti-CD20 antitesteket adtunk, a sejtek homotípusos adhézi-óját figyeltük meg. If the WIL-2S-B-cell lymphoma cell line was added crosslinking Santi-CD20 antibodies was observed óját homotypic adhesion of cells. A sejtek ilyenfajta összetapadása azegyik jele annak, hogy a sejtek a CD20-on keresztül aktivá-lódtak. Nesting of this type unless one of the cells indicated that the cells through the activation of CD20 on lódtak. A CD20 elleni Octopus-antitestek - keresztkötéstőlfüggetlenül - ugyanezen homotípusos adhéziós jelenséget in-dukálják, és (ahogy a 34. ábrán a P0Poct-3CD20 esetébenlátható) sokkal kisebb koncentrációkban, mint a keresztkö-tött I?5 anti-CD20 antitest. anti-CD20 Octopus antibodies - keresztkötéstőlfüggetlenül - same homotypic adhesion phenomenon in-dukálják, and (as in Figure 34 the P0Poct-3CD20 case shown) much lower concentrations than the bridging via-filled T 5 of anti-CD20 antibody.

Az apoptózis különböző anti-CD20 antitestek által tör-ténő redukálását krónikus limfocitikus leukémiában (CLL)szenvedő pácienstől vett vér alkalmazásával is értékeltük.Dextráncs szedimenzációval perifériás vérből származólimfocizákaz izolálnunk, majd ezeket mosást követően szé-rummentes Iimfocita-tépközegre szélesztettük, és egy éjsza-kán minta nélkül, lF5-antitesttel (20 pg/ml), egér anti-IgG-vel keresztkötőzt l?5-antitesttel (100 pg/mi), OctCD20-Ffab'}^-antitesttel (hozzávetőleg 0,5-1,0 pg/ml) vagy?OPcct-3CD20-antizeszzei (0,5 pg/ml) egy éjszakán át kezel- tűk. Apoptosis származólimfocizákaz isolating peripheral értékeltük.Dextráncs szedimenzációval blood also using blood taken by various anti-CD20 antibodies in a patient suffering from break-Tenon reduction of chronic lymphocytic leukemia (CLL) and, after these washings were plated serum rummentes lymphocyte tépközegre and one night decane but without sample LF5 antibody (20 pg / ml), mouse anti-IgG keresztkötőzt 5 l antibody (100 pg / ml), OctCD20-Ffab '} ^ -? antibody (approximately 0.5 to 1.0 pg / ml) or? OPcct-3CD20-antizeszzei (0.5 pg / ml) were treated overnight.

Annexin és PI-festés akalmazáséval apoptózis-tesztetvégezzünk. Annexin and PI staining akalmazáséval apoptosis carry out a test. Az apoptózisos sejtek százalékos aránya a követ-kezők szeri?.?. The percentage of apoptotic cells in the stone-those times?.?. alakul?: It develops ?:

Kezelés nélkül: 38,5 % 201 * · *··*··• · ··· ··· · ······« · · · · • ··« · · · · J· ·« anti-IgG antitesttel keresztkötött lF5-antitest: 25,1 % POPoct-3CD20 (0,5 gg) : 50,2 % Without treatment: 38.5% 201 * * · ·· ·· * • ··· ··· · · ······ "· · · · ·· •« · · · · · · J «anti- cross-linked IgG-LF5 antibody 25.1% POPoct-3CD20 (0.5 gg): 50.2%

OctCD20-F(ab')2 (0,5 gg) : 37,7 % OctCD20 F (ab ') 2 (0.5 gg): 37.7%

OctCD20-F(ab')2 (1,0 gg): 48,6 % OctCD20 F (ab ') 2 (1.0 gg): 48.6%

Ezek az adatok azt jelzik, hogy a többértékű anti-CD20antitestek (különösen a POPoct-3CD20) dózisfüggő módon fo-kozzák az apopotózist. These data indicate that multivalent anti-CD20antitestek (especially POPoct-3CD20) dose-dependent manner by liquid publish apopotózist.

Internalizációs vizsgálatok Három B-sejt-iimfoma sejtvonal (DB, WIL-2 és Ramos)alkalmazásával végzett internalizációs tesztekben azOctCD2C-antitest immuntoxin-terápiában való alkalmazhatósá-gát - a RITUXAN®-hoz viszonyítva - értékeltük. Internalization Internalization studies Three assays using B cell lymphoma cell line (DB, Ramos and WIL-2) azOctCD2C antibody applicability barrier to immunotoxin therapy - evaluated - RITUXAN® compared. Ahogy a 35.ábrán látható, a sejtek kétszer annyi OctCD20-antitestetinternalizáltak, mint RITUXAN®-t (melyet a sejtek neminternalizáltak elfogadható szinten). As shown in 35.ábrán, twice the number of cells OctCD20-antitestetinternalizáltak than Rituxan® (which cells neminternalizáltak acceptable level). A többértékű antites-tek - kötőhelyek nagyobb száma miatt várható - nagyobbaviditását az a tény is alátámasztja, hogy az idő előreha-ladásával - a RI7UXAX®-hoz képest - több OctCD20-antitest The more the antibodies value-tek - likely due to the higher number of binding sites - nagyobbaviditását is supported by the fact that, over time, if ladásával - more OctCD20 antibody - compared to the RI7UXAX®

S Sθ ~ Tl· ΤΘ J_ Ü θTl·Γ.θ Z kötődve. S Sθ Ü ~ J_ θTl ΤΘ Tl · · Z Γ.θ binding. - 202 - - 202 -

Szekvencialista sequence Listing

Szekvenciák, száma: 11 <210> 1 <211> 218 <212> PRT - 213;· Homo sapiens <4002 Pro 1 1 Alá Pro Glu Leu 5 Leu Gly Gly Pro Ser 10 Val Phe Leu Phe Pro 15 Pro Lys Pro Lys Asp 20 Thr Leu Met Ile Ser 25 Arg Thr Pro Glu Val 30 Thr Cys Val Val Val 35 Asp Val Ser His Glu 40 Asp Pro Glu Val Lys 45 Phe Asn T rp Tyr Val 50 Asp Gly Val Glu Val 55 His Asn Alá Lys Thr 60 Lys Pro Ara Glu Glu 65 Gin Tyr Asn Ser Thr 70 Tyr Arg Val Val Ser 75 Val Leu Thr Val Leu 80 His Gin Asp Trp Leu 85 Asn Gly Lys Glu Tyr 90 Lys Cys Lys Val Ser 95 Asn Lys Alá Leu Pro 100 Alá Pro Ile Glu Lys 105 Thr Ile Ser Lys A1 a110 Lys Gly Gin Pro Arg 115 Glu Pro Gin Val Tyr 120 Thr Leu Pro Pro Ser 125 Ara Glu Glu Met Thr 130 Lys Asn Gin Val Ser 135 Len Thr Cys Leu Val 140 Lys Gly Phe Tyr Pro 145 Ser Asp Ile A1 a Val 150 Glu Trp Glu Ser Asn 155 Gly Gin Pro Glu Asn 160 Asn Tyr Lys Thr Thr 165 Pro P re Va1 Leu Asp 170 Ser Asp Gly Ser Phe 175 Phe Leu Tyr Ser Lys 180 Í..C 11 Thr Val .-.sp Lys 185 Ser A. rq Trp Gin Gin 190 Gly Asn Sequences count: 11 <210> 1 <211> 218 <212> PRT - 213; · Homo sapiens <4002 Pro 1 1 Falling Pro Glu Leu 5 Leu Gly Gly Pro Ser 10 Val Phe Leu Phe Pro 15 Pro Lys Pro Lys Asp 20 Thr Leu Met Ile Ser 25 Arg Thr Pro Glu Val 30 Thr Cys Val Val Val 35 Asp Val Ser His Glu 40 Asp Pro Glu Val Lys 45 Phe Asn T rp Tyr Val 50 Asp Gly Val Glu Val 55 His Asn Falling Lys Thr 60 Lys Pro Ara Glu Glu 65 Gln Tyr Asn Ser Thr 70 Tyr Arg Val Val Ser 75 Val Leu Thr Val Leu 80 His Gln Asp Trp Leu 85 Asn Gly Lys Glu Tyr 90 Lys Cys Lys Val Ser 95 Asn Lys Falling Leu Pro 100 Falling Pro Ile Glu Lys 105 Thr Ile Ser Lys A1 A110 Lys Gly Gln Pro Arg 115 Glu Pro Gln Val Tyr 120 Thr Leu Pro Pro Ser 125 Ara Glu Glu Met Thr 130 Lys Asn Gln Val Ser 135 Len Thr Cys Leu Val 140 Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile 145 150 A1 Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 155 160 165 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Leu Asp 170 P from VA1 Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys 175 180 Í..C Thr Val 11 .-. 185 sp Lys Ser Trp Gln Gln 190 A rq Gly Asn Val Phe Ser 195 Val Phe Ser 195

Cy's Ser Val Két His Glu Alá Leu His Asn Kis Tyr Thr Gin Lys200 205 210 ·<··» »·« • * · • · ·*· «· ·»·*·< * · · * « · · «;> »a . Cy's Ser Val Two His Glu Falling Leu His Asn Small Tyr Thr Gin Lys200 205 210 · <·· »» · «• * · • · · * ·« · »· * · <* · * '·'; > »in. β a 203 - β 203 -

Ser Leu Ser Len Ser Pro Gly Lys21S <210> 2 <211> 2 Ser Ser Leu Ser Pro Gly Lys21S Flax <210> 2 <211> 2

<212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2Asp Leu 1 <210> 3 <211> 217 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 2Asp Leu <210> 3 <211> 217

<212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3

Pro Alá Pro Pro Val Alá Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro15 10 15 Falling Pro Pro Pro Pro Gly Ser Val Val Falling Phe Leu Phe Pro Pro15 10 15

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr20 25 30 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val 25 30 Thr20

Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gin Phe 35 40 45 Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe 35 40 45

Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn 711a Lys Thr Lys 50 55 60 Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Lys Thr Lys 50 55 711a 60

Pro Arg Glu Glu Gin Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val 65 70 75 Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val 65 70 75

Leu Thr Val Val His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 80 85 " 90 Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 80 85 "90

Cvs Lvs Val Ser Asn Lvs Gly Leu Pro Alá Pro Ile Glu Lys Thr 95 " 100 105 Cvs Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Pro Ile Glu Lys Thr Falling 95 "100 105

Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr 110 " 115 120 Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr 110 '115 120

Leu Pro Pro Ser Arq Glu Glu Met Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu 125 130 135 Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 125 130 135

Thr Cvs Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Alá Val Glu 140 " 145 ' 150 Cvs Leu Thr Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Val Glu Falling 140 '145' 150

Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro 155 160 165 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro 155 160 165

Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu 170 ' 175 180 Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu 170 '175 180

Thr Val Asp Lvs Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys 185 ' 190 195 Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys 185 '190 195

Ser Val Két His Glu Alá Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser 200 205 210 Two Ser Val Leu His Asn His Glu Falling His Tyr Thr Gln Lys Ser 200 205 210

Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 215 <210' • ί*·· ·· * » ·····-. Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 215 <210 '* • ί ·· ·· * »····· -. • 9 ··· » *<« »·«· · 9 « | • 9 ··· »* <« »·« · 9 «| « ··» JW »·-4· »«. "··" JW "-4 · ·» «. 204 <211> 218 204 <211> 218

<212> PRT <213> Homo" sapiens <400> 4 <212> PRT <213> Homo "sapiens <400> 4

Pro 1 lila Pro Glu Leu 5 Leu Gly Gly Pro Ser 10 Val Phe Leu Phe Pro 15 Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val 20 25 30 Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gin 35 40 45 Phe Lys Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Alá Lys Thr 50 55 60 Lys Pro Arg Glu Glu Gin Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser 65 70 75 Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 80 85 90 Lys Cys Lys Val Ser Asn -Lys Alá Leu Pro Alá Pro Ile Glu Lys 95 100 105 Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr 110 115 120 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gin Val Ser 125 130 135 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Alá Val 140 145 150 Glu Trp Glu Ser Ser Giv Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Asn Thr Thr 155 160 165 Pro P ro Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys no 175 180 Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Ile Phe Ser 185 190 195 Cys Ser Val Met His Glu A1 a Leu His Asn Arg Phe Thr Gin Lys 200 205 210 Ser Leu Pro 1 purple Pro Glu Leu 5 Leu Gly Gly Pro Ser 10 Val Phe Leu Phe Pro 15 Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val 20 25 30 Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln 35 40 45 Phe Lys Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Falling Lys Thr 50 55 60 Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser 65 70 75 Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 80 85 90 Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Leu Pro Falling Falling Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser 95100105 Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro 110 115 120 Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser 125 130 135 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Falling Val 140 145 150 Glu Trp Glu Ser Ser gIV Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Asn Thr Thr 155 160 165 Pro P ro Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys no 175 180 Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Ile Phe Ser 185 190 195 Cys Ser Val Met His Glu A1a Leu His Asn Arg Phe Thr Gln Lys Ser Leu 200 205 210 Ser Leu Ser Pro Gly Lys 215 <210; Ser Leu Ser Pro Gly Lys 215 <210; - 5 <211; - 5 <211; • 21: c <-· <212; • 21: c <- · <212; • PR' 2 <213; • PR '2 <213; Homo sapiens <400> 5 Pro Alá Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro 5 10 15 Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Iie Ser Arg Thr Pro Glu Val 20 25 30 Tn r Cys Val Val Val Asp Val Ser C-ln Glu Asp Pro Glu Val Gin 35 40 4 5 - 205 Homo sapiens <400> 5 Pro Falling Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro 5 10 15 Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val 20 25 30 Tn r Cys Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp Pro C-ln Val Glu Gln 35 40 4 5-205

Phe As n Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Alá Lys Thr 50 55 60 Lys Pro Arg Glu Glu Gin Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser 65 70 75 Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 80 85 90 Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser lle Glu Lys 95 100 105 Thr lle Ser Lys Alá Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr 110 115 120 Thr Leu Pro Pro Ser Gin Glu Glu Met Thr Lys Asn Gin Val Ser 125 130 135 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp lle Alá Val 140 145 150 Gin Trp Glx Ser As n Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr 155 160 165 Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg 170 175 180 Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Glu Gly Asn Val Phe Ser 185 190 195 Cy s Ser Val Met His Glu Alá Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys 200 205 210 Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 215 <210> 6 <211> 215 > <212> PRT <213> Kus . Phe As n Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Falling Lys Thr 50 55 60 Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser 65 70 75 Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 80 85 90 Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys 95100105 Thr Ile Ser Lys Falling Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 110 115 120 Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser 125 130 135 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Falling Val 140 145 150 Gln Trp Glx Ser As n Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr 155 160 165 Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg 170 175 180 Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser 185 190 195 Cys Ser Val Met His Glu Falling Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys 200 205 210 Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 215 <210> 6 <211> 215> <212> PRT <213> Kus. isusculus <400> 6 Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe lle Phe Pro P ro Lys Pro 1 5 10 15 Lys Asp Val Leu Thr lle Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val 20 25 30 Val Val Asp lle Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gin Phe Ser Trp 35 4 0 45 Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Alá Gin Thr Gin Pro Arg 50 55 60 Glu Glu Gin Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro 65 7 0 75 lle hét His Glu Asp Cys Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg • C -A 85 90 Val As π Ser Alá z\ í 3 Phe Pro Alá Pro lle Glu Lys Th t. isusculus <400> 6 Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro P ro Lys Pro 1 5 10 15 Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val 20 25 30 Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp 35 4 0 45 Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Falling Gin Thr Gin Pro Arg 50 55 60 Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro 65 7 0 75 Ile seven His Glu Asp Cys Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg -A • C 85 90 Val Ser As Falling π z \ f 3 Falling Phe Pro Pro Ile Glu Lys Th t. He Ser C : 100 105 Lys T π x? He Ser C: T π x 100 105 Lys? £,V < Gly A: c Pro Lys A1 a Pro Gin Tvr Th r I le Pro • · - 206 - 110 115 120 £ V <Gly A: c Pro Lys A1a Pro Gin Tvr Th r I le Pro • · - 206 to 110,115,120

Pro Pro Lys Glu Gin Met Alá Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys125 130 135 Pro Pro Lys Glu Gln Met Lys Asp Falling Lys Val Leu Thr Ser Cys125 130 135

Met Ile Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gin140 145 150 Met Ile Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp 145 150 Gin140

Trp Asn Gly Gin Pro Alá Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gin Pro Ile155 160 165 Trp Asn Gly Gln Pro Glu Asn Tyr Lys Asn Falling Thr Gln Pro Ile155 160 165

Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val170 175 180 Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val170 175 180

Gin Lys Ser Asn Trp Glu Alá Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val185 190 195 Gln Lys Ser Asn Trp Glu Gly Asn Thr Phe Thr Falling Cys Ser Val185 190 195

Leu His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser200 205 210 Leu His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser200 205 210

His Ser Pro Gly Lys215 <210> 7 <211> 218 His Ser Pro Gly Lys215 <210> 7 <211> 218

<212> FRT <213> Mus musculus <400> 7 <212> FRT <213> Mus musculus <400> 7

Pro Alá Pro Asn Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro15 10 15 Falling Pro Asn Pro Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro15 10 15

Pro Lys Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Leu Ser Pro Ile Val 20 25 30 Pro Lys Lys Asp Val Ile Ile Met Leu Ser Leu Ser Pro Val Ile 20 25 30

Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp Val Gin 35 40 45 Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp Val Gln 35 40 45

Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn Val Glu Val His Thr Alá Gin Thr 50 55 60 Ile Ser Val Asn Phe Trp Asn Val Glu Val His Thr Gln Thr 50 55 60 Falling

Gin Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val Val Ser 65 70 75 Gin Thr His Arg Glu Asp Asn Ser Thr Leu Tyr Arg Val Val Ser 65 70 75

Alá Leu Pro Ile Gin His Gin Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe 8 0 85 90 Under Leu Pro Gln Ile His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe 85 90 8 0

Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro Alá Pro Ile Glu Arg 95 100 105 Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Leu Asp Ile Glu Arg Pro Pro Falling 95100105

Thr Ile Ser Lys Pro Lvs Gly Ser Val Arg Alá Pro Gin Val Tyr 110 ' 115 120 Thr Ser Ile Lys Pro Arg Lys Gly Ser Val Pro Gln Val Tyr 110 Falling '115120

Val Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu Met Thr Lys Lys Gin Val Thr 125 130 * “ 135 Val Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu Met Thr Lys Lys Gin Val Thr 125 130 * "135

Leu Thr Cys Met Val Thr Asp Phe Met Pro Glu Asp Ile Tyr Val l-.O 14 5 150 Leu Thr Cys Met Val Thr Asp Phe Met Pro Glu Asp Ile Tyr Val l .O 14 5150

Glu Trp Thr Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu Asn Tyr Lys Asn Thr 155 160 165 Glu Trp Thr Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu Asn Asn Thr Tyr Lys 155 160 165

Glu Pro Val Leu Asc Ser A.sp Gly Ser Tyr Phe Met Tvr Ser Lys 170 * 175 ' 180 • 9 - 207 - *99 9 99 * · ·'·· 999 Glu Val Leu Pro Gly Ser Tyr A.sp Asc Ser Tvr Phe Met Ser Lys 170 175 * '180 • 9-207 - * 9 99 99 * ·' ·· 999

Len Arg Val Glu Lys18 5 Lys Asn Trp Val Glu 190 Arg Asn Ser Tyr Ser 195 Cys Ser Val Val His 200 Glu Gly Leu His Asn 205 His His Thr Thr Lys 210 Ser Phe Ser Arg Thr 215 Pro Gly Lys <210> <211> <212> <213> • 8 218 PRT Mus musculus <400> Pro 1 8 Alá Pro As n Leu 5 Glu Gly Gly Pro Ser 10 Val Phe Ile Phe Pro 15 Pro Asn Ile Lys Asp 20 Val Leu Met Ile Ser 25 Leu Thr Pro Lys Val 30 Thr Cys Val Val Val 35 Asp Val Ser Glu Asp 40 Asp Pro Asp Val Gin 45 Ile Ser Trp Phe Val 50 Asn Asn Val Glu Val 55 His Thr Alá Gin Thr 60 Gin Thr His Arg Glu 65 Asp Tyr Asn Ser Thr 70 Ile Arg Val Val Ser 75 Kis Len Pro Ile Gin 80 His Gin Asp Trp Met 85 Ser Gly Lys Glu Phe 90 Lys Cys Lys Val Asn 95 Asn Lys Asp Leu Pro 100 Ser Pro Ile Glu Arg 105 Thr Ile Ser- Lys Pro 110 Lys Gly Leu Val Arg 115 Alá Pro Gin Val Tyr 120 Thr Len Pro Pro Pro 125 Alá Glu Gin Leu Ser 130 Arg Lys Asp Val Ser 135 Leu Thr Cys Leu Val 140 Val Gly Phe Asn Pro 145 Gly Asp Ile Ser Val 150 Gin Trp Thr Ser Asn 155 Gly His Thr Glu Glu 160 Asn T Len Arg Val Glu Lys18 5 Lys Asn Trp Val Glu 190 Arg Asn Ser Tyr Ser 195 Cys Ser Val Val His 200 Glu Gly Leu His Asn 205 His His Thr Thr Lys 210 Ser Phe Ser Arg Thr 215 Pro Gly Lys <210> <211 > <212> <213> • 8218 PRT Mus musculus <400> Pro 1 8 Falling Pro As n Leu 5 Glu Gly Gly Pro Ser 10 Val Phe Ile Phe Pro 15 Pro Asn Ile Lys Asp 20 Val Leu Met Ile Ser 25 Leu Thr Pro Lys Val 30 Thr Cys Val Val Val 35 Asp Val Ser Glu Asp 40 Asp Pro Asp Val Gln 45 Ile Ser Trp Phe Val 50 Asn Asn Val Glu Val 55 His Thr Falling Gln Thr 60 Gln Thr His Arg Glu 65 Asp Tyr Asn Ser Thr 70 Val Val Arg Ile Ser Gln Ile Pro Len Small 75 80 85 His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn 90 95 Asn Lys Asp Leu Ser Pro 100 105 Pro Ile Glu Thr Arg Ile Ser Lys Pro 110 Lys Gly Leu Val Arg 115 Falling Pro Gln Val Tyr 120 Thr Len Pro Pro Pro 125 Falling Glu Gln Leu Ser 130 Arg Lys Asp Val Ser 135 Leu Thr Cys Leu Val 140 Val Gly Phe Asn Pro 145 Gly Asp Ile Ser Val 150 Gln Trp Thr Ser Asn Gly 155 160 His Thr Glu Glu Asn T yr Lys Asp Thr 165 Ma fro Val Leu Asp 170 Ser Asp Gly Ser Tyr 175 Phe Ile Tyr Ser Lys 180 Leu Asn Lys Thr 1SS Ser Lys Trp Glu Lys 190 Thr .Asp Ser Phe Ser 195 CVS ssn Val Arg His2 00 Glu Gly Leu Lys Asn 205 Tyr Tyr Leu Lys Lys 210 T hr Ile Ser Arg Ser Pro Gly Lys 215 <210> 9 yr Lys Asp Thr Val Leu Asp fro Today 165 170 Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Ile Tyr Ser Lys 175 180 Asn Leu Lys Thr Glu Trp Lys Ser 1SS 190 Lys Thr Ser Phe Ser 195 .asp CVS ssn Val Arg Leu Gly Glu 00 HIS2 205 Lys Asn Tyr Leu Tyr Lys Ile Ser Lys 210 hr T Arg Ser Gly Lys Pro 215 <210> 9

<?li> 21 S <2L2> <213χ Mus kuscuIus • · · ·• · ·· • · • · · · · · <400> 9 <? Li> 21 S <2L2> <213χ Mus kuscuIus • · · · · ·· • • • · · · · · · <400> 9

Pro Pro Gly Asn Ile Leu Gly Gly1 5 Pro Pro Gly Leu Gly Asn Ile Gly1 5

Pro Lys Pro Lys Asp Alá Leu Met20 Pro Lys Pro Lys Asp Met20 Leu Falling

Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser 35 Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser 35

Val Ser Trp Phe Val Asp Asn Lys50 Val Ser Trp Phe Val Asp Asn Lys50

Gin Pro Arg Glu Alá Gin Tyr Asn65 711a Leu Pro Ile Gin His Gin Asp80 Gln Arg Pro Glu Gln Tyr Falling Asn65 711a Leu Pro Gln Ile His Gln Asp80

Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Alá95 Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Alá95

Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly Arg110 " Lys Thr Ile Ser Gly Lys Pro Arg110 "

Thr Ile Pro Pro Pro Arg Glu Gin125 Thr Arg Ile Pro Pro Pro Glu Gin125

Leu Thr Cys Leu Val Thr Asn Phe140 Leu Thr Cys Leu Val Thr Asn Phe140

Glu Trp Glu Arg Asn Gly Glu Leu155 Glu Trp Glu Arg Asn Gly Glu Leu155

Pro Pro Ile Leu Asp Ser Asp Gly170 Pro Pro Ile Leu Asp Ser Asp Gly170

Leu Thr Val Asp Thr Asp Ser Trp185 Leu Thr Val Asp Thr Asp Ser Trp185

Cvs Ser Val Val His Glu Alá Leu200 208 Cvs Ser Val Val His Glu Leu200 208 Falling

Pro Pro

Ile Ile

Glu Glu

Glu Glu

Ser Ser

Trp Trp

Leu Leu

Alá below

Met Met

Phe Phe

Glu Glu

Thr Thr

Leu Leu

His His

Ser 1Ό Ser 1Ό

Ser 25 Ser 25

Asp 40 asp 40

Val 55 Val 55

Thr 70 Thr 70

Met 85 Met 85

Pro 100 Pro 100

Gin 115 115 Gin

Ser 130 Ser 130

Ser 145 Ser 145

Gin 160 160 Gin

Tyr 175 Tyr 175

Gin 190 190 Gin

Asn 205 Asn 205

Val With

Leu Leu

Asp asp

His His

Phe Phe

Arg Arg

Alá below

Thr Thr

Lys Lys

Glu Glu

Asp asp

Phe Phe

Gly Gly

His His

Phe Phe

Thr Thr

Pro Pro

Thr Thr

Arg Arg

Gly Gly

Pro Pro

Pro Pro

Lys Lys

Tlla TllAA

Tyr Tyr

Leu Leu

Glu Glu

His His

Ile Ile

Pro Pro

Asp 7Vla Asp 7Vla

Val With

Lys Lys

Ile Ile

Gin Gin

Lys Lys

Ile Ile

Lys Lys

Tyr Tyr

Ile Ile

Thr Thr

Phe Phe

Lys Lys

Val With

Trp Trp

Val With

Glu Glu

Glu Glu

Val With

Val With

Ser Ser

Asn Asn

Ser Ser

Phe Phe

Gin Gin

Pro 15 Pro 15

Val 30 Val 30

His 45 His 45

Thr 60 Thr 60

Ser 75 Ser 75

Phe 90 Phe 90

Arg 105 Arg 105

Tyr 120 Tyr 120

Ser 135 Ser 135

Val 150 Val 150

Thr 165 Thr 165

Lys 180 Lys 180

Thr 195 Thr 195

Lys 210 Lys 210

Asn Leu Ser Arg Ser Pro Gly Lys215 <210 <211> <212> <213> IC £ PRT Mesterséges szekvencia <220 <223> Szintetizált szekvencia <4 00 lö Gly . Asn Leu Ser Ser Pro Arg Gly Lys215 <210 <211> <212> <213> Artificial Sequence IC £ PRT <220 <223> synthesized sequence <4 00 lÖ Gly. Ser Gly Ser 1 <210 11 <211" 4 <212> PKT <213" Mesterséges szekvencia <220" 209 <223> Szintetizált szekvencia <400> 11Gly Gly Gly Ser 1 Ser Gly Ser 1 <210 11 <211 "4 <212> PKT <213" Artificial Sequence <220 "209 <223> synthesized sequence <400> 11Gly Gly Gly Ser 1

Claims (41)

  1. • · ·· · • · · • · · · · • · · · · • · · · - 210 - Szabadalmi igénypontok ·· • · • · • · · · · · · · · · · • • · · · - 210 - Claims
    1. Izolált antitest, amely Fc-régiót és - attól N-terminális irányban - három vagy több antigénkötő helyet tartalmaz. 1. An isolated antibody comprising an Fc region, and - containing three or more antigen binding sites - from the N-terminal direction.
  2. 2. Az 1. igénypont szerinti antitest, amely négyantigénkötő helyet tartalmaz. 2. The antibody of claim 1 comprising négyantigénkötő space.
  3. 3. Az 1. igénypont szerinti antitest, amely öt vagytöbb antigénkötő helyet tartalmaz. 3. The antibody of claim 1 comprising five or more antigen binding sites.
  4. 4. Az 1. igénypont szerinti antitest, amely tartalmazegy polipeptid-láncot, amely két vagy több variábilis domént tartalmaz. 4. The antibody of claim 1 comprising a polypeptide chain comprising two or more variable domains. 5. A 4. igénypont szerinti antitest, amelynekpoiipeptid-lánca VD1-(XI) n-VD2-(X2) n-Fc általános képlettelirhazó le, amelyben VD1 jelentése: első variábilis dómén;VD2 jelentése: második variábilis dómén; 5. The antibody of claim 4, amelynekpoiipeptid chain VD1- (XI) n-VD2- (X2) n-Fc general képlettelirhazó down, wherein VD1 is a first variable domain, VD2 is a second variable domain; Fc jelentése: egyFc-régió egyik poiipeptid-lánca; FC represents one of the polypeptide chain egyFc region; és XI és X2 jelentése:axinosav vagy polipeptid; and XI and X2 represent axinosav or polypeptide; és "n" értéke 0 vagy 1. and "n" is 0, or the first
  5. 6. Az 5. igénypont szerinti antitest, amely két vagytöbb polipeptid-láncot tartalmaz, melyek mindegyike VD1-(XI)--VD2-(X2) n-Fc általános képlettel írható le. 6. The antibody of claim 5, comprising two or more polypeptide chains, each VD1- (XI) - is represented by formula VD2- (X2) n-Fc.
  6. 7. Az 1. igénypont szerinti antitest, amely legalábbegy pc1ipepzid-láncct tartalmaz, amely a következő általá-nos képletek egyikével írható le: (a) V--CH1-(flexibilis kapcsolószekvencia)-VH-CH1-(Fc- • · · · - 211 - régió); 7. The antibody of claim 1 comprising at least one pc1ipepzid chain, which can be described by the following formulas In a general one of: (a) V - CH1 (flexible linker) -VH-CH1 (Fc • · · · - 211 - region); és (b) VH-CH1-VH-CH1-(Fc-régió). and (b) VH-CH1-VH-CH1 (Fc region).
  7. 8. Az 1. igénypont szerinti antitest, amely legalább két könnyű lánc variábilis dómén polipeptidet tartalmaz. 8. The antibody of claim 1 comprising a polypeptide of at least two light chain variable domain. 9. A 8. igénypont szerinti antitest, amelynek könnyűlánc variábilis donién polipeptidjei CL-domént is tartalmaz-nak. 9. The antibody of claim 8, wherein said light chain variable Doni polypeptides comprise a CL domain does contain.
  8. 10. Az 1. igénypont szerinti antitest, amely Fd- (flexibilis kapcsolószekvencia)-Fd polipeptid-láncot tar- t aIma z. 10. The antibody of claim 1 which is FD (flexible linker) polypeptide chain -Fd Tar- AIMA t z. 11. A 10. igénypont szerinti antitest, amelyben a fle-xibilis kapcsolószekvencia a következő peptidek egyikéttartalmazza: Gly-3er, Gly-Ser-Gly-Ser (10. azonosítószámúszekvencia), Ala-Ser és Gly-Gly-Gly-Ser (11. azonosítószámú szekvencia). 11. The antibody of claim 10, wherein the FLE-xibilis linker peptides of the following one comprising: Gly-3er, Gly-Ser-Gly-Ser (10, SEQ ID NO:), Ala-Ser and Gly-Gly-Gly-Ser (11 . SEQ ID NO:).
  9. 12. Az 1. igénypont szerinti antitest, amelyet az an-titest által megköthető antigént termelő sejt gyorsabbaninternaiizál, mint egy kétértékű antitestet. 12. The antibody of claim 1 which gyorsabbaninternaiizál bindable by the antibody antigen presenting cells than a bivalent antibody.
  10. 13. Az 1. igénypont szerinti antitest, amely agonista hatású antitest. 13. The antibody of claim 1 which is an antibody agonist activity.
  11. 14. Az 1. igénypont szerinti antitest, amelyapoptőzist indukál. 14. The antibody of claim 1 amelyapoptőzist induces.
  12. 15. Az 1. igénypont szerinti antitest, amelynek háromvagy több antigénkötő helye ugyanazon antigénhez kötődik. 15. The antibody of claim 1 having three or more antigen binding site binds to the same antigen. • · · - 212 - • · · - 212 -
  13. 16. Az 1. igénypont szerinti antitest, amelynek háromvagy több antigénkötő helye két vagy több különböző anti-génhez kötődik. 16. The antibody of claim 1 having three or more antigen binding site binds to two or more different anti-gene.
  14. 17. Az 1. igénypont szerinti antitest, amelytumorsejtek által termelt sejtfelületi proteinhez kötődik. 17. The antibody of claim 1 bound to a cell surface protein produced by amelytumorsejtek. 18. A 17. igénypont szerinti antitest, amely sejtfelü-leti proteinként epidermális növekedési faktor receptorhoz(EGFR), HER2-receptorhoz, HER3-receptorhoz, HER4-receptorhoz vagy DcR3-receptorhoz kötődik. 18. The antibody of claim 17 which sejtfelü-lations protein binds epidermal growth factor receptor (EGFR), HER2 receptor, HER3 receptor, HER4 receptor, or DcR3 receptor. 19. A 17. igénypont szerinti antitest, amely sejtfelü-leti proteinként HER2-receptorhoz kötődik. 19. The antibody of claim 17 which sejtfelü-lations protein binds to the HER2 receptor.
  15. 20. Az 1. igénypont szerinti antitest, amelytumorsejtek által túlzott mértékben termelt sejtfelületi proteinhez kötődik. 20. The antibody of claim 1 bound to a cell surface protein overexpressed by amelytumorsejtek.
  16. 21. Az 1. igénypont szerinti antitest, amely atumornekrózis faktor (TNF) receptor főcsaládba tartozó re- oectorhoz kötődik. 21. The antibody of claim 1 which binds atumornekrózis factor (TNF) receptor superfamily belonging re- oectorhoz. 21. A. 21. igénypont szerinti antitest, amely TNF-receptorként Apo2L-receptorhoz kötődik. 21. A antibody according to claim 21, which binds to Apo2L receptor TNF receptor. 23. A 22. igénypont szerinti antitest, amely Apo2L-reoeptorként DR4-hez, 3R5-höz, DcRl-hez vagy DcR2-höz kötő- 24. A 22. igénypont szerinti antitest, amely Apo2L-receptorkénz DR4-hez vagy DR5-höz kötődik. 23. The antibody of claim 22 wherein the Apo2L reoeptorként DR4, 3R5 to, DcRl or DcR2 offer to binder 24. The antibody of claim 22 which receptorkénz Apo2L to DR4 or DR5 bound. • «·· - 213 - 25. A 21. igénypont szerinti antitest, amely agonista hatású antitest. • «·· - 213 - 25. The antibody of claim 21, wherein the agonistic antibody activity. 26. A 21. igénypont szerinti antitest, amelyapoptózist indukál. 26. The antibody of claim 21 amelyapoptózist induces.
  17. 27. Az 1. igénypont szerinti antitest, amely B-sejt-felületi antigénhez kötődik. 27. The antibody of claim 1 which binds a B cell surface antigen. 28. A 27. igénypont szerinti antitest, amely B-sejt-felületi antigénként CD19-hez, CD20-hoz, CD22-höz vagy CD40-hez kötődik. 28. The antibody of claim 27 which binds to CD19, CD20, CD22 or CD40 B cell surface antigen. 29. A 27. igénypont szerinti antitest, amely B-sejt-felületi antigénként CD20-hoz kötődik. 29. The antibody of claim 27 which binds to CD20 B cell surface antigen.
  18. 30. Immunkonjugátum, amely citotoxikus hatóanyaghozkonjugélva 1. igénypont szerinti antitestet tartalmaz. 30. An immunoconjugate comprising hatóanyaghozkonjugélva cytotoxic antibody according to claim 1. 31. A 30. igénypont szerinti immunkonjugátum, amelycitotoxikus hatóanyagként olyan hatóanyagot tartalmaz,amely internalizációt követően a sejthalált okoz. 31. The immunoconjugate of claim 30, amelycitotoxikus active ingredient comprises an agent which causes cell death after internalization. 32. A 30. igénypont szerinti immunkonjugátum, amely citotoxikus hatóanyagként radioaktív izotópot, mavtansinoidot vagy calecheamicint tartalmaz. 32. The immunoconjugate of claim 30, comprising a radioisotope, or mavtansinoidot calecheamicint cytotoxic agents.
  19. 33. Izolált antitest, amely három vagy többantigénkötő helyet tartalmaz, és a tumornekrózis faktor{1NF< receptor fócsalédba tartozó receptorhoz képes kötőd- ni. 33. An isolated antibody comprising three or többantigénkötő space and capable ni kötőd- a receptor in the tumor necrosis factor {1NF <fócsalédba receptor. • · • · · - 214 - 34. A 33. igénypont szerinti antitest, amely nem natívszekvenciájú IgM vagy IgA antitest. • • · · · - 214 - 34. The antibody of claim 33 which does not natívszekvenciájú IgM or IgA antibody. 35. A 33. igénypont szerinti antitest, amely csak egyFc-régiót tartalmaz vagy nem tartalmaz Fc-régiót. 35. The antibody of claim 33 comprising only egyFc region or an Fc region. 36. A 33. igénypont szerinti antitest, amely két vagytöbb variábilis domént tartalmazó polipeptid-láncot tartal-maz. 36. The antibody of claim 33, wherein said polypeptide chain comprising two or more variable domains comprise maz. 37. A 33. igénypont szerinti antitest, amely négyantigénkötő helyet tartalmaz, melyek mindegyike TNF-receptcrhoz képes kötődni. 37. The antibody of claim 33 comprising négyantigénkötő space, each capable of binding TNF receptcrhoz. 38. A 33. igénypont szerinti antitest, amely TNF-receptorként Apo2L-receptorhoz kötődik. 38. The antibody of claim 33 wherein the Apo2L receptor binds TNF receptors. 39. A 38. igénypont szerinti antitest, amely Apo2L-receptcrként DR4-hez, DR5-höz, DcRl-hez vagy DcR2-höz kötő- 43. A 38. igénypont szerinti antitest, amely Apo2L-receptcrként DR4-hez vagy DR5-höz kötődik. 39. The antibody of claim 38, wherein the Apo2L receptcrként DR4, DR5, DcRl or DcR2 offer to binder 43. The antibody of claim 38 which receptcrként Apo2L to DR4 or DR5 bound. 41. A 33. igénypont szerinti antitest, amely agonista hatású antitest. 41. The antibody of claim 33 wherein the agonistic antibody activity. 43. A 33. igénypont szerinti antitest, amely l j.ΩűuK3i · 43. The antibody of claim 33 which j.ΩűuK3i · l
  20. 43. Izolált antitest, amely legalább három antigénkötőhelyet tartalmaz, és Frb3-receptorhoz képes kötődni. 43. An isolated antibody comprising at least three antigen binding site and is capable of binding Frb3 receptor. • · • 9·· • · • ·· 9
    - 215 - 44. A 43. igénypont szerinti antitest, amely nem natívszekvenciájú IgM vagy IgA antitest. - 215 - 44. The antibody of claim 43 which does not natívszekvenciájú IgM or IgA antibody. 45. A 43. igénypont szerinti antitest, amely csak egyFc-régiót tartalmaz vagy nem tartalmaz Fc-régiót. 45. The antibody of claim 43 comprising only egyFc region or an Fc region. 46. A 43. igénypont szerinti antitest, amely két vagytöbb variábilis domént tartalmazó polipeptid-láncot tartal-maz . 46. ​​The antibody of claim 43, wherein said polypeptide chain comprising two or more variable domains comprise maz. 47. A 43. igénypont szerinti antitest, amely négy antigénkötő helyet tartalmaz, melyek mindegyike ErbB- receptorhoz képes kötődni. 47. The antibody of claim 43 which comprises four antigen binding sites each capable of binding ErbB- receptor. 48. A 43. igénypont szerinti antitest, amely ErbB- receptorként epidermális növekedési faktor receptorhoz (EGFR), HER2-receptorhoz, HER3-recepnorhoz vagy HER4- receptorhoz kötődik. 48. The antibody of claim 43, which binds to epidermal growth factor receptor (EGFR), HER2 receptor, HER3 receptor ErbB- HER4- recepnorhoz or receptor. 49. A 43. igénypont szerinti antitest, amely ErbB- receptorként HER2-receptorhoz kötődik. 49. The antibody of claim 43 which binds to the HER2 receptor ErbB- receptor.
  21. 50. Izolált antitest, amely legalább három antigénkötőhelyet tartalmaz, és 3-sejt-felületi antigénhez képes kö-tődni . 50. An isolated antibody comprising at least three antigen binding site and is capable of co-tődni 3-cell surface antigen.
  22. 51. Az 50. igénypont szerinti antitest, amely nem na-tív szekvenciájú IgM vagy IgA antitest. 51. The antibody of claim 50 which does not na-tive sequence IgM or IgA antibody.
  23. 52. Az 50. igénypont szerinti antitest, amely csakFc-régict tartalmaz vagy nem tartalmaz Fc-régiót. 52. The antibody of claim 50, comprising csakFc-régict or not contain an Fc region. egy - 216 - a - 216 -
  24. 53. Az 50. igénypont szerinti antitest, amely kétvagy több variábilis domént tartalmazó polipeptid-láncot tartalmaz. 53. The antibody of claim 50, comprising of two or more polypeptide chain comprising a variable domain.
  25. 54. Az 50. igénypont szerinti antitest, amely négyantigénkötó helyet tartalmaz, melyek mindegyike képes B-sejt-felületi antigénhez kötődni. 54. The antibody of claim 50, comprising négyantigénkötó space, each capable of binding to a B cell surface antigen.